EA 013118B1 20100226 Номер и дата охранного документа EA200701589 20060127 Регистрационный номер и дата заявки US60/648,219 20050127 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2006/001514 20060127 Номер международной заявки (PCT) WO2006/109191 20061019 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа EAb21001 Номер бюллетеня [RU] АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕРФЕРОНА-ГАММА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа [8] C07K 16/24, [8] A61K 39/395 Индексы МПК [FR] Ферлэн Уолтер, [CH] Фишер Николас, [FR] Элсон Грег, [FR] Лежер Оливье Сведения об авторах [CH] НОВИММУН С.А. (CH) Сведения о патентообладателях [CH] НОВИММУН С.А. (CH) Сведения о заявителях WO 2004046306 A2 WO 2004035747 A2 WO 03097082 A2 SKURKOVICH B. ET AL.: "ANTI-INTERFERON-GAMMA ANTIBODIES IN THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES" CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS, CURRENT DRUGS, LONDON, GB, vol. 5, no. 1, 2003, pages 52-57, XP008043742 ISSN: 1464-8431 the whole document SIGIDIN Y.A. ET AL.: "RANDOMIZED, DOUBLE-BLIND TRIAL OF ANTI-INTERFERON-GAMMA ANTIBODIES IN RHEUMATOID ARTHRITIS" SCANDINAVIAN JOURNAL OF RHEUMATOLOGY, ALMQVIST & WIKSELL PERIODICAL CO., STOCKHOLM, SE, vol. 30, no. 4, 2001, pages 203-207, XP008071740 the whole document Цитируемые документы
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000013118b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим антителам и их фрагментам, которые связываются с человеческим интерфероном-гамма (hIFN γ) и, тем самым, модулируют взаимодействие IFN γ с его рецептором, IFN γ-R и/или модулируют биологические активности IFN γ. Настоящее изобретение также относится к применению таких анти-IFN γ-антител для предупреждения или лечения иммунных расстройств и ослабления симптома, ассоциированного с иммунным расстройством.


Формула

[0001] Выделенное полностью человеческое моноклональное антитело против IFN γ или его фрагмент, где указанное антитело содержит:

[0002] Антитело по п.1, где указанное антитело дополнительно содержит:

[0003] Антитело по п.1, имеющее IgG-изотип.

[0004] Антитело по п.2, где указанное антитело содержит VH-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO:3); VH-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4), VH-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); VL-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); VL-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); и VL-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10).

[0005] Антитело по п.1, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

[0006] Выделенное полностью человеческое моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 или 103, и где указанное антитело связывается с IFN γ.

[0007] Антитело по п.6, где указанное антитело дополнительно содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 или 105, и где указанное антитело связывается с IFN γ.

[0008] Антитело по п.7, где указанное антитело содержит VH-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO:3); VH-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4), VH-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); VL-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); VL-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); и VL-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10).

[0009] Антитело по п.4, имеющее IgG-изотип.

[0010] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.1 и носитель.

[0011] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.4 и носитель.

[0012] Способ ослабления симптома аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства, предусматривающий введение антитела по п.1 индивидууму, нуждающемуся в этом, в количестве, достаточном для ослабления у указанного индивидуума симптома аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства.

[0013] Способ по п.12, где указанным индивидуумом является человек.

[0014] Способ по п.12, где указанное антитело содержит VH-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO:3); VH-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4), VH-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); VL-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); VL-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); и VL-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10).

[0015] Способ по п.14, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

[0016] Способ по п.12, где указанное аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Крона, системной красной волчанки, псориаза, ревматоидного артрита, васкулита, атопического дерматита и вторичного прогрессирующего рассеянного склероза.

[0017] Способ по п.12, где указанное антитело вводят внутривенно.

[0018] Способ по п.12, где указанное антитело вводят вместе со вторым средством, выбранным из группы, состоящей из:

[0019] Способ снижения экспрессии молекул МНС класса II на клетке, предусматривающий контактирование клетки с антителом по п.1 в количестве, достаточном для снижения уровня экспрессии МНС класса II на указанной клетке.

[0020] Способ по п.19, где указанной клеткой является клетка человеческой меланомы.

[0021] Способ по п.19, где указанное антитело содержит VH-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO:3); VH-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4), VH-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); VL-CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); VL-CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); и VL-CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10).

[0022] Способ по п.21, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

[0023] Способ по п.19, где указанная клетка контактирует со вторым средством, выбранным из группы, состоящей из:


Полный текст патента

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах, настоящее изобретение относится к полностью человеческим антителам против интерферона-гамма, а также к способам их применения.

Предшествующий уровень техники

Человеческий интерферон-гамма (IFN γ, IFN-гамма) представляет собой лимфокин, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами и природными клетками-киллерами. Он обладает антипролиферативной, противовирусной и иммуномодуляторной активностью, связывается с IFN γ-R, то есть с гетеродимерным рецептором, присутствующим на большинстве первичных клеток иммунной системы, и запускает каскад событий, приводящих к воспалению. Известно, что противовирусная и иммуномодуляторная активность IFN γ оказывает благоприятное действие при различных клинических состояниях. Однако известно, что существует множество клинических состояний, при которых активность IFN γ оказывает неблагоприятное действие. Так, например, аутоиммунные заболевания ассоциируются с высокими уровнями IFN γ в крови и с поражением ткани у пациентов, страдающих такими аутоиммунными заболеваниями. Активность IFN γ также ассоциируется с такими патологическими состояниями как кахексия и септический шок.

В соответствии с этим, необходимо разработать способ лечения, направленный на подавление активности IFN γ.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам против интерферона-гамма (IFN γ, также называемого здесь IFN-гамма). Примерами моноклональных антител являются NI-0501; AC1.2R3P2_A6 (также обозначаемое здесь "А6"); AC1.2R3P2_B4 (также обозначаемое здесь "В4"); AD1.4R4P1_B9 (также обозначаемое здесь "В9"); AD1.4R4P2_C9 (также обозначаемое здесь "С9"); АС1.4R4P2_C10 (также обозначаемое здесь "C10"); AC1.2R3P7_D3 (также обозначаемое здесь "D3"); AD1.2R2P2_D6 (также обозначаемое здесь "D6"); AC1.2R2P2_D8 (также обозначаемое здесь "D8"); AD1.3R3P6_B1 (также обозначаемое здесь "E1"); AD1.3R3P5_F8 (также обозначаемое здесь "F8"); AD1.3R3P6_F9 (также обозначаемое здесь "F9"); AD1.4R4P2_G7 (также обозначаемое здесь "G7"); AD1.1R3P3_G9 (также обозначаемое здесь "G9"); и AD1.3R3P6_G10 (также обозначаемое здесь "G10"), описанные в настоящей заявке. Альтернативно, моноклональным антителом является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, как и антитела NI-0501; AC1.2R3P2_B4; AD1.4R4P1_B9; AD1.4R4P2_C9; AC1.4R4P2_C10; AC1.2R3P7_D3; ADI.2R2P2_D6; AC1.2R2P2_D8; AD1.3R3P6_E1; AD1.3R3P5_F8; ADI.3R3P6_F9; ADI.4R4P2_G7; AD1.1R3P3_G9 или AD1.3R3P6_G10. Указанные антитела, соответственно, называются здесь антителами против huIFN γ.

Антитело против huIFNy содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 или 103, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 или 105. Предпочтительно три гипервариабельные области (комплементарность-определяющие области, CDR) тяжелой цепи включают аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4); DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID NO: 13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO: 21); DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29); SNAMS (SEQ ID NO: 43); TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO: 45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO: 76) и DFWVITSGNDY (SEQ ID NO: 89); а легкая цепь имеет три CDR, которые включают аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17); QSNDSDNW (SEQ ID NO: 18); DDDQRPS (SEQ ID NO: 25); QSYDSSNVV (SEQ ID NO: 26); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO: 32); DDKKRPS (SEQ ID NO: 33); QSYDSNNLW (SEQ ID NO: 34); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO: 39); QSYDNSNHWV (SEQ ID NO: 40); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO: 48); QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO: 49); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 55); QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56); QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO: 72); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO: 73); QSYEGF (SEQ ID NO: 79); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO: 84); EDTQRPS (SEQ ID NO: 85); QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86); QSFDSTNLVV (SEQ ID NO: 92); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 97); QSYSYNNQVV (SEQ ID NO: 98); TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); EDNRRPS (SEQ ID NO: 107). Указанное антитело связывается с IFN γ.

Антитела против huIFN γ согласно изобретению включают V H -CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO: 3) или SNAMS (SEQ ID NO: 43); V H -CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) или TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44), a V H -CDR3-область содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); DHSSGWYVTSGMDV (SEQ ID NO: 13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO: 21); DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO: 45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO: 76) и DFWVITSGNDY (SEQ ID NO: 89).

Анти-huIFN γ-антитела включают V L -CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO: 32); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO: 39); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO: 48); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 55); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO: 72); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO: 84); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 97) и TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); V L -CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17); DDDQRPS (SEQ ID NO: 25); DDKKRPS (SEQ ID NO: 33); EDTQRPS (SEQ ID NO: 85) и EDNRRPS (SEQ ID NO: 107); и V L -CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); QSNDSDNVV (SEQ ID NO: 18); QSYDSSNVV (SEQ ID NO: 26); QSYDSNNLVV (SEQ ID NO: 34); QSYDNSNHWV (SEQ ID NO: 40); QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO: 49); QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56); QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO: 73); QSYEGF (SEQ ID NO: 79); QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86); QSFDSTNLVV (SEQ ID NO: 92) и QSYSYNNQVV (SEQ ID NO: 98).

Анти-huIFN γ-антитела включают, например, V H -CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность SYAMS (SEQ ID NO: 3) или SNAMS (SEQ ID NO: 43); V H -CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) или TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44); V H -CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5); DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID NO: 13); DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO: 21); DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29); GTELVGGGLDN (SEQ ID NO: 45); RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64); VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69); GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO: 76) и DFWVITSGNDY (SEQ ID NO: 89); V L -CDR1-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO: 32); TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO: 39); TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO: 48); TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 55); TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO: 72); TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO: 84); AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 97) и TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); V L -CDR2-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из EDNQRPS (SEQ ID NO: 9); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17); DDDQRPS (SEQ ID NO: 25); DDKKRPS (SEQ ID NO: 33); EDTQRPS (SEQ ID NO: 85) и EDNRRPS (SEQ ID NO: 107), и V L -CDR3-область, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10); QSNDSDNVV (SEQ ID NO: 18); QSYDSSNV (SEQ ID NO: 26); QSYDSNNLVV (SEQ ID NO: 34); QSYDNSNHWV (SEQ ID NO: 40); QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO: 49); QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56); QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61); QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO: 73); QSYEGF (SEQ ID NO: 79); QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86); QSFDSTNLVV (SEQ ID NO: 92) и QSYSYNNQVV (SEQ ID NO: 98).

Тяжелая цепь анти-huIFN γ-антитела происходит от гена зародышевой линии V (вариабельной области), такого, например, как ген зародышевой линии DP47 (IGHV3-23) (GenBank Accession No. M99660) или последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичная генной последовательности человеческой зародышевой линии DP47. Последовательность нуклеиновой кислоты для гена зародышевой линии DP47 (IGHV 3-23) включает, например, последовательность нуклеиновой кислоты, представленную ниже: GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGA (SEQ ID NO: 99).

Легкая цепь анти-huIFN γ-антитела происходит от гена зародышевой линии вариабельной области легкой цепи лямбда Ig, такого, например, как IGLV6-57 или V1-22 (GenBank Accession No. Z73673) или последовательность нуклеиновой кислоты, гомологичная последовательности гена зародышевой линии человеческого IGLV6-57. Последовательность нуклеиновой кислоты для гена IGLV6-57 зародышевой линии включает, например, последовательность нуклеиновой кислоты, представленную ниже: AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTAACCATCTCC TGCACCCGCAGCAGTGGCAGCATTGCCAGCAACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGCGCCCGGGC AGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCAAAGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTC TCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATCTCTGGACTGAAGACTGAG GACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTATGATAGCAGCAATCA (SEQ ID NO: 108).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или ослабления симптомов иммунного расстройства путем введения индивидууму анти-huIFN γ-антитела. Так, например, анти-huIFN γ-антитела могут быть использованы для лечения, предупреждения или ослабления симптомов, ассоциированных с иммунными расстройствами, такими как болезнь Крона, системная красная волчанка, псориаз, саркоидоз, ревматоидный артрит, васкулиты, атопический дерматит и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз. Затем, но необязательно, указанному индивидууму вводят второе средство, такое как, но не ограничивающееся ими, антитело против цитокина или хемокина, которое распознает цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 и IL-31, и/или хемокины, такие как MIP1- α, MIP1- β, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF и фракталкин.

В соответствии с настоящим изобретением указанный индивидуум страдает иммунным расстройством, таким, например, как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, или имеет предрасположенность к развитию этих заболеваний.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антител NI-0501 и АС1.2R3P2_A6. На фиг. 1А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи NI-0501, а на фиг. 1В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1А. На фиг. 1В гипервариабельные области (CDR) подчеркнуты. На фиг. 1С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи NI-0501, а на фиг. 1D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1С. На фиг. 1D CDR подчеркнуты. На фиг. 1E представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи АС1.2R3P2_A6, а на фиг. 1F представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1E. На фиг. 1F CDR подчеркнуты. На фиг. 1G представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи АС1.2R3P2_A6, а на фиг. 1Н представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 1G. На фиг. 1Н CDR подчеркнуты.

На фиг. 2 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела АС1.2R3P2_B4. На фиг. 2А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 2В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 2А. На фиг. 2В CDR подчеркнуты. На фиг. 2С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 2D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 2С. На фиг. 2D CDR подчеркнуты.

На фиг. 3 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.4R4P1_B9. На фиг. 3А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 3В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 3А. На фиг. 3В CDR подчеркнуты. На фиг. 3С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 3D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 3С. На фиг. 3D CDR подчеркнуты.

На фиг. 4 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.4R4P2_C9. На фиг. 4А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 4В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 4А. На фиг. 4В CDR подчеркнуты. На фиг. 4С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 4D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 4С. На фиг. 4D CDR подчеркнуты.

На фиг. 5 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела АС1.4R4P2_C10. На фиг. 5А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 5В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 5А. На фиг. 5В CDR подчеркнуты. На фиг. 5С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 5D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 5С. На фиг. 5D CDR подчеркнуты.

На фиг. 6 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела АС1.2R3P7_D3. На фиг. 6А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 6В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 6А. На фиг. 6В CDR подчеркнуты. На фиг. 6С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 6D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 6С. На фиг. 6D CDR подчеркнуты.

На фиг. 7 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.2R2P2_D6. На фиг. 7А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 7В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 7А. На фиг. 7В CDR подчеркнуты. На фиг. 7С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 7D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 7С. На фиг. 7D CDR подчеркнуты.

На фиг. 8 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AC1.2R2P2_D8. На фиг. 8А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 8В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 8А. На фиг. 8В CDR подчеркнуты. На фиг. 8С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 8D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 8С. На фиг. 8D CDR подчеркнуты.

На фиг. 9 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.3R3P6_E1. На фиг. 9А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 9В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 9А. На фиг. 9В CDR подчеркнуты. На фиг. 9С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 9D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 9С. На фиг. 9D CDR подчеркнуты.

На фиг. 10 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.3R3P5_F8. На фиг. 10А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 10В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 10А. На фиг. 10В CDR подчеркнуты. На фиг. 10С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 10D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 10С. На фиг. 10D CDR подчеркнуты.

На фиг. 11 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.3R3P6_F9. На фиг. 11А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 11В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 11А. На фиг. 11В CDR подчеркнуты. На фиг. 11С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 11D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 11С. На фиг. 11D CDR подчеркнуты.

На фиг. 12 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.4R4P2_G7. На фиг. 12А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 12В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 12А. На фиг. 12В CDR подчеркнуты. На фиг. 12С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 12D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 12С. На фиг. 12D CDR подчеркнуты.

На фиг. 13 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.1R3P3_G9. На фиг. 13А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 13В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 13А. На фиг. 13В CDR подчеркнуты. На фиг. 13С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 13D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 13С. На фиг. 13D CDR подчеркнуты.

На фиг. 14 представлен ряд нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей анти-huIFN γ-антитела AD1.3R3P6_G10. На фиг. 14А представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, а на фиг. 14В представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 14А. На фиг. 14В CDR подчеркнуты. На фиг. 14С представлена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, а на фиг. 14D представлена аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг. 14С. На фиг. 14D CDR подчеркнуты.

