Настоящее изобретение относится к антителам, в том числе антителам человека, и их антигенсвязывающим частям, которые связываются с Р-кадгерином и которые функционируют, ингибируя Р-кадгерин. Также изобретение относится к тяжелой и легкой цепям иммуноглобулинов, получаемым из антител против Р-кадгерина человека, и к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют такие иммуноглобулины. Также настоящее изобретение относится к способам получения антител против Р-кадгерина человека, содержащим такие антитела композициям и способам применения антител и композиций. Также изобретение относится к трансгенным животным или растениям, содержащим молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.

[0001] Антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфичны к Р-кадгерину, содержащие домен VH, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% совпадает с любой из SEQ ID №:13, 320, 321 и 322, и домен VL, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% совпадает с любой из SEQ ID №:22, 326, 327 и 328, и обладающие по крайней мере одним свойством, выбранным из группы, которая состоит из:

[0002] Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, выбранные из группы, которая состоит из:

[0003] Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащие домен VH, который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 на 1-10 консервативных аминокислотных замен; и дополнительно содержащие домен VL, который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 на 1-10 консервативных аминокислотных замен.

[0004] Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR3 VH, выбранный из любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 на 1 или 2 консервативные аминокислотные замены.

[0005] Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR3 VL, выбранный из любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 на 1 или 2 консервативные аминокислотные замены.

[0006] Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат:

[0007] Антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат:

[0008] Антитело по любому из пп.1-7, представляющее собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD или получаемое из них.

[0009] Антитело по п.8, где IgG представляет собой IgG1, где константная область тяжелой цепи содержит SEQ ID №:344 и где константная область легкой цепи содержит SEQ ID №:345, при условии, что С-концевой остаток лизина из SEQ ID №:344 необязательно расщеплен.

[0010] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающую часть по пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

[0011] Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, как указано в любой из SEQ ID №:80, 89, 332, 333, 334, 338, 339 и 340, где нуклеотидная последовательность кодирует домен VH или домен VL антитела или его антигенсвязывающей части по п.1.

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/675311, зарегистрированной 26 апреля 2005 г., которая приведена здесь в полном объеме ссылкой.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим частям, которые связывают Р-кадгерин. Также изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие антитела и антигенсвязывающие части, к способам получения антител и антигенсвязывающих частей против Р-кадгерина, к композициям, содержащим такие антитела и антигенсвязывающие части, и к способам использования антител, антигенсвязывающих частей и композиций.

Уровень техники

Кадгерины представляют собой суперсемейство трансмембранных гликопротеинов, регулирующих межклеточную адгезию в ходе развития и поддержания гомеостаза тканей (Gumbiner J. Cell. Biol., 148:399-404 (2000); Yagi, et al., Genes Dev., 14:1169-1180 (2000)). Внутриклеточные домены кадгерина взаимодействуют с цитоплазматическими белками, такими как катенины и р120, которые формируют основу прикрепления кадгерина к актиновому цитоскелету. Кадгерины имеют пять внеклеточных доменов, связывающих Са ²⁺ , и небольшой цитоплазматический домен, который является высококонсервативным среди классических кадгеринов. Члены семейства классических кадгеринов включают Р-кадгерин, Е-кадгерин и N-кадгерин. Полагают, что молекулы клеточной адгезии, такие как кадгерины, играют важную роль в клеточных контактах раковых и метастатических клеток (Furukawa, et al., Microscopy Res. Technique 38 (4):343-352 (1997)). Экспрессия Р-кадгерина в обычных взрослых тканях является низкой и, в основном, ограничивается миоэпителиальными клетками и базальными слоями многослойного эпителия (Shimoyama, et al. Cancer Res. 49:2128-33 (1989)). Экспрессия Р-кадгерина повышается при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как болезнь Крона и колит (Hardy, et al., Gut 50:513-519 (2002)). В настоящее время значительная совокупность данных также свидетельствует, что нарушенная экспрессия Р-кадгерина связана с клеточной пролиферацией и с опухолями толстой кишки, молочной железы, легких, щитовидной железы и шейки матки (Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001); и Stefansson, et al., J. Clin. Oncol. 22 (7):1242-1252 (2004)). Было описано, что Р-кадгерин человека представляет собой антиген, распознаваемый моноклональным антителом NCC-CAD-299, которое образуется против плоскоклеточного рака женских наружных половых органов (Shimoyama, et al., Cancer Res., 49:2128-2133 (1989)). Предполагают, что регуляция опосредуемой Р-кадгерином адгезии и внутриклеточной передачи сигналов приводит к сниженной пролиферации и выживанию опухолевых клеток in vivo. Соответственно, в связи с центральной ролью, которую Р-кадгерин, по-видимому, играет в клеточной пролиферации и развитии солидной опухоли, желательно получить антитела против Р-кадгерина, которые способны обеспечить благоприятное терапевтическое воздействие на пациентов с различными видами рака.

Сущность изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, где антитело или его антигенсвязывающая часть обладают по крайней мере одним из нескольких функциональных свойств, как описано ниже в A)-K).

А) Например, в одном из вариантов осуществления антитела или их антигенсвязывающая часть обладают более высокой аффинностью связывания Р-кадгерина (K _D (P)), чем Е-кадгерина (K _D (E)). В одном из вариантов осуществления антитела или их антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеют величину K _D (E)/K _D (P), превышающую или равную 1,5. В другом варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению имеют величину K _D (E)/K _D (P), превышающую или равную 2, превышающую или равную 3, превышающую или равную 5, превышающую или равную 10, превышающую или равную 20, превышающую или равную 50, превышающую или равную 100, превышающую или равную 200, превышающую или равную 500 или превышающую или равную 1000. Как правило, верхнего предела для K _D (E)/K _D (P) не существует, поскольку величина K _D (E) может быть очень небольшой, например, 0. Однако в практических целях верхний предел для величины K _D (E)/K _D (P) может составлять 1 ×10 ⁶ . Такие величины K _D для Р-кадгерина и для Е-кадгерина можно измерять любым способом, известным специалистам в данной области, например, посредством ELISA, RIA, проточной цитометрии или поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE ™.

B) В другом варианте осуществления антитело или его часть связывают Р-кадгерин с величиной K _D 1000 нМ или менее, как измерено поверхностным плазмонным резонансом. В другом варианте осуществления антитело или участок связывают Р-кадгерин с величиной K _D , составляющей менее чем 500 нМ, менее чем 100 нМ, менее чем 50 нМ, менее чем 20 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 500 пМ или менее чем 100 пМ, как измерено поверхностным плазмонным резонансом. Как правило, нижнего предела для величины K _D не существует. Однако в практических целях нижний предел можно предполагать равным приблизительно 1 пМ.

C) В другом варианте осуществления антитело или его часть имеют скорость обратной реакции (k _обр ) для Р-кадгерина, составляющую менее чем. или равную 0,01 с ^-1 , как измерено поверхностным плазмонным резонансом. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело или часть имеют величину k _обp. для Р-кадгерина, составляющую менее чем 0,005 с ^-1 , менее чем 0,004 с ^-1 , менее чем 0,003 с ^-1 , менее чем 0,002 с ^-1 или менее чем 0,001 с ^-1 . Как правило, нижнего предела для величины k _обр не существует. Однако в практических целях нижний предел можно предполагать равным приблизительно 1 ×10 ^-7 с ^-1 .

D) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть обладают величиной IC ₅₀ 100 нМ или менее, как измерено посредством анализа зависящей от Р-кадгерина адгезии клеток. В другом варианте осуществления указанная IC ₅₀ составляет менее чем 50 нМ, менее чем 40 нМ, менее чем 20 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 500 пМ, менее чем 200 пМ, менее чем 100 пМ или менее чем 10 пМ, как измерено посредством анализа зависящей от Р-кадгерина адгезии клеток. Как правило, нижнего предела для величины IC ₅₀ , как измерено посредством анализа зависящей от Р-кадгерина адгезии клеток, не существует. Однако в практических целях нижний предел можно предполагать равным приблизительно 1 пМ.

E) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть обладают величиной IC ₅₀ 100 нМ или менее, как измерено посредством анализа зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток. В другом варианте осуществления указанная IC ₅₀ составляет менее чем 50 нМ, менее чем 40 нМ, менее чем 20 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 500 пМ, менее чем 200 пМ, менее чем 100 пМ или менее чем 1 пМ, как измерено посредством анализа зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток. Как правило, нижнего предела для величины IC ₅₀ , как измерено посредством анализа зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток, не существует. Однако в практических целях нижний предел можно предполагать равным приблизительно 1 пМ.

F) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть повышают распад шаровидного образования в 2 раза или более в анализе распада шаровидного образования, зависящего от Р-кадгерина, при сравнении с контрольным образцом без наличия IgG. В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть повышают распад шаровидного образования в анализе распада шаровидного образования, зависящего от Р-кадгерина, по крайней мере в 3, по крайней мере в 4, по крайней мере в 6, по крайней мере в 10 или по крайней мере в 15 раз в сравнении с контрольным образцом без наличия IgG.

G) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть конкурируют за связывание Р-кадгерина с антителом, выбранным из группы, которая состоит из 194-е06; 194-a02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-е06; 129-1c4 и g-129-1c4.

H) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть перекрестно конкурируют за связывание Р-кадгерина с антителом, выбранным из группы, которая состоит из 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-а09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06, 129-1c4 и g-129-1c4.

I) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть связываются с тем же эпитопом Р-кадгерина, что и антитело, выбранное из группы, которая состоит из 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-а09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4 и g-129-1c4.

J) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть связываются с Р-кадгерином практически с той же величиной K _D , что и антитело, выбранное из группы, которая состоит из 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4 и g-129-1c4.

K) В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или его часть связываются с Р-кадгерином практически с той же величиной k _обр , что и антитело, выбранное из группы, которая состоит из 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4 и g-129-1c4.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, содержащим домен V _H , аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% совпадает с любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность указанного домена V _H совпадает по крайней мере на 91%, по крайней мере на 93%, по крайней мере на 95%, по крайней мере на 97%, по крайней мере на 99 или 100% с любой из SEQ ID №:1-12 и 320-325.

В другом варианте осуществления антитело или его часть обладают по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, содержащим домен V _H , который представляет собой любую из SEQ ID №:1-13 и 320-325 или отличается от любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 наличием по крайней мере одной консервативной аминокислотной замены. Например, домен V _H может отличаться от любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен. В другом варианте осуществления любая из этих консервативных аминокислотных замен может происходить в областях CDR1, CDR2 и/или CDR3.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, содержащим домен V _L , аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% совпадает с любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность указанного домена V _L совпадает по крайней мере на 91%, по крайней мере на 93%, по крайней мере на 95%, по крайней мере на 97%, по крайней мере на 99% или 100% с любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331.

В другом варианте осуществления антитело или его часть обладают по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств и содержат домен V _L , который представляет собой любую из SEQ ID №:14-23 и 326-331 или отличается от любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 наличием по крайней мере одной консервативной аминокислотной замены. Например, домен V _L может отличаться от любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен. В другом варианте осуществления любая из этих консервативных аминокислотных замен может происходить в областях CDR1, CDR2 и/или CDR3.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, где аминокислотная последовательность доменов V _L и V _H по крайней мере на 90% совпадает с доменами V _L и V _H , соответственно, любого из антител 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; и g-129-1c4. Например, аминокислотная последовательность каждого из доменов V _L и V _H по крайней мере на 91, 93, 95, 97, 99 или 100% совпадает с доменами V _L и V _H , соответственно, любого из антител 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-а09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4 и g-129-1c4.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, которые выбирают из группы, состоящей из а) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:1, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:14; b) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:2, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:14; с) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:2, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:15; d) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:3, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:16; е) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:4, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:17; f) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:4, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:23; g) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:5, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:18; h) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:6, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:23; i) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:7, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:23; j) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:8, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:23; k) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:9, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:23; l) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:10, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:19; m) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:11, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:20; n) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:12, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:21; о) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:13, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:22; р) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:320, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:326; q) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:321, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:327; r) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:322, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:328; s) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:323, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:329; t) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:324, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:330; и и) антитела или его участка, содержащих домен V _H , как указано в SEQ ID №:325, и домен V _L , как указано в SEQ ID №:331.

В другом варианте осуществления в случае любого из антител или их частей, описанных выше в группах а)-u), домены V _H и/или V _L могут отличаться от конкретных указанных в настоящей заявке SEQ ID № по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, домены V _H и/или V _L могут отличаться от указанной SEQ ID № на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен. В другом варианте осуществления любая из этих консервативных аминокислотных замен может происходить в областях CDR1, CDR2 и/или CDR3.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, содержащим домен V _H , который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 или последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену, и дополнительно содержащим домен V _L , который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331, или последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, каждый из доменов V _H и V _L может независимо отличаться от любой из SEQ ID №:1-13, 320-325, 14-23 и 326-331 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, где указанное антитело или участок содержат CDR3 V _H , выбранный из любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 или последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, CDR3 V _H может отличаться от любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 на 1, 2, 3 или 4 консервативных аминокислотных замены.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR3 V _L , выбранный из любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 или последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, CDR3 V _L может отличаться от любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 на 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замены.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR1 V _H , как указано в SEQ ID №:24, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:24 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену; CDR2 V _H , как указано в SEQ ID №:25, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:25 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену; и CDR3 V _H , который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256, или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, каждая из указанных выше последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 V _H может независимо отличаться от соответствующих указанных SEQ ID № на 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR1 V _L , как указано в SEQ ID №:38, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:38 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену; CDR2 V _L , как указано в SEQ ID №:39, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:39 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену; и CDR3 V _L , который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319, или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, каждая из указанных выше последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 V _L может независимо отличаться от соответствующих указанных SEQ ID № на 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат: CDR1 V _H , как указано в SEQ ID №:24; CDR2 V _H , как указано в SEQ ID №:25; CDR3 V _H , выбранный из любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256; CDR1 V _L , как указано в SEQ ID №:38; CDR2 V _L , как указано в SEQ ID №:39; и CDR3 V _L , выбранный из любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319. В другом варианте осуществления каждая из указанных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 V _H и V _L может независимо отличаться от конкретных указанных выше SEQ ID № по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, каждая из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 может независимо отличаться от соответствующих конкретных SEQ ID №, указанных выше, на 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR1 V _H и V _L , CDR2 V _H и V _L и CDR3 V _H и V _L , как встречается в каком-либо из антител 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-а09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4 и g-129-1c4.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, содержащим домен V _H , который выбирают из любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 или который отличается от любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 на 1-10 консервативных аминокислотных замен.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, содержащим домен V _L , который выбирают из любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 или который отличается от любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 на 1-10 консервативных аминокислотных замен.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, содержащим домен V _H , который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 или последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:1-13 и 320-325 на 1-10 консервативных аминокислотных замен, и дополнительно содержащим домен V _L , который независимо выбирают из любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 или последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:14-23 и 326-331 на 1-10 консервативных аминокислотных замен.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR1 V _H , как указано в SEQ ID №:24, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:24 на 1-4 консервативные аминокислотные замены; CDR2 V _H , как указано в SEQ ID №:25, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:25 на 1-4 консервативные аминокислотные замены; и CDR3 V _H , который выбирают из любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256, или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:26-37 и 91-256 на 1-4 консервативные аминокислотные замены.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат CDR1 V _L , как указано в SEQ ID №:38, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:38 на 1-4 консервативные аминокислотные замены; CDR2 V _L , как указано в SEQ ID №:39, или последовательность, отличающуюся от SEQ ID №:39 на 1-4 консервативные аминокислотные замены; и CDR3 V _L , который выбирают из любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319, или из последовательности, отличающейся от любой из SEQ ID №:40-47 и 257-319 на 1-4 консервативные аминокислотные замены.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, обладающим по крайней мере одним из описанных ранее в А)-K) функциональных свойств, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть содержат FR1 V _H , как указано в SEQ ID №:48; FR2 V _H , как указано в SEQ ID №:49; FR3 V _H , выбранный из любой из SEQ ID №:50-55; FR4 V _H , выбранный из любой из SEQ ID №:56 и 57; FR1 V _L , выбранный из любой из SEQ ID №:58 и 59; FR2 V _L , выбранный из любой из SEQ ID №:60-62; FR3 V _L , выбранный из любой из SEQ ID №:63-66; и FR4 V _L , как указано в SEQ ID №:67. В другом варианте осуществления каждая из указанных последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4 V _H и V _L может также независимо отличаться от конкретных указанных выше SEQ ID № по крайней мере на одну консервативную аминокислотную замену. Например, каждая из последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4 может независимо отличаться от соответствующих конкретных SEQ ID №, указанных выше, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен. В еще одном варианте осуществления любую из последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4 можно подвергать мутации для совпадения с соответствующей последовательностью каркасной области зародышевой линии.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к любому из описанных в настоящей заявке антител, где антитело представляет собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD или получено из них. Например, антитело может представлять собой IgG1 или IgG2. Например, в одном из вариантов осуществления IgG представляет собой IgG1, где константная область тяжелой цепи содержит SEQ ID №:344 и где константная область легкой цепи содержит SEQ ID №:345, при условии, что С-концевой остаток лизина из SEQ ID №:344, необязательно, расщеплен.

Другой вариант осуществления относится к любым описанным выше антителам или антигенсвязывающим частям, представляющим собой фрагмент Fab, фрагмент F(ab') ₂ , фрагмент Fv, одноцепочечный фрагмент Fv, одноцепочечный фрагмент V _H , одноцепочечный фрагмент V _L , гуманизированное антитело, химерное антитело или биспецифическое антитело.

Другой вариант осуществления относится к дериватизированному антителу или антигенсвязывающей части, содержащим любое из антител или их частей, как описано в настоящей заявке, и по крайней мере одну дополнительную молекулу. Например, по крайней мере одна дополнительная молекула может представлять собой другое антитело (например, биспецифическое антитело или димер), средство для регистрации, метку, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые способны опосредовать связь антитела или участка антитела с другой молекулой (такой как внутренняя область стрептавидина или полигистидиновая метка). Например, эффективные средства для регистрации, посредством которых можно дериватизировать антитело или антигенсвязывающая часть по изобретению, включают флуоресцентные соединения, в том числе флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, хлорид 5-диметиламин-1-нафталинсульфонила, фикоэритрин, лантанидные люминофоры и т.п. Также антитело можно метить эффективными для регистрации ферментами, такими как пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозоксидаза и т.п. В другом варианте осуществления антитела или их участки по настоящему изобретению можно также метить биотином или заранее заданным полипептидным эпитопом, распознаваемым вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновых застежек, участки связывания для вторичных антител, домены связывания металлов, эпитопные метки). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения любые из антител или их частей также можно дериватизировать химической группой, такой как полиэтиленгликоль (PEG), метильной или этильной группой, или углеводной группой.

В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящей заявке антитела или антигенсвязывающие части против Р-кадгерина прикрепляют к твердому носителю.

В некоторых вариантах осуществления расщепляют С-концевой лизин тяжелой цепи из любого антитела против Р-кадгерина по изобретению. В различных вариантах осуществления изобретения тяжелые и легкие цепи антител против Р-кадгерина могут, необязательно, содержать N-концевую сигнальную последовательность. Например, сигнальная последовательность тяжелой цепи может представлять собой SEQ ID №:346, a сигнальная последовательность легкой цепи может представлять собой SEQ ID №:347.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к любому из антител или их антигенсвязывающих частей, как описано в настоящей заявке, где антитела или их антигенсвязывающие части принадлежат человеку.

Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любое из антител или их антигенсвязывающих частей, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к молекуле выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует любое из антител или их антигенсвязывающих частей, как описано в настоящей заявке. Один из конкретных вариантов осуществления относится к молекуле выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, как указано в любой из SEQ ID №:68-90 и 332-343. Кроме того, изобретение относится к вектору, содержащему любую из описанных в настоящей заявке молекул нуклеиновых кислот, где вектор, необязательно, содержит контролирующую экспрессию последовательность, которая функционально связана с молекулой нуклеиновой кислоты.

Другой вариант осуществления относится к клетке-хозяину, содержащей любой из описанных в настоящей заявке векторов или содержащей любую из описанных в настоящей заявке молекул нуклеиновых кислот. Также настоящее изобретение относится к отдельной линии клеток, продуцирующих какое-либо из антител или антигенсвязывающих частей, как описано в настоящей заявке, или продуцирующих тяжелую цепь или легкую цепь какого-либо из указанных антител или указанных антигенсвязывающих частей.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, где способ включает культивирование в приемлемых условиях любых описанных в настоящей заявке клеток-хозяев или клеточных линий и выделение указанного антитела или антигенсвязывающего участка.

Также настоящее изобретение относится к не относящемуся к человеку трансгенному животному или трансгенному растению, содержащим какую-либо из описанных в настоящей заявке нуклеиновых кислот, где не относящееся к человеку трансгенное животное или трансгенное растение экспрессирует указанную нуклеиновую кислоту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу выделения антитела или его антигенсвязывающего участка, которые связываются с Р-кадгерином, где способ включает стадию выделения антитела из не относящегося к человеку трансгенного животного или трансгенного растения, как описано в настоящей заявке.

Также настоящее изобретение относится к способу лечения патологического роста клеток у млекопитающего при необходимости этого, где способ включает стадию введения указанному млекопитающему какого-либо из антител или их антигенсвязывающих частей, или какой-либо из фармацевтических композиций, как описано в настоящей заявке. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения патологического роста клеток у млекопитающего при необходимости этого посредством антитела или его антигенсвязывающего участка, связывающихся с Р-кадгерином, где способ включает стадии введения указанному млекопитающему эффективного количества какой-либо из описанных в настоящей заявке молекул нуклеиновых кислот в приемлемых условиях, позволяющих экспрессию указанных молекул нуклеиновых кислот. В другом варианте осуществления способ лечения патологического роста клеток дополнительно включает введение определенного количества одного или нескольких веществ, выбранных из противоопухолевых средств, противоангиогенных средств, ингибиторов передачи сигналов и антипролиферативных средств, где эти количества вместе эффективны в лечении указанного патологического роста клеток. В конкретных вариантах осуществления указанный патологический рост клеток является раковым.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу снижения зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток, где способ включает контактирование клеток с каким-либо из описанных в настоящей заявке антител или их антигенсвязывающих частей или с какой-либо из описанных в настоящей заявке фармацевтических композиций.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающей части, содержащим аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, для которой используется ген семейства V _H -3 человека. Например, в одном из вариантов осуществления ген семейства V _H -3 человека представляет собой V _H -3-23.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к любому из антител или их антигенсвязывающих частей, как описано в настоящей заявке, где указанное антитело или антигенсвязывающая часть представляет собой антитело человека. В другом аспекте указанное антитело или антигенсвязывающая часть представляют собой рекомбинантное антитело человека.

Также изобретение относится к способу получения антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, где способ включает стадии синтеза фаговой библиотеки антител человека, скрининга библиотеки посредством Р-кадгерина или его антигенной части, выделения фага, связывающего Р-кадгерин, и получения антитела из фага.

Определения и общие способы

Пока в настоящей заявке не указано иначе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, которые обычно подразумевают специалисты в данной области. Кроме того, пока по контексту не требуется иначе, термины в единственном числе включают в себя множественное число, а термины во множественном числе включают в себя единственное число. В целом, номенклатура, используемая в рамках описания и используемая при описании в настоящей заявке способов культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот, а также гибридизации являются такими, которые хорошо известны и обычно используются в данной области.

