Описаны соединения формулы (1)

где радикалы определены в описании, способы их получения и их применение в синтезе конъюгатов с радионуклидами для использования в терапии и диагностике людей и животных, особенно для диагностики и терапии патологических состояний, таких как опухоли.

[0001] Соединение формулы (I)

[0002] Соединение формулы (I) по п.1, где А независимо представляет собой СН2, В представляет собой Н, Q представляет собой -(СН2)n-, где n является целым числом от 4 до 8, предпочтительно 6, c и d - оба 3 или 6, R' и R" представляют собой - Λ, где Y всегда представляет собой -СН2СООН; X представляет собой водород и р=2.

[0003] Комплекс соединения формулы (I) по п.1 или 2 с радиоизотопом.

[0004] Комплекс по п.3, в котором радиоизотоп выбирают из группы, состоящей из Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I-125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Bi-212, Bi-213, Rh-105, Sm-153, Lu-177 и Au-198.

[0005] Комплекс по п.3 или 4, где Q представляет собой -(СН2)n-, где n является целым числом от 4 до 8, предпочтительно 6, Y представляет собой -СН2-СООН и радиоизотопом является Y-90.

[0006] Фармацевтическая и/или диагностическая композиция, содержащая соединение по п.1 или 2, в смеси с подходящими носителями и/или наполнителями.

[0007] Применение соединения по п.1 или 2 для приготовления лекарственного средства, полезного в лечении опухолей.

[0008] Фармацевтическая и/или диагностическая композиция, содержащая комплекс по любому из пп.3, 4 или 5, в смеси с подходящими носителями и/или наполнителями.

[0009] Применение комплекса по любому из пп.3, 4 или 5 в качестве противоракового радиофармацевтического препарата.

[0010] Набор для лучевой терапии или диагностики опухолей, отличающийся тем, что по меньшей мере один из компонентов указанного набора содержит соединение по п.1 или комплекс по п.3.

Область техники

Изобретение, описанное в настоящей заявке, относится к модифицированным биотинам, полезным для получения коньюгатов с радионуклидами для применения в диагностике и терапии людей и животных, особенно для диагноза и лечения патологических состояний, таких как опухоли.

Уровень техники

Терапию опухоли, главным образом, осуществляют с помощью веществ, нацеленных на разрушение раковых клеток. Это может быть достигнуто с цитотоксическими веществами, которые должны проникать в опухолевые клетки, чтобы проявить свое полное влияние, или посредством обработки опухолевых клеток радиацией достаточной энергии, чтобы убить клетки. В обоих случаях главная проблема состоит в доставке вещества селективным образом к целевым клеткам так, чтобы избежать возможного повреждения окружающих здоровых клеток. В случае радиофармацевтических препаратов, то есть веществ, несущих радиоактивные участки, проблема селективной доставки активной части (то есть радиоактивного участка) к целевой опухоли, избегая в максимально возможной степени диффузии радионуклида в теле или взаимодействия со здоровыми клетками, окружающими опухоль, воспринимается как особенно важная.

Для обсуждения всех включаемых проблем и решений, предложенных до настоящего времени, читатель отсылается к патентам США 5,283,342, 5,608,060 и 5,955,605 от корпорации NeoRx.

В этих документах, среди других, обсуждается проблема устойчивости молекулы, несущей радионуклид, к метаболическим атакам организма. Конкретно, случаем, наиболее тщательно изученным, является молекула биотина, которая является одним из первых выборов для доставки радионуклида к опухолевым клеткам, благодаря его известному взаимодействию с авидинами. Биотин связывают с частью, хелатирующей радионуклид, например молекулой тетраазациклододекантетрауксусной кислоты [DOTA], через линкер. Одной из главных проблем, связанных с использованием коньюгатов биотин-DOTA, является устойчивость комплексного соединения, содержащего молекулу биотина, как связанную с радионуклидом через линкер, к биотинидазам - ферментам, которые разрушают пептидную связь, присутствующую в комплексном соединении. Эта пептидная связь происходит от объединения хелатирующего реагента и биотина.

Среди его наиболее желательных характеристик является то, что он должен быть удален из организма быстро и эффективно и должен быть достаточно малым (M.W. <1000), чтобы позволить его легкое распределение во внеклеточной жидкости, где он будет связываться с опухолевыми клетками. Кроме того, он должен показать проверенную стабильность in vivo с только минимальным поглощением неопухолевыми клетками и быстрым (почечным) клиренсом и не должен метаболизироваться.