На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий ингибирование IFN γ-индуцированной экспрессии гена-репортера под действием периплазматических scFv-экстрактов. Определенное количество scFv-экстрактов ингибировало IFN γ-индуцируемую экспрессию гена-репортера в зависимости от дозы. Были протестированы различные концентрации (2,7, 0,68, 0,17, 0,043 и 0,011 нМ) для каждого scFv-клона, название которого указано вверху в каждом столбце (по убывающей концентрации слева направо, см. также табл. 3, приведенную ниже).

На фиг. 16 на панелях 1-12 представлена серия графиков, иллюстрирующих ингибирование IFN γ-индуцируемой экспрессии МНС класса II на клетках меланомы под действием scFv-экстрактов. Очищенные полноразмерные человеческие scFv ингибировали IFN γ-индуцируемую экспрессию МНС II на клетках меланомы. Представлены графики для scFv-клонов (-) и для мышиных mAb против человеческого IFN γ 16C3 (---).

На фиг. 17 на панелях 1-7 представлена серия графиков, иллюстрирующих ингибирование IFN γ-индуцируемой экспрессии МНС класса II на клетках меланомы под действием scFv-экстрактов, которые были преобразованы в каркас полностью человеческого IgG. Очищенные mAb против полностью человеческих IgG ингибировали IFN γ-индуцируемую экспрессию МНС II на клетках меланомы. Представлены графики для полностью человеческих IgG-клонов (-Х-), мышиных mAb против человеческого IFN γ 16C3 (- ▲-) и мышиных МАВ285 против человеческого IFN γ, R &D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) (- ●-).

На фиг. 18 представлен график, иллюстрирующий аффинность антитела NI-0501 против человеческого IFNy (huIFN γ).

На фиг. 19 представлен график, иллюстрирующий сравнение активности антител, продуцируемых клонами А6 и NI-0501 (также называемых здесь "А6, подвергнутым обратной мутации с восстановлением зародышевой линии" или "обратно мутированным А6'').

На фиг. 20 представлен график, иллюстрирующий активность анти-huIFN γ-антитела NI-0501 против природного человеческого IFN γ.

На фиг. 21A-F представлена серия графиков, иллюстрирующих связывание анти-huIFN γ-антитела NI-0501 с рекомбинантным IFN γ, происходящим от различных видов.

На фиг. 22 представлен график, иллюстрирующий способность анти-huIFN γ-антитела NI-0501 нейтрализовать активацию МНС класса II, индуцируемую нативным IFN γ собакоподобных обезьян.

На фиг. 23 представлен график, иллюстрирующий способность анти-huIFN γ-антитела NI-0501 блокировать IFN γ-индуцируемое продуцирование IP-10 в цельной крови.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим моноклональным антителам против интерферона-гамма (IFN γ). Эти антитела в целом называются здесь анти-huIFN γ-антителами.

Анти-huIFN γ-антителами являются, например, антагонисты или ингибиторы IFN γ, модулирующие по меньшей мере одну биологическую активность IFN γ. Биологическими активностями IFN γ являются, например, связывание с рецептором IFN γ (IFN γ-R), модуляция, например снижение уровня или ингибирование экспрессии главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II на клеточной поверхности, и модуляция, например снижение или ингибирование пролиферации клеток. Так, например, анти-huIFN γ-антитела полностью или частично ингибируют активность IFN γ посредством частичного или полного блокирования связывания IFN γ с рецептором IFN γ (IFN γ-R). Считается, что анти-IFN γ-антитела конкурентно ингибируют активность IFN γ, если уровень активности IFN γ в присутствии анти-huIFN γ-антитела снижается по меньшей мере на 95%, например на 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем активности IFN γ в отсутствие связывания с описанным здесь анти-huIFN γ-антителом. Считается, что анти-IFN γ-антитела частично ингибируют активность IFN γ, если уровень активности IFN γ в присутствии анти-huIFN γ-антитела снижается менее чем на 95%, например на 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 85 или 90% по сравнению с уровнем активности IFN γ в отсутствие связывания с описанным здесь анти-huIFN γ-антителом.

Кроме того, анти-huIFN γ-антитела согласно изобретению ингибируют IFN γ-индуцируемую экспрессию МНС класса II на клетках (см., например, примеры 4 и 5). Предпочтительно анти-huIFN γ-антитела более чем на 50% ингибируют IFN γ-индуцируемую экспрессию МНС класса II в человеческой клеточной линии меланомы Ме67.8 при концентрации по меньшей мере 0,02 нМ. Так, например, указанные антитела более чем на 50% ингибируют IFN γ-индуцируемую экспрессию МНС класса II в клеточной линии Ме67.8 при концентрации в пределах от 0,022 до 0,044 нМ, например при концентрации 0,022, 0,028 или 0,044 нМ.

Анти-huIFN γ-антитела модулируют иммунный ответ у индивидуума, например у человека. Предпочтительно, указанные анти-huIFN γ-антитела модулируют адаптивный иммунный ответ у индивидуума. Более предпочтительно анти-huIFN γ-антитела модулируют клеточный или клеточно-опосредуемый иммунный ответ, также известный как ответ Th1-типа или Th1-опосредуемый ответ.

Так, например, описанные здесь анти-huIFN γ-антитела модулируют, например снижают, ингибируют или предотвращают повышение Th1-опосредуемого иммунного ответа, например повышение Th1-опосредуемого иммунного ответа, ассоциированного с аутоиммунным воспалительным расстройством, таким как болезнь Крона, системная красная волчанка, псориаз, саркоидоз, ревматоидный артрит, васкулиты, атопический дерматит и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз. Используемый здесь термин "повышенный" Th1-опосредуемый иммунный ответ означает присутствие повышенного уровня Th1-цитокинов, таких как IL-2, IL-3, TNF-альфа (TNF- α) и IFN γ, у индивидуума по сравнению с уровнем продуцирования Th1-цитокинов у индивидуума, не страдающего заболеванием или расстройством, ассоциированным с повышенным иммунным Th1-ответом. Для отнесения Th1-опосредуемого иммунного ответа к категории повышенного ответа оценивают уровень продуцирования Th1-цитокинов, например, путем измерения и оценки уровня секретируемых цитокинов с помощью ELISA или другого анализа.

Описанные здесь анти-huIFN γ-антитела модулируют, например ингибируют, снижают или предотвращают переключение класса на изотип IgG, такое как IFN γ-индуцируемое переключение класса.

Такие анти-huIFN γ-антитела модулируют, например ингибируют, предотвращают или снижают Th1-опосредуемый ответ и, тем самым, подавляют IFN γ-индуцируемое переключение класса.

Анти-huIFN γ-антитела согласно изобретению были продуцированы путем иммунизации животного IFN γ, таким как мышиный или человеческий IFN γ (см., например, Genbank Accession No. X13274) или его иммуногенным фрагментом, производным или вариантом. Альтернативно, животное иммунизируют клетками, транфицированным вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую IFN γ, так, чтобы IFN γ экспрессировался на поверхности трансфицированных клеток и связывался с ними. Альтернативно, указанные антитела получают путем скрининга библиотеки, содержащей антитело или последовательности антигенсвязывающего домена, связывающиеся с IFN γ. Эту библиотеку получают, например, в бактериофаге в виде белковых или пептидных гибридов с оболочечным белком бактериофага, который экспрессируется на поверхности собранных фаговых частиц, содержащих кодирующие последовательности ДНК (и такая библиотека называется "библиотекой фагового представления").

Анти-huIFN γ-антитела согласно изобретению включают, например, гипервариабельные области тяжелой цепи (CDR), представленные ниже в табл. 1, CDR легкой цепи, представленные в табл. 2, и их комбинации.

Таблица 1Последовательности VH клонов антител, которые связываются с IFN γ и нейтрализуют его

Таблица 2Последовательности VL клонов антител, которые связываются с IFN γ и нейтрализуют его

Репрезентативным моноклональным анти-huIFN γ-антителом является описанное здесь антитело NI-0501. Антитело NI-0501 представляет собой вариант антитела АС1.2R3.Р2_А6, подвергнутый "обратной мутации". Используемый здесь термин "обратная мутация" означает мутацию нуклеотида или аминокислотного остатка, которая приводит к восстановлению нуклеотида или аминокислотного остатка, присутствующего в соответствующем положении последовательности зародышевой линии. Антитело NI-0501 включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 7), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 6 (фиг. 1A-1D).

Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области (CDR), определенные по Чотию и др. и по Кэбату и др. (Е.А. Kabat), подчеркнуты на фиг. 1В и 1D (см. Chothia, С., et al., Nature 342:877-883 (1989); Kabat, E.A., et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). CDR тяжелой цепи антитела А6 имеет следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) и DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5). CDR легкой цепи антитела А6 имеет следующие последовательности: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 8); EDNQRPS (SEQ ID NO: 9) и QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10).

Другим репрезентативным моноклональным анти-huIFN γ-антителом является описанное здесь антитело АС1.2R3.Р2_А6 ("А6"). Антитело А6 включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 103), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 102, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 105), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 104 (фиг. 1Е-1Н). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области (CDR) и определенные по Чотию и др. и по Кэбату и др. (Е.А. Kabat), подчеркнуты на фиг. 1F и 1Н (см. Chothia, С., et al., Nature 342:877-883 (1989); Kabat, E.A., et al., Sequences of Protein of immunological interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). CDR тяжелой цепи антитела А6 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5). CDR легкой цепи антитела А6 имеют следующие последовательности: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 106); EDNRRPS (SEQ ID NO: 107) и QSYDGSNRWM (SEQ ID NO: 10).

Антитело AC1.2R3P2_B4 (также обозначаемое здесь "В4") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 12), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 15), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 14 (фиг. 2А-2D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 2В и 2D. CDR тяжелой цепи антитела В4 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DHSSGWYVISGMDV (SEQ ID NO: 13). CDR легкой цепи антитела В4 имеют следующие последовательности: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSNDSDNVV (SEQ ID NO: 18).

Антитело AD1.4R4P1_B9 (также обозначаемое здесь "В9") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 20), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 23), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 22 (фиг. 3А-3D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 3В и 3D. CDR тяжелой цепи антитела В9 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DLTVGGPWYYFDY (SEQ ID NO: 21). CDR легкой цепи антитела В9 имеют следующие последовательности: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 8); DDDQRPS (SEQ ID NO: 25) и QSYDSSNVV (SEQ ID NO: 26).

Антитело AD1.4R4P2_C9 (также обозначаемое здесь "С9") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 28), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 31), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 30 (фиг. 4А-4D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 4В и 4D. CDR тяжелой цепи антитела С9 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29). CDR легкой цепи антитела С9 имеют следующие последовательности: TRSGGSIGSYYVQ (SEQ ID NO: 32); DDKKRPS (SEQ ID NO: 33) и QSYDSNNLVV (SEQ ID NO: 34).

Антитело АС1.4R4P2_C10 (также обозначаемое здесь "C10") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 36), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 38), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 37 (фиг. 5А-5D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 5В и 5D. CDR тяжелой цепи антитела C10 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5). CDR легкой цепи антитела C10 имеет следующие последовательности: TRSSGTIASNYVQ (SEQ ID NO: 39); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSYDNSNHWV (SEQ ID NO: 40).

Антитело AC1.2R3P7_D3 (также обозначаемое здесь "D3") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 42), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 41, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 47), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 46 (фиг. 6А-6D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 6В и 6D. CDR тяжелой цепи антитела D3 имеют следующие последовательности: SNAMS (SEQ ID NO: 43); TLTGSGGTAYYADSVEG (SEQ ID NO: 44) и GTELVGGGLDN (SEQ ID NO: 45). CDR легкой цепи антитела D3 имеет следующие последовательности: TGSGGSIATNYVQ (SEQ ID NO: 48); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSYDSDNHHVV (SEQ ID NO: 49).

Антитело AD1.2R2P2_D6 (также обозначаемое здесь "D6") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 51), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 54), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 53 (фиг. 7А-7D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 7В и 7D. CDR тяжелой цепи антитела D3 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29). CDR легкой цепи антитела D6 имеет следующие последовательности: TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 55); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSYDSSNQEVV (SEQ ID NO: 56).

Антитело AC1.2R2P2_D8 (также обозначаемое здесь "D8") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 58), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 60), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 59 (фиг. 8А-8D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 8В и 8D. CDR тяжелой цепи антитела D8 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGSSGWYVPHWFDP (SEQ ID NO: 5). CDR легкой цепи антитела D8 имеет следующие последовательности: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 8); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSYDSNNFWV (SEQ ID NO: 61).

Антитело AD1.3R3P6_E1 (также обозначаемое здесь "E1") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 63), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 66), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 65 (фиг. 9А-9D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 9В и 9D. CDR тяжелой цепи антитела Е1 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и RSFDSGGSFEY (SEQ ID NO: 64). CDR легкой цепи антитела E1 имеет следующие последовательности: TRSSGSIVSNYVQ (SEQ ID NO: 8); DDDQRPS (SEQ ID NO: 25) и QSYDSSNVV (SEQ ID NO: 26).

Антитело AD1.3R3P5_F8 (также обозначаемое здесь "F8") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 68), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 67, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 71), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 70 (фиг. 10А-10D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 10В и 10D. CDR тяжелой цепи антитела F8 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и VGSWYLEDFDI (SEQ ID NO: 69). CDR легкой цепи антитела F8 имеет следующие последовательности: TRSSGSIASNYVH (SEQ ID NO: 72); EDNRRPS (SEQ ID NO: 9) и QSSDTTYHGGVV (SEQ ID NO: 73).

Антитело AD1.3R3P6_F9 (также обозначаемое здесь "F9") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 75), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 74, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 78), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 77 (фиг. 11А-11D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 11В и 11D. CDR тяжелой цепи антитела F9 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:4) и GGNYGDYFDYFDY (SEQ ID NO: 76). CDR легкой цепи антитела F9 имеют следующие последовательности: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSYEGF (SEQ ID NO: 79).

Антитело AD1.4R4P2_G7 (также обозначаемое здесь "G7") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 81), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 80, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 83), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 82 (фиг. 12А-12D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 12В и 12D. CDR тяжелой цепи антитела G7 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29). CDR легкой цепи антитела G7 имеют следующие последовательности: TGRNGNIASNYVQ (SEQ ID NO:84); EDTQRPS (SEQ ID NO: 85) и QSSDSNRVL (SEQ ID NO: 86).

Антитело AD1.1R3P3_G9 (также обозначаемое здесь "G9") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 88), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 87, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 91), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 90 (фиг. 13А-13D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 13В и 13D. CDR тяжелой цепи антитела G9 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO:3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DFWVITSGNDY (SEQ ID NO: 89). CDR легкой цепи антитела G9 имеют следующие последовательности: TRSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 16); EDNRRPS (SEQ ID NO: 9) и QSFDSTNLVV (SEQ ID NO: 92).

Антитело AD1.3R3P6_G10 (также обозначаемое здесь "G10") включает вариабельную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 94), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (SEQ ID NO: 96), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 95 (фиг. 14А-14D). Аминокислоты, составляющие гипервариабельные области CDR и определенные по Чотию и др. (1989) и по Кэбату и др. (1991), подчеркнуты на фиг. 14В и 14D. CDR тяжелой цепи антитела G10 имеют следующие последовательности: SYAMS (SEQ ID NO: 3); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 4) и DGWNALGWLES (SEQ ID NO: 29). CDR легкой цепи антитела G10 имеют следующие последовательности: AGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 97); EDNQRPS (SEQ ID NO: 17) и QSYSYNNQVV (SEQ ID NO: 98).

Анти-huIFN γ-антителами согласно изобретению также являются антитела, которые включают аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97, 98, 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 12, 20, 28, 36, 42, 51, 58, 63, 68, 75, 81, 88, 94 или 103 (фиг. 1-14), и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 90, 92, 95, 97 98, 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 38, 47, 54, 60, 66, 71, 78, 83, 91, 96 или 105 (фиг. 1-14).

Альтернативно, моноклональным антителом является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, как и антитело NI-0501, А6, В4, В9, С9, С10, D3, D6, D8, E1, F8, F9, G7, G9 или G10.

Если это не оговорено особо, то используемые в настоящем описании научные и технические термины имеют общепринятые значения, известные среднему специалисту в данной области. Кроме того, если это не очевидно из контекста описания, то существительные, употребляемые в единственном числе, могут означать и существительные во множественном числе, а существительные, употребляемые во множественном числе, могут означать существительные в единственном числе. В общих чертах, номенклатура и способы культивирования тканей, методы молекулярной биологии, химии белков и олиго- или полинуклеотидов и их гибридизации, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Стандартными методами являются методы рекомбинантных ДНК, олигонуклеотидный синтез, а также культивирование и трансформация тканей (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителей или в соответствии со стандартными процедурами или процедурами, описанными в настоящей заявке. Вышеупомянутые способы и процедуры обычно осуществляют стандартными методами, хорошо известными специалистам и описанными в различных общих и специальных руководствах, цитируемых и обсуждаемых в настоящем описании. См., например, руководство Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Используемая здесь номенклатура, лабораторные процедуры и методы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящей заявке, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Химический синтез, химические анализы, приготовление фармацевтических препаратов, составление композиций, их доставку и лечение пациентов осуществляют стандартными методами.

