EA 015165B1 20110630 Номер и дата охранного документа EA200400965 20030117 Регистрационный номер и дата заявки US10/053,088 20020118 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок AU2003/000039 20030117 Номер международной заявки (PCT) WO2003/061672 20030731 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа EAb21103 Номер бюллетеня [RU] СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ИЗ ПОЛИ(2-ПРОПЕНАЛЯ, 2-ПРОПЕНОВОЙ КИСЛОТЫ) ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И АНТИМИКРОБНАЯ КОМПОЗИЦИЯ Название документа [8] A61K 31/765, [8] A61K 31/78, [8] A61P 1/04, [8] A61P 31/04, [8] A61P 1/12 Индексы МПК [AU] Мелрос Грэм Джон Гамильтон, [AU] Хаксем Эндрю Джеймс, [AU] Тилбрук Деймон Метью Годби, [AU] Уайкоко Винсент Леонард Сведения об авторах [AU] КЕМЕК ЭлТиДи (AU) Сведения о патентообладателях [AU] КЕМЕК ЭлТиДи (AU) Сведения о заявителях WO 9638186 A1 WO 8804671 A1 WO 0003723 A1 Hampson, D.J. et al. Evaluation of a novel antimicrobial polymer for the control of porcine post weaning colibacillosis. Aust. Vet. J. February 2000, vol. 78, no. 2, pages 117-120, the whole document АФИНОГЕНОВ Г.Е. и др. Антимикробные полимеры, из-во "Гиппократ", Санкт-Петербург, 1993, стр. 44-45, 176-177 RU 2079304 С1 RU 2185806 С1 Цитируемые документы
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000015165b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Способ лечения желудочно-кишечного заболевания, включающий использование полимерного антимикробного средства, содержащего производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), которое получено посредством реакции между поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислотой) и полиалкиленгликолем с формированием защищенных карбонильных групп. Изобретение касается также антимикробной композиции, содержащей указанное производное.


Формула

[0001] Применение полимера, содержащего производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), для производства лекарственного средства, которое вводится в желудочно-кишечный тракт, для лечения или профилактики желудочно-кишечного заболевания у животного, включая человека, в котором указанное производное получают посредством реакции поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) с полиалкиленгликолем при температуре от 40 до 150 °С в течение от 1 до 1400 ч с формированием защищенных карбонильных групп.

[0002] Применение по п.1, при котором лекарственное средство является пероральным.

[0003] Применение по п.1, при котором животное страдает по меньшей мере от одного желудочно-кишечного заболевания, выбранного из группы, состоящей из гастроэнтерита, язвы, диареи, рака желудочно-кишечного тракта и недостаточного набора массы тела, спровоцированного дизентерией.

[0004] Применение по п.1, при котором животное страдает по меньшей мере от одного из заболеваний, являющихся диареей, гастроэнтеритом и дизентерией.

[0005] Применение по п.1, при котором животное выбирают из группы, состоящей из собак, свиней, овец, лошадей, крупного рогатого скота, кошек, домашней птицы, уток, индеек и перепелок.

[0006] Применение по п.1, при котором животное выбрают из жвачных животных, а лекарственное средство является ректальным.

[0007] Применение по п.1, при котором животное выбирают из домашней птицы и свиней.

[0008] Применение по п.1, при котором животное представлено подросшей свиньей.

[0009] Применение по п.1, при котором заболевание желудочно-кишечного тракта представлено колибациллезом поросят, отнятых от свиноматки, а лекарственное средство является оральным.

[0010] Применение по п.1, при котором лекарственное средство вводят в дозе от 0,05 до 5000 мг/кг массы тела/день.

[0011] Применение по п.1, при котором лекарственное средство вводят в дозе от 0,5 до 500 мг/кг массы тела/день.

[0012] Применение по п.1, при котором поросятам вводят лекарственное средство в дозе, находящейся в интервале от 0,05 до 50 мг/кг массы тела/день.

[0013] Применение по п.1, при котором желудочно-кишечное заболевание вызвано по меньшей мере одним из микробов, выбранных из группы, состоящей из бактерий кишечной группы, сальмонелл, P. aeruginosa, Helicobacter, Proteus, энтеробактерий, дрожжей, простейших, клостридий, шигелл и кокцидий.

[0014] Применение по п.1, при котором органическое соединение содержит по меньшей мере одну гидроксильную группу, выбранную из алканолов, фенолов, полиолов и их смесей, а указанное заболевание является заболеванием желудочно-кишечного тракта, вызываемым инфекцией Helicobacter.

[0015] Применение по п.1, при котором желудочно-кишечное заболевание вызвано по меньшей мере одним из микроорганизмов, являющихся энтеротоксигенными Е. coli и β-гемолитическими Е. coli.

[0016] Применение по п.1, при котором заболевание желудочно-кишечного тракта представлено некротическим энтеритом у домашней птицы.

[0017] Применение по п.1, при котором заболевание желудочно-кишечного тракта представлено кокцидиозом у домашней птицы.

[0018] Применение по п.1, при котором производное содержит множество защищенных карбонильных групп, выбранных по меньшей мере из одной из гемиацетальных групп и ацетальных групп.

[0019] Применение по п.18, при котором защищенные карбонильные группы включают ацетальные группы.

[0020] Применение по п.1, при котором полиалкиленгликоль представлен полиэтиленгликолем молекулярной массы от 200 до 2000.

[0021] Антимикробная композиция в качестве кормовой или пищевой добавки или добавки в воду для питья, содержащая от 0,1 до 70 мас.% производного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), которое получено посредством реакции при температуре от 40 до 150 °С с образованием защищенных карбонильных групп.

[0022] Композиция по п.21, в которой антимикробное средство присутствует в количестве от 0,001 до 25 мас.% от общей массы композиции.

[0023] Антимикробная композиция по п.21, которая дополнительно содержит активное средство, выбранное из группы, состоящей из антимикробных средств и химиотерапевтических средств.


Полный текст патента

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение касается способов лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний и стимуляции роста животных и человека, а также включает антимикробные композиции для использования в данных способах лечения.

Предшествующий уровень техники

Антимикробные средства представляют собой соединения, которые убивают микроорганизмы, такие как бактерии. Антибиотики являются подгруппой антимикробных средств, которые, как правило, выделены из других микроорганизмов и действуют путем нарушения специфических механизмов в микроорганизме-мишени. Антибиотики впервые были использованы в 1940-1950-х годах, и с тех пор их применение расширилось. Развитие антибиотикоустойчивости стало серьезным и потенциально опасным для жизни явлением во всем мире. Некоторые штаммы Staphylococcus продемонстрировали устойчивость почти ко всем антибиотикам и вызывали смертельные инфекции в больницах. Другие организмы с лекарственной устойчивостью включают пневмококки, которые являются причиной пневмонии, а также Cryptosporidium и Е. coli, которые вызывают диарею.

Считают, что ускоренное развитие устойчивости в значительной мере обусловлено использованием антибиотиков в кормах для животных, в результате чего их применение взято под контроль во многих странах. Это привело к проблемам в разведении животных, выражающимся в трудности борьбы с заболеваниями и получения оптимальных скоростей роста. Данная проблема заслуживает особого внимания в свиноводстве и птицеводстве. Например, желудочно-кишечные заболевания, такие как колибациллез у свиней и кокцидиоз у птицы, наносят большой ущерб.

Melrose и соавт. в международной патентной публикации № 96/38186 первыми описали препарат на основе акролеиновых полимеров для применения при лечении желудочно-кишечного заболевания.

Данные полимеры, содержащие повторяющуюся субъединицу формулы

или данную субъединицу в гидратированной форме или в форме гемиацеталя или ацеталя, представленную формулой

где R - водород и n - целое число = 1 или более, были продемонстрированы ранее. В материалах, предшествующих данной заявке, биоцидные свойства акролеиновых полимеров при использовании в качестве антисептиков были описаны Melrose и соавт. в международной заявке № WO 88/04671. Немецкая патентная заявка Р4404404 и такие эквиваленты, как ЕР 667358 и AU 11686/95 (действие которой в настоящее время прекращено) раскрывают процесс, согласно которому акролеин полимеризуется в водной среде, содержащей гидроксид натрия. В описании указано, что полученный в результате полиакролеин растворяется в многоатомном спирте при 40-50 °С с образованием раствора полиакролеина в многоатомном спирте. Как объясняется ниже, уполномоченным поданной немецкой заявки впоследствии была обнаружена сомнительность таких полимеров и их низкая растворимость в водной среде.

Европейская публикация № 792895 Werle и соавт. (соответствующая US 6060571) касается полимеров, выделяющих акролеин, полученных путем сополимеризации акролеинового мономера и многоатомного спирта. Werle и соавт. обращают внимание на то, что полиакролеины, описанные в немецкой заявке № P4404404, сомнительны в том плане, что выход является более низким, чем желательно, и полимеры практически не растворимы в воде. В европейской заявке 792895 раскрывается возможность преодоления данных проблем путем образования полимера, выделяющего акролеин, сополимеризацией акролеинового мономера и мономера многоатомного спирта. Предложена следующая структура сополимера:

Хотя свободный акролеин действует как антимикробное средство, он вызывает раздражение глаз, легких, тканей и кожи. Для ряда вариантов использования, в особенности при лечении желудочно-кишечных заболеваний, существует необходимость в антимикробных средствах, которые стабильны, имеют высокую растворимость в воде и безопасны для применения. Кроме того, имеется потребность в эффективных антимикробных средствах для лечения или профилактики желудочно-кишечного заболевания, которые могут уменьшить склонность к развитию антибиотикоустойчивости.

Обсуждение предпосылок для создания изобретения введено в данном контексте с целью объяснения обстановки, сложившейся вокруг изобретения. Не следует считать правильным, что любой из приведенных материалов был опубликован, известен или являлся частью обычного общего знания на дату приоритета любого из пунктов формулы изобретения.

Сущность изобретения

Обнаружено, что активность и стабильность полимеров поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) при лечении или профилактике желудочно-кишечного заболевания значительно повышается при проведении реакции между данными полимерами и спиртом или многоатомным спиртом с образованием защищенных карбонильных групп, таких как производные ацеталей и/или гемиацеталей. Неожиданно было обнаружено, что активность производного при лечении или профилактике желудочно-кишечного заболевания значительно повышается, несмотря на то, что содержание свободного акролеина в полимере может быть чрезвычайно низким или пренебрежимым. Растворимость полимера в воде также является очень высокой.

