EA 012965B1 20100226 Номер и дата охранного документа EA200501890 20040527 Регистрационный номер и дата заявки US60/473,798 20030528 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2004/016680 20040527 Номер международной заявки (PCT) WO2004/112831 20041229 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа EAb21001 Номер бюллетеня [RU] КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАССОРТАНТНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА ГРИППА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ВИРУСА И РЕАССОРТАНТНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ГРИППА Название документа [8] C12N 7/02, [8] C12N 7/04, [8] C12N 15/86 Индексы МПК [US] Каваока Йошихиро Сведения об авторах [US] ВИСКОНСИН ЭЛАМНИ РИСЁЧ ФАУНДЭЙШН (US) Сведения о патентообладателях [US] ВИСКОНСИН ЭЛАМНИ РИСЁЧ ФАУНДЭЙШН (US) Сведения о заявителях SCHICKLI J.H. ET AL.: "Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates", PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY OF LONDON. SERIES B, BIOLOGICAL SCIENCES. 29 DEC 2001, vol. 356, no. 1416, 29 December 2001 (2001-12-29), pages 1965-1973, XP002314283, ISSN: 0962-8436, page 1965 - page 1968; figures 1, 2; table 1, page 1972 & NEUMANN G. ET AL.: "Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 96, August 1999 (1999-08), pages 9345-9350, XP002150093, ISSN: 0027-8424 HOFFMANN E. ET AL.: "Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines", VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 20, no. 25-26, 19 August 2002 (2002-08-19), pages 3165-3170, XP004374556, ISSN: 0264-410X, page 3166 - page 3169; figure 1; tables 1-3 & HOFFMANN E. ET AL.: "A DNA TRANSFECTION SYSTEM FOR GENERATION OF INFLUENZA A VIRUS FROM EIGHT PLASMIDS", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 97, no. 11, 23 May 2000 (2000-05-23), pages 6108-6113, XP000982038, ISSN: 0027-8424 SUBBARAO KANTA ET AL.: "Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics", VIROLOGY. 5 JAN 2003, vol. 305, no. 1, 5 January 2003 (2003-01-05), pages 192-200, XP002314284, ISSN: 0042-6822, page 193 - page 195; figure 1; tables 1, 2, page 198 & FODOR E. ET AL.: "Rescue of influenza A virus from recombinant DNA", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 73, no. 11, November 1999 (1999-11), pages 9679-9682, XP002151487, ISSN: 0022-538X NEUMANN G. ET AL.: "Plasmid-driven formation of Influenza virus-like particles", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 74, no. 1, January 2000 (2000-01), pages 547-551, XP002140119, ISSN: 0022-538X, page 547 - page 548; figures 1, 2, page 550 HOFFMANN E. ET AL.: "Rescue of influenza B virus from eight plasmids", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 99, no. 17, 20 August 2002 (2002-08-20), pages 11411-11416, XP002973258, ISSN: 0027-8424, page 11412 - page 11415; figure 1 WO 0060050 A NEUMANN GABRIELE ET AL.: "Generation of influenza A virus from cloned cDNAs-historical perspective and outlook for the new millenium", REVIEWS IN MEDICAL VIROLOGY. 2002 JAN-FEB, vol. 12, no. 1, January 2002 (2002-01), pages 13-30, XP002314285, ISSN: 1052-9276, page 20 - page 24; figures 3, 4 NEUMANN G. ET AL.: "Plasmid-driven formation of influenza virus-like particles", JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 74, no. 1, January 2000 (2000-01), pages 547-551, XP002140119, ISSN: 0022-538X, page 547 - page 548; figures 1, 2, page 550 HOFFMANN E. ET AL.: "Rescue of influenza B virus from eight plasmids", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, vol. 99, no. 17, 20 August 2002 (2002-08-20), pages 11411-11416, XP002973258, ISSN: 0027-8424, page 11412 - page 11415; figure 1 WO 0060050 A NEUMANN GABRIELE ET AL.: "Generation of influenza A virus from cloned cDNAs-historical perspective and outlook for the new millenium", REVIEWS IN MEDICAL VIROLOGY. 2002 JAN-FEB, vol. 12, no. 1, January 2002 (2002-01), pages 13-30, XP002314285, ISSN: 1052-9276, page 20 - page 24; figures 3, 4 Цитируемые документы
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000012965b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Изобретение относится к композициям, полезным для получения вирусов гриппа в высоких титрах, например в отсутствие хелперных вирусов, содержащих последовательности генов из изолятов вирусов гриппа высоких титров.


Формула

[0001] Композиция для получения "6+2" реассортантного рекомбинантного вируса гриппа с высоким титром, содержащая множество векторов вирусов гриппа, включающая в себя:

[0002] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что векторы по подпункту б) дополнительно включают вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок НА вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок NA вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок M1 вируса гриппа, вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок М2 вируса гриппа, или вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок NS2 вируса гриппа.

[0003] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой НА типа А.

[0004] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой НА типа В.

[0005] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что промотор РНК-полимеразы I представляет собой человеческий промотор РНК-полимеразы I.

[0006] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что все векторы по подпункту б) содержат промотор РНК-полимеразы II.

[0007] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый вектор по подпункту а) является отдельной плазмидой.

[0008] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый вектор по подпункту б) является отдельной плазмидой.

[0009] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый из векторов, приведенных в подпункте б), дополнительно содержит последовательность терминации РНК-транскрипции.

[0010] Композиция по п.1, дополнительно содержащая вектор, включающий промотор, связанный с 5'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 5'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с представляющей интерес последовательностью кДНК, соединенной с 3'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 3'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с последовательностью терминации транскрипции.

[0011] Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК находится в смысловой ориентации.

[0012] Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК находится в антисмысловой ориентации.

[0013] Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК включает открытую рамку считывания иммуногенного полипептида, или пептида патогенного организма, или терапевтически активного полипептида, или пептида.

[0014] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой подтип Н5.

[0015] Композиция по п.14, отличающаяся тем, что Н5 НА представляет собой мутантный Н5 с авирулентным сайтом расщепления.

[0016] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS имеют нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO:1-6 или комплементарным им последовательностям.

[0017] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS кодируют полипептид с одной или более консервативных замен по сравнению с соответствующим полипептидом, кодируемым одной из последовательностей SEQ ID NO:1-6.

[0018] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS содержат область, кодирующую полипептид, кодируемый одной из последовательностей SEQ ID NO:1-6.

[0019] Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS соответствуют последовательностям SEQ ID NO:1-6.

[0020] Способ получения инфекционного вируса гриппа, включающий обеспечение контактирования клетки с композицией по п.1 в количестве, эффективном для получения инфекционного вируса гриппа.

[0021] Способ по п.20, дополнительно включающий выделение вируса.

[0022] Способ получения переносчика (носителя) для доставки генов, включающий обеспечение контактирования клеток с композицией по п.10 в количестве, эффективном для получения вируса гриппа, который является указанным переносчиком, и выделение вируса.