Кроме того, хелатирующий фрагмент должен быть таким, чтобы не выделялся in vivo, таким образом, поставляя потенциально токсические соединения в пределах организма. Эксперты в этой области хорошо знакомы с проблемой выделения радионуклида хелатирующей частью, включая металлические ионы, которые полностью чужды организму и которые могут быть наделены радиоактивностью различных типов и даже высокоэнергетическим излучением, которое, поэтому, является весьма разрушительным.

В предыдущей заявке на патент от того же самого заявителя (WO 02/066075) наша группа сообщила о синтезе нового конъюгата биотина-DOTA вместе с исследованиями связывания, стабильности и сродства, выполненными на этом новом производном. Новизна нового конъюгата состоит в том, что карбоксильная группа амида была восстановлена до метилена, таким образом, давая N-аминогексилбиотинамидопроизводное (r-BHD), в котором амид был преобразован во вторичный амин, не оказывая влияния на длину боковой цепи биотина, включенную в связь Av/Sav. Лиганд DOTA в этом соединении непосредственно связан с аминогруппой восстановленного производного биотингексаметилендиамина через одну из четырех боковых N-карбоксиметильных групп.

Кроме того, синтетическая гибкость r-BHD позволяет производить много новых производных биотина, например, с двумя хелатирующими группами DOTA, конъюгированными с боковой цепью биотина с целью увеличить эффективность терапии целенаправленного радионуклида, обеспечивая более высокую дозу облучения опухоли.

Заявка на патент США 2004/0241172 от Д.Б. Аксуорти и др. (Axworthy D.B. et al.) раскрывает производные биотина, включающие две группы DOTA, связанные через определенные линкеры, которые непосредственно связаны через группу бензил с ядром молекул DOTA. Эта модификация группы DOTA могла снизить связывающую способность хелатирующего фрагмента.

Для того чтобы улучшить отношение излучение/доза, мы разработали и синтезировали новый класс производных биотина.

Описание изобретения

Главной задачей настоящего изобретения является создание новых производных биотина, которые отвечают высокому отношению излучение/доза.

В особенности, изобретение базируется на новом классе производных биотина, несущих две хелатирующие группы на молекулу биотина.

Таким образом, используя то же самое молярное количество производного биотина, радиоактивность, достигающая опухолевых клеток, удваивается.

Одной из задач изобретения, описанного в настоящей заявке, являются соединения формулы (I) следующим образом:

где А представляет собой СН ₂ или СО;

В представляет собой Н, СНО или СООН; при условии, что когда А представляет собой СН ₂ , Q представляет собой группу -(СН ₂ ) _n -, в которой n является целым числом от 4 до 12, и в этом случае R отсутствует; когда А представляет собой СО, Q выбирают из группы, состоящей из -(СН ₂ ) _a -СН(R-)-(СН ₂ ) _b -, где а и b, независимо, являются целыми числами от 0 до n-1 и R определен ниже;

W представляет собой С ₁ -С ₁₂ алкилен или C ₂ -C ₁₂ алкенилен с нормальной цепью или функционализированный полиэтиленгликоль; или С ₆ -С ₁₀ ароматический остаток; или остаток глюкофуранозы; или W, один или вместе с атомом азота, образующие цепи -(CH ₂ ) _c -NHR' и -(СН ₂ ) _d -NHR", является гетероциклической группой с 5 или 6 членами, содержащими один или более гетероатомов, выбранных из О, N, S;

когда W представляет собой ароматический остаток, гетероциклическую группу или остаток сахара, атом азота, образующий цепи -(CH ₂ ) _c -NHR' и -(СН ₂ ) _d -NHR", возможно отсутствует, а цепи -(CH ₂ ) _c -NHR' и -(СН ₂ ) _d -NHR" непосредственно и независимо связаны с атомами углерода или азота ароматического или гетероциклического колец или с атомами кислорода остатка глюкофуранозы;

c и d, независимо, являются целыми числами от 3 до 10; R' и R", независимо, представляют собой - Λ, где - Λ представляет собой макроцикл формулы (II)

где Y одинаковые или различные, выбраны из группы, состоящей из водорода, линейного или разветвленного C ₁ -C ₄ -алкила, -(СН ₂ ) _m -СООН, где m представляет собой целое число от 1 до 3;

