Изобретение относится к новым производным бетулиновой кислоты формулы (I), где R представляет собой С(=СН ₂ )СН ₃ или СН(СН ₃ ) ₂ ; R ₂ представляет собой -ОН или замещенный амин, где заместители выбирают из СН ₂ СООН, CH ₂ CO ₂ CH ₃ , C ₆ H ₅ CF ₃ , C ₆ H ₄ OCF ₃ , циклопропана и циклопентана; R ₃ и R ₄ представляет собой водород или фенил при условии, что оба независимо не означают водород или алкил, или R ₃ и R ₄ , соединенные вместе, образуют фенильное кольцо, необязательно замещенное группой X, где X выбирают из водорода, галогена, алкила и алкокси; Y означает N или О; и R ₁ отсутствует, когда Y является О; и R ₁ означает водород, алкил или фенилалкил, когда Y является N; пригодным для торможения роста раковых клеток.

[0001] Соединение формулы (I)

[0002] Соединение по п.1, где R означает С(=СН2)СН3; Y является N; R1 означает водород; R2 означает ОН; R3 и R4 соединены вместе с образованием фенильного кольца, которое замещается группой X; и X означает галоген.

[0003] Соединение по п.1, где R означает С(=СН2)СН3; Y означает N; R1 означает водород; R2 означает -NHCH2COOH; R3 и R4 соединены вместе с образованием фенильного кольца, которое замещается группой X; и X означает водород.

[0004] Соединение по п.1, где указанное соединение формулы (I) выбирают из

[0005] Способ получения соединения формулы (I)

[0006] Способ получения соединения формулы (I)

[0007] Способ по п.6, где указанную реакцию осуществляют в присутствии или в отсутствии хлористо-водородной кислоты и в присутствии подходящих растворителей, выбранных из этанола, метанола и изопропанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

[0008] Способ получения соединения формулы (I)

[0009] Способ по п.8, где указанную реакцию осуществляют в присутствии или в отсутствии паратолуолсульфокислоты, и в отсутствие или в присутствии молекулярных сит, и в присутствии подходящего растворителя, например этанола, метанола и изопропанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

[0010] Способ получения соединения формулы

[0011] Способ по п.10, где указанную реакцию осуществляют в присутствии или в отсутствии растворителя при температуре, колеблющейся от 0 °С до комнатной температуры.

[0012] Способ получения соединения формулы (I)

[0013] Способ по п.12, где реакцию осуществляют в присутствии подходящих растворителей, выбранных из метиленхлорида, хлороформа, четыреххлористого углерода, ацетона и простого эфира, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

[0014] Способ получения соединения формулы (I)

[0015] Способ по п.14, где указанную реакцию осуществляют в присутствии подходящих растворителей, выбранных из тетрагидрофурана, этанола и метанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

[0016] Способ получения соединения формулы (I)

[0017] Способ по п.16, где реакцию осуществляют в присутствии подходящего растворителя, такого как гексаметилфосфорамид, при температуре, колеблющейся от 0 °С до комнатной температуры.

[0018] Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) по п.1 в присутствии подходящего фармацевтически приемлемого носителя, адъюванта или разбавителя, для лечения рака.

[0019] Способ лечения рака у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, как определено в п.18.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым производным бетулиновой кислоты формулы (I), проявляющим ингибирующее действие в отношении раковых клеток и, в частности, обладающим улучшенной фармакокинетикой по сравнению с бетулиновой кислотой.

Настоящее изобретение также относится к способу получения новых производных бетулиновой кислоты формулы (I).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим новые производные бетулиновой кислоты формулы (I) для лечения рака.

Предшествующий уровень техники

Соединение, 3 β-гидрокси-луп-20(29)-ен-28-овая кислота, обычно называемая как бетулиновая кислота и представленная формулой (II)

является природным пентациклическим тритерпеноидом (Journal of Applied Biomedicine, 2003, 1, 7-12), проявляющим пригодные биологические свойства, такие как противораковую, противовоспалительную, противовирусную, антисептическую, противомалярийную, сперматолитическую, противомикробную, противолейшманиозную, противоглистную и антифидентную активности.

Однако было обнаружено, что среди всех перечисленных выше активностей, бетулиновая кислота особенно проявляет противораковую активность и обладает анти-ВИЧ активностью (Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences, 2002, 24, 1031-1037).

Ранее бетулиновую кислоту рассматривали как цитотоксическое средство, специфическое для меланомы, однако недавние исследования указывают на то, что она имеет широкий спектр активностей, направленных против других типов раковых клеток (Drugs, 2004, 7(4), 359-373).

Бетулиновая кислота была выбрана NCI, США для программы Rapid Access to Intervention Development (RAID). Было показано, что бетулиновая кислота действует посредством индукции апоптоза независимо от статуса р-53 и CD-95 в клетках. Некоторые экспериментальные сообщения указывают на то, что бетулиновая кислота функционирует через митохондриальный путь.

Фармакокинетика и тканевое распределение бетулиновой кислоты исследовали на мышах CD-1, однако для определения кинетических параметров бетулиновой кислоты требуется более детальное изучение (Biopharm. Drug Dispos., 1999, 20, 379-383). Недавнее исследование указывает на то, что хотя бетулиновая кислота имеет более низкую эффективность по сравнению с доксорубицином, но первая, по-видимому, является избирательной для опухолевых клеток, поскольку наблюдалась минимальная токсичность относительно нормальных клеток (Cancer Letters, 2002, 175, 17-25). Полученные данные и благоприятный терапевтический индекс, даже при дозе вплоть до 500 мг/кг веса тела, делают бетулиновую кислоту весьма многообещающим кандидатом для клинического лечения различных форм рака (Medicinal Research Reviews, 2004, 24(1), 90-114).

Поскольку бетулиновая кислота имеет перспективные возможности для лечения различных типов рака, исследование в недавнее время было направлено на синтез и отбор новых производных кислоты с целью выявления более эффективных соединений. Краткое изложение результатов, достигнутых с успехом в последнее время, приведено в тексте ниже.

Вначале следует упомянуть, что варианты различных заместителей у положений 2, 3, 20 и 28 молекулы бетулиновой кислоты формулы (II) являлись предметом всех исследований для получения эффективных конечных соединений, а именно патент US 6048847; патент US 6225353; патент US 6369109; патент US 6670345; международная публикация WO 98/51293; международная публикация WO 98/51294; международная публикация WO 02/16395; международная публикация WO 02/091858; патент US 03/0181429; патент US 03/0186945; патент US 6403816.

Недавно было сообщено, что изоксазоловые производные бетулиновой кислоты являются цитотоксическими средствами (Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 2003, 13, 3137-3140).

Даже если все вышеупомянутые сообщения вместе раскрывают огромное количество производных бетулиновой кислоты, причем подавляющее большинство из них, как было найдено, обладает противоопухолевой активностью, все же вследствие различных причин они не являются хорошими кандидатами, а также клинически не обладают наилучшими из фармакокинетических свойств.

Данные, полученные в лаборатории авторов изобретения, показывают, что из всех производных бетулиновой кислоты, описанных в тексте выше, одна из молекул, раскрытая в патенте US 6403816 и обозначенная как MJ1098-RS формулы (III) проявляет хорошую цитотоксичность in vitro в различных линиях раковых клеток. Патент US 6670345 также описывает соединение формулы (III), действие которого приводит к уменьшению опухоли на моделях ксенотрансплантата мыши.