[0023] Способ получения "6+2" реассортантного рекомбинантного вируса гриппа, включающий обеспечение контактирования клетки с вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NP вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NA вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NS вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РА вируса гриппа; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РВ1 вируса гриппа; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РВ2 вируса гриппа, и вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NP вируса гриппа, так чтобы получать инфекционный вирус, причем кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS содержат последовательности, кодирующие полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из SEQ ID NO:1-6, а кДНК для НА и NA не содержат последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 7 или 8, и векторы для продуцирования вРНК содержат промотор РНК-полимеразы I и последовательность терминации РНК-полимеразы I.

[0024] Способ по п.23, дополнительно включающий обеспечение контактирования клеток с вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим НА вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NA вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим M1 вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим М2 вируса гриппа, и вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NS2 вируса гриппа.

[0025] Способ по п.23 или 24, дополнительно включающий обеспечение контактирования клеток с вектором, содержащим промотор, функционально связанный с 5'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 5'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с представляющей интерес последовательностью кДНК или ее фрагментом, соединенной (или соединенным) с 3'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 3'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с последовательностью терминации транскрипции.

[0026] Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК включает открытую рамку считывания иммуногенного полипептида, или пептида патогенного организма, или терапевтически активного полипептида, или пептида.

[0027] Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК находится в смысловой ориентации.

[0028] Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК находится в антисмысловой ориентации.

[0029] Способ по п.23, дополнительно включающий выделение вируса.

[0030] Способ по п.23, отличающийся тем, что НА представляет собой подтип Н5.

[0031] Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS имеют нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO:1-6 или комплементарным им последовательностям.

[0032] Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS кодируют полипептид с одной или более консервативных замен по сравнению с соответствующим полипептидом, кодируемым одной из последовательностей SEQ ID NO:1-6.

[0033] Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS имеют кодирующую область для полипептида, кодируемого одной из последовательностей SEQ ID NO:1-6.

[0034] Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS комплементарны последовательностям SEQ ID NO:1-6.

[0035] Выделенный "6+2" реассортантный рекомбинантный вирус гриппа, полученный способом по п.31, содержащий вирусную геномную РНК для Н5 НА, который выращивают в куриных эмбрионах до титра по меньшей мере 1010 ED50/мл.

[0036] Реассортантный вирус гриппа по п.35, отличающийся тем, что Н5 НА представляет собой мутантный Н5.


Полный текст патента

Предпосылки создания изобретения

Вирусы с отрицательной смысловой РНК относятся к семи семействам (Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae), которые включают широко распространенные патогены человека, такие как респираторно-синцитиальный вирус, вирус гриппа, вирус кори, вирус Эбола, а также вирусы животных, наносящие значительный ущерб птицеводству и животноводству (например, вирус болезни Ньюкастла и вирус чумы рогатого скота). Первые четыре семейства характеризуются несегментированным геномом, в то время как в последние три семейства входят вирусы, геном которых состоит из шести-восьми, трех или двух отрицательных смысловых РНК соответственно. Общим свойством вирусов с отрицательной смысловой РНК является отрицательная полярность генома, т.е. вирусная РНК (вРНК) комплементарна матричной РНК (мРНК) и таким образом сама по себе неинфекционна. Для инициации вирусной транскрипции и репликации вРНК должна транскрибироваться в положительную смысловую мРНК или кРНК соответственно комплексом вирусной полимеразы и нуклеопротеина; в случае вирусов гриппа типа А комплекс вирусной полимеразы состоит из трех полимеразных белков, а именно РВ2, РВ1 и РА. Во время вирусной репликации кРНК служит матрицей для синтеза новых молекул вРНК. Для всех вирусов с отрицательной смысловой РНК некодирующие участки на обоих 3- и 5-концах вРНК и кРНК являются определяющими для транскрипции и репликации вирусного генома. В отличие от клеточных или вирусных мРНК-транскриптов как кРНК, так и вРНК не кэпированы на 5-конце и не полиаденилированы на 3-конце.

Основные функции многих вирусных белков были установлены в биохимических экспериментах и при исследовании течения вирусной инфекции. Однако обратные генетические системы существенным образом увеличили наши знания о вирусах с отрицательной смысловой РНК, формирующей как фрагментированный, так и нефрагментированный геном, применительно к механизмам их патогенности и репликации, а также обусловили значительный прогресс в разработке живых аттенуированных вирусных вакцин. Обратные генетические системы, как этот термин используется в молекулярной вирусологии, означает формирование вирусов на основе генома, происходящего из клонированных кДНК (см., например, обзор Neumann et al., 2002).

Для инициации репликации вирусов с отрицательной смысловой РНК вРНК или кРНК должны быть экспрессированы вместе с полимеразным комплексом и нуклеопротеином. Вирус бешенства был первым вирусом с отрицательной смысловой РНК, формирующей нефрагментированный геном, который был целиком получен на основе клонированной кДНК. Schell et al. (1994) получили рекомбинантный вирус бешенства совместной трансфекцией клеток конструктом кДНК, кодирующим полноразмерную кРНК, и конструктами, экспрессирующими вирусные белки L, Р и N, находящимися под контролем промотора РНК-полимеразы Т7. Инфицирование клеток рекомбинантным вирусом вакцины, обеспечивающим РНК-полимеразу Т7, приводило к сборке инфекционных частиц вируса бешенства. В указанной системе полимеразы Т7 первичная транскрипция полноразмерной кРНК под контролем РНК-полимеразы Т7 обеспечивала образование некэпированного кРНК-транскрипта. Однако три гуанидиновых нуклеотида, которые формируют оптимальную инициаторную последовательность РНК-полимеразы Т7, были прикреплены к 5-концу. С целью формирования аутентичного 3-конца кРНК-транскрипта, который необходим для продуктивного инфекционного цикла, была использована рибозимная последовательность вируса гепатита дельта (HDVRz), чтобы обеспечить точное аутокаталитическое расщепление на 3-конце кРНК-транскрипта.

Со времени первоначального сообщения Schnell et al. (1994) технологии, сходные с обратными генетическими системами, обусловили получение многочисленных вирусов с отрицательной смысловой РНК, формирующей нефрагментированный геном (Conzelmann, 1996; Conzelmann, 1998; Conzelmann et al., 1996; Marriott et al., 1999; Munoz et al., 2000; Nagai, 1999; Neumann et al., 2002; Roberts et al., 1998; Rose, 1996). Модификации исходной процедуры "спасения" включают экспрессию РНК-полимеразы Т7 из стабильно трансфицированных клеточных линий (Radecke et al., 1996) или из экспрессирующих белки плазмид (Lawson et al., 1995), а также процедуры теплового шока для увеличения эффективности "спасения" (Parks et al., 1999). Основываясь на системе полимеразы Т7, Bridgen и Elliott (1996) получили вирус Буньямвера (семейство Bunyaviridae) из клонированных кДНК и продемонстрировали возможность искусственного создания с помощью данной системы вирусов с отрицательной смысловой РНК, формирующей фрагментированный геном.

