Применение соединения для приготовления лекарственного средства для лечения бактериальной инфекции при условии, что бактериальная инфекция является иной, чем микобактериальная инфекция, причем указанное соединение является соединением формулы (I), его фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной солью или аддитивной солью с основанием, четвертичным амином, стереохимической изомерной формой, таутомерной формой или N-оксидной формой, где R ¹ представляет собой водород или галоген; р равно 1, 2 или 3; s равно 0, 1, 2, 3 или 4; R ² представляет собой водород, галоген или алкилокси; R ³ представляет собой Ar; q равно 0, 1, 2, 3 или 4; R ⁴ и R ⁵ , каждый независимо, представляют собой алкил; R ⁶ представляет собой водород; r равно 1, 2, 3, 4 или 5 и R ⁷ представляет собой водород или алкил; алкил представляет собой прямой или разветвленный углеводородный радикал, имеющий от 1 до 6 углеродных атомов; или является циклическим насыщенным углеводородным радикалом, имеющим от 3 до 6 углеродных атомов; или является циклическим насыщенным углеводородным радикалом, имеющим от 3 до 6 углеродных атомов, присоединенным к прямому или разветвленному насыщенному углеводородному радикалу, имеющему от 1 до 6 углеродных атомов; где каждый углеродный атом может быть необязательно замещен гидрокси, алкилокси или оксо; Ar представляет собой фенил или нафтил, каждый из которых необязательно замещен 1, 2 или 3 заместителями, независимо выбранными из галогенов; галоген представляет собой заместитель, выбранный из фтора, хлора, брома и йода; при условии, что когда радикал представленной ниже формулы находится в положении 3 хинолинового фрагмента, R ⁷ находится в положении 4 хинолинового фрагмента и R ² находится в положении 2 хинолинового фрагмента молекулы и представляет собой водород или алкилокси, тогда s равно 1, 2, 3 или 4.

[0001] Применение соединения для приготовления лекарственного средства для лечения бактериальной инфекции, где указанное соединение является соединением формулы (I)

[0002] Применение по п.1 при условии, что радикал

[0003] Применение по любому из предшествующих пунктов, где р равно 1.

[0004] Применение по любому из предшествующих пунктов, где R2 представляет собой водород или галоген.

[0005] Применение по любому из предшествующих пунктов, где q равно 1 или 3.

[0006] Применение по любому из предшествующих пунктов, где R4 и R5, каждый независимо, представляет собой C1-6алкил.

[0007] Применение по любому из предшествующих пунктов, где s равно 0 или 1.

[0008] Применение по любому из предшествующих пунктов, где алкил представляет собой C1-6алкил.

[0009] Применение по любому из предшествующих пунктов, где бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную грамположительной бактерией.

[0010] Соединение, выбранное из

[0011] Комбинация (а) соединения, выбранного из соединений по п.10, и (b) одного или нескольких антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства.

[0012] Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество (а) соединения, выбранного из соединений по п.10, и (b) одного или нескольких других антибактериальных средств, при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства.

[0013] Применение комбинации по п.11 или фармацевтической композиции по п.12 для лечения бактериальной инфекции.

[0014] Продукт, содержащий (а) соединение, выбранное из соединений по п.10, и (b) одно или несколько других антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства, представляющий собой комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении бактериальной инфекции.

[0015] Применение по любому из пп.1-9 и 13, где бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococci, Enterococci или Streptococci.

[0016] Применение по любому из пп.1-9 и 13, где бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную резистентным к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), резистентным к метициллину коагулаза-отрицательным стафилококком (MRCNS), резистентным к пенициллину Streptococcus pneumoniae и полирезистентным Enterococcus faecium.

[0017] Применение по любому из пп.1-9 и 13, где бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus или Streptococcus pneumoniae.

[0018] Применение по любому из пп.1-9 и 13, где бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus (MRSA).

Настоящее изобретение относится к применению производных хинолина для приготовления лекарственного средства для лечения бактериальной инфекции.

Резистентность к приоритетному ряду антибиотических средств является неотложной проблемой. Некоторые важные примеры включают в себя резистентный к пенициллину Streptococcus pneumoniae, резистентный к ванкомицину энтерококк, резистентный к метициллину Staphylococcus aureus, полирезистентную сальмонеллу.

Последствия резистентности к антибиотическим средствам являются серьезными. При инфекциях, вызванных резистентными микробами, отсутствует реакция на лечение, что приводит к продолжительному заболеванию и увеличению риска смерти. Несостоятельность лечения также приводит к более длительным периодам инфективности, которые увеличивают число инфицированных людей, общающихся в обществе и, таким образом, подвергающих все население риску заражения инфекцией резистентной линии.

Больницы являются опасной составной частью проблемы противомикробной резистенции во всем мире. Сочетание весьма восприимчивых пациентов, интенсивного и длительного применения противомикробных средств и внутрибольничной инфекции приводит к инфекциям с чрезвычайно резистентными бактериальными патогенными микроорганизмами.

Самолечение противомикробными средствами является другим главным фактором, способствующим резистенции. Самолечение антимикробными средствами, которое может не являться необходимым, часто проводится в неадекватных дозах либо с использованием лекарственного средства, не содержащего адекватную дозу.

Точное соблюдение пациентом рекомендованного лечения является другой существенной проблемой. Пациенты забывают принимать лекарственное средство, прерывают свое лечение, когда начинают чувствовать себя лучше, или могут быть не в состоянии позволить себе полный курс, тем самым создавая идеальную среду для микробов, в которой они адаптируются, а не уничтожаются.

Из-за опасной резистенции ко многим антибиотикам врачи сталкиваются с инфекциями, для которых не имеется эффективного лечения. Распространение заболеваемости, смертность и финансовые затраты на лечение таких инфекций вынуждают увеличивать нагрузку систем медико-санитарной помощи во всем мире.

Следовательно, имеется высокая потребность в новых соединениях для лечения бактериальных инфекций, в особенности для лечения инфекций, вызванных резистентными штаммами.

В US 5965572 (Соединенные Штаты Америки) уже описаны замещенные хинолины для лечения резистентных к антибиотикам инфекций и в WO 00/34265 для ингибирования роста бактериальных микроорганизмов.

В WO 2004/011436, WO 2005/070924, WO 2005/070430 и WO 2005/075428 описаны производные замещенного хинолина, обладающие активностью против микобактерий, в особенности, против Mycobacterium tuberculosis. Одно конкретное соединение из этих производных замещенного хинолина описано в Science (2005), 307, 223-227.

Ни в одной из этих публикаций не описано применение предложенных производных замещенного хинолина согласно данному изобретению.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению соединения для приготовления лекарственного средства для лечения бактериальной инфекции, причем указанное соединение представляет собой соединение формулы (I)

его фармацевтически приемлемую кислотно-аддитивную соль или аддитивную соль с основанием, его четвертичный амин, стереохимическую изомерную форму, таутомерную форму или N-оксидную форму,

где R ¹ представляет собой водород или галоген;

р равно 1, 2 или 3;

s равно 0, 1, 2, 3 или 4;

R ² представляет собой водород, галоген или алкилокси;

R ³ представляет собой Ar;

q равно 0, 1, 2, 3 или 4;

R ⁴ и R ⁵ , каждый независимо, представляют собой алкил;

R ⁶ представляет собой водород;

r равно 1, 2, 3, 4 или 5 и

R ⁷ представляет собой водород или алкил;

алкил представляет собой прямой или разветвленный углеводородный радикал, имеющий от 1 до 6 углеродных атомов; или является циклическим насыщенным углеводородным радикалом, имеющим от 3 до 6 углеродных атомов; или является циклическим насыщенным углеводородным радикалом, имеющим от 3 до 6 углеродных атомов, присоединенным к прямому или разветвленному насыщенному углеводородному радикалу, имеющему от 1 до 6 углеродных атомов; где каждый углеродный атом может быть необязательно замещен гидрокси, алкилокси или оксо;

Ar представляет собой фенил или нафтил, каждый из которых необязательно замещен 1, 2 или 3 заместителями, независимо выбранными из галогенов;

галоген представляет собой заместитель, выбранный из фтора, хлора, брома и йода;

при условии, что когда радикал

находится в положении 3 хинолинового фрагмента, R ⁷ находится в положении 4 хинолинового фрагмента и R ² находится в положении 2 хинолинового фрагмента молекулы и представляет собой водород или алкилокси, тогда s равно 1, 2, 3 или 4; при условии, что бактериальная инфекция является иной, чем микобактериальная инфекция.

Настоящее изобретение также относится к соединению, выбранному из

или

его фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли или аддитивной соли с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к комбинациям:

(а) соединения, выбранного из соединений

или

их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы; и

(b) одного или нескольких антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество

(а) соединения, выбранного из соединений

или

их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы; и

(b) одного или нескольких других антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства.

В еще одном варианте предложенное изобретение относится к применению вышеуказанных комбинации и фармацевтической композиции для лечения бактериальной инфекции.

Настоящее изобретение также относится к продукту, содержащему:

(а) соединение, выбранное из соединений

или

их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы; и

(b) одно или несколько других антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства, представляющий собой комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении бактериальной инфекции.

Подробное описание изобретения

В пределах данного изобретения линии, направленные от заместителей в кольцевые системы, обозначают, что связь может быть присоединена к любому из подходящих атомов кольца.

