EA 014874B1 20110228 Номер и дата охранного документа EA200801137 20061122 Регистрационный номер и дата заявки ESP200502890 20051123 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2006/003312 20061122 Номер международной заявки (PCT) WO2007/060524 20070531 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа EAb21101 Номер бюллетеня [RU] СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ АПОПТОЗА Название документа [8] C07K 5/087, [8] C07K 7/64, [8] C07K 5/083, [8] C07K 5/097 Индексы МПК [ES] Перес Пая Энрике, [ES] Висент Докон Мария Хесус, [ES] Орсаес Калатаюд Мар, [ES] Мондрагон Мартинес Лаура, [ES] Мессегуэр Пайпоч Анхель, [ES] Моуре Фернандес Алехадра, [ES] Санклименс Перес Де Росас Глория, [ES] Малет Энгра Хема Сведения об авторах [ES] КОНСЕХО СУПЕРИОР ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОНЕС СЬЕНТИФИКАС (ES), [ES] ЛАБОРАТОРИОС САЛЬВАТ, С.А. (ES) Сведения о патентообладателях [ES] КОНСЕХО СУПЕРИОР ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОНЕС СЬЕНТИФИКАС (ES), [ES] ЛАБОРАТОРИОС САЛЬВАТ, С.А. (ES) Сведения о заявителях LURA R. ET AL.: "Role of peptide conformation in the rate and mechanism of deamidation of asparaginyl residues", BIOCHEMISTRY 1988, UNITED STATES, vol. 27, no. 20, 1988, pages 7671-7677, XP002426034, ISSN: 0006-2960, Compound II in page 7673 ASHWELL S.: "Caspases: Recent advances in small molecule inhibitors", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS, ASHLEY PUBLICATIONS, GB, vol. 11, no. 10, 2001, pages 1593-1603, XP002315131, ISSN: 1354-3776, compounds WO 9946248 A Цитируемые документы
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000014874b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), а также к лекарственным конъюгатам на основе соединений формулы (I), действующим в качестве ингибиторов апоптоза, а также к способу их получения, к содержащим их фармацевтическим композициям и к их применению в медицине.


Формула

[0001] Соединение общей формулы I

[0002] Соединение, которое представляет собой лекарственный конъюгат, содержащий радикал формулы II

[0003] Соединение формулы III, которое представляет собой лекарственный конъюгат по п.2

[0004] Соединение по п.2 или 3, где полиглутаминовая кислота представляет собой поли(L-глутаминовую кислоту); n равно 2 и R4 представляет собой боковую цепь глицина.

[0005] Применение соединения формулы I, как определено в п.1 без условия для R2, или соединения, как определено в п.2, для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза.

[0006] Применение по п.5, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.

[0007] Способ лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза, включающий введение соединения формулы I, как определено в п.1 без условия для R2, или соединения, как определено в п.2, и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

[0008] Способ по п.7, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.

[0009] Фармацевтическая композиция, которая содержит эффективное количество соединения формулы I, как определено в п.1, или соединения, как определено в п.2, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

[0010] Фармацевтическая композиция по п.9 в форме наносфер, микрочастиц и наночастиц.


Полный текст патента

Настоящее изобретение относится к соединениям, действующим в качестве ингибиторов апоптоза, а также к способам их получения, к содержащим их фармацевтическим композициям и к их применению в медицине.

Предшествующий уровень техники

Апоптоз представляет интерес как биологический процесс по причине его значимости для целого ряда биологических систем, включая нормальный функциональный цикл клеток, иммунную систему и эмбриональное развитие, и по причине его связи с различными заболеваниями. Неадекватный апоптоз вовлечен во многие патологии человека, включая нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Альцгеймера и Гентингтона, ишемию, автоиммунные заболевания и некоторые формы рака (Reed J.C., Trends Mol. Med. 2001,7:314-319).

Различные апоптотические стимулы, включая активацию рецепторов смерти на клеточной поверхности, противораковые агенты, облучение, недостаток факторов выживаемости и ишемию (обзор Strasse A. et al., Annu. Rev. Biochem. 2000, 69:217-245) вызывают сигнальные каскады, которые активируют семейство цистеин-аспартил-протеаз, называемых каспазами. Эти протеазы осуществляют процесс апоптоза.

Некоторые апоптотические сигналы активируют опосредованный митохондриями или внутренний путь, в котором в качестве инициатора выступает каспаза-9. Образование макромолекулярного комплекса, называемого апоптосомой, является ключевым событием в данном пути.

Апоптосома представляет собой голоферментный мультипротеиновый комплекс, образованный активируемым цитохромом C Apaf-1 (апоптотический фактор активации протеаз), дАТФ (дезоксиаденозинтрифосфат) и прокаспазой-9 (Li P. et al., Cell 1997, 91: 479-489; Acehan D. et al., Mol. Cell 2001,9:423-432; Rodriguez J. et al, Genes Dev. 1999, 13: 3179-3184; Srinivasula S.M. et al., Mol. Cell 1998, 1:949-957). В этом макромолекулярном комплексе активируется связанная с апоптосомой каспаза-9, и затем, в свою очередь, она активирует эффекторные каспазы.

Для идентификации молекул, которые могли бы оказать положительное влияние на процесс апоптоза, связанный с заболеванием, попытки разработки лекарственных средств первоначально были нацелены на регуляцию активности каспаз, и при этом осуществляли поиск специфических ферментных активаторов или ингибиторов (Scott C.W. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 304: 433-440; Garcia-Calvo M., J. Bioi. Chem. 1998, 273: 32608-32613), а не модуляторов предшествующего каскада/пути активации.

Тем не менее, белок-белковые взаимодействия, предшествующие активации каспаз, также могут представлять собой значимые точки для вмешательства при разработке модуляторов сигнальных путей апоптоза. В частности, недавние данные предполагают, что образование апоптосомы является интересной мишенью для разработки модуляторов апоптоза.

Таким образом, имеется интерес в поиске молекул, которые ингибируют активацию апоптоза, опосредованную апоптосомой.