В описании настоящего изобретения используются указанные ниже термины, которые, если это не оговорено особо, имеют значения, определенные ниже.

Используемый здесь термин "антитело" означает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина (Iq), то есть молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, специфически связывающийся (вступающий в иммунную реакцию) с антигеном. Такими антителами являются, но не ограничиваются ими, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело, Fab-, Fab'- и F(ab') 2 -фрагменты и библиотека экспрессируемых Fab-фрагментов. Термин "специфически связывается" или "вступает в иммунную реакцию" означает, что указанное антитело реагирует с одной или несколькими антигенными детерминантами нужного антигена и не реагирует (то есть не связывается) с другими полипептидами или связывается с другими полипептидами с гораздо более низкой аффинностью (K d > 10 -6 ).

Известно, что основную структурную единицу антитела составляет тетрамер. Каждый тетрамер состоит из идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну "легкую" цепь (примерно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (примерно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область, состоящую примерно из 100-110 или более аминокислот, ответственных, главным образом, за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяется константной областью, ответственной, главным образом, за эффекторную функцию. Легкие цепи человеческого антитела классифицируются как легкие цепи κ и λ. Тяжелые цепи классифицируются как μ-, δ-, γ-, α- или ε-цепи и определяют изотип антитела, такой как IgM, IgD, IgA и IgE соответственно. В легких и тяжелых цепях имеются вариабельные и константные области, присоединенные друг к другу "J"-областью, состоящей примерно из 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает "D"-область, состоящую примерно из 10 или более аминокислот. В общих чертах, см. руководство Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ea., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Вариабельные области каждой пары легких/тяжелых цепей образуют антигенсвязывающий сайт.

Используемый здесь термин "моноклональное антитело" (MAb) или композиция "моноклональных антител" означает популяцию молекул антител, содержащих молекулы антител только одного вида, состоящие из одного генного продукта легкой цепи и одного генного продукта тяжелой цепи. В частности, гипервариабельные области (CDR) моноклонального антитела являются идентичными у всех молекул данной популяции. MAb содержат антигенсвязывающий сайт, способный вступать в иммунную реакцию с конкретным эпитопом антигена, характеризующимся аффинностью специфического связывания с этим антителом.

В общих чертах, молекулы человеческих антител относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, которые отличаются друг от друга природой тяжелой цепи, присутствующей в данной молекуле. Некоторые классы также подразделяются на подклассы, такие как IgG1, IgG2 и т.п. Кроме того, у человека легкая цепь может представлять собой цепь κ или λ.

Термин "антигенсвязывающий сайт" или "связывающая часть" означает часть молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании с антигеном. Антигенсвязывающий сайт образован аминокислотными остатками N-концевых вариабельных ("V") областей тяжелой цепи ("Н") и легкой цепи ("L"). Три в высокой степени вариабельных фрагмента, присутствующих в V-областях тяжелой и легкой цепей, называемых "гипервариабельными областями", расположены между более консервативными фланкирующими фрагментами, известными как "каркасные области" или "FR". Таким образом, термин "FR" означает аминокислотные последовательности, которые обычно расположены между гипервариабельными областями в иммуноглобулинах и являются смежными с этими гипервариабельными областями. В молекуле антитела указанные три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи локализованы напротив друг друга в трехмерном пространстве и образуют антигенсвязывающую поверхность. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связанного антигена, и указанные три гипервариабельные области каждой тяжелой и легкой цепей называются "комплементарность-определяющими областями" или "CDR". Присвоение аминокислот каждому домену белков, представляющих интерес с точки зрения иммунологии, осуществляют в соответствии с определениями последовательностей по Кэбату (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)) или по Чотию (Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia at al. Nature 342:878-883 (1989)).

Используемый здесь термин "эпитоп" означает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином, scFv или с Т-клеточным рецептором. Термин "эпитоп" включает любую детерминанту белка, способную специфически связываться с иммуноглобулином или с Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обычно имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Считается, что антитело специфически связывается с антигеном, если константа диссоциации составляет ≤1 мкМ, предпочтительно ≤100 нМ, а наиболее предпочтительно ≤10 нМ.

Используемые здесь термины "иммунологическое связывание" и "иммунологические связывающие свойства" означают нековалентные взаимодействия определенного типа, которые происходят между молекулой иммуноглобулина и антигеном, по отношению к которому данный иммуноглобулин является специфичным. Сила связывания или аффинность иммунологических взаимодействий могут быть определены таким термином как "константа диссоциации" (K d ) взаимодействия, при этом чем меньше K d , тем больше аффинность. Иммунологические связывающие свойства выбранных полипептидов количественно определяют методами, хорошо известными специалистам. Один из таких методов позволяет измерять скорость образования и диссоциации комплекса "антигенсвязывающий сайт/антиген", где указанная скорость зависит от концентрации партнеров данного комплекса, аффинности взаимодействия и геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, "констнанта скорости ассоциации" (K on ) и "констнанта скорости диссоциации" (K off ) могут быть определены путем вычисления концентраций и фактических скоростей ассоциации и диссоциации (см. Nature 361: 186-87 (1993)). Отношение K off /K on позволяет исключить все параметры, не относящиеся к аффинности, и равно константе диссоциации K d (см. в общих чертах Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473). Считается, что антитело согласно изобретению специфически связывается с эпитопом IFN γ, если константа равновесного связывания (K d ) составляет ≤1 мкМ, предпочтительно ≤100 нМ, более предпочтительно ≤10 нМ, а наиболее предпочтительно от ≤100 примерно до 1 пМ, как было измерено в анализах, таких как анализы на связывание с радиоактивным лигандом или аналогичные анализы, известные специалистам.

Специалистам в данной области известно, что без излишнего экспериментирования можно определить, обладает ли человеческое моноклональное антитело такой же специфичностью, как и человеческое моноклональное антитело согласно изобретению (например, моноклональное антитело NI-0501, А6, В4, В9, С9, С10, D3, D6, D8, E1, F8, F9, G7, G9 или G10), путем установления способности первого из указанных антител предотвращать связывание второго из указанных антител с полипептидом антигена IFN γ. Если тестируемое человеческое моноклональное антитело конкурирует с человеческим моноклональным антителом согласно изобретению, на что будет указывать снижение уровня связывания с человеческим моноклональным антителом согласно изобретению, то эти два моноклональных антитела связываются с одним и тем же или с близкородственным эпитопом. Для того чтобы установить, обладает ли человеческое моноклональное антитело специфичностью человеческого моноклонального антитела согласно изобретению, может быть применен другой способ, включающий предварительное инкубирование человеческого моноклонального антитела согласно изобретению с полипептидом антигена IFN γ, с которым оно обычно реагирует, и последующее добавление тестируемого человеческого моноклонального антитела для того, чтобы определить, ингибируется ли способность тестируемого человеческого моноклонального антитела связываться с полипептидом антигена IFN γ. Если такое ингибирование тестируемого человеческого моноклонального антитела происходит, то, по всей вероятности, это антитело обладает такой же или функционально эквивалентной специфичностью к эпитопу, как и моноклональное антитело согласно изобретению.

Для продуцирования моноклональных антител против белка, такого как белок IFN γ, или против его производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов, применяются различные процедуры, известные специалистам (см., например, руководство Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки). Полностью человеческими антителами являются молекулы антител, в которых все последовательности легкой и тяжелой цепей, включая CDR, происходят от человеческих генов. Такие антитела называются здесь "человеческими антителами" или "полностью человеческими антителами". Человеческие моноклональные антитела получают, например, в соответствии с процедурами, описанными ниже в разделе "Примеры". Человеческие моноклональные антитела могут быть также получены триомным методом; методом с использованием человеческой В-клеточной гибридомы (см. Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); и методом EBV-гибридом с продуцированием человеческих моноклональных антител (см. Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут быть продуцированы с использованием человеческих гибридом (см. Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейна-Барра in vitro (см. Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Антитела очищают хорошо известными методами, такими как аффинная хроматография на белке А или белке G, которая позволяет получать, главным образом, IgG-фракцию в иммунной сыворотке. Затем или альтернативно, специфический антиген, который является мишенью для рассматриваемого иммуноглобулина, или его эпитоп могут быть иммобилизованы на колонке для очистки иммуноспецифического антитела с помощью иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, в работе D. Wilkinson (опубликованной в The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28).

Антитело согласно изобретению желательно модифицировать так, чтобы это приводило к усилению его эффекторной функции, например, к повышению его эффективности при лечении иммунных заболеваний. Так, например, цистеиновый(е) остаток(ки) может (могут) быть введен(ы) в Fc-область для образования в этой области межцепьевой дисульфидной связи. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать повышенной способностью к интернализации и/или к комплемент-опосредуемому клеточному лизису и повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Альтернативно, антитело может быть сконструировано так, чтобы оно имело две Fc-области и, тем самым, обладало бы повышенной способностью к лизису комплемента и антителозависимой цитотоксичностью (ADCC) (см. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).

Настоящее изобретение также включает Fv-, Fab-, Fab'- и F(ab') 2 -фрагменты анти-huIFN γ-антитела, одноцепочечные анти-huIFN γ-антитела, биспецифические анти-huIFN γ-антитела и гетероконъюгаты анти-huIFN γ-антител.

Биспецифическими антителами являются антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными антигенами. В настоящем изобретении одной из таких специфичностей связывания является специфичность к IFN γ. Второй мишенью связывания является любой другой антиген, а предпочтительно белок клеточной поверхности, рецептор или субъединица рецептора.

Методы получения биспецифических антител известны специалистам. Традиционный метод рекомбинантного продуцирования биспецифических антител основан на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). В результате случайной реаранжировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют смесь из десяти возможных различных молекул антитела, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистку такой "правильной" молекулы обычно осуществляют путем проведения постадийной аффинной хроматографии. Аналогичные процедуры описаны, например, в заявке WO 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 г., и в работе Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Вариабельные домены антитела, обладающие нужной специфичностью связывания (имеющие сайты связывания с антигеном), могут быть присоединены к последовательностям константного домена иммуноглобулина. Такой гибрид предпочтительно имеет константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере часть шарнирной области, СН2-области и СН3-области. При этом предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из гибридов присутствовала первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью. ДНК, кодирующие гибриды тяжелых цепей иммуноглобулина и, если это необходимо, гибриды легких цепей иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессионные векторы и котрансфицируют в подходящий организм хозяина. Более подробное описание получения биспецифических антител можно найти, например, в публикации Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

В соответствии с другим подходом, описанным в WO 96/27011, пограничная область между парой молекул антител может быть сконструирована в целях максимизации процента содержания гетеродимеров, которые выделяют из рекомбинантной клеточной культуры. Предпочтительная пограничная область содержит по меньшей мере часть СН3-области константного домена антитела. В этом методе одну или несколько небольших аминокислот боковых цепей в пограничной области молекулы первого антитела заменяют более крупными аминокислотами боковых цепей (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие "полости" идентичного или аналогичного размера для крупных боковых цепей создают на пограничной области второй молекулы антитела путем замены крупных аминокислот боковых цепей более мелкими аминокислотами (например, аланином или треонином). Такая замена обеспечивает механизм увеличения выхода гетеродимеров по отношению к выходам других нежелательных побочных продуктов, таких как гомодимеры.

Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или их фрагментов (например, F(ab') 2 -фрагментов биспецифических антител). Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител описаны в литературе. Так, например, биспецифические антитела могут быть получены посредством химического связывания. В работе Brennan et al., Science 229:81 (1985) описана процедура протеолитического расщепления интактных антител с получением F(ab') 2 -фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, а именно арсенита натрия, для стабилизации соседних дитиолов и для предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в тионитробензоатные (TNB) производные. После этого одно из производных Fab'-TNB снова превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB, в результате чего получают биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Кроме того, Fab'-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E.coli и подвергнуты химическому связыванию с образованием биспецифических антител. В публикации Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) описано продуцирование полностью гуманизированной молекулы F(ab') 2 -фрагмента биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент был отдельно секретирован из E.coli и подвергнут непосредственному химическому связыванию in vitro с образованием биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладает способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и с нормальными человеческими Т-клетками, а также способностью индуцировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, направленную против опухоли-мишени молочной железы человека.

Были также описаны различные методы получения и выделения биспецифических фрагментов антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Так, например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием "лейциновых молний". Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиды "лейциновой молнии" белков Fos и Jun были присоединены к Fab'-фрагментам двух различных антител путем лигирования их генов. Гомодимеры антител были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем снова окислены с образованием гетеродимеров антител. Этот метод может быть также применен для продуцирования гомодимеров антител. Техника "диантител", описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), представляет собой альтернативный метод получения фрагментов биспецифических антител. Эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V H ), присоединенный к вариабельному домену легкой цепи (V L ) посредством линкера, который является слишком коротким для образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи. В соответствии с этим, домены V H и V L одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными доменами V H и V L другого фрагмента и, тем самым, образовывать два антигенсвязывающих сайта. Была также описана и другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, предусматривающая использование одноцепочечных Fv(sFv)-димеров. См. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Рассматриваются также антитела, имеющие более чем две валентности. Так, например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

Репрезентативные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами, по меньшей мере один из которых присутствует в антигене белка согласно изобретению. Альтернативно, антигенсвязывающий домен молекулы иммуноглобулина может быть присоединен к домену, который связывается со стимулирующей молекулой на лейкоцитах, такой как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD2, IFN γ, CD28 или В7), или с Fc-рецепторами для IgG (Fc γR), такими как Fc γRI (CD64), FcyRII (IFN γII) и Fc γRIII (CD16), так, чтобы их механизм клеточной защиты был направлен на клетки, экспрессирующие конкретный антиген. Биспецифические антитела могут быть также использованы для направления цитотоксических агентов на клетки, которые экспрессируют конкретный антиген. Эти антитела имеют антигенсвязывающий домен и домен, который связывается с цитотоксическим агентом или с агентом, образующим хелатный комплекс с радионуклидом, таким как EOTUBE, DPTA, DOTA или ТЕТА. Другое представляющее интерес биспецифическое антитело связывается с описанным здесь антигеном белка, а также связывается с тканевым фактором (TF).

Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела используются, например, для направления клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекций (WO 91/00360; WO 92/200373; ЕР 03089).

Предполагается, что такие антитела могут быть получены in vitro известными методами химического синтеза белков, включая методы с использованием перекрестносшивающих агентов. Так, например, иммунотоксины могут быть сконструированы путем проведения реакций дисульфидного обмена или образования тиоэфирной связи.

Примерами реагентов, подходящих для этих целей, являются иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и реагенты, описанные, например, в патенте США № 4676980.

Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат).

Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки фитолакки американской (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для продуцирования антител, конъюгированных с радионуклидом, могут быть использованы различные известные радионуклиды. Примерами являются 212 Bi, 131 I, 131 In, 90 Y и 186 Re.

Конъюгаты антител и цитотоксических агентов получают с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен как описано в работе Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Репрезентативным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклида с антителом является 14 С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен-триаминпента-уксусная кислота (MX-DTPA). (См. WO 94/11026).

Среднему специалисту в данной области известно, что к полученным антителам или к другим молекулам согласно изобретению могут быть присоединены различные молекулы широкого ряда (см., например, публикацию "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R.E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), полное содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Присоединение осуществляют посредством любой химической реакции связывания двух молекул, при условии, что указанное антитело и другая молекула будут сохранять свою активность. Такое связывание может происходить посредством многих химических механизмов, например посредством ковалентного связывания, аффинного связывания, интеркаляции, координированного связывания и образования комплексов. Однако предпочтительным связыванием является ковалентное связывание. Ковалентное связывание осуществляют либо путем прямой конденсации имеющихся боковых цепей, либо путем включения внешних молекул, образующих мостиковые связи. Для присоединения молекул белка, например антител согласно изобретению, к другим молекулам может быть использовано множество двухвалентных или поливалентных связывающих агентов. Так, например, репрезентативными связывающими агентами могут быть органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидоэфиры, диизоцианаты, глутаральдегид, диазобензолы и гексаметилендиамины. Этот список не является исчерпывающим списком связывающих агентов различных классов, известных специалистам, а просто включает примеры наиболее часто используемых связывающих агентов. (См. Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); и Vitetta et al. , Science 238: 1098 (1987). Предпочтительные линкеры описаны в литературе. (См., например, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984), где описано использование MBS (М-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидоэфира). См. также патент США № 5030719, где описано использование галогенированного производного ацетилгидразида, присоединенного к антителу посредством олигопептидного линкера. Наиболее предпочтительными линкерами являются: (i) EDC (гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида); (ii) SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил- α-метил- α-(2-пиридилдитио)толуол) (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат) (Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамид]гексаноат) (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); и (v) сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид: Pierce Chem. Co., Cat. #24510), конъюгированные с EDC.

