Изобретение относится к синтетическим молекулам, которые спонтанно и стабильно включаются в липидные бислои, в том числе клеточные мембраны. Конкретно, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических мембранных якорей или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии клеточных поверхностных антигенов.

[0001] Водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция структуры

[0002] Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацилглицеролипидов.

[0003] Синтетическая молекулярная конструкция по п.2, где L выбран из группы, состоящей из фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гексадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты.

[0004] Синтетическая молекулярная конструкция по п.3, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.

[0005] Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где L выбран из группы, состоящей из 1,2-O-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE) и 1,2-О-дистеарил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE).

[0006] Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-5, где L представляет собой глицерофосфолипид, и синтетическая молекулярная конструкция включает в себя субструктуру

[0007] Синтетическая молекулярная конструкция по п.6, где n равно 3.

[0008] Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где синтетическая молекулярная конструкция спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактирует с липидным бислоем.

[0009] Синтетическая молекулярная конструкция по п.8, где синтетическая молекулярная конструкция стабильно включается в липидный бислой.

[0010] Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-9, где F выбран из группы, состоящей из синтетических гликотопов.

[0011] Синтетическая молекулярная конструкция по п.10, где F представляет собой синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев сахаров.

[0012] Синтетическая молекулярная конструкция по п.1, где F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда олигосахаридов лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила.

[0013] Синтетическая молекулярная конструкция по п.12, где F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара

[0014] Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-13, где, когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и -CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-.

[0015] Синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-14, где S1 представляет собой С3-5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила.

[0016] Синтетическая молекулярная конструкция по п.15, где S1 представляет собой 3-аминопропил.

[0017] Синтетическая молекулярная конструкция по п.14, имеющая структуру

[0018] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0019] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0020] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0021] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0022] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0023] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0024] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0025] Синтетическая молекулярная конструкция, имеющая структуру

[0026] Способ получения водорастворимой синтетической молекулярной конструкции структуры F-S1-S2-L, включающий в себя следующие стадии:

[0027] Способ по п.26, где L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацилглицеролипидов.

[0028] Способ по п.27, где L выбран из группы, состоящей из фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гексадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты.

[0029] Способ по п.28, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.

[0030] Способ по п.26, где L выбран из группы, состоящей из 1,2-O-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE) и 1,2-О-дистеарил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE).

[0031] Способ по любому из пп.26-30, где L представляет собой глицерофосфолипид и синтетическая молекулярная конструкция включает в себя субструктуру

[0032] Способ по п.31, где n равно 3.

[0033] Способ по любому из пп.26-32, где F представляет собой синтетический гликотоп.

[0034] Способ по п.33, где F представляет собой синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев сахаров.

[0035] Способ по п.26, где F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда олигосахаридов лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила.

[0036] Способ по п.35, где F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара

[0037] Способ по любому из пп.26-36, где, S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-.

[0038] Способ по любому из пп.26-37, где S1 представляет собой С3-5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила.

[0039] Способ по п.38, где S1 представляет собой 3-аминопропил.

[0040] Водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция, полученная способом по любому из пп.26-39.

[0041] Способ осуществления качественных и/или количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессируемых клеточной или поликлеточной структурой, включающий стадию контактирования суспензии клеточной или поликлеточной структуры с водорастворимой синтетической молекулярной конструкцией по любому из пп.1-25 или 40 в течение времени и при температуре, достаточных для осуществления качественного и/или количественного изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеточной или поликлеточной структурой.

[0042] Способ по п.41, где клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.

[0043] Способ по п.41 или 42, где концентрация водорастворимой синтетической молекулярной конструкции в суспензии находится в диапазоне 0,1-10 мг/мл.

[0044] Способ по любому из пп.41-43, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с водорастворимой синтетической молекулярной конструкцией при температуре в диапазоне 2-37 °С.

[0045] Способ по п.44, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с раствором водорастворимого синтетического мембранного якоря или водорастворимой синтетической молекулярной конструкции при температуре в диапазоне 2-25 °С.

[0046] Способ по п.45, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с раствором водорастворимого синтетического мембранного якоря или водорастворимой синтетической молекулярной конструкции при температуре в диапазоне 2-4 °С.

[0047] Способ по любому из пп.41-46, где F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара

[0048] Способ по п.47, где F выбран из группы гликотопов, состоящей из олигосахаридов GalNAc α1-3(Fuc α1-2)Gal β и Gal α1-3(Fuc α1-2)Gal β.

[0049] Способ по п.41, где синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя

[0050] Способ по п.41, где клеточной или поликлеточной структурой является эмбрион.

[0051] Способ по п.50, где F представляет собой молекулу присоединения, где молекула присоединения имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.

[0052] Способ по п.51, где компонент, экспрессированный на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессированным в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.

[0053] Способ по п.41, где клеточной или поликлеточной структурой является эритроцит.

[0054] Способ по п.53, где F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния.

[0055] Способ по п.54, где F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).

[0056] Клеточная или поликлеточная структура, включающая водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию по любому из пп.1-25 или 40.

[0057] Клеточная или поликлеточная структура по п.56, где клеточная или поликлеточная структура имеет человеческое или мышиное происхождение.

[0058] Клеточная или поликлеточная структура по п.56 или 57, где клеточной или поликлеточной структурой является эритроцит, включающий водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя

[0059] Клеточная или поликлеточная структура по п.56 или 57, где клеточной или поликлеточной структурой является эмбрион, включающий водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя

[0060] Набор, включающий в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции по любому из пп.1-25 или 40.

[0061] Набор по п.60, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция по любому из пп.1-25 или 40 выбрана из группы, состоящей из

[0062] Набор, включающий в себя суспензию в суспендирующем растворе клеток или поликлеточных структур по любому из пп.56-59.

[0063] Набор по п.62, где суспендирующий раствор, по существу, не содержит липид.

[0064] Набор по п.62 или 63, где клеточная или поликлеточная структура имеет человеческое или мышиное происхождение.

[0065] Набор по любому из пп.62-64, где клетками являются эритроциты, которые в природе не экспрессируют А- или В-антиген и включают в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из

[0066] Набор по п.62, где суспендирующий раствор дополнительно содержит одно или несколько антител.

[0067] Набор по п.62, где клетки являются контролями чувствительности.

[0068] Фармацевтический препарат, включающий в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции по любому из пп.1-25 или 40.

[0069] Фармацевтический препарат по п.68, где фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.

[0070] Фармацевтический препарат по п.68, где фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.

[0071] Фармацевтический препарат, включающий в себя клетки или поликлеточные структуры по любому из пп.56-59.

[0072] Фармацевтический препарат по п.71, где клетки или поликлеточные структуры имеют человеческое происхождение.

[0073] Фармацевтический препарат по п.71 или 72, где фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.

[0074] Фармацевтический препарат по п.71 или 72, где фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к синтетическим молекулам, которые самопроизвольно и стабильно включаются в липидные бислои, включающие клеточные мембраны. В частности, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических «мембранных якорей » или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии антигенов клеточной поверхности.

Уровень техники

Антигены клеточной поверхности опосредуют ряд взаимодействий между клетками и их окружающей средой. Эти взаимодействия включают в себя взаимодействие клетка-клетка, взаимодействия клетка-поверхность и взаимодействия клетка-растворенное вещество. Антигены клеточной поверхности опосредуют также внутриклеточную передачу сигнала.

Клетки характеризуются качественными и количественными различиями в экспрессированных антигенах клеточной поверхности. Качественные и количественные различия в экспрессированных антигенах клеточной поверхности изменяют как функцию клетки (способ действия), так и функциональность клетки (оказываемое действие).

Способность осуществлять качественные и/или количественные изменения в антигенах клеточной поверхности, экспрессированных клетками, имеет диагностическую и терапевтическую ценность. Трансгенные и нетрансгенные методы осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой, являются известными.

Окрашивание белка является нетрансгенным методом осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой. Этот метод использует способность GPI-связанных белков спонтанно прикрепляться к клеточной мембране через их липидные хвосты. Метод, изложенный в описании, сопровождающем международную патентную заявку № PCT/US 98/15124 (WO 99/05255), включает в себя стадию встраивания GPI-связанного белка, выделенного из биологического источника, в мембрану. Выделенные GPI-прикрепленные белки указываются как обладающие необычной способностью реинтегрироваться с мембраной поверхности клетки.

Клетки существуют в водной окружающей среде. Клеточная мембрана является липидным бислоем, который служит в качестве полупроницаемого барьера между цитоплазмой клетки и этой водной окружающей средой. Локализацию антигенов на клеточной поверхности можно также достичь посредством применения гликолипидов в качестве «мембранных якорей ».

Способ, изложенный в описании, сопровождающем международную патентную заявку № PCT/NZ 02/00214 (WO 93/034074), включает в себя стадию встраивания регулируемого количества гликолипида в мембрану. Количество встроенного гликолипида регулируют для обеспечения клеток требуемым уровнем экспрессии антигена.

Способ, изложенный в описании, сопровождающем международную патентную заявку № PCT/NZ 03/00059 (WO 93/087346), включает в себя стадию встраивания модифицированного гликолипида в мембрану в качестве «мембранного якоря ». Модифицированный гликолипид обеспечивает локализацию антигенов на поверхности клетки или поликлеточной структуры. Тем самым клетке или поликлеточной структуре могут быть приданы новые характеристики.

Эти методы обычно включают в себя выделение гликолипида или связанного с гликолипидом антигена из биологического источника. Выделение гликолипидов или связанных с гликолипидом антигенов из биологических источников является дорогим, изменяемые и поддающиеся выделению количества их часто ограничены. Терапевтическое применение получаемых из зоологических источников реагентов является особенно проблематичным, особенно, когда реагент или его продукты-производные нужно ввести субъекту, являющемуся человеком.

Предпочтительными являются синтетические молекулы, для которых риск загрязнения зоопатогенными агентами может быть исключен. Описаны синтетические аналоги для существующих в природе гликолипидов и синтетических неогликолипидов. Однако синтетический гликолипид, который нужно применять в качестве «мембранного якоря », должен быть способен спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой из водной окружающей среды. Полезность синтетических гликолипидов в диагностических или терапевтических применениях дополнительно ограничивается теми синтетическими гликолипидами, которые могут образовывать раствор в солевом растворе.

Органические растворители и/или поверхностно-активные вещества, применяемые для облегчения растворения гликолипидов в солевом растворе, должны быть биосовместимыми. Растворители и поверхностно-активные вещества часто должны быть исключены или быстро удалены, так как они могут быть вредными для некоторых клеточных мембран. Удаление растворителей или поверхностно-активных веществ из таких препаратов может быть проблематичным.

Повреждение клеточных мембран должно быть исключено, особенно, когда подача клеток или поликлеточных структур ограничена, например эмбрионов, или клетки являются особенно восприимчивыми к нарушению, например гепатоциты.

