В настоящем изобретении предложены способы, относящиеся к получению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) и вакцины против PRRSV.

[0001] Способ получения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) из клеток позвоночного животного, включающий стадии:

[0002] Способ по п.1, где указанные клетки становятся более пермиссивными в отношении PRRSV за счет экспрессии CD163.

[0003] Способ по п.1, где клетки ранее не экспрессировали полипептид CD163.

[0004] Способ по п.1, где клетки выбраны из группы, состоящей из клеток почки детенышей хомячков (BHK21), клеток почки свиньи, клеток почки кошки, клеток птиц и тестикулярных клеток свиньи.

[0005] Способ по п.1, где PRRSV имеет европейский генотип.

[0006] Способ по п.1, где PRRSV имеет североамериканский генотип.

[0007] Способ по п.1, где указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 70%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO:14.

[0008] Способ по п.7, где указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO:14.

[0009] Способ по п.1, где указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO:19.

[0010] Способ по п.1, где указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO:24.

[0011] Способ по п.1, где указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO:32.

[0012] Способ по п.1, где указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO:46.

[0013] Способ по п.1, где трансфекция клеток экзогенным полинуклеотидом, который кодирует CD163 полипептид млекопитающих, сопровождается электропорацией.

[0014] Способ по п.1, где указанный экзогенный полинуклеотид кодирует слитый белок, включающий полипептид млекопитающих CD163.

[0015] Способ получения вакцины против вируса PRRSV, включающий стадии (а), (б) и (в), как определено в п.1, и дополнительно включающий стадию получения вакцины из выделенного вируса.

[0016] Способ по п.15, где вакцина содержит инактивированный вирус.

[0017] Способ по п.15, где вакцина содержит живой аттенуированный вирус.

Область изобретения

В настоящем изобретении предложены способы и композиции, относящиеся к получению клеток-хозяев, пермиссивных в отношении роста вирусов семейства Asfarviridae и Arteriviridae.

Предшествующий уровень техники

Asfarviridae.

Asfarviridae представляет собой семейство икосаэдрических оболочечных вирусов, геном которых состоит из одной молекулы линейной двухцепочечной ДНК, имеющей длину приблизительно 150000-190000 нуклеотидов. Название семейства происходит от вируса африканской лихорадки свиней и родственных вирусов (African Swine Fever Virus and Related Viruses). Вирус африканской лихорадки свиней (ASFV) представляет собой типичный вид рода Asfivirus и является единственным представителем данного семейства. Недавно косвенно предположили, что полипептид CD163 свиньи представляет собой клеточный рецептор для вируса африканской лихорадки свиней (ASFV) (Sanchez-Torres et al., 2003).

Arteriviridae.

Вирусы семейства Arteriviridae включают вирус артериита лошадей (EAV), вирус, увеличивающий уровень лактатдегидрогеназы (LDV), и вирус гемморрагической лихорадки обезьян (SHFV). Артеривирус, имеющий наибольшое экономическое значение, представляет собой вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV).

PRRSV.

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) является одним из наиболее экономически важных заболеваний свиней. Этот синдром появился почти одновременно в Северной Америке и Восточной Европе в конце 1980-х годов и с того времени распространился таким образом, что стал эндемическим заболеванием в большей части стран Европы, Азии и Америки, производящих свинину. Этиологический агент PRRS представляет собой вирус, который обозначен как вирус PRRS или PRRSV. Для европейских и североамериканских PRRS заболевание характеризуется нарушением репродуктивной системы у свиноматок и молодых свиней (аборты на поздней стадии беременности, рождение мертвых и мумифицированных плодов), высокой смертностью среди поросят и респираторным заболеванием у свиней всех возрастов. Заболевание является основной темой недавних обзоров (Mengeling and Lager, 2000; Murtaugh et al., 2002; Nodelijk, 2002; Plagemann, 2003).

У свиней инфицирование PRRSV ограничено подгруппой клеток моноцитарно-макрофагального происхождения. Полностью дифференцированные альвеолярные макрофаги свиней (РАМ) представляют собой первичные клетки-мишени для вирусной репликации (Duan et al., 1997а; Duan et al., 1997b). Иммортализация РАМ клеток является технически трудной и, в случае успеха, приводит в результате к клеточным линиям, которые не являются пермиссивными в отношении роста вируса PRRS (Weingartl et al., 2002). Вирионы PRRS специфически связываются макрофагами и интернализуются в покрытые клатрином ямки посредством эндоцитоза. Высвобождение из эндоцитозных пузырьков требует кислого рН (Nauwynck et al., 1999). Первоначальное связывание вирионов опосредовано взаимодействием белка вирусной матрицы с гепарин-сульфат-гликозаминогликанами (Delputte et al., 2002). Интернализация может быть облегчена благодаря мембранному гликопротеину с массой 210 или 220 кДа, поскольку инкубация РАМ клеток с моноклональными антителами к этому полипептиду блокирует инфицирование вирусом PRRS (Duan et al., 1998; Wissink et al., 2003). Гликопротеин с массой 210 кДа недавно был идентифицирован как сиалоадгезин, являющийся представителем семейства Siglec иммуноглобулинподобных лектинов, связывающих сиаловую кислоту (Pensaert et al., 2003). Трансфекция непермиссивной клеточной линии PK-15 (почки свиньи) сиалоадгезином свиней подтвердила способность PRRSV частиц интернализоваться, но оставался явный блок на стадии отсутствия покрытия, так как вирионы проникали в клеточные везикулы, но не подвергались разрушению нуклеокапсида и слиянию с везикулярной мембраной. Вирусные гены не экспрессировались, и трансфицированные клетки PK-15 не становились пермиссивными в отношении вируса PRRS (Vanderheijden et al., 2003). В дополнение к нашим знаниям не было показано, что трансфекция сиалоадгезином является достаточной для превращения какой-либо клеточной линии, непермиссивной в отношении PRRSV, в фенотип, пермиссивный в отношении PRRSV.

Помимо первичных клеток свиней моноцитарно-макрофагального происхождения, другим единственным типом клеток, который известен тем, что является пермиссивным в отношении роста PRRSV в культуре клеток, является иммортализованная клеточная линия почки обезьяны MA-104 (Chladek et al., 1998) и производные, такие как MARC-145 (Kim et al., 1993) и CL-2621. Не известно, почему одна конкретная клеточная линия является пермиссивной, а другие клеточные линии млекопитающих не являются пермиссивными. Вирус PRRS специфически связывается со множеством различных типов клеток, но не инициирует инфекцию (Kreutz, 1998; Therrien et al., 2000). В клетках MARC-145 интернализация вируса посредством эндоцитоза и последующее удаление оболочки в везикулах с низким уровнем рН, по-видимому, имитирует похожие события в клетках РАМ (Kreutz and Ackermann, 1996). Однако многие моноклональные антитела, которые связываются с сиалоадгезином свиней, не смогли обнаружить гомологичный белок на поверхности клеток MARC-145 (Duan et al., 1998; Wissink et al., 2003), что свидетельствует о том, что клетки MARC-145 могут использовать вместе дивергирующий член того же белкового семейства или другой рецептор.

Современные PRRSV вакцины размножают на линиях клеток обезьян, что представляет собой потенциально опасную активность. Применение линий клеток обезьян для производства вакцины имеет перспективу введения интересующих вирусов приматов в линии свиней, предназначенные для целей ксенотрансплантации. Поскольку свиньи все больше исследуются в качестве источника органов, являющихся ксенотрансплантатами для людей, введение линий клеток приматов популяциям свиней в конечном итоге может представлять риск для людей, которым пересаживают органы, являющиеся ксенотрансплантатами. Таким образом, было бы целесообразно избегать применения линий клеток обезьян в препаратах вакцин для свиней. Таким образом, было бы желательно идентифицировать или получать клетки, отличные от клеток обезьян, или клеточные линии, способные поддерживать репликацию PRRSV. Для этой цели важно идентифицировать генный продукт(ы), который может быть ответственен за обеспечение пермиссивности в отношении репликации PRRSV, что наблюдается в некоторых линиях клеток обезьян, а также РАМ клетках. После идентификации таких генных продуктов непермиссивные клетки можно перевести в состояние пермиссивности посредством трансфекции в них этого важного гена, обеспечивая таким образом более широкий спектр линий, продуцирующих вакцину.

В одной из лабораторий сообщили о том, что тетраспаниновый белок CD151 из клеток MARC-145, трансфицированный в непермиссивные клетки BHK-21, обеспечивает пермиссивность в отношении вируса PRRS (Kapil and Shanmukhappa, 2003; Shanmukhappa and Kapil, 2001). Это наблюдение было подтверждено также независимой лабораторией.

Авторы изобретения раскрыли в данном описании неродственный полипептид, который при трансфекции в непермиссивные клетки обеспечивает пермиссивность в отношении вируса PRRS.

Процитированные ссылки.

Chladek, D.W., Harris, L.L. and Gorcyca, D.E. Method of growing and attenuating a viral agent associated with mystery swine disease. Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. 677,585 [US 5840563], 1-24. 11-24-1998. USA. 7-9-1996. Ref Type: Patent.

Dea, S., Gagnon, C.A., Mardassi, H., Pirzadeh, B. and Rogan, D. (2000). Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates [Review]. Arch. Virol., 145, 659-688.

Delputte, P.L., Vanderheijden, N., Nauwynck, H.J. and Pensaert, M.B. (2002). Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages. J. Virol., 76, 4312-4320.

Duan, X., Nauwynck, H.J. and Pensaert, M.B. (1997a). Effects of origin and state of differentiation and activation of monocytes/macrophages on their susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Arch. Virol., 142, 2483-2497.

Duan, X., Nauwynck, H.J. and Pensaert, M.B. (1997b). Virus quantification and identification of cellular targets in the lungs and lymphoid tissues of pigs at different time intervals after inoculation with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Vet. Microbiol., 56, 9-19.

Duan, X.B., Nauwynck, H.J., Favoreel, H.W. and Pensaert, M.B. (1998). Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrophages. J. Virol., 72, 4520-4523.

Graversen, J.H., Madsen, M. and Moestrup, S.K. (2002). CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma. [Review] [19 refs]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 34, 309-314.

Gronlund J., Vitved L., Lausen M., Skjodt K., Holmskov U. Cloning of a novel scavenger receptor cysteine-rich type I transmembrane molecule (M160) expressed by human macrophages. Journal of Immunology, 165(11):6406-6415, 2000.

Kapil, S. and Shanmukhappa, K. Host susceptibility factor(s) for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses in swine breeding, as a target for antiviral compounds, and development of a non-simian recombinant cell line for propagation virus, none. US 2003/0186236 A1, 1-45. 10-2-2003. USA. 1-28-2002. Ref Type: Patent.

Kim, H.S., Kwang, J., Yoon, I.J., Joo, H.S. and Frey, M.L. (1993). Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogenous subpopulation of MA-104 cell line. Arch. Virol., 133, 477-483.

Kreutz, L.C. (1998). Cellular membrane factors are the major determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus tropism. Virus Res., 53, 121-128.

Kreutz, L.C. and Ackermann, M.R. (1996). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus enters cells through a low pH-dependent endocytic pathway. Virus Res., 42, 137-147.

Mengeling, W.L. and Lager, K.M. (2000). A brief review of procedures and potential problems associated with the diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome. Veterinary Research, 31, 61-69.

Meulenberg, J.J.M. (2000). PRRSV, the virus. Veterinary Research, 31, 11-21.

Murtaugh, M.P., Xiao, Z.G. and Zuckermann, F. (2002). Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection [Review]. Viral Immunology, 15, 533-547.

Nauwynck, H.J., Duan, X., Favoreel, H.W., Van Oostveldt, P., and Pensaert, M.B. (1999). Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages via receptor-mediated endocytosis. J. Gen. Virol., 80, 297-305.

Nodelijk, G. (2002). Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) with special reference to clinical aspects and diagnosis - A review [Review]. Vet. Quart., 24, 95-100.

Pensaert, M., Nauwynck, H. and Vanderheijden, N. Nucleic acid encoding polypeptide involved in cellular entrance of the PRRS virus. Akzo Nobel N.V. and Universiteit Gent. WO 03/010200 A2, 1-24. 2-6-2003. 7-18-2002. Ref Type: Patent.

Philippidis, P., Mason, J.C., Evans, B.J., Nadra, I., Taylor, K.M., Haskard, D.O. and Landis, R.C. (2004). Hemoglobin scavenger receptor CD163 mediates interleukin-10 release and heme oxygenase-1 synthesis - Antiinflammatory monocyte-macrophage responses in vitro, in resolving skin blisters in vivo, and after cardiopulmonary bypass surgery. Circulation Research 94, 119-126.

Plagemann, P.G.W. (2003). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: Origin hypothesis. Emerging Infectious Diseases 9, 903-908.

Ritter, M., Buechler, C., Langmann, T. and Schmitz, G. (1999). Genomic organization and chromosomal localization of the human CD163 (M130) gene: a member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily. Biochemical & Biophysical Research Communications, 260, 466-474.

Sanchez-Torres, C., Gomez-Puertas, P., Gomez-del-Moral, M., Alonso, F., Escribano, J.M., Ezquerra, A. and Dominguez, J. (2003). Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch. Virol., 148, 2307-2323.

Shanmukhappa, K. and Kapil, S. (2001). Cloning and identification of MARC-145 cell proteins binding to 3'UTR and partial nucleoprotein gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Adv. Exp. Med. Biol., 494, 641-646.

Snijder, E.J. and Meulenberg, J.J.M. (2001). Arteriviruses. In Fields Virology, D.M. Knipe, P.M. Howley, D.E. Griffin, M.A. Martin, R.A. Lamb, B. Roizman and S.E. Straus, eds. (Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins), p.1205-1220.

Therrien, D., St Pierre, Y. and Dea, S. (2000). Preliminary characterization of protein binding factor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on the surface of permissive and non-permissive cells. Arch. Virol., 145, 1099-1116.

Vanderheijden, N., Delputte, P.L., Favoreel, H.W., Vandekerckhove, J., Van Damme, J., van Woensel, P.A. and Nauwynck, H.J. (2003). Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages. J. Virol., 77, 8207-8215.

Weingartl, H.M., Sabara, M., Pasick, J., van Moorlehem, E. and Babiuk, L. (2002). Continuous porcine cell lines developed from alveolar macrophages - Partial characterization and virus susceptibility. J. Virol. Methods, 104, 203-216.

Wissink, E.H.J., van Wijk, H.A.R., Pol, J.M.A., Godeke, G.J., van Rijn, P.A., Rottier, P.J.M., and Meulenberg, J.J.M. (2003). Identification of porcine alveolar macrophage glycoproteins involved in infection of porcine respiratory and reproductive syndrome vitus. Arch. Virol., 148, 177-187.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение относится к способу получения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) из клеток позвоночного животного, включающему стадии:

(а) получения рекомбинантных клеток позвоночного, трансфицированных экзогенным полинуклеотидом, который кодирует CD163 полипептид млекопитающих, с целью повышения и/или обеспечения экспрессии CD163 полипептида в указанных клетках;

(б) приведения в контакт указанных клеток с вирусом PRRSV в условиях, которые обеспечивают возможность инфицирования клеток и развития вируса; и

(в) выделения вируса из указанных клеток.

В одном воплощении данного изобретения указанные клетки становятся более пермиссивными в отношении PRRSV за счет экспрессии CD163.

В еще одном воплощении данного изобретения клетки ранее не экспрессировали полипептид CD163.

В предпочтительном воплощении клетки животного выбраны из группы, состоящей из клеток почки детенышей хомячков (BHK21), клеток почки свиньи, клеток почки кошки, клеток птиц и тестикулярных клеток свиньи.

В одном воплощении изобретения PRRSV имеет европейский генотип.

В другом воплощении изобретения PRRSV имеет североамериканский генотип.

В одном воплощении изобретения экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 70%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 14.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 14.

В еще одном воплощении изобретения указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 19.

В еще одном воплощении изобретения указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 24.

В еще одном воплощении изобретения указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 32.

В еще одном воплощении изобретения указанный экзогенный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий трансмембранный домен и по меньшей мере 90%-ную идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 46.

В одном предпочтительном воплощении изобретения трансфекция клеток экзогенным полинуклеотидом, который кодирует CD163 полипептид млекопитающих, сопровождается электропорацией.

Еще в одном воплощении изобретения экзогенный полинуклеотид кодирует слитый белок, включающий полипептид млекопитающих CD163.

Данное изобретение относится также к способу получения вакцины против вируса PRRSV, включающему стадии (а), (б) и (в), как определено выше, и дополнительно включающему стадию получения вакцины из выделенного вируса.

В одном воплощении изобретения вакцина содержит инактивированный вирус.

В еще одном воплощении изобретения вакцина содержит живой аттенуированный вирус.

Краткое описание перечней последовательностей

SEQ ID NO: 1 - последовательность кДНК, кодирующая susCD163v1 свиньи.

SEQ ID NO: 2 - предсказанная аминокислотная последовательность susCD163v1 свиньи.

SEQ ID NO: 3 - последовательность кДНК, Genbank, кат. № AJ311716.

SEQ ID NO: 4 - предсказанная аминокислотная последовательность, полученная из Genbank, кат. № AJ311716.

SEQ ID NO: 5 - последовательность кДНК susCD163v1, содержащая фланкирующую (некодирующую) последовательность.

SEQ ID NO: 6-11 - последовательности праймеров.

SEQ ID NO: 12 - последовательность кДНК, кодирующая susCD163v2 свиньи, содержащая фланкирующую (некодирующую) последовательность.

SEQ ID NO: 13 - последовательность кДНК, кодирующая susCD163v2 свиньи.

SEQ ID NO: 14 - предсказанная аминокислотная последовательность susCD163v2 свиньи.

SEQ ID NO: 15-16 - последовательности праймеров.

SEQ ID NO: 17 - последовательность кДНК, кодирующая CD163v2 человека, содержащая фланкирующую (некодирующую) последовательность.

SEQ ID NO: 18 - последовательность кДНК, кодирующая CD163v2 человека.

SEQ ID NO: 19 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v2 человека.

SEQ ID NO: 20-21 - последовательности праймеров.

SEQ ID NO: 22 - последовательность кДНК, кодирующая CD163v2 мыши, содержащая фланкирующую (некодирующую) последовательность.

SEQ ID NO: 23 - последовательность кДНК, кодирующая CD163v2 мыши.

SEQ ID NO: 24 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v2 мыши.

SEQ ID NO: 25 - последовательность кДНК, кодирующая CD163v3 мыши, содержащая фланкирующую (некодирующую) последовательность.

SEQ ID NO: 26 - последовательность кДНК, кодирующая CD163v3 мыши.

SEQ ID NO: 27 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v3 мыши.

SEQ ID NO: 28-29 - последовательности праймеров.

SEQ ID NO: 30 - последовательность кДНК, кодирующая MARC-145 CD163v3, содержащая фланкирующую (некодирующую) последовательность.

SEQ ID NO: 31 - последовательность кДНК, кодирующая MARC-145 CD163v3.

SEQ ID NO: 32 - предсказанная аминокислотная последовательность MARC-145 CD163v3.

SEQ ID NO: 33 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v2 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 34 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v2 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 35 - последовательность кДНК, кодирующая транрскрипт CD163v3 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 36 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v3 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 37 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v4 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 38 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v4 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 39 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v5 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 40 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v5 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 41 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v6 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 42 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v6 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 43 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v7 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 44 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v7 из клеток Vero.

SEQ ID NO: 45 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v2 собаки.

SEQ ID NO: 46 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v2 собаки.

SEQ ID NO: 47 - последовательность кДНК, кодирующая транскрипт CD163v3 собаки.

SEQ ID NO: 48 - предсказанная аминокислотная последовательность CD163v3 собаки.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Схематическое сравнение susCD163v1 с AJ311716.

Фиг. 2. Выравнивание аминокислотной последовательности susCD163v1 (SEQ ID NO: 2) с AJ311716 (SEQ ID NO: 4).

Фиг. 3. Выравнивание нуклеотидной последовательности susCD163v1 с AJ311716.

Фиг. 4. Получение фрагментов ДНК и лигирование для размещения CD163 непосредственно за промотором RSV. Плазмиды переваривали с помощью DraIII или DrdI с последующей реакцией затупления с использованием фермента Кленова. После очистки плазмиды переваривали с помощью NotI. Очистка в геле давала фрагменты ДНК, которые затем лигировали с использованием липких NotI-концов. Промоторы из RSV (pRSV) и SV40 (pSV40) указаны стрелками.