Описание изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к предложению новых соединений общей формулы I

их стереоизомеров и их смесей, их полиморфов и их смесей и их фармацевтически приемлемых сольватов и солей присоединения, где:

R1 представляет собой (С 1 5 )алкил, -(СН 2 ) 1-3 -NHCO-(С 1-3 )алкил, -(СН 2 ) 0-3 -(3-6)Су, -(СН 2 ) 1-3 -фенил, -(CH 2 ) 1-3 -(5-10)Hetar или -(CH 2 ) 0-3 -(5-6)Hetcy;

R2 представляет собой -(СН 2 ) 2 -СН(фенил) 2 ;

R3 представляет собой -(СН 2 ) 1-3 -фенил;

1 5 )алкил, возможно, может быть замещен одним или более заместителями, выбранными из групп -O-(С 1 2 )алкил, -S-(C 1 -C 2 )алкил, -NH 2 , -NH-(С 1 2 )алкил и -N[(C 1 -C 2 )алкил] 2 ;

1 3 )алкил, возможно, может быть замещен одним или более атомами галогена;

(3-6)Су представляет собой радикал 3-6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца;

Су и Hetcy, возможно, могут быть замещены одним или более заместителями, выбранными из галогена, -CF 3 и -OH;

(5-6)Hetcy представляет собой C- или N-радикал 5- или 6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца, содержащего один или два гетероатома, независимо выбранных из O, S и N;

(5-10)Hetar представляет собой С- или N-радикал ароматического 5-10-членного кольца, содержащего от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из О, S и N;

фенил и (5-10)Hetar, возможно, могут быть замещены одним или более заместителями, выбранными из галогена и группы -О-(C 1 -C 3 )алкил;

при условии, что R2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил.

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению, которое представляет собой лекарственный конъюгат, содержащий радикал формулы II

его стереоизомеры и их смеси и его фармацевтически приемлемые сольваты и соли присоединения, конъюгированный с полимером, представляющим собой полиглутаминовую кислоту, где R1, R2 и R3 имеют такие же значения, как определено для соединений формулы I без условия для R2; каждый R4 независимо представляет собой боковую цепь из аминокислоты, выбранной из глицина, фенилаланина, аргинина и валина, и n равно 0, 1, 2 или 3.

Другой аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы III, которое представляет собой указанный выше лекарственный конъюгат

где соотношение у к х составляет от 25-30 до 75-70 мас.%.

В частности, изобретение относится к указанным выше соединениям, где полиглутаминовая кислота представляет собой поли(L-глутаминовую кислоту); n равно 2 и R4 представляет собой боковую цепь глицина.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы I, как оно определено выше без условия для R2, или соединения формулы II для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза.

В частности, изобретение относится к указанному выше применению, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза, включающий введение соединения формулы I, как оно определено выше без условия для R2, или соединения формулы II и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

В частности, изобретение относится к указанному выше способу, где состояние выбрано из удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, состояния при трансплантации органа, патологий, связанных с алкоголизмом, или лечения алопеции.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, которая содержит эффективное количество соединения формулы I или II, его фармацевтически приемлемой соли или сольвата и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

В частности, изобретение относится к указанной выше фармацевтической композиции в форме наносфер, микрочастиц и наночастиц.

Соединения формулы II содержат различные группировки: радикал формулы I, образующий амидную связь с пептидной цепью из п L-аминокислот и амидным производным L-лизина, где N его боковой цепи связан с полимером, представляющим собой полиглутаминовую кислоту.

В предыдущих определениях термины (С 1 -C 3 )алкил и (С 1 5 )алкил означают прямую или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, содержащую от одного до трех и от одного до пяти атомов углерода, соответственно. Примеры (C 1 -C 3 )алкила включают, не ограничиваясь этим, метил, этил, пропил, изопропил. Примеры (C 1 -C 5 )алкила дополнительно включают, не ограничиваясь этим, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, 1-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил и 2,2-диметилпропил.

Группы (C 1 -C 3 )алкил и (C 1 -C 6 )алкил, возможно, могут быть замещены в соответствии с описанием, как целесообразно с химической точки зрения.

Термин (3-6)Су обозначает радикал 3-6-членного частично ненасыщенного или насыщенного карбоциклического кольца. Как упомянуто выше, он возможно может быть замещен одним или более заместителями, которые могут располагаться в любом доступном положении кольца. Примеры (3-6)Су включают, не ограничиваясь этим, радикалы циклопропана, циклопентана, циклогексана, 1-циклобутена, 2-циклобутена, 1-циклопентена, 2-циклопентена, 1-циклогексена, 2-циклогексена и 3-циклогексена.

Термин (5-6)Hetcy обозначает С- или N-радикал частично ненасыщенного или насыщенного 5- или 6-членного карбоциклического кольца, содержащего один или два гетероатома, независимо выбранных из О, S и N, который может быть замещен в соответствии с описанием изобретения по любому доступному положению кольца. Примеры (5-6)Hetcy включают, не ограничиваясь этим, радикалы дигидрофурана, пирролина, пиразолина, имидазолидина, изотиазолидина, изоксазолидина, оксазолидина, пиразолидина, пирролидина, тиазолидина, диоксана, морфолина, пиперазина, пиперидина, пирана, тетрагидропирана, оксазина, оксазолина, пирролина, тиазолина, пиразолина, имидазолина, изоксазолина и изотиазолина.

Термин (5-10)Hetar обозначает С- или N-радикал ароматического 5-10-членного кольца, содержащего от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из O, S и N, который может быть замещен в соответствии с описанием изобретения по любому доступному положению кольца. Примеры включают, не ограничиваясь этим, радикалы пиррола, фурана, тиофена, имидазола, изоксазола, изотиазола, оксазола, 1,2,4-оксадиазола, 1,2,4-тиадиазола, 1,3,4-оксадиазола, 1,3,4-тиадиазола, 1,2,3-триазола, 1,2,4-триазола, пиридина, пиримидина, пиридазина и пиразина. Примеры (5-10)Hetar включают дополнительно, не ограничиваясь этим, радикалы бензимидазола, бензофурана, бензотиазола, бензотиофена, имидазопиразина, имидазопиридазина, имидазопиридина, имидазопиримидина, индазола, индола, изоиндола, изохинолина, пиразолопиразина, пиразолопиридина, пиразолопиримидина, пурина, хиназолина, хинолина и хиноксалина.

Выражение ″возможно замещенная одним или более ″ означает, что группа может быть либо незамещенной, либо замещена одним или более, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, заместителями, при условии, что данная группа имеет 1, 2, 3 или 4 положения, которые могут быть замещены.

