Настоящее изобретение относится к способу определения для женской особи, в организм которой будет проводиться имплантация, способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения, путем измерения для множества ооцитов, отобранных от упомянутого объекта, уровня гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) в фолликулярной жидкости, присутствующего в фолликулярной жидкости (ФЖ) фолликула каждого отобранного ооцита; и определения на основании результатов измерения уровня ГКСФ ФЖ способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения этих ооцитов. Изобретение также относится к способу искусственного оплодотворения женской особи путем отбора некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта, определения способности к имплантации эмбриона, полученного из каждого ооцита, оплодотворения ооцитов, для получения эмбрионов, и имплантации эмбрионов, обладающих высокой способностью к имплантации.

[0001] Способ определения для женской особи, в организм которой будет проводиться имплантация, способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения, включающий следующие этапы:

[0002] Способ по п.1, в котором ооциты с самым высоким уровнем ГКСФ ФЖ признаются обладающими наибольшей способностью к имплантации.

[0003] Способ по п.1 или 2, в котором каждая проба ФЖ получается из материала, отобранного из фолликула путем аспирации.

[0004] Способ по любому из пп.1-3, в котором соответствующий уровень ГКСФ ФЖ измеряют в течение 20 ч с момента отбора материала из фолликула путем аспирации.

[0005] Способ по любому из пп.1-4, в котором уровень ГКСФ ФЖ, равный или ниже 20,6 пг/мл, определяет способность к имплантации как нулевую или низкую.

[0006] Способ по любому из пп.1-4, в котором уровень ГКСФ ФЖ, равный или выше 24,0 пг/мл, определяет способность к имплантации как высокую.

[0007] Способ по любому из пп.1-6, в котором соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью иммуноанализа.

[0008] Способ по любому из пп.1-7, в котором соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью конкурентного или количественного иммуноанализа, такого как радиоиммунологический анализ (RIA), количественный радиоиммуноанализ (IRMA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT).

[0009] Способ по любому из пп.1-8, в котором соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью анализа по технологии Люминекс (Luminex).

[0010] Способ по п.9, в котором при анализе по технологии Люминекс (Luminex) применяется набор для технологии Luminex компании Biorad ® или набор компании R &D ®.

[0011] Способ по любому из пп.1-6, в котором соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются путем измерения уровней и-РНК ГКСФ ФЖ.

[0012] Способ по любому из пп.1-6, в котором соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью любого способа поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии, способа резонансного переноса энергии флуоресценции, способа резонансного переноса энергии биолюминесценции, способа гашения флуоресценции флуоресценцией, флуоресцентного поляризационного иммуноанализа, масс-спектрометрии (МС), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ВЭЖХ/МС, ВЭЖХ/МС/МС, капиллярного электрофореза, блочного электрофореза в плоском геле и в столбиках геля.

[0013] Способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

[0014] Способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

Искусственное оплодотворение, такое как оплодотворение in vitro (IVF) или внутриплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ), в течение трех десятилетий использовалось для решения проблем пациентов, страдающих бесплодием. Несмотря на широкие исследования, оно остается сложной и дорогостоящей процедурой, при которой, как правило, отмечается низкий показатель имплантации пересаженных эмбрионов (15-20%).

Больницы и частные центры, предоставляющие услугу искусственного оплодотворения, после оплодотворения ооцита в своем выборе опираются на свойства эмбриона, полученного таким способом. Например, выбор может быть основан на морфологии эмбриона (Guerif et al., 2007, Hum. Reprod 22(7): 1973) или на выработке эмбрионами растворимого главного комплекса гистосовместимости человека (HLA-G) (Fuzzi В. et al., 2002, Eur. J Immunol. Feb; 32(2): 311-5). Оба этих способа требуют вмешательства в эмбрион.

Для повышения вероятности наступления беременности обычно пересаживают более одного эмбриона. В Европе обычная практика состоит в пересадке двух эмбрионов в полость матки. В США пересаживают большее число эмбрионов, как правило, три или четыре. Отрицательной стороной такой стратегии является увеличение числа многоплодных беременностей и соответствующих акушерских патологий, более конкретно недоношенности и, главным образом, низкий показатель рождаемости.

Кроме того, искусственное оплодотворение является дорогой процедурой и может нанести психологическую травму пациенту. Хирургические процедуры требуются для получения яйцеклеток для искусственного оплодотворения и после оплодотворения необходимо проведение дополнительных хирургических манипуляций для имплантации оплодотворенных яйцеклеток в матку. После этого реципиент должен ожидать в течение некоторого времени, пока можно будет установить, наступила беременность или нет. В отдельных случаях беременность может не наступить вообще, несмотря на неоднократные попытки, и эти случаи дорого обходятся обществу как в финансовом, так и человеческом плане.

В этой связи было бы желательно иметь способ анализа и набор, которые могут послужить признаком способности ооцита к имплантации до оплодотворения, максимально увеличив шансы эмбриона на успешную имплантацию и позволить использовать показатели низкой вероятности успеха для предотвращения вышеупомянутой травмы и предупреждения затрат в связи с искусственным оплодотворением.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение основано на неожиданном открытии наших изобретателей того, что у женской особи, склонной к образованию множества ооцитов при гиперстимуляции яичников, будет проявляться изменчивость уровня ряда цитокинов и факторов роста, присутствующих в фолликулярной жидкости фолликула, из которого происходит каждый ооцит. Кроме того, изобретатели обнаружили существование сильной корреляции между высоким уровнем гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ), присутствующего в фолликулярной жидкости отдельного фолликула, из которого происходит ооцит, и высокой способностью к имплантации эмбриона, полученного путем оплодотворения вышеназванного ооцита. Ранее не было показано, что у одного и того же индивидуума фолликулярная жидкость, окружающая каждый отдельный ооцит, может варьировать по составу и что указанный состав является показателем успешности имплантации оплодотворенного впоследствии ооцита. Это открытие позволяет классифицировать множество эмбрионов, полученных от одного пациента, по их способности к имплантации. Впервые у пациентов с пограничной естественной фертильностью, выявленной с помощью таких показателей, как маркеры средней фертильности ооцитов (например, 11-бета гидроксистероид-дегидрогеназы - ГСД), могут быть обнаружены ооциты с высокой способностью к имплантации по сравнению с общим низким уровнем; это открывает новые возможности для женских особей, имевших ранее указания на бесплодие. Более того, этот способ дает возможность оценивать каждый ооцит и, следовательно, эмбрион индивидуально, не подвергая вмешательству этот эмбрион или ооцит.

Настоящее изобретение относится к способу определения способности к имплантации множества эмбрионов, каждый из которых был получен или будет получен с помощью искусственного оплодотворения ооцита женской особи, включающему измерение уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости, присутствующей в фолликуле, из которого был отобран каждый ооцит, и определение способности каждого эмбриона к имплантации на основании уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости. Ооцит из фолликула с самым высоким уровнем ГКСФ в фолликулярной жидкости даст эмбрион с наибольшей способностью к имплантации.

Настоящее изобретение относится к набору, который может быть использован для прогнозирования результата искусственного оплодотворения женской особи. Изобретение также относится к такому способу и набору для использования в ходе процедуры оплодотворения с целью улучшения имплантации.