Принимается, что фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают терапевтически активные нетоксичные формы кислотно-аддитивных солей, которые способны образовывать соединения, соответствующие формуле (I). Указанные кислотно-аддитивные соли можно получать обработкой соединений, соответствующих формуле (I), в форме основания подходящими кислотами, например неорганическими кислотами, например галоген-водородной кислотой, в особенности хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной, азотной и фосфорной кислотами; органическими кислотами, например уксусной, гидроксиуксусной, пропановой, молочной, пировиноградной, щавелевой, малоновой, янтарной, малеиновой, фумаровой, яблочной, винной, лимонной, метансульфоновой, этансульфоновой, бензолсульфоновой, п-толуолсульфоновой, цикламовой, салициловой, п-аминосалициловой и памовой кислотами.

Соединения согласно формуле (I), содержащие кислотные протоны, также можно превратить в их терапевтически активные нетоксичные формы аддитивных солей с основаниями обработкой соответствующими органическими или неорганическими основаниями. Подходящие формы солей с основаниями включают в себя, например, соли аммония, соли щелочных и щелочно-земельных металлов, в особенности соли лития, натрия, калия, магния и кальция с органическими основаниями, например бензатином, N-метил-D-глюкамином, гидраминовые соли и соли с аминокислотами, например аргинином и лизином.

С другой стороны, указанные формы аддитивных солей с кислотами или основаниями можно превратить в свободные формы обработкой подходящим основанием или кислотой.

Термин "аддитивная соль", применяемый в пределах данного изобретения, также включает в себя сольваты, которые способны образовывать соединения, согласно формуле (I), а также их соли. Такие сольваты представляют собой, например, гидраты и алкоголяты.

Термин "четвертичный амин", применяемый здесь выше по тексту, обозначает соли четвертичного аммония, которые способны образовывать соединения формулы (I) взаимодействием основного азота соединения формулы (I) и подходящего кватернизующего агента, такого как, например, необязательно замещенный алкилгалогенид, арилалкилгалогенид, алкилкарбонилгалогенид, Ar-карбонилгалогенид, Het-алкилгалогенид или Het-карбонилгалогенид, например метилйодид или бензилйодид. Предпочтительно Het представляет собой моноциклический гетероцикл, выбранный из фуранила или тиенила; или бициклический гетероцикл, выбранный из бензофуранила или бензотиенила; каждый моноциклический и бициклический гетероцикл может быть необязательно замещен 1, 2 или 3 заместителями, каждый заместитель независимо выбран из группы галогена, алкила и Ar. Предпочтительно кватернизующий агент представляет собой алкилгалогенид. Можно также применять другие реагенты и легко удаляемые группы, такие как алкилтрифторметансульфонаты, алкилметансульфонаты и алкил-п-толуолсульфонаты. Четвертичный амин имеет положительно заряженный азот. Фармацевтически приемлемые противоионы включают в себя хлор, бром, йод, трифторацетат, ацетат, трифлат, сульфат, сульфонат.

Предпочтительно противоион представляет собой йод. Выбранный противоион можно вводить с применением ионообменных смол.

Соединения формулы (I) и некоторые промежуточные соединения неизменно имеют в своей структуре по меньшей мере два стереогенных центра, что может приводить по меньшей мере к 4 стереохимически различным структурам.

Применяемый здесь термин "стереохимические изомерные формы" обозначает все возможные изомерные формы, которыми могут обладать соединения формулы (I). Если не упоминается или не указано иным образом, химическое название соединений обозначает смесь всех возможных стереохимических изомерных форм, причем указанные смеси содержат все диастереомеры и энантиомеры базовой молекулярной структуры. Более конкретно, стереогенные центры могут иметь R- или S-конфигурацию; заместители на бивалентных циклических (частично) насыщенных радикалах могут иметь либо цис-, либо транс-конфигурацию.

Стереохимические изомерные формы соединений формулы (I) несомненно предназначены для включения в объем данного изобретения.

Следуя условным обозначениям CAS-номенклатуры, когда в молекуле присутствуют два стереогенных центра известной абсолютной конфигурации, обозначение R или S (на основании правила последовательности Кана-Ингольда-Прелога) присваивают самому низшему по номеру хиральному центру, ссылочному центру. Конфигурацию второго стереогенного центра указывают с применением соответствующих обозначений [R*,R*] или [R*,S*], где R* всегда обозначают как ссылочный центр, [R*,R*] обозначают центры с такой же хиральностью и [R*,S*] обозначают центры отличающейся хиральности. Например, если самый низший по номеру хиральный центр в молекуле имеет S-конфигурацию и второй центр имеет R-конфигурацию, стереохимическое обозначение следует обозначать как S-[R*,S*]. Если применяют термин " α" и " β": положение наиболее приоритетного заместителя на асимметрическом атоме углерода в кольцевой системе, имеющей самый низкий номер кольца, всегда условно находится в положении " α" средней плоскости, определяемой посредством кольцевой системы. Положение наиболее высоко приоритетного заместителя на другом асимметрическом атоме в кольцевой системе, относительно положения наиболее высоко приоритетного заместителя на ссылочном атоме обозначают " α", если он находится на той же стороне средней плоскости, определяемой посредством кольцевой системы, или " β", если он находится на другой стороне средней плоскости, определяемой посредством кольцевой системы.

Когда указывают определенную стереоизомерную форму, это обозначает, что указанная форма является, по существу, индивидуальной, т.е. содержит менее чем 50%, предпочтительно менее чем 20%, более предпочтительно менее чем 10%, даже более предпочтительно менее чем 5%, еще предпочтительнее менее чем 2% и наиболее предпочтительно менее чем 1% другого изомера (других изомеров). Таким образом, когда соединение формулы (I), например, обозначено как ( αS, βR), это означает, что соединение, по существу, не содержит ( αR, βS)-изомера.

Соединения формулы (I) можно синтезировать в форме рацемических смесей энантиомеров, которые можно разделить, для отделения одно от другого следующими известными в области техники методами разделения. Рацемические соединения формулы (I) можно превратить в соответствующие диастереоизомерные солевые формы взаимодействием с подходящей хиральной кислотой. Названные диастереоизомерные формы солей, по существу, разделяют, например, селективной или фракционной кристаллизацией и энантиомеры выделяют из них щелочью. Альтернативный способ разделения энантиомерных форм соединений формулы (I) включает в себя жидкостную хроматографию с применением хиральной стационарной фазы. Указанные чистые стереохимические изомерные формы можно также получать из соответствующих чистых стереохимических изомерных форм соответствующих исходных веществ при условии, что реакция протекает стереоспецифически. Предпочтительно, если требуется определенный стереоизомер, то указанное соединение будут синтезировать стереоспецифическими способами получения. В этих способах будут преимущественно применять энантиомерно чистые исходные вещества.

Принимается, что таутомерные формы соединений формулы (I) включают в себя такие соединения формулы (I), где, например, енольная группа превращается в кетогруппу (кето-енольная таутомерия).

Принимается, что N-оксидные формы соединений согласно формуле (I), включают в себя такие соединения формулы (I), где один или несколько атомов азота окислены в так называемый N-оксид, в особенности такие N-оксиды, где азот аминного радикала окислен.

Изобретение также включает производные соединения (обычно называемые "пролекарства") фармакологически активных соединений согласно изобретению, которые разлагаются in vivo с получением соединений согласно изобретению. Пролекарства обычно оказывают (но не всегда) уменьшенное действие на целевой рецептор, чем соединения, на которые они разлагаются. Пролекарства в особенности применимы, когда требуемое соединение имеет химические или физические свойства, которые делают его введение затруднительным или неэффективным. Например, требуемое соединение может быть исключительно плохо растворимым, оно может плохо транспортироваться через эпителий слизистой оболочки или оно может иметь нежелательно короткий период полувыведения из плазмы. Дальнейшую дискуссию по пролекарствам можно найти в публикации Stella, V.J. et al., "Prodrugs", Drug Delivery Systems, 1985, p. 112-176 и Drugs, 1985, 29, p. 455-473.

Пролекарственные формы фармакологически активных соединений согласно изобретению будут в основном представлять собой соединения согласно формуле (I), их фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли или аддитивные соли с основаниями, стереохимические изомерные формы, таутомерные формы и N-оксидные формы, имеющие кислотную группу, которая является этерифицированной или амидированной. В такие этерифицированные кислотные группы включены группы формулы -COOR ^x , где R ^x представляет собой C _1-6 алкил, фенил, бензил или одну из следующих групп:

Амидированные группы включают в себя группы формулы -CONR ^Y R ^Z , где R ^Y представляет собой Н, С _1-6 алкил, фенил или бензил и R ^Z представляет собой -ОН, Н, С _1-6 алкил, фенил или бензил.

Соединения, соответствующие изобретению, имеющие аминогруппу, можно дериватизировать кетоном или альдегидом, таким как формальдегид, с образованием основания Манниха. Это основание будет гидролизоваться в водном растворе согласно кинетикам первого порядка.

Принимается, что всегда применяемый далее по тексту термин "соединения формулы (I)" также включает в себя их N-оксидные формы, соли, четвертичные амины, таутомерные формы или стереохимические изомерные формы. Особый интерес представляют собой соединения формулы (I), которые являются стереохимически чистыми.