На всем протяжении описания и формулы изобретения слово ″содержит ″ и его вариации, такие как ″содержащий ″, не предполагает исключения других добавок, компонентов, элементов или стадий.

В данном контексте термин ″лечение ″ включает лечение, предупреждение и управление таким состоянием. Термин ″фармацевтически приемлемый ″ в данном контексте относится к таким соединениям, композициям и/или лекарственным формам, которые в рамках медицинского суждения пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных при отсутствии излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соответственно разумному соотношению польза/риск.

В конкретном воплощении изобретения R1 представляет собой (C 1 -C 5 )алкил, -(СН 2 ) 0-3 -(3-6)Су,

-(CH 2 ) 0-3 -(5-6)Hetcy, -(CH 2 ) 1-3 -(5-10)Hetar, -(CH 2 ) 1-3 -фенил, каждый из которых возможно замещен.

В конкретном воплощении изобретения R1 представляет собой -(CH 2 ) 0-3 -(5-6)Hetcy, -(CH 2 ) 1-3 -(5-10)Hetar, -(СН 2 ) 1-3 -фенил, каждый из которых возможно замещен.

В другом воплощении R1 представляет собой -(СН 2 ) 2 -фенил, возможно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогена. В другом воплощении R1 представляет собой 2,4-дихлорфенил.

В другом воплощении R2 представляет собой (CH 2 ) 2 -CH(Ph) 2 , возможно замещенный, при условии, что R2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил. В другом воплощении R2 представляет собой 3,3-дифенилпропил при условии, что R2 не представляет собой 2-(4-фторфенил)этил.

В другом воплощении R3 представляет собой возможно замещенный -(СН 2 ) 2 -фенил. В другом воплощении R3 представляет собой -(СН 2 ) 2 -фенил, возможно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогена. В другом воплощении R3 представляет собой 2,4-дихлорфенил.

В другом воплощении R2 представляет собой 3,3-дифенилпропил, и R1 и R3 оба представляют собой 2,4-дихлорфенил.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к соединению, которое представляет собой лекарственный конъюгат, содержащий соединение формулы II, конъюгированное с полимером, представляющим собой полиглутаминовую кислоту, как определено выше, где указанный полимер имеет молекулярную массу от 20 до 60 кДа.

В другом воплощении в соединении формулы III n равно 0. В другом воплощении n равно 2, и R4 представляет собой боковую цепь глицина. В другом воплощении n равно 3, и R4 представляет собой боковую цепь глицина, боковую цепь аргинина и боковую цепь фенилаланина. В другом воплощении n равно 3, и R4 представляет собой боковую цепь валина, боковую цепь аргинина и боковую цепь фенилаланина.

В конъюгате полимера и лекарственного средства полиглутаминовая кислота может представлять собой поли(L-глутаминовую кислоту), поли(D-глутаминовую кислоту) или поли(DL-глутаминовую кислоту). В одном воплощении изобретения полиглутаминовая кислота является поли(L-глутаминовой кислотой).

Кроме того, все возможные комбинации вышеупомянутых воплощений также составляют часть данного изобретения.

Соединения формулы I содержат по меньшей мере один хиральный центр. Настоящее изобретение включает как рацемические соединения, так и энантиомерные соединения формулы I, то есть соединения, где конфигурация хирального атома углерода, соединенного с R1, является (S), и соединения, где конфигурация хирального атома углерода, соединенного с R1, является (R), как показано ниже.

Соединения формулы II содержат по меньшей мере два хиральных центра. Настоящее изобретение также включает смеси стереоизомеров и отдельные стереоизомеры формулы II.

Соединения по настоящему изобретению могут содержать один или более основных атомов азота и, таким образом, могут образовывать соли с кислотами, которые также составляют часть данного изобретения. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают среди прочих соли присоединения неорганических кислот, таких как соляная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, азотная, хлорная, серная и фосфорная кислота, а также соли присоединения органических кислот, таких как уксусная, метансульфоновая, трифторметансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, пара-толуолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, миндальная, щавелевая, янтарная, фумаровая, винная и малеиновая кислота. Аналогично, соединения по настоящему изобретению могут содержать один или более кислотных протонов и, таким образом, могут образовывать соли с основаниями, которые также составляют часть данного изобретения. Примеры таких солей включают соли с катионами металлов, такими как, например, ион щелочного металла, ион щелочно-земельного металла или ион алюминия; или они могут образовывать координационное соединение с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают среди прочих диэтиламин и триэтиламин. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид алюминия, гидроксид кальция, гидроксид калия, карбонат натрия и гидроксид натрия. Соединение может иметь более одного катиона или аниона в зависимости от числа заряженных функциональных групп и от валентности катионов и анионов.

Соли, являющиеся производными от фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклических аминов и основных ионобменных смол, таких как аргинин, бетаин, кофеин, холин, N,N-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминовые смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и им подобные.

Ограничений по типу солей, которые могут быть использованы, нет при условии, что эти соли являются фармацевтически приемлемыми при их применении для терапевтических целей. Соли могут быть синтезированы с помощью традиционных химических способов на основе исходного соединения, содержащего основную или кислотную группировку. Обычно такие соли могут быть получены путем проведения реакции данных соединений в форме свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, таком как диэтиловый эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитил, или в их смеси. Соединения формулы I или формулы III и их соли отличаются по некоторым физическим свойствам, но для целей настоящего изобретения они эквивалентны.

Некоторые из соединений формулы I или формулы III по настоящему изобретению могут существовать как в несольватированной форме, так и в сольватированной форме, например в форме гидратов. Настоящее изобретение охватывает все подобные вышеупомянутые формы, которые являются фармацевтически активными.

Некоторые из соединений общей формулы I могут проявлять полиморфизм, при этом настоящее изобретение охватывает все возможные полиморфные формы и их смеси. Различные полиморфные формы могут быть получены путем кристаллизации при различных условиях или путем нагревания или плавления соединения с последующим постепенным или быстрым охлаждением. Присутствие полиморфов можно определить с помощью твердотельной ЯМР (ядерно-магнитный резонанс) спектроскопии, ИК (инфракрасной) спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии, порошковой дифракции рентгеновских лучей или других подобных методик.