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ для определения для женской особи, в организм которой будет проводиться имплантация, способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения, включающий следующие этапы:

(i) измерение для множества ооцитов, отобранных от упомянутого объекта, уровня гранул оцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) в фолликулярной жидкости, присутствующего в фолликулярной жидкости (ФЖ) фолликула каждого отобранного ооцита; и

(ii) определение на основании результатов измерения уровня ГКСФ ФЖ способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения этих ооцитов.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого ооциты с самым высоким уровнем ГКСФ ФЖ признаются обладающими наибольшей способностью к имплантации.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого каждая проба ФЖ получается из материала, отобранного из фолликула путем аспирации.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого соответствующий уровень ГКСФ ФЖ измеряют в течение 20 ч с момента отбора материала из фолликула путем аспирации.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого уровень ГКСФ ФЖ, равный или ниже 20,6 пг/мл, определяет способность к имплантации как нулевую или низкую.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого уровень ГКСФ ФЖ, равный или выше 24,0 пг/мл, определяет способность к имплантации как высокую.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью иммуноанализа.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью конкурентного или количественного иммуноанализа, такого как радиоиммунологический анализ (RIA), количественный радиоиммуноанализ (IRMA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT).

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью способа по технологии Люминекс (Luminex).

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого при способе по технологии Люминекс (Luminex) применяется набор для технологии Luminex компании Biorad ® или набор компании R &D ®.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются путем измерения уровней и-РНК ГКСФ ФЖ.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ согласно описанию выше, в ходе которого соответствующие уровни ГКСФ ФЖ определяются с помощью любого способа поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии, способа резонансного переноса энергии флуоресценции, способа резонансного переноса энергии биолюминесценции, способа гашения флуоресценции флуоресценцией, флуоресцентного поляризационного иммуноанализа, масс-спектрометрии (MC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ВЭЖХ/МС, ВЭЖХ/МС/МС, капиллярного электрофореза, блочного электрофореза в плоском геле и в столбиках геля.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой набор для использования при проведении способа согласно описанию выше, включающий по меньшей мере один реагент, подходящий для определения уровня ГКСФ ФЖ или и-РНК ГКСФ ФЖ.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой набор согласно описанию выше, дополнительно включающий комплект эталонных концентраций ГКСФ ФЖ.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой набор согласно описанию выше, дополнительно включающий некоторое количество наконечников для аспиратора для извлечения ооцитов и фолликулярной жидкости из тела объекта.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) отбор некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение способности к имплантации эмбриона, полученного из каждого ооцита с помощью способа согласно описанию выше;

(iii) оплодотворение ооцитов, соответствующих эмбрионам, которые обладают высокой способностью к имплантации, и

(iv) имплантацию полученного таким образом эмбриона в организм женской особи.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) получение некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение способности к имплантации эмбриона, полученного из каждого ооцита с помощью способа согласно описанию выше;

(iii) оплодотворение ооцитов для получения эмбрионов и

(iv) имплантацию эмбрионов, обладающих высокой способностью к имплантации.

Перечень фигур

Фиг. 1. Рабочая характеристическая кривая (РХК) из эксперимента по технологии Luminex для определения ГКСФ ФЖ с помощью набора для технологии Luminex компании Biorad. Показатель истинных позитивных заключений (чувствительность) отложен относительно показателя ложно-позитивных заключений (100-специфичность) для различных точек отсечки по концентрации ГКСФ ФЖ. Каждая точка на РХК представляет собой пару показателей чувствительности/специфичности, соответствующую конкретному порогу выбора. Площадь под кривой РХК является критерием того, насколько точно ГКСФ ФЖ может провести разграничение между двумя диагностическими группами (достоверная имплантация/ отсутствие имплантации). Линия 1: площадь под кривой составляет 0,82, что указывает на то, что экспериментальный показатель случайно выбранной индивидуальной пробы из позитивной группы выше такового случайно выбранной индивидуальной пробы из негативной группы в 82% случаев. Линия 2: площадь под кривой РХК составляет 0,5, что представляет собой нулевую гипотезу.

Фиг. 2. Рабочая характеристическая кривая (РХК) из эксперимента по технологии Luminex для определения ГКСФ ФЖ с помощью набора для технологии Luminex компании R &D ®. Линия 3: площадь под кривой составляет 0,72, что указывает на то, что экспериментальный показатель случайно выбранной индивидуальной пробы из позитивной группы выше такового случайно выбранной индивидуальной пробы из негативной группы в 72% случаев. Линия 4: площадь под кривой РХК составляет 0,5, что представляет собой нулевую гипотезу.

Фиг. 3. График, показывающий колебания концентрации в индивидуальных пробах фолликулярной жидкости одной группы эмбрионов, полученных от объектов, от каждого из которых было отобрано по нескольку проб. Каждый прямоугольник отражает отклонение показателя индивидуальной пробы от среднего значения в той же группе полученных эмбрионов.

Подробное описание изобретения

Если не оговорено иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, употребляются в том же значении, в каком их понимает специалист в данной области. Все публикации, упоминаемые в настоящем документе, включены в него путем ссылки. Все патенты и заявки на патенты США, упоминаемые в настоящем документе, включены в него путем ссылки целиком и полностью, включая чертежи.

Словосочетание, такое как "одна проба", означает одну пробу или более одной пробы.

Перечисление областей числовых значений по конечным точкам включает все целые числа и, где это уместно, дроби, находящиеся в этой области (например, от 1 до 5 может включать 1, 2, 3, 4, если речь идет, например, о количестве проб, и может также включать 1,5; 2; 2,75 и 3,80, если речь идет, например, о концентрации). Перечисление конечных точек также включает значения самих конечных точек (например, от 1,0 до 5,0 включает оба значения 1,0 и 5,0).

Как было упомянуто в других местах документа, настоящее изобретение относится к неожиданному открытию изобретателями того, что у женской особи, образующей множество ооцитов при гиперстимуляции яичников, будет проявляться изменчивость уровня ряда цитокинов и факторов роста, присутствующих в фолликулярной жидкости фолликула, из которого происходит каждый ооцит. Кроме того, изобретатели обнаружили существование сильной корреляции между высоким уровнем гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ), присутствующего в фолликулярной жидкости отдельного фолликула, из которого происходит ооцит, и высокой способностью к имплантации эмбриона, полученного путем оплодотворения вышеназванного ооцита. Ранее не было показано, что у одного и того же индивидуума фолликулярная жидкость, окружающая каждый отдельный ооцит, может варьировать по составу и что указанный состав является показателем успешности имплантации оплодотворенного впоследствии ооцита. Это открытие позволяет классифицировать множество эмбрионов, полученных от одного пациента, по их способности к имплантации. Впервые у пациентов с пограничной естественной фертильностью, выявленной с помощью таких показателей, как маркеры средней фертильности ооцитов (например, 11-бета гидроксистероид-дегидрогеназы - ГСД), могут быть обнаружены ооциты с высокой способностью к имплантации по сравнению с общим низким уровнем; это открывает новые возможности для женских особей, имевших ранее указания на бесплодие. Более того, этот способ дает возможность оценивать каждый ооцит и, следовательно, эмбрион индивидуально, не подвергая вмешательству этот эмбрион или ооцит.