Здесь существует потребность в водорастворимых синтетических молекулах, которые являются функционально эквивалентными существующим в природе гликолипидам и связанных с гликолипидами антигенам в отношении их способности спонтанно и стабильно включаться в липидные бислои, включая клеточные мембраны. Обеспечение такими синтетическими молекулами может устранить ограничения гликолипидов и связанных с гликолипидами антигенов, выделенных из биологических источников, и облегчить их способность осуществлять качественные и/или количественные изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой.

Задачей данного изобретения является обеспечение таких синтетических молекул и метода для их получения. Следующей задачей данного изобретения является предоставление синтетических молекул для применения в диагностических и терапевтических применениях. Предшествующие задачи должны быть истолкованы отдельно от настоящей задачи, чтобы, по меньшей мере, обеспечить общественность полезным выбором.

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретение заключается в применении молекулы структуры R-S ₂ -L в качестве синтетического «мембранного якоря » или при получении синтетических молекулярных конструкций, где

R представляет собой химически реакционноспособную функциональную группу;

S ₂ - спейсер, связывающий R с L; и

L - липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих церамид.

Предпочтительно R выбран из группы, включающей в себя бис-(N-гидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис-(пентафторфенил), бис-(пентахлорфенил).

Предпочтительно S ₂ выбран из группы, включающей в себя -СО(СН ₂ ) ₃ СО-, -СО(СН ₂ ) ₄ СО- (адипат (Ad)) и -СО(СН ₂ ) ₅ СО-.

Предпочтительно R и S ₂ являются связанными сложноэфирными связями.

Предпочтительно L представляет собой липид, выбранный из группы, включающей в себя диацил- и диалкилглицеролипиды, включая глицерофосфолипиды. Более предпочтительно L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученного из одной или нескольких транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно L выбран из группы, состоящей из 1,2-О-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-О-дистеарил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).

Предпочтительно L представляет собой глицерофосфолипид, и молекула его включает в себя структуру

где n равно 3-5 и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно n равно 3.

В конкретных вариантах осуществления молекула имеет структуру

обозначенную Ad-DOPE; структуру

обозначенную sp ₁ -Ad-DOPE, или структуру

обозначенную Ad-DSPE.

M обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na ⁺ , K ⁺ или NH ₄ ⁺ .

Bo втором аспекте изобретение заключается в синтетической молекулярной конструкции структуры F-S ₁ -S ₂ -L, где

F представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина;

S ₁ -S ₂ представляет собой спейсер, связывающий F с L; и

L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды, и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включая церамид.

Предпочтительно молекула является водорастворимой.

Предпочтительно молекула спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор молекулы контактирует с липидным бислоем. Более предпочтительно молекула стабильно включается в липидный бислой.

Предпочтительно F, S ₁ , S ₂ и L ковалентно связаны.

Предпочтительно F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина. Наиболее предпочтительно F выбран из группы, состоящей из существующих в природе и синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).

Предпочтительно L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды. Более предпочтительно L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно L выбран из группы, состоящей из 1,2-O-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-О-дистеарил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).

Предпочтительно L представляет собой глицерофосфолипид и молекула его включает в себя субструктуру

где n равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно n равно 3.

S ₁ -S ₂ выбран так, чтобы образовывалась водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция.

В первом варианте осуществления F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. Предпочтительно F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более единиц сахаров. Более предпочтительно F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила олигосахаридов. Более предпочтительно F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара

Когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S ₂ выбран из группы, включающей в себя -СО(СН ₂ ) ₃ СО-, -СО(СН ₂ ) ₄ СО- (адипат), -СО(СН ₂ ) ₅ СО- и CO(CH ₂ ) ₅ NHCO(CH ₂ ) ₅ CO-, предпочтительно S ₁ представляет собой С _3-5 аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила. Более предпочтительно S ₁ представляет собой 3-аминопропил.

Во втором варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность. Предпочтительно F представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности. Более предпочтительно F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах. Еще более предпочтительно F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия. Наиболее предпочтительно компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.

В третьем варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество. Предпочтительно F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).

В конкретных вариантах осуществления водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру

обозначенную А _три -sp-Ad-DOPE (I); структуру

обозначенную А _три -spsp ₁ -Ad-DOPE (II); структуру

обозначенную А _три -sp-Ad-DSPE (III); структуру

обозначенную В _три -sp-Ad-DOPE (VI); структуру

обозначенную Н _три -sp-Ad-DOPE (VII); структуру

обозначенную Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII); структуру

обозначенную Gal β ₁ -sp-Ad-DOPE (IX); структуру

обозначенную Fuc α1-2Gal β ₁ -3GlcNAc β ₁ -3Gal β ₁ -4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII); или структуру

обозначенную Fuc α1-2Gal β1-3(Fuc α1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).

М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na ⁺ , K ⁺ или NH ₄ ⁺ .

В третьем аспекте изобретение заключается в методе получения синтетической молекулярной конструкции F-S ₁ -S ₂ -L, включающем в себя стадии:

1) реакцию активатора (А) с липидом (L) с образованием активированного липида (A-L);

2) дериватизацию антигена (F) для получения производного антигена (F-S ₁ ) и

3) конденсацию A-L с F-S ₁ для получения молекулы; в которой

А представляет собой активатор, выбранный из группы, включающей в себя бис-(N-гидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис-(пентафторфенил), бис-(пентахлорфениловые) эфиры карбодиовых кислот (С ₃ -С ₇ );

L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды; и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих в себя церамид;

F представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина, и

S ₁ -S ₂ представляет собой спейсер, связывающий F с L, где S ₁ выбран из группы, включающей в себя первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин, и S ₂ отсутствует или выбран из группы, включающей в себя -СО(СН ₂ ) ₃ СО-, -СО(СН ₂ ) ₄ СО- (адипат) и -СО(СН ₂ ) ₅ СО-.

Предпочтительно молекула является водорастворимой.

Предпочтительно молекула спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор молекулы контактирует с липидным бислоем. Более предпочтительно молекула стабильно включается в липидный бислой.

Предпочтительно F, S ₁ , S ₂ и L являются ковалентно связанными.

Предпочтительно F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина. Наиболее предпочтительно F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).

Предпочтительно L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды. Более предпочтительно L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот: транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно L выбран из группы, состоящей из 1,2-O-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-О-дистеарил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).

Предпочтительно L представляет собой глицерофосфолипид, и молекула его включает в себя структуру

где n равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно n равно 3.

Предпочтительно A(R-S ₂ ) и S ₁ выбраны так, чтобы образовывалась водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция.

В первом варианте осуществления F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. Предпочтительно F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев сахаров. Более предпочтительно F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботераозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила олигосахаридов. Наиболее предпочтительно F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара

Когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S ₂ выбран из группы, включающей в себя -СО(СН ₂ ) ₃ СО-, -СО(СН ₂ ) ₄ СО- (адипат), -СО(СН ₂ ) ₅ СО- (например, А представляет собой бис-(N-гидроксисукцинимидил)адипат), предпочтительно S ₁ представляет собой С _3-5 аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила). Более предпочтительно S ₁ представляет собой 3-аминопропил.

Во втором варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность. Предпочтительно F представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности. Более предпочтительно F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах. Еще более предпочтительно F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия. Наиболее предпочтительно компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.

В третьем варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество. Предпочтительно F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).

В конкретных вариантах осуществления водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру

обозначенную А _три -sp-Ad-DOPE (I); структуру

обозначенную А _три -spsp ₁ -Ad-DOPE (II); структуру

обозначенную А _три -sp-Ad-DSPE (III); структуру

обозначенную В _три -sp-Ad-DOPE (VI); структуру

обозначенную Н _три -sp-Ad-DOPE (VII); структуру

обозначенную Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII); структуру

обозначенную Gal β1-sp-Ad-DOPE (IX); структуру

обозначенную Fuc α1-2Gal β1-3GlcNAc β1-3Gal β1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII); или структуру

обозначенную Fuc α1-2Gal β1-3(Fuc α1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).

М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na ⁺ , K ⁺ или NH ₄ ⁺ .

В четвертом аспекте изобретение относится к водорастворимой синтетической молекулярной конструкции, полученной методом согласно третьему аспекту изобретения.

В пятом аспекте изобретение относится к методу осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессируемых клеточной или поликлеточной структурой, включающему стадию

1) контактирования суспензии клеточной или поликлеточной структуры с синтетической молекулярной конструкцией согласно второму аспекту или четвертому аспекту изобретения в течение времени и при температуре, достаточных для осуществления качественного и/или количественного изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеточной или поликлеточной структурой.

Предпочтительно клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.

Предпочтительно концентрация водорастворимой синтетической молекулярной конструкции в суспензии находится в диапазоне 0,1-10 мг/мл.

Предпочтительно температура находится в диапазоне 2-37 °С. Более предпочтительно температура находится в диапазоне 2-25 °С. Наиболее предпочтительно температура находится в диапазоне 2-4 °С.

В первом варианте осуществления клеткой является эритроцит.

В этом варианте осуществления предпочтительно F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара

Предпочтительно синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя

Во втором варианте осуществления поликлеточной структурой является эмбрион.

В этом варианте осуществления предпочтительно F представляет собой молекулу присоединения, где молекула присоединения имеет аффинность в отношении компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.

Компонентом, экспрессируемым на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндотелия, может быть экспрессируемый в природе компонент или экзогенно включаемый компонент.

Предпочтительно синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя

Третьим вариантом осуществления клетки является эритроцит.

В этом варианте осуществления предпочтительно F представляет собой лиганд для молекулы связывания, где присутствие молекулы связывания является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).

В шестом аспекте изобретение заключается в клеточной или поликлеточной структуре, включающей в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию согласно второму или четвертому аспекту изобретения.

Предпочтительно клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.

В первом варианте осуществления клеткой является эритроцит, включающий в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя

Во втором варианте осуществления клеткой является эмбрион, включающий в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из

В седьмом аспекте изобретение заключается в наборе, включающем в себя высушенный препарат или раствор молекулы согласно первому аспекту изобретения, или высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции согласно второму или четвертому аспекту изобретения.

Предпочтительно молекула согласно первому аспекту изобретения выбрана из группы, состоящей из Ad-DOPE; sp ₁ -Ad-DOPE и ad-DSPE.

Предпочтительно водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция согласно второму или четвертому аспекту изобретения выбрана из группы, состоящей из

В восьмом аспекте изобретение заключается в наборе, включающем в себя суспензию в суспендирующем растворе клеток или поликлеточных структур согласно шестому аспекту изобретения.

Предпочтительно суспендирующий раствор, по существу, не содержит липид.

Предпочтительно клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.

Предпочтительно клетки являются эритроцитами, которые в природе не экспрессируют А- или В-антиген и включают в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из

Более предпочтительно клетки являются контролями чувствительности.