Как правило, способы и процедуры по настоящему изобретению осуществляют в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, процитированных и указанных на протяжении всего настоящего описания, до тех пор, пока не указано иначе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); и Coligan, et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003), описания которых приведены здесь полностью ссылкой. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с указаниями производителя, как обычно выполняют в данной области или как описано в настоящей заявке. Номенклатура, используемая в рамках описания и используемая при описании в настоящей заявке лабораторных процедур и способов аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской, и фармацевтической химии являются такими, которые хорошо известны и обычно используются в данной области. Для химического синтеза, химического анализа, фармацевтического препарата, состава, доставки, а также лечения пациентов используют общепринятые способы.

Известно, что основная структурная единица антитела содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух одинаковых пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну "легкую" (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой цепи содержит вариабельную область приблизительно от 100 до 120 или более аминокислот, которая, в основном, ответственна за распознавание антигена.

Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, которая, в основном, ответственна за эффекторную функцию. Принадлежащие человеку легкие цепи подразделяют на легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи подразделяют на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельная и константная области соединены посредством участка "J", состоящего приблизительно из 12 или более аминокислот, где тяжелая цепь также включает участок "D" приблизительно из 3 или более аминокислот. В целом, см. Fundamental Immunology. Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (приведено здесь полностью ссылкой для всех целей). Вариабельные области каждой пары тяжелая/легкая цепи (V _H и V _L ) формируют участок связывания антитела. Таким образом, например, целое антитело IgG имеет два участка связывания. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два участка связывания являются одинаковыми.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей обладают одинаковой общей структурой из относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными участками, также называемыми участками, определяющими комплементарность, или CDR. Термин "вариабельный" относится к тому факту, что среди антител последовательность определенных участков вариабельных доменов в значительной степени отличается, и они используются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела относительно его конкретного антигена. Однако вариабельность распределена среди вариабельных доменов антител неравномерно, а сконцентрирована в CDR, которые разделены более высоко консервативными FR. CDR из двух цепей каждой пары выравнены посредством FR, что позволяет связываться с конкретным эпитопом. С N-конца по направлению к С-концу и легкая, и тяжелая цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Соотнесение аминокислот с каждым доменом происходит в соответствии с определениями Rabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)) или Chothia & Lesk J., Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989), описания которых приведены здесь полностью ссылкой.

Пока не указано иначе, следующие термины следует понимать как обладающие следующими значениями.

Пока конкретно не указано иначе, термин "Р-кадгерин" относится к Р-кадгерину человека, который представляет собой интегральный белок мембраны и является членом классического кадгеринового семейства трансмембранных гликопротеинов, регулирующих межклеточную адгезию. Клонирование и секвенирование Р-кадгерина человека было описано, например, Shimoyama, et al., J. Cell Biol. 109 (4 Pt 1), 1787-1794 (1989), описание которого приведено здесь полностью ссылкой. Подразумевают, что термин "Р-кадгерин" включает рекомбинантный Р-кадгерин человека и рекомбинантные химерные формы Р-кадгерина, которые можно получать общепринятыми способами рекомбинантной экспрессии или покупать коммерчески доступные (R &D Systems 861-PC-100).

В рамках настоящей заявки, пока конкретно не указано иначе, термин "Е-кадгерин" относится к Е-кадгерину человека, который представляет собой интегральный белок мембраны и является членом классического кадгеринового семейства трансмембранных гликопротеинов, регулирующих межклеточную адгезию. Е-кадгерин описан, например, в Takeichi, Science, 251:1451-1455 (1991), описание которого приведено здесь полностью ссылкой. Подразумевают, что термин "Е-кадгерин" включает рекомбинантный Е-кадгерин человека и рекомбинантные химерные формы Е-кадгерина, которые можно получать общепринятыми способами рекомбинантной экспрессии или покупать коммерчески доступные (R &D 648-EC-100).

Термин "полипептид" включает природные или искусственные белки, фрагменты белков и полипептидные аналоги белковой последовательности. Полипептид может быть мономерный или полимерный.

Термин "выделенный белок", "выделенный полипептид" или "выделенное антитело" относится к белку, полипептиду или антителу, которое вследствие своего происхождения или источника получения (1) не связано с природно соединенными с ним компонентами, которые сопутствуют ему в его естественном состоянии, (2) свободно от других белков из того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида или (4) не встречается в природе. Таким образом, полипептид, синтезируемый химически или синтезируемый в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в естественных условиях, "отделяют" от природно связанных с ним компонентов. Также белок можно получать в виде практически не содержащего природно связанных компонентов посредством выделения с использованием хорошо известных в данной области способов очистки белков.

Примеры выделенных антител включают антитело против Р-кадгерина, которое было очищено аффинным способом с использованием Р-кадгерина, а также антитело против Р-кадгерина, которое было синтезировано посредством линии клеток in vitro.

Белок или полипептид является "практически чистым", "практически гомогенным" или "практически очищенным", если по крайней мере приблизительно от 60 до 75% образца характеризуется как полипептид одного вида. Полипептид или белок может быть мономерный или мультимерный. Как правило, практически чистый полипептид или белок может содержать приблизительно 50, 60, 70, 80 или 90% мас./мас. образца белка, более обычно, приблизительно 95%, а предпочтительно может быть чистым более чем на 99%. Чистота или гомогенность белка может быть показана множеством хорошо известных в данной области способов, таких как электрофорез белкового образца в полиакриламидном геле с последующим получением изображения единственной полипептидной полосы после окрашивания геля с использованием хорошо известной в данной области краски. Для определенных целей можно обеспечивать более высокое разрешение с использованием HPLC или других способов, хорошо известных в данной области для очистки.

В рамках настоящей заявки термин "полипептидный фрагмент" относится к полипептиду, имеющему аминоконцевую или карбоксиконцевую делецию, но где остальная аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в природной последовательности. В некоторых вариантах осуществления длина фрагментов составляет по крайней мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В других вариантах осуществления длина фрагментов составляет по крайней мере 14, по крайней мере 20, по крайней мере 50 или по крайней мере 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот.

В рамках настоящей заявки термин "аналог" или "полипептидный аналог" относится к полипептиду, содержащему участок, практически совпадающий с определенной контрольной аминокислотной последовательностью и практически обладающий той же функцией или активностью, что и контрольная аминокислотная последовательность. Как правило, полипептидные аналоги содержат консервативную аминокислотную замену (или вставку, или делецию) относительно контрольной последовательности. Длина аналогов может составлять по крайней мере 20 или 25 аминокислот, или длина может составлять по крайней мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот или более, а часто аналоги могут быть такими же длинными, как и полноразмерный полипептид. Некоторые варианты осуществления изобретения включают антитела из полипептидных фрагментов или из полипептидных аналогов с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 заменами относительно аминокислотной последовательности зародышевой линии. Руководствуясь этим описанием, специалисты в данной области могут легко получать фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулинов.

В определенных вариантах осуществления аминокислотные замены в антителе против Р-кадгерина или в его антигенсвязывающей части являются такими, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания для формирования белковых комплексов, а также (4) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов, но при сохранении специфического связывания с Р-кадгерином. Аналоги могут содержать различные замены относительно природной пептидной последовательности. Например, в природной последовательности, например, в участке полипептида, расположенном вне пределов домена(ов), формирующего межмолекулярные контакты, можно осуществлять единичные или множественные аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены. Также в формирующем межмолекулярные контакты домене(ах) можно осуществлять аминокислотные замены, способные улучшить активность полипептида. Консервативная аминокислотная замена не должна существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности; например, замена аминокислоты не должна изменять антипараллельную β-складчатую структуру, образующую домен связывания иммуноглобулина, который находится в исходной последовательности, или не должна нарушать другие типы вторичной структуры, характеризующей исходную последовательность. В целом, в антипараллельной β-складчатой структуре не используют глицин и пролин. Примеры признанных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в Proteins. Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland. Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thornton, et al., Nature, 354:105 (1991), приведенных здесь полностью ссылкой.

В рамках настоящей заявки термин "антитело" является синонимом иммуноглобулину, и его следует понимать, как общепринято в данной области. В частности, термин "антитело" не ограничен каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, термин "антитело" включает в себя, но ими не ограничивается, рекомбинантные антитела, моноклональные антитела и поликлональные антитела.

В рамках настоящей заявки термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "участок антитела") относится к одному или нескольким фрагментам антитела, сохраняющим способность специфически связываться с антигеном (например, Р-кадгерином). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, входящих в термин "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V _L , V _H , C _L и C _H 1; (ii) фрагмент F(ab') ₂ , бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, которые соединены дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V _H и C _H 1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V _L и V _H одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward, et al., Nature, (1989) 341:544-546), состоящий из домена V _H ; и (vi) отдельный гипервариабельный участок (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V _L и V _H , кодируются отдельными генами, их можно соединять с использованием рекомбинантных способов посредством синтетического линкера, позволяющего получать их в виде единой белковой цепи, в которой участки V _L и V _H объединяют в пару для формирования моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv)); см., например, Bird, et al., Science (1988) 242:423-426 и Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела также подразумеваются входящими в термин "антигенсвязывающая часть" антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как димеры. Димеры представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых домены V _H и V _L экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, являющегося слишком коротким, чтобы позволить объединение в пару двух доменов на одной и той же цепи, тем самым вынуждая домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и формируя два антигенсвязывающих участка (см., например, Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Poljak, et al. Structure, 2:1121-1123 (1994)).

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, сформированных ковалентным или нековалентным взаимодействием антитела или участка антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование внутренней области стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov, et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6:93-101 (1995)) и использование цистеинового остатка, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov, et al., Mol. Immunol., 31:1047-1058 (1994)). Другие примеры включают случаи, когда один или несколько CDR антитела ковалентно или нековалентно включены в молекулу, делая ее иммуноадгезивной, специфически связывающейся с интересующим антигеном, таким как Р-кадгерин. В таких вариантах осуществления CDR можно включать в качестве части более крупной полипептидной цепи, можно ковалентно связывать с другой полипептидной цепью или можно включать нековалентным способом. Участки антитела, такие как фрагменты Fab и F(ab') ₂ , можно получать из целых антител с использованием общепринятых способов, таких как расщепление целых антител папаином или пепсином, соответственно. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием общепринятых способов рекомбинантной ДНК, как описано в настоящей заявке.

Если "антитело" упоминают в настоящей заявке в отношении настоящего изобретения, то следует понимать, что также можно использовать его антигенсвязывающую часть. Антигенсвязывающая часть конкурирует с целым антителом за специфическое связывание. См., в целом, Fundamental Immunology. Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (приведенное здесь полностью ссылкой для всех целей). Антигенсвязывающие части можно получать способами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением целых антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие части включают фрагменты Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fd, Fv, dAb и гипервариабельные участки (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела, димеры и полипептиды, которые содержат, по крайней мере, участок антитела, достаточный для придания полипептиду специфического связывания антигена. В вариантах осуществления с одним или несколькими участками связывания участки связывания могут совпадать друг с другом или могут отличаться.

В рамках настоящей заявки термин "антитело человека" обозначает любое антитело, в котором последовательности вариабельных и константных доменов представляют собой последовательности человека. Термин включает антитела с последовательностями, полученными на основе генов человека, но которые были изменены, например, для снижения возможной иммуногенности, увеличения аффинности, устранения цистеинов, способных вызывать нежелательное сворачивание, и т.д. Также термин включает такие антитела, которые получают рекомбинантно в не относящихся к человеку клетках, способных обеспечивать несвойственное клеткам человека гликозилирование. Эти антитела можно получать множеством способов, как описано ниже.

В рамках настоящей заявки термин "химерное антитело" обозначает антитело, содержащее участки из двух или более различных антител, в том числе антител из различных видов. Например, один или несколько CDR химерного антитела можно получать из антитела человека против Р-кадгерина. В одном из примеров CDR из антитела человека можно объединять с CDR из не принадлежащего человеку антитела, например, мышиного или крысиного. В другом примере все CDR можно получать из антител человека против Р-кадгерина. В еще одном примере CDR из более чем одного антитела человека против Р-кадгерина можно объединять в химерное антитело. Например, химерное антитело может содержать CDR1 из легкой цепи первого антитела человека против Р-кадгерина, CDR2 из легкой цепи второго антитела человека против Р-кадгерина и CDR3 из легкой цепи третьего антитела человека против Р-кадгерина, a CDR из тяжелой цепи могут быть получены из одного или нескольких других антител против Р-кадгерина. Кроме того, каркасные области можно получать из одного из антител против Р-кадгерина, из которого получают один или несколько CDR, или из одного или нескольких различных антител человека. Кроме того, подразумевают, что термин "химерное антитело" включает любое из указанных выше сочетаний, где сочетания содержат антитела человека и не принадлежащие человеку антитела.

В рамках настоящей заявки термин "гуманизированное антитело" относится к антителам из не относящегося к человеку источника, где аминокислотные остатки, характерные для последовательностей антител из не относящихся к человеку видов, заменены на остатки, которые находятся в соответствующих положениях в антителах человека. Полагают, что этот процесс "гуманизации" снижает иммуногенность получаемого антитела у человека. Понимают, что антитела из не относящегося к человеку источника можно гуманизировать с использованием хорошо известных в данной области способов. См., например, Winter, et al., Immunol. Today, 14:43-46 (1993). Интересующее антитело можно конструировать способами рекомбинантной ДНК для замещения CH1, CH2, CH3, шарнирных доменов и/или каркасного домена соответствующей последовательностью человека. См., например, WO 92/02190 и патенты США №5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085. В рамках настоящей заявки термин "гуманизированное антитело" включает в свое значение химерные антитела человека и антитела с присоединенными CDR. Химерные антитела человека по изобретению включают V _H и V _L антитела из не относящегося к человеку вида и домены C _H и C _L антитела человека. Антитела с присоединенными CDR по изобретению получают в результате замены CDR из V _H и V _L антитела человека на CDR из V _H и V _L , соответственно, из антитела животного, отличного от человека.

В рамках настоящей заявки термин "ELISA" относится к твердофазному иммуноферментному анализу. Этот анализ хорошо известен специалистам в данной области. Примеры этого анализа можно найти в Vaughan, T.J., et al., Nat. Biotech., 14:309-314 (1996), а также в примере 7 настоящей заявки.

В рамках настоящей заявки термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, позволяющему анализировать биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени посредством регистрации изменений концентраций белков в биосенсорной матрице, например, с использованием системы BIACORE ™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N. J.). Для дополнительных описаний см. Jonsson et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson, et al., Biotechniques, 11:620-627 (1991); Jonsson, et al., J. Mol. Recognit, 8:125-131 (1995); и Johnsson, et al., Anal. Biochem., 198:268-277 (1991).

Термин "K _D " относится к равновесной константе аффинности связывания для конкретного взаимодействия антитело-антиген. Указывают, что антитело специфично связывается с антигеном, если K _D ≤1 мМ, предпочтительно ≤100 нМ, а наиболее предпочтительно ≤10 нМ. Константу аффинности связывания K _D можно измерять поверхностным плазмонным резонансом, например, с использованием системы BIACORE ™, как описано в примере 6.

Термин "k _обр " относится к константе скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. Константу скорости диссоциации k _обр можно измерять поверхностным плазмонным резонансом, например с использованием системы BIACORE ™, как описано в примере 6.

В рамках настоящей заявки термин "анализ зависящей от Р-кадгерина адгезии клеток" относится к анализу, используемому для измерения способности антитела против Р-кадгерина блокировать адгезию клеток к рецептору Р-кадгерина, зафиксированному на твердом носителе. Например, этот тип анализа можно осуществлять фиксированием Р-кадгерина на твердом носителе, таком как пластмасса. Затем клеткам со сверхэкспрессией Р-кадгерина позволяют прикрепляться к твердому носителю посредством взаимодействий Р-кадгерин-Р-кадгерин. Затем можно количественно определять величину адгезии при наличии и отсутствии антитела против Р-кадгерина. Адгезию как функцию концентрации антитела можно затем использовать для определения величины IC ₅₀ . В примере 3 представлены дополнительные подробности анализа зависящей от Р-кадгерина адгезии клеток, который использовали для измерения величин IC ₅₀ для антител против Р-кадгерина.

В рамках настоящей заявки термин "анализ зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток" относится к анализу для измерения способности антитела против Р-кадгерина блокировать агрегацию клеток, экспрессирующих на своей поверхности Р-кадгерин. Например, в этом типе анализа можно использовать линию клеток, сверхэкспрессирующих Р-кадгерин, где клетки помещают в суспензию и позволяют формировать зависящие от Р-кадгерина скопления. Затем анализ агрегации используют для количественного определения способности антитела против Р-кадгерина предотвращать эту агрегацию, проводимого посредством измерения размера клеточных скоплений, которые образуются в присутствии и отсутствии антитела. Размер скопления клеток как функцию концентрации антитела против Р-кадгерина затем можно использовать для определения величины IC ₅₀ . В примере 4 представлены дополнительные подробности анализа зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток, который использовали для измерения величин IC ₅₀ для нескольких антител против Р-кадгерина.

В рамках настоящей заявки термин "анализ зависящего от Р-кадгерина распада шаровидного образования" относится к анализу для измерения способности антитела против Р-кадгерина нарушать предварительно образованные, зависящие от Р-кадгерина скопления клеток. Посредством измерения уменьшения размера скоплений как функции концентрации антитела можно определять величину IC ₅₀ . В примере 5 представлены дополнительные подробности анализа зависящего от Р-кадгерина распада шаровидного образования, который использовали для измерения величин IC ₅₀ для антител против Р-кадгерина.

В рамках настоящей заявки термин "молекулярная избирательность" относится к аффинности связывания антитела в отношении специфического антигена, превышающей аффинность для родственного антигена. Например, антитела по настоящему изобретению могут быть избирательны по отношению к Р-кадгерину в сравнении с Е-кадгерином, что означает, что аффинность связывания антитела для Р-кадгерина по крайней мере в 2 раза выше, например, в 4 раза или в 10 раз, или в 50 раз, или в 100 раз или более, чем для Е-кадгерина. Такие величины аффинности связывания можно измерять с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области.

Термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клеток или к иному взаимодействию с молекулой. Как правило, детерминанты эпитопов состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов или сахаров, и, как правило, обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. "Эпитоп" может быть "линейным" или "конформационным". В линейном эпитопе все участки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) расположены линейно вдоль основной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе участки взаимодействия расположены в поперечном направлении относительно аминокислотных остатков белка, отделенных друг от друга. После определения желаемого эпитопа на антигене можно получать антитела против этого эпитопа, например, с использованием описанных в настоящем изобретении способов. Альтернативно, в ходе процесса открытия получение и характеризация антител могут приводить к дополнению информации о желаемых эпитопах. Затем на основе этой информации можно проводить конкурентный скрининг антител, на предмет связывания с одним и тем же эпитопом. Способ достижения этого состоит в проведении исследований перекрестного конкурирования для нахождения антител, конкурентно связывающихся друг с другом, т.е. антитела конкурируют за связывание с антигеном. Высокопроизводительный способ "сортировки" антител на основе их перекрестного конкурирования описан в международной патентной публикации № WO 03/48731.

В рамках настоящей заявки термин "конкурирует" в отношении антитела означает, что первое антитело или его антигенсвязывающая часть конкурирует за связывание со вторым антителом или его антигенсвязывающей частью, где связывание первого антитела с его родственным эпитопом в присутствии второго антитела заметно снижается в сравнении со связыванием первого антитела в отсутствии второго антитела. Альтернативно, может существовать, но необязательно, случай, когда связывание второго антитела с его эпитопом в присутствии первого антитела также заметно снижается. Т.е. первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом в отсутствии ингибирования вторым антителом связывания первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако если каждое антитело значительно ингибирует связывание другого антитела с его родственным эпитопом или лигандом, в одинаковой, большей или меньшей степени, то указывают, что антитела "перекрестно конкурируют" друг с другом за связывание с их соответствующим эпитопом(ами). В настоящее изобретение входит и конкурирование, и перекрестное конкурирование антител. Вне зависимости от механизма, которым происходит такое конкурирование или перекрестное конкурирование (например, стерическое препятствие, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его участком и т.п.), специалист в данной области на основе представленных в настоящей заявке указаний понимает, что такое конкурирование и/или перекрестное конкурирование антител входит и может быть эффективным для описанных в настоящей заявке способов.

В рамках настоящей заявки термин "использует" в отношении конкретного гена означает, что аминокислотная последовательность конкретного участка в антителе получена непосредственно с этого гена в ходе созревания В-клетки. Например, выражение "аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи, для которой используется ген семейства V _H -3 человека" относится к случаю, когда область V _H антитела получена с участков гена семейства V _H -3 в ходе созревания В-клетки. В В-клетках человека существует более 30 различных функциональных генов вариабельной области тяжелой цепи, с которых образуются антитела. Таким образом, использование конкретного гена вариабельной области тяжелой цепи показательно для предпочтительного связывающего фрагмента при взаимодействии антитело-антиген в отношении сочетанных свойств связывания с антигеном и функциональной активности. Как понимают, анализ использования гена обеспечивает только ограниченное представление о структуре антитела. Поскольку В-клетки человека случайным образом образуют транскрипты V-D-J тяжелой или V-J легкой каппа-цепи, то происходит множество вторичных процессов, в том числе, без ограничений, соматическая гипермутация, n-добавления и удлинения CDR3. См., например, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

В рамках настоящей заявки придерживаются общепринятого использования двадцати общепринятых аминокислот и их сокращенных обозначений. См. Immunology - A Synthesis (2 ^nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), приведенное здесь полностью ссылкой.

В рамках настоящей заявки термин "полинуклеотид" обозначает полимерную форму нуклеотидов длиной по крайней мере 10 оснований, рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов, или модифицированной формы каждого типа нуклеотида. Термин включает одно- и двухцепочечные формы.

В рамках настоящей заявки термин "изолированный полинуклеотид" обозначает полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения или их определенного сочетания, где вследствие своего происхождения "изолированный полинуклеотид" (1) не связан со всеми или с частью полинуклеотидов, с которыми "изолированный полинуклеотид" наблюдают в природе, (2) функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части более крупной последовательности.

В рамках настоящей заявки термин "природные нуклеотиды" включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. В рамках настоящей заявки термин "модифицированные нуклеотиды" включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахаров и т.п. В рамках настоящей заявки термин "олигонуклеотидные связи" включает такие олигонуклеотидные связи, как фосфортиоатная, фосфордитиоатная, фосфорселеноатная, фосфордиселеноатная, фосфоранилотиоатная, фосфораниладатная, фосфорамидатная и т.п. См., например, LaPlanche, et al., Nucl. Acids Res., 14:9081 (1986); Stec, et al., J. Am. Chem. Soc, 106:6077 (1984); Stein, et al., Nucl. Acids Res., 16: 3209 (1988); Zon, et al., Anti-Cancer Drug Design, 6:539 (1991); Zon, et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); патент США №5151510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543 (1990), описания которых приведены здесь полностью ссылкой. По желанию, олигонуклеотид может содержать метку для регистрации.

