EA 014886B1 20110228 Номер и дата охранного документа EA200870401 20070330 Регистрационный номер и дата заявки US60/787,762 20060331 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2007/065636 20070330 Номер международной заявки (PCT) WO2007/115168 20071011 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа EAb21101 Номер бюллетеня [RU] КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Eg5 Название документа [8] C07H 21/02, [8] C07H 21/04, [8] A01N 43/04, [8] A61K 31/70 Индексы МПК [US] Бумкрот Дэвид, [DE] Тан Памела, [DE] Форнлохер Ханс-петер, [DE] Гайкк Анке Сведения об авторах [US] ЭЛНИЛЭМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US) Сведения о патентообладателях [US] ЭЛНИЛЭМ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US) Сведения о заявителях WEIL et al. BioTechniques, 2002, vol. 33, No. 6, pages 1244-1248 ELBASHIR et al. The EMBO Journal, 2001, vol. 20, pages 6877-6888 ELBASHIR et al. Methods, 2002, vol. 26, pages 199-213 Цитируемые документы
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000014886b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Данное изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена Eg5 (ген Eg5), содержащей антисмысловую цепь, имеющую нуклеотидную последовательностью длиной менее 30 нуклеотидов, как правило, длиной в 19-25 нуклеотидов, и которая, по существу, комплементарна по меньшей мере части гена Eg5. Данное изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей дцРНК совместно с фармацевтически приемлемым носителем; к способам лечения заболеваний, вызываемых экспрессией Eg5 и экспрессией гена Eg5, с использованием фармацевтической композиции и к способам ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке.


Формула

[0001] Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена Eg5 человека в клетке, где указанная дцРНК содержит по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу, и где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, содержащую участок комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части мРНК, кодирующей Eg5, где указанная часть мРНК, кодирующей Eg5, состоит из последовательности UCGAGAAUCUAAACUAACU, и где указанный участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов, и где указанная дцРНК при контакте с клеткой, экспрессирующей указанный Eg5, ингибирует экспрессию указанного гена Eg5.

[0002] Двухцепочечная РНК по п.1, где указанная первая последовательность представляет собой последовательность SEQ ID NO:135 и указанная вторая последовательность представляет собой последовательность SEQ ID NO:136.

[0003] Двухцепочечная РНК по п.1, где указанная первая последовательность представляет собой последовательность SEQ ID NO:1240 и указанная вторая последовательность представляет собой последовательность SEQ ID NO:1241.

[0004] Двухцепочечная РНК по любому из пп.1-3, содержащая по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.

[0005] Двухцепочечная РНК по п.4, где указанный модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-O-метилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфоротиоатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с холестерильным производным или с группой бисдециламида додекановой кислоты, 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированого нуклеотида, замкнутого нуклеотида, абазического нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего неприродное основание.

[0006] Клетка, содержащая дцРНК по п.1.

[0007] Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена Eg5, содержащая дцРНК по любому из пп.1-5.

[0008] Фармацевтическая композиция по п.7, дополнительно содержащая дцРНК, которая ингибирует экспрессию гена VEGF.

[0009] Фармацевтическая композиция по п.7, дополнительно содержащая дцРНК, которая ингибирует экспрессию гена VEGF, где дцРНК, которая ингибирует экспрессию гена VEGF, содержит смысловую цепь, содержащую SEQ ID NO:1242, и антисмысловую цепь, содержащую SEQ ID NO:1243.

[0010] Способ ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке in vitro, предусматривающий:

[0011] Способ по п.10, где в указанную клетку вводят вторую дцРНК, которая ингибирует экспрессию VEGF.

[0012] Способ по п.10, где в указанную клетку вводят вторую дцРНК, которая ингибирует экспрессию VEGF, и эта вторая дцРНК содержит смысловую цепь, содержащую SEQ ID NO:1242, и антисмысловую цепь, содержащую SEQ ID NO:1243.

[0013] Применение двухцепочечной РНК по любому из пп.1-5 для лечения, профилактики или управления течением патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5.

[0014] Применение по п.13, где пациенту вводят вторую дцРНК, которая ингибирует экспрессию VEGF.

[0015] Применение по п.13, где пациенту вводят вторую дцРНК, которая ингибирует экспрессию VEGF, и эта вторая дцРНК содержит смысловую цепь, содержащую SEQ ID NO:1242, и антисмысловую цепь, содержащую SEQ ID NO:1243.

[0016] Вектор для ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке, содержащий регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну цепь дцРНК по п.1.

[0017] Клетка, содержащая вектор по п.16.


Полный текст патента

Родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 60/787762, поданной 31 марта 2006 г., и предварительной заявке США № 60/870259, поданной 15 декабря 2006 г. Обе предшествующие заявки включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

Область изобретения

Данное изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), и к ее применению в опосредовании интерференции РНК для ингибирования экспрессии гена Eg5 и к применению дцРНК для лечения патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5, таких как злокачественная опухоль, отдельно или в сочетании с дцРНК, нацеленной на сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).

Предпосылки изобретения

Поддержание клеточных популяций в организме регулируется клеточными процессами деления клеток и запрограммированной гибели клеток. В нормальных клетках клеточные процессы, ассоциированные с инициацией и завершением каждого процесса, строго регулируются. При пролиферативном заболевании, таком как злокачественная опухоль, один или оба из этих процессов могут нарушаться. Например, в злокачественной клетке может быть утрачена регуляция (контроль в контрольных точках) клеточного деления либо через сверхэкспрессию положительного регулятора, либо через утрату отрицательного регулятора, вероятно, посредством мутации.

Альтернативно злокачественная клетка может утрачивать способность подвергаться запрограммированной клеточной гибели через сверхэкспрессию отрицательного регулятора. Таким образом, существует необходимость в разработке новых химиотерапевтических лекарственных средств, которые будут восстанавливать процессы контроля в контрольных точках и запрограммированной гибели клеток в злокачественных клетках.

Одним подходом для лечения злокачественных опухолей у человека является нацеливание на белок, который необходим для прохождения клеточного цикла. Для перехода клеточного цикла из одной фазы в следующую должны произойти определенные необходимые процессы. В клеточном цикле существуют контрольные точки, которые обеспечивают надлежащий порядок событий и фаз. Одной такой контрольной точкой является контрольная точка веретена, которая появляется в ходе стадии метафазы митоза. Низкомолекулярные соединения, которые нацелены на белки с необходимыми функциями в митозе, могут инициировать остановку клеток в митозе через контрольную точку веретена. Среди низкомолекулярных соединений, которые вызывают остановку клеток в митозе, соединения, которые проявляют противоопухолевую активность в клинике, также индуцируют апоптоз, морфологические изменения, ассоциированные с запрограммированной клеточной гибелью. Эффективным химиотерапевтическим средством для лечения злокачественной опухоли, таким образом, может быть средство, которое индуцирует контроль в контрольной точке и запрограммированную гибель клеток. К сожалению, существует немного соединений, доступных для контроля этих процессов в клетке. Большинство соединений, о которых известно, что они вызывают остановку в митозе и апоптоз, действуют в качестве связывающих тубулин веществ. Эти соединения изменяют динамическую нестабильность микротрубочек и непрямо изменяют функцию/структуру митотического веретена, вызывая посредством этого остановку в митозе. Вследствие того, что большинство из этих соединений специфически нацелено на белок тубулина, который является компонентом всех микротрубочек, эти соединения могут влиять также на один или несколько из множества нормальных клеточных процессов, в которых участвуют микротрубочки. Таким образом, существует необходимость также в низкомолекулярных соединениях, которые более специфически нацелены на белки, ассоциированные с пролиферирующими клетками.

Eg5 представляет собой один из нескольких кинезин-подобных двигательных белков, которые расположены в митотическом веретене и о которых известно, что они требуются для образования и/или функционирования биполярного митотического веретена. Недавно появилось сообщение о низкомолекулярном соединении, которое нарушает биполярность митотического веретена (Mayer, T.U. et al. 1999. Science 286(5441) 971-4, включенная в настоящий документ в качестве ссылки). Более конкретно, низкомолекулярное соединение индуцировало образование аберрантного митотического веретена, где из центральной пары центросом выходят микротрубочки с моноастральным расположением, при этом хромосомы присоединяются к дистальным концам микротрубочек. Низкомолекулярное соединение получило название "монастрол" вследствие моноастрального расположения. Этот фенотип с моноастральным расположением ранее был выявлен в митотических клетках, в которых был иммунологически устранен двигательный белок Eg5. Этот характерный фенотип с моноастральным расположением способствовал идентификации монастрола в качестве потенциального ингибитора Eg5. Действительно, далее было показано, что монастрол ингибирует запускаемую двигательным белком Eg5 подвижность микротрубочек в анализе in vitro. Ингибитор Eg5 монастрол не оказывал заметного эффекта на сходный моторный белок кинезин или на белок (белки), ответственный за движение аппарата Гольджи в клетке. Клетки, которые проявляют фенотип с моноастральным расположением, либо через иммунное устранение Eg5, либо через ингибирование Eg5 монастролом, останавливаются в М-фазе клеточного цикла. Однако остановка в митозе, индуцированная либо посредством иммунного устранения, либо посредством ингибирования Eg5, является временной (Kapoor, T.M., 2000, J Cell Biol 150(5) 975-80). Как фенотип с моноастральным расположением, так и остановка клеточного цикла в митозе, индуцируемая монастролом, являются обратимыми. Клетки восстанавливаются с образованием нормального биполярного митотического веретена, для завершения митоза и для прохождения через клеточный цикл и нормальной клеточной пролиферации. Эти данные позволяют предположить, что низкомолекулярный ингибитор Eg5, который индуцирует временную остановку митоза, может быть неэффективным для лечения злокачественной клеточной пролиферации. Тем не менее, открытие, что монастрол вызывает остановку в митозе, является интересным, и, таким образом, существует необходимость в последующем исследовании и идентификации соединений, которые можно применять для модулирования двигательного белка Eg5 таким образом, который является эффективным для лечения злокачественных опухолей у человека. Также существует необходимость в исследовании этих соединений в сочетании с другими средствами против злокачественной опухоли.

VEGF (также известный как фактор сосудистой проницаемости, VPF) представляет собой многофункциональный цитокин, который стимулирует ангиогенез, пролиферацию эпителиальных клеток и выживаемость клеток эндотелия. VEGF может продуцироваться во множестве тканей, и его сверхэксрессия или аберрантная экспрессия может приводить к различным нарушениям, включая злокачественные опухоли и нарушения сетчатки, такие как связанная со старением дегенерация желтого пятна и другие ангиогенные нарушения.

Недавно было показано, что двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК) блокируют экспрессию генов через высоко консервативный регуляторный механизм, известный как интерференция РНК (RNAi). В WO 99/32619 (Fire et al. ) описано применение дцРНК длиной по меньшей мере 25 нуклеотидов для ингибирования экспрессии генов в С. elegans. Также было показано, что дцРНК вызывает деградацию РНК-мишени в других организмах, включая растения (см., например, WO 99/53050, Waierhouse et al.; и WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (см., например, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) и млекопитающих (см. WO 00/44895, Limmer и DE 10100586.5, Kreuizer et al.). В настоящее время этот механизм стал основной для разработки нового класса фармацевтических средств для лечения нарушений, причиной которых является аберрантная или нежелательная регуляция гена.

Несмотря на существенные достижения в области RNAi и достижения в лечении патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5, остается необходимость в средстве, которое может селективно и эффективно подавлять ген Eg5 с использованием собственного аппарата RNAi клеток, которое обладает как высокой биологической активностью, так и стабильностью in vivo, и которое может эффективно ингибировать экспрессию гена Eg5-мишени, для применения в целях лечения патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), а также к композициям и способам для ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке или у млекопитающего с использованием такой дцРНК, отдельно или в сочетании с дцРНК, нацеленной на VEGF. Также данное изобретение относится к композициям и способам для лечения патологических состояний и заболеваний, вызываемых экспрессией гена Eg5, например, при злокачественной опухоли. дцРНК согласно изобретению содержит цепь РНК (антисмысловую цепь), имеющую участок, который обладает длиной менее 30 нуклеотидов, как правило, длиной 19-24 нуклеотидов, и является по существу комплементарной по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена Eg5.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к двухцепочечным молекулам рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена Eg5. дцРНК содержит по меньшей мере две последовательности, комплементарные друг другу. дцРНК содержит смысловую цепь, содержащую первую последовательность, и антисмысловую цепь, содержащую вторую последовательность. Антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, по существу комплементарную по меньшей мере части мРНК, кодирующей Eg5, и участок комплементарности обладает длиной менее 30 нуклеотидов, как правило, длиной 19-24 нуклеотидов. дцРНК, при контактировании с клеткой, экспрессирующей Eg5, ингибирует экспрессию гена Eg5 по меньшей мере на 40%.

Например, молекулы дцРНК согласно изобретению могут состоять из первой последовательности дцРНК, которая выбрана из группы, состоящей из смысловых последовательностей, представленных в таблицах 1-3, и второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1-3. Молекулы дцРНК согласно изобретению могут состоять из встречающихся в природе нуклеотидов или они могут состоять по меньшей мере из одного модифицированного нуклеотида, такого как 2'-О-метилмодифицированный нуклеотид, нуклеотид, содержащий 5'-фосфортиоатную группу, и терминальный нуклеотид, связанный с производным холестериловым производным. Альтернативно модифицированный нуклеотид может быть выбран из группы из 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, абазического нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолино-нуклеотида, фосфорамидата и содержащего неприродное основание нуклеотида. Как правило, такая модифицированная последовательность будет основана на первой последовательности указанной дцРНК, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, представленных в табл. 1-3, и второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1-3.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к клетке, содержащей одну из дцРНК согласно изобретению. Клетка, как правило, представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования экспрессии гена Eg5 в организме, главным образом, у субъекта-человека, содержащей одну или несколько из дцРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или материал для доставки.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к способу ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке, включающему в себя следующие стадии:

(a) введение в клетку двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК), где дцРНК содержит по меньшей мере две последовательности, комплементарные друг другу. дцРНК содержит смысловую цепь, содержащую первую последовательность, и антисмысловую цепь, содержащую вторую последовательность. Антисмысловая цепь содержит участок комплементарности, который является, по существу, комплементарным по меньшей мере части мРНК, кодирующей Eg5, и где длина участка комплементарности составляет менее 30 нуклеотидов, как правило, 19-24 нуклеотида, и где дцРНК, при контакте с клеткой, экспрессирующей Eg5, ингибирует экспрессию гена Eg5 по меньшей мере на 40%; и

(b) поддержание клетки, полученной на стадии (а) в течение периода, достаточного для достижения деградации мРНК-транскрипта гена Eg5, ингибируя посредством этого экспрессию гена Eg5 в клетке.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к способам лечения, профилактики или управления течением патологического процесса, опосредуемого экспрессией Eg5, например злокачественной опухоли, включающим в себя введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, профилактике или управлении течением, терапевтически или профилактически эффективного количества одной или нескольких дцРНК согласно изобретению.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к векторам для ингибирования экспрессии гена Еg5 в клетке, содержащим регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну цепь одной из дцРНК согласно изобретению.

В другом варианте осуществления данное изобретение относится к клетке, содержащей вектор для ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке. Вектор содержит регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну цепь одной из дцРНК согласно изобретению.

В следующем варианте осуществления данное изобретение относится к Eg5 дцРНК и ее применению, как описано выше, в сочетании со второй дцРНК, нацеленной на мРНК VEGF. Сочетание дцРНК, нацеленной на Eg5, и второй дцРНК, нацеленной на VEGF, обеспечивает взаимодополняющую и синергическую активность в отношении лечения непролиферативных нарушений, в частности карциномы печени.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), а также к композициям и способам для ингибирования экспрессии гена Eg5 в клетке или у млекопитающего с использованием дцРНК. Также данное изобретение относится к композициям и способам лечения патологических состояний и заболеваний у млекопитающего, вызываемых экспрессией гена Eg5, с использованием дцРНК. дцРНК осуществляет специфичную в отношении последовательности деградацию мРНК посредством процесса, известного как интерференция РНК (RNAi). Кроме того, изобретение относится к указанным дцРНК в сочетании со второй дцРНК, которая ингибирует экспрессию гена VEGF.

