EA 013057B1 20100226

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000013057b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Настоящее изобретение относится к N-ацильным производным аминокислот общей формулы (I)

где n равно 2 или 3; и R ₁ представляет

или их фармацевтически приемлемым солям, к новым способам их получения, их применению в качестве противоаллергических, антианафилактических, противовоспалительных и гиполипидемических средств, а также к фармацевтической композиции, содержащей указанные соединения в эффективном количестве и способу лечения аллергических и воспалительных заболеваний и нарушений липидного обмена: бронхиальной астмы, аллергического ринита, поллинозов, сезонного и круглогодичного ринита, аллергического воспаления легких, атопического дерматита, псориаза, крапивницы, аллергических (в том числе анафилактических) реакций на укусы насекомых и лекарственные препараты, холодовой аллергии, аллергического конъюнктивита, атеросклероза, ожирения, ишемической болезни сердца и головного мозга, инфаркта миокарда, инсульта.

Формула

[0001] N-Ацильные производные аминокислот общей формулы (I)

[0002] Соединение по п.1, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой моно- или динатриевую соль.

[0003] Способ получения N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I)

[0004] Способ получения N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I)

[0005] Фармацевтическая композиция, обладающая противоаллергической, антианафилактической,

[0006] Применение N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I)

[0007] Применение N-ацильных производных аминокислот, определенных в п.6, для получения лекарственного средства для снижения антигензависимой секреции гистамина, дегрануляции базофилов, а также регулирования содержания эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов.

[0008] Применение N-ацильных производных аминокислот, определенных в п.6, для получения лекарственного средства для облегчения симптомов бронхиальной астмы, аллергического ринита, поллинозов, сезонного и круглогодичного ринита, аллергического воспаления легких, атопического дерматита, псориаза, крапивницы, аллергических (в том числе анафилактических) реакций на укусы насекомых и лекарственные препараты, холодовой аллергии, аллергического конъюктивита.

[0009] Применение N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I)

[0010] Лекарственное средство, обладающее противоаллергической, антианафилактической, противовоспалительной и гиполипидемической активностью, включающее N-ацильные производные аминокислот общей формулы (I)

[0011] Способ лечения аллергических, анафилактических заболеваний, в том числе заболеваний, сопровождающихся воспалением, гиперлипидемией, гиперхолистеринемией, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения общей формулы (I)

[0012] Способ лечения бронхиальной астмы, аллергического ринита, поллинозов, сезонного и круглогодичного ринита, аллергического воспаления легких, атопического дерматита, псориаза, крапивницы, аллергических (в том числе анафилактических) реакций на укусы насекомых и лекарственные препараты, холодовой аллергии, аллергического конъюнктивита, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения общей формулы (I)

[0013] Способ лечения атеросклероза, ожирения, ишемической болезни сердца и головного мозга, инфаркта миокарда, инсульта, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения общей формулы (I)

Полный текст патента

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии и касается N-ацильных производных аминокислот и их фармацевтически приемлемых солей, новых способов синтеза указанных соединений, а также фармацевтических композиций на их основе и применения в медицине в качестве противоаллергических, противовоспалительных и гиполипидемических средств.

Предшествующий уровень техники

Как известно, в настоящее время аллергические заболевания и нарушения липидного обмена весьма распространены вследствие плохой экологической обстановки, изменения структуры питания и образа жизни населения. Поэтому проблема создания лекарственных средств для борьбы с этими патологиями, а также с воспалительными процессами, как правило, сопровождающими аллергию, продолжает оставаться актуальной.

Наиболее распространенной группой противоаллергических препаратов являются блокаторы Н ₁ -гистаминовых рецепторов. В настоящее время выделяют два поколения антигистаминных препаратов [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2005, с.285].

Антигистаминные препараты 1-го поколения проникают через гематоэнцефалический барьер и способны вызывать блокаду Н1-рецепторов клеток центральной нервной системы, что обусловливает их нежелательный седативный эффект. Для достижения выраженного антигистаминного действия необходимы высокие концентрации этих препаратов в крови, что требует назначения их в больших дозах. Отрицательной характеристикой этих препаратов является довольно частое развитие тахифилаксии, влияние на ЦНС, проявляющееся в нарушении координации, головокружении, чувстве вялости, снижении способности концентрировать внимание. Несмотря на вышеуказанное, антигистаминные средства первого поколения по-прежнему применяются, особенно в тех ситуациях, когда необходим очень быстрый эффект от лечения, например при анафилаксии. К антигистаминным препаратам первого поколения относятся димедрол (дифенгидрамин), супрастин (хлорпирамин), тавегил (клемастин), фенкарол (хифенадин).

Антигистаминные препараты 2-го поколения получили в последние годы широкое применение в аллергологической практике, поскольку не обладают побочными эффектами, присущими препаратам 1-го поколения. В частности, препараты 2-го поколения не проникают через гематоэнцефалический барьер, не имеют седативного и снотворного эффектов. Для них характерно быстрое и продолжительное антигистаминное действие. К антигистаминным средствам второго поколения относятся: кларитин (лоратадин), зиртек (цетиризин), кестин (эбастин). Однако проведенные клинические испытания выявили побочные действия и этих препаратов, обусловленные их взаимодействием с другими лекарственными средствами или нарушением их метаболизма цитохромом Р 450. Таким образом, были выявлены потенциально седативные (цетиризин, лоратадин) и потенциально кардиотоксичные (терфенадин, астемизол (эбастин)) эффекты у антигистаминных средств 2-го поколения.

В некоторых случаях, например при бронхиальной астме, применяют глюкокортикостероиды, оказывающие мощное антиаллергическое действие. Однако их применение сопровождается системными проявлениями в виде синдрома Иценко-Кушинга, гипертензии, гипергликемии, остеопороза и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993, т.1, с.565].

Особое значение в развитии аллергических заболеваний имеет патохимическая стадия аллергических реакций, которая в значительной степени определяется степенью активации клеток-мишеней аллергии 1-го порядка (базофилов и тучных клеток). Их важной особенностью является способность к накоплению и высвобождению под действием стимула (аллергена) биологически активных соединений, в первую очередь гистамина. При IgE- и/или IgG-опосредованном ответе на антиген именно эти клетки определяют степень выраженности клинической картины немедленной аллергии [Паркер Ч.В. Медиаторы: высвобождение и функции // В кн.: Иммунология / Под ред. У. Пола. - М.: Мир, 1989, т.3, с.170-247; Chakravarty N.K. // In: The mast cell: Its role in health and disease. ed. J. Pepys, 1979, p.38-46].

Существует группа препаратов (кромогликат-натрия (динатриевая соль кромоглициевой кислоты), кетотифен, оксатомид, применяемых при бронхиальной астме и бронхоспастических состояниях, в основе действия которых лежит способность тормозить дегрануляцию тучных клеток и задерживать высвобождение из них медиаторных веществ, способствующих развитию бронхоспазма, аллергии и воспаления (брадикинина, гистамина). В качестве побочных эффектов могут наблюдаться раздражение слизистых оболочек, головная боль, отек гортани, кашель, удушье [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2005, с.297].

Известно, что наиболее частым проявлением атеросклероза является ишемическая болезнь сердца, стоящая на первом месте в ряду причин смертности взрослого населения планеты. Одним из ведущих нарушений при данном заболевании признано нарушение липидного обмена, выражающееся в повышении содержания в плазме крови холестерина, в том числе в составе липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП), получивших название "атерогенных", с одновременным снижением количества "антиатерогенных" липопротеинов высокой плотности (ЛПВП).

Показано, что изменение содержания и соотношения липидов в плазме отражает их изменение в мембранных структурах паренхиматозных органов. Состав мембран клетки, например микросомальных, прямо зависит от состава рациона экспериментальных животных [Wade A., Harred W. // Feder. Proct., 1976, vol. 55, p.2475-2479]. Введение животным холестерина вызывает накопление его в мембранах клеток, уменьшая текучесть, что, в свою очередь, приводит к изменению функционального состояния ферментов [Buters J.T.M., Zysset Т., Reichen J. // Biochem. Pharmacol., 1993, vol. 46, Iss 6, p.983-991].

Гиполипидемические средства, снижающие содержание холестерина и триглицеридов в крови, могут применяться для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями липидного обмена. Последние характеризуются повышением содержания триглицеридов, общего холестерина (ХС), холестерина в составе липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП) и снижением содержания холестерина в составе липопротеинов высокой плотности при таких заболеваниях, как атеросклероз, ожирение, ишемическая болезнь сердца и головного мозга, инфаркт миокарда, инсульт, и которые служат фактором риска манифестации сахарного диабета и тромбообразования.

Известно клиническое применение так называемых статинов, ингибиторов биосинтеза холестерина, например зокора (симвастатин). Препараты данной группы в дозах 80 мг/день достаточно эффективны, главным образом, в отношении понижения уровня общего холестерина в крови, при этом малодоступны, дороги и представляют собой чужеродные для организма химические соединения. Кроме того, их применение может сопровождаться побочными эффектами: изменением функций печени с повышением уровня трансаминаз в крови, диспепсией [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993, т.1, с.463].