Представляющий интерес вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основаниями, стереохимических изомерных форм, таутомерных форм или N-оксидных форм, где

R ¹ представляет собой водород или галоген;

р равно 1, 2 или 3;

s равно 0, 1, 2, 3 или 4;

R ² представляет собой водород, галоген или алкилокси;

R ³ представляет собой Ar;

q равно 0, 1, 2, 3 или 4;

R ⁴ и R ⁵ , каждый независимо, представляют собой алкил;

R ⁶ представляет собой водород;

r равно 1, 2, 3, 4 или 5 и

R ⁷ представляет собой водород или алкил;

алкил представляет собой прямой или разветвленный углеводородный радикал, имеющий от 1 до 6 углеродных атомов; или является циклическим насыщенным углеводородным радикалом, имеющим от 3 до 6 углеродных атомов; или является циклическим насыщенным углеводородным радикалом, имеющим от 3 до 6 углеродных атомов, присоединенным к прямому или разветвленному насыщенному углеводородному радикалу, имеющему от 1 до 6 углеродных атомов; где каждый углеродный атом может быть необязательно замещен гидрокси, алкилокси или оксо;

Ar представляет собой фенил или нафтил, каждый из которых необязательно замещен 1, 2 или 3 заместителями, независимо выбранными из галогенов;

галоген представляет собой заместитель, выбранный из фтора, хлора, брома и йода;

при условии, что когда радикал

находится в положении 3 хинолинового фрагмента, R ⁷ находится в положении 4 хинолинового фрагмента и R ² находится в положении 2 хинолинового фрагмента молекулы и представляет собой водород или алкилокси, тогда s равно 1, 2, 3 или 4; и при условии, что бактериальная инфекция является иной, чем микобактериальная инфекция.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где радикал

в соединении формулы (I) не находится в положении 3 хинолинового фрагмента молекулы.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где р=1.

Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где R ² представляет собой водород или галоген.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где q равно 1 или 3.

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где R ⁴ и R ⁵ , каждый независимо, представляют собой C _1-6 алкил.

Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где s равно 0 или 1.

Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению таких соединений формулы (I), где алкил представляет собой С _1-6 алкил.

Кроме того, настоящее изобретение относится к соединению, выбранному из

или

его фармацевтически приемлемым кислотно-аддитивной солям или аддитивным солям с основанием, четвертичному амину, стереохимической изомерным формам или N-оксидной форме.

В предпочтительном варианте предложенное изобретение относится к применению описанных выше соединений для приготовления лекарственного средства для лечения бактериальных инфекций, вызванных грамположительной бактерией.

Предпочтительно бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную резистентным к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), резистентным к метициллину коагулаза-отрицательным стафилококком (MRCNS), резистентным к пенициллину Streptococcus pneumoniae и полирезистентным Enterococcus faecium. Предпочтительно бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococci, Enterococci или Streptococci. Предпочтительно бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus или Streptococcus pneumoniae, в частности инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus (MRSA).

Обычно, бактериальные патогенные микроорганизмы можно классифицировать либо как грамположительные, либо как грамотрицательные патогенные микроорганизмы. Антибиотические соединения с активностью против как грамположительных, так и грамотрицательных патогенных микроорганизмов обычно рассматривают как обладающие широким спектром активности. Соединения данного изобретения рассматривают как активные против грамположительных и/или грамотрицательных бактериальных патогенных микроорганизмов. В особенности, представленные соединения являются активными, по меньшей мере, против одной грамположительной бактерии, предпочтительно против нескольких грамположительных бактерий, более предпочтительно против одной или нескольких грамположительных бактерий и/или одной или нескольких грамотрицательных бактерий.

Данные соединения обладают бактерицидной или бактериостатической активностью.

Примеры грамположительных и грамотрицательных аэробных и анаэробных бактерий включают в себя Staphylococci, например S.aureus; Enterococci, например Е.faecalis; Streptococci, например S.pneumoniae, S.mutans, S.pyogens; Bacilli, например Bacillus subtilis; Listeria, например Listeria monocytogenes; Haemophilus, например Н.influenza; Moraxella, например М.catarrhalis; Pseudomonas, например Pseudomonas aeruginosa; и Escherichia, например Е.coli.

Грамположительные патогенные микроорганизмы, например Staphylococci, Enterococci и Streptococci являются в особенности важными, потому что в свое время доказано развитие резистентных штаммов, которые являются как трудными для лечения, так и трудными для уничтожения, например, из больничной среды. Примерами таких штаммов являются резистентный к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), резистентный к метициллину коагулаза-отрицательный стафилококк (MRCNS), резистентный к пенициллину Streptococcus pneumoniae и полирезистентный Enterococcus faecium.

Соединения данного изобретения также проявляют активность против резистентных бактериальных штаммов.

Соединения данного изобретения в особенности активны против Staphylococcus aureus, включая резистентный Staphylococcus aureus, такой как, например, резистентный к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) и Streptococcus pneumoniae.

В особенности, соединения настоящего изобретения действуют на такие бактерии, жизнеспособность которых зависит от характерного функционирования АТФ-синтазы F1F0. He ссылаясь на какую-либо теорию, считают, что активность данных соединений заключается в ингибировании АТФ-синтазы F1F0, в особенности ингибировании F0 комплекса АТФ-синтазы F1F0, более конкретно, в ингибировании субъединицы с F0 комплекса АТФ-синтазы F1F0, более конкретно, в ингибировании субъединицы F0 комплекса АТФ-синтазы F1F0, что приводит к нейтрализации бактерий деплецией уровней клеточной АТФ бактерий.

Когда бы ни указывали, выше или ниже по тексту, что "соединения могут лечить бактериальную инфекцию", это означает, что соединения могут лечить инфекцию, вызванную одним или несколькими бактериальными штаммами.

Когда бы ни указывали, выше или ниже по тексту, что "бактериальная инфекция другая, чем микобактериальная инфекция", это означает, что бактериальная инфекция другая, чем инфекция, вызванная одним или несколькими штаммами микобактерий.

Точная доза и частота введения данных соединений зависят от конкретного применяемого соединения формулы (I), конкретного состояния, подвергаемого лечению, тяжести состояния, подвергаемого лечению, возраста, массы, анатомического пола, диеты, времени введения и общего физического состояния конкретного пациента, способа введения, а также другого лекарственного лечения, которое может получать индивидуум, как хорошо известно специалисту в области техники. Кроме того, очевидно, что эффективное суточное количество можно снижать или увеличивать в зависимости от восприимчивости подвергаемого лечению субъекта и/или в зависимости от оценки врача, прописывающего соединения настоящего изобретения.

Соединение данного изобретения можно вводить в фармацевтически приемлемой форме, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. Соединения и композиции, включающие в себя соединения, можно вводить такими путями, как местные, локальные, или системно. Системное применение включает в себя любой способ введения соединения в ткани организма, например интратекальное, эпидуральное, внутримышечное, чрескожное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, подъязычное, ректальное или пероральное введение. Конкретную дозу антибактериального средства для введения, а также длительность лечения можно устанавливать, как требуется.

Бактериальные инфекции, которые можно лечить данными соединениями, включают в себя, например, инфекции центральной нервной системы, инфекции наружного уха, инфекции среднего уха, такие как острое воспаление среднего уха, инфекции черепных пазух, глазные инфекции, инфекции полости рта, такие как инфекции зубов, десен и слизистой оболочки, инфекции верхних дыхательных путей, инфекции нижних дыхательных путей, мочеполовые инфекции, желудочно-кишечные инфекции, гинекологические инфекции, септицемия, инфекции кости и суставов, инфекции кожи и кожной структуры, бактериальный эндокардит, ожоги, антибактериальная профилактика хирургического вмешательства и антибактериальная профилактика для иммуносупрессивных пациентов, таких как пациенты, получающие раковую химиотерапию, или пациентов с трансплантированным органом.

На основании факта, что соединения формулы (I) являются активными против бактериальных инфекций, данные соединения можно объединять с другими антибактериальными средствами для того, чтобы эффективно подавлять бактериальные инфекции.

Следовательно, данное изобретение также относится к комбинации:

(а) соединения, выбранного из соединений

или

их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы; и

(b) одного или нескольких антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства.

Кроме того, предложенное изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество:

(а) соединения, выбранного из соединений

или

их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы; и

(b) одного или нескольких других антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства.

Согласно настоящему изобретению предложено применение вышеуказанной комбинации и фармацевтической композиции для лечения бактериальной инфекции. В предпочтительном варианте вышеуказанные комбинации и фармацевтическую композицию применяют для лечения бактериальной инфекции, вызванной Staphylococci, Enterococci или Streptococci. Предпочтительно указанная бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную резистентным к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), резистентным к метициллину коагулаза-отрицательным стафилококком (MRCNS), резистентным к пенициллину Streptococcus pneumoniae и полирезистентным Enterococcus faecium.

Предпочтительно бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus или Streptococcus pneumoniae, в частности инфекцию, вызванную Staphylococcus aureus (MRSA).

Настоящее изобретение также относится к продукту, содержащему:

а) соединение, выбранное из соединений

или

их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или аддитивных солей с основанием, четвертичного амина, стереохимической изомерной формы или N-оксидной формы; и

(b) одно или несколько других антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств являются иными, чем антимикобактериальные средства, представляющие собой комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении бактериальной инфекции.

Данная фармацевтическая композиция может иметь различные фармацевтические формы для целей введения. В качестве подходящих композиций можно перечислить все композиции, обычно применяемые для системно вводимых лекарственных средств. Для приготовления фармацевтических композиций данного изобретения эффективное количество конкретных соединений, необязательно в форме аддитивной соли, в качестве активного ингредиента объединяют в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, такой носитель можно брать в широко разнообразных формах в зависимости от формы препарата, требуемого для введения. Эти фармацевтические композиции требуются в унифицированной лекарственной форме, в особенности подходящей для введения перорально или парентеральной инъекцией. Например, при изготовлении композиций в пероральной лекарственной форме можно применять любую из обычных фармацевтических сред, таких как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п., в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры, эмульсии и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, разбавители, смазывающие агенты, связывающие агенты, дезинтегрирующие агенты и т.п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Вследствие легкости введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее подходящие пероральные лекарственные формы, которые обычно применяют в случае твердых фармацевтических носителей. Для парентеральных композиций носитель обычно будет включать в себя стерильную воду, по меньшей мере в большей части, хотя могут быть включены другие ингредиенты, например, чтобы обеспечить растворимость. Например, можно изготавливать инъецируемые растворы, в которых носитель включает в себя физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и раствора глюкозы. Можно также изготавливать инъецируемые суспензии, в случае которых можно использовать подходящие жидкие носители, суспендирующие агенты и т.п. Также включенными являются препараты в твердой форме, которые предназначены для превращения, незадолго до применения препаратов в жидкой форме.