дцРНК согласно изобретению содержат цепь РНК (антисмысловую цепь), имеющую участок, который обладает длиной менее 30 нуклеотидов, главным образом длиной 19-24 нуклеотидов, и который по существу комплементарен по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена Eg5. Применение таких дцРНК обеспечивает нацеленную деградацию мРНК генов, которые вовлечены в репликацию и/или поддержание злокачественных клеток у млекопитающих. С использованием клеточных анализов и анализов на животных авторы настоящего изобретения показали, что очень низкие дозировки этих дцРНК могут специфически и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена Eg5. Таким образом, способы и композиции согласно изобретению, включающие эти дцРНК, пригодны для лечения патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5, например злокачественной опухоли, посредством нацеливания на ген, вовлеченный в митотическое деление.

В представленном ниже подробном описании разъяснено получение и применение дцРНК и композиций, содержащих дцРНК, для ингибирования экспрессии гена Eg5, а также композиции и способы лечения заболеваний и нарушений, вызываемых экспрессией Eg5, таких как злокачественная опухоль, отдельно или в сочетании со второй дцРНК, нацеленной на ген VEGF. Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, содержащую участок комплементарности длиной менее 30 нуклеотидов, главным образом, длиной 19-24 нуклеотидов, и, по существу, комплементарен по меньшей мере части РНК-транскрипта гена Eg5, совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Как рассмотрено выше, такие композиции далее могут включать в себя вторую дцРНК, нацеленную на VHGF.

Таким образом, определенные аспекты данного изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим дцРНК согласно изобретению совместно с фармацевтически приемлемым носителем, способам применения композиций для ингибирования экспрессии гена Eg5 и к способам применения фармацевтических композиций для лечения заболеваний, вызываемых экспрессией гена Eg5. Кроме того, изобретение относится к указанным выше фармацевтическим композициям, дополнительно содержащим вторую дцРНК, сконструированную для ингибирования экспрессии VEGF.

I. Определения

Для удобства значение определенных терминов и выражений, используемых в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, представлено ниже. Если существует очевидное отличие между применением термина в других частях этого описания и его определением, представленным в этом разделе, определение, представленное в этом разделе, будет преимущественным.

Каждый из "G", "С", "А" и "U" обычно относится к нуклеотиду, который содержит, соответственно, гуанин, цитозин, аденин и урацил в качестве основания. Однако будет понятно, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" также может относиться к модифицированному нуклеотиду, как подробно описано ниже, или к замещающей группе. Специалистам хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил можно заменять другими группами без существенного изменения свойств олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, обладающий такой замещающей группой. Например, но не ограничиваясь этим примером, известно, что нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пары с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Таким образом, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, можно заменять в нуклеотидной последовательности согласно изобретению нуклеотидом, содержащим, например, инозин.

Последовательности, содержащие такие замещающие группы, являются вариантами осуществления данного изобретения.

Здесь "Eg5" относится к 11 члену семейства кинезинов человека, который также известен как KIF 11, Eg5, HKSP, KNSL1 или TRIPS. Последовательность Eg5 можно найти в качестве NCBI GeneID:3832, HGNC ID:HGNC:6388 и RefSeq ID номер: NM_004523.

В настоящем документе "последовательность-мишень" относится к непрерывному участку нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованному в процессе транскрипции гена Eg5, включая мРНК, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции.

Здесь VEGF, также известный как фактор проницаемости сосудов, представляет собой ангиогенный фактор роста. VEGF представляет собой гетеродимерный гликопротеин массой 45 кДа, который существует по меньшей мере в трех различных изоформах. Изоформы VEGF экспрессируются в эндотелиальных клетках. Ген VEGF содержит 8 экзонов, которые экспрессируют изоформу белка из 189 аминокислот. В изоформе из 165 аминокислот отсутствуют остатки, кодируемые 6 экзоном, в то время как в изоформе из 121 аминокислот отсутствуют остатки, кодируемые 6 и 7 экзонами. VEGF145 представляет собой изоформу, для которой предсказано, что она содержит 145 аминокислот и лишена 7 экзона, VEGF может действовать на эндотелиальные клетки посредством связывания с эндотелиальным тирозинкиназным рецептором, таким как Flt-1 (VEGFR-1) или KDR/flk-1 (VEGFR-2). VEGFR-2 экспрессируется в эндотелиальных клетках и вовлечен в дифференцировку эндотелиальных клеток и образование сосудов. Третий рецептор, VEGPR-3, вовлечен в лимфогенез.

Различные изоформы обладают различными видами биологической активности и клиническим значением. Например, VEGF145 индуцирует ангиогенез и аналогично VEGF189 (но в отличие от VEGF165), VEGF145 связывается эффективно с внеклеточным матриксом посредством механизма, который не зависит от ассоциированных с внеклеточным матриксом гепаринсульфатов. VEGF проявляет активность в качестве митогена эндотелиальных клеток и хемоаттрактанта in vitro и индуцирует сосудистую проницаемость и ангиогенез in vivo. VEGF секретируется широким множеством клеток злокачественного типа и обеспечивает рост опухолей посредством индукции развития ассоциированных с опухолью сосудов. Было показано, что ингибирование функции VEGF ограничивает как рост первичных экспериментальных опухолей, так и встречаемость метастазов у иммунодефицитных мышей. Различные дцРНК, направленные на VEGF, описаны в одновременно рассматриваемых заявках США Ser. No. 11/078073 и 11/340080, включенных в настоящий документ в качестве ссылок.

Здесь термин "цепь, содержащая последовательность" относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описывается последовательностью, обозначаемой с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.

В настоящем документе, если нет иных указаний, термин "комплементарный", при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению к другой нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру в определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, что очевидно для специалистов. Такие условия, например, могут представлять собой жесткие условия, где жесткие условия могут включать в себя следующее: 400 мМ NaCl 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ ЭДТА, 50 °С или 70 °С в течение 12-16 ч, с последующим промыванием. Можно применять другие условия, такие как условия, соответствующие физиологическим, встречающиеся в организме. Специалист сможет определить набор условий, наиболее подходящих для определения комплементарности двух последовательностей, в соответствии с окончательным применением гибридизованных нуклеотидов.

Это определение включает спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, на протяжении всей длины первой и второй нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности в настоящем документе могут быть обозначены как "полностью комплементарные" в отношении друг друга. Однако когда первая последовательность в настоящем документе обозначена как "по существу комплементарная" в отношении второй последовательности, две последовательности могут быть полностью комплементарными, или при гибридизации они могут образовывать одну или несколько, но, как правило, не более 4, 3 или 2, не совпадающих пар, сохраняя способность гибридизоваться в условиях, наиболее соответствующих их конечному применению. Однако когда два олигонуклеотида сконструированы для образования, при гибридизации, одного или нескольких одноцепочечных выступающих концов, такие выступающие концы не будут считаться несовпадениями в отношении определения комплементарности. Например, дцРНК, содержащую один олигонуклеотид длиной в 21 нуклеотид, и другой олигонуклеотид длиной в 23 нуклеотида, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которые полностью комплементарны более короткому нуклеотиду, тем не менее, можно назвать "полностью комплементарной" для целей данного изобретения.

Здесь "комплементарные" последовательности также могут включать в себя пары оснований, образованные не по принципу Уотсона-Крика, и/или пары оснований, образованные из неприродных и модифицированных нуклеотидов, или они могут быть полностью образованы ими, при условии выполнения требований в отношении их способности к гибридизации.

Термины "комплементарный", "полностью комплементарный" и "по существу комплементарный" могут здесь использоваться в отношении соответствия пар между смысловой и антисмысловой цепями дцРНК или между антисмысловой цепью дцРНК и последовательностью-мишенью, как будет понятно из контекста их применения.

Здесь полинуклеотид, который "по существу комплементарен по меньшей мере части" матричной РНК (мРНК), относится к полинуклеотиду, который, по существу, комплементарен непрерывному участку представляющей интерес мРНК (например, кодирующей Eg5). Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части мРНК Eg5, если последовательность по существу комплементарна не прерывающейся части мРНК, кодирующей Eg5.

Здесь термин "двухцепочечная РНК", или "дцРНК", относится к комплексу молекул рибонуклеиновой кислоты, имеющих дуплексную структуру, содержащую две антипараллельные и по существу комплементарные, как определено выше, цепи нуклеиновых кислот. Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут быть различными частями более крупной молекулы РНК, или они могут представлять собой отдельные молекулы РНК. Когда две цепи являются частью более крупной молекулы и, таким образом, соединены непрерывной цепью нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, образующих дуплексную структуру, соединительную цепь РНК обозначают как "шпилечная петля". Когда две цепи соединены ковалентно структурами, отличными от непрерывной цепи нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, образующих дуплексную структуру, соединяющую структуру обозначают как "линкер". Цепи РНК могут обладать одинаковым или различным числом нуклеотидов. Максимальное количество пар оснований представляет собой количество нуклеотидов в наиболее короткой цепи дцРНК минус какие-либо выступающие концы, которые находятся в дуплексе. В дополнение к дуплексной структуре дцРНК может содержать один или несколько нуклеотидных выступающих концов.

Здесь "нуклеотидный выступающий конец" относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выступают из дуплексной структуры дцРНК, когда 3'-конец одной цепи дцРНК продолжается за пределами 5'-конца другой цепи, или наоборот. "Тупой", или "тупой конец", означает, что не существует неспаренных нуклеотидов на этом конце дцРНК, т.е. нет нуклеотидных выступающих концов. дцРНК "с тупым концом" представляет собой дцРНК, которая является двухцепочечной на протяжении всей длины, т.е. в которой отсутствуют выступающие нуклеотидные концы на любом конце молекулы.

Термин "антисмысловая цепь" относится к цепи дцРНК, которая включает в себя участок, который по существу комплементарен последовательности-мишени. Здесь термин "участок комплементарности" относится к участку антисмысловой цепи, который по существу комплементарен последовательности, например последовательности-мишени, как определено в настоящем документе. Когда участок комплементарности не полностью комплементарен последовательности-мишени, несоответствия наиболее допустимы в концевых участках, и, если они имеются, как правило, находятся на концевом участке или участках, например, в пределах 6, 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов от 5'- и/или 3'-конца.

Здесь термин "смысловая цепь" относится к цепи дцРНК, которая включает в себя участок, который по существу комплементарен участку антисмысловой цепи.

"Введение в клетку", в отношении дцРНК, означает способствование захвату или поглощению клеткой, как понятно специалистам в данной области. Поглощение и захват дцРНК может происходить через диффузионные или активные клеточные процессы без содействия или посредством вспомогательных средств или устройств. Значение этого термина не ограничено клетками in vitro; дцРНК также можно "вводить в клетку", где клетка является частью живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать в себя доставку в организм. Например, для доставки in vivo дцРНК можно инъецировать в область ткани или вводить системно. Введение в клетку in vitro включает в себя способы, известные в данной области, такие как электропорация и липофекция.

Термины "подавление" и "ингибирование экспрессии", в отношении гена Eg5, в настоящем документе относятся по меньшей мере к частичному подавлению экспрессии гена Eg5, проявляющемуся снижением количества мРНК, транскрибируемой с гена Eg5, которую можно выделить из первой клетки или группы клеток, в которых ген Eg5 транскрибируется и которые были обработаны, чтобы экспрессия гена Eg5 ингибировалась, по сравнению со второй клеткой или группой клеток, по существу, идентичных первой клетке или группе клеток, но которые не были обработаны таким образом (контрольные клетки). Степень ингибирования, как правило, выражают следующим образом:

Альтернативно степень ингибирования можно приводить в величинах снижения параметра, который функционально связан с транскрипцией гена Eg5, например, через количество белка, кодируемого геном Eg5, который секретируется клеткой, или количество клеток, проявляющих определенный фенотип, например апоптоз. В принципе подавление гена Eg5 можно определить в любой клетке, экспрессирующей мишень, либо конститутивно, либо посредством геномной инженерии, и посредством любого пригодного анализа. Однако когда требуется эталон в целях определения того, ингибирует ли данная дцРНК экспрессию гена Eg5 на определенном уровне, и, таким образом, относится ли она к настоящему изобретению, анализ, представленный ниже в разделе "Примеры", будет служить в качестве эталона.

Например, в некоторых случаях экспрессию гена Eg5 (или гена VEGF) подавляют по меньшей мере приблизительно на 20, 25, 35 или 50% посредством введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления ген Eg5 подавляют по меньшей мере приблизительно на 60, 70 или 80% посредством введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления ген Eg5 подавляется по меньшей мере приблизительно на 85, 90 или 95% посредством введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В табл. 1-3 представлены значения для ингибирования экспрессии с использованием различных молекул Eg5 дцРНК в различных концентрациях.

В настоящем документе в контексте экспрессии Eg5 термины "лечить", "лечение" и т.п. относятся к избавлению от патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5 или их смягчению. Здесь, если это относится к любому из других состояний, приведенных в настоящем документе ниже (отличных от патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5), термины "лечить", "лечение" и т.п. означают избавление по меньшей мере от одного симптома, обусловленного таким состоянием, или смягчение его, или замедление, или реверсию прогрессирования такого состояния, такое как замедление и реверсия прогрессирования карциномы печени.

Здесь выражения "терапевтически эффективное количество" и "профилактически эффективное количество" относятся к количеству, которое обеспечивает терапевтическую пользу при лечении, профилактике или управлении течением патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5, или очевидного симптома патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5 (отдельно или в сочетании с экспрессией VEGF). Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, может легко определить врач, и оно может варьировать, в зависимости от факторов, известных в данной области, например, таких как тип патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5, анамнез и возраст пациента, стадия патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5, и проведение других противопатологических процессов, опосредуемых средствами, направленными на экспрессию Eg5.

Здесь "фармацевтическая композиция" включает в себя фармакологически эффективное количество дцРНК и фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем документе "фармакологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или просто "эффективное количество" относится к количеству РНК, эффективному для достижения намеченного фармакологического, терапевтического или профилактического результата. Например, если данное клиническое лечение считают эффективным, когда происходит снижение поддающегося измерению параметра, ассоциированного с заболеванием или нарушением, по меньшей мере на 25%, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения представляет собой количество, необходимое для достижения по меньшей мере 25% снижения этого параметра.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю для введения лекарственного средства. Такие носители включают в себя, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их сочетания. В частности, термин не относится к клеточной культуральной среде. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают в себя, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как инертные разбавители, дезинтеграторы, связующие вещества, смазывающие вещества, подсластители, вкусовые добавки, красители и консерванты. Пригодные инертные разбавители включают в себя карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу, в то время как пригодными дезинтеграторами являются кукурузный крахмал и альгиновая кислота. Связующие вещества могут включать в себя крахмал и желатин, в то время как смазывающее вещество, при его наличии, главным образом будет представлять собой стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. При желании таблетки можно покрывать материалом, таким как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для замедления всасывания в желудочно-кишечном тракте.

В настоящем документе "трансформированная клетка" представляет собой клетку, в которую встроен вектор, с которого может экспрессироваться молекула дцРНК.

II. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК)

В одном варианте осуществления данное изобретение относится к двухцепочечным молекулам рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена Eg5 (отдельно или в сочетании со второй дцРНК для ингибирования экспрессии VEGF) в клетке или у млекопитающего, где дцРНК включает в себя антисмысловую цепь, состоящую из участка комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части мРНК, образованной при экспрессии гена Eg5, и где участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов, как правило, длину в 19-24 нуклеотида, и где указанная дцРНК, при контакте с клеткой, экспрессирующей указанный ген Eg5, ингибирует экспрессию указанного гена Eg5 по меньшей мере на 40%. дцРНК содержит две цепи РНК, которые достаточно комплементарны для гибридизации с образованием дуплексной структуры. Одна цепь дцРНК (в антисмысловой цепи) содержит участок комплементарности, который, по существу, комплементарен и, как правило, полностью комплементарен последовательности, образованной из последовательности мРНК, образованной в процессе экспрессии гена Eg5, другая цепь (смысловая цепь) содержит участок, который комплементарен антисмысловой цепи, так что две цепи гибридизуются и образуют дуплексную структуру при объединении в подходящих условиях. Как правило, дуплексная структура имеет длину между 15 и 30, чаще между 18 и 25, еще чаще между 19 и 24 и наиболее часто между 19 и 21 парами оснований. Аналогично, участок комплементарности последовательности-мишени имеет длину между 15 и 30, чаще между 18 и 25, еще чаще между 19 и 24 и наиболее часто между 19 и 21 нуклеотидами. дцРНК согласно изобретению могут дополнительно содержать один или несколько одноцепочечных нуклеотидных выступающих концов. дцРНК можно синтезировать стандартными способами, известными в данной области, как рассмотрено ниже, например, с использованием автоматического устройства для синтеза ДНК, такого как устройство, коммерчески доступное, например, от Biosearch, Applied Biosystems, Inc. В предпочтительном варианте осуществления ген Eg5 представляет собой ген Eg5 человека. В конкретных вариантах осуществления антисмысловая цепь дцРНК содержит смысловые последовательности, представленные в табл. 1-3, и вторая последовательность выбрана из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1-3. Альтернативные антисмысловые средства, которые нацелены на другую область последовательности-мишени, представленной в табл. 1-3, можно легко определить с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности Eg5. В вариантах осуществления с использованием второй дцРНК, нацеленной на VEGF, такие средства проиллюстрированы в разделе "Примеры" и в одновременно рассматриваемых заявках США с серийными No: 11/078073 и 11/340080, включенных в настоящий документ в качестве ссылок.

дцРНК будут содержать по меньшей мере две нуклеотидных последовательности, выбранных из групп последовательностей, представленных в табл. 1-3. Одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей по существу комплементарна последовательности мРНК, полученной при экспрессии гена Eg5. Таким образом, дцРНК будет содержать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая цепь в табл. 1-3, а второй олигонуклеотид описан в качестве антисмысловой цепи в табл. 1-3.

Специалисту хорошо известно, что дцРНК, содержащие дуплексную структуру из 20-23, в частности, 21 пар оснований, признаны особенно эффективными в отношении индукции интерференции РНК (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако было выявлено, что более короткие или более длинные дцРНК также могут быть эффективны. В вариантах осуществления, описанных выше, вследствие структуры олигонуклеотидных последовательностей, представленных в табл. 1-3, дцРНК согласно изобретению могут содержать по меньшей мере одну цепь длиной минимум в 21 нуклеотид. Можно с полным основанием ожидать, что более короткие дцРНК, содержащие одну из последовательностей, представленных в табл. 1-3, минус только небольшое количество нуклеотидов на одном или обоих концах могут быть сходным образом эффективны по сравнению с дцРНК, описанными выше. Таким образом, изобретение охватывает дцРНК, содержащие неполную последовательность по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более последовательно расположенных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в таблицах 1-3, и отличающиеся по их способности ингибировать экспрессию гена Eg5 в анализе FACS, как описано в настоящем документе ниже, не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования, от дцРНК, содержащей полную последовательность. Кроме того, дцРНК, которые расщепляют последовательность-мишень, представленную в табл. 1-3, можно легко получить с использованием последовательности Eg5 и представленной последовательности-мишени.

Кроме того, агенты RNAi, представленные в табл. 1-3, идентифицируют участок в мРНК Eg5, чувствительный к расщеплению посредством RNAi. По существу, настоящее изобретение далее включает в себя агенты (средства) RNAi, которые направлены на последовательность, на которую нацелен один из агентов согласно изобретению. В настоящем документе второй агент RNAi называют направленным на последовательность первого агента (средства) RNAi, если второй агент RNAi расщепляет транскрипт в любой области мРНК, которая комплементарна антисмысловой цепи первого агента RNAi. Такой второй агент главным образом будет состоять по меньшей мере из 15 последовательно расположенных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в табл. 1-3, связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из области, смежной с выбранной последовательностью в гене Eg5. Например, последние 15 нуклеотидов SEQ ID NO:1, в сочетании со следующими 6 нуклеотидами из гена-мишени Eg5, образуют одноцепочечный агент из 21 нуклеотида, который основан на одной из последовательностей, представленных в табл. 1-3.

дцРНК согласно изобретению может содержать одно или несколько несовпадений с последовательностью-мишенью. В предпочтительном варианте осуществления дцРНК согласно изобретению содержит не более 3 несовпадений. Если антисмысловая цепь дцРНК содержит несовпадения с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы область несовпадения не была расположена в центре участка комплементарности. Если антисмысловая цепь дцРНК содержит несовпадения с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы несовпадение было ограничено 5 нуклеотидами с каждого конца, например 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидами либо с 5'-, либо с 3'-конца участка комплементарности. Например, цепь дцРНК из 23 нуклеотидов, которая комплементарна участку гена Eg5, как правило, не содержит какого-либо несовпадения в центральных 13 нуклеотидах. Описанные способы, относящиеся к данному изобретению, можно использовать для определения наличия эффективности дцРНК, содержащей несовпадение с последовательностью-мишенью в отношении ингибирования экспрессии гена Eg5. Оценка эффективности дцРНК с несовпадениями в отношении ингибирования экспрессии гена Eg5 является важной, особенно если известно, что для конкретной области комплементарности в гене Eg5 отмечена полиморфная вариация последовательности в популяции.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один конец дцРНК имеет одноцепочечный выступающий нуклеотидный конец из 1-4, в основном 1 или 2 нуклеотидов. дцРНК, имеющие по меньшей мере один выступающий нуклеотидный конец, обладают неожиданно более высокими ингибиторными свойствами, чем их аналоги с тупыми концами. Более того, авторы настоящего изобретения открыли, что наличие только одного выступающего нуклеотидного конца усиливает активность дцРНК в отношении интерференции, без влияния на их общую стабильность. Было показано, что дцРНК, имеющие только один выступающий конец, особенно стабильны и эффективны in vivo, а также во множестве клеток, клеточных культуральных средах, крови и сыворотке. В основном одноцепочечный выступающий конец расположен на 3'-конце антисмысловой цепи или, альтернативно, на 5'-конце смысловой цепи. Также дцРНК может обладать тупым концом, как правило, расположенным на 5'-конце антисмысловой цепи. Такие дцРНК обладают повышенной стабильностью и ингибиторной активностью, таким образом, позволяя введение в низких дозировках, т.е. менее 5 мг/кг массы тела реципиента в сутки. Как правило, антисмысловая цепь дцРНК имеет выступающий нуклеотидный конец на 3'-конце, а 5'-конец является тупым. В другом варианте осуществления один или несколько из нуклеотидов в выступающем конце заменены нуклеозидтиофосфатом.

В другом варианте осуществления дцРНК химически модифицирована для повышения стабильности. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению можно синтезировать и/или модифицировать способами, общепринятыми в данной области, такими как способы, описанные в "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, inc., New York, NY, USA, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки. Конкретные примеры предпочтительных соединений дцРНК, пригодных для применения в данном изобретении, включают в себя дцРНК, содержащие модифицированные остовы или не содержащие природных межнуклеозидных связей. Как определено в этом описании, дцРНК, обладающие модифицированными остовами, включают дцРНК, которые сохраняют атом фосфора в остове, и дцРНК, которые не имеют атом фосфора в остове. Для целей этого описания и как иногда упоминают в данной области, модифицированные дцРНК, которые не имеют атом фосфора в их межнуклеозидном остове, также можно считать олигонуклеотидами.

Предпочтительные модифицированные остовы дцРНК включают в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфордитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил-и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги и аналоги, имеющие обратную полярность, где соседние пары нуклеозидных элементов связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Также включаются различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.

Репрезентативные патенты США, в которых описано применение указанных выше содержащих фосфор связей, включают, но не ограничиваются ими, патенты США № № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5 625050, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылок.

Предпочтительные модифицированные остовы дцРНК, которые не содержат атом фосфора, включают в себя остовы, которые образованы короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или цилкоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы, имеющие связи морфолино (частично образованные из части сахара нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и метилентиоформацетильные остовы; содержащие алкен остовы; сульфаматные остовы; метиленимино- и метиленгидразиноостовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие остовы, имеющие смешанные части из компонентов N, О, S и СН 2 .

Репрезентативные патенты США, в которых описано получение указанных выше олигонуклеотидов, включают, но не ограничиваются ими, патенты США № № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылок.

В других предпочтительных миметиках дцРНК, как сахар, так и межнуклеотидная связь, т.е. остов нуклеотидных элементов, заменены новыми группами. Элементы-основания сохранены для гибридизации с соответствующим соединением нуклеиновой кислоты-мишени. Одно такое олигомерное соединение, миметик дцРНК, который, как было показано, обладает превосходными свойствами, касающимися гибридизации, называют пептидной нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA сахарный остов дцРНК заменен содержащим амид остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеиновые основания сохранены и связаны прямо или косвенно через аза-атомы азота амидной части остова. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение соединений PNA, включают, но не ограничиваются ими, патенты США № № 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылок. Дальнейшее описание соединений PNA можно найти в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

Наиболее предпочтительные варианты осуществления данного изобретения представляют собой дцРНК с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеотидами с гетероатомными остовами, и, в частности -CH 2 -NH-CH 2 -, -CH 2 -N(CH 3 )-O-CH 2 - [известным как остов метилен (метилимино) или ММ1], -CH 2 -O-N(CH 3 )-CH 2 -, -CH 2 -N(CH 3 )-N(СН 3 )-СН 2 - и -N(СН 3 )-СН 2 -СН 2 [где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -O-Р-O-СН 2 -] упоминаемого выше патента США № 5489677 и амидные остовы упоминаемого выше патента США № 5602240. Также предпочтительными являются дцРНК, имеющие структуры морфолиноостова упомянутого выше патента США № 5034506.

Модифицированные дцРНК могут содержать также одну или несколько замещенных групп сахаров. Предпочтительные дцРНК включают в 2'-положении один из следующих элементов: ОН; F; O-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил, О-S- или N-алкинил; или О-алкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенные или незамещенные C 1 10 алкил или С 2 10 алкенил и алкинил. Особенно предпочтительными являются O[(CH 2 ) n O] m CH 3 , O(CH 2 ) n OCH 3 , O(CH 2 ) n NH 2 , O(CH 2 ) n CH 3 , O(CH 2 ) n ONH 2 и О(СН 2 ) n ON[(CH 2 ) n CH 3 ] 2 , где m и n составляют от 1 до 10. Другие предпочтительные дцРНК включают в 2'-положении одно из следующего: C 1 10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или O-аралкил, SH, SCH 3 , OCN, Cl, Br, CN, CF 3 , OCF 3 , SOCH 3 , SO 2 CH 3 , ONO 2 , NO 2 , N 3 , NH 2 , гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалирующую группу, группу для улучшения фармакокинетических свойств дцРНК или группу для улучшения фармакодинамических свойств дцРНК, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метилокси (2'-O-СН 2 СН 2 ОСН 3 , также известная как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995; 78, 486-504) т.е. алкокси-алкоксигруппу. Следующая предпочтительная модификация включает 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группу О(СН 2 ) 2 ON(CH 3 ) 2 , также известную как 2'-DMAOE, как описано ниже в разделе "Примеры", и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известный в данной области как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-O-СН 2 -O-CH 2 -N(СН 2 ) 2 , также описанный ниже в разделе "Примеры".

Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси(2'-ОСН 3 ), 2'-аминопропокси(2'-OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации также можно проводить в других положениях дцРНК, в частности, в 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных дцРНК и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. дцРНК могут содержать также миметики сахаров, такие как циклобутильные группы вместо пентафуранозильного сахара. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких модифицированных структур Сахаров, включают, но не ограничиваются ими, патенты США № 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых имеют общего с этой заявкой патентовладельца, и каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ДцРНК могут включать в себя также нуклеотидные модификации и замены оснований (часто обозначаемые в данной области просто как "основания"). В настоящем документе "не модифицированные", или "природные" нуклеотидные основания, включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) , и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, б-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Кроме того, нуклеиновые основания включают основания, описанные в патенте США № 3687808, основания, описанные в Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, стр. 858-859, Kroschwitz, J.L., ed. John Wiley & Sons, 1990, основания, описанные Englisch et al., Angewandte Chemie, Internationaal Edition, 1991, 30, 613, и основания, описанные Sanghvi, Y.S., глава 15, ДцРНК Research and Applications, стр. 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, В., Ed. CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно пригодны для повышения аффинности связывания олигомерных соединений согласно изобретению. Они включают замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и O-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинурацил и 5-пропинцитозин. Было показано, что замены 5-метилцитозином повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooks, S.T. and Lebku, S., Eds., ДцРНК Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными заменами оснований, более конкретно, в сочетании с модификациями сахаров 2'-О-метоксиэтилом.

Репрезентативные патенты США, в которых описано получение некоторых из указанных выше модифицированных нуклеотидных оснований, а также других модифицированных нуклеотидных оснований, включают, но не ограничиваются ими, указанный выше патент США No. 3687808, а также патенты США № 4845205; 513030, 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 3614617 и 5681941, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылок, и патент США № 5750692, также включенный в настоящий документ в качестве ссылки.

Другие модификации дцРНК согласно изобретению включают химическое связывание с дцРНК одной или нескольких групп или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточный захват дцРНК. Такие группы включают, но не ограничиваются ими, липидные группы, такие как группа холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Biorg, Med. Chem. Let., 1994 4:1053-1060), тиоэфир, например, берил-S-тритилтиол (Manoharan et al. , Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al. , Biorg. Med. Chera. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl Acids Res., 1992, 20, 533-538), остатки с алифатической цепью, например остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimic, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-rac-глицеро-3Н-фосфонат (Manoharan el al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea el al. , Nucl Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al. Nucleosides & Nocleotides, 1995, 14, 969-973), или адамантануксусная кислота (Manoharan ei al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), группа пальмитила (Mishra et al., Biochim. Biophys, Acta. 1995, 1264, 229-237) , или группа октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).

Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов, включают, но не ограничиваются ими, патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536: 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылок.

Не обязательно, чтобы все положения в данном соединении были одинаково модифицированы, и, в действительности, в одно соединение или даже в один нуклеозид в дцРНК может быть включено более одной из упомянутых выше модификаций. Также настоящее изобретение включает соединения дцРНК, которые представляют собой химерные соединения. "Химерные" соединения дцРНК или "химеры" в контексте этого изобретения представляют собой соединения дцРНК, в частности дцРНК, которые содержат два или более химически отличающихся участков, каждый из которых состоит по меньшей мере одного мономерного элемента, т.е. нуклеотида в случае соединения дцРНК. Эти дцРНК, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где дцРНК модифицирована, чтобы обеспечивать повышенную устойчивость дцРНК к деградации нуклеазами, повышенный захват клетками и повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Дополнительный участок дцРНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Таким образом, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени, значительно повышая посредством этого эффективность ингибирования посредством дцРНК экспрессии гена. Следовательно, при применении химерных дцРНК часто можно получать сравнимые результаты для более коротких дцРНК, по сравнению с фосфоротиоатными дезокси-дцРНК, гибридизующимися с тем же участком-мишенью. Расщепление РНК-мишени можно определять общепринятыми способами с помощью гель-электрофореза и, если необходимо, ассоциированными с ним способами гибридизации нуклеиновых кислот, известными в данной области.