В 1999 г. была разработана технология плазмидных обратных генетических систем, основанная на использовании клеточной РНК-полимеразы I с целью получения вируса гриппа А с фрагментированным геномом непосредственно из клонированных кДНК (Fodor et al., 1999; Neumann и Kawaoka, 1999). РНК-полимераза I, ядерный фермент, синтезирует рибосомальную РНК, которая подобно РНК вируса гриппа не содержит кэпа на 5-конце или полиА-структуры на 3-конце. Транскрипция с помощью РНК-полимеразы I приводит к образованию конструкта, содержащего кРНК вируса гриппа, фланкированного промотором РНК-полимеразы I и последовательностями терминации, что обеспечивает синтез вРНК вируса гриппа (Fodor et al., 1999; Neumann и Kawaoka, 2001; Pekosz et al., 1999). Система является высокоэффективной, обеспечивает формирование более 10 8 инфекционных вирусных частиц в расчете на 1 мл супернатанта трансфицированных плазмидой клеток через 48 ч после трансфекции.

Необходимой остается разработка способа получения ортомиксовирусов высокого титра, таких как вирус гриппа А, исключительно при использовании кДНК.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к выделенной и/или очищенной молекуле нуклеиновой кислоты (полинуклеотиду), кодирующей по крайней мере один из белков вируса гриппа в высоком титре, например большем чем 10 9 /мл, например большем чем 10 10 /мл, или участок такого белка, а также к последовательности, комплементарной указанной. В одном случае выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белки НА, NA, РВ1, РВ2, PA, NP, М или NS или их участки, имеющие по существу ту же самую активность, что и соответствующие полипептиды, кодируемые SEQ ID NO: 1-8.

Используемый здесь термин "по существу та же самая активность" означает активность, которая составляет 0,1, 1, 10, 30, 50, 90%, например, до 100% или более от активности соответствующего полноразмерного полипептида или означает определяемый уровень белка, который составляет около 80, 90% или более определяемого уровня соответствующего полноразмерного полипептида. В другом варианте осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который, по существу, идентичен, например, по крайней мере на 80%, например на 90, 92, 95, 97 или 99% аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из SEQ ID NO: 1-8. В еще одном варианте осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая, по существу, идентична, например, по крайней мере на 50%, например на 60, 70, 80 или 90% или более одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-8 или комплементарна ей и, в одном случае, также кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по крайней мере на 80%, например на 90, 92, 95, 97 или 99% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из SEQ ID NO: 1-8. В другом варианте осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид с одной или более, например, 2, 5, 10, 15, 20 или более консервативными аминокислотными заменами, например консервативными заменами от 10 до 20% остатков по отношению к полипептиду, кодируемому одной из SEQ ID NO: 1-8.

"Консервативные аминокислотные замены" относятся к взаимозаменяемым остатками, имеющим сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, состоит из глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; группа аминокислот, имеющих алифатическо-гидроксильные боковые цепи, состоит из серина и треонина; группа аминокислот, имеющих боковые цепи, содержащие амид, состоит из аспарагина и глутамина; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, состоит из фенилаланина, тирозина и триптофана; группа аминокислот, имеющих щелочные боковые цепи, состоит из лизина, аргинина и гистидина, и группа аминокислот, имеющих боковые цепи, содержащие серу, состоит из цистеина и метионина. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются следующие: валин-лейцин-изолейцин; фенилаланин-тирозин; лизин-аргинин; аланин-валин; глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота и аспарагин-глутамин.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты или комплементарная ей последовательность гибридизуется с одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-8 или комплементарной ей последовательностью в строгих, умеренно строгих или мягких условиях. Например, могут быть использованы следующие условия гибридизации: 7% додецилсульфата натрия (SDS), 0.5 М NaPO 4 , 1 мМ EDTA при 50 °С с отмыванием 2XSSC, 0.1% SDS при 50 °С (мягкие условия); 7% додецилсульфата натрия (SDS), 0.5 NaPO 4 , 1 мМ EDTA при 50 °С с отмыванием 1XSSC, 0.1% SDS при 50 °С (умеренно строгие условия, которые являются более желательными); 7% додецилсульфата натрия (SDS), 0.5 NaPO 4 , 1 мМ EDTA при 50 °С с отмыванием 0.5XSSC, 0.1% SDS при 50 °С (жесткие условия, которые являются наиболее желательными). Предпочтительными являются следующие условия: 7% додецилсульфата натрия (SDS), 0.5 М NaPO 4 , 1 мМ EDTA при 50 °С с отмыванием 0.1XSSC, 0.1% SDS при 50 °С (более строгие условия); 7% додецилсульфата натрия (SDS), 0.5 М NaPO 4 , 1 мМ EDTA при 50 °С с отмыванием 0.1XSSC, 0.1% SDS при 65 °С (очень строгие условия). В одном случае заявленная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 50%, например на 60, 70, 80 или 90% или более соответствует аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого последовательностью нуклеотидов, идентичной одной из SEQ ID NO: 1-8, и который обладает по существу той же самой активностью, что и полноразмерный полипептид, кодируемый одной из SEQ ID NO: 1-8.

Заявленная молекула нуклеиновой кислоты может быть использована для экспрессии белков вируса гриппа, получения химерных генов, например, с другими вирусными генами, включая другие гены вируса гриппа, и/или для получения рекомбинантного вируса. Изобретение также относится к выделенным полипептидам, рекомбинантному вирусу и клеткам-хозяевам, которые контактируют с молекулами нуклеиновой кислоты или заявленным в соответствии с изобретением рекомбинантным вирусом.

Изобретение также относится по крайней мере к одному из следующих выделенных и/или очищенных векторов: вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка NP вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка NA вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектору, содержащему промотор, функционально связанный с кДНК белка NS вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем по крайней мере один вектор включает последовательности, кодирующие белки НА, NA, PB1, РВ2, PA, NP, M, NS или их участки, имеющие по существу ту же самую активность, что и соответствующий полипептид, кодируемый одной из SEQ ID NO: 1-8, например последовательность, кодирующую полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 80% идентична последовательности полипептида, кодируемого одной из SEQ ID NO: 1-8. Факультативно, два вектора могут быть использованы вместо вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, например вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка M1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка М2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции.