Фиг. 5. Карта вектора для прямого клонирования pCDNA3.1 V5/His/TOPO.

Фиг. 6. Три клеточные линии BHK/CMV/v1 #3, #5 и #12 и непермиссивную клеточную линию BHK инфицировали изолятом P129 PRRSV и окрашивали SDOW17-FITC (фенилизотиоцианат). Панель А демонстрирует непермиссивный клеточный клон BHK21. Панель В демонстрирует BHK/CMV/v1 клон #3. Панель С демонстрирует BHK/CMV/v1 клон #5. Панель D демонстрирует BHK/CMV/v1 клон #12.

Фиг. 7. Три клеточные линии BHK/RSV/v1 #2, #3 и #4 инфицировали изолятом P129 PRRSV и окрашивали SDOW17-FITC. Панель А демонстрирует BHK/RSV/v1 клон #2. Панель В демонстрирует BHK/RSV/v1 клон #3. Панель С демонстрирует BHK/RSV/v1 клон #4.

Фиг. 8. Клеточные линии почки кошки, стабильно экспрессирующие CD163v1 свиньи, демонстрирующие бляшки PRRSV. Клеточные линии NLFK-CMV-susCD163v1-G4F и NLFK-CMV-susCD163v1-G4L, обе на 4 пассаже, инфицировали изолятом P129 североамериканского PRRSV и инкубировали в течение 6 суток. Монослои фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали моноклональным антителом SDOW17-FITC. Фазово-контрастная микроскопия (справа) демонстрирует локализованные области вирусных CPE (бляшки), тогда как FA детекция (слева) демонстрирует колокализованный вирусный нуклеокапсидный антиген.

Фиг. 9. Четыре клеточные линии FK/RSV/v1 #1, #2, #3 и #4 инфицировали изолятом P129 PRRSV и окрашивали моноклональным антителом SDOW17-FITC. Панель А демонстрирует FK/RSVv1 клеточный клон #1. Панель В демонстриует FK/RSV/v1 клон #2. Панель С демонстрирует FK/RSV/v1 клон #3. Панель D демонстрирует FK/RSV/v1 #4.

Фиг. 10. Клетки PK-CMV-susCD163v1-A10 на пассаже 19, инфицированные изолятом P129 PRRSV. Слева: монослой фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc.), специфическим в отношении нуклеокапсида PRRSV. Справа: Та же самая лунка при светлопольном освещении, демонстрирующая распределение клеток.

Фиг. 11. BHK-CMVScript-susCD163v2-A9 на пассаже 17, инфицированные изолятом P129 PRRSV. Монослой фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc.), специфическим в отношении нуклеокапсида PRRSV.

Фиг. 12. Три типичных примера клеточных линий BHK/RSV/v2. Клетки инфицировали изолятом P129 PRRSV и затем окрашивали SDOW17-FITC. Панель А демонстрирует клеточную линию BHK/RSV/v2 #1. Панель В демонстрирует клеточную линию BHK/RSV/v2 #34. Панель С демонстрирует клеточную линию BHK/RSV/v2 #47.

Фиг. 13. FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6 на пассаже 15, инфицированные изолятом P129 PRRSV. Монослой фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc.), специфическим в отношении нуклеокапсида PRRSV.

Фиг. 14. Количество потомства PRRSV, продуцируемого четырьмя рекомбинантными клеточными линиями, стабильно экспрессирующими susCD163v1, и клетками MARC-145, определяли в эксперименте с кривой роста, используя изолят NVSL 94-3 PRRSV. Образцы, собранные с 12-часовыми интервалами, титровали на монослоях клеток MARC-145.

Фиг. 15. Анализ инфицирования PRRSV в присутствии антитела, специфического к CD163, посредством проточной цитометрии. Клетки BHK-21, экспрессирующие CD163MARC-145 после временной трансфекции, инкубировали с антителом, специфическим к CD163, или с нормальным IgG козы (NGS), и инфицировали PRRSV, экспрессирующим GFP (зеленый флуоресцентный белок). Значение в каждой точке представляет собой результат для трех лунок.

Фиг. 16. Анализ инфицирования PRRSV в присутствии антитела, специфического к CD163, посредством проточной цитометрии. Клетки NLFK, стабильно экспрессирующие CD163 человека, инкубировали с антителом, специфическим к CD163, или с нормальным IgG козы (NGS), и инфицировали PRRSV, экспрессирующим GFP. Через 24 ч после инфицирования определяли процент инфицированных клеток, экспрессирующих GFP. Значение в каждой точке представляет собой результат, полученный для одной лунки с клетками.

Фиг. 17. Графическое представление шести альтернативных сплайс-вариантов мРНК CD163, полученных из клеток Vero. Шесть вариантов отличаются присутствием или отсутствием трех экзонов, обозначенных Е6, E105 и Е83. Экзоны Е6 и E105 имеют длины, кратные трем, и, таким образом, когда отсутствуют, не приводят к изменению рамки считывания. Наоборот, отсутствие Е83 приводит в результате к сдвигу рамки считывания и альтернативной аминокислотной последовательности на карбокси-конце белка (указанной на фигуре заштрихованной областью). Гидрофобный трансмембранный участок (TM) кодируется в E105.

Фиг. 18. Клетки PK-RSVScript-susCD163v2 #9, инфицированные изолятом P129 PRRSV. Неразведенный супернатант от РАМ, инфицированных изолятом Р201 PRRSV, использовали для инфицирования клеток PK-RSVScript-susCD163v2 #9. После инкубации в течение двух суток клетки фиксировали и окрашивали моноклональным антителом SDOW17, как описано в примере 11.

Фиг. 19. Клетки FK-RSVScript-susCD163v2 #51, инфицированные изолятом P129 PRRSV. Неразведенный супернатант от РАМ, инфицированных изолятом Р201 PRRSV, использовали для инфицирования клеток FK-RSVScript-susCD163v2 #51. Через двое суток после инфицирования клетки фиксировали ацетоном и окрашивали моноклональным антителом SDOW17, как описано в примере 11.

Фиг. 20. Инфицирование клеток PK-RSVScript-susCD163v2 клон #9 изолятом Р201 PRRSV. Панель А демонстрирует монослой клеток, инфицированных PRRSV Р201, на пассаже 1, через двадцать четыре часа после инфицирования. Панель В демонстрирует монослой клеток через 2 суток после инфицирования бесклеточным супернатантом PRRSV Р201 на пассаже 10.

Фиг. 21. Родительские клетки NLFK и один субклон FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6 проверяли в отношении экспрессии CD163. Клетки фиксировали в 80%-ном ацетоне и подвергали взаимодействию с антителами козы против CD163 человека (R &D System в соотношении 1:200) в течение одного часа с последующей промывкой PBS. Для визуализации использовали FITC-конъюгированные IgG осла против антител козы (Biodesign Inc в соотношении 1:100). Как показано на фиг. 21A, в родительских клетках NLFK не было обнаружено никакой специфической флуоресценции. Большая часть субклона FK.A6.A2 продемонстрировала хорошее флуоресцентное окрашивание, указывающее на присутствие CD163 (фиг. 21В).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение охватывает способ облегчения инфицирования одной или более чем одной клетки вирусом, выбранным из группы, состоящей из Arteriviridae и Asfarviridae, включающий стадию направленной повышенной экспрессии полипептида CD163 в указанной клетке. В предпочтительном воплощении CD163 связан с мембраной. В одном воплощении вирус выбран из группы, состоящей из Arteriviridae. В предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV. В другом воплощении указанный вирус представляет собой вирус артериита лошадей (EAV). В еще одном воплощении указанный вирус представляет собой вирус африканской лихорадки свиней (ASFV).

Повышенную экспрессию полипептида CD163 можно осуществить с использованием способов, таких как введение экзогенных нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды CD163. Такие способы включают трансфекцию, электропорацию и слияние с носителем полинуклеотида, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид CD163, но не ограничиваются ими. Повышенную экспрессию также можно осуществить посредством индукции экспрессии эндогенного CD163 химической обработкой.

Данный способ может приводить к тому, что клетки, ранее непермиссивные в отношении PRRSV, становятся пермиссивными в отношении PRRS. Данный способ также может включать превращение одной или более чем одной клетки, ранее не экспрессирующей полипептид CD163, в клетки, которые индуцированы к экспрессии полипептида CD163.

Клетки в предпочтительном воплощении представляют собой клетки животных. Они могут представлять собой клетки позвоночных или беспозвоночных животных. Клетки могут представлять собой клетки млекопитающих. Клетки или линия клеток может представлять собой линию клеток насекомых. Клетки могут представлять собой клетки BHK21. Клетки могут быть получены из клеток почки свиньи. Клетки или линия клеток может быть получена из клеток почки кошки. Клетки или линия клеток может представлять собой клетки BHK-21, NLST-1, NLFK-1, Vero или RL, но не ограничивается ими. PRRSV может иметь европейский или североамериканский генотип.

Как указано выше, повышенную экспрессию полипептида CD163 можно осуществить с использованием способов, которые включают трансфекцию, электропорацию и слияние с носителем полинуклеотида, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид CD163, но не ограничиваются ими. Рассмотрены любые полипептиды CD163. Предпочтительными являются полипептиды, содержащие трансмембранный участок. Примеры полипептидов CD163 выбраны из группы, состоящей из перечисленных ниже полинуклеотидов.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с SEQ ID NO: 2.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 2 не более чем на 20 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 2 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 2.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 14.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 14 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 14 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 14.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 13.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 24 не более чем на 2 консервативные аминокислотные замены.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 24.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 23.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 27.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 27 не более чем на 20 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 27 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 27.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 26.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 32.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 32 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 32 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 32.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 31.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 34.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 34 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 34 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 34.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 33.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 36.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 36 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 36 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 36.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 35.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 42.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 42 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 42 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 42.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 41.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 44.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 44 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 44 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 44.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 43.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 46.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 46 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 46 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 46.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 45.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 48.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 48 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 48 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 48.

Один из таких полинуклеотидов включает полинуклеотид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 47.

Описанный выше способ облегчения инфицирования дополнительно может включать стадию получения культуры вируса.

Изобретение также относится к культуре, выделенной описанным выше способом.

Любой из описанных выше способов дополнительно может включать стадию получения PRRS или другой вирусной вакцины. Вакцина может представлять собой убитую вакцину или живую аттенуированную вакцину.

Изобретение также относится к клетке или линии клеток, где способность одной или более чем одной клетки инфицироваться вирусом, выбранным из группы, состоящей из Arterviridae и Asfarviridae, модифицирована посредством направленной повышенной экспрессии полипептида CD163 в указанных клетках.

В предпочтительном воплощении полипептид CD163 включает трансмембранный участок. В одном воплощении вирус выбран из группы, состоящей из Arteriviridae. B предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV. В другом воплощении указанный вирус представляет собой вирус артериита лошадей (EAV). В еще одном воплощении указанный вирус представляет собой вирус африканской лихорадки свиней (ASFV).

Клетка или клеточная линия по изобретению ранее может быть непермиссивной в отношении PRRSV, и ее переводят в состояние пермиссивности в отношении PRRSV посредством направленной повышенной экспрессии полипептида CD163 в указанной клетке или клеточной линии.

Клетка или клеточная линия по изобретению включает клетки или клеточные линии, которые не экспрессируют полипептид CD163 и индуцируются для экспрессии полипептида CD163.

Клетки в предпочтительном воплощении представляют собой клетки животных. Они могут представлять собой клетки позвоночных или беспозвоночных животных. Клетки могут представлять собой клетки млекопитающих. Клетка или линия клеток может представлять собой клетку или линию клеток насекомых. Клетки могут представлять собой клетки BHK21. Клетки могут быть получены из клеток почки свиньи. Клетка или линия клеток может быть получена из клеток почки кошки. Клетки могут представлять собой клетки BHK-21, NLST-1, NLFK-1, Vero или RL, но не ограничиваются ими. PRRSV может быть североамериканским или европейским.

Изобретение охватывает способ измерения предрасположенности тестируемой клетки или клеточной линии к инфицированию вирусом, выбранным из группы, состоящей из Arteriviridae и Asfarviridae, включающий:

а) получение образца, содержащего нуклеиновые кислоты из тестируемой клетки или клеточной линии;

б) определение количества полинуклеотида, кодирующего полипептид CD163, или его комплемента в указанном образце,

где повышенное количество полинуклеотида, кодирующего полипептид CD163, относительно контрольного образца, полученного из контрольной клетки или клеточной линии, которая известна тем, что не поддерживает рост указанного вируса, свидетельствует о предрасположенности тестируемой клетки или клеточной линии к поддержанию репликации указанного вируса.

В одном воплощении вирус выбран из группы, состоящей из Arteriviridae. B предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV. В другом воплощении указанный вирус представляет собой вирус артериита лошадей (EAV). В еще одном воплощении указанный вирус представляет собой вирус африканской лихорадки свиней (ASFV).

Количество полинуклеотида, кодирующего полипептид CD163, может быть определено посредством гибридизации.

Количество полинуклеотида, кодирующего полипептид CD163, может быть определено посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Изобретение также охватывает способ измерения предрасположенности тестируемой клетки или клеточной линии к инфицированию вирусом, выбранным из группы, состоящей из Arteriviridae и Asfarviridae, включающий:

(а) получение образца, содержащего полипептиды из тестируемой клетки или клеточной линии;

(б) определение количества полипептида CD163 в указанном образце,

где повышенное количество полипептида CD163 относительно контрольного образца, полученного из контрольной клетки или клеточной линии, которая известна тем, что не поддерживает рост указанного вируса, свидетельствует о предрасположенности тестируемой клетки или клеточной линии к поддержанию репликации указанного вируса.

В одном воплощении вирус выбран из группы, состоящей из Arteriviridae. B предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV. В другом воплощении указанный вирус представляет собой вирус артериита лошадей (EAV). В еще одном воплощении указанный вирус представляет собой вирус африканской лихорадки свиней (ASFV).

В одном воплощении определение осуществляют посредством приведения полипептида CD163 в контакт с антителом, специфическим в отношении полипептида CD163, в условиях, при которых данное антитело связывается с полипептидом CD163.

Изобретение охватывает способ измерения предрасположенности свиньи к инфицированию вирусом, выбранным из группы, состоящей из Arteriviridae и Asfarviridae, включающий:

а) получение образца, содержащего нуклеиновые кислоты из тестируемой свиньи;

б) определение количества полинуклеотида, кодирующего полипептид CD163, или его комплемента в указанном образце,

где повышенное количество полинуклеотида, кодирующего полипептид CD163, относительно контрольного образца, полученного от свиньи, которая известна тем, что резистентна к инфицированию указанным вирусом, свидетельствует о предрасположенности тестируемой свиньи к инфицированию указанным вирусом.

В одном воплощении вирус выбран из группы, состоящей из Arteriviridae. B предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV. В другом воплощении указанный вирус представляет собой вирус артериита лошадей (EAV). В еще одном воплощении указанный вирус представляет собой вирус африканской лихорадки свиней (ASFV).

В одном воплощении определение осуществляют посредством гибридизации. В другом воплощении определение осуществляют посредством ПЦР.

Изобретение также охватывает способ измерения предрасположенности свиньи к инфицированию вирусом, выбранным из группы, состоящей из Arteriviridae и Asfarviridae, включающий:

(а) получение образца, содержащего полипептиды из тестируемой свиньи;

(б) определение количества полипептида CD163 в указанном образце,

где повышенное количество полипептида CD163 относительно контрольного образца, полученного от свиньи, которая известна тем, что резистентна к инфицированию указанным вирусом, свидетельствует о предрасположенности тестируемой свиньи к инфицированию указанным вирусом.

В одном воплощении вирус выбран из группы, состоящей из Arteriviridae. B предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV. В другом воплощении указанный вирус представляет собой вирус артериита лошадей (EAV). В еще одном воплощении указанный вирус представляет собой вирус африканской лихорадки свиней (ASFV).

В одном воплощении определение осуществляют посредством приведения полипептида CD163 в контакт с антителом, специфическим в отношении полипептида CD163, в условиях, при которых данное антитело связывается с полипептидом CD163.

Изобретение также охватывает выделенный полипептид, где полипептид выбран из группы, состоящей из полипептидов, описанных ниже.

Таким образом, изобретение также включает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с SEQ ID NO: 2.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 2 не более чем на 20 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 2 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов включает SEQ ID NO: 2.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 14.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 14 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 14 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов включает SEQ ID NO: 14.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 24 не более чем на 2 консервативные аминокислотные замены.

Один из таких полипептидов включает SEQ ID NO: 24.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 27.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 27 не более чем на 20 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 27 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 27.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 32.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 32 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 32 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 32.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 34.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 34 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 34 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 34.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 36.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 36 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 36 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 36.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 38.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 38 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 38 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 40.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 40.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 40 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 40 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 40.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 42.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 42 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 42 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 42.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 44.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 44 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 44 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 44.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 46.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 46 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 46 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, содержащий SEQ ID NO: 46.

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 48.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 48 не более чем на 15 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полипептидов представляет собой полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 48 не более чем на 10 консервативных аминокислотных замен.

Один из таких полинуклеотидов охватывает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий SEQ ID NO: 48.

Изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид CD163, где указанный полинуклеотид выбран из группы, состоящей из полинуклеотидов, перечисленных ниже.

Таким образом, изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или 5,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 2,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 2,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12 или 13,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 14,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 14,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22 или 23,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 24,

(в) полинуклеотид, комплементарный любому из (а) или (б).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25 или 26,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 27,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 27,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30 или 31,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 32,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 32,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 33,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 34,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 34,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 35,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 36,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 36,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 37,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 38,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 38,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 39,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 40,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 40,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 41,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 42,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 42,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 44,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 44,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 45,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 46,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 46,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 47,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 48,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 49,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Таким образом, изобретение также включает полипептид CD163, в котором трансмембранный участок делетирован.

Таким образом, изобретение также охватывает полинуклеотид, кодирующий полипептид CD163, в котором трансмембранный участок делетирован.

Помимо вышеизложенного, изобретение охватывает в качестве дополнительного аспекта все воплощения изобретения, ограниченные тем или иным образом по объему изобретения по сравнению с вариациями, конкретно упомянутыми выше.

Общие определения

Клетки и клеточные линии могут быть "пермиссивными" или "непермиссивными" в отношении вируса. Например, клетка или клеточная линия, которая является пермиссивной в отношении вируса, способна инфицироваться вирусом с последующей репликацией и продукцией вируса. Клетка или клеточная линия, которая является непермиссивной в отношении вируса, не способна инфицироваться вирусом с последующей репликацией и продукцией вируса. Клеточную линию, которая в некоторой степени уже является пермиссивной, можно сделать еще более пермиссивной с помощью способов по изобретению.

Arteriviridae относится к семейству оболочечных вирусов с плюс-цепью РНК, принадлежащих к другим Nidovirales. Данное семейство включает в себя вирус, увеличивающий уровень лактатдегидрогеназы (LDV) мышей, вирус артериита лошадей (EAV), вирус гемморрагической лихорадки обезьян (SHFV) и PRRSV.

Asfarviridae представляет собой семейство икосаэдрических оболочечных вирусов, геномы которых состоят из одной молекулы линейной двухцепочечной ДНК длиной приблизительно 150000-190000 нуклеотидов. Название семейства происходит от вируса африканской лихорадки свиней и родственных вирусов. Вирус африканской лихорадки свиней (ASFV) представляет собой типичный вид рода Asfivirus и является единственным представителем этого семейства.

Термин "PRRSV" или вирус PRRS относится к европейским и североамериканским генотипам вируса PRRS. В пределах каждого генотипа изоляты, как правило, имеют 85% нуклеотидной идентичности или больше. Однако между генотипами уровень идентичности последовательностей составляет лишь приблизительно 60%.