В некоторых случаях дцРНК можно модифицировать не являющейся лигандом группой. Ряд не являющихся лигандом молекул были конъюгированы с дцРНК в целях повышения активности, распределения в клетках или захвата клетками дцРНК, и в научной литературе доступны способы проведения таких конъюгаций. Такие не являющиеся лигандом группы включают липидные группы, такие как холестерин (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86:6553), холевая кислота (Manoharan et al. , Biorg, Med. Chem. Let., 1994 4:1053), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl Acids Res., 1992, 20:533), остатки с алифатической цепью, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, дигексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-rac-глицеро-3Н-фосфонат (Manoharan el al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea el al., Nucl Acids Res., 1990, 18:3777), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al. Nucleosides & Nocleotides, 1995, 14:969), или адамантануксусная кислота (Manoharan ei al. Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), группа пальмитила (Mishra et al., Biochim. Biophys, Acta. 1995, 1264:229) или группа октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов дцРНК, приведены выше. Типичные протоколы конъюгации вовлекают синтез дцРНК, обладающих амино-линкером в одном или нескольких положениях последовательности. Затем аминогруппу подвергают реакции с молекулой, подлежащей конъюгации, с использованием соответствующих связывающих или активирующих реагентов. Реакцию конъюгации можно проводить либо с дцРНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после отщепления дцРНК в жидкой фазе. Очистка конъюгата дцРНК посредством ВЭЖХ, как правило, приводит к чистому конъюгату.

Кодируемые вектором средства RNAi

дцРНК согласно изобретению также можно экспрессировать внутриклеточно с рекомбинантных вирусных векторов in vivo. Рекомбинантные вирусные векторы согласно изобретению состоят из последовательностей, кодирующих дцРНК согласно изобретению, и любого пригодного промотора для экспрессии последовательностей дцРНК. Пригодные промоторы включают, например, промоторные последовательности РНК pol III U6 или H1 и промотор цитомегаловируса. Выбор других пригодных промоторов находится в пределах квалификации в данной области. Рекомбинантные вирусные векторы согласно изобретению также могут содержать индуцируемые или регулируемые промоторы для экспрессии дцРНК в конкретной ткани или в конкретной внутриклеточной среде. Применение рекомбинантных вирусных векторов для доставки дцРНК согласно изобретению в клетки in vivo более подробно описано ниже.

дцРНК согласно изобретению можно экспрессировать с рекомбинантного вирусного вектора либо в качестве двух отдельных комплементарных молекул РНК, либо в качестве одной молекулы РНК с двумя комплементарными участками.

Можно использовать любой вирусный вектор, способный включать кодирующие последовательности для молекулы (молекул) дцРНК, подлежащей экспрессии, например векторы, образованные из аденовируса (AV); аденоассоциированного вируса (AAV); ретровирусов, например лентивирусов (LV), рабдовирусов, вируса лейкоза мышей, вируса герпеса и т.п. Тропизм вирусных векторов можно модифицировать посредством псевдотипирования векторов с белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов, или посредством замены различных белков капсида вируса соответствующим образом.

Например, лентивирусные векторы согласно изобретению можно псевдотипировать с поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSY), бешенства, Эбола, Мокола и т.п. AAV-векторы согласно изобретению можно получать для нацеливания на различные клетки посредством конструирования векторов для экспрессии различных серотипов капсидных белков. Например, AAV-вектор, экспрессирующий капсид 2 серотипа на геноме 2 серотипа, называют AAV 2/2. Ген этого капсида 2 серотипа в векторе AAV 2/2 можно заменять геном капсида 5 серотипа с получением вектора AAV 2/5. Способы конструирования AAV-векторов, которые экспрессируют различные серотипы капсидных белков, находятся в пределах квалификации в данной области; см., например, Rabinowitz J.E. et al., (2002), J. Virol 76:791-801, полное описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Выбор рекомбинантных вирусных векторов, пригодных для применения в настоящем изобретении, способы вставки последовательностей нуклеиновых кислот для экспрессии дцРНК в вектор и способы доставки вирусного вектора в представляющие интерес клетки находятся в пределах квалификации в данной области. См. например, Domburg R. (1995}. Gene Therap, 2:301-310; Eglitis M.A. (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller A.D. (1990), Him Gene Therap. 1:5-14; Anderson W.F. (1998), Nature 392:25-30; и Rubinson D.A. et al., Nat. Genet. 33:401-406, полное описание которых включено в настоящий документ в качестве ссылок.

Предпочтительными вирусными векторами являются векторы, образованные из AV и AAV. В особенно предпочтительном варианте осуществления дцРНК согласно изобретению экспрессируют в качестве отдельных комплементарных одноцепочечных молекул РНК с рекомбинантного AAV-вектора, содержащего, например, РНК-промоторы либо U6, либо или H1, или промотор цитомегаловируса (CMV).

Пригодный AV-вектор для экспрессии дцРНК согласно изобретению способ конструирования рекомбинантного AV-вектора и способ доставки вектора в клетки-мишени описаны в Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

Пригодные AAV-векторы для экспрессии дцРНК согласно изобретению способы конструирования рекомбинантного AV-вектора и способы доставки векторов в клетки-мишени описаны в Samulski R. et al. (1987), J. Virol 61:3096-3101; Fisher K.J. et al. (1906), J. Virol 70:520-532; Samulski R. et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826; патент США No. 5252479, патент США № 5139941; международной патентной заявке № WO 94/13788 и международной патентной заявке № WO 93/24641, полное описание которых включено в настоящей документ в качестве ссылок.

III. Фармацевтические композиции, содержащие дцРНК

В одном варианте осуществления данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим дцРНК, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая дцРНК, пригодна для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного экспрессией или активностью гена Eg5, такого как патологические процессы, опосредуемые экспрессией Eg5. Такие фармацевтические композиции изготавливают, исходя из способа доставки. Одним примером являются композиции, которые изготавливают для системного введения посредством парентеральной доставки.

В другом варианте осуществления такие композиции далее будут содержать вторую дцРНК, которая ингибирует экспрессию VEGF. ДцРНК, направленные на VEGF, описаны в разделе "Примеры" и в одновременно рассматриваемых заявках США с серийными № 11/078073 и 11/340080.

Фармацевтические композиции согласно изобретению вводят в дозировках, достаточных для ингибирования экспрессии гена Eg5 (и экспрессии VEGF, в случае включения второй дцРНК). Как правило, пригодная доза дцРНК будет находиться в диапазоне от 0,01 до 5,0 мг на килограмм массы тела реципиента в сутки, главным образом, в диапазоне от 1 мкг до 1 мг на килограмм массы в сутки. Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в сутки или дцРНК можно вводить в качестве двух, трех или более меньших доз через соответствующие промежутки на протяжении суток или даже с использованием непрерывной инфузии или доставки через композицию с контролируемым высвобождением. В этом случае дцРНК, находящаяся в каждой меньшей дозе, должна быть соответственно меньшей в целях достижения общей суточной дозировки. Единицу дозировки также можно изготавливать для доставки в течение нескольких суток, например, с использованием общепринятых композиций с замедленным высвобождением, которые обеспечивают замедленное высвобождение дцРНК на протяжении нескольких суток. Композиции с замедленным высвобождением хорошо известны в данной области и особенно пригодны для доставки средств в конкретную область, так что их можно использовать со средствами по настоящему изобретению. В этом варианте осуществления единица дозировки содержит соответствующую многократную суточную дозу.

Для специалистов очевидно, что некоторые факторы могут влиять на дозировку и время, требуемое для эффективного лечения субъекта, включая, но не ограничиваясь ими, тяжесть заболевания или нарушения, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта, и другие имеющиеся заболевания. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать однократное лечение или серию лечений. Оценку эффективных дозировок и время полужизни in vivo для отдельных дцРНК, охватываемых данным изобретением, можно проводить с использованием общепринятых способов или исходя из тестирования in vivo с использованием соответствующей модели на животных, как описано в настоящем документе.

Достижения генетики мышей привело к созданию ряда мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, опосредуемые экспрессией Eg5. Такие модели используют для тестирования дцРНК in vivo, а также для определения терапевтически эффективной дозы.

Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, которые включают соединения дцРНК согласно изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить рядом способов, в зависимости от того, локальное или системное введение является желательным и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным, легочным, например посредством ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, например посредством устройства для распыления; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или внутрижелудочковое введение.

Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, аэрозоли, жидкости и порошки. Могут быть желательными или необходимыми общепринятые фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. Также могут быть пригодны покрытые презервативы, перчатки и т.п. Предпочтительные местные составы включают составы, в которых дцРНК согласно изобретению находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристоилфосфатидилхолин DMPC, дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димиристоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA). ДцРНК согласно изобретению могут быть инкапсулированными в липосомы, или они могут образовывать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно дцРНК могут не образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионными липидами.

Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры включают, но не ограничиваются ими, арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозаноевую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислота, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или C 1-10 алкильный сложный эфир (например, изопропилмиристат IPM), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного применения подробно описаны в патентной заявке США серии № 09/31298, поданной 20 мая 1999 г., которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или в неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. Могут быть желательны загустители, вкусовые добавки, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки или связующие вещества. Предпочтительные пероральные составы представляют собой составы, в которых дцРНК согласно изобретению вводят совместно с одним или несколькими усиливающими проникновение веществами, поверхностно-активными веществами и хелатирующими агентами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолиновую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глухолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Предпочтительные жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, с натрием). Также предпочтительными являются сочетания усиливающих проникновение веществ, например, жирные кислоты/соли в сочетании с желчными кислотами/солями. Особенно предпочтительным сочетанием является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Кроме того, усиливающие проникновение вещества включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. ДцРНК согласно изобретению можно доставлять перорально, в гранулярной форме, включая высушенные распылением частицы, или в форме комплексов, образующих микро- или наночастицы.

Образующие комплекс с дцРНК вещества включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксиэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины; альбумины; крахмалы; акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; производные посредством DEAE полиимины, поллуланы, целлюлозы и крахмалы. Особенно предпочтительные образующие комплекс вещества включают хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен P(TDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочную кислоту), сополимер DL-молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные составы для дцРНК и их получение подробно описаны в заявке США серии № 08/886829 (поданной 1 июля 1997 г.), серии № 09/108673 (поданной 1 июля 1998 г.); серии № 09/256515 (поданной 23 февраля 1999 г.), серии № 09/082624 (поданной 21 мая 1998 г.) и серии № 09/315298 (поданной 20 мая 1999 г.), каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

Композиции и составы для парентерального, интратекального, внутрижелудочкого или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также содержат буферы, разбавители и другие пригодные добавки, такие как, но не ограничиваясь ими, усиливающие проникновение вещества, соединения носителей и другие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Эти композиции можно получать из различных компонентов, которые включают, но не ограничиваются ими, предварительно изготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества или самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Особенно предпочтительными являются составы, которые нацелены на печень, при лечении печеночных нарушений, таких как печеночная карцинома.

Фармацевтические составы по настоящему изобретению, которые для удобства могут быть представлены в единичной дозированной форме, можно получать общепринятыми способами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие способы включают стадию объединения активных ингредиентов с фармацевтическим носителем(ями) или эксципиентом(ами). Как правило, составы получают гомогенным и непосредственным объединением активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или и с теми и с другими, с последующим приданием формы продукту, если необходимо.

Композиции по настоящему изобретению можно изготавливать в любой из множества возможных дозированных форм, таких как, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции по настоящему изобретению также можно изготавливать в качестве суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии далее могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Также суспензия может содержать стабилизаторы.

Эмульсии

Композиции по настоящему изобретению можно получать и изготавливать в качестве эмульсий. Эмульсии, как правило, представляют собой гетерогенные системы из одной жидкости, диспергированной в другой в форме капель с диаметром, как правило, превышающим 0,1 мкм (Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel. Dekker, Inc., New York, N.Y.. volume 1, p. 199; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешивающиеся жидкие фазы, гомогенно смешанные и диспергированные друг в друге. Как правило, эмульсии могут представлять собой либо тип "вода-в-масле" (w/o), либо тип "масло-в-воде" (o/w). Когда водную фазу тонко измельчают и диспергируют в виде мелких капель в объемной масляной фазе, полученную композицию называют эмульсией типа "вода-в-масле" (w/o). Альтернативно, когда масляную фазу тонко измельчают и диспергируют в виде мелких капель в объемной водной фазе, полученную композицию называют эмульсией типа "масло-в-воде" (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты, в дополнение к диспергированным фазам, и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в качестве раствора либо в водной фазе, либо в масляной фазе, либо самостоятельно в качестве отдельной фазы. Фармацевтические эксципиенты, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, также могут присутствовать в эмульсиях, если необходимо. Фармацевтически эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят более чем из двух фаз, например, такие как в случае эмульсий типа "масло-в-воде-в-масле" (o/w/o) и "вода-в-масле-в-воде" (w/o/w). Такие комплексные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двойные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капли эмульсии o/w включают небольшие капли воды, представляют собой эмульсии w/o/w. Аналогично система масляных капель, заключенных в капли воды, стабилизированные в масляной фазе, представляет собой эмульсию o/w/o.

Эмульсии характеризуются небольшой термодинамической стабильностью или ее отсутствием. Часто диспергированная или непрерывная фаза эмульсии хорошо диспергирована во внешней или непрерывной фазе и поддерживается в этой форме посредством эмульгаторов или вязкости состава. Любая из фаз эмульсии может быть полутвердой или твердой, как в случае основ мазей и кремов эмульсионного типа. Другие способы стабилизации эмульсий включают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы можно приближенно классифицировать на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбирующие основы и тонкодисперсные твердые вещества (Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Mc, New York, N.Y., vol. 1, p. 199).

Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как поверхностно-активные агенты, нашли широкое применение в составах эмульсий и рассмотрены в литературе (Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.) 1988, Marcel Dekker, Inc.. New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, vol. 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества, как правило, являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Соотношение гидрофильных и гидрофобных свойств поверхностно-активного вещества было названо гидрофильным/липофильным балансом (HLB), и оно является важным параметром при классификации и выборе поверхностно-активных веществ при изготовлении составов. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать на различные классы, исходя из характера гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 285).

Встречающиеся в природе эмульгаторы, используемые в эмульсионных составах, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбирующие основы обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий w/o, но сохраняя их полутвердую консистенцию, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин. Тонкоизмельченные твердые вещества также используют в качестве пригодных эмульгаторов, особенно в сочетании с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерилтристеарат.

Большое множество неэмульгирующих материалов также включают в эмульсионные составы, и они обеспечивают свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, жирные сложные эфиры, смачивающие вещества, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p, 335; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.. New York, N.Y.. vol. 1, p. 199).

Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе камеди и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза и карбоксипропилцеллюлоза) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии посредством образования сильных межфазных пленок вокруг капель дисперсной фазы и посредством повышения вязкости наружной фазы.

Поскольку эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стерины и фосфатиды, которые в значительной степени могут поддерживать рост микробов, эти составы часто включают консерванты. Обычно используемые консерванты, включенные в эмульсионные составы, включают метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, хлорид бензалкония, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также часто добавляют в эмульсионные составы для предотвращения повреждения состава. Используемые антиоксиданты могут представлять собой ловушки свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол или восстановители, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергисты антиоксидантов, такие как лимонная кислота, виннокаменная кислота и лецитин.