Описанные выше линкеры содержат компоненты, имеющие различные признаки, позволяющие получать конъюгаты с различными физико-химическими свойствами. Так, например, сульфо-NHS-эфиры алкилкарбоксилатов являются более стабильными, чем сульфо-NHS-эфиры ароматических карбоксилатов. Линкеры, содержащие NHS-эфир, являются менее растворимыми, чем линкеры, содержащие сульфо-NHS-эфиры. Кроме того, указанный линкер SMPT содержит стерически затрудненную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с более высокой стабильностью. Дисульфидные связи обычно являются менее стабильными, чем другие связи, поскольку дисульфидная связь расщепляется in vitro, что приводит к образованию менее доступного конъюгата. В частности, сульфо-NHS может повышать стабильность карбодиимидных связей. Карбодиимидные связи (такие как EDC), если они используются в сочетании с сульфо-NHS, образуют сложные эфиры, которые являются более резистентными к гидролизу, чем связи, полученные только посредством реакции карбодиимидного связывания.

Используемый здесь термин "выделенный полинуклеотид" означает полинуклеотид, полученный от геномной ДНК, кДНК или путем синтеза, или их некоторых комбинаций, где указанный "выделенный полинуклеотид" по своей природе (1) не ассоциирован со всеми полинуклеотидами или с частью полинуклеотидов, с которыми он ассоциируется в природе, (2) функционально присоединен к другому полинуклеотиду, с которым он не ассоциируется в природе или (3) не встречается в природе как часть более крупной последовательности.

Используемый здесь термин "выделенный белок" означает белок, продуцируемый кДНК, рекомбинантной РНК, или синтезированный белок, или их комбинацию, где указанный "выделенный белок", по своему происхождению или источнику происхождения, (1) не ассоциируется с природными белками, (2) изолирован от других белков, происходящих от того же источника, например от мышиных белков, (3) экспрессируется клетками различных типов или (4) не встречается в природе.

Используемый здесь термин "полипептид" представляет собой общее понятие, означающее нативный белок или фрагменты или аналоги полипептидной последовательности. Следовательно, фрагменты нативного белка, а также его аналоги представляют собой молекулы типа полипептидов. Предпочтительные полипептиды согласно изобретению включают молекулы тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, представленные на фиг. 1B, 2B, 3В и 4В, и молекулы легкой цепи человеческого иммуноглобулина, представленные на фиг. 1D, 2D, 3D и 4D, а также молекулы антитела, образованные комбинациями, содержащими молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина и молекулы легкой цепи иммуноглобулина, такие как молекулы легкой цепи κ иммуноглобулина, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги.

Используемый здесь термин "природный", относящийся к определенному объекту, означает, что данный объект может существовать в природе. Так, например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), может считаться природной, если она выделена из ее природного источника и если она не была специально модифицирована человеком в лабораторных или в каких-либо других условиях.

Используемый здесь термин "функционально присоединенный" относится к положениям описанных здесь компонентов, присоединенных друг к другу способом, обеспечивающим их "правильное" функционирование. Так, например, регуляторная последовательность, "функционально присоединенная" к кодирующей последовательности, связана с этой последовательностью так, чтобы могла осуществляться экспрессия кодирующей последовательности в условиях, пригодных для функционирования данных регуляторных последовательностей.

Используемый здесь термин "регуляторная последовательность" означает полинуклеотидые последовательности, необходимые для осуществления экспрессии и процессинга или для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. Природа таких регуляторных последовательностей варьируется в зависимости от организма-хозяина; причем в прокариотах такие регуляторные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания с рибосомой и последовательность терминации транскрипции; а в эукариотах такими регуляторными последовательностями обычно являются промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин "регуляторные последовательности" включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых является необходимым для осуществления экспрессии и процессинга, а также он может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например лидерные последовательности и последовательности, являющиеся партнерами для гибридных последовательностей. Используемый здесь термин "полинуклеотид" означает полимерную форму нуклеотидной последовательности длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, либо рибонуклеотидной или дезоксинуклеотидной последовательности, либо модифицированную форму, состоящую из нуклеотидов любого типа. Этот термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК.

Используемый здесь термин "олигонуклеотид" означает природные и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом природными и неприродными олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотидную подпоследовательность, имеющую длину обычно в 200 нуклеотидов или менее. Предпочтительно олигонуклеотиды имеют длину в 10-60 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно в 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 нуклеотидов. Обычно олигонуклеотиды являются одноцепочечными, например олигонуклеотиды, используемые в качестве зондов, хотя иногда они могут быть двухцепочечными, например олигонуклеотиды, используемые для конструирования генных мутантов. Олигонуклеотиды по изобретению могут быть смысловыми или антисмысловыми.

Используемый здесь термин "природные нуклеотиды" означает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый здесь термин "модифицированные нуклеотиды" означает нуклеотиды с модифицированными или с замещенными сахарными группами и т.п. Используемый здесь термин "олигонуклеотидные связи" включает такие олигонуклеотидные связи, как фосфортиоат, фосфордитиоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и т.п. См., например, LaPlanche et al., Nucl. Acids. Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids. Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., патент США № 5151510; Uhlmann & Peyman Chemical Reviews, 90:543 (1990). Если необходимо, олигонуклеотид может включать метку для детекции.

Используемый здесь термин "селективная гибридизация" относится к детектируемому и специфическому связыванию. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты согласно изобретению селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в таких условиях гибридизации и промывки, которые значительно минимизируют количество детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Для обеспечения селективной гибридизации, известной специалистам и обсуждаемой в настоящей заявке, могут быть использованы условия высокой жесткости. В общих чертах, гомология между последовательностями полинуклеотидов, олигонуклеотидов и фрагментов согласно изобретению и последовательностью представляющей интерес нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 80%, а более предпочтительно по меньшей мере 85, 90, 95, 99 и 100%. Две аминокислотные последовательности являются гомологичными, если их последовательности являются частично или полностью идентичными. Так, например, 85%-ная гомология последовательностей означает, что при выравнивании этих двух последовательностей для сопоставления на их максимальное соответствие, 85% аминокислот являются идентичными. "Пробелы" (в любой из двух сопоставляемых последовательностей) позволяют максимизировать соответствие; при этом предпочтительная длина пробела составляет 5 аминокислот или менее, а более предпочтительно 2 аминокислоты или менее. Альтернативно и предпочтительно, две последовательности белка (или полипептидные последовательности, происходящие от этих последовательностей и имеющие длину по меньшей мере в 30 аминокислот) считаются гомологичными в общепринятом смысле этого слова, если они имеют цену выравнивания более чем 5 (в единицах стандартного отклонения) при сопоставлении, осуществляемом с использованием программы ALIGN с матрицей данных по мутации и со штрафом за "пробел" 6 или более. См. публикацию Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation, 1972)) и приложение 2 к этому тому (Supplement 2 to this volume, pp. 1-10). Две последовательности или их части являются более предпочтительными гомологами, если их аминокислоты идентичны на 50% или более при их оптимальном сопоставлении путем выравнивания с использованием программы ALIGN. Используемый здесь термин "соответствует" означает, что полинуклеотидная последовательность является гомологичной (т.е. идентичной, но не является строго эволюционно родственной) всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности, либо этот термин означает, что данная полипептидная последовательность идентична эталонной полипептидной последовательности. В противоположность этому, используемый здесь термин "комплементарный" означает, что комплементарная последовательность гомологична всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности. Так, например, нуклеотидная последовательность "ТАТАС" соответствует эталонной последовательности "ТАТАС" и комплементарна эталонной последовательности "GTATA".

Для описания сходства между двумя или более полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями используются следующие термины: "эталонная последовательность", "окно сравнения", "идентичность последовательностей", "процент идентичности последовательностей" и "значительная идентичность". Термин "эталонная последовательность" означает последовательность, которая используется в качестве основы для сравнения последовательностей; эталонная последовательность может представлять собой подпоследовательность более крупной последовательности, например, сегмент полноразмерной кДНК или генной последовательности, имеющейся в списке последовательностей, либо эта последовательность может содержать полноразмерную кДНК или генную последовательность. Вообще говоря, эталонная последовательность имеет длину по меньшей мере в 18 нуклеотидов или 6 аминокислот, обычно по меньшей мере 24 нуклеотида или 8 аминокислот, а чаще всего по меньшей мере 48 нуклеотидов или 16 аминокислот. Поскольку каждая из двух полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей (1) может содержать последовательность (то есть часть полноразмерной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), которая является сходной у этих двух молекул, и (2) может, кроме того, содержать последовательность, которая отличается у этих двух полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей, то сравнение последовательностей двух (или более) молекул обычно осуществляют путем сопоставления последовательностей этих двух молекул по "окну сравнения" для идентификации и сравнения локальных областей гомологии последовательностей. Используемый здесь термин "окно сравнения" означает концептуальный сегмент, состоящий по меньшей мере из 18 смежных нуклеотидов или из 6 аминокислот, где полинуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность могут сравниваться с эталонной последовательностью, состоящей по меньшей мере из 18 смежных нуклеотидов или из 6 аминокислот, и где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления, делеции, замены и т.п. (то есть пробелы), которые составляют 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью (не содержащей добавлений или делеций) и которые используются для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей, осуществляемое для их сопоставления по окну сравнения, может быть осуществлено с использованием алгоритма локальной гомологии (Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), алгоритма выравнивания областей гомологии (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), методом поиска сходства (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988)) путем компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks или пакеты программ MacVector) или с использованием программы контроля и построения наилучшего выравнивания (то есть получения наиболее высокого процента гомологии по "окну сравнения"), достигаемого различными методами.

Термин "идентичность последовательностей" означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности являются идентичными (то есть на нуклеотидном или аминокислотном уровне) в окне сравнения. Термин "процент идентичности последовательностей" означает процент, который вычисляют путем сравнения двух оптимально выравниваемых последовательностей по окну сравнения; определения числа положений идентичных оснований нуклеиновых кислот (например, А, Т, С, G, U или I) или остатков в обеих последовательностях с получением числа соответствующих положений; деления этого числа соответствующих положений на общее число положений в окне сравнения (то есть на размер окна) и умножения полученного результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Используемый здесь термин "значительная идентичность" означает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, где указанный полинуклеотид или указанная аминокислота составляют последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, а более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична эталонной последовательности в окне сравнения, составляющем по меньшей мере 18 нуклеотидов (6 аминокислот), а чаще всего составляющем по меньшей мере 24-48 нуклеотидов (8-16 аминокислот), где процент идентичности последовательностей вычисляют путем сравнения эталонной последовательности с последовательностью, которая может включать делеции или добавления, которые в целом составляют 20% или менее по сравнению с эталонной последовательностью, в окне сравнения. Эталонная последовательность может представлять собой подпоследовательность более крупной последовательности.

Используемые здесь двадцать главных аминокислот имеют общепринятые аббревиатуры. См. публикацию Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R Gren. Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати главных аминокислот, неприродных аминокислот, таких как α, α-дизамещенные аминокислоты; N-алкилзамещенных аминокислот, молочной кислоты и других редких аминокислот могут также служить подходящими компонентами полипептидов согласно изобретению. Примерами редких аминокислот являются 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемой здесь системе обозначения полипептидов в соответствии с общепринятой практикой и с принятым соглашением о терминологии левый конец аминокислоты называется аминоконцом, а правый конец аминокислоты называется карбоксиконцом.

Аналогичным образом, если это не оговорено особо, левым концом одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей является 5'-конец, а направлением слева направо для двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей считается 5'-направление (5' →). Направление присоединения растущих РНК-транскриптов 5' →3' называется направлением транскрипции, при этом области последовательностей на ДНК-цепи, имеющей такую же последовательность, как и РНК-цепь, которые находятся со стороны 5'-конца по отношению к 5'-концу РНК-транскрипта, называются "предшествующими последовательностями" (то есть расположенными выше по ходу транскрипции), а области последовательностей на ДНК-цепи, имеющей такую же последовательность, как и РНК-цепь, которые находятся со стороны 3'-конца по отношению к 3'-концу РНК-транскрипта, называются "последующими последовательностями" (то есть расположенными ниже по ходу транскрипции).

Термин "в основном идентичный", используемый по отношению к полипептидам, означает, что две пептидных последовательности, при их оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием "весов" пробелов по умолчанию, имеют по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей, а наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательностей.

При этом предпочтительно, чтобы положения остатков, которые не являются идентичными, отличались в результате консервативных аминокислотных замен.

Термин "консервативные аминокислотные замены" означает взаимозаменяемые остатки, составляющие сходные боковые цепи. Так, например, группу аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, составляют глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группу аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, составляют серин и треонин; группу аминокислот, имеющих амид-содержащие боковые цепи, составляют аспарагин и глутамин; группу аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, составляют фенилаланин, тирозин и триптофан; группу аминокислот, имеющих основные боковые цепи, составляют лизин, аргинин и гистидин; а группу аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, составляют цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными аминокислотными заменами являются замены в пределах таких групп, как валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота и аспарагин-глутамин.

Как обсуждается в настоящей заявке, небольшие изменения в аминокислотных последовательностях молекул антител или иммуноглобулинов рассматриваются как изменения, входящие в объем настоящего изобретения, при условии, что при таких изменениях аминокислотная последовательность описанных здесь молекул антител или иммуноглобулинов будет сохраняться по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95%, а наиболее предпочтительно на 99%. В частности, рассматриваются также консервативные аминокислотные замены. Консервативными заменами являются замены, которые входят в семейство аминокислот, являющихся родственными по их боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты обычно подразделяются на следующие семейства: (1) кислотные аминокислоты = аспартат, глутамат; (2) основные аминокислоты = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные аминокислоты = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и (4) незаряженные полярные аминокислоты = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Гидрофильными аминокислотами являются аргинин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. Гидрофобными аминокислотами являются аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, финилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин. Аминокислотами, принадлежащими к другим семействам, являются (i) серин и треонин, принадлежащие к семейству алифатических оксикислот; (ii) аспарагин и глутамин, принадлежащие к семейству амидсодержащих кислот; (iii) аланин, валин, лейцин и изолейцин, принадлежащие к семейству алифатических аминокислот, и (iv) фенилаланин, триптофан и тирозин, принадлежащие к семейству ароматических аминокислот. Так, например, следует ожидать, что отдельная замена лейцина изолейцином или валином, замена аспартата глутаматом, замена треонина серином или аналогичная замена какой-либо аминокислоты структурно родственной аминокислотой не будет оказывать значительного влияния на функцию связывания или свойства полученной молекулы, особенно, если эта замена не является аминокислотной заменой в каркасном участке. Продуцирование функционального пептида в результате такой аминокислотной замены может быть легко установлено путем анализа на удельную активность полипептидного производного. Такие анализы подробно описаны в настоящей заявке. Фрагменты или аналоги молекул антител или иммуноглобулинов могут быть легко получены средним специалистом в данной области. Предпочтительно, чтобы амино- и карбоксиконцы этих фрагментов или аналогов находились вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных о нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностях с данными о последовательностях, имеющихся в известных общедоступных базах данных или в базах данных, находящихся в частной собственности. Предпочтительно для идентификации мотивов последовательностей или конформационных доменов предсказанных белков, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией, применяются методы компьютерного сравнения. Методы идентификации последовательностей белка, которые образуют известную трехмерную структуру, известны специалистам. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Так, например, описанные ранее примеры продемонстрировали, что специалист в данной области может легко выявить мотивы последовательностей и структурные конформации, которые могут быть использованы для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с приведенным здесь описанием.

Предпочтительными аминокислотными заменами являются замены, которые приводят: (1) к снижению чувствительности к протеолизу, (2) к снижению чувствительности к окислению, (3) к изменению аффинности связывания для образования белковых комплексов, (4) к изменению аффинности связывания и (5) к сообщению или модификации других физико-химических или функциональных свойств таких аналогов. Указанными аналогами могут быть различные мутеины с последовательностью, отличающейся от природной пептидной последовательности. Так, например, в природную последовательность (предпочтительно в ту часть полипептида, которая расположена за пределами доменобразующих межмолекулярных контактов) могут быть внесены одна или множество аминокислотных замен (предпочтительно, консервативных аминокислотных замен). Консервативная аминокислотная замена не должна значительно влиять на структурные свойства родительской последовательности (например, аминокислотная замена не должна приводить к разрушению спирали, присутствующей в родительской последовательности, или к нарушению вторичной структуры других типов, которая характеризует родительскую последовательность). Примеры известных вторичных и третичных структур полипептида описаны в работах Protein, Structures and Molecular Principles (Creighton ed., W.H. Freeman and Company, New York 1984); Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) и в работе Thornton et al., Nature 354:105 (1991).