Так, настоящее изобретение относится к способу анализа и набору, который может быть использован для прогнозирования результата искусственного оплодотворения женской особи. Изобретение также относится к такому способу и набору для использования в способе терапии при оплодотворении с целью улучшения имплантации. Несмотря на то что наше изобретение, описанное ниже, было разработано на основании исследований, проведенных на людях, пациентах женского пола, оно будет применимо для любых женских особей млекопитающих и может использоваться для повышения успешности, например, программ разведения в неволе видов, находящихся под угрозой исчезновения, или селекции на промышленной основе путем искусственного оплодотворения животных, например крупного рогатого скота или лошадей. Предпочтительно, чтобы объект прошел предварительную терапию для повышения фертильности (например, был подвергнут гиперстимуляции яичников) с целью увеличения числа яйцеклеток, образуемых во время месячного цикла. Искусственное оплодотворение в том виде, в котором оно используется в этом способе, относится к способам оплодотворения ex vivo, при которых ооцит оплодотворяется вне тела женской особи, более конкретно оплодотворение in vitro (IVF) или внутриплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ).

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ для определения способности к имплантации множества эмбрионов, каждый из которых был получен или будет получен с помощью искусственного оплодотворения ооцита женской особи, включающий измерение уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости, присутствующей в фолликуле, из которого происходит каждый ооцит, и определение способности каждого эмбриона к имплантации на основании уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ для определения для женской особи способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения, включающий следующие этапы:

(i) измерение для множества ооцитов, отобранных от упомянутого объекта, уровня гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) в фолликулярной жидкости, присутствующего в фолликулярной жидкости (ФЖ) фолликула каждого отобранного ооцита; и

(ii) определение на основании результатов измерения уровня ГКСФ ФЖ способности к имплантации эмбрионов, полученных или тех, которые будут получены с помощью искусственного оплодотворения этих ооцитов. Ооцит из фолликула с самым высоким уровнем ГКСФ в фолликулярной жидкости даст эмбрион с наибольшей способностью к имплантации.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ) является образующимся естественным путем цитокином, который относится к семейству гемопоэтического фактора роста (Clark, et al., 1987, Science 236(4806): 1229). Его основная описанная роль состоит в воздействии на пролиферацию, дифференциацию и активацию гематопоэтических клеток нейтрофильной линии (Mielcarek et al., 1996, Blood 87(2): 574, Visani et al., 1995, 18(5-6): 423). Образуемый главным образом гемопоэтическими клетками ГКСФ также продуцируется негемопоэтическими клетками, более конкретно теми, которые располагаются в репродуктивных путях: лютеинизированными клетками зернистого слоя фолликула человека (Salmassi A., et al., 2004, Fertil Steril, 81 Suppl. 1: 786), эндометриальными клетками (Giacomini G., et al., 1995, Hum Reprod 10(12): 3259), отпадающей оболочкой матки и плацентой (Duan J.S., 1990, Osaka City Med. J. 36(2): 81; Miyama M. et al., 1998, Osaka City Med J., 44(1): 85) и различными тканями плода (Calhoun et al., 1999, Pediatr Res 46(3): 333). В яичнике белок ГКСФ и его рецептор располагались (вестерн-блоттинг и иммуногистохимия) в основном в клетках зернистого слоя фолликула и клетках желтого тела (Salmassi, et al., 2004).

Предпочтительно уровень ГКСФ в фолликулярной жидкости (ГКСФ ФЖ) определяют в течение суток с момента отбора ооцита. Как известно специалистам, аспирация фолликула проводится под контролем трансвагинальной сонографии после локальной или общей анестезии. Аспирация каждой пробы фолликулярной жидкости, соответствующей одному фолликулу яичника, который был визуализирован при помощи вагинальной сонографии, выполняется отдельно. Захват каждого ооцита не требует проведения никаких дополнительных манипуляций, поскольку фолликулярная жидкость, окружающая ооцит, отсасывается вместе с ооцитом. Просмотр фолликулярной жидкости под микроскопом позволяет сразу идентифицировать присутствие ооцита. Пробы фолликулярной жидкости и соответствующие ооциты не объединяют, ооцит отделяют от жидкости в момент отбора, поэтому уровень ГКСФ ФЖ можно измерять индивидуально. По одному из аспектов изобретения уровень ГКСФ ФЖ определяется через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ч после отбора ооцита, или в момент, находящийся в интервале между двумя любыми вышеперечисленными значениями. Предпочтительно уровень ГКСФ ФЖ определяют в период от 1 до 20 ч после отбора ооцита.

Уровень ГКСФ ФЖ, связанный с отдельным ооцитом, может быть измерен с помощью любого походящего способа количественного анализа. Например, измерение может быть выполнено с помощью способа из числа биохимических анализов (более конкретно, посредством жидко- или твердофазного иммуноанализа), способа поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии, способа резонансного переноса энергии флуоресценции, способа гашения флуоресценции, флуоресцентного поляризационного иммуноанализа. Такие способы хорошо известны специалистам, их краткое описание приводится в документе ниже.

Биохимический анализ обычно основан на иммобилизации анализируемого компонента, например, на мембране или на другом твердофазном носителе и воздействии на него лигандом. После смыва избытка лиганда количество связанного лиганда определяют с помощью иммуноанализа или с помощью меченного лиганда (например, лиганда с радиоактивной меткой, лиганда с флуоресцентной меткой, лиганда с меткой из нерастворимых частиц и тому подобное). Также существуют способы для определения и получения лигандов, которые обладают высоким сродством с конкретным анализируемым веществом; см., например, WO 89/09088 под названием "Паралог-аффинная хроматография" ("Paralog Affinity Chromatography"). В примере иммуноанализа проба фолликулярной жидкости может взаимодействовать с антителами к ГКСФ, которые были иммобилизированы на магнитных гранулах. Концентрацию связанного ГКСФ можно установить с помощью иммуноанализа первичных и вторичных антител. Обычно при иммуноанализе проводят калибровку с использованием комплекта эталонных концентраций. Более конкретно, твердофазный иммуноанализ описан в US 4376110. Варианты иммуноанализа в рамках настоящего изобретения включают любой конкурентный или количественный способ иммуноанализа с использованием антител к ГКСФ, например радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) или анализ по технологии Luminex (комплексный иммуноферментный сэндвич-анализ на гранулах).

Предпочтительно уровень ГКСФ ФЖ определяется с помощью технологии Luminex. Luminex является высокочувствительным способом одновременного измерения уровней специфических компонентов в системе. В нем используются твердая фаза, маркированные красителем микросферы, которые настолько малы по размеру, что их поведение скорее напоминает раствор в жидкости. Каждая микросфера покрыта антителом или другим связывающим лиганд реагентом, специфическим для определяемых компонентов (например, для ГКСФ ФЖ). Компоненты пробы улавливаются, и их количество измеряется на микросферах. В анализаторе лазеры приводят в возбуждение внутренние красители, которые идентифицируют каждую микросферную частицу, а также любой репортерный краситель, связанный во время анализа. Для подтверждения результатов на каждом комплекте гранул выполняют множество анализов. Таким образом, чувствительный комплексный анализ становится быстрым и точным способом. Предпочтительно уровень ГКСФ ФЖ измеряют с помощью набора(ов), изготовленного(ых) компанией Biorad ® или R &D ®. В предпочтительном варианте осуществления набор Biorad ® представляет собой набор для иммуноанализа человеческого цитокина с помощью флюоресцентных гранул, Bio-Plex ™ (Hercules, CA, USA, 17A1 1127). В другом предпочтительном варианте осуществления набор R &D ® представляет собой набор LUH000, LUH279, LUH270, LUH271, LUH278, LUH208, LUH214, LUH215B, LUH285, LUH200, LUH280, LUH201, LUH202, LUH204, LUH205, LUH206, LUH217, LUH317, LUH210, LUH293, LUBOOO, LUB320, LUB294, LUB219 и/или LUB213.