"Функционально связанные" последовательности включают контролирующие экспрессию последовательности, которые прилегают к интересующему гену, и контролирующие экспрессию последовательности, которые действуют в транс-положении или на расстоянии, контролируя интересующий ген.

В рамках настоящей заявки термин "контролирующая экспрессию последовательность" обозначает полинуклеотидные последовательности, необходимые для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают последовательности инициации транскрипции, терминации, промоторов и энхансеров; эффективные сигналы для процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, увеличивающие стабильность белка; и, когда требуются, последовательности, повышающие секрецию белка. Природа таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, содержат промотор, участок связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности содержат промоторы и последовательность терминации транскрипции. Подразумевают, что термин "контролирующие последовательности" включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, наличие которых является благоприятным, например, лидерные последовательности и последовательности участников для слияния. В рамках настоящей заявки термин "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была соединена. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую можно лигировать дополнительные участки ДНК. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, где дополнительные участки ДНК можно лигировать в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы с бактериальным участком инициации репликации и принадлежащие млекопитающему эписомальные векторы). В других вариантах осуществления векторы (например, принадлежащие млекопитающему неэписомальные векторы) можно встраивать в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и таким образом их можно реплицировать вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны контролировать экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. В рамках настоящей заявки такие векторы называют "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторами экспрессии").

В рамках настоящей заявки термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") обозначает клетку, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что "рекомбинантная клетка-хозяин" и "клетка-хозяин" обозначают не только конкретную клетку объекта, но также и потомство такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные изменения, обусловленные мутацией или воздействиями окружающей среды, то фактически такое потомство может быть не идентичным родительской клетке, однако при этом оно включено в объем термина "клетка-хозяин" в рамках настоящей заявки.

В рамках настоящей заявки термин "зародышевая линия" относится к нуклеотидным последовательностям генов и участков генов для антител в том виде, в каком они передаются от родителей потомкам через гаметы. Эта последовательность зародышевой линии отлична от кодирующих антитела в зрелых В-клетках нуклеотидных последовательностей, которые были изменены событиями рекомбинации и гипермутации в ходе созревания В-клеток.

Термин "процент совпадения последовательности" в контексте последовательностей нуклеиновых кислот обозначает остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на предмет максимального соответствия. Длина сравниваемой на предмет совпадения последовательности может превышать участок длиной по крайней мере приблизительно девять нуклеотидов, обычно по крайней мере приблизительно 18 нуклеотидов, более обычно по крайней мере приблизительно 24 нуклеотида, как правило, по крайней мере приблизительно 28 нуклеотидов, более обычно по крайней мере приблизительно 32 нуклеотида, а предпочтительно по крайней мере приблизительно 36, 48 или более нуклеотидов. Существует множество известных в данной области различных алгоритмов, которые можно использовать для определения совпадения нуклеотидных последовательностей. Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием FASTA, Gap или Bestfit,: представляющих собой программы в Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, содержащая, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает выравнивания и процент совпадения последовательностей в областях наилучшего перекрывания заданной и искомой последовательностей (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); приведенные здесь полностью ссылкой). Пока не указано иначе, для конкретной программы или алгоритма используют параметры по умолчанию. Например, процент совпадения последовательностей между последовательностями нуклеиновых кислот можно определять с использованием FASTA с ее установленными по умолчанию параметрами (длина слова составляющая 6 и фактор NOPAM для матрицы для количественного подсчета) или с использованием Gap с ее установленными по умолчанию параметрами, как предоставлено в GCG Version 6.1, приведенной здесь полностью ссылкой.

Пока не указано иначе, образец для сравнения нуклеотидной последовательности включает комплементарную ей последовательность. Таким образом, образец для сравнения нуклеиновой кислоты, обладающей определенной последовательностью, следует понимать как включающий ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

Термин "значительное сходство" или "значительное сходство последовательностей" в отношении нуклеиновой кислоты или ее участка означает, что при оптимальном выравнивании вместе с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) наблюдают совпадение нуклеотидных последовательностей по крайней мере приблизительно на 85%, предпочтительно по крайней мере приблизительно на 90%, а более предпочтительно по крайней мере приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, как определено любым хорошо известным алгоритмом для совпадения последовательностей, таким как FASTA, BLAST или Gap, как описано выше.

Термин "процент совпадения последовательностей" в контексте аминокислотных последовательностей обозначает остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на предмет максимального соответствия. Длина сравниваемой на предмет совпадения последовательности может превышать участок длиной по крайней мере приблизительно пять аминокислот, обычно по крайней мере приблизительно 20 аминокислот, более обычно по крайней мере приблизительно 30 аминокислот, как правило, по крайней мере приблизительно 50 аминокислот, более обычно по крайней мере приблизительно 100 аминокислот, а еще более обычно приблизительно 150, 200 или более аминокислот. Существует множество известных в данной области различных алгоритмов, которые можно использовать для определения совпадения, аминокислотных последовательностей. Например, аминокислотные последовательности можно сравнивать с использованием FASTA, Gap или Bestfit, представляющих собой программы в Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.

Применительно к полипептидам термин "значительное совпадение" или "значительное сходство" означает, что две последовательности аминокислот при оптимальном выравнивании, таком как при посредстве программ GAP или BESTFIT с использованием установленных по умолчанию величин разрыва, как предоставлено в программах, обладают сходством последовательностей по крайней мере на 70, 75 или 80%, предпочтительно сходством последовательностей по крайней мере на 90 или 95%, а более предпочтительно сходством последовательностей по крайней мере на 97, 98 или 99%. В определенных вариантах осуществления положения остатков, которые не являются одинаковыми, различаются консервативными аминокислотными заменами.

В рамках настоящей заявки термин "консервативная аминокислотная замена" относится к случаю, когда аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, обладающим группой R боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В целом, консервативная аминокислотная замена практически не изменяет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотных последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент совпадения последовательностей можно повышать, внося поправку на консервативный характер замены. Способы осуществления этой поправки хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson, Methods Mol. Biol., 243:307-31 (1994). Примеры групп аминокислот, имеющих боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают: 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатическо-гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; 3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислые боковые цепи: аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Например, консервативные аминокислотные замены групп могут представлять собой: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин.

Альтернативно, консервативная замена представляет собой любое изменение, обладающее положительной величиной в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, описанной в Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), приведенном здесь полностью ссылкой. "Умеренно консервативная" замена представляет собой любое изменение, обладающее неотрицательной величиной в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.

Как правило, совпадение последовательностей для полипептидов определяют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет последовательности с использованием измерений сходства, соотносимого с различными заменами, делециями и другими модификациями, в том числе консервативными аминокислотными заменами. Например, GCG содержит программы, такие как "Gap" и "Bestfit", которые можно использовать с установленными по умолчанию параметрами, как указано в программах, для определения гомологии последовательностей или совпадения последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды из различных видов организмов, или между белком дикого типа и его аналогом. См., например, GCG Version 6.1 (University of Wisconsin, WI). Также полипептидные последовательности можно сравнивать с использованием FASTA, применяя установленные по умолчанию или рекомендуемые параметры, см. GCG Version 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и процент совпадения последовательностей в областях наилучшего перекрывания заданной и искомой последовательностей (Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132:185-219 (2000)). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности по изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно blastp или tblastn, с использованием установленных по умолчанию параметров, как предоставлено вместе с программами. См., например, Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997).

Как правило, длина полипептидных последовательностей, сравниваемых на предмет гомологии, составляет по крайней мере приблизительно 16 аминокислотных остатков, обычно по крайней мере приблизительно 20 остатков, более обычно по крайней мере приблизительно 24 остатков, как правило, по крайней мере приблизительно 28 остатков, а предпочтительно приблизительно более чем 35 остатков. При поиске базы данных, содержащей последовательности из большого количества различных организмов, является предпочтительным проводить сравнение аминокислотных последовательностей.

В рамках настоящей заявки термины "метка" или "меченный" относятся к включению другой молекулы в антитело. В одном из вариантов осуществления метка представляет собой поддающийся выявлению маркер, например включение меченной радиоактивной меткой аминокислоты или присоединение к полипептиду биотинилированных молекул, которые можно выявлять меченным авидином (например, стрептавидином, обладающий флуоресцентным маркером или ферментативной активностью, которые можно регистрировать оптическими или колориметрическими способами). В другом варианте осуществления метка или маркер могут представлять собой терапевтическое средство, например, конъюгат лекарственного средства или токсин. В данной области известны и могут быть использованы различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают в себя, но ими не ограничиваются, следующее: радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, ³ Н, ¹⁴ С, ¹⁵ N, ³⁵ S, ⁹⁰ Y, ⁹⁹ Tc, ¹¹¹ In, ¹²⁵ I, ¹³¹ I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантанидные люминофоры), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинилированные группы, заранее определенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновых застежек, участки связывания для вторичных антител, домены связывания металлов, эпитопные метки), магнитные вещества, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как коклюшный токсин, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. В некоторых вариантах осуществления метки присоединяют к спейсерным группам различной длины для уменьшения возможного стерического препятствия.

"Терапевтически эффективное количество" относится к такому вводимому количеству терапевтического средства, которое в определенной степени ослабляет один или несколько симптомов заболевания, подлежащего лечению. В отношении лечения рака терапевтически эффективное количество относится к такому количеству, которое оказывает по крайней мере один из следующих эффектов: уменьшение размера опухоли; ингибирование (т.е. замедление в некоторой степени, предпочтительно, прекращение) метастазирования опухоли; ингибирование в некоторой степени (т.е. замедление в некоторой степени, предпочтительно, прекращение) роста опухоли, а также ослабление в некоторой степени (или, предпочтительно, устранение) одного или нескольких симптомов, связанных с раком.

"Лечить", "лечащий" и "лечение" относится к способу ослабления или устранения биологического нарушения и/или сопутствующих ему симптомов. В отношении рака эти термины просто означают, что ожидаемая продолжительность жизни пораженного раком индивидуума увеличена или что ослаблен один или несколько симптомов заболевания.

"Контактирование" относится к сведению вместе антитела или его антигенсвязывающего участка по настоящему изобретению и Р-кадгерина-мишени или его эпитопа таким образом, что антитело может воздействовать на биологическую активность Р-кадгерина. Такое "контактирование" можно осуществлять "in vitro", т.е. в пробирке, чашке Петри или т.п. В пробирке в контактирование может быть вовлечено только антитело или его антигенсвязывающая часть и Р-кадгерин или его эпитоп или в него могут быть вовлечены целые клетки. Клетки также можно поддерживать или растить в планшетах для культивирования клеток и в такой окружающей среде приводить в контакт с антителами или их антигенсвязывающими участками. В этом контексте способность конкретного антитела или его антигенсвязывающей части воздействовать на связанное с Р-кадгерином заболевание, т.е. IC ₅₀ для антитела, можно определять до попытки использовать антитело in vivo у более сложных живых организмов. В случае клеток, находящихся вне организма, для контактирования Р-кадгерина с антителами или их антигенсвязывающими частями существует множество способов, и они хорошо известны специалистам в данной области.

Пока не указано иначе, в рамках настоящей заявки "патологический рост клеток" относится к клеточному росту, не зависящему от обычных регуляторных механизмов (например, утрата контактного ингибирования), в том числе к патологическому росту обычных клеток и к росту патологических клеток. Это включает в себя, но им не ограничивается, патологический рост: опухолевых клеток (опухолей), пролиферирующих вследствие экспрессии мутантной тирозинкиназы или сверхэкспрессии рецептора тирозинкиназы; доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях, при которых происходит патологическая активация тирозинкиназы; любых опухолей, пролиферирующих при посредстве рецептора тирозинкиназ; любых опухолей, пролиферирующих вследствие патологической активации серин/треонинкиназы; доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях, при которых происходит патологическая активация серин/треонинкиназы; опухолей, доброкачественных и злокачественных, экспрессирующих активированный онкоген Ras; опухолевых клеток, доброкачественных и злокачественных, в которых белок Ras активирован в результате онкогенной мутации в другом гене; доброкачественных и злокачественных клеток при других пролиферативных заболеваниях, при которых происходит патологическая активация Ras. Примеры таких доброкачественных пролиферативных заболеваний представляют собой псориаз, доброкачественную гипертрофию предстательной железы, вирус папилломы человека (HPV) и рестеноз. Также "патологический рост клеток" относится к и включает в себя патологический рост доброкачественных и злокачественных клеток, обусловленный активностью фермента фарнезилпротеинтрансферазы.

В настоящей заявке термины "патологический рост клеток" и "гиперпролиферативное заболевание" используют взаимозаменяемо.

"In vitro" относится к процедурам, выполняемым в искусственной окружающей среде, такой как, например, без ограничений, пробирка или культуральная среда.

"In vivo" относится к процедурам, выполняемым в живом организме, таком как, без ограничений, мышь, крыса или кролик.

Краткое описание чертежа

На чертеже представлены последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот из SEQ ID №:1-347.

Подробное описание изобретения

Антитела против Р-кадгерина человека.

Это изобретение относится к выделенным антителам человека или их антигенсвязывающим частям, которые связываются с Р-кадгерином человека. Предпочтительно антитела человека представляют собой рекомбинантные антитела против Р-кадгерина человека, обладающие сродством к Р-кадгерину, превышающим сродство к Е-кадгерину. В различных аспектах изобретение относится к таким антителам и антигенсвязывающим частям, и их фармацевтическим композициям, а также нуклеиновым кислотам, рекомбинантным векторам экспрессии и клеткам-хозяевам для получения таких антител и антигенсвязывающих частей. Также изобретение относится к способам применения антител и антигенсвязывающих частей по настоящему изобретению для выявления Р-кадгерина или для ингибирования активности Р-кадгерина человека, in vitro или in vivo.

Известны аминокислотные и нуклеотидные последовательности Р-кадгерина из нескольких видов, включая человека (см., например, уникальный идентификатор №NM_001793.3). Р-кадгерин человека или его антигенные части можно получать в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области, или их можно покупать у коммерческих производителей (например, R &D Systems 861-PC-100).

В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой IgG, обозначенные как: 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-a09; 200-h06; g-194-b09; g-194-g09; g-196-g03; g-196-h02; g-194-e01; g-194-e06; 129-1c4; и g-129-1c4. Как более подробно описано в примере 1, использовали высокопроизводительный скрининг библиотеки фагового дисплея scFv для выявления 129-1с4 scFv, который затем преобразовывали в IgG. 129-1c4 представляет собой ведущее антитело, выявляемое в ходе начального скрининга фагового дисплея, и является родительским антителом для линии, из которой получали некоторые другие антитела по настоящему изобретению. Некоторые из таких полученных антител обозначены как 194-e06; 194-а02; 194-b09; 195-e11; 194-g09; 196-h02; 194-e01; 196-d10; 196-g03; 196-e06; 195-a09; 198-а09; а также 200-h06 и представляют собой оптимизированные антитела родительской линии 129-1с4. Антитело g-129-1с4 представляет собой вариант зародышевой линии родительского антитела 129-1с4, где определенные аминокислоты в каркасных областях доменов V _H и V _L изменены мутацией для совпадения с таковыми в каркасных областях зародышевой линии. Любое из указанных выше антител также можно сделать принадлежащим к зародышевой линии таким образом, чтобы последовательности каркасных областей совпадали с каркасными последовательностями зародышевой линии, как в g-129-1с4. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитела g-194-b09, g-194-g09, g-196-g03, g-196-h02, g-194-e01, g-195-e11, g-200-h06 и g-194-e06 представляют собой варианты зародышевой линии 194-b09, 194-g09, 196-g03, 196-h02, 194-e01, 195-e11, 200-h06 и 194-e06, соответственно. Конкретные аминокислоты, которые изменяли мутацией для получения вариантов зародышевой линии, очевидны специалистам в данной области в результате сравнения последовательностей антитела зародышевой линии и антитела, не относящегося к зародышевой линии. Как указано ниже, конкретные аминокислотные последовательности антител по настоящему изобретению описаны в табл. 1-3 и на чертеже.

Антитела по настоящему изобретению получали со значительным смещением в сторону использования семейства генов V _H 3 вариабельных областей тяжелой цепи. В частности, родительское антитело 129-1с4 получено из части гена вариабельной области V _H 3-23. В В-клетках человека существует более 30 различных функциональных генов вариабельных областей тяжелой цепи, посредством которых получают антитела. Таким образом, смещение указывает на предпочтительный связывающий фрагмент при взаимодействии антитело-антиген в отношении сочетанных свойств связывания с антигеном и функциональной активности.

Как понимают, анализ использования генов обеспечивает только ограниченное представление о структуре антител.

Поскольку В-клетки человека случайным образом образуют транскрипты V-D-J тяжелой или V-J легкой каппа-цепи, то происходит множество вторичных процессов, в том числе, без ограничений, соматическая гипермутация, n-добавления и удлинения CDR3. См., например, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) и опубликованную патентную заявку США №2003-0070185, зарегистрированную 19 февраля 2002 года. В соответствии с дальнейшим исследованием структуры антител по настоящему изобретению предварительно определенные аминокислотные последовательности антител получали с кДНК, полученных из клонов. Кроме того, N-концевые аминокислотные последовательности получали посредством секвенирования белка. На фиг. 1 представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей для некоторых антител по настоящему изобретению.

Каждое из указанных выше конкретных антител может быть описано посредством последовательностей их вариабельных доменов тяжелой (V _H ) и легкой (V _L ) цепей, как указано в табл. 1 и 2. Конкретные последовательности, обозначенные этими SEQ ID №, представлены на фиг. 1. Как указано в табл. 1 и 2, соответствующие последовательности аминокислот и ДНК V _H и V _L для описанных выше антител указаны посредством SEQ ID №:l-23, 68-90 и 320-343.

Таблица 1. Антитела против Р-кадгерина человека

Таблица 2. Антитела против Р-кадгерина человека, приведенные к состоянию зародышевой линии

Дополнительные антитела и антигенсвязывающие части по настоящему изобретению также могут быть описаны как содержащие различные последовательности CDR и FR, которые приводят к вариабельным областям тяжелой и легкой цепей антител, указанных в табл. 1 и 2. Соответственно, SEQ ID №, соответствующие различным последовательностям CDR и FR антител по настоящему изобретению, указаны в табл. 3. Кроме того, в областях CDR3 тяжелой и легкой цепей родительского антитела 129-1с4 также осуществляли множество выбранных случайным образом мутаций, приводящих к улучшенной аффинности к Р-кадгерину, находящейся в диапазоне от 10- до 417-кратного улучшения, как измерено анализом конкурирования за эпитоп (см. пример 8). SEQ ID № этих мутантных последовательностей CDR3 V _H и V _L (SEQ ID №:91-256 и 257-319) также включены в приведенную ниже табл. 3.

Таблица 3

Способы получения антителБиблиотеки фагового дисплея

Антитела или антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно получать в соответствии с несколькими известными в данной области способами. Например, способы фагового дисплея можно использовать для обеспечения библиотек, содержащих совокупность антител с различным сродством к Р-кадгерину. Затем эти библиотеки можно скринировать для выявления и выделения антител с желаемым сродством к Р-кадгерину.

Например, рекомбинантные антитела против Р-кадгерина человека по настоящему изобретению можно выделять скринингом рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител.

Предпочтительно, библиотека представляет собой библиотеку фагового дисплея scFv, получаемую с использованием кДНК V _L и V _H человека, которые получают из мРНК, выделяемых из В-клеток человека. Способы получения и скрининга таких библиотек известны в данной области. Наборы для получения библиотек фагового дисплея являются коммерчески доступными (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, номер в каталоге №27-9400-01; и набор фагового дисплея Stratagene SurfZAP ™, номер в каталоге №240612). Также существуют другие способы и реактивы, которые можно использовать для получения и скрининга библиотек дисплея антител (см., например, патент США №5223409; публикации РСТ №WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047 и WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay, et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse, et al., Science, 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths, et al., EMBO J., 12:725-734 (1993); Hawkins, et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992); Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad, et al., Bio/Technology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom, et al., Nuc. Acid Res., 19:4133-4137 (1991); Barbas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88:7978-7982 (1991); и Griffiths, et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994); которые приведены здесь полностью ссылкой).

Другой способ получения библиотеки антител для использования в способах фагового дисплея включает стадии иммунизации не относящегося к человеку животного, содержащего участки иммуноглобулинов человека, посредством Р-кадгерина или его антигенной части для вызова иммунной реакции, выделения у иммунизированных животных клеток, которые продуцируют антитела; выделения из полученных клеток РНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антител по изобретению, обратной транскрипции РНК для получения кДНК, амплификации кДНК с использованием праймеров и вставки кДНК в вектор фагового дисплея таким образом, чтобы антитела экспрессировались в фаге. Для получения таких совокупностей необходимо иммортализовать В-клетки от иммунизированного животного. Предпочтительно первичные В-клетки можно непосредственно использовать в качестве источника ДНК. Смесь кДНК, которые получают из В-клеток, например, полученных из селезенок, используют для получения библиотеки экспрессии, например библиотеки фагового дисплея, трансфицируемой в Е. coli. В конечном итоге, в библиотеке выявляют клоны, обладающие желаемой величиной аффинности связывания антигена, а ДНК, которая кодирует ответственный за такое связывание продукт, выделяют и обрабатывают для обычной рекомбинантной экспрессии. Также библиотеки фагового дисплея можно конструировать с использованием предварительно обработанных последовательностей нуклеотидов и сходным образом подвергать скринингу. Как правило, кДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи, предоставляют по отдельности или в связанном виде для формирования аналогов Fv для продукции в фаговой библиотеке. Затем фаговую библиотеку скринируют на предмет антител с наивысшей аффинностью к Р-кадгерину, и из соответствующего клона выделяют генетический материал.

Дополнительные стадии скрининга могут повышать аффинность исходного выделяемого антитела.

В одном из вариантов осуществления для выделения и получения антител против Р-кадгерина человека, обладающих желаемыми характеристиками, антитело против Р-кадгерина человека, как описано в настоящей заявке, сначала используют для отбора последовательностей тяжелых и легких цепей человека со сходной активность связывания в отношении Р-кадгерина, применяя способы получения отпечатков эпитопа, описанные в публикации РСТ №WO 93/06213, которая приведена здесь полностью ссылкой. Предпочтительно, используемые в этом способе библиотеки антител представляют собой библиотеки scFv, получаемые и скринируемые, как описано в публикации РСТ №WO 92/01047, McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990); и Griffiths, et al., EMSO J. 12:725-734 (1993), все из которых приведены здесь полностью ссылкой. Библиотеки антител scFv можно скринировать с использованием Р-кадгерина человека в качестве антигена. Фаговую библиотеку скринируют на предмет антител с наивысшей аффинностью к Р-кадгерину, и выделяют генетический материал из соответствующего клона. Дополнительные стадии скрининга могут повышать аффинность исходного выделяемого антитела.