В связи с указанным выше актуальным является поиск новых эффективных противоаллергических и гиполипидемических средств с альтернативными механизмами действия, способных проявлять активность в низких концентрациях и лишенных побочных эффектов. В этом отношении особый интерес представляют соединения, включающие остатки веществ природного происхождения, так как для них можно прогнозировать более низкую токсичность и частоту побочных эффектов.

В публикации международной заявки WO 99/01103 описано противоаллергическое и гиполипидемическое действие N-ацильных производных биогенных аминов, например γ-глутамилгистамина и его ближайшего аналога глутарилгистамина, которые наиболее близки по структуре и действию к заявляемым соединениям. В статье Кржечковская В.В., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. и др. Изучение антианафилактической активности и механизмов действия γ-L-глутамилгистамина // Патогенез, 2003, т.1, №2, с.60-64 показано, что γ-глутамилгистамин обладает выраженной антианафилактической активностью при использовании различных видов животных и способов введения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в тучных клетках животных под действием γ-глутамилгистамина достоверно снижается содержание гистамина и его антиген-стимулированная секреция. В тесте по исследованию влияния глутарилгистамина на выраженность антиген-индуцированного бронхоспазма было показано снижение величины бронхоспазма более чем на 50% по сравнению с контролем. Данный эффект проявлялся как при пероральном, так и интратрахеальном способе его введения в низкой дозе - 50 мкг/кг. Глутарилгистамин обладает способностью снижать проявления пассивной кожной анафилаксии. В WO 99/01103 показано, что при введении животным глутарилгистамина в дозах 50 и 500 мкг/кг было продемонстрировано достоверное снижение интенсивности гиперчувствительности замедленного типа. Кроме того, глутарилгистамин в дозах 50 и 500 мкг/кг обладал также некоторой антихолестеринемимической активностью, снижая содержание общего холестерина по сравнению с животными с атерогенной нагрузкой на 5-7%.

Недостатком глутарилгистамина является его сравнительно высокая стоимость и малая доступность исходного сырья для его получения - гистамина. Кроме того, указанное вещество недостаточно эффективно в вышеперечисленных тестах.

С целью расширения арсенала технических средств и создания более эффективного и доступного противоаллергического, противовоспалительного и гиполипидемического средства, авторами изобретения были выявлены некоторые специфические N-ацильные производные аминокислот общей формулы (I), раскрытой в публикации международной заявки WO 99/01133, но конкретно в ней не описанные, не полученные и не охарактеризованные, за исключением глутарил-L-гистидина метилового эфира (XII).

Так, под общую формулу (I) вышеуказанной международной заявки подпадают соединения настоящего изобретения. Однако в указанной публикации не приведены ни конкретные структурные формулы данных соединений, ни какие-либо физико-химические характеристики, а также не описаны способы их получения. Соединения настоящего изобретения подпадают под общую структурную формулу соединений, раскрытых в публикации международной заявки WO 03/072124, обладающих индуцирующим дифференцировку клеток действием. Однако в данной публикации не описан способ их синтеза и не приведены какие-либо физико-химические константы.

Одно из соединений глутарилгистидин упоминается только в виде метилового эфира по С-концу His [Glt-His(OMe) (XII)] в патенте США 3963691, в качестве промежуточного соединения в синтезе пептида Glt-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-poly-Lys. Кроме того, в публикации международной заявки WO 99/01133 описан синтез глутарил-L-гистидина метилового эфира (XII) и приведены физико-химические характеристики: данные ¹ Н-ЯМР-, масс-спектрометрии, ВЭЖХ.

Соединение сукцинилгистидин упоминается в публикации международной заявки WO 93/04690. В этой публикации указано, что добавление свободного имидазола или сукцинилгистидина ускоряет взаимодействие карнозина с дигидроксиацетоном. Методики синтеза сукцинилгистидина и его физико-химические константы не приведены.

Структурная формула сукцинилтриптофана упоминается в заявке США № 2005079515. В указанной публикации ни методики синтеза сукцинилтриптофана, ни его физико-химические константы не приведены.

В Бюллетене экспериментальной биологии и медицины, 1998, т.125, №5, с.544-547 раскрыта дикалиевая соль N-сукцинил-d,l-триптофана, обладающая противоаритмической и противофибриллярной активностью, которая оказывает антиишемическое и антигипоксическое действие, стабилизирует показатели гемодинамики при острой ишемии миокарда.

В Justus liebigs annalen der chemie, 1966, Band 691, р.159-164 описан рацемический сукцинилтриптофан.

В Tetrahedron, 2005, v.61, №4, p.919-926 приведены физико-химические характеристики сукцинил-L-триптофана и сукцинил-D-триптофана. Какие-либо сведение об их биологической активности отсутствуют.

В статье Joseph R. Votano et al. Inhibition of deoxyhemoglobin S polymerization by biaromatic peptides found to associate with the hemoglobin molecule at a preferred site, Biochemistry, 1977, v.16, №25, p.5484-5491 упомянут сукцинил-L-триптофан и изучена его способность связываться с деоксигемоглобином.

В статье Dongmei H., Chao W., Ming Z., Shiqi P. Synthesis and analgesic activity of N,N'-dicarbonyltryptamines. Prep. Biochem. & Biotechnol., 2000, V.30(3), p.231-240 описан синтез N α-сукцинил-L-триптофана метилового эфира (XI), исходя из метилового эфира триптофана и янтарного ангидрида в присутствии диметиламинопиридина, с последующей хроматографической очисткой целевого продукта. N α-Сукцинил-L-триптофан метилового эфира (XI) охарактеризован физико-химическими данными: ¹ Н-ЯМР-, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, температурой плавления и данными элементного анализа.

Глутарил-L-триптофан метиловый эфир (XIII) упоминается в статье Raimondi S., Monti D., Pagnoni U.M., Riva S. Glutaryl acylases: One-reaction enzymes or versatile enantioselective biocatalysts? Adv. Synth. Catal., 2003, V.345(6-7), p.783-789, где приведена только типичная методика синтеза, а из физико-химических констант - данные ¹ Н-ЯМР-спектроскопии. Соединение (XIII) было синтезировано с целью его исследования в качестве субстрата для глутарилацилазы.

Получение N α-глутарил-L-гистамина описано в публикации международной заявки WO 99/01103 и представляет собой N-ацилирование биогенного амина глутаровым ангидридом в среде безводного N,N-диметилформамида. Кроме того, в публикации Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. - Киев: Наукова думка, 1992, с.360 описан способ ацилирования аминокислот в водно-органической, сильно щелочной среде.

В Sorm F., Pravda Z. Proteins and amino acids. X. Synthesis of two peptide analogs. // Chemicke Listy pro Vedu a Prumysl., 1951, V.45, p.423-425 описан способ синтеза сукцинилтирозина этилового эфира в смеси воды и этилацетата при соотношении (1:1), исходя из хлоргидрата этилового эфира тирозина и глутарового ангидрида в присутствии NaHCO ₃ для поддержания слабощелочного рН.

Ацилирование ангидридами дикарбоновых кислот свободного гистидина в литературе не описано.

Целью настоящего изобретения являются новые эффективные N-ацильные производные аминокислот и их фармацевтически приемлемые соли, обладающие противоаллергическим, противовоспалительным и гиполипидемическим действием в низких дозах, и не проявляющие побочных эффектов фармацевтические композиции на их основе, их применение в качестве более эффективных противоаллергических, противовоспалительных и гиполипидемических средств, а также новые способы синтеза N-ацильных производных аминокислот.

Авторами изобретения разработан простой и эффективный способ синтеза соединений общей формулы (I), заключающийся в том, что ангидрид глутаровой или янтарной кислоты в виде твердого вещества прибавляют к водному раствору аминокислоты в отсутствие неорганического и органического основания с получением целевого продукта с достаточно высоким выходом 55-60%.

Авторами изобретения также разработан еще один способ синтеза соединений общей формулы (I), в том числе N-ацильных производных гистидина и триптофана, включающий проведение реакции в двухфазной системе, состоящей из водного раствора гистидина или соли триптофана и раствора ацилирующего агента в подходящем органическом растворителе при использовании избытка ацилирующего агента.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым N-ацильным производным аминокислот общей формулы (I)

где n равно 2 или 3;

R ₁ представляет

a R ₂ =Н, -СН ₃ , -С ₂ Н ₅ ,

и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим противоаллергическим, противовоспалительным и гиполипидемическим действием.

Настоящее изобретение также относится к способу получения N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I) и их солей, включающему прибавление ангидрида глутаровой или янтарной кислоты в виде твердого вещества к водному раствору аминокислоты общей формулы

где R ₁ представляет

и, необязательно, превращение целевого продукта в его соль.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I) и их солей, включающему проведение реакции в двухфазной системе с ангидридом глутаровой или янтарной кислоты в несмешивающемся с водой органическом растворителе с водным раствором аминокислоты общей формулы

где R ₁ представляет

и, необязательно, превращение целевого продукта в его соль.