Применительно к целям настоящего изобретения термин "антитело", если не указано противное, включает моноклональные антитела, поликлональные антитела и фрагменты целых антител, которые сохраняют свою связывающую способность по отношению к целевому антигену. Такие фрагменты включают фрагменты Fv, F(ab') и F(ab') ₂ , а также одноцепочечные антитела. Кроме того, антитела и их фрагменты могут быть гуманизированными антителами, например, такими, какие описаны в EP-A-239400 (Winter).

Антитела к ГКСФ ФЖ могут быть моноклональными или поликлональными антителами. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с помощью традиционной технологии гибридомы, в которой в качестве иммуногена используются белки или их пептидные фрагменты. Поликлональные антитела также могут быть приготовлены с помощью традиционных средств, включающих введение животному-хозяину, например, крысе или кролику, пептида по изобретению и получение иммунной сыворотки.

Альтернативно, уровень ГКСФ ФЖ можно оценить путем анализа уровня и-РНК ГКСФ ФЖ в клетках зернистого слоя. Клетки зернистого слоя вокруг лучистого венца могут быть сохранены на стадии декоронизации каждого ооцита и до анализа храниться в стабилизаторе РНК (например, при 80 °C). Зонды для гена ГКСФ ФЖ могут быть сконструированы для использования в качестве зондов, например, для применения в анализе амплификации и/или гибридизации нуклеиновой кислоты (ПЦР). Способы и условия проведения ПЦР и реакций гибридизации известны специалистам, их можно найти, например, в сборнике "Молекулярное клонирование: практикум" (третье издание) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) (Joseph Sambrook, Peter MacCallum, David Russell, Cold Spring Habor Laboratory Press)) или можно осуществить с помощью комплексного количественного анализа генов, который предназначен для количественного определения множества мишень-специфических молекул РНК (Panomics).

Способ поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии может альтернативно использоваться в качестве способа количественного анализа уровня ГКСФ в пробе фолликулярной жидкости. В фолликулярной жидкости распознают связанное с чипом антитело к ГКСФ и определяют его содержание способом поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии. Для получения значения уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости реакции связывания выполняют с применением эталонных концентраций.

Способ резонансного переноса энергии флуоресценции может также использоваться для определения уровня ГКСФ в пробе фолликулярной жидкости. ГКСФ и антитела к ГКСФ маркируют донорскими и акцепторными флюоресцентными метками, составляющими комплементарную пару. При связывании меток за счет взаимодействия ГКСФ и антитела к ГКСФ флуоресценция, испускаемая при возбуждении донорской флюоресцентной метки, характеризуется иной длиной волны, нежели та, которая испускается в ответ на воздействие той же длиной волны возбуждения в том случае, если ГКСФ и антитело к ГКСФ не связаны друг с другом; это позволяет провести количественную оценку связанных и несвязанных молекул путем измерения интенсивности испускания при каждой длине волны. Для получения значения уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости реакции связывания можно сравнивать с набором эталонных концентраций.

Способ резонансного переноса энергии биолюминесценции может также использоваться для определения уровня ГКСФ в пробе фолликулярной жидкости. Свет испускается акцептором в момент, когда он находится в непосредственной близости от донора, более конкретно, когда в результате взаимодействия молекул образуется комплекс ГКСФ - антитело к ГКСФ. Уровень ГКСФ в фолликулярной жидкости определяют путем сравнения взаимодействия с набором эталонов.

Точно так же способ гашения флуоресценции флуоресценцией предоставляет возможность определения уровня ГКСФ. Как правило, снижение флуоресценции маркированного антитела к ГКСФ является показателем того, что ГКСФ, несущий гаситель флуоресценции, связан. Очевидно, что аналогичный эффект возникнет, если ГКСФ имеет флуоресцентную метку, а антитело к ГКСФ несет гаситель флуоресценции. Уровень ГКСФ в фолликулярной жидкости определяют путем сравнения взаимодействия с набором эталонов.

Уровень ГКСФ в пробе фолликулярной жидкости можно также определить с помощью флуоресцентного поляризационного иммуноанализа. Комплексы, в частности комплексы, образованные ГКСФ, связанным с флуоресцентным антителом к ГКСФ, будут обладать более высокими показателями поляризации, чем не образовавшие комплексов маркированные антитела к ГКСФ. Это составляет основу для определения уровня ГКСФ в пробе фолликулярной жидкости, анализ которого обычно проводится одновременно с набором эталонных концентраций ГКСФ.

Другие способы, которые можно использовать для количественного анализа ГКСФ ФЖ, включают масс-спектрометрию (МС), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), ВЭЖХ/МС, ВЭЖХ/МС/МС, капиллярный электрофорез, блочный электрофорез в плоском геле и в столбиках геля в сочетании с анализом изображения. Такие способы хорошо известны специалистам в том описании, в каком они приведены, например, в справочниках "Современная ВЭЖХ для ученых-практиков" (Modern HPLC for Practicing Scientists (Dong, M., Wiley-lnterscience, June 2006)), "Тандемная масс-спектрометрия" (Tandem Mass Spectrometry (McLafferty F.W. John Wiley & Sons Inc, November, 1983)), "Масс-спектрометрия для биотехнологии" (Mass Spectrometry for Biotechnology (Siuzdak, G., Academic Press, February 1996)), "Применение капиллярного электрофореза в медицинской практике (Способы в молекулярной медицине)" (Clinical Applications of Capillary Electrophoresis (Methods in Molecular Medicine) (Palfrey S.M., Humana Press, June 1999)), "Справочник по капиллярному электрофорезу", второе издание (Handbook of Capillary Electrophoresis, Second Edition, (Landers J.P. CRC; December 1996)), "Электрофорез и иммунофиксация с высоким разрешением: методики и толкование результатов" (High-Resolution Electrophoresis and Immunofixation: Techniques and Interpretation (Keren, D.F. Hodder Arnold, January, 1994)).

После определения уровня ГКСФ ФЖ для множества ооцитов, отобранных от одного пациента, эти результаты можно использовать для установления относительной способности к имплантации эмбрионов, полученных при оплодотворении вышеупомянутых ооцитов, т.е. ранжировать их по порядку. Уровень ГКСФ ФЖ можно использовать для определения того, сумеют ли все ооциты, некоторые из них или ни один из них обеспечить имплантацию после оплодотворения в организме женской особи, подвергнутой искусственному оплодотворению. Более того, уровень ГКСФ ФЖ можно использовать для определения того, сумеют ли все эмбрионы, некоторые из них или ни один из них имплантироваться в организме женской особи, подвергнутой искусственному оплодотворению.