Используемый здесь термин "фрагмент полипептида" означает полипептид, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию, но в котором остальная аминокислотная последовательность в соответствующих положениях аминокислот идентична природной аминокислотной последовательности, происходящей, например, от полноразмерной кДНК-последовательности. Фрагменты обычно имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот, а предпочтительно по меньшей мере 14 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, обычно по меньшей мере 50 аминокислот, а еще более предпочтительно по меньшей мере 70 аминокислот. Используемый здесь термин "аналог" означает полипептиды, которые состоят из сегмента, имеющего по меньшей мере 25 аминокислот, в основном, идентичных части выведенной аминокислотной последовательности, и которые обладают по меньшей мере одним из нижеследующих свойств, а именно, они (1) специфически связываются с IFN γ в подходящих условиях связывания; (2) способны блокировать соответствующее связывание с IFN γ или (3) способны ингибировать рост IFN γ-экспрессирующих клеток in vitro или in vivo. Обычно полипептидные аналоги по сравнению с природной последовательностью содержат консервативную аминокислотную замену (добавление или делецию). Аналоги обычно имеют длину по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот или более, а чаще всего они имеют такую же длину, как и полноразмерный природный полипептид.

Пептидные аналоги обычно используются в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарственных средств, обладающих свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Непептидные соединения этого типа называются "пептидными миметиками" или "пептидомиметиками". См. публикации Fauchere, J. Adv. Drug. Res. 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS p.392 (1985) и Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютерной программы молекулярного моделирования. Пептидные миметики, структурно сходные с терапевтически ценными пептидами, могут быть использованы для достижения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики являются структурно сходными с репрезентативным полипептидом (то есть с полипептидом, который обладает биохимическими свойствами или фармакологической активностью), таким как человеческое антитело, и они обычно имеют одну или несколько пептидных связей, которые могут быть заменены, но необязательно, связью, выбранной из группы, состоящей из -CH 2 NH-, -CH 2 S-, -CH 2 -CH 2 -, -СН=СН- (цис и транс), СОСН 2 -, -СН(ОН)СН 2 - и -CH 2 SO-, в соответствии с хорошо известной методикой. Системная замена одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности D-аминокислотой того же типа (например, замена L-лизина на D-лизин) может быть использована для генерирования более стабильных пептидов. Кроме того, пептиды с конформационными ограничениями, содержащие консенсусную последовательность или вариант последовательности, в основном идентичный консенсусной последовательности, могут быть генерированы известными методами (Rizo & Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)), например, путем присоединения внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют данный пептид.

Используемый здесь термин "агент" означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов.

Используемый здесь термин "метка" или "меченый" относится к включению в полипептид детектируемого маркера, например радиоактивно меченной аминокислоты или присоединения к полипептиду биотинильной группы, которая может быть детектирована с использованием меченого авидина (например стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые могут быть детектированы оптическими или калориметрическими методами). В некоторых случаях такая метка или маркер могут быть также терапевтическими. Могут быть применены различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов, известные специалистам. Примерами меток, используемых для мечения полипептидов, являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15 N, 35 S, 90 Y, 94 Tc, 111 In, 125 I, 131 I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, комплекс "лантанид-фосфор"), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные метки, биотинильные группы, и предварительно определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторым репортером (например, пара последовательностей "лейциновой молнии", сайты связывания для "вторых" антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах изобретения метки присоединяют посредством спейсерных групп различной длины для предотвращения возможных стерических затруднений. Используемый здесь термин "фармацевтическое средство или лекарственное средство" означает химическое соединение или композицию, которые способны индуцировать желательный терапевтический эффект при их соответствующем введении пациенту.

Другие общепринятые химические термины, используемые в настоящей заявке, описаны в руководстве The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker S. Ed, McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Используемый здесь термин "противоопухолевое средство" означает средство, которое обладает функциональным свойством ингибировать развитие или прогрессирование опухоли у человека, а в частности злокачественной (раковой) опухоли, такой как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Таким свойством противоопухолевых средств часто является способность ингибировать развитие метастазов.

Используемый здесь термин "в основном чистый" относится к рассматриваемой молекуле, которая является преобладающей молекулой (то есть присутствует в более высокой молярной концентрации по сравнению с любыми другими отдельными молекулами, имеющимися в данной композиции), а предпочтительно этот термин означает "в основном очищенную фракцию", то есть композицию, в которой рассматриваемая молекула составляет по меньшей мере примерно 50% (на молярном уровне) от всех присутствующих макромолекул данного вида.

Обычно в основном чистая композиция составляет примерно более 80% от всех макромолекул, присутствующих в данной композиции, а более предпочтительно примерно более 85, 90, 95 и 99%. Наиболее предпочтительно, чтобы рассматриваемая молекула была очищена почти до полной гомогенности (где примеси, присутствующие в данной композиции, не могут быть детектированы стандартными методами детекции) так, чтобы указанная композиция состояла, в основном, из макромолекул одного вида.

Термин "пациент" включает человека и животных. Термин индивидуум включает человека и других млекопитающих.

Человеческие антитела и "гуманизация" антител.

Анти-huIFN γ-антитело продуцируют, например, в соответствии с процедурами, описанными ниже в разделе "Примеры". Анти-huIFN γ-антитело типа IgG продуцируют, например, путем превращения scFv-клона в IgG-формат (см., например, пример 6). Альтернативно, такое анти-huIFN γ-антитело получают, например, методами фагового представления с использованием антител, содержащих только человеческие последовательности. Такие методы хорошо известны специалистам и описаны, например, в заявке WO 92/01047 и в патенте США № 6521404, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В этом методе комбинаторную фаговую библиотеку, несущую рандомизированные пары легких и тяжелых цепей, скринируют с использованием природного или рекомбинантного источника IFN γ или их фрагментов.

Анти-huIFN γ-антитело получают способом, в котором по меньшей мере одна стадия включает иммунизацию трансгенного животного, не являющегося человеком, человеческим белком IFN γ. Некоторые эндогенные локусы тяжелой и/или легкой цепи каппа указанного ксеногенного животного были блокированы, а поэтому они были неспособны к реаранжировке, требуемой для генерирования генов, кодирующих иммуноглобулины в ответ на антиген. Кроме того, животному стабильно трансфицируют по меньшей мере один локус человеческой тяжелой цепи и по меньшей мере один локус человеческой легкой цепи. Таким образом, в ответ на введение антигена, человеческий локус подвергается реаранжировке с генерированием генов, кодирующих человеческие вариабельные области, обладающие иммуноспецифичностью к данному антигену. Поэтому после иммунизации у мыши Xenomouse продуцируются В-клетки, которые секретируют полностью человеческие иммуноглобулины.

Существует ряд хорошо известных методов получения ксеногенных животных, не являющихся человеком. Так, например, см. патенты США № 6075181 и № 6150584. В одной из стратегий ксеногенные (человеческие) гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина вводят в зародышевую линию хозяина (например, в сперму или ооциты), и в отдельных стадиях соответствующие гены хозяина делают нефункциональными путем инактивации посредством гомологичной рекомбинации. Человеческие гены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина реконструируют в соответствующем эукариотическом или прокариотическом микроорганизме, и полученные ДНК-фрагменты вводят соответствующему хозяину, например, в пронуклеус оплодотворенных ооцитов или в эмбриональные стволовые клетки мыши. Инактивацию эндогенного локуса иммуноглобулина хозяина осуществляют путем нацеленной дизрупции соответствующего локуса посредством гомологичной рекомбинации в клетках-хозяевах, а в частности, в эмбриональных стволовых клетках или в пронуклеусе оплодотворенных ооцитов мыши. Такая нацеленная дизрупция может включать введение мутации или делеции в нужный локус, либо делецию в нужном локусе с последующей инсерцией в этот локус, например, селективного маркера. В случае эмбриональных стволовых клеток, получают химерных животных, которые частично развиваются из модифицированных эмбриональных стволовых клеток и которые способны передавать генетические модификации через зародышевую линию. В результате скрещивания хозяев, несущих введенные локусы человеческого иммуноглобулина, с животными, у которых имеется инактивированный эндогенный локус, получают животных, у которых продуцируется полностью ксеногенное антитело, например человеческое антитело.

В альтернативной стратегии по меньшей мере часть локусов тяжелой и легкой цепей человеческого иммуноглобулина используют для прямой замены соответствующего эндогенного локуса иммуноглобулина путем гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках. Эта процедура приводит к одновременной инактивации и к замене эндогенного иммуноглобулина. В результате этого продуцируются химерные животные, у которых в зародышевые линии входят клетки, происходящие от эмбриональных стволовых клеток.

Так, например, у ксеногенного животного, не являющегося человеком, выделяют В-клеточный клон, который экспрессирует человеческое анти-IFN γ-антитело, и подвергают иммортализации различными методами, известными специалистам. Такими В-клетками, которые могут быть непосредственно выделены из крови и из лимфоидных тканей животного, являются, но не ограничиваются ими, клетки селезенки, миндалин, лимфоузлов и костного мозга. Полученные иммортализованные В-клетки могут быть размножены и культивированы in vitro с получением большого количества клинически ценного анти-huIFN γ-антитела.

Альтернативно, гены, кодирующие иммуноглобулины, содержащие одну или несколько человеческих вариабельных областей, могут быть выделены и экспрессированы в клетках различных типов, включая, но не ограничиваясь ими, систему клеточных культур млекопитающих, в целях получения самих антител или их отдельных цепей, состоящих из одноцепочечных Fv-молекул.

Кроме того, весь набор полностью человеческих анти-IFN γ антител, продуцируемых у ксеногенного животного, не являющегося человеком, может быть скринирован для идентификации одного такого клона с оптимальными свойствами. Такими свойствами являются, например, аффинность связывания с человеческим белком IFN γ, стабильность взаимодействия, а также принадлежность к изотипу полностью человеческого анти-IFN γ-антитела. Затем клоны, полученные от всего набора антител с нужными свойствами, используют в качестве источника нуклеотидных последовательностей, кодирующих нужные вариабельные области, для проведения последующих манипуляций в целях генерирования антител с такими свойствами, с применением в альтернативных клеточных системах стандартных методов рекомбинантных или трансгенных ДНК.

Указанная общая стратегия, которая была продемонстрирована в комбинации с продуцированием первых штаммов XenoMouse ™, была описана в 1994 г. См. Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994). Этот подход также обсуждается и описывается в следующих заявках на патент США: в заявке рег. № 07/466008, поданной 12 января 1990г., 07/610515, поданной 8 ноября 1990 г., 07/919297, поданной 24 июля 1992 г., 07/922649, поданной 30 июля 1992 г., 08/031801, поданной 15 марта 1993 г., 08/112848, поданной 27 августа 1993 г., 08/234145, поданной 28 апреля 1994 г., 08/376279, поданной 20 января 1995 г., 08/430938, поданной 27 апреля 1995 г., 08/464584, поданной 5 июня 1995 г., 08/464582, поданной 5 июня 1995 г., 08/463191, поданной 5 июня 1995 г., 08/462837, поданной 5 июня 1995 г., 08/486853, поданной 5 июня 1995 г., 08/486857, поданной 5 июня 1995 г., 08/486859, поданной 5 июня 1995 г., 08/462513, поданной 5 июня 1995 г., 08/724752, поданной 2 октября 1996 г. и 08/759620, поданной 3 декабря 1996 г.; в патентах США № № 6162963, 6150584, 6114598, 6075181 и 5939598 и в японских патентных заявках № № 3068180 В2, 3068506 В2 и 3068507 В2. См. также Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) и Green and Jakobovits J. Exp. Med.: 188:483-495 (1998). См. также европейский патент № ЕР 0463151 В1, выданный и опубликованный 12 июня 1996 г., международную патентную заявку № WO 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 г., международную патентную заявку № WO 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 г., заявку WO 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 г., и заявку WO 00/76310, опубликованную 21 декабря 2000 г.

В альтернативном методе другие исследователи использовали "минилокусы". В этом подходе с использованием минилокусов был имитирован локус экзогенного Ig путем включения фрагментов (отдельных генов) локуса Ig. Таким образом, из одного или нескольких генов V H , одного или нескольких генов D H , одного или нескольких генов J H , константной μ-области и второй константной области (предпочтительно константной γ-области) была создана конструкция для введения животному. Этот метод описан в патенте США № 5545807, Surani et al. и в патентах США № № 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5877397, 5874299 и 6255458, Lonberg & Kay, в патентах США № № 5591669 и 6023010, Krimpenfort & Berns, в патентах США № № 5612205, 5721367 и 5789215, Berns et al., и в патенте США № 5643763, Choi & Dunn, и в международных заявках на патент США GenPharm; в заявке per. № 07/574748, поданной 29 августа 1990 г., заявке 07/575962, поданной 31 августа 1990 г., заявке 07/810279, поданной 17 декабря 1991 г., заявке 07/853408, поданной 18 марта 1992 г., заявке 07/904068, поданной 23 июня 1992 г., заявке 07/990860, поданной 16 декабря 1992 г., заявке 08/053131, поданной 26 апреля 1993 г., заявке 08/096762, поданной 22 июля 1993 г., заявке 08/155301, поданной 18 ноября 1993 г., заявке 08/161739, поданной 3 декабря 1993 г., заявке 08/165699, поданной 10 декабря 1993 г., и заявке 08/209741, поданной 9 марта 1994 г. См. также европатент № 0546073 В1, международные патентные заявки № № WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 и WO 98/24884, и патент США № 5981175. См. также публикации Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) и Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

Преимуществом метода минилокусов является быстрота генерирования и введения животным конструкций, включающих части Ig-локусов. Однако при этом указанный метод минилокусов имеет существенный недостаток, который заключается в том, что, теоретически, при введении животному небольшого числа генов V, D и J, у него вырабатывается недостаточное разнообразие антител. Действительно, этот недостаток обсуждается в опубликованных работах. В соответствии с этим размножение В-клеток и генерирование антител у животных, продуцированных методом минилокусов, были прекращены. Поэтому для достижения большего разнообразия и для восстановления репертуара антител у животных исследования, проводимые при разработке настоящего изобретения, были соответственно направлены на введение крупных фрагментов Ig-локусов.

Было продемонстрировано продуцирование человеческих антител у мышей, которым путем слияния микроклеток вводили большие сегменты хромосом или целые хромосомы. См. заявки на европатент № 773288 и 843961.

Вырабатывание человеческих антимышиных антител (НАМА) послужило стимулом к целой индустрии продуцирования химерных или как-либо иначе гуманизированных антител. Поскольку химерные антитела имеют человеческую константную область и иммуновариабельную область, то предполагается, что в данном случае будут продуцироваться некоторые ответы в виде вырабатывания человеческих антител против химерных антител (НАСА), в частности, при постоянном или многократном введении этого антитела. Таким образом, для устранения этих недостатков и/или предотвращения эффектов НАМА- или НАСА-ответов желательно получить полностью человеческие антитела против IFN γ.

Продуцирование антител с пониженной иммуногенностью также осуществляют методами гуманизации и представления с использованием соответствующих библиотек. Следует отметить, что мышиные антитела или антитела, происходящие от других видов, могут быть гуманизированы или "приматизированы" методами, хорошо известными специалистам. См., например, Winter и Harris, Immunol Today 14:43-46 (1993) и Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Представляющее интерес антитело может быть сконструировано методами рекомбинантных ДНК для замены CH1, CH2, СН3, шарнирных доменов и/или каркасных доменов соответствующими человеческими последовательностями (см. WO 92102190 и патенты США № № 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). Специалистам также известно применение кДНК Ig для конструирования химерных генов иммуноглобулина (Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) and J. Immunol. 139:3521 (1987)). мРНК выделяют из гибридом или других клеток, продуцирующих антитело, и используют для продуцирования кДНК. Представляющая интерес кДНК может быть амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров (патенты США № № 4683195 и 4683202). Альтернативно, для выделения представляющей интерес последовательности получают и скринируют библиотеку. Затем последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, присоединяют к последовательностям человеческой константной области. Описание последовательностей генов человеческих константных областей можно найти у Кэбата и др. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, публикация NIH № 91-3242. Гены человеческой С-области могут быть легко выделены из известных клонов. Изотип может быть выбран с учетом нужных эффекторных функций, таких как фиксация комплемента или антитело-зависимая клеточная цитотоксичность. Предпочтительными изотипами являются IgG1, IgG3 и IgG4. Могут быть использованы человеческие константные области легкой цепи κ или λ. Затем химерное гуманизированное антитело экспрессируют стандартными методами.

Фрагменты антител, такие как Fv, F(ab') 2 и Fab, могут быть получены путем расщепления интактного белка, например протеазного или химического расщепления. Альтернативно, может быть сконструирован усеченный ген. Так, например, химерный ген, кодирующий часть F(ab') 2 -фрагмента, должен включать последовательности ДНК, кодирующие СН1-домен и шарнирную область Н-цепи, за которыми следует кодон терминации трансляции, в результате чего может быть получена усеченная молекула.