Применение эмульсионных составов посредством дерматологических, пероральных и парентеральных путей и способы их изготовления рассмотрены в литературе (Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., vol. 1, p. 199). Эмульсионные составы для пероральной доставки широко используют вследствие простоты изготовления, а также эффективности с точки зрения всасывания и биодоступности (Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., vol. 1, p. 245; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199). К материалам, которые часто вводят перорально в форме эмульсий o/w, относятся слабительные средства на основе минерального масла, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жиров.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции дцРНК и нуклеиновых кислот изготавливают в форме микроэмульсий. Микроэмульсию можно определить как систему воды, масла и амфифильного вещества, которая представляет собой отдельный оптически изотропный и термодинамически стабильный жидкий раствор (Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Как правило, микроэмульсии представляют собой системы, которые получают первоначальным диспергированием масла в водном растворе поверхностно-активного вещества с последующим добавлением достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта средней длины цепи, с образованием прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также описаны как термодинамически стабильные, изотропно чистые дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, которые стабилизированы межфазными пленками из поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, стр. 185-215). Микроэмульсии обычно получают комбинированием от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Является ли микроэмульсия эмульсией типа "вода-в-масле" (w/o) или "масло-вводе" (o/w), зависит от свойств используемого масла и поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрического расположения полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностно-активного вещества (Schott, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

Феноменологический подход с применением фазовых диаграмм был широко исследован и привел к обширному знанию специалистами в данной области того, каким образом изготавливать микроэмульсии (Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N,Y.; vol. 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., vol. 1, p. 335). По сравнению с общепринятыми эмульсиями микроэмульсия обеспечивает преимущество растворения нерастворимых в воде лекарственных средств в составе термодинамически стабильных капель, которые образуются спонтанно.

Поверхностно-активные вещества, используемые для получения микроэмульсий, включают в себя, но не ограничиваются ими, ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, олеиловые эфиры полиоксиэтилена, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, монолауреат тетраглицерина (ML310), моноолеат тетраглицерина (МО310), моноолеат гексаглицерина (РО310), пентаолеат гексаглицерина (РО500), монокапрат декаглицерина (МСА750), моноолеат декаглицерина (МО750), секвиолеат декаглицерина (SO750), декаолеат декаглицерина (DAO750), отдельно или в сочетании с вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, как правило, короткоцепочечный спирт, такой как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для повышения межфазной текучести посредством проникновения в пленку поверхностно-активного вещества, с последующим разрушением пленки вследствие свободного объема, создаваемого между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии можно получать без применения вторичных поверхностно-активных веществ, и не содержащие спирт самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы известны в данной области. Водная фаза, как правило, может представлять собой, но не ограничивается ими, воду, водный раствор лекарственного средства, глицерин PEG300, PEG4 00, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать, но не ограничиваться ими, материалы, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, моно-, ди- и триглицериды средней цепи (С8-С12), полиоксиэтилированные глицерильные сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты, полигликозилированные глицериды, насыщенные полигликозилированные С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.

Микроэмульсии представляют собой особый интерес с точки зрения растворения лекарственных средств и усиленного всасывания лекарственных средств, микроэмульсии на основе липидов (как o/w, так и w/o) были предложены для усиления пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества улучшенного растворения лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного усиления всасывания лекарственного средства вследствие индуцируемых поверхностно-активным веществом изменений текучести и проницаемости мембран, простоты изготовления, простоты перорального введения по сравнению с твердыми дозированными формами, повышенной клинической эффективности и сниженной токсичности (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться спонтанно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающей среды. Это может быть особенно преимущественным при изготовлении термически нестойких лекарственных средств, пептидов или дцРНК. Микроэмульсии также эффективны при трансдермальной доставке активных компонентов как в косметических, так и в фармацевтических способах применения. Ожидается, что микроэмульсионные композиции и составы по настоящему изобретению будут способствовать повышенному системному всасыванию дцРНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также повысят локальный клеточный захват дцРНК и нуклеиновых кислот.

Микроэмульсии по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как моностеарат сорбитана (Grill 3), Labrasol, и усиливающие проникновение вещества для улучшения свойств состава и для повышения всасывания дцРНК и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Усиливающие проникновение вещества, используемые в микроэмульсиях по настоящему изобретению, можно классифицировать, как относящиеся к одной из пяти широких категорий - поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, желчные соли, хелатирующие агенты и нехелатирующие не поверхностно-активные вещества (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Все из этих классов рассмотрены выше.

Липосомы

Существует множество упорядоченных структур поверхностно-активных веществ, помимо микроэмульсий, которые были исследованы и которые использовали для изготовления лекарственных средств. Они включают монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, привлекли большой интерес, вследствие их специфичности и длительности действия, которые они обеспечивают с точки зрения доставки лекарственных средств. Как используют в настоящем изобретении, термин "липосома" означает носитель, состоящий из амфифильных липидов, расположенных в виде сферического бислоя или бислоев.

Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые обладают мембраной, образованной из липофильного материала, и водным содержимым. Водная часть содержит композицию, подлежащую доставке. Катионные липосомы обладают тем преимуществом, что они способны к слиянию с клеточной стенкой. Некатионные липосомы, хотя и не способны к такому эффективному слиянию с клеточной стенкой, захватываются макрофагами in vivo.

Для пересечения интактной кожи млекопитающих липидные везикулы должны пройти через ряд мелких пор, каждая из которых обладает диаметром менее 50 нм, под действием пригодного трансдермального градиента. Таким образом, является желательным применение липосомы, которая является высоко деформируемой и способна проходить через такие мелкие поры.

Следующие преимущества липосом включают липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биологически совместимыми и биологически деградируемыми; липосомы могут включать широкий диапазон растворимых в воде и липидах лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в их внутренних частях от метаболизма и деградации (Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Важным фактором при получении липосомальных составов является поверхностный заряд липида, размер везикулы и объем воды в липосомах.

Липосомы пригодны для переноса и доставки активных ингредиентов в область действия. Вследствие того, что липосомальная мембрана структурно сходна с биологическими мембранами, когда липосомы наносят на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами и по мере прогрессирования слияния липосомы и клетки содержимое липосом выходит в клетку, где активное средство может действовать.

Липосомальные составы являются объектом широкого исследования в качестве способа доставки множества лекарственных средств. Существуют накапливающиеся данные, что для местного введения липосомы обладают некоторыми преимуществами относительно других составов. Такие преимущества включают сниженные побочные эффекты, связанные с высоким системным всасыванием вводимого лекарственного средства, повышенное накопление вводимого лекарственного средства в области требуемой мишени, и способность вводить широкий диапазон лекарственных средств как гидрофильных, так и гидрофобных, в кожу.

В нескольких сообщениях была указана способность липосом доставлять средства, включающие высокомолекулярную ДНК, в кожу. В кожу вводили соединения, включающие анальгетики, антитела, гормоны и высокомолекулярные ДНК. Большинство применений приводило к направлению в верхний эпидермис.

Липосомы относятся к двум широким классам. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосома связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализуется в эндосоме. Вследствие кислых значений рН в эндосоме, липосомы разрушаются, высвобождая содержимое в цитоплазму клетки (Wang et al., Biochem. Biophys. Res, Commun, 1987, 147, 980-985).

Липосомы, которые являются чувствительными к рН или отрицательно заряженными, включают ДНК, а не образуют комплекс с ней. Поскольку как ДНК, так и липид сходным образом заряжены, происходит отталкивание, а не образование комплекса. Тем не менее, некоторые ДНК заключены в водное содержимое этих липосом. Чувствительные к рН липосомы использовали для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы, в монослои клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена выявляли в клетках-мишенях (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

Один основной тип липосомальной композиции включает фосфолипид, отличный от природного фосфатидилхолина.

Нейтральные липосомальные композиции, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомальные композиции, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, в то время как анионные фузогенные липосомы образованы, главным образом, из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомальной композиции образован из фосфатидилхолина (FC), например, такого как PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипидов и/или фосфатидилхолина и/или холестерина.

В нескольких исследованиях оценивали местную доставку липосомальных лекарственных составов в кожу. Применение липосом, содержащих интерферон, на коже морской свинки привело к снижению кожных герпетических язв, в то время как доставка интерферона другими способами (например, в качестве раствора или в качестве эмульсии) была неэффективной (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Кроме того, в дополнительном исследовании проводили тестирование эффективности интерферона, вводимого в качестве части липосомального состава, и введение интерферона с использованием водной системы, и сделали вывод, что липосомальный состав превосходил водное введение (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).

Неионные липосомальные системы также исследовали для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомальные составы, содержащие Novasome ™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome ™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина-А в дерму кожи мыши. Результаты показали, что такие неионные липосомальные системы являются эффективными в отношении способствования накоплению циклоспорина-А в различных слоях кожи (Hu et al., S.T.P.Pharma, Sci., 1994, 4, 6, 466).

Также липосомы включают "пространственно стабилизированные" липосомы, термин, который, как используют в настоящем документе, относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к повышенному времени нахождения в кровотоке относительно липосом, лишенных таких специализированных липидов. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующей везикулу липидной фракции липосомы (А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид G M 1, или (В) образует производное с одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как группа полиэтиленгликоля (PEG). Без связи с какой-либо конкретной теорией, в данной области полагают, что, по меньшей мере, для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или производные посредством PEG липиды, повышенное время полужизни в кровотоки этих пространственно стабилизированных является следствием сниженного захвата в клетки ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu el al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны в данной области. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) сообщили о способности моносиалоганглиозида G M 1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола повышать время полужизни липосом в крови. Эти открытия были развиты Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad, Sci., U.S.A., 1988, 85, 6949). В патенте США № 4837028 и WO 88/04924, оба Allen el al., описаны липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид G M 1 или сложный эфир сульфата галактоцереброзида. В патенте США No. 5543152 (Webb el al.) описаны липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, описаны в WO 97/13499 (Lim et al.).

Множество липосом, содержащих липиды, преобразованные посредством одного или нескольких гидрофильных полимеров, и способы их получения известны в данной области. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описали липосомы, содержащие неионный детергент, 2C 12 l5G, который содержит группу PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) отметили, что гидрофильное покрытие частиц полистирола полимерными гликолями приводит к значительному повышению времени полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные посредством присоединения карбоксильных групп полиалкиленгликолей (например, PEG), описаны Sears (патенты США № 4426330 и 4534899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) описали эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (РЕ), преобразованный посредством PEG или стеарата PEG, обладают значительно повышенным временем полужизни в кровотоке. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) расширили эти наблюдения посредством других преобразованных посредством PEG фосфолипидов, например DSPE-PEG, образованного из сочетания дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и PEG. Липосомы, обладающие ковалентно связанными группами PEG на их наружной поверхности, описаны в европейском патенте № ЕР 0445131 В1 и WO 90/04384, выданных Fisher. Липосомальные композиции, содержащие 1-20 мольных процентов РЕ, преобразованного посредством PEG, и способы их применения описаны Woodle at al. (патенты США № 5013556 и 5356633) и Martin et al. (патент США № 5213804 и европейский патент № ЕР 0496813 В1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов липид-полимер, описаны в WO 91/05545 и патенте США № 5225212 (оба Martin et al.) и в WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Липосомы, содержащие модифицированные посредством PEG церамидные липиды, описаны в WO 96/10391 (Choi et al.). В патенте США № 5540935 (Miyazaki et al.) и патенте США № 5556948 (Tagawa et al.) описаны содержащие PEG липосомы, которые могут быть далее преобразованы функциональными группами на их поверхностях.

В данной области известно ограниченное число липосом, содержащих нуклеиновые кислоты. В WO 96/40062, Thierry et al., описаны способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомы. В патенте США № 5264221, выданном Tagawa et al., описаны связанные белком липосомы, и утверждается, что содержимое таких липосом может включать дцРНК. В патенте США № 5665710, выданном Rahman et al., описаны некоторые способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомы. В WO 97/04787, Love et al., описаны липосомы, содержащие дцРНК, нацеленные на ген raf.

Трансферосомы являются другим типом липосом, и они представляют собой высоко деформируемые липидные агрегаты, которые являются привлекательными кандидатами в качестве носителей для доставки лекарственных средств. Трансферосомы можно описать, как липидные капли, которые являются настолько высоко деформируемыми, что они способны легко проникать через поры, которые меньше капель. Трансферосомы адаптируются к среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (адаптивными к форме пор в коже), самовосстанавливающимися, часто достигают их мишеней без фрагментации и часто являются самонагружающимися. Для получения трансферосом к стандартной липосомальной композиции можно добавлять активаторы границ поверхностей, как правило, поверхностно-активные вещества. Трансферосомы использовали для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредуемая трансферосомами доставка сывороточного альбумина является такой же эффективной, как и подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.

Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классификации и упорядочивания свойств множества различных типов поверхностно-активных веществ, как природных, так и синтетических, является применение гидрофильного/липофильного баланса (HLB). Структура гидрофильной группы (также известной как "головка") обеспечивает наиболее пригодные способы классификации различных поверхностно-активных веществ, используемых в составах (Rieger, Pfarmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Если молекула поверхностно-активного вещества не является ионизированной, ее классифицируют как неионное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества широко применяют в фармацевтических и косметических продуктах, и они применимы при широком диапазоне значений рН. В основном их значения HLB варьируют от 2 приблизительно до 18, в зависимости от их структуры. Неионные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Также к этому классу относятся неионные аланоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры.

Поверхностно-активные вещества на основе полиоксиэтилена являются наиболее известными членами класса неионных поверхностно-активных веществ.

Если молекула поверхностно-активного вещества обладает отрицательным зарядом, когда она растворена или диспергирована в воде, поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсулофонаты, ацилизотионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными членами класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла.

Если молекула поверхностно-активного вещества обладает положительным зарядом, когда она растворена или диспергирована в воде, поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают четвертичные соли аммония и этоксилированные амины.

Четвертичные соли аммония являются наиболее используемыми членами этого класса.

Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести либо положительный, либо отрицательный заряд, поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.

Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и эмульсиях описано (Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., 1988, p. 285).

Усиливающие проникновение вещества

В одном варианте осуществления для достижения эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности дцРНК, в кожу животных в настоящем изобретении используют различные усиливающие проникновения вещества. Большинство лекарственных средств находятся в растворе, как в ионизированной, так и в неионизированной форме. Однако, как правило, только растворимые в липидах или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было открыто, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембраны, подлежащие пересечению, обработаны усиливающим проникновение веществом. В дополнение к способствованию диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, усиливающие проникновение вещества также усиливают проницаемость для липофильных лекарственных средств.

Усиливающие проникновение вещества можно классифицировать, как относящиеся к одной из пяти широких категорий, т.е. к поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, желчным солям, хелатирующим агентам, нехелатирующим не поверхностно-активным веществам (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из упомянутых выше классов усиливающих проникновение лекарственных средств более подробно описан ниже.

Поверхностно-активные вещества:

В отношении настоящего изобретения, поверхностно-активные вещества (или "поверхностно-активные агенты") представляют собой химические молекулы, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межповерхностное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, что приводит к усилению всасывания дцРНК через слизистую оболочку. В дополнение к желчным солям и жирным кислотам эти усиливающие проникновение вещества включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфторированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Жирные кислоты:

Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют в качестве усиливающих проникновение веществ, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеил-rac-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, 1-монокапрат глицерина, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их C 1-10 -алкиловые сложных эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый), и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol, 1992, 44, 651-654).