В зависимости от способа введения фармацевтическая композиция будет предпочтительно включать в себя от 0,05 до 99 мас.%, более предпочтительно от 0,1 до 70 мас.% активных ингредиентов и от 1 до 99,95 мас.%, более предпочтительно от 30 до 99,9 мас.%, фармацевтически активного носителя, причем все проценты основаны на полной композиции.

Массовые соотношения соединения формулы (I) и (b) другого антибактериального средства(в), применяемые как комбинация, может устанавливать специалист в области техники. Указанное соотношение, точная доза и частота введения зависят от применяемого конкретного соединения формулы (I) и другого антибактериального средства(в), конкретного состояния, подвергаемого лечению, тяжести состояния, подвергаемого лечению, возраста, массы, анатомического пола, диеты, времени введения и общего физического состояния конкретного пациента, способа введения, а также возможно получаемого другого лекарственного лечения индивидуума, как хорошо известно специалисту в области техники. Кроме того, очевидно, что эффективное суточное количество можно уменьшить или увеличить в зависимости от реакции подвергаемого лечению субъекта и/или в зависимости от оценки врача, прописывающего соединения настоящего изобретения.

Соединения формулы (I) и одно или несколько других антибактериальных средств можно объединять в одном препарате или их можно изготавливать в отдельных препаратах таким образом, что их можно вводить одновременно, раздельно или последовательно. Таким образом, настоящее изобретение также относится к продукту, содержащему (а) соединение формулы (I) и (b) одно или несколько других антибактериальных средств при условии, что одно или несколько других антибактериальных средств отличаются от антимикобактериальных средств, в качестве объединенного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении бактериальной инфекции.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать различные другие ингредиенты, известные в области техники, например смазывающий агент, стабилизирующий агент, буферный агент, эмульгирующий агент, агент регулирования вязкости, поверхностно-активное вещество, консервант, корригент или окрашивающий агент.

Это является в особенности подходящим для приготовления вышеуказанных фармацевтических композиций в стандартной лекарственной форме для легкости введения и стандартизации дозы. Применяемая здесь стандартная лекарственная форма относится к физически отдельным единицам, подходящим как единые дозы, причем каждая единица содержит заранее заданное количество активного ингредиента, рассчитанного для получения требуемого терапевтического действия, объединенного с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких стандартных лекарственных форм являются таблетки (включающие таблетки с надрезами или покрытием), капсулы, пилюли, пакетики порошка, пластинки, суппозитории, инъецируемые растворы или суспензии и тому подобное, и их изолированные многократные формы. Суточная доза соединения согласно изобретению будет, конечно, изменяться с применяемым соединением, способом введения, требуемым лечением и указанным бактериальным заболеванием.

Другими антибактериальными средствами, которые можно объединять с соединениями формулы (I), являются антибактериальные средства, известные в области техники. Другие антибактериальные средства включают в себя антибиотики группы β-лактама, такие как природные пенициллины, полусинтетические пенициллины, природные цефалоспорины, полусинтетические цефалоспорины, цефамицины, 1-оксацефемы, клавулановые кислоты, пенемы, карбапенемы, нокардицины, монобактамы; тетрациклины, ангидротетрациклины, антрациклины; аминогликозиды; нуклеозиды, такие как N-нуклеозиды, С-нуклеозиды, карбоциклические нуклеозиды, бластицидин S; макролиды, такие как макролиды с 12-членным кольцом, макролиды с 14-членным кольцом, макролиды с 16-членным кольцом; ансамицины, пептиды, такие как блеомицины, грамицидины, полимиксины, бацитрацины, антибиотические пептиды с большим кольцом, содержащие лактонные связи, актиномицины, амфомицин, капреомицин, дистамицин, эндурацидины, микамицин, неокарциностатин, стендомицин, биомицин, виргиниямицин; циклогексимид; циклосерин; вариотин; саркомицин А; новобиоцин; гризеофулвин; хлорамфеникол; митомицины; фумагиллин; монензины; пирролнитрин; фосфомицин; фузидовая кислота; D-(п-гидроксифенил)глицин; D-фенилглицин; энедиины.

Конкретными антибиотиками, которые можно объединять с данными соединениями формулы (I), являются, например, бензилпенициллин (калий, прокаин, бензатин), феноксиметилпенициллин (калий), фенетициллин калий, пропициллин, карбенициллин (динатрий, фенилнатрий, инданилнатрий), сулбенициллин, тикарциллин динатрий, метициллин натрий, оксациллин натрий, клоксациллин натрий, диклоксациллин, флуклоксациллин, ампициллин, мезлоциллин, пиперациллин натрии, амоксициллин, циклациллин, гектациллин, сулбактам натрий, талампициллин гидрохлорид, бакампициллин гидрохлорид, пивмециллинам, цефалексин, цефаклор, цефалоглицин, цефадроксил, цефрадин, цефроксадин, цефапирин натрий, цефалотин натрий, цефацетрил натрий, цефсулодин натрий, цефалоридин, цефатризин, цефоперазон натрий, цефамандол, вефотиам гидрохлорид, цефазолин натрий, цефтизоксим натрий, цефотаксим натрий, цефменоксим гидрохлорид, цефуроксим, цефтриаксон натрий, цефтазадим, цефокситин, цефметазол, цефотетан, латамоксеф, клавулановая кислота, имипенем, азтреонам, тетрациклин, хлортетрациклин гидрохлорид, деметилхлортетрациклин, окситетрациклин, метациклин, доксициклин, ролитетрациклин, миноциклин, даунорубицин гидрохлорид, доксорубицин, акларубицин, канамицин сульфат, беканамицин, тобрамицин, гентамицин сульфат, дибекацин, амикацин, микрономицин, рибостамицин, неомицин сульфат, паромомицин сульфат, стрептомицин сульфат, дигидрострептомицин, дестомицин А, гигромицин В, апрамицин, сизомицин, нетилмицин сульфат, спектиномицин гидрохлорид, астромицин сульфат, валидамицин, касугамицин, полиоксин, бластицидин S, эритромицин, эритромицин эстолат, олеандомицин фосфат, трацетилолеандомицин, китазамицин, иозамицин, спирамицин, тилозин, ивермектин, мидекамицин, блеомицин сульфат, пепломицин сульфат, грамицидин S, полимиксин В, бацитрацин, колистин сульфат, колистинметансульфонат натрий, энрамицин, микамицин, виргинамицин, капреомицин сульфат, биомицин, энвиомицин, ванкомицин, актиномицин D, неокарциностатин, бестатин, пепстатин, монесин, лазалоцид, салиномицин, амфотерицин В, нистатин, натамицин, трихомицин, митрамицин, линкомицин, клиндамицин, клиндамицин пальмитат гидрохлорид, флавофосфолипол, циклосерин, пецилоцин, гризеофулвин, хлорамфеникол, хлорамфеникол пальмитат, митомицин С, пирролнитрин, фосфомицин, фузидовая кислота, бикозамицин, тиамулин, сикканин.

Общий способ получения

Соединения согласно изобретению обычно можно получать последовательными стадиями, каждая из которых известна специалисту в области техники.

Соединения формулы (I) можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (II) с промежуточным соединением формулы (III) в присутствии подходящего агента сочетания, такого как, например, н-бутиллитий, втор-BuLi, и в присутствии подходящего растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран, и необязательно в присутствии подходящего основания, такого как, например, 2,2,6,6-тетраметилпиперидин, NH(CH ₂ CH ₂ CH ₃ ) ₂ , N,N-диизопропиламин или триметилэтилендиамин.

В вышеуказанной реакции полученное соединение формулы (I) можно выделить и, если требуется, очистить согласно методикам, обычно известным в области техники, таким как, например, экстракция, кристаллизация, перегонка, растирание в порошок и хроматография. В случае когда соединение формулы (I) закристаллизовалось, его можно выделить фильтрованием. Иначе кристаллизацию можно вызвать добавлением подходящего растворителя, такого как, например, вода; ацетонитрил; спирт, такой как, например, метанол, этанол; и сочетания указанных растворителей. В альтернативном случае реакционную смесь также можно выпаривать досуха с последующей очисткой остатка хроматографией (например, ВЭЖХ с обращенной фазой, флэш-хроматографией и т.п.). Реакционную смесь можно также очищать хроматографией без предварительного выпаривания растворителя. Соединение формулы (I) можно также выделять выпариванием растворителя с последующей перекристаллизацией в подходящем растворителе, таком как, например, вода; ацетонитрил; спирт, такой как, например, метанол; и сочетания указанных растворителей.

Для нахождения наиболее подходящего способа выделения специалист, работающий в области техники, будет распознавать, какой способ следует применять, какой растворитель является наиболее подходящим для применения или он относится к общепринятому экспериментальному методу.

Соединения формулы (I), где q равно 2, 3 или 4, причем указанные соединения представлены формулой (I-а), можно также получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (XVIII), где q' равно 0, 1 или 2, с первичным или вторичным амином HNR ⁴ R ⁵ в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, Rh(cod) ₂ BF ₄ , необязательно в присутствии второго катализатора (для восстановления), такого как, например, Ir(cod) ₂ BF ₄ , в присутствии подходящего лиганда, такого как, например, Xantphos, в подходящем растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран и спирт, например метанол, в присутствии СО и Н ₂ (под давлением) при повышенной температуре. Эту реакцию предпочтительно проводят для получения промежуточных соединений формулы (XVIII), где q'=1.