В девятом аспекте изобретение заключается в фармацевтическом препарате, включающем в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции согласно второму или пятому аспекту изобретения.

Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.

Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.

В десятом аспекте изобретение заключается в фармацевтическом препарате, включающем в себя клетки или поликлеточные структуры согласно шестому аспекту изобретения.

Предпочтительно клетки или поликлеточные структуры имеют человеческое или мышиное происхождение.

Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.

Предпочтительно фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.

Подробное описание

Синтетические молекулярные конструкции изобретения спонтанно и стабильно включаются в липидный бислой, такой как мембрана, когда раствор молекулы контактируют с липидным бислоем. Без намерения быть связанным с теорией считают, что встраивание в мембрану липидных концов липида (L) термодинамически является предпочтительным. Считается, что последующее отделение диссоциацией синтетической молекулярной конструкции от липидной мембраны термодинамически не является предпочтительной. Неожиданным образом обнаружено, что синтетические молекулярные конструкции, идентифицированные здесь, являются водорастворимыми.

Синтетические молекулярные конструкции применяют для трансформации клеток, что приводит к качественным и/или количественным изменениям в экспрессированных поверхностных антигенах. Должно быть понятно, что трансформация клеток согласно изобретению отличается от трансформации клеток генной инженерией. Изобретение обеспечивает фенотипическую трансформацию клеток без генетической трансформации.

В контексте данного изобретения термин «трансформация » в отношении к клеткам применяют для указания на встраивание или включение в клеточную мембрану экзогенно полученных синтетических молекулярных конструкций, чтобы тем самым осуществить качественные и/или количественные изменения в клеточных поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой.

Синтетические молекулярные конструкции изобретения включают в себя антиген (F), связанный с липидной частью (или остатком) (L) через спейсер (S ₁ -S ₂ ). Синтетические молекулярные конструкции можно получить конденсацией первичного аминоалкильного, вторичного алифатического аминоалкильного или первичного ароматического аминного производного антигена с активированным липидом. Описан обзор методов получения неогликоконъюгатов (Bovin, N. Biochem. Soc. Symp., 69, 143-160).

Требуемую фенотипическую трансформацию можно достичь с применением синтетических молекулярных конструкций.

Требуемую фенотипическую трансформацию можно достичь с применением синтетических молекулярных конструкций изобретения одностадийным методом или двухстадийным методом. В одностадийном методе водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция (F-S ₁ -S ₂ -L) включает в себя поверхностный антиген в качестве F.

В двухстадийном методе синтетическая молекулярная конструкция (F-S ₁ -S ₂ -L) включает в себя антиген (F), который служит в качестве функциональной группы, с которой поверхностный антиген может быть связан после встраивания синтетической молекулярной конструкции в мембрану. Функциональной группой может быть такая группа, как лецитин, авидин или биотин. При применении в двухстадийном методе синтетическая молекулярная конструкция действует в качестве синтетического мембранного якоря.

Согласно изобретению первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин и активатор липида выбирают для обеспечения образования синтетической молекулярной конструкции, которая является водорастворимой и будет спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактирует с липидным бислоем.

В контексте данного изобретения термин «водорастворимый » означает, что образуется стабильная, однофазная система, когда синтетическую молекулярную конструкцию контактируют с водой или солевым раствором (таким как PBS) в отсутствие органических растворителей или поверхностно-активных веществ, и термин «раствор » имеет соответствующее значение.

В контексте данного изобретения фраза «стабильно включается » означает, что синтетические молекулярные конструкции включаются в липидный бислой или мембрану с минимальным последующим обменом между липидным бислоем или мембраной и водной внешней окружающей средой липидного бислоя или мембраны.

Выбор первичного аминоалкила, вторичного алифатического аминоалкила или первичного ароматического амина и активатора зависит от физико-химических свойств антигена (F), который нужно связать с липидом (L).

Специалисту в данной области должно быть понятно, что для неспецифического взаимодействия, такого как взаимодействие между диацил- или диалкилглицеролипидом и мембраной, структурные изомеры и стереоизомеры существующих в природе липидов могут быть функционально эквивалентными. Например, авторами изобретения предполагается, что фосфатидат (3-фосфат диацилглицерина) может быть заменен 2-фосфатом диацилглицерина. Кроме того, авторами изобретения предполагается, что абсолютная конфигурация фосфатидата может быть либо R-, либо S-конфигурацией.

Авторы изобретения определили, что для получения синтетических молекулярных конструкций изобретения, в которых антиген (F) представляет собой олигосахарид, выбранный из группы гликотопов для А-, В- и Н-антигенов групп крови АВО, первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин и активатор должны быть выбраны так, чтобы обеспечить образование альтернативных структур S ₁ -S ₂ для водорастворимой синтетической молекулярной конструкции (F-S ₁ -S ₂ -L), где F представляет собой углевод (или другой антиген) с одинаковыми физико-химическими свойствами с углеводной частью А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО, и L представляет собой глицерофосфолипид, S ₁ выбран из -O(CH ₂ ) _n NH- и S ₂ выбран из -O(CH ₂ ) _n CO- или -CO(CH ₂ ) _m NHCO(CH ₂ ) _n CO- (n, m независимо равны 2-5).

Специалисту в данной области должно быть понятно, что после того, как структура спейсера (S ₁ -S ₂ ) определена для данного класса антигенов, такая же структура спейсера может быть принята для получения синтетических молекулярных конструкций других классов антигена с подобными физико-химическими свойствами.

Например, структура спейсера для синтетических молекулярных конструкций (F-S ₁ -S ₂ -L), где F представляет собой гликотоп А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО, может быть структурой спейсера, выбранного для получения синтетических молекулярных конструкций других антигенов с физико-химическими свойствами, подобными гликотопам А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО.

В принципе гликотопом широкого диапазона связанных с группой крови гликолипидов или гликопротеинов может быть антиген (F) синтетической молекулярной конструкции F-S ₁ -S ₂ -L, где S ₁ -S ₂ -L является идентичной или эквивалентной соответствующей части синтетических молекулярных конструкций, обозначенных

Структуры известных связанных с группой крови гликолипидов и гликопротеинов (см. ссылки) представлены в нижеследующем перечне.

Гликолипиды*

(*В общем, почти для всех примеров А-антигенов концевой сахар А GalNAc может быть заменен сахаром В Gal. Кроме того, отсутствие либо А-, либо В-детерминанты создает эквивалентную детерминанту Н).

О-Связанные гликопротеины

Дисиалотетрасахарид

Олигосахарид с дисиалоильной группой

Н-Активный трисахарид

Сиалилированный Н-активный тетрасахарид

Олигосахарид Cad

Олигосахарид GlcNAc

Олигосахарид муцина/А-активный гликопротеин

А-активный гликопротеин-6а кисты яичника

А-активный гликопротеин-6b кисты яичника

Le ^a -активный гликопротеин-7 кисты яичника

Le ^a -активный гликопротеин-10 кисты яичника

А-активный гликопротеин-18 кисты яичника

N-связанные гликопротеины

Тип комплекса/стабильная к щелочи цепь

Гибридный тип

Гликопротеин Тамма-Хорсфалла

Тип с высоким содержанием манноза

Дисиалилфоетальный антиген эритроцита

Трисиалоилфоетальный антиген эритроцита (дисиалоильная группа на разветвлении)

Монофукозилмоносиалилфоетальный антиген эритроцита (фукозилированная главная цепь)

Монофукозилмоносиалилфоетальный антиген эритроцита (дисиалильная группа на разветвлении)

Монофукозилдисиалилфоетальный антиген эритроцита (дисиалильная группа на разветвлении)

Дифукозилфоетальный антиген эритроцита

Фоетальлактозаминогликан

Лактозаминогликан зрелой клетки

Монофукозилмоносиалоильный антиген зрелого эритроцита

Монофукозилмоносиалоильный антиген зрелого эритроцита

Дифукозильный антиген зрелого эритроцита

Специалисту должно быть понятно, что синтетические молекулярные конструкции (F-S ₁ -S ₂ -L) изобретения, где F представляет собой олигосахарид, можно применять в качестве «синтетических гликолипидов » и замещений для гликолипидов, полученных из биологических (ботанических и зоологических) источников.

В контексте данного изобретения термин «гликолипид » означает липид, содержащий углевод амфипатического характера, включающий в себя гликозилированные глицеролипиды, такие как гликозилированные фосфоглицериды и гликозилглицериды; гликозилированные сфинголипиды (нейтральные гликолипиды), такие как гликозилцерамиды или цереброзиды; и ганглиозиды (кислотные гликолипиды).

В контексте данного изобретения фраза «связанный с гликолипидом антиген » означает липид, содержащий углевод, в котором антиген (например, белок) связан с гликолипидом через углеводную часть молекулы. Примеры связанных с гликолипидом антигенов включают в себя GPl-связанные белки.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что гликолипид сам является антигеном. Термин и фраза «гликолипид » и «связанный с гликолипидом антиген » применяют для проведения различия между существующими в природе молекулами, у которых антигеном является гликолипид, и существующими в природе молекулами, у которых антиген связан с гликолипидом через углеводную часть гликолипида. По аналогии синтетические молекулярные конструкции изобретения могут быть описаны в качестве как «синтетических гликолипидов », так и синтетических мембранных якорей до степени, при которой антигеном может быть синтетический гликолипид per se или антиген присоединен к синтетическому гликолипиду.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что углеводная часть гликолипида может быть модифицирована и связана с другими антигенами методами, изложенными в описании, сопровождающим международную патентную заявку № PCT/NZ 2003/00059 (опубликована как WO 03087346).

В контексте данного описания изобретения термин «гликотоп » применяют для обозначения антигенной детерминанты, расположенной на углеводной части гликолипида. Классификация гликолипидных антигенов в серологии групп крови основана на структуре углеводной части гликолипида.

В серологии групп крови известно, что концевыми сахарами гликотопов А-антигенов являются GalNAc α1-3(Fuc α1-2)Galp и концевыми сахарами гликотопов В-антигенов являются Gal α1-3(Fuc α1-2)Gal β. Включение в мембрану RBC водорастворимых синтетических молекулярных конструкций изобретения, в которых F представляет собой GalNAc α1-3(Fuc α1-2)Gal β или Gal α1-3(Fuc α1-2)Gal β, дает RBC, которые являются серологически эквивалентными А-антигену или В-антигену, экспрессируемому RBC, соответственно.

Концевые три сахара углеводной части присутствующего в природе А- или В-антигена являются детерминантой определения групп крови А и В. Концевые четыре или пять сахаров углеводной части присутствующего в природе А- или В-антигена являются детерминантой подгрупп крови А типа 1 А и типа 2 А и т.д. Соответственно этому, RBC, включающие синтетические молекулярные конструкции изобретения, можно применять для характеризации и проведения различий между реагентами типирования крови (антителами) различной специфичности.