Вирус PRRS является представителем семейства Arteriviridae. Геном артеривирусов представляет собой одноцепочечную РНК, имеющую положительную полярность и длину от 12 до 16 т.п.о., кэпированную на 5'-конце и полиаденилированную на 3'-конце. Свыше двух третей генома находится в открытых рамках считывания (ORF) 1a и 1b, кодирующих неструктурные функции вируса. ORF1b представляет собой продолжение ORF1a и является результатом рибосомального сдвига рамки считывания. ORF 1a и 1b транслируются непосредственно с геномной РНК. Эти крупные полипептидные продукты расщепляются вирусными протеазами с получением 12 или 13 дискретных меньших пептидов. Оставшиеся ORF, кодирующие вирусные структурные белки, экспрессируются из ряда 3'-котерминальных субгеномных РНК (sgRNA). SgRNA продуцируются посредством прерывистой транскрипции минус-цепи РНК таким образом, что общая 5'-лидерная последовательность становится слитой с каждым из транскриптов. Основные структурные белки представляют собой нуклеокапсид (N, кодируемый ORF7), матриксный белок (M, кодируемый ORF6) и основной гликопротеин оболочки (GP5, кодируемый ORF5). Оставшиеся белки GP4 (ORF4), GP3 (ORF3), GP2 (ORF2a) и E (ORF26) представляют собой минорные структурные компоненты вириона, функции которых до сих пор еще не выяснены. Молекулярная биология PRRSV является предметом недавних обзорных статей (Dea et al., 2000; Meulenberg, 2000; Snijder and Meulenberg, 2001).

Используемый в данном описании термин "полипептид CD163" означает белок, кодируемый геном CD163 млекопитающего, включая аллельные варианты, содержащие консервативные или неконсервативные изменения. Было сообщено о последовательности кДНК, кодирующей полипептид CD163 свиньи (Genbank, кат. № AJ311716). Также было сообщено о полипептиде CD163 мыши (Genbank, кат. № AF274883), а также о многочисленных человеческих вариантах этого полипептида, примеры которых представлены в Genbank под номерами ААН51281 и САА80543. Авторы изобретения в данном описании сообщают о полинуклеотидах, которые кодируют полипептиды CD163 свиньи, человека, мыши, собаки и африканской зеленой мартышки и которые содержат последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 42, 43, 45 и 47. "Полипептид CD163" является представителем семейства скавенжер цистеин-богатых рецепторов (SRCR) трансмембранных гликопротеинов, и полагают, что он экспрессируется исключительно на моноцитах и макрофагах. Одна из идентифицированных ролей CD163 заключается в ингибировании окислительного тканевого повреждения после гемолиза посредством поглощения комплексов гемоглобин:гаптоглобин в результате эндоцитоза. Последующее высвобождение интерлейкина-10 и синтез гемоксигеназы-1 приводит в результате к противовоспалительным и цитопротективным эффектам (Philippidis et al., 2004; Graversen et al., 2002). Ген CD163 человека охватывает 35 т.п.о. на хромосоме 12 и состоит из 17 экзонов и 16 интронов. Известно, что множество изоформ полипептида CD163, включая мембраносвязанный, цитоплазматический и секретируемый типы, образуются в результате альтернативного сплайсинга (Ritter et al., 1999). Особенно предпочтительными являются изоформы, содержащие трансмембранный домен.

Трансмембранный домен характеризуется полипептидным сегментом более крупной последовательности, которая экпонируется на обеих сторонах мембраны. Цитоплазматический и внеклеточный домены разделены по меньшей мере одним сегментом, заполняющим мембрану, который пересекает гидрофобное окружение липидного бислоя. Сегмент, заполняющий мембрану, состоит из аминокислотных остатков с неполярными боковыми цепями, обычно в форме альфа-спирали. Сегменты, которые содержат приблизительно 20-30 гидрофобных остатков, имеют достаточную длину для того, чтобы заполнить мембрану в виде альфа-спирали, и они часто могут быть идентифицированы с помощью кривой гидрофобности. Предсказанный трансмембранный домен SEQ ID NO: 2 и 14 указан в описании жирным шрифтом. Чтобы определить, содержат ли другие последовательности CD163, похожий элемент последовательности легко определить путем просмотра последовательности или кривых гидрофобности. SEQ ID NO: 37-40 представляют собой типичные варианты белков CD163, которые не содержат трансмембранный домен и кодирующие его нуклеиновые кислоты.

Используемый далее термин "полинуклеотид", как правило, относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. "Полинуклеотиды" включают без ограничения одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, представляющую собой смесь одно- и двухцепочечных участков, одно- и двухцепочечную РНК, РНК, представляющую собой смесь одно- и двухцепочечных участков, и гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, что более типично, двухцепочечными, или смесь одно- и двухцепочечных участков. Кроме того, "полинуклеотид" относится к трехцепочечным участкам, содержащим РНК или ДНК или и РНК, и ДНК. Термин "полинуклеотид" также включает ДНК или РНК, содержащие одно или более чем одно модифицированное основание, и ДНК или РНК с цепями, модифицированными для стабильности или по другим причинам. "Модифицированные" основания включают, например, тритированные основания и необычные основания, такие как инозин. В отношении ДНК и РНК может быть произведено множество модификаций; таким образом, "полинуклеотид" охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, обычно обнаруживаемых в природе, а также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток.

"Полинуклеотид" также охватывает относительно короткие полинуклеотиды, часто называемые олигонуклеотидами.

Используемый далее термин "полипептид" относится к любому пептиду или белку, содержащему аминокислоты, связанные друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями. "Полипептид" относится к коротким цепям, которые обычно называют пептидами, олигопептидами или олигомерами, и к более длинным цепям, которые обычно называют белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличающиеся от 20 аминокислот, кодируемых генами. "Полипептиды" включают аминокислотные последовательности, модифицированные либо естественным путем, таким как посттрансляционный процессинг, либо поредством способов химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Такие модификации хорошо описаны в основных учебниках и более подробных монографиях, а также в обширной научно-технической литературе. В полипептиде могут возникать модиификации, включающие пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксильные концы. Понятно, что тот же тип модификации в той же или иной степени может быть представлен в нескольких сайтах данного полипептида. Кроме того, данный полипептид может содержать множество типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными, как результат убиквитинирования, и они могут быть циклическими с разветвлением или без разветвления. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут появляться в результате посттрансляционных природных процессов или могут быть получены синтетическими способами. Модификации или модифицированные формы включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемсодержащей группировки, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI (гликозилированного фосфатидилинозитного) якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рецемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование, и убиквитинирование (смотри, например, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Postranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann N.Y. Acad Sci (1992) 663:4842).

Используемый далее термин "выделенный" означает изменение человеком из природного состояния. Если в природе появляется "выделенная" композиция или вещество, оно было изменено или удалено из исходного окружения или и то и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в живом животном, не является "выделенным", но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих вместе с ним в естественном состоянии веществ, является "выделенным" в том смысле, в котором этот термин используется в данном описании. Таким образом, термин "выделенный", используемый в данном описании и понятный в данной области, когда относится к "выделенным" полинуклеотидам или полипептидам, означает выделение из исходного клеточного окружения, в котором в норме обнаруживается данный полипептид или нуклеиновая кислота. Таким образом, как использовано в данном описании, только в виде примера, в трансгенном животном или рекомбинантной клеточной линии, сконструированной с полинуклеотидом по изобретению, используют "выделенную" нуклеиновую кислоту. Специально исключены из определения выделенных полинуклеотидов по изобретению целые хромосомы, выделенные из нативных клеток-хозяев, из которых первоначально был получен данный полинуклеотид.

В описании, которое следует ниже, авторы изобретения часто используют термин "идентичность" или сходство, применяемые в отношении аминокислотных последовательностей полипептидов. Процент "идентичности" аминокислотной последовательности в отношении полипептидов определен в данном описании как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам в последовательностях-мишенях после выравнивания обеих последовательностей и введения брешей (gaps), если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Процентную идентичность последовательностей определяют стандартными способами. Например, BLASTP 2.2.6 [Tatusova T.A. and T.L. Madden, "BLAST 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences." (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250].

Кратко, как указано выше, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации оценки выравнивания с использованием штрафа за внесение бреши 10 (gap opening penalty), штрафа за длину бреши 0,1 (gap extension penalty) и оценочной матрицы "blosum 62" от Henikoff and Henikoff (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. 1992).

Процентную идентичность затем рассчитывают следующим образом:

Процентное "сходство" последовательностей (часто называемое "гомологией") в отношении полипептида по изобретению определено в данном описании как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам в последовательностях-мишенях после выравнивания последовательностей и введения брешей, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности (как описано выше), и также рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности.

Аминокислоты могут быть классифицированы в соответствии с физическими свойствами и вкладом во вторичную и третичную структуру белка. Консервативная замена рассматривается в данной области как замена одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую похожими свойствами.

Примеры консервативных замен представлены в табл. 1, 2 и 3 ниже.

Таблица 1

Альтернативно, консервативные аминокислоты могут быть сгруппированы, как описано в Lehninger [Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), p.71-77] и приведено в табл. 2 ниже.

Таблица 2

В качестве еще одной альтернативы в табл. 3 ниже представлены примеры консервативных замен.

Таблица 3

Способы, направленные на продукцию вируса и клеток-хозяев согласно изобретению

В изобретении предложен способ модификации продукции вируса, являющегося представителем семейства Arteriviridae и Asfarviridae, в клетке, включающий стадию направления указанной клетки в сторону экспрессии полипептида CD163. Этот способ может включать превращение клетки, непермиссивной в отношении вируса, в клетку, пермиссивную в отношении вируса, или может включать превращение клетки в более пермиссивную в отношении вируса.

В одном воплощении вирус, являющийся представителем семейства Arteriviridae или Asfarviridae, выбран из группы, состоящей из LDV мыши, вируса артериита лошадей (EAV), вируса геморрагической лихорадки обезьян (SHFV), PRRSV свиней и ASFV свиней.

В предпочтительном воплощении вирус представляет собой PPRSV.

В изобретении дополнительно предложен способ получения культуры вируса, являющегося представителем семейства Arteriviridae или Asfarviridae, включающий стадии получения клеточной линии; направления указанной клеточной линии в сторону экспрессии полипептида CD163; инфицирования указанной клеточной линии вирусом и стимулирования указанной клеточной линии к продукции вирусного потомства.

В одном воплощении вирус, являющийся представителем семейства Arteriviridae, выбран из группы, состоящей из LDV мышей, вируса артериита лошадей (EAV), вируса геморрагической лихорадки обезьян (SHFV), PRRSV свиней и ASFV свиней.

В предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV.

Во всех вышеприведенных способах используют клетки и клеточные линии, экспрессирующие полипептид CD163. CD163 может быть облегчена или усилена способами, которые вовлекают введение в клетку экзогенной нуклеиновой кислоты. Такая клетка может включать полинуклеотид или вектор таким образом, который облегчает экспрессию кодируемого полипептида CD163.

Полинуклеотиды, которые кодируют CD163, могут быть введены в клетку-хозяина в виде части кольцевой плазмиды или в виде линейной ДНК, содержащей выделенную белок-кодирующую область, или в вирусном векторе. Способы введения экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, хорошо известные и рутинно используемые на практике в данной области, включают трансформацию, трансфекцию, электропорацию, инъекцию в ядро или слияние с носителями, такими как липосомы, мицеллы, тени клетки и протопласты. Системы клеток-хозяев согласно изобретению включают системы клеток беспозвоночных и позвоночных животных. Хозяева могут включать в себя следующее: клетки насекомых, клетки почки свиньи (PK), клетки почки кошки (FK), тестикулярные клетки свиньи (ST), клетки почки зеленой африканской мартышки (клетки МА-104, MARC-145, VERO и COS), клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки почки детенышей хомячков, клетки 293 человека и фибробласты 3Т3 мыши, но не ограничиваться ими. Системы культуры клеток-хозяев насекомых также могут быть использованы для экспрессии полипептидов CD163. В другом воплощении полипептиды CD163 экспрессируют с использованием системы экспрессии на основе дрозофилы.

Выбор подходящего экспрессирующего вектора для экспрессии полипептидов CD163 безусловно будет зависеть от конкретной используемой клетки-хозяина и находится в пределах знаний специалиста в данной области. Примеры подходящих экспрессирующих векторов включают pSport и pcDNA3 (Invitrogen), pCMV-Script (Stratagene) и pSVL (Pharmacia Biotech). Экспрессирующие векторы для применения в клетках-хозяевах млекопитающих могут включать в себя последовательности контроля транскрипции и трансляции, происходящие из вирусных геномов. Обычно используемые последовательности промоторов и модифицирующие последовательности, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают последовательности, происходящие из цитомегаловируса человека (CMV), вируса саркомы Рауса (RSV), аденовируса 2, вируса полиомы и обезьяньего вируса (SV40), но не ограничиваются ими. Способы конструирования экспрессирующих векторов млекопитающих раскрыты, например, в Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)); Cosman et al. (Mol. Immunol. 25:935 (1986)); Cosman et al. (Nature 312:168 (1984)); EP-A-0367566 и WO 91/18982.

Так как известно, что последовательности CD163 существуют в клетках различных видов, эндогенный ген может быть модифицирован таким образом, чтобы обеспечить или увеличить экспрессию полипептида CD163. Клетки могут быть модифицированы (например, посредством гомологичной рекомбинации) с целью обеспечения повышенной экспрессии путем замены целиком или частично природного промотора CD163 целым гетерологичным промотором или его частью таким образом, что клетки экспрессируют полипептид CD163 на более высоких уровнях. Гетерологичный промотор встраивают таким образом, чтобы он был функциональным образом связан с эндогенными последовательностями, кодирующими CD163 [смотри, например, международную заявку PCT № WO 94/12650, международную заявку PCT № WO 92/20808 и международную заявку PCT № WO 91/09955]. Также считают, что в дополнение к гетерологичной промоторной ДНК, амплифицируемая маркерная ДНК (например, ada, dhfr и мультифункциональный ген cad, кодирующий карбамилфосфатсинтазу, аспартаттранскарбамилазу и дигидрооротазу) и/или интронная ДНК могут быть встроены вместе с гетерологичной промоторной ДНК. Если маркерная ДНК связана с последовательностью, кодирующей CD163, то амплификация маркерной ДНК стандартными способами селекции приводит в результате к коамплификации в клетках последовательностей, кодирующих CD163.

Экспрессия CD163 также может быть индуцирована посредством химической обработки. Форболовые эфиры, особенно форболмиристилацетат (PMA), активируют один или более изоферментов повсеместного мембранного рецептора, представляющего собой протеинкиназу С (PKC), и представляют собой особенно предпочтительные способы повышения экспрессии CD163. Также вовлечены другие способы мобилизации внутриклеточного кальция.

Производство вакцины.

Описанные выше способы могут быть использованы для продукции любого вируса, являющегося представителем семейства Arteriviridae или Asfarviridae, для цели производства вакцины или диагностики.

В одном воплощении вирус, являющийся представителем семейства Arteriviridae, выбран из группы, состоящей из LDV мыши, вируса артериита лошадей (EAV), вируса гемморрагической лихорадки обезьян (SHFV) и PRRSV свиней.

В предпочтительном воплощении вирус представляет собой PRRSV.

Приготовление вакцины.

Описанные выше способы могут быть использованы для продукции вируса для цели приготовления вакцины или диагностики.

Могут быть приготовлены убитая (инактивированная) или живая вакцины. Поэтому, чтобы приготовить живую вакцину, вирусный изолят или его аттенуированный или мутантный вариант выращивают в культуре клеток. Вирус собирают согласно способам, хорошо известным в данной области. Затем вирус можно сконцентрировать, заморозить и хранить при -70 °C или лиофилизировать и хранить при 4 °C. Перед вакцинацией вирус смешивают в соответствующей дозе (которая составляет от приблизительно 10 ³ до 10 ⁸ тканево-культуральных инфекционных доз на мл (ТКИД ₅₀ /мл)) с фармацевтически приемлемым носителем, таким как физиологический раствор и возможно адъювант.

Приготовленная вакцина также может включать инактивированную или убитую вакцину, содержащую вирус, выращенный согласно способам по изобретению. Инактивированную вакцину получают способами, хорошо известными в данной области. Например, как только вирус размножится до высоких титров, специалисту в данной области будет понятно, что вирусная антигенная масса может быть получена способами, хорошо известными в данной области. Например, вирусная антигенная масса может быть получена путем разведения, концентрирования или экстракции. Все эти способы используются для получения соответствующей вирусной антигенной массы для приготовления вакцин. Затем вирус инактивируют посредством обработки формалином, бета-проприолактоном (BPL), двойным этиленимином (BEI) или другими способами, известными специалистам в данной области. Инактивированный вирус затем смешивают с фармацевтически приемлемым носителем, таким как физиологический раствор, и возможно адъювантом. Примеры адъювантов включают гидроксид алюминия, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, AMPHIGEN, сапонины, такие как QuilA, и полипептидные адъюванты, включающие интерлейкины, интерфероны и другие цитокины, но не ограничиваются ими.

Инактивацию с помощью формалина осуществляют путем смешивания вирусной суспензии с 37%-ным формальдегидом до конечной концентрации формальдегида 0,05%. Вирус-формальдегидную смесь готовят путем непрерывного перемешивания в течение приблизительно 24 ч при комнатной температуре. Инактивированную вирусную смесь затем тестируют на наличие оставшегося живого вируса путем измерения роста на соответствующей клеточной линии.

Инактивацию с помощью BEI осуществляют путем смешивания вирусной суспензии согласно настоящему изобретению с 0,1 M BEI (2-бромэтиламином в 0,175 н NaOH) до конечной концентрации BEI 1 мМ. Смесь вирус-BEI приготавливают путем непрерывного перемешивания в течение приблизительно 48 ч при комнатной температуре с последующим добавлением 1,0 M тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Перемешивание продолжают в течение еще двух часов. Инактивированную вирусную смесь тестируют на наличие оставшегося живого вируса путем измерения роста на соответствующей клеточной линии.

Клетки, пермиссивные в отношении вируса, которые были направлены на экспрессию CD163, также могут быть использованы для количественной оценки живого вируса. Два стандартных способа, которые хорошо известны специалистам в данной области, представляют собой анализ бляшек и анализ с ограничивающим разведением.

CD163-экспрессирующие клеточные линии согласно настоящему изобретению могут быть использованы для роста вируса для цели получения вирусного антигена для диагностических наборов. Например, лизаты от инфицированных клеток (с возможной очисткой вирусных частиц или экстракцией выделенных вирусных белков) могут быть нанесены на планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) с целью детекции и количественной оценки антител к вирусу в сыворотках свиной крови.

Рост живого или инактивированного вируса в клетках, экспрессирующих CD163, может быть использован после возможного разделения вирусных белков для иммунизации животных с целью получения поликлональных, моноспецифических или моноклональных антител. В свою очередь, они могут быть использованы в качестве основы для диагностических анализов для детекции и количественной оценки вируса в сыворотке свиней и других биологических образцах.

Анализы согласно изобретению

В изобретении предложены способы определения предрасположенности животного к инфицированию вирусом, являющимся представителем семейства Arteriviridae или Asfarviridae, или клеточной линии для поддержания репликации вируса, являющегося представителем семейства Arteriviridae или Asfarviridae. Образцы получают из любого источника и анализируют на экспрессию CD163. Уровень экспрессии гена CD163 можно сравнить с уровнями контролей, которые известны тем, что не поддерживают репликацию вируса.

В случае животного, образцы могут представлять собой любой образец, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты или белки из образца и полученный из ткани организма, экспрессирующей CD163, включая альвеолярные макрофаги, культивируемые клетки, биопсии или другие тканевые препараты, но не ограничиваясь ими. Уровень экспрессии можно оценить при уровне продуцируемой информационной РНК или белка или при обоих уровнях. В предпочтительном воплощении вирус, являющийся представителем семейства Arteriviridae или Asfarvirida, выбран из группы, состоящей из LDV мышей, вируса артериита лошадей (EAV), вируса геморрагической лихорадки обезьян (SHFV), PRRSV свиней и ASFV свиней.

Анализы на основе нуклеиновых кислот.

Способы определения уровней CD163 могут быть основаны на нуклеиновых кислотах, как указано выше. Нуклеиновые кислоты, происходящие из CD163, могут находиться в растворе или на твердом носителе. В некоторых воплощениях они могут быть использованы в качестве элементов матрицы в самих микроматрицах или в комбинации с другими молекулами элемента матрицы. В способах, основанных на нуклеиновых кислотах, как правило, требуется выделение ДНК или РНК из образца и последующая гибридизация или амплификация посредством ПЦР с использованием специфических праймеров, происходящих из любых известных в данной области CD163-кодирующих последовательностей или последовательностей, конкретно раскрытых в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47. ДНК или РНК может быть выделена из образца согласно любому из множества способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, способы очистки нуклеиновых кислот описаны в Tijssen, P. (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, New York, N.Y. В одном из предпочтительных воплощений общую РНК выделяют, используя для выделения общей РНК реагент TRIZOL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg Md.), а мРНК выделяют, используя колоночную хроматографию с олиго d(T) или стеклянные шарики. При амплификации молекул нуклеиновой кислоты образца желательно амплифицировать молекулы нуклеиновой кислоты образца и поддерживать относительные концентрации в исходном образце, включая транскрипты с низкой концентрацией. РНК может быть амплифицирована in vitro, in situ или in vivo (смотри Eberwine, патент США № 5514545).