Соединения формулы I по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один хиральный центр. Кроме того, они могут иметь дополнительные хиральные центры. Настоящее изобретение включает все возможные стереоизомеры и их смеси, в особенности их рацемические смеси. Отдельный энантиомер может быть получен посредством любого из общепринятых способов, например посредством хроматографического разделения рацемической смеси на стационарной хиральной фазе, посредством разделения рацемической смеси с помощью методик фракционной кристаллизации ее диастереоизомерных солей, посредством хирального синтеза, посредством ферментативного разделения или посредством биотрансформации. Данное разделение может быть проведено для любого хирального синтетического промежуточного соединения или для продуктов общей формулы I. В качестве альтернативы любой энантиомер соединения общей формулы I может быть получен с помощью энантиоспецифического синтеза с использованием оптически чистых исходных материалов или реагентов известной конфигурации.

Соединения формулы I или формулы III могут существовать в виде нескольких диастереоизомеров и могут быть разделены с помощью общепринятых методик, таких как хроматография или фракционная кристаллизация. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут иметь цис/транс изомеры. Настоящее изобретение включает все геометрические изомеры и их смеси. Настоящее изобретение охватывает все изомеры и их смеси (например рацемические смеси), полученные путем синтеза и также путем их физического смешивания.

Настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанных новых соединений, их производных, их аналогов, их таутомерных форм, их стереоизомеров, их полиморфов или их фармацевтически приемлемых солей и сольватов.

Соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы с помощью описанных ниже способов, а также с помощью других способов, известных в области органического синтеза. Предпочтительные способы включают, не ограничиваясь этим, общие способы, изображенные на приложенных схемах. Если не указано иное, группы R1, R2, R3, R4, n, x и у имеют значения, описанные в общих формулах I, II и III.

Соединения формулы I могут быть получены с помощью следующего способа.

Способ А.

Согласно способу А при удалении защиты в виде флуоренилметоксикарбонильной группы амин с твердой подложкой IV подвергают ацилированию ацилирующим агентом V, где X представляет собой уходящую группу, например галоген, и Y представляет собой -OH или галоген. Если Y представляет собой галоген, например в случае хлорацетилхлорида, реакцию можно проводить в присутствии третичного основания, такого как триэтиламин. Если Y представляет собой -OH, например в случае бромуксусной кислоты, реакцию можно проводить в присутствии подходящего агента сочетания, например N,N'-диизопропилкарбодиимида. В обоих случаях реакцию можно проводить в инертном растворителе, в котором смола способна к правильному набуханию, таком как N,N'-диметилформамид или дихлорметан, и при комнатной температуре или с использованием микроволнового излучения, снижающего время реакции. Затем осуществляют сочетание с амином VIa, используя третичный амин в качестве основания. Реакцию можно проводить с нагреванием, например при 60 °С, или с использованием микроволнового излучения.

Карбоновую кислоту VIII, где PG представляет собой защитную группу, такую как аллил, подвергают взаимодействию с амином VII с получением амида IX, используя агент сочетания, например комбинацию N,N'-диизопропилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола. Далее осуществляют взаимодействие с амином VIb посредством реакции Михаэля, используя основание и растворитель, такой как N,N'-диметилформамид или диметилсульфоксид, с получением промежуточного соединения X. После повтора ацилирования и аминирования таким же образом, как описано для промежуточного соединения VII, получают XI. Удаление защиты, проводимое с использованием PhSiH 3 и Pd(PPh 3 ) 4 в дихлорметане в качестве растворителя (Tetrahedron Lett 1999, 40:2505-2508; Tetrahedron Lett 1997, 38:7275-7278) или с водным KOH в диоксане позволяет получить XII. Замыканию кольца способствует образование амида с использованием стандартных агентов сочетания для процедур твердофазного пептидного сочетания, таких как комбинация гексафторфосфата бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония и 1-гидроксибензотриазола, в присутствии третичного основания, такого как N,N-диизопропилэтиламин. Конечное соединение I может быть освобождено от смолы с помощью смеси трифторуксусной кислоты, дихлорметана и воды.

Альтернативная стратегия получения соединения формулы I включает ацилирование аминов IV и X аминокислотами формул XIIIa и XIIIb соответственно (способ Б).

Способ Б.

Как будет очевидно специалисту в области, для получения соединения формулы I можно комбинировать определенные стадии способа А с определенными стадиями способа Б.

Исходные первичные амины VIa, VIb и VIc имеются в продаже или могут быть получены с помощью известных методик (March, Advanced Organic Chemistry, 1991, Ed. John Wiley & Sons) или с помощью, например, схемы, описанной ниже.

Схема 1

Амин может быть получен посредством реакции Мицунобу с исходными материалами в виде спирта и фталимида калия в присутствии, например, диэтилазодикарбоксилата ДЭАД) и трифенилфосфина в тетрагидрофуране в качестве растворителя с последующим расщепления с помощью гидрата гидразина (Mitsunobu, J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 679-680).

N-замещенные глицины XIIIa и XIIIb можно синтезировать с помощью описанных ниже способов, либо посредством восстановительного аминирования соответствующего глицина с помощью подходящего альдегида (схема 2) с использованием восстановителей, таких как NaBH 4 , NaBH 3 CN или NaBH(AcO) 3 , либо посредством нуклеофильного замещения эфира подходящим амином E-NH 2 (схема 3).

Схема 2

Схема 3

Соединения формулы II могут быть получены, используя реакции, аналогичные описанным выше.

Таким образом, для получения соответствующей карбоновой кислоты формулы I, а именно соединения формулы Ia, используют ту же последовательность, что и для синтеза соединения формулы I (используя способы А и/или Б), за исключением того, что исходная твердая подложка (IVa) содержит реакционно-способные атомы галогенов вместо аминогруппы.

Пептид XVI для присоединения к соединению Ia получают также с помощью стандартных реакций для синтеза пептидов. Таким образом, амин с твердой подложкой IV сначала подвергают взаимодействию с защищенным лизином (XIVa) и возможно затем проводят реакцию с другой защищенной аминокислотой (XIVb). После сочетания защитную группу удаляют. Эту последовательность можно повторять вплоть до трех раз.

Затем проводят реакцию карбоновой кислоты Ia с амином XVI и после удаления защитной группы получают соединение IIa. Амидное сочетание между IIa и полиглутаминовой кислотой XVIIa (полученной из соответствующей соли XVII) позволяет получить лекарственный конъюгат III.

Соединения по настоящему изобретению являются ингибиторами apaf-1. Следовательно, они полезны для лечения или предупреждения состояния, связанного с избыточным апоптозом.

