Изобретение относится к препарату метаболически активных пробиотических бактерий, композициям, содержащим такой препарат, например пробиотическим добавкам или кормам для животных, и к их применению, например в лечении заболеваний, нарушающих микробный баланс кишечника. Также описан ростовой субстрат для пробиотических бактерий, содержащий смесь сложных и простых сахаров, и способ изготовления препаратов метаболически активных пробиотических бактерий с использованием этого ростового субстрата.

[0001] Препарат, содержащий жизнеспособные метаболически активные пробиотические бактерии, и ростовой субстрат, содержащий смесь сложных и простых сахаров, белков и пептидов, где бактерии в препарате демонстрируют практически равновесное состояние роста, характеризующееся тем, что популяция бактерий поддерживается на постоянном уровне при хранении приблизительно при 4 °С и при pH в диапазоне от 3,8 до 4,5 в течение периода времени по меньшей мере 5 месяцев, где общее количество сахаров находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл и где общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл.

[0002] Препарат по п.1, где популяция бактерий поддерживается в диапазоне от 108 до 109 жизнеспособных клеток на миллилитр при хранении приблизительно при 4 °С и при указанном контролируемом pH в течение периода времени по меньшей мере 5 месяцев.

[0003] Препарат по п.1 или 2, где общее количество белка и пептидов в ростовом субстрате находится в диапазоне от 1 до 2 мг/мл, причем общее количество высокомолекулярных пептидов находится в диапазоне от 100 до 300 мкг/мл.

[0004] Препарат по любому из пп.1-3, где бактерии представляют собой молочно-кислые бактерии.

[0005] Препарат по п.4, где бактерии относятся к роду Lactobacillus.

[0006] Препарат по любому из пп.1-3, где бактерии относятся к роду Enterococcus.

[0007] Препарат по любому из пп.5, 6, содержащий по меньшей мере один из видов бактерий Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei или Lactobacillus acidophilus.

[0008] Препарат по п.7, содержащий Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus casei.

[0009] Препарат по любому из пп.1-8, дополнительно содержащий противогрибковый агент.

[0010] Препарат по любому из пп.1-5, дополнительно содержащий антиоксидант.

[0011] Ростовой субстрат для метаболически активных пробиотических бактерий препарата по любому из пп.1-10, содержащий смесь сложных и простых сахаров, белков и пептидов, где общее количество сахаров находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл, а общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл.

[0012] Ростовой субстрат по п.11, где общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 15 мг/мл.

[0013] Ростовой субстрат по любому из пп.11, 12, где общее количество белков и пептидов находится в диапазоне от 1 до 2 мг/мл, причем общее количество высокомолекулярных пептидов находится в диапазоне от 100 до 300 мкг/мл.

[0014] Способ получения стабильного препарата метаболически активных пробиотических бактерий по любому из пп.1-10, включающий

[0015] Способ по п.14, где два вида бактерий выращивают вместе в одном ростовом субстрате.

[0016] Способ по п.14 или 15, где два или более видов бактерий выращивают в отдельных ростовых субстратах и смешивают вместе перед хранением приблизительно при 4 °С.

[0017] Способ получения стабильного препарата метаболически активных пробиотических бактерий по любому из пп.1-10, включающий добавление бактерий в ростовой субстрат, содержащий смесь сложных и простых сахаров, белков и пептидов, где общее количество сахаров находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл, а общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл, с получением препарата бактерий в концентрации, обеспечивающей практически равновесное состояние роста бактерий, причем популяция бактерий в препарате поддерживается на постоянном уровне при хранении приблизительно при 4 °С и при pH в диапазоне от 3,8 до 4,5 в течение периода времени по меньшей мере 5 месяцев, если хранение предусмотрено.

[0018] Способ по п.17, где бактерии представляют собой молочно-кислые бактерии.

[0019] Способ по п.18, где бактерии относятся к роду Lactobacillus.

[0020] Способ по п.17, где бактерии относятся к роду Enterococcus.

[0021] Способ по любому из пп.18-20, где концентрация бактерий в препарате находится в диапазоне от 108 до 109 жизнеспособных клеток на миллилитр.

[0022] Способ по любому из пп.14-21, где ростовой субстрат является таким, как определено в любом из пп.11-13.

[0023] Способ по любому из пп.14-22, где перед хранением препарата в него добавляют противогрибковый агент.

[0024] Корм для животных, содержащий стабильный препарат метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10.

[0025] Пищевой продукт, пригодный для потребления человеком, содержащий стабильный препарат метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10.

[0026] Напиток, пригодный для потребления человеком, содержащий стабильный препарат метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10.

[0027] Фармацевтическая композиция, содержащая стабильный препарат метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10, смешанный с одним или более фармацевтически приемлемыми разбавителями, носителями или эксципиентами.

[0028] Применение стабильного препарата метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10 в качестве пробиотика.

[0029] Применение стабильного препарата метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10 в изготовлении лекарственного средства для использования в лечении расстройства, нарушающего кишечный микробный баланс у млекопитающего.

[0030] Применение по п.29, где расстройство, нарушающее кишечный микробный баланс, представляет собой хроническое воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит или болезнь Крона.

[0031] Применение стабильного препарата метаболически активных бактерий по любому из пп.1-10 в изготовлении лекарственного средства для использования для поддержания кишечного микробного баланса у млекопитающего.

Область изобретения

Изобретение относится к препарату метаболически активных пробиотических бактерий, композициям, содержащим такой препарат, например пробиотическим добавкам или кормам для животных, и к их применению, например в лечении заболевания. Изобретение также относится к ростовому субстрату для пробиотических бактерий, содержащему смесь сложных и простых сахаров, и к способу получения препаратов метаболически активных пробиотических бактерий с использованием этого ростового субстрата.

Предшествующий уровень техники

Микробиологические организмы часто используют в качестве пищевых добавок. Один из примеров представляет собой пробиотические бактерии, которые, как известно, обладают благоприятными эффектами в отношении кишечной микрофлоры, увеличивая устойчивость к инфекционному заболеванию, такому как диарея. Кроме того, показано, что пробиотики вовлечены в модификацию химического состава крови и в иммуномодуляцию (см. ссылки, приведенные под заголовком «Потенциальные благоприятные действия в отношении здоровья » в разделе ссылок).

Пробиотические бактерии могут быть обнаружены в молочных продуктах, таких как йогурт, и виды, которые, как известно, обладают благоприятными действиями в отношении здоровья, включают виды родов Enterococcus и Lactobacillus. Тем не менее пробиотические молочные продукты обладают коротким сроком годности. Пробиотики также доступны для потребителя в форме порошка или таблеток. Дополнительное применение пробиотиков относится к применению в кормах для животных.

В существующих в настоящее время способах хранения бактериальных культур, как правило, применяют лиофилизацию, также названную сушкой вымораживанием. В этом способе воду удаляют из организма путем сублимации и организм может быть оживлен путем добавления воды. Тем не менее высушенные замораживанием бактерии не являются метаболически активными и хорошо известно, что высушенные замораживанием продукты, как правило, утрачивают большую часть своей упругости после нескольких недель хранения при комнатной температуре (Fonseca et al. и Murga et al.).

Кроме того, множество имеющихся в продаже пробиотиков, по-видимому, содержат не все компоненты, указанные на этикетках, и когда присутствуют бактерии, количество жизнеспособных бактерий часто является очень низким (J. Hamilton-Miller).

Авторы настоящего изобретения определили, что стабильные препараты жизнеспособных метаболически активных бактерий могут быть получены путем использования конкретного ростового субстрата, содержащего сбалансированные количества сложных и простых углеводов. В противоположность пробиотикам предшествующего уровня техники препараты, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, содержат большие количества стабильных и активных бактерий, которые могут поддерживаться при длительном хранении.