В изобретении предложен способ лечения или профилактики желудочно-кишечного заболевания у животного или у человека, предусматривающий введение животному или человеку эффективного количества производного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), полученного посредством реакции между поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой) и органическим соединением, содержащим одну или более гидроксильных групп, таким как спирт, предпочтительно выбранный из алканолов, фенолов, полиолов и их смесей, с образованием защищенных карбонильных групп.

В другом аспекте изобретение представляет антимикробное средство для лечения желудочно-кишечного заболевания, содержащее производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), полученное путем реакции между поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой) и органическим соединением, содержащим одну или более гидроксильных групп, таким как спирт, предпочтительно выбранный из алканолов, фенолов, полиолов и их смесей, с образованием защищенных карбонильных групп.

Термин полиол, как используют в данном контексте, означает молекулу, содержащую по меньшей мере две гидроксильные группы.

Полученные производные, как правило, выбраны из производных гемиацеталей и ацеталей. Не желая связывать себя с какой-либо теорией, авторы полагают, что при реакции поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) со спиртом образуются гемиацетальные и/или ацетальные группы по меньшей мере из части боковых альдегидных групп, стабилизируя таким образом карбонильные группы полимеров в отношении щелочного разложения посредством реакции Канницаро. Обнаружено, что образование ацетальных групп в значительной мере снижает или прекращает выход свободного акролеина, неожиданно повышая при этом активность полученного производного.

В еще одном варианте осуществления в изобретении представлено применение вышеописанного антимикробного средства для приготовления лекарственного препарата для лечения или профилактики желудочно-кишечного заболевания.

В описании и пунктах формулы изобретения данной заявки слово "содержат" и варианты данного слова, такие как "содержащий" и "содержит", не предусматривает исключение других добавок, компонентов или чисел.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть получено путем нагревания поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) в присутствии спирта, предпочтительно полиола, такого как полиэтиленгликоль. В спиртах обязательно присутствует вода, и следует понимать, что наличие, по меньшей мере, небольшого количества воды способствует протеканию нуклеофильной реакции, приводящей в результате к образованию гемиацеталя или ацеталя.

Раствор, как правило, нагревают до температуры, лежащей в интервале от 40 до 150 °С, более предпочтительно от 40 до 115 °С и наиболее предпочтительно от 70 до 115 °С.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, получают из полимеров поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты). Данные полимеры и способ их получения описаны в международной патентной заявке No. WO 96/38186 (PCT/AU 96/00328), содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки. Предпочтительно, когда полимеры поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) получают путем полимеризации акролеина, предпочтительно в водном растворе посредством анионной полимеризации с последующим автоокислением. Полимеры содержат повторяющуюся субъединицу формулы (I) и по меньшей мере одну (и, как правило, смесь) гидратированных гемиацетальных и ацетальных форм.

Гидратированные гемиацетальные и ацетальные формы, полученные путем полимеризации акролеина, как известно, образуются из акролеина с помощью углерод-углеродных и углерод-кислородных механизмов полимеризации. Например, гидратированная форма, как правило, представляет собой гидратированную диольную форму, гемиацетальная или ацетальная форма может быть образована при конденсации диольной формы с альдегидной или диольной формой, тетрагидропирановая или слитая тетрагидропирановая форма может быть образована при конденсации диольной формы и самоконденсированной альдольной формы Михаэля. Типичные примеры данных форм представлены формулами (а)-(f) ниже

где R - водород и n - целое число от одного или более. Доля повторяющейся субъединицы формулы (I), как правило, составляет менее 20% и часто от 5 до 15%. Несмотря на относительно низкую долю данных субъединиц, обнаружено, что они оказывают значительное действие на стабильность полимера.

Поли(2-пропеналь, 2-пропеновая кислота) в основном будет содержать не более 10 мол.% мономерных субъединиц, представленных мономерами, отличными от акролеина, и более предпочтительно, когда она представляет собой гомополимер (перед автоокислением). Другие мономеры (в случае их использования) выбраны из группы, состоящей из акриловой кислоты и винилпирролидона. Группы 2-пропеновой кислоты, как правило, присутствуют в количестве от 0,1 до 5 моль карбоксильных групп/кг. Полимеры поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) обычно имеют среднюю молекулярную массу более 1000 и предпочтительно более 2000. Как правило, молекулярная масса не превышает 10000.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, представляет собой производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), полученное путем реакции со спиртом или фенолом с образованием защищенных карбонильных групп. Защищенные карбонильные группы образуются из групп 2-пропеналя, которые реагируют со спиртом с образованием гемиацетальных или ацетальных групп. Спирт предпочтительно представлен полиолом, что означает, что он предпочтительно содержит по меньшей мере две гидроксильные группы. Могут быть использованы алканолы, такие как С 1 10 -алканолы. В случае, когда спирт является полиолом, при реакции возможно получение ацеталей или гемиацеталей, образованных путем реакции одной или более чем одна спиртовых групп. Кроме того, когда происходит реакция двух спиртовых групп, они могут реагировать с одной и той же или различными карбонильными группами в составе полимера.

Что касается вышеприведенной формулы (I) и гемиацетальных и ацетальных форм, то в изобретении представлены производные, в которых меньше субъединиц формулы (I) и они образуют группу, где одна или более групп R происходят из спирта или, когда спирт является полиолом, более двух групп R могут вместе образовывать мостиковую группу, такую как циклическая ацетальная группа.

Вероятность образования полиолами внутренних циклических групп будет зависеть от пространственного расположения и конфигурации полиола. Предпочтительные спирты представлены полиалкиленгликолями, а более предпочтительные спирты - полиэтиленгликолями.

Молекулярная масса полиалкиленгликолей предпочтительно составляет от 200 до 2000 (более предпочтительно от 200 до 1000).

Предпочтительно, когда спирт, такой как полиэтиленгликоль, присутствует в процессе получения антимикробных полимеров в количестве между 50 и 99 мас.%. Особенно предпочтительными являются относительно разбавленные композиции акролеинового полимера, в которых спирт представлен полиолом, поскольку при разведении снижается степень межмолекулярного перекрестного связывания.

Более предпочтительно, когда при получении полимеров полиэтиленгликоль присутствует в количестве между 64 и 95 мас.%. Предпочтительно, когда к полимерам добавляют основание или щелочь с последующим смещением в сторону кислого рН перед и/или во время нагревания, поскольку происходит нейтрализация кислотных групп полимера, таким образом, повышают антимикробную активность полимеров. Предпочтительно, когда введение основания или щелочи изначально доводит рН полимеров поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) до 7-9. Еще более предпочтительным является, когда исходное значение рН при добавлении основания составляет приблизительно 8. Предпочтительным основанием является гидроксид щелочного металла, карбонат, бикарбонат или их смеси.

В еще одном варианте осуществления изобретения ингибируют выход свободного акролеинового мономера, блокируя непрерывный выход, при этом снижается вероятность того, что полимеры становятся источником раздражения ткани или кожи.

Обнаружено, что антимикробное средство, соответствующее изобретению, обладает значительно более высокой активностью при лечении желудочно-кишечного заболевания по сравнению с поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой), из которой он получен. Суперактивированное производное, соответствующее данному изобретению, может быть использовано для лечения широкого круга животных (или для лечения человека) и широкого круга микробных инфекций.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть использовано для лечения желудочно-кишечного заболевания у человека, однако особенно предпочтительной является возможность его применения для лечения животных, в частности животных, выбранных из группы, состоящей их собак, свиней, овец, лошадей, коз, крупного рогатого скота, кошек, хомячков, домашней птицы, уток, индеек и перепелок.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть приготовлено для перорального или ректального введения. Ректальное введение может быть особенно эффективным у жвачных животных. Пероральные препараты для жвачных животных также могут быть приготовлены с использованием энтеросолюбильных покрытий для обеспечения оптимальной активности в нижней части желудочно-кишечного тракта.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, особенно эффективно при лечении и профилактике желудочно-кишечных язв, диареи и желудочно-кишечных форм рака. Антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть также использовано для повышения скорости увеличения массы тела у сельскохозяйственных животных путем улучшения у животных превращения корма в массу тела.

Обнаружено, что антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть использовано как стимулятор роста и что полимер можно использовать вместо используемых в настоящее время антибиотиков. Лекарственная устойчивость патогенных бактерий представляет собой проблему большой клинической важности в медицине. Данная проблема усугубляется применением важных антибиотиков в кормах для животных с целью набора массы тела у сельскохозяйственных животных, в особенности у птицы и свиней. В самом деле, в некоторых странах Европы запрещено применение обычных антибиотиков в кормах для животных. Антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть использовано для лечения животных, чтобы значительно увеличить срок эффективного применения обычных антибиотиков при лечении человека.

Обнаружено, что антимикробное средство, соответствующее изобретению, эффективно против широкого круга микроорганизмов, включая простейших, грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии. Полимеры, соответствующие изобретению, содержат множество структур разнообразных конфигураций и можно найти их соответствие белкам, обнаруживаемым в клеточной стенке организмов-мишеней. Это ускоряет инактивацию белка и деструкцию клетки. Показано, что в отношении грамотрицательных бактерий антимикробное средство, соответствующее изобретению, особенно эффективно в плане проявления активности широкого спектра против бактерий кишечной группы или энтеробактерий. Оно особенно эффективно при лечении желудочно-кишечных заболеваний, обусловленных инфекцией Е. coli, такой как энтеротоксигенной Е. coli и β-гемолитической Е. coli. Колибациллез представляет собой заболевание, наносящее большой ущерб в свиноводстве. Заболевание в основном связано с пролиферацией β-гемолитической Е. coli в тонкой кишке после отъема от свиноматки. Оно приводит к высоким уровням заболеваемости и смертности среди молодых отнятых поросят. Инфицированные отнятые поросята не способны набрать нормальную массу тела.

Кокцидиоз представляет собой протозойное заболевание животных, в частности домашней птицы, и если его не контролировать, наносит большой ущерб. Обнаружено, что антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть использовано для лечения или профилактики кокцидиоза у птиц, в особенности у домашней птицы. У кур типичные клинические признаки кокцидиоза включают прекращение развития, быструю потерю массы тела, диарею и дизентерию. Наиболее серьезное действие заболевание оказывает на кишку, где простейшие обычно колонизируют слизистую оболочку и вызывают повреждения, поражения и кровотечения эпителия. Предпринимались попытки профилактики кокцидиоза с использованием вакцин, но они имеют побочные эффекты, включающие тенденцию к снижению массы тела и эффективности использования корма.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть использовано в комбинации с другими лекарственными веществами, которые, как известно, обладают активностью против кокцидиоза. Данные лекарственные вещества включают нитрокарбанилид, хинолин, пиридон, гуанидин, хиноксалин, толтразурал, толуамид, потенцированные сульфопрепараты и ионофор с карбанидидом.