Исходя из вышеизложенного, следует, что имеется потребность в новых производных бетулиновой кислоты, которые являются не только эффективными, но также клинически безопасными и, кроме того, проявляют наилучшие фармакокинетические свойства.

При попытке выявить молекулы, которые являются не только терапевтически эффективными, но и клинически приемлемыми, авторы изобретения обнаружили, что замещения у С-2 и С-3 положений бетулиновой кислоты формулы (II) гетероциклом, конденсированным с указанными положениями, придают желаемые характеристики, которые составляют основу настоящего изобретения.

Цели настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление новых производных бетулиновой кислоты, проявляющих противоопухолевую активность.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление новых производных бетулиновой кислоты, которые являются не только терапевтически эффективными, но также обладают улучшенной фармакокинетикой.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способов получения новых производных бетулиновой кислоты.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей новые производные бетулиновой кислоты, для лечения рака.

Сущность изобретения

Пытаясь решить поставленные задачи, авторы настоящего изобретения обнаружили, что новый класс производных бетулиновой кислоты может быть получен путем замещения у С-2 и С-3 положений бетулиновой кислоты формулы (II) гетероциклом, конденсированным с указанными положениями.

В частности, было обнаружено, что С-2 и С-3 положения бетулиновой кислоты формулы (II), замещенные посредством конденсации кольца у указанных С-2 и С-3 положений с пятичленным гетероциклом, обеспечивают получение новых соединений, представленных формулой (I), которые проявляют благоприятную противораковую активность. Указанные производные являются новыми, и до сих пор о них не было сообщений.

Среди большого числа таких соединений формулы (I) их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, их изомеры, полиморфы, N-оксид или метаболиты, где

R представляет собой С(=СН ₂ )СН ₃ или СН(СН ₃ ) ₂ ; R ₂ представляет собой -ОН или замещенный амин, где заместители выбирают из СН ₂ СООН, СН ₂ СО ₂ СН ₃ , C ₆ H ₅ CF ₃ , C ₆ H ₄ OCF ₃ , циклопропана и циклопентана; R ₃ и R ₄ представляет собой водород или фенил при условии, что оба независимо не означают водород или алкил, или R ₃ и R ₄ , соединенные вместе, образуют фенильное кольцо, необязательно замещенное группой X, где X выбирают из водорода, галогена, алкила и алкокси; Y означает N или О; и R ₁ отсутствует, когда Y является О; и R ₁ означает водород, алкил или фенилалкил, когда Y является N; и являются защищенными, в частности одно из соединений, обозначенное как соединение 5, по всему описанию, как было найдено, проявляет значительную эффективность, т.е., существенно улучшенную противораковую активность по сравнению с бетулиновой кислотой формулы (II), и сопоставимую эффективность с MJ-1098-RS формулы (III). Данные сравнения противораковой активности соединения 5 с такой же активностью бетулиновой кислоты (II) и MJ-1098-RS (III) представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение величин IC50 цитотоксичности in vitro производного бетулиновой кислоты (соединение 5) с бетулиновой кислотой (II) и MJ-1098-RS (III)

Кроме того, было обнаружено, что соединение 5 проявляет значительно превосходящие бетулиновую кислоту (II) фармакокинетические свойства и сравнимые свойства со свойствами соединения MJ-1098-RS (III), что отражено в табл. 2.

Таблица 2. Сравнение фармакокинетических свойств соединения 5 со свойствами бетулиновой кислоты (II) и MJ-1098-RS (III)

Фармакокинетические параметры указывают на то, что аналог бетулиновой кислоты MJ-1098-RS (III) и соединение 5 оказывают наилучшее системное воздействие (AUC _0- ∞) и имеют меньшую скорость элиминации (К _эл ) по сравнению с бетулиновой кислотой. Полученные данные свидетельствуют о том, что указанные соединения будут иметь лучший терапевтический ответ по сравнению с бетулиновой кислотой.

Характерные соли соединений формулы (I) включают, но не ограничиваются следующими солями: ацетатом, аскорбатом, бензоатом, цитратом, оксалатом, стеаратом, трифторацетатом, сукцинатом, тартратом, лактатом, фумаратом, глюконатом, глутаматом, фосфатом/дифосфатом и валератом. Другие соли включают в себя соли Са, Li, Mg, Na и K, галоидные соединения, соли аминокислот, таких как лизин или аргинин; гуанидин, аммоний, замещенные аммониевые соли или соли алюминия.

Фармацевтические композиции, содержащие соединения формулы (I), их соли и т.д., как было найдено, являются пригодными для подавления роста раковых клеток у человека. В частности, было обнаружено, что фармацевтические композиции являются пригодными для лечения человека, млекопитающих или других объектов, страдающих от рака или других опухолей.

Типичные представители соединений, которые описаны формулой (I), приведены в табл. 3.

Таблица 3. Типичные представители соединений, описанных формулой (I)

Улучшенные профиль цитотоксичности и фармакокинетические свойства данных соединений делают новые производные бетулиновой кислоты формулы (I) согласно изобретению превосходными кандидатами для лечения рака.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет новые производные бетулиновой кислоты формулы (I), оказывающие подавляющее действие на рост раковых клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет соединение формулы (I), которое обладает улучшенной фармакокинетикой по сравнению с бетулиновой кислотой формулы (II) и сопоставимой с соединением MJ-1098-RS формулы (III) фармакокинетикой.

В еще другом аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ получения новых производных бетулиновой кислоты формулы (I).

В другом аспекте, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую соединения формулы (I), для лечения рака.

Подробное описание изобретения

Соединения формулы (I) могут быть получены из бетулоновой кислоты формулы (IV) или 20,29-дигидробетулоновой кислоты формулы (V).

Исходные соединения формул (IV) и (V) могут быть получены согласно способу, описанному в патенте US 6670345.

Соединения № 1-10, 30 и 31, приведенные в табл. 3, могут быть получены путем взаимодействия бетулоновой кислоты формулы (IV) или 20,29-дигидробетулоновой кислоты формулы (V) с соответствующими гидразинами или с их хлористо-водородной солью. Реакцию можно осуществлять в присутствии или отсутствие хлористо-водородной кислоты и в присутствии подходящих растворителей, например, этанола, метанола и изопропанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

Соединения № 11, 12, приведенные в табл. 3, могут быть получены путем взаимодействия бетулоновой кислоты формулы (IV) или 20,29-бетулоновой кислоты формулы (V) с соответствующим O-фенилгидроксиламином или с его хлористо-водородной солью. Реакцию можно осуществлять в присутствии или отсутствие хлористо-водородной кислоты и в присутствии подходящих растворителей, например, этанола, метанола и изопропанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

Соединение № 13 из табл. 3 может быть получено путем взаимодействия бетулоновой кислоты формулы (IV) с соответствующими аминами и соответствующими Р-нитростиролами. Реакцию можно осуществлять в присутствии или отсутствие паратолуолсульфокислоты и в отсутствие или присутствии молекулярных сит и в присутствии подходящего растворителя, например этанола, метанола и изопропанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

Соединения № 15-19 из табл. 3 могут быть получены путем взаимодействия соединения № 14 с подходящими галоидными соединениями. Реакцию можно осуществлять в присутствии подходящего основания, например карбоната калия или триэтиламина, и в присутствии подходящего растворителя, например ацетона и простого эфира, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

Соединение № 20 может быть получено путем взаимодействия соединения № 14 с оксалилхлоридом. Реакцию можно осуществлять в присутствии или отсутствие растворителя при температуре, колеблющейся от 0 °С до комнатной температуры.