Затем, после отбора исходных доменов V _L и V _H человека, можно осуществлять эксперименты "смешивания и сопоставления", в которых различные пары исходно выбранных участков V _L и V _H скринируют на предмет связывания Р-кадгерина для отбора предпочтительных сочетаний пар V _L /V _H . Эти эксперименты по смешиванию и сопоставлению также можно осуществлять после того, как участки V _L и V _H были случайным образом изменены мутацией для оптимизации связывания, как описано ниже. Кроме того, для дальнейшего улучшения качества антитела участки V _L и V _H из предпочтительной пары(пар) V _L /V _H можно случайным образом изменять мутацией, предпочтительно в участке CDR3 V _H и/или V _L , в процессе, аналогичном процессу соматических мутаций in vivo, который ответственен за созревание аффинности антител в ходе естественной иммунной реакции. Например, такое созревание аффинности in vitro можно осуществлять амплифицированием доменов V _H и V _l с использованием праймеров для PCR, которые комплементарны CDR3 V _H или CDR3 V _L , соответственно, где праймеры были "дополнены" в определенных положениях случайной смесью из четырех нуклеотидных оснований таким образом, что получаемые продукты PCR кодируют участки V _H и V _L , в участки CDR3 V _H и/или V _L которых были введены случайные мутации. Эти измененные случайной мутацией участки V _H и V _L можно повторно скринировать на предмет связывания с Р-кадгерином, и можно отбирать последовательности, которые обладают высокой аффинностью и низкой скорость обратной реакции для Р-кадгерина. Как описано ранее, некоторые последовательности CDR3 V _H и V _L по настоящему изобретению, которые были изменены случайной мутацией и обладали улучшенной аффинностью, указаны посредством SEQ ID №:91-256 и 257-319.

После скрининга и выделения антитела против Р-кадгерина по изобретению из рекомбинантной библиотеки дисплея иммуноглобулинов нуклеиновые кислоты, кодирующие выбранное антитело, можно выделять из упаковки дисплея (например, из генома фага) и субклонировать в другие векторы экспрессии общепринятыми способами рекомбинантной ДНК. По желанию, нуклеиновую кислоту можно дополнительно обрабатывать для получения других форм антитела по настоящему изобретению, как описано ниже. Для экспрессии рекомбинантного антитела человека, выделяемого скринингом комбинаторной библиотеки, кодирующую антитело ДНК клонируют в рекомбинантный вектор экспрессии и вводят в клетку-хозяина, как описано ниже.

Иммунизация

В другом варианте осуществления антитела против Р-кадгерина человека можно получать посредством иммунизации не относящегося к человеку трансгенного животного, содержащего в своем геноме некоторые или все участки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека с антигеном Р-кадгерина. Например, не относящееся к человеку животное может представлять собой животное XENOMOUSE ™. (Abgenix, Inc., Fremont, CA).

Мыши XENOMOUSE ™ представляют собой сконструированные линии мышей, содержащих большие фрагменты участков тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина человека и являющихся дефектными по продукции мышиных антител. См., например, Green, et al., Nature Genetics, 7:13-21 (1994) и патенты США №5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 и 6150584. См. также WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 и WO 00/037504.

Описанные в этих документах способы можно изменять, как описано в патенте США № 5994619, который приведен здесь полностью ссылкой. В патенте США № 5994619 описаны способы получения новых клеток и клеточных линий культивируемой внутриклеточной массы (CICM), получаемых от свиней и коров, и трансгенных клеток CICM, в которые была вставлена гетерологичная ДНК. Трансгенные клетки CICM можно использовать для получения клонированных трансгенных эмбрионов, зародышей и потомства. Также в патенте 619 описаны способы получения трансгенных животных, способных передавать гетерологичную ДНК своим потомкам. Примеры не относящихся к человеку животных, которые можно использовать в этих способах, включают крыс, овец, свиней, коз, крупный рогатый скот, цыплят и лошадей.

Мыши XENOMOUSE ™ продуцируют сходную с принадлежащей взрослому человеку совокупность антител, полностью относящихся к человеку, а также продуцируют антигенспецифические антитела человека. В некоторых вариантах осуществления мыши XENOMOUSE ™ содержат приблизительно 80% совокупности генов V антитела человека в результате введения фрагментов участков тяжелой цепи человека и участков легкой цепи каппа в конфигурации зародышевой линии, величиной в миллион пар оснований, в искусственную хромосому дрожжей (YAC). В других вариантах осуществления мыши XENOMOUSE ™ дополнительно содержат приблизительно все участки легкой цепи лямбда человека. См. Mendez, et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495 (1998) и WO 98/24893, описания которых приведены здесь полностью ссылкой.

В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное, содержащее гены иммуноглобулинов человека, представляет собой животных, которые обладают "мини-участками" иммуноглобулинов человека. В способе мини-участков экзогенный участок Ig имитируют посредством включения отдельных генов из участка Ig. Таким образом, один или несколько генов V _H , один или несколько генов D _H , один или несколько генов J _H , константный домен мю и второй константный домен (предпочтительно, константный домен гамма) формируют в виде конструкта для введения животному. Этот способ описан в патентах США №5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 и 5643763, приведенных здесь полностью ссылкой.

Затем не относящихся к человеку животных, как описано выше, можно иммунизировать антигеном Р-кадгерина, как описано ниже, в условиях, позволяющих продукцию антител. У животных выделяют продуцирующие антитела клетки, а из выделенных клеток, продуцирующих антитела, или из иммортализованной клеточной линии, полученной из таких клеток, выделяют нуклеиновые кислоты, которые кодируют тяжелые и легкие цепи интересующего антитела против Р-кадгерина. Затем эти нуклеиновые кислоты конструируют с использованием способов, известных специалистам в данной области, и, как дополнительно описано ниже, для снижения количества не относящейся к человеку последовательности, т.е. для гуманизирования антитела для ослабления иммунной реакции у человека.

В некоторых вариантах осуществления антиген Р-кадгерина может представлять собой выделенный и/или очищенный Р-кадгерин. В некоторых вариантах осуществления антиген Р-кадгерина представляет собой Р-кадгерин человека. В других вариантах осуществления антиген Р-кадгерина может представлять собой клетку, экспрессирующую или сверхэкспрессирующую Р-кадгерин. В других вариантах осуществления антиген Р-кадгерина представляет собой рекомбинантный белок, экспрессируемый посредством рекомбинантного способа в дрожжах, клетках насекомых, бактериях, таких как Е. coli, или других источниках. Иммунизацию животных можно проводить любым известным в данной области способом. См., например, Harlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual. New York: Gold Spring. Harbor Press (1990). Способы иммунизации не относящихся к человеку животных, таких как мыши, крысы, овцы, козы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади, хорошо известны в данной области. См., например, Harlow and Lane, выше, и патент США №5994619. Например, антиген Р-кадгерина можно вводить вместе с адъювантом для стимуляции иммунной реакции. Примеры адъювантов включают полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (дипептиды мурамила) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого диспергирования посредством его изоляции в местном отложении, или они могут содержать вещества, стимулирующие организм-хозяин секретировать факторы, которые являются хемотаксическими для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно в случае введения полипептида схема иммунизации включает два или более введений полипептида, проводящихся в течение нескольких недель.

Например, после иммунизации трансгенного животного посредством Р-кадгерина, как описано выше, у иммунизированного трансгенного животного можно выделять первичные клетки (например, В-клетки селезенки или периферической крови) и можно выявлять отдельные клетки, продуцирующие антитела, которые специфичны к желаемому антигену. Затем из каждой отдельной клетки выделяют полиаденилированную мРНК и проводят полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR), используя смысловые праймеры для отжига с последовательностями вариабельных областей (например, вырожденные праймеры, распознающие большинство или все участки FR1 генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепей человека, а также антисмысловые праймеры для отжига с последовательностями константной области или соединяющей области). Затем кДНК вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей клонируют и экспрессируют в любой приемлемой клетке-хозяине, например, миеломной клетке, в виде химерных антител с соответствующими константными областями иммуноглобулинов, такими как константные домены тяжелой цепи и константные домены k или λ. См. Babcook, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-48, (1996), приведенную здесь полностью ссылкой. Затем антитела против Р-кадгерина можно выявлять и выделять, как описано в настоящей заявке.

Рекомбинантные способы получения антител

Антитело или часть антитела по изобретению можно получать рекомбинантной экспрессией генов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Например, для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, которые кодируют иммуноглобулиновые легкие и тяжелые цепи антитела таким образом, что легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, где из такой среды можно выделять антитела. Для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, для встраивания этих генов в рекомбинантные векторы экспрессии и для введения векторов в клетки-хозяева используют общепринятые способы рекомбинантной ДНК, такие как способы, описанные в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M., et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и в патенте США №4816397, описания которых приведены здесь полностью ссылкой.

Мутации и модификации

Для экспрессии антител против Р-кадгерина по настоящему изобретению фрагменты ДНК, кодирующие участки V _H и V _L , можно исходно получать с использованием любого из указанных выше способов. Также в последовательности ДНК можно вводить различные мутации, делеции и/или добавления с использованием способов, известных специалистам в данной области. Например, мутагенез можно осуществлять с использованием общепринятых способов, таких как мутагенез, опосредуемый PCR, при котором измененные мутацией нуклеотиды встраивают в праймеры для PCR таким образом, что продукт PCR содержит желаемые мутации, или сайт-направленный мутагенез. Например, одним из типов замен, которые можно осуществлять, является замена в антителе одного или нескольких цистеинов, которые могут быть химически реакционноспособны, на другой остаток, такой как, без ограничений, аланин или серин. Например, это может быть замена неканонического цистеина. Замену можно проводить в CDR или каркасной области вариабельного домена или в константном домене антитела. В некоторых вариантах осуществления цистеин является каноническим.

Также антитела можно изменять мутацией в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей, например, для изменения связывающего свойства антитела. Например, мутацию можно осуществлять в одном или нескольких участках CDR для увеличения или уменьшения величины K _D антитела относительно Р-кадгерина, увеличения или уменьшения величины k _обр или изменения специфичности связывания антитела. Способы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook, et al. and Ausubel, et al., выше, приведенный здесь полностью ссылкой. Например, как более подробно описано в примере 8, множество вариантов последовательностей CDR3 V _H и V _L из родительской 129-1с4 были получены в соответствии с описанными выше способами и указаны как SEQ ID №:91-256 (варианты CDR3 V _H ) и SEQ ID №:257-319 (варианты CDR3 V _L ) на фиг. 1.

Также мутацию можно осуществлять в каркасной области или константном домене для повышения времени полужизни антитела против Р-кадгерина. См., например, публикацию РСТ №WO 00/09560, приведенную здесь полностью ссылкой. Также мутацию в каркасной области или константном домене можно осуществлять для изменения иммуногенности антитела, обеспечения участка для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой или для изменения таких свойств, как связывание комплемента, связывание FcR или зависящая от антитела, опосредуемая клетками цитотоксичность (ADCC). По изобретению отдельное антитело может иметь мутации в любом одном или нескольких CDR или каркасных областей вариабельного домена или в константном домене.

В способе, известном как "приведение к состоянию зародышевой линии" определенные аминокислоты в последовательностях V _H и V _L можно изменять мутацией для совпадения с аминокислотами, которые встречаются в природе в последовательностях V _H и V _L зародышевой линии. В частности, аминокислотные последовательности каркасных областей в последовательностях V _H и V _L можно изменять мутацией для совпадения с последовательностями зародышевой линии для снижения риска развития иммуногенности при введении антитела. Последовательности ДНК зародышевой линии для генов V _H и V _L человека известны в данной области (см., например, базу данных последовательностей зародышевой линии человека "Vbase"; см. также Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, публикация NIH №91-3242; Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 221-776-798; и Cox, et al. Eur. J. Immunol. 24:827-836 (1994); содержания каждой из которых в явной форме приведены здесь полностью ссылкой).

Другой тип аминокислотной замены, которую можно осуществлять, представляет собой устранение возможных участков протеолиза в антителе. Такие участки могут возникать в CDR или каркасной области вариабельного домена или в константном домене антитела. Замена остатков цистеина и устранение участков протеолиза могут снижать риск гетерогенности в продукте антитела и таким образом повышать его гомогенность. Другой тип аминокислотной замены проводят для удаления пар аспарагин-глицин, формирующих возможные участки дезамидирования, посредством изменения одного или обоих остатков. В другом примере можно расщеплять С-концевой лизин тяжелой цепи антитела против Р-кадгерина по изобретению. В различных вариантах осуществления изобретения тяжелые и легкие цепи антител против Р-кадгерина могут, необязательно, содержать N-концевую сигнальную последовательность, такую как последовательности, указанные в SEQ ID №:346 и 347.

После получения фрагментов ДНК, кодирующих участки V _H и V _L по настоящему изобретению, эти фрагменты ДНК можно дополнительно обрабатывать общепринятыми способами рекомбинантной ДНК, например, преобразовывать гены вариабельных областей в гены полноразмерных цепей антитела, в гены фрагментов Fab или в ген scFv. При этих обработках фрагмент ДНК, кодирующий V _H или V _L , функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Как используют в настоящем контексте, термин "функционально связанный" предназначен для обозначения того, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в одной рамке считывания.

Выделенную ДНК, кодирующую участок V _H , можно преобразовывать в ген полноразмерной тяжелой цепи посредством функционального связывания кодирующей V _H ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, публикация NIH №91-3242), а фрагменты ДНК, содержащие эти участки, можно получать общепринятой амплификацией посредством PCR. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно, она представляет собой константную область IgG1 или IgG2. Последовательность константной области IgG1 может представлять собой любой из различных аллелей или аллотипов, которые, как известно, встречаются у различных индивидуумов, например, Gm(1), Gm(2), Gm(3) и Gm(17). Эти аллотипы отражают возникающую в природе аминокислотную замену в константных областях IgG1. Например, константная область тяжелой цепи IgG1 может представлять собой SEQ ID №:344. В случае гена фрагмента Fab тяжелой цепи ДНК, кодирующую V _H , можно функционально связывать с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область тяжелой цепи СН1. Константную область тяжелой цепи СН1 можно получать из любого из генов тяжелой цепи.

Выделенную ДНК, кодирующую участок V _L , можно преобразовывать в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген Fab легкой цепи) посредством функционального связывания кодирующей V _L ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, C _L . Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, публикация NIH №91-3242), а фрагменты ДНК, содержащие эти участки, можно получать общепринятой амплификацией посредством PCR. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда. Константная область каппа может представлять собой любой из различных аллелей, которые, как известно, встречаются у различных индивидуумов, например, Inv(1), Inv(2) и Inv(3). Константную область лямбда можно получать из любого из трех генов лямбда. Например, константная область легкой цепи IgG1 может представлять собой SEQ ID №:347.

Для получения гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие V _H и V _L , функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly ₄ -Ser) ₃ таким образом, что последовательности V _H и V _L могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, где участки V _L и V _H соединены гибким линкером (см., например, Bird et al. Science 242:423-426 (1988); Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty, et al., Nature, 348:552-554 (1990)). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если используют только одни V _H и V _L , бивалентным, если используют два V _H и V _L , или поливалентным, если используют более двух V _H и V _L . Можно получать биспецифические или поливалентные антитела, связывающиеся специфично с Р-кадгерином и другой молекулой.

В другом варианте осуществления можно получать слитое антитело или иммуноадгезивное вещество, которые содержат все или участок антитела против Р-кадгерина по изобретению, связанные с другим полипептидом. В другом варианте осуществления с полипептидом связаны только вариабельные домены антитела против Р-кадгерина. В другом варианте осуществления домен V _H антитела против Р-кадгерина связан, с первым полипептидом, тогда как домен V _L антитела против Р-кадгерина связан со вторым полипептидом, который объединен с первым полипептидом таким образом, что домены V _H и V _L могут взаимодействовать друг с другом, образуя антигенсвязывающую часть. В другом варианте осуществления домен V _H отделен от домена V _L линкером таким образом, что домены V _H и V _L могут взаимодействовать друг с другом. Затем антитело V _H -линкер-V _L связывают с интересующим полипептидом. Кроме того, можно получать слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела связаны друг с другом. Это эффективно при желании получить двухвалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи или при желании получить биспецифическое антитело.

В других вариантах осуществления можно получать другие модифицированные антитела с использованием молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против Р-кадгерина. Например, "каппа-тела" (III, et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), "мини-тела" (Martin, et al., EMBO J., 13:5303-9 (1994)), "димеры" (Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:6444-6448 (1993)) или "Janusins" (Traunecker, et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) и Traunecker, et al., Int. J. Cancer, (Suppl.) 7:51-52 (1992)) можно получать с использованием общепринятых способов молекулярной биологии в соответствии с указаниями в описании.

Биспецифические антитела или антигенсвязывающие фрагменты можно получать множеством способов, в том числе слиянием гибридом или связыванием фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990), Kostelny, et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992). Кроме того, биспецифические антитела можно формировать в виде "димеров" или "Janusins". В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело связывается с двумя различными эпитопами Р-кадгерина. В некоторых вариантах осуществления описанные выше модифицированные антитела получают с использованием одного или нескольких вариабельных доменов или участков CDR из предоставленного в настоящей заявке антитела против Р-кадгерина человека.

Векторы и клетки-хозяева

Для экспрессии антител и антигенсвязывающих частей по изобретению ДНК, получаемые, как описано выше, которые кодируют части или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, встраивают в векторы экспрессии таким образом, что гены оказываются функционально связанными с последовательностями, которые контролируют транскрипцию и трансляцию. В этом контексте термин "функционально связанный" предназначен для обозначения того, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности в векторе выполняют предназначенную им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и контролирующие экспрессию последовательности выбирают, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Векторы экспрессии включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирус табачной мозаики, космиды, YAC, эписомы, получаемые из EBV, и т.п. Ген антитела лигируют в вектор таким образом, что контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности в векторе выполняют предназначенную им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и контролирующие экспрессию последовательности выбирают, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно вставлять в отдельные векторы. В предпочтительном варианте осуществления оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вставляют в вектор экспрессии общепринятыми способами (например, лигированием комплементарных участков рестрикции во фрагменте гена антитела и векторе или лигированием тупых концов в случае отсутствия участков рестрикции).

Удобным вектором является вектор, кодирующий функционально полную последовательность C _H или C _L иммуноглобулина человека вместе с соответствующими участками рестрикции, которые сконструированы таким образом, что любую последовательность V _H или V _L можно легко вставлять и экспрессировать, как описано выше. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между донорским участком сплайсинга во вставленном участке J и акцепторным участком сплайсинга, предшествующим домену С человека, а также в участках сплайсинга, возникающих в экзонах C _H человека.

Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в природных участках хромосом, расположенных ниже кодирующих участков. Также рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, способствующий секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, что сигнальный пептид оказывается связанным в одной рамке считывания с аминоконцевым участком цепи иммуноглобулина. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, не относящегося к иммуноглобулинам).

Кроме генов цепей антитела, рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению содержат регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Специалисты в данной области понимают, что схема вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор подлежащей трансформации клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка и т.п. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяина млекопитающего включают в себя вирусные элементы, приводящие к экспрессии белка в клетках млекопитающих на высоких уровнях, например, промоторы и/или энхансеры, получаемые из ретровирусных LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, промотор/энхансер CMV), вирус обезьяны 40 (SV40) (например, промотор/энхансер SV40), аденовируса, (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)), полиомы, а также такие сильные промоторы млекопитающих, как природные промоторы иммуноглобулинов и актина. Для дополнительного описания вирусных ретуляторных элементов и их последовательностей см., например, патенты США № 5168062, 4510245 и 4968615. Способы экспрессии антител в растениях, включая описание промоторов и векторов, а также трансформации растений, известны в данной области. См., например, патент США № 6517529, приведенный здесь полностью ссылкой. Также в данной области хорошо известны способы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках.

Кроме генов цепей антитела и ретуляторных последовательностей рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, участки инициации репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера способствует селекции клеток-хозяев, в которых был введен вектор (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017, приведенные здесь полностью ссылкой). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолат-редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах вместе с селекцией/амплификацией метотрексата), ген неомицин-фосфотрансферазы (для селекции G418) и ген глутамат-синтетазы.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела против Р-кадгерина, и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот, можно использовать для трансфекции приемлемой клетки-хозяина млекопитающих, растений, бактерий или дрожжей. Трансформацию можно осуществлять любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают трансфекцию, опосредуемую декстраном, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую полибреном, слияние протопластов, электропорацию, заключение полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот можно вводить в клетки млекопитающих посредством вирусных векторов. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области. См., например, патенты США №4399216, 4912040, 4740461 и 4959455, приведенные здесь полностью ссылкой. Способы трансформации растительных клеток хорошо известны в данной области, включая, например, трансформацию, опосредуемую Agrobacterium, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Также в данной области хорошо известны способы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток.

Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве клеток-хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных клеточных линий, доступных в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Например, они включают в себя клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки NSO, клетки SP2, клетки HEK-293Т, клетки NIH-3T3, клетки HeLa, эмбриональные клетки почки хомячка (BHK), клетки почки африканской зеленой мартышки (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки А549 и множество других линий клеток. Особенно предпочтительные линии клеток выбирают, определяя, какие из клеточных линий обладают экспрессией на высоком уровне. Другие линии клеток, которые можно использовать, представляют собой линии клеток насекомых, например, клетки Sf9 или Sf21. В случае введения рекомбинантных векторов экспрессии, кодирующих гены антитела, в клетки-хозяева млекопитающих антитела получают посредством культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для предоставления возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно выделять из культуральной среды с использованием общепринятых способов очистки белков. Растительные клетки-хозяева включают в себя, например, Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.п. Бактериальные клетки-хозяева включают виды Е. coli и Streptomyces. Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Кроме того, экспрессию антител по изобретению в продуцирующих клеточных линиях можно повышать с использованием множества известных способов. Например, общепринятые способы повышения экспрессии в определенных условиях представляют собой системы экспрессии глутамин-синтетазы (система GS) и гена DHFR. Клеточные клоны с высокой экспрессией можно выявлять с использованием общепринятых способов, таких как клонирование серийными разведениями и способ микрокапель. Система GS описана в европейских патентах № 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.

Вероятно, антитела, экспрессируемые различными линиями клеток или в трансгенных животных, отличаются друг от друга различным гликозилированием. Однако все антитела, которые кодируются предоставленными в настоящей заявке молекулами нуклеиновых кислот или которые содержат предоставленные в настоящей заявке последовательности аминокислот, являются частью настоящего изобретения вне зависимости от гликозилирования антител.

Трансгенные животные и растения

Также антитела против Р-кадгерина по изобретению можно получать трансгенно посредством размножения млекопитающего или растения, которое является трансгенным в отношении интересующих последовательностей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, и получения из них антитела в пригодной для выделения форме. Применительно к трансгенной продукции в млекопитающих антитела против Р-кадгерина можно получать в и выделять из молока коз, коров или других млекопитающих. См., например, патенты США № 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957, приведенные здесь полностью ссылкой. В некоторых вариантах осуществления не относящихся к человеку трансгенных животных, которые содержат участки иммуноглобулинов человека, иммунизируют Р-кадгерином или его иммуногенной частью, как описано выше. Способы получения антител в растениях описаны, например, в патентах США № 6046037 и 5959177, приведенных здесь полностью ссылкой.

В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку трансгенные животные или растения получают введением общепринятыми трансгенными способами в животное или растение одной или нескольких молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против Р-кадгерина или его антигенсвязывающая часть по изобретению. См. Hogan и патент США №6417429, выше. Трансгенные клетки, используемые для получения трансгенного животного, могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки или соматические клетки, или оплодотворенную яйцеклетку. Не относящиеся к человеку трансгенные организмы могут быть химерными, нехимерными гетерозиготами и нехимерными гомозиготами. См., например, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2 ^nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson, et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); и Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999), все из которых приведены здесь полностью ссылкой. В некоторых вариантах осуществления не относящиеся к человеку трансгенные животные содержат заданный разрыв и замену посредством нацеленного конструкта, кодирующего интересующую тяжелую цепь и/или легкую цепь. Антитела против Р-кадгерина можно получать в любом трансгенном животном. В предпочтительном варианте осуществления не относящиеся к человеку животные представляют собой мышей, крыс, овец, свиней, коз, крупный рогатый скот или лошадей. Не относящиеся к человеку трансгенные животные экспрессируют указанные кодируемые полипептиды в крови, молоке, моче, слюне, слезной жидкости, слизи и других жидкостях организма.