Изобретение также относится к выделенным и очищенным векторам или плазмидам, которые экспрессируют или кодируют белки вируса гриппа, или экспрессируют или кодируют вРНК, как нативную, так и рекомбинантную вРНК. Предпочтительно векторы содержат кДНК вируса гриппа, например, вируса гриппа А (например, любой ген вируса гриппа А, в том числе подтипов 15 НА или 9 NA), вируса гриппа В или С [см. главы 45 и 46 Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996), включенные в настоящее описание в качестве ссылок], хотя в составе заявленных векторов и способов могут быть использованы гены любых организмов. Может быть использована кДНК, находящаяся как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации по отношению к промотору. Например, вектор, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, может кодировать белок вируса гриппа (смысловая ориентация) или вРНК (антисмысловая ориентация). Любой подходящий промотор или последовательность терминации транскрипции может использоваться для экспрессии белка или пептида, например, вирусного белка или пептида, белка или пептида невирусного патогенна или терапевтически значимого белка или пептида.

Изобретение также относится к композициям, содержащим многочисленные векторы на основе вируса гриппа, заявленные в соответствии с настоящим изобретением. В одном случае композиции включают: а) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NP вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NA вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NS вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем по крайней мере один вектор содержит промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; и б) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, кодирующего белок РА вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ1 вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ2 вируса гриппа, и вектора, кодирующего белок NP вируса гриппа. Необязательно, векторы, указанные в б), включают один или более векторов, кодирующих белки NP, NS, М, например, M1 и М2, НА или NA. Предпочтительно векторы, кодирующие вирусные белки, также содержат последовательность терминации транскрипции.

Еще в одном случае композиции включают: а) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NP вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белков NA и NB вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка NS вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектора, содержащего промотор, функционально связанный с кДНК белка ВМ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, причем по крайней мере один вектор содержит промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; и б) по крайней мере два вектора, выбранные из вектора, кодирующего белок РА вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ1 вируса гриппа, вектора, кодирующего белок РВ2 вируса гриппа, вектора, кодирующего белок NP вируса гриппа. Необязательно, векторы, указанные в б), включают один или более векторов, кодирующих белки NP, NS, М, НА или NA. Предпочтительно векторы, кодирующие вирусные белки, также содержат последовательность терминации транскрипции.

Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также могут содержать представляющие интерес ген или открытую рамку считывания, например чужеродный ген, кодирующий иммуногенный пептид или белок, используемые в качестве вакцины. Соответственно, изобретение также относится к композициям, описанным выше, в которых один из векторов замещен или же композиции дополнительно содержат вектор, включающий промотор, связанный с 5-концом последовательностей вируса гриппа, необязательно содержащих 5-кодирующие вирусные последовательности или их фрагменты, связанные с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, например, с кДНК, соединенной с 3-концом последовательностей вируса гриппа, необязательно содержащих 3-кодирующие вирусные последовательности или их фрагменты, связанные с последовательностью терминации транскрипции. Предпочтительно представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, такая как кДНК, находится в антисмысловой ориентации. Введение такой композиции в клетку-хозяин, пермиссивную для репликации вируса гриппа, приводит к сборке рекомбинантного вируса, содержащего вРНК, соответствующую последовательностям вектора. Промотор в таком векторе, необходимый для образования вРНК, может быть промотором РНК-полимеразы I, промотором РНК-полимеразы II, промотором РНК-полимеразы III, промотором Т7 и промотором Т3, и, необязательно, вектор содержит последовательность терминации транскрипции, такую как последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы I, последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы II, последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы III или рибозим. В одном случае вектор, содержащий представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, содержит представляющую интерес кДНК. Такая кДНК как в составе вектора для получения вРНК, так и в составе вектора для получения белка, может кодировать иммуногенный эпитоп, такой как эпитоп, полезный для терапии рака или для использования в качестве вакцины, или пептид, а также полипептид, полезный для целей генной терапии. При получении вируса вектор или плазмида, содержащие представляющие интерес ген или кДНК, могут быть замещены вектором или плазмидой, содержащими ген вируса гриппа, или могут быть добавлены к векторам или плазмидам, содержащим все гены вируса гриппа.

Многочисленные векторы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть физически соединены друг с другом или же каждый вектор может присутствовать в качестве индивидуальной плазмиды или в другой форме, например в виде линейного вектора доставки нуклеиновой кислоты.

Промотор или последовательность терминации транскрипции в векторах экспрессии вРНК или белка могут быть теми же самыми или отличными от промотора и последовательности терминации транскрипции любого другого вектора. Предпочтительно, вектор или плазмида, которые экспрессируют вРНК вируса гриппа, включают промотор, подходящий для экспрессии по крайней мере в одной подходящей клетке-хозяине, например, клетке-хозяине птиц или млекопитающих, таких, как клетка собаки, кошки, лошади, коровы, овцы или клетка приматов, в том числе человека, или, предпочтительно, в более чем одной клетке-хозяине.

В одном случае один или более векторов для получения вРНК включают промотор (без ограничений указанными) РНК-полимеразы I, например промотор РНК-полимеразы I человека; промотор РНК-полимеразы II, промотор РНК-полимеразы III, промотор Т7 и промотор Т3. Предпочтительные последовательности терминации транскрипции для векторов экспрессии вРНК включают (без ограничений указанными) последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы I, последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы II, последовательность терминации транскрипции РНК-полимеразы III или рибозим. В объеме настоящего изобретения рибозимы (без ограничений указанными) включают рибозимы tetrahynema, РНКазу Р, рибозимы в форме головки молотка, рибозимы в форме булавочной головки рибозимы вируса гепатита, а также синтетические рибозимы.

Еще в одном случае по крайней мере один вектор для получения вРНК включает промотор РНК-полимеразы II, соединенной с последовательностью рибозима, связанной с вирусной кодирующей последовательностью, соединенной с другой последовательностью рибозима, необязательно с последовательностью терминации транскрипции РНК-полимеразы II. Кроме того, по крайней мере два и более предпочтительно, например, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 векторов для получения вРНК включают промотор РНК-полимеразы II, первую последовательность рибозима, которая связана с 5-концом последовательности, соответствующей вирусным последовательностям, в том числе вирусным кодирующим последовательностям, которые связаны с 5-концом второй последовательности рибозима, которая связана с 5-концом последовательности терминации транскрипции. Каждый промотор РНК-полимеразы II в каждом векторе для получения вРНК может быть тем же самым промотором РНК-полимеразы II или отличным от такового любого другого вектора для получения вРНК. Сходным образом, любая последовательность рибозима в каждом векторе для получения вРНК может быть той же самой последовательностью или отличной от таковой любого другого вектора для получения вРНК. Согласно одному варианту осуществления изобретения последовательности рибозимов в одном векторе не являются одинаковыми.

Изобретение также относится к способу получения вируса гриппа. Способ включает обеспечение контактирования клетки с многочисленными векторами, заявленными в соответствии с настоящим изобретением, например, одновременно или последовательно, в частности, с заявленной композицией, в количестве, эффективном для получения инфекционного вируса гриппа. Изобретение также относится к выделению вируса из клетки, которая контактировала с указанной выше композицией. Таким образом, изобретение также относится к выделенному вирусу, а также к клетке-хозяину, которая контактировала с заявленными композицией или вирусом. Кроме того, изобретение относится к способу контактирования клетки с одним или более векторами, предназначенными как для получения вРНК, так и белка, до контактирования с другими векторами, предназначенными как для получения вРНК, так и белка.