Клостридии и грамотрицательные бактерии вызывают серьезные заболевания у ряда животных. Например, некротический энтерит является заболеванием, которое, как известно, поражает промышленную птицу. Бактерии из группы клостридии продуцируют экзотоксины, которые являются одними из наиболее токсичных из всех известных токсинов. Некротический энтерит особенно поражает бройлеров с возрасте между 14 и 42 сутками. Состояние вызывает выраженную вялость, диарею и может привести к гибели в течение нескольких часов.

Заболевание верхних отделов желудочно-кишечного тракта, включая хронический гастрит, язву желудка и язву двенадцатиперстной кишки, представляют собой важные проблемы здоровья человека. Считают, что Helicobacter является причиной развития язв и возникновения желудочно-кишечных форм рака, в частности аденокарциномы желудка. Обнаружено, что антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть особенно эффективно против Helicobacter, включая Н. pylori, при желудочно-кишечном заболевании у животных или у человека.

Инфекция желудка Helicobacter pylori является одним из наиболее часто встречающихся инфекционных заболеваний в мире. Приблизительно 50% населения инфицировано Н. pylori. По приблизительной оценке в развивающихся странах более 80% населения инфицируется Н. pylori уже в детстве.

Helicobacter pylori представляет собой грамотрицательную микроаэрофильную спиральную бациллу, которая движется с помощью жгутиков, расположенных на одном конце клетки. Стандартным лечением инфекций Н. pylori является так называемая тройная антибиотикотерапия, все компоненты которой включают либо метронидазол, либо кларитромицин. К сожалению, появились штаммы Н. pylori, устойчивые к обоим данным антибиотикам.

Н. pylori обитает в желудке на границе между поверхностью эпителиальных клеток желудка и покрывающим их слоем гелеобразной слизи. Кроме того, Н. pylori можно обнаружить в верхней части желудочного эпителия двенадцатиперстной кишки и пищевода. У других видов животных имеются их собственные уникальные виды Helicobacter, присутствующие в их желудочно-кишечном тракте, которые обладают свойствами, близкими Н. pylori. Кроме ассоциации с желудочно-кишечными формами рака Н. pylori у человека был непосредственно связан с гастритом и образованием пептической язвы.

Виды Helicobacter в общем и Н. pylori, в частности, выживают в экстремальных условиях желудка за счет секреции уреазы, которая гидролизует мочевину с образованием аммония и иона бикарбоната, повышая таким образом рН среды, непосредственно окружающей бациллы. Это локальное изменение условий защищает бактерии от бактерицидного эффекта желудочной кислоты. Предпочтительная локализация подзащитным слоем слизи желудка также дает преимущество в плане выживаемости, а подвижность позволяет бактерии проникать через указанный слой, чтобы достигнуть данного положения.

Через эпителиальные клетки, выстилающие желудок, трудно проникнуть естественным путем. Частью их функции является защита остального организма от желудочной кислоты и пищеварительного сока. Эта сложность проникновения также затрудняет для естественных факторов защиты организма прохождение через стенку желудка и достижение области инфекции Н. pylori. Это явление имеет два последствия: то, что организм направляет больше питательных веществ в данную область для помощи белым клеткам крови, Т-клеткам и другим механизмам защиты, одновременно снабжая бациллы, и то, что защитные клетки в конечном счете погибают, выделяя свой груз ионов супероксида и других летальных химических агентов, которые повреждают окружающие эпителиальные клетки.

Очевидно, что это именно та активность, которая приводит к гастриту, легко переходящему в пептические язвы. При продолжении повреждающего действия вероятность возникновения аденокарциномы желудка и лимфомы, ассоциированной со слизистой оболочкой лимфоидной ткани (MALT), значительно возрастает. Аденокарцинома желудка зарождается в слизистой оболочке, и первая стадия ее развития, кишечная метаплазия, представляет собой ответ желудка, направленный на самоэлиминацию инфекции Н. pylori. Кроме того, исследования, проведенные в UCL Medical School (на медицинском факультете Калифорнийского университета в Лос-Анжелесе), показали, что для роста лимфомы MALT требуется поддержка Н. pylori-специфических Т-клеток. Борьба с инфекцией Н. pylori, как было показано, является чрезвычайно эффективной при лечении лимфомы MALT. Всемирная Организация здравоохранения отнесла данный патоген к канцерогенам группы I.

В соответствии с этим данное изобретение представляет также способ лечения или профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызываемых инфекцией Helicobacter, который предусматривает желудочно-кишечное введение терапевтического количества средства, содержащего производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), полученное путем реакции между поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой) и органическим соединением, содержащим гидроксильные группы, выбранное из алканолов, фенолов, полиолов и их смесей, с образованием защищенных карбонильных групп. Термин полиол, как используют в данном контексте, означает соединение, содержащее по меньшей мере две гидроксильные группы. Полученные производные, как правило, выбраны из гемиацетальных и ацетальных производных.

Следовательно, применение способа, соответствующего данному изобретению, представляет альтернативу применения хирургического вмешательства, радиотерапии или традиционной химиотерапии при лечении желудочно-кишечных форм рака.

Кроме того, в изобретении представлен способ лечения желудочно-кишечной инфекции бактерий видов Helicobacter, таких как гастрит, язва желудка, язва двенадцатиперстной кишки, злокачественного лимфомы желудка или рака желудка, который предусматривает желудочно-кишечное введение терапевтически эффективного количества средства, содержащего производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), полученное путем реакции между поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой) и органическим соединением, содержащим гидроксильные группы, выбранное из алканолов, фенолов, полиолов и их смесей, с образованием защищенных карбонильных групп.

Данное изобретение представляет альтернативу стандартным способам лечения инфекций Helicobacter, которые в основном предусматривают так называемую тройную антибиотикотерапию, все компоненты которой включают либо метронидазол, либо кларитромицин. Появились штаммы Н. pylori, устойчивые к обоим данным антибиотикам, и было показано, что способ, соответствующий данному изобретению, позволяет эффективно лечить такие антибиотикоустойчивые бактерии.

Было показано, что средство, которое представляет собой продукт реакции между поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой) и органическим соединением, содержащим одну или более гидроксильных групп, является более эффективным при лечении инфекций Helicobacter, чем соответствующие несуперактивированные группы поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты).

Далее изобретение представляет применение производного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) для приготовления лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания, вызываемого инфекцией Helicobacter.

Способ, соответствующий данному изобретению, может быть использован для лечения или профилактики желудочно-кишечных форм рака. Данные формы могут включать, например, рак пищевода, желудка, тонкой кишки и толстой кишки. Примером данного типа рака является клеточная линия рака толстой кишки человека НТ-29.

Введение антимикробного средства, соответствующего изобретению, в корм или воду для животного может быть осуществлено обычным путем. В предпочтительном варианте изобретения антимикробное средство, соответствующее изобретению, вводят в премикс. Премикс предпочтительно будет содержать антимикробное средство, физиологически приемлемый носитель и (необязательно) кормовой продукт. Премикс, как правило, находится в относительно концентрированной форме и адаптирован для разбавления другим материалом, таким как один или более других носителей, витамины, минеральные добавки и кормовые продукты с целью получения конечного корма для животных. Предпочтительно, когда премикс включает антимикробное средство в концентрации, находящейся в диапазоне от 0,1 до 70 мас.%, предпочтительно 0,5-50 мас.%. Оптимальная концентрация будет зависеть от того, является ли обработка профилактической или предпринимается с целью регуляции и излечения и является ли антимикробное средство, соответствующее изобретению, единственным активным ингредиентом или его используют в сопутствующей терапии в сочетании с другими материалами или антимикробными средствами.

В предпочтительном варианте осуществления концентрированная композиция антимикробного средства находится в форме с контролируемым высвобождением. Форма с контролируемым высвобождением будет включать антимикробное средство и полимерный материал для обеспечения контролируемого высвобождения антимикробного средства из системы с контролируемым высвобождением. Данная форма особенно эффективна в композициях для добавления к твердому кормовому материалу. В результате применения препарата с контролируемым высвобождением выход антимикробного средства может быть задержан таким образом, чтобы он в основном происходил в двенадцатиперстной кишке. Полимер, обеспечивающий контролируемое высвобождение, может также снижать до минимума неприятие композиции из-за ее вкуса или может быть использован для ректальных суппозиториев.

Антимикробная композиция, соответствующая данному изобретению, может быть в форме гранул, пилюль или представлять собой твердую композицию. Гранулы, содержащие антимикробное средство, соответствующее изобретению, можно приготовить с использованием следующих стадий:

(i) растворение указанного антимикробного средства в водном щелочном или основном растворе;

(ii) нейтрализация указанного раствора кислотой;

(iii) добавление к указанному нейтрализованному раствору нерастворимых перекрестно-сшитых впитывающих полимеров акриловой кислоты и/или сополимеров акриламида и акриловой кислоты с образованием влажных набухших гранул и

(iv) необязательная полная или частичная сушка указанных влажных набухших гранул.

Образованные таким образом влажные набухшие гранулы могут быть использованы либо во влажном виде, либо частично высушенными или полностью высушенными как добавка, например, в корм животного. Кроме того, данная система разработана таким образом, что карбоксилсодержащие группы наружного полимерного носителя обеспечивают, чтобы целевые полимеры в основном оставались в носителе при нахождении в кислой среде желудка. Однако в щелочной среде двенадцатиперстной кишки происходит ионизация и взаимное отталкивание карбоксильных групп носителя, и гранула быстро набухает, позволяя целевым полимерам с помощью отталкивания, возникающего среди его собственных ионных групп, высвободиться посредством процессов диффузии с приблизительным соответствием скорости прохождения корма через двенадцатиперстную кишку.

В данном изобретении термин "система с контролируемым высвобождением" используется в том же контексте и включает тот же круг примеров, который приведен в монографии "Контролируемая доставка лекарственных веществ" ("Controlled Drug Delivery") (Robinson и Lee, 1987). Полимер акриловой кислоты или сополимер акриламида и акриловой кислоты могут быть заменены многими другими рН-чувствительными системами с контролируемым высвобождением, которые известны в области техники (см. Robinson и Lee, 1987). Например, растворимые и анионные или нерастворимые перекрестно-сшитые и анионные целлюлозные системы или растворимые и анионные или нерастворимые перекрестно-сшитые и анионные полимеры, полученные из любого полимера из группы акриловой кислоты и/или ее производных. Данные перекрестно-сшитые и нерастворимые полимеры являются предпочтительными, поскольку они набухают, а также с меньшей вероятностью метаболизируются.