Желчные соли:

Физиологическая роль желчи включает способствование диспергированию и всасыванию липидов и жирорастворимых витаминов (Brunton, глава 38 в: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9th Ed., Hardman et al. , Eds., McGraw-Hill, New York. 1906, pp. 934-935). Различные природные желчные соли и их синтетические производные действуют в качестве усиливающих проникновение веществ. Таким образом, термин "желчные соли" включает любые из встречающихся в природе компонентов желчи, а также любые из их синтетических производных. Желчные соли согласно изобретению включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глухолевую кислоту (глухолат натрия), глихолевую кислоту (глихолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (Lee et al. , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, стр. 92; Swinyard, глава 39 в: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton. Pa., 1990, стр. 782-783; Muranishi, (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990. 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Хелатирующие агенты:

Хелатирующие агенты, как используют в отношении настоящего изобретения, можно определить как соединения, которые удаляют из раствора ионы металлов посредством образования с ними комплексов, что приводит к усилению всасывания дцРНК через слизистые оболочки. В отношении их применения в качестве усиливающих проникновения веществ в настоящем изобретении, хелатирующие агенты обладают дополнительным преимуществом, состоящим в том, что они также служат в качестве ингибиторов ДНКаз, поскольку наиболее хорошо охарактеризованным ДНК-нуклеазам для катализа необходимы двухвалентные ионы, и, таким образом, они ингибируются хелатирующими агентами (Jarrett. J. Chromatogr., 19 93, 618, 315-339). Хелатирующие агенты согласно изобретению включают, но не ограничиваются ими, этилендиаминтетраацетат динатрия (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), N-ацил-производные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацил-производные бета-дикетонов (энамины) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

Нехелатирующие не поверхностно-активные вещества:

Как используют в настоящем документе, усиливающие проникновение соединения в виде нехелатирующих не поверхностно-активных веществ можно определить как соединения, которые демонстрируют незначительную активность в качестве хелатирующих агентов или в качестве поверхностно-активных веществ, но которые, тем не менее, усиливают всасывание дцРНК через слизистые оболочки пищеварительного тракта (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс усиливающих проникновение веществ включает, например, ненасыщенные циклические соединения мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, стр. 92); и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol. 1987, 39, 621-626).

Также в фармацевтические и другие композиции по настоящему изобретению можно добавлять средства, которые усиливают захват дцРНК на клеточном уровне. Например, известно, что клеточный захват дцРНК усиливают катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al., патент США No. 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка РСТ WO 97/30731).

Для усиления проникновения вводимых нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, включая гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.

Носители

Некоторые композиции по настоящему изобретению также включают в состав соединения носителей. Как используют в настоящем документе, "соединение носителя" или "носитель" может относиться к нуклеиновой кислоте, или ее аналогу, которая является инертной (т.е. не обладает самостоятельной биологической активностью), но распознается в качестве нуклеиновой кислоты в процессах in vivo, которая снижает биодоступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, например, посредством деградации биологически активной нуклеиновой кислоты или обеспечения ее удаления из циркуляции. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения носителя, как правило, с избытком последнего вещества, может приводить к значительному снижению количества нуклеиновой кислоты, доставляемой в печень, почку или другие внециркуляторные резервуары, главным образом, вследствие конкуренции между соединением носителя и нуклеиновой кислоты за общий рецептор. Например, доставку частично фосфоротиоатной дцРНК в печеночную ткань можно снизить при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидной кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev, 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Эксципиенты

В отличие от соединения носителя, "фармацевтический носитель" или "эксципиент" представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее вещество или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот животному. Эксципиент может быть жидким или твердым, и его выбирают с учетом намеченного способа введения, чтобы обеспечить требуемый объем, консистенцию и т.д., при комбинировании с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают, но не ограничиваются ими, связующие вещества (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или водородфосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтегрирующие вещества (например, крахмал, натрия крахмала гликолят и т.д.) и смачивающие вещества (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).

Фармацевтически приемлемый органический или неорганический эксципиент, пригодный для непарентерального введения, который не вступает в неблагоприятные реакции с нуклеиновыми кислотами, также можно использовать для изготовления композиций по настоящему изобретению. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

Составы для местного введения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы и общепринятые растворители, такие как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидкой или твердой масляных основах. Также растворы могут содержать буферы, разбавители и другие пригодные добавки. Можно использовать фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, пригодные дли непарентерального введения, которые не вступают в неблагоприятные реакции с нуклеиновыми кислотами.

Пригодные фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилазу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

Другие компоненты

Композиции по настоящему изобретению, кроме того, могут содержать дополнительные вспомогательные компоненты, обычно присутствующие в фармацевтических композициях, с их установленными в данной области уровнями применения. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически-активные материалы, например, такие как противозудные средства, вызывающие сокращение тканей средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или они могут содержать дополнительные материалы, пригодные для физического изготовления различных дозированных форм композиций по настоящему изобретению, такие как красители, вкусовые добавки, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны чрезмерно препятствовать видам биологической активности компонентов композиций по настоящему изобретению. Составы можно стерилизовать и, если желательно, смешивать со вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими веществами, эмульгаторами, солями для изменения осмотического давления, буферами, красителями, вкусовыми добавками и/или ароматическими веществами и т.п., которые вступают в неблагоприятные реакции с нуклеиновой кислотой(ами) состава.

Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Также суспензия может содержать стабилизаторы.

Некоторые варианты осуществления этого изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим (а) одно или несколько антисмысловых соединений и (b) одно или несколько других химиотерапевтических средств, которые функционируют посредством не антисмыслового механизма. Примеры таких химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваются ими, даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозинарабинозид, бис-хлорэтилнитрозомочевину, бусульфан, митомицин С, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевину, азотистые иприты, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксициклофосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстилбестрол (DES). См., главным образом, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J. При применении с соединениями согласно изобретению такие хемотерапевтические средства можно использовать отдельно (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение периода времени с последующим МТХ и олигонуклеотидом) или в сочетании с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими средствами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид, или 5-FU, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь ими, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и противовирусные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь ими, рибивирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, также можно комбинировать в композициях согласно изобретению. См., главным образом, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., стр. 2499-2506 и 46-49, соответственно). Другие неантисмысловые химиотерапевтические средства также находятся в объеме этого изобретения. Два или более комбинированных соединений можно использовать совместно или последовательно.

Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определять стандартными фармацевтическими способами в клеточных культурах или у экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной у 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной у 50% популяции). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс, и его можно выразить в виде соотношения LD50/ED50. Соединения, которые обладают высокими терапевтическими индексами, являются предпочтительными.

Данные, полученные из анализов в культуре клеток и исследований на животных, можно использовать при изготовлении диапазона дозировок для применения у человека. Дозировка композиций согласно изобретению, главным образом, находится в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают ED50 с небольшой токсичностью или с ее отсутствием. Дозировка может варьировать в этом диапазоне в зависимости от используемой дозированной формы и применяемого способа введения. Для любого соединения, используемого в способе согласно изобретению, терапевтически эффективную дозу можно первоначально оценить из анализов в клеточной культуре. В моделях на животных дозу можно изготавливать для достижения диапазона концентраций в циркулирующей плазме соединения или, когда это применимо, полипептидного продукта последовательности-мишени (например, достижение сниженной концентрации полипептида), которая включает IC50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, которая достигает половины максимального ингибирования симптомов), определенную в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодных доз у человека. Уровни в плазме можно измерять, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией.

В дополнение к их введению отдельно или в сочетании, как рассмотрено выше, дцРНК согласно изобретению можно вводить в сочетании с другими известными средствами, эффективными для лечения патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5. В любом случае проводящий введение врач может корректировать количество и интервалы для введения дцРНК, исходя из результатов, выявленных с использованием стандартных показателей эффективности, известных в данной области или описанных в настоящем документе.

Способы лечения заболеваний, вызываемых экспрессией гена Eg5

Данное изобретение относится, в частности, к применению дцРНК или фармацевтической композиции, полученной из нее, для лечения злокачественной опухоли, например, для ингибирования роста опухоли и метастазирования опухоли. Например, дцРНК или фармацевтическую композицию, полученную из нее, можно применять для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак легкого, рак головы и шеи, злокачественная опухоль головного мозга, абдоминальная злокачественная опухоль, рак толстого кишечника, рак ободочной и прямой кишки, рак пищевода, желудочно-кишечный рак, глиома, рак печени, рак языка, нейробластома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, ретинобластома, опухоль Вильмса, множественная миелома, и для лечения рака кожи, такого как меланома, для лечения лимфом и злокачественных опухолей крови. Кроме того, данное изобретение относится к применению дцРНК в соответствии с этим изобретением или фармацевтической композиции, полученной из нее, для ингибирования экспрессии Eg5 и/или дли ингибирования накопления асцитной жидкости и плеврального выпота при различных типах злокачественной опухоли, например, при раке молочной железы, раке легкого, раке головы, раке шеи, злокачественной опухоли головного мозга, абдоминальном раке, раке толстого кишечника, раке ободочной и прямой кишки, раке пищевода, желудочно-кишечном раке, глиоме, раке печени, раке языка, нейробластоме, остеосаркоме, раке яичника, раке поджелудочной железы, раке предстательной железы, ретинобластоме, опухоли Вильмса, множественной миеломе, раке кожи, меланоме, лимфомах и злокачественных опухолях крови. Вследствие ингибиторного эффекта на экспрессию Eg5, дцРНК в соответствии с этим изобретением или фармацевтическая композиция, полученная из нее, может повышать качество жизни.

Более того, данное изобретение относится к применению дцРНК или ее фармацевтической композиции, например, для лечения злокачественной опухоли или для профилактики метастазирования опухоли, в сочетании с другими фармацевтическими средствами или другими способами терапии, например, с известными фармацевтическими средствами и/или известными способами терапии, например, такими как средства и способы, которые в настоящее время применяют для лечения злокачественной опухоли и/или для профилактики метастазирования опухоли.

Предпочтительным является сочетание с лучевой терапией и химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин, циклофосфамид, 5-фторурацил, адриамицин, даунорубицин или тамоксифен. Другие варианты осуществления включают применение второй дцРНК, используемой для ингибирования экспрессии VEGF.

Также данное изобретение можно применять на практике посредством включения со специфичным средством RNAi, в сочетании с другим химиотерапевтическим средством против злокачественной опухоли, таким как любое общепринятое химиотерапевтическое средство, или с другой дцРНК, применяемой для ингибирования экспрессии VEGF. Сочетание определенного связывающего средства с другими такими средствами может усиливать действие химиотерапевтического протокола.

Квалифицированному специалисту будет известно множество химиотерапевтических протоколов, которые можно включать в способ согласно изобретению. Можно использовать любое химиотерапевтическое средство, включая алкилирующие средства, антиметаболиты, гормоны и антагонисты, радиоизотопы, а также природные продукты. Например, соединение согласно изобретению можно вводить с антибиотиками, такими как доксорубицин и другие антрациклиновые аналоги, азотистые иприты, такие как циклофосфамид, аналоги пиримидинов, такие как 5-фторурацил, цисплатин, гидроксимочевина, таксол и его природные и синтетические производные, и т.п. В качестве другого примера, в случае смешанных опухолей, таких как аденокарцинома молочной железы, где опухоли включают гонадотропин-зависимые и гонадотропин-независимые клетки, соединение можно вводить совместно с леупролидом или гозерелином (синтетические пептидные аналоги LH-RH). Другие протоколы против злокачественных опухолей включают применение соединения тетрациклина с другим способом лечения, например, хирургической операцией, лучевой терапией и т.д., также обозначаемыми в настоящем документе как "дополнительные способы лечения злокачественных опухолей". Таким образом, способ согласно изобретению можно использовать с такими общепринятыми схемами с преимуществом снижения побочных эффектов и усиления эффективности.

Способы ингибирования экспрессии гена Eg5

В другом аспекте данное изобретение относится к способу ингибирования экспрессии гена Eg5 у млекопитающего. Способ включает введение композиции согласно изобретению млекопитающему, чтобы происходило подавление экспрессии гена-мишени Eg5. Вследствие высокой специфичности дцРНК согласно изобретению специфично нацелены на РНК (первичные или процессированные) гена-мишени Eg5. Композиции и способы для ингибирования экспрессии этих генов Eg5 с использованием дцРНК можно осуществлять, как описано в настоящем документе.

В одном варианте осуществления способ включает введение композиции, содержащей дцРНК, где дцРНК содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна по меньшей мере части РНК-транскрипта гена Eg5 млекопитающего, подлежащего лечению. Когда организм, подлежащий лечению, представляет собой млекопитающее, такое как человек, композицию можно вводить любыми способами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, пероральные или парентеральные способы, включая внутримышечное, подкожное, трансдермальное, осуществляемое через дыхательные пути (аэрозоль), назальное, ректальное и местное (включая буккальное и сублингвальное) введение. В предпочтительных вариантах осуществления композиции вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции.

Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, обладают тем же значением, как обычно понимает специалист в области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что при осуществлении на практике или тестирования этого изобретения можно применять способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, пригодные способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, включены в качестве ссылок в полном объеме. В случае противоречий следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Примеры"Прогулка по гену" Eg5

Исходная скрининговая группа

Проводили конструирование siRNA для идентификации siRNA, нацеленных на Eg5 (также известный как KIF11, HSKP, KNSL1 и TRIP5). Использовали последовательности мРНК человека к Eg5, RelSeq ID номер:NM_004523.

Конструировали дуплексы siRNA, перекрестно реагирующие с Eg5 человека и мыши. Для скрининга синтезировали двадцать четыре дуплекса (табл. 1).

Расширенная скрининговая группа

Была определена вторая скрининговая группа из 266 siRNA, нацеленных на EG5 человека, а также на его ортолог макак-резус (табл. 2). Была выбрана расширенная скрининговая группа из 328 siRNA, нацеленных на EG5, без обязательного совпадения с какой-либо мРНК EG5 других видов (табл. 3).

Последовательности мРНК EG5 человека и частично резус загружали из нуклеотидной базы данных NCBI, и последовательность человека далее использовали в качестве эталонной последовательности (EG5 человека: NM_0004523.2, 4908 п.о. и EG5 резус: ХМ_001087644.1, 878 п.о. (только 5'-часть EG5 человека).

Для идентификации других последовательностей EG5 резус проводили поиск mega blast с последовательностью человека против эталонного генома резус. Загруженная последовательность резус и участки совпадений в blast hit были собраны в консенсусную последовательность резус с ~92% идентичностью с EG5 человека на протяжении полной длины.

Из последовательности мРНК человека были извлечены все возможные 19-меры с получением пула участков мишеней-кандидатов, соответствующих 4890 (смысловая цепь) последовательностям siRNA, реакционноспособных в отношении EG5 человека.

Для исходной скрининговой группы из этого пула кандидатов в качестве необходимого условия для селекции siRNA in silico определяли перекрестную реактивность человек-резус. Для определения резус-реакционных siRNA каждый участок мишени-кандидата для siRNA исследовали в отношении наличия в собранной последовательности для резус. Кроме того, предсказанную специфичность siRNA в качестве критерия для селекции из пула перекрестно-реагирующих siRNA человека-резус выявляли посредством нацеливания на последовательности мРНК EG5 человека, но не на другие мРНК человека.

Специфичность siRNA можно выражать через ее потенциал в отношении нацеливания на другие гены, которые обозначают как "не являющиеся мишенью гены".

Для предсказания неспецифического потенциала для siRNA были сделаны следующие допущения:

1) неспецифический потенциал цепи можно определить из количества и распределения несовпадений с не являющимся мишенью геном;

2) наиболее сходный не являющийся мишенью ген, который представляет собой ген, для которого предсказано, что он обладает наиболее высокой вероятностью к подавлению вследствие допустимых несовпадений, определяет неспецифический потенциал цепи;

3) положения от 2 до 9 (нумерация от 5' к 3') цепи (зона затравки) могут в большей степени приводить к неспецифическому потенциалу, чем остальная часть последовательности (которая представляет собой не область затравки и участка расщепления);

4) положения 10 и 11 (нумерация от 5' к 3') цепи (область участка расщепления) могут приводить в большей степени к неспецифическому потенциалу, чем не область затравки (которая представляет собой положения с 12 по 18, при нумерации от 5' к 3');

5) положения 1 и 19 каждой цепи не участвуют в неспецифических взаимодействиях;

6) неспецифический потенциал можно выразить посредством показателя неспецифичности для наиболее сходного не относящегося к мишени гена, вычисленного на основе количества и положения несовпадений цепи с наиболее гомологичной областью в не относящемся к мишени гене, с учетом допущений с 3 по 5;

7) неспецифический потенциал антисмысловой и смысловой цепей будет сходным, в то время как является вероятным потенциальное прекращение активности смысловой цепи посредством внутренних модификаций.