Заявленный в соответствии с изобретением способ обеспечивает простое манипулирование вирусами гриппа, например, путем введения аттенуированных мутаций в вирусный геном. Более того, поскольку вирусы гриппа индуцируют сильный гуморальный и клеточный иммунитет, изобретение позволяет использовать указанные вирусы в качестве высокоэффективных вакцинных векторов, в особенности с точки зрения доступности природных вариантов вируса, которые могут быть использованы последовательно в целях генной терапии.

Описанные здесь способы получения вирусов, которые не требуют инфицирования хелперными вирусами, полезны в исследованиях вирусного мутагенеза, для получения вакцин (например, против СПИДа, гриппа, гепатита В, гепатита С, риновирусной инфекции, филовирусной инфекции, малярии, герпеса и ящура) и конструирования векторов для целей генной терапии (например, для терапии рака, опухолей центральной нервной системы, СПИДа, мышечной дистрофии, недостаточности аденозиндезаминазы и орнитинтранскарбамилазы). Таким образом, изобретение обеспечивает получение вирусов, которые могут использоваться в медицинской практике (например, для получения вакцин или в генной терапии).

Изобретение также относится к способу иммунизации индивидуума против патогенного организма, например бактерии, вируса или паразита, а также злокачественной опухоли. Способ включает введение индивидууму такого количества по крайней мере одного выделенного вируса, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, необязательно в комбинации с адъювантом, которое эффективно для иммунизации индивидуума. Вирус содержит вРНК, в том числе кодирующую полипептид патогенного организма или специфичный для опухоли полипептид.

Изобретение также относится к способу усиления или увеличения экспрессии эндогенного белка в организме млекопитающих, у которых имеются указания на заболевание или само заболевание, характеризующееся пониженным количеством или утратой синтеза эндогенного белка. Способ включает введение млекопитающему такого количества выделенного вируса, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в таком количестве, которое эффективно для усиления или увеличения количества эндогенного белка в организме млекопитающего. Предпочтительно млекопитающим является человек.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Схематическая диаграмма установленной обратной генетической системы. Согласно методу трансфекции RNP (А) очищенный NP и полимеразу собирают в комплексы RNPs при использовании in vitro синтезированной вРНК. Клетки трансфицируют RNPs и далее инфицируют хелперным вирусом. Согласно методу РНК-полимеразы I (В) плазмиду, содержащую промотор РНК-полимеразы I, кДНК, кодирующую вРНК, подлежащую "спасению", и терминатор РНК-полимеразы I путем трансфекции вводят в клетки. Внутриклеточная транскрипция с помощью РНК-полимеразы I приводит к синтезу синтетической вРНК, которая упаковывается в потомство вирусных частиц при инфицировании клеток хелперным вирусом. При обоих методах вирусы-трансфектанты (т.е. вирусы, содержащие РНК, происходящую из клонированной кДНК) отбирают из популяции хелперных вирусов.

Фиг. 2. Схематическая диаграмма получения конструктов РНК-полимеразы I. КДНК, происходящую из вируса гриппа, амплифицировали методом PCR, расщепляли BsmBI и клонировали в сайты BsmBI вектора рНН21 (Е. Hoffmann, Ph. D. тезисы, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany), который содержит промотор РНК-полимеразы I человека (Р) и терминатор РНК-полимеразы I мыши (Т). Тимидиновый нуклеотид "выше" терминирующей последовательности (*Т) соответствует 3-концу вРНК вируса гриппа. Последовательности вируса гриппа А показаны в блоках, закрашенных черным цветом (SEQ ID NO: 29-40).

Фиг. 3. Предлагаемый обратно-генетический способ для получения сегментированных вирусов с отрицательной смысловой РНК. Плазмиды, содержащие промотор РНК-полимеразы I и кДНК для каждого из восьми сегментов вирусной РНК, а также терминатор РНК-полимеразы I вводят путем трансфекции в клетки вместе с плазмидами, экспрессирующими белок. Несмотря на то что инфекционные вирусы могут быть получены при использовании плазмид, экспрессирующих PA, PB1, РВ2 и NP, экспрессия всех остальных структурных белков (показаны в овалах) увеличивает эффективность продукции вируса в зависимости от того, какой вирус получают.

Фиг. 4. Титры различных вирусов гриппа.

Детальное описание изобретения

Определения.

Используемые здесь понятия "выделенный и/или очищенный" относятся к заявленным в соответствии с изобретением полученным, выделенным и/или очищенным in vitro вектору, плазмиде или вирусу, которые не ассоциированы с какими-либо примесями in vivo или по существу свободны от каких-либо примесей in vitro. Выделенный препарат вируса обычно получают культивированием вируса in vitro и его размножением; такой препарат по существу свободен от других инфекционных агентов.

Используемый здесь термин "по существу свободный" означает, что определенный инфекционный агент находится в количествах ниже уровня детекции при использовании стандартных методов определения данного агента.

Понятие "рекомбинантный вирус" означает, что данный вирус был сконструирован in vitro, например, при использовании технологии рекомбинантных ДНК для введения изменений в вирусный геном.

Понятие "рекомбинантная нуклеиновая кислота" или "рекомбинантная ДНК-последовательность или фрагмент (сегмент)" относится к нуклеиновой кислоте, например, ДНК, которая происходит или выделена из источника, который может последовательно химически "изменять" указанную ДНК in vitro таким образом, что эта последовательность будет отличаться от природной или не будет соответствовать ни одной из известных природных последовательностей, которые локализуются или будут локализованы в нативном геноме. Примером ДНК, происходящей из такого рода источника, может быть ДНК-последовательность, представляющая собой полезный ДНК-фрагмент, который химически синтезирован в очищенной по существу форме. Примером ДНК, "выделенной" из такого рода источника, может быть полезная ДНК-последовательность, которая вырезана или удалена из указанного источника химическим путем, например, при использовании рестрикционных эндонуклеаз, таким образом, что она может быть в дальнейшем использована, скажем, амплифицирована в целях осуществления изобретения, с помощью методов генной инженерии.

Репликация вируса гриппа.