Также полезно включать контроли в образец для гарантии того, что процедуры амплификации и мечения не изменяют действительного распределения молекул нуклеиновых кислот в образце. Для этой цели в образец вводят некоторое количество контрольной молекулы нуклеиновой кислоты, для которой известно, что она будет обнаруживаться при гибридизации с ее комплементарной упорядоченной молекулой нуклеиновой кислоты, и композиция молекул нуклеиновой кислоты включает референсные молекулы нуклеиновой кислоты, которые специфически гибридизуются с контрольными упорядоченными молекулами нуклеиновых кислот. После гибридизации и процессинга полученные сигналы о гибридизации должны точно отражать количества контрольных упорядоченных молекул нуклеиновых кислот, добавленных к образцу.

Перед гибридизацией может быть желательна фрагментация молекул нуклеиновой кислоты образца. Фрагментация улучшает гибридизацию благодаря минимизации вторичной структуры и перекрестной гибридизации с другими молекулами нуклеиновых кислот образца или некомплементарными молекулами нуклеиновых кислот. Фрагментацию можно осуществлять с помощью механических или химических способов.

Мечение.

Молекулы или пробы нуклеиновых кислот образца могут быть мечены одной или более чем одной группировкой для мечения, чтобы обеспечить возможность детекции комплексов молекул гибридизованных упорядоченных/нуклеиновых кислот образца. Группировки для мечения могут включать композиции, которые могут быть обнаружены с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, биоэлектронных, иммунохимических, электрических, оптических или химических средств. Группировки для мечения включают радиоизотопы, такие как (32)Р, (33)Р или (35)S, хемилюминисцентные соединения, меченые связывающие белки, атомы тяжелых металлов, спектроскопические маркеры, такие как флуоресцентные маркеры и красители, магнитные метки, связанные ферменты, метки (tags) для масс-спектрометрии, спиновые метки, электронпереносящие доноры и акцепторы и т.п. Предпочтительные флуоресцентные маркеры включают флуорофоры Су3 и Су5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.).

Гибридизация.

Последовательность молекулы нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47 или другие последовательности, кодирующие CD163, в данной области и их фрагменты могут быть использованы в различных технологиях гибридизации для различных целей. Гибридизационные зонды могут быть разработаны или получены из любой последовательности CD163 млекопитающего, но в них могут быть использованы последовательности, раскрытые в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47. Такие зонды могут быть получены из высокоспецифического участка или из консервативного мотива, и они могут быть использованы в протоколах для количественной оценки сигнала, опосредованного CD163, аллельных вариантов или родственных последовательностей. Гибридизационные зонды согласно изобретению могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть получены из любой последовательности CD163 млекопитающего, известной в данной области, или из последовательностей, раскрытых в данном описании как SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, или из геномных последовательностей, включающих промоторы, энхансеры и интроны гена млекопитающего. Гибридизационные или ПЦР зонды могут быть получены с использованием олигомечения, ник-трансляции, концевого мечения или ПЦР-амплификации в присутствии меченого нуклеотида. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, может быть использован для получения зонда мРНК in vitro путем добавления РНК-полимеразы и меченых молекул нуклеиновой кислоты. Эти методики могут быть осуществлены с использованием имеющихся в продаже наборов, таких как наборы, поставляемые Amersham Pharmacia Biotech.

Жесткость условий гибридизации определяют по содержанию G+C в зонде, концентрации соли и температуре. В частности, жесткость условий может быть увеличена путем уменьшения концентрации соли или увеличения температуры гибридизации. В растворах, используемых для некоторых гибридизаций на основе мембран, добавление органического растворителя, такого как формамид, позволяет реакции протекать при более низкой температуре. Гибридизацию можно осуществлять в условиях низкой жесткости с использованием буферов, таких как 5 ×SSC с 1% SDS (додецилсульфат натрия) при 60 °C, что способствует образованию гибридизационного комплекса между нуклеотидными последовательностями, которые содержат некоторые ошибочные спаривания. Последующие промывки проводят при более жестких условиях с использованием буферов, таких как 0,2 ×SSC с 0,1% SDS, либо при 45 °С (средняя жесткость), либо при 68 °С (высокая жесткость). При условиях высокой жесткости гибридизационные комплексы будут оставаться стабильными только тогда, когда последовательности нуклеиновых кислот являются почти комплементарными. При некоторых гибридизациях на основе мембран предпочтительно 35% или наиболее предпочтительно 50% формамида может быть добавлено к раствору для гибридизации для уменьшения температуры, при которой осуществляют гибридизацию, и фоновые сигналы могут быть уменьшены путем использования других детергентов, таких как Sarkosyl или Triton X-100, и блокирующего агента, такого как ДНК спермы лосося. Выбор компонентов и условий гибридизации хорошо известен специалистам в данной области и рассмотрен в Ausubel (выше) и Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview N.Y.

Примеры очень жестких условий гибридизации следующие: гибридизация при 42 °C в растворе для гибридизации, содержащем 50% формамида, 1% SDS, 1 M NaCl, 10% декстрансульфата, и двойная промывка в течение 30 мин при 60 °C в растворе для промывки, содержащем 0,1 X SSC и 1% SDS. В данной области понятно, что условия эквивалентной жесткости могут быть достигнуты благодаря варьированию температуры и буфера или концентрации соли, как описано в Ausubel et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10. Модификации условий гибридизации могут быть определены эмпирически или точно рассчитаны на основе длины и процентном спаривании гуанозин/цитозиновых оснований (GC) в пробе. Условия гибридизации могут быть рассчитаны, как описано в Sambrook et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51.

Специфичность гибридизации может быть оценена путем сравнения гибридизации молекул нуклеиновой кислоты с контролируемой специфичностью с молекулами нуклеиновой кислоты образца с контролируемой специфичностью, которые добавлены к образцу в известном количестве. Упорядоченные молекулы нуклеиновой кислоты с контролируемой специфичностью могут иметь одно или более ошибочных спариваний по сравнению с соответствующими упорядоченными молекулами нуклеиновой кислоты. Таким образом, можно определить, только ли комплементарные упорядоченные молекулы нуклеиновой кислоты гибридизуются с молекулами нуклеиновой кислоты образца или образуются ли гибридные дуплексы с ошибочным спариванием.

Реакции гибридизации могут осуществляться в абсолютном или дифференциальном формате. В абсолютном формате гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты из одного образца гибридизуют с молекулами в микроматричном формате, и сигналы, обнаруживаемые после образования гибридизационного комплекса, коррелируют с уровнями молекул нуклеиновой кислоты в образце. В дифференциальном формате гибридизации анализируют дифференциальную экспрессию набора генов в двух биологических образцах. Для дифференциальной гибридизации приготавливают молекулы нуклеиновой кислоты из двух биологических образцов и метят различными группировками для мечения. К микроматрице добавляют смесь двух меченых молекул нуклеиновых кислот. Затем микроматрицу исследуют в условиях, при которых излучения двух различных меток могут быть определены индивидуально. Молекулы в микроматрице, которые гибридизуются, по существу, с эквивалентыми количествами молекул нуклеиновых кислот, полученных из обоих биологических образцов, дают определенную комбинированную флуресценцию (Shalon et al.; публикация PCT WO 95/35505). В предпочтительном воплощении метки представляют собой флуоресцентные метки с различимыми спектрами эмиссии, такие как флуорофоры Су3 и Су5.

После гибридизации микроматрицу промывают для удаления непрогибридизовавшихся молекул нуклеиновой кислоты и детектируют образование комплекса между гибридизуемыми элементами матрицы и молекулами нуклеиновой кислоты. Способы детекции образования комплекса хорошо известны специалистам в данной области. В предпочтительном воплощении молекулы нуклеиновой кислоты метят флуоресцентной меткой и измерение уровней и картин флуоресценции, свидетельствующих об образовании комплекса, осуществляют с помощью флуоресцентной микроскопии предпочтительно конфокальной флуоресцентной микроскопии.

В эксперименте по дифференциальной гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты из двух или более различных биологических образцов метят двумя или более различными флуоресцентными метками с различными длинами волн излучения. Флуоресцентные сигналы детектируют раздельно с использованием различных фотоумножителей, настроенных на обнаружение специфических длин волн. Получают относительные концентрации/уровни экспрессии молекул нуклеиновой кислоты в двух или более образцах.

Типично, интенсивности флуоресценции в микроматрице могут быть нормализованы для учета вариаций в интенсивности гибридизаций, когда более чем одну микроматрицу используют в похожих условиях тестирования. В предпочтительном воплощении интенсивности гибридизации комплекса индивидуальной упорядоченной молекулы нуклеиновой кислоты и нуклеиновой кислоты образца нормализуют с использованием интенсивностей, полученных на основе внутренних нормализованных контролей, содержащихся в каждой микроматрице.

Анализы на основе полипептидов.

В настоящем изобретении предложены способы и реагенты для детекции и количественной оценки полипептидов CD163. Эти способы включают в себя аналитические биохимические способы, такие как электрофорез, масс-спектрометрия, хроматографические способы и т.п, или различные иммунологические способы, такие как радиоиммуноанализ (РИА), иммуноферментные анализы (ИФА), иммунофлуоресцентные анализы, вестерн-блоттинг, аффинная масс-спектрометрия, биологическая активность и другие, описанные ниже и очевидные специалистам в данной области при просмотре данного описания.

Иммуноанализы.

В настоящем изобретении также предложены способы детекции полипептидов CD163, в которых используют один или более чем один реагент с антителом к CD163 (т.е. иммуноанализы). Используемый в данном описании иммуноанализ представляет собой анализ, в котором используют антитело (как широко определено в данном описании и конкретно включает фрагменты, химеры и другие связывающие агенты), которое специфически связывается с полипептидом CD163 или эпитопом.

Известно множество общепринятых форматов иммунологических анализов связывания, подходящих для практического применения согласно изобретению (смотри, например, патенты США № № 4366241; 4376110; 4517288 и 4837168). Смотри, например, Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991); Harlow and Lane, выше [например, глава 14], и Ausubel et al., выше [например, глава 11]. Как правило, в иммунологических анализах связывания (или иммуноанализах) используют "захватывающий агент" для специфического связывания и зачастую иммобилизации аналита на твердой фазе. В одном воплощении захватывающий агент представляет собой группировку, которая специфически связывается с полипептидом CD163 или подпоследовательностью, такой как антитело к CD163.

Обычно анализируемый генный продукт CD163 детектируют непосредственно или опосредованно с использованием детектируемой метки. Конкретная метка или детектируемая группа, используемая в анализе, обычно не является критическим аспектом согласно изобретению, поскольку она существенно не мешает специфическому связыванию антитела или антител, используемых в анализе. Метка может быть ковалентно связана с захватывающим агентом (например, антителом к CD163) или может быть присоединена к третьей группировке, такой как другое антитело, которое специфически связывается с полипептидом CD163.

В настоящем изобретении предложены способы и реагенты для конкурентных и неконкурентных иммуноанализов для детекции полипептидов CD163. Неконкурентные иммуноанализы представляют собой анализы, в которых непосредственно измеряют количество захваченного аналита (в этом случае CD163). Один из таких анализов представляет собой двухсайтный, основанный на моноклональных антителах иммуноанализ, в котором используют моноклональные антитела, реактивные в отношении двух неперекрывающихся эпитопов на полипептиде CD163. Информацию о предшествующем уровне техники смотри, например, в Maddox et al., 1983, J. Exp. Med., 158:1211. В одном из "сэндвич"-анализов захватывающий агент (например антитело к CD163) непосредственно связан с твердым субстратом, на котором он иммобилизован. Эти иммобилизованные антитела затем захватывают любой полипептид CD163, присутствующий в тестируемом образце. Иммобилизованный таким образом полипептид CD163 затем может быть мечен, т.е. посредством связывания со вторым антителом к CD163, несущим метку. Альтернативно, второе антитело к CD163 может быть лишено метки, но связано третьим меченым антителом, специфическим к антителам видов, из которых получено второе антитело. Второе антитело альтернативно может быть модифицировано с помощью детектируемой группировки, такой как биотин, с которой специфически может быть связана третья меченая молекула, такая как меченный ферментом стрептавидин.

В конкурентных анализах количество полипептида CD163, присутствующего в образце, измеряют опосредованно путем измерения количества добавленного (экзогенного) полипептида CD163, вытесняемого (или конкурирующего) из захватывающего агента (например, антитела к CD163) полипептидом CD163, присутствующим в образце. Гаптен-ингибирующий анализ представляет собой еще один пример конкурентного анализа. В этом анализе полипептид CD163 иммобилизуют на твердом субстрате. К образцу добавляют известное количество антитела к CD163, и образец затем приводят в контакт с иммобилизованным полипептидом CD163. В этом случае количество антитела к CD163, связанного с иммобилизованным полипептидом CD163, обратно пропорционально количеству полипептида CD163, находящемуся в образце. Количество иммобилизованного антитела может быть обнаружено путем детекции иммобилизованной фракции антитела или фракции антитела, которая остается в растворе. В этом аспекте детекция может быть прямой, при которой метят антитело, или опосредованной, при которой метка связана с молекулой, которая специфически связывается с антителом, как описано выше.

Другие форматы анализов на основе антител.

В изобретении также предложены реагенты и способы детекции и количественной оценки присутствия полипептида CD163 в образце с использованием формата иммуноблоттинга (вестерн-блоттинг). Еще один иммуноанализ представляет собой так называемую "проточную горизонтальную хроматографию". В неконкурентной версии проточной горизонтальной хроматографии образец движется через субстрат, например, под действием капиллярных сил и сталкивается с движущимся меченым антителом, которое связывается с аналитом, образуя конъюгат. Затем конъюгат движется через субстрат и сталкивается со вторым иммобилизованным антителом, которое связывает аналит. Таким образом, иммобилизованный аналит детектируют путем обнаружения меченого антитела. В конкурентной версии проточной горизонтальной хроматографии меченый вариант аналита движется через носитель и конкурирует с немеченым аналитом за связывание с иммобилизованным антителом. Чем больше количество аналита в образце, тем меньше связывание меченым аналитом и, таким образом, слабее сигнал. Смотри, например, May et al., патент США № 5622871 и Rosenstein, патент США № 5591645.

В зависимости от анализа различные компоненты, включая антиген, антитело-мишень или антитело к катепсину S, могут быть связаны с твердой поверхностью или носителем (т.е. субстратом, мембраной или фильтровальной бумагой). В данной области известно множество способов иммобилизации биомолекул на различных твердых поверхностях. Например, твердая поверхность может представлять собой мембрану (например, нитроцеллюлозу), микротитровальную чашку (например ПВХ (поливинилхлоридную), полипропиленовую или полистироловую), тест-пробирку (стеклянную или пластиковую), щуп (например, стеклянный, ПВХ, полипропиленовый, полистироловый, латексный и т.п.), микроцентрифужную пробирку или стеклянные или пластиковые шарики. Желаемый компонент может быть ковалентно связан или нековалентно присоединен через неспецифическое связывание.

Широкий спектр органических и неорганических природных и синтетических полимеров может быть использован в качестве материала для твердой поверхности. Иллюстративные полимеры включают полиэтилен, полипропилен, поли(4-метилбутен), полистирол, полиметакрилат, поли(этилентерефталат), вискозу, нейлон, поли(винилбутират), поливинилидендифторид (PVDF), силиконы, полиформальдегид, целлюлозу, ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу и т.п. Другие материалы, которые могут быть использованы, включают бумагу, стекла, керамику, металлы, металлоиды, полупроводниковые материалы, цементы или т.п. Кроме того, могут быть использованы вещества, которые образуют гели, такие как белки (например, желатины), липополисахариды, силикаты, агароза и полиакриламиды. Также подходят полимеры, образующие несколько водных фаз, такие как декстраны, полиалкиленгликоли или поверхностно-активные вещества, такие как фосфолипиды, длинноцепочечные (12-24 атомов углерода) соли алкиламмония и т.п. Когда твердая поверхность является пористой, тогда могут быть использованы различные размеры пор в зависимости от природы системы.

Масс-спектрометрия.

Масса молекулы часто может быть использована в качестве идентификатора этой молекулы. Таким образом, способы масс-спектрометрии могут быть использованы для идентификации белкового аналита. Масс-спектрометры могут измерять массу путем определения времени, которое требуется для того, чтобы ионизированный аналит прошел через пролетную трубку и был обнаружен детектором ионов. Один из способов масс-спектрометрии белков представляет собой масс-спектрометрию с лазерной десорбцией/ионизацией в присутствии матрицы ("MALDI"). В MALDI аналит смешивают с материалом матрицы, поглощающим энергию, который поглощает энергию длин волн лазера, и помещают на поверхность зонда. При воздействии на матрицу лазером аналит десорбируется с поверхности зонда, ионизируется и обнаруживается детектором ионов. Смотри, например, Hillenkamp et al., патент США № 5118937.

Другие способы масс-спектрометрии белков описаны в Hutchens and Yip, патент США № 5719060. В одном из таких способов, известном как "Поверхности, усиленные для аффинного захвата" ("SEAC" от англ. Surfaces Enhanced for Affinity Capture), для отделения аналита от других материалов в образце используют твердофазный аффинный реагент, который специфически или не специфически связывается с аналитом, такой как антитело или ион металла. Затем захваченный аналит десорбируют с твердой фазы при помощи, например, лазерной энергии, ионизируют и обнаруживают при помощи детектора.

Нуклеиновые кислоты по изобретению

Примеры раскрывают обнаруженные авторами изобретения несколько новых полинуклеотидов CD163. Изобретение включает эти новые полинуклеотиды CD163. В настоящем изобретении предложено несколько выделенных новых полинуклеотидов (например, последовательности ДНК и транскрипты РНК, как смысловые, так и комплементарные антисмысловые цепи, одно и двухцепочечные, включая их сплайс-варианты), которые кодируют новые полипептиды CD163. Авторы изобретения сообщают в данном описании о выделенных новых полинуклеотидах, которые кодируют полипептиды CD163 свиньи, мыши, человека, собаки и африканской зеленой мартышки и которые содержат последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47.

Следует признать, что описание SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47 предоставляет специалисту в данной области множество способов получения этих последовательностей. В качестве примера можно было бы получить зонды из последовательностей, раскрытых в SEQ ID NO: 1, 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47, и скринировать кДНК или геномные библиотеки свиньи, мыши, человека, собаки и африканской зеленой мартышки и тем самым получить полноразмерную SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47 или ее геномный эквивалент. Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989). Также в качестве примера специалист в данной области может немедленно распознать, что используя последовательность, раскрытую в SEQ ID NO: 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47, можно получить соответствующие праймеры для ПЦР-амплификации для получения полноразмерной последовательности, представленной этими последовательностями (смотри, например, PCR Technology, H.A. Erlich, ed., Stockton Press, New York, 1989; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M.A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky and Thomas J. White, eds., Academic Press, Inc., New York, 1990).

ДНК полинуклеотиды по изобретению включают кДНК и ДНК, которые были химически синтезированы полностью или частично, а также предполагается, что они включают их аллельные варианты. Аллельные варианты представляют собой модифицированные формы генетической последовательности дикого типа, модификация является результатом рекомбинации во время сегрегации хромосом или воздействия условий, которые приводят к генетической мутации. Аллельные варианты, подобные генам дикого типа, представляют собой последовательности, встречающиеся в природе (в противоположность не встречающимся в природе вариантам, которые возникают в результате манипуляции in vitro).

Последовательности ДНК, кодирующие новые полипептиды CD163, представлены в SEQ ID NO: 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47.