Соединения № 21, 23, 25-27 и 32-35, приведенные в табл. 3, могут быть получены путем взаимодействия соединения № 20 с подходящими аминами. Реакция может быть осуществлена в присутствии подходящих растворителей, например метиленхлорида, хлороформа, четыреххлористого углерода, ацетона и простого эфира, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

Соединения № 22 и 24 могут быть получены путем взаимодействия соединения № 21 и 23 с водным раствором гидроксида натрия, соответственно. Реакция может быть осуществлена в присутствии подходящих растворителей, например тетрагидрофурана, этанола и метанола, при температуре, колеблющейся от 0 до 100 °С.

Соединения № 28 и 29, приведенные в табл. 3, могут быть получены путем взаимодействия соединения № 23 и 21 с бензилбромидом и гидразидом натрия, соответственно. Реакция может быть осуществлена в присутствии подходящих растворителей, например, гексаметилфосфорамида, при температуре, колеблющейся от 0 °С до комнатной температуры.

Способы получения соединений от 1 до 35, приведенных в табл. 3, суммированы на схемах 1, 2 и 3.

Схема 1

Схема 2

Схема 3

Из представленных данных следует, что производные бетулиновой кислоты формулы (I) (соединения 1-13, 30 и 31) согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы путем последовательных реакций, как показано на схеме 1, в то время как некоторые производные бетулиновой кислоты формулы (I) (соединения 15-29 и 32-35) согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы путем последовательных реакций, описанных на схемах 2 и 3.

Фармацевтически приемлемые соли, фармацевтически приемлемые сольваты, их изомеры, полиморфы, N-оксиды и метаболиты указанных производных могут быть получены способами, известными в данной области.

Синтез соединений формулы (I) также описан в следующих примерах, которые не должны рассматриваться, как ограничивающие объем изобретения.

Бетулиновая кислота (II) была приобретена в Dabur Pharma Ltd. Kalyani, WB, India. Растворители и реагенты были закуплены у различных компаний, таких как Aldrich, Lancaster, Acros, Rankem, Qualigens Fine Chemicals, Spectrochem, SD Fine Chem и Merck, и использованы как таковые. Все производные бетулиновой кислоты были очищены колоночной хроматографией с использованием силикагеля (100-200 меш) в качестве адсорбента и системы растворителей дихлорметан/метанол или гексан/этилацетат в качестве элюента. Данные ТСХ (R _f величины) были получены с помощью алюминиевых пластин, покрытых силикагелем 60 F ₂₅₄ (Merck). Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) записывали на приборе Bruker 300 MHz, используя тетраметилсилан (ТМС) в качестве внутреннего стандарта. Масс-спектры записывали на приборе Micromass Quattro micro ™. Чистоту производных бетулиновой кислоты определяли с помощью прибора ВЭЖХ Shimadzu LC-2010 С НТ, используя систему градиента. Точки плавления определяли в капиллярных трубках с помощью теплового аппарата МР-1 для измерения точки плавления и не корректировали.

Следующие сокращения использовали в настоящем изобретении:

pTSA (пара-толуолсульфокислота),

DCM (дихлорметан илиметиленхлорид),

CHCl ₃ (хлороформ),

EtOAc (этилацетат),

МеОН (метанол),

EtOH (этанол),

THF (тетрагидрофуран),

NaOH (гидроксид натрия),

Na ₂ CO ₃ (карбонат натрия),

K ₂ CO ₃ (карбонат калия) и

Na ₂ SO ₄ (сульфат натрия).

Исходный материал бетулоновую кислоту (IV) и 20,29-дигидробетулоновую кислоту (V) синтезировали из бетулиновой кислоты и 20,29-дигидробетулиновой кислоты, соответственно, как описано в патенте US 6670345.

Пример 1. Общая процедура синтеза соединений, описанных формулой I (соединения № 1-12, 30 и 31):

Бетулоновую кислоту (IV) или 20,29-дигидробетулоновую кислоту (V) (1 экв.) и соответствующий гидразин или его хлоргидрат (1,1 экв.) растворяли в растворителе этаноле. К раствору добавляли 2-3 капли 3N HCl и кипятили с обратным холодильником в течение 6-9 ч. Затем, растворитель удаляли в вакууме, и остаток экстрагировали водой и EtOAc или DCM. Органический слой отделяли, сушили над Na ₂ SO ₄ и затем упаривали с получением сырого продукта. Продукт очищали на колонке, используя в качестве элюента DCM или смесь DCM/MeOH или EtOAc/гексан.

Пример 2. Общая процедура синтеза соединений, описанных формулой I (соединение № 13).

К раствору бетулоновой кислоты (IV) или 20,29-дигидробетулоновой кислоты (V) (1 экв.) в растворителе этаноле добавляли амин (1,1 экв.), моногидрат паратолуолсульфокислоты (каталитическое количество) и молекулярные сита. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. Затем ее охлаждали и добавляли соответствующий β-нитростирол (1 экв.). Смесь кипятили с обратным холодильником в течение дополнительных 7 ч. Затем ее охлаждали и фильтровали. Растворитель упаривали в вакууме и полученный остаток промывали гексаном. Продукт очищали на колонке, используя в качестве элюента DCM или смесь DCM/MeOH или EtOAc/гексан.

Пример 3. Общая процедура синтеза соединений, описанных формулой I (соединения № 15-19).

Смесь соединения 14 (1 экв.) и K ₂ CO ₃ (1,5 экв.) в растворителе ацетоне перемешивали в течение 30 минут. Соответствующий бромид или хлорид (2,5 экв.) добавляли, и смесь перемешивали в течение ночи. Бромид или хлорид (1,5 экв.) вновь добавляли и перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали в вакууме, и полученный остаток промывали водой и гексаном. Затем, остаток экстрагировали DCM. Органические слои объединяли, сушили над Na ₂ SO ₄ , и затем растворитель упаривали с получением неочищенного продукта. Продукт очищали на колонке, используя в качестве элюента DCM или смесь DCM/MeOH или EtOAc/гексан.

Пример 4. Общая процедура синтеза производных бетулоноилхлорида (соединение № 20).

Соединение 14 (1 экв.) растворяли в DCM и добавляли оксалилхлорид (1,5 экв.) и перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток промывали водой, обрабатывали водным раствором Na ₂ CO ₃ и экстрагировали DCM. Объединенные органические слои сушили над Na ₂ SO ₄ и затем упаривали в вакууме с получением производного бетулоноилхлорида 20, которое использовали на следующей стадии без очистки.

Пример 5. Общая процедура синтеза соединений, описанных формулой I (соединения № 21-27 и 32-35).

Амин (2 экв.) добавляли к раствору соответствующего производного бетулоноилхлорида 20 (1 экв.) в DCM и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем растворитель упаривали в вакууме, и полученный остаток промывали водой и гексаном. Остаток экстрагировали посредством DCM. Органические слои объединяли, сушили над Na ₂ SO ₄ , и затем растворитель упаривали с получением неочищенного продукта. Продукт очищали на колонке, используя в качестве элюента DCM или смесь DCM/MeOH или EtOAc/гексан.

Гидролиз соединений № 21 и 23 осуществляли, используя 4N водный раствор NaOH в смеси растворителей THF/MeOH (1:1) с получением соединений № 22 и 24, соответственно.