Соединения формулы (I) дополнительно можно получать превращением соединений формулы (I) друг в друга согласно известным в области техники реакциям трансформации группы.

Соединения формулы (I) можно превратить в соответствующие N-оксидные формы последующими известными в области техники методами для превращения трехвалентного азота в его N-оксидную форму. Указанную реакцию N-окисления обычно можно осуществлять взаимодействием исходного вещества формулы (I) с подходящим органическим или неорганическим пероксидом. Подходящие неорганические пероксиды включают в себя, например, пероксид водорода, пероксиды щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, например пероксид натрия, пероксид калия; подходящие органические пероксиды могут включать в себя пероксикислоты, такие как, например, бензолкарбопероксовую кислоту или галогензамещенную бензолкарбопероксовую кислоту, например 3-хлорбензолкарбопероксовую кислоту, пероксоалкановые кислоты, например пероксоуксусную кислоту, алкилгидропероксиды, например трет-бутилгидропероксид. Подходящими растворителями являются, например, вода, низшие спирты, например этанол, и т.п., углеводороды, например толуол, кетоны, например 2-бутанон, галогенированные углеводороды, например дихлорметан, и смеси таких растворителей.

Соединения формулы (I), где R ¹ представляет собой галоген, можно превратить в соединение формулы (I), где R ¹ представляет собой Het, например пиридил, взаимодействием с в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, Pd(PPh ₃ ) ₄ , подходящего растворителя, такого как, например, простой диметиловый эфир, или спирт, например метанол, и т.п., и подходящего основания, такого как, например, карбонат динатрия или карбонат дикалия.

Соединения формулы (I), где R ¹ представляет собой галоген, также можно превратить в соединение формулы (I), где R ¹ представляет собой метил, взаимодействием с Sn(CH ₃ ) ₄ в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, Pd(PPh ₃ ) ₄ , подходящего растворителя, такого как, например, толуол.

Некоторые из соединений формулы (I) и некоторые из промежуточных соединений в настоящем изобретении могут состоять из смеси стереохимических изомерных форм. Чистые стереохимические изомерные формы указанных соединений и указанных промежуточных соединений можно получать с применением известных в области техники методик. Например, диастереоизомеры можно разделить физическими методами, такими как селективная кристаллизация, или хроматографическими методами, например противоточной распределительной жидкостной хроматографией и т.п. Энантиомеры можно получать из рацемических смесей первоначальным превращением указанных рацемических смесей с применением подходящих агентов для разделения, таких как, например, хиральные кислоты, в смеси диастереомерных солей или соединений; затем физическим разделением указанных смесей диастереомерных солей или соединений, например селективной кристаллизацией, или хроматографическими методами, например жидкостной хроматографией, и подобными способами; и в заключение, превращением указанных разделяемых диастереоизомерных солей или соединений в соответствующие энантиомеры. Чистые стереохимические изомерные формы также можно получить из чистых стереохимических изомерных форм подходящих промежуточных соединений и исходных веществ при условии, что осуществляемые реакции протекают стереоспецифически.

Альтернативный способ разделения энантиомерных форм соединений формулы (I) и промежуточных соединений включает в себя жидкостную хроматографию, в особенности жидкостную хроматографию с применением хиральной стационарной фазы или хроматографии с суперкритической жидкостью.

Понятно, что в вышеприведенных или последующих способах получения продукты реакции можно выделять из реакционной среды и, если требуется, дополнительно очищать согласно методикам, общепринятым в области техники, таким как, например, экстракция, кристаллизация, перегонка, растирание в порошок и хроматография.

Некоторые из промежуточных соединений и исходных веществ являются известными соединениями и могут быть коммерчески доступными или могут быть получены согласно известным в области техники методикам или методикам, описанным в WO 2004/011436, который приведен здесь в качестве ссылки.

Промежуточные соединения формулы (II), где радикал

находится в положении 2 хинолинового кольца, s=1 и положение 4 хинолинового кольца незамещенное, причем указанные промежуточные соединения, представленные формулой (II-а), можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (IV) с фенилоксибензолом в присутствии этилацетата

Промежуточные соединения формулы (IV), где R ² и R ⁷ представляют собой водород, причем указанные промежуточные соединения, представленные формулой (IV-a), можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (V) с промежуточным соединением формулы (VI) в присутствии подходящего основания, такого как, например, гидроксид натрия.

Промежуточные соединения формулы (II), где радикал

находится в положении 2 хинолинового кольца и s=0, причем указанные промежуточные соединения, представленные формулой (II-b), можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (VII), где W ₁ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как, например, галоген, например хлор и т.п., с промежуточным соединением формулы (VIII), где W ₂ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как, например, галоген, например хлор, бром и т.п., в присутствии Zn, хлортриметилсилана, 1,2-дибромэтана и Pd(PPh ₃ ) ₄ и подходящего растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран

Промежуточные соединения формулы (VII), где W ₁ представляет собой хлор, причем указанные промежуточные соединения, представленные формулой (VII-а), можно получать взаимодействием промежуточного продукта формулы (IX) с POCl ₃

Промежуточные соединения формулы (IX) можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (X) с 4-метилбензолсульфонилхлоридом в присутствии подходящего растворителя, такого как, например, метиленхлорид, и подходящего основания, такого как, например, карбонат динатрия

Промежуточные соединения формулы (X) можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (XI) с подходящим окисляющим агентом, таким как, например, 3-хлорбензолкарбопероксовая кислота, в присутствии подходящего растворителя, такого как, например, метиленхлорид

Промежуточные соединения формулы (II), где s=0, причем указанные промежуточные соединения, представленные формулой (II-с), можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (XII) с Et ₃ SiH в присутствии подходящей кислоты, такой как, например, трифторуксусная кислота, и подходящего растворителя, такого как, например, метиленхлорид

Промежуточные соединения формулы (XII) можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (XIII), где W ₃ представляет собой подходящую удаляемую группу, такую как, например, галоген, например хлор или бром и т.п., с промежуточным соединением формулы (XIV) в присутствии подходящего агента сочетания, такого как, например, н-бутиллитий, втор-BuLi, и в присутствии подходящего растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран, и необязательно в присутствии подходящего основания, такого как, например, 2,2,6,6-тетраметилпиперидин, NH(CH ₂ CH ₂ CH ₃ ) ₂ , N,N-диизопропиламин или триметилэтилендиамин

Промежуточные соединения формулы (XII), где радикал

находится в положении 8 хинолинового кольца, R ² находится в положении 2; R ⁷ находится в положении 4 и R ¹ находится в положении 6 хинолинового кольца, причем указанные промежуточные соединения, представленные формулой (XII-a), можно получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (XV) с промежуточным соединением формулы (XIV) в присутствии подходящего агента сочетания, такого как, например, н-бутиллитий, втор-BuLi, и в присутствии подходящего растворителя, такого как, например, тетрагидрофуран, и необязательно, в присутствии подходящего основания, такого как, например, 2,2,6,6-тетраметилпиперидин, NH(СН ₂ СН ₂ СН ₃ ) ₂ , N,N-диизопропиламин или триметилэтилендиамин

Промежуточные соединения формулы (III) представляют собой соединения, которые являются либо коммерчески доступными, либо такие, которые можно получать согласно общепринятым методикам реакций, обычно известным в данной области. Например, промежуточные соединения формулы (III), где q=1, указанные промежуточные соединения представлены формулой (III-а), можно получать согласно следующей схеме реакции 1.

Схема 1

Схема реакции (1) включает в себя стадию (а), в которой подходящий R ³ взаимодействует по реакции Фриделя-Крафта с подходящим ацилхлоридом, таким как 3-хлорпропионилхлорид или 4-хлорбутирилхлорид, в присутствии подходящей кислоты Льюиса, такой как AlCl ₃ , FeCl ₃ , SnCl ₄ , TiCl ₄ или ZnCl ₂ , и подходящего для реакции инертного растворителя, такого как метиленхлорид или этилендихлорид. Реакцию можно подходящим образом осуществлять при температуре в интервале от комнатной температуры до температуры кипячения с обратным холодильником. В следующей стадии (b) вводят аминогруппу (например, -NR ⁴ R ⁵ ) взаимодействием промежуточного соединения, полученного на стадии (а) с подходящим амином HNR ⁴ R ⁵ .

Промежуточные соединения формулы (III) можно также получать взаимодействием промежуточного соединения формулы (XVI) и промежуточного соединения формулы (XVII) с формальдегидом в присутствии подходящего растворителя, такого как, например, спирт, например этанол, и подходящей кислоты, например HCl

Очевидно, что в вышеуказанных и в следующих реакциях продукты реакции можно выделить из реакционной среды и, если требуется, дополнительно очистить согласно методикам, обычно известным в области техники, таким как, например, экстракция, кристаллизация и хроматография. Кроме того, очевидно, что продукты реакции, которые существуют более чем в одной энантиомерной форме, можно выделять из их смеси известными способами, в особенности препаративной хроматографией, такой как препаративная ВЭЖХ, хиральная хроматография. Индивидуальные диастереоизомеры или индивидуальные энантиомеры можно также получать с применением хроматографии с суперкритической жидкостью (SCF).

Промежуточные соединения формулы (XVIII) можно получать сначала взаимодействием соответствующим образом замещенного хинолина формулы (XIII) с соответствующим образом замещенным дезоксибензоином в присутствии подходящего катализатора, такого как, например, диацетат палладия, подходящего лиганда, такого как, например, X-PHOS, подходящего основания, такого как, например, карбонат цезия, подходящего растворителя, такого как, например, ксилол, в токе N ₂ (см. стадию (а) в схеме ниже по тексту). На следующей стадии (b) продукт, полученный на стадии (а), взаимодействует с подходящими реагентами Гриньяра, например СН ₂ =СН-(СН ₂ ) _q -Mg-Br, такими как, например, аллилмагнийбромид, в подходящем растворителе, таком как, например, тетрагидрофуран.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его.