X представляет собой водород, группу -CH ₂ -U, где U выбран из метила, этила, п-аминофенила, или X представляет собой группу -(CHJ) _o -Z, где о представляет собой целое число от 1 до 5, J представляет собой водород, метил или этил, Z представляет собой 5- или 6-членную гетероциклическую группу, содержащую один или более гетероатомов, выбранных из О, N-R ₁ , где R ₁ представляет собой водород или линейный или разветвленный C ₁ -C ₄ алкил и S; или Z выбирают из -NH ₂ , -NH-C(=NH-)-NH ₂ или -S-R ₂ , где R ₂ представляет собой линейный или разветвленный С ₁ -С ₄ алкил;

р представляет собой целое число 2 или 3;

R выбирают из группы, состоящей из линейного или разветвленного C ₁ -C ₄ алкила, циклоалкила, гетероцикла или -(CH ₂ ) _q -T, где Т выбирают из группы, состоящей из S-СН ₃ , -ОН или -СООН, и q =0, 1 или 2.

Линейный или разветвленный С ₁ -С ₄ алкил представляет собой метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил или трет-бутил.

5- или 6-членный гетероцикл представляет собой ароматический или неароматический гетероцикл, имеющий в кольце, по меньшей мере, гетероатом, выбранный из О, N-R ₁ или S, такой как, например, 2-, 3- или 4-пиридил или 2-, 4- или 5-имидазолил.

Чтобы снизить связывающую способность хелатирующего фрагмента А, получают первую группу предпочтительных соединений по изобретению формулы (I), где А представляет собой СН ₂ , В представляет собой Н, Q представляет собой -(СН ₂ ) _n -, где n - целое число от 4 до 8, предпочтительно 6, c и d - оба 3 или 6, R' и R" представляют собой - Λ, где Y представляет собой всегда -СН ₂ -СООН; X представляет собой водород, и р=2.

Другой задачей изобретения, описанного в настоящей заявке, является создание соединений формулы (I) с радиоизотопами для диагностического и/или терапевтического применения. Примерами этих изотопов являются: Fe-52, Mn-52m, Co-55, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Tc-99m, In-111, I-123, I-125, I-131, P-32, Sc-47, Cu-67, Y-90, Pd-109, Ag-111, Pm-149, Re-186, Re-188, At-211, Bi-212, Bi-213, Rh-105, Sm-153, Lu-177 и Au-198.

Первая группа предпочтительных комплексов по изобретению представляет собой соединения формулы (I), где А представляет собой СН ₂ , В представляет собой Н, Q представляет собой -(СН ₂ ) _n -, где n - целое число от 4 до 8, предпочтительно 6, с и d - вместе 3 или 6, R' и R" представляют собой - Λ, где Y представляет собой всегда -СН ₂ -СООН; X представляет собой водород, р=2, и радиоизотоп представляет собой Y-90.

Другой задачей изобретения, описанного в настоящей заявке, являются способы получения соединений формулы (I) и их комплексов с радиофармацевтическими препаратами.

Задачей настоящего изобретения является также создание фармацевтических и/или диагностических композиций, содержащих соединения формулы (I) и их комплексы, как указано выше.

Другой задачей изобретения настоящей заявки является применение соединений формулы (I) и их комплексов с радиоизотопами в качестве лекарственных средств или диагностических инструментов, особенно для приготовления лекарственных средств, которые являются полезными в терапии опухоли или их диагностики.

Эти и другие задачи настоящего изобретения иллюстрируются посредством экспериментальных примеров.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены согласно следующей схеме, включая стадии:

a) образование амидной связи между карбоксильной группой биотина и первичной аминогруппой диамина H ₂ N-Q-NH ₂ , причем другая первичная аминогруппа защищена, например, группой Boc, если необходимо; или, альтернативно, сочетание может быть выполнено с группой α - α-NH ₂ α, ω-диаминокислоты (то есть Lys), причем ω-аминогруппа соответственно защищена;

b) удаление защитной группы первичной аминогруппы;

c) восстановление амидогруппы в аминогруппу, если А является группой СН ₂ ;

d) сочетание амина с N-защищенными N,N-бисзамещенными глицинаминами формулы (III)

которые могут быть получены методами, известными специалистам в данной области; где V и L представляют собой подходящие защитные группы, и с и d независимо равны от 3 до 10;

е) коньюгация с желательным хелатирующим реагентом - Λ формулы (II).