Пример 6. Общая процедура синтеза соединений, описанных формулой I (соединения № 28-29).

Гидрид натрия (NaH) (1,1 экв.) добавляли к раствору соединений № 23 или 21 в гексаметилфосфорамиде (НМРА) при 0 °С в атмосфере азота и перемешивали в течение 10 мин. Затем смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре. Бензилбромид (1 экв.) добавляли при 0 °С и перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды. Затем смесь разбавляли водой и экстрагировали посредством EtOAc. Органический слой объединяли, сушили над Na ₂ SO ₄ , и затем растворитель упаривали с получением неочищенного продукта. Продукт очищали на колонке, используя в качестве элюента DCM.

Спектральные характеристики различных соединений формулы (I), представленных в табл. 3, даны ниже.

2,3-Дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулиновая кислота (1).

R _f 0,72 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,69 (ушир.с, 1Н), 7,39-7,25 (м, 2Н), 7,12-7,02 (м, 2Н), 4,7 (ушир.с, 1Н), 4,64 (ушир.с, 1Н), 3,1-2,9 (м, 1Н), 2,83 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,28-1,98 (м, 4Н), 1,82-1,38 (м, 20Н), 1,27 (с, 3H), 1,16 (с, 3H), 1,03 (с, 6Н), 0,86 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 528 (100); чистота на основании ВЭЖХ 97,48%.

2,3-Дидегидро-20,29-дигидроиндоло[2', 3':2,3]бетулиновая кислота (2).

R _f 0,59 (2% МеОН/CHCl ₃ ); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,68 (ушир.с, 1Н), 7,42-7,40 (м, 1Н), 7,29-7,24 (м, 1Н), 7,13-7,03 (м, 2Н), 2,84 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,3-1,98 (м, 3H), 1,9-1,24 (м, 23Н), 1,15 (с, 3H), 1,02-0,85 (м, 12Н), 0,78 (д, 3H, J=6,7 Гц); МС m/z (% относительной интенсивности) 529 (100); чистота на основании ВЭЖХ 96,87%.

2,3-Дидегидро-1'-метилиндоло [ 2', 3': 2,3 ] бетулиновая кислота (3).

R _f 0,88 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,45-7,42 (м, 1Н), 7,29-7,17 (м, 2Н), 7,12-7,07 (м, 1Н), 4,83 (ушир.с, 1Н), 4,69 (ушир.с, 1Н), 3,86 (с, 3H), 3,2-3,05 (м, 1Н), 2,92 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,45-2,0 (м, 4Н), 1,98-1,44 (м, 23Н), 1,31 (с, 3H), 1,08 (с, 6Н), 0,91 (с, 3H), МС m/z (% относительной интенсивности) 540 (100); чистота на основании ВЭЖХ 94,94%.

2,3-Дидегидро-20,29-дигидро-1'-метилиндоло[2', 3':2,3]бетулиновая кислота (4).

R _f 0,83 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,45-7,43 (м, 1Н), 7,28-7,16 (м, 2Н), 7,11-7,06 (м, 1Н), 3,85 (с, 3H), 2,9 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,45-2,15 (м, 3H), 2,14-1,20 (м, 26Н), 1,08-0,83 (м, 12Н), 0,80 (д, 3H, J=6,6 Гц); МС m/z (% относительной интенсивности) 542 (100); чистота на основании ВЭЖХ 89,29%.

5'-Хлор-2,3-дидегидроиндоло [2', 3': 2,3] бетулиновая кислота (5).

R _f 0,62 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,73 (ушир.с, 1Н), 7,36 (с, 1Н), 7,07-7,06 (м, 1Н), 7,04-7,03 (м, 1Н), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,65 (ушир.с, 1Н), 3,14-3,0 (м, 1Н), 2,80 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,32-2,27 (м, 2Н), 2,2-1,99 (м, 3H), 1,77-1,26 (м, 22Н), 1,18 (с, 3H), 1,03 (с, 6Н), 0,85 (с, 3H);

MC m/z (% относительной интенсивности) 560 (100); чистота на основании ВЭЖХ 99,09%.

5'-Хлор-2,3-дидегидро-20,29-дигидроиндоло[2', 3':2,3]бетулиновая кислота (6).

R _f 0,9 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,66 (ушир.с, 1Н), 7,29 (д, 1Н, J=1,9 Гц), 7,13-7,10 (м, 1Н), 6,99-6,96 (м, 1Н), 2,70 (д, 1Н, J=15,1 Гц), 2,32-2,19 (м, 3H), 2,10-1,96 (м, 1Н), 1,85-1,68 (м, 2Н), 1,64-1,18 (м, 20Н), 1,09 (с, 3H), 0,94 (с, 6Н), 0,83-0,78 (м, 6Н), 0,71 (д, 3H, J=6,6 Гц); MC m/z (% относительной интенсивности) 562 (100); чистота на основании ВЭЖХ 98,38%.

2,3-Дидегидро-5'-фториндоло[2',3':2,3]бетулиновая кислота (7).

R _f 0,63 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,68 (ушир.с, 1Н), 7,20-7,15 (м, 1Н), 7,03-6,89 (м, 1Н), 6,87-6,80 (м, 1Н), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,64 (ушир.с, 1Н), 3,20-3,06 (м, 1Н), 2,74 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,36-2,19 (м, 2Н), 2,15-1,98 (м, 3H), 1,80-1,26 (м, 22Н), 1,17 (с, 3H), 1,03 (с, 6Н), 0,86 (с, 3H); MC m/z (% относительной интенсивности) 544 (100); чистота на основании ВЭЖХ 93,36%.

2,3-Дидегидро-5'-фтор-20,29-дигидроиндоло[2', 3':2,3]бетулиновая кислота (8).

R _f 0,82 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,68 (ушир.с, 1Н), 7,20-7,16 (м, 1Н), 7,06-7,02 (м, 1Н), 6,87-6,80 (м, 1Н), 2,76 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,30-2,10 (м, 4Н), 1,95-1,85 (м, 2Н), 1,80-1,25 (м, 20Н), 1,17 (с, 3H), 1,01 (с, 6Н), 0,90-0,87 (м, 10 6Н), 0,78 (д, 3H, J=6, 6 Гц); MC m/z (% относительной интенсивности) δ46 (100); чистота на основании ВЭЖХ 99,14%.

7'-Хлор-2,3-дидегидроиндоло[2', 3':2,3]бетулиновая кислота (9).

R _f 0,76 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,85 (ушир.с, 1Н), 7,28-7,26 (м, 1Н), 7,09 (д, 1Н, J=7,3 Гц), 7,0-6,95 (м, 1Н), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,64 (ушир.с, 1Н), 3,05-15 2,95 (м, 1Н), 2,79 (д, 1Н, J=15,1 Гц), 2,32-2,2 (м, 2Н), 2,18-1,98 (м, 3H), 1,90-1,33 (м, 13Н), 1,31-1,21 (м, 12Н), 1,03 (с, 6Н), 0,86 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 560 (100); чистота на основании ВЭЖХ 91,16%.

2,3-Дидегидро-5'-метоксииндоло [2',3':2,3]бетулиновая кислота (10).