Описание изобретения

В соответствии с первым аспектом изобретения предложен препарат, содержащий жизнеспособные метаболически активные пробиотические бактерии и ростовой субстрат, содержащий смесь сложных и простых сахаров, белков и пептидов, где бактерии в препарате демонстрируют практически равновесное состояние роста, характеризующееся тем, что популяция бактерий поддерживается на постоянном уровне при хранении приблизительно при 4 °С и при pH в диапазоне от 3,8 до 4,5 в течение периода времени по меньшей мере 5 месяцев, где общее количество сахаров находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл и где общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл.

В этом равновесном состоянии скорость размножения бактерий поддерживается близкой к скорости гибели. В предпочтительном воплощении популяция метаболически активных бактерий в состоянии, близком к равновесному, поддерживается в диапазоне от 10 ⁸ до 10 ⁹ жизнеспособных клеток на миллилитр.

Ростовой субстрат содержит смесь сложных и простых углеводов (сахаров). Используемые здесь термины "сложные углеводы" или "сложные сахара" включают олигосахариды и полисахариды, тогда как термины "простые углеводы" или "простые сахара" включают моносахариды и дисахариды.

В предпочтительном воплощении концентрация общих сахаров составляет приблизительно 30 мг/мл, а концентрация редуцирующих сахаров составляет приблизительно 10 мг/мл.

Как правило, общее количество белков и пептидов, присутствующих в субстрате, находится в диапазоне от 1 до 2 мг/мл, а общее количество высокомолекулярных пептидов (молекулярная масса больше 5000 Да) находится в диапазоне от 100 до 300 мкг/мл. В конкретном воплощении концентрация белка и пептидов может составлять приблизительно 2 мг/мл, а концентрация высокомолекулярных пептидов может составлять приблизительно 250 мкг/мл.

Ростовой субстрат может содержать дополнительные компоненты, такие как, например, целлюлоза, крахмал, β-глюканы, пентозаны, полифенолы, рибонуклеиновые кислоты, липиды, фосфаты, флавеноиды, аминокислоты, витамины (B ₁ , В ₂ , С и Е), силикаты и микроэлементы.

В предпочтительном воплощении ростовой субстрат получают из осоложенного зерна злаков. Наиболее предпочтительно ростовой субстрат получают с использованием описанного ниже способа.

Изобретение обладает преимуществом по сравнению с существующими в настоящее время пробиотическими препаратами, поскольку метаболически активные бактерии могут храниться в течение многих месяцев без повреждения или утраты активности. Используемые в настоящее время препараты высушенных замораживанием бактерий, как правило, содержат небольшое количество, если вообще содержат, метаболически активных бактерий. Кроме того, препараты высушенных замораживанием бактерий утрачивают некоторые из своих характеристик и активность при регидратации. Кроме того, реактивированные бактерии обладают коротким сроком хранения и могут храниться только в течение короткого периода времени. Высушенные замораживанием бактерии часто не регидратируют перед применением у животного хозяина. Если они регидратированы, то, как правило, должны быть использованы в тот же самый день, иначе они могут быстро утрачивать жизнеспособность и портиться из-за загрязнения организмами.

Еще одна проблема с высушенными замораживанием препаратами из предшествующего уровня техники заключается в том, что они являются гигроскопичными (поглощают влагу из воздуха) и, таким образом, пакет необходимо использовать в течение нескольких дней после открывания, иначе частичная гидратация вызывает быструю утрату жизнеспособности.

Препарат по изобретению позволяет избежать вышеперечисленных проблем, связанных с использованием высушенных замораживанием бактериальных культур. Дополнительно авторами изобретения также продемонстрировано, что бактериальные культуры, приготовленные в соответствии с изобретением, значительно более жизнеспособны по сравнению с бактериями, приготовленными с использованием способов, известных из предшествующего уровня техники, что дает возможность бактериям быстрее приживаться в животных-хозяевах и выдерживать агрессивную среду пищеварительного тракта млекопитающего (проиллюстрировано в примере 5).

Авторы изобретения преодолели проблему обычно используемых препаратов путем использования ростового субстрата со сбалансированным запасом питательных веществ в форме сложных и простых сахаров, белков и пептидов в комбинации с контролируемым pH и хранением на холоде. В этих условиях в препарате происходит непрерывный медленный рост бактерий. Комбинация температуры, pH, фазового роста и субстрата обеспечивает состояние роста, близкое к равновесному, посредством чего высокие концентрации жизнеспособных, метаболически активных бактерий могут поддерживаться в течение периодов по меньше мере 5 месяцев.

В конкретном воплощении pH препарата при хранении поддерживают приблизительно на уровне 4,0. pH препарата удобно можно контролировать путем добавления подходящего буфера или комбинации буферных агентов. Предпочтительные буферы включают, например, тринатрий-цитратный или фосфатный буфер. Применение буферов, таких как тринатрий-цитратный или фосфатный буфер, описано в стандартных способах в области техники.

В предпочтительном воплощении бактерии в препарате представляют собой молочно-кислые бактерии. Используемый здесь термин "молочно-кислые бактерии (МКБ)" описывает группу грамположительных каталазанегативных неподвижных анаэробных бактерий, ферментирующих углеводы в молочную кислоту. Эта группа включает роды Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus, Bifidobacterium и Enterococcus.

В предпочтительном воплощении бактерии относятся к роду Lactobacillus или Enterococcus. В наиболее предпочтительном воплощении молочно-кислые бактерии представляют собой по меньшей мере один из следующих видов: Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei и Lactobacillus acidophilus. В предпочтительном воплощении применяют комбинацию Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei.

Препарат дополнительно может содержать противогрибковый агент, такой как, например, стерилизованный сорбат калия и/или антиоксидант, такой как витамин С.

Во втором аспекте изобретения также предложен ростовой субстрат для метаболически активных пробиотических бактерий препарата по изобретению, содержащий сложную смесь углеводов. Ростовой субстрат содержит смесь сложных и простых сахаров, включая мономеры, димеры, олигомеры и полимеры сахаров.

Предпочтительные признаки ростового субстрата являются, по существу, такими, как описано выше в связи с первым аспектом изобретения. Таким образом, общее количество углеводов (простые плюс сложные сахара), присутствующих в ростовом субстрате, предпочтительно находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл, более предпочтительно в диапазоне от 25 до 35 мг/мл и наиболее предпочтительно составляет приблизительно 30 мг/мл. Из этого общего содержания углеводов (сахаров) общее количество редуцирующих сахаров (моносахаридов) предпочтительно находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл, более предпочтительно от 5 до 15 мг/мл и наиболее предпочтительно составляет приблизительно 10 мг/мл.

Хотя простые и сложные углеводы представляют собой ключевой компонент ростового субстрата, понятно, что ростовой субстрат также может содержать дополнительные компоненты, такие как белки, которые обеспечивают азот для роста бактерий. Соответственно, ростовой субстрат предпочтительно содержит общее количество белка и пептидов в диапазоне от 1 до 2 мг/мл, предпочтительно приблизительно 2 мг/мл. Из этого общего содержания белка/пептидов общее количество высокомолекулярных пептидов (молекулярная масса больше 5000 Да) может находиться в диапазоне от 100 до 300 мкг/мл и обычно составляет приблизительно 250 мкг/мл. Точная идентичность (например, аминокислотная последовательность) белкового и пептидного компонентов в ростовом субстрате, как правило, не представляет собой объект изобретения.

Ростовой субстрат может содержать дополнительные компоненты, такие как, например, целлюлоза, крахмал, β-глюканы, пентозаны, полифенолы, рибонуклеиновые кислоты, липиды, фосфаты, флавеноиды, аминокислоты, витамины (B ₁ , B ₂ , С и Е), силикаты и микроэлементы. Точная идентичность и относительные количества этих дополнительных компонентов в субстрате не являются особенно лимитирующими. Если, как это предпочтительно, ростовой субстрат получен из природного растительного источника, например осоложенного зерна хлебных злаков, эти дополнительные компоненты обычно представляют собой биомолекулы природного происхождения.