Водорастворимые синтетические молекулярные конструкции изобретения, которые исключают углеводную часть, рассматриваются изобретением. Антигены, другие, чем углеводы или олигосахариды, но со сходными физико-химическими свойствами, могут заменять F в описанных «синтетических гликолипидах ».

Синтетические молекулярные конструкции изобретения, которые включают в себя антиген F с физико-химическими свойствами, отличными от физико-химических свойств углеводов или олигосахаридов, также рассматриваются авторами изобретения. Водорастворимые синтетические молекулярные конструкции, включающие в себя эти антигены, можно получить выбором разных спейсеров.

Преимущества, обеспечиваемые синтетическими молекулярными конструкциями данного изобретения, будут повышаться при применении на практике изобретений, изложенных в описаниях международных патентных заявок № № PCT/NZ 02/00212 (опубликована как WO 03/034074) и PCT/NZ 03/00059 (опубликована как WO 03087346). Описания, сопровождающие эти заявки, включены здесь в качестве ссылки.

Синтетические молекулярные конструкции преодолевают многие из ограничений применяемых природных гликолипидов на практике этих изобретений. Конкретным преимуществом синтетических молекулярных конструкций является их превосходящая активность и способности быть пригодными для применения при трансформации клеток при пониженных температурах, например 4 °С.

Как описано здесь, не все структуры спейсера (S ₁ -S ₂ ) могут обеспечивать получение синтетической молекулярной конструкции (F-S ₁ -S ₂ -L), которая является водорастворимой и спонтанно и стабильно включается в липидный бислой, такой как клеточная мембрана. Обнаружено, что синтетические молекулярные конструкции, обозначенные А _три -sp-липид (IV) и А _три -PAA-DOPE (V), не являются водорастворимыми и/или не способны спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой, такой как клеточная мембрана.

обозначенная А _три -sp-липид (IV).

обозначенная А _три -PAA-DOPE (V), где х, у = 0,05-0,2.

Изобретение теперь будет иллюстрировано ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры и фигуры прилагаемых графических материалов.

На фиг. 1 показаны результаты анализа Diamed сохраняемых в Cellstab ™ клеток, трансформированных раствором природного гликолипида А для трансформации (L к R) при 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2 мг/мл, 2 мг/мл* и 1 мг/мл. Применяемыми антисыворотками являются албаклон (верх) и биоклон (низ). (* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не промывали после инкубации, его оставляли на ночь и промывали на следующий день (день 2)).

На фиг. 2 показаны результаты анализа Diamed сохраняемых в Cellstab ™ клеток, трансформированных раствором природного гликолипида В для трансформации (L к R) при 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2 мг/мл, 2 мг/мл* и 1 мг/мл. Применяемыми антисыворотками являются албаклон (верх) и биоклон (низ). (* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не промывали после инкубации, его оставляли на ночь и промывали на следующий день (день 2)).

На фиг. 3 показан анализ FACS после трансформации in vitro Le(a-b)-эритроцитов человека природным Le ^b -6-гликолипидом на протяжении времени при трех температурах трансформации, 37 °С (верх), 22 °С (середина) и 4 °С (низ).

На фиг. 4 показаны результаты анализа Diamed клеток, трансформированных при 4 °С раствором для трансформации А _три -sp-Ad-DOPE (I) (L к R (слева направо)): промытые, 0,08 мг/мл; не промытые, 0,08 мг/мл; промытые, 0,05 мг/мл; не промытые, 0,05 мг/мл; промытые, 0,03 мг/мл и не промытые, 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-А.

На фиг. 5 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С раствором трансформации А _три -sp-Ad-DOPE (I) (L к R): 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-А.

На фиг. 6 в левом столбце показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С раствором трансформации В _три -sp-Ad-DOPE (VI) (L к R): промытые, 0,6 мг/мл; не промытые, 0,6 мг/мл; промытые, 0,3 мг/мл; не промытые, 0,3 мг/мл; промытые, 0,15 мг/мл и не промытые, 0,15 мг/мл; в правом столбце показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С раствором трансформации В _три -sp-Ad-DOPE (VI) (L к R): промытые, 0,08 мг/мл; не промытые, 0,08 мг/мл; промытые, 0,05 мг/мл; не промытые 0,05 мг/мл; промытые, 0,03 мг/мл и не промытые, 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-В.

На фиг. 7 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С раствором трансформации В _три -sp-Ad-DOPE (VI) (L к R): 0,6, 0,3 и 0,15 мг/мл.

На фиг. 8 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 9 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 10 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, промытые А 0,07 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 11 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 12 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, промытые А 0,06 А + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 13 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 14 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, промытые А 0,06 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 15 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 16 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, промытые А 0,05 А + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 17 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 18 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, промытые А 0,05 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.

На фиг. 19 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4 °С параллельной трансформацией А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L к R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.

Сравнительные примеры.

Сравнительные примеры не образуют часть заявленного изобретения. Сравнительные примеры описывают трансформацию эритроцитов природными гликолипидами.

Сравнительный пример 1. Получение природных гликолипидов.

Очистка ВЭЖХ.

В первой стадии колонки заполняли сухим диоксидом кремния (15-25 мкм) перед каждым опытом. Можно применять относительно нечистые образцы при анализе ВЭЖХ, поскольку диоксид кремния можно разгрузить вместе с теоретически высоким уровнем необратимо связанных загрязняющих примесей.

Гликолипиды разделяли на силикагеле с подвижной фазой повышенной пористости. Программой был линейный градиент, начинающийся 100% смесью 80:20:1 (об./об.) хлороформ-метанол-вода и кончающийся 100% смесью 40:40:12 (об./об.) хлороформ-метанол-вода.

Применяемым оборудованием ВЭЖХ была система Shimadzu, способная перекачивать и смешивать четыре отдельных растворителя при программированных отношениях. Поскольку хлороформ, метанол и вода испаряются с разными скоростями, была разработана программа, при помощи которой компоненты растворителя не смешивали перед подачей для ВЭЖХ.

Четыре разные жидкости для ВЭЖХ Shimadsu смешивали быстрым отбором «выстрелом » их по очереди из каждой из четырех бутылей. «Выстрелы » хлороформа и воды непосредственно друг за другом в линиях могут вызвать проблемы смешиваемости. Метанол был «прослойкой » между этими двумя несмешиваемыми компонентами. Кроме того, воду предварительно смешивали с метанолом в отношении 1:1 для дополнительного предотвращения появления проблем со смешиваемостью.

Сравнительный пример 2. Трансформация эритроцитов природными гликолипидами.

Агглютинация.

Трансформацию эритроцитов определяли агглютинацией с применением системы микротипирования Diamed-ID помимо применения общепринятой пробирочной серологии. Карты типирования Diamed ABO не применяли. Применяемыми картами были содержащие NaCl, ферментную пробу и не содержащие радиоактивное вещество карты агглютинина, которые предварительно не загружали какой-либо антисывороткой или другими реагентами. Это позволяет применять специфические антисыворотки в обеих методологиях.

Таблица 1Гель-карты

Сравнительное испытание проводили между пробирочной серологией и системой Diamed для установления эффективности двух систем. Клетки трансформировали при 25 °С в течение 4 ч. Для измерения эквивалентности примеряли анти-А-сыворотки сераклон и альбаклон. Результаты показаны в приведенной ниже табл. 3.

Таблица 2Антисыворотки, применяемые при сравнении пробирочной серологии с системой Diamed

Таблица 3Результаты агглютинации, сравнивающие пробирочную серотологию с системой Diamed

В этом эксперименте доказали, что система Diamed является более чувствительной к более слабым реакциям, чем пробирочная серотология с сераклоном анти-А, но не с албаклоном. Эти реагенты изготовляют различно и, таким образом, не предполагается, что они выполняют анализ идентично. Однако тот факт, что комбинация пробирочной серотологии с сераклоном анти-А не давала положительный результат, вероятно, является результатом интерпретации оператора. Более слабые реакции заведомо трудно оценить в баллах и разница между 1+ и 0 может быть трудно различимой в пробирках.

Оптимизация.

Изучали влияние изменения концентрации гликолипидов, температуры инкубации, продолжительности инкубации, разбавителя и раствора для хранения на жизнеспособность клеток. Эффективность и стабильность трансформации определяли агглютинацией соответствующим антителом.

Таблица 4Определяемая пробирочной серологией агглютинация клеток, трансформированныхприродным гликолипидом А на протяжении различного времени и при разных температурах

Концентрация гликолипида.

Эксперименты с начальной трансформацией проводили с очень очищенным (ВЭЖХ) образцом Le ^b -гликолипида и менее чистым образцом гликолипида группы крови А. Трансформацию проводили при 37 °С в течение 2,5 ч.

Образец гликолипида А содержал другие липидные примеси и, таким образом, сравнительно меньше молекул группы крови А по массе, чем образец Le ^b -гликолипида эквивалентной концентрации (мас./об.). По-видимому это подтверждается фактом, что более высокие концентрации гликолипида А, чем Le ^b -гликолипида, требовались для получения эквивалентной оценки агглютинации в баллах (см. табл. 6).

Уровень примеси в образце гликолипида А может также способствовать более низкой стабильности на протяжении периода 62 дней - А-трансформированные клетки «умирали » при самой высокой концентрации (получившие самую высокую дозу примеси).

Таблица 5Анти-А и анти-Leb, применяемые при начальном тестированиитрансформации природным гликолипидом

Таблица 6Стабильность RBC, трансформированных природным гликолипидом А и Leb,оцениваемая агглютинацией пробирочной серологией на протяжении периода 62 дней

Указанные выше клетки оценивали также для гемолиза и эти результаты приводятся ниже в табл. 7.

Таблица 7Гемолиз, подсчитываемый визуально

День 1 - в супернатанте первого промывания после трансформации; дни 25 и 62 - в растворе консервации клеток перед тем, как клетки ресуспендируют после хранения. Шкала подсчета в баллах аналогична шкале агглютинации от 4+ до 0; hhhh - сильно гемолизованные, hhh - очень гемолизованные, hh - умеренно гемолизованные, h - среднегемолизованные, w - слабогемолизованные и 0 - гемолиз не виден.

Можно обнаружить, что эти результаты показывают, что гемолиз клеток ассоциирован с трансформацией с высокими концентрациями гликолипида. Не ясно, является ли лежащим в основе этого механизма разрыв мембраны плазмы большими количествами встраиваемого гликолипида, скорость такого встраивания или это, возможно, обусловлено количеством ассоциированных примесей. Однако оказалось, что результаты для Le ^b на день 62 поддерживают первое объяснение.

Образец Le ^b был очень очищенным перед растворением, он был порошком чистого белого цвета и поэтому маловероятно, что гемолиз был обусловлен вредным влиянием примесей. Из данных ясно видно, что на день 62 степень имеющего место гемолиза уменьшается в соответствии со снижением концентрации гликолипида.

Температура инкубации.