R _f 0,3 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,50 (ушир.с, 1Н), 7,09 (д, 1Н, J=8,6 20 Гц), 6,78 (д, 1Н, J=2,3 Гц), 6,70-6,66 (м, 1Н), 4,70 (ушир.с, 1Н), 4,56 (ушир.с, 1Н), 3,76 (с, 3H), 3,1-2,9 (м, 1Н), 2,72 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,30-2,15 (м, 2Н), 2,09-1,85 (м, 3H), 1,80-1,25 (м, 13Н), 1,21-1,18 (м, 9Н), 1,09 (с, 3H), 0,96 (с, 6Н), 0,80 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 556 (100); чистота на основании ВЭЖХ 99,45%.

2,3-Дидегидробензфурано[2',3':2,3]бетулиновая кислота (11).

R _f 0,38 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,41-7,31 (м, 2Н), 7,19-7,15 (м, 2Н), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,64 (ушир.с, 1Н), 3,12-2,90 (м, 1Н), 2,70 (д, 1Н), 2,4-2,2 (м, 2Н), 2,19-1,98 (м, 3H), 1,90-1,25 (м, 22Н), 1,2 (с, 3H), 1,03 (с, 6Н), 0,89 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 527 (100); чистота на основании ВЭЖХ 93,83%.

2,3-Дидегидро-20,29-дигидробензфурано[2',3':2,3]бетулиновая кислота (12).

R _f 0,87 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,42-7,34 (м, 2Н), 7,20-7,16 (м, 2Н), 2,71 (д, 1Н, J=15,2 Гц), 2,35-2,10 (м, 3H), 2,0-1,2 (м, 26Н), 1,02-0,87 (м, 12Н), 0,78 (д, 3H, J=6,7 Гц); МС m/z (% относительной интенсивности) 529 (100); чистота на основании ВЭЖХ 90,89%.

1'-Бензил-2,3-дидегидро-20,29-дигидро-4'-фенилпирроло[2',3': 2,3]бетулиновая кислота (13).

R _f 0,75 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,37-7,28 (м, 8Н), 7,19-6,99 (м, 2Н), 6,63 (с, 1Н), 5,29 (ушир.с, 2Н), 2,79 (д, 1Н, J=14,6 Гц), 2,37-2,12 (м, 3H), 1,99-1,80 (м, 2Н), 1,78-0,79 (м, 39Н); МС m/z (% относительной интенсивности) 646 (100); чистота на основании ВЭЖХ 83,86%.

28-O-Бензил-2,3-дидегидро[2',3':2,3]индолобетулинат (15).

R _f 0,9 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,73 (ушир.с, 1Н), 7,40-7,28 (м, 6Н), 7,14-7,06 (м, 3H), 5,15 (дд, 2Н, J=12,3, 20,4 Гц), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,64 (ушир.с, 1Н), 3,10-3,07 (м, 1Н), 2,84 (д, 1Н, J=14,8 Гц), 2,4-2,0 (м, 3H), 1,98-1,29 (м, 24Н), 1,20 (с, 3H), 1,02 (с, 6Н), 0,87 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 618 (100); чистота на основании ВЭЖХ 94,56%.

28-O-Бензил-2,3-дидегидро-20,29-дигидро [2', 3': 2,3] индолобетулинат (16).

R _f 0,8 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,68 (ушир.с, 1Н), 7,34-7,19 (м, 6Н), 7,05-6,97 (м, 3H), 5,04 (дд, 2Н, J=12,3, 17,4 Гц), 2,85 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,48-2,30 (м, 3H), 2,02-1,20 (м, 23Н), 1,0 (с, 3H), 0,91-0,85 (м, 12Н), 0,79 (д, 3H, J=6,7 Гц); МС m/z (% относительной интенсивности) 620 (100); чистота на основании ВЭЖХ 97,8%.

28-O-Пивалоилоксиметил-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинат (17).

R _f 0,87 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,90 (ушир.с, 1Н), 7,42 (д, 1Н, J=7,0 Гц), 7,30 (д, 1Н, J=7,3 Гц), 7,16-7,06 (м, 2Н), 5,83 (дд, 2Н, J=5,4, 11,0 Гц), 4,81 (ушир.с, 1Н), 4,68 (ушир.с, 1Н), 3,08-3,05 (м, 1Н), 2,86 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,4-2,1 (м, 3H), 2,0-1,8 (м, 2Н), 1,75-1,22 (м, 34Н), 1,06 (с, 6Н), 0,90 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 664 (100), 642 (37); чистота на основании ВЭЖХ 92,19%.

28-O-Аллил-2,3-дидегидроиндоло[2', 3':2,3]бетулинат (18).

R _f 0,4 (20% EtOAc/гексан); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,71 (ушир.с, 1Н), 7,38-7,37 (м, 1Н), 7,3-7,28 (м, 1Н), 7,10-7,04 (м, 2Н), 6,0-5,9 (м, 1Н), 5,37-5,25 (м, 2Н), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,63-4,58 (м, 3H), 3,15-3,05 (м, 1Н), 2,83 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,45-2,05 (м, 3H), 2,0-1,8 (м, 2Н), 1,75-1,01 (м, 31Н), 0,86 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 566 (95), 113 (100); чистота на основании ВЭЖХ 100%.

28-O-Бензил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло [2',3':2,3]бетулинат (19).

R _f 0,5 (20% EtOAc/гексан); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,67 (ушир.с, 1Н), 7,30-7,25 (м, 6Н), 7,11-7,08 (м, 1Н), 6,98-6,94 (м, 1Н), 5,06 (дд, 2Н, J=12,3, 20,9 Гц), 4,68 (ушир.с, 1Н), 4,55 (ушир.с, 1Н), 3,10-2,90 (м, 1Н), 2,68 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,30-1,95 (м, 3H), 1,9-1,85 (м, 2Н), 1,75-1,0 (м, 25Н), 0,92 (с, 3H), 0,76-0,75 (м, 6Н); МС m/z (% относительной интенсивности) 650 (100); чистота на основании ВЭЖХ 100%.

28-N-Метилглицинат-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинамид (21).

R _f 0,53 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,69 (ушир.с, 1Н), 7,31 (д, 1Н, J=7,2 Гц), 7,21 (д, 1Н, J=7,7 Гц), 7,05-6,97 (м, 2Н), 6,01 (ушир.с, 1Н), 4,70 (ушир.с, 1Н), 4,55 (ушир.с, 1Н), 3,97-3,94 (м, 2Н), 3,69 (с, 3H), 3,2-3,0 (м, 1Н), 2,74 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,6-2,3 (м, 1Н), 2,2-1,8 (м, 3H), 1,78-1,70 (м, 2Н), 1,68-0,95 (м, 30Н), 0,78 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 621 (100), 599 (60); чистота на основании ВЭЖХ 93,43%.

28-N-Глицин-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинамид (22).

R _f 0,43 (7% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,70 (ушир.с, 1Н), 7,37 (д, 1Н, J=7,4 Гц), 7,30-7,27 (м, 1Н), 7,12-7,04 (м, 2Н), 6,13 (ушир.с, 1Н), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,62 (ушир.с, 1Н), 4,09-4,06 (м, 2Н), 3,15-3,12 (м, 1Н), 2,83 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,6-2,45 (м, 1Н), 2,2-1,88 (м, 3H), 1,85-1,70 (м, 2Н), 1,68-1,01 (м, 30H), 0,86 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 583 (100); чистота на основании ВЭЖХ 97,59%.

28-N-Метилглицинат-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло [2',3':2,3]бетулинамид (23).