В наших исследованиях уровень ГКСФ ФЖ измеряли с помощью иммуноанализа, более конкретно с использованием технологии Luminex компаний Biorad ® и R &D ®. Мы обнаружили, что у тех эмбрионов, которые были получены из ооцитов с концентрацией ГКСФ ФЖ равной или ниже 20,0 пг/мл, отмечались низкие или нулевые шансы на успех имплантации. Напротив, у эмбрионов, которые были получены из ооцитов с концентрацией ГКСФ ФЖ выше 24 пг/мл, отмечалась достоверная имплантация.

Несмотря на то что в ходе наших исследований мы установили некое "пороговое" значение уровня ГКСФ ФЖ, ниже которого эмбрионы не имплантируются (и выше которого у пациентов значительно возрастает вероятность имплантации), специалисты в данной области оценят то, что этот показатель является статистическим критерием и можно использовать другие результаты измерений и пороговые значения. Применяя изобретение на практике, очень важно добиться постоянства анализа; и, таким образом, каждый практикующий врач (или бригада по искусственному оплодотворению) сможет отладить собственный конкретный способ анализа и определить свой пороговый уровень. Это может быть установлено путем первоначального исследования данных анамнеза по пробам от предыдущих пациентов.

Так, упомянутый выше уровень ГКСФ ФЖ представляет собой критерий, который мы использовали в наших исследованиях в качестве подходящего предела. Однако если уровень ГКСФ ФЖ будет определяться любым другим способом, отличным от перечисленных выше, желательно с помощью обычных процедур провести контрольное исследование с использованием нашего способа анализа с целью выявления зависимости между нашими результатами и результатами, полученными другими способами, с тем, чтобы стало возможным проводить прямое сравнение.

По одному аспекту настоящего изобретения прогнозируется, что эмбрион, полученный из ооцита, в фолликуле которого уровень ГКСФ ФЖ равен или ниже 21,6; 21,4; 21,2; 21,0; 20,8; 20,6; 20,4; 20,2; 20,0; 19,8; 19,6; 19,4; 19,2; 19,0; 18,8; 18,6; 18,4; 18,2; 18,0; 17,8; 17,6; 17,4; 17,2; 17,0; 16,8; 16,6; 16,4; 16,2; 16,0; 15,8; 15,6; 15,4; 15,2; 15,0 пг/мл, или этот уровень составляет промежуточное значение между любыми двумя перечисленными выше значениями, обладает низкой способностью к имплантации. Предпочтительно прогнозируется, что уровень ГКСФ ФЖ равный или ниже диапазона от 15,0 до 20,0 пг/мл, более предпочтительно равный или ниже диапазона от 19,8 до 20,6 пг/мл, наиболее предпочтительно ниже 20,6 пг/мл соответствует нулевой или низкой способности к имплантации. Уровни в настоящем варианте осуществления настоящего изобретения считаются пороговыми уровнями для способа искусственного оплодотворения (ниже). Низкий уровень имплантации представляет собой вероятность имплантации 10, 9, 8% или менее.

По одному аспекту настоящего изобретения прогнозируется, что эмбрион, полученный из ооцита, в фолликуле которого уровень ГКСФ ФЖ равен или ниже 34,0; 33,5; 33,0; 32,5; 32,0; 31,5; 31,0; 30,5; 30,0; 29,5; 29,0; 28,5; 28,0; 27,5; 27,0; 26,5; 26,0; 25,5; 25,0; 24,5; 24,0; 23,5; 23,0; 22,5; 22,0; 21,5; 21,0; 20,5; 20,0; 19,5; 19,0; 18,5; 18,0; 17,5; 17,0; 16,5; 16,0; 15,5; 15,0 пг/мл, или этот уровень составляет промежуточное значение между любыми двумя перечисленными выше значениями, обладает вероятными шансами на успех имплантации. Предпочтительно прогнозируется, что уровень ГКСФ ФЖ в диапазоне от 15,0 до 34,0 пг/мл, более предпочтительно в диапазоне от 20,0 до 24,0 пг/мл соответствует вероятной имплантации. Вероятная имплантация означает более высокий шанс успеха, чем отсутствие достоверной имплантации; вероятный шанс на успех имплантации означает вероятность имплантации от 15 до 25%. Уровни в настоящем варианте осуществления настоящего изобретения считаются пороговыми уровнями для способа искусственного оплодотворения (ниже).

По одному аспекту настоящего изобретения прогнозируется, что эмбрион, полученный из ооцита, в фолликуле которого уровень ГКСФ ФЖ равен или выше 22,0; 22,1; 22,2; 22,3; 22,4; 22,5; 22,6; 22,7; 22,8; 22,9; 23,0; 23,1; 23,2; 23,3; 23,4; 23,5; 23,6; 23,7; 23,8; 23,9; 24,0; 24,1; 24,2; 24,3; 24,4; 24,5; 24,6; 24,7; 24,8; 24,9; 25,0; 25,1; 25,2; 25,3; 25,4; 25,5; 25,6; 25,7; 25,8; 25,9; 26,0; 26,1; 26,2; 26,3 пг/мл, или этот уровень составляет промежуточное значение между любыми двумя перечисленными выше значениями, обладает высокой способностью к имплантации. Предпочтительно прогнозируется, что уровень ГКСФ ФЖ равный или выше 24,0 пг/мл, более предпочтительно выше 35 пг/мл соответствует высокой способности к имплантации. Уровни в настоящем варианте осуществления настоящего изобретения считаются пороговыми уровнями для способа искусственного оплодотворения (ниже). Высокий уровень имплантации представляет собой вероятность имплантации 30, 35, 40, 43, 44% или более.

Если уровень ГКСФ ФЖ у таких пациентов значительно ниже уровня, связываемого с вероятной или достоверной имплантацией всех отобранных ооцитов, отказ от имплантации позволит сэкономить время, деньги и уберечь такого пациента от стресса. В таких случаях практикующий врач (или клиника по искусственному оплодотворению) сможет принять решение, проводить первую имплантацию или даже не пытаться это делать. С другой стороны, если один или большее число ооцитов демонстрируют высокую вероятность или полную достоверность имплантации, можно оплодотворять только эти ооциты и имплантировать полученные в результате этого эмбрионы, таким образом, экономить деньги и ресурсы, оплодотворяя только те ооциты, у которых высока вероятность прижиться в виде эмбрионов. Альтернативно можно оплодотворять все ооциты, а имплантировать только эмбрионы, полученные из ооцитов, которые демонстрируют высокую вероятность или полную достоверность имплантации; это повышает шансы на успех, поскольку указания на имплантацию не обязательно коррелируют с шансами на оплодотворение.

Настоящее изобретение существенно повышает показатель имплантации, уменьшая число подсаженных эмбрионов. Это также позволяет специалисту более успешно предупреждать многоплодную беременность и все связанные с ней патологии плода и болезни матерей. Пересаженным имплантом может быть ооцит и, следовательно, эмбрион с самой высокой способностью к имплантации, что позволяет придерживаться политики пересадки одного эмбриона без снижения общего процента наступления беременности.