Ростовой субстрат может содержать различные добавки, такие как буферные агенты и другие вещества, разработанные для улучшения характеристик субстрата и/или удлинения срока хранения. Такие добавки могут включать, например, противогрибковые агенты, антиоксиданты и т.д.

В предпочтительном воплощении ростовой субстрат может содержать материал в виде частиц, например частицы, не превышающие в диаметре 1 мм.

Ростовой субстрат может быть получен из осоложенного зерна злаков с использованием описанного ниже способа получения. Однако изобретение не ограничивается субстратами, полученными в соответствии с этим способом. Ростовые субстраты, демонстрирующие, по существу, схожие свойства, могут быть получены синтетически, например путем смешивания вместе требуемой смеси сложных и простых углеводов с любым из перечисленных выше дополнительных компонентов.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения предложен способ получения ростового субстрата для пробиотических бактерий, включающий

стадию затирания осоложенного зерна, на которой осоложенное зерно смешивают с водной жидкостью и помещают во временные и температурные условия, ограничивающие степень превращения сложных углеводов в простые, так что получают смесь сложных и простых углеводов, белков и пептидов, и

отделение смеси сложных и простых углеводов, белков и пептидов от использованного осоложенного зернового продукта с получением ростового субстрата.

Используемые здесь термины "осоложенное зерно" или "солод" относятся к продукту процесса осоложивания, примененному к зерну злаков. Осоложивание представляет собой процесс, хорошо известный в области пивоварения.

В типичном процессе осоложивания зерно злаков проращивают для того, чтобы индуцировать мобилизацию запасных питательных веществ. Прорастающие зерна продуцируют ряд ферментов для мобилизации запасных белков и углеводов, включая α-амилазы, которые гидролизуют крахмал в мальтозу. Предпочтительное воплощение относится к применению ячменя, но в объеме изобретения могут быть использованы другие злаки, такие как рис, пшеница, кукуруза и овес или даже их смеси. Способ проращивания в общем хорошо известен. Следует понимать, что способ может быть осуществлен с осоложенным зерном или синтетическим субстратом, содержащим смесь углеводов, белков и ферментов.

Предпочтительно осоложенное зерно плющат перед дальнейшей обработкой. Растрескивание зерен в результате расплющивания облегчает доступ воды и экстракцию питательных веществ во время стадии смешивания, в то же время предотвращение раздробления зерна способствует последующему отделению ростового субстрата от использованного осоложенного зерна.

Полученный солод подвергают операции затирания, которая напоминает стадию затирания, используемую в способах пивоварения (см., например, Kunze, W. Technology Brewing and Malting (1996)). Термин "затирание" хорошо известен в области пивоварения и относится к процессу, при котором осоложенное зерно перемешивают в присутствии воды, нагретой до определенных температур, для получения сусла. Во время стадии затирания сложные углеводы в осоложенном зерне разрушаются до мальтозы.

Способ по изобретению также включает стадию затирания, на которой осоложенное зерно злаков смешивают с водной жидкостью (как правило, водой) и эту смесь нагревают до различных определенных температур. Эта стадия затирания, однако, не соответствует типичному процессу затирания в пивоварении. Пивовары ставят задачу превратить максимально возможное количество углеводов в простые сахара для последующей их ферментации в спирт. Условия же стадии затирания в способе по изобретению, напротив, подобраны конкретно для ограничения степени превращения в простые (редуцирующие) сахара, оставляя значительные количества углеводов в более сложных олигомерных и полимерных формах.

В неограничивающих воплощениях степень превращения углевода может быть ограничена так, чтобы количество простых (редуцирующих) сахаров, присутствующих в получающемся в результате ростовом субстрате, выраженное в виде процента (мас./мас.) от общего содержания углеводов, находилось в диапазоне от 10 до 50% (мас./мас.).

Желаемое ограниченное превращение сложных сахаров в простые может быть достигнуто путем увеличения температуры на стадии затирания в течение короткого периода времени, как правило, 30 мин, не давая смеси осоложенное зерно/вода возможности выдерживаться при промежуточных температурах. Традиционные процессы пивоварения включают выдержку при 60-65 и 70-74 °С, поскольку это дает возможность ферментам продуцировать высокие концентрации простых сахаров (в основном мальтозы). Соответственно, в предпочтительном воплощении изобретения стадия затирания не включает выдержку при температурах в диапазоне от 60 до 65 °С и/или при температурах в диапазоне от 70 до 74 °С.

В конкретном воплощении стадия затирания включает смешивание осоложенного зерна с водой при температуре в диапазоне от 30 до 45 °С, выдерживание смеси в течение промежутка времени от 1 до 2 ч, увеличение температуры до температуры в диапазоне от 75 до 85 °С в течение периода времени в диапазоне от 20 до 40 мин, предпочтительно 30 мин, и затем выдерживание смеси при температуре в диапазоне от 75 до 85 °С в течение периода времени в диапазоне от 60 до 90 мин. При более высокой температуре любые ферменты, присутствующие в смеси, инактивируются и питательные вещества могут быть экстрагированы. Как правило, предпочтительны более высокие температуры в диапазоне от 76 до 80 °С и конкретно 78 °С. Температура на этой стадии должна быть достаточно высокой в течение промежутка времени, достаточно длительного для инактивации всех ферментов, присутствующих в препарате. Следует понимать, что точная используемая температура и временные промежутки могут в некоторой степени варьировать в соответствии с типом используемого зерна.

Описанный здесь способ специфически ограничивает степень превращения сложных сахаров в простые сахара. Кроме того, исходное выдерживание при температуре в диапазоне от 30 до 45 °С обеспечивает дополнительное преимущество, заключающееся в том, что оно максимизирует высвобождение аминокислот и пептидов. Как правило, предпочтительны температуры, находящиеся ближе к верхней границе этого диапазона, т.е. от 40 до 45 °С или конкретно приблизительно 45 °С. Задача этой стадии заключается в гидролизе запасных белков, присутствующих в зерне хлебных злаков, до доступных аминокислот и пептидов. Оптимальная комбинация времени и температуры для достижения желаемого гидролиза может в некоторой степени варьировать в зависимости от типа используемого зерна.

Присутствие высоких концентраций белков, пептидов и аминокислот желательно в ростовом субстрате, используемом для поддержания роста бактерий, поскольку обеспечивает полезный источник азота. Типичные способы затирания, используемые в традиционном пивоварении, как правило, не включают выдерживание при температуре в этом диапазоне, поскольку пивовары обычно не стремятся достичь высокого содержания белка или аминокислот в сусле, предназначенном для ферментации с получением спирта.

По завершении стадии затирания, например, когда все желаемые питательные вещества экстрагированы из уже "истощенного" осоложенного зерна, получающаяся в результате смесь, содержащая сложные и простые углеводы, белки и пептиды, может быть отделена от оставшегося зерна с получением ростового субстрата с использованием любых подходящих способов. Как правило, они включают грубую фильтрацию, например с использованием фильтра 1 мм, такого как имеющая форму клина проволочная клетка, с получением раствора, содержащего грубые частицы. Признак способа по изобретению заключается в том, что ростовой субстрат не осветляют, как это обычно имеет место в случае сусла, приготовленного в ходе процедуры стандартного пивоварения. В традиционном пивоварении сусло обычно осветляют для удаления всех грубых частиц, таким образом получая прозрачную жидкость.

Присутствие некоторого количества материала в виде частиц в ростовом субстрате, приготовленном в соответствии со способом по изобретению, является благоприятным с точки зрения последующего применения для поддержания роста бактерий, поскольку обеспечивает медленное высвобождение питательных веществ и поверхности частиц для адгезии бактериальных культур.