R _f 0,5 (2% MeOH/DCM); ¹ Н ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,73 (ушир.с, 1Н), 7,32 (д, 1Н, J=1,7 Гц), 7,18 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 7,05-7,02 (м, 1Н), 6,06 (т, 1Н, J=5,0 Гц), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,63 (ушир.с, 1Н), 4,04-4,02 (м, 2Н), 3,76 (с, 3H), 3,25-3,1 (м, 1Н), 2,76 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,6-2,4 (м, 1Н), 2,15-1,95 (м, 3H), 1,9-1,75 (м, 2Н), 1,70-1,01 (м, 30H), 0,84 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 633 (100); чистота на основании ВЭЖХ 100%.

28-N-Глицин-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинамид (24).

R _f 0,31 (7% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,67 (ушир.с, 1Н), 7,25 (с, 1Н), 7,11 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 6,97-6,95 (м, 1Н), 6,2 (ушир.с, 1Н), 4,69 (ушир.с, 1Н), 4,55 (ушир.с, 1Н), 3,93 (ушир.с, 2Н), 3,2-2,95 (м, 1Н), 2,68 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,5-2,3 (м, 1Н), 2,25-1,85 (м, 5Н), 1,8-0,75 (м, 33H); МС m/z (% относительной интенсивности) 617 (100); чистота на основании ВЭЖХ 100%.

28-N-(2"-пиридин)-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло [2',3':2,3]бетулинамид (25).

R _f 0,7 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 8,18-8,15 (м, 2Н), 8,08 (ушир.с, 1Н), 7,76 (ушир.с, 1Н), 7,62 (т, 1Н, J=7,6 Гц), 7,26 (с, 1Н), 7,08 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 6,97-6,94 (м, 2Н), 4,72 (ушир.с, 1Н), 4,58 (ушир.с, 1Н), 3,2-3,05 (м, 1Н), 2,69 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,04-1,9 (м, 5Н), 1,87-1,09 (м, 25Н), 1,03 (с, 3H), 0,96-0,93 (м, 2Н), 0,76 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 638 (100); чистота на основании ВЭЖХ 95,81%.

28-N-(2"-тиазол)-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло [2',3':2,3]бетулинамид (26).

R _f 0,59 (2% MeOH/DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 9,9 (ушир.с, 1Н), 7,72 (ушир.с, 1Н), 7,45 (д, 1Н, J=3,4 Гц), 7,33 (с, 1Н), 7,17 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 7,05-6,97 (м, 2Н), 4,81 (ушир.с, 1Н), 4,66 (ушир.с, 1Н), 3,25-3,1 (м, 1Н), 2,76 (д, 1Н, J=14,8 Гц), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,25-1,8 (м, 5Н), 1,75-1,26 (м, 21Н), 1,17 (с, 3H), 1,04-0,97 (м, 6Н), 0,83 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 644 (100); чистота на основании ВЭЖХ 91,43%.

28-N-Пропаргил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2', 3':2,3]бетулинамид (27).

R _f 0,68 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,71 (ушир.с, 1Н), 7,33 (д, 1Н, J=1,5 Гц), 7,17 (д, 1Н, J=8,5 Гц), 7,05-7,02 (м, 1Н), 5,71 (ушир.с, 1Н), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,63 (ушир.с, 1Н), 4,08-4,0 (м, 2Н), 3,25-3,1 (м, 1Н), 2,76 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,6-2,45 (м, 1Н), 2,2-1,95 (м, 3H), 1,9-1,25 (м, 24Н), 1,18 (с, 3H), 1,02 (с, 6Н), 0,84 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 599 (100); чистота на основании ВЭЖХ 98,01%.

28-N-Глицин-1'-бензил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2', 3':2,3]бетулинамид (28).

R _f 0,5 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,73 (с, 1Н), 7,36-7,33 (м, 5Н), 7,18 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 7,05-7,02 (м, 1Н), 6,06 (т, 1Н), 5,.23-5,14, (м, 2Н), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,62 (ушир.с, 1Н), 4,08-4,06 (м, 2Н), 3,15-3,09 (м, 1Н), 2,76 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,56-2,49 (м, 1Н), 2,11-1,8 (м, 5Н), 1,64-0,99 (м, 31Н), 0,83 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 709 (20), 731 (100); чистота на основании ВЭЖХ 96,6%.

28-N-Глицин-1'-бензил-2,3-дидегидроиндоло[2', 3':2,3]бетулинамид (29).

R _f 0,6 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,71 (с, 1Н), 7,37-7,26 (м, 6Н), 7,12-7,02 (м, 2Н), 6,07 (ушир.с, 1Н), 5,19 (с, 2Н), 4,77 (ушир.с, 1Н), 4,62 (ушир.с, 1Н), 4,07 (д, 2Н, J=4,5 Гц), 3,15-3,1 (м, 1Н), 2,81 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,56-2,48 (м, 1Н), 2,13 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,0-1,79 (м, 4Н), 1,64-1,0 (м, 31Н), 0,85 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 675 (10), 697 (100); чистота на основании ВЭЖХ 98,6%.

2,3-Дидегидро-5',7'-дихлориндоло [2',3':2,3]бетулиновая кислота (30).

R _f 0,7 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,85 (ушир.с, 1Н), 7,25 (д, 2Н, J=3,0 Гц), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,65 (ушир.с, 1Н), 3,1-3,0 (м, 1Н), 2,74 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,32-2,23 (м, 2Н), 2,09 (д, 1Н, J=15,0 Гц), 2,04-1,97 (м, 2Н), 1,81 (д, 1Н, J=12,0 Гц), 1,64-1,25 (м, 22Н), 1,19 (с, 3H), 1,02 (с, 6Н), 0,84 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 594 (100); чистота на основании ВЭЖХ 91,6%.

2,3-Дидегидро-4',6'-дихлориндоло [2',3':2,3]бетулиновая кислота (31).

R _f 0,4 (20% EtOAc/гексан); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,79 (ушир.с, 1Н), 7,14 (с, 1Н), 6,98 (с, 1Н), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,64 (ушир.с, 1Н), 3,3 (д, 1Н, J=15,6 Гц), 3,1-3,0 (м, 1Н), 2,32-2,22 (м, 3H), 2,05-1,98 (м, 2Н), 1,79 (д, 1Н, J=12,6 Гц), 1,64-1,25 (м, 22Н), 1,17 (с, 3H), 1,02 (с, 6Н), 0,87 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 594 (100); чистота на основании ВЭЖХ 98,6%.

28-N-(4"-Трифторметил)фенил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинамид (32).

R _f 0,3 (20% EtOAc/гексан); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,72 (ушир.с, 1Н), 7,65-7,56 (м, 3H), 7,38 (с, 1Н), 7,33 (д, 1Н, J=1,8 Гц), 7,18 (д, 1Н, J=8,5 Гц), 7,06-7,02 (м, 1Н), 4,78 (ушир.с, 1Н), 4,66 (ушир.с, 1Н), 3,22-3,19 (м, 1Н), 2,79-2,66 (м, 2Н), 2,4-2,2 (м, 1Н), 2,2-1,8 (м, 5Н), 1,56-1,01 (м, 30H), 0,84 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 703 (100); чистота на основании ВЭЖХ 90%.

28-N-(4"-Трифторметокси)бензил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинамид (33).

Rf 0,8 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,68 (ушир.с, 1Н), 7,27-7,24 (м, 3H), 7,12-7,09 (м, 3H), 6,98-6,95 (м, 1Н), 5,89 (т, 1Н), 4,7 (ушир.с, 1Н), 4,56 (ушир.с, 1Н), 4,44-4,42 (м, 1Н), 4,3-4,28 (м, 1Н), 3,13-3,11 (м, 1Н), 2,69 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,5-2,3 (м, 1Н), 2,1-1,74 (м, 5Н), 1,57-1,1 (м, 24Н), 0,94 (с, 3H), 0,86 (с, 3H), 0,77 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 735 (55), 757 (100); чистота на основании ВЭЖХ 97,3%.