У взрослых постмитотические клетки, такие как нейроны и клетки сердечной мышцы, редко обновляются. Таким образом, их потеря может вызывать неврологические и сердечные расстройства. Эти клетки подвергаются клеточной смерти путем апоптоза при целом ряде острых и хронических дегенеративных заболеваний. Аналогично септический шок, ишемия и интоксикация могут вызывать обширный апоптоз во многих органах. Инфекции могут вызывать повышенный апоптотический метаболизм определенных клеточных типов, например лимфоцитов при СПИДе (синдром приобретенного иммунодефицита) или клеток слизистой оболочки желудка при инфекции Helicobacter pylori. Случаи апоптоза также существенны в процедурах при ишемии и для консервации и реперфузии в трансплантации органов. Таким образом, данные заболевания являются кандидатами для терапевтического подавления клеточной смерти.

Другие состояния или заболевания, связанные с апоптозом, включают, не ограничиваясь этим, удар, травматическое состояние, повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, менингит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Кеннеди, рассеянный склероз, заболевания, связанные с прионами, а также другие острые или хронические сердечно-сосудистые заболевания, патологии, связанные с алкоголизмом, и лечение алопеции.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению данных соединений для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения вышеупомянутых заболеваний или состояний.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы I без учета условия для R2 или соединения, являющегося конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или состояния, ассоциированного с апоптозом.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с ингибированием апоптоза, включающему введение соединения формулы I без учета условия для R2 или соединения, являющегося конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предупреждения удара, травматического состояния, повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, менингита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Кеннеди, рассеянного склероза, заболеваний, связанных с прионами, ишемии миокарда, а также других острых или хронических сердечно-сосудистых заболеваний, трансплантации органов, патологий, связанных с алкоголизмом, и лечения алопеции, включающему введение соединения формулы I без учета условия для R2 или соединения, являющегося конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, и одного или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы I или соединение, которое является конъюгатом полимера и лекарственного вещества, как определено выше, его фармацевтически приемлемую соль или сольват, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами, в виде единичной или множественной дозы. Примеры упомянутых ниже эксципиентов служат только для иллюстрации и не должны восприниматься как ограничивающие объем изобретения.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде любой фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция зависит от природы активного соединения и способа введения. Может быть использован любой способ введения, например пероральный, трансбуккальный, легочный, местный, парентеральный (включая подкожный, внутримышечный и внутривенный), трансдермальный, окулярный (офтальмологический), ингаляция, интраназальный, ушной, трансмукозальный, имплантант или ректальное введение. Однако предпочтительным является пероральное, местное или парентеральное введение.

Твердые композиции для перорального введения включают среди прочих таблетки, грануляты и твердые желатиновые капсулы, в виде препаратов с немедленным высвобождением или с модифицированным высвобождением.

В качестве альтернативы соединения по настоящему изобретению могут быть включены в жидкие пероральные препараты, такие как эмульсии, растворы, дисперсии, суспензии, сиропы, эликсиры, или могут иметь вид мягких желатиновых капсул. Они могут содержать общеупотребительные инертные разбавители, такие как очищенная вода, этанол, сорбит, глицерин, полиэтиленгликоли (макроголы) и пропиленгликоль. Вспомогательные композиции также могут содержать коадъюванты, такие как смачивающие, суспендирующие агенты, подсластители, корригенты, консерванты, буферы, хелатирующие агенты и антиоксиданты.

Препараты для инъекций для парентерального введения содержат стерильные растворы, суспензии или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать коадъюванты, такие как суспендирующие, стабилизирующие агенты, агенты для регулирования тоничности или диспергирующие агенты.

Соединение также может быть приготовлено в виде препарата для местного введения. Препараты включают кремы, лосьоны, гели, порошки, препараты в форме шампуня, пероральную пасту, препараты для полоскания рта и пластыри, где соединение распределено или растворено в подходящих эксципиентах.

В одном воплощении изобретения фармацевтическая композиция имеет форму наносфер, микрочастиц и наночастиц.

Эффективная дозировка активного ингредиента может различаться в зависимости от конкретного вводимого соединения, способа введения, природы и серьезности заболевания, подлежащего лечению, а также возраста, общего состояния и массы тела пациента, среди других факторов. Типичный пример подходящего диапазона дозировки составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, что может быть введено в виде единичной дозы или раздельными дозами. Однако вводимая дозировка обычно остается на усмотрение врача.

Токсичность и выживание клеток в анализе МТТ

Анализ МТТ оценивает пролиферацию клеток, а также снижение жизнеспособности клеток в случае, если метаболические процессы ведут к апоптозу или некрозу. Его также можно использовать для оценки уровня выживаемости данной клеточной линии при ее инкубации в присутствии ксенобиотиков. Снижение уровня солей тетразолия принимают в качестве надежного способа анализа клеточной пролиферации. Уровень желтого тетразолия МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолия) снижается за счет метаболически активных клеток и приводит к внутриклеточному образованию пурпурного формазана, уровень которого можно измерить с помощью спектрофотометра после солюбилизации в ДМСО (диметилсульфоксиде).

В данном изобретении МТТ анализ был использован для оценки токсичности соединений в различных концентрациях. Для анализа их возможного негативного влияния на клеточную жизнеспособность, соединения добавляли к клеточным линиям Saos-2 и U937 в различных концентрациях и инкубировали в течение различных периодов времени. Результаты выражены в процентах жизнеспособности клеток.

Анализ МТТ также использовали для оценки восстановления клеток посредством добавления соединений в клеточные линии с индуцированным апоптозом. Для клеточной линии Saos-2 индукцию апоптоза производили посредством добавления доксициклина 2 мкМ; в случае клеточных линий U937, HeLa, U2-OS апоптоз индуцировали доксорубицином в концентрациях 0,25, 1,5, 2 мкМ, соответственно. Результаты выражены в % жизнеспособности клеток с учетом того, что добавление доксициклина и доксорубицина индуцирует 100%-ную клеточную гибель и 0% выживания клеток в линиях Saos-2 и HeLa, U2-OS или U937, соответственно.