Предпочтительно, когда система с контролируемым высвобождением содержит рН-чувствительную перекрестно-сшитую впитывающую воду гранулу, которая во влажном виде представляет собой гель.

В изобретении представлена также композиция корма для животных, содержащая антимикробное средство, соответствующее изобретению, и кормовой продукт. Антимикробное средство предпочтительно присутствует в количестве от 0,0001 до 25% от общей композиции корма и предпочтительно от 0,0001 до 5% от общей композиции корма.

В другом предпочтительном варианте осуществления антимикробное средство, соответствующее изобретению, может быть приготовлено для добавления в питьевую воду для животных.

Антимикробное средство, соответствующее изобретению, предпочтительно вводят в количествах от 0,05 до 5000 мг/кг массы тела/день, более предпочтительно от 0,05 до 50 мг/кг массы тела/день.

Примеры подходящих инертных носителей для применения в композициях для введения антимикробного средства, соответствующего изобретению, включают воду, оливковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, масло земляного ореха, кокосовое масло, жидкий парафин, этиленгликоль, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, этанол, пропанол, изопропанол, глицерин, жирные спирты, триглицериды, поливиниловый спирт, частично гидролизованный поливинилацетат и их смеси.

Твердые формы для перорального или ректального введения могут содержать фармацевтически или ветеринарно приемлемые связующие агенты, подсластители, дезинтегрирующие агенты, разбавители, вкусовые добавки, покрывающие агенты, консерванты, лубриканты и/или агенты, задерживающие время действия. Подходящие связующие агенты включают гуммиарабик, желатин, кукурузный крахмал, камедь трагаканта, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу или полиэтиленгликоль. Подходящие подсластители включают сахарозу, лактозу, глюкозу или флавоноидные гликозиды, такие как дигидрохалькон неогесперидина. Подходящие дезинтегрирующие агенты включают кукурузный крахмал, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, ксантановую камедь, бентонит, альгиновую кислоту или агар. Подходящие разбавители включают лактозу, сорбит, маннит, декстрозу, каолин, целлюлозу, карбонат кальция, силикат кальция или дикальцийфосфат. Подходящие вкусовые добавки включают масло перечной мяты, масло грушанки, добавки со вкусом вишни, апельсина или малины. Подходящие покрывающие агенты включают полимеры или сополимеры акриловой кислоты и/или метакриловой кислоты, и/или их сложные эфиры, и/или их амиды, воска, жирные спирты, зеин, шеллак или глютен. Подходящие консерванты включают бензоат натрия, витамин Е, α-токоферол, аскорбиновую кислоту, метилпарабены, пропилпарабены или бисульфит натрия. Подходящие скользящие вещества включают стеарат магния, стеариновую кислоту, олеат натрия, хлорид натрия или тальк. Подходящие агенты, задерживающие время действия, включают глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Кроме того, суспензии для перорального или ректального применения могут содержать диспергирующие и/или суспендирующие агенты. Подходящие суспендирующие агенты включают карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, альгинат натрия или цетиловый спирт. Подходящие диспергирующие агенты включают лецитин, сложные эфиры полиоксиэтилена или жирные кислоты, такие как стеариновая кислота, моно- или диолеат, стеарат или лаурат полиоксиэтиленсорбитана и т.п.

Композиция антимикробного средства может, кроме того, содержать один или более эмульгирующих агентов. Подходящие эмульгирующие агенты включают диспергирующие агенты, примеры которых приведены выше, или природные камеди, такие как гуммиарабик или камедь трагаканта.

Композиции для введения в способе, соответствующем изобретению, могут быть приготовлены с помощью средств, известных в области приготовления композиций (таких как в области ветеринарных и фармацевтических композиций), включая перемешивание, измельчение, гомогенизацию, суспендирование, растворение, эмульгирование, диспергирование и, когда это подходит, смешивание целевых полимеров с выбранными наполнителями, разбавителями, носителями и адъювантами.

Фармацевтическая или ветеринарная композиция, предназначенная для перорального введения, может быть в форме таблеток, лепешек, пилюль, пастилок, капсул, эликсиров, порошков, включая лиофилизированные порошки, растворов, гранул, суспензий, эмульсий, сиропов и тинктур. Могут быть также приготовлены формы с замедленным или задержанным высвобождением, например, в форме частиц с покрытием, многослойных таблеток или микрогранул.

В общем предпочтительно, когда поли(2-пропеналь, 2-пропеновую кислоту) получают из поли(2-пропеналя) путем окисления твердого вещества на воздухе. Полимер поли(2-пропеналя) можно сначала нагреть преимущественно в сухом состоянии до температуры между 80 и 110 °С. Более предпочтительно, когда полимер сначала нагревают до температуры приблизительно 85 °С. Предпочтительно, когда поли(2-пропеналь, 2-пропеновую кислоту) нагревают в спирте в течение периода времени в интервале от 1 до 1400 ч и более предпочтительно в течение от 1 до 60 ч.

Согласно данному изобретению далее представлено консервирующее соединение или композиция, содержащие антимикробное средство, соответствующее изобретению.

В соответствии с данным изобретением, кроме того, представлено еще дезинфицирующее или антисептическое соединение или композиция, содержащие антимикробное средство, соответствующее изобретению.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предложена композиция для лечения желудочно-кишечного заболевания, содержащая антимикробный полимер, как описано выше в данном контексте, и дополнительное химиотерапевтическое средство, где дополнительное химиотерапевтическое средство адсорбировано на антимикробном средстве.

Адсорбция, как правило, будет снижать проникновение через мембрану дополнительного химиотерапевтического средства. Пригодные для применения в данном варианте осуществления химиотерапевтические средства представлены агентами, которые проявляют значительное снижение проникновения через мембраны при смешивании с полимерным антимикробным средством. Предпочтительно, когда происходит ингибирование фактором проникновения по меньшей мере на 50%.

Эффективные химиотерапевтические средства для применения в данном аспекте изобретения включают антибиотики для лечения желудочно-кишечного заболевания и противораковые средства для лечения желудочно-кишечных форм рака.

Применение химиотерапевтических средств в комбинации с полимерным антимикробным средством снижает проникновение через мембраны, уменьшая, таким образом, системные побочные эффекты и обеспечивая более направленную терапию. Во многих случаях уменьшается также запах.

Примеры химиотерапевтических средств для лечения желудочно-кишечного заболевания включают антибиотики и противораковые средства.

Примеры антибиотиков, которые могут быть использованы в комбинации с антимикробным полимером, включают тетрациклины, пенициллины, аминогликозиды, сульфопрепараты, цефалоспорины и нитрофураны.

Антибиотики могут быть представлены обычными антибиотиками, используемыми для лечения инфекций желудочно-кишечного тракта.

Примерами противораковых средств, которые могут быть использованы в комбинации с полимерным антимикробным средством, соответствующим изобретению, являются алкилирующие агенты, антиметаболиты, противораковые антибиотики, растительные алкалоиды, гормоны и другие противораковые средства, содержащие только углерод, водород и кислород.

Композиции, соответствующие изобретению, могут также содержать один или более дополнительных антимикробных средств, таких как выбранные из группы фенола (предпочтительно в количестве от 0,1 до 10 мас.%), изотиазолинона (предпочтительно в количестве от 0,001 до 1 мас.%), алкилпарабенов (предпочтительно в количестве от 0,02 до 2 мас.%) и низшего спирта (предпочтительно в количестве от 20 до 99 мас.%), где количества приведены на основе соотношения массы к массе композиции.

Обнаружено, что производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), используемое в способе, соответствующем изобретению, обладает в значительной мере повышенной стабильностью по сравнению с полимерами поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты). Поскольку в предшествующем уровне техники зарегистрирована некоторая нестабильность поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), что следует из данных о потере антимикробной активности ее композиций, было проведено "ускоренное старение" при повышенной температуре, т.е. при 40 °С. Однако к большому удивлению повышенная до 40 °С температура "старения" поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) в водном растворе и водном растворе, содержащем полиэтиленгликоль, не только не замедляла снижение антимикробной активности, но в действительности, как ни странно, повышала антимикробную активность поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), см. пример 2(а) и (b). Данные результаты полностью противоположны и неожиданны в свете предшествующего уровня техники, который предсказывает, что повышение температуры должно приводить к "ускоренному старению", т.е. ускоренной потере антимикробной активности.

В данном контексте процесс получения повышенной антимикробной активности путем образования новой конфигурации целевых полимеров, включающих поли(2-пропеналь, 2-пропеновую кислоту), называют "суперактивацией", а полимеры называют "суперактивированными полимерами".

В свете предшествующего уровня техники еще более удивительно обнаружение того факта, что основные условия среды, которые затем заменяют кислыми, способствуют суперактивации в водном растворе полиэтиленгликоля. Нагревание и влажность также способствуют суперактивации.

Присутствие полиэтиленгликолей или полиолов или алканолов облегчает суперактивацию, поскольку, как полагают, присутствие полиэтиленгликоля или полиола или алканола за счет образования ацеталей защищает и стабилизирует карбонильные группы полимеров от щелочной деградации посредством реакции Канниццаро.

Дополнительное преимущество суперактивации состоит в том, что она снижает или устраняет примеси акролеина, который представляет собой источник раздражения ткани или кожи.

Следует подчеркнуть, что суперактивация является совершенно отдельным и дополнительным фактором относительно любого повышения антимикробной активности, которое может быть обусловлено простым повышением доступности полимера в любой водной тест-среде в результате увеличения гидрофильности полимера, как показано в австралийской патентной заявке AU-А-11686/95, действие которой в настоящее время прекращено (в дальнейшем 11686/95). Авторы точно воспроизвели способ, описанный в 11686/95, и тогда после этого обнаружили, что последующая суперактивация частично растворимого полимера явно приводит к появлению дополнительной значительной антимикробной активности. Следует отметить, что даже суперактивация не делает полимер, представленный в 11686/95, полностью растворимым в отличие от суперактивации, происходящей у полимера, нагретого сначала до 80-85 °С.

Оптимальное время суперактивации растворов поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) находится в обратно пропорциональной зависимости от температуры. Будет очевидно, что даже старение при комнатной температуре может быть использовано для суперактивации, в особенности, когда ему способствует присутствие гидроксильного растворителя и/или основания с последующим подкислением, но это может быть непригодным для применения, поскольку требует более длительных периодов времени.