Если требуется, ростовой субстрат, приготовленный в соответствии с изобретением, может быть стерилизован перед дальнейшим использованием. Как понятно, это может быть осуществлено путем кипячения в течение приблизительно одного часа или путем автоклавирования при 120 °С в течение приблизительно 20 мин.

Если необходимо, в ростовой субстрат может быть добавлен буфер или несколько буферных компонентов, например, если ростовой субстрат затем должен быть использован для приготовления бактериального препарата в соответствии с первым аспектом изобретения. Предпочтительные буферы являются такими, как перечислено в связи с первым аспектом изобретения. Если ростовой субстрат должен быть простерилизован, буфер(ы) может(гут) быть добавлен(ы) перед, во время или после стерилизации, как целесообразно.

В еще одном аспекте изобретение также относится к способу получения стабильного препарата жизнеспособных, метаболически активных пробиотических бактерий, включающему

выращивание бактерий в ростовом субстрате, содержащем смесь сложных и простых сахаров, белков и пептидов, где общее количество сахаров находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл, а общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл, и

охлаждение полученных бактерий до температуры приблизительно 4 °С, при которой бактерии демонстрируют практически равновесное состояние роста, характеризующееся тем, что популяция бактерий может поддерживаться на постоянном уровне при хранении приблизительно при 4 °С и при pH в диапазоне от 3,8 до 4,5 в течение периода времени по меньшей мере 5 месяцев.

В конкретном воплощении бактерии выращивают в ростовом субстрате до достижения ими концентрации от 2 ×10 ⁸ до 1 ×10 ⁹ колониеобразующих единиц в миллилитре. В этот момент культуру (или ферментационную среду) охлаждают до приблизительно 4 °С, и комбинация температуры, pH, фазы роста и состава оставшегося субстрата обеспечивает равновесные условия, дающие возможность для поддержания практически равновесного состояния роста при длительном хранении. В этом практически равновесном состоянии, которое может поддерживаться в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 5 месяцев, популяцию метаболически активных бактерий поддерживают, по существу, на постоянном уровне в диапазоне от 10 ⁸ до 10 ⁹ жизнеспособных клеток на миллилитр. Следует понимать, однако, что точное количество жизнеспособных клеток в этом практически равновесном состоянии может в некоторой степени варьировать в зависимости от видов используемых бактерий.

Способ в соответствии с этим аспектом изобретения включает "стадию роста", на которой бактерии выращивают в ростовом субстрате до достижения ими концентрации, дающей возможность достижения при последующем хранении практически равновесного состояния. Важная особенность способа заключается в том, что используемый ростовой субстрат обеспечивает сбалансированное поступление питательных веществ, содержащих смесь сложных и простых сахаров, где высокая доля углеводного содержимого находится в форме сложных сахаров, которые могут быть использованы в качестве источника энергии бактериями. Эта смесь дает возможность для ограничения непосредственно доступной энергии во время стадии роста. Композиция и предпочтительные признаки ростового субстрата предпочтительно являются такими, как описано выше в связи с первым и вторым аспектами изобретения. Ростовой субстрат предпочтительно готовят из осоложенного зерна злаков с использованием описанного здесь способа получения. Следует понимать, тем не менее, что не является строго необходимым использовать ростовой субстрат, полученный в соответствии с этим способом. Похожие результаты могут быть достигнуты при использовании ростового субстрата, полученного синтетически путем смешивания требуемых пропорций сложных и простых углеводов, белков и пептидов.

Стадию роста следует осуществлять с осторожностью, чтобы не выращивать бактерии слишком длительное время для того, чтобы избежать получения кислых условий, которые ингибировали бы дальнейший рост, а также ограничивали период хранения получающегося в результате препарата. С другой стороны, если преждевременно прервать стадию роста, это будет ограничивать продукцию биомассы. Величину pH препарата во время выращивания бактерий можно использовать в качестве индикатора практически равновесного состояния. В типичном воплощении культуры молочно-кислых бактерий могут выращиваться до достижения pH 4,5 ±0,3 единицы.

Следует понимать, что pH ростового субстрата может в некоторой степени варьировать в зависимости от оптимального диапазона pH для используемой бактерии. В типичном воплощении (подходящем для молочно-кислых бактерий) величина pH во время хранения должна находиться в диапазоне от 3,8 до 4,5. Предпочтительно в ростовой субстрат для контроля pH в течение роста бактерий и последующего хранения добавляют буферы, такие как тринатрийцитрат или фосфаты.

Следует понимать, что точная длительность стадии роста бактерий до достижения практически равновесного состояния зависит от используемых видов. Выращивание бактерий может быть осуществлено в любом подходящем аппарате для культивирования. В специфических воплощениях стадия роста может быть осуществлена путем ферментации в ферментационном сосуде.

В предпочтительном воплощении используемые бактерии представляют собой молочно-кислые бактерии. Предпочтительные виды относятся к родам Enterococcus и Lactobacillus. Если такие виды должны были бы быть выращены с использованием "обычных" ростовых сред, состоящих в значительной степени из простых сахаров, избыточное поступление энергии привело бы к избыточной продукции кислоты молочно-кислыми бактериями, что ограничило бы продукцию биомассы и срок хранения получающейся в результате культуры. Наоборот, сложная смесь сахаров, присутствующих в ростовом субстрате, используемая в способе по изобретению, поставляет энергию для роста в исходной стадии роста и также для поддержания при хранении продукта.

В соответствии с изобретением стадия роста может быть осуществлена с использованием отдельного вида бактерии. В предпочтительном воплощении изобретения два или более чем два разных вида бактерий могут быть выращены независимо в отдельных ростовых средах и затем смешаны перед или после стадии охлаждения. Ростовые субстраты, используемые для независимого культивирования двух или более чем двух различных видов бактерий, могут иметь одинаковый или разный состав. Таким образом, можно оптимизировать условия роста культур индивидуальных видов бактерий и затем объединять культуры вместе для хранения в условиях, дающих возможность для поддержания равновесного роста для каждого из индивидуальных видов в культуре.

В других воплощениях способа два или более чем два различных вида бактерий можно выращивать вместе в единой культуре в одном и том же ростовом субстрате при условии, что их скорости роста сравнимы, так что ни один вид не будет доминировать в популяции. После стадии роста препарат может быть проанализирован с использованием стандартных способов для определения микробиологической чистоты и подсчета бактерий. Также можно выращивать две или более чем две различные комбинации бактерий вместе в отдельных ростовых субстратах и затем объединять культуры вместе в конечном продукте. Комбинированная культура аналогичным образом может быть смешана с культурой отдельного вида бактерий.

Исходные культуры для стадии роста способа включают, например, высушенные замораживанием бактерии или жидкие культуры.

Следует понимать, что препарат бактерий, приготовленный с использованием способа по изобретению, может быть использован непосредственно после стадии охлаждения, но чаще всего препарат хранят перед применением. Оптимальная температура для хранения для поддержания практически равновесного состояния роста в культуре составляет приблизительно 4 °С, но специалисту в данной области техники понятно, что температура хранения может в некоторой степени варьировать. Для удобства аликвоты практически равновесной культуры, полученной данным способом, могут быть распределены в подходящую стерильную упаковку перед длительным хранением.

Ключевое преимущество способа по изобретению заключается в том, что полученные практически равновесные культуры сохраняют жизнеспособность и целостность при хранении в течение продолжительных периодов времени, как правило, в течение по меньшей мере 5 месяцев. Однако следует понимать, что для данного способа не является существенным, чтобы культуры в действительности хранились в течение по меньшей мере 5 месяцев перед использованием.

Для того чтобы избежать роста грибов или дрожжей, перед хранением может быть добавлен противогрибковый агент, такой как стерильный сорбат калия. Противогрибковые агенты главным образом предотвращают порчу дрожжами или грибами во время использования конечными пользователями после открывания контейнера с продуктом. Кроме того, может быть добавлен антиоксидант, например витамин С, для того, чтобы способствовать предотвращению порчи продукта при хранении. Следует понимать, что другие агенты, хорошо известные в области техники, также могут быть использованы в качестве противогрибковых агентов или антиоксидантов.