Консенсусные последовательности Н- и L-J-областей могут быть использованы для конструирования олигонуклеотидов в целях их применения в качестве праймеров для введения нужных рестрикционных сайтов в J-область и последующего присоединения сегментов V-области к сегментам человеческой С-области. кДНК С-области может быть модифицирована с помощью сайт-направленного мутагенеза для введения рестрикционного сайта в аналогичное положение человеческой последовательности.

Экспрессионными векторами являются плазмиды, ретровирусы, YAC, EBV-эписомы и т.п. Подходящим вектором является вектор, кодирующий функционально полноразмерную последовательность СН- или CL-области человеческого иммуноглобулина с соответствующими рестрикционными сайтами, сконструированными в целях облегчения инсерции и экспрессии любой последовательности VH- или VL-31. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между донорным сайтом сплайсинга во встроенной J-области и акцепторным сайтом сплайсинга, за которым находится человеческая С-область, а также в областях сплайсинга, которые присутствуют в человеческих СН-экзонах. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в природных участках хромосом, расположенных ниже кодирующих областей. Полученное химерное антитело может быть присоединено к любому сильному промотору, включая LTR ретровирусов, например ранний промотор SV-40 (Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), LTR вируса саркомы Рауса (Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)) и LTR вируса мышиного лейкоза Молони (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)). Следует также отметить, что могут быть также использованы нативные промоторы Ig и т.п.

Кроме того, человеческие антитела или антитела других видов могут быть получены с применением технологии представлений, включая, но не ограничиваясь ими, фаговое представление, ретровирусное представление, рибосомное представление и другие хорошо известные методы, а затем полученные молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, такому как аффинное созревание, например, методами, хорошо известными специалистам. Wright & Harris, см. выше; Hanes & Plucthau PEAS USA 94:4937-4942 (1997), (рибосомное представление), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (фаговое представление), Scott TIB5 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), и патент США 5733743. Если технологии представления применяются для продуцирования антител, которые не являются человеческими, то такие антитела могут быть гуманизированы как описано выше.

С применением таких технологий могут быть генерированы антитела против IFN γ-экспрессирующих клеток, против самих IFN γ, против некоторых форм IFN γ, их эпитопов или пептидов, и экспрессирующих их библиотек (см., например, патент США 5703057), которые затем могут быть скринированы на вышеуказанные активности, как описано выше.

Разработка и получение других терапевтических средств.

В соответствии с настоящим изобретением и исходя из активности антител против IFN γ, которые были продуцированы и охарактеризованы в настоящей заявке, помимо способов с использованием описанных молекул антител, могут быть легко разработаны и другие терапевтические способы. Такими способами являются, но не ограничиваются ими, улучшенные терапевтические методы с применением антител, таких как биспецифические антитела, иммунотоксины и радиоактивно меченные терапевтические средства, методы получения пептидных терапевтических средств, методы генотерапии, а в частности, методы с применением телец включения, антисмысловых терапевтических молекул и малых молекул.

Так, например, что касается биспецифических антител, то могут быть получены биспецифические антитела, которые включают (i) два антитела, одно из которых обладает специфичностью к IFN γ, а другое обладает специфичностью ко второй молекуле, где указанные два антитела являются конъюгированными, (ii) одно антитело, которое имеет одну цепь, специфичную к IFN γ, и вторую цепь, специфичную ко второй молекуле, или (iii) одноцепочечное антитело, которое обладает специфичностью к IFN γ и к другой молекуле. Такие биспецифические антитела получают методами, хорошо известными специалистам; так, например, получение антител по пунктам (i) и (ii) описано, например, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) и Wright and Harris, см. выше, а получение антитела по пункту (iii) описано, например, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

Что касается иммунотоксинов, то путем модификации методами, хорошо известными специалистам, могут быть получены антитела, которые действуют как иммунотоксины. См., например, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). См. также патент США № 5194594. Что касается радиоактивно меченных антител, то такие модифицированные антитела могут быть легко получены методами, хорошо известными специалистам. См., например, Junghans et al. в Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). См. также патенты США № 4681581, 4735210, 5101827, 5102990 (RE 35500), 5648471 и 5697902. Каждый из иммунотоксинов и каждая из радиоактивно меченных молекул, вероятно, будут разрушать клетки, экспрессирующие IFN γ, а в частности клетки, для которых антитела согласно изобретению являются эффективными.

Что касается генерирования терапевтических пептидов, то с использованием информации о структуре молекул IFN γ и антител против этих молекул, таких как антитела согласно изобретению, или с применением скрининга пептидных библиотек могут быть получены терапевтические пептиды против IFN γ. Получение и скрининг пептидных терапевтических средств обсуждается в публикациях Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Иммунотоксины и радиоактивно меченные молекулы могут быть также получены способом, аналогичным способу получения пептидных молекул, обсуждаемых выше для получения антител. Если предположить, что молекула IFN γ (или ее форма, такая как вариант сплайсинга или альтернативная форма) является функционально активной при данном заболевании, то может быть также сконструирован ген и его антисмысловые терапевтические последовательности с применением стандартных методов. Такие методы могут быть осуществлены для модуляции функции IFN γ. В соответствии с этим, с помощью антител согласно изобретению могут быть легко разработаны и применены функциональные анализы, связанные с применением этих антител. Протоколы и стратегия получения антисмысловых терапевтических последовательностей подробно обсуждаются в международной патентной заявке № WO 94/29444. Протоколы и стратегии проведения генотерапии хорошо известны специалистам. Однако, в частности, было подтверждено, что особенно предпочтительными являются методы генотерапии, включающие использование телец включения. См., например, Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) и Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). Общие протоколы и обсуждение методов генотерапии можно также найти в международной патентной заявке № WO 97/38137.

Информация о структуре молекулы IFN γ и ее взаимодействиях с другими молекулами согласно изобретению, такими как антитела согласно изобретению и т.п., может быть использована для рациональной разработки других терапевтических методов. В этой связи, рациональные методы разработки лекарственных средств, такие как рентгеновская кристаллография, компьютерное (или с применением компьютера) молекулярное моделирование (САММ), установление количественной или качественной взаимосвязи "структура-активность" (QSAR), и аналогичные методы могут быть направлены на обнаружение новых лекарственных средств. Рациональный план исследований позволяет предсказывать структуры белков или синтетических молекул, способных взаимодействовать с данной молекулой или с ее конкретными формами, которые могут быть использованы для модификации или модуляции активности IFN γ. Такие структуры могут быть химически синтезированы или экспрессированы в биологических системах. Такой подход описан в публикации Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drags (Stockton Press, NY (1988)). Кроме того, могут быть сконструированы и синтезированы комбинаторные библиотеки, и такие библиотеки могут быть использованы в программах скрининга, таких как высокоэффективный скрининг.

Терапевтическое введение и композиции.

Следует отметить, что терапевтические средства согласно изобретению могут быть введены вместе с подходящими носителями, наполнителями и другими средствами, включенными в данные препараты для улучшения их переноса и доставки, и повышения толерантности и т.п. Химикам-фармацевтам известны различные фармацевтические препараты, которые можно найти в известном реестре лекарственных средств: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), а в частности, в гл. 87, Blaug, Seymour. Такими препаратами являются, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, везикулы, содержащие липиды (катионогенные или анионогенные) (такие как липофектин ™), ДНК-конъюгаты, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии типа "масло-в-воде" и "вода-в-масле", эмульсионный карбовакс (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Для лечения и терапии согласно изобретению могут быть использованы любые вышеупомянутые смеси, при условии, что активный ингредиент в данной композиции не будет инактивироваться, и что данная композиция будет физиологически совместимой и будет хорошо переноситься при выбранном способе введения. См. также публикации Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein Pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J. Pharm. Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311 (1998) и указанную в них дополнительную информацию, относящуюся к лекарственным препаратам, наполнителям и носителям, хорошо известным химикам-фармацевтам.

Терапевтические препараты согласно изобретению, включающие анти-huIFN γ-антитела согласно изобретению, используются для лечения или ослабления симптомов, ассоциированных с иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство.

Так, например, введение анти-huIFN γ-антитела индивидууму, страдающему болезнью Крона (БК), может воздействовать непосредственно на клетки, вызывающие данное заболевание, и, тем самым, обеспечивать быстрый эффект с минимальной супрессией иммунной системы. Введение анти-huIFN γ-антитела индивидууму, страдающему системной красной волчанкой, является другим медицинским показанием, которое позволяет модифицировать иммунные клетки, ответственные за развитие этого заболевания. Введение анти-huIFN γ-антитела, полноразмерного человеческого белка индивидууму, страдающему псориазом, позволяет избежать необходимости лечения пациентов более агрессивными лекарственными средствами (например, метотрексатом), которые дают хорошо известные нежелательные побочные эффекты (например, поражение печени). Введение анти-huIFN γ-антитела индивидууму, страдающему ревматоидным артритом, является другим медицинским показанием, которое позволяет модулировать последующее продуцирование и осуществление функции Th1-опосредуемого ответа, индуцирующего данным заболеванием.

Аутоиммунными заболеваниями являются, например, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, который представляет собой вирусное заболевание с аутоиммунным компонентом), гнездная аллопеция, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЛПС), аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (АТП), болезнь Бехчета, кардиомиопатия, кишечная спру, герпетиформный дерматит; синдром хронической усталости, ассоциированный с расстройством иммунной системы (CFIDS), хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДПН), рубцовый пемфигоид, болезнь холодовых агглютининов, CREST-синдром, болезнь Крона, болезнь Дегоса, ювенильный дерматомиозит, дискоидная волчанка, первичная смешанная криоглобулинемия, фибромиалгия-фибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический фиброз легких, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), IgA-нефропатия, инсулинзависимый сахарный диабет, ювенильный хронический артрит, (болезнь Стилла), ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительных тканей, рассеянный склероз, тяжелая миастения, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный биллиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, синдром Рейно, синдром Райтера, ревматическая лихорадка, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия (прогрессирующий системный склероз) (ПСС), также известный как системный склероз (СС)), синдром Шегрена, синдром "негнущегося человека", системная красная волчанка, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, витилиго и гранулематоз Вегенера.

Воспалительными расстройствами являются, например, хронические и острые воспалительные расстройства. Примерами воспалительных расстройств являются болезнь Альцгеймера, астма, атопическая аллергия, аллергия, атеросклероз, бронхиальная астма, экзема, гломерулонефрит, реакция "трансплантат против хозяина", гемолитическая анемия, остеоартрит, сепсис, инсульт, заболевания, вызываемые трансплантацией тканей и органов, васкулиты, диабетическая ретинопатия и поражение легких, индуцированное вентиляцией легких.

Анти-huIFN γ-антитела модулируют иммунный ответ у индивидуума, например, у человека. Так, например, анти-huIFN γ-антитела, описанные в настоящей заявке, модулируют, например, снижают, ингибируют или предупреждают увеличение Th1-опосредуемого иммунного ответа, такого как повышенный Th1-опосредуемый иммунный ответ, ассоциированный с аутоиммунным или воспалительным расстройством, таким, например, как болезнь Крона, системная красная волчанка, псориаз, саркоидоз, ревматоидный артрит, васкулиты, атопический дерматит и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз. При повышенном Th1-опосредуемом иммунном ответе Th1-цитокины, такие как IL-2, IL-3, TNF-альфа (TNF- α) и IFN γ, присутствуют у индивидуума на уровне, превышающем уровень Th1-цитокинов у индивидуума, не страдающего заболеванием или расстройством, ассоциированным с повышенным иммунным Th1-ответом. Для отнесения Th1-опосредуемого иммунного ответа к категории повышенного ответа оценивают уровень продуцирования Th1-цитокинов, например, путем измерения и оценки уровня секретируемых цитокинов с помощью ELISA или другого анализа.

Описанные здесь анти-huIFN γ-антитела используются для модуляции, например, ингибирования, снижения или предотвращения переключения класса на изотип IgG, такого как IFN γ-индуцируемое переключение класса. Указанные анти-huIFN γ-антитела модулируют, например, ингибируют, предотвращают или снижают Th1-опосредуемый ответ и, тем самым, подавляют IFN γ-индуцированное переключение класса.

В одном из вариантов изобретения композиции анти-huIFN γ-антител, используемые для лечения иммунного расстройства, вводят в комбинации с любыми различными антицитокиновыми или антихемокиновыми средствами. Подходящие антицитокиновые или антихемокиновые реагенты распознают, например, цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27 и IL-31, и/или хемокины, такие как MIP1- α, MIP1- β, RANTES, MCP1, IP-10, ITAC, MIG, SDF и фракталкин.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения или ослабления симптомов, ассоциированных с иммунным расстройством. Так, например, композиции согласно изобретению используют для лечения или ослабления симптомов любого из описанных здесь аутоиммунных заболеваний и воспалительных расстройств. Симптомами, ассоциированными с иммунными расстройствами, являются, например, воспаление, высокая температура, потеря аппетита, потеря веса, абдоминальные симптомы, например, боли в области брюшины, диарея или запор, боли в суставах или головные боли (артралгия), усталость, сыпь, анемия, сильная чувствительность к холоду (синдром Рейно), мышечная слабость, мышечная усталость, изменения кожного или тканевого тонуса, одышка или другие патологические формы дыхания, боли в области грудной клетки или сокращение мышц грудной клетки, нарушение частоты сердечных сокращений (например, увеличение или снижение частоты сердечных сокращений), светочувствительность, неясность зрения или другие нарушения зрения, и снижение функции органов.

Терапевтические композиции анти-huIFN γ-антител вводят индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство. Наличие у индивидуума аутоиммунного заболевания или воспалительного расстройства определяют методами, известными специалистам. Так, например, наличие у индивидуума аутоиммунного заболевания, такого как болезнь Крона, волчанка или псориаз, определяют с помощью любых различных клинических и/или лабораторных тестов, таких как физическое обследование, рентгенологическое исследование и анализ крови, мочи и кала для оценки иммунного статуса. Так, например, пациентов, страдающих волчанкой, выявляют, например, с помощью теста на антиядерные антитела (АЯА), позволяющего определить наличие в крови пациента аутоантител против клеточных ядер. Пациентов, страдающих болезнью Крона, выявляют, например, путем исследования верхних отделов желудочно-кишечного тракта и/или колоноскопии, например, для исследования тонкой и толстой кишки соответственно. Пациентов, страдающих псориазом, выявляют, например, путем исследования ткани, взятой из пораженных участков кожи, под микроскопом, а пациентов, страдающих ревматоидным артритом, выявляют, например, с помощью анализов крови и/или рентгеновского анализа или других визуализирующих исследований.

Введение анти-huIFN γ-антитела индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, осуществляют в том случае, если достигается любой из различных лабораторных или клинических результатов. Так, например, введение анти-huIFN γ-антитела индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, считается успешным, если один или несколько из симптомов, ассоциированных с указанным расстройством, ослабляется, подавляется, ингибируется или не прогрессирует, то есть не переходит в более тяжелую форму. Введение анти-huIFN γ-антитела индивидууму, страдающему иммунным расстройством, таким как аутоиммунное заболевание или воспалительное расстройство, считается успешным, если, например, наблюдается ремиссия аутоиммунного расстройства, либо это расстройство не прогрессирует, то есть не переходит в более тяжелую форму.

Диагностические и профилактические композиции.

Полностью человеческие анти-IFN γ MAb согласно изобретению используют для получения диагностических и профилактических препаратов. В одном из вариантов изобретения анти-huIFN γ MAb согласно изобретению вводят пациентам, подверженным риску развития у них одного из вышеупомянутых аутоиммунных заболеваний. Предрасположенность пациента к одному или нескольким вышеупомянутым аутоиммунным заболеваниям может быть определена с использованием генотипических, серологических или биохимических маркеров.

В другом варианте изобретения анти-huIFN γ-антитело вводят человеку, у которого были диагностированы одно или несколько вышеупомянутых аутоиммунных заболеваний. После установления диагноза пациенту вводят анти-huIFN γ-антитело для ослабления или предотвращения развития у него аутоиммунного заболевания.

Антитела согласно изобретению могут быть также использованы для детекции IFN γ в образцах, взятых у пациента, то есть они могут быть использованы в качестве диагностических средств. Так, например, анти-huIFN γ-антитела согласно изобретению используют в in vitro-анализах, например ELISA, для детекции уровней IFN γ в образце, взятом у пациента.

В одном из вариантов изобретения анти-huIFN γ-антитело согласно изобретению иммобилизуют на твердом носителе (например, на лунке(ах) микротитрационного планшета).

Иммобилизованное антитело служит в качестве антитела для захвата любого IFN γ, который может присутствовать в тест-образце. Перед контактированием иммобилизованного антитела с образцом, взятым у пациента, твердый носитель промывают и обрабатывают блокирующим агентом, таким как белок норки или альбумин для предупреждения неспецифической адсорбции аналита.