Экспериментальная часть

Для некоторых соединений абсолютную стереохимическую конфигурацию стереогенных атомов углерода в них экспериментально не определяли. В таких случаях стереохимическую изомерную форму, которую выделяли первой, обозначали как "А", и вторую, как "В", без дополнительной ссылки на действительную стереохимическую конфигурацию. Однако указанные изомерные формы "А" и "В" может однозначно охарактеризовать специалист в области техники с применением методов, известных в области техники, таких как, например, рентгеновская дифрактометрия.

В случае когда "А" и "В" представляют собой стереоизомерные смеси, в особенности смеси диастереоизомеров, их можно в дальнейшем разделить, тем самым соответствующие первые выделенные фракции обозначали "А1", соответственно "В1", и вторые как "А2", соответственно "В2", без дополнительной ссылки на действительную стереохимическую конфигурацию. Однако указанные изомерные формы "A1", "A2" и "B1", "B2", в особенности указанные энантиомерные формы "А1", "А2" и "В1", "В2", может однозначно охарактеризовать специалист в области техники с применением известных в области техники способов, таких как, например, рентгеновская дифрактометрия.

Для синтеза данных соединений имеется ссылка на WO 2005/075428, которая приведена здесь в качестве ссылки.

Ниже по тексту термин "DIPE" означает простой диизопропиловый эфир, "ТГФ" обозначает тетрагидрофуран, "НОАс" обозначает уксусную кислоту, "EtOAc" обозначает этилацетат, Rt обозначает время удерживания, полученное в методе ЖХМС и выраженное в минутах.

А. Способ получения промежуточных соединений.

Пример А1. Получение промежуточного соединения 1 и промежуточного соединения 2

Промежуточное соединение 1

Промежуточное соединение 2

Смесь 5-бром-1Н-индол-2,3-диона (0,221 моль) в NaOH 3н. (500 мл) перемешивали при 80 °С в течение 30 мин и затем охлаждали до комнатной температуры. Добавляли 4-фенил-2-бутанон (0,221 моль). Смесь перемешивали и нагревали при кипячении в течение 90 мин, охлаждали до комнатной температуры и подкисляли НОАс до рН 5. Осадок отфильтровывали, промывали H ₂ O и сушили.

Выход:75 г (95%) смеси промежуточного соединения 1 и промежуточного соединения 2.

Пример А2. Получение промежуточного соединения 3

Смесь промежуточного соединения 1 и промежуточного соединения 2 (0,21 моль) в 1,1'-окси-бис-[бензоле] (600 мл) перемешивали при 300 °С в течение 12 ч. Добавляли EtOAc. Смесь экстрагировали три раза 6н. HCl, подщелачивали твердым K ₂ CO ₃ экстрагировали CH ₂ Cl ₂ . Органический слой отделяли, сушили (MgSO ₄ ), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (36 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH 99/1; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 11 г (16%) промежуточного соединения 3.

Пример A3. Получение промежуточного соединения 4.

Смесь 1-(3-фторфенил)этанона (0,195 моль), формальдегида (0,235 моль) и NH(CH ₃ ) ₂ ∙HCl (0,235 моль) в этаноле (300 мл) и конц. HCl (1 мл) перемешивали и нагревали при кипячении в течение ночи, затем оставляли при комнатной температуре. Осадок фильтровали, промывали этанолом и сушили. Слой маточного раствора упаривали. Остаток переносили в простой диэтиловый эфир. Осадок фильтровали, промывали простым диэтиловым эфиром и сушили. Эту фракцию переносили в 10% K ₂ CO ₃ . Осадок промывали CH ₂ Cl ₂ и сушили.

Выход: 18,84 г (49%) промежуточного соединения 4.

Пример А4.

a) Получение промежуточного соединения 5

Смесь 6-бром-2(1Н)-хинолинона (0,089 моль) в POCl ₃ (55 мл) перемешивали при 60 °С в течение ночи, затем при 100 °С в течение 3 ч и растворитель выпаривали. Остаток переносили в CH ₂ Cl ₂ , выливали в ледяную воду, подщелачивали концентрированным NH ₄ OH, фильтровали через целит и экстрагировали CH ₂ Cl ₂ . Органический слой отделяли, сушили (MgSO ₄ ), фильтровали и растворитель выпаривали.

Выход: 14,5 г промежуточного соединения 5 (67%).

b) Получение промежуточного соединения 6

Смесь Zn (0,029 моль) и 1,2-дибромэтана (0,001 моль) в ТГФ (6 мл) перемешивали и нагревали при кипячении в течение 10 мин, затем охлаждали до комнатной температуры. Добавляли хлортриметилсилан (0,001 моль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли по каплям раствор бромметилбензола (0,025 моль) в ТГФ (25 мл) при 5 °С в течение 90 мин. Смесь перемешивали при 0 °С в течение 2 ч. Добавляли раствор промежуточного соединения 5 (полученного согласно А4.а) (0,021 моль) в ТГФ (75 мл). Добавляли Pd(PPh ₃ ) ₄ (0,0008 моль). Смесь перемешивали и нагревали при кипячении в течение 2 ч, затем охлаждали до комнатной температуры, выливали в 10% NH ₄ Cl и экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали H ₂ O, затем насыщенным раствором NaCl, сушили (MgSO ₄ ), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (12 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/CH ₂ Cl ₂ 50/50; 20-45 мкм). Собирали две фракции и растворитель выпаривали.

Выход второй фракции: 2,5 г промежуточного соединения 6.

Пример А5.

a) Получение промежуточного соединения 7

н-Бутиллитий (1,6 М) (0,066 моль) добавляли по каплям при -50 °С к смеси 6-бром-2-хлор-3-этилхинолина (0,055 моль) в ТГФ (150 мл). Смесь перемешивали при -50 °С в течение 1 ч. Добавляли раствор бензальдегида (0,066 моль) в ТГФ (70 мл) при -70 °С. Смесь перемешивали при -70 °С в течение 1 ч, выливали в H ₂ O при 0 °С и экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили (MgSO ₄ ), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (15 г) кристаллизовали из DIPE/iPrOH. Осадок отфильтровывали и сушили.

Выход: 7,6 г промежуточного соединения 7 (46%).

b) Получение промежуточного соединения 8

Смесь промежуточного соединения 7 (полученного согласно А5.а) (0,021 моль), Et ₃ SiH (0,21 моль) и CF ₃ COOH (0,21 моль) в CH ₂ Cl ₂ (100 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Добавляли H ₂ O. Смесь экстрагировали CH ₂ Cl ₂ . Органический слой отделяли, промывали 10% раствором K ₂ CO ₃ , сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали.

Остаток (8 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/AcOEt 95/5; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 3,8 г промежуточного соединения 8 (64%, т.пл. 66 °С).

Пример А6.

a) Получение промежуточного соединения 9

н-Бутиллитий (0,055 моль) медленно добавляли при -70 °С к смеси 7-бром-2-хлор-3-этилхинолина (0,037 моль) в ТГФ (100 мл) в токе N ₂ . Смесь перемешивали в течение 2 ч, затем добавляли раствор бензальдегида (0,055 моль) в ТГФ (55 мл). Смесь перемешивали в течение 3 ч, добавляли воду при -20 °С и смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (12,2 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/AcOEt 80/20; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 6,1 г промежуточного соединения 9 (56%).

b) Получение промежуточного соединения 10

Смесь промежуточного соединения 9 (полученного согласно А6.а) (0,0205 моль), Et ₃ SiH (0,205 моль) и CF ₃ COOH (0,205 моль) в CH ₂ Cl ₂ (300 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 7 дней. Добавляли H ₂ O. Смесь экстрагировали CH ₂ Cl ₂ . Органический слой отделяли, промывали 10% раствором K ₂ CO ₃ , сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (7,1 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/AcOEt 95/5; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 4,8 г промежуточного соединения 10 (83%).

Пример А7.

a) Получение промежуточного соединения 11

К смеси 2,2,6,6-тетраметилпиперидина (0,0090 моль) в ТГФ (15 мл) медленно добавляли н-бутиллитий (0,0090 моль) при -20 °С в токе N ₂ . Смесь перемешивали в течение 20 мин, затем охлаждали до -70 °С. Добавляли раствор 6-бром-2-хлор-4-фенилхинолина (0,0060 моль) в ТГФ (40 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч. Добавляли раствор бензальдегида (0,0090 моль) в ТГФ (15 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч при -70 °С, затем 3 ч при комнатной температуре. Добавляли H ₂ O. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (3,0 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: циклогексан/AcOEt 95/5; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 1,8 г промежуточного соединения 11 (71%).

b) Получение промежуточного продукта 12

Смесь промежуточного соединения 11 (полученного согласно А7.а) (0,0042 моль), Et ₃ SiH (0,0424 моль) и CF ₃ COOH (0,0424 моль) в CH ₂ Cl ₂ (100 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Добавляли H ₂ O. Смесь экстрагировали CH ₂ Cl ₂ . Органический слой отделяли, промывали 10% раствором K ₂ CO ₃ , сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (1,3 г) кристаллизовали из DIPE. Осадок отфильтровывали и сушили.

Выход: 0,66 г промежуточного соединения 12 (38%, т.пл. 121 °С).

Пример A8.

а) Получение промежуточного соединения 13

Промежуточное соединение 13

В смесь дезоксибензоина (1 ммоль), (1 ммоль), XPHOS (0,08 ммоль), диацетата палладия (0,04 ммоль), карбоната цезия (2 ммоль) в ксилоле (4 мл) пропускали N ₂ и нагревали при 145 °С в течение 20 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли 2 мл H ₂ O и 10 мл CH ₂ Cl ₂ . Слои разделяли (Extralute) и отделенный органический слой концентрировали в вакууме. Остаток очищали ВЭЖХ на RP с NH ₄ HCO ₃ -буфером. Фракции продукта собирали и растворитель выпаривали.