Эксперименты проводили для исследования возможных механизмов снижения гемолиза RBC во время стадии встраивания. Предыдущие эксперименты показали, что гемолиз снижался при более высоких концентрациях гликолипида, чем при более низких концентрациях, и, считается, что гемолиз может быть также связан со скоростью встраивания гликолипида. Поскольку считается, что температура влияет на скорость встраивания, эксперименты проводили для сравнения трансформации при 37 °С с трансформацией при комнатной температуре (к.т.; 25 °С).

Поскольку предполагается, что скорость снижается, когда снижается температура, период инкубации для эксперимента при к.т. был 4 ч. Гемолиз оценивали визуально и считали в баллах после встраивания. Тесты серологии также проводили на клетках. Результаты показаны в табл. 8.

Таблица 8Влияние температуры инкубации на гемолиз и агглютинацию во время встраивания гликолипидов в мембраны RBC. Гемолиз оценивали в баллах визуально при каждой из трех промывок

Продолжительность промывки.

Инкубацию при 37 °С проводили в течение 1 и 2 ч и ее влияние на гибель и трансформацию клеток оценивали агглютинацией подходящим антителом.

Таблица 9Антисыворотки, применяемые при различных продолжительностях опытов инкубации

Таблица 10Влияние времени инкубации на агглютинацию клеток,трансформированных природными гликолипидами

Эти результаты показывают, что повышение продолжительности инкубации во время встраивания природных гликолипидов не повышает агглютинацию. Фактически, баллы счета агглютинации снижаются после 2 ч инкубации. Это может быть обусловлено дестабилизацией мембраны или возвращением гликолипидов обратно в раствор.

Разбавитель.

Эксперименты проводили также для определения, может ли замена раствора для разведения гликолипида снижать гемолиз. Рабочую эффективность PBS сравнивали с рабочей эффективностью 2 ×PBS и 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Клетки инкубировали при 37 °С в течение 1,5 ч. Результаты показаны в табл. 11.

Таблица 11Исследование по влиянию на гемолиз замены растворов для разведения гликолипидовво время встраивания гликолипидов в мембраны RBC

Стабильность.

После того как гликолипиды групп крови А и В были очищены ВЭЖХ до приемлемого уровня, проводили эксперимент для нахождения подходящих концентраций для проведения опытов по стабильности.

Таблица 12Исследование ранней стабильности клеток, трансформированных природным гликолипидом А

Таблица 13Антисыворотки, применяемые в испытаниях стабильности (табл. 14 и 15)

Таблица 14Пробирочная серология О RBC, трансформированных гликолипидом А,для установления подходящих концентраций для проведения испытаний стабильности

1 и 2 Трансформация при 25 °С в течение 4 ч.

Таблица 15Пробирочная серотология О RBC, трансформированных гликолипидом В,для установления подходящих концентраций для проведения испытаний на стабильность

1 и 2 Трансформация при 25 °С в течение 4 ч.

Два набора клеток трансформировали при различных концентрациях природного гликолипида А. Трансформацию проводили при 25 °С. Один набор клеток тестировали в течение длительного времени и один набор клеток тестировали еженедельно на агглютинацию. Результаты агглютинации, проводимой пробирочной серологией и Diamed, показаны ниже в табл. 16. Все клетки хранили в Cellstab ™ в бутылях с плоскими основаниями. Клетки обнаружили от минимального гемолиза до отсутствия гемолиза в любой точке времени.

Таблица 16Результаты агглютинации клеток, трансформированных различными концентрациямиприродного гликолипида А. Результаты получали с применением албаклона анти-А

* Албаклон, тогда как во все других опытах применяли сераклон анти-А.

Раствор для хранения.

Сравнение двух растворов для хранения клеток, Celpresol (CSL) и Cellstab ™ (Diamed) проводили для тестирования их относительных способностей поддерживать модифицированные RBC.

Испытывали стабильность RBC, трансформированных растворами антигенов групп крови А и В с различными концентрациями, при хранении в двух разных растворах для хранения клеток - Cellstab ™ и Alsevers ™.

В серологическом тестировании применяли антисыворотки А и В из двух разных источников.

Все клетки тестировали с применением стандартной платформы пробирочной серотологии в течение до 42 дней, при таком времени реакции агглютинации клеток становились слишком трудными для ручного счета (см. табл. 17 для результатов А и табл. 18 для результатов В).

Тестирование гель-карт Diamed проводили до 56 дней для клеток, сохраняемых в Alsevers, и прерывали в день 63 вследствие грибковым загрязнением (несмотря, однако, на повторение позитивных оценок в баллах).

Хранение клеток в Cellstab ™ продолжали в течение до 70 дней до тестирования, они были все же жизнеспособными в этой точке (см. фиг. 1 для результатов А и фиг. 2 для результатов В).

Реагенты, применяемые в испытании стабильности, показаны в табл. 13.

Таблица 17Результаты испытания пробирочной серологией стабильности клеток, трансформированных сизменяемыми концентрациями гликолипида А и хранимых либо в Cellstab ™, либо в Alsevers ™

* раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не отмывали после инкубации,

его оставляли на ночь и отмывали на следующий день

⁺⁺ положительная оценка клеток в баллах, но число клеток уменьшается (оценка в баллах

становится невозможной)

Таблица 18Серологические результаты испытания стабильности клеток, трансформированных с измененяемыми концентрациями гликолипида В и сохраняемых либо в Cellstab ™, либо в Alsevers ™

* раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не отмывали после инкубации, его

оставляли на ночь и отмывали на следующий день

⁺⁺ положительная оценка клеток в баллах, но число клеток уменьшается (оценка в баллах

становится невозможной)

FACS-анализ встраивания гликолипида.

Проводили трансформацию Le(a-b)-тромбоцитов человека природным Le ^b -6-гликолипидом на протяжении времени при трех температурах трансформации (37, 22 и 4 °С) (фиг. 3). Природный Le ^b -6-гликолипид растворяли в плазме и применяли для трансформации RBC при конечной концентрации 2 мг/мл и конечной суспензии 10%.

Реакционную способность определяли FACS-анализом с применением гамма-анти-Leb. (Уровень серологического детектирования был приблизительно 10 ² молекул. Встраивание природных гликолипидов при 4 °С в течение 8 ч не поддавалось детектированию агглютинацией антителами). Проецирование кривой скорости встраивания из FACS-анализа не указывало, что скорость встраивания при 4 °С могла достичь уровней детекции агглютинации через 24 ч.

Инкубация при низкой температуре.

Трансформацию RBC природным гликолипидом А или В проводили при 37 °С в течение 1 ч и 2 °С в течение варьируемых интервалов. Клетки агглютинировали биоклоном анти-А или биоклоном анти-В. Результаты представлены в табл. 19 и 20.

Таблица 19Результаты Diamed сравнения трансформации природным гликолипидом А при 37 °Св течение 1 ч и 2 °С в течение варьируемых интервалов

Таблица 20Результаты Diamed сравнения трансформации природным гликолипидом В при 37 °Св течение 1 ч и 2 °С в течение варьируемых интервалов

Скорость трансформации является медленной как для природного гликолипида А, так и для природного гликолипида В, что демонстрируется отрицательными оценками в баллах агглютинации после 1 ч при 2 °С. Значительное встраивание было показано при 37 °С для этого интервала времени.

Встраивание природного гликолипида А при 2 °С требовало 48 ч для достижения такого же уровня встраивания, который можно получить трансформацией при 37 °С. После этого времени дальнейшее встраивание не наблюдалось. Подобным же образом встраивание природного гликолипида В при 2 °С не было таким же быстрым, как трансформация при 37 °С. Подсчет агглютинации в баллах не повышался при продолженной инкубации и, таким образом, оказалось, что встраивание достигло максимума в этой точке времени для этих концентраций.

Примеры

В примерах описана трансформация эритроцитов синтетическими молекулярными конструкциями изобретения. В контексте этих примеров термин «синтетические гликолипиды » применяют для обозначения этих конструкций.

Пример 1. Получение синтетических гликолипидов.

Материалы и методы.

Анализы ТСХ проводили на пластинах силикагеля 60 F ₂₅₄ (Merck), соединения детектировали окрашиванием 8% фосфорной кислотой в воде с последующим нагреванием при температуре выше чем 200 °С. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 (0,2-0,63 мм, Merck) или сефадексе LH-20 (Amersham). ¹ H ЯМР-спектры снимали на спектрометре Брукер DRX-500. Химические сдвиги указываются в м.д. ( δ) относительно CD ₃ OD.

Синтез активированного 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE) и 1,2-дистереоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) (глицерофосфолипиды).

К раствору бис-(N-гидроксисукцинимидил)адипата (а) (70 мг, 205 мкмоль) в сухом N,N-диметилформамиде (1,5 мл) добавляли DOPE или DSPE (L) (40 мкмоль) в хлороформе (1,5 мл) с последующим добавлением триэтиламина (7 мкл). Смесь выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем нейтрализовали уксусной кислотой и частично концентрировали в вакууме.

Колоночная хроматография (сефадекс LH-20, смесь 1:1 хлороформ-метанол, 0,2% уксусной кислоты) остатка дала активированный липид (A-L) (37 мг, 95%) в виде бесцветного сиропа; ТСХ (хлороформ-метанол-вода, 6:3:0,5): R _f =0,5 (DOPE-A), R _f =0,55 (DSPE-A).

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ /CD ₃ OD, 2:1), δ:

Конденсация активированного DOPE (или DSPE) с аминопропилгликозидом.

К раствору активированного DOPE (или DSPE) (A-L) (33 мкмоль) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляют 30 мкмоль Sug-S ₁ -NH ₂ (F-S ₁ -NH ₂ ) и 5 мкл триэтиламина. Например, Sug может быть любым аминопропилгликозидом (F-S ₁ -NH ₂ ) либо трисахарида GalMAc α1-3(Fuc α1-2)Gal β (А-гликотоп) (F), либо трисахариада Gal α1-3(Fuc α1-2)Gal β (В-гликотоп) (F).

Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Колоночная хроматография (сефадекс LH-20 в смеси 1:1 хлороформ-метанол, затем силикагель в смеси 4:3:1 об./об./об.) этилацетат-изопропанол-вода) смеси обычно дает 85-90% синтетической молекулярной конструкции, например, А _три -sp-Ad-DOPE (I) или А _три -sp-Ad-DOPE (VI).

¹ Н ЯМР (CDCl ₃ /CD ₃ OD, 1:1), δ:

Пример 2. Растворимость синтетических гликолипидов.

Для применения при трансформации клеток первым критерием для того, чтобы синтетические гликолипиды были удовлетворительными, является то, чтобы они были растворимыми в водных растворителях, например забуференном фосфатом солевом растворе. Сначала применяли ряд методик, включающих в себя нагревание и обработку ультразвуком, для достижения максимума растворимости испытуемых синтетических гликолипидов (табл. 21).