В еще одном аспекте изобретение также относится к альтернативному способу получения стабильного препарата жизнеспособных метаболически активных пробиотических бактерий, для которого не требуется стадия активного роста. Этот способ включает следующие стадии: добавление бактерий в ростовой субстрат, содержащий смесь сложных и простых сахаров, белков и пептидов, где общее количество сахаров находится в диапазоне от 20 до 40 мг/мл, а общее количество редуцирующих сахаров находится в диапазоне от 5 до 20 мг/мл, с получением препарата бактерий в концентрации, обеспечивающей практически равновесное состояние роста бактерий, причем популяция бактерий в препарате поддерживается на постоянном уровне при хранении приблизительно при 4 °С и при pH в диапазоне от 3,8 до 4,5 в течение периода времени по меньшей мере 5 месяцев, если хранение предусмотрено.

Предпочтительные виды бактерий являются такими, как перечислено выше в связи со способом, для которого требуется стадия активного роста.

Для этого способа не требуется, чтобы бактерии выращивались в ростовом субстрате перед помещением их в условия для практически равновесного роста. Точнее, ростовой субстрат инокулируют закваской(ами) бактерий в концентрации, дающей возможность для поддержания равновесного состояния, когда получающийся в результате препарат хранят при 4 °С и указанной контролируемой величине pH в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 5 месяцев. Закваски для способа включают, например, высушенные замораживанием бактерии или жидкие культуры. Ростовой субстрат может быть инокулирован более чем одним видом бактерий. Предпочтительно концентрация жизнеспособных клеток в закваске превосходит концентрацию жизнеспособных клеток на миллилитр.

Практически равновесного состояния вновь достигают путем комбинирования питательных веществ в ростовом субстрате, температуры, pH и фазы роста. В практически равновесном состоянии, которое может поддерживаться в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 5 месяцев, популяцию метаболически активных бактерий предпочтительно поддерживают на постоянном уровне в диапазоне от 10 ⁸ до 10 ⁹ жизнеспособных клеток в миллилитре. Опять же следует понимать, что точное количество жизнеспособных клеток в практически равновесном состоянии может в некоторой степени варьировать в зависимости от видов используемых бактерий. Кроме того, понятно, что точная концентрация закваски и pH ростового субстрата могут варьировать в зависимости от видов используемых бактерий.

Признаки, раскрытые в качестве предпочтительных в отношении практически равновесных культур, полученных посредством способа, требующего стадии роста, применимы при внесении необходимых изменений в отношении практически равновесных культур, получаемых посредством этого способа. Предпочтительно для поддержания pH в диапазоне от 3,8 до 4,5 при хранении используют буферы, такие как тринатрийцитрат или фосфаты.

В предпочтительном воплощении используемые бактерии представляют собой молочно-кислые бактерии. Предпочтительные виды относятся к родам Enterococcus и Lactobacillus.

Предпочтительные признаки ростового субстрата, используемого в этом способе, являются такими, как описано выше в связи со вторым аспектом изобретения. Вновь, предпочтительно, но не существенно, чтобы ростовой субстрат был приготовлен из осоложенного зерна хлебных злаков с использованием описанного здесь способа.

Применения препарата метаболически активных бактерий.

Благоприятные эффекты пробиотиков в отношении здоровья хорошо известны (см., например, Marteau, P. and Rambaud, J.-C., (1996) Therapeutic applications of probiotics in humans' in Leeds, A.R. and Rowland, I.R. (eds.) Gut flora and health - past, present and future, Royal Society of Medicine Press Limited, London; Stark, B.A. and Wilkinson, (eds.) (1989) Probiotics. Theory and Applications). Показано, что пробиотики полезны при лечении диареи и запора, синдрома раздраженного кишечника, лечении и профилактике рака и других заболеваний, нарушающих кишечную микрофлору. Бактериальные препараты, предложенные в изобретении, таким образом, обладают особенной полезностью в лечении или профилактике заболеваний, нарушающих кишечную микрофлору, и более общей полезностью при поддержании здоровой микрофлоры.

Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения или предупреждения расстройства, нарушающего кишечный баланс микроорганизмов у пациента - человека или животного, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества стабильного препарата метаболически активных бактерий по изобретению.

В частности, изобретение относится к лечению или предупреждению хронического воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита или болезни Крона. Кроме того, бактериальные культуры в соответствии с изобретением могут быть введены пациенту, человеку или животному (например, млекопитающему или птице), для общего поддержания здоровой микрофлоры, а не для лечения конкретного заболевания.

В еще одном воплощении изобретение также относится к применению стабильного препарата метаболически активных бактерий в соответствии с изобретением для изготовления лекарственного средства для лечения заболеваний, нарушающих кишечную микрофлору.

Бактериальные препараты могут быть использованы сами по себе, например в виде пробиотических добавок, или они могут быть смешаны с дополнительными компонентами перед введением человеку или животному или даже введены вместе с дополнительными компонентами без смешивания. Для ветеринарного применения может быть удобно добавлять бактериальный препарат в обычный корм для животных. В ветеринарной практике препараты особенно полезны в лечении видов птиц, в особенности промышленной птицы (как проиллюстрировано в сопутствующих примерах), а также видов млекопитающих, например коров, овец, лошадей, кошек, собак и т.д.

Для применения у людей бактериальные препараты могут быть введены сами по себе или опять же могут быть смешаны или приготовлены с дополнительными компонентами перед введением субъекту-человеку. Таким образом, изобретение охватывает композиции, содержащие бактериальный препарат по изобретению вместе с одним или более чем одним дополнительным компонентом. В качестве примера дополнительные компоненты могут быть добавлены для улучшения вкусовых качеств композиции для потребления людьми. Если удобно, препараты в соответствии с изобретением могут быть включены в продукты питания или напитки для потребления людьми при условии, что это не повлияет на жизнеспособность бактерий в препарате.

Для применения людьми и/или ветеринарного применения может быть удобно готовить препараты по изобретению в стандартных лекарственных формах сами по себе или в комбинации с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым разбавителем, эксципиентом или носителем. Опять же, такой препарат не должен негативно влиять на жизнеспособность бактерий в препарате.

Это изобретение дополнительно поясняется со ссылкой на следующие не ограничивающие объем изобретения экспериментальные примеры вместе с сопутствующими графическими материалами, на которых представлено следующее.

Фиг. 1а-1г демонстрируют устойчивость жидкой культуры Lactobacillus plantarum, приготовленной описанным здесь способом ("жидкая") по сравнению с лиофилизированным препаратом бактерии ("сухой"). Первые две кривые роста (фиг. 1а и 1б) указывают на то, что в невраждебной среде бактерии, приготовленные в соответствии с изобретением, растут быстрее по сравнению с лиофилизированным препаратом. Кривая роста на фиг. 1в демонстрирует рост Lactobacillus plantarum, приготовленных описанным здесь способом ("жидкая") по сравнению с лиофилизированным препаратом бактерии ("сухой") в среде, обогащенной солями желчных кислот. Фиг. 1г демонстрирует рост Lactobacillus plantarum, приготовленной описанным здесь способом ("жидкая") по сравнению с лиофилизированным препаратом бактерии ("сухой") при низком pH и в присутствии солей желчных кислот, имитирующих среду, обнаруженную в пищеварительном тракте млекопитающих. Результаты демонстрируют, что бактерии, приготовленные в соответствии со способом по изобретению, более устойчивы к враждебной среде.

Фиг. 2а и 2б демонстрируют, что срок хранения бактерий, приготовленных в соответствии с изобретением, увеличивается.

Фиг. 3 демонстрирует колонизацию бактерий в тонкой кишке цыпленка.

Пример 1. Получение ростового субстрата с использованием среды на основе ячменя.