28-N-Циклопропил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2',3':2,3]бетулинамид (34).

R _f 0,3 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,71 (ушир.с, 1Н), 7,33 (с, 1Н), 7,18 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 7,05-7,02 (м, 1Н), 5,67 (ушир.с, 1Н), 4,76 (ушир.с, 1Н), 4,62 (ушир.с, 1Н), 3,21-3,18 (м, 1Н), 2,76 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,67-2,65 (м, 1Н), 2,53-2,51 (м, 1Н), 2,1-1,7 (м, 5Н), 1,55-1,01 (м, 30H), 1,0-0,8 (м, 6Н), 0,45-0,44 (м, 1Н); МС m/z (% относительной интенсивности) 601 (100); чистота на основании ВЭЖХ 98,1%.

28-N-Циклопентил-5'-хлор-2,3-дидегидроиндоло[2', 3':2,3]бетулинамид (35).

R _f 0,5 (DCM); ¹ H ЯМР (CDCl ₃ ) δ величины 7,66 (ушир.с, 1Н), 7,25 (д, 1Н, J=1,7 Гц), 7,11 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 6,98-6,95 (м, 1Н), 5,4 (д, 1Н, J=6,9 Гц), 4,7 (ушир.с, 1Н), 4,55 (ушир.с, 1Н), 4,15-4,09 (м, 1Н), 3,12-3,09 (м, 1Н), 2,68 (д, 1Н, J=14,9 Гц), 2,47-2,45 (м, 1Н), 2,05-1,7 (м, 5Н), 1,56-0,95 (м, 38Н), 0,77 (с, 3H); МС m/z (% относительной интенсивности) 629 (85), 651 (100); чистота на основании ВЭЖХ 97,5%.

Авторы изобретения осуществляли поиск по базе данных PubMed в Национальной библиотеке Медицины, чтобы убедиться в уместности использования клеточных линий для определения противораковой активности пептидов. В то время как клетки DU145 (предстательная железа человека) проявили 829 "попаданий" при исследовании рака, другие раковые клеточные линии человека, используемые авторами изобретения, также показали большое число попаданий (3047 для А549, 349 для РА-1 и 134 для Miapaca.2). Эти данные свидетельствуют о широком применении указанных клеточных линий в исследовании рака. Кроме того, такой подход является общей и стандартной практикой для испытания молекул на противораковую активность in vitro относительно клеточных линий опухолей человека (Br. J. Cancer, 2001 May 18; 84 (10):1289-90 (Flasks, Fibres and Flanks - Preclinical tumor model for predicting clinical antitumor activity). Авторы сообщают, что действие in vitro, оказываемое на 6 или более линий клеток рака легкого или молочной железы, дает необязательность прогнозировать активность ксенотрансплантата против указанных типов опухолей. В статьях "Semin Oncol 1992 Dec; 19(6):622-38 (The National Cancer Institute: cancer drug discovery and development program)" и "Jpn J Antibiot., 1911 Dec; 30 Suppl:35-40 (Antitumor screening procedures of the National Cancer Institute)" сообщают о широком использовании клеточных линий опухолей человека для идентификации эффективных цитотоксических лекарственных средств.

Цитотоксичность in vitro соединений формулы (I)

Ряд соединений, перечисленных в табл. 3, испытывали на цитотоксичность относительно клеточных линий опухолей предстательной железы, легкого, гортани, поджелудочной железы, молочной железы, ободочной кишки и яичника, лейкоза и лимфомы. Кратко, анализ цитотоксичности с помощью МТТ-теста осуществляли в течение 3 дней, который основан на принципе поглощения МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид), соли тетразолия, метаболически активными клетками, где указанное соединение претерпевает превращение в активных митохондриях в продукт формазан, окрашенный в голубой цвет, определяемый спектрофотометрически. МТТ растворяли в забуференном фосфатом физиологическом растворе при рН 7,4 с получением концентрации МТТ 5 мг/мл; полученную смесь фильтровали через фильтр 0,22 мкм для стерилизации и удаления небольшого количества нерастворимого остатка. Для каждого типа опухолевых клеток от 10000 до 15000 клеток помещали в 96-луночный планшет для культуры клеток и инкубировали с индивидуальными производными бетулиновой кислоты в инкубаторе с CO ₂ в течение 72 ч. Контрольные клетки, необработанные производными бетулиновой кислоты, инкубировали таким же образом. Анализ заканчивали путем добавления 100 мкг (20 мкл) МТТ к каждой ячейке, инкубирования в течение дополнительного одного часа и, наконец, добавления 50 мкл 10% SDS-0,01N HCl к каждой лунке для лизиса клеток и растворения формазана. После инкубации в течение одного часа планшет прочитывали спектрофотометрически при 540 нм, и процент цитотоксичности рассчитывали, используя следующую формулу:

процент цитотоксичности = 100 ×[1-(X/R1)],

где Х=(оптическая плотность обработанного образца при 540 нм)-(оптическая плотность контроля при 540 нм);

R ₁ =оптическая плотность контрольного образца при 540 нм.

Величины IC ₅₀ цитотоксичности, выражающие концентрацию, при которой 50% клеток погибает in vitro, рассчитывали для каждой линии клеток, обработанных любым из производных бетулиновой кислоты.

Величины IC ₅₀ цитотоксичности in vitro производных бетулиновой кислоты формулы (I) представлены в табл. 4.

Проверка цитотоксичности на клетках NIH 3T3

Цитотоксический эффект синтезированных соединений оценивали на клетках NIH 3T3 в культуре посредством определения метаболизма клеток с помощью ранее описанного МТТ-теста. Здоровые клетки NIH 3T3 (установленная линия клеток), поддерживаемые постоянно в культуре, делятся и размножаются в течение длительного времени. Основой данной проверки является то, что цитотоксическое действие соединений (независимо от участка или механизма действия) будет препятствовать этому процессу и, таким образом, приведет к снижению роста клеток, что отразится на количестве клеток. Степень торможения роста клеток, зависящая от концентрации испытуемого соединения, является показателем цитотоксичности.

Клетки NIH 3T3 поддерживали в культуре и подвергали воздействию испытуемых соединений, находящихся в широком диапазоне концентраций, и количество выживших клеток определяли после 72 ч воздействия с помощью МТТ-теста. Количество клеток в присутствии тестируемых соединений сравнивали с количеством клеток в контрольных культурах, и процент торможения роста клеток рассчитывали. Концентрацию IC ₅₀ (т.е. концентрация, производящая 50% торможения роста клеток) определяли и выражали в единицах мкг/мл. Отношение IC ₅₀ для клеток NIH 3T3 к этой величине для опухолевых клеток является показателем прогнозируемой токсичности молекулы и представляет собой "индекс безопасности". Чем выше величина, тем лучше предсказанная безопасность молекулы. В табл. 5 представлены величины IC ₅₀ , определенные для клеток NIH 3T3, и индекс безопасности молекул в различных линиях клеток.