Обнаружено, что полимеры, суперактивированные, как описано в данном контексте, пригодны для применения в желудочно-кишечной терапии в качестве консервантов для продуктов или процессов на водной основе и активных ингредиентов дезинфицирующих средств или антисептиков, обладающих преимуществом в виде повышенной антимикробной активности. Более того, показано, что антимикробная активность данных дезинфицирующих средств или антисептиков возрастает с повышением их рН, например более рН 6.

Общим признаком изобретения является присоединение к антимикробному средству, соответствующему изобретению, группы, способной к гидрофобному взаимодействию, посредством образования гемиацеталя/ацеталя или путем адсорбции с целью повышения антимикробной активности.

Теперь изобретение будет описано посредством ряда примеров, которые не должны быть истолкованы, как ограничивающие его объем.

Тест на биоцидную активность

Образец растворяют в 1 мас.% водном растворе бикарбоната натрия с целью получения необходимой концентрации (если не определено иначе, 0,125% от массы полимера). 19,9 г разведенного образца взвешивают в стерильный сосуд, инокулируют 0,1 мл 10 7 -10 8 КОЕ (колониеобразующих единиц) Ps. aeruginosa и перемешивают. Через определенные интервалы времени 1 мл инокулированного образца переносят в 9 мл и бульона Letheen и взбалтывают. На чашки помещают десятикратные серийные разведения и заливают их триптиказным соевым агаром. Инкубируют 3 суток при 37 °С.

Пример 1.

В примере описан способ получения поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) путем окисления твердого акролеинового полимера на воздухе. Данный способ получения поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) является предпочтительным для получения исходного материала для применения в способе, соответствующем изобретению. Воду (720 мл при комнатной температуре, приблизительно 20 °С) и акролеин (60 г; свежеперегнанный с добавлением 0,25 мас.% гидрохинона) вносят в открытый химический стакан в вытяжном шкафу и очень интенсивно механически перемешивают. Затем добавляют 0,2М водного раствора гидроксида натрия (21,4 мл) для того, чтобы подвести рН до 10,5-11,0.

Раствор сразу делается желтым, типичным для аниона гидрохинона, в течение минуты окрашивание исчезает и прозрачный раствор становится мутным.

Приблизительно через 1 мин начинается осаждение белого хлопьевидного полимера, которое заканчивается через 15-30 мин. Осадок отфильтровывают и промывают водой (250 мл), затем распределяют тонким слоем в стеклянных чашках Петри и нагревают при 40 °С в течение 8 ч. Данное нагревание продолжают в следующем режиме: 50 °С/15 ч; 65 °С/4 ч; 75 °С/18 ч; 84 °С/24 ч.

Предусматривают, что данный способ может быть масштабирован путем включения, например, постадийного добавления акролеина, реализации в закрытой емкости и с последующей ускоренной сушкой (ср. с примером 10).

Как правило, раствор конечного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) готовят посредством добавления 2 г целевого полимера при перемешивании в течение 15-30 мин к 1% (мас./мас.) водному раствору карбоната кальция (100 мл), а затем разводят, как требуется. Данные растворы абсолютно прозрачны в противоположность полученным при попытке растворения с альтернативным использованием полимера, полученного в примере 5 11686/95.

Пример 2.

В данном примере описано образование ацеталя из поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты).

(a) 5 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) растворяют в 64 г полиэтиленгликоля (ПЭГ) 200 и смешивают с 31 г 0,71% (мас./мас.) раствора карбоната натрия. Часть раствора с рН приблизительно 5,8 оставляют при комнатной температуре, тогда как

(b) оставшийся после отделения части (а) образец нагревают при 60 °С в течение 12 или 25 дней.

Образцы из (а) и (b) разводят 1% (мас./мас.) бикарбонатом натрия и подвергают тестированию на биоцидную активность при концентрациях полимера 0,125% (мас./мас.). Неожиданно образцы, подвергнутые "ускоренному хранению", демонстрируют улучшенную антимикробную активность, как можно видеть из табл. 1.

Таблица 1

* Колониеобразующие единицы/мл

1 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) растворяют в 200 мл 0,1% (мас./мас.) Na 2 CO 3 и оставляют на ночь. Лаурилсульфат натрия вводят на уровне 0,05% (мас./мас.) и подкисляют раствор HCl до рН 5,9. Части раствора хранят как при комнатной температуре, так и при 60 °С. Тесты на биоцидную активность проводят с 0,125% (мас./мас.) растворами полимера при использовании 1% (мас./мас.) NaHCO 3 в качестве разбавителя. "Состаренный" образец демонстрирует неожиданное повышение активности, как можно видеть из табл. 2.

Таблица 2

* Колониеобразующие единицы/мл

(с) 5% (мас./мас.) раствор суперактивированного полимера готовят, как в примере (2а), но ПЭГ 200 заменяют ПЭГ 1000. Часть данного раствора обрабатывают концентрированным NaOH до получения рН 8,1. Образцы нагревают при 60 °С и проводят тестирование на биоцидную активность. Образец, помещенный в более основные условия, неожиданно дает повышенную биоцидную активность, как можно видеть из табл. 3.

Таблица 3

* Колониеобразующие единицы/мл

Пример 3.

В данном примере проводят исследование продукта, полученного при реакции поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) с полиэтиленгликолем.

Присутствие ацеталей в полимерах, полученных в примере 2(b), можно определить путем исследования твердого остатка, образующегося при диализе и концентрировании раствора полимера, с использованием протонной ( 1 Н) и углеродной ( 13 С) ЯМР-спектроскопии. При диализе удаляют весь материал с молекулярной массой менее 1000. В табл. 4 представлены результаты протонной ( 1 Н) и углеродной ( 13 С) ЯМР-спектроскопии. Как видно из табл. 4, спектроскопия ядерного магнитного резонанса остатка демонстрирует пики при δ 3,58 и 3,56 в 1 Н-спектре ядерного магнитного резонанса и δ 71,62, 69,48 и 60,25 в 13 С-спектре ядерного магнитного резонанса. Данные пики указывают на присоединение субъединиц полиэтиленгликоля как ацеталей.

Таблица 4Данные 600 МГц 1Н- и 125 МГц 13С-спектров ядерного магнитного резонанса D2O с 1% (мас./мас.) Na2CO3 твердого остатка суперактивированного полимера после диализа и концентрирования

Пример 4.

(а) 5% (мас./мас.) растворы полимеров в интервале степеней суперактивации со средним рН 5,7 готовят аналогично примеру 2(a), но варьируя процент содержания ПЭГ 200.

Образцы нагревают при 60 °С и мониторируют их стабильность во времени. Нарушением физической стабильности считают появление осадка или образование геля. Измерения УФ-спектра проводят при концентрации полимера 0,01% (мас./мас.) в 1% (мас./мас.) растворе карбоната натрия. Снижение соотношения поглощения при длине волны 268 и 230 нм считают аналогичным снижению химической стабильности. Результаты представлены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты как по физическим характеристикам, так и по УФ-спектрам демонстрируют положительный эффект ПЭГ на стабильность; более высокое содержание ПЭГ приводит в результате к более высокой физической и химической стабильности.

(b) Следующие растворы А и В готовят путем растворения 4 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) в 196 г 1% (мас./мас.) бикарбоната натрия и подведения рН до 7 (для А) и 5,5 (для В) разбавленной HCl. Раствор С готовят путем растворения 50 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) в ПЭГ 200 (640 г) при 65-70 °С. Затем добавляют раствор 4 г карбоната натрия в воде (306 г). При этом средний рН составляет 7, а затем, в конце периода обработки (31 день), 5,5.

Все образцы хранят при 40 °С. Через различные интервалы времени образцы, содержащие эквивалент 0,125% (мас./мас.) полимера, подвергают тестированию на биоцидную активность. Результаты приводят в табл. 6.

Таблица 6

Пример 5.

1 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) нагревают в сухой или влажной закрытой камере, в обоих случаях при 60 °С в течение 3 дней. Растворы сухого полимера и увлажненного полимера, соответственно, готовят в концентрации 0,125% (мас./мас.) (с поправкой на содержание влаги) и оценивают с помощью теста на биоцидную активность.

Таблица 7

* Колониеобразующие единицы/мл

Полимеры демонстрируют поглощение, соответствующее карбонилу и/или карбоксилу в ИК-спектре при длине волны 1700-1730 см -1 , карбонильные группы (например, с использованием реагента Шиффа) и имеют Mw (средневесовую молекулярную массу) = прибл. 10000 и Mn (среднечисленную молекулярную массу) = прибл. 5000; титрование указывает на наличие карбоксильных групп прибл. 5 мол.%. Данные параметры близки (не одинаковы) параметрам поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты).

Пример 6.

В повторных экспериментах готовят образец полимера и затем растворяют его в этандиоле точно, как описано в примере 5 11686/95. Далее половину данного материала нагревают при 80 °С в течение 24 ч (после чего растворимость в водной среде остается неполной). Образцы сравнивают по антимикробной активности с использованием стандартного теста биоцидной активности. Оба образца, обработанные нагреванием, т.е. суперактивацией, демонстрируют явное повышение антимикробной активности, как показано в табл. 8.

Таблица 8

* Колониеобразующие единицы/мл

Пример 7.

50 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) растворяют в ПЭГ 200 (640 г) при температуре 65-70 °С. Затем добавляют водный раствор карбоната натрия (4 г) в воде (306 г). Образец делят и части либо оставляют при комнатной температуре, либо нагревают при 80 °С в течение 24 ч. Содержание акролеина в растворе определяют через определенное время с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с обращенной фазой. Результаты приведены в табл. 9.

Таблица 9

Пример 8.

Растворы поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) готовят, как в примере 7, и подвергают температурной обработке при 40, 60, 80, 100 и 115 °С в течение различных периодов времени. Образцы подвергают стандартному тесту на биоцидную активность с целью подтверждения повышения скорости уничтожения. Результаты приводят в табл. 10.

Таблица 10

Как видно, количество времени, необходимое для суперактивации, обратно пропорционально температуре. Все растворы полимеров, полученные в процессе суперактивации, полностью смешиваются во всех пропорциях с водными растворителями.

Пример 9.