Переключение класса

Класс (например, IgG, IgM, IgE, IgA или IgD) и подкласс (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) антител против Р-кадгерина можно определять любым известным в данной области способом. Как правило, класс и подкласс антитела можно определять с использованием антител, специфичных к конкретному классу и подклассу антитела. Такие антитела являются коммерчески доступными. Класс и подкласс можно определять посредством ELISA или Вестерн-блоттингом, а также другими способами. Альтернативно, класс и подкласс можно определять секвенированием всех или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей антител, сравнением их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различного класса и подкласса иммуноглобулинов и определением класса и подкласса антител. Антитела против Р-кадгерина по настоящему изобретению могут представлять собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. Например, антитела против Р-кадгерина могут представлять собой IgG, относящийся к подклассу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном из вариантов осуществления антитела против Р-кадгерина могут иметь константную область тяжелой цепи, указанную посредством SEQ ID №:344, и константную область легкой цепи, указанную посредством SEQ ID №:345.

В одном из аспектов изобретение относится к способу преобразования класса или подкласса антитела против Р-кадгерина в другой класс или подкласс. В некоторых вариантах осуществления с использованием хорошо известных в данной области способов выделяют кодирующую V _L или V _h молекулу нуклеиновой кислоты, которая не содержит последовательностей, кодирующих C _L или C _H . Затем молекулу нуклеиновой кислоты функционально связывают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей C _L или C _H из иммуноглобулина желаемого класса или подкласса. Это можно осуществлять с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, содержащих цепь C _L или C _H , как описано выше. Например, класс антитела против Р-кадгерина, исходно являвшегося IgM, можно переключить на IgG. Кроме того, переключение класса можно использовать для преобразования одного подкласса IgG на другой, например, с IgG1 на IgG2. Другой способ получения антитела по изобретению, содержащего желаемый изотип, включает стадии выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела против Р-кадгерина, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела против Р-кадгерина, выделения последовательности, кодирующей участок V _H , лигирования последовательности V _H и последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи желаемого изотипа, экспрессии гена легкой цепи и конструкта тяжелой цепи в клетке и получения антитела против Р-кадгерина желаемого изотипа.

Деиммунизированные антитела

В другом аспекте изобретения антитела или их антигенсвязывающие части можно деиммунизировать для снижения их иммуногенности с использованием способов, описанных, например, в публикациях РСТ № WO98/52976 и WO00/34317 (которые приведены здесь полностью ссылкой).

Дериватизированные и меченные антитела

Антитело против Р-кадгерина или антигенсвязывающие части по изобретению можно дериватизировать или связывать с другой молекулой (например, другим пептидом или белком). Как правило, антитела или их части дериватизируют таким образом, что дериватизация или мечение не оказывают неблагоприятное влияние на связывание Р-кадгерина. Соответственно, подразумевают, что антитела и участки антител по изобретению включают исходные и модифицированные формы антител против Р-кадгерина человека, описанные в настоящей заявке. Например, антитело или часть антитела по изобретению можно функционально связывать (химическим связыванием, генетическим слиянием, нековалентной связью или иным способом) с одной или несколькими другими молекулами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или димер), средство для регистрации, метка, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые способны опосредовать связь антитела или части антитела с другой молекулой (например, внутренняя область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Один из типов дериватизированного антитела получают посредством сшивки двух или более антител (одинакового типа или различного типа, например, для получения биспецифических антител). Приемлемые средства для сшивки включают средства, которые являются гетеробифункциональными, обладая двумя различными реакционноспособными группами, разделенными соответствующим спейсером (например, сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида), или являются гомобифункциональными (например, суберат дисукцинимидила). Такие линкеры доступны в Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Другой тип дериватизированного антитела представляет собой меченное антитело. Эффективные средства для регистрации, посредством которых можно дериватизировать антитело или антигенсвязывающая часть по изобретению, включают флуоресцентные соединения, в том числе флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, хлорид 5-диметиламин-1-нафталинсульфонила, фикоэритрин, лантанидные люминофоры и т.п. Также антитело можно метить эффективными для регистрации ферментами, такими как пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозоксидаза и т.п. Если антитело метят поддающимся выявлению ферментом, то его выявляют добавлением дополнительных реагентов, используемых ферментом для продуцирования продукта реакции, который можно регистрировать. Например, когда присутствует средство в виде пероксидазы хрена, то добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, поддающемуся регистрации. Также антитело можно метить биотином и выявлять косвенным измерением связывания авидина или стрептавидина. Также антитело можно метить заранее заданным полипептидным эпитопом, распознаваемым вторичным репортером (например, парными последовательностями лейциновых застежек, участками связывания для вторичных антител, доменами связывания металлов, эпитопными метками). В некоторых вариантах осуществления метки присоединяют посредством спейсерных участков различной длины для снижения возможного стерического препятствия. Также антитело против Р-кадгерина можно дериватизировать химической группой, такой как полиэтиленгликоль (PEG), метильная или этильная группа, или углеводная группа. Эти группы эффективны для улучшения биологических характеристик антитела, например, для увеличения времени полужизни в сыворотке.

Аффинность связывания антител против Р-кадгерина с Р-кадгерином

Аффиность связывания (K _D ) и скорость диссоциации (k _обр ) антитела: против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части относительно Р-кадгерина можно определять известными в данной области способами. Аффинность связывания можно измерять посредством ELISA, RIA, проточной цитометрии или поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE ™. Скорость диссоциации можно измерять поверхностным плазмонным резонансом.

Предпочтительно аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют поверхностным плазмонным резонансом. Более предпочтительно аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют с использованием BIACORE ™. Обладает ли антитело практически такой же величиной K _D , что и антитело против Р-кадгерина, можно определять с использованием известных в данной области способов. Такие способы определения K _D и k _обр можно использовать в ходе стадии исходного скрининга, а также в ходе последующих стадий оптимизации.

Выявление эпитопов Р-кадгерина, распознаваемых антителами против Р-кадгерина

Изобретение относится к антителам против Р-кадгерина человека, связывающимся с Р-кадгерином и конкурирующим или перекрестно конкурирующим за и/или связывающимся с тем же эпитопом, что и любое из антител, описанных в табл. 1 или 2. Связывается ли антитело с тем же эпитопом или перекрестно конкурирует за связывание с антителом против Р-кадгерина по настоящему изобретению можно определять с использованием известных в данной области способов. В одном из вариантов осуществления антителу против Р-кадгерина по изобретению позволяют связываться с Р-кадгерином в насыщающих условиях, а затем измеряют способность тестируемого антитела связываться с Р-кадгерином. Если тестируемое антитело способно связываться с Р-кадгерином в то же время, что и антитело против Р-кадгерина, следовательно тестируемое антитело связывается с эпитопом, отличным от эпитопа для антитела против Р-кадгерина. Однако если тестируемое антитело не способно в одно и то же время связываться с Р-кадгерином, следовательно тестируемое антитело связывается с тем же самым эпитопом, перекрывающимся эпитопом или эпитопом, который расположен в непосредственной близости от эпитопа, связываемого антителом, против Р-кадгерина человека. Этот эксперимент можно проводить, с использованием ELISA, RIA, BIACORE ™ или проточной цитометрии. В предпочтительном варианте осуществления эксперимент проводят с использованием ELISA.

Ингибирование активности Р-кадгерина антителом против Р-кадгерина

Антитела против Р-кадгерина, ингибирующие активность Р-кадгерина, можно выявлять с использованием множества анализов. Например, анализ агрегации клеток обеспечивает способ измерения клеточной агрегации, зависящей от Р-кадгерина. В этом типе анализа используют линию клеток, сверхэкспрессирующих Р-кадгерин, где клетки помещают в суспензию и позволяют образовывать зависящие от Р-кадгерина скопления. Затем анализ агрегации используют для количественного определения способности антитела против Р-кадгерина предотвращать эту агрегацию посредством измерения размера клеточных скоплений, образующихся при наличии и отсутствии антитела. Затем размер скопления клеток как функцию концентрации антитела против Р-кадгерина можно использовать для определения величины IC ₅₀ . В примере 4 представлены дополнительные подробности анализа зависящей от Р-кадгерина агрегации, использованного для измерения величин IC ₅₀ для нескольких антител против Р-кадгерина.

Также для измерения способности антитела против Р-кадгерина блокировать адгезию клеток к рецептору Р-кадгерина, зафиксированному на твердом носителе, можно использовать анализы клеточной адгезии. Например, этот тип анализа можно проводить посредством фиксирования Р-кадгерина на твердом носителе, таком как пластмасса. Затем сверхэкспрессирующим Р-кадгерин клеткам позволяют прикрепляться к твердому носителю посредством взаимодействий Р-кадгерин-Р-кадгерин. После этого можно количественно определять степень адгезии при наличии и отсутствии антитела против Р-кадгерина. Затем величину адгезии как функцию концентрации антитела используют для определения величины IC ₅₀ . В примере 3 представлены дополнительные подробности анализа зависящей от Р-кадгерина адгезии клеток, который использовали для измерения величине IC ₅₀ для антител против Р-кадгерина.

Ингибирование активности Р-кадгерина также можно измерять с использованием анализа зависящего от Р-кадгерина распада шаровидного образования. Этот тип анализа измеряет способность антитела против Р-кадгерина разрушать предварительно образованные клеточные скопления, зависящие от Р-кадгерина. Величину IC ₅₀ можно определять посредством измерения уменьшения размера скоплений как функции концентрации антитела. В примере 5 представлены дополнительные подробности анализа зависящего от Р-кадгерина распада шаровидного образования, который использовали для измерения величин IC ₅₀ для антител против Р-кадгерина. Описанные выше способы и анализы для определения ингибирования активности Р-кадгерина различными антителами или их антигенсвязывающими частями можно использовать в ходе стадии исходного скрининга, а также в ходе последующих стадий оптимизации.

Молекулярная избирательность

Избирательность антител против Р-кадгерина по настоящему изобретению относительно других кадгеринов, таких как Е-кадгерин, можно определять с использованием хорошо известных в данной области способов. Например, избирательность можно определять с использованием Вестерн-блоттинга, проточной цитометрии, ELISA, иммунопреципитации или RIA. В примере 7 представлены дополнительные подробности анализа ELISA, который использовали для измерения избирательности специфических антител по отношению к Р-кадгерину в сравнении с Е-кадгерином. Описанные выше способы и анализы для определения избирательности различных антител или их антигенсвязывающих частей в отношении Р-кадгерина можно использовать в ходе стадии исходного скрининга, а также в ходе последующих стадий оптимизации.

Фармацевтические композиции и введение

Также это изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения патологического клеточного роста у млекопитающего, в том числе человека, содержащей количество антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, как описано в настоящей заявке, которое эффективно для лечения патологического клеточного роста, а также содержащей фармацевтически приемлемый носитель.

Антитела и антигенсвязывающие части по настоящему изобретению можно включать в фармацевтические композиции, приемлемые для введения индивидууму. Как правило, фармацевтическая композиция содержит антитело или антигенсвязывающую часть по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В рамках настоящей заявки "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает все без исключения растворители, диспергирующие среды, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых носителей представляют собой воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их сочетания. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические средства, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых веществ представляют собой увлажнители или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, консерванты или буферные вещества, которые повышают срок хранения или эффективность антитела.

Композиции по этому изобретению могут находиться во множестве форм, например жидкой, полутвердой и твердой лекарственных формах, таких как жидкие растворы (например, растворы, вводимые инъекцией и инфузией), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Как правило, предпочтительные композиции находятся в виде растворов, вводимых инъекцией или инфузией, например композиции, сходные с композициями, которые используют для пассивной иммунизации человека. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводят внутривенной инфузией или инъекцией. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело вводят внутримышечной или подкожной инъекцией. Препараты для инъекции могут находиться в виде стандартной лекарственной формы, например в ампулах или содержащих множество доз контейнерах, при наличии или отсутствии добавляемого консерванта. Композиции могут находиться в виде таких форм, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, а также могут содержать способствующие составлению средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в виде порошка для составления с приемлемым носителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием.

Как правило, терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой заданной структуры, приемлемой для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные растворы, вводимые инъекцией, можно получать включением антитела против Р-кадгерина в необходимом количестве в соответствующий растворитель вместе с одним или сочетанием описанных выше ингредиентов, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают включением активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсную среду и другие необходимые ингредиенты из числа тех, что указаны выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов, вводимых инъекцией, предпочтительными способами получения являются сушка в вакууме и лиофилизация, приводящие к получению порошка активного ингредиента вместе с любым дополнительным желаемым ингредиентом из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, с использованием такого покрытия, как лецитин, посредством обеспечения необходимого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Продолжительное всасывание композиций, вводимых инъекцией, можно обеспечивать включением в композицию средства, замедляющего всасывание, например, солей моностеарата и желатина.

Антитела или участки антител по настоящему изобретению можно вводить множеством известных в данной области способов, хотя для многих вариантов терапевтического применения предпочтительным способом/схемой введения является подкожное, внутримышечное введение или внутривенная инфузия. Как понимает специалист в данной области, способ и/или схема введения различается в зависимости от желаемых результатов.

В определенных вариантах осуществления композиции антитела по настоящему изобретению можно получать вместе с носителем, предохраняющим антитело от быстрого высвобождения, например, в виде препарата с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и системы доставки в микрокапсулах. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимер молочной кислоты. Как правило, специалистам в данной области известно множество способов получения таких составов. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, приведенную здесь полностью ссылкой.

Также в композиции можно включать дополнительные активные соединения. В определенных вариантах осуществления ингибирующее антитело против Р-кадгерина по изобретению составляют совместно с и/или вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами. Эти средства включают, без ограничений, антитела, связывающие другие мишени, противоопухолевые средства, антиангиогенные средства, ингибиторы передачи сигнала, антипролиферативные средства, химиотерапевтические средства или пептидные аналоги, ингибирующие Р-кадгерин. Для таких вариантов сочетанной терапии могут быть необходимы более низкие дозы ингибирующего антитела против Р-кадгерина, а также совместно вводимых средств, что соответственно позволяет избегать возможной токсичности или осложнений, связанных с различными вариантами монотерапии.

Композиции по изобретению могут содержать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или антигенсвязывающего участка по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое эффективно при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающей части может различаться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, а также способность антитела или части антитела вызывать у индивидуума желаемую реакцию. Также терапевтически эффективное количество представляет собой количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты превосходят какие-либо токсические или неблагоприятные эффекты антитела или антигенсвязывающей части. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, которое эффективно при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу используют для индивидуумов до развития или на ранней стадии заболевания, то профилактически эффективное количество может быть меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Схемы введения доз можно приспосабливать для обеспечения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической или профилактической реакции). Например, можно вводить разовую ударную дозу, можно вводить несколько отдельных доз в течение определенного времени или дозу можно пропорционально снижать или повышать, как указывается потребностью терапевтической ситуации. Особенно эффективным является составление композиций для парентерального введения в единичной дозированной форме для облегчения введения и равномерности дозы. В рамках настоящей заявки единичная дозированная форма относится к физически обособленным формам, пригодным в качестве разовых доз для подлежащих лечению индивидуумов, относящихся к млекопитающим; каждая форма содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для оказывания желаемого терапевтического эффекта, вместе с требуемым фармацевтическим носителем. Описание стандартных лекарственных форм по изобретению обусловлено и непосредственно зависит от: а) уникальных характеристик антитела против Р-кадгерина или его части и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который следует достигнуть, а также (b) ограничений, присущих данной области составления такого антитела для лечения восприимчивости у индивидуумов.

Пример неограничивающего диапазона для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела по изобретению составляет от 0,025 до 50 мг/кг, более предпочтительно - от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно 0,1-25, от 0,1 до 10 или от 0,1 до 3 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления препарат содержит 5 мг/мл антитела в буфере из 20 мМ цитрата натрия, рН 5,5, 140 мМ NaCl и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Следует отметить, что величины доз могут различаться в зависимости от вида и тяжести состояния, подлежащего облегчению. Кроме того, следует понимать, что для каждого конкретного индивидуума конкретные схемы введения доз с течением времени следует регулировать в соответствии с потребностями индивидуума и профессиональным решением индивидуума, вводящего или контролирующего введение композиций, и что указанные в настоящей заявке диапазоны доз предназначены только для примера и не предназначены для ограничения объема или применения на практике заявленной композиции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам, содержащим антитело против Р-кадгерина или антигенсвязывающая часть по изобретению или композицию, которая содержит такое антитело или часть. Кроме антитела или композиции, набор может содержать диагностические или терапевтические средства. Также набор может содержать инструкции для применения в способе диагностики или лечения. В предпочтительном варианте осуществления набор содержит антитело или содержащую его композицию, а также диагностическое средство, которое можно использовать в описанном ниже способе. В другом предпочтительном варианте осуществления набор содержит антитело или содержащую его композицию и одно или несколько терапевтических средств, которые можно использовать в описанном ниже способе.

Используемые способы диагностики

Антитела против Р-кадгерина или их антигенсвязывающие части можно использовать в способах диагностики для выявления Р-кадгерина в биологическом образце in vitro или in vivo. Например, антитела против Р-кадгерина можно использовать в общепринятом иммуноанализе, в том числе, без ограничений, ELISA, RIA, проточной цитометрии, иммуногистохимии тканей, Вестерн-блоттинге или иммунопреципитации. Антитела против Р-кадгерина по изобретению можно использовать для выявления Р-кадгерина у человека. Также антитела против Р-кадгерина можно использовать для выявления Р-кадгерина у мышей, крыс и яванских макак.

Изобретение относится к способу выявления Р-кадгерина в биологическом образце, включающему контактирование биологического образца с антителом против Р-кадгерина по изобретению и выявление связавшегося антитела. В одном из вариантов осуществления антитело против Р-кадгерина непосредственно метят поддающейся выявлению меткой. В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина (первое антитело) является немеченым, а метят второе антитело или другую молекулу, способную связывать антитело против Р-кадгерина. Как хорошо известно специалисту в данной области, второе антитело выбирают так, чтобы оно было способно специфично связывать первое антитело конкретного вида и класса. Например, если антитело против Р-кадгерина представляет собой IgG человека, то вторичное антитело должно представлять собой антитело против IgG человека. Другие молекулы, способные связываться с антителами, включают в себя, но ими не ограничиваются, белок А и белок G, оба из которых коммерчески доступны, например, в Pierce Chemical Co.

Приемлемые метки для антитела или вторичного антитела были описаны ранее и включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры приемлемых ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры приемлемых комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры приемлемых флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, хлорид дансила или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; а примеры приемлемого радиоактивного вещества включают ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ³⁵ S или ³ Н.

В других вариантах осуществления Р-кадгерин можно анализировать в биологическом образце посредством конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов Р-кадгерина, меченных поддающимся выявлению веществом, и немеченого антитела против Р-кадгерина. В этом анализе сочетают биологический образец, меченные стандарты Р-кадгерина и антитело против Р-кадгерина и определяют количество меченного стандарта Р-кадгерина, связавшегося с немеченым антителом. Количество Р-кадгерина в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченного стандарта Р-кадгерина, связавшегося с антителом против Р-кадгерина.

Описанные выше иммуноанализы можно использовать для множества целей. Например, антитела против Р-кадгерина можно использовать для выявления Р-кадгерина в культивируемых клетках. В предпочтительном варианте осуществления антитела против Р-кадгерина используют для определения количества Р-кадгерина, продуцируемого клетками, которые были обработаны различными соединениями. Этот способ можно использовать для выявления соединений, регулирующих уровни белка Р-кадгерина. В соответствии с этим способом один образец клеток в течение определенного периода времени обрабатывают тестируемым соединением, тогда как другой образец оставляют необработанным. Если следует измерить общий уровень Р-кадгерина, то клетки лизируют и определяют общий уровень Р-кадгерина с использованием одного из описанных выше иммуноанализов. Для определения эффекта тестируемого соединения сравнивают общий уровень Р-кадгерина в обработанных и необработанных клетках.

Предпочтительный иммуноанализ для измерения общих уровней Р-кадгерина представляет собой проточную цитометрию или иммуногистохимию. Такие способы, как ELISA, RIA, проточная цитометрия, Вестерн-блоттинг, иммуногистохимия, мечение интегральных мембранных белков на клеточной поверхности и иммунопреципитация хорошо известны в данной области. См., например, Harlow and Lane, выше. Кроме того, масштаб иммуноанализов можно приспосабливать к высокопроизводительному скринингу для тестирования большого количества соединений на предмет активации или ингибирования экспрессии Р-кадгерина.

Также антитела против Р-кадгерина по изобретению можно использовать для определения уровней Р-кадгерина в ткани или в получаемых из ткани клетках. В некоторых вариантах осуществления ткань представляет собой пораженную заболеванием ткань. В некоторых вариантах осуществления способа ткань или ее биоптат иссекают у пациента. Затем ткань или биоптат используют в иммуноанализе для определения, например, общих уровней Р-кадгерина или местоположения Р-кадгерина посредством описанных выше способов.

Также антитела по настоящему изобретению можно использовать in vivo для выявления тканей и органов, экспрессирующих Р-кадгерин. Одно из преимуществ использования антител против Р-кадгерина человека по настоящему изобретению состоит в том, что их можно безопасно использовать in vivo в отсутствии вызова значительной иммунной реакции на антитело после введения, в отличие от антител из не относящегося к человеку источника или гуманизированных или химерных антител.

Способ включает стадии введения меченного поддающейся выявлению меткой антитела против Р-кадгерина или содержащей их композиции пациенту при необходимости такого диагностического теста, а также проведения пациенту анализа получения изображения для определения расположения экспрессирующих Р-кадгерин тканей. Анализ получения изображения хорошо известен в области медицины и включает в себя, но ими не ограничивается, рентгенографию, магнитно-резонансную томографию (MRI) или компьютерную томографию (СТ). Антитело можно метить любым веществом, приемлемым для получения изображения in vivo, например, контрастным веществом, таким как барий, который можно использовать в рентгенографии, или магнитным контрастным веществом, таким как хелат гадолиния, который можно использовать для MRI или СТ. Другие метки включают в себя, но ими не ограничиваются, радиоактивные изотопы, такие как ⁹⁹ Тс. В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина является немеченым, и его изображение получают введением второго антитела или другой молекулы, которая поддается выявлению и которая способна связывать антитело против Р-кадгерина. В одном из вариантов осуществления биоптат получают у пациента для определения того, экспрессирует ли интересующая ткань Р-кадгерин.