Анализ ингибирования каспаз

Было проанализировано зависимое от времени ингибирование каспаз, вызванное соединениями, описанными в данном изобретении. Клеточные линии выращивали в присутствии или в отсутствие соединений (50 мкМ) в течение разных периодов времени. Активность каспаз анализировали, используя экстракты клеток Saos-2 или U937 и Ac-DEVD-afc(N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-afc(7-амино-4-трифторметилкумарин)) в качестве субстрата (20 мкМ). Активность каспаз непрерывно контролировали по высвобождению флуоресцентного afc, используя флуориметр Cytofluor 4000 (возбуждение 400 нм, излучение 508 нм) в течение 1 ч. Влияние соединений на активность каспаз выражали в виде процента ингибирования флуоресцентного сигнала обработанных клеток против необработанных (контрольных).

Ингибирование апоптоза, индуцированного Apaf-1

Оценивали активность соединений в отношении их специфической мишени в аппарате апоптоза. Олигомеризация Apaf-1 представляет собой событие на молекулярном уровне, которое ведет к активации образования апоптосомы, которое приводит к индукции апоптоза. Эти эксперименты проводили в бесклеточном анализе и в анализах на клетках.

Для бесклеточного анализа цитоплазматические экстракты Неk-293 получали, как описано ранее (Malet et al., 2005), и выполняли фракционирование полного клеточного экстракта. Параллельно очищали рекомбинантный Apaf-1 согласно Malet et al., 2005. Фракцию FT (содержащую каспазу-3 и -9, но не содержащую Apaf-1) инкубировали с рекомбинантным Apaf-1 в присутствии разных концентраций соединений (см. фиг. 1). Активность соединений анализировали по ингибированию активности каспаз (см. выше).

Для анализа на клетках клетки Saos-2 и U937 обрабатывали активатором апоптосомы (Nguyen and Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100:7533-7538), который специфически индуцирует олигомеризацию Apaf-1 После этого соединения добавляли к клеткам (50 мкМ) и инкубировали в течение 24 или 48 ч. Способность соединений ингибировать апоптоз, вызванный Apaf-1, анализировали по ингибированию активности каспаз (см. выше).

Связывание IIa.1 с CARD доменом (домен активации и рекрутирования каспазы) Apaf-1: анализ поляризации флуоресценции.

Измерения поляризации флуоресценции производили на счетчике Victor2V 1420 Multilabel HTS. 60 нМ раствор меченого 5'-6'-карбоксифлуоресцеином IIa.1 (называемого CF-IIA.1; λ возбуждения = 480 нм; λ излучения = 535 нм) в буфере А (общий объем реакционной смеси составлял 200 мкл) титровали с помощью концентрированных белковых растворов. Данные записывали с помощью программного обеспечения Wallac 1420 Workstation. Величины Kd вычисляли с помощью модели двух состояний (см. фиг. 2).

Для исходной характеристики сайта связывания пептоидов с апоптосомой авторы изобретения синтезировали флуоресцентный аналог IIa.1 (CF-IIa.1). CF-IIa. 1 связывался с CARD доменом Apaf-1, но не с цитохромом С и другими контрольными белками (Malet at al, 2005) с константой диссоциации (Kd) 60 нМ, как было определено в анализе поляризации флуоресценции (фиг. 2). Тем не менее величина константы связывания отличалась от концентрации IIa.1, необходимой для ингибирования 50% активности каспаз в анализах (IC50 составляла приблизительно 30 мкМ, фиг. 1). Предполагаемое объяснение для согласования этих данных заключается в том, что лизат ретикулоцитов, используемый для трансляции прокаспазы-9 in vitro, содержал компоненты, которые снижали эффективную концентрацию IIa.1.

Примеры

В примерах использовали следующие аббревиатуры:

Boc: трет-бутоксикарбонил

DCM: дихлорметан

DIC: N,N'-диизопропилкарбодиимид

DIPEA: диизопропилэтиламин

DMF: N,N'-диметилформамид

экв.: молярный эквивалент

EtOAc: этилацетат

Fmoc: флуоренилметоксикарбонил

Глицин: G

HATU: гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония

НОВТ: 1-гидроксибензотриазол

Лизин: K

PGA: поли(L-глутаминовая кислота)

Фенилаланин: F

PyBOP: гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония

R: аргинин

rt: время удерживания

ТФУ: трифторуксусная кислота

Валин: V

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами. Примеры приведены только для иллюстрации и не должны рассматриваться, как ограничивающие объем изобретения.

Полистирольную смолу AM RAM (0,75 ммоль/г) приобретали у Rapp Polymere GmbH (Германия). Смолу на основе 2-хлортритилхлорида (1,4 ммоль/г) приобретали у Novabiochem. Полупрепаративную ОФ-ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой) проводили в системе Waters (Milford, MA, USA), используя колонку X-Terra C 18 (19 ×25 см, 5 мкм); элюент: А = 0,1% ТФУ в воде, В = 0,1% ТФУ в ацетонитриле, градиент: 0 мин 20% В - 20 мин 80% В. Масс-спектры высокого разрешения (HRMS-FAB (бомбардировка быстрыми атомами)) регистрировали в Службе масс-спектрометрии в Университете Сантьяго де Компостела (Испания).

Используемая в данном документе номенклатура основана на AUTONOM (Автоматическая номенклатура), компьютеризованной системе Института Beilstein для генерации систематической номенклатуры IUPAC (Международного союза по теоретической и прикладной химии).

Промежуточное соединение VIII.

VIII: моноаллиловый эфир (Z)-бут-2-ендиовой кислоты

К раствору 2 г малеинового ангидрида (20 ммоль) в хлороформе добавляли 1,8 мл аллилового спирта (26 ммоль, 1,3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 60 °С в течение 50 мин под микроволновым облучением. Полученный раствор обрабатывали 1 н. HCl и экстрагировали хлороформом. Органические экстракты промывали солевым раствором, затем сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали посредством колоночной хроматографии с получением промежуточного соединения VIII в виде масла (чистота 95%, выход 85%).

Соединения формулы I.

I.1: карбамоилметил-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]амид 1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-4-(3,3-дифенилпропил)-3,7-диоксо[1,4]-диазепан-5-карбоновой кислоты.