Синтетический гликолипид должен быть способен встраиваться в мембрану и быть распознаваемым для подходящего антитела для трансформации, чтобы детектироваться агглютинацией. Первоначальные тесты на молекулы должны были устанавливать растворимость и тем самым элиминировать те молекулы, которые были неподходящими для применения при трансформации клеток.

Результаты этих первоначальных тестов представлены в табл. 22.

Таблица 21Диапазон испытанных синтетических гликолипидных молекул

Таблица 22Растворимость синтетических гликолипидов в горячем PBS и способность их к трансформации

Считали, что отсутствие детектируемой трансформации для Gal β-sp-Ad-DOPE (IX) и Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII) обусловлено неспособностью антитела узнавать гликотоп этих синтетических молекул. А _три -sp-липид (IV) имеет моноацильную, а не диацильную хвостовую часть и было предположено, что не имелось встраивания этой синтетической молекулы в мембранный бислой.

Пример 3. Низкотемпературная трансформация RBC синтетическими гликолипидами А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI).

RBC являются здоровыми при хранении при 4 °С и, считается, что подобным же образом являются здоровыми при трансформации при 4 °С. На основании предыдущих исследований (см. сравнительные примеры) и исследований других авторов (Schwarzmann, 2000) не предполагалось, что довольно высокая скорость встраивания синтетических гликолипидов может иметь место при 4 °С. Эти исследования проводили с природными гликолипидами. Удивительно, что эти исследования не предсказали поведение синтетических гликолипидов изобретения.

Хотя и без желания быть связанными с теорией, считают, что в исследованиях Schwarzmann низкая скорость встраивания природных гликолипидов может быть обусловлена физико-химическими свойствами хвостовой части природного гликолипида, сфинголипида и жирной кислоты.

Диацильная хвостовая часть гликолипида может быть важной в определении скорости встраивания. Некоторые диацильные хвостовые части могут сохранять более высокую текучесть при более низких температурах. В альтернативном случае, домен мембраны плазмы, в который диацильный хвост этих гликолипидов встраивается, может сохранять эту более высокую текучесть.

Известно, что сфинголипидные хвосты природных гликолипидов скапливаются в жестких доменах и эти домены могут не позволить дальнейшее включение гликолипида при низких температурах. Синтетические гликолипиды с цис-ненасыщенными диацильными хвостами могут быть благоприятными для применения.

Впервые была оценена трансформация RBC синтетическими гликолипидами с различными липидными хвостами (табл. 22 и 24).

Таблица 23Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 24-27

Таблица 24Оценка встраивания различных липидных хвостов агглютинацией приемлемыми антисыворотками

* - сплаттер

Затем оценивали трансформацию RBC синтетическими гликолипидами А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при 4 °С (табл. 25-28). Эти трансформации были направлены на получение клеток, экспрессирующих низкие уровни гликотопов А, В или А и В ( «слабые клетки для А, В и АВ »).

Для получения «слабых клеток для А и В » растворы для трансформации (20 мкл А _три -sp-Ad-DOPE (I) при 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл и В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6, 0,3, 0,15, 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл) в 1 ×PBS смешивали с промытой эритроцитарной массой RBC группы О (60 мкл).

Для получения «слабых клеток для АВ » растворы для трансформации (20 мкл А _три -sp-Ad-DOPE (I) при 0,07, 0,06 и 0,05 мг/мл и В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при 0,3 и 0,2 мг/мл) в 1 ×PBS смешивали с промытой эритроцитарной массой RBC группы О (60 мкл). Комбинациями были

Клетки и растворы для трансформации помещали в холодильник при 4 °С. Смешивание пипеткой проводили с интервалами. Клетки удаляли для тестирования через интервалы времени против подходящих антисывороток и тестировали как в промытых, так и непромытых состояниях (т.е. промытые образцы имели удаленный раствор для трансформации).

Спустя 48 ч к клеткам добавляли Celpresol ™, так чтобы конечное отношение клетки:неклетки было 3:5 (об./об.). Клетки продолжали тестировать через интервалы времени. Тестирование прерывали через 10 дней, так как клетки становились коричневыми.

Это изменение цвета может быть приписано ряду факторов, включающих в себя следующие факторы: клетки были уже возраста 21 дня, когда их трансформировали; 48-часовая трансформация была в PBS, но не в Celpresol ™, поэтому клетки в течение этого времени подвергались стрессу; и с клетками могли неправильно обращаться при транзите между лабораториями трансформации и тестирования. Это можно уменьшить трансформацией клеток в Celpresol ™, в противоположность PBS.

Таблица 25Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией А, трансформированных при 4 °С против анти-А

Таблица 26Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией В, трансформированных при 4 °С против анти-В

Таблица 27Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией АВ, трансформированных при 4 °Св блок-титре против анти-А

Таблица 28Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией АВ, трансформированных при 4 °Св блок-титре против анти-В

Пример 4. Эффективность трансформации RBC встраиванием синтетических гликолипидов А _три -sp-Ad-DOPE (I) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI).

Растворы-супернатанты после трансформации (из А _три -sp-Ad-DOPE (I) при 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,3 мг/мл и В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли неразбавленными и при разведении 1:2 к промытой, эритроцитарной массе RBC (60 мкл). Пробирки инкубировали при 37 °С на водяной бане в течение 1 ч, причем перемешивание проводили каждые 15 мин.

Трансформированные RBC промывали 3 ×PBS и затем суспендировали в Cellstab ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.

Таблица 29Пробирочный серологический тест

Оценка в баллах, проведенная с раствором-супернатантом после трансформации (из раствора перед трансформацией 0,08 мг/мл), не является одинаковой с оценкой в баллах раствора для трансформации 0,3 мг/мл при первом пассаже (w+). Эти результаты указывают, что > 75% молекул встраивается в мембраны RBC при первом пассаже.

Кроме того, растворы после трансформации концентрировали 20 × и сравнивали соответственно с растворами трансформации известной концентрации. Тестировали только растворы после трансформации, полученные из растворов 0,08 мг/мл А _три -sp-Ad-DOPE (I) и 0,6 мг/мл В _три -sp-Ad-DOPE (VI).

Растворы после трансформации (20 мкл) диализовали (размер пор 500 Да) против деионизированной воды в течение 2 дней. Образцы оставляли для сушки в вытяжном шкафу в течение 10 дней. В конце этого времени их переносили в колбу роторного испарителя и устанавливали на роторный испаритель для вращения при включении вакуума с нагреванием на протяжении ночи.

Образцы сушили на водяной бане при 40 °С и промывали в меньшие сосуды смесью 2:1 хлороформ-метанол, получая оставшиеся значительные количества высушенного клеточного материала. Промывочные растворы хлороформ-метанол, 2:1, сушили, промывали снова в тест-пробирки смесью 2:1 хлороформ-метанол и сушили. Эти образцы снова растворяли в 1 мл 1 ×PBS и применяли для экспериментов по трансформации. Клеточный материал на дне склянок промывали водой в другой набор пробирок.

Растворы после трансформации (из А _три -sp-Ad-DOPE (I) при 0,08 мг/мл и В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли к промытой, эритроцитарной массе RBC (60 мкл). Параллельно растворы для трансформации (А _три -sp-Ad-DOPE (I) при 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,03 мг/мл и В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли к высушенной, эритроцитарной массе RBC (60 мкл).

Пробирки инкубировали на водяной бане при 37 °С в течение 1 ч, причем перемешивание проводили каждые 15 мин. Трансформированные RBC промывали 3 ×PBS и затем суспендировали в Cellstab ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.

Таблица 30Серология Diamed

Эти результаты позволяют предположить, что имеется недостаточное число молекул в растворе после трансформации, даже когда концентрация 20 ×, чтобы быть детектированными серологией.

Пример 5. Трансформация мышиных RBC синтетическим гликолипидом Н _три -sp-Ad-DOPE (VII).

Мышиные клетки трансформировали при 37 °С в течение 1 ч.

Таблица 31Реагенты анти-Н, применяемые для получения результатов, приведенных в табл. 32 и 33

Таблица 32Пробирочная серология

Таблица 33Diamed

Пример 6. Трансформация RBC фильтрованным синтетическим гликолипидом А _три -sp-Ad-DOPE (I).

Некоторое количество А _три -sp-Ad-DOPE (I) фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Для исследования того, будет ли трансформация одинаковой, с этим продуктом проводили сравнительный опыт.

Таблица 34Анти-А, применяемая для получения результатов, представленных в табл. 35

Таблица 35Колоночная агглютинация RBC А, трансформированных с варьируемыми концентрациями фильтрованного в стерильных условиях Атри-sp-Ad-DOPE (I) по сравнению с нефильтрованным Атри-sp-Ad-DOPE (I)

Эти результаты не показывают значительное различие между двумя препаратами А _три -sp-Ad-DOPE (I) и позволяют предположить, что фильтрование через фильтр 0,2 мкМ не удаляет молекулы или не изменяет состав или свойства жидкости до точки, которая влияет на трансформацию.

Пример 7. Хранение трансформированных клеток.

Для исследования того, изменяет ли хранение при 4 или 37 °С результаты агглютинации трансформированных А _три -sp-Ad-DOPE (I) и природным гликолипидов О RBC, идентифицированные как клетки «син-А » и «прир-А » соответственно, эти клетки делили на две части и суспендировали до 5% в Cellstab ™.

Одну партию клеток хранили при 4 °С и другую партию хранили при 37 °С на водяной бане. Оценивали агглютинацию трансформированных клеток после хранения (табл. 36).

Таблица 36

Пример 8. Трансформация RBC синтетическими А- и В-антигенными гликолипидами с разными неуглеводными структурами.

Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные А _три -sp-Ad-DOPE (I), А _три -sp ₁ sp ₂ -Ad-DOPE (II), А _три -sp-Ad-DSPE (III) и В _три -sp-Ad-DOPE (VI), получали согласно методу, описанному в примере 1 с необходимыми модификациями.

Промытую эритроцитарную массу эритроцитов (RBC) группы О (3 об.ч.) и раствор синтетического гликолипида (1 об.ч., варьируемые концентрации) добавляли в пробирку Эппендорфа. Пробирку инкубировали на водяной бане при 37 °С в течение 1 ч, перемешивая содержимое каждые 15 мин. Трансформированные RBC промывали 3 ×PBS и затем суспендировали в Cellstab ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.

Результаты пробирочного серологического теста и Diamed гель-карт для RBC, трансформированных различными синтетическими молекулярными конструкциями, представлены в табл. 38.

Результаты стабильности RBC, трансформированных различными синтетическими гликолипидами при различных концентрациях, представлены в табл. 39-44.

Таблица 37Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 38-44

Таблица 38Сравнение трансформации RBC при применении А-антигенных синтетическихгликолипидов при разных концентрациях

Аббревиатура: н.о. - не определяли

Таблица 39Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией

Аббревиатура: - сплаттер

Таблица 40Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при низких концентрациях (0,1, 0,05 и 0,025 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией

Аббревиатура: не определяли,

⁰ -сплаттер

Таблица 41Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли на Diamed гель-картах

Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали.