SiRNA с низким неспецифическим потенциалом были определены как предпочтительные, и было предположено, что они являются более специфичными.

В целях идентификации специфичные к EG5 человека siRNA, все другие транскрипты человека, все из которых считали потенциальными не относящимися к мишени последовательностями, подергали исследованию в отношении потенциальных участков-мишеней для последовательностей смысловых цепей перекрестно реагирующего 19-мера человека-резус, а также комплементарных антисмысловых цепей. Для этого использовали алгоритм fastA в целях определения наиболее гомологичной области совпадения в каждой последовательности базы данных человека RefSeq, которая, как полагают авторы настоящего изобретения, предоставляет обширный транскриптом человека.

Для присвоения категорий всем потенциальным не относящимся к мишени последовательностям в соответствии с допущениями 3-5 и посредством этого идентифицировать наиболее сходный не относящийся к мишени ген и его показатель неспецифичности, выходные данные fastA анализировали далее посредством сценария perl.

Сценарий извлек следующие неспецифические свойства для каждой 19-мерной введенной последовательности и каждого не относящегося к мишени гена для вычисления показателя неспецифичности:

Количество несовпадений не в области затравки

Количество несовпадений в области затравки

Количество несовпадений в области участка расщепления

Показатель неспецифичности вычисляли с учетом допущений 3-5 следующим образом:

Показатель неспецифичности = количество несовпадений в области затравки*10 + количество несовпадений в области расщепления*1,2 + количество несовпадений не в области затравки*1

Наиболее сходный не относящийся к мишени ген для каждой последовательности 19-мера был определен как ген с наименьшим показателем неспецифичности. Таким образом, наиболее низкий показатель неспецифичности был определен как соответствующий неспецифическому потенциалу цепи.

Для скрининговой группы, представленной в табл. 2, показатель неспецифичности, составляющий 3 или более для смысловой цепи, был выбран в качестве предварительного условия для селекции siRNA, в то время как все последовательности, содержащие 4 или более последовательно расположенных G (последовательности поли-G), были исключены. Исходя из этого предела, было выбрано 266 перекрестно-реактивных последовательностей человека-резус, удовлетворяющих критерию специфичности (см. табл. 2).

Для определения расширенной скрининговой группы перекрестную реактивность с резус исключили, провели повторные вычисления предсказанной специфичности, исходя из новой доступной базы данных RefSeq человека и выбрали только те 328 не поли-G-siRNA с показателем неспецифичности 2,2 или более для антисмысловой и смысловой цепей (см. табл. 3).

Для таблиц: обозначения: A,G,С,U-рибонуклеотиды: Т-дезокситимидин: u,с-2'-О-метилнуклеотиды: s-фосфоротиоатная связь.

Синтез дцРНК

Когда источник реагента не приведен конкретно в настоящем документе, такой реагент можно получить от любого поставщика реагентов для молекулярной биологии со стандартным качеством/чистотой для применения в молекулярной биологии.

Синтез siRNA

Одноцепочечные РНК получали посредством твердофазного синтеза в масштабе 1 мкмоль с использованием устройства для синтеза Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt Germany) и стекла с определенным размером пор (CPG, 500А, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany) в качестве твердой подложки. РНК и РНК, содержащую 2'-O-метилнуклеотиды, получали твердофазным синтезом с использованием соответствующих фосфорамидитов и 2'-O-метилфосфорамидитов, соответственно (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany). Эти структурные элементы были включены в выбранные участки в последовательности олигонуклеотидной цепи с использованием стандартных фосфорамидитных химических групп для нуклеозидов, таких как описаны в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. Фосфоротиоатные связи вносили посредством замены окислительного раствора йода растворов реагента Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, UK) в ацетонитриле (1%). Кроме того, дополнительные реагенты были получены от Mallinckrodt Baker (Griesheim, Germany).

Удаление защитных групп и очистку неочищенных олигонуклеотидов посредством анионообменной ВЭЖХ проводили установленными способами. Выход и концентрации определяли посредством УФ-поглощения раствора соответствующей РНК при длине волны 260 нм с использованием спектрофотометра (DU 640В, Beckman Coulter GmbH, UnterschleiBheim, Germany).

Двухцепочечную РНК получали посредством смешивания эквимолярного раствора цепей в буфере для отжига (20 мМ фосфат натрия, рН 6,8, 100 мМ хлорид натрия), нагревали на водяной бане при 85-90 °С в течение 3 мин и охлаждали до комнатной температуры в течение 3-4 ч. Раствор РНК после отжига хранили при -20 °С до применения.

Для синтеза 3'-конъюгированных с холестерином siRNA (обозначаемых в настоящем документе как Chol-3') использовали соответствующим образом модифицированную твердую подложку для синтеза РНК. Модифицированную твердую подложку получали следующим образом:

Диэтил-2-азабутан-1,4-дикарбоксилат АА

В перемешиваемый ледяной раствор гидрохлорида этилглицината (32,19 г, 0,23 моль) в воде (50 мл) добавляли 4,7 М водный раствор гидроксида натрия (50 мл). Затем добавляли этилакрилат (23,1 г, 0,23 моль) и смесь перемешивали при комнатной температуре до подтверждения завершения реакции посредством TLC. Через 19 ч раствор разделяли дихлорметаном (3x100 мл). Органический слой сушили безводным сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали. Осадок дистиллировали с получением АА (28,8 г, 61%).

Этиловый эфир 3-{этоксикарбонилметил-[6-(9Н-фторен-9-илметоксикарбониламино)гексаноил]амино}пропионовой кислоты АВ

Fmoc-6-аминогексановую кислоту (9,12 г, 25,83 ммоль) растворяли в дихлорметане (50 мл) и охлаждали льдом. К раствору добавляли диизопропилкарбодиимид (3,25 г, 3,99 мл, 25,83 ммоль) при 0 °С. Затем добавляли диэтилазабутан-1,4-дикарбоксилат (5 г, 24,6 ммоль) и диметиламинопиридин (0,305 г, 2,5 ммоль). Раствор доводили до комнатной температуры и далее перемешивали в течение 6 ч. Завершение реакции определяли посредством TLC. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, и к осажденной диизопропилмочевине добавляли этилацетат. Суспензию фильтровали. Фильтрат промывали 5% водным раствором хлористо-водородной кислоты, 5% бикарбонатом натрия и водой. Объединенный органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали колоночной хроматографией (50% EtOAC/гексаны) с получением 11,87 г (88%) АВ.

Этиловый эфир 3-[(6-аминогексаноил)этоксикарбонилметиламино]пропионовой кислоты АС

Этиловый эфир 3-{этоксикарбонилметил-[6-(9Н-фторен-9-илметоксикарбониламино)гексаноил]амино}пропионовой кислоты АВ (11,5 г, 21,3 ммоль) растворяли в 20% пиперидине в диметилформамиде при 0 °С. Раствор продолжали перемешивать в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, к осадку добавляли воду и продукт экстрагировали этилацетатом. Неочищенный продукт очищали превращением в гидрохлорид.

Этиловый эфир 3-({6- [17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}этоксикарбонилметиламино)пропионовой кислоты AD

Гидрохлорид этилового эфира 3-[(6-аминогексаноил)этоксикарбонилметиламино]пропионовой кислоты АС (4,7 г, 14,8 ммоль) отбирали в дихлорметан. Суспензию охлаждали до 0 °С на льду. К этой суспензии добавляли диизопропилэтиламин (3,87 г, 5,2 мл, 30 ммоль). К полученному раствору добавляли холестерилхлорформиат (6,675 г, 14,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали 10% хлористо-водородной кислотой. Продукт очищали флэш-хроматографией (10,3 г, 92%).

Этиловый эфир 1-{6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}-4-оксопирролидин-3-карбоновой кислоты АЕ

Трет-бутоксид калия (1,1 г, 9,8 ммоль) суспендировали в 30 мл сухого толуола. Смесь охлаждали до 0 °С на льду и добавляли 5 г (6,6 ммоль) диэфира AD медленно при перемешивании в течение 20 мин. В процессе добавления поддерживали температуру ниже 5 °С. Перемешивание продолжали в течение 30 мин при 0 °С и добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты, а затем сразу 4 г NaH 2 PO 4 ∙H 2 O в 40 мл воды. Полученную смесь дважды экстрагировали, каждый раз 100 мл дихлорметана, и объединенные органические экстракты промывали два раза, каждый раз 10 мл фосфатного буфера, сушили и выпаривали до высушивания. Осадок растворяли в 60 мл толуола, охлаждали до 0 °С и экстрагировали тремя 50-мл порциями холодного карбонатного буфера, рН 9,5. Водные экстракты доводили до рН 3 фосфорной кислотой и экстрагировали пятью 40-мл порциями хлороформа, которые объединяли, сушили и выпаривали до высушивания. Осадок очищали колоночной хроматографией с использованием 25% смеси этилацетат/гексан с получением 1,9 г b-сложного кетоэфира (39%) .

17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-иловый эфир [6-(3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидин-1-ил)-6-оксогексил]карбаминовой кислоты AF

К смеси b-кетоэфира АЕ (1,5 г, 2,2 ммоль) и борогидрида натрия (0,226 г, 6 ммоль) в тетрагидрофуране (10 мл) по каплям добавляли метанол (2 мл) в течение 1 ч. Перемешивание продолжали при температуре кипячения с обратным холодильником в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 1Н HCl (12,5 мл), смесь экстрагировали этилацетатом (3 ×40 мл) . Объединенный слой этилацетата сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением продукта, который очищали колоночной хроматографией (10% МеОН/CHCl 3 ) (89%).

17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-иловый эфир (6-{3-[бис-(4-метоксифенил)фенилметоксиметил]-4-гидроксипирролидин-1-ил}-6-оксогексил)карбаминовой кислоты AG

Диол AF (1,25 г 1,994 ммоль) сушили выпариванием с пиридином (2 ×5 мл) в вакууме. Добавляли безводный пиридин (10 мл) и 4,4'-диметокситритилхлорид (0,724 г, 2,13 ммоль) при перемешивании. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили добавлением метанола. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и к осадку добавляли дихлорметан (50 мл). Органический слой промывали 1 М водным бикарбонатом натрия. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Пиридин осадка удаляли выпариванием с толуолом. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (2% МеОН/хлороформ, Rf=0,5 в 5% МеОН/CHCl 3 ) (1,75 г, 95%).

Моно-(4-[бис-(4-метоксифенил)фенилметоксиметил]-1-{6-[17-(1,5-диметилгексил)-10,13-диметил-

2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-илоксикарбониламино]гексаноил}пирролидин-3-ил)овый эфир янтарной кислоты АН

Соединение AG (1,0 г, 1,05 ммоль) смешивали с янтарным ангидридом (0,150 г, 1,5 ммоль) и DMAP (0,0 73 г, 0,6 ммоль) и сушили в вакууме при 40 °С в течение ночи. Смесь растворяли в безводном дихлорэтане (3 мл), добавляли триэтиламин (0,318 г, 0,440 мл, 3,15 ммоль) и раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 16 ч. Затем его разбавляли дихлорметаном (4 0 мл) и промывали ледяным водным раствором лимонной кислоты (5 мас.%, 30 мл) и воды (2 ×20 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали до высушивания. Осадок использовали в таком виде для следующей стадии.

Производное CPG с холестерином AI

Сукцинат АН (0,254 г, 0,242 ммоль) растворяли в смеси дихлорметан/ацетонитрил (3:2, 3 мл). К этому раствору последовательно добавляли DMAP (0,02 96, 0,2 42 ммоль) в ацетонитриле (1,25 мл), 2,2'-дитио-бис(5-нитропиридин) (0,075 г, 0,242 ммоль) в смеси ацетонитрил/дихлорэтан (3:1, 1,25 мл). К полученному раствору добавляли трифенилфосфин (0,064 г, 0,242 ммоль) в ацетонитриле (0,6 мл). Реакционная смесь приобретала ярко-оранжевую окраску. Раствор быстро встряхивали с использованием устройства для встряхивания wrist-action shaker (5 мин). Добавляли алкиламин длинной цепи-CPG (LCAA-CPG) (1,5 г, 61 мМ). Суспензию встряхивали в течение 2 ч. CPG фильтровали через синтерированную воронку и последовательно промывали ацетонитрилом, дихлорметаном и эфиром. Не вступившие в реакцию аминогруппы закрывали с использованием смеси уксусный ангидрид/пиридин. Полученную нагрузку CPG определяли проведением УФ-измерения (37 мМ/г).

Синтез siRNA, обладающих группой бисдециламида 5'-12-додеканоевой кислоты (обозначаемой в настоящем документе как "5'-С32-") или группой 5'-холестерильного производного (обозначаемой в настоящем документе как "5'-Chol-"), проводили, как описано в WO 2004/065601, за исключением того, что для холестерильного производного стадию окисления проводили с использованием реагента Beaucage в целях внесения фосфоротиоатной связи на 5'-конец олигомера нуклеиновой кислоты.

Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и, конкретно, сокращений, представленных в табл. 4.

Таблица 4. Сокращения нуклеотидных мономеров, используемых при представлении последовательностей нуклеиновых кислот, понятно, что эти мономеры, когда они представлены в олигонуклеотиде, связаны друг с другом 5'-3'-фосфодиэфирными связями

а Прописные буквы соответствуют 2'-дезоксирибонуклеотидам (ДНК), строчные буквы соответствуют рибонуклеотидам (РНК)

Экспрессирующие дцРНК-векторы

В другом аспекте этого изобретения специфичные к Eg5 молекулы дцРНК, которые модулируют активность экспрессии гена Eg5, экспрессируют с транскрипционных элементов, встроенных в векторы ДНК или РНК (см., например, Couture, A, et al., TIG (1996), 12:5-10; Skillern. A., el al., международная публикация PCT No. WO 00/22113, Conrad, международная публикация РСТ No. WO 00/22114, и Conrad, патент США No. 6054299). Эти трансгены можно вносить в качестве линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может встраиваться и наследоваться в качестве трансгена, встроенного в геном хозяина. Также трансген может быть сконструирован, чтобы обеспечить возможность его наследования в качестве внехромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

Отдельные цепи дцРНК можно транскрибировать посредством промоторов на двух отдельных экспрессирующих векторах и совместно трансфицировать в клетку-мишень. Альтернативно каждую отдельную цепь дцРНК можно транскрибировать посредством промоторов, оба из которых расположены на той же экспрессирующей плазмиде. В предпочтительном варианте осуществления дцРНК экспрессируют в качестве инвертированного повтора, соединенного линкерной полинуклеотидной последовательностью, так что дцРНК обладает структурой стебля и петли.

Рекомбинантные экспрессирующие дцРНК векторы, как правило, представляют собой ДНК-плазмиды или вирусные векторы. Экспрессирующие дцРНК вирусные векторы можно конструировать на основе, но не ограничиваясь им, аденоассоциированного вируса (для обзора см. Muzyczka, et al., Curr. Topies Micro. Immunol. (1992) 158:97-129); аденовируса (см., например, Berkner, et al., BioTechniques (1997) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434) и Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155) или альфавируса, а также других вирусов, известных в данной области. Ретровирусы использовали для внесения множества генов во множество различных типов клеток, включая эпителиальные клетки, in vitro и/или in vivo (см., например, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber el al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991 , Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. , 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; патент США No. 4868116; патент США No. 4980286; заявка PCT WO 89/07136; заявка РСТ WO 89/02468; заявка РСТ WO 89/05345; и заявка РСТ WO 92/07573). Рекомбинантные ретровирусные векторы, способные к трансдукции и экспрессии генов, встроенных в геном клетки, можно получать посредством трансфекции рекомбинантного ретровирусного генома в пригодные упаковочные клеточные линии, такие как РА317 и Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). Рекомбинантные аденовирусные векторы можно использовать для инфицирования широкого множества клеток и тканей у восприимчивых хозяев (например, крысы, хомяка, собаки и шимпанзе) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), и также они обладают тем преимуществом, что им для инфекции не требуются митотически активные клетки.