Используемые терапевтические способы

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования активности Р-кадгерина посредством введения пациенту антитела против Р-кадгерина при необходимости этого. Любое из описанных в настоящей заявке антител или их антигенсвязывающих частей можно использовать терапевтически. В предпочтительном варианте осуществления антитело против Р-кадгерина представляет собой принадлежащее человеку, химерное или гуманизированное антитело. В другом предпочтительном варианте осуществления Р-кадгерин принадлежит человеку, а пациент представляет собой пациента человека. Альтернативно, пациент может представлять собой млекопитающее, экспрессирующее Р-кадгерин, с которым перекрестно реагирует антитело против Р-кадгерина. Антитело можно вводить не относящемуся к человеку млекопитающему, экспрессирующему Р-кадгерин, с которым перекрестно реагирует антитело, (например, крысе, мыши или яванскому макаку) для ветеринарных целей или в качестве животной модели заболевания человека. Такие животные модели могут быть эффективны для оценки терапевтической эффективности антител по этому изобретению.

В другом варианте осуществления антитело против Р-кадгерина или часть антитела можно вводить пациенту, экспрессирующему Р-кадгерин на несоответствующе высоких уровнях. Антитело можно вводить один раз, однако более предпочтительно многократное введение. Антитело можно вводить от трех раз в сутки до одного раза в каждые шесть месяцев или в более длительный период. Введение можно осуществлять по такой схеме, как три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, один раз в каждые двое суток, один раз в каждые трое суток, один раз в неделю, один раз в каждые две недели, один раз в каждый месяц, один раз в каждые два месяца, один раз в каждые три месяца и один раз в каждые шесть месяцев. Также антитело можно вводить непрерывно посредством мини-помпы. Антитело можно вводить в слизистую, буккально, интраназально, посредством ингаляции, внутривенным, подкожным, внутримышечным, парентеральным или внутриопухолевым способом. Антитело можно вводить один раз, по крайней мере два раза или по крайней мере в течение периода времени, пока состояние лечат, временно облегчают или вылечивают. Как правило, антитело вводят до тех пор, пока присутствует состояние. Обычно антитело вводят в виде части фармацевтической композиции, как описано выше. Как правило, доза антитела находится в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг, более предпочтительно от 0,5 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 1 до 20 мг/кг, а еще более предпочтительно от 1 до 10 мг/кг. Концентрацию антитела в сыворотке можно измерять любым известным в данной области способом.

Также это изобретение относится к способу лечения патологического роста клеток у млекопитающего, в том числе человека, где способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, как описано в настоящей заявке, которое эффективно для лечения патологического клеточного роста.

В одном из вариантов осуществления этого способа патологический рост клеток представляет собой рак, включая в себя, но ими не ограничиваясь, мезотелиому, гепатобилиарный рак (печени и желчных протоков), первичную или вторичную опухоль ЦНС, первичную или вторичную опухоль головного мозга, рак легких (NSCLC и SCLC), рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак яичника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта (желудочный, колоректальный и дуоденальный), рак молочной железы, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному наружных женских половых органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягкой ткани, рак уретры, рак мужского полового члена, рак предстательной железы, рак семенников, хронический или острый лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфоцитарные лимфомы, рак мочевого пузыря, рак почек или мочеточника, карциному эпителия почек, карциному почечной лоханки, неоплазию центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, неходжкинскую лимфому, опухоли позвоночника, глиому ствола мозга, аденому гипофиза, рак коры надпочечников, рак желчного пузыря, множественную миелому, холангиокарциному, фибросаркому, нейробластому, ретинобластому или сочетание одного или нескольких вышеописанных вариантов рака.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак выбирают из рака легких (NSCLC и SCLC), рака головы или шеи, рака яичника, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака анальной области, рака желудка, рака молочной железы, рака почек или мочеточника, карциномы эпителия почек, карциномы почечной лоханки, неоплазии центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы ЦНС, неходжкинской лимфомы, опухолей позвоночника или сочетания одного или нескольких вышеописанных вариантов рака.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рак выбирают из рака легких (NSCLC и SCLC), рака яичника, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака анальной области или сочетания одного или нескольких вышеописанных вариантов рака.

В другом варианте осуществления указанного способа указанный патологический рост клеток представляет собой доброкачественное пролиферативное заболевание, включая в себя, но ими не ограничиваясь, псориаз, доброкачественную гипертрофию предстательной железы или рестеноз.

Также это изобретение относится к способу лечения патологического роста клеток у млекопитающего, где способ включает введение указанному млекопитающему количества антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающего участка, как описано в настоящей заявке, которое эффективно для лечения патологического клеточного роста, в сочетании с противоопухолевым средством, выбранным из группы, которая состоит из ингибиторов митоза, алкилирующих веществ, антиметаболитов, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов факторов роста, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомеразы, регуляторов биологических реакций, антител, цитотоксических веществ, антигормонов и антиандрогенов.

Также изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения патологического роста клеток у млекопитающего, в том числе человека, которая включает количество антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, как описано в настоящей заявке, которое эффективно для лечения патологического клеточного роста, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и противоопухолевым средством, выбранным из группы, которая состоит из ингибиторов митоза, алкилирующих веществ, антиметаболитов, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов факторов роста, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомеразы, регуляторов биологических реакций, антигормонов и антиандрогенов.

Также изобретение относится к способу лечения гиперпролиферативного заболевания у млекопитающего, где способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей части, как описано в настоящей заявке, в сочетании с противоопухолевым средством, выбранным из группы, которая состоит из антипролиферативных средств, ингибиторов киназ, ингибиторов ангиогенеза, ингибиторов факторов роста, ингибиторов сох-I, ингибиторов сох-II, ингибиторов митоза, алкилирующих средств, антиметаболитов, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов факторов роста, радиоактивного излучения, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомеразы, регуляторов биологических реакций, антител, цитотоксических средств, антигормонов, статинов и антиандрогенов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения противоопухолевое средство, используемое в сочетании с антителом против Р-кадгерина или его антигенсвязывающим участком, а также описанными в настоящей заявке фармацевтическими композициями, представляет собой противоангиогенное средство, ингибитор киназ, ингибитор пан-киназ или ингибитор факторов роста. Предпочтительные ингибиторы пан-киназ включают SU-11248, описанный в патенте США № 6573293 (Pfizer, Inc, NY, USA).

Противоангиогенные средства включают в себя, но ими не ограничиваются, следующие вещества, например, ингибитор EGF, ингибиторы EGFR, ингибиторы VEGF, ингибиторы VEGFR, ингибиторы TIE2, ингибиторы IGF1R, ингибиторы COX-II (циклооксигеназы II), ингибиторы ММР-2 (матриксной металлопротеиназы 2) и ингибиторы ММР-9 (матриксной металлопротеиназы 9). Предпочтительные ингибиторы VEGF включают в себя, например, авастин (бевацизумаб), моноклональное антитело против VEGF из Genentech, Inc. of South San Francisco, California.

Дополнительные ингибиторы VEGF включают СР-547632 (Pfizer Inc., NY, USA), AG13736 (Pfizer Inc.), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171, ловушку VEGF (Regeneron/Aventis), ваталаниб (также известный как РТК-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), макуген (пегаптаниб октанатрия, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Washington, USA); и ангиозим, синтетический рибозим из Ribozyme (Boulder, Colorado) и Chiron (Emeryville, California), а также их сочетания. Ингибиторы VEGF, эффективные для осуществления настоящего изобретения на практике, описаны в патентах США №6534524 и 6235764, оба из которых приведены здесь полностью для всех целей. Особенно предпочтительные ингибиторы VEGF включают СР-547632, AG13736, ваталаниб, макуген и их сочетания.

Дополнительные ингибиторы VEGF описаны, например, в WO 99/24440 (опубликованном 20 мая 1999 г.), международной публикации РСТ PCT/IB99/00797 (зарегистрированной 3 мая 1999 г.), в WO 95/21613 (опубликованном 17 августа 1995 г.), WO 99/61422 (опубликованном 2 декабря 1999 года), патенте США № 6534524 (в котором описан AG13736), патенте США № 5834504 (выданном 10 ноября 1998 г.), WO 98/50356 (опубликованном 12 ноября 1998 г.), патенте США №5883113 (выданном 16 марта 1999 г.), патенте США №5886020 (выданном 23 марта 1999 г.), патенте США №5792783 (выданном 11 августа 1998 г.), патенте США №6653308 (выданном 25 ноября 2003 г.), WO 99/10349 (опубликованном 4 марта 1999 г.), WO 97/32856 (опубликованном 12 сентября 1997 г.), WO 97/22596 (опубликованном 26 июня 1997 г.), WO 98/54093 (опубликованном 3 декабря 1998 г.), WO 98/02438 (опубликованном 22 января 1998 г.), WO 99/16755 (опубликованном 8 апреля 1999 г.) и WO 98/02437 (опубликованном 22 января 1998 г.), все из которых приведены здесь полностью ссылкой.

Другие антипролиферативные средства, которые можно использовать вместе с антителами или их антигенсвязывающими участками по настоящему изобретению, включают ингибиторы фермента фарнезилпротеинтрансферазы и ингибиторы рецептора тирозинкиназы PDGFr, в том числе соединения, описанные и заявленные в следующих патентных заявках США: 09/221946 (зарегистрированной 28 декабря 1998 г.); 09/454058 (зарегистрированной 2 декабря 1999 г.); 09/501163 (зарегистрированной 9 февраля 2000 г.); 09/539930 (зарегистрированной 31 марта 2000 г.); 09/202796 (зарегистрированной 22 мая 1997 г.); 09/384339 (зарегистрированной 26 августа 1999 г.); и 09/383755 (зарегистрированной 26 августа 1999 г.); а также соединения, описанные и заявленные в следующих условных патентных заявках США: 60/168207 (зарегистрированной 30 ноября 1999 г.); 60/170119 (зарегистрированной 10 декабря 1999 г.); 60/177718 (зарегистрированной 21 января 2000 г.); 60/168217 (зарегистрированной 30 ноября 1999 г.) и 60/200834 (зарегистрированной 1 мая 2000 г.). Каждая из указанных выше патентных заявок и условных патентных заявок приведена здесь полностью ссылкой.

Ингибиторы PDGRr включают в себя, но ими не ограничиваются, вещества, описанные в WO01/40217, опубликованном 7 июля 2001 г. и WO2004/020431, опубликованном 11 марта 2004 г., содержания которых приведены здесь полностью для всех целей. Предпочтительные ингибиторы PDGFr включают Pfizer CP-673451 и СР-868596, а также их фармацевтически приемлемые соли.

Предпочтительные ингибиторы GARF включают Pfizer AG-2037 (пелитрексол и его фармацевтически приемлемые соли). Ингибиторы GARF, эффективные для осуществления настоящего изобретения на практике, описаны в патенте США № 5608082, приведенном здесь полностью для всех целей.

Примеры эффективных ингибиторов COX-II, которые можно использовать в сочетании с антителом против Р-кадгерина или их антигенсвязывающими участками, как описано в настоящей заявке, а также описанными в настоящей заявке фармацевтическими композициями, включают в себя CELEBREX ™ (целекоксиб), парекоксиб, деракоксиб, АВТ-963, МК-663 (эторикоксиб), СОХ-189 (лумиракоксиб), BMS 347070, RS 57067, NS-398, бекстра (валдекоксиб), паракоксиб, виокс (рофекоксиб), SD-8381, 4-метил-2-(3,4-диметилфенил)-1-(4-сульфамоилфенил)-1Н-пиррол, 2-(4-этоксифенил)-4-метил-1-(4-сульфамоилфенил)-1Н-пиррол, Т-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, СТ-3, SC-58125 и аркоксия (эторикоксиб). Кроме того, ингибиторы COX-II описаны в патентных заявках США №10/801446 и 10/801429, содержания которых приведены здесь полностью для всех целей.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой целекоксиб, как описано в патенте США №54 66823, содержания которого полностью приведены здесь для всех целей ссылкой.

Структура целекоксиба представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой валекоксиб, как описано в патенте США № 5633272, содержания которого полностью приведены здесь для всех целей ссылкой.

Структура валекоксиба представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой парекоксиб, как описано в патенте США № 5932598, содержания которого полностью приведены здесь для всех целей ссылкой.

Структура парекоксиба представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой деракоксиб, как описано в патенте США № 5521207, содержания которого полностью приведены здесь для всех целей ссылкой.

Структура деракоксиба представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой SD-8381, как описано в патенте США № 6034256, содержания которого полностью приведены здесь для всех целей ссылкой.

Структура SD-8381 представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой АВТ-963, как описано в международной публикации №WO 2002/24719, содержания которой полностью приведены здесь для всех целей ссылкой. Структура АВТ-963 представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой рофекоксиб, как представлено ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой МК-663 (эторикоксиб), как описано в международной публикации №WO 1998/03484, содержания которой полностью приведены здесь для всех целей ссылкой. Структура эторикоксиба представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой СОХ-189 (лумиракоксиб), как описано в международной публикации №WO 1999/11605, содержания которой полностью приведены здесь для всех целей ссылкой. Структура лумиракоксиба представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой BMS-347070, как описано в патенте США №6180651, содержания которой полностью приведены здесь для всех целей ссылкой. Структура BMS-347070 представлена ниже:

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой NS-398 (CAS 123653-11-2). Структура NS-398 (CAS 123653-11-2) представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой RS 57067 (CAS 17932-91-3). Структура RS 57067 (CAS 17932-91-3) представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой 4-метил-2-(3,4-диметилфенил)-1-(4-сульфамоилфенил)-1Н-пиррол. Структура 4-метил-2-(3,4-диметилфенил)-1-(4-сульфамоилфенил)-1Н-пиррола представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой 2-(4-этоксифенил)-4-метил-1-(4-сульфамоилфенил)-1Н-пиррол. Структура 2-(4-этоксифенил)-4-метил-1-(4-сульфамоилфенил)-1Н-пиррола представлена ниже

В одном из предпочтительных вариантов осуществления противоопухолевое средство представляет собой мелоксикам. Структура мелоксикама представлена ниже

Другие эффективные ингибиторы, как и противоопухолевые средства, используемые в сочетании с антителами по настоящему изобретению и описанными в настоящей заявке фармацевтическими композициями, включают в себя аспирин и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), которые ингибируют образующий простагландины фермент (циклооксигеназу I и II), что приводит к более низким уровням простагландинов, где средства включают в себя, но ими не ограничиваются, салсалат (амигесик), дифлунизал (долобид), ибупрофен (мотрин), кетопрофен (орудис), набуметон (релафен), пироксикам (фельден), напроксен (алев, напросин), диклофенак (вольтарен), индометацин (индоцин), сулиндак (клинорил), толметин (толектин), этодолак (лодин), кеторолак (торадол), оксапрозин (дайпро) и их сочетания. Предпочтительные ингибиторы COX-I включают ибупрофен (мотрин), нуприн, напроксен (алев), индометацин (индоцин), набуметон (релафен) и их сочетания.

Нацеливаемые средства, которые используют в сочетании с антителом против Р-кадгерина или его антигенсвязывающим участком, как описано в настоящей заявке, и их фармацевтическими композициями, как описано в настоящей заявке, включают в себя ингибиторы EGFr, такие как пресса (гефитиниб, AstraZeneca), тарцева (эрлотиниб или OSI-774, OSI Pharmaceuticals Inc.), эрбитукс (цетуксимаб, Imclone Pharmaceuticals, Inc.), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. и Abgenix Inc.), HR3 (Cuban Government), антитела IgA (University of Erlangen-Nuremberg), TP-38 (IVAX), слитый белок EGFR, EGF-вакцина, иммунолипосомы против EGFr (Hermes Biosciences Inc.) и их сочетания.

Предпочтительные ингибиторы EGFr включают ирессу, эрбитукс, тарцеву и их сочетания.

Также настоящее изобретение относится к противоопухолевым средствам, выбранным из ингибиторов пан-рецептора erb или ингибиторов рецептора ErbB2, например, СР-724714 (Pfizer, Inc.), CI-1033 (канертиниб, Pfizer, Inc.), герцептин (трастузумаб, Genentech Inc.), омитарг (2С4, пертузумаб, Genentech Inc.), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (лонафарниб, GlaxoSmithKline), GW-282974 (GlaxoSmithKline), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (вакцина HER2, Corixa и GlaxoSmithKline), APC8024 (вакцина HER2, Dendreon), биспецифическое-антитело против HER2/neu (Decof Cancer Center), B7.her2.IgG3 (Agensys), AS HER2 (Research Institute for Rad Biology & Medicine), трифункциональные биспецифические антитела (University of Munich) и моноклональное антитело AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc), а также моноклональное антитело 2В-1 (Chiron) и их сочетания. Предпочтительные противоопухолевые средства, избирательные в отношении erb, включают герцептин, TAK-165, СР-724,714, ABX-EGF, HER3 и их сочетания.

Предпочтительные ингибиторы пан-рецептора erbb включают GW572016, CI-1033, EKB-569 и омитарг, а также их сочетания.

Дополнительные ингибиторы erbB2 включают ингибиторы, описанные в WO 98/02434 (опубликованном 22 января 1998 г.), WO 99/35146 (опубликованном 15 июля 1999 г.), WO 99/35132 (опубликованном 15 июля 1999 г.), WO 98/02437 (опубликованном 22 января 1998 г.), WO 97/13760 (опубликованном 17 апреля 1997 г.), WO 95/19970 (опубликованном 27 июля 1995 г.), патенте США №5587458 (выданном 24 декабря 1996 г.) и патенте США № 5877305 (выданном 2 марта 1999 г.), каждый из которых приведен здесь полностью ссылкой. Эффективные по настоящему изобретению ингибиторы рецептора ErbB2 также описаны в патентах США №6465449 и 6284764, а также международной заявке №WO 2001/98277, где каждый из которых приведен здесь полностью ссылкой.

Кроме того, другие противоопухолевые средства можно выбирать из следующих средств: BAY-43-9006 (Onyx Pharmaceuticals Inc.), генасенс (огмеросен, Genta), панитумумаб (Abgenix/Amgen), зевалин (Schering), бексар (Corixa/GlaxoSmithKline), абареликс, алимта, ЕРО 906 (Novartis), дискодермолид (ХАА-296), АВТ-510 (Abbott), неовастат (Aeterna), энзастаурин (Eli Lilly), комбрестатин А4Р (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), флавопиридол (Aventis), CYC-202 (Cyclacel), AVE-8062 (Aventis), DMXAA (Roche/Antisoma), тимитак (Eximias), темодар (темозоломид, Schering Plough) и ревилимд (Celegene), а также их сочетания.

Другие противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: CyPat (ацетат ципротерона), гистерелин (ацетат гистрелина), пленексис (депо абареликса), атрасентан (АВТ-627), сатраплатин (JM-216), таломид (талидомид), тератоп, темилифен (DPPE), ABI-007 (паклитаксел), эвиста (ралоксифен), атаместан (биомед-777), ксиотакс (полиглутаматпаклитаксел), таргетин (бексаротин) и их сочетания.

Кроме того, другие противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: тризаон (тирапазамин), апосин (экзисулинд), невастат (АЕ-941), цеплен (дигидрохлорид гистамина), оратецин (рубитекан), вирулизин, гастриммун (G17DT), DX-8951f (мезилат экзатекана), онконаз (ранпирназ), ВЕС2 (митумоаб), кситрин (мотексафин гадолиния) и их сочетания.

Дополнительные противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: цеавак (СЕА), неутрексин (глюкуронат триметрезата) и их сочетания. Дополнительные противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: оварекс (ореговомаб), осидем (IDM-1) и их сочетания. Дополнительные противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: адвексин (ING 201), тиразон (тирапазамин) и их сочетания. Дополнительные противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: RSR13 (эфапроксирал), котара (1311 chTNT 1/b), NBI-3001 (IL-4) и их сочетания. Дополнительные противоопухолевые средства можно выбирать из следующих веществ: канваксин, вакцина GMK, интерон A PEG, таксопрексин (DHA/паклитаксел) и их сочетания. Другие предпочтительные противоопухолевые средства включают ингибитор PD325901 МЕК1/2 Pfizer, ингибитор MEK ARRY-142886 Array Biopharm, ингибитор CDK2 BMS-387032 Bristol Myers, ингибитор CDK PD0332991 Pfizer и AXD-5438 AstraZeneca, а также их сочетания. Кроме того, также можно использовать ингибиторы mTOR, такие как CCI-779 (Wyeth) и производные рапамицина RAD001 (Novartis) и АР-23573 (Ariad), ингибиторы HDAC SAHA (Merck Inc./Aton Pharmaceuticals) и их сочетания. Дополнительные противоопухолевые средства включают ингибитор aurora 2 VX-680 (Vertex), ингибитор Chk1/2 XL844 (Exilixis).

В сочетании с антителом против Р-кадгерина или его антигенсвязывающей частью, как описано в настоящей заявке, а также их фармацевтическими композициями, как описано в настоящей заявке, можно использовать следующие цитотоксические средства, например, одно или несколько, выбранных из группы, которая состоит из эпирубицина (элленс), доцетаксела (таксотер), паклитаксела, зинекарда (дексразоксан), ритуксимаба (ритуксан), мезилата иматиниба (гливек) и их сочетаний.

Также изобретение относится к использованию антител и их антигенсвязывающих частей по настоящему изобретению вместе с гормональной терапией, включая в себя, но ими не ограничиваясь, экземестан (аромазин, Pfizer Inc.), леупрорелин (лупрон или леуплин, TAP/Abbott/Takeda), анастрозол (аримидекс, Astrazeneca), госрелин (золадекс, AstraZeneca), доксеркальциферол, фадрозол, форместан, цитрат тамоксифена (тамоксифен, нолвадекс, AstraZeneca), казодекс (AstraZeneca), абареликс (Praecis), трелстар и их сочетания.

Также изобретение относится к таким средствам гормональной терапии, как противоэстрогенные средства, включающие в себя, но ими не ограничивающиеся, фулвестрант, торемифен, ралоксифен, лазофоксифен, летрозол (фемара, Novartis), противоандрогенные средства, такие как бикалутамид, флутамид, мифепристон, нилутамид, казодекс ® (4'-циано-3-(4-фторфенилсульфонил)-2-гидрокси-2-метил-3'-(трифторметил)пропионанилид, бикалутамид) и их сочетания.

Кроме того, изобретение относится к антителам по настоящему изобретению по отдельности или в сочетании с одним или несколькими продуктами заместительной терапии, например продуктом, выбранным из группы, которая состоит из филграстима (неупоген), ондансетрона (зофран), фрагмина, прокрита, алокси, эменда или их сочетаний.

Особенно предпочтительные цитотоксические средства включают камптосар, эрбитукс, ирессу, гливек, таксотер и их сочетания.

В качестве противоопухолевых средств можно использовать следующие ингибиторы топоизомеразы I: камптотецин, иринотекан HCI (камптосар), эдотекарин, оратецин (суперген), экзатекан (Daiichi), BN-80915 (Roche) и их сочетания. Особенно предпочтительные ингибиторы топоизомеразы II включают эпирубицин (элленс).

Антитела по изобретению можно использовать вместе с противоопухолевыми средствами, алкилирующими средствами, антиметаболитами, антибиотиками, получаемыми из растений противоопухолевыми средствами, производными камптотецина, ингибиторами тирозинкиназы, другими антителами, интерферонами и/или регуляторами биологических реакций.