Фармакокинетические исследования

Фармакокинетическое поведение бетулиновой кислоты (II), MJ-1098-RS (III) и соединения 5 согласно настоящему изобретению изучали на трех самцах крыс линии Wistar (150-180 г) после введения в дозе 10 мг/кг путем внутривенной инъекции. Образцы крови брали в различные интервалы времени после введения, получали плазму и замораживали при -20 °С вплоть до анализа.

Образец плазмы анализировали с помощью соответствующего метода ВЭЖХ, используя колонку С-18. рН воды доводили до 3,0 фосфорной кислотой. Градиент начинали с 70% ацетонитрила в течение 5 мин и увеличивали концентрацию вплоть до 100% в течение 25 мин с последующим удерживанием концентрации 100% в течение 10 мин. Таким путем необязательно построить кривую, показывающую концентрацию в плазме как функцию от времени и позволяющую определить различные фармакокинетические параметры исследуемого соединения. Программу WinNonlin использовали для расчета фармакокинетических параметров, которые представлены в табл. 2. Представленные в табл. 2 результаты показывают, что концентрации MJ-1098-RS и соединения 5 в плазме являются очень высокими и продолжительно действующими по сравнению с концентрацией бетулиновой кислоты (II). Следовательно, соединения согласно изобретению имеют весьма благоприятные фармакокинетические параметры, что сделает возможным существенно снизить количество действующего начала и число суточных введений, которое является необходимым для заданного терапевтического эффекта. Последующие исследования находятся в развитии с целью оценки указанных соединений для предварительной клинической разработки. Изучение эффективности in vivo на модели ксенотрансплантата мыши и исследования безопасности, которые будут включены в законченную заявку, также продолжаются,.

Таблица 4. Величины IC50 цитотоксичности in vitro производных бетулиновой кислоты

Таблица 5. Величины IC50, определенные на клетках NIH 3T3, и индекс безопасности молекул в различных линиях клеток

Как упомянуто в описании выше, фармацевтические композиции, содержащие соединения формулы (I), их соли и т.д., как было обнаружено, пригодны для торможения роста раковых клеток у человека. В частности, было обнаружено, что фармацевтические композиции пригодны для лечения человека, млекопитающих или других субъектов, страдающих от рака или других опухолей.

Фармацевтические композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, известные в данной области, такие как носители, разбавители и т.д. Типичные носители, которые могут быть использованы, включают в себя дезинтегрирующее средство и смазывающее средство.

Дезинтегрирующие и смазывающие средства являются хорошо известными средствами в фармацевтической области. Подходящие дезинтегрирующие средства включают в себя крахмал, кроскармелозу натрия, кросповидон, натриевую соль крахмалгликолевой кислоты, кроскармелозу кальция, микрокристаллическую целлюлозу и полакралин калия и тому подобное. Подходящие смазывающие средства включают в себя стеарат магния, стеарилфумарат натрия, гидрированное растительное масло, гидрированное касторовое масло, гидрированное хлопковое масло, стеариновую кислоту и стеарат кальция, коллоидную двуокись кремния и тому подобное.

Дезинтегрирующее и смазывающее средства выбирают так, чтобы они составляли эффективное для дезинтегрирования количество дезинтегрирующего средства и/или эффективное для смазывания количество смазывающего средства, соответственно. Например, обычная композиция может содержать от 0% до 30% масс. дезинтегрирующего средства и от 0 до 10 мас.% смазывающего средства. В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит от 1 до 10 мас.% дезинтегрирующего средства и от 0,2 до 2 мас.% смазывающего средства.

Кроме того, композиция может содержать другие добавки, такие как суспендирующие средства, загустители, консерванты, рН-модификаторы, наполнители и ароматизирующие вещества.

Примеры подходящих суспендирующих средств включают в себя ксантановую камедь, гидроксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, каррагенан, карбоксиметилцеллюлозу натрия и смеси карбоксиметилцеллюлоза натрия/микрокристаллическая целлюлоза, особенно смеси карбоксиметилцеллюлоза натрия/микрокристаллическая целлюлоза.

Подходящими суспендирующими средствами являются тиксотропные суспендирующие средства, такие как ксантан, каррагенан и смеси карбоксиметилцеллюлоза натрия/микрокристаллическая целлюлоза и их смеси. Наиболее предпочтительными из них являются ксантановая камедь и гуаровая камедь.

Средства для сгущения, являющиеся подходящими в настоящем изобретении, включают в себя двуокись кремния.

Водорастворимые консерванты, являющиеся пригодными в настоящем изобретении, включают в себя бензоат натрия, цитрат натрия и хлорид бензалкония, предпочтительным их них является бензоат натрия.

Подсластители, которые могут быть использованы, включают в себя сахара, такие как фруктоза, сахароза, глюкоза, мальтоза или лактоза, а также некалорийный подсластитель, такой как аспартам, который может быть использован сам по себе или в комбинации с другим некалорийным или низкокалорийным подсластителем, который, как известно, обладает синергическим действием с аспартамом, например, сахарин, ацесульфам, тауматин, халкон, цикламат, стевиозид и тому подобное. Композиции с подсластителем являются более экономичными и обладают сладким вкусом без остаточного привкуса.

Композиция необязательно и предпочтительно содержит фармацевтически приемлемые разбавители, наполнители, растворители, связывающие вещества, стабилизаторы и тому подобное. Такие разбавители могут включать в себя: RPMI 1649, забуференный физиологический раствор, изотонический раствор NaCl, раствор Рингера, воду, дистиллированную воду, полиэтиленгликоль (неразбавленный или в воде), 2% твин в воде, диметилсульфоксид с концентрацией до 50% в воде, пропиленгликоль (неразбавленный или в воде), забуференный фосфатом физиологический раствор, уравновешенный солевой раствор, глицерин и другие обычные жидкости, которые являются подходящими для внутривенного введения. Фармацевтические композиции, которые составляют приблизительно от 0,1 до 10 г (предпочтительно от 0,5 до 5,0 г) композиции на стандартную дозу, являются предпочтительными, и их обычно приготовляют в виде таблеток, пастилок, капсул, порошков, водных или масляных суспензий, сиропов, эликсиров и водных растворов. Природа используемой фармацевтической композиции будет зависеть, конечно, от желаемого способа введения.

Способы настоящего изобретения заключаются в систематическом введении млекопитающему терапевтически эффективной композиции производных бетулиновой кислоты формулы (I). Эффективная доза производных бетулиновой кислоты или фармацевтически приемлемых солей производных бетулиновой кислоты формулы (I) колеблется от 1 мг/кг веса тела до 300 мг/кг веса тела (предпочтительно 10-100 мг/кг веса тела) млекопитающего в зависимости от искомых эффектов, способа введения и рака, который подвергают лечению. Системное введение относится к пероральному, ректальному, назальному, чрескожному и парентеральному (т.е. внутримышечное, внутривенное и подкожное) введениям. В соответствии с благоприятной клинической практикой, предпочтительно вводить композицию в дозе, которая будет производить противораковое действие без появления чрезмерных вредных побочных эффектов. Композиция может быть введена сама по себе или в виде смеси с другими терапевтическими средствами, такими как 5-фторурацил, метотрексат, этопозид, паклитаксел, таксотер, доксорубицин, даунарубицин, винкристин, винбластин и другие известные и установленные противораковые лекарственные средства.

Соединения общей формулы (I) и композиции, включающие в себя соединения общей формулы (I), могут быть использованы для торможения и/или предотвращения рака предстательной железы, легкого, гортани, поджелудочной железы, молочной железы, ободочной кишки и яичника, лейкоза и лимфомы.