(А) Проращивание (осоложивание).

День 1.

Ячмень замачивали в воде в течение 2-24 ч в зависимости от партии зерна. 0,1% (мас./об.) гипохлорита натрия (отбеливатель) может быть включено в воду для ингибирования роста биологических загрязнителей в течение фазы проращивания. Через 4 ч воду с зерна сливали и зерно оставляли при комнатной температуре при 10-30 °С в течение приблизительно 1 дня.

День 2.

Зерно замачивали в чистой воде в течение еще одного 4-часового периода. В воду для этого и последующих замачиваний может быть добавлена перекись водорода (0,1% мас./об.). Перекись водорода обеспечивает кислород для прорастающего зерна и действует в качестве обеззараживающего средства. Альтернативно, может быть использован гипохлорит натрия. Через 4 ч воду с зерна сливали и зерно оставляли приблизительно на 1 день. Редкое (например, каждые 4 ч) встряхивание зерен может улучшить проращивание путем увеличения газообмена, снабжения кислородом и удаления двуокиси углерода.

День 3 и далее.

Цикл замачивания, сушки и выдерживания продолжали до тех пор, пока появляющиеся на зернах корешки не достигали длины 2-4 мм. Эта стадия роста свидетельствовала о том, что зерно продуцировало ферменты для мобилизации запасных питательных веществ. Эти ферменты являются ключевыми для последующей продукции ростовой среды во время "затирания". Может быть допустимой более экстенсивная модификация зерна с сохранением фазы прорастания до тех пор, пока корешки не достигнут длины нескольких миллиметров. Однако слишком значительный рост лишь превратит питательные вещества в корни и побеги растения, которые не могут быть использованы в ферментации.

(Б) Плющение.

После того как зерно достаточно проросло, его затем перемалывают с использованием вальцовой плющилки. Плющилка отрегулирована таким образом, чтобы зерна растрескивались, но не раздроблялись или полностью не расплющивались. Растрескивание зерен дает возможность для доступа воды и экстракции питательных веществ во время затирания, в то же время предотвращение раздробления зерен облегчает стадию фильтрации.

(В) Приготовление ростового субстрата.

Пророщенные перемолотые зерна смешивали с водой в количестве, достаточном для того, чтобы покрыть их, при 45 °С, и смесь выдерживали при 45 °С в течение 1 ч.

Через 1 ч при 45 °С температуру увеличивали до 78 °С в течение 30 мин.

Смесь оставляли стоять при 78 °С в течение 1 ч. После выдерживания при 78 °С истощенные зерна отделяли путем фильтрования. Использовали относительно грубый фильтр (например, имеющая форму клина проволочная клетка, 1 мм) с получением раствора, содержащего значительные количества суспендированных твердых веществ. Истощенное зерно удаляли и жидкость затем подвергали температурной обработке для ее пастеризации или стерилизации. В этом конкретном эксперименте жидкость кипятили в течение 45 мин. Затем добавляли буфер (0,5% (мас./об.) тринатрийцитрат) и смесь кипятили в течение еще 15 мин с получением конечного ростового субстрата.

Пример 2. Анализ ростового субстрата.

(а) Анализы углеводов.

Общее содержание углеводов определяли путем анализа с использованием фенол-серной кислоты с глюкозой в качестве референсного стандарта (Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. and Smith, F. (1956) Analytical Chemistry, vol. 28, p. 350).

Редуцирующие сахара определяли с использованием способа Нельсона-Сомогуи (Nelson-Somogyi) опять же с глюкозой в качестве референсного стандарта (Somogyi, М. (1952) Journal of Biological Chemistry, vol. 195, p. 19).

Результаты.

Общие сахара в субстрате находятся в диапазоне от 20 до 40 мг/мл.

Редуцирующие сахара находятся в диапазоне от 5 до 20 мг/мл.

(б) Белковые и пептидные анализы.

Общее содержание белка определяли с использованием двух анализов с бычьим сывороточным альбумином в качестве референсного стандарта.

(1) Биуретовый реагент (Itzhaki, R.F & Gill, D.M. (1964) Analytical Biochemistry, Vol. 9, p. 401-410).

(2) Метод Лоури, модифицированный Охниши и Барром (Ohnishi and Barr) (Ohnishi, S.Т. & Barr, J.K. (1978) Journal of Biological Chemistry, Vol. 193, p. 265).

Пептиды, имеющие молекулярную массу больше 5000 Да, определяли с использованием реагента Брэдфорда (Bradford, M.М. (1976) Analytical Biochemistry, Vol. 72, p. 248-254).

Результаты.

Общее содержание белка и пептидов находятся в диапазоне от 1 до 2 мг/мл.

Высокомолекулярные пептиды (больше чем 5000 Да) находятся в диапазоне от 100 до 300 мкг/мл.

Пример 3. Продукция метаболически активной бактериальной культуры.

(А) Ферментация.

Ростовой субстрат, приготовленный в соответствии с примером 1, охлаждали до 37 °С и добавляли бактериальные культуры. Примеры подходящего инокулума представляют собой высушенные замораживанием бактерии или жидкие закваски (как правило, 1% (об./об.) ночной культуры в питательном бульоне).

В этом примере следующие бактерии выращивали в двух сосудах:

(1) Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum;

(2) Lactobacillus casei.

Ферментацию осуществляли в течение 16-20 ч до тех пор, пока pH не достигала 4,5 ±0,3 единиц. Ферментационную смесь затем охлаждали до 4 °С и подвергали стандартным анализам для оценки качества (для определения микробиологической чистоты и подсчета бактерий).

В этот момент в ферментационный бульон может быть добавлен стерильный сорбат калия (конечная концентрация 0,005% мас./об.). Это осуществляют для ингибирования роста любых грибов или дрожжей, который может возникать ввиду загрязнения при манипуляции конечным пользователем. Также в качестве антиоксиданта может быть добавлен витамин С (конечная концентрация 0,01% мас./об.).

Если необходимо, после тестов для оценки качества различные партии могут быть смешаны с получением продуктов со сложными смесями бактериальных видов.

В представленном здесь примере смешивание двух партий бактерий дает конечный продукт, содержащий бактерии Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus casei.

Пример 4. Срок годности метаболически активной бактериальной культуры.

Для оценки срока годности метаболически активной бактериальной культуры партии бактериальной культуры, содержащей виды Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum и Lactobacillus casei, полученной в примере 2, хранили при 4 °С ( ±1 °С). Образцы отбирали с недельными интервалами и аликвоты по 100 мкл серийных разведений в 0,1%-ном (мас./об.) пептонном бульоне растирали на чашках с агаром. Чашки инкубировали в течение приблизительно 48 ч при приблизительно 37 °С и бактериальные колонии подсчитывали.

Результаты.

Приведенные ниже результаты демонстрируют срок годности для бактерий, приготовленных способом по изобретению, в виде количества колониеобразующих единиц на миллилитр в неделю (также смотри фиг. 2). Партии А и Б готовили в соответствии с тем же самым способом, описанным здесь, но в другие дни.

E.f = Enterococcus faecium.

L.p = Lactobacillus plantarum.

L.c = Lactobacillus casei.

МКБ = Молочно-кислые бактерии.

КОЕ на мл = колониеобразующие единицы на миллилитр.

Таблица 1

Партия А (8059)

Таблица 2

Партия Б (8060)

Пример 5. Оценка устойчивости метаболически активной культуры и высушенных замораживанием бактерий.

В этой серии экспериментов отдельный штамм lactobacillus plantarum использовали для инокуляции ростовых сред. Последующий рост приблизительно при 37 °С измеряли путем контроля поглощения при 600 нм (и также проверяли путем растирания разведений на агаровых средах).

"Жидкая" относится к жидкой культуре бактерии (продуцируемой способом, описанным в данном патенте). "Сухой" относится к лиофилизированному препарату бактерии, суспендированному в бульоне MRS (De Man, Rogosa and Sharpe Broth) непосредственно перед инкубацией в конкретные среды. Идентичные количества "жидких" и "сухих" бактерий использовали в каждой паре инкубации.