Настоящее изобретение относится также к применению соединений общей формулы (I) и их фармацевтически приемлемых солей в качестве противоаллергических, противовоспалительных и гиполипидемических средств.

Далее, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции и средству, обладающим противоаллергическим, антианафилактическим и противовоспалительным, и гиполипидемическим действием, содержащим эффективное количество соединения общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, а также, если требуется фармацевтически приемлемый носитель.

Еще одним объектом изобретения является способ лечения аллергических заболеваний, включающих бронхиальную астму, аллергический ринит, поллинозы, сезонный ринит, круглогодичный ринит, атопический дерматит, псориаз, крапивницу, аллергические (в том числе анафилактические) реакции на укусы насекомых и лекарственные препараты, холодовую аллергию, аллергический конъюктивит, хронических обструктивных заболеваний легких, а именно хронического обструктивного бронхита, эмфиземы, облитерирующего бронхита, муковисцидоза, а также заболеваний, связанных с нарушениями липидного обмена: атеросклероз, ожирение, ишемическая болезнь сердца и головного мозга, инфаркт миокарда, инсульт, включающий введение эффективного количества соединения общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

Детальное описание изобретения

Предпочтительные соединения общей формулы (I) представлены в табл. 1.

Таблица 1

Синтез соединений общей формулы (I) может быть осуществлен двумя способами. Первый способ заключается в постепенном добавлении к водному раствору аминокислоты общей формулы

где R ₁ представляет

глутарового или янтарного ангидрида в виде твердого вещества с последующим выделением целевого продукта ионообменной хроматографией, предпочтительно пропусканием реакционной смеси через колонку с катионитом и последующей кристаллизацией из водного раствора. Полученные кристаллы целевого продукта промывают подходящим растворителем, предпочтительно метанолом. Главное преимущество заявляемого способа состоит в отсутствии щелочи в водном растворе аминокислоты, что препятствует инактивации ангидрида дикарбоновой кислоты в результате гидролиза. Кроме того, остаток имидазола в составе молекулы аминокислоты может осуществлять кислотно-основный аутокатализ реакции ацилирования аминогруппы аминокислоты. Достаточно высокие выходы (55-60%) при использовании заявляемого способа достигаются, в частности, благодаря постепенному прибавлению ангидрида дикарбоновой кислоты, взятого в избытке, и интенсивному перемешиванию реакционной массы.

Соединения общей формулы (I) также могут быть получены альтернативным способом в двухфазной системе, включающим добавление ангидрида глутаровой или янтарной кислоты в несмешивающемся с водой органическом растворителе к водному раствору аминокислоты общей формулы

где R ₁ представляет

или

Данный способ позволяет использовать избыток ацилирующего агента, достичь полного ацилирования α-аминогруппы аминокислоты и выхода целевого продукта около 70%. Для поддержания необходимого рН вместо неорганической щелочи используют органическое основание - пиридин, который не гидролизует ангидрид, и, кроме того, как известно, является катализатором ацилирования. Использование пиридина позволяет избежать загрязнения конечного продукта неорганическими солями, которые вместе с продуктом реакции остаются в водном слое. Использованные подходы позволяют упростить отделение целевого продукта от непрореагировавших ангидрида и соответствующей аминокислоты и выделять целевой продукт простой кристаллизацией.

Предпочтительными несмешивающимися с водой органическими растворителями являются бутанол, этилацетат, хлороформ.

Предпочтительными растворителями, используемыми для кристаллизации целевого продукта, являются водно-спиртовые смеси, в частности вода-этанол.

N-Ацилированные производные эфиров аминокислот по изобретению (VI-XIII) можно получить действием соответствующих внутренних ангидридов дикарбоновых кислот на аминосвободные эфиры гистидина или триптофана в органической или водно-органической среде. Предпочтительным является получение соединений VI-XIII в двухфазной системе с использованием несмешивающихся с водой органических растворителей: бутанол, этилацетат, хлороформ.

Соединения общей формулы (I) могут быть также получены в виде фармацевтически приемлемых солей путем взаимодействия, например, с гидроксидом натрия, гидроксидом калия, карбонатом магния, гидроксидом лития, карбонатом кальция рутинными способами, широко описанными в литературе.

Соединения общей формулы (I) обладают противоаллергической, противовоспалительной и гиполипидемической активностью и могут быть использованы для лечения аллергических, анафилактических, в том числе сопровождающихся воспалением заболеваний, а также нарушениями липидного обмена.

В частности, соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения следующих аллергических заболеваний: бронхиальной астмы, аллергического ринита, поллинозов, сезонного ринита, круглогодичного ринита, атопического дерматита, псориаза, крапивницы, аллергических (в том числе анафилактических) реакций на укусы насекомых и лекарственные препараты, холодовой аллергии, аллергического конъюктивита, хронических обструктивных заболеваний легких, а именно хронического обструктивного бронхита, эмфиземы, облитерирующего бронхита, муковисцидоза, а также заболеваний, связанных с нарушениями липидного обмена, таких как атеросклероз, ожирение, ишемическая болезнь сердца и головного мозга, инфаркт миокарда, инсульт.

Соединения настоящего изобретения вводятся в эффективном количестве, которое обеспечивает желаемый терапевтический результат.

Для лечения аллергических заболеваний, включающих бронхиальную астму, аллергический ринит, поллинозы, сезонный ринит, круглогодичный ринит, атопический дерматит, псориаз, крапивницу, аллергические (в том числе анафилактические) реакции на укусы насекомых и лекарственные препараты, холодовую аллергию, аллергический конъюктивит, хронические обструктивные заболевания легких, а именно хронический обструктивный бронхит, эмфизему, облитерирующий бронхит, муковисцидоз, а также заболеваний, связанных с нарушениями липидного обмена, таких как атеросклероз, ожирение, ишемическая болезнь сердца и головного мозга, инфаркт миокарда, инсульт, соединения общей формулы (I) могут быть введены перорально, местно, парентерально, интраназально, ингаляционно и ректально в виде стандартных лекарственных форм, содержащих нетоксичные фармацевтически приемлемые носители. Используемый в настоящем описании термин «парентеральное введение » означает подкожные, внутривенные, внутримышечные или внутригрудные инъекции или вливания.

Соединения настоящего изобретения могут быть введены пациенту в дозах, составляющих от 0,01 до 10 мг/кг веса тела в день, предпочтительно в дозах от 0,05 до 5 мг/кг один или более раз в день.

При этом следует отметить, что конкретная доза для каждого конкретного пациента будет зависеть от многих факторов, включая активность данного используемого соединения, возраст, вес тела, пол, общее состояние здоровья и режим питания пациента, время и способ введения лекарственного средства, скорость его выведения из организма, конкретно используемую комбинацию лекарственных средств, а также тяжесть заболевания у данного индивида, подвергаемого лечению.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат соединение общей формулы (I) в количестве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соединения настоящего изобретения в качестве активного ингредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, интраназального и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмульсий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.

В качестве наполнителей могут быть использованы различные вещества, такие как сахариды, например глюкоза, лактоза или сахароза, манит или сорбит, производные целлюлозы и/или фосфаты кальция, например трикальций фосфат или кислый фосфат кальция, в качестве связующего компонента могут быть использованы такие как крахмальная паста, например кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон. При необходимости могут быть использованы разрыхляющие агенты, такие как вышеупомянутые крахмалы и карбоксиметилкрахмал, поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Могут быть использованы необязательные добавки, такие как агенты, регулирующие текучесть, и смазывающие агенты, такие как диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота и ее соли, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или пропиленгликоль.

Ядро драже обычно покрывают слоем, который устойчив к действию желудочного сока. Для этой цели могут быть использованы концентрированные растворы сахаридов, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, и подходящие органические растворители или их смеси.

В качестве добавок могут быть также использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.

В качестве мазевой основы могут быть использованы углеводородные мазевые основы, такие как вазелин белый и желтый (Vaselinum album, Vaselinum flavum), вазелиновое масло (Oleum Vaselini), мазь белая и жидкая (Unguentum album, Unguentum flavum), а в качестве добавок для придания более плотной консистенции, такие как твердый парафин и воск; абсорбтивные мазевые основы, такие как гидрофильный вазелин (Vaselinum hydrophylicum), ланолин (Lanolinum), кольдкрем (Unguentum leniens); мазевые основы, смываемые водой, такие как гидрофильная мазь (Unguentum hydrophylum); водорастворимые мазевые основы, такие как полиэтиленгликолевая мазь (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), бентонитовые основы и другие.

В качестве основы для гелей могут быть использованы метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол.

В качестве основы для суппозитория могут быть использованы основы, не растворимые в воде, такие как масло какао; основы, растворимые в воде или смешиваемые с водой, такие как желатино-глицериновые или полиэтиленоксидные; комбинированные основы - мыльно-глицериновые.

При приготовлении стандартной лекарственной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьироваться в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства.

Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций содержание активного агента в них составляет 0,01-5%. В качестве разбавителей могут быть использованы 0,9% раствор хлорида натрия, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы, специфические добавки для растворения. При введении в организм соединений настоящего изобретения в виде таблеток и суппозиториев их количество составляет 5,0-500 мг на стандартную лекарственную форму.

Лекарственные формы настоящего изобретения получают по стандартным методикам, таким как, например, процессы смешивания, гранулирования, формирование драже, растворение и лиофилизация.

Следует отметить, что соединения настоящего изобретения проявляют биологическую активность в дозах на два-три порядка ниже по сравнению с известными препаратами, использованными для сравнения, при практически одинаковой эффективности, и для них не выявлено отрицательных побочных действий и не обнаружено противопоказаний к применению. При этом при исследовании токсичности соединений настоящего изобретения в дозе 3000 мг/кг перорально не зарегистрировали гибели экспериментальных животных.

Детальное описание соединений настоящего изобретения, их получения и исследования фармакологической активности представлено в нижеследующих примерах, предназначенных для иллюстрации предпочтительных вариантов изобретения, и не ограничивающими его объем.

Примеры синтеза N-ацильных производных аминокислот общей формулы (I)

Индивидуальность полученных соединений проверялась методом ТСХ на пластинках "Kieselgel 60 F ₂₅₄ " "Merck" (Германия) в системах: метанол (1), хлороформ-метанол-аммиак (4:3:1) (2).

Хроматограммы проявляли хлортолидиновым реактивом, нингидрином, йодом по свечению в УФ-свете.

Углы оптического вращения измеряли на поляриметре "Perkin Elmer 341" (Швеция).

¹ Н-ЯМР регистрировали на приборе "АМХ-400 Bruker" (Германия).

Температуру плавления определяли на приборе "Boetius" (Германия).

Аналитическую ВЭЖХ проводили на приборе "System Gold" ("Beckman", США): скорость элюции 0,25 мл/мин, детекция при 214 нм в условиях: колонка Ultrasphere ODS "Beckman" , 2 ×250 мм, 5 мкм, элюция 0,1%-ной TFA, скорость элюирования 0,25 мл/мин (1); скорость элюции 1 мл/мин, детекция при 220 нм, колонка Luna-5 "Phenomenex", C ₁₈ , 250 ×4,6 мм, элюция 25% ацетонитрила в 0,05 М фосфатном буфере (рН 3,0) (2).

Пример 1. N α-Глутарил-L-гистидин (IV).

Методика А.

К раствору 103,4 г (0,67 моль) гистидина в 400 мл воды добавляют 83,7 г (0,73 моль) глутарового ангидрида. Суспензию перемешивают 1 ч, образующийся раствор упаривают до объема 150 мл, оставляют в холодильнике на 16 ч. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 150 мл метанола и сушат. Очистку проводят ионообменной хроматографией на смоле Пьюролайт в Н ⁺ форме, элюируя водой. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают до начала выпадения осадка и оставляют на 16 ч при +4 °С. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 200 мл метанола и сушат до постоянного веса. Выход 98,8 г (55%). R _f 0,55 (1), 0,37 (2). Т _пл =222-224 °С. [ α] _D ²⁰ + 15,95 ° (С 0,53, вода). [М+Н] ⁺ 270,1. ¹ H-ЯМР спектр (D ₂ O), δ, м.д.: 1,60-1,80 (м, 2Н, β-CH ₂ -Glt), 2,10-2,25 (м, 4Н, α, γ-CH ₂ -Glt), 2,90-3,25 (м, 2Н, β-CH ₂ -His), 4,40-4,50 (м, 1Н, α-CH-His), 7,15 (с, 1Н, CH-4-Im), 8,50 (с, 1Н, CH-2-Im). Найдено, %: С 49,18; Н 5,91; N 15,42. C ₁₁ H ₁₅ N ₃ O ₅ . Вычислено, %: С 49,07; Н 5,62; N 15,61.

Методика Б.

К суспензии 0,3 г (1,93 ммоль) гистидина в 5 мл воды при интенсивном перемешивании добавляют 0,44 г (3,86 ммоль) глутарового ангидрида, растворенного в 2,5 мл этилацетата. Перемешивают 2 ч, пиридином доводят рН до 7 и перемешивают еще 1 ч. Этилацетатный и водный слой разделяют. Водный слой дважды промывают эфиром, эфирный слой отбрасывают. Воду удаляют в вакууме, остаток растворяют в минимальном количестве воды и добавляют этанол до начала выпадения белого осадка, оставляют при +4 °С на 20 ч. Осадок отделяют фильтрованием, сушат в вакууме. Выход 0,36 г (70%). R _f 0,56 (1), 0,35 (2). Т _пл =219-221 °С. [ α] _D ²⁰ =+15,71 ° (С 0,56, вода). [М+Н] ⁺ 270,1. ¹ H-ЯМР спектр (D ₂ O), δ, м.д.: 1,40-1,55 (м, 2Н, β-CH ₂ -Glt), 1,90-2,0 (м, 4Н, α, γ-CH ₂ -Glt), 2,7-3,0 (м, 2Н, β-CH ₂ -His), 4,20-4,30 (м, 1Н, α-CH-His), 6,95 (с, 1Н, 4-CH-Im), 8,30 (с, 1Н, 2-CH-Im). ВЭЖХ в условиях: (1) - индивидуальный пик, время удерживания 14,55 мин. Найдено, %: С 49,07; Н 5,65; N 15,65. C ₁₁ H ₁₅ N ₃ O ₅ . Вычислено, %: С 49,07; Н 5,62; N 15,61.

Пример 2. N α-Сукцинил-L-гистидин (V).

Синтез проводили в соответствии с методикой А, приведенной для соединения IV.

Выход 0,08 г (57%).

R _f 0,44 (1), 0,25 (2).

Т _пл =179-181 °С.

[ α] _D ²⁰ =+30,71 ° (С 0,56, вода).

[М] ⁺ 255,2.

¹ H-ЯМР спектр (D ₂ O), δ, м.д.: 2,15-2,30 (м, 4Н, (СН ₂ ) ₂ -Suc), 2,75-2,95 (м, 2Н, β-CH ₂ -His), 4,25 (уш.с, 1Н, α-CH-His), 6,95 (с, 1Н, 4-CH-Jm), 8,25 (с, 1Н, 2-CH-Jm).

Найдено, %: С 47,09; Н 5,04; N 16,40. C ₁₀ H ₁₃ N ₃ O ₅ . Вычислено, %: С 47,06; Н 5,13; N 16,46.

Синтез проводили в соответствии с методикой Б, приведенной для соединения IV.

Выход 0,101 г (67%).

R _f 0,45 (1), 0,27 (2).

Т _пл =178-180 °С.

[ α] _D ²⁰ =+30,8 ° (С 0,57, вода).

ВЭЖХ в условиях (1) - индивидуальный пик, время удерживания 7,54 мин.

Найдено %: С 47,15; Н 5,2; N 16,50. C ₁₀ H ₁₃ N ₃ O ₅ . Вычислено %: С 47,06; Н 5,13; N 16,46.

Пример 3. N α-Глутарилтриптофан (III).

К суспензии 1,0 г (4,9 ммоль) триптофана в 7 мл воды прибавляют по каплям раствор 1 N NaOH (4,9 ммоль). К полученному раствору добавляют раствор 0,56 г (4,9 мммоль) глутарового ангидрида в 3 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона в темноте, оставляют на 16 ч при +4 °. Растворитель из реакционной смеси удаляют в вакууме. Полученный маслообразный остаток растворяют в 30 мл воды при перемешивании, охлаждают до 0 °, добавляют раствор 1 N HCl до рН 4. Продукт экстрагируют этилацетатом (3 ×25 мл). Объединенный этилацетатный экстракт охлаждают до 0 °, промывают водой (4 ×25 мл) до рН 7, раствором 5% HCl (5мл), водой (4 ×25 мл) до рН 7, сушат над безводным Na ₂ SO ₄ в течение 1 ч. Осадок Na ₂ SO ₄ отфильтровывают, промывают этилацетатом, растворитель удаляют в вакууме. Получают серовытый твердый остаток, который сушат в вакууме.

Выход 1,0 г (70%).

R _f 0,54 (1).

Т _пл =150-152 °С. [ α] _D ²⁰ =+8,20 ° (С 0,5, метанол).

¹ H-ЯМР спектр (CD ₃ OD), δ, м.д.: 1,75-1,84 (м, 2Н, β-СН ₂ -Glt), 2,15-2,30 (м, 4Н, α, γ-CH ₂ -Glt), 3,30-3,40 (м, 2Н, β-СН ₂ -Trp), 3,80-3,90 (м, 1Н, α-CH-Trp), 6,97 (т, J=7 Гц, 1Н, СН-6-Ind), 7,06 (т, J=7 Гц, 1Н, CH-7-Ind), 7,15 (д, J=7 Гц, 1Н, СН-2-Ind), 7,33 (д, J=7 Гц, 1Н, CH-5-Ind), 7,55 (д, J=7 Гц, 1Н, CH-8-Ind).