Выход: промежуточное соединение 13.

b) Получение промежуточного соединения 14

Промежуточное соединение 14

Промежуточное соединение 13 (0,000466 моль) растворяли в ТГФ (3 мл) и добавляли раствор аллилмагнийбромида (1 М в Et ₂ O, 1 ммоль). После перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре добавляли 2 мл насыщенного раствора NH ₄ Cl и перемешивание продолжали в течение 1 ч. Смесь экстрагировали CH ₂ Cl ₂ , слои разделяли с применением extralute и органический слой концентрировали в вакууме. Остаток очищали ВЭЖХ на RP с NH ₄ HCO ₃ -буфером.

Выход: 0.053 г (17%) промежуточного соединения 14.

В. Получение конечных соединений.

Пример В1. Получение соединения 1 и соединения 4

Соединение 1 (диастереоизомер А)Соединение 4 (диастереоизомер В)

К смеси N-(1-метилэтил)-2-пропанамингидрохлорида (1:1) (0,0071 моль) в ТГФ (25 мл) в токе азота добавляли н-BuLi 1,6 М (0,0072 моль) при -20 °С. Смесь перемешивали в течение 20 мин, затем охлаждали до -70 °С. Добавляли раствор промежуточного соединения 3 (0,0061 моль) в ТГФ (5 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч. Добавляли раствор промежуточного соединения 4 (0061 моль) в ТГФ (5 мл) при -70 °С. Смесь перемешивали при -70 °С в течение 3 ч. Добавляли 10% NH ₄ Cl. Смесь экстрагировали EtOAc. Отделяли органический слой, сушили (MgSO ₄ ), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (3,4 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH/NH ₄ OH 97/3/0,1; 15-40 мкм). Две фракции собирали и растворитель выпаривали. Первый остаток (0,9 г) кристаллизовали из простого диизопропилового эфира. Осадок отфильтровывали и сушили.

Выход: 0,49 г соединения 1 (диастереоизомер А) (т.пл. 136 °С).

Второй остаток (0,79 г) кристаллизовали из простого диизопропилового эфира. Осадок отфильтровывали и сушили.

Выход: 0,105 г соединений 4 (диастереоизомер В) (т.пл. 179 °С).

Пример В2. Получение соединения 2 и соединения 3

Соединение 2 (диастереоизомер А)Соединение 3 (диастереоизомер В)

К раствору N-(1-метилэтил)-2-пропанамингидрохлорида (1:1) (0,0071 моль) в ТГФ (25 мл) в токе азота добавляли по каплям при -20 °С H-BuLi 1,6 М (0,0072 моль). Смесь перемешивали в течение 20 мин. Затем охлаждали до -70 °С. Добавляли раствор промежуточного соединения 3 (0,0061 моль) в ТГФ (5 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч. Добавляли раствор 3-(диметиламино)-1-(1-нафталинил)-1-пропанона (0,0062 моль) в ТГФ (5 мл) при -70 °С. Смесь перемешивали при -70 °С в течение 3 ч. Добавляли 10% NH ₄ Cl. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили (MgSO ₄ ), фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (4 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH/NH ₄ OH 97/3/0,1; 15-40 мкм). Собирали две фракции и растворитель выпаривали. Первый остаток (0,61 г) кристаллизовали из DIPE. Осадок отфильтровывали и сушили.

Выход: 0,303 г соединения 2 (диастереоизомер А) (т.пл. 143 °С).

Второй остаток (0,56 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /CH ₃ OH 98/2). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 0,104 г соединения 3, (диастереоизомер В) (т.пл. 69 °С).

Пример В3. Получение соединения 5 и соединения 6

Соединение 5 (диастереоизомер А)Соединение 6 (диастереоизомер В)

К смеси диизопропиламина (0,013 моль) в ТГФ (50 мл) в токе N ₂ медленно добавляли при -20 °С н-бутиллитий (0,013 моль). Смесь перемешивали в течение 20 мин, затем охлаждали до -70 °С. Добавляли раствор промежуточного соединения 8 (0,0106 моль) в ТГФ (20 мл). Смесь перемешивали в течение 1 ч. Добавляли раствор 3-(диметиламино)-1-(1-нафталинил)-1-пропанона (0,013 моль) в ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч. Добавляли H ₂ O. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток (5,5 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /MeOH 99/1; 15-40 мкм). Собирали две фракции и растворитель выпаривали.

Выход: 0,33 г соединения 5 (диастереоизомер А) (3%, МН ⁺ =509, Rt: 5,46) и 0,11 г соединения 6 (диастереоизомер В) (1%, МН ⁺ =509, Rt: 5,58).

Следующее соединение получали согласно вышеуказанной методике. Указана очистка остатка (*) вследствие отличия от вышеописанной очистки.

Пример В4. Получение соединения 7 и 8

Соединение 7 (диастереоизомер А)Соединение 8 (диастереоизмер В)

К смеси диизопропиламина (0,0043 моль) в ТГФ (10 мл) в токе N ₂ медленно добавляли при -20 °С н-бутиллитий (0,0043 моль).

Смесь перемешивали в течение 20 мин, затем охлаждали до -70 °С. Добавляли раствор промежуточного соединения 10 (полученного согласно А6.b) (0,0036 моль) в ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч. Добавляли раствор 3-(диметиламино)-1-(1-нафталинил)-1-пропанона (0,0043 моль) в ТГФ (10 мл). Смесь перемешивали в течение 2 ч. Добавляли Н ₂ О. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический слой отделяли, сушили над сульфатом магния, фильтровали и растворитель выпаривали.

Остаток (*) (1,8 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /MeOH/NH ₄ OH 98/2/0,2; 15-40 мкм). Собирали две фракции и растворитель выпаривали.

Выход: 0,17 г фракции 1 и 0,15 г фракции 2.

Фракцию 1 кристаллизовали из МеОН. Осадок отфильтровывали и сушили.

Выход: 0,082 г соединения 7 (5%, диастереоизомер А).

Фракцию 2 очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: CH ₂ Cl ₂ /MeOH 98/2; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и растворитель выпаривали.

Выход: 0,13 г соединения 8 (7%, диастереоизомер В, МН ⁺ =509, Rt: 5,58).

Следующие соединения получали согласно вышеуказанной методике. Указана очистка остатка (*) вследствие отличия от вышеописанной очистки.

Пример В5. Получение соединения 12

Соединение 12

Смесь промежуточного соединения 14 (0,000125 моль), диметиламина (0,000125 моль), Rh(cod) ₂ BF ₄ (0,000005 моль), Ir(cod) ₂ BF ₄ (0,01 ммоль), Xantphos (0,02 ммоль) в ТГФ (15 мл) и МеОН (15 мл) под давлением СО (7 атм) и Н ₂ (33 атм) нагревали в автоклаве при 100 °С в течение 48 ч. После охлаждения реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в CH ₂ Cl ₂ и раствор фильтровали через колонку с оксидом кремния Silica SCX (IST 530-0100-С) для улавливания соединения. Колонку промывали CH ₂ Cl ₂ /MeOH; 90/10 и продукт выделяли с применением смеси CH ₂ Cl ₂ -MeOH/NH ₃ 70/30. Раствор концентрировали и остаток очищали ВЭЖХ на RP с NH ₄ HCO ₃ -буфером. Фракции продукта собирали и растворитель выпаривали. Выход: соединение 12 (диастереоизомер А/диастереоизомер В 19/81) (МН+=483, Rt: 6,42).

Соединение 13 (диастереоизомер А/диастереоизомер В 35/65)

(МН ⁺ =469, Rt: 6,17) получали согласно протоколу, описанному выше по тексту для соединения 12.

С. Аналитические методы.

Массы соединений регистрировали методом ЖХМС (масс-спектрометрия с жидкостной хроматографией). Применяли три метода, которые описаны ниже по тексту. Данные представлены в табл. 1.

Общая методика А.

Градиент ВЭЖХ обеспечивали системой Alliance HT 2795 (Waters), включающей в себя четырехступенчатый насос с дегазатором, автосэмплер и детектор DAD. Поток из колонки расщепляли для детектора МС. Детекторы МС снабжены источником ионизации с электрораспылением. Напряжение на капиллярной игле составляло 3 кВт, температуру источника поддерживали при 100 °С на LCT (времяпролетный масс-спектрометр с Z-спреем от Waters) и соответственно 3,15 кВт и 110 °С на ZQ (простой квадрипольный масс-спектрометр с Z-спреем от Waters). В качестве распыляемого газа применяли азот. Сбор данных осуществляли с помощью системы данных Waters-Micromass MassLynx-Openlynx.

Общая методика В.

Градиент ВЭЖХ обеспечивали системой Alliance HT 2790 (Waters), которая включала в себя четырехступенчатый насос с дегазатором, автосэмплер, термостатированную колонку (установленную при 40 °С) и детектор DAD. Поток из колонки расщепляли для детектора МС. Детекторы МС были снабжены источником ионизиции электроспреем. Масс-спектры получали в режиме сканирования от 100 до 1000 В 1 с с применением времени выдержки 0,1 с. Напряжение на капиллярной игле было 3 кВт, и температуру источника поддерживали при 140 °С. В качестве распыляемого газа применяли азот. Сбор данных осуществляли с помощью системы данных Waters-Micromass MassLynx-Openlynx.

ЖХМС-метод 1.