(а) 540 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) растворяют в 2304 г ПЭГ 200 при 65 °С перед смешиванием с раствором 43,2 г карбоната натрия в 712 г воды. Затем раствор нагревают до 100 °С в течение 4 ч и добавляют 36 г лаурилсульфата натрия, 7 г ECOTERIC T20 (неионный детергент) и 2 г лимонной отдушки. Состав, имеющий рН 6, разводят 1:30 жесткой водой и проверяют активность в отношении Staphylococcus aureus (грамположительной бактерии, имеющей особое значение в плане госпитальных инфекций) и Salmonella cholerae suis (грамотрицательной бактерии, имеющей особое значение в плане инфекций в области приготовления пищевых продуктов), используя руководство "Официально принятые методы анализа ассоциации химиков, работающих в сельском хозяйстве (Association of Agricultural Chemists Official Methods of Analysis) (1995) 991.47 и 991.48 соответственно (тест-метод с использованием носителя с твердой поверхностью) (Hard Surface Carrier Test Method). Результаты приведены в табл. 11.

Таблица 11

Подведение данного состава до более высоких значений рН повышает антимикробную активность, как видно по результатам мониторинга с помощью теста на биоцидную активность. Результаты приведены в табл. 12(a) и 12(b).

Таблица 12(а)Активность в отношении Staphylococcus aureusИсходное число, 3 ×106 КОЕ/мл; полимер 350 млн-1

Таблица 12(b)Активность в отношении Pseudomonas aeruginosaИсходное число 3,7 ×106 КОЕ/мл; полимер 350 млн-1

(b) 1200 г поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) растворяют в 7680 г ПЭГ 200 при 60 °С, а затем добавляют раствор 96 г Na 2 CO 3 в 3024 г воды. Раствор нагревают при 100 °С в течение 6 ч.

Состав вводят в резервуар башенного охладителя с отсасывающим вентилятором до получения концентрации 300 млн -1 (30 млн -1 полимера) 3 раза в неделю. Дозирование проводят вечером для обеспечения времени контактирования 8-12 ч до возобновления операции, остаточная концентрация, как ожидают, уменьшается вдвое каждые 3-6 ч проведения операции. Циркулирующая в замкнутом цикле вода в среднем имеет температуру 27 °С, рН 8,5, проводимость μS. Микробные числа ежедневно определяют и сравнивают с данными по соседнему, идентичному башенному охладителю, в который вводят биодиспергирующий агент. Результаты представлены в табл. 13.

Таблица 13

* Колониеобразующие единицы/мл

Данные показывают, что программа обработки поддерживает микробные числа в рамках, рекомендуемых Стандартом AS/NZ 3666.3(lnt):1998, и они ниже, чем в соседнем башенном охладителе, содержащем биодиспергирующий агент (который, как показано, совершенно не соответствует требованиям в условиях очень жаркого летнего периода тестирования).

Пример 10.

10(а). Сравнительный пример.

В данном примере демонстрируют способ получения акролеинового полимера без использования способа, соответствующего изобретению.

1.0. 0,8% (мас./мас.) гидроксид натрия

9,90 кг деионизированной воды наливают в бак из нержавеющей стали объемом 10 л, добавляют в воду 0,08 кг гидроксида натрия и перемешивают для растворения.

2.0. Полимеризация

100,1 кг деионизированной воды наливают в бак из нержавеющей стали объемом 200 л и добавляют в бак объемом 200 л 4,99 кг 0,8% (мас./мас.) раствора гидроксида натрия. Раствор уравновешивают при 15-20 °С. Одновременно в бак объемом 200 л добавляют 20 кг акролеинового мономера и оставшийся 0,8% (мас./мас.) раствор гидроксида натрия со скоростью 1 ч, так что значение рН остается на уровне 10,5-11,0, а температура не поднимается выше 30 °С. Полимеризацию продолжают еще в течение 90 мин.

3.0. Промывание

Полимеризационную смесь фильтруют/центрифугируют и промывают полимер деионизированной водой, пока рН промывной воды не станет меньше 7,0. Приблизительный выход составляет 8 кг.

4.0. Сушка

Полимер сушат на воздухе, затем нагревают в печи с использованием следующей программы.

Растворение.

400 л воды наливают в бак объемом 500 л, добавляют 4 кг карбоната натрия и перемешивают до растворения. Медленно добавляют 8 кг сухого нагретого полимера и перемешивают в течение 30 мин.

Показано, что полученный в результате полимер имеет растворимость приблизительно 90-95% (мас./мас.) в 1% (мас./мас.) растворе карбоната натрия.

Пример 10(b).

В данном примере описан способ получения акролеинового полимера, в котором проводят суперактивацию полимера, соответствующего сравнительному примеру, способом, соответствующим изобретению.

1.0. Приготовление основания.

В подходящей емкости растворяют 0,4 кг карбоната натрия в 30,6 кг воды и в емкость при перемешивании вносят 64 кг полиэтиленгликоля 200. Начинают перемешивание с помощью механической мешалки и нагревают ПЭГ 200 до 65 ±3 °С.

К ПЭГ 200 добавляют 5 кг сухого акролеинового полимера, полученного согласно примеру 10(а), и перемешивают до образования однородной смеси. Примечание: на этой стадии твердое вещество может раствориться не полностью. К гликолевой смеси медленно добавляют раствор карбоната натрия со скоростью, которая обеспечивает сохранение рН раствора в интервале 3,5-9,0.

Раствор перемешивают в течение 45 мин при 65 ±3 °С. Примечание: значение рН должно находиться в интервале 7-9. Температуру следует поддерживать в интервале 65 ±3 °С.

2.0. Суперактивация.

Емкость, в которой происходит перемешивание, закрывают и нагревают до 100 °С в течение 4 ч. Полученный в результате полимер, как показано, имеет примерную растворимость в воде 99,5-100% (мас./мас.).

Пример 11.

В данном примере исследуют антимикробную активность сухого нормально активированного полимера поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), соответствующего примеру 10(а), и антимикробную активность суперактивированного ацетального производного, описанного в примере 10(b).

Цыплят, леченых каждым из антимикробных средств, сравнивают с контрольной группой согласно следующей процедуре.

Для каждого исследования в коммерческой инкубаторной станции приобретают двадцать суточных цыплят Cob (линии 53). Их взвешивают, разделяют по признаку пола и случайным образом размещают в соседних клетках в комнате отдельного помещения для животных. Самцов и самок цыплят распределяют поровну. Вода и корм находятся в свободном доступе. Диета представлена имеющимся в продаже измельченным кормом (Chick Starter, Milne Feeds: 18% неочищенного белка) с добавленным кокцидиостатическим средством (125 млн -1 Динитолмида).

Десяти цыплятам вводят препарат 0,1% (мас./мас.) нормально активированного антимикробного средства, соответствующего примеру 10(а), в воде в течение 14 дней с помощью постоянных поилок при уровне дозирования 30 мг/кг/день. Другие десять цыплят составляют контрольную группу.

Цыплят в обеих группах взвешивают в дни 0, 4, 7, 11 и 14. По завершении исследования всех цыплят безболезненно умерщвляют и проводят посмертное вскрытие леченых цыплят. Предпринимают всестороннее макроскопическое исследование грудной и брюшной полостей.

Результаты.

Таблица 14аМасса тела, набранная в процессе исследования при использовании нормально активированногоантимикробного средства, соответствующего примеру 10(а)

В конце 14-дневного периода в группе лечения происходит измеряемо более высокий набор массы тела по сравнению с контрольной группой.

По завершении эксперимента при посмертном вскрытии и макроскопическом исследовании не выявляют никаких клинических или патологических признаков токсичности в группе леченых цыплят.

Таблица 14bМасса тела, набранная в процессе исследования при использовании антимикробного средствана основе суперактивированного ацеталя, соответствующего примеру 10(b)

При посмертном вскрытии и макроскопическом исследовании по завершении эксперимента среди оставшихся цыплят в обоих группах не выявляют никаких клинических или патологических признаков.

Заключение.

Существует значимое различие в наборе массы тела в группе лечения по сравнению с контрольной группой ( χ 2 ; P <0,015). По завершении эксперимента набор массы тела в группе лечения на 23% выше, чем в контрольной группе.

Значительное повышение набора массы тела при использовании суперактивированного ацетального производного по сравнению с контролем и, как показано в следующем примере, по сравнению с нормально активированным поли(2-пропеналем, 2-пропеновой кислотой) демонстрирует существенное повышение кишечной антимикробной активности ацетального производного.

Пример 12.

В данном примере оценивают полимерное антимикробное средство, соответствующее примеру 10(b), в реальных условиях в плане контроля колибациллеза у свиней после отъема от матки (PWC).

Способ.

146 молодых отнятых поросят, либо получающих различные препараты суперактивированного антимикробного средства в корме, либо APRALAN ® (Elanco) перорально или аутогенную вакцинацию, либо ничего не получающих, подвергают стрессу, связанному с отъемом, в большом промышленном свинарнике, который давно имеет проблемы с PWC.

Реакции свиней, заключающиеся в развитии диареи, наборе массы тела и смертности, представлены в табл. 15.

Таблица 15

Примечания:

1. Кодировка лечения:

i. Группа 1 = 0,1% (мас./мас.) суперактивированного полимерного антимикробного средства в корме.

ii. Группа 2 = 0,02% (мас./об.) суперактивированного полимерного антимикробного средства в воде.

2. Процент погибших от PWC в группе во время эксперимента.

3. Среднее число дней для каждой свиньи в группе, когда регистрируют фекальное число 1 или 2, фекальное число служит для измерения интенсивности диареи.

4. Сумма фекальных чисел, деленная на число отмеченных образцов/свинью.

5. F = точный критерий Фишера.

Заключение.

Данный эксперимент в реальных условиях выделяет следующие моменты, которые положительным образом отражаются на эффективности ацетального производного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) (суперактивированного антимикробного средства) при использовании для лечения поросят в промышленном свинарнике при экспериментальном заражении бета-гемолитической Escherichia coli после отъема.

1. Смертность.

Для любой из групп, леченных суперактивированным полимерным антимикробным средством, характерны более низкие уровни смертности, чем для любой из нелеченых, вакцинированных или леченных APRALAN ® групп.

2. Дни диареи.

Продолжительность диареи (количество дней) в любой из групп, леченных суперактивированным полимерным антимикробным средством [F; Р <0,0001], значительно меньше, чем в любой из нелеченых, вакцинированных или леченных APRALAN ® групп.

3. Фекальные числа.

Фекальные числа в любой из групп, леченных суперактивированным полимерным антимикробным средством [F; Р <0,0001], значительно ниже, чем в любой из нелеченых, вакцинированных или леченных APRALAN ® групп.

Пример 13.

В данном примере исследуют эффект использования некоторых дополнительных компонентов с антимикробным средством, соответствующим изобретению.