ВЭЖХ в условиях: (2) - индивидуальный пик, время удерживания 6,77 мин.

Найдено, %: С 60,07; Н 5,65; N 8,75. C ₁₆ H ₁₈ N ₂ O ₅ . Вычислено, %: С 60,37; Н 5,7; N 8,8.

Пример 4. N α-Сукцинил-L-триптофан (II).

Синтез проводили в соответствии с методикой, приведенной для соединения III.

Выход 100,5 мг (67%).

R _f 0,63 (1).

[ α] _D ²⁰ =+21,05 ° (С 0,6, вода).

¹ H-ЯМР спектр (DMSO-d ₆ ), δ, м.д.: 2,33-2,41 (м, 4Н, α, β-CH ₂ -Suc), 2,93-3,01 (м, 1Н, β-СН ₂ -Trp), 3,10-3,16 (м, 1Н, β-СН ₂ -Trp), 4,39-4,47 (м, 1Н, α-CH-Trp), 6,93-7,06 (м, 2Н, СН-6,7-Ind), 7,11 (д, J=2,2 Гц, 1Н, CH-2-Ind), 7,30-7,32 (м, 1Н, СН-5-Ind), 7,44-7,47 (м, 1Н, CH-8-Ind). [М] ⁺ 304,3.

ВЭЖХ в условиях: (2) - индивидуальный пик, время удерживания 6,35 мин.

Найдено, %: С 59,07; Н 5,65; N 9,35. C ₁₅ H ₁₆ N ₂ O ₅ . Вычислено, %: С 59,21; Н 5,3; N 9,21.

Пример 5. Мононатриевая соль N α-глутарил-L-гистидина (IV).

К раствору 1,0 г (3,7 ммоль) N α-глутарил-L-гистидина в 15 мл воды при перемешивании и охлаждении до +5 °С прибавляют раствор 0,15 г (3,7 ммоль) NaOH в 20 мл воды. Раствор перемешивают 30 мин, растворитель удаляют в вакууме. К маслообразному остатку порциями добавляют бензол, растворитель удаляют в вакууме. Твердый остаток сушат над гранулированной щелочью.

Выход 1,07 г (99,7%). Т _пл =208-210 °С.

[ α] _D ²⁰ =+16,27 ° (С 0,58, вода).

Найдено, %: С 45,25; Н 5,51; N 14,52. C ₁₁ H ₁₅ N ₃ O ₅ Na. Вычислено, %: С 45,21; Н 5,17; N 14,38.

Пример 6. Мононатриевая соль N α-сукцинил-L-гистидина (V).

Синтез проводили в соответствии с методикой, приведенной для мононатриевой соли N α-глутарил-L-гистидина (IV) (пример 5).

Выход 1,06 г (97,0%).

[ α] _D ²⁰ =+40,21 ° (С 0,48, вода).

Найдено, %: С 43,25; Н 4,51; N 15,52. C ₁₀ H ₁₃ N ₃ O ₅ Na. Вычислено, %: С 43,17; Н 4,71; N 15,10.

Пример 7. Мононатриевая соль N α-сукцинил-L-триптофана (II).

Выход 0,21 г (98,0%).

Т _пл =147-150 °С.

[ α] _D ²⁰ =+22,02 ° (С 0,39, вода).

Найдено, %: С 55,25; Н 4,51; N 8,32. C ₁₅ H ₁₆ N ₂ O ₅ Na. Вычислено, %: С 55,05; Н 4,93; N 8,56.

ВЭЖХ в условиях: (2) - индивидуальный пик, время удерживания 6,56 мин.

Пример 8. Мононатриевая соль N α-глутарил-L-триптофана (III).

Выход 0,11 г (99,0%).

Т _пл =128-130 °С.

[ α] _D ²⁰ =+22,06 ° (С 0,34, метанол).

Найдено, %: С 56,15; Н 5,21; N 8,22. C ₁₆ H ₁₈ N ₂ O ₅ Na. Вычислено, %: С 56,30; Н 5,32; N 8,21.

ВЭЖХ в условиях: (2) - индивидуальный пик, время удерживания 6,96 мин.

Пример 9. Динатриевая соль N α-глутарил-L-гистидина (IV).

К раствору 1,0 г (3,7 ммоль) N α-глутарил-L-гистидина в 15 мл воды при перемешивании и охлаждении до +5 °С прибавляют раствор 0,3 г (7,44 ммоль) NaOH в 15 мл воды. Раствор перемешивают 30 мин, растворитель удаляют в вакууме. К маслообразному остатку порциями добавляют бензол, растворитель удаляют в вакууме. Твердый остаток сушат над гранулированной щелочью.

Выход 1,15 г (99,0%).

[ α] _D ²⁰ =+11, 92 ° (С 0,57, вода).

Найдено, %: С 41,25; Н 4,51; N 13,52. C ₁₁ H ₁₅ N ₃ O ₅ Na ₂ . Вычислено, %: С 41,91; Н 4,80; N 13,3.

Пример 10. Динатриевая соль N α-сукцинил-L-гистидина (V).

Синтез проводили в соответствии с методикой, приведенной для динатриевой соли N α-глутарил-L-гистидина (IV) (пример 9).

Выход 1,16 г (99,0%).

Т _пл =124-128 °С.

[ α] _D ²⁰ =+20,06 ° (С 0,67, вода).

Найдено, %: С 39,55; Н 4,31; N 13,52. C ₁₀ H ₁₃ N ₃ O ₅ Na ₂ . Вычислено, %: С 39,88; Н 4,35; N 13,95.

Пример 11. Динатриевая соль N α-сукцинил-L-триптофана (II).

Выход 0,56 г (97,7%).

Найдено, %: С 51,35; Н 4,31; N 8,22. C ₁₅ H ₁₆ N ₂ O ₅ Na ₂ . Вычислено, %: С 51,43; Н 4,60; N 8,0.

Пример 12. Динатриевая соль N α-глутарил-L-триптофана (III).

Выход 0,56 г (98,5%).

Найдено, %: С 52,55; Н 4,71; N 7,52. C ₁₆ H ₁₈ N ₂ O ₅ Na ₂ . Вычислено, %: С 52,75; Н 4,98; N 7,69.

Пример 13. N α-сукцинил-L-гистидина метиловый эфир.

К раствору 1,0 г (4,13 ммоль) гистидина метилового эфира в 5 мл N,N-диметилформамида при интенсивном перемешивании добавляют 5 мл воды и раствор 0,41 г (4,13 ммоль) янтарного ангидрида в 2,5 мл этилацетата. Перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Этилацетатный и водный слой разделяют. Водный слой дважды промывают эфиром, эфирный слой отбрасывают. Воду удаляют в вакууме, остаток затирают с 10 мл гексана. Осадок отфильтровывают, сушат в вакууме.

Выход 0,70 г (67%).

R _f 0,38 (1).

Т _пл =171-173 °С.

¹ Н-ЯМР спектр (DMSO-d ₆ ), δ, м.д.: 2,26-2,37 (м, 4Н, α, β-CH ₂ -Suc), 2,70 (с, 3Н, -О-СН ₃ ), 2,76-2,87 (м, 2Н, β-CH ₂ -His), 4,33-4,45 (м, 1Н, α-CH ₂ -His), 6,78 (с, 1Н, 4-CH-Im), 7,93 (с, 1Н, 2-CH-Im), 8,25 (д, J=7Гц, NH-амид.). [ α] _D ²⁰ =+11, 92 ° (С 0,57, вода).

По аналогичным типовым методикам получают также новые соединения общей формулы (I), приведенные в табл. 2.

Таблица 2Строение и характеристики соединений общей формулы (I)

Тесты на биологическую активность.

Пример 14. Влияние соединений общей формулы (I) на аллергические реакции немедленного типа (тест индуцированной овальбумином (ОА) дегрануляции базофилов крови иммунизированной морской свинки in vitro.

Выделение лейкоцитов из крови морской свинки осуществляли по методу Фримеля [Иммунологические методы/ Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987, с.222 в нашей модификации].

Для постановки теста использовали морских свинок обоего пола массой 600-800 г. Животных иммунизировали однократно смесью овальбумина 10 мкг и 100 мг гидроокиси алюминия на животное по Andersson [Andersson P. Antigen-induced bronchial anaphulaxis in actively sensitized geinea-pigs. // Allergy., 1980, Vol. 35, p.63-71].

Под эфирным наркозом из сердца морской свинки отбирали 15 мл крови. Для выделения базофилов в составе лейкоцитарной взвеси использовали двойное осаждение клеток посредством ЭДТА и с помощью цитратсодержащей осаждающей жидкости.

Кровь смешивали с 5% раствором ЭДТА ∙Na ₂ 2H ₂ O ("Sigma") в соотношении 9:1 и через 30 мин мягко центрифугировали (12 мин при 80 г). Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали 15 мин при 500 г.