(1) Рост в обогащенной и "дружественной" среде.

Бактерии инокулировали в бульон MRS и контролировали их рост ( ×1=инокулюм конечной концентрации 1 ×10 ⁷ КОЕ/мл; ×2=2 ×10 ⁷ КОЕ/мл). Результаты представлены на фиг. 1а. Эта первая кривая роста указывает на то, что в невраждебной среде жидкая культура растет быстрее по сравнению с лиофилизированным препаратом. Предположительно для бактерий в лиофилизированном препарате, находящихся в состоянии покоя, требуется время для регидратации и запуска их метаболизма.

(2) Влияние кислотного шока.

1% (об./об.) жидкой культуры или суспензии лиофилизированных бактерий добавляли к бульону MRS, который доводили до различных значений pH с использованием HCl. Бактерии инкубировали в кислых бульонах в течение 1 ч и затем образцы подсчитывали на чашках с MRS-агаром.

КОЕ = колониеобразующие единицы на миллилитр.

Этот результат указывает на то, что "жидкие" бактерии лучше способны выживать в кислой среде по сравнению с "сухими" бактериями. Поскольку в желудке могут достигаться уровни pH вплоть до 2, это с очевидностью имеет отношение к выживанию и приспособленности бактерий в течение последующего передвижения в желудочно-кишечном тракте.

(3) Комбинирование эффектов pH и солей желчных кислот.

Принимая во внимание уровень требований следующей стадии, рост "жидких" и "сухих" бактериальных препаратов сравнивали в следующих условиях.

(а) Только бульон MRS (фиг. 16).

(б) Бульон MRS, дополненный 0,5% (мас./об.) солей желчных кислот (Oxoid L55) (фиг. 1в).

(в) Инкубация в MRS при pH 3,0 в течение 1 ч с последующим ростом в бульоне MRS с солями желчных кислот (фиг. 1г).

Объединенные результаты этих экспериментов указывают на следующие моменты.

"Жидкие" бактерии растут быстрее "сухих" бактерий. Кислотный шок оказывает более разрушительное действие на "сухие" бактерии, чем на "жидкие".

Соли желчных кислот ингибируют оба типа, возможно с более выраженным неблагоприятным воздействием на "сухие", чем на "жидкие".

Объединенные последовательные эффекты кислотного шока с последующим воздействием солями желчных кислот значительно уменьшают рост "жидких" бактерий, но убивают "сухие" бактерии (о чем судят по отсутствию колоний на агаровых чашках).

Однако хотя pH и устойчивость к желчным кислотам с очевидностью представляют собой важные факторы, существует множество других воздействий, химических и микробных, с которыми должны столкнуться пробиотические бактерии. Таким образом, жизнеспособность и общее количество бактерий, которые оценивают просто по количеству колониеобразующих единиц на грамм или миллилитр, является только одним показателем способности препарата функционировать в качестве пробиотика. Если бактерии не находятся в активном состоянии при попадании в организм хозяина, существует значительная вероятность того, что они или будут уничтожены, или пройдут слишком далеко в кишечный тракт перед тем, как у них появится возможность образовывать колонии. Таким образом, пробиотики перспективны для применения в хозяине, если они находятся в метаболически активном состоянии при проникновении в организм хозяина. В соответствии с изобретением бактерии находятся в живой и метаболически активной форме, так что они способны переносить враждебную среду желудочно-кишечного (ЖК) тракта. Метаболически активная природа продукта предназначена для увеличения шансов выживания и образования колоний в организме хозяина.

Пример 6. Влияния на кишечную микрофлору цыплят домашней птицы.

Введение и способы.

Пробиотик, содержащий молочно-кислые бактерии Е.faecium, L.plantarum, L.casei и L.acidophilus, готовили в соответствии с описанным здесь способом. Пробиотик тестировали в отношении его способности изменять кишечную микрофлору цыплят домашней птицы в коммерческом птицеводческом (бройлерном) хозяйстве.

Обработка цыплят.

Цыплятам домашней птицы давали антибиотик линкоспектин с 1-го дня (прошедший день) по 3-й день.

На 4-й день птиц не обрабатывали.

На 5-й день половина помещений для бройлеров получала препарат в дозе 1 л на 5000 цыплят. Оставшиеся помещения использовали в качестве контролей.

На 6-й день из каждой группы случайным образом отбирали по шесть птиц, умерщвляли их и анализировали кишечную микрофлору. (Объединяли тканевые образцы от пар птиц в каждой группе, получая по три образца из каждой группы).

Микробиологический анализ.

Области пищеварительной системы, выбранные для анализа, представляли собой верхний отдел кишечного тракта, взятый от начала тонкой кишки до точки присоединения желточного мешка.

Кишечные ткани и их содержимое от пары птиц вымачивали в стерильной пептонной воде, разбавляли и наносили образцы на ряд полуселективных агаров. После инкубации чашек регистрировали характеристики и количество колоний вместе с микроскопическим анализом бактерий. Идентификацию видов молочно-кислых бактерий проверяли (осуществляли) путем оценки характеристик колоний, клеточной морфологии и профилей ферментации углеводов (последнее с использованием тестового набора "api 50 СН" от BioMerieux).

Результаты.

Результаты представлены на фиг. 3.

L1-L3 = птицы, обработанные пробиотиками (пары 1-3).

С1-С3 = контрольные птицы (пары 1-3).

ТК = Тонкая кишка.

КОЕ = Колониеобразующие единицы.

Как ожидалось, в желудочно-кишечном тракте контрольных и обработанных пробиотиками птиц присутствовало множество различных микробов. В целом, у обеих групп птиц присутствовали схожие количества и типы бактерий, но со значительными различиями в распределении и количестве конкретных видов.

Молочно-кислые бактерии.

Существовало весьма отчетливое различие в содержании молочно-кислых бактерий (МКБ) между птицами, обработанными препаратом, и контрольными птицами. Хотя обе группы имели сравнимые общие количества МКБ, во флоре контрольных птиц доминировал отдельный вид, тогда как у птиц, обработанных пробиотиком, присутствовала более обширная смесь представленных видов.

Пример 7. Действие пробиотического препарата на птенцов страуса.

Проводили исследование для оценки воздействия препарата по изобретению на птенцов страуса. Исследование проводили в течение 4 недель с птенцами, страдающими от диареи с 4-го дня. Одну группу птенцов обрабатывали препаратом по изобретению, вторую - антибиотиком широкого спектра, а третью - витаминно-аминокислотной добавкой. Результаты исследования демонстрируют, что в группе, обработанной препаратом по изобретению, смертность уменьшалась на 67% по сравнению с группой, обработанной антибиотиком, и что введение препарата может уменьшать симптомы запора, диареи, кишечных стазов, девиантного поведения и пролапсов. Кроме того, в группе, обработанной пробиотическим препаратом, наблюдали увеличение массы на 27% по сравнению с контрольными группами.

Во втором исследовании, в котором 100 мл препарата по изобретению вводили племенной птице, наблюдали, что введение приводит в результате к увеличенной фертильности по сравнению с контрольной группой.

Соответственно, эти результаты демонстрируют, что введение пробиотического препарата по изобретению влияет на скорость роста, заболеваемость и смертность.

Пример 8. Благоприятные действия пробиотического препарата на млекопитающих.

В небольшом независимом исследовании оценивали действие препарата по изобретению на кошек и собак, страдающих от хронического энтерита, и обнаружили, что он полезен для восстановления нормальной флоры кишечника.

В исследовании на людях добровольцы обнаружили благоприятные эффекты препарата в острых случаях диареи и при коррекции хронической нерегулярной работы кишечника.