Амидную смолу Ринка (500 мг, 0,4 ммоль) обрабатывали 3 мл 20%-ного пиперидина в DMF, и смесь перемешивали в микроволновом реакторе в течение 2 мин при 60 °С. Смолу отфильтровывали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Смолу обрабатывали раствором бромуксусной кислоты (V, 275 мг, 5 экв.) и DIC (306 мкл, 5 экв.) в DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 мин при 60 °С в микроволновом реакторе. Смолу высушивали и промывали DCM (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). Раствор 2,4-дихлорфенетиламина (VIa, 300 мкл, 5 экв.) и триэтиламина (275 мкл, 5 экв.) в 3 мл DMF добавляли к смоле, и суспензию перемешивали в течение 2 мин при 90 °С с микроволной активацией. Надосадочную жидкость удаляли и остаток сушили и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором моноаллилового эфира (Z)-бут-2-ендиовой кислоты (VIII, 310 мг, 5 экв.), НОВТ (267 мг, 5 экв. и DIC (306 мкл, 5 экв.) в DCM:DMF (2:1, 3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, фильтровали и реакцию повторяли при тех же условиях. Смолу высушивали и промывали DCM (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). Затем к смоле добавляли раствор 3,3-дифенилпропиламина (VIb, 418 мг, 5 экв.) и триэтиламина (275 мкл, 5 экв.) в 3 мл DMF и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Реакцию повторяли в течение ночи при той же температуре. Надосадочную жидкость удаляли и остаток сушили, и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором бромуксусной кислоты (V, 275 мг, 5 экв.) и DIC (306 мкл, 5 экв.) в DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 мин при 60 °С в микроволновом реакторе. Смолу высушивали и промывали DCM (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). Раствор 2,4-дихлорфенетиламина (VIc, 200 мкл, 5 экв.) и триэтиламина (210 мкл, 5 экв.) в 3 мл DMF добавляли к смоле и суспензию перемешивали в течение 2 мин при 90 ° с микроволновой активацией. Надосадочную жидкость удаляли и смолу высушивали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Затем смолу обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием(0) (46 мг, 0,1 экв.) и фенилсиланом (490 мкл 10 экв.) в безводном DCM в течение 15 мин при комнатной температуре в атмосфере аргона. Данную процедуру повторяли три раза. Надосадочную жидкость удаляли и смолу высушивали, и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Замыканию кольца способствовала обработка РуВОР (308 мг, 1,5 экв.), НОВТ (80 мг, 1,5 экв.) и DIPEA (203 мкл, 3 экв.) в DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и фильтровали. Смолу высушивали и промывали DCM (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). Наконец, с помощью обработки смолы смесью 60:40:2 ТФУ:DCM:вода получали неочищенную реакционную смесь, содержащую указанное в заголовке соединение I.1, которую фильтровали. Растворители удаляли из фильтрата путем выпаривания при пониженном давлении с последующей лиофилизацией. Полученный остаток очищали посредством полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ, используя градиент водного ацетонитрила (42% ацетонитрила 80% ацетонитрила, 35 мин), с получением 91 мг желаемого продукта (выход 30%, не менее 98% чистоты).

HRMS (М + Н) + : вычислено для C 39 H 38 Cl 4 N 4 O 4 767,1647; найдено 767,1720.

Следуя процедуре, аналогичной описанной для примера I.1, но с использованием других аминов, были получены следующие продукты:

Промежуточное соединение Ia.

Ia: {[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-[1-[2-(2,4-дихлорфенил)этил]-4-(3,3-дифенил пропил )-3,7-диоксо[1,4]диазепан-5-карбонил]амино}уксусная кислота

Смолу 2-хлортритилхлорида (IVa, 700 мг, 0,98 ммоль) обрабатывали раствором хлоруксусной кислоты (V, 463 мг, 5 экв.) и DIPEA (840 мкл, 5 экв.) в DCM (4 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, реакцию гасили с помощью метанола (550 мкл) и перемешивание продолжали в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, остаток высушивали и промывали DCM (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). К смоле добавляли раствор 2,4-дихлорфенетиламина (VIa, 740 мкл, 5 экв.) и DIPEA (840 мкл, 5 экв.) в 4 мл DMF и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором моноаллилового эфира (Z)-бут-2-ендиовой кислоты (VIII) (765 мг, 5 экв.), НОВТ (662 мг, 5 экв.) и DIC (760 мкл, 5 экв.) в смеси 2:1 DCM:DMF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтровали и повторяли реакцию при тех же условиях. Затем к смоле добавляли раствор 3,3-дифенилпропиламина (VIb, 1,0 г, 5 экв.) и DIPEA (840 мкл, 5 экв.) в 4 мл DMF и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Реакцию повторяли и перемешивание продолжали в течение 16 ч при той же температуре. Надосадочную жидкость удаляли, осадок сушили и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Затем смолу обрабатывали раствором хлоруксусной кислоты (V, 463 мг, 5 экв.) и DIC (760 мкл, 5 экв.) в смеси 2:1 DCM:DMF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Смолу высушивали и промывали DCM (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). Раствор 2,4-дихлорфенетиламина (VIc, 740 мкл, 5 экв.) и DIPEA (840 мкл, 5 экв.) в 4 мл DMF добавляли к смоле и суспензию перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Затем смолу обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием(0) (114 мг, 0,1 экв.) и фенилсиланом (1,2 мл, 10 экв.) в безводном DCM в течение 15 мин при комнатной температуре в аргоновой атмосфере. Данную стадию синтеза выполняли три раза. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и промывали DCM (3 х 3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DMF (3 ×3 мл). Замыканию кольца способствовала обработка РуВОР (765 мг, 1,5 экв.), НОВТ (199 мг, 1,5 экв.) и DIPEA (505 мкл, 3 экв.) в DMF (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч и фильтровали. Смолу высушивали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Наконец, с помощью обработки смолы смесью 5:95 ТФУ:DCM получали неочищенную реакционную смесь, которую фильтровали. Растворители удаляли из фильтрата при пониженном давлении с последующей лиофилизацией с получением соединения Ia (460 мг, выход 61%, не менее 55% чистоты) в виде бесцветного твердого вещества.

Промежуточные соединения IIa

С амидной смолы Ринка (IV, 505 мг, 0,4 ммоль) снимали защитную группу с помощью 3 мл 20%-ного пиперидина в DMF. Смесь перемешивали в микроволновом реакторе в течение 2 мин при 60 °С. Смолу отфильтровывали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (XIVa, 2 экв.) связывали со смолой, используя НОВТ (108 мг, 2 экв.) и DIG (125 мкл, 2 экв.). Смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Смолу высушивали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). После удаления группы Fmoc с помощью 3 мл 20%-ного пиперидина в DMF (30 мин) смолу промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). При необходимости присоединяли другие аминокислоты (XIVb) в тех же условиях, что описаны выше для получения промежуточного соединения XVI.