Способ.

Готовят суточные бульоны культур для заражения и определяют общее число жизнеспособных клеток (TVC) суточных культур.

Готовят серийные разведения образцов 1:1 с использованием стерильного изотонического раствора (5 мл). В качестве разбавителя при тестировании образцов, содержащих EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту), используют жесткую стерильную воду (SHW).

1 часть каждой из суточных культур разводят в 9 частях разбавителя. Полученные разбавленные суспензии используют в качестве инокулюма.

Каждое разведение образца инокулируют 100 мкл разведенной суточной культуры. (Используют одну культуру/пробирку). Образцы хорошо перемешивают.

Пробирки инкубируют в течение ≤24 ч при температуре 37 °С (А. niger инкубируют при 28 °С в течение ≤24 ч).

Из каждой тест-пробирки отбирают 1 мл, субкультивируют в 9 мл бульона для выделения и хорошо перемешивают (используют следующие бульоны для выделения: питательный бульон + 3% Твин 80 (NBT) для полимерного антимикробного средства EDTA; питательный бульон + 3% Твин 80 + 0,1% аммиака (NBTA) для глутаральдегида и бульон Letheen (LB) для метилпарабенов).

Образцы инкубируют при температуре 37 °С в течение дополнительных ≤48 ч (для A. niger при температуре 28 °С в течение ≤5 дней).

Исследуют рост в каждой пробирке. Затем все пробирки субкультивируют на селективной агаризованной среде и инкубируют в течение ≤24 ч при температуре 37 °С (для A. niger при температуре 28 °С в течение ≤5 дней). Выращивание на селективной агаризованной среде проводят для подтверждения роста тест-организма.

Положительные контроли готовят с использованием 5 мл разбавителя, инокулированного культурой, и подвергают инкубированию, выделению и подтверждению.

Отрицательные контроли готовят с использованием 5 мл неинокулированного разбавителя и подвергают инкубированию, выделению и подтверждению.

Результаты.

Результаты представлены ниже в виде табл. 16.

Таблица 16МКС выбранных консервантов и коэффициент синергии

Примечание: все значения соотношений выражены как соотношение полимерного антимикробного средства к консерванту

Условные обозначения:

1) Полимерное антимикробное средство, 0,025% (мас./мас.)

2) Полимерное антимикробное средство, 0,2% (мас./мас.)

3) Глутаральдегид, 0,025% (мас./мас.)

4) Полимерное антимикробное средство, 0,025% (мас./мас.) + глутаральдегид, 0,025% (мас./мас.)

5) Полимерное антимикробное средство, 0,2% (мас./мас.) + глутаральдегид 0,025% (мас./мас.)

6) Полимерное антимикробное средство, 0,2% (мас./мас.)

7) EDTA 0,1% (мас./мас.)

8) Полимерное антимикробное средство, 0,2% (мас./мас.) + EDTA, 0,1% (мас./мас.)

9) Полимерное антимикробное средство, 0,2% (мас./мас.) (в 80% (мас./мас.) глицерине)

10) Метилпарабен, 1% (мас./мас.) (в 80% (мас./мас.) глицерине)

11) Полимерное антимикробное средство, 0,2% (мас./мас.) (в 80% (мас./мас.) глицерине) + метилпарабен, 1% (мас./мас.) (в 80% (мас./мас.) глицерине).

Таблица 17Коэффициент синергии с полимерным антимикробным средством

Примечание: синергия <1,0, аддитивный эффект = 1,0, антагонистическое действие > 1,0

Соответственно SI=CD/A + СЕ/В

А = МКС полимерного антимикробного средства

В = МКС консерванта

С = МКС смеси

D = соотношению А:В

Е = соотношению В:А

Заключение.

Показано, что ацетальное производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) обладает синергическим действием с глутаральдегидом, EDTA и метилпарабеном соответственно, в отношении A. niger, С. albicans, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus.

Пример 14.

В данном примере демонстрируется активность антимикробного средства, соответствующего изобретению, в комбинации с антимикробным средством марки "Dettol".

Серийные разведения образца 1:1 делают с использованием стерильного изотонического раствора (5 мл).

Каждым из разведений образца инокулируют 100 мкл разведенной суточной культуры (на пробирку используют одну культуру). Образцы хорошо перемешивают.

Образцы инкубируют при 37 ±2 °С в течение ≤24 ч (пробирки, инокулированные Aspergillus niger, инкубируют при 28 ±2 °С в течение ≤24 ч).

1 мл из каждой пробирки субкультивируют в 9 мл бульона для выделения и хорошо перемешивают (среды NBT или Сабуро + 3% Твин 80 (SABT) для A. niger).

Образцы инкубируют при 37 ±2 °С в течение ≤24 ч (Aspergillus niger инкубируют при 28 ±2 °С в течение дополнительных 5 дней).

Бульоны для выделения проверяют на мутность (наличие роста) и высевают штрихом на селективные агаризованные среды для подтверждения роста.

Таблица 18Результаты МКС в млн-1 для суперактивированного полимерногоантимикробного средства и/или "Dettol"

Условные обозначения:

1) 0,1% (мас./мас.) полимерное антимикробное средство

2) 0,2% (мас./мас.) полимерное антимикробное средство

3) "Dettol" 4,8% (мас./об.) (разведение 1:20)

4) 0,1% (мас./мас.) полимерное антимикробное средство + Dettol (разведение 1:20)

5) 0,2% (мас./мас.) полимерное антимикробное средство + Dettol (разведение 1:20)

Таблица 19

Коэффициент синергического действия полимерного антимикробного средства и Dettol

Примечание: антагонистическое действие при SI > 1, аддитивное действие при SI=1, синергическое действие при SI <1

SI = CD/A + СЕ/В

А = МКС полимерного антимикробного средства (млн -1 )

В = МКС Dettol (млн -1 )

С = МКС полимерного антимикробного средства/смеси Dettol (млн -1 )

D = соотношение полимерного антимикробного средства и Dettol

Е = соотношение Dettol и полимерного антимикробного средства

Примечание: активным антимикробным средством в Dettol является хлорксиленол.

Заключение.

Показано, что полимерное антимикробное средство, соответствующее изобретению, обладает синергическим действием с Dettol в отношении Е. coli, S. aureus, P. aeruginosa, С. albicans и A. niger. Это показывает, что Dettol и полимерное антимикробное средство при совместном использовании в виде смешанного раствора будут действовать значительно лучше, чем при использовании по отдельности.

Пример 15.

Антисептические количества поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного].

Исследуют антисептические свойства антимикробного средства поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного].

Число бактерий на руках субъектов определяют до и после нанесения антимикробного средства с последующим надеванием хирургических перчаток. Антисептический эффект поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного] сравнивают с обычно применяемым хирургическим антисептиком - 4% хирургическим скрабом на основе хлоргексидина (производится Orion Laboratories, in Perth, Western Australia).

3% (мас./мас.) водные растворы поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного] снижают исходные количества бактериальных популяций на руках в перчатках через 3 ч.

2% (мас./мас.) водный раствор поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного] с 70% этанолом демонстрируют длительное снижение исходного количества бактерий на руках в перчатках через 3 ч, как 4% хлоргексидин.

3,2% (мас./мас.) нанесение на руки водного раствора поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного] с 3,1% лаурилсульфатом натрия с последующим применением 4% (мас./мас.) водного раствора поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [суперактивированного] в 70% этаноле перед надеванием хирургических перчаток приводит к значительному снижению исходного количества бактерий через 3 ч.

Результаты показывают, что поли(2-пропеналь, 2-пропеновая кислота) [суперактивированный] обладает хорошей остаточной антимикробной активностью, которая необходима для длительного контроля числа бактерий в хирургическом асептике. Введение в состав 70% этанола способствует исходному быстрому снижению числа бактерий.

Пример 16.

Биоцидная активность 0,125% (мас./мас.) и 0,05% (мас./мас.) суперактивированного полимера в отношении референс-штамма Н. pylori NCTC 11637 при рН 7 и 4.

Эффективность in vitro суперактивированного полимера впервые устанавливают в отношении референс-штамма Н. pylori - Н. pylori NCTC 11637. В качестве вариантов выбирают две концентрации, одна из которых является 40-кратным разведением 5% раствора суперактивированного полимера, полученного в примере 2, что дает 0,125% (мас./мас.) концентрацию суперактивированного полимера, имитирующую разведение в желудке; другая представлена 100-кратным разведением, дающим 0,05% (мас./мас.) концентрацию суперактивированного полимера. Выбирают два значения рН - рН 7 как исходное и рН 4 для имитации условий в желудке.

Культуры Н. pylori NCTC 11637 выращивают в микроаэробных условиях на чашках с селективной агаризованной средой при 37 ±2 °С до тех пор, пока не появляется значительный рост. Выросшую культуру в асептических условиях удаляют с чашек и готовят как суспензию со стандартизованной мутностью 10% Т, согласно показаниям колориметра Vitek, разводя стерильным изотоническим раствором.

Взвешивают 19,9 г образца и инокулируют его 100 мкл суспензии культуры. 1 мл образца немедленно переносят в бульон для дезактивации/выделения (питательный бульон + 3% Твин 80), а затем готовят серийные разведения. Аликвоты по 100 мкл помещают на чашки с селективной агаризованной средой и распределяют с помощью стерильного одноразового шпателя. Стадии переноса повторяют через интервалы времени 5, 10, 15 и 20 мин. Все чашки инкубируют в микроаэробных условиях при 37 ±2 °С до появления значительного роста (приблизительно в течение 5-7 суток). Все колонии подсчитывают и определяют снижение популяции в течение времени. Тест повторяют с использованием стерильного изотонического раствора в качестве образца для определения естественной скорости гибели в атмосферных условиях.

Условные обозначения:

Культура 1. Суперактивированный полимер, рН 7, 0,125% (мас./мас.).

Культура 2. Суперактивированный полимер, рН 7, 0,05% (мас./мас.).

Культура 3. Суперактивированный полимер, рН 4, 0,125% (мас./мас.).

Культура 4. Суперактивированный полимер, рН 4, 0,05% (мас./мас.).

Культура 5. Стерильный изотонический раствор, рН 7.

Культура 6. Стерильный изотонический раствор, рН 4.

Таблица 20Биоцидная активность полимерного антимикробного средства CHEMEQRTMв отношении Н. pylori (NCTC 11637)

Примечание: числа колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл дезактивирующего бульона

Результаты, полученные в отношении референс-штамма (см. табл. 20), показывают, что суперактивированный полимер эффективен при рН 7 при обеих, 0,125% (мас./мас.) и 0,05% (мас./мас.), концентрациях и эффективен также при рН 4 и в концентрации 0,125% (мас./мас.).