Описанный в документе способ может быть также использован в способе содействия оплодотворению женской особи. Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) отбор некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение уровня ГКСФ ФЖ в фолликуле каждого отобранного ооцита;

(iii) оплодотворение ооцитов, имеющих самый высокий уровень ГКСФ ФЖ, и

(iv) имплантацию полученного таким образом эмбриона в организм женской особи.

Число оплодотворенных впоследствии ооцитов может быть 1, 2, 3, 4 или 5 или больше. Альтернативно, оплодотворяют 50, 40, 30, 20 или 10% ооцитов, относящихся к категории с наивысшим уровнем ГКСФ ФЖ.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) отбор некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение уровня ГКСФ ФЖ в фолликуле каждого отобранного ооцита;

(iii) оплодотворение ооцитов для получения эмбрионов;

(iv) имплантацию эмбрионов, полученных из ооцитов с наивысшим уровнем ГКСФ ФЖ.

Число имплантированных эмбрионов может быть 1, 2, 3, 4 или 5 или больше. Альтернативно, пересаживают 50, 40, 30, 20 или 10% эмбрионов, относящихся к категории с наивысшим уровнем ГКСФ ФЖ.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) отбор некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение уровня ГКСФ ФЖ в фолликуле каждого отобранного ооцита;

(iii) оплодотворение ооцитов для получения эмбрионов;

(iv) имплантацию эмбрионов, полученных из ооцитов с уровнем ГКСФ ФЖ, превышающим предварительно установленный порог.

Число имплантированных эмбрионов может быть 1, 2, 3, 4 или 5 или больше. Альтернативно, пересаживают 50, 40, 30, 20 или 10% эмбрионов, относящихся к категории с наивысшим уровнем ГКСФ ФЖ.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) отбор некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение способности к имплантации эмбриона, полученного из каждого ооцита, в соответствии с описанным выше способом;

(iii) оплодотворение ооцитов, соответствующих эмбрионам с высокой способностью к имплантации;

(iv) имплантацию полученного таким образом эмбриона в организм женской особи.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ искусственного оплодотворения женской особи, включающий:

(i) отбор некоторого количества ооцитов от вышеназванного объекта;

(ii) определение способности к имплантации эмбриона, полученного из каждого ооцита, в соответствии с описанным выше способом;

(iii) оплодотворение ооцитов для получения эмбрионов и

(iv) имплантацию эмбрионов с самой высокой способностью к имплантации.

Описанные выше варианты осуществления настоящего изобретения применительно к способу относятся к соответствующим вариантам осуществления способа искусственного оплодотворения. В других местах настоящего документа приведены пороговые значения. Специалист поймет, что могут иметь место промежуточные этапы, например замораживание после отбора ооцитов. За счет использования настоящего изобретения у клиник искусственного оплодотворения появляется возможность более эффективно распределять ресурсы таким образом, что у пациентов с низким уровнем ГКСФ ФЖ в фолликуле отобранного ооцита, наступление беременности которых при искусственном оплодотворении маловероятно, эту манипуляцию не проводят.

Могут быть предоставлены наборы для использования при проведении способа по изобретению. Такие наборы включают по меньшей мере один реагент, полезный для обнаружения ГКСФ ФЖ. Подходящие агенты включают антитела, или другие подходящие связывающие лиганды реагенты, к ГКСФ ФЖ, факультативно связанному с меткой. Типичными метками являются те, которые обычно используются при иммуноанализе, например пероксидаза хрена. Набор может также включать эталоны, более конкретно, определенное количество ГКСФ ФЖ (например, белка или РНК) может быть маркировано обнаруживаемой меткой. Набор может также включать одноразовые наконечники для аспиратора для использования при извлечении ооцитов и фолликулярной жидкости.

Набор может использоваться для определения ГКСФ ФЖ в способе диагностики, прогнозирования и/или искусственного оплодотворения женской особи. Кроме того, изобретение предоставляет возможность использовать реагент для обнаружения ГКСФ ФЖ для нужд прогнозирования вероятности беременности в результате искусственного оплодотворения женской особи.

Для изготовления диагностического набора, предназначенного для использования при процедуре или при диагностике пригодности к искусственному оплодотворению, могут быть использованы вышеназванные антитела, их фрагменты и варианты и другие подходящие связывающие лиганды реагенты, которые могут быть факультативно маркированы обнаруживаемой меткой.

Уровень ГКСФ ФЖ можно также определить с помощью анализа уровня и-РНК ГКСФ ФЖ, присутствующей в полученных пробах. Для этого ГКСФ ФЖ или его фрагменты можно использовать в качестве зонда для определения уровня ГКСФ в фолликулярной жидкости. Альтернативно, уровень ГКСФ ФЖ можно измерить путем анализа уровня и-РНК ГКСФ ФЖ, экспрессированной в фолликулярной жидкости или в клетках зернистого слоя. Клетки зернистого слоя вокруг лучистого венца могут быть сохранены на стадии декоронизации каждого ооцита и до анализа храниться в стабилизаторе РНК (например, при 80 °C). Такие зонды также могут быть сконструированы в наборах способами, аналогичными тем, которые были описаны для антител, и могут содержать контролирующие нуклеиновые кислоты. Зонды для гена ГКСФ ФЖ могут быть сконструированы для использования в качестве зондов, например, для применения в анализе амплификации нуклеиновой кислоты.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения проиллюстрированы на следующих неограничивающих примерах.

Пример 1. Схема эксперимента.

Пациенты.

В период с января 2005 по март 2007 г. в эксперименте участвовало 280 пациенток, страдающих бесплодием и включенных в программу ИКСИ. Основанием для включения в программу ИКСИ было, главным образом, мужское бесплодие, а также неуспех предыдущего оплодотворения in vitro (IVF) или низкая оплодотворяемость в ходе предыдущего традиционного IVF. При включении в эксперимент мы руководствовались принципом случайного отбора, чтобы не допустить сдвигов в выборе пациентов по клиническим признакам. В течение периода исследования каждую пациентку включали в эксперимент один раз. Все пациентки были полностью информированы и это исследование было одобрено Экспертным советом организации (Консультативный комитет защиты лиц, Пуасси, Сен-Жермен-ан-Ле).

Предварительная терапия.

Пациенток подвергали классической процедуре гиперстимуляции яичников. Мы придерживались протокола, предложенного их терапевтом. Ответ организма на стимуляцию контролировали с помощью серии анализов крови и ультразвукового обследования для наблюдения за фолликулами и ростом эндометрия. Критерием для запуска овуляции считался момент, когда по меньшей мере 5 фолликулов достигали размера 16 мм.

Отбор ооцитов проводили через 35-36 ч после запуска овуляции. В экспериментальной группе аспирацию ооцитов выполняли под общей или местной анестезией под контролем вагинальной ультрасонографии с помощью индивидуального шприца на 10 мл для каждого фолликула. Таким образом, мы адаптировали классический способ аспирации ооцитов с целью индивидуализации фолликулярной жидкости каждого отобранного ооцита.

Пробы фолликулярной жидкости.