Затем лунки обрабатывают тест-образцом, который предположительно содержит антиген, или раствором, содержащим стандартное количество антигена. Таким образцом является, например, проба сыворотки, взятая у индивидуума с подозрением на наличие у него определенных уровней циркулирующего антигена, которые рассматриваются как диагностические индикаторы данной патологии. После промывки тест-образца или стандарта твердый носитель обрабатывают "вторым" антителом, которое является детектируемо меченным. Указанное меченое "второе" антитело служит в качестве детектирующего антитела. Затем измеряют уровень детектируемой метки и определяют концентрацию антигена IFN γ в тест-образце путем сравнения со стандартной кривой, построенной по данным, полученным для стандартных образцов.

Следует отметить, что на основании результатов, полученных с использованием анти-huIFN γ-антител согласно изобретению в диагностическом анализе in vitro, может быть определена стадия заболевания (например, аутоиммунного или воспалительного расстройства) индивидуума, исходя из уровней экспрессии антигена IFN γ. Для этого у индивидуумов, у которых проводят диагностику, берут пробы крови на различных стадиях течения заболевания и/или в различные периоды терапевтического лечения заболевания. С использованием набора образцов, которые дают статистически значимые результаты для каждой стадии течения заболевания или терапии, определяют интервалы концентраций антигена, которые могут рассматриваться как характерные для каждой стадии заболевания.

Все цитируемые здесь публикации и патентные документы вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая такая публикация или документ были конкретно и отдельно введены в настоящее описание посредством ссылки. При этом подразумевается, что цитируемые здесь публикации и патентные документы не относятся к предмету изобретения, и предполагается, что они не входят в объем настоящего изобретения и не датированы таким же числом, как и настоящее изобретение. Настоящее изобретение было представлено здесь в виде описания заявки, однако, для специалистов очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено в различных вариантах и что представленное здесь описание и нижеследующие примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема изобретения, определенного в представленной ниже формуле изобретения.

Примеры

Нижеследующие примеры, включающие описание проводимых экспериментов и полученных результатов, приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка человеческого интерферона- γ.

Клонирование.

Последовательность, соответствующую зрелой последовательности человеческого интерферона-гамма (hIFN γ, huIFN γ), амплифицировали из человеческой кДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических олигонуклеотидов. Продукт амплификации подвергали гель-очистке и клонировали в экспрессионный вектор рЕТ41с (Novagen, San Diego CA). Затем этот вектор модифицировали с введением метки Avitag ™ (Avidity, Denver CO) и окта-гистидиновой метки в С-конец hIFN γ для биотинилирования белка in vivo и очистки с помощью IMAC (аффинной хроматографии на иммобилизованных ионах металла).

Экспрессия.

Клетки BL21 E.coli подвергали котрансформации вектором pET41c-hIFN γ и вектором pACYC184-BirA, кодирующим фермент BirA, необходимый для in vivo биотинилирования последовательности Avitag ™. Моноколонии, резистентные к канамицину (50 мкг/мл) и к хлорамфениколу (10 мкг/мл), отбирали и использовали для инокуляции исходной культуры в среде LB (Kan, 50 мкг/мл, Cm, 10 мкг/мл), а затем культивировали в течение ночи при 37 °С.

На следующий день культуру использовали для инокуляции (разведение 1:100) 400 мл культуры LB (Kan, 50 мкг/мл; Cm, 10 мкг/мл), в которую было добавлено 50 мкМ биотина. Затем культуру выращивали при 37 °С со встряхиванием (240 об./мин) до достижения OD 600 =0,6. На этой стадии добавляли изопропил- β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ, и эту культуру инкубировали еще в течение 3 ч в тех же условиях. Клетки центрифугировали при 4000 об./мин в течение 20 мин и осадок замораживали при -20 °С. В этих условиях, по существу, все hIFN γ были нерастворимыми и находились в тельцах включения.

Очистка.

Бактериальные штаммы оттаивали и ресуспендировали в 8 мл реагента Bugbuster, содержащего 8 мкл бензоназы (Novagen), и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали в течение 30 мин при 15000 ×g при 4 °С. Осадок, содержащий тельца включения, ресуспендировали в 7 мл буфера для солюбилизации (50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, 6М гуанидин-HCl). Ресуспендированный материал центрифугировали при 4 °С в течение 30 мин при 15000 ×g.

Две 5-миллилитровые колонки с хелатообразующим агентом HiTrap (Amersham, Buckinghamshire, England), загруженные NiSO 4 и уравновешенные буфером для солюбилизации, подсоединяли в соответствии с инструкциями производителей. После стадии центрифугирования супернатант фильтровали на 0,45 мкм-мембране и наносили на колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/мин. Затем колонки помещали в первую хроматографическую систему AKTA для рефолдинга белка и его элюирования. Иммобилизованный белок промывали 35 мл буфера для солюбилизации при скорости 1 мл/мин. Затем на колонку наносили линейный градиент буфера для солюбилизации с возрастающими концентрациями буфера для рефолдинга (50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 300 мМ NaCl) со скоростью 1 мл/мин в течение 1 ч до тех пор, пока объем буфера для рефолдинга не достигал 100%. После этого колонку снова промывали 25 мл буфера для рефолдинга. Затем белок, подвергнутый рефолдингу, элюировали с колонки элюирующим буфером (50 мМ трис-HCl, 300 мМ NaCl, 400 мМ имидазола). Фракции, содержащие белок, объединяли и обессоливали на колонках PD10 (Amersham), уравновешенных PBS. Затем обессоленный белок разделяли на аликвоты и хранили при -80 °С.

Пример 2. Экспрессия интерферона- γ на клеточной поверхности.

Клетки яичника китайского хомячка (СНО) (взятые из АТСС) стабильно трансфицировали c-myc-меченной кДНК человеческого IFN γ. кДНК субклонировали в плазмиды pCDNA 3.1 (Invitrogen, Carlsbad CA), содержащие гены резистентности к неомицину. Трансфектанты отбирали с использованием этого антибиотика, а затем проводили клеточный сортинг с помощью проточной цитометрии с использованием анти-6 ×His-антитела (Sigma). Экспрессию человеческого IFN γ на клеточной поверхности подтверждали с помощью проточной цитометрии с использованием анти-IFN γ mAb (клон В27, Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ).

Пример 3. Скрининг библиотек человеческих scFv.

Общие процедуры конструирования и обработки библиотек человеческих scFv описаны в публикации Vaughan et al. (Nat. Biotech. 1996, 14:309-314), которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Скрининг библиотек человеческих scFv против hIFN γ проводили в соответствии с нижеследующей процедурой.

Отбор в жидкой фазе.

Аликвоты scFv-фаговых библиотек (10 12 б.о.е.), полученных от фирмы Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK), блокировали PBS, содержащим 3% (мас./об.) сепарированного молока, в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. После этого блокированный фаг отделяли от покрытых стрептавидином магнитных сфер (Dynal M-280) в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. Затем выделенный фаг инкубировали с in vivo биотинилированным hIFN γ (100 нМ) в течение 2 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. Сферы собирали с использованием магнитного стенда, а затем четыре раза промывали PBS/0,1% твин 20 и 3 раза - PBS. Затем сферы непосредственно добавляли к 10 мл клеток TG1 в фазе экспоненциального роста и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С с медленным перемешиванием (100 об./мин). Аликвоту инфицированных клеток TG1 серийно разводили для титрования продукта отбора. Остальные инфицированные клетки TG1 центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин, ресуспендировали в 0,5 мл 2 ×TY-AG (в среде 2 ×TY, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы) и наносили на планшеты с агаром 2 ×TYAG Bioassay. После инкубирования в течение ночи при 30 °С в планшеты добавляли 10 мл 2 ×TYAG, и клетки соскабливали с поверхности и переносили в 50-миллилитровую полипропиленовую пробирку. К клеточной суспензии добавляли среду 2 ×TYAG, содержащую 50% глицерин, до конечной концентрации глицерина 17%. Аликвоты продукта цикла отбора хранили при -80 °С.

Отбор на клеточной поверхности.

Аликвоты scFv-фаговых библиотек (10 12 б.о.е.), полученных от фирмы Cambridge Antibody Technology (Cambridge, UK), блокировали PBS, содержащим 3% (мас./об.) сепарированное молоко, в течение 1 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. После этого блокированный фаг отделяли от клеток СНО, трансфицированных пустым вектором pDisplay (в колбах Т75 при конфлюэнтности 80%), в течение 1 ч при 37 °С/5% СО 2 и подвергали предварительному блокированию PBS, содержащим 2% (мас./об.) сепарированное молоко. Выделенный фаг инкубировали с клетками CHO-pDisplay-hIFN γ в течение 1 ч при комнатной температуре с легким помешиванием. Затем клетки десять раз промывали PBS. Связанный фаг элюировали путем прямого добавления в колбу Т75 10 мл клеток TG1 в фазе экспоненциального роста и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч при медленном перемешивании. Аликвоту инфицированных клеток TG1 серийно разводили для титрования продукта отбора. Инфицированные клетки TG1 центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин, ресуспендировали в 0,5 мл 2 ×TY-AG (в среде 2 ×TY, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы) и наносили на планшеты с агаром 2 ×TYAG Bioassay. После инкубирования в течение ночи при 30 °С в планшеты добавляли 10 мл 2 ×TYAG и клетки соскабливали с поверхности и переносили в 50-миллилитровую полипропиленовую пробирку. К клеточной суспензии добавляли среду 2 ×TYAG, содержащую 50% глицерин, до конечной концентрации глицерина 17%. Аликвоты продукта цикла отбора хранили при -80 °С.

"Спасение" фага.

100 мкл клеточной суспензии, полученной в предыдущих циклах отбора, добавляли к 20 мл 2 ×TYAG и культивировали при 37 °С с перемешиванием (240 об./мин) до тех пор, пока OD 600 не достигал 0,3-0,5. Затем культуру суперинфицировали 3,3 ×10 10 хелперного фага MK13K07 и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С (150 об./мин). После этого среду заменяли путем центрифугирования культуры при 2000 об./мин в течение 10 мин, а затем среду удаляли и осадок ресуспендировали в 20 мл 2 ×TY-AK (100 мкг/мл ампициллина; 50 мкг/мл канамицина). Культуру выращивали в течение ночи при 30 °С (240 об./мин).

"Спасение" моноклонального фага для анализа ELISA.

Одиночные клоны высевали в микротитрационный планшет, содержащий 150 мкл среды 2 ×TYAG (2% глюкозы) на лунку, и культивировали при 37 °С (100-120 об./мин) в течение 5-6 ч. В каждую лунку добавляли хелперный фаг М13K07 до получения множественности заражения (m.o.i.) 10 (то есть 10 фагов на каждую клетку в культуре) и инкубировали при 37 °С (100 об./мин) в течение 1 ч. После культивирования планшеты центрифугировали при 3200 об./мин в течение 10 мин. Супернатант осторожно удаляли и клетки ресуспендировали в 150 мкл среды 2 ×TYAK, a затем культивировали в течение ночи при 30 °С (120 об./мин). Для проведения ELISA фаг блокировали добавлением 150 мкл 2 ×PBS, содержащего 5% сепарированное сухое молоко, а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин и супернатант, содержащий фаг, использовали для ELISA.

ELISA фага.

ELISA-планшеты (Maxisorb, NUNC) сенсибилизировали в течение ночи 2 мкг/мл hIFN γ в PBS. Контрольные планшеты сенсибилизировали 2 мкг/мл BSA. Затем планшеты блокировали 3% сепарированным молоком/PBS при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты 3 раза промывали PBS/0,05% твин 20, после чего переносили в супернатанты, содержащие предварительно блокированный фаг, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты 3 раза промывали PBS/0,05% твин 20. В каждую лунку добавляли 50 мкл 3% сепарированного молока/PBS, содержащего ПХ-конъюгированное анти-М13-антитело (Amersham, разведенное 1:10000). После инкубирования при комнатной температуре в течение 1 ч планшеты 5 раз промывали PBS/0,05% твином 20. Затем ELISA-планшеты проявляли путем добавления 50 мкл ТМВ (Sigma) и реакцию завершали добавлением 50 мкл 2н. H 2 SO 4 . Оптическую плотность регистрировали при 450 нм.

Секвенирование фагового клона.

Одиночные клоны высевали в микротитрационный планшет, содержащий 15 мкл среды 2 ×TYAG (2% глюкозы) на лунку, и культивировали при 30 °С (120 об./мин) в течение ночи. На следующий день 5 мкл культуры переносили в другой планшет, содержащий 45 мкл dH 2 O, и перемешивали. Затем планшеты замораживали при -20 °С. После оттаивания 1 мкл этой суспензии использовали для ПЦР-амплификации в соответствии со стандартными ПЦР-протоколами с использованием праймера, специфичного для pCANTAB6: mycseq, 5'-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3' (SEQ ID NO: 100) и gene31eader, 5'-TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT-3' ( SEQ ID NO: 101).

Продукты ПЦР-реакции очищали в 96-луночном планшете с использованием системы Montage РСР μ96 (Millipore). 5 мкл элюированной ДНК секвенировали с использованием праймеров mycseq и gene31eader.

Получение периплазматического ScFv для проведения тестов на функциональность.

Отдельные клоны инокулировали в микротитрационном планшете с глубокими лунками, содержащими 0,9 мл среды 2 ×TYAG (0,1% глюкозы) на лунку, и культивировали при 37 °С в течение 5-6 ч (250 об./мин). Затем добавляли 100 мкл на лунку 0,2 мМ IPTG в среде 2 ×TY до конечной концентрации 0,02 мМ IPTG. Планшеты инкубировали в течение ночи при 30 °С со встряхиванием при 250 об./мин. Планшеты с глубокими лунками центрифугировали при 2500 об./мин в течение 10 мин и супернатант осторожно удаляли. Осадок ресуспендировали в 150 мкл буфера TES (50 мМ трис/HCl (рН 8), 1 мМ EDTA (рН 8), 20% сахарозы, с добавлением полного набора ингибиторов протеазы, Roche). Гипотонический шок индуцировали добавлением 150 мкл разведенного буфера TES (1:5 разведение TES:вода) и смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем планшеты центрифугировали при 4000 об./мин в течение 10 мин для удаления клеток и дебриса. Затем супернатант осторожно переносили в другой микротитрационный планшет и выдерживали на льду для непосредственного тестирования в функциональных анализах или ELISA.

Крупномасштабная очистка scFv.

Исходную культуру 1 мл 2 ×TYAG инокулировали одной колонией, взятой из планшета с агаром 2 ×TYAG со свежезасеянной штриховой культурой, и инкубировали со встряхиванием (240 об./мин) при 37 °С в течение 5 ч. 0,9 мл этой культуры использовали для инокуляции 400 мл культуры той же самой среды и культивировали в течение ночи при 30 °С при интенсивном перемешивании (300 об./мин).

На следующий день культуру индуцировали путем добавления 400 мкл 1М IPTG и инкубирование продолжали еще 3 ч. Клетки собирали путем центрифугирования при 5000 об./мин в течение 10 мин при 4 °С. Осажденные клетки ресуспендировали в 10 мл охлажденного льдом буфера TES, в который были добавлены ингибиторы протеазы, как описано выше. Осмотический шок вызывали путем добавления 15 мл разведенного 1:5 буфера TES и инкубирования в течение 1 ч на льду. Клетки центрифугировали при 10000 об./мин в течение 20 мин при 4 °С для осаждения клеточного дебриса. Супернатант осторожно переносили в свежую пробирку. К этому супернатанту добавляли имидазол до конечной концентрации 10 мМ. В каждую пробирку добавляли 1 мл смолы Ni-NTA (Qiagen), уравновешенной в PBS, и инкубировали на ротационном смесителе при 4 °С (20 об./мин) в течение 1 ч.

Пробирки центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин и супернатант осторожно удаляли. Осажденную смолу ресуспендировали в 10 мл холодного (4 °С) промывочного буфера 1 (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, рН до 8,0). Полученную суспензию наносили на колонку Polyprep (Biorad). Для промывки колонки самотеком использовали 8 мл холодного промывочного буфера 2 (50 мМ NaH 2 PO 4 , 3 00 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, рН до 8,0). scFv элюировали с колонки с использованием 2 мл элюирующего буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол, рН до 8,0). Фракции анализировали путем измерения оптической плотности при 280 нм, и фракции, содержащие белок, объединяли, а затем подвергали буферному обмену на обессоливающей колонке PD10 (Amersham), уравновешенной PBS. scFv в PBS анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и количественно оценивали путем измерения оптической плотности при 280 нм. Очищенные scFv разделяли на аликвоты и хранили при -20 °С и при 4 °С.

Пример 4. Ингибирование scFv-экстрактами экспрессии гена-репортера, индуцированной интерфероном-гамма.