Алкилирующие средства включают в себя, но ими не ограничиваются, N-оксид азотистого иприта, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, бусульфан, митобронитол, карбоквон, тиотепу, ранимустин, нимустин, темозоломид, AMD-473, алтретамин, АР-5280, апазиквон, бросталлицин, бендамустин, кармустин, эстрамустин, фотемустин, глуфосфамид, ифосфамид, KW-2170, мафосфамид и митолактол; алкилирующие соединения из координационных соединений платины включают в себя, но ими не ограничиваются, цисплатин, параплатин (карбоплатин), эптаплатин, лобаплатин, недаплатин, элоксатин (оксалиплатин, Sanofi) или сатрплатин и их сочетания. Особенно предпочтительные алкилирующие средства включают элоксатин (оксалиплатин).

Антиметаболиты включают в себя, но ими не ограничиваются, метотрексат, 6-меркаптопуринрибозид, меркаптопурин, 5-фторурацил (5-FU) по отдельности или в сочетании с леуковорином, тегафур, UFT, доксифлуридин, кармофур, цитарабин, окфосфат цитарабина, эноцитабин, S-1, алимту (пеметрексед динатрия, LY231514, МТА), гемзар (гемцитабин, Eli Lilly), флударабин, 5-азацитидин, капецитабин, кладрибин, клофарабин, децитабин, эфлорнитин, этинилцитидин, арабинозид цитозина, гидроксимочевину, TS-1, мелфалан, неларабин, нолатрексед, окфосфат, пеметрексед динатрия, пентостатин, пелитрексол, ралтитрексед, триапин, триметрексат, видарабин, винкристин, винорелбин; или, например, один из предпочтительных антиметаболитов, описанных в европейской патентной заявке №239362, такой как N-(5-[N-(3,4-дигидро-2-метил-4-оксохиназолин-6-илметил)-N-метиламино]-2-теноил)-L-глутаминовая кислота и их сочетания.

Антибиотики включают в себя, но ими не ограничиваются, интеркалирующие антибиотики: акларубицин, актиномицин D, амрубицин, аннамицин, адриамицин, блеомицин, даунорубицин, доксорубицин, элсамитруцин, эпирубицин, галарубицин, идарубицин, митомицин С, неморубицин, неокарзиностатин, пепломицин, пирарубицин, ребеккамицин, стималамер, стрептозоцин, валрубицин, зиностатин и их сочетания.

Получаемые из растений противоопухолевые вещества включают в себя, например, вещества, выбранные из ингибиторов митоза, например, винбластина, доцетаксела (таксотер), паклитаксела и их сочетаний.

Цитотоксические ингибиторы топоизомеразы включают одно или несколько средств, выбранных из группы, которая состоит из акларубицина, амонафида, белотекана, камптотецина, 10-гидроксикамптотецина, 9-аминокамптотецина, дифломотекана, иринотекана HCI (камптосар), эдотекарина, эпирубицина (элленс), этопозида, экзатекана, гиматекана, луртотекана, митоксантрона, пирарубицина, пиксантрона, рубитекана, собузоксана, SN-38, тафлупозида, топотекана и их сочетаний.

Предпочтительные цитотоксические ингибиторы топоизомеразы включают одно или несколько средств, выбранных из группы, которая состоит из камптотецина, 10-гидроксикамптотецина, 9-аминокамптотецина, иринотекана HCI (камптосара), эдотекарина, эпирубицина (элленс), этопозида, SN-38, топотекана и их сочетаний.

Иммунологические средства включают интерфероны и множество других усиливающих иммунитет средств. Интерфероны включают интерферон альфа, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, интерферон бета, интерферон гамма-1a, интерферон гамма-1b (актиммун) или интерферон гамма-n1 и их сочетания. Другие средства включают филграстим, лентинан, сизофилан, терацис, убенимекс, WF-10, альдеслейкин, алемтузумаб, ВАМ-002, дакарбазин, даклизумаб, денилейкин, гемтузумаб озогамицина, ибритумомаб, имиквимод, ленограстим, лентинан, вакцина меланомы (Corixa), молграмостим, OncoVAX-CL, сарграмостим, тазонермин, теклейкин, тималазин, тозитумомаб, вирулизин, Z-100, эпратузумаб, митумомаб, ореговомаб, пемтумомаб (Y-muHMFG1), провендж (Dendreon) и их сочетания.

Регуляторы биологических реакций представляют собой средства, модифицирующие защитные механизмы живых организмов или биологические реакции, такие как выживание, рост или дифференцировка клеток ткани, направляющая их на приобретение противоопухолевой активности. Такие средства включают крестин, лентинан, сизофиран, пицибанил, убенимекс и их сочетания.

Другие противораковые средства включают алитретиноин, амплиген, бексаротен атрасентана, бортезомиб, босентан, кальцитриол, экзисулинд, финастерид, фотемустин, ибандроновую кислоту, милтефосин, митоксантрон, L-аспарагиназу, прокарбазин, дакарбазин, гидроксикарбамид, пегаспаргазу, пентостатин, тазаротен, телциту (TLK-286, Telik Inc.), велкаду (бортемазиб, Millenium), третиноин и их сочетания.

Другие противоангиогенные соединения включают ацитретин, фенретинид, талидомид, золедроновую кислоту, ангиостатин, аплидин, циленгитид, комбретастатин А-4, эндостатин, галофугинон, ребимастат, ремоваб, ревлимид, скваламин, украин, витаксин и их сочетания.

Координационные соединения платины включают в себя, но ими не ограничиваются, цисплатин, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин и их сочетания.

Производные камптотецина включают в себя, но ими не ограничиваются, камптотецин, 10-гидроксикамптотецин, 9-аминокамптотецин, иринотекан, SN-38, эдотекарин, топотекан и их сочетания.

Другие противоопухолевые средства включают митоксантрон, L-аспарагиназу, прокарбазин, дакарбазин, гидроксикарбамид, пентостатин, третиноин и их сочетания.

Также можно использовать противоопухолевые средства, способные усиливать противоопухолевые иммунные реакции, например, антитела против CTLA4 (антиген цитотоксических лимфоцитов 4) и другие средства, способные блокировать CTLA4, такие как MDX-010 (Medarex) и соединения CTLA4, описанные в патенте США № 6682736; а также антипролиферативные средства, такие как другие ингибиторы фарнезилпротеинтрансферазы, например ингибиторы фарнезилпротеинтрансферазы. Кроме того, специфические антитела против CTLA4, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают антитела, описанные в условной заявке США № 60/113647 (зарегистрированной 23 декабря 1998 г.), патенте США № 6682736, оба из которых приведены здесь полностью ссылкой.

Специфические антитела против IGF1R, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают антитела, описанные в международной патентной заявке № WO 2002/053596, которая приведена здесь полностью ссылкой.

Специфические антитела против CD40, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают антитела, описанные в международной патентной заявке №WO 2003/040170, которая приведена здесь полностью ссылкой.

Также в качестве противоопухолевых средств можно использовать средства для генной терапии, такие как TNFerade (GeneVec), экспрессирующий TNF-альфа в ответ на лучевую терапию.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения статины можно использовать в сочетании с антителом против Р-кадгерина или его антигенсвязывающим участком, как описано в настоящей заявке, и их фармацевтическими композициями. Статины (ингибиторы HMG-CoA-редуктазы) можно выбирать из группы, состоящей из аторвастатина (липитор, Pfizer Inc.), правастатина (правахол, Bristol-Myers Squibb), ловастатина (мевакор, Merck Inc.), симвастатина (зокор, Merck Inc.), флувастатина (лескол, Novartis), церивастатина (байкол, Bayer), розувастатина (крестор, AstraZeneca), ловостатина и ниацина (адвикор, Kos Pharmaceuticals), их производных и сочетаний.

В предпочтительном варианте осуществления статин выбирают из группы, состоящей из аторвастатина и ловастатина, их производных и сочетаний.

Другие средства, эффективные в качестве противоопухолевых средств, включают кадуэт.

Для любого из способов лечения гиперпролиферативного заболевания или патологического роста клеток, как описано в настоящей заявке, с использованием сочетания антитела против Р-кадгерина или антигенсвязывающей части вместе по крайней мере с одним дополнительным терапевтическим средством антитело против Р-кадгерина можно конъюгировать или дериватизировать посредством дополнительного терапевтического средства. Также по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить отдельно или в недериватизированном или неконъюгированном виде. Если по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство не дериватизировано или конъюгировано с антителом, то его можно вводить в том же фармацевтическом препарате, что и антитело, или его можно вводить в отдельном препарате.

Генная терапия

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела и части антител по настоящему изобретению, можно вводить пациенту при необходимости этого посредством генной терапии. Терапию можно проводить in vivo или ex vivo. В предпочтительном варианте осуществления пациенту вводят молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь. В более предпочтительном варианте осуществления молекулы нуклеиновых кислот вводят таким образом, что они устойчиво встраиваются в хромосомы В-клеток, поскольку эти клетки специализированы на продукции антител. В предпочтительном варианте осуществления предшественников В-клеток трансфицируют или инфицируют ex vivo и повторно трансплантируют пациенту при необходимости этого. В другом варианте осуществления предшественников В-клеток или другие клетки инфицируют in vivo с использованием вируса, для которого известно инфицирование интересующего типа клеток. Общепринятые векторы, используемые для генной терапии, включают липосомы, плазмиды и вирусные векторы. Примеры вирусных векторов представляют собой ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы. После инфицирования in vivo или ex vivo уровни экспрессии антител можно наблюдать, получая образец от подвергающегося лечению пациента и используя любой иммуноанализ, известный в данной области или описанный в настоящей заявке.

В предпочтительном варианте осуществления способ генной терапии включает стадии введения изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающая часть из антитела против Р-кадгерина, и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления способ генной терапии включает стадии введения изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающая часть из антитела против Р-кадгерина, и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. В более предпочтительной процедуре способ генной терапии включает стадии введения изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающая часть, и изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающая часть из антитела против Р-кадгерина по изобретению, и экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Также способ генной терапии может включать стадию введения другого терапевтического средства, такого как любое из средств, описанных ранее в связи с сочетанной терапией.

Для лучшего понимания этого изобретения приведены следующие примеры. Эти примеры предназначены только для иллюстрации и не предназначены каким-либо образом для ограничения объема изобретения.

Примеры

В следующих примерах и способах получения "BSA" обозначает бычий сывороточный альбумин; "EDTA" обозначает этилендиаминтетрауксусную кислоту; "DMSO" обозначает диметилсульфоксид; "MOPS" обозначает 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту; "MES" обозначает 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту; "PBS" обозначает забуференный фосфатом физиологический раствор; "dPBS" обозначает забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко; "НЕМА" обозначает 2-гидроксиэтилметакрилат; "DMEM" обозначает модифицированную по способу Дульбекко среду Игла; "FBS" обозначает эмбриональную телячью сыворотку; "NEAA" обозначает заменимые аминокислоты; "HEPES" обозначает N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту; и "DMF" обозначает диметилформамид.

Пример 1. Скрининг библиотеки фагового дисплея scFv

Для скрининга библиотеки фагового дисплея scFv использовали в качестве антигена рекомбинантный Р-кадгерин человека (R &D Systems 861-PC-100). Для отбора использовали большие библиотеки антител человека scFv, клонированные в фагмидный вектор (Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996)). Распознаваемые Р-кадгерином scFv выделяли из библиотек фагового дисплея сериями повторных циклов селекции на рекомбинантном Р-кадгерине человека и слившихся монослоях клеток НСТ116, которые экспрессируют Р-кадгерин. Вкратце, после инкубации вместе с библиотекой связавшийся фаг отделяли от Р-кадгерина, а несвязавшийся фаг вымывали. Затем связавшийся фаг выделяли, как описано в Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996) и повторяли процесс селекции. Клоны с характерным соотношением из продуктов выхода циклов селекции подвергали твердофазному иммуноферментному фаговому анализу (ELISA) для тестирования связывания с Р-кадгерином, преимущественно, как описано в Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996). В ELISA использовали два различных антигена: рекомбинантный Р-кадгерин человека (R &D Systems) и слившиеся монослои клеток А431, экспрессирующих Р-кадгерин. ELISA-положительные клоны подвергали секвенированию ДНК, как описано в Vaughan, T.J. et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996) и в Osbourn, J.K. et al., Immune-technology 3:293-302 (1998). Уникальные ELISA-положительные клоны преобразовывали в целые молекулы IgG и тестировали их способность нейтрализовать Р-кадгерин в анализе зависящей от Р-кадгерина адгезии, который описан в примере 4. На основе результатов этого скрининга в качестве основной родительской линии для дальней оптимизации было выбрано антитело 129-1с4 (IC50 1-3 мкМ в анализе адгезии А431).

Пример 2. Оптимизации основной линии

Полученные из 129-1с4 библиотеки фагового дисплея конструировали олигонуклеотид-направленным мутагенезом вариабельных участков CDR3 тяжелой (V _H ) и вариабельных участков CDR3 легкой (V _L ) цепи антитела. Библиотеки конструировали с использованием общепринятых способов молекулярной биологии, как описано в Clackson and Lowman, Phage Display - A Practical Approach (Oxford University Press 2004). Селекцию на основе аффинности проводили следующим образом: после инкубации вместе с библиотекой рекомбинантный Р-кадгерин человека (R &D Systems) поглощали посредством парамагнитных гранул, покрытых белком G (Dynal 100.03), а связавшийся фаг выделяли магнитным разделением, тогда как несвязавшиеся комплексы вымывали. Процесс селекции повторяли со снижающимися концентрациями рекомбинантного Р-кадгерина человека (от 25 нМ до 10 пМ в течение 4 циклов), присутствующего в ходе селекции. Кроме того, продукты выхода селекции из библиотек CDR3 V _H и CDR3 V _L рекомбинировали в дополнительные библиотеки фагового дисплея и отбирали в течение еще двух циклов селекции на основе аффинности. Клоны с характерным соотношением из продуктов выхода циклов селекции подвергали скринингу в качестве scFv в конкурентном анализе для эпитопа 129-1с4, как описано в примере 8.

Пример 3. Анализ зависящей от Р-кадгерина адгезии

Для определения величин IC ₅₀ в анализе зависящей от Р-кадгерина адгезии применяли следующую схему, используя несколько оптимизированных scFv, которые были преобразованы в IgG в ходе стадии оптимизации при изобретении антитела, как описано выше в примере 2. Средние измеренные величины IC ₅₀ для этих антител приведены ниже в табл. 4.

Рекомбинантный Fc Р-кадгерина человека (R &D, номер в каталоге №861-РС) за 24 ч до использования разбавляли до концентрации 1 мг/мл посредством 2 мМ CaCl ₂ в воде MilliQ и хранили при 4 °С. Клетки А431 культивировали и получали следующим образом. Клетки А431 (ЕСАСС №85090402) культивировали общепринятым способом в тройных флаконах Nunc (площадь 3 ×175 см ² ) в минимальной поддерживающей среде (MEM) (Invitrogen, номер в каталоге №31095), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, номер в каталоге №10100-147) и 1% заменимых аминокислот (Invitrogen, номер в каталоге № 11140-035). К моменту сбора для использования в анализе культивируемые клетки достигали смыкания монослоя с величиной приблизительно 80%. Для предотвращения возможных эффектов, связанных с пересевом, клетки обычно использовали между 4 и 8 пассажами и снимали после 48 или 72 ч культивирования. Клетки А431 снимали посредством 0,25% трипсина/1 мМ EDTA (Gibco, номер в каталоге №25200-056) в течение времени, достаточного для диссоциации клеток (7-10 мин), а затем сразу разводили в среде для культивирования ткани до плотности приблизительно 2 ×10 ⁶ клеток/мл. Затем клетки А431 центрифугировали (1200 об./мин), ресуспендировали в буфере для анализа (сбалансированный солевой раствор Хенкса (без Mg ²⁺ и Са ²⁺ , без фенолового красного) (Invitrogen, номер в каталоге №14175-053), дополненный до конечной концентрации CaCl ₂ величиной 1 мМ), повторно центрифугировали и снова ресуспендировали в буфере для анализа при конечной плотности 2 ×10 ⁶ клеток/мл.

Получение серийных разведений IgG и предварительную инкубацию с клетками А431 осуществляли следующим образом. 180 мкл каждого тестируемого IgG или его участка дополняли 20 мкл буфера для анализа, содержащего 10% BSA (Sigma, номер в каталоге №А-9576), для стандартизации концентрации BSA до величины 1%. Контрольное поликлональное антитело против Р-кадгерина мыши/человека (R &D, номер в каталоге №AF-761) первоначально ресуспендировали в воде MilliQ для получения исходного раствора 1 мг/мл. Затем 40 мкл этого исходного раствора дополнительно разводили в 140 мкл буфера для анализа. Затем добавляли 20 мкл содержащего 10% BSA буфера для анализа, получая 200 мкл с концентрацией антитела 0,2 мг/мл и 0,1% BSA. Два образца серийных разведений получали посредством первоначального добавления 2 ×90 мкл поликлонального антитела AF-761 или тестируемого IgG в ряд 196-луночного полипропиленового планшета для разведений Greiner (Greiner, номер в каталоге №780271). Затем в ряды 2-11 добавляли 60 мкл буфера для анализа. После этого выполняли разведение 30 мкл в 60 мкл (1:3) поперек планшета, слева направо для рядов 1-11. Затем для определения максимальной адгезии к лункам 12 A-D добавляли только 60 мкл буфера для анализа. Минимальные величины адгезии определяли добавлением 60 мкл 25 мМ EDTA (в буфере для анализа) к лункам 12 Е-Н. Затем во все лунки добавляли 60 мкл суспензии клеток А431 (2 ×10 ⁶ клеток/мл в буфере для анализа - получаемых, как указано выше) и после перемешивания планшеты предварительно инкубировали в течение 1 ч при 37 °С.

Наряду с получением серийных разведений тестируемого IgG и предварительной инкубацией с клетками А431 получали покрытые Р-кадгерином аналитические планшеты следующим образом.

Рекомбинантный Fc Р-кадгерина человека разводили в буфере для нанесения покрытия (PBS без Mg ²⁺ и Са ²⁺ - Invitrogen, номер в каталоге №14190-094) до концентрации 10 мкг/мл и распределяли по 96-луночным аналитическим планшетам Fluoronunc (Nunc, номер в каталоге №437958) (100 мкл/лунка). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч 30 мин при комнатной температуре. После этого планшеты промывали 3 раза посредством PBS с использованием промывающего устройства для 96-луночных планшетов Тесаn. Затем для блокирования добавляли 200 мкл/лунка буфера для анализа, и планшеты инкубировали в течение дополнительного 1 ч при комнатной температуре. После этого планшеты промывали 3 раза посредством PBS, как описано ранее.

Затем 100 мкл/лунка предварительно инкубированного вещества IgG/A431 переносили из 96-луночных планшетов для разведения Greiner в покрытые Р-кадгерином аналитические планшеты. Во время переноса вещество IgG/A431 перемешивали пипетированием для обеспечения гомогенности клеток. Затем позволяли происходить процессу адгезии посредством инкубации аналитических планшетов при 37 °С в течение 30-45 мин. После окончания инкубации неприкрепившиеся клетки удаляли осторожным отсасыванием среды из планшетов и повторным наполнением лунок буфером для промывания клеток (сбалансированный солевой, раствор Хенкса (без Mg ²⁺ и Са ²⁺ , без фенолового красного) (Invitrogen, номер в каталоге № 14175-053), дополненный до конечной концентрации CaCl ₂ величиной 1 мМ). Затем планшеты в течение 15 мин переворачивали в резервуаре с буфером для промывания клеток для удаления оставшихся неприкрепленных клеток. После окончания этой инкубации осторожно отсасывали содержимое лунок.

Подсчет прикрепившихся клеток проводили следующим образом. Прикрепившиеся клетки выявляли добавлением 100 мкл/лунка сочетанного реагента для регистрации лизиса/щелочной фосфатазы (5Х-концентрированный диэтаноламиновый буфер для субстрата (Pierce, номер в каталоге № 34064) разводили водой до соотношения 1:5, а после чего растворяли одну таблетку PNPP 15 мг (Sigma, номер в каталоге №N-2640) в 25 мл 1X раствора) с последующей инкубацией в течение 30-60 мин при 37 °С. Затем прекращали реакцию добавлением 1М NaOH (50 мкл/лунка) для достижения максимальной величины OD, составляющей приблизительно 0,8 в отсутствии ингибирования. После этого измеряли поглощение при 405 нм с использованием общепринятого планшет-ридера.

Затем результаты анализировали следующим образом. Принимая лунки A-D ряда 12 за 100% адгезии и лунки Е-Н ряда 12 за 0% адгезии, преобразовывали сначала данные рядов в величины % адгезии следующим образом:

% адгезии = {(величина адгезии - минимальная величина адгезии)/(максимальная величина адгезии - минимальная величина адгезии)}*100

Затем строили график зависимости % адгезии от концентрации ингибитора IgG и определяли величины IC ₅₀ с использованием программного обеспечения Prism. В случае наблюдения частичного ингибирования IC ₅₀ выражают в виде концентрации IgG, приводящей к величине фактического ингибирования 50% в отличие от значения средней точки кривой. Величины IC ₅₀ приведены в табл. 4.

Таблица 4

Для исследования нескольких приведенных к состоянию зародышевой линии, оптимизированных IgG из линии 129-1с4 в сравнении с их эквивалентами, не приведенными к состоянию зародышевой линии, проводили два отдельных анализа адгезии А431. Для этих экспериментов было необходимо перейти на новую порцию Р-кадгерина (CFR-134041), что, по-видимому, связано с немного повышенными величинами IC ₅₀ в сравнении с другими данными. Средние значения данных для нескольких приведенных к зародышевому состоянию IgG из двух экспериментов представлены в табл. 5. Как указано ранее, g-194-b09 соответствует варианту приведенного к зародышевому состоянию 194-b09 и т.д.

Таблица 5

Пример 4. Анализ зависящей от Р-кадгерина агрегации клеток.

Для определения величин IC ₅₀ в анализе зависящей от Р-кадгерина агрегации применяли следующую схему, используя несколько оптимизированных scFv, которые были преобразованы в IgG в ходе стадии оптимизации при изобретении антитела, как описано выше в примере 2. Поскольку сверхэкспрессирующие Р-кадгерин клеточные линии при помещении в суспензию для роста формируют плотные многоклеточные скопления, то можно измерять агрегацию клеток в присутствии антител против Р-кадгерина, препятствующих клеточной агрегации. Средние измеренные величины IC ₅₀ для некоторых антител приведены ниже в табл. 6.

Получение планшета осуществляли следующим образом. Каждый 96-луночный аналитический планшет покрывали 50 мкл поли-НЕМА (12 мг/мл в 90% этанола, 10% метанола), а затем выпаривали в течение периода от 6 ч до периода всей ночи с последующей промывкой 3 ×100 мкл стерильной H ₂ O перед использованием. После этого клетки культивировали следующим образом. Клетки из клеточной линии SW480 человека (стабильно экспрессирующие Р-кадгерин G418 ^r ) пересевали в полную среду для роста (qs DMEM (InVitrogen 11995-065), 10% FBS (Omega Scientific FB-02), 1:100 NEAA (InVitrogen 11140-050), 1:100 пируват натрия (InVitrogen 11360-070), 1:100 глутамин (InVitrogen 25030-051), 1:100 пенициллин/стрептолизин (InVitrogen 15070-063), 1:100 генетицин 50 мг/мл (InVitrogen 10131-035)) + G418 (500 мкг/мл), а затем разделяли на части 1:3-4 дважды в неделю. После этого культуры замораживали в среде для роста + 10% DMSO.