Промотор, запускающий экспрессию дцРНК либо в ДНК-плазмиде, либо в вирусном векторе согласно изобретению, может представлять собой промотор эукариотической РНК-полимеразы I (например, промотор рибосомальной РНК), РНК-полимеразы II (например, ранний промотор CMV или промотор актина или промотор snRNA U1) или, главным образом, промотор РНК-полимеразы III (например, промотор snRNA U6 или РНК 7SK) или прокариотический промотор, например промотор Т7, при условии, что экспрессирующая плазмида также кодирует РНК-полимеразу Т7, необходимую для транскрипции с промотора Т7. Промотор может направлять экспрессию трансгена в поджелудочную железу (см., например регуляторную последовательность инсулина для поджелудочной железы (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:2511-2515)).

Кроме того, экспрессию трансгена можно точно регулировать, например, с использованием индуцибельной регуляторной последовательности и экспрессирующих систем, таких как регуляторная последовательность, которая является чувствительной к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням глюкозы в кровотоке, или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцибельные экспрессирующие системы, пригодные для контроля экспрессии трансгена в клетках или у млекопитающих, включают регуляцию посредством экдизона, эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических веществ, индуцирующих димеризацию, и изопропил-бета-D1-тиогалактопиранозида (EPTG). Специалист в данной области сможет выбирать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, исходя из предполагаемого применения трансгена дцРНК.

Как правило, рекомбинантные векторы, способные экспрессировать молекулы дцРНК, доставляют, как описано ниже, и они сохраняются в клетках-мишенях. Альтернативно можно использовать вирусные векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул дцРНК. Такие векторы при необходимости можно вводить повторно. После экспрессии дцРНК связываются с РНК-мишенью и модулируют ее функцию или экспрессию. Доставка экспрессирующих дцРНК векторов может быть системной, такой как внутривенное или внутримышечное введение, посредством введения в клетки-мишени, извлеченные из пациента с последующим повторным введением пациенту, или другими способами, которые обеспечивают введение в требуемую клетку-мишень.

Экспрессирующие дцРНК ДНК-плазмиды, как правило, трансфицируют в клетки-мишени в качестве комплекса с катионными липидными носителями (например, Oligofectamine) или носителями на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO ™) . Многократные трансфекции посредством липидов для опосредуемого дцРНК нокдауна, нацеленного на различные участки одного гена Eg5 или нескольких генов Eg5 на протяжении недели или более, также охватываются данным изобретением. Успешное введение векторов согласно изобретению в клетки-хозяева можно подвергать мониторингу с использованием различных известных способов. Например, временную трансфекцию можно выявлять посредством репортера, такого как флуоресцентный маркер, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP). В наличии стабильной трансфекции клеток ex vivo можно убедиться с использованием маркеров, которые обеспечивают устойчивость трансфицированных клеток к конкретным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), такую как устойчивость к гигромицину В.

Специфичные к Eg5 молекулы дцРНК также можно встраивать в векторы и использовать в качестве векторов для генной терапии у пациентов-людей. Векторы для генной терапии можно доставлять субъекту, например, посредством внутривенной инъекции, местного введения (см. патент США 5328470) или посредством стереотаксической инъекции (см. например, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91:3054-3057). Фармацевтический препарат вектора для генной терапии может включать вектор для генной терапии в приемлемом разбавителе, или он может содержать матрикс для замедленного высвобождения, в который погружен носитель для доставки гена. Альтернативно, когда полный вектор для доставки гена можно получить без участия рекомбинантных клеток, например, в случае ретровирусных векторов, фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему для доставки гена.

Поскольку было показано, что подавление Eg5 вызывает остановку митоза (Weil D. et al., [2002], Biotechniques 33:1244-8), для скрининга активности siRNA использовали анализ жизнеспособности клеток. Клетки HeLa (14000 на лунку [скрининги 1 и 3] или 10000 на лунку [скрининг 2]) высевали в 96-луночные планшеты и одновременно трансфицировали Lipofectamine2000 (Invitrogen) в конечных концентрациях siRNA в лунке 30 нМ и в конечных концентрациях 50 нМ (1 скрининг) и 25 нМ (2 скрининг) Набор дуплексов тестировали при 25 нМ в третьем скрининге (табл. 5). Через 72 ч после трансфекции оценивали клеточную пролиферацию посредством добавления реагента WST-1 реагент (Roche) в культуральную среду и последующего измерения поглощения при 450 нм. Величину поглощения для контрольных (нетрансфицированных) клеток считали 100-процентной, и поглощение для трансформированных посредством siRNA лунок сравнивали с контрольным значением. Анализы проводили по шесть экземпляров для каждого из трех скринингов. Группу siRNA далее тестировали в диапазоне концентраций siRNA. Анализы проводили в клетках HeLa (14000 на лунку; способ такой же, как указано выше, табл. 5).

Таблица 5

Девять дуплексов siRNA, которые показали наибольшее ингибирование роста в табл. 5, повторно тестировали в диапазоне концентраций siRNA в клетках HeLa. Тестируемые концентрации siRNA представляли собой 100, 33,3, 11,1, 3,70, 1,23, 0,41, 0,14 и 0,046 нМ. Анализы проводили по шесть экземпляров, и вычисляли концентрацию каждой siRNA, приводящую к пятидесятипроцентному ингибированию пролиферации клеток (IC 50 ). Анализ доза-эффект проводили от двух до четырех раз для каждого дуплекса. Средние значения IC 50 (нМ) приведены в табл. 6.

Таблица 6

Непосредственно перед трансфекцией клетки Hela S3 (номер АТСС: CCL-2.2, LCG Promochem GmbH, Wesel, Germany) высевали в количестве 1,5 ×10 4 клеток/лунка в 96-луночные планшеты (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) в 75 мкл среды для роста (Ham F12, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 100 Ед. пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина, все от Biochrom AG Berlin, Germany). Трансфекцию проводили по четыре экземпляра. Для каждой лунки 0,5 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) смешивали с 12 мкл Opti-МЕМ (Invitrogen) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Для концентрации siRNA, составляющей 50 нМ, в смеси для трансфекции объемом 100 мкл, 1 мкл 5 мкМ siRNA смешивали с 11,5 мкл Opti-МЕМ на лунку, в сочетании со смесью Lipofectamine2000-Opti-MEM и снова инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Комплексы siRNA-Lipofectamine2000 наносили полностью (25 мкл каждого на лунку) на клетки, и клетки инкубировали в течение 24 ч при 37 °С и 5% СО 2 в инкубаторе с увлажнением (Heraeus GmbH, Hanau). Скрининг однократной дозы проводили в концентрациях 50 нМ и 25 нМ, соответственно.

Клетки собирали нанесением 50 мкл смеси для лизиса (содержимое набора QuantiGene bDNA-kit от Genospectra, Fremont, USA) в каждую лунку, содержащую 100 мкл среды для роста, и подвергали лизису при 53 °С в течение 30 мин. После этого 50 мкл лизатов инкубировали с наборами зондов, специфичных к Eg5 человека и GAPDH человека, и анализ продолжали в соответствии с протоколом изготовителя для QuantiGene. В конце измеряли хемилюминесценцию в Victor2-Light (Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany) в виде RLU (относительных световых единиц), и значения, полученные для набора зондов для hEg5 нормализовывали к соответствующим значениям GAPDH для каждой лунки. Значения, полученные для siRNA, направленных против Eg5, были сходны со значениями, полученными для специфичной siRNA (направленной против HCV), которые были установлены как 100% (табл. 1, 2 и 3) .

Эффективные siRNA из скрининга далее охарактеризовывали посредством кривых доза-эффект. Трансфекции для кривых доза-эффект проводили в следующих концентрациях: 100, 16,7, 2,8, 0,46 нМ, 77, 12,8, 2,1, 0,35 пМ, 59,5, 9,9 фМ и пустая (без siRNA), и разбавляли Opti-MEM до конечной концентрации 12,5 мкл в соответствии с указанным выше протоколом. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel, дополненного XL-fit 4.2 (IDBS, Guildford, Surrey, UK) и с применением модели доза-эффект номер 205 (табл. 1, 2 и 3).

Лидирующую siPHK AD12115 дополнительно анализировали применением анализа пролиферации WST от Roche (как описано ранее).

Группу из 34 дуплексов из табл. 2, которые показали наибольшую активность, анализировали посредством трансфекции в клетках HeLa в конечных концентрациях, варьирующих от 100 нМ до 10 фМ. Трансфекцию проводили в четырех экземплярах. Для каждого дуплекса проводили два анализа доза-эффект. Для каждого дуплекса вычисляли концентрацию, приводящую к 20% (IC20), 50% (IC50) и 80% (IC80) снижению мРНК KSP (табл 7).

Концентрации приведены в пМ.

Таблица 7

(ND-не определено)

Подавление Eg5/KSP печени у молодых крыс после однократного болюсного введения siRNA, изготовленной с LNP01

От рождения до возраста приблизительно 23 суток экспрессию Eg5/KSP можно выявлять в растущей печени крыс. Подавление мишени изготовленной siRNA Eg5/KSP оценивали у молодых крыс.

Тестированный дуплекс KSF

ID дуплекса Мишень Смысловая Антисмысловая

Способы

Дозирование животным. Молодым самцам крыс Sprague-Dawley (в возрасте 19 суток) вводили однократные дозы изготовленной с липидоидом ("LNP01") siRNA посредством инъекции в хвостовую вену. В группах из десяти животных вводили дозы, составляющие 10 мг на килограмм (мг/кг) массы тела, либо AD6248, либо неспецифичной siRNA. Уровень дозы относится к количеству вводимого дуплекса siRNA в составе. В третьей группе вводили фосфатно-солевой буфер. Животных умерщвляли через двое суток после введения siRNA. Каждую печень извлекали, быстро замораживали в жидком азоте и растирали в порошок.

Определение мРНК.

Уровни мРНК Eg5/KSP измеряли в печени из всех групп по введению. Образцы порошка из каждой печени (приблизительно десять миллиграмм) гомогенизировали в буфере для лизиса тканей, содержащем протеазу К. Уровни мРНК Eg5/KSP и мРНК GAPDH измеряли в трех экземплярах для каждого образца с использованием анализа разветвленной ДНК Quantigene (GenoSpectra). Средние значения для Eg5/KSP нормализовывали относительно средних значений GAPDH для каждого образца. Определяли средние значения для групп и нормализовывали относительно группы PBS для каждого эксперимента.

Статистический анализ.

Значимость определяли посредством ANOVA с последующим анализом с помощью апостериорного критерия Tukey.

Результаты

Обобщенные данные

Приведены средние значения ( ±стандартное отклонение) для мРНК Eg5/KSP. Показана статистическая значимость (значение р) относительно группы с PBS (ns, не значимо [р > 0,05]).

Эксперимент 1.

Статистически значимое снижение в печени мРНК Eg5/KSP было достигнуто после введения AD6248 в составе в дозе 10 мг/кг.

Подавление VEGF печени крысы после внутривенной инфузии с дуплексов siRNA в составе с LNP01

"Липидоидный состав", содержащий эквимолярную смесь двух siRNA, вводили крысам. Одна siRNA (AD3133) была направлена против VEGF. Другая (AD12115) была направлена против Eg5/KSP. Поскольку экспрессия Eg5/KSP практически не поддается выявлению в печени взрослых крыс, после введения siRNA измеряли только уровни VEGF.

Вводимые дуплексы siRNA

Обозначения: A, G, С, U - рибонуклеотиды, с, u-2'-О-Ме-рибонуклеотиды, s - фосфоротиоат

Способы

Дозирование на животных. Взрослым самкам крыс Sprague-Dawley вводили изготовленную с липидоидом ("LNP01") siRNA посредством инфузии в течение двух часов в бедренную вену. В группах из четырех животных вводили дозы 5, 10 и 15 мг на килограмм (мг/кг) массы тела siRNA в составе. Уровень дозы относится к общему количеству дуплекса siRNA, вводимого в составе. В четвертой группе вводили фосфатно-солевой буфер. Животных умерщвляли через 72 ч после завершения инфузии siRNA. Каждую печень извлекали, быстро замораживали в жидком азоте и растирали в порошок.

Процесс изготовления

Для получения наночастиц липид-siRNA использовали липидоид ND98*4HCl (MW 1487) (формула 1), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids). Получали исходные растворы каждого из них в этаноле: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-Церамид С16, 100 мг/мл. Затем исходные растворы ND98, холестерина и PEG-Церамида С16 комбинировали в молярном соотношении 42:48:10. Объединенный раствор липидов быстро перемешивали с водным раствором siRNA (в ацетате натрия, рН 5), чтобы конечная концентрация этанола составляла 35-45%, и конечная концентрация ацетата натрия составляла 100-300 мМ. Наночастицы липид-siRNA образовывались спонтанно при перемешивании. В зависимости от требуемого распределения размера частиц полученную смесь наночастиц в некоторых случаях экструдировали через поликарбонатную мембрану (предел 100 нм) с использованием экструдера с термостаканом (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc.). В других случаях стадию экструдирования исключали. Удаление этанола и одновременную замену буфера проводили посредством либо диализа, либо проточной фильтрации вдоль потока. Буфер заменяли фосфатно-солевым буфером (PBS) рН

Характеристика композиций

Композиции, полученные либо стандартным способом, либо способом без экструдирования, характеризуют сходным образом. Сначала композиции характеризуют в результате визуального осмотра. Они должны представлять собой беловатые прозрачные растворы, не содержащие агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение размеров частиц липидов-наночастиц измеряют посредством динамического рассеивания света с использованием Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Размер частиц должен составлять 20-300 нм, а, в идеальном случае 40-100 нм. Распределение размеров частиц должно быть однородным. Общую концентрацию siRNA в композиции, а также захваченную фракцию оценивали с использованием анализа вытеснения пигмента. Образец siRNA с композиции инкубируют со связывающим РНК пигментом Ribogreen (Molecular Probes) в присутствии или отсутствие разрушающей композиции поверхностно-активного вещества, 0,5% Triton-Х100. Общее количество siRNA в композиции определяют по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, относительно стандартной кривой. Захваченную фракцию определяют вычитанием содержания "свободной" siRNA (как определяют по сигналу в отсутствие поверхностно-активного вещества) из общего содержания siRNA. Процентное количество захваченной siRNA, как правило, составляет > 85%.

Определение мРНК

Образцы порошка из каждой печени (приблизительно по десять миллиграммов) гомогенизировали в буфере для лизиса тканей, содержащем протеазу К. Уровни мРНК VEGF и GAPDH измеряли в трех повторах для каждого образца с использованием анализа разветвленной ДНК Quantigene (GenoSpectra). Средние значения для VEGF нормализовывали относительно средних значений GAPDH для каждого образца. Определяли средние значения для групп и нормализовывали относительно группы PBS для каждого эксперимента.

Определение белка

Образцы порошка из каждой печени (приблизительно по 60 мг) гомогенизировали в 1 мл буфера RIPA. Определяли общую концентрацию белка с использованием набора для анализа белка Micro BCA (Pierce). Образцы тотального белка от каждого животного использовали для определения уровней белка VEGF с использованием анализа ELISA VEGF (R &D systems). Средние значения в группах определяли и нормализовали относительно группы PBS для каждого эксперимента.

Статистический анализ. Значимость определяли посредством ANOVA с последующим анализом с использованием критерия Tukey.

РезультатыОбобщенные данные

Приведены средние значения ( ±стандартное отклонение) для мРНК (VEGF/GAPDH) и белка (rel. VEGF). Показана статистическая значимость (значение р) относительно группы с PBS для каждого эксперимента.

Статистически значимые снижения мРНК и белка VEGF в печени были определены при всех трех уровнях доз siRNA.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3