Специалисту в данной области очевидно, что ДНК по изобретению включает двухцепочечную молекулу, например молекулу, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47, вместе с комплементарной молекулой ("некодирующая цепь" или "комплемент"), имеющей последовательность, которая может быть выведена из последовательности SEQ ID NO: 5, 12, 13, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47 в соответствии с правилами спаривания оснований ДНК по Уотсону-Крику. Также в изобретении рассмотрены другие полинуклеотиды, кодирующие полипептиды CD163 свиньи, мыши и африканской зеленой мартышки, приведенные SEQ ID NO: 2, 14, 24, 27 и 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, последовательности которых отличаются от полинуклеотида SEQ ID NO: 1, 3, 5, 12, 13, 17, 18, 22, 23, 25, 26, 30, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 и 47 благодаря общеизвестной вырожденности генетического кода, как хорошо известно в данной области. Таким образом, настоящее изобретение охватывает другие молекулы ДНК и РНК, которые при экспрессии кодируют полипептиды SEQ ID NO: 2, 14, 24, 27 и 32. Имея идентифицированную аминокислотную последовательность, кодирующую полипептид CD163 свиньи, и зная все триплетные кодоны для каждого конкретного аминокислотного остатка, можно описать все такие последовательности, кодирующие РНК и ДНК. Таким образом, молекулы ДНК и РНК, отличающиеся от молекул ДНК и РНК, конкретно раскрытых в данном описании, характеризующиеся просто изменением кодона для конкретной аминокислоты, также находятся в рамках настоящего изобретения.

Таблица аминокислот и их типичных аббревиатур, символов и кодонов представлена ниже.

Таблица 4

Как общеизвестно в данной области, кодоны составляют триплетные последовательности нуклеотидов в мРНК и их соответствующих молекулах кДНК. Кодоны характеризуются основанием урацилом (U), когда присутствуют в молекуле мРНК, но характеризуются основанием тимидином (T), когда присутствуют в ДНК. Простая замена в кодоне для одного и того же аминокислотного остатка в полинуклеотиде не приведет к изменению последовательности или структуры кодируемого полипептида. Очевидно, что когда фраза гласит, что конкретная 3-нуклеотидная последовательность "кодируют(ет)" какую-либо конкретную аминокислоту, специалисту понятно, что вышеприведенная таблица является средством идентификации конкретных нуклеотидов. В качестве примера, если конкретная трехнуклеотидная последовательность кодирует треонин, то из вышеприведенной таблицы видно, что возможные триплетные последовательности представляют собой АСА, ACG, ACC и ACU (ACT, если в ДНК).

Таким образом, изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность susCD163v1, приведенную в SEQ ID NO: 1 и 5,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 2,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 2,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность susCD163v2, приведенную в SEQ ID NO: 12 или 13,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 14,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 14,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность CD63v2 мыши, приведенную в SEQ ID NO: 22 или 23,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 24,

(в) полинуклеотид, комплементарный любому из (а) или (б).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность CD163v3 мыши, приведенную в SEQ ID NO: 25 или 26,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 27,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 27,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность CD163v2 африканской зеленой мартышки, приведенную в SEQ ID NO: 30 или 31,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 32,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 32,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 33,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 34,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 34,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 35,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 36,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 36,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 37,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 38,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 38,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 39,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 40,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 40,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 41,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 42,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 42,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 43,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 44,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 44,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 45,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 46,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 46,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Изобретение также включает выделенный полинуклеотид, содержащий:

(а) полинуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 47,

(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 48,

(в) полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 49,

(г) полинуклеотид, комплементарный любому из (а), (б) или (в).

Информация о полинуклеотидной последовательности, предложенная в изобретении, дает возможность для крупномасштабной экспрессии кодируемого полипептида с использованием способов, хорошо известных и рутинно используемых в данной области. Полинуклеотиды по изобретению также позволяют идентифицировать и выделять полинуклеотиды, кодирующие родственные полипептиды CD163v1 свиньи, такие как аллельные варианты полипептида человека и видовые гомологи, с использованием хорошо известных способов, включающих саузерн и/или нозерн-гибридизацию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Знание последовательности любой из раскрытых в данном описании последовательностей CD163 также делает возможным через применение саузерн-гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) идентификацию геномных последовательностей ДНК, кодирующих регуляторные последовательности CD163, такие как промоторы, операторы, энхансеры, репрессоры и т.п.

Как указано в разделе выше, озаглавленном "Анализы согласно изобретению", полинуклеотиды по изобретению также полезны в гибридизационных анализах для определения способности клеток экспрессировать CD163 или для измерения уровней экспрессии CD163. Полинуклеотиды по изобретению также могут представлять собой основу для способов диагностики, полезных для определения восприимчивости животного к вирусной инфекции, как описано выше.

Раскрытие в данном описании полноразмерных полинуклеотидов, кодирующих полипептид CD163, дает специалисту в данной области возможность легко получить фрагменты полноразмерного полинуклеотида. Таким образом, в изобретении предложены уникальные фрагменты полинуклеотидов, кодирующих CD163, содержащих по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов из полноразмерной последовательности (включая каждое и каждое целое значение) полинуклеотида, кодирующего CD163, раскрытый в данном описании. Поскольку полинуклеотиды по изобретению (включая фрагменты) содержат последовательности, уникальные для конкретной CD163-кодирующей полинуклеотидной последовательности, то они поэтому могут гибридизоваться при очень жестких или умеренно жестких условиях только (т.е. "специфически") с полинуклеотидами, кодирующими различные полипептиды CD163. Последовательности, уникальные для полинуклеотидов по изобретению, могут распознаваться путем сравнения данных последовательностей с другими известными полинуклеотидами и могут быть идентифицированы с помощью программ выравнивания, рутинно используемых в данной области, например программ, которые общедоступны в базах данных по последовательностям. Такие последовательности также могут распознаваться с помощью анализов саузерн-гибридизации для определения количества фрагментов геномной ДНК, с которой будет гибридизоваться полинуклеотид. Полинуклеотиды по изобретению могут быть мечены с помощью способа, который позволяет их детектировать, включая радиоактивное, флуоресцентное и ферментативное мечение.

Один или более уникальных фрагментов полинуклеотидов (или других полинуклеотидов CD163, как обсуждалось выше) могут быть включены в наборы, которые используют для определения присутствия полинуклеотида, кодирующего CD163, или для определения вариаций в полинуклеотидной последовательности, кодирующей CD163. Также с помощью изобретения могут стать доступными антисмысловые полинуклеотиды, которые распознают и гибридизуются с полинуклеотидами, кодирующими CD163. Предложены полноразмерные антисмысловые полинуклеотиды и их фрагменты. Фрагменты антисмысловых молекул по изобретению включают (1) фрагменты, которые специфически распознают и гибридизуются с вариантами CD163, раскрытыми в данном описании (что определяется с помощью сравнения последовательности ДНК, кодирующей CD163, с ДНК, кодирующей другие известные молекулы). Идентификация последовательностей, уникальных для новых полинуклеотидов, кодирующих CD163, может быть выведена с использованием любой общедоступной базы данных по последовательностям и/или с использованием имеющихся в продаже программ сравнения последовательностей. Уникальность выбранных последовательностей в целом геноме может быть дополнительно проверена с помощью гибридизационных анализов. После идентификации желаемых последовательностей может быть осуществлено выделение с помощью переваривания рестриктазами или амплификации с использованием любой из различных методик полимеразной цепной реакции, хорошо известных в данной области. Антисмысловые полинуклеотиды особенно подходят для регуляции экспрессии CD163 клетками, экспрессирующими мРНК CD163.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты (предпочтительно олигонуклеотиды с 10-20 парами оснований), способные специфически связываться с последовательностями, контролирующими экспрессию CD163, или РНК CD163, вводят в клетки (например с помощью вирусного вектора или коллоидной дисперсионной системы, такой как липосома). Антисмысловая нуклеиновая кислота связывается с целевой нуклеотидной последовательностью CD163 свиньи в клетке и предотвращает транскрипцию или трансляцию целевой последовательности. Фосфоротиоатные и метилфосфонатные антисмысловые олигонуклеотиды конкретно предложены в изобретении для терапевтического применения. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть дополнительно модифицированы с помощью поли-L-лизина, трансферринполилизина или холестериновых группировок на их 5'-конце. Супрессия экспрессии CD163 свиньи на транскрипционном или трансляционном уровне полезна для создания клеточных или животных моделей для заболеваний, характеризующихся аберрантной экспрессией CD163 свиньи, или в качестве терапевтического средства.

Как более подробно указано выше, нуклеиновые кислоты по изобретению включают векторы, содержащие полинуклеотид по изобретению. Такие векторы полезны, например, для амплификации полинуклеотидов в клетках-хозяевах для получения их полезных количеств. В других воплощениях вектор представляет собой экспрессирующий вектор, где полинуклеотид по изобретению функциональным образом связан с полинуклеотидом, содержащим последовательность, контролирующую экспрессию. Такие векторы полезны для рекомбинантного получения полипептидов по изобретению.

Как указано выше, в изобретении предложены клетки-хозяева, которые трансформированы или трансфицированы (стабильно или временно) полинуклеотидами по изобретению или векторами по изобретению. Как указано выше, такие клетки-хозяева полезны для продукции вируса и производства вакцин.

В изобретении также предложены выделенные полипептиды CD163, кодируемые новым полинуклеотидом по изобретению.

Полипептиды по изобретению

Примеры раскрывают обнаружение авторами изобретения нескольких новых полипептидов CD163. Изобретение включает эти новые полипептиды CD163, которые представлены в SEQ ID NO: 2, 14, 19, 24, 27, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 и 48.

Таким образом, изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий полипептид susCD163v1, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 2.

Таким образом, изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий полипептид susCD163v2, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 99% идентичности и/или сходства с полипептидом susCD163v2, приведенным в SEQ ID NO: 14.

Изобретение также включает полипептид CD163v2 мыши, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 24.

Изобретение также включает полипептид CD163v3 мыши, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27.

Изобретение также включает по меньшей мере полипептид, имеющий 96, 97, 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 27.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 32.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 98 или 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 32.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 34.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 36.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 38.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 39.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 40.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 40.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 42.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 42.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 44.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 44.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 46.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 46.

Изобретение также включает полипептид, имеющий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48.

Изобретение также включает полипептид, имеющий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности и/или сходства с полипептидом, приведенным в SEQ ID NO: 48.

Полипептиды по изобретению могут быть выделены из природных клеточных источников или могут быть химически синтезированы, но их предпочтительно получают рекомбинантными способами, включающими клетки-хозяева согласно изобретению. Ожидают, что применение клеток-хозяев млекопитающих обеспечит такие посттрансляционные модификации (например, гликозилирование, укорочение, липидизацию и фосфорилирование), которые могут быть необходимы для оптимальной биологической активности рекомбинантных продуктов экспрессии согласно изобретению. Включены гликозилированные и негликозилированные формы новых полипептидов CD163.

Сверхэкспрессия в эукариотических и прокариотических хозяевах, как описано выше, облегчает выделение полипептидов CD163. Таким образом, изобретение включает выделенные полипептиды CD163, приведенные в SEQ ID NO: 2, 14, 19, 24, 27 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, и их варианты и консервативные аминокислотные замены в них, включающие меченые и маркированные полипептиды.

Изобретение включает новые полипептиды CD163, которые "мечены". Термин "меченый" используется в данном описании для ссылки на конъюгацию или ковалентную связь любой подходящей детектируемой группы, включая ферменты (например, пероксидазу хрена, бета-глюкуронидазу, щелочную фосфатазу и бета-D-галактозидазу), флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, люциферазу) и радиоактивные метки (например, ¹⁴ C, ¹²⁵ I, ³ H, ³² P и ³⁵ S) с соединением, которое метят. Способы мечения различных соединений, включая белки, петиды и антитела, хорошо известны. Смотри, например, Morrison, Methods in Enzymology 32b, 103 (1974); Syvanen et al., J. Biol. Chem., 284, 3762 (1973); Bolton and Hunter, Biochem. J., 133, 529 (1973). Название "меченый" также может охватывать полипептид, который ковалентно связан с аминокислотным "хвостом" (tag), как обсуждается ниже.

Кроме того, новые полипептиды CD163 по изобретению могут быть мечены опосредованно. Это мечение включает ковалентное добавление группировки к полипептиду и последующее связывание дополнительной группировки с меткой или меченым соединением, которое демонстрирует специфическое связывание с дополнительной группировкой. Возможности для опосредованного мечения включают биотинилирование пептида с последующим связыванием с авидином, связанным с одной из вышеуказанных групп для мечения. Другой пример может представлять собой инкубацию радиомеченого антитела, специфического в отношении гистидинового "хвоста", с полипептидом CD163, содержащим полигистидиновый "хвост". Суммарный эффект заключается в связывании радиоактивного антитела с полипептидом ввиду значительной аффинности антитела к "хвосту".

Изобретение также охватывает варианты (или аналоги) нового белка CD163. В одном из примеров предложены инсерционные варианты, где один или более аминокислотных остатков дополняют аминокислотную последовательность нового CD163. Инсерции могут находиться на любом или обоих концах белка или могут располагаться во внутренних участках аминокислотной последовательности нового белка CD163. Инсерционные варианты с дополнительными остатками по любому одному или обоим концам могут включать, например, слитые белки и белки, содержащие аминокислотные "хвосты" или метки. Инсерционные варианты включают новые полипептиды CD163, где один или более аминокислотных остатков добавлены к аминокислотной последовательности CD163 или к ее биологически активному фрагменту.

Таким образом, инсерционные варианты также могут включать слитые белки, где амино- и/или карбоксиконец нового полипептида CD163 слит с другим полипептидом. Различные tag-полипептиды и соответствующие им антитела хорошо известны в данной области. Примеры включают полигистидиновые (поли-his) или полигистидинглициновые (поли-his-gly) "хвосты"; tag-полипептид НА вируса гриппа и антитело к нему 12СА5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc "хвост" и антитела к нему 8F9, 3С7, 6Е10, G4, В7 и 9Е10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)] и гликопротеин D (gD) "хвост" вируса простого герпеса и антитело к нему [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Другие tag-полипептиды включают Flag-пептид [Норр et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид KT3-эпитопа [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид альфа-тубулинового эпитопа [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] и пептидный "хвост" белка 10 гена Т7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. Кроме того, полипептид CD163 может быть мечен ферментативными белками, такими как пероксидаза и щелочная фосфатаза.

В еще одном аспекте изобретения предложены делеционные варианты, где один или более чем один аминокислотный остаток в новом полипептиде CD163 удален. Делеции могут быть осуществлены на одном или обоих концах нового полипептида CD163 или путем удаления одного или более остатков в пределах аминокислотной последовательности нового CD163. Таким образом, делеционные варианты включают все фрагменты нового полипептида CD163.

Полипептиды CD163 содержат трансмембранный или мембранный заякоривающий участок. Понятно, что такие трансмембранные домены полезны при экспрессии в случае гетерологичного белка для направленной доставки гетерологичного белка к мембранам. Также понятно, что предпочтительным может быть удаление некоторых трансмембранных доменов для повышения очистки или растворимости белка. Трансмембранные делетированные варианты CD163 и кодирующие их полинуклеотиды обладают потенциальной ценностью в качестве антивирусных лекарственных средств. Такие варианты конкретно раскрыты в данном описании как SEQ ID NO: 37-40.

Настоящее изобретение также включает варианты вышеупомянутых полипептидов, то есть полипептиды, которые отличаются от последовательности, используемой в качестве контроля, консервативными аминокислотными заменами.

Примеры консервативных замен представлены в табл. 1, 2 и 3 в вышеприведенном разделе, озаглавленном "Определения".

В тех ситуациях, когда предпочтительно частично или полностью выделить новые полипептиды CD163, очистку можно осуществлять с использованием стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области. Такие способы включают без ограничения разделение с помощью электрофореза с последующей электроэлюцией, различные типы хроматографии (иммуноаффинная, на молекулярных ситах и/или ионнообменная) и/или жидкостная хроматография высокого давления. В некоторых случаях может быть предпочтительным использование более чем одного из этих способов для полной очистки.

Очистка новых полипептидов CD163 может быть осуществлена с использованием множества способов. Если полипептид был синтезирован таким образом, что содержит "хвост", такой как гексагистидин (CD163/гекса His), или другой небольшой пептид, такой как FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.) или myc (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) на всем карбокси- или аминоконце, то он, по существу, может быть очищен в одностадийном способе путем пропускания раствора через аффинную колонку, в которой матрикс колонки обладает высокой аффинностью к этому "хвосту" или непосредственно к полипептиду (т.е. моноклональное антитело, специфически распознающее CD163). Например, полигистидин с высокой аффинностью и специфичностью связывается с никелем, таким образом, для очистки CD163/поли His может быть использована аффинная колонка с никелем (например, колонки с никелем, имеющие зарегистрированный товарный знак Qiagen) (смотри, например, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).

Даже если новый полипептид CD163 получают без метки или "хвоста", чтобы облегчить очистку, новый CD163 по изобретению может быть очищен с помощью иммуноаффинной хроматографии. Чтобы осуществить это, нужно получить антитела, специфические в отношении полипептида CD163, с помощью способов, хорошо известных в данной области.

Антитела к новым полипептидам CD163 по изобретению могут быть получены путем введения полипептидов или несущих эпитоп фрагментов, аналогов или клеток, животному, предпочтительно отличающемуся от человека, с использованием стандартных протоколов. Для получения моноклональных антител может быть использован любой способ, известный в данной области, который позволяет получать антитела, продуцируемые постоянными культурами клеточных линий. Примеры включают различные способы, такие как способы, представленные в Kohler, G. and Milstein, С., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., p.77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Когда новые полипептиды CD163 получают без присоединенного "хвоста" и нет никаких антител, тогда могут быть использованы другие хорошо известные способы очистки. Такие способы включают без ограничения ионообменную хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах, ЖХВД, нативный гель-электрофорез в комбинации с гель-элюцией и препаративное изоэлектрофокусирование (аппарат/способ "Isoprime", Hoefer Scientific). B некоторых случаях два или более из этих способов могут быть скомбинированы для достижения повышенной чистоты.

Следует понимать, что определение полипептидов по изобретению, как предполагают, включает полипептиды, несущие модификации, отличающиеся от инсерции, делеции или замены аминокислотных остатков. В качестве примера, модификации могут быть ковалентными по природе и включать, например, химическую связь с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими группировками.

Антитела

Также настоящее изобретение охватывает антитела (например, моноклональные и поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, химерные антитела, бифункциональные/биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела человека и антитела, связанные с областью, определяющей комплементарность (CDR), включающие соединения, содержащие последовательности CDR, специфически распознающие полипептид по изобретению), специфические в отношении нового CD163 или его фрагментов.

Термин "специфический в отношении", используемый для описания антител по изобретению, указывает на то, что вариабельные участки антител по изобретению распознают и связываются исключительно с полипептидами CD163 (т.е. способны отличать полипептиды CD163 от других известных полипептидов благодаря измеряемым различиям в аффинности связывания, несмотря на возможное существование локализованной идентичности последовательностей, гомологии или сходства между новым CD163 и такими полипептидами). Понятно, что специфические антитела также могут взаимодействовать с другими белками (например, белком A S.aureus или другими антителами в методиках ИФА) посредством взаимодействия с последовательностями, находящимися вне вариабельной области антител, и, в частности, в константной области молекулы. Скрининговые анализы для определения специфичности связывания антитела по изобретению хорошо известны и рутинно используются в данной области. Исчерпывающее обсуждение таких анализов смотри в Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6. Также охвачены антитела, распознающие и связывающиеся с фрагментами полипептидов CD163 по изобретению, при условии, что эти антитела, во-первых и прежде всего, являются специфическими в отношении новых полипептидов CD163. Антитела по изобретению могут быть получены с использованием любого из способов, хорошо известных и рутинно используемых на практике в данной области. Антитела, отличающиеся от антител человека, могут быть гуманизированы любыми способами, известными в данной области. В одном из способов CDR, отличающиеся от CDR человека, встраивают в антитело человека или консенсусную скелетную последовательность антитела. Затем в структуру антитела могут быть введены дополнительные изменения для модуляции аффинности или иммуногенности.

Антитела по изобретению полезны для диагностических целей для детекции или количественной оценки CD163, а также для очистки CD163. Также охвачены наборы, включающие антитело по изобретению, для любой из описанных здесь целей. Как правило, набор по изобретению также включает контрольный антиген, в отношении которого антитело является иммуноспецифическим.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Временная трансфекция посредством CD163 свиньи придает непермиссивной клеточной линии пермиссивность в отношении PRRS вирусной инфекции.