Кроме основной методики А, осуществляли анализ ЖХМС (ионизация электрораспылением как в положительном, так и в отрицательном (импульсном) режиме, режим сканирования от 100 до 900 аем) на колонке Kromasil C18 (Interchim, Montlucon, FR; 5 мкм, 4,5 ×150 мм) со скоростью потока 1 мл/мин. Применяли две подвижные фазы (подвижную фазу А: 30% 6,5 мМ ацетата аммония + 40% ацетонитрила + 30% муравьиной кислоты (2 мл/л); подвижную фазу В: 100% ацетонитрил) для выполнения условия градиента от 100% А в течение 1 мин до 100% В в течение 4 мин, 100% В в течение 5 мин до 100% А в течение 3 мин и восстановление равновесия 100% А в течение 2 мин.

ЖХМС-метод 2.

Кроме основной методики А, осуществляли анализ ЖХМС (ионизация электрораспылением как в положительном, так и в отрицательном (импульсном) режимах, режим сканирования от 100 до 1000 аем) на колонке Kromasil C18 (Interchim, Montlucon, FR; 3,5 мкм, 4,6 ×100 мм) при скорости потока 0,8 мл/мин. Применяли две подвижные фазы (подвижную фазу А: 35% 6,5 мМ ацетата аммония + 30% ацетонитрила + 35% муравьиной кислоты (2 мл/л); подвижную фазу В: 100% ацетонитрил) для выполнения условия градиента от 100% А в течение 1 мин до 100% В в течение 4 мин, 100% В при скорости потока 1,2 мл/мин в течение 4 мин до 100% А при 0,8 мл/мин в течение 3 мин и восстановление равновесия 100% А в течение 1,5 мин.

ЖХМС-метод 3.

Кроме основной методики В, осуществляли ЖХМС с обращенной фазой на колонке Xterra MS C18 (3,5 мм, 4,6 ×100 мм) при скорости потока 1,6 мл/мин. Применяли три подвижные фазы (подвижную фазу А: 95% 25 мМ ацетата аммония + 5% ацетонитрила; подвижную фазу В: ацетонитрил; подвижную фазу С: метанол) для выполнения условия градиента от 100 до 1% А, 49% В и 50% С в течение 6,5 мин до 1% А и 99% В в течение 1 мин и поддерживали эти условия в течение 1 мин и восстановление равновесия 100% А в течение 1,5 мин. Применяли объем для введения 10 мкл. Напряжение на конусе 10 В для режима положительной ионизации и 20 В для режима отрицательной ионизации.

Таблица 1

Основной пик (МН+) ЖХМС и применяемый метод ЖХМС

Фармакологические примеры.

Приготовление бактериальных суспензий для тестирования чувствительности бактерий.

Бактерии, применяемые в этом исследовании, выращивали в течение ночи в колбах, содержащих 100 мл бульона Mueller-Hinton Broth (Becton Dickinson - cat. No. 275730) в стерильной деионизированной воде, при встряхивании, при 37 °С. Исходные растворы (0,5 мл/пробирка) до применения сохраняли при -70 °С. Титрование бактерий проводили в титрационных микропланшетах и определяли колониеобразующие единицы (CFU). Обычно для тестирования чувствительности бактерий применяли уровень инокулята приблизительно 100 CFU.

Тестирование антибактериальной чувствительности: определение IC ₉₀ .

Анализ на титрационном микропланшете.

Плоскодонные стерильные 96-луночные пластмассовые титрационные микропланшеты наполняли 180 мкл стерильной деионизированной воды с добавлением 0,25% BSA. Затем исходные растворы (7,8 × конечная тестируемая концентрация) соединений добавляли в объемах 45 мкл в колонку 2. Последовательные пятикратные разведения (45 мкл в 180 мкл) производили непосредственно в титрационных микропланшетах от колонки 2 до достижения колонки 11. Необработанные контрольные образцы с инокулятом (колонка 1) и без инокулята (колонка 12) вводили в каждый титрационный микропланшет. В зависимости от типа бактерий добавляли приблизительно от 10 до 60 CFU на лунку инокулята бактерий (100 TCID ₅₀ ) в объеме 100 мкл в 2,8 × среда бульона Mueller-Hinton к рядам от А до Н, исключая колонку 12. Тот же самый объем бульонной среды без инокулята добавляли к колонке 12 в ряду от А до Н. Культуры инкубировали при 37 °С в течение 24 ч при нормальной атмосфере (инкубатор с открытым воздушным клапаном и непрерывной вентиляцией). В конце инкубирования, через один день после инокуляции, флуориметрически количественно определяли бактериальный рост. Затем через 3 ч после инокуляции добавляли резацурин (0,6 мг/мл) в объеме 20 мкл ко всем лункам и микропланшеты повторно инкубировали в течение ночи. Изменение цвета от голубого до розового указывало на рост бактерий. Флуоресценцию считывали в контролируемом компьютером флуориметре (Cytofluor Biosearch) при длине волны возбуждения 530 нм и длине волны испускания 590 нм. Ингибирование роста, в %, достигаемое соединениями, вычисляли согласно стандартным методам. IC ₉₀ (выраженный в мкг/мл) обозначали как концентрацию для получения 90% ингибирования бактериального роста. Результаты представлены в табл. 2.

Метод разведения с применением агара.

Величину MIC ₉₉ (минимальную концентрацию для получения 99% ингибирования бактериального роста) можно определить проведением стандартного метода разведения с применением агара согласно стандартам* NCCLS, в которых применяемая среда включает в себя агар Mueller-Hinton.

*Clinical Laboratory standard institute. 2005. Methods for dilution Antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grows Aerobically: approved standard -sixth edition.

Анализы времени нейтрализации бактерий.

Бактерицидную или бактериостатическую активность соединений можно определять анализом времени нейтрализации с применением метода микроразведения бульоном*. В анализах времени нейтрализации на Staphylococcus aureus и резистентной к метициллину S.aureus (MRSA), исходный инокулят S. aureus и MRSA представлял собой 10 ⁶ CFU/мл в бульоне Muller Hinton. Антибактериальные соединения применяли в концентрации от 0,1 до 10-кратной MIC (т.е. IC ₉₀ , как определили в анализе на титрационном микропланшете). Лунки без добавления антибактериального агента представляли собой контроли культурального роста. Планшеты, содержащие микроорганизм и тестируемые соединения, инкубировали при 37 °С. Через 0, 4, 24 и 48 ч инкубирования образцы удаляли для определения количества жизнеспособных микроорганизмов последовательным разведением (от 10 ^-1 до 10 ^-6 ) в стерильной PBS и культивированием (200 мкл) на агаре Mueller Hinton. Планшеты инкубировали при 37 °С в течение 24 ч и определяли количество колоний. Кривые нейтрализации можно изобразить графически как зависимость log ₁₀ CFU на 1 мл от времени. Бактерицидное действие обычно определяли как уменьшение 3log10 количества CFU на 1 мл по сравнению с необработанным инокулятом. Возможное действие переноса лекарственных средств предотвращали последовательными разведениями и определением количества колоний при наивысшем разведении, применяемом для культивирования. Действие переноса не наблюдали при разведении 10 ^-2 , применяемом для культивирования. Это дает в результате ограничение обнаружения 5 ×10 ² CFU/мл или <2,7log CFU/мл.

*Zurenko, G.E. et al. In vitro activities of U-100592 and U-100766, novel oxazolidinone antibacterial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 839-845 (1996).

Определение клеточных уровней АТФ.

Для того чтобы анализировать изменение полной клеточной концентрации АТФ (с применением набора для биолюминесценции АТФ Roche), анализы осуществляли выращиванием исходной культуры S.aureus (ATCC29213) в 100 мл колбах Mueller Hinton и инкубированием в инкубаторе с шейкером в течение 24 ч при 37 °С (300 об/мин). Измеряли OD _405HM и вычисляли CFU/мл. Разводили культуры до 1 ×10 ⁶ CFU/мл (конечная концентрация для измерения ATP: 1 ×10 ⁵ CFU/100 мкл/лунку) и добавляли тестируемое соединение в 0,1 до 10-кратного количества MIC (т.е. IC ₉₀ , как определяли анализом в титрационном микропланшете). Инкубировали эти пробирки в течение 0, 30 и 60 мин при 300 об/мин и 37 °С. Применяли 0,6 мл бактериальной суспензии из пробирок с защелкивающейся крышкой и добавляли в новые 2 мл пробирки Эппендорфа. Добавляли 0,6 мл реагента клеточного лизиса (набор Roche), интенсивно перемешивали с максимальной скоростью и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Охлаждали на льду. Позволяли люминометру нагреваться до 30 °С (прибор Luminoskan Ascent Labsystems с инжектором). Наполняли одну колонку (=6 лунок) 100 мкл такого же образца. Добавляли 100 мкл реагента люциферазы к каждой лунке с применением инжекторной системы. Измеряли люминесценцию в течение 1 с.

Таблица 2

Величины IC90 (мкг/мл), определенные согласно анализу на титрационном микропланшете

BSU 43639 обозначает Bacillus subtilis (ATCC 43639);

EFA 14506 обозначает Enterococcus faecalis (ATCC 14506);

EFA 29212 обозначает Enterococcus faecalis (ATCC 29212);

LMO 49594 обозначает Listeria monocytogenes (ATCC 49594);

РАЕ 27853 обозначает Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853);

SMU 33402 обозначает Streptococcus mutans (ATCC 33402);

SPN 6305 обозначает Streptococcus pneumoniae (ATCC 6305);

SPY 8668 обозначает Streptococcus pyogens (ATCC 8668);

STA 25923 обозначает Staphylococcus aureus (ATCC 25923);

STA 29213 обозначает Staphylococcus aureus (ATCC 29213);

STA RMETH обозначает устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) (клинический изолят из университета Antwerp);

АТСС обозначает американский тип тканевой культуры.