Биотин является товарным продуктом так же, как аминокислота Lys. Диамины H ₂ N-Q-NH ₂ доступны на рынке и могут в любом случае быть получены в несколько стадий, используя известные методы.

Защита первичных аминогрупп легко достигается, используя подходящие защитные группы, такие как, например, Boc или Fmoc, и которые в любом случае могут быть найдены из числа тех, о которых сообщают в литературе (см., например, Грин и Byтc, "Защитные группы в органическом синтезе" (T.W. Greene, P.G.M. Wuts, "Protective groups in organic synthesis", 3rd Ed., J. Wiley & Sons, Inc., New York, 1999); (Handbook of Reagents for Organic Synthesis, "Oxidizing and Reducing Agents", Edited by S.D. Bruke and R.L. Danheiser, J. Wiley & Sons, Inc., New York, 1999).

Альтернативно, соединения формулы (I), если А представляет собой группу CO, могут быть получены согласно вышеупомянутой схеме, исключая стадию с).

Активация группы -СООН биотина могла быть выполнена согласно известным методам синтеза пептидов, П. Ллойд-Вильямс и др., "Химические Подходы к Синтезу Пептидов и Белков", (Р. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, "Chemical Approaches to Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, Boca Raton, New York, 1997); если сочетание выполняют с α, ω-диаминокислотой (то есть Lys), реакция может быть выполнена, закрепляя аминокислоту на подходящей смоле, следуя методикам, известным в технике твердофазного синтеза пептидов.

Конъюгацию соединения согласно изобретению с радиоизотопом для получения комплексов, предусмотренных согласно изобретению, выполняют, используя известные традиционные методы, как описано, например, в Paganelli, Chinol et al., European Journal of Nuclear Medicine, vol. 26, no. 4, 1999, 348-357.

Одним из предпочтительных соединений по изобретению является соединение, в котором А представляет собой СН ₂ , Q представляет собой -(СН ₂ ) _n -, где n представляет собой предпочтительно 6, c=d=3 или 6, R'=R" представляет собой - Λ, где m=1, Y представляет собой всегда -СН ₂ -СООН; X представляет собой водород, и р=2 (хелатирующий реагент - DOTA).

Способ получения этого предпочтительного соединения включает следующие стадии:

a) образование амидной связи между карбоксильной группой биотина и первичной аминогруппой гексаметилендиамина, соответственно защищенной, например, группой Вос, если необходимо;

b) удаление защитной группы гексаметилендиамина;

c) восстановление амидогруппы в аминогруппу;

d) конъюгацию с амином формулы (III), где c=d=3 или 6, V=L являются защитными группами Fmoc;

e) удаление защитных групп с полученного амина;

f) коньюгацию с хелатирующим комплексом - Λ.

Стадия а) в способе по изобретению включает образование амидной связи между карбоксильной группой биотина и первичной аминогруппой гексаметилендиамина-Вос. Биотин обрабатывали HATU с образованием in situ чрезвычайно активного сложного эфира, который реагирует с первичной аминогруппой гексаметилендиамина-Вос с образованием соответствующего амида. Этот механизм активации, который используется, прежде всего, для синтеза пептида в твердой фазе, требует основной среды. Чтобы воспрепятствовать основанию реагировать с активным сложным эфиром, применяют третичные органические основания, такие как диизопропилэтиламин (DIPEA) или N-метилморфолин (NMM). Защита одной из двух аминогрупп гексаметилендиамина группой Boc (трет-бутилоксикарбонил) необходима, чтобы предотвратить связывание биотина с обоими концами цепи диамина. Конечный продукт выделяют из реакционной среды после испарения растворителя (ДМФ) и осаждения водой. Продукт перекристаллизовывают из пропанола и характеризуют ¹ Н-ЯМР, элементным анализом и масс-спектроскопией с ионизацией электрораспылением (ESI-MS). Выход реакции составляет приблизительно 88%.

На стадии b) биотинилгексаметилендиамин-Вос солюбилизируют в смеси AcOEt/HCl, приблизительно 3 М, чтобы отщепить группу Boc. После удаления смеси растворителя продукт лиофилизируют, чтобы полностью удалить HCl. Образец очищают посредством перекристаллизации из водного раствора при основном рН и характеризуют ¹ Н-ЯМР и ТСХ.