Вирус гриппа типа А имеет геном, состоящий из восьми одноцепочечных отрицательных смысловых вирусных РНК (вРНК), которые кодируют все десять вирусных белков. Жизненный цикл вируса гриппа начинается со связывания гемагглютинина (НА) с рецепторами, содержащими сиаловую кислоту, находящимися на поверхности клетки-хозяина, с последующим опосредованным рецепторами эндоцитозом. Низкое значение рН в эндосомах запускает конформационное изменение НА, что приводит к экспонированию N-концевых участков субъединицы НА2 (так называемого белка слияния). Белок слияния инициирует слияние вируса и эндосомной мембраны и в цитоплазму клетки высвобождаются матриксный белок (М) и комплексы RNP. Последние состоят из нуклеопротеина (NP), который образует капсид для вРНК, и комплекса вирусной полимеразы, который сформирован белками PA, PB1 и РВ2. RNPs транспортируются в ядро, где происходят транскрипция и репликация вируса. Комплекс РНК-полимеразы катализирует три различные реакции: синтез мРНК с 5-кэпом и 3-полиА-структурой, синтез полноразмерной комплементарной РНК (кРНК) и синтез геномной вРНК при использовании кДНК в качестве матрицы. Вновь синтезированные вРНК, NP и белки полимеразы затем собираются в RNPs, экспортируются из ядра и транспортируются к плазматической мембране, где происходит выпочковывание вирусных частиц потомства. Белок нейраминидаза (NA) играет определяющую роль на поздней стадии инфекционного процесса, удаляя сиаловую кислоту из сиалилолигосахаридов, что приводит к высвобождению заново собранных вирионов через клеточную мембрану и предотвращает самоагрегацию вирусных частиц. Несмотря на то что сборка вируса включает взаимодействия типа "белок-белок" и "белок-вРНК", природа таких взаимодействий остается в значительной степени неизвестной.

Хотя вирусы гриппа типов В и С структурно и функционально схожи с вирусом гриппа типа А, между ними имеются определенные различия. Например, вирус гриппа типа В не имеет белка М2, обладающего активностью ионных каналов. Вирус гриппа типа С также не имеет белка М2, обладающего активностью ионных каналов. Однако белок СМ1, скорее всего, имеет такую активность. Активность белка ионных каналов может быть определена методами, хорошо известными из уровня техники, например, описанными Holsinger et al. (1994) или в заявке WO 01/79273.

Клеточные линии и вирусы гриппа, которые могут быть использованы в соответствии с заявленным изобретением.

В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы любые клетки, эффективно поддерживающие репликацию вирусов гриппа, в том числе мутантные клетки, которые экспрессируют пониженные уровни одной или более сиаловых кислот, которые являются рецепторами вируса гриппа. Полученные таким образом вирусы могут быть реассортантными вирусами.

Предпочтительно клетки являются клетками, которые сертифицированы ВОЗ или проходят сертификацию и формируют перевиваемые клеточные линии. Требования к таким линиям при прохождении сертификации включают их характеристику посредством указания, по крайней мере, на родословную, ростовые свойства, иммунологический маркер, туморогенность, условия хранения, а также подразумевают тестирование на животных, куриных эмбрионах и клеточных культурах. Такая характеристика делается для того, чтобы подтвердить, что линии свободны от определяемых побочных агентов. В некоторых странах могут требоваться кариологические исследования. Кроме того, туморогенность предпочтительно тестируется в клетках, которые находятся на том же уровне пассирования, что и клетки, используемые для получения вакцин. Вирус предпочтительно очищают способом, который продемонстрировал постоянные результаты, до того, как он будет инактивирован или аттенуирован для получения вакцины (см., например, ВОЗ, 1982).

Также предпочтительно полностью охарактеризовать клеточные линии, подлежащие использованию, с точки зрения чистоты получаемого конечного продукта. Данные, которые могут быть использованы для характеристики клеток, используемых в соответствии с настоящим изобретением, включают (а) информацию об их источнике, происхождении и числе пассажей; (б) информацию об их ростовых свойствах и морфологических признаках; (в) результаты тестирования на наличие аденовирусных агентов; (г) описание отличительных свойств, например, биохимических, иммунологических, цитогенетических, которые позволяют четко идентифицировать клетки среди других клеточных линий, и (д) результаты тестирования туморогенности. Предпочтительно число пассажей и время удвоения популяции клеточной линии, используемой в качестве хозяина, должно быть как можно более низким.

Также предпочтительно, чтобы вирус, продуцируемый в клетках, был очень хорошо очищен до того, как он будет использован в целях приготовления вакцины или генной терапии. В целом, способы очистки должны приводить к эффективному удалению клеточной ДНК, других клеточных компонентов и аденовирусных агентов из препарата вируса. Способы эффективного расщепления или денатурации ДНК также могут быть использованы. См., например, Mizrahi, 1990.

Вакцины.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением вакцины могут содержать иммуногенные белки, в том числе гликопротеины любого патогенного организма, например, иммуногенный белок одной или более бактерий, вирусов, дрожжей или грибов. Таким образом, в одном случае заявленные вирусы гриппа могут быть вакцинными векторами вирусов гриппа или других вирусов, включая (без ограничений указанными) лентивирусы, такие как СПИД; вирусы гепатита В и С; вирусы герпеса, такие как CMV и HSV и вирус ящура.

Полную вирусную вакцину концентрируют путем ультрафильтрации и затем очищают зональным центрифугированием или хроматографией. Вакцину инактивируют до очистки или после очистки с помощью, например, формалина или бета-пропиолактона.

Субъединичные вакцины содержат очищенные гликопротеины. Такие вакцины могут быть получены, например, при использовании вирусных суспензий, фрагментированных обработкой детергентом, очищенных поверхностных антигенов или ультрацентрифугированием. Субъединичные вакцины могут содержать главный НА белок, а также NA. Используемый детергент может быть катионным детергентом, например дексадецил триметил бромидом аммония (Bachmeyer, 1975), анионным детергентом, таким как дезоксихолат аммония (Laver & Webster, 1976); или неионным детергентом, таким как имеющий коммерческое название TRITON X100. Гемагглютинин также может быть выделен после обработки вирионов протеазой, такой как бромелин, и далее очищен любым способом, например, описанным Grand и Skehel (1972).

Расщепленные вакцины содержат вирионы, которые были подвергнуты обработке агентами, которые растворяют липиды. Такие вакцины могут быть получены, например, при использовании водной суспензии очищенного вируса, полученного, как описано выше, инактивированного или нет, обработанной при перемешивании растворителями липидов, такими как этиловый эфир или хлороформ, ассоциированными с детергентами. Растворение липидов вирусной оболочки приводит к фрагментации вирусных частиц. Замещенная водная фаза содержит расщепленную вакцину, включающую фрагментированные вирусные частицы с удаленными природными липидными оболочками гемагглютинина и нейраминидазы, а также удаленными коровыми структурами и продуктами их деградации. Полученные в результате указанных процедур инфекционные частицы инактивируют, если это не было сделано ранее.

Инактивированные вакцины.