Тотальную мРНК из первичных альвеолярных макрофагов свиньи использовали для создания библиотеки кДНК в плазмиде pCMV-Sport6.1 (Invitrogen) с кДНК, клонированной между сайтами EcoRV и NotI. Выделенный и временно трансфицированный в клеточную линию BHK-21 (почки детенышей хомячка) представитель этой библиотеки приводил к фенотипу, пермиссивному в отношении PRRS. Клетки выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS) в атмосфере 5% СО ₂ при 37 °С. Клеточные культуры временно трансфицировали, используя 10,0 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen) и 2,0 мкг плазмиды. Дубликатный монослой трансфицировали плазмидой рРАМВ в качестве отрицательного контроля. Эта плазмида представляет собой pCMV-Sport6.1 без вставки. Эффективность трансфекции контролировали с помощью плазмиды, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP). Приблизительно через 24 ч после трансфекции монослои инфицировали либо североамериканским (изолят P129), либо европейским (изолят 96V198) генотипами вируса PRRS. Для детекции репликации PRRS монослои фиксировали с помощью 80%-ного ацетона приблизительно через 24 ч после инфекции и инкубировали в течение приблизительно 1 ч с FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc.). Это моноклональное антитело является специфическим в отношении вирусного нуклеокапсида PRRS, экспрессируемого с открытой рамки считывания 7. Инвертированный флуоресцентный микроскоп Nikon TE 300 с 10 × объективом использовали для фотографирования монослоя, содержащего FITC-положительные клетки, и отрицательного контрольного монослоя.

Подтвердили, что трансфицированные клетки становятся пермиссивными в отношении как североамериканского (изолят P129), так и европейского (изолят 96V198) генотипов PRRSV. Экспрессия вирусных генов может быть обнаружена во многих трансфицированных клетках BHK, и вирусное потомство можно легко обнаружить в супернатанте. Контрольные трансфекции с использованием вектора без вставки или нерелевантных плазмид не приводили к пермиссивности.

Секвенирование вставки в функциональной плазмиде с использованием набора Big Dye Terminator Version 1.0 Sequence Reaction (Applied Biosystems, Foster City, CA) и анализатора ДНК Applied Biosystems 3730 (Applied Biosystems) выявило ген, который был высокогомологичным опубликованной кДНК гена CD163 свиньи (Genbank, кат. № AJ311716). кДНК, которую идентифицировали авторы изобретения, содержала дополнительные 5'- и 3'-нетранслируемые области, родственные AJ311716, и открытую рамку считывания, отличающуюся тремя особенностями: (1) внутренней делецией 738 п.о. около 5'-конца, (2) удлинением 5'-конца на 15 п.о. выше кодона ATG и (3) изменениями шестнадцати нуклеотидов, которые, как предполагают, вызывают изменения 10 аминокислот. Идентичность между нуклеотидными последовательностями составила 99,4%. Выравнивания вновь открытой последовательности CD163 свиньи с последовательностью AJ311716, о которой сообщалось ранее, представлены на фиг. 1 и 2. Новый вариант CD163 свиньи обозначен "susCD163v1".

Пример 2. Конструирование плазмиды pCMVsusCD163v1.

Конструирование плазмиды pCMVsusCD163v1 осуществляли следующим образом. Функциональный клон, идентифицированный в первичной библиотеке кДНК макрофагов свиньи как придающий пермиссивность в отношении PRRSV, служил матрицей для ПЦР-амплификации вставки CD163, включающей 5'- и 3'-нетранслируемые области, с использованием праймеров 5'DS-CD163 (SEQ ID NO: 6) (5'-CGGAATT CCGCGG ATGTAATAATACAAGAAGA-3') и 3'CD163 (SEQ ID NO: 7) (5'CCG CTCGAG TAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTT-3'). Праймер 5'DS-CD163 включает сайт рестрикции для SacII на 5'-конце вставки CD163, тогда как праймер 3'CD163 включает сайт рестрикции для XhoI на 3'-конце вставки (подчеркнут). Реакции, содержащие 190 нг плазмидной матрицы, амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Platinum Pfx (Invitrogen, кат. № 11708-013) согласно инструкциям производителя. Реакционные смеси нагревали до 94 ° в течение 2 мин, затем циклы повторяли 35 раз при 94 ° в течение 20 с, при 55 ° в течение 30 с и при 68 ° в течение 3,5 мин с последующим удлинением концов при 72 ° в течение 7 мин. Полученные ПЦР-продукты очищали, используя набор для очистки Qiaquick PCR purification kit (Qiagen, кат. № 28104), переваривали рестриктазами SacII и XhoI, и полученные фрагменты очищали в геле, используя набор Qiaquick Gel Extraction kit (Qiagen, кат. № 28704). ПЦР-фрагмент CD163 затем лигировали в плазмиду pCMV-Script (Stratagene, кат. № 212220), подготовленную для принятия гидролизованного ПЦР-фрагмента путем переваривания SacII и XhoI с последующей очисткой в геле, как описано выше. Лигированный материал трансформировали в E.coli штамм DH5 α и рекомбинанты отбирали по росту в 50 мкг/мл канамицина и идентифицировали с помощью рестрикционного анализа. Полученная плазмида "pCMVsusCD163v1" содержит вставку CD163 свиньи, описанную в примере 1, под транскрипционным контролем эукариотического промотора CMV (цитомегаловируса) и ген устойчивости к неомицину/канамицину под контролем как эукариотических, так и прокариотических промоторов.

Пример 3. Конструирование экспрессирующего вектора pRSV-Script и pRSVsusCD163v1.

Плазмиду pRc/RSV (Invitrogen) использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации промотора RSV. Последовательность промотора RSV содержалась в нуклеотидах с 209 по 604 pRc/RSV. Синтезировали прямой праймер PCIRSVLTR (SEQ ID NO: 8) (5'-ACACTCG ACATGT CGATGTACGGGCCAGATATACGCGT-3') и обратный праймер VSRRTLSAC (SEQ ID NO: 9) (5'TTCCTTACA GAGCTC GAGGTGCACACCAATGTGGTGAA-3'). Сайты распознавания для рестрикционных эндонуклеаз PciI и SacI (подчеркнуты) включали в 5'- и 3'-праймеры, соответственно, для будущего клонирования. ПЦР осуществляли, используя набор Taq ДНК-полимеразы HotMaster (Eppendorf) согласно инструкциям производителя. Реакционные смеси содержали 0,9 нг плазмидной матрицы pRc/RSV и 0,3 мкМ каждого описанного выше праймера. Реакционные смеси нагревали до 94 ° в течение 2 мин, затем осуществляли 30 циклов при 94 ° в течение 20 с, при 52 ° в течение 10 с и при 65 ° в течение 1 мин. Полученный ПЦР-фрагмент переваривали рестриктазами PciI и SacI, очищали в геле и клонировали в плазмиду pCMV-Script (Stratagene), которую переваривали аналогично с целью удаления последовательности промотора CMV. Конечную конструкцию помещали в промотор RSV непосредственно выше сайта множественного клонирования и назвали "pRSV-Script".

Вставку susCD163v1 клонировали ниже промотора RSV следующим образом. Последовательность susCD163v1 вырезали из плазмиды pCMVsusCD163v1 путем переваривания рестриктазами (KpnI и SacII) и очищали в геле. Этот фрагмент лигировали в pRSV-Script, которую также переваривали теми же ферментами, и очищали в геле. Цитирующую смесь трансформировали в E.coli DH5 α и трансформанты подвергали селекции, используя 50 мкг/мл канамицина. Клон, содержащий правильную вставку, обозначили как "pRSVsusCD163v1".

Пример 4. Клонирование и характеристика более длинного варианта кДНК CD163 свиньи.

На основе последовательности CD163v1 свиньи были конструированы прямой праймер 5'CD163NotIlong (SEQ ID NO: 10) (5'CGGTCCGGA GCGGCCGC GATGTAATAATACAAGAAGATTTAAATGG-3') и обратный праймер 3'CD163KpnI (SEQ ID NO: 11) (5'CGGTT GGTACC CAGCAATATTCTTTTTTATTTAATGCC-3') с использованием программы Lasergene PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison WI) для амплификации полноразмерного гена CD163 свиньи. Сайты рестрикции для эндонуклеаз NotI и KpnI (подчеркнуты) были включены в 5'- и 3'-праймеры, соответственно, для обеспечения удобного клонирования. Тотальную клеточную РНК выделяли из первичных альвеолярных макрофагов (РАМ), собранных из легочных смывов здоровых свиней. Выделение РНК осуществляли, используя набор RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Реакционные смеси для ОТ-ПЦР (ПЦР с использованием обратной транскриптазы) приготавливали, используя набор Superscript one-step RT-PCR for Long Templates kit (Invitrogen, Carlsbad, CA), и параметры ОТ-ПЦР устанавливали следующим образом: при 50 °C в течение 30 мин, при 94 °С в течение 2 мин (при 94 °С 30 с, 55 °C 30 с и 68 °С 4 мин) для 35 циклов, при 72 °С в течение 10 мин. ПЦР-продукты анализировали на 0,8%-ных агарозных гелях SeaKem GTG. ОТ-ПЦР-продукты разных размеров вырезали из агарозных гелей и ДНК экстрагировали, используя набор GeneClean kit (QBiogene). Эти ОТ-ПЦР-продукты клонировали в клонирующий вектор pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Клоны анализировали на наличие вставки путем переваривания рестриктазами. Колонии, содержащие вставки, секвенировали, используя набор Big Dye Terminator Version 1.0 Sequence Reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и анализатор ДНК Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) для подтверждения аутентичности последовательности. Последовательности редактировали и компоновали с использованием программ Lasergene EditSeq и SeqMan (DNASTAR Inc., Madison WI). Одну из плазмид с крупной вставкой обозначили "pCRsusCD163v2" (pCR2.1, содержащая вариант 2 CD163 свиньи, которую авторы изобретения обозначили как SEQ ID NO: 12). Кодирующую последовательность, содержащуюся в SEQ ID NO: 12, репродуцировали ниже и обозначили как SEQ ID NO: 13. Анализ последовательности продемонстрировал, что этот CD163 свиньи кодирует аминокислотную последовательность из 1115 аминокислот, которую авторы изобретения обозначили как SEQ ID NO: 14. При сравнении с последовательностью CD163 свиньи в GenBank (регистрационный № AJ311716), последовательность CD163v2, раскрытая авторами изобретения, на 98,9% идентична на аминокислотном уровне. CD163v2 также имеет 5 дополнительных аминокислотных остатков на 5'-конце, удлиняя открытую рамку считывания до внутрирамочного, находящегося выше, инициирующего кодона ATG (как в последовательности CD163v1 свиньи, описанной в примере 1). На аминокислотном уровне CD163 свиньи на 84,3% идентичен CD163 человека (GenBank, кат. № Z22968) и на 73,7% идентичен CD163 мыши (GenBank, кат. № AF274883). Предсказанная сигнальная последовательность и трансмембранный участок SEQ ID NO: 14 обозначены, соответственно, подчеркиванием и жирным шрифтом. Определение того, имеют ли другие последовательности CD163 похожие свойства, легко осуществить путем анализа последовательности.

Sus CD163 v2 в pCRsusCD163v2 выделяли из вектора pCR2.1 после переваривания рестриктазами KpnI и NotI и очистки в геле. Реципиентный вектор pCMV-script также разрезали той же парой рестриктаз и обеспечивали прямое клонирование susCD163v2 в pCMV-script. После лигирования susCD163 v2 с pCMV-script лигирующую смесь использовали для трансформации клеток E.coli STBL 2 (Invitrogen). C помощью анализа переваривания рестриктазами было обнаружено, что один из трансформантов содержит ген CD163, и его обозначили pCMV-script susCD163v2 клон № 3.

Пример 5. Приготовление экспрессирующей системы на основе промотора RSV способом прямого лигирования и трансфекции.

Разработали не основанную на клонировании методику получения микрограммовых количеств линейной ДНК, подходящей для применения в получении стабильных клеточных линий, экспрессирующих CD163 с промотора RSV (фиг. 4). В эту методику включены выделение и лигирование двух фрагментов ДНК, первый из которых содержит ген неомицина и кассету промотора RSV, происходящую из pRSV-script, а второй содержит последовательность, кодирующую susCD163v2, из pCMVsusCD163v2. Векторную плазмиду pRSV-Script линеаризовали с помощью DraIII выше гена неомицина и получали тупые концы с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli. Затем эту плазмиду переваривали NotI непосредственно ниже промотора RSV. Клон pCMVsusCD163v2 переваривали в последовательности вектора ниже вставки CD163 с помощью DrdI и получали тупые концы с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. Последовательность, кодирующую CD163, высвобождали из вектора с помощью NotI, расположенной непосредственно выше последовательности, кодирующей CD163. Для каждого переваривания плазмиды соответствующие фрагменты очищали из агарозных гелей. Крупномасштабную реакцию лигирования осуществляли следующим образом. Приблизительно 20 мкг каждого фрагмента ДНК инкубировали в объеме 600 мкл с 15 единицами ДНК-лигазы Т4. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин, после чего отбирали аликвоту и реакционную смесь замораживали на сухом льду. Анализ аликвоты в агарозном геле обнаружил, что осталось значительное количество нелигированной ДНК, поэтому добавляли еще 15 единиц лигазы и инкубировали в течение еще 10 мин при комнатной температуре. После лигирования линейный фрагмент ДНК, содержащий все соответствующие элементы, очищали посредством электрофореза в агарозном геле. Лигирование двух фрагментов DNA через липкие концы, полученные с помощью NotI, приводило в результате к размещению 5'-последовательностей гена CD163 ниже промотора RSV, что обеспечивало направленную экспрессию CD163 в клетках млекопитающих. После выделения очищенную ДНК использовали для трансфекции различных клеточных линий млекопитающих.

Пример 6. Клонирование и характеристика кДНК CD163 человека.

Основываясь на известной последовательности кДНК CD163 человека (GenBank, регистрационный № ВС051281) и используя программу PrimerSelect, сконструировали прямой праймер Hu5'Not (SEQ ID NO: 15) (5'CACC GCGGCCGC GAAGTTATAAATCGCCACCATGAGCAAACTCAGAATGG-3') и обратный праймер Hu3'Kpn (SEQ ID NO: 16) (5'-TGCTCC GGTACC TAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3'). Сайты рестрикции для NotI и KpnI (подчеркнуты) были включены в 5'- и 3'-праймеры, соответственно, для облегчения клонирования в экспрессирующие векторы. Последовательность CACC добавляли к 5'-концу 5'-праймера для того, чтобы обеспечить возможность прямого клонирования в вектор pCDNA3.1D/V5/His/TOPO (кат. № K49001, Invitrogen, смотри фиг. 6). кДНК CD163 человека амплифицировали из РНК, экстрагированной из клеточной линии U937 после стимуляции форбол-12-миристат-13-ацетатом (100 нг/мл) в течение 3 суток. Тотальную клеточную РНК выделяли, используя набор RNeasy kit (Qiagen). Реакции ОТ-ПЦР и способы секвенирования были такими же, как описано в примере 4. ПЦР-продукты разделяли на 0,8%-ном агарозном геле SeaKem и экстрагировали из геля, используя набор GeneClean kit. ПЦР-продукты направленно клонировали в вектор pCDNA3.1D/V5/His/TOPO согласно инструкциям производителя. Два клона с крупными вставками секвенировали. Секвенирование и способы анализа последовательностей описаны в примере 4. Клон с правильной вставкой обозначили как "pcDNA3.1D-humCD163v2", и авторы изобретения обозначили последовательность вставки SEQ ID NO: 17.

Открытая рамка считывания CD163 в pCDNA3.1D-humCD163v2 имеет длину 1121 остатков (обозначена как SEQ ID NO: 18, которая кодирует SEQ ID NO: 19, раскрытую ниже) и на 100% идентична Genbank Z22968 (кДНК CD163 человека, имеющая такую же длину). Полученная авторами изобретения последовательность CD163v2 человека также на 100% идентична Genbank BC051281 и Z22969 (сплайс-варианты CD163 человека), за исключением того, что 42 негомологичных остатка в двух последовательностях Genbank заменяют семь карбокси-концевых остатков в последовательности, полученной авторами изобретения. Это различие является следствием присутствия 83-нуклеотидного экзона в ВС051281 и Z22969 и полученного в результате сдвига рамки считывания на 3'-конце экзона. (Law, S.K., Micklem, K.J., Shaw, J.M., Zhang, X.P., Dong, Y., Willis, A.C. and Mason, D.Y. (1993) A new macrophage differentiation antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily. European Journal of Immunology 23 (9), 2320-2325).

Пример 7. Клонирование и характеристика CD163 мыши.

Основываясь на последовательности CD163 мыши в GenBank (AF274883) и используя программу PrimerSelect, разработали прямой праймер Mus-new5' (SEQ ID NO: 20) (5'-CACCGCGGCCGCCACACGGAGCCATCAAAATCATCAA-3') и обратный праймер Mus-new3' (SEQ ID NO: 21) (5'-GGTACCGCGAACAAGCAAACCAATAGCAATATTGTTTAATTCCCTC-3'). Сайты рестрикции для эндонуклеаз NotI и KpnI были включены в 5'- и 3'-праймеры, соответственно, для облегчения клонирования в другие экспрессирующие векторы. Перитонеальные макрофаги мыши выделяли из мышей через 2 суток после инъекции тиогликолятной среды в брюшную полость. Тотальную клеточную РНК выделяли из перитонеальных макрофагов, используя набор RNeasy kit. Реакции ОТ-ПЦР и параметры ОТ-ПЦР были такими же, как описано в примере 4, за исключением того, что температуру отжига увеличивали до 60 °C, а температуру элонгации увеличивали до 72 °C. ПЦР-продукт очищали на 0,8%-ном агарозном геле SeaKem и направленно клонировали в pCDNA3.1D/V5/His/TOPO согласно инструкциям производителя. Несколько клонов с крупными вставками идентифицировали для дальнейшего анализа. Плазмиду, содержащую вставку (SEQ ID NO: 22) с CD163 мыши, которая кодирует белок такой же длины, как (1121 аминокислота SEQ ID NO: 24) и отличается от Genbank AF274883 только двумя аминокислотами (99,8% идентичности), обозначили "pCDNA3.1D-murCD163v2".

Получали еще одну плазмиду "pCDNA3.1D-murCD163v3", которая содержала вставку (SEQ ID NO: 25), содержащую последовательность, кодирующую CD163 мыши (SEQ ID NO: 26), которая кодирует белок длиной 1159 аминокислот (SEQ ID NO: 27). Он отличается от AF274883 только 3 аминокислотами в первых 1107 остатках (99,7% идентичности), но последовательности совершенно различаются, начиная с 1108 остатка. Это является следствием вставки 82 нуклеотидов в кДНК и сопутствующего сдвига рамки считывания ниже вставки. В результате, CD163v3 мыши содержит 52 аминокислоты на карбоксиконце, не гомологичные 14 карбокси-концевым остаткам CD163v2 мыши. Наиболее вероятно, что эти две альтернативные версии "полноразмерного" CD163 мыши представляют собой сплайс-вариант одного и того же гена, как описано для CD163 человека (Law, S.K., Micklem, K.J., Shaw, J.M., Zhang, X.P., Dong, Y., Willis, A.C. and Mason, D.Y. (1993) A new macrophage differentiation antigen which is a member of the scavenger receptor superfamily. European Journal of Immunology, 23 (9), 2320-2325).

Пример 8. Клонирование и характеристика MARC-145 CD163.

Для амплификации кДНК CD163 из клеток MARC-145 африканской зеленой мартышки использовали прямой праймер 5'simianCD163 (SEQ ID NO: 28) (5'-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3', основанный на CD163 человека) и обратный праймер HuCD163-3'Kpn (SEQ ID NO: 29) (5'-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3'). Тотальную клеточную РНК выделяли из клеток MARC-145, используя набор RNeasy kit. Параметры ОТ-ПЦР были такими же, как описано в примере 4. Продукты ОТ-ПЦР направленно клонировали в вектор pCDNA3.1D/V5/His/TOPO согласно инструкциям производителя. Анализировали несколько клонов, содержащих крупные вставки. Клон № 25 обозначили "pCDNA3.1 D-MARC-CD163v2". Эта новая кДНК CD163 из клеток MARC-145 имеет длину 1116 аминокислот. При сравнении с последовательностями в базе данных GenBank, аминокислотная последовательность CD163 MARC-145 на 96,3% идентична CD163 человека (Genbank Z22968), на 84,7% идентична CD163 свиньи (Genbank AJ311716) и на 73,9% идентична CD163 мыши (Genbank AF274883).

Пример 9. Клонирование и характеристика CD163 обезьяны из клеток Vero.