Сразу же определяли присутствие или отсутствие ооцита в каждом фолликуле, и фолликулы, в которых не было ооцита, выбрасывали. В экспериментальной группе отбирали индивидуальную пробу фолликулярной жидкости, каждая из которых соответствовала одному зрелому ооциту. Регистрировали объем и внешний вид (лимонная, оранжевая или кровяная) каждой пробы фолликулярной жидкости Индивидуальные пробы фолликулярной жидкости центрифугировали и отбирали аликвотную пробу надосадочной жидкости после анонимизации каждой пробы в соответствии с базой данных для последующего проведения слепого опыта. Пробы сначала хранили при -20 °C, а затем при -80 °C до анализа. Вся клиническая и биологическая информация регистрировалась в базе данных (Medifirst) в реальном времени.

Оплодотворение ооцита и выращивание эмбриона до 2-х суток.

Отбирали ооциты, а бугорок и клетки лучистого венца удаляли с помощью гиалуронидазы 80 ME (Fertipro). Ооциты вводили в 5 мкл каплю промывочной жидкости (JCD) с пробой спермы, движение сперматозоидов в которой было замедлено средой с поливинлпирролидоном (Fertopto). Введенные ооциты культивировали в одиночной 40 мкл микрокапельке ISM1 (Medicult, France) под масляной пленкой при 37 °C. Число пронуклеусов и внешний вид оценивали через 20 ч по критериям Джанароли (Gianaroli). На 2-й день регистрировали число бластомеров, деление и правильность каждого бластомера. Пересадку эмбрионов назначали на 2-й день.

Для анализа мы разделили пересаженные эмбрионы на две категории:

1) эмбрионы самого лучшего качества, имеющие 4-5 клеток на 2-й день, 8-9 клеток на 3-й день и менее 10% делений и обычных клеток (эмбрионы высокого качества);

2) эмбрионы, развивающиеся по любой другой схеме (эмбрионы низкого качества).

Способ по технологии Luminex выполнялся только для проб фолликулярной жидкости, соответствующих пересаженным эмбрионам.

Оценка способности к имплантации.

Каждую пробу оценивали на предмет вероятности имплантации, которая называется в настоящем документе "показатель имплантации". Клинический показатель имплантации эмбриона определяли для каждой тестируемой пробы как количество пересаженных желточных мешков /количество эмбрионов. Клинический показатель имплантации определяли на 8-й неделе аменореи путем ультразвуковой визуализации желточного мешка.

Выделяют три основных категории результатов пересадки:

отсутствие имплантации: показатель имплантации=0;

достоверная имплантация: количество подсаженных эмбрионов равно количеству желточных мешков, наблюдаемых при УЗИ на 8-й неделе аменореи (1 подсаженный эмбрион и одноплодная беременность, два подсаженных эмбриона и двуплодная беременность): показатель имплантации=1;

вероятная имплантация, которая указывает на вероятность имплантации, поскольку количество желточных мешков меньше количества подсаженных эмбрионов (например, 1 из 2, 1 из 3, 2 из 3, в этих случаях показатель имплантации=0,5; 0,33; 0,66).

Для построения РХК (рабочей характеристической кривой) учитывались только две категории:

отсутствие имплантации;

остоверная имплантация: количество подсаженных эмбрионов равно количеству желточных мешков, наблюдаемых при УЗИ на 8-й неделе аменореи (1 подсаженный эмбрион и одноплодная беременность, два подсаженных эмбриона и двуплодная беременность).

Разграничение между категориями "отсутствие имплантации" и "достоверная имплантация" в зависимости от концентрации ГКСФ в каждой пробе оценивали на основании анализа РХК (программное обеспечение MedCalc, Mariakerke, Бельгия). Для трех способов обнаружения были получены данные по чувствительности, специфичности и площади под кривой РХК. На кривой РХК показатель истинных позитивных заключений (чувствительность) был отложен относительно показателя ложно-позитивных заключений (100-специфичность) для различных точек отсечки. Каждая точка на РХК представляет собой пару показателей чувствительности/специфичности, соответствующую конкретному порогу выбора. Тест с идеальным разграничением (отсутствие перекрытия в двух областей распространения) имеет РХК, проходящую через верхний левый угол (100% чувствительность, 100% специфичность). Поэтому чем ближе располагается РХК к верхнему левому углу, тем выше общая точность теста (Zweig & Campbell, 1993). Расчет площади под кривой РХК дает количественную оценку точности, то есть способности ГКСФ провести разграничение между имплантацией и отсутствием имплантации.

Однако большинство имплантировавшихся эмбрионов относились к категории вероятной имплантации. Например, если при пересадке двух эмбрионов только один приживался, то каждая проба характеризовалась 50% вероятностью имплантации.

Таким образом, мы установили для каждого способа

нижний порог имплантации, который определялся 100% прогностической ценностью отрицательного результата по данным площади под кривой РХК;

верхний порог имплантации, который определялся самой высокой прогностической ценностью положительного результата по имплантации.

Анализ ГКСФ, выполненный на пробах ФЖ.

Для анализа отдельных проб фолликулярной жидкости, из которых были взяты пересаженные эмбрионы, последовательно применяли два способа обнаружения по технологии Luminex.

С января по июнь 2005 г.

Технология Luminex применялась с использованием набора компании Biorad ® (Hercules, Ca, USA,17A11 127, цитокины человека, 27-компонентный набор).

С сентября 2005 по март 2007 г.

С помощью технологии Luminex с применением набора компании R &D (Minneapolis, MN, USA, LUH000, LUH279, LUH270, LUH271, LUH278, LUH208, LUH214, LUH215B, LUH285, LUH200, LUH280, LUH201, LUH202, LUH204, LUH205, LUH206, LUH217, LUH317, LUH210, LUH293, LUB000, LUB320, LUB294, LUB219, LUB213) провели анализ 80 проб из тех, которые были исследованы в предыдущей серии с применением набора Luminex компании Biorad ®, и 120 новых отобранных проб.

Был проведен многофакторный и однофакторный анализ. Величина р ниже 0,05 считалась незначительной. В табл. 1 обобщены данные о числе пациенток и количестве проб, которые были последовательно проанализированы с помощью двух способов исследования.

Таблица 1Число пациенток и количество проб, которые были последовательно проанализированы с помощью двух способов исследования

Определения с использованием наборов Luminex компаний Biorad ® и R &D ® подробно рассматриваются в примерах 2 и 3.

Пример 2. Оценка с помощью набора Luminex, выпускаемого компанией Biorad ®.

Был проведен анализ уровня содержания некоторых цитокинов и хемокинов в 132 пробах фолликулярной жидкости, соответствующих 132 впоследствии пересаженным эмбрионам. В частности, определяли концентрацию IL-1 бета, IL-I Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IFN альфа, TNF-альфа, G-CSF (ГКСФ), GM-CSF, VEGF, PDGF, FGF, IP-10, МСР-1, рантеса, эотаксина, MIP-1 альфа, MIP-1 бета с помощью технологии Luminex с применением набора Luminex компании Biorad ®.

Были получены следующие результаты:

1) во всех пробах фолликулярной жидкости были обнаружены: LIF, IL-1 ra, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, G-CSF (ГКСФ), VEGF, IP-10, МСР-1, эотаксин и MIP-бета;

2) ни в одной из проб фолликулярной жидкости не были обнаружены: IL-1 бета, IL-5, IL-7, IL-17, TNF альфа, MIP-альфа;

3) IL-15, GM-CSF, рантес, PDGF, IFN-гамма, IL-9, IL-2, IL-15, FGF были обнаружены, соответственно, в 95, 94, 88, 81, 76, 65, 60, 48 и 22% проб фолликулярной жидкости.