Заявленные инактивированные вакцины вируса гриппа получают инактивированием реплицирующегося вируса, который является объектом настоящего изобретения, при использовании известных способов, таких как (без ограничений указанными) обработка формалином или бета-пропиолактоном. Инактивированные вакцины, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, могут включать вакцины, содержащие целые вирусы (WV), или вакцины, содержащие субвирионы (SV) (расщепленные вакцины). WV вакцины содержат интактный, инактивированный вирус, в то время как SV вакцины содержат очищенный вирус, разрушенный обработкой детергентами, которые растворяют содержащую липиды вирусную оболочку, и далее подвергнутый химической инактивации.

Кроме того, вакцины, которые могут быть использованы, включают такие вакцины, которые содержат выделенные поверхностные белки НА и NA. В целом, ответы на SV вакцины и вакцины, содержащие поверхностные антигены (т.е. на НА или NA), являются схожими. Экспериментальным образом инактивированная WV вакцина, содержащая антиген NA, иммунологически родственный таковому эпидемического вируса, и неродственный НА, по-видимому, менее эффективна (Ogra et al., 1977). Инактивированные вакцины, содержащие оба релевантных поверхностных антигена, предпочтительны.

Живые аттенуированные вирусные вакцины

Живые аттенуированные вакцины вируса гриппа также могут быть использованы для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой указанным вирусом, в соответствии с известными подходами. Аттенуация предпочтительно обеспечивается при использовании одностадийной процедуры, подразумевающей перенос аттенуированных генов из аттенуированного донорного вируса в реплицированный вирусный изолят или реассортантный вирус с помощью известных методов (см., например, Murphy, 1993). Поскольку устойчивость к вирусу гриппа типа А опосредуется развитием иммунного ответа на гликопротеины НА и NA, гены, кодирующие указанные поверхностные антигены, должны быть получены из реассортантных вирусов или клинических изолятов, обладающих высокой скоростью роста. Аттенуированные гены получают из аттенуированных родительских вирусов. Согласно данному подходу, гены, которые обеспечивают аттенуацию, предпочтительно, не кодируют гликопротеины НА и NA. С другой стороны, эти гены не могут быть перенесены в реассортанты, экспонирующие поверхностные антигены клинических вирусных изолятов.

Многие донорные вирусы были протестированы на их способность служить аттенуированными вирусами гриппа. В качестве примера, не ограничивающего соответствующий подход, для получения аттенуированной вирусной вакцины может быть использован адаптированный к холоду донорный вирус A/AnnArbor(AA)/6/60(H2N2) (см., например, Edwards, 1994; Murphy, 1993). Кроме того, живые аттенуированные реассортантные вирусные вакцины могут быть получены путем комбинирования адаптированного к холоду донорного вируса с вирулентным реплицированным вирусом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Реассортантное потомство затем отбирают при 25 °С (рестриктивная температура для репликации вирулентного вируса) в присутствии антисыворотки к H2N2, которая ингибирует репликацию вируса, экспрессирующего поверхностные антигены аттенуированного адаптированного к холоду донорного вируса A/AA//6/60(H2N2).

Значительные серии реассортантов H1N1 и H3N2 были протестированы на людях и удовлетворяли следующим свойствам: (а) инфекционности; (б) были аттенуированы по отношению к серонегативным детям и иммунологически примированным людям; (в) иммуногенности и (г) генетической стабильности. Иммуногенность адаптированных к холоду реассортантов коррелировала с уровнем их репликации. Таким образом, приобретение шести трансферабельных генов адаптированного к холоду вируса новыми вирусами дикого типа воспроизводимым образом аттенуировало эти вирусы и позволило использовать их в вакцинах, предназначенных как для взрослых, так и для детей.

Другие аттенуирующие мутации могут быть введены в гены вируса гриппа с помощью сайт-направленного мутагенеза для "спасения" инфекционных вирусов, имеющих эти мутантные гены. Аттенуирующие мутации могут быть введены в некодирующие участки генома, а также и в кодирующие участки. Такие мутации также могут быть ведены в гены, отличные от тех, что кодируют НА или NA, например в ген РВ2 полимеразы (Subbarao et al., 1993). Таким образом, могут быть получены новые донорные вирусы, содержащие аттенуированные мутации, введенные сайт-направленным мутагенезом, которые могут быть использованы для редукции живых аттенуированных реассортантов H1N1 и H3N2, являющихся кандидатными вакцинными вирусами, с помощью метода, аналогичного описанному выше для адаптированного к холоду донорного вируса А/АА//6/60. Сходным образом, другие известные и подходящие аттенуированные донорные штаммы могут быть реассортированы с заявленным в соответствии с настоящим изобретением вирусом гриппа с целью получения аттенуированных вакцин, пригодных для вакцинации млекопитающих (Enami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbaro et al., 1993).

Предпочтительно, чтобы такие аттенуированные вирусы сохраняли гены, полученные от вирусов, кодирующих антигенные детерминанты, практически сходные с таковыми первоначальных клинических изолятов. Это обусловлено тем, что аттенуированная вакцина предназначена для генерации по существу той же самой антигенности, которой обладает первоначальный клинический изолят вируса, и в то же время она должна утратить инфекционность до такой степени, чтобы минимальным образом индуцировать серьезные условия для развития заболевания в организме иммунизируемого млекопитающего.

Соответственно, вирус должен быть аттенуирован или инактивирован, введен в состав вакцины и применен согласно известным методам, чтобы вакцина индуцировала иммунный ответ в организме животного, например млекопитающего. Из уровня техники хорошо известны способы определения того, обладает ли аттенуированная или инактивированная вакцина той же антигенностью, что и клинический изолят или обладающий высокой ростовой активностью происходящий из него штамм. Указанные известные способы включают использование антисыворотки или антител к выделенным вирусам, экспрессирующим антигенные детерминанты донорного вируса; химическую селекцию (например, с помощью амантадина или римантидина); выявление активности или ингибирование активности НА или NA и скрининг ДНК (напримрр, гибридизация с пробой или PCR) для подтверждения того, что донорные гены, кодирующие антигенные детерминанты (например, гены НА и NA), не обнаруживаются в аттенуированных вирусах. См., например, Robertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992).

Фармацевтические композиции.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции, подходящие для инокуляции или парентерального или перорального введения, содержат аттенуированные или инактивированные вирусы гриппа и необязательно стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Композиции также могут содержать дополнительные агенты или наполнители, известные из уровня техники. См., например, Berkow et al., 1987; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992. Заявленные композиции, в основном, находятся в форме индивидуальных доз (единичных доз).