Периплазматические scFv-экстракты различных анти-huIFN γ-антител получали как описано выше. Для идентификации одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), блокирующего активность IFN γ, проводили высокоэффективный клеточный скрининг-анализ. Репортерный ген (люциферазы светляка), регулируемый IFN γ-индуцибельным промотором GBP1, трансфицировали в человеческую клеточную линию меланомы, Ме67.8. В клеточную культуру одновременно добавляли scFv и IFN γ. После 6-часового инкубирования проводили анализ на ген-репортер люциферазы. scFv, который, как было обнаружено, ингибировал индуцирование люциферазы светляка, сохраняли для дальнейшего подтверждения.

Несколько scFv-экстрактов ингибировали IFN γ-индуцируемый ген-репортер в зависимости от дозы (фиг. 15). Для каждого scFv-клона, название которого указано вверху в каждом столбце (по убывающей концентрации слева направо), были протестированы различные концентрации (2,7, 0,68, 0,17, 0,043 и 0,011 нМ). Проценты ингибирования каждым scFv-экстрактом в указанных концентрациях представлены ниже в табл. 3.

Таблица 3Проценты ингибирования IFN γ-индуцированной экспрессии гена-репортерапериплазматическими scFV-эктрактами

Пример 5. scFv-Ингибирование экспрессии МНС класса II, индуцированной интерфероном- γ.

Для идентификации полностью человеческих антител IgG или их фрагментов, способных блокировать экспрессию IFN γ-индуцированных молекул МНС класса II, проводили проточный цитометрический анализ. После высевания клеток Ме67.8 в культуры добавляли 5 нг/мл рекомбинантного человеческого IFN γ в присутствии различных концентраций полностью человеческих моноклональных антител-кандидатов против IFN γ. После культивирования в течение 48 ч клетки окрашивали флуоресцентно меченным антителом человеческого МНС класса II (HLA-DR) и анализировали на устройстве FACSCalibur ®. Таким образом, для каждого антитела-кандидата определяли IC 50 (то есть 50%-концентрацию, при которой происходит 50%-ное ингибирование IFN γ-индуцированной экспрессии МНС класса II).

Очищенный полностью человеческий scFv получали, как описано выше в примере 1. Воздействие scFv на IFN γ-индуцированную экспрессию молекул МНС класса II, присутствующих на клетках меланомы, оценивали с помощью описанного выше проточного цитометрического анализа. Указанные scFv ингибировали IFN γ-индуцированную экспрессию МНС класса II на клетках меланомы (фиг. 16, панели 1-12). Способность этих scFv-клонов ингибировать IFN γ-индуцированную экспрессию молекул МНС II на клетках меланомы сравнивали с соответствующей способностью мышиного mAb против человеческого IFN γ, обозначаемого здесь 16С3. scFv-клоны (-) и мышиное mAb против человеческого IFN γ, 16С3 ( • • • •) представлены на фиг. 16.

Пример 6. Превращение scFv в формат IgG.

Очищенный полностью человеческий scFv получали, как описано выше в примере 1. Последовательности V H и V L отобранных scFv амплифицировали с использованием специфических олигонуклеотидов, вводящих лидерную последовательность и рестрикционный HindIII-сайт в 5'-конец. ApaI- или AvrII-сайт вводили в 3'-конец последовательности тяжелой и легкой цепей соответственно. Амплифицированные V H -последовательности гидролизовали ферментами HindIII/ApaI и клонировали в экспрессионный вектор pCon_gammal (LONZA, Basel, Switzerland). Амплифицированные V L -последовательности гидролизовали ферментами HindIII/AvrII и клонировали в экспрессионный вектор pCon_lambda2 (LONZA). Эти конструкции подтверждали путем секвенирования с последующей трансфекцией в клетки млекопитающих.

Последовательности кДНК V H и V L в их соответствующих экспрессионных векторах трансфицировали в клетки млекопитающих с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Roche, Basel, Switzerland). Вкратце, собранные клетки культивировали в 6-луночных планшетах при концентрации 6 ×10 5 клеток на лунку в 2 мл культуральной среды, содержащей фетальную бычью сыворотку. Экспрессионные векторы, кодирующие последовательности-кандидаты V H и V L , котрансфицировали в клетки с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 в соответствии с инструкциями производителя. На следующий день после трансфекции культуральную среду отсасывали, а затем в клетки добавляли 3 мл свежей бессывороточной среды и культивировали в течение трех дней при 37 °С. После трехдневного культивирования супернатант собирали для очистки IgG на колонках с G-белком.

Реконструированный полностью человеческий IgG выделяли из бессывороточных супернатантов от трансфицированных клеток на колонках Fast Flow с G-белком - Сефарозой 4В (Sigma, St. Louis, МО) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, супернатанты от трансфицированных клеток инкубировали в течение ночи при 4 °С с буфером для связывания с IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). Затем образцы пропускали через колонки Fast Flow с G-белком-Сефарозой 4В, и IgG очищали с использованием элюирующего буфера. После этого элюированную IgG-фракцию диализовали против PBS, и содержание IgG количественно оценивали путем определения оптической плотности при 280 нм. Чистоту и целостность IgG подтверждали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

Пример 7. Ингибирование индуцированной интерфероном- γ экспрессии МНС класса II реконструированным scFv.

scFv Реконструировали в формат IgG, как описано выше. Воздействие IgG-клонов на IFN γ-индуцированную экспрессию молекул МНС класса II, присутствующих на клетках меланомы, оценивали с помощью проточного цитометрического анализа, описанного выше в примере 2. Как показано на фиг. 17, на панелях 1-7, указанные IgG-клоны ингибировали IFN γ-индуцированную экспрессию МНС класса II на клетках меланомы. Способность этих IgG-клонов ингибировать IFN γ-индуцированную экспрессию молекул МНС II на клетках меланомы сравнивали с соответствующей способностью мышиного mAb против человеческого IFN γ, 16C3, и мышиного антитела против человеческого IFN γ MAB285 R & D Systems. Также представлены графики для полноразмерных IgG-клонов (-х-), мышиных mAb против человеческого IFN γ 16C3 (- ▲-) и мышиного МАВ285 против человеческого IFN γ, R &D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) (- ●-).

Величины IC 50 для этих IgG-клонов представлены ниже в табл. 4.

Таблица 4Анализ для определения IC50 полностью человеческих моноклональных анти-IFN γ антител

Пример 8. Обратная мутация клона анти-huIFN γ-антитела с восстановлением последовательности зародышевой линии.

В описанных здесь исследованиях нуклеотиды и аминокислотные остатки в последовательности нуклеиновой кислоты и в аминокислотной последовательности клона А6 были мутированы так, чтобы они соответствовали нуклеотидам или аминокислотным остаткам, присутствующим в последовательности зародышевой линии. Такой процесс называется здесь "обратной мутацией".

Тяжелая цепь А6. Ген вариабельной области тяжелой цепи антитела А6 имеет 100%-ную гомологию с геном человеческой зародышевой линии DP-47 или IGHV3-23 (GenBank Accession number M99660). Область соединения тяжелой цепи иммуноглобулина (IGHJ) А6 сравнивали с шестью человеческими функциональными областями IGHJ. Область IGHJ А6 была идентифицирована как IGHJ2 (табл. 5А, см. ниже), но она имела большую гомологию с IGHJ5-02 (табл. 5В, см. ниже). Поэтому исходная область IGHJ А6 была подвергнута мутации так, чтобы ее последовательность соответствовала последовательности IGHJ5-02, но только для последовательности, находящейся за пределами CDR3. В табл. 5А и 5В мутированные нуклеотиды и аминокислотные остатки обозначены рамками, а области CDR подчеркнуты.

Таблица 5АСравнение генов А6 и генов человеческого функционального IGHJ2

Таблица 5ВСравнение генов А6 и генов человеческого функционального IGHJ5-02

Легкая цепь А6. Ген вариабельной области λ иммуноглобулина (VL) антитела А6 принадлежит к подгруппе IGLV6-57 или к подгруппе V1-22 (GenBank Accession Number Z73673). VL А6 имеет 7 мутаций по сравнению с IGLV6-57, три из которых находятся в CDR и четыре в каркасных областях (табл. 6, см. ниже). В табл. 6 мутированные нуклеотиды и аминокислотные остатки обозначены рамками, а области CDR подчеркнуты.

Четырьмя мутациями в каркасных областях являются замена Ser на Ala в каркасной области 2 в положении 43 по Кэбату; замена Ser на Thr в каркасной области 3 в положении 72 по Кэбату; замена Lys на Glu и Thr на Ala в каркасной области 3 в положениях 79 и 80 по Кэбату соответственно. Сначала были сделаны четыре отдельные мутации в каркасных областях, а затем сразу были сделаны обратные мутации так, чтобы они соответствовали остаткам последовательности человеческой зародышевой линии. Обратные мутации в этих четырех остатках с получением последовательности, соответствующей аминокислотной последовательности человеческой зародышевой линии, не оказывали какого-либо влияния на аффинность связывания антитела NI-0501, также называемого здесь "А6 с обратной мутацией", с его антигеном-мишенью, по сравнению с антителом А6. Мутации вводили в последовательность VL А6 так, чтобы они соответствовали остаткам зародышевой линии в CDR1 (замена Ala на Val) и CDR2 (замена Gln на Arg), и было показано, что они не влияют на общую аффинность связывания анти-huIFN γ-антитела NI-0501 (антитела А6 с обратной мутацией) по сравнению с антителом А6.

Таблица 6Сравнение генов А6 и человеческого функционального IGHV6-57

Полноразмерные последовательности тяжелых и легких цепей антитела NI-0501 представлены на фиг. 1A-1D. Нуклеотиды и аминокислотные остатки, которые были подвергнуты обратной мутации с продуцированием антитела NI-0501 (т.е. нуклеотиды и аминокислотные остатки, которые отличались от нуклеотидов и аминокислотных остатков в результате замены в исходной последовательности А6), подчеркнуты и выделены курсивом на фиг. 1А и 1С.

Пример 9. Аффинность и кинетика связывания анти-huIFN γ-антитела.

Аффинность и кинетику связывания анти-huIFN γ-антитела NI-0501 оценивали на устройстве Biacore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden). 200 единиц отклика (RU) NI-0501 были иммобилизованы на чипе C1 Biacore с использованием химических реагентов EDC/NHS. Уровень связывания определяли путем пропускания hIFN γ (R &D Systems) в буфере HBS-EP при концентрациях 200-1 нм. Скорость потока составляла 100 мкл/мин, а температура была установлена на 25 °С. Эти данные соответствовали 1:1 лангмюровской модели; и были определены величины K on , K off и K D (фиг. 18).

Пример 10. Активность анти-huIFN γ-антитела.

Активность анти-huIFN γ-антитела NI-0501 сравнивали с активностью антитела, продуцированного клоном А6 (то есть анти-huIFN γ-антителом А6). В этом исследовании оценивали способность каждого анти-huIFN γ-антитела ингибировать индуцированную рекомбинантным человеческим IFN γ (rhuIFN γ) активацию МНС класса II на клеточной линии человеческой меланомы, Ме67.8. Вкратце, клетки меланомы Ме67.8 инкубировали с rhuIFN γ в присутствии NI-0501 или анти-huIFN γ-антитела А6 в течение 48-72 ч. Активацию МНС класса II определяли как описано выше в примере 5. Два этих антитела обладали аналогичной активностью, что указывает на то, что обратные мутации в анти-huIFN γ-антителе NI-0501 не влияют на активность данного антитела (фиг. 19).

Затем анализировали активность анти-huIFN γ-антитела NI-0501 по отношению к нативному IFN γ. В этом исследовании человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) активировали 1 мкг/мл митогена РНА в течение 48 ч, и супернатанты анализировали с помощью ELISA на присутствие нативного IFN γ. Затем супернатант использовали для стимуляции активации МНС класса II на клетках Ме67.8. Антитело NI-0501 обладало способностью нейтрализовать активацию МНС класса II, индуцированную нативным человеческим IFN γ (фиг. 20).

Пример 11. Перекрестная реактивность анти-huIFN γ-антитела.

Анализ на связывание.

Антитело NI-0501 анализировали на его способность связываться с IFN γ с помощью анализа в формате "сэндвич''-ELISA. Вкратце, IFN γ от видов, указанных для каждого графика на фиг. 21, иммобилизовывали на чипах, предварительно покрытых антителом NI-0501 (- ▲-) или контрольным mAb против IFN γ других видов (- ■-). IFN γ каждого вида детектировали с использованием поликлонального антитела, специфичного для IFN γ в этом анализе. Как показано на фиг. 21, антитело NI-0501 связывалось с крысиным IFN γ так же, как и контрольное антитело, но не связывалось с IFN γ других видов, за исключением IFN γ собакоподобных обезьян.

Нейтрализация активности IFN γ.

Антитело NI-0501 анализировали на его способность нейтрализовать или ингибировать рекомбинантные белки IFN γ от некоторых различных видов. Вкратце, рекомбинантный IFN γ от различных тестируемых видов помещали на 48-72 ч в культуры клеток Ме67.8 в присутствии или в отсутствие NI-0501. Активацию МНС класса II оценивали, как описано выше в примере 5. Перекрестная реактивность с IFN γ собакоподобных обезьян или его нейтрализация были продемонстрированы путем ингибирования активации МНС класса II на человеческой клеточной линии меланомы, Ме67.8 (фиг. 21). Антитело NI-0501 обладало способностью ингибировать IFN γ собакоподобных обезьян, но было неспособно нейтрализовать IFN γ от других тестируемых видов, что указывало на отсутствие перекрестной реактивности указанного антитела с IFN γ этих видов (табл. 7).

Таблица 7Перекрестная реактивность NI-0501

nhu = нативный человеческий IFN γ

rhu = рекомбинантный человеческий IFN γ

ncy = нативный IFN γ собакоподобных обезьян

rcy = рекомбинантный IFN γ собакоподобных обезьян

rd = рекомбинантный собачий IFN γ

rc = рекомбинантный кошачий IFN γ

rr = рекомбинантный крысиный IFN γ

rm = рекомбинантный мышиный IFN γ

+ = перекрестная реактивность

- = отсутствие перекрестной реактивности

* = не тестировали

Кроме того, МКПК собакоподобных обезьян активировали 1 мкг/мл митогена РНА в течение 48 ч и супернатанты анализировали с помощью ELISA на присутствие нативного IFN γ. Затем этот супернатант использовали для стимуляции активации МНС класса II на клетках Ме67.8. Антитело NI-0501 обладало способностью нейтрализовать активацию МНС класса II, индуцированную нативным IFN γ собакоподобных обезьян (фиг. 22).

Пример 12. Биологическая активность анти-huIFN γ-антитела.

Исследования, описанные в настоящей заявке, проводили для оценки биологической активности анти-huIFN γ-антитела NI-0501 после его введения собакоподобным обезьянам. Антитело NI-0501 было выбрано для оценки его безопасности и проведения описанных здесь фармакокинетических (ФК) исследований, поскольку было обнаружено, что указанное анти-huIFN γ-антитело способно перекрестно реагировать с IFN γ собакоподобных обезьян, как описано выше. Для оценки побочных клинических эффектов после многократных внутривенных вливаний обезьянам делали вливания в следующих дозах: 30, 100 и 200 мг/кг.

У мышей с разрушенным геном IFN γ наблюдались пониженные уровни IgG2a и повышенные уровни IgG1 в ответ на KLH-иммунизацию, что свидетельствовало о корреляции между уровнем IFN γ и IgG-ответом. Во время основных токсикологических исследований, проводимых в течение 13 недель, обезьян иммунизовали KLH в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). У обезьян, кообработанных плацебо, наблюдался типичный иммунный ответ на иммунизацию KLH/IFA с вырабатыванием KLH-специфических IgM и IgG, обнаруженных в сыворотке. Эти исследования были разработаны для того, чтобы определить, может ли нейтрализация IFN γ у NI-0501-обработанных обезьян, которые были иммунизованы KLH в IFA, приводить к изменению титра KLH-специфического IgG-титра.

Пример 13. Модуляция активности IFN γ с использованием анти-huIFN γ антител.

Продуцирование хемокина IP-10 в некоторых клеточных линиях стимулируется IFN γ. На основании этих наблюдений был разработан анализ цельной крови. В этом анализе цельной крови пробы цельной крови, взятые от нескольких доноров, смешивали с фиксированной концентрацией IFN γ и с различными концентрациями NI-0501. После инкубирования уровни IP-10 измеряли с помощью ELISA, используемого для оценки способности анти-huIFN γ-антитела блокировать продуцирование IP-10 (фиг. 23).

Другие варианты осуществления изобретения

Хотя настоящее изобретение было подробно описано в представленной здесь заявке, однако, настоящее описание приводится лишь в иллюстративных целях и не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. В указанную формулу изобретения входят и другие аспекты, преимущества и модификации.

Список последовательностей