Для амплификации кДНК CD163 из клеток Vero использовали прямой праймер 5'simianCD163 (SEQ ID NO: 28) (5'-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3', основанный на CD163 человека) и обратный праймер HuCD163-3'Kpn (SEQ ID NO: 29) (5'-TGCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3'). Тотальную клеточную РНК выделяли из клеток Vero, используя набор RNeasy kit. Параметры OT-ПЦР были такими же, как описано в примере 4. Продукты ОТ-ПЦР направленно клонировали в вектор pCDNA3.1D/V5/His/TOPO согласно инструкциям производителя. Восемь клонов, содержащих крупные вставки, секвенировали и обнаружили шесть дискретных схем сплайсинга. Эти схемы графически изображены на фиг. 17.

Шесть сплайс-вариантов отличаются присутствием или отсутствием трех экзонов, обозначенных Е6, E105 и Е83. Пропуск Е6 или E105 не изменяет рамку считывания, тогда как пропуск Е83 меняет рамку считывания. Схемы, похожие на v2 и/или v3, также обнаружены у свиньи, мыши, человека и в клетках MARC-145 мартышки. Схемы v4 и v5 лишены 105-нуклеотидного экзона, кодирующего гидрофобный трансмембранный участок. Эти кДНК не способны придавать клеткам BHK пермиссивность в отношении PRRSV инфекции в анализе временной трансфекции, возможно из-за того, что CD163 секретируется, а не остается связанным с мембраной. Хотя молекулы CD163, лишенные трансмембранного участка, по-видимому, являются нефункциональными в качестве пермиссивных клеточных факторов, возможно, что они могут иметь ценность при прямой нейтрализации вируса (подобно нейтрализующим антителам) или в качестве иммуногена для индукции антител к CD163, которые блокируют вирусную инфекцию в животном-хозяине.

Самый длинный сплайс-вариант v7 содержит все три экзона Е6, E105 и Е83. Эта новая кДНК CD163 из клеток Vero кодирует полипептид длиной 1153 аминокислот. При сравнении с последовательностями в базе данных Genbank, аминокислотная последовательность Vero CD163v7 на 95,4% идентична последовательности CD163 человека (Genbank Z22968), на 83,7% идентична последовательности CD163 свиньи (Genbank AJ311716) и на 72,1% идентична последовательности CD163 мыши (Genbank AF274883). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности шести сплайс-вариантов, обнаруженных в клетках Vero, представлены ниже (SEQ ID NO: 33-44).

Пример 10. Клонирование и характеристика CD163 собаки из клеток DH82.

Для амплификации кДНК CD163 из клеток DH82 использовали прямой праймер 5'simianCD163 (SEQ ID NO: 28) (5'-CACCGGAATGAGCAAACTCAGAATGG-3', основанный на CD163 человека) и обратный праймер HuCD163-3'Kpn (SEQ ID NO: 29) (5'-GCTCCGGTACCTAGTCCAGGTCTTCATCAAGGTATCTTA-3'). Тотальную клеточную РНК выделяли из клеток DH82, используя набор RNeasy kit. Тотальную клеточную РНК выделяли из клеток Vero, используя набор RNeasy kit. Параметры OT-ПЦР были такими же, как описано в примере 4. Продукты ОТ-ПЦР направленно клонировали в вектор pCDNA3.1D/V5/His/TOPO согласно инструкциям производителя. Анализировали несколько клонов, содержащих крупные вставки, и они попали в схемы сплайсинга v2 или v3, наблюдаемые для других видов. Вариант v2 лишен 81-нуклеотидного экзона (Е81) при сравнении с вариантом v3, что приводит в результате к сдвигу рамки считывания и альтернативным карбокси-концевым аминокислотным последовательностям. кДНК CD163v2 собаки из клеток DH82 кодирует пептид длиной 1115 аминокислот. При сравнении с последовательностями в базе данных Genbank она на 83,9% идентична последовательности CD163 человека (Genbank Z22968), на 85,1% идентична последовательности CD163 свиньи (Genbank AJ311716) и на 74,3% идентична последовательности CD163 мыши (Genbank AF274883). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности двух сплайс-вариантов, обнаруженных в клетках DH82, представлены ниже (SEQ ID NO: 45-48).

Пример 11. Различные клеточные линии становятся пермиссивными в отношении инфекции североамериканским PRRSV после временной трансфекции плазмидой pCMV-susCD163v1.

Клетки почки свиньи (PK032495), тестикулярные клетки свиньи из Norden Labs (NLST-1), клетки почки собаки из Norden Labs (NLDK-1) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Клеточные линии почки детенышей хомячка (BHK21), почки собаки из Norden Labs (NLFK-1) и легкого кролика (RL) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Клетки Vero были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °C и 5% СО ₂ в ростовых средах, состоящих из минимальной питательной среды альфа (MEM, Pfizer Inc. formulation), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и гентамицином в количестве 20 мк на мл. Лунки с клеточной культурой (35 мм), содержащие приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку плазмиды pCMV-susCD163v1 в DMEM без FBS или антибиотиков с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. Клеточную линию RL трансфицировали 1,0 мкг на лунку плазмиды pCMV-susCD163v1. Член библиотеки кДНК РАМ клеток без вставки, обозначенный рРАМВ (по существу, пустой плазмидный вектор pSport), был использован в качестве отрицательной контрольной плазмиды. Через 24 ч после трансфекции содержимое лунок удаляли и дважды промывали DMEM/5% FBS с последующим инфицированием североамериканским изолятом P129 PRRSV. Вирусу давали возможность абсорбироваться в 0,5 мл ростовой среды в течение минимум двух часов, после чего добавляли дополнительное количество среды до конечного объема 2,0 мл и инкубировали в течение ночи. Вирус затем удаляли, клетки дважды промывали ростовой средой и добавляли свежую ростовую среду (2,0 мл на лунку). Образец культуральной жидкости, отобранный в нулевой момент времени, немедленно отбирали из инокулята, чтобы определить фоновый уровень инфекционного вируса. Минимум через 48 ч после инфицирования культуры скринировали на пермиссивность путем отбора культуральных жидкостей для анализа жизнеспособного вируса, и пермиссивные клетки в монослое детектировали с помощью флуоресцентного анализа с использованием антител (FA). FA завершали путем фиксации монослоя 80%-ным ацетоном и окрашивания FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc), специфическим в отношении белка нуклеокапсида PRRSV. Жизнеспособный вирус титровали с помощью инокулирующих разведений культуральных жидкостей на клетках MARC-145. В табл. 5 представлены результаты инфицирования вирусом, полученные с помощью FA, и присутствия вирусного потомства для каждой тестируемой клеточной линии.

Невозможность обнаружения вирусного потомства из некоторых клеточных линий может являться результатом низкого титра вируса в клеточных культуральных жидкостях, находящегося ниже предела обнаружения в данном анализе. Пермиссивность клеток Vero к инфицированию PRRSV увеличивали с помощью экспрессии susCD163v1. По сравнению с измерением фонового вируса в нулевой момент времени наблюдали увеличение титров вируса в клетках Vero, трансфицированных pCMV-susCD163v1, почти на 2 порядка, тогда как в клетках, трансфицированных отрицательной контрольной плазмидой рРАМВ, наблюдали увеличение титра вируса меньше чем на 1 порядок. Все клеточные линии, за исключением NLDK-1, были положительными в соответствии с FA в отношении пермиссивности к инфицированию североамериканским изолятом P129 PRRSV после трансфекции плазмидой pCMV-susCD163v1.

Таблица 5

+++ = Существенно положительное

++ = Умеренно положительное

+ = Слегка положительное

- = Недетектируемое

HT = Не тестировали

Пример 12. Клетки BHK21 становились пермиссивными к инфицированию европейским PRRSV после временной трансфекции плазмидой pCMV-susCD163v1.

Клеточная линия почки детенышей хомячка (BHK21) была получена от Pfizer Inc. и выращивалась при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Лунки с культурой клеток (35 мм), содержащие приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку плазмиды pCMV-susCD163v1 в DMEM без FBS или антибиотиков с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. Через 24 ч после трансфекции содержимое лунок отбирали и дважды промывали DMEM/5% FBS с последующим инфицированием европейским изолятом 96V198 PRRSV. Вирусу давали возможность абсорбироваться в течение минимум 2 ч. Вирус затем удаляли, лунки дважды промывали ростовой средой и добавляли свежую ростовую среду (2,0 мл на лунку). Образец культуральной жидкости, отобранный в нулевой момент времени, немедленно отбирали из инокулята, чтобы определить фоновый уровень инфекционного вируса. Минимум через 48 ч после инфицирования культуры скринировали на пермиссивность путем отбора культуральных жидкостей для анализа жизнеспособного вируса, и пермиссивные клетки в монослое обнаруживали с помощью флуоресцентного анализа с использованием антител (FA). FA завершали путем фиксации монослоя 80%-ным ацетоном и окрашивания FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc), специфическим в отношении белка нуклеокапсида PRRSV. Жизнеспособный вирус титровали посредством инокулирующих разведений культуральных жидкостей на клетках MARC-145. В результате временной трансфекции BHK21 плазмидой pCMV-susCD163v1 клетки становились пермиссивными к инфицированию европейским изолятом 96V198 PRRSV и давали вирусное потомство.

Пример 13. Гены CD163 из множества видов животных делают клетки BHK21 пермиссивными к инфицированию вирусом PRRS.

Клетки BHK21, выращиваемые в DMEM (Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия и антибиотиками, использовали в экспериментах по временной трансфекции. Перед трансфекцией клетки однократно промывали OptiMEM (Invitrogen) без сыворотки или других добавок. Липофектамин 2000 (Invitrogen) использовали во всех экспериментах по трансфекции в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Смесь для трансфекции состояла из 10 мкл липофектамина 2000 и 2-3 мкг ДНК на 35 мм лунку. После инкубации в течение ночи среду для трансфекции удаляли и клетки инфицировали изолятом P129 PRRSV. Инфицирование осуществляли в течение 24-48 ч, после чего клетки фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technology Inc., Brookings, SD). Окрашивание белка нуклеокапсида визуализировали под флуоресцентным микроскопом.

Таблица 6. Временная трансфекция клеток BHK21 различными генами CD163 делает клетки пермиссивными к инфицированию вирусом PRRS.

Таблица 6

+++ = Существенно положительное

++ = Умеренно положительное

+ = Слегка положительное

Пример 14. Получение стабильных клеточных линий BHK21, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pCMV-susCD163v1.

Клетки BHK-21 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия и антибиотиками. Для трансфекции клетки засевали приблизительно при 90% конфлюэнтности в 6-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37 °С в 5% CO ₂ . Клетки трансфицировали ДНК pCMV-susCD163v1 с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Через сутки после трансфекции клетки подвергали трипсинизации и повторно засевали в 96-луночные планшеты в сериях разведений. Для отбора стабильных трансфектантов с этого момента среды дополняли 1 мг/мл генетицина (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027). Среду меняли каждые 3-5 суток. Планшеты культивировали до тех пор, пока лунки с колониями, происходящими из одной клетки, не достигали конфлюэнтности, после чего планшеты подвергали трипсинизации и засевали в дупликатные 96-луночные планшеты. Один из двух 96-луночных планшетов инфицировали изолятом P129 PRRSV, и клоны, пермиссивные к инфицированию, идентифицировали путем окрашивания FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17. Положительные клоны затем наращивали из второго дупликатного планшета. Для обеспечения гомогенности положительные культуры подвергали клонированию из одной клетки путем лимитирующего разведения. При каждом клонировании субклоны, которые демонстрировали устойчивый рост и высокую пермиссивность в отношении PRRSV, отбирали для наращивания. Выбрали три клона, обозначенные BHK/CMV/v1 #3, BHK/CMV/v1 #5 и BHK/CMV/v1 #12 (фиг. 6). Эти клеточные линии поддерживали пермиссивный фенотип в течение 20 пассажей.

Пример 15. Получение стабильных клеточных линий BHK21, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pRSV-susCD163v1.

Клетки BHK-21 выращивали, как описано в примере 14. Клетки BHK-21 трансфицировали плазмидой pRSVsusCD163v1 с использованием липофектамина 2000, как описано в примере 14. Клонирование трансфицированных клеток и скрининг пермиссивных клонов осуществляли, по существу, как описано в примере 14. В результате исходного клонирования 3 клона были идентифицированы как пермиссивные и затем повторно клонированы еще дважды для обеспечения гомогенности и с целью выделения субклонов с более высокой пермиссивностью (смотри фиг. 7). Полученные клеточные линии названы BHK/RSV/v1, #2, #3 и #4. Все эти клоны поддерживали пермиссивный фенотип на самом высоком тестированном пассаже (пассаж 11 для клона #2, пассаж 7 для клона #3 и пассаж 5 для клона #4).

Пример 16. Получение стабильных клеточных линий почки кошки, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pCMV-susCD163v1.

Родительские клетки почки кошки из Norden Labs (NLFK) выращивали при 37 °С и 5% CO ₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Invitrogen, кат. № 11965-092), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия и антибиотиками. Каждую из нескольких 35 мм лунок, содержащих приблизительно 2 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 4 мкг на лунку pCMV-susCD163v1, в OptiMEM, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), разведенный в среде, и засевали в три 96-луночных планшета при трех плотностях (приблизительно 2 ×10 ² , 2 ×10 ³ и 2 ×10 ⁴ клеток на лунку). Клеткам давали возможность осесть в течение ночи при 37 °С перед началом селекции стабильных трансформантов. На следующее утро среду заменяли на 100 мкл/лунку свежей среды, содержащей 500 мкг/мл генетицина (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) для селекции клеток, экспрессирующих ген устойчивости к неомицину. Среду меняли каждые 2 или 3 дня для поддержания эффективности генетицина. После 19 суток селекции 96-луночный планшет с самой низкой исходной плотностью клеток (приблизительно 200 клеток/лунку) содержал 70 пустых лунок и 26 лунок с одной или более колониями клеток, устойчивых к G418 (рассчитанное количество устойчивых клеток/лунку составляло 0,3 с использованием распределения Пуассона). Эти 26 лунок разделяли на две параллели и клеткам давали возможность осесть в течение ночи. Один ряд лунок инфицировали изолятом P129 PRRSV, инкубировали в течение 24 ч, затем фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc), специфическим в отношении нуклеокапсида PRRSV. Из 26 клонов 8 содержали несколько клеток, инфицированных PRRSV. Один из них, обозначенный "NLFK-CMV-susCD163v1-G4", был явно более пермиссивным, чем другие, с почти 100% клеток, положительно окрашенных на вирусный антиген.

После пятого пассажа клеток имелось некоторое доказательство фенотипической гетерогенности клеточной линии NLFK-CMV-susCD163v1-G4. Поэтому клетки клонировали по одной клетке путем лимитирующего разведения в среде, содержащей G418, начиная с замороженной исходной суспензии NLFK-CMV-susCD163v1-G4, пассаж 4. Двенадцать таких клонов ("А"-"L") наращивали для исследования. Из них клоны NLFK-CMV-susCD163v1-G4F и NLFK-CMV-susCD163v1-G4L отличались по их способности образовывать дискретные бляшки (локализованные области CPE) при инфицировании изолятом P129 PRRSV (смотри фиг. 8).

Пример 17. Получение стабильных клеточных линий почки кошки, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pRSV-susCD163v1.

Клетки почки кошки из Norden Labs (NLFK) выращивали при 37 °C и 5% СО ₂ в минимальной питательной среде альфа (Invitrogen, кат. № 12571-071), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотиками. Клетки NLFK засевали в 6-луночные планшеты приблизительно при 90% конфлюэнтности и давали возможность прикрепляться в течение ночи. Клетки затем трансфицировали плазмидой pRSV-susCD163v1 с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Через 24 ч клетки клонировали, как описано в примере 14. Скрининг клонов клеток, пермиссивных в отношении PRRSV, осуществляли, как описано в примере 14. В результате скрининга выбрали четыре клона и клонировали путем лимитирующего разведения еще дважды. Отбирали четыре клона, названные FK/RSV/v1 #1, FK/RSV/v1 #2, FK/RSV/v1 #3 и FK/RSV/v1 #4. Эти клеточные линии поддерживали фенотип, пермиссивный в отношении PRRSV, в течение по меньшей мере 8 пассажей (смотри фиг. 9).

Пример 18. Получение стабильных клеточных линий почки свиньи, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pCMV-susCD163v1.

Родительские клетки почки свиньи (PK032495) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Каждую из лунок (35 мм) с тканевой культурой, содержащей приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку плазмиды pCMV-susCD163v1 в DMEM без FBS или антибиотиков с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки промывали PBS и удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), и разбавляли в ростовой среде, содержащей генетицин (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) в количестве 1,0 мг/мл, и засевали в 96-луночные планшеты при различных плотностях для обеспечения получения одноклеточных клонов после селекции генетицином. При селекции генетицином среды меняли приблизительно каждые 3-5 суток. После селекции лунки, содержащие одноклеточные клоны, выращивали в дупликатных 96-луночных планшетах и инкубировали до достижения 100% конфлюэнтности. Один ряд лунок скринировали на пермиссивность в отношении PRRSV путем инфицирования изолятом P129 PRRSV в течение минимум 48 ч. Было обнаружено, что одиннадцать клонов являются пермиссивными в отношении PRRSV. Один из них, обозначенный "PK-CMV-susCD163v1-A10", явно поддерживал пермиссивный фенотип после множества пассажей (смотри фиг. 10).

Пример 19. Получение стабильных клеточных линий BHK21, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pCMVScript-susCD163v2.

Родительские клетки почки детенышей хомячка (BHK21) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Каждую из лунок (35 мм) с тканевой культурой, содержащей приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку pCMVScript-susCD163v2, в DMEM без FBS или антибиотиков, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки промывали PBS и удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), и разбавляли в ростовой среде, содержащей генетицин (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) в количестве 1,0 мг/мл, и засевали в 96-луночные планшеты при различных плотностях для обеспечения получения одноклеточных клонов после селекции генетицином. При селекции генетицином среды меняли приблизительно каждые 3-5 суток. После селекции лунки, содержащие одноклеточные клоны, выращивали в дупликатных 96-луночных планшетах и инкубировали до достижения 100% конфлюэнтности. Один ряд лунок скринировали на пермиссивность в отношении PRRSV путем инфицирования изолятом P129 PRRSV и инкубации в течение минимум 48 ч. Было обнаружено, что три клона являются пермиссивными в отношении PRRSV и один из них, обозначенный "BHK-CMVScript-susCD163v2-A9", был выбран для дальнейшего исследования (смотри фиг. 11).

Пример 20. Получение стабильных клеточных линий BHK-21, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pRSV-susCD163v2.

Клетки BHK-21 культивировали, как описано в примере 14. Клетки BHK-21 трансфицировали конструкцией ДНК pRSV-susCD163v2, описанной в примере 5, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Последующее клонирование и селекцию клеточных линий, пермиссивных в отношении PRRSV, осуществляли, как описано в примере 14. Из 336 скринированных одноклеточных клонов 129 были положительными. Несколько из этих клеточных клонов пассировали до 7 раз и они поддерживали фенотип, пермиссивный в отношении PRRSV (смотри фиг. 12). Эти клеточные линии названы BHK/RSV/v2 с последующим цифровым номером клона.

Пример 21. Получение стабильных клеточных линий почки свиньи, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pCMVScript-susCD163v2.

Родительские клетки почки свиньи (PK032495) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Каждую из лунок (35 мм) с тканевой культурой, содержащей приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трасфицировали 2 мкг на лунку pCMVScript-susCD163v2 в DMEM без FBS или антибиотиков, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки промывали PBS и удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), и разбавляли в ростовой среде, содержащей генетицин (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) в количестве 1,0 мг/мл, и засевали в 96-луночные планшеты при различных плотностях для обеспечения получения одноклеточных клонов после селекции генетицином. При селекции генетицином среды меняли приблизительно каждые 3-5 суток. После селекции лунки, содержащие одноклеточные клоны, выращивали в дупликатных 96-луночных планшетах и инкубировали до достижения 100% конфлюэнтности. Один ряд лунок скринировали на пермиссивность путем инфицирования изолятом P129 PRRSV и инкубации в течение минимум 48 ч. Один из клонов, обозначенный "PK-CMVScript-susCD163v2-D1", демонстрировал фенотип, пермиссивный в отношении PRRSV.

Пример 22. Получение стабильных клеточных линий BHK21, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pcDNA3.1D-humCD163v2.