Соответствующие вакцины, в целом, содержат от около 0.1 до около 200 мкг, предпочтительно от 10 до 15 мкг гемагглютинина каждого из штаммов, входящих в состав композиции. Вакцина, которая представляет собой основную составляющую заявленной в соответствии с изобретением вакцинной композиции, может содержать вирусы типов А, В или С или их комбинацию, например, по крайней мере из двух или трех типов, по крайней мере из двух различных субтипов, по крайней мере из двух одинаковых типов, по крайней мере из двух одинаковых субтипов или из различных изолятов или реассортантов. Вирус гриппа человека типа А включает субтипы H1N1, H2N2 и H3N3.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и/или эмульсии, которые могут содержать дополнительные агенты или наполнители, известные из уровня техники. Примерами неводных растворов могут служить пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, например, оливковое и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Носители или окклюзивные повязки могут использоваться для увеличения проницаемости кожи и усиления адсорбции антигена. Жидкие дозированные формы для перорального применения могут включать раствор липосом, содержащий жидкую дозированную форму. Подходящие формы для суспендирования липосом включают эмульсии, суспензии, растворы, сиропы и эликсиры, содержащие инертные добавки, широко используемые в практике, например очищенную воду. Помимо инертных добавок такие композиции могут также включать адъюванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, а также подсластители, добавки, улучшающие вкус и запах и маскирующие вкус и запах. См., например, Berkow et al., 1992; Avery s, 1987; Osol, 1980 и Katzung, 1992.

Для введения заявленной композиции индивидууму она может быть составлена таким образом, что содержит соли, буферы, адъюванты или другие вещества, которые желательно использовать для повышения ее эффективности. В случае вакцин могут быть использованы адъюванты, вещества, которые усиливают специфический иммунный ответ. Обычно адъювант и композицию смешивают до презентации иммунной системе, но иногда вводят отдельно, но в один и тот же участок тела иммунизируемого млекопитающего. Примеры соединений, подходящих для использования в вакцинах, описаны Osol (1980).

Гетерогенность вакцин может быть обеспечена смешиванием по крайней мере двух штаммов реплицированных вирусов гриппа, например 2-50 штаммов. Штаммы вируса гриппа А или В, имеющие более новую антигенную композицию, предпочтительны. В соответствии с настоящим изобретением вакцины могут содержать штамм вируса гриппа, имеющий определенные антигенные вариации, полученные с помощью известных методов.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением фармацевтические композиции могут содержать или дополнительно включать по крайней мере одно химиотерапевтическое соединение, например, необходимое для генной терапии, иммуносупрессор, противовоспалительный агент или усилитель иммунитета. В случае вакцин химиотерапевтическое соединение включает (без ограничений указанными) гамма-глобулин, амантадин, гуанидин, гидроксибензимидазол, интерферон альфа, интерферон бета, интерферон гамма, фактор некроза опухолей альфа, тиосемикарбазоны, метисазоны, рифампин, рибавирин, аналог пиримидина, аналог пурина, фоскарнет, фосфоноуксусную кислоту, ацикловир, дидезоксинуклеозиды, ингибитор протеазы или ганцикловир. См., например, Katzung (1992) и ссылки, приведенные в этой работе на с. 798-800 и 680-681 соответственно.

Композиции также могут содержать различные, но небольшие количества формальдегида, свободного от эндотоксина, и консервантов, которые безопасны и не обладают нежелательными побочными эффектами при введении в организм при иммунизации млекопитающего соответствующей композицией.

Фармацевтические цели.

Введение композиции (или антисыворотки) может быть как профилактическим, так и терапевтическим. При профилактическом использовании заявленные композиции, которые в данном случае представляют собой вакцины, вводят в организм до того, как будут обнаружены какие-либо симптомы инфекции. Профилактическое введение композиции служит для предотвращения или ослабления возможной последующей инфекции. Сказанное справедливо и в том случае, когда заявленные в соответствии с изобретением композиции используются для целей генной терапии. Такое использование также предотвращает или ослабляет один или более симптомов, ассоциированных с заболеванием.

При терапевтическом использовании аттенуированные или инактивированные вирусные вакцины вводят в организм при обнаружении какие-либо симптомов инфекции. Терапевтическое введение композиции служит для ослабления имеющейся инфекции.

См., например, Berkow et al., 1992; Avery, 1987 и Katzung, 1992. Сказанное справедливо и в том случае, когда заявленные в соответствии с изобретением композиции используются для целей генной терапии. Такое использование также ослабляет один или более симптомов, ассоциированных с заболеванием, или течение заболевания.

Таким образом, заявленные в соответствии с изобретением аттенуированные или инактивированные вакцинные композиции могут применяться как до возникновения инфекции (для предотвращения или ослабления возможной инфекции), так и после ее обнаружения. Сходным образом, когда заявленные в соответствии с изобретением композиции используются для целей генной терапии, они вводятся в организм до того, как обнаруживаются какие-либо симптомы заболевания или нарушения, а также после этого.

Композиция считается "фармацевтически приемлемой", если ее введение не вызывает у реципиента никаких побочных реакций. Агент вводится в "терапевтически эффективном количестве", если это количество достаточно с физиологической точки зрения. Заявленная композиция считается "физиологически достаточной", если ее введение приводит к определяемому изменению физиологического состояния реципиента, например, усиливает по крайней мере один первичный или вторичный гуморальный или клеточный иммунный ответ по крайней мере на один штамм инфекционного вируса гриппа.

"Защита" не является абсолютной, т.е. инфекция вируса гриппа не может быть полностью предотвращена или устранена, даже если выявляется статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией или выборкой пациентов. Защита может заключаться в смягчении тяжести заболевания или снижении быстроты проявления симптомов инфицирования вирусом гриппа.

Фармацевтическое введение.

Заявленные в соответствии с изобретением композиции могут обеспечивать устойчивость к одному или более патогенам, например одному или более штаммам вируса гриппа как за счет пассивной, так и за счет активной иммунизации. При активной иммунизации инактивированные или аттенуированные живые вакцинные композиции вводят профилактически в организм хозяина (например, млекопитающего), и иммунная система хозяина отвечает на это введение защитой организма от соответствующей инфекции и/или заболевания. При пассивной иммунизации реципиенту, имеющему инфекцию вируса гриппа, вызванную по крайней мере одним штаммом, или находящемуся в группе риска, вводится готовая антисыворотка. Заявленные композиции при использовании в процедурах целей генной терапии могут вводиться как с терапевтическим целями, так и с профилактическими целями, что обеспечивается экспрессией нужного генного продукта при активной иммунизации.

В одном случае вакцина может использоваться применительно к особи женского пола млекопитающего (как во время беременности или родов, так и после них) в такие временные сроки и в таком количестве, чтобы обеспечить генерацию иммунного ответа, способного защитить как мать, так плод или новорожденного (путем пассивного проникновения антител через плаценту или их передачи с материнским молоком).

Настоящее изобретение также относится к способам предотвращения или аттенуирования нарушения или заболевания, например инфекции по крайней мере одного штамма патогенного организма. Как понимается в настоящем описании, вакцина предотвращает или ослабляет заболевание, если ее введение приводит к полному или частичному ослаблению (т.е. супрессии) симптомов или течения заболевания или же к развитию полного или частичного иммунитета к данному заболеванию. Как здесь понимается, композиция, используемая в целях генной терапии, предотвращает или ослабляет заболевание, если ее ведение