Эта картина благоприятных действий свидетельствует о том, что продукт, основанный на приведенном здесь способе, может оказывать значительные благоприятные воздействиями на людей, заключающиеся в контроле острой и хронической желудочно-кишечной дисфункции (включающей синдром разраженного кишечника и воспалительное заболевание кишечника, пищевое отравление, инфекционную диарею и запор). Также проводится полное клиническое исследование для поддержки ранее полученных результатов.

Ссылки

F. Fonseca, С. Beal, and G. Corrieu. J. Dairy Res. 67 (1):83-90, 2000.

M.L.F. Murga, A.P.D. Holgado, and G.F. de Valdez. Cryobiology 36 (4): 315-319, 1998.

J. Hamilton-Miller. Lancet 355 (9201): 413-414, 2000.

Kunze, W. Technology Brewing and Malting (1996).

Потенциальные благоприятные воздействия на здоровье

Collins, J.K., О' Sullivan, G. and Shanahan, F. (1996; Gut flora and health - past, present and future, Royal Society of Medicine Press Limited, London.

D. Haller, С. Bode, and W.P. Hammes. Microbiol. Immunol. 43 (10):925-935, 1999.

С. Hessle, L.A. Hanson, and A.E. Wold. Clin.Exp. Immunol. 116 (2):276-282, 1999.

E. Isolauri, Y. S ütas, P. Kankaanpaa, H. Arvilommi, and S. Salminen. Am. J. Clin. Nutr. 73 (2): 444S-450S, 2001.

M. Miettinen, S. Matikainen, J. Vuopio-Varkila, J. Pirhonen, K. Varkila, M. Kurimoto, and I. Julkunen. Infect. Immun. 66 (12):6058-6062, 1998.

A.E. Wold and I. Adlerberth. Adv. Exp. Med. Biol. 478:77-93, 2000.

Химия крови

J.W. Anderson and S.E. Gilliland. J. Am. Coll. Nutr. 18 (1):4 3-50, 1999.

H. Bukowska, J. Pieczul-Mr óz, M. Jastrzebska, K. Chelstowski, and M. Naruszewicz. Atherosclerosis 137 (2):437-438, 1998.

I. De Smet, P. De Boever, and W. Verstraete. Br. J. Nutr. 79 (2):185-194, 1998.

T. Endo, M. Nakano, S. Shimizu, M. Fukushima, and S. Miyoshi. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (9):1569-1575, 1999.

H. Kikuchi-Hayakawa, N. Onodera, S. Matsubara, E. Yasuda, Y. Shimakawa, and F. Ishikawa. Br. J. Nutr. 79 (1):97-105, 1998.

H. Kikuchi-Hayakawa, H. Shibahara-Sone, K. Osada, N. Onodera-Masuoka, F. Ishikawa, and M. Watanuki. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (3):466-475, 2000.

F.A.M. Klaver and R. van der Meer. The Assumed Appl. Environ. Microbiol. 59(4): 1120-1124, 1993.

B.K. Mital and S.K. Garg. Crit. Rev. Microbiol. 21 (3):175-214, 1995.

G.R.J. Taylor and С.M. Williams. Br. J. Nutr. 80 (4):S225-S230, 1998.

Лечение и профилактика рака

Y. Aso, H. Akaza, Т. Kotake, Т. Tsukamoto, К. Imai, and S. Naito. Eur. Urol. 27:104-109, 1995.

R. Balansky, B. Gyosheva, G. Ganchev, Z. Mircheva, S. Minkova, and G. Georgiev. Cancer Lett. 147 (1-2): 125-137, 1999.

L.J. Brady, D.D. Gallaher, and F.F. Busta. J. Nutr. 130 (2):410S-414S, 2000.

D.D. Gallaher and J. Khil. J. Nutr. 129 (7): 1483S-1487S, 1999.

B.R. Goldin. Br. J. Nutr. 80 (4):S203-S207, 1998.

S.L. Gorbach. Am. J. Gastroenterol. 95 (1):S2-S4, 2000.

K. Hirayama and J. Rafter. Antonie Van Leeuwenhoek - International Journal of Microbiology 76 (1):391-394, 1999.

K. Hirayama and J. Rafter. Microbe. Infect. 2 (6):681-686, 2000.

W.H. Ling. Nutr. Res. 15 (3):439-454, 1995.

G.H. McIntosh, P.J. Royle, and M.J. Playne. Nutr. Cancer 35 (2):153-159, 1999.

J.J. Rafter. Scand. J. Gastroenterol. 30:497-502, 1995.

B.S. Reddy. Br. J. Nutr. 80 (4):S219-S223, 1998.

Rowland, I.R. (1996) 'Gut microflora and cancer' in Leeds, A.R. and Rowland, I.R. (eds.) Gut flora and health - past, present and future, Royal Society of Medicine Press Limited, London.

M.D. Winters, T.L. Schlinke, W.A. Joyce, S.R. Glore, and M.M. Huycke. Am. J. Gastroenterol. 93 (12):2491-2500, 1998.

Диарея и запор

Т. Arvola, K. Laiho, S. Torkkeli, H. Mykkanen, S. Salminen, L. Maunula, and E. Isolauri. Pediatrics 104 (5):L1-L4, 1999.

R. Bennet, S.L. Gorbach, B.R. Goldin, T.W. Chang, B.E. Laughon, W.B. Greenough, and J.G. Bartlett. Nutrition Today 31 (6):35S-38S, 1996.

A. Bomba, R. Nemcova, S. Gancarcikova, R. Herich, and R. Kastel. Adv. Exp. Med. Biol. 473:185-190, 1999.

N.M. De Roos and M.B. Katan. Am. J. Clin. Nutr. 71 (2):405- 411, 2000.

H.L. DuPont. J. Pediatr. 134 (I): 1-2, 1999.

S.L. Gorbach. Am. J. Gastroenterol. 95 (1):S2-S4, 2000.

M. Heyman. J. Am. Coll. Nutr. 19 (2): 137S-146S, 2000.

E. Isolauri, M. Kaila, H. Mykkanan, W.H. Ling, and S. Salminen. Dig. Dis. Sci. 39(12):2595-2600, 1994.

R.A. Oberhelman, E.H. Gilman, P. Sheen, D.N. Taylor, R.E. Black, L. Cabrera, A.G. Lescano, R. Meza, and G. Madico. J. Pediatr. 134 (1): 15-20, 1999.

R.D. Rolfe. J. Nutr. 130 (2):396S-402S, 2000.

J. Saavedra. Am. J. Gastroenterol. 95 (1):S16-S18, 2000.

С. Scarpignato and P. Rampal. Chemotherapy 41 (suppl. 1):48-81, 1995.

А.V. Shornikova, I.A. Casas, H. Mykkanen, E. Salo, and T. Vesikari. Pediatr. Infect. Dis. J. 16 (12): 1103-1107, 1997.

J.A. Vanderhoof, D.B. Whitney, D.L. Antonson, T.L. Hanner, J.V. Lupo, and R.J. Young. J. Pediatr. 135 (5):564- 568, 1999.

Синдром раздраженного кишечника

P. Brigidi, В. Vitali, E. Swennen, G. Bazzocchi, and D. Matteuzzi. Res. Microbiol. 152 (8):735-741, 2001.

K. Niedzielin, H. Kordecki, and B. Birkenfeld. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 13(10): 1143-1147, 2001.

S. Nobaek, M.L. Johansson, G. Molin, S. Ahrne, and B. Jeppsson. Am. J. Gastroenterol. 95 (5): 1231-1238, 2000.

Общий обзор

Marteau, P. and Rambaud, J.-C., (1996) Therapeutic applications of probiotics in humans' in Leeds, A. R. and Rowland, I. R. (eds.) Gut flora and health - past, present and future, Royal Society of Medicine Press Limited, London.

Stark, B.A. and Wilkinson, (eds.) (1989) Probiotics. Theory and Applications, Chalcombe Publications, Bucks, UK.21