На стадии с) амидогруппу восстанавливают ВН ₃ THF. Так как восстановитель является чрезвычайно реакционноспособным, способ должен быть выполнен в безводных условиях. Исходный продукт выдерживали в вакууме до реакции и затем солюбилизировали в безводном ТГФ (перегнанным с натрием и бензофеноном). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в атмосфере азота до полного восстановления амидогруппы (как проверено спектрами ¹ Н-ЯМР). После испарения растворителя при пониженном давлении реакционную смесь обрабатывали водным раствором HCl. После лиофилизации кислотного раствора продукт очищали перекристаллизацией из водного раствора при основном рН и затем колоночной хроматографией с обращенными фазами. Продукт анализировали аналитической ТСХ, которая показала его чистоту. Выход реакции составляет приблизительно 55%.

Стадия d) обеспечила реакцию конъюгации восстановленного биотинил-гексаметилендиамина с защищенным амином (III) активацией системой HATU/NMM в NMP в качестве растворителя.

На стадии е) группы Fmoc удаляли, используя пиперидин как основание.

Стадия f) обеспечила сочетание двух групп DOTA и была выполнена с определенными реактивами для образования амидных связей в водной среде: 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид хлоргидрат (EDC) и сульфо-NHS. DOTA (4 мол. эквив. на производное биотина) растворяли в воде и рН приводили к значению, подходящему для активации, обычно, одной из четырех карбоксильных групп (G. Sabatino, M. Chinol, G. Paganelli, S. Papi, M. Chelli, G. Leone, A. M. Papini, A. DeLuca и М. Ginanneschi, J. Med. Chem. 2003, 46, 3170-3173). Таким образом, можно снизить вероятность получения побочных продуктов. К основному раствору добавляли сульфо-NHS и наконец EDC. После образования активного сложного эфира in situ добавляли N,N-бисалкиламиноглицинопроизводное восстановленного биотинил-гексаметилендиамина, проверяя, чтобы рН раствора оставался приблизительно 7,5. Предочистка сырого продукта была выполнена экстракцией твердой фазы (SPE, solid phase extraction), и очистку выполняли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенными фазами (RP-HPLC, reversed-phase HPLC).

Изобретение относится к фармацевтическим или диагностическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента по меньшей мере одно соединение формулы (I) также в форме комплекса с радиоизотопом или, в случае указанного соединения формулы (I), в комбинации с другими активными ингредиентами, пригодными в лечении болезней, указанных в описании изобретения, например другие продукты, обладающие противораковой активностью; также в отдельной лекарственной форме или в формах, подходящих для комбинированной терапии. Активный ингредиент согласно изобретению будет в форме смеси наряду с подходящими связующими и/или инертными наполнителями, обычно используемыми в фармацевтической технологии, такими как, например, описанные в Фармацевтическом Руководстве Ремингтона, последнее издание. Составы согласно изобретению должны содержать терапевтически эффективное количество активного ингредиента. Дозировки будут определяться экспертом в этой области, например клиническим врачом или терапевтом, в зависимости от типа болезни, подлежащей лечению, и состояния пациента, или сопутствующим назначением других активных ингредиентов.

Примерами фармацевтических композиций являются те, которые пригодны для парентерального или локо-регионального введения. Фармацевтические композиции, подходящие для этого назначения, представляют собой растворы, суспензии или лиофилизированные формы, чтобы быть ресуспендированными во время использования.

Формы, подходящие для промышленного применения в соответствии с изобретением, представляют собой наборы для лучевой терапии рака, как, например, описано в европейском патенте 0496074, в статье Paganelli, Chinol, и др., опубликованной в European Journal of Nuclear Medicine, 26, no. 4, 1999, 348-357, в патенте США 5,968,405 и в другой литературе.

Настоящее изобретение относится также к набору для лечения или диагностики опухолей посредством радиоактивности, характеризующемуся тем, что по меньшей мере один из компонентов указанного набора содержит соединение формулы (I) или один из его комплексов с подходящим радиоизотопом.

Соединения согласно изобретению полезны для приготовления терапевтических и/или диагностических средств для лечения и диагноза опухолей.

Соединения согласно изобретению, после связывания с радиоизотопами для диагностического и/или терапевтического применения (как объяснено прежде), полезны для радиомеченных препаратов коллоидов авидина для различного медицинского применения.