Родительские клетки почки детенышей хомячка (BHK21) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Каждую из лунок (35 мм) с тканевой культурой, содержащей приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку pcDNA3.1D-humCD163v2 в DMEM без FBS или антибиотиков, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки промывали PBS и удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), и разбавляли в ростовой среде, содержащей генетицин (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) в количестве 1,0 мг/мл, и засевали в 96-луночные планшеты при различных плотностях для обеспечения получения одноклеточных клонов после селекции генетицином. При селекции генетицином среды меняли приблизительно каждые 3-5 суток. После селекции лунки, содержащие одноклеточные клоны, выращивали в дупликатных 96-луночных планшетах и инкубировали до достижения 100% конфлюэнтности. Один ряд лунок скринировали на пермиссивность путем инфицирования изолятом P129 PRRSV и инкубации в течение минимум 48 ч. Было обнаружено, что семь кандидатных клонов являются пермиссивными в отношении PRRSV. Существует некоторое доказательство фенотипической гетерогенности в каждом из семи кандидатных клонов, возможно потому, что они не были клонированы. Поэтому кандидатные клоны подвергали одноклеточному клонированию путем лимитирующего разведения в среде, содержащей G418. Один из полученных одноклеточных клонов, обладающий явной пермиссивностью в отношении PRRS, обозначен BHK-cDNA3.1D-humCD163v2-H9.

Пример 23. Получение стабильных клеточных линий почки кошки, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pcDNA3.1D-humCD163v2.

Родительские клетки почки кошки из Norden Labs (NLFK) выращивали при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Каждую из лунок (35 мм) с тканевой культурой, содержащей приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку pcDNA3.1D-humCD163v2 в DMEM без FBS или антибиотиков, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки промывали PBS и удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), и разбавляли в ростовой среде, содержащей генетицин (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) в количестве 500 мкг/мл, и засевали в 96-луночные планшеты при различных плотностях для обеспечения получения одноклеточных клонов после селекции генетицином. При селекции генетицином среды меняли приблизительно каждые 3-5 суток. После селекции лунки, содержащие одноклеточные клоны, выращивали в дупликатных 96-луночных планшетах и инкубировали до достижения 100% конфлюэнтности. Один ряд лунок скринировали на пермиссивность путем инфицирования изолятом P129 PRRSV и инкубации в течение минимум 48 ч. Было обнаружено, что пять клонов являются пермиссивными. Один из клонов, обозначенный "FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6", явно демонстрировал пермиссивный фенотип (смотри фиг. 13).

Родительские клетки NLFK и один субклон FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6 проверяли в отношении экспрессии CD163. Клетки фиксировали в 80%-ном ацетоне и подвергали реакции с антителами козы к CD163 человека (R &D System в 1:200) в течение одного часа с последующей промывкой PBS. Для визуализации использовали FITC-конъюгированные IgG осла к антителам козы (Biodesign Inc. в 1:100). В родительских клетках NLFK не было обнаружено никакой специфической флуоресценции, как показано на фиг. 21A. Большинство субклонов FK.A6.A2 продемонстрировали хорошее флуоресцентное окрашивание, указывающее на присутствие CD163 (фиг. 21В).

Пример 24. Получение стабильных клеточных линий почки свиньи, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pcDNA3.1D-humCD163v2.

Родительские клетки почки свиньи (PK032495) были получены от Pfizer Inc. и выращивались при 37 °С и 5% СО ₂ в ростовой среде, состоящей из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, кат. № 11965), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и антибиотиками. Каждую из лунок (35 мм) с тканевой культурой, содержащей приблизительно 1 ×10 ⁶ клеток, трансфицировали 2 мкг на лунку pcDNA3.1D-humCD163v2 в DMEM без FBS или антибиотиков, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, кат. № 11668-027) согласно инструкциям производителя. После инкубации в течение ночи клетки промывали PBS и удаляли с субстрата, используя Accutase (Innovative Cell Technologies, кат. № AT104), и разбавляли в ростовой среде, содержащей генетицин (G418 сульфат, Invitrogen, кат. № 10131-027) в количестве 1,0 мг/мл, и засевали в 96-луночные планшеты при различных плотностях для обеспечения получения одноклеточных клонов после селекции генетицином. При селекции генетицином среды меняли приблизительно каждые 3-5 суток. После селекции лунки, содержащие одноклеточные клоны, выращивали в дупликатных 96-луночных планшетах и инкубировали до достижения 100% конфлюэнтности. Один ряд лунок скринировали на пермиссивность путем инфицирования изолятом P129 PRRSV и инкубации в течение минимум 48 ч. Было обнаружено, что два клона являются пермиссивными. Один из клонов, обозначенный "PK-cDNA3.1D-humCD163v2-B11", явно демонстрировал фенотип, пермиссивный в отношении PRRSV.

Пример 25. Получение стабильных клеточных линий почки кошки, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием лигированной pRSV-Script MARC CD163v2.

Разработали не основанный на клонировании способ получения микрограммовых количеств линейной ДНК, подходящей для применения в получении стабильных клеточных линий, экспрессирующих CD163 с промотора RSV (фиг. 4). Похожий способ адаптировали для размещения CD163v2 обезьяны из клеток MARC-145 за промотором RSV. В способе осуществляют выделение и лигирование двух фрагментов ДНК, один из которых содержит ген неомицина и кассету промотора RSV, происходящую из pRSV-script, а другой содержит последовательность, кодирующую MARC CD163v2 из pCDNA3.1D MARC CD163v2. Векторную плазмиду pRSV-Script линеаризовали с помощью HindIII и KpnI. Сначала плазмиду переваривали KpnI и получали тупые концы с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli. Затем эту плазмиду переваривали HindIII непосредственно ниже промотора RSV. Клон pCDNA3.1D MARC CD163v2 переваривали в векторной последовательности ниже вставки CD163 с помощью EcoRV и HindIII - выше CD163. Последовательность, кодирующую CD163, высвобождали из вектора. Для каждого переваривания плазмиды соответствующие фрагменты очищали из агарозных гелей. Крупномасштабную реакцию лигирования осуществляли следующим образом. Приблизительно 20 мкг каждого фрагмента ДНК инкубировали в объеме 600 мкл с 15 единицами ДНК-лигазы Т4. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После лигирования линейный участок ДНК, содержащий все соответствующие элементы, очищали с помощью электрофореза в агарозном геле. Анализ переваривания рестриктазами осуществляли для подтверждения аутентичности каждого лигированного фрагмента. Лигирование двух фрагментов ДНК с помощью липких концов, полученных с помощью HindIII, приводило в результате к размещению 5'-последовательностей гена CD163 MARC ниже промотора RSV, что обеспечивало направленную экспрессию CD163 в клетках млекопитающих. После выделения очищенную ДНК использовали для трансфекции выбранных линий клеток млекопитающих.

Клетки почки кошки из Norden Labs (NLFK) выращивали при 37 °С и 5% СО ₂ в DMEM, дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки и антибиотиками. Клетки NLFK засевали в 6-луночные планшеты приблизительно при 90% конфлюэнтности и давали возможность прикрепиться в течение ночи. Клетки затем трансфицировали лигированной плазмидой pRSV-MARC CD163v2 с использованием липофектамина 2000 согласно инструкциям производителя. Через 24 ч клетки клонировали, как описано в примере 12. Скрининг клеточных клонов, пермиссивных в отношении PRRSV, осуществляли, как описано в примере 12. Один из клонов является положительным к инфицированию PRRSV и обозначен NLFK-MARC CD163 D4. Этот клон D4 поддерживал фенотип, пермиссивный в отношении PRRSV, на протяжении 9 пассажей.

Пример 26. Кинетика роста изолята NVSL 94-3 PRRSV в рекомбинантных клетках BHK-21 и NLFK, стабильно экспрессирующих susCD163v1 с промотора CMV.

Оценивали количества вирусного потомства, продуцируемого клетками BHK-21 или NLFK, инфицированными PRRSV, стабильно сконструированными для экспрессии susCD163v1. Четыре клеточные линии, экспрессирующие susCD163v1, BHK/CMV/susv1 #3, BHK/CMV/susv1 #5, BHK/CMV/susv1 #12 и FK/CMV/susv1 G4 засевали при субконфлюэнтности в 6-луночные планшеты и после инкубации в течение ночи инфицировали изолятом NVSL 94-3 PRRSV. Для сравнения в эксперимент включали клетки MARC-145. Клетки инфицировали вирусом при m.o.i. (множественности заражения) приблизительно 0,1. Вирус абсорбировали в течение 60-90 мин и удаляли. Клетки трижды промывали PBS для удаления оставшегося вируса. Аликвоты объемом один миллилитр отбирали из культур с 12-часовыми интервалами, начиная непосредственно после инфицирования и продолжая в течение 96 ч. К клеткам в различные моменты времени добавляли свежие культуральные среды для поддержания объема культуры, достаточного для предотвращения высыхания клеточного монослоя. Культуральные супернатанты хранили при -80 ° до тех пор, пока не будут собраны все образцы. Количество PRRSV, находящееся в культуральных супернатантах, определяли путем анализа бляшек на клетках MARC-145. На фиг. 14 показано, что все тестируемые рекомбинантные клеточные линии, экспрессирующие CD163, способны продуцировать потомство PRRSV.

Пример 27. Блокирование инфицирования PRRSV антителом к CD163: временно трансфицированные клетки.

Клетки BHK-21, засеянные в 24-луночные планшеты, временно трансфицировали плазмидой pCDNA3.1D-MARC-CD163v2, описанной в примере 8, с использованием липофектамина 2000, как описано в примере 14. После инкубации в течение ночи для обеспечения возможности экспрессии CD163, титр поликлонального антитела козы, специфического в отношении CD163 человека (R &D Systems, кат. № AF1607), в PBS добавляли к клеткам в объеме 100 мкл. В качестве контроля использовали эквивалентные количества нормального IgG козы (R &D Systems, кат. № АВ-108-С). После инкубации в течение одного часа при 37 °С монослои инфицировали приблизительно 1 ×10 ⁷ БОЕ (бляшкообразующие единицы) рекомбинантного штамма P129 PRRSV, экспрессирующего GFP. Клеточные монослои с антителом к CD163 и PRRSV инкубировали при 37 °С в течение одного часа, после чего смесь вирусный инокулят/антитело удаляли, клеточный монослой один раз промывали PBS и в лунки добавляли 1 мл ростовой среды. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37 °C для обеспечения возможности PRRSV-направленной экспрессии GFP. Для анализа клетки подвергали трипсинизации, ресуспендировали в 500 мкл PBS и анализировали с помощью проточной цитометрии для подсчета PRRSV-инфицированных клеток через экспрессию GFP. Для проточной цитометрии неинфицированные клетки BHK-21 использовали для установки базового уровня для флуоресцентной детекции и приблизительно 100000 клеток анализировали из каждого последующего образца. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 15, показывают, что антитело, специфическое в отношении CD163, способно значительно уменьшать количество инфицированных клеток по сравнению с клетками, инкубированными с нормальным IgG козы.

Пример 28. Блокирование инфицирования PRRSV с помощью антитела к CD163: стабильно трансфицированные клетки.

Клетки NLFK, которые стабильно экспрессируют CD163 человека (FK-cDNA3.1D-humCD163v2-A6), описанные в примере 23, засевали в 24-луночные планшеты. После того, как клеткам давали возможность прикрепляться в течение ночи, титр поликлонального антитела козы, специфического в отношении CD163 человека (R &D Systems, кат. № AF1607), в PBS добавляли к клеткам в объеме 100 мкл. В качестве контроля использовали эквивалентные количества нормального IgG козы (R &D Systems, кат. № АВ-108-С). Во время инкубации в течение одного часа при 37 °C монослои инфицировали с помощью приблизительно 1 ×10 ⁷ БОЕ рекомбинантного штамма P129 PRRSV, экспрессирующего GFP. Клеточные монослои с антителом к CD163 и PRRSV инкубировали при 37 °С в течение одного часа, после чего смесь вирусный инокулят/антитело удаляли, клеточный монослой однократно промывали PBS и в лунки добавляли 1 мл ростовой среды. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37 °C для обеспечения возможности PRRSV-направленной экспрессии GFP. Для анализа клетки подвергали трипсинизации, ресуспендировали в 500 мкл PBS и анализировали с помощью проточной цитометрии для подсчета клеток, инфицированных PRRSV, через экспрессию GFP. Приблизительно 100000 клеток анализировали из каждого образца. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 16, продемонстрировали, что антитело, специфическое в отношении CD163, способно значительно уменьшать количество инфицированных клеток при сравнении с клетками, инкубированными с нормальным IgG козы.

Пример 29. Получение стабильных клеточных линий почки свиньи, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pRSV-susCD163v2.

Клетки почки свиньи (PK032495) культивировали, как описано в примере 21. Для трансфекции клетки засевали в 24-луночный планшет при 80% конфлюэнтности и давали возможность восстановиться в течение ночи. Трансфекцию лигированной ДНК pRSV-susCD163v2, описанной в примере 5, осуществляли с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Последующее клонирование и селекцию клеток, пермиссивных в отношении PRRSV, осуществляли, по существу, как описано в примере 14. Первоначальное клонирование путем лимитирующего разведения не позволило получить клоны, происходящие из одной клетки, поэтому 5 лунок с клетками, пермиссивными в отношении PRRSV, повторно клонировали путем лимитирующего разведения с получением клональных клеточных линий. Десять клонов были выбраны для дальнейшего исследования и один из этих клонов, PK-RSVScript-susCD163v2 #9, продемонстрировал способность поддерживать очаговый рост PRRSV непосредственно после инфицирования (смотри фиг. 18).

Пример 30. Получение стабильных клеточных линий почки кошки, пермиссивных в отношении PRRSV, с использованием pRSV-susCD163v2.

Клетки почки кошки NLFK культивировали, как описано в примере 17. Для трансфекции клетки высевали приблизительно при 80% от максимальной плотности в 24-луночные планшеты. После инкубации в течение ночи монослои трансфицировали RSV/susCD163v2, полученным путем лигирования (смотри пример 5), с использованием липофектамина согласно инструкциям производителя. Клонирование трансфицированных клеток и селекцию клеточных клонов, пермиссивных в отношении PRRSV, осуществляли, по существу, как описано в примере 14. Из 67 клеточных клонов, протестированных на пермиссивность в отношении PRRSV, было обнаружено, что 20 являются положительными. Пример наблюдаемого окрашивания представлен в примере 19.

Пример 31. Пассаж изолята Р201 PRRSV в клетках PK-RSVScript-susCD163v2.

Амплификацию клинического изолята PRRSV осуществляли следующим образом. Периферические альвеолярные макрофаги (РАМ) высевали в концентрации 5,4Е6 клеток на 10 см ² в 6-луночную чашку с использованием сред OptiMEM, дополненных 2% FBS. Через 6 ч среды удаляли и к клеткам добавляли 2 мл аликвоту сыворотки, взятой у свиньи, инфицированной PRRSV. После абсорбции в течение 90 мин сывороточный инокулят удаляли и замещали OptiMEM. Приблизительно через 40 мин после инфицирования супернатант собирали и осветляли с помощью центрифугирования в течение 10 мин. Супернатант непосредственно использовали для инфицирования клеток клона #9 PK-RSVScript-susCD163v2, используя адсорбцию в течение 6 ч. После удаления инокулята клетки повторно погружали в D-MEM. Вирус Р201 последовательно пассировали на клеточной линии #9 PK-RSVScript-susCD163v2, используя поочередно инфицированные клетки и бесклеточные супернатанты. Авторы изобретения обнаружили, что для эффективного размножения вируса клетки должны быть засеяны с 50-70% конфлюэнтности за день до инфицирования с использованием колб с клетками, которые поддерживали на субконфлюэнтном уровне. В соответствии с процессом инфицирования каждый пассаж повторяли во множестве лунок с идентично инфицированными клетками и каждый день одну из лунок фиксировали ацетоном и окрашивали FITC-меченным моноклональным антителом SDOW17. Если процент инфицированных клеток составлял не больше 50% и значительного прогресса развития очагов по сравнению с предшествующими днями наблюдения не наблюдали, клетки в эквивалентной лунке подвергали трипсинизации и пересевали во множество свежих лунок. Эти пассажи инфицированных клеток типично осуществляли в соотношении 1:4 и иногда они включали добавление эквивалентного количества клеток из неинфицированной культуры. Альтернативно, если окрашивание SDOW17 выявляло, что очаги инфицированных клеток размножаются в достаточной степени, составляя более 50% от общего количества клеток, то бесклеточные супернатанты собирали и использовали для инфицирования множества лунок с свежезасеянными клетками (фиг. 20). После 11 пассажей не было необходимости в промежуточных клеточных пассажах, поскольку вирус обладал способностью расти до достижения достаточного титра, необходимого для последующего бесклеточного пассирования вируса в супернатанте.

Пример 32. Отбор различных CD163 клеточных линий на пермиссивность в отношении различных европейских и североамериканских изолятов PRRSV.

Различные трансгенные CD163 клеточные линии оценивали на пермиссивность в отношении мало пассируемых европейских и североамериканских изолятов PRRSV (смотри табл. 7). Трансгенные CD163 клеточные линии, описанные в ранее приведенных примерах, включали NLFK-MARC CD163 D4, PK-RSVScript-susCD163v2clone #9 и PK-CMV-susCD163v1-A10. Каждую CD163 клеточную линию вместе с клеточной линией MARC-145, родительской клеточной линией почки кошки, родительской клеточной линией почки свиньи (служащих в качестве контролей) засевали в 96-луночные культуральные планшеты. Ростовые среды удаляли из монослоев и инокулировали с помощью 0,1 мл на лунку каждого изолята PRRSV. На 3 сутки после инфекции планшеты фиксировали 80%-ным ацетоном и окрашивали FITC-конъюгированным моноклональным антителом SDOW17 (Rural Technologies Inc.), специфическим в отношении нуклеокапсида. Результаты анализа с флуоресцентными антителами (FA) представлены в табл. 7.

Таблица 7

^а Все изоляты PRRSV являются североамериканскими, за исключением EU98V226, который

представляет собой европейский изолят.

Пример 33. Форбол-12-миристат-13-ацетатная (PMA) индукция CD163 делает клетки U937 человека пермиссивными к инфицированию PRRSV.

Клетки U937 человека, полученные из ATCC (CRL-1593.2), размножали в среде RPMI, содержащей сыворотку и добавки согласно спецификации ATCC. Известно, что эти клетки экспрессируют CD163 при активации обработкой PMA (Gronlund et al., 2000). Клетки U937 засевали в двух параллелях в лунки 6-луночного планшета. Один ряд лунок обрабатывали 100 нг/мл PMA, а другой ряд не обрабатывали. Через трое суток после стимуляции PMA одну лунку из каждого ряда инфицировали изолятом P129 PRRSV. Другую лунку из каждого ряда фиксировали и окрашивали на экспрессию CD163 в непрямом иммунофлуоресцентном антительном анализе с использованием антител козы к CD163 человека (R &D System) и FITC-конъюгированного IgG осла к антителу козы (BioDesign International).

Необработанные клетки U937 продолжали делиться до высокой плотности через 3 суток после первоначального посева. Клетки U937, обработанные PMA, прекращали делиться, увеличивались и прикреплялись к поверхности культуральных лунок. Небольшая фракция необработанных клеток U937 положительно окрашивалась на CD163, тогда как почти все РМА-обработанные U937 были положительными на окрашивание CD163. В необработанных клетках U937 не наблюдали клеток, инфицированных PRRSV. Тем не менее, сотни клеток U937, обработанных PMA, становились инфицированными PRRSV. Это демонстрирует, что непермиссивные клетки могут стать пермиссивными к инфицированию PRRSV после химической индукции экспрессии CD163.

Дополнительные особенности и варианты изобретения будут очевидны специалистам в данной области из этой заявки на изобретение, рассматриваемой во всей ее полноте, включая подробное описание, и все такие признаки рассматриваются в качестве аспектов изобретения. Аналогично, описанные здесь признаки изобретения могут быть перегруппированы в дополнительных воплощениях, которые также рассматриваются в качестве аспектов изобретения, независимо от того, упоминается ли выше конкретно комбинация признаков в качестве аспекта или воплощения изобретения. Кроме того, в качестве ограничений должны рассматриваться только такие ограничения, которые описаны здесь в качестве критических для изобретения; варианты изобретения, лишенные ограничений, которые не описаны здесь в качестве критических, предложены в качестве аспектов изобретения.

Понятно, что изобретение может использоваться на практике иначе, чем как описано, в частности, в предшествующем описании и примерах.

Многочисленные модификации и варианты настоящего изобретения возможны в свете вышеприведенных аспектов и, таким образом, находятся в пределах объема защиты изобретения.

Полное описание всех процитированных в данном описании публикаций включено в данное описание посредством ссылки в той степени, в которой они согласуются с приведенным здесь описанием.

Перечень последовательностей