Таблица 42Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при низких концентрациях (0,1, 0,05 и 0,025 мг/мл). Агглютинацию определяли на Diamed гель-картах

Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали.

Таблица 43Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (VI) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией

Аббревиатуры: ⁰ - сплаттер

Таблица 44Исследование стабильности RBC, трансформированных Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при высоких концентрациях (1, 0,5 и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли на Diamed гель-картах

Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали.

Пример 9. Трансформация эритроцитов Н-антигенными синтетическими гликолипидами.

Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные Н _три -sp-Ad-DOPE (VII), Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII) и Gal β-sp-Ad-DOPE (IX), получали согласно методу, описанному в примере 1, с необходимыми модификациями.

Промытую эритроцитарную массу мышиных RBC (3 об.ч.) и растворы синтетических гликолипидов (1 об.ч. варьирующихся концентраций) добавляли к пробирке Эппендорфа. Пробирку инкубировали на водяной бане при 37 °С в течение 1 ч, перемешивая каждые 15 мин. Трансформированные RBC промывали 3 ×РВС и затем суспендировали в Cellstab ™ при концентрации, подходящей для серологического тестирования.

Результаты пробирочной серологии и анализа на Diamed гель-картах для RBC, трансформированных различными синтетическими гликолипидами, представлены в табл. 46. Результаты показывают, что три сахара (Н _три ) требуется для детектирования анти-Н IgM, по меньшей мере, применяемым реагентом.

Таблица 45Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 46

Таблица 46Сравнение трансформации RBC с применением Н-антигенных синтетических гликолипидов с различными гликотопами, приготовленными при различных концентрациях

Аббревиатура: н.о. - не определяли

Пример 10. Встраивание синтетических липидов Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII) и Gal β-sp-Ad-DOPE (IX) в мышиные эритроциты.

Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII) и Gal β-sp-Ad-DOPE (IX), получали согласно методу, описанному в примере 1, с необходимыми модификациями.

Мышиные RBC промывали 3 × в 1 ×PBS. 30 мкл эритроцитарной массы RBC смешивали с 30 мкл Н _ди -sp-Ad-DOPE (VIII) и 30 мкл эритроцитарной массы RBC смешивали с 30 мкл Gal β-sp-Ad-DOPE (IX) соответственно. Обе синтетические молекулярные конструкции применяли при концентрации 1,0 мг/мл. 30 мкл 1 ×PBS добавляли к 30 мкл эритроцитарной массы RBC для действия в качестве контрольной группы. Клетки инкубировали в течение 90 мин во встряхиваемой водяной бане при 37 °С. RBC промывали 3 × в 1 ×PBS.

Три группы эритроцитарной массы RBC инкубировали в равном объеме лецитина UEA-1 в течение 30 мин при комнатной температуре. Лецитин получали в 1 ×PBS при концентрации 1 мг/мл. 50 мкл 3% клеточной суспензии вращали в течение 15 с в иммунофуге при низкой скорости. Результаты считывали пробирочной серологией. Результаты представлены в табл. 48. Результаты показывают, что ни анти-Н IgM, ни UEA-1 не детектирует два сахара (Н _ди ).

Таблица 47Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 48

Таблица 48Мышиные RBC, трансформированные Gal β-sp-Ad-DOPE или Нди-sp-Ad-DOPE, оцененные агглютинацией

Аббревиатуры: и.о. - не определяли

Пример 11. Получение контролей чувствительности.

Синтетические гликолипиды изобретения можно применять при получении «контролей чувствительности » (называемых также «клетками контроля качества », «контролями серологии » или «контролями способа »), как описано в описании, прилагаемом к международной патентной заявке № PCT/NZ 02/00214 (WO 03/034074). Синтетические гликолипиды обеспечивают преимущество, состоящее в том, что трансформация RBC может быть достигнута при пониженных температурах.

Растворы для трансформации RBC.

Применяют два исходных раствора.

Раствор 1: 1 мг/мл А _три -sp-Ad-DOPE (I), суспендированного в растворе Celpresol ™.

Раствор 2: 5 мг/мл D _три -sp-Ad-DOPE (VI), суспендированного в растворе Celpresol ™.

Гликолипиды получали в виде белого сухого порошка. Гликолипиды в этой форме (заключенные в герметизированный контейнер при регулируемой температуре) являются стабильными в течение неограниченного периода времени. Гликолипиды суспендируют в растворе (например, Celpresol ™) по массе, чтобы приготовить растворы для трансформации.

После того как растворы для трансформации получают при CSL, их фильтруют (через фильтр 0,22 мк MILLEX ®-GV) в асептических условиях.

Процессинг RBC.

Доноров RBC обрабатывают с применением устройства-центрифуги для мойки с непрерывным потоком в асептических условиях. Доноров RBC промывают в забуференном солевом растворе, затем в растворе Celpresol ™. PCV доноров RBC измеряют на анализаторе Beckman Coulter АсТ Diff. Объем доноров затем регулируют до 50% объема эритроцитарной массы (PCV) добавлением Celpresol ™.

Трансформация RBC для получения «клеток со слабой экспрессией АВ ».

RBC промывают в буферном солевом растворе и Celpresol ™. Клетки суспендируют в растворе Celpresol ™ до > 50% PCV. PCV эритроцитов измеряют с применением Beckman Coulter AcT Diff. Массу раствора эритроцитов определяют взвешиванием.

Количество А _три -sp-Ad-DOPE (I), В _три -sp-Ad-DOPE (VI) и Celpresol ™ для трансформации вычисляют с применением следующих уравнений:

где а равно количеству А _три -sp-Ad-DOPE (I), которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл),

b равно количеству В _три -sp-Ad-DOPE (VI), которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл),

с равно количеству Celpresol ™, которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл), чтобы развести клетки до 50% PCV,

Р равно PCV раствора эритроцитов,

F равно конечной требуемой концентрации гликолипида,

S равно концентрации исходного раствора гликолипида.

Для определения количества гликолипида и Celpresol ™, которое нужно добавить к объемной массе образца эритроцитов, каждое из чисел а, b и с умножают на объем эритроцитов. К объемной массе образца в асептических условиях добавляют А _три -sp-Ad-DOPE (I), В _три -sp-Ad-DOPE (VI) и Celpresol ™.

Образец инкубируют в течение 3 ч при 20 °С в регулируемых температурных условиях и постоянном осторожном перемешивании. В конце периода 3 ч в асептических условиях отбирают образец эритроцитов и образец тестируют для подтверждения трансформации RBC. Определение группы крови проводят с применением методик пробирочной реакции агглютинации, агглютинации на керамической плитке или технологии колоночной агглютинации (CAT).

Образец эритроцитов инкубируют в течение 3 ч при 2-8 °С в регулируемых температурных условиях и постоянном осторожном перемешивании в течение 18 ч. В конце 3-часового периода в асептических условиях отбирают образец эритроцитов и образец тестируют для подтверждения трансформации эритроцитов. Определение группы крови проводят с применением пробирочной методики, методики на керамической плитке и CAT.

Трансформированные эритроциты промывают с применением метода центрифугирования с непрерывным потоком в асептических условиях и с применением раствора Celpresol ™. Измеряют PCV промытых эритроцитов и величину регулируют до 50% PCV добавлением раствора Celpresol ™.

Препарат и его распределение.

В асептических условиях объем трансформированных RBC объединяют с объемом имитирующей разбавитель плазмы (SPD). Плазма может содержать моноклональные и поликлональные антитела. Антитела выбирают согласно требуемым характеристикам контролей чувствительности. Плазма может дополнительно содержать тартразин и бычий сывороточный альбумин.

Определение группы и скрининг антител проводят на образцах массы с применением пробирочной методики, методики на керамической плитке и CAT. Затем смесь трансформированных RBC-SPD в асептических условиях распределяют в пробирки BD Vacutainer и пробирки соответственно метят.

Тестирование валидности.

Клетки со слабой экспрессией АВ, продуцированные с применением синтетических гликолипидов (обозначенных A _W B _W в табл. 51-53), применяли для обоснования диапазона платформ для тестирования параллельно с существующими в природе клетками со слабой экспрессией А, В и АВ.

Таблица 49Реагенты и карты, применяемые при валидации тестирования

Таблица 50Методология платформы тестирования для валидации тестирования

Таблица 51Результаты валидации всех методов против анти-А

Таблица 52Результаты валидации всех методов против анти-В

Таблица 53Результаты валидации всех методов против анти-АВ

Пример 12. Присоединение модифицированных эмбрионов к трансформированным эндометриальным клеткам.

Исследовали возможности осуществлять количественные и качественные различия в антигенах клеточной поверхности экспрессированными типами клеток, другими, чем RBC. Способность повышать адгезию эмбрионов к эндометриальным клеткам принимали как модельную систему.

Синтетические молекулы можно применять в качестве синтетических мембранных якорей и/или синтетических молекулярных конструкций. Следовательно, их можно применять также в способе повышения имплантации эмбрионов, как описано в международной патентной заявке № PCT/NZ 2003/000059 (опубликована как WO 03/087346), которая включена в качестве ссылки.

Трансформация эндотелиальных клеток.

Встраивание водорастворимой синтетической молекулярной конструкции.

Получали суспензию отдельных эндометриальных эпителиальных клеток. Эндометриальные клетки промывали 3 × ресуспендированием в CMF HBSS и центрифугированием при 2000 об./мин в течение 3 мин.

Препарат промытых клеток ресуспендировали в 50 мкл М2.

Получали пробирки микроцентрифуги, причем каждая из них содержала 50 мкл раствора 5М/мл эндометриальных клеток. К отдельным пробиркам эндометриальных клеток добавляли 50 мкл синтетических гликолипидов А _три -sp-Ad-DOPE (I) или В _три -sp-Ad-DOPE (VI) или 50 мкл М2 добавляли к контрольным клеткам. Клетки инкубировали в течение 90 мин при 37 °С на смесителе. Эндометриальные клетки промывали 3 × ресуспендированием в среде CMF HBSS и центрифугированием при 2000 об./мин в течение 3 мин. Препарат промытых клеток ресуспендировали в 50 мкл М2. Тест на встраивание с применением флуоресцентного зонда: 50 мкл соответствующего первичного мышиного моноклонального антитела добавляли к каждой пробирке. Каждую пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Клетки промывали 3 × в среде М2. 10 мкл мышиного анти-IgG FITC добавляли к каждой пробирке. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в темных условиях в течение 10 мин. Эндометриальные клетки помещали на предметные стекла и рассматривали под флуоресцентным микроскопом. Тест для прямой агглютинации: 5 мкл каждой группы клеток помещали на отдельные предметные стекла микроскопа. К каждой 5 мкл капле клеток добавляли 5 мкл соответствующего антитела. Клетки осторожно смешивали на предметном стекле в течение 2 мин. Агглютинацию визуально наблюдали под микроскопом. Результаты представлены в табл. 55.