Пример 17.

Кроме анализа, описанного в примере 16, исследуют три дополнительных штамма Н. pylori при рН 7 и рН 4. Н. pylori 01/303, устойчивый к кларитромицину и метронидазолу, Н. pylori SS1 - клинический штамм, выделенный в Сиднее и обладающий высокой колонизирующей активностью, который представляет интерес для возможного применения в моделях на животных, и Н. pylori ATCC 700392 - штамм, геном которого секвенирован и выделен в Соединенном Королевстве.

Таблица 21Биоцидная активность суперактивированного полимера в концентрации 0,125% при рН 7

При обработке суперактивированным полимером в концентрации 0,125% (мас./мас.) при рН 7 все штаммы быстро погибают, при этом антибиотикоустойчивый штамм оказывается наиболее уязвимым, его гибель наступает меньше чем через 10 мин (см. табл. 21). Контрольный штамм не обрабатывают.

Пример 18.

Способ, соответствующий примеру 3, повторно используют для тестирования биоцидной активности 0,125% (мас./мас.) суперактивированного полимера (рН 4) в отношении всех штаммов Н. pylori.

Таблица 22Биоцидная активность полимерного антимикробного средства CHEMEQRTMв концентрации 0,125% при рН 4

Тестирование суперактивированного полимера при рН 4, значении, которое имитирует рН желудка, и при концентрации 0,125% (мас./мас.) приводит к гибели всех штаммов в течение 20 мин (см. табл. 3). Данный результат важен, поскольку эти временные рамки уничтожения Н. pylori меньше, чем время прохождения через желудок (40 мин-1 ч). Данный факт демонстрирует эффективность суперактивированного полимера при рН, концентрации и во временных рамках, соответствующих лечению инфекции Н. pylori в желудке. Контрольный штамм не обрабатывают.

Пример 19.

Данный пример демонстрирует кишечную антимикробную активность ацетального производного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), полученного согласно процедуре, соответствующей примеру 10(b).

Материалы и способы.

Шестнадцать отнятых поросят (возраст: 18+2 дня и масса тела: 5,5+1,0 кг) приобретают в промышленном свинарнике. Их случайным образом разделяют на 2 группы по 8 поросят (при равном распределении по полу) и помещают в изолированном помещении для животных с контролем условий окружающей среды. Вода и корм находятся в свободном доступе у входа в помещение для животных. Диета представлена имеющимся в продаже гранулированным кормом для отнятых поросят (19% неочищенного белка), не содержащим антимикробное средство.

Всех отнятых поросят безболезненно умерщвляют инъекцией барбитурата натрия, а затем проводят посмертное вскрытие. ДНК из желудочного и пищеводного отделов желудка двадцати четырех отнятых поросят экстрагируют при вскрытии при использовании набора для тканей Qiagen Dneasy в соответствии с сопровождающими инструкциями. 3 мкл экстрагированной ДНК используют для тестирования присутствия Helicobacter spp. в образцах ткани, полученных при биопсии. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят дважды с каждым образцом при семи контрольных образцах ДНК, включенных в каждую реакцию ПЦР. Не обнаруживают никаких расхождений между проведенными ПЦР.

Результаты.

Кодировка вариантов лечения:

Группа 1: отсутствие лечения (отрицательный контроль)

Группа 2: 0,1% (мас./об.) суперактивированное полимерное антимикробное средство, соответствующее примеру 10(b), 30 мг/кг/день.

Таблица 23Результаты ПЦР по Helicobacter spp. с использованием предварительно оптимизированныхродоспецифических праймеров, где + представляет положительную детекцию Helicobacter spp. и- означает отсутствие детекции

В группе 1 (отсутствие лечения) имеется пять положительных результатов ПЦР по Helicobacter spp. (1 - желудочный, 4 - пищеводные), тогда как в группе 2 (0,1% (мас./об.) полимерного антимикробного средства) положительные результаты ПЦР отсутствуют.

Заключение.

Ацетальное производное поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) в концентрации 0,1% (мас./об.) достоверно ( χ 2 :Р <0,025) снижает частоту свиного Helicobacter spp. в слизистой ткани желудка и пищевода отнятых поросят.

Пример 20.

Сравнительный пример 20(а).

В данном примере демонстрируют способ получения не суперактивированного поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты).

0,8% (мас./мас.) гидроксида натрия

9,90 кг деионизированной воды наливают в бак из нержавеющей стали объемом 10 л, добавляют в воду 0,08 кг гидроксида натрия и перемешивают до растворения.

Полимеризация

100,1 кг деионизированной воды наливают в бак из нержавеющей стали объемом 200 л и добавляют в бак объемом 200 л 4,99 кг 0,8% (мас./мас.) раствора гидроксида натрия. Раствор уравновешивают при 15-20 °С. Одновременно в бак объемом 200 л добавляют 20 кг акролеинового мономера и оставшийся 0,8% (мас./мас.) раствор гидроксида натрия со скоростью 1 ч, так что значение рН остается на уровне 10,5-11,0, а температура не поднимается выше 30 °С. Полимеризацию продолжают еще в течение 90 мин.

Промывание

Полимеризационную смесь фильтруют/центрифугируют и промывают полимер деионизированной водой, пока рН промывной воды не станет меньше 7,0. Приблизительный выход составляет 8 кг.

Сушка

Полимер сушат на воздухе, затем нагревают в печи с использованием следующей программы.

Растворение

400 л воды наливают в бак объемом 500 л, добавляют 4 кг карбоната натрия и перемешивают до растворения. Медленно добавляют 8 кг сухого нагретого полимера и перемешивают в течение 30 мин.

Показано, что полученный в результате полимер имеет растворимость приблизительно 90-95% (мас./мас.) в 1% (мас./мас.) растворе карбоната натрия.

Пример 20(b).

В данном примере описан способ получения акролеинового полимера, в котором полимер, соответствующий сравнительному примеру 20(a), суперактивирован.

Приготовление основания

В подходящей емкости растворяют 0,4 кг карбоната натрия в 30,6 кг воды и в емкость при перемешивании вносят 64 кг полиэтиленгликоля 200. Начинают перемешивание с помощью механической мешалки и нагревают ПЭГ 200 до 65 ±3 °С. К ПЭГ 200 добавляют 5 кг сухого акролеинового полимера, полученного согласно примеру 20(а), и перемешивают до образования однородной смеси.

Примечание: на этой стадии твердое вещество может раствориться не полностью. К гликолевой смеси медленно добавляют раствор карбоната натрия со скоростью, которая обеспечивает сохранение рН раствора в интервале 3,5-9,0.

Раствор перемешивают в течение 45 мин при 65 ±3 °С.

Примечание: значение рН должно находиться в интервале 7-9. Температуру следует поддерживать в интервале 65 ±3 °С.

Суперактивация

Емкость, в которой происходит перемешивание, закрывают и нагревают до 100 °С в течение 4 ч. Полученный в результате суперактивированный полимер, как показано, смешивается с водой во всех пропорциях.

Пример 21.

В примере 14 PCT/AU 9600328 продемонстрировано, что полимер поли(2-пропеналь, 2-пропеновая кислота) в 0,5% (мас./мас.) растворе карбоната натрия обладает противораковой активностью в отношении клеточной линии асцита Эрлиха в модели на мышах.

Исследована противораковая активность полимера поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) [пример 20(а)] относительно активности суперактивированного полимера [пример 20(b)]. Модель in vitro желудочно-кишечной формы рака осуществляют на клеточной линии рака толстой кишки человека НТ-29. Поли(2-пропеналь, 2-пропеновую кислоту) используют в концентрации 5% (мас./мас.). В тесте используют инкубирование раковых клеток с различными концентрациями полимера для построения графика, на основании которого можно определить IC 50 (50% ингибирующую концентрацию).

Методология.

Клетки НТ-29 (клетки рака толстой кишки человека) высевают (в 100 мкл среды) в лунки 96-луночных плат и инкубируют в течение ночи при 37 °С в увлаженной атмосфере 5% CO 2 . Полимер [полимер поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты), соответствующий сравнительному примеру 20(а), и суперактивированный полимер, соответствующий примеру 20(b)] растворяют в воде, а затем разводят в среде с получением 10 концентраций, лежащих в интервале 4-log. Затем 100 мкл каждого раствора вводят в каждую и 5 лунок. Платы инкубируют в течение еще 72 ч, после чего измеряют жизнеспособные клетки с помощью анализа с использованием сульфородамина В (см. статьи Skehan и соавт., J. Nat. Cancer Inst., 82:1107-1112, (1990), Monks и соавт., J. Nat. Cancer Inst., 83:757-766, (1991). Потом клетки фиксируют 10% холодной трихлоруксусной кислотой в течение 1 ч при 4 °С, промывают чашки дистиллированной водой, оставляют на воздухе для высыхания, а потом окрашивают 0,4% сульфородамином В (Aldrich) в 1% уксусной кислоте (об./об.) в течение 30 мин. После этого несвязанный краситель удаляют промыванием два раза дистиллированной водой и в конце 1% уксусной кислотой. Затем связанный с белком краситель солюбилизируют в 10 мМ незабуференном Трис-основании и читают поглощение при длине волны 550 нм при использовании автоматического ридера для чашек. Среднее поглощение для каждой дозы лекарственного вещества выражают как процент от поглощения контрольной необработанной лунки.

Результаты теста представлены в табл. 24.

Полимер поли(2-пропеналь, 2-пропеновая кислота), соответствующий сравнительному примеру 20(а), дает среднее значение IC 50 0,030% по двум тестам, значение для полимера поли(2-пропеналя, 2-пропеновой кислоты) принято за 100%. Это относится к 0,0015% (мас./мас.) активному полимеру.

Суперактивированный полимер, соответствующий примеру 20(b), дает среднее значение IC 50 0,025% по четырем тестам. Это относится к 0,00125% (мас./мас.) суперактивированному полимеру и показывает, что суперактивированный полимер обладает сильной противораковой активностью.

Таблица 24IC50 полимерного антимикробного средства CHEMEQRTMв отношении клеток рака толстой кишки человека НТ-29

IC 50 представляет собой концентрацию, необходимую для ингибирования роста клеток на 50%.

Наконец, следует понимать, что могут быть осуществлены различные другие модификации и/или изменения, не выходящие за рамки сущности данного изобретения, как указано в данном контексте.