Например, они могут применяться в методах лечения опухолей противораковыми радиофармацевтическими препаратами, такими как, например, препараты, описанные в европейском патенте 04 96074, в статье Paganelli, Chinol, и др., опубликованной в European Journal of Nuclear Medicine, 26, no. 4, 1999, 348-357, в патенте США 5,968,405 и в другой литературе.

Следующий пример далее иллюстрирует изобретение.

Пример. Получение BisDOTA-С ₃ - соединение 4.

Получение cоединения 4 выполняли, следуя стадиям, изложенным ниже.

Синтез восстановленного биотинамидогексиламина (r-BHD) - соединение 1.

О детализированной синтетической процедуре и физико-химических свойствах соединения 1 сообщали в статье (G. Sabatino, M. Chinol, G. Paganelli, S. Papi, M. Chelli, G. Leone, A. M. Papini, A. DeLuca и M. Ginanneschi, J. Med. Chem. 2003, 46, 3170-3173).

Спектры ЯМР продуктов зарегистрированы в растворе диметилсульфоксида-d6 на приборе Varian 400. N, N-бис [3-(Fmoc-амино)пропил]глицин примера был куплен во Fluka (Швейцария) как соль сульфата калия.

Синтез конъюгата r-BHD с N,N-бис[(3-амино)пропил]глицином - соединение 2.

HATU (66,5 мг, 0,175 ммол, 0,7 мол. экв.) в NMP (0,5 мл) добавляли к раствору N,N-бис[3-(Fmoc-амино)пропил]глицин калий сульфата (115,5 мг, 0,15 ммол, 0,6 мол. экв.) и NMM (33,05 мкл, 0,3 ммол, 1,2 мол. экв.) в NMP (1 мл). Этот раствор по каплям добавляли в течение 5 мин к суспензии r-BHD (соединение 1) (100 мг, 0,25 ммол) в NMP (5 мл), содержащих NMM (27,5 мкл, 0,25 ммол, 1 мол. экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре, контролируя реакцию с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами (RP-HPLC) (растворитель для элюирования: от 30% до 100% В в течение 20 мин; t _R =13,4 мин). После 2,5 ч соединение 1 (57,7 мг, 0,08 ммол, 0,3 мол. экв.) добавляли снова к реакционной смеси. После 2,5 ч реакцию останавливали и растворитель испаряли при пониженном давлении. Желто-оранжевое масло суспендировали в воде при 0 °С при перемешивании, получая белый осадок, который очищали RP-CC (LiChroprep RP-8, 40-63 мкм; 170 ×20 мм; растворитель для элюирования: CH ₃ CN/H ₂ O/HCl=50:50:0,1, 1 мл/мин), получая соединение 2 (130 мг; 55% выход). Fmoc-защищенное бисамино производное (соединение 2), как оказалось, является чистым при проверке ТСХ (CH ₃ CN/H ₂ O/HCl=50:50:0,1). ¹ Н ЯМР (200 МГц, диметилсульфоксид) : δ 9,63 (ушир. с, 1Н), 8,64 (ушир. с, 3Н), 7,87 (д, 4Н), 7,65 (д, 4Н), 7,43-7,27 (м, 8Н), 6,41(д, 2Н), 4,31-4,14 (м, 8Н), 3,85 (с, 2Н), 3,14-3,03 (м, 11Н), 2,82-2,76 (м, 4Н), 2,6 (д, 2Н), 1,76-1,25 (м, 20Н), ESI-MS (m/e): вычислено [М.+Н] ⁺ 944,5, найдено 944,5.

Fmoc-защищенное бисамино производное (соединение 2) (88 мг, 0,09 ммол) растворяли в ДМФ, содержащем 25% пиперидина (5 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре 6 часов, контролируя реакцию с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами (RP-HPLC) (от 30% до 100% В в течение 20 мин; t _R =16,7 мин). Реакционную смесь затем испаряли при пониженном давлении и неочищенное масло, растворяли в минимальном количестве МеОН и осаждали с помощью Et ₂ O. Собранное твердое вещество дважды промывали эфиром, растворяли в воде и лиофилизировали, получая белый продукт, который очищали SPE, (экстракцией твердой фазы; LiChroprep RP-18, 25-40 мкм; 170 ×20 мм; растворитель для элюирования: Н ₂ О 100%-МеОН от 4 до 100%). Элюируемые фракции собирали и лиофилизировали, получая незащищенный бис-амин (соединение 3) (30 мг, 75% выход).