Таблица 54Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в табл. 55

Таблица 55Эндометриальные клетки, трансформированные Атри-sp-Ad-DOPE (I) или Втри-sp-Ad-DOPE (VI),визуализируемые с применением флуоресценции

Модификация эмбриона.

Встраивание водорастворимой синтетической молекулярной конструкции.

Прозрачную зону эмбрионов удаляли обработкой эмбрионов 9,5% протаназой в термостате при 37 °С в течение 6 мин или до тех пор, пока не будут удалены все зоны. Микрокапли получали добавлением 5 мкл синтетического гликолипида А _три -sp-Ad-DOPE (I) или В _три -sp-Ad-DOPE (VI) при концентрации 1 мг/мл к 45 мкл капле среды М2, покрытой минеральным маслом. Все группы эмбрионов инкубировали в 50 мкл микрокапель в течение 1 ч при 37 °С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали 3 × средой М2.

Тест на встраивание.

Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп помещали в микрокаплю соответствующего антитела и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали 3 × средой М2.

Эмбрионы из всех экспериментальных и контрольных групп помещали в микрокапли антимышиного Ig FITC (разведение 1:50 антимышиного Ig FITC в М2) и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали 3 × средой М2. Эмбрионы помещали на предметные стекла микроскопа в 5 мкл каплю М2 и капли покрывали маслом.

Предметные стекла изучали под флуоресцентным микроскопом. Результаты представлены в табл. 56 и 57. Отрицательный результат для трансформации В _три -sp-Ad-DOPE (VI) относят к отсутствию чувствительности у антитела 1 °.

Таблица 56Эмбрионы, трансформированные Атри-sp-Ad-DOPE (I), визуализуемые с применением флуоресценции

Таблица 57Эмбрионы, трансформированные Атри-sp-Ad-DOPE (I) или Втри-sp-Ad-DOPE (VI),визуализуемые с применением флуоресценции

Аббревиатуры: н.о. - не определяли

Повышенное прикрепление трансформированных эндотелиальных клеток к модифицированным эмбрионам.

Модифицированные эмбрионы (BioG-Avidin-BiolgG ^B и BioG-Avidin-BiolgM ^A ) получали согласно методам, описанным в описании, сопровождающем международную патентную заявку № PCT/NZ 03/000059 (опубликована как WO03/087346).

Получали два вогнутых предметных стекла, одно с двумя лунками эндометриальных клеток, в которые встроен синтетический гликолипид А _три -sp-Ad-DOPE (I), и другое с двумя лунками эндометриальных клеток, в которые встроен синтетический гликолипид В _три -sp-Ad-DOPE (VI).

Две группы эмбрионов переносили в каждое из вогнутых предметных стекол.

Эмбрионы окружали эндометриальными клетками. Лунки покрывали минеральным маслом и инкубировали в течение 15 мин при 37 °С. С применением ручных пипеток с широким просветом каждую группу эмбрионов осторожно переносили в свежую каплю среды М2. Эмбрионы осторожно промывали. Эмбрионы осторожно переносили в 2 мкл среды М2 на маркированном предметном стекле микроскопа. Каждую каплю покрывали минеральным маслом.

Определяли число эндотелиальных клеток, прилипших к эмбрионам в каждой группе, под центральной плоскостью фокуса на микроскопе Olympus. Число клеток, прилипших к каждому эмбриону, регистрировали. Результаты представлены в табл. 58.

Таблица 58Эндотелиальные клетки, трансформированные Атри-sp-Ad-DOPE (I) или Втри-sp-Ad-DOPE (VI),и эмбрионы, модифицированные BioG-Avidin-BiolgGB или BioG-Avidin-BiolgMA.Оценка по прикреплению эндометриальных клеток к эмбрионам

Когда в предшествующем описании приведена ссылка на целые числа или компоненты, имеющие известные эквиваленты, то такие эквиваленты включены здесь как-будто указанные индивидуально.

Хотя изобретение было описано путем примеров и со ссылкой на возможные его варианты осуществления, должно быть понятно, что к ним могут быть сделаны усовершенствования и/или модификации, не выходящие за пределы объема или сущности изобретения.

Ссылки

Abe K., McKibbin J.M. & Hakomori S.L. (1983) The monoclonal antibody directed to difucosylated type 2 chain (Fucal →2Galj1 →4[Fucc1 →3]GlcNAc; Y determinant). J. Biol. Chem. 258: 11793-11797.

Adamany A.M., Blumenfeld O.O., Sabo В. & McCreary J. (1983) A carbohydrate structural variant of MM glycoprotein (glycophorm A). J. Biol. Chem. 258:11537-11545.

Blanchard D., Cartron J.P., Fournet B., Mountreuill J., van Halbeek H. & Vliegenthart J.F.G. (1983) Primary structure of the oligosaccharide determinant of blood group Cad specificity, J. Biol. Chem. 258:7691-7695.

Fukuda M., Dell A. & Fukuda M., (1984a) Structure of fetal lactosaminoglycan. The carbohydrate moiety of band 3 isolated from human umbilical cord erythrocytes. J. Biol. Chem. 259:4782-4791.

Fukuda M., Dell A., Oates J.E. & Fukuda M. (1984b) Structure of branched lactosaminoglycan, the carbohydrate moiety of band 3 isolated from adult human erythrocytes. J. Biol. Chem. 259:8260-3273.

Fukuda M., Lauffenberger M., Sasaki H., Rogers M.E. & Dell A., (1987) Structures of novel sialylated O-linked oligosaccharides isolated from human erythrocyte glycophorins. J. Biol. Chem. 262:11952-11957.

Fukuda M.N., Dell A., Oates J.E., Wu P., Klock J.C. & Fukuda M. (1985) Structures of glycosphingolipids isolated from human granulocytes. The presence of a series of linear poly-N-acetyllactosaminylceramide and its significance in glycolipids of whole blood cells. J. Biol. Chem. 260: 1067-1082.

Gillard B.K., Blanchard D., Bouhours J.F., Cartron J.P., van Kuik J.A., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. & Marcus D.M. (1988) Structure of a ganglioside with Cad blood group antigen activity. Biochemistry, 27: 4601-4604.

Hakomori S.I., Nudelman E., Levery S.B. & Kannagi R. (1984) Novel fucolipids accumulating in human adenocarcinoma. I. Glycilipids with di- or trifucosylated type 2 chain. J. Biol. Chem. 259; 4672-4680.

Hanfland P. (1975) Characterisation of В and H blood group active glycosphingolipids from human В erythrocyte membranes. Chem. Phys. Lipids. 15:105-124.

Hanfland P., Kordowicz M., Niermann H., Egge H., Dabrowski U., Peter-Katalinic J. & Dabrowski J. (1984) Purification and structures of branched blood-group-B-active glycosphingolipids from human erythrocyte membranes. Eur. J. Biochem. 145: 531-542.

Hanfland P., Kordowicz M., Peter-Katalinic J., Pfannschmidt G., Crawford R.J., Graham H.A. & Egge H. (1986) Immunochemistry of the Lewis blood-group system: isolation and structures of Lewis-c active and related glycosphingoliplds from the plasma of blood-group О Le(a-b-) nonsecretors. Arch. Biochem. Blophys. 246: 655-672.

Hiraiwa N., Tsuyuoka K., Li Y.T., Tanaka M., Seno T., Okubo Y., Fukuda Y., Imura H. & Kannagi R. (1990) Gangliosides and siatoglycoproteins carrying a rare blood group antigen determinant, Cad, associated with human cancers as detected by specific monoclonal antibodies. Cancer Res. 50: 5497-5503.

Kannagi R., Nudelman E., Levery S.B., & Hakomori S.I. (1982) A series of human srythrocytes glycosphingolipids reacting to the monoclonal antibody directed to a developmentally regulated antigen, SSEA-1. J. Biol. Chem. 257: 14865-14874.

Kewitz S., Grop H.J., Kosa R. & Roelcke D. (1995) Anti=Pr cold agglutinins recognise immunodominant α2,3- or α2,6-sialyl groups on glycophorins. Glycocon. J. 12: 714-720.

Koscielak J., Miller-Podraza H., Krauze R. & Piasek A. (1976) Isolation and characterisation of poly(glycosyl)ceramides (megaloglycolipids) with A, H, and I blood group activities. Eur. J. Biochem. 71:9-18.

Laine R.A. (1994) Invited commentary. Glycobiol 4: 759-767.

Lidowska E., Duk M. & Dahr W. (1980) Comparison of alkali-labile oligosaccharide chains of M and N blood-group glycopeptides from human erythrocyte membrane. Carbohydr. Res. 79: 103-113.

Lloyd K.O. & Kabat E.A. (1968) Immunochemical studies on blood groups. XLI. Proposed structures for the carbohydrate portions of blood group А, В, Н, Lewis ^a , and Lewis ^b substances. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 61: 1470-1477.

Lundblad A. (1977) Urinary glycoproteins, glycopeptides, and oligosaccharides. In: The Glycoconjugates Eds Horowitz M.I. & Pigman W. Vol 1: 441-458.

Magnani J.L., Nilsson B., Brockhaus M., Zopf D., Steplewski Z., Koprowski H. & Ginsburg V. (1986) A monoclonal antibody-defined antigen associated with gastrointestinal cancer is a ganglioside containing sialylated lacto-N-fucopentaose II. J, Biol. Chem. 257:14365-14369.

Nudelman E., Fukushi Y., Levery S.B., Higuchi T. & Hakomori S.I. (1986) Novel fucolipids of human adenocarcinoma: disialoyl Le ^a antigen (III ⁴ FucIII ⁴ NeuAclV ³ NeuAcLc ₄ ) of human colonic adenocarcinoma and the monoclonal antibody (FH7) defining this structure. J. Biol. Chem. 261:5487-5495.

Slomiany A., Zdebska E. & Slomiany B.L. (1984) Structures of the neutral oligosaccharides isolated from A-active human gastric mucin. J. Biol. Chem. 259:14743-14749.

Takasaki S., Yamashita K. & Kobata A. (1978) The sugar chain structures of ABO blood group active glycoproteins obtained from human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem, 253: 6086-6091.

Tanaka M., Dube V.E. & Anderson B. (1984) Structures of oligosaccharides cleaved by base-borohydride from an I, H, and Le ^a active ovarian cyst glycoprotein. Biochim. Biophys. Acta. 798: 283-290.

Thomas D.B. & Winzler R.J. (1969) Structural studies on human erythrocytes glycoprotein. Alkali-labile oligosaccharides. J. Biol: Chem, 244: 5943-5946.

Watkins W.M. (1966) Blood group substances. Science. 152:172-181.

Yoshima H., Furthmayr H. & Kobata A. (1980) Structures of the asparagine-linked sugar chains of glycophorin A. J. Biol. Chem. 255: 9713-9718.