К промежуточному соединению XVI, набухшему в DMF, добавляли кислоту Ia (460 мг, 1,5 экв.) в присутствии HATU (228 мг, 1,5 экв.) и DIPEA (205 мкл, 3 экв.) в DMF (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и фильтровали. Смолу высушивали и промывали DMF (3 ×3 мл), изопропиловым спиртом (3 ×3 мл) и DCM (3 ×3 мл). С помощью обработки смолы смесью 80:20:2,5:2,5 ТФУ/DCM/вода/триизопропилсилан получали неочищенную реакционную смесь, содержащую соединение IIа, которую фильтровали. Растворители удаляли из фильтрата при пониженном давлении с последующей лиофилизацией. Полученный остаток очищали путем полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ, используя градиент смеси воды и ацетонитрила.

Соединения формулы III

III.1 PGA-IIa.1

К раствору натриевой соли PGA (XVII, 0,1 г, 0,5 ммоль) с молекулярной массой (M w ) в диапазоне 17000-43000 Да в воде добавляли 0,2 М HCl до тех пор, пока рН раствора не достигал 2,0. Осадок собирали, проводили диализ против воды и подвергали лиофилизации. Затем PGA в протонной форме (XVIIa) растворяли в сухом DMF (7,5 мл), добавляли DIC (3 экв.) и НОВТ (3 экв.) и оставляли с перемешиванием на 15 мин. Затем добавляли промежуточное соединение IIa.1 (0,052 ммоль (12 мол.%) 1 экв.) и доводили рН до 8 с помощью DIPEA (1,5 мл). Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 36 ч. Тонкослойная хроматография (ТСХ, диоксид кремния) показала полную конверсию IIa.1 (R f =0,5) в полимерный конъюгат (R f =0, MeOH:H 2 O:AcOH=85:10:5). Для прекращения реакции смесь выливали в CHCl 3 . Полученный осадок собирали и сушили под вакуумом. Натриевую соль конъюгата PGA-пептоид III.1 получали посредством растворения продукта в 1,0 М NaHCO 3 . Проводили диализ этого водного раствора против дистиллированной воды (M w CO 6000-8000 Да). Лиофилизация продукта диализа позволяла получить продукт в виде белого порошка. Общее содержание пептоида в полимере, определенное с помощью ультрафиолета ( λ = 282 нм), находилось в диапазоне 25-30% (мас./мас.) (10-12 мол.% функционализации), содержание свободного лекарственного средства составляло менее 1 мас.% от общего содержания лекарственного средства.

Среднюю молекулярную массу (M w ), полидисперсность (M w /M n ) и поведение III.1 и контрольного XVII в растворе анализировали с помощью гель-хроматографии (SEC) и аналитического ультрацентрифугирования (AUC). Обе методики показали, что III.1 имеет более компактную конформационную структуру с меньшим гидродинамическим объемом и большим коэффициентом седиментации (S), чем XVII (tr = 12,5 мин и S = 3,5 ± 0,4 с против tr = 11,6 мин и S = 1,9 ± 0,1 с для III.1 и XVII, соответственно). С помощью метода седиментационного равновесия M w определили, как равную 26700 Да для XVII и 58600 Да для III.1, однако с помощью гель-проникающей хроматографии с использованием PEG (полиэтиленгликоль) стандартов Mw была определена как равная 36000 Да (M w /M n = 1,8) и 38000 Да (M w /M n = 1,5) для XVII и III.1, соответственно.

Определение общего содержания лекарственного средства путем УФ спектроскопии

Готовили исходный раствор IIа в MeOH (1 мг/мл). Для получения калибровочной кривой образцы разводили, используя МеОН, до концентрации в диапазоне 0-1 мг/мл. Общее содержание лекарственного средства в конъюгатах определяли посредством измерения оптической плотности при 272 нм и 281 нм в H 2 O. В качестве контроля использовали PGA в том же диапазоне концентраций, что и анализируемый конъюгат III (0-5 мг/мл) в H 2 O. Коэффициент экстинкции для IIa при 281 нм в МеОН при комнатной температуре составлял

Определение содержания свободного лекарственного средства с помощью ВЭЖХ

Готовили водные растворы III.1 (1 мг/мл), аликвоту (100 мкл) добавляли в полипропиленовую пробирку и доводили водой до 1 мл. рН образцов доводили до 8 буфером на основе формиата аммония (100 мкл, 1 М, рН 8,5) и затем добавляли CHCl 3 (5 мл). Затем образцы тщательно перемешивали с помощью встряхивания (3 × 10 с). Верхний водный слой осторожно удаляли и растворитель выпаривали в атмосфере N 2 . Сухой остаток растворяли в 200 мкл ацетонитрила для ВЭЖХ. Параллельно ту же процедуру выполняли для исходного соединения IIa.1 (используя 200 мкл исходного водного раствора 1 мг/мл). Добавление 1 мл ацетонитрила для повторного растворения продукта позволяло получить базовый раствор с концентрацией 200 мкг/мл, из которого получали растворы с различной концентрацией (от 2 до 100 мкг/мл). Свободное количество лекарственного средства в конъюгатах определяли с помощью ВЭЖХ, используя колонку Lichrospher ® C18 (150 × 3,9 мм) со скоростью потока 1 мл/мин, используя градиент ацетонитрила в водной 0,1%-ной ТФУ (от 20 до 100% ацетонитрила в 20 мин). Время удерживания составляло tr = 14,3 мин для IIa.1 ( λ = 220 нм).

Следуя данной процедуре, как для III1, были получены следующие соединения.

Описание графических материалов

Фиг. 1 - бесклеточный анализ ингибирования каспаз с использованием FT цитоплазматической фракции Hek-293 после инкубации с рекомбинантным Apaf-1 в присутствии различных концентраций соединения IIa.1;

фиг. 2 - анализ взаимодействия CRAD/IIa.1. 240 нм раствора CF-IIa.1 в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) титровали возрастающими концентрациями CRAD-Apaf, и измеряли поляризацию флуоресценции при 30 °С. Данные (среднее, стандартное отклонение; n=3) записывали в единицах миллиполяризации (mP).