¹ Н ЯМР (200 МГц, CDCl ₃ ) : δ 8,12(ушир. с, 2Н), 6,45(с, 2Н), 4,26(м, 1Н), 4,12(м, 1Н), 3,59-2,95(м, 7Н). 2,95-2,70(м, 12Н), 2,50(д, 2Н), 1,80-1,20(м, 20Н), ESI-MS (m/e): вычислено [М. + Н] ⁺ 443,6, найдено 443,1.

Коньюгация соединения 3 с активированным DOTA для получения Бис-DOTA-C3 - соединение 4.

Сульфо-NHS (26 мг, 0,12 ммол) добавляли к раствору DOTA-0,31Н ₂ О (49,2 мг, 0,12 ммол) в Н ₂ О (0,750 мл). рН раствора доводили до значения 6,5 с помощью 0,1 М NaOH и добавляли раствор EDC (23 мг, 0,12 ммол) в Н ₂ О (0,5 мл) по каплям при 0 °С. Реакционную смесь перемешивали при 0 °С в течение 30 мин и затем добавляли раствор соединения 3 (15 мг, 0,03 ммол) в Н ₂ О (0,750 мл) при рН 7,8 по каплям в течение 5 мин. Реакцию контролировали с помощью RP-HPLC (от 5 до 100% В в течение 30 мин; t _R =16,4 мин).

По прошествии 2 ч реакционную смесь лиофилизировали и неочищенное соединение предварительно очищали SPE (экстракцией твердой фазы; LiChroprep RP-18, 25-40 мкм; 15 ×65 мм; растворитель для элюирования: а) Н ₂ О, b) 4% МеОН в H ₂ O, с) 100% МеОН). Тест ВЭЖХ (HPLC) экстрагированных фракций показал, что соединение 4, главным образом, находилось во фракции с. Метанольный раствор испаряли, а продукт очищали с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами (RP-HPLC) (от 5 до 30% В в течение 30 мин; t _R =16,4 мин), получая чистый бис-DOTA (соединение 4) (15 мг, 24% выход) в виде белого твердого вещества.

ESI-MS: m/e, вычислено [М+Н ⁺ 1272,7, найдено 1272,7; [М-Н] ⁺ 1270,7, найдено 1270,9. Анализ (C ₅₆ H ₁₀₁ N ₁₅ O ₁₆ S ∙6TFA ∙5H ₂ O) С, Н, N.

Тесты с использованием метки, радиохимическую чистоту и серологические испытания на стабильность выполняли с соединением, полученным в предшествующем примере.

Тесты с использованием метки выполняли, используя 2 мг/мл MilliQ водные растворы Бис-DOTA-C ₃ . 1,0 мМ буфер ацетата натрия (рН 5,0) добавляли к Бис-DOTA-C ₃ , которые затем добавляли с раствором радиоизотопного хлорида (MCl ₃ , М ⁼¹¹¹ In, ⁹⁰ Y, ¹⁷⁷ Lu) при удельной активности 1 MCi/7,2 мкг. Наконец, эти растворы культивировали при 95 °С в течение 30 мин.

Чтобы определить радиохимическую чистоту (RCP), использовали моментальную тонкослойную хроматографию на силикагеле (ITLC-SG). Аликвоту радиомеченой смеси добавляли к молярному избытку Авидина и DTPA, затем каплю наносили на полоски ITLC и проявляли солевым раствором. Полосу анализировали прибором Радио-ТСХ; в этой системе, комплекс, образованный Бис-DOTA-С ₃ и Авидином, остается вначале, в то время как несвязанный радиометалл образует комплекс с DTPA и мигрирует с фронтом растворителя. Радиохимическая чистота обычно оценивается как > 96%.

Анализы на стабильность выполняли с и без аскорбиновой кислоты (АК) как акцептора радикалов. Аликвоты меченых молекул выращивали при 37 °С с 4-кратным объемом солевого раствора или раствора АК (4 мг/мл в 1,0 М буфере ацетата натрия, рН 5,0). Исследования на стабильность выполняли в течение 24 и 48 ч, и радиохимическую чистоту (RCP) вычисляли, используя метод ITLC-SG, как описано прежде. Результаты показали, что, в присутствии АК, радиомеченые М-Бис-DOTA-С ₃ устойчивы к радиолизу до 48 ч.