К оставшимся клеткам крови добавляли цитратсодержащую осаждающую жидкость (3) в пропорции 3:10 (термостатируется при 37 °С в течение 30 мин). Обогащенную лейкоцитами надосадочную фракцию центрифугировали 7 мин при 100 г. К осадку лейкоцитов добавляли 0,85% раствор NaCl и концентрацию клеток доводили до 30 ×10 ³ /мкл.

Постановка теста дегрануляции базофилов in vitro [Справочник по клиническим лабораторным методам исследования/ Под ред. Е.А.Кост. - М.: Медицина, 1975, с.130].

Для постановки теста в центрифужную пробирку (используется по 3 пробирки на каждую пробу) помещали 300 мкл клеточной взвеси, затем добавляли 300 мкл солевого раствора исследуемого соединения (или солевого раствора в контроле спонтанной и максимальной дегрануляции) и преинкубировали при 37 °С в течение 15 мин, затем добавляли по 300 мкл 1% солевого раствора ОА в каждую пробирку (в контроль спонтанной дегрануляции добавляли солевой раствор в таком же количестве) и еще раз преинкубировали при 37 °С в течение 10 мин. Рабочая концентрация лейкоцитов составляет при этом 10 ⁴ /мкл. Из каждой пробирки отбирали пробы (100 мкл) в отдельные пробирки для оценки полной дегрануляции базофилов, а к оставшимся клеткам добавляли охлажденный солевой раствор (по 5 мл в каждую пробирку) для остановки реакции дегрануляции, затем центрифугировали 7 мин при 100 г, а из осадка готовили препараты для микроскопирования. Фиксацию и окраску препаратов проводили по методу Seder et al. [Seder R.A. et al. Mouse splenic and bone marrow cell populations that express high - affinity Fs ε receptors and produce interleukin-4 are highly enriched in basophils. // Proc.Natl.Acad.USA, 1991, V.88, p.2835-2839].

Для выявления специфической зернистости базофилов использовали краситель 0,5% альциановый синий (рН 1,0), ядра докрашивали сафранином (0,1% раствор в 1% уксусной кислоте). Препараты использовали для оценки суммарного торможения дегрануляции.

Торможение суммарной дегрануляции (ТГ) (%) рассчитывали по формуле

где max - % дегранулированных базофилов при максимальной дегрануляции (ОА);

спонт. - % дегранулированных базофилов при спонтанной дегрануляции (контроль);

экспер. - % дегранулированных базофилов после воздействия исследуемого соединения.

Оценка полной дегрануляции базофилов.

Отобранные после постановки теста дегрануляции базофилов пробы (по 100 мкл) помещали в пробирки с красителем (0,5% альциановый синий, рН 1,0) в соотношении 1:1. Окрашивание производили при комнатной температуре не менее 50 мин. Подсчет количества окрашенных базофилов проводили с использованием камеры Фукса-Розенталя. Торможение полной дегрануляции (ТПД) базофилов рассчитывали по формуле

ТПД(%)=1 - [(М ср (к) - М ср (эксп.)]/[М ср (к) - М ср (ОА)] × 100,

где М ср (к) - среднее(по 3-м пробам) количество базофилов в тесте спонтанной дегрануляции ;

М ср (ОА) - среднее (по 3-м пробам) количество базофилов в тесте максимальной антиген-индуцированной дегрануляции;

М ср (эксп.) - среднее (по 3-м пробам) количество базофилов в тесте дегрануляции после инкубации с исследуемым соединением.

Таблица 3Торможение ОА-индуцированной дегрануляции базофилов крови иммунизированных морских свинок in vitro под воздействием соединений общей формулы (I)

(* - Р < 0,001)

Данные табл. 3 показывают, что по сравнению с глутарилгистамином соединение (IV) оказывает выраженное антианафилактическое действие, проявляющееся практически 100% торможением дегрануляции в тесте полной ОА-индуцированной дегрануляции базофилов крови активно иммунизированных морских свинок (реакция анафилаксии in vitro в безкальциевой среде). Значительный антианафилактический эффект соединения IV проявляется и в уменьшении количества дегранулированных клеток, особенно выраженном в концентрации 10 ^-5 М (отсутствие дегранулированных клеток).

Пример 15. Изучение влияния соединений общей формулы (I) на системную анафилаксию in vivo.

Использовали модель бронхоспазма у ненаркотизированных активно сенсибилизированных морских свинок с аэрозольным воздействием овальбумина в качестве антигена [Ковалева В.Л. Методические указания по изучению бронхолитических, муколитических и противовоспалительных средств// Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.-М., 2000, с.242-250].

Морских свинок сенсибилизировали овальбумином по методу Andersson [Andersson P. Antigen-induced bronchial anaphulaxis in actively sensitized geinea-pigs. // Allergy, 1980, Vol. 35, p.63-71] и через 1-2 месяца после сенсибилизации индуцировали бронхоспазм аэрозольным введением разрешающей дозы овальбумина (3 мг/кг в 1 мл физ. раствора).

В опытных группах морским свинкам в течение трех дней внутрижелудочно с помощью зонда вводили исследуемые соединения в дозах 10, 50 и 150 мкг/кг. В другой серии экспериментов исследуемые соединения в дозе 50 мкг/кг (в 1 мл физ. раствора) вводили ингаляционно (с помощью небуляйзера) также в течение трех дней 1 раз в сутки. Контрольной группе вводили физ. раствор. Через 1 ч после последнего введения веществ ингалировали с помощью небуляйзера овальбумин и оценивали длительность (в секундах) и интенсивность бронхоспастической реакции животных.

Таблица 4Торможение системной анафилактической реакции морских свинок при ингаляционном введении соединения IV в дозе 50 мкг/кг

Таблица 5Торможение системной анафилактической реакции морскихсвинок при внутрижелудочном введении соединения IV в дозах 10 и 150 мкг/кг (М ±m)

* - Р < 0,001

Результаты экспериментов, представленные в табл. 4 и 5, показывают, что соединение IV при внутрижелудочном введении в дозах 10 и 150 мкг/кг и ингаляционном введении в дозе 50 мкг/кг проявило антианафилактическую активность. Ингаляционное введение вещества в дозе 50 мкг/кг блокировало развитие острой фазы бронхоконстрикторной реакции, которая, вызывая удушье, является причиной гибели животных. При внутрижелудочном введении соединения IV в дозах 10 и 150 мкг/кг был выявлен значительный протективный эффект в отношении антиген-индуцированного бронхоспазма.

Таким образом, соединение IV проявляет значительный протективный эффект в отношении системной анафилактической реакции in vivo.

Пример 16. Противоаллергическое действие соединений общей формулы (I) на модели аллергического ринита у морских свинок.

Использована модель аллергического ринита у морских свинок.

Морских свинок иммунизировали по определенной схеме в течение 1,5-2-х месяцев (Hutson P.A., Church M.K. et al., 1988): вначале животных иммунизировали внутрибрюшинным введением овальбумина в дозе 10 мг/кг с 7-дневным интервалом (дважды), затем свинкам ингалировали с помощью небуляйзерной техники (Pari) раствор овальбумина в возрастающей концентрации, начиная с 0,1 до 1% с интервалом в 4 дня между ингаляциями. Последнюю дозу овальбумина вводили в назальные ходы с помощью микропипетки. Через 24 ч после последнего введения овальбумина производили забор назального смыва (через систему специальных трубочек) и изменения в слизистой носа оценивали с помощью комплекса методов: гистологических и цитологических. Исследуемые соединения (0,1% раствор) вводили ежедневно в виде ингаляций с помощью небуляйзерной техники в течение 6 дней, на 6-й день введения вызывали провокацию антигеном (ОА). Назальный смыв получали через сутки после провокации.

Таблица 6Влияние соединения IV на цитоз (абсолютное количество клеток в 1 мкл) в назальном смыве

* - отличие от интактного контроля;

° - отличие от модели ( ° - Р < 0,05; * - Р < 0,01; ** - Р < 0,001)

Таблица 7Влияние соединения IV на показатели цитограммы (%) назального смыва морских свинок

* - отличие от интактного контроля;

° - отличие от модели (ринит) ( ° - Р <0,05; **, ° ° - Р <0,01; ***, ° ° ° - Р <0,001)

Таблица 8Влияние соединения IV на абсолютное количество клеточных субпопуляций назального смыва морских свинок (в 1 мкл)

Примечание: * - отличие от интактного контроля;

° -отличие от модели (* - Р <0,05; **, ° ° - Р <0,01; *** -Р <0,001)

Из данных табл. 5-7 следует, что в условиях моделирования аллергического ринита соединение IV значительно подавляет эозинофильное воспаление. Это подтверждается снижением до нормы абсолютного и относительного количества эозинофилов, а также существенным снижением цитоза в назальном смыве.

Пример 17. Противоаллергическая активность соединений общей формулы (I) на модели аллергического воспаления легких у морских свинок.

Использована модель аллергического воспаления легких у морских свинок.

Иммунизация животных аналогична той, которая описана в примере 7.