Сравнение двух категорий эмбрионов: эмбрионов самого высокого качества с эмбрионами другой категории показало, что ГКСФ не связан с морфологией эмбриона. Следовательно, корреляция между ГКСФ и морфологическим качеством эмбриона отсутствует (пересаженные эмбрионы высокого качества по сравнению с эмбрионами другого качества).

Цитокины, факторы роста и показатели имплантации.

В ходе многофакторного и однофакторного анализа было установлено, что только один цитокин был связан со способностью соответствующего эмбриона к имплантации, а именно гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ).

Эмбрионы классифицировали по их показателю имплантации.

Для построения площади под кривой РХК для ГКСФ мы учитывали число эмбрионов, которые сумели имплантироваться (n=89), и число эмбрионов, имплантация которых была подтверждена (n=13). Достоверной имплантацией считалась имплантация, при которой у всех пересаженных эмбрионов образовывались желточные мешки.

Площадь под кривой РХК составляла 0,82 [0,73-0,89] и была высоко значимой (p=0,0001) (фиг. 1). Следовательно, имеет место корреляция ГКСФ и показателя имплантации (r=0,40, p <0,0001).

Мы также обнаружили существенное различие между эмбрионами с достоверной имплантацией и отсутствием имплантации (р=0,0002) и между эмбрионами с достоверной имплантацией и вероятной имплантацией (p=0,001) (табл.2).

Таблица 2Корреляция между показателем успеха имплантации и уровнем ГКСФ ФЖ и IL-1 ra ФЖ при определении с помощью набора Luminex, изготовленного компанией Biorad ®

По данным площади под кривой РХК установили нижний и верхний порог ГКСФ для того, чтобы проверить, можно ли использовать концентрацию ГКСФ для оценки "способности к имплантации" каждого эмбриона с целью принятия решения о том, сколько эмбрионов следует пересаживать.

Нижний порог характеризовался более выраженной прогностической ценностью отрицательного результата имплантации. При уровне ГКСФ ниже 20 пг/мл прогностическая ценность отрицательного результата составляет 100% по данным площади под кривой РХК. При уровне ГКСФ выше 24 пг/мл прогностическая ценность положительного результата достигает своего максимума - 40%.

Если все пересаживаемые эмбрионы оценивать по уровню ГКСФ, в показателе имплантации отмечаются следующие расхождения (табл. 3).

Таблица 3Корреляция между показателем успеха имплантации и уровнем ГКСФ ФЖ при определении с помощью набора Luminex, изготовленного компанией Biorad ®

*p=0,003 между средним и низким уровнем ГКСФ;

**p <0,001 между высоким и низким уровнем ГКСФ.

Пример 3. Оценка фолликулярной жидкости с помощью набора Luminex, изготовленного компанией R &D ®.

Был проведен анализ 200 проб фолликулярной жидкости, соответствующих 200 впоследствии пересаженным эмбрионам. С помощью технологии Luminex с применением набора компании R &D ® определяли концентрацию следующих цитокинов и хемокинов: IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-I Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IFN альфа, TNF-альфа, G-CSF (ГКСФ), GM-CSF, MIP-1 альфа, MIP-1 бета, рантес, МСР-1, VEGF.

Обнаружение цитокинов и хемокинов.

G-CSF, IL-1 Ra; IL-6, IL-8, MIP-бета, рантес, МСР-1, VEGF были обнаружены в 95-100% протестированных проб фолликулярной жидкости:

IL-4, TNF-альфа, GM-CSF, IL-5 были обнаружены в 75-94% протестированных проб фолликулярной жидкости;

IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-10, MIP-альфа были обнаружены в 50-74% протестированных проб фолликулярной жидкости;

IL-2, IFN-гамма и IL-17 были обнаружены менее чем в 50% протестированных проб фолликулярной жидкости.

Цитокины, хемокины и показатель имплантации.

Для построения площади под кривой РХК для ГКСФ мы учитывали число эмбрионов, которые не имплантировались (n=146), и число эмбрионов, имплантация которых была достоверной (n=16). Площадь под кривой РХК составляла 0,72 [0,65-0,79] и была высоко значимой (p=0,0025) (фиг. 2).

Было обнаружено существенное различие по уровню ГКСФ между эмбрионами с достоверной имплантацией и отсутствием имплантации (p=0,01) и между эмбрионами с вероятной имплантацией и достоверной имплантацией и (p=0,03) (табл.4).

Таблица 4Корреляция между показателем успеха имплантации и уровнем ГКСФ ФЖ при определении с помощью набора Luminex, изготовленного компанией R &D ®

ГКСФ был обнаружен во всех жидкостях, его концентрация в разных пробах имела небольшое отклонение от эталонных значений, что является строгим требованием при идентификации биомаркера. По данным площади под кривой РХК мы установили нижний и верхний порог ГКСФ для того, чтобы оценить, можно ли использовать концентрацию ГКСФ для прогнозирования "способности к имплантации" каждого эмбриона, которая поможет принять решение о том, сколько эмбрионов следует пересаживать. Нижний порог характеризовался более выраженной прогностической ценностью отрицательного результата имплантации. При уровне ГКСФ ниже 15 пг/мл прогностическая ценность отрицательного результата составляла 100% по данным площади под кривой РХК. При уровне ГКСФ выше 34 пг/мл прогностическая ценность положительного результата достигает своего максимума - 27,8%.

Если все пересаживаемые эмбрионы оценивать по уровню ГКСФ, установленному по данным площади под кривой РХК, в показателе имплантации отмечаются следующие расхождения (табл.5).

Таблица 5Корреляция между показателем успеха имплантации и уровнем ГКСФ ФЖ при определении с помощью набора Luminex, изготовленного компанией R &D ®

** p <0,001 между низким, средним и высоким уровнем ГКСФ.

Пример 4. Средний уровень ГКСФ в смешанных пробах фолликулярной жидкости не отражает колебаний, зарегистрированных в индивидуальных пробах фолликулярной жидкости.

У 15 пациенток были взяты все пробы фолликулярной жидкости, из которых были получены эмбрионы, и проведен их совместный анализ, вне зависимости от результата. Анализ 76 проб был выполнен с помощью технологии Luminex с применением набора, изготовленного компанией Biorad ®.

По каждой пробе мы оценивали следующее соотношение. Средний уровень ГКСФ в объединенной пробе фолликулярной жидкости минус концентрация ГКСФ в индивидуальной пробе ФЖ (n=76).

Фиг. 3 представляет собой график, отображающий колебания концентрации в отдельных пробах фолликулярной жидкости одной группы эмбрионов, полученных от 10 объектов, от каждого из которых было отобрано по нескольку проб. Каждый прямоугольник отражает отклонение показателя индивидуальной пробы от среднего значения в той же группе полученных эмбрионов. Этот результат исследования предполагает, что не все полученные эмбрионы одинаковы по уровню ГКСФ ФЖ и, следовательно, по их способности к имплантации.