В сутки 1 клетки SW480:pCAD и контрольный образец SW480:pCLNX (устойчивый контрольный вектор) высевали на планшет 5 ×10 ⁶ клеток/100 мм при разведении, не превышающем 1:3. Затем клетки выращивали в культуре в течение 48 ч. Каждый планшет 100 мм обеспечивал приблизительно 10 ×10 ⁶ клеток, или достаточное количество для 2 ×96-луночных планшетов.

В сутки 3 удаляли среду с последующей промывкой посредством dPBS (PBS Дульбекко (InVitrogen 14040-133)), после чего клетки обрабатывали трипсином в планшете 3 мл/100 мм.

Затем после выделения посредством двух объемов (6 мл) полной среды для роста проводили нейтрализацию. Затем планшет трижды промывали с использованием пипетки с 10 мл для разрушения скоплений. После этого клетки подсчитывали и получали осадок, используя центрифугу Beckman при 1000 об./мин в течение 5 мин. Затем среду отсасывали, осадок сначала ресуспендировали в <1 мл полной среды для роста посредством встряхивания пальцами, а затем пипеткой р1000, а после этого концентрацию клеток нормализовали до 1,3 М/мл. Наличие дисперсии отдельных клеток подтверждали микроскопией.

Затем получали планшет с реагентом посредством блокирования 96-луночного планшета dPBS и 5% FBS в течение 30 мин. После этого промывали планшет с использованием 1 ×100 мкл dPBS с последующим отсасыванием и встряхиванием для сушки. Серии разведений тестируемого IgG получали посредством dPBS с использованием 4 ×[IgG] концентрации, достаточной для 3 лунок планшета для обработки в одной лунке 96-луночного планшета. 40000 клеток в 30 мкл/лунка разделяли на порции в 96-луночный, промытый, покрытый поли-НЕМА планшет Costar3590, не предназначенный для культивирования ткани (Corning 3590). Затем в каждую лунку 96-луночного планшета переносили 10 мкл реагента. Для каждого варианта обработки получали три серии образцов с использованием 8-канальной пипетки. Затем в течение ночи (16-18 ч) проводили инкубацию при 250 об./мин, при встряхивании, в увлажняемом инкубаторе 5% CO ₂ , 37 °С.

В сутки 4 40 мкл встряхиваемых клеток переносили в покрытый полилизином 96-луночный планшет (покрытый полилизином 96-луночный планшет BioCoat: BD 356516). Затем лунки промывали посредством 60 мкл полной среды для роста, планшет встряхивали легким постукиванием и переносили в планшет, покрытый полилизином. При необходимости проводили дополнительную промывку посредством 50 мкл. Затем в течение 60 мин проводили инкубацию в увлажняемом инкубаторе 5% CO ₂ , 37 °С. На этой стадии проявляли осторожность для количественного переноса всех клеток, насколько возможно осторожно, без избыточного пипетирования. Затем клетки фиксировали добавлением 100 мкл фиксирующего раствора (7,4% формальдегид (37% мас./об. - Sigma F15587)) в вытяжном шкафу с последующей инкубацией в течение > 30 мин при комнатной температуре.

Затем для промывки клеток жидкость сливали в стакан для сбора или лоток и слегка стряхивали для удаления оставшейся жидкости, и осторожно постукивали по бумажной салфетке. Затем использовали 100 мкл dPBS на лунку для промывки с последующей инкубацией в течение 15 мин. Затем клетки окрашивали посредством слива жидкости, как указано выше, и использования 100 мкл красителя Hoescht (1 мкг/мл красителя Hoescht в dPBS -10 мг/мл молекулярных зондов Hoescht 33342) с последующей инкубацией в течение 30 мин. После этого клетки дважды промывали, оставляя остаток в виде 100 мкл dPBS в лунке для микроскопии.

Затем измеряли (Cellomics) количество агрегированных объектов, а среднее число объектов (с тестируемым IgG) сравнивали с таковым для IgG (например, Gt-антитело против Р-кадгерина R &D Systems AF761) или контроля в виде только среды. Затем строили график зависимости числа объектов от концентрации ингибитора IgG и определяли величины IC ₅₀ . Величины IC ₅₀ для нескольких антител по настоящему изобретению представлены в табл. 6.

Таблица 6

Пример 5. Анализ зависящего от Р-кадгерина распада шаровидных образований

Следующий анализ распада шаровидного образования представляет собой вариант анализа агрегации (описанный в примере 4), в котором скопления клеток формируются в течение ночи перед добавлением Р-кадгерина и контрольных антител. Затем добавляют тестируемые реагенты на дополнительные 24 ч перед анализом.

Получение планшета осуществляли следующим образом. Каждый 96-луночный аналитический планшет покрывали посредством 50 мкл поли-НЕМА (12 мг/мл в 90% этанола, 10% метанола), а затем выпаривали в течение периода от 6 ч до периода всей ночи с последующей промывкой 3 ×100 мкл стерильной H ₂ O перед использованием. После этого клетки культивировали следующим образом. Клетки из клеточной линии SW480 человека (стабильно экспрессирующие Р-кадгерин G418 ^r ) пересевали в полную среду для роста (qs DMEM (InVitrogen 11995-065), 10% FBS (Omega Scientific FB-02), 1:100 NEAA (InVitrogen 11140-050), 1:100 пируват натрия (InVitrogen 11360-070), 1:100 глутамин (InVitrogen 25030-051), 1:100 пенициллин/стрептолизин (InVitrogen 15070-063), 1:100 генетицин 50 мг/мл (InVitrogen 10131-035)) + G418 (500 мкг/мл), а затем разделяли на части 1:3-4 дважды в неделю. После этого культуры замораживали в среде для роста + 10% DMSO.

В сутки 1 клетки SW480:pCAD и контрольный образец SW480:pCLNX (устойчивый контрольный вектор) высевали на планшет 5 ×10 ⁶ клеток/100 мм при разведении, не превышающем 1:3. Затем клетки выращивали в культуре в течение 48 ч. Каждый планшет 100 мм обеспечивал приблизительно 10 ×10 ⁶ клеток, или достаточное количество для 2 ×96-луночных планшетов.

В сутки 3 удаляли среду с последующей промывкой посредством dPBS (PBS Дульбекко (InVitrogen 14040-133)), после чего клетки обрабатывали трипсином в планшете 3 мл/100 мм. Затем, после выделения посредством двух объемов (6 мл) полной среды для роста проводили нейтрализацию. Затем планшет трижды промывали с использованием пипетки с 10 мл для разрушения скоплений. После этого клетки подсчитывали и получали осадок, используя центрифугу Beckman при 1000 об./мин в течение 5 мин. Затем среду отсасывали, осадок сначала ресуспендировали в <1 мл полной среды для роста посредством встряхивания пальцами, а затем пипеткой р1000, а после этого концентрацию клеток нормализовали до 1,0 ×10 ⁶ /мл. Наличие дисперсии отдельных клеток подтверждали микроскопией.

40000 клеток в 40 мкл/лунка разделяли на порции в 96-луночный, промытый, покрытый поли-НЕМА планшет Costar3590, не предназначенный для культивирования ткани (Corning 3590). Затем в течение ночи (16-18 ч) проводили инкубацию при 250 об./мин, при встряхивании, в увлажняемом инкубаторе 5% CO ₂ , 37 °С.

Затем в сутки 4 получали планшет с реагентом посредством блокирования 96-луночного планшета dPBS и 5% FBS в течение 30 мин. После этого промывали планшет с использованием 1 ×100 мкл dPBS с последующим отсасыванием и встряхиванием для сушки. Серии разведений тестируемого IgG получали посредством dPBS с использованием 5 ×[IgG] концентрации, достаточной для 3 лунок планшета для обработки в одной лунке 96-луночного планшета. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета переносили 10 мкл реагента. Для каждого варианта обработки получали три серии образцов с использованием 8-канальной пипетки. Затем проводили инкубацию (20-24 ч) при 250 об./мин, при встряхивании, в увлажняемом инкубаторе 5% CO ₂ , 37 °С.

В сутки 5 50 мкл встряхиваемых клеток переносили в покрытый полилизином 96-луночный планшет (покрытый полилизином 96-луночный планшет BioCoat: BD 356516). Затем лунки промывали посредством 50 мкл полной среды для роста, планшет встряхивали легким постукиванием и переносили в планшет, покрытый полилизином. При необходимости проводили дополнительную промывку посредством 50 мкл. Затем в течение 60 мин проводили инкубацию в увлажняемом инкубаторе 5% CO ₂ , 37 °С. На этой стадии проявляли осторожность для количественного переноса всех клеток, насколько возможно осторожно, без избыточного пипетирования. Затем клетки фиксировали добавлением 100 мкл фиксирующего раствора (7,4% формальдегид (37% мас./об. - Sigma F15587)) в вытяжном шкафу с последующей инкубацией в течение > 30 мин при комнатной температуре.

Затем для промывки клеток жидкость сливали в стакан для сбора или лоток и слегка стряхивали для удаления оставшейся жидкости, и осторожно постукивали по бумажной салфетке. Затем использовали 100 мкл dPBS на лунку для промывки с последующей инкубацией в течение 15 мин. Затем клетки окрашивали посредством слива жидкости, как указано выше, и использования 100 мкл красителя Hoescht (1 мкг/мл красителя Hoescht в dPBS -10 мг/мл молекулярных зондов Hoescht 33342) с последующей инкубацией в течение 30 мин. После этого клетки дважды промывали, оставляя остаток в виде 100 мкл dPBS в лунке для микроскопии. Затем измеряли (Cellomics) количество агрегированных объектов, а среднее число объектов (с тестируемым IgG) сравнивали с таковым для IgG (например, Gt-антитело против Р-кадгерина R &D Systems AF761) или контроля в виде только среды. Затем для определения величин IC ₅₀ можно строить график зависимости числа объектов от концентрации ингибитора IgG. Альтернативно, число объектов выражали в виде числа раз, в которое усиливался распад в сравнении с контролем при одной конкретной концентрации, как представлено в табл. 7.

Таблица 7

Пример 6. Измерение K _D и k _oбp для антител против Р-кадгерина

Измерения аффинности (K _D и k _обр ) одноцепочечных антител scFv против Р-кадгерина посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием устройства BIACORE ™ 3000 проводили следующим образом, применяя протоколы производителя.

Для выполнения кинетических анализов слитый белок рекомбинантный Р-кадгерин человека/Fc (hCad/Fc) и слитый белок Р-кадгерин мыши/Fc (mCad/Fc) фиксировали в отдельных плавающих ячейках сенсорной матрицы СМ5 BIACORE ™ с использованием общепринятого связывания посредством аминов. Поверхности обрабатывали с использованием 10 мМ ацетатного буфера, рН 4,5 вместе с 2,0 мМ CaCl ₂ в качестве фиксирующего буфера и достигали плотности белка величиной 5800 и 1600 единиц ответа для слитых белков hCad/Fc и mCad/Fc, соответственно. Деактивацию непрореагировавших сложных эфиров N-гидроксисукцинимида проводили с использованием 1М гидрохлорида этаноламина, рН 8,5. Активированную/деактивированную пустую поверхность использовали в качестве контрольной поверхности. Образцы антител scFv в проточном буфере получали в концентрациях, находящихся в диапазоне от 200 до 0,78 нМ (0 нМ раствор, содержащий только проточный буфер, включали в качестве нулевой точки отсчета). Образцы выбирали случайным образом и в течение 1 мин вводили инъекцией в виде трех серий каждый в плавающие ячейки с использованием HBS-P (10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20) вместе с 2,0 мМ CaCl ₂ в качестве проточного буфера. Для определения констант аффинности использовали объемную скорость потока 25 мкл/мин. Диссоциацию антитела наблюдали в течение 5 мин, а поверхность восстанавливали посредством инъекции 10 мМ глицин-HCl рН 1,5 (25 мкл/мин) в течение 12 с. Исходные данные обрабатывали с использованием пакета программного обеспечения Scrubber ( ©BioLogic Software) и анализировали с использованием пакета программного обеспечения CLAMP ( ©BioLogic Software). Данные в целом приводили в соответствие с простой моделью связывания Лэнгмюра 1:1.

Константы аффинности для одноцепочечных антител против Р-кадгерина по настоящему изобретению приведены в табл. 8.

Таблица 8

Пример 7. Определение избирательности антител против Р-кадгерина

Для определения избирательности различных антител в отношении Р-кадгерина по сравнению с Е-кадгерином использовали следующую схему.

Рекомбинантный Р-кадгерин человека (R &D Systems 861-РС-100) и рекомбинантный Е-кадгерин человека (R &D Systems 648-ЕС-100) наносили на лунки планшетов для фиксирования белков Exiqon (VWR International) при 1 мкг/мл в PBS + 0,5 мМ CaCl ₂ . Образцы IgG блокировали в 3% Marvel/PBS + 0,5 мМ CaCl ₂ в течение 1 ч до титрования от 50 нМ (7,5 мкг/мл) до 0,64 нМ (0,096 мкг/мл) и добавляли в виде двух серий в лунки, покрытые двумя различными антигенами. После уравновешивания в течение ночи при 4 °С планшеты три раза промывали посредством 1 × PBS/0,1% Tween + 0,5 мМ CaCl ₂ , а затем три раза посредством 1 × PBS + 0,5 мМ CaCl ₂ . Затем 50 мкл конъюгата антитела против Fab человека и пероксидазы, разведенного 1:5000 в 3% Marvel/PBS + 0,5 мМ CaCl ₂ , добавляли в каждую лунку и оставляли уравновешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза посредством 1 × PBS/0,1% Tween + 0,5 мМ CaCl ₂ и три раза посредством 1 × PBS + 0,5 мМ CaCl ₂ . В каждую лунку добавляли 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ; Sigma) и позволяли развиваться реакциям в течение 20 мин до прекращения посредством добавления 25 мкл/лунка 0,5 М H ₂ SO ₄ .

После считывания величин поглощения при 450 нм анализировали данные с использованием программного обеспечения Graphpad Prism для вычисления относительных величин K _D для каждого антитела для связывания с Р-кадгерином и Е-кадгерином. Полученные данные обобщены в табл. 9.

Таблица 9

Пример 8. Анализ конкурирования за эпитоп

Для измерения величин IC ₅₀ в анализе конкурирования за эпитоп для определения способности различных scFv из родительской линии вытеснять родительский IgG из природного Р-кадгерина на поверхности клеток А431 использовали следующую схему. Количество связавшегося биотинилированного родительского IgG при наличии ингибирующего scFv выявляют с использованием европия-стрептавидина и количественного подсчета DELFIA. Измеренные величины IC ₅₀ для нескольких scFv представлены в табл. 10.

Клетки А431 (ЕСАСС №85090402), культивируемые в соответствии с общепринятыми способами, а затем снимаемые при величине смыкания монослоя приблизительно 80%, высевали при 2,5 ×10 ⁴ клеток в лунке в покрытые коллагеном 96-луночные планшеты Beckton Dickenson (BD, номер в каталоге №6407) за сутки до использования. Затем планшеты промывали 3 раза посредством погружения в емкость с буфером PBS (Gibco, номер в каталоге №14190-094, без кальция, магния и бикарбоната натрия) перед добавлением 200 мкл в лунку блокирующего буфера (PBS Gibco, номер в каталоге №14190-094, вместе с 3% Marvel (Premier International Foods Ltd.)) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого планшеты 3 раза промывали посредством PBS, как указано выше.

Для высокопроизводительного скрининга и получения профиля IC ₅₀ вещества scFv/IgG исходно получали в планшетах для разведения Greiner (96-луночные полипропиленовые планшеты Greiner (Greiner, номер в каталоге №780271)) в общем объеме 60 мкл аналитического буфера. Затем переносили 50 мкл из вспомогательного планшета Greiner непосредственно в аналитический планшет и позволяли проходить реакции связывания в течение 2 ч 30 мин при комнатной температуре. После окончания реакции связывания планшеты промывали 3 раза в PBS перед добавлением меченного европием стрептавидина (Perkin Elmer, номер в каталоге №1244-360, разведение 1:1000 в буфере для анализа DELFIA (Perkin Elmer, номер в каталоге №4002-0010)) и инкубировали в течение дополнительного 1 ч при комнатной температуре.

Затем планшеты промывали 7 раз с использованием буфера для промывки DELFIA (Perkin Elmer, номер в каталоге №4010-0010) посредством многократного погружения планшетов в емкость с буфером. В итоге, после добавления усиливающего средства для DELFIA (Perkin Elmer, номер в каталоге №4001-0010-100 мкл/лунка) планшеты считывали с использованием общепринятого протокола DELFIA на совместимом ридере (например, Wallac или Envision).

Подготовка планшета для разведений Greiner-HTS

Условия высокопроизводительного скрининга (HTS) изменяли различным образом в зависимости от стадии оптимизации. В случае HTS продуктов из оптимизации отдельных цепей V _H и V _L конечный [периплазматический препарат] фиксировали на уровне 12,5% таким образом, что родительский scFv приводил к частичному ингибированию. В случае более позднего HTS продуктов из рекомбинантных библиотек V _H :V _L конечная концентрация периплазматического препарата была снижена до 1,7%, и в этих условиях контрольный scFv с оптимизированной V _H (TOP-108-C01) приводил к частичному ингибированию. Оптимизация концентрации периплазматического препарата таким образом, что соответствующий контрольный scFv приводил к частичному ингибированию, оставляла интервал для выявления в нем улучшенных клонов.

Для достижения этих конечных концентраций периплазматического препарата scFv использовали следующую процедуру:

i) С использованием устройства Cybiwell переносили необходимый объем (см. ниже) вещества образца периплазматического препарата из имеющего глубокие лунки планшета для образцов в планшет для разведений Greiner в ряды 1-11.

(предварительно разведенный периплазматический препарат 1:10 получали переносом 10 мкл чистого периплазматического препарата из планшета для образцов в планшет для разведений Greiner, содержащий 90 мкл аналитического буфера (с использованием Cybiwell)).

ii) Затем объем в рядах 1-11 доводили до 30 мкл добавлением соответствующего объема аналитического буфера.

iii) После этого добавляли 30 мкл аналитического буфера в ряд 12 (A-D) (лунки для общего связывания).

iv) Для определения неспецифического связывания к ряду 12 (Е-Н) добавляли 30 мкл избытка немеченого родительского IgG (129-1с4) в аналитическом буфере. IgG добавляли в концентрации 1000 нМ для получения конечной концентрации 500 нМ.

v) Биотинилировали IgG 129-1c4 с использованием водонерастворимого реагента EZ-link-NHS-LC-Biotin (Perbio/Pierce, номер продукта №21336). Раствор IgG дополняли добавлением 1/10-ой объема 1 М NaHCO ₃ и 1/10-ой объема диметилформамида. Реагент EZ-link-NHS-LC-Biotin растворяли в DMF, а затем добавляли в пятикратном молярном избытке в сравнении с IgG и позволяли проходить реакции в течение 20 мин при комнатной температуре. После этого биотинилированный IgG стабилизировали добавлением BSA (0,1%). Затем во все лунки добавляли 30 мкл биотинилированного родительского IgG 129-1c4 в аналитическом буфере для получения конечной концентрации 1,5 нМ в конечном объеме 60 мкл (т.е. меченный европием IgG добавляли в 2 × конечной концентрации).

vi) После смешивания содержимого планшета Greiner посредством встряхивания переносили 50 мкл непосредственно в аналитический планшет и позволяли проходить реакции связывания в течение 2 ч 30 мин при комнатной температуре (как описано ранее).

Подготовка планшета для разведений Greiner - получение профиля IC ₅₀

i) Добавляли 30 мкл/лунка аналитического буфера в ряды 2-11 и лунки 12A-12D в обычных планшетах для разведения Greiner.

ii) Для определения неспецифического связывания к ряду 12 (Е-Н) добавляли 30 мкл избытка немеченого родительского IgG (129-1с4) в аналитическом буфере. IgG следует добавлять в концентрации 1000 нМ для получения конечной концентрации 500 нМ.

iii) В ряд 1 добавляли 2 ×45 мкл каждого неразведанного scFv гистидин-prep таким образом, чтобы получить 4 серии из 11 точек титрования IC ₅₀ на 96-луночный аналитический планшет. Затем проводили две серии серийных разведений 1:3 посредством отбора 15 мкл из ряда 1 и смешиванием в ряде 2 с последующим отбором 15 мкл из ряда 2 и смешиванием в ряде 3 и т.д. После смешивания в ряде 11 удаляли 15 мкл (т.е. оставляя конечный объем 30 мкл).

iv) Затем во все лунки добавляли 30 мкл биотинилированного родительского IgG 129-1c4 в аналитическом буфере для получения конечной концентрации 1,5 нМ в конечном объеме 60 мкл (т.е. меченный европием IgG добавляли в 2 × конечной концентрации).

v) После смешивания содержимого планшета Greiner посредством встряхивания переносили 50 мкл непосредственно в аналитический планшет и позволяли проходить реакции связывания в течение 2 ч 30 мин при комнатной температуре, как описано ранее.

В случае HTS scFv экспрессировали в 96-луночной структуре в виде неочищенного экстракта из. бактериальной периплазмы (периплазматический препарат scFv) в основном буфере, содержащем MOPS/EDTA/сорбит рН 7,4 (MES рН 7,4). Для получения профиля IC ₅₀ scFv экспрессировали в более низкопроизводительной очищенной форме с использованием гистидиновой метки scFv для аффинной очистки (гистидиновый препарат scFv) в основном буфере из PBS.

Для обоих анализов HTS и IC ₅₀ исходные данные сначала преобразовывали в данные % связывания в соответствии со следующим равенством:

% связывания = {(величина связывания - величина неспецифического связывания)/(величина общего связывания величина неспецифического связывания)}*100

Затем данные HTS дополнительно анализировали с использованием общепринятых матриц Excel для выявления сигналов, приводящих к более высокому ингибированию (более низкому % связывания), чем соответствующий контрольный scFv. Для анализа IC ₅₀ данные по % связывания анализировали с использованием программного обеспечения для обработки кривых Prism версия 4.0. scFv представляют собой варианты родительского IgG 129-1c4, где участки CDR3 V _H и V _L были случайным образом изменены мутацией, как описано в примере 2. Последовательности вариантов CDR3 V _H представлены на фиг. 1 в виде SEQ ID №:91-256. Последовательности вариантов CDR3 V _L представлены на фиг. 1 в виде SEQ ID №:257-319. Величины IC ₅₀ для нескольких scFv, у которых наблюдали улучшенное связывание в сравнении с родительским IgG 129-1c4, представлены в табл. 10. Каждый из вариантов scFv родительского 129-1с4 обозначен посредством двух SEQ ID №:CDR3 V _H и CDR3 V _L . Для сравнения, IC ₅₀ для родительского IgG 129-1c4 составлял 108,3 нМ.

Таблица 10

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в этом описании, включены здесь в виде ссылки в такой же степени, как если бы каждая публикация или патентная заявка была индивидуально и конкретно указана для включения ссылкой. Хотя указанное выше изобретение описано относительно в виде иллюстрации и примера в целях ясности понимания, специалисты в данной области, учитывая описание этого изобретения, легко понимают, что в нем можно осуществлять определенные изменения и модификации без утраты сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.

Список последовательностей