Через 24 ч после последнего введения овальбумина производили забор бронхоальвеолярного смыва (через канюлю, вставленную в трахею) и изменения в слизистой бронхов оценивали с помощью комплекса методов: гистологических и цитологических.

Исследуемые соединения (0,1% раствор) вводили ежедневно в виде ингаляций с помощью небуляйзерной техники в течение 6 дней, на 6-й день введения вызывали провокацию антигеном (ОА).

Таблица 9Влияние соединения IV на цитоз (абсолютное количество клеток в 1 мкл) в бронхоальвеолярном смыве

* Р <0,01 - отличие от интактного контроля

Таблица 10Влияние соединения IV на абсолютное количество клеточных субпопуляций бронхоальвеолярного смыва морских свинок (в 1 мкл)

* - отличие от интактного контроля;

°- отличие от модели (*, ° - Р <0,05; ** - Р <0,01)

Из данных табл. 9 и 10 следует, что соединение IV в условиях модели аллергического воспаления легких существенно ингибирует воспалительный процесс, что проявляется уменьшением цитоза, снижением содержания ключевой клетки аллергического воспаления - эозинофилов, резким снижением нейтрофилов, а также уменьшением числа лимфоцитов.

Пример 18. Изучение противовоспалительного действия соединений общей формулы (I) на модели воспаления легких у крыс, индуцированного сефадексом.

Модель сефадекс-индуцированного (6-дневного) воспаления легких у крыс.

В опытах были использованы крысы-самцы породы Вистар с массой тела 270-300 г.

Воспаление в легких индуцировали однократным ингаляционным введением сефадекса А-25 (гидрофильного порошка с размерами частиц от 20 до 80 мкм) в дозе 5 мг/кг с помощью дозирующего устройства, являющегося лабораторным аналогом ингалятора "Циклохалера" (НИИ пульмонологии РФ).

Методика ингаляционного введения сефадекса фармакологических веществ.

Крысам с помощью оригинального дозирующего устройства для ингаляционного введения сухих порошков под эфирным наркозом вводили сефадекс А-25 в дозе 5 мг на 1 кг массы тела. Крысы Вистар после введения сефадекса А-25 быстро выходили из наркоза и внешне каких-либо особенностей в поведении, характере дыхания у них не отмечалось. Вещества в виде сухого порошка вводили ингаляционно в дозе 500 мкг/кг через 1 ч после введения сефадекса, затем в течение 5 дней подряд ежедневно 1 раз в день в одни и те же утренние часы. Контроль представлен 2 группами: группой интактных животных, группой крыс, которым ингаляционно однократно ввели сефадекс.

Результаты терапевтического действия фармакологических веществ на развитие воспалительного процесса в легких оценивали через 6 суток после аэрозольного воздействия сефадекса с помощью морфологических и морфометрических показателей (объемная плотность эмфиземы и альвеолита).

Методы, использованные в работе.

Гистологические.

Проводили гистологическое исследование легких, окрашенных гематоксилином и эозином.

Морфометрические.

Готовили гистологические срезы легких толщиной 4-5 мкм, в которых подсчитывали число нейтрофилов в межальвеолярных перегородках, а также оценивали объемную плотность альвеолита и эмфиземы с помощью сетки Автандилова [Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию//М.: Медицина, 1980, с.203]. Также проводили морфометрическое исследование лимфоидной ткани легких. С этой целью макропрепараты легких фиксировали по методу Beinenstock et al. [Bienenstock J., Johnson N., Perey D.Y.E. Bronchial lymphoid tissue 1. Morphologic characteristics//Lab. Invest. 1973, v.28, p.693-698.] Легкие с трахеей извлекали из грудной полости и макропрепарат помещали в 2% водный раствор уксусной кислоты. Через 18-24 ч трахею, главные и долевые бронхи рассекали; методом точечного счета под лупой (Ув.7) проводили морфометрическую оценку объемной плотности лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами. Методом точечного счета определяли объемную плотность альвеолита и эмфиземы.

Цитологические.

Бронхоальвеолярный смыв у крыс и морских свинок получали под гексеналовым наркозом путем двукратного промывания легких через трахею 10 мл физиологического раствора. Жизнеспособность клеток определяли в тесте с трипановым синим. В жидкости бронхоальвеолярного смыва (БАС) с помощью камеры Горяева определяли абсолютное число клеток в 1 мл (цитоз). В мазках из осадка жидкости БАС, полученного с помощью центрифугирования при 200 г в течение 10 мин и затем окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывали эндопульмональную цитограмму (в процентах) [Авцын А.П., Лукомский Г.И., Романова Л.К. и соавт. Эндопульмональная цитограмма // Сов. мед., 1982, №7, с.8-14].

Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Таблица 11Показатели цитоза бронхоальвеолярного смыва крыс Вистарпосле аэрозольного воздействия сефадекса А-25 и леченияфармакологическими агентами (М ±m)ЦитозАбсолютное количество клеток в 1 мкл БАЛ

Примечание: * - отличие от интактного контроля

Таблица 12Показатели клеточного состава бронхоальвеолярного смыва крыс Вистар после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 и лечения исследуемого соединения (М ± m)ЦитозАбсолютное количество клеток различных субпопуляций в 1 мкл БАЛ

Примечание: * - отличие от интактного контроля (Р <0,05)

Гистологическое исследование легких.

Соединение IV вызвало отчетливое противовоспалительное действие: распространенность альвеолита была достоверно ниже по сравнению с модельной группой животных; эмфизема практически не выявлялась; не отмечена инфильтрация нейтрофилами межальвеолярных перегородок. По уровню цитоза и количеству нейтрофилов в БАЛ воспалительный процесс также значительно менее выражен, чем у животных, получавших сефадекс в течение 5 дней.

Таким образом, весь комплекс использованных экспериментальных моделей свидетельствует о значительной противоаллергической, антианафилактической и противовоспалительной активности соединений общей формулы (I), проявляемой как в тестах in vitro, так и при моделировании аллергической и воспалительной патологии in vivo.

Пример 19. Исследование гиполипидемического действия соединений общей формулы (I) модели гиперхолестеринемии крыс.

Исследование проводили на крысах-самцах Вистар массой 200 ±20 г. Гиперлипидемию вызывали пероральным введением холестериновой нагрузки - масляной суспензии холестерина:

оливковое масло (Acorsa, Испания) - 5 мл/кг веса животных;

холестерин (Sigma, USA) - 1 г/кг веса;

холат натрия (Sigma, USA) - 100 мг/кг веса.

В качестве препарата сравнения использовали препарат из группы статинов - «мевакор » (ловастатин) фирмы Merck Sharp & Dohn в дозе 40 мг/кг. Холестериновую суспензию вводили утром ежедневно в течение 10 дней. Исследуемые соединения (в дозе 500 мкг/кг) и препарат сравнения (в дозе 40 мг/кг) вводили животным вместе с холестериновой суспензией в течение 10 дней. Все животные получали стандартный брикетированный корм.

Животные были разбиты на следующие группы:

«Контроль » - интактные животные (n=6);

«Холестерин » - крысы, получавшие per os холестериновую нагрузку (n=10);

«Ловастатин » - крысы, получавшие per os холестериновую нагрузку и ловастатин (n=10);

«соединение IV » - крысы, получавшие per os холестериновую нагрузку и исследуемое соединение IV (n=10).

Образца крови брали на 5, 8, 10 день эксперимента.

Статистическую обработку гиполипидемического действия исследуемых веществ проводили по отношению к группе «холестерин » (табл. 13).

Таблица 13Содержание холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и печени крыс, получавших в течение10 дней per os оливковое масло, холестерин и соединение IV одновременно с холестериновой нагрузкой

* - р <0, 1;

** - р <0,05;

*** - р <0,01

Введение соединения IV в дозе 500 мкг/кг приводило к достоверному снижению общего холестерина сыворотки на 19,5%, печени - на 22,7%, холестерина ЛНП на 29,8%, триглицеридов печени на 19%. Соединение глутарилгистамин, снижая содержание общего холестерина лишь на 9%, оказывало влияние только на ЛПНП и ЛПОНП (липопротеинов низкой и очень низкой плотности), что показано в публикации международной заявки WO 99/01103, и, очевидно, менее эффективно, чем соединение IV, в аналогичном биологическом эксперименте.

Ниже приведены результаты исследований других заявленных соединений.

Экспериментальные группы включали:

1) «Холестерин » - получавшие в течение 10 дней per os масляную суспензию холестерина;

2) «соединение IV » - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и исследуемое соединение IV;

3) «соединение IV - 1Na » - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и исследуемую мононатриевую соль соединения IV;

4) «соединение IV - 2Na » - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и исследуемую динатриевую соль соединения IV;

5) «соединение V - 1Na » - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и исследуемую мононатриевую соль соединения V;

6) «соединение III - 1Na » - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и исследуемую мононатриевую соль соединения III;

7) «соединение II - 1Na » - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и исследуемую мононатриевую соль соединения II;

8) "Sim" - крысы, получавшие per os масляную суспензию холестерина и симвастатина;

9) контроль - интактные крысы до начала эксперимента.

На 10-й день опыта образцы крови брали после декапитации животных. Перед декапитацией животные голодали 12 ч.

В сыворотке крови измеряли содержание общего холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). Холестерин липопротеидов низкой и очень низкой плотности рассчитывали по разности общего холестерина и холестерина ЛВП.

Содержание общего холестерина и триглицеридов в сыворотке крови определяли ферментативным методом.

Определение содержания холестерина в липопротеидах высокой плотности ( α-ЛП) проводили методом осаждения ЛНП и ЛОНП фосфорновольфрамовой кислотой и ионами магния.

Статистическая обработка.

Данные в таблицах представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий между группами «холестерин » и «препарат... » оценивали по двухвыборочному t-тесту Стьюдента. Вероятность ошибки (р) указана в графах таблицы.

Данные о влиянии исследуемых соединений на содержание холестерина и триглицеридов в сыворотке крови крыс, получавших холестериновую нагрузку, представлены в табл. 14-21.

Таблица 14Экспериментальная гиперхолестеринемия

Десятидневное введение крысам масляной суспензии холестерина привело к достоверному увеличению содержания общего холестерина в сыворотке в 2,3 раза, триглицеридов в 1,9 раза. При развитии индуцированной гиперлипидемии холестерин ЛПВП снижался на 15%. Холестерин ЛПНП+ЛПОНП возрастал в 5 раз. Триглицериды ЛНП+ЛОНП возрастали в 2,3 раза.

Таблица 15Содержание холестерина и триглицеридов (мг/100 мл) в сыворотке крови крыс на 5-й день эксперимента

Таблица 16Содержание холестерина и триглицеридов (мг/100 мл) в сыворотке крови крыс на 8-й день эксперимента

Таблица 17Содержание холестерина и триглицеридов (мг/100 мл) в сыворотке крови крыс на 10-й день эксперимента

Таблица 18Развитие гиперхолестеринемии у подопытных животных в группе «Холестерин »

Десятидневное введение крысам масляной суспензии холестерина привело к достоверному увеличению содержания общего холестерина в сыворотке в 1,7 раза, триглицеридов в 1,6 раза (табл. 18). Холестерин ЛПВП снижался на 28% с исходных 66,7 до 48 мг/100 мл при развитии индуцированной гиперлипидемии. Холестерин ЛПНП+ЛПОНП возрастал в 4,4 раза с 22,5 до 99 мг/100 мл.

Таблица 19Содержание холестерина и триглицеридов (мг/100 мл) в сыворотке крови крыс на 5-й день эксперимента

Таблица 20Содержание холестерина и триглицеридов (мг/100 мл) в сыворотке крови крыс на 8-й день эксперимента

Таблица 21Содержание холестерина и триглицеридов (мг/100 мл) в сыворотке крови крыс на 10-й день эксперимента

Введение животным мононатриевой соли соединения III достоверно снижало общий холестерин (ХС) сыворотки на 29% и холестерин фракций ЛПОНП+ЛПНП - на 40%, но не изменяло уровень ХС антиатерогенных ЛПВП и общих триглицеридов сыворотки.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что моно- и динатриевые соли превосходили соединение IV по динамике действия на общий холестерин сыворотки и холестерин ЛПНП+ЛПОНП и другие показатели липидного обмена. В то время как к 10-у дню опыта достоверное и сравнимое снижение упомянутых показателей происходило под действием всех упомянутых выше соединений и препарата сравнения "Зокор" (симвастатин), соли соединения IV начинали действовать на более ранних сроках эксперимента (на 5 и 8 день). Обе натриевые соли соединения IV повышали ЛПВП уже к 5 дню эксперимента, в то время как соединение IV повышало этот показатель лишь к 8 дню. Препарат сравнения симвастатин не оказывал влияния на холестерин ЛПВП. Кроме того, динатриевая соль соединения IV снижала уровень общих триглицеридов сыворотки на 5 и 10 дни эксперимента.

Отличительным свойством мононатриевой соли соединения V явилась способность снижать уровень общих триглицеридов сыворотки, в то время как снижение уровня общего холестерина, ХС ЛПОНП и повышение содержания ЛПВП было ниже, чем у мононатриевой соли соединения III и мононатриевой соли соединения IV.

Таким образом, соли соединений II, III, IV и V обладают повышенной гиполипидемической активностью по сравнению с активностью соединений, описанных в публикации международной заявки WO 99/01103, и соединений, предложенных в настоящем изобретении, включающей способность снижать уровень триглицеридов, ХС холестерин сыворотки, в том числе в ЛПНП, и повышать холестерин ЛВП.

Пример 19. Исследование гиполипидемического действия соединений общей формулы (I) на модели «эндогенной » гиперхолестеринемии морских свинок.

Исследование проводили на морских свинках самцах (порода Агути), исходной массой 304 ±25 г. Продолжительность эксперимента 31 день. Контрольная группа, 6 свинок - интактные животные. Изучаемые соединения вводили с первого дня эксперимента (с первого дня введения жировой нагрузки).

Животные экспериментальных групп ежедневно на протяжении 31 дня получали per os исследуемое соединение и жировую нагрузку. Исследуемое соединение в указанных ниже дозах вводили в виде водного раствора (0,5 мл на животное); жировую нагрузку - смесь свиной жир/предварительно прогретое кукурузное масло, 4:1 по объему, из расчета 5 мл/кг веса через 0,5 ч после введения исследуемого вещества.

Экспериментальные группы:

1) «контроль » - интактные животные;

2) «жир » - животные, получавшие только жировую нагрузку;

3) «соединение IV » - животные, получавшие жировую нагрузку + соединение IV в дозе 500 мкг/кг веса;

4) «соединение V » - животные, получавшие жировую нагрузку + соединение V в дозе 500 мкг/кг.

Данные о содержании холестерина и триглицеридов в сыворотке крови морских свинок, получавших жировую нагрузку и исследуемые соединения, представлены в табл. 22-25.

Таблица 22Содержание общего холестерина в сыворотке крови морских свинок, получавших жировую нагрузку и исследуемые соединения

Статистическая обработка проводилась с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

Таблица 23Содержание общих триглицеридов в сыворотке крови морских свинок, получавших жировую нагрузку и исследуемые соединения

Таблица 24Содержание общего холестерина на 31-й день во фракциях липопротеидов сыворотки крови морских свинок, получавших жировую нагрузку и исследуемые соединения

Таблица 25Содержание общих триглицеридов на 31-й день во фракциях липопротеидов сыворотки крови морских свинок, получавших жировую нагрузку и исследуемые соединения

Исследуемые соединения IV и V значительно снижали уровень общего холестерина только к 31 дню эксперимента на 33,9 и 37,8% соответственно. При этом они достоверно снижали холестерин ЛПНП на 37,7 и 38%.

Изменение общего холестерина сыворотки под влиянием жировой нагрузки и различных доз (50-1500 мкг/кг) соединения IV

Вертикальными тонкими линиями указано стандартное отклонение от среднего значения.

Преимуществом заявляемых соединений, в частности соединения IV, является широкий диапазон действующих доз, что обеспечивает широту его терапевтического действия. Так, например, соединение IV практически одинаково эффективно снижало содержание общего холестерина в течение 20 дней в интервале доз от 50 до 1500 мкг/кг, отличающихся в 30 раз.

Таким образом, заявляемые соединения, соответствующие общей формуле (I), обладают значительной гиполипидемической активностью, существенно улучшая показатели липидного обмена в сыворотке крови и в печени.

Пример 20. Исследование противовоспалительного действия соединений общей формулы (I) на модели каррагенинового отека лапы крысы.

Эксперименты выполнены на белых аутбредных крысах самцах массой 250 г. Общее число животных в эксперименте 12.

Модель каррагенин-индуцированного отека по методу Winter et al. (Winter et al. Studies of the mediators of the acute inflammatory response induced in rats in different sites by carrageenan and turpentine//J.Phamacol., 1971, V.104, p.15-29). В правую лапу крысы субплантарно вводили 1% раствор каррагенина (SERVA) 0,1 мл. Животные рассаживались в индивидуальные камеры. Гель (1%), содержащий исследуемое вещество, наносили на лапу 3 раза: непосредственно после введения каррагенина, через 1 и 2 ч. Измерение объема лап проводили с помощью плетизмометра (Ugo Basile) через 4 ч после введения каррагенина. Эффект терапевтического воздействия геля оценивали по степени угнетения воспалительной реакции в сравнении с интактной левой лапой данного животного и реакцией лап крыс контрольной (нелеченой) группы. Торможение воспалительной реакции, выраженное в процентах, рассчитывали по формуле.

Исследуемые соединения VI и XIII в виде 1% геля вызвали торможение отека на 44 и 40%, соответственно, а препарат сравнения диклофенак (1% гель) - 62%.

Примеры лекарственных форм.

Пример 21.

А. Таблетированная форма.

Таблетированную форму получают, используя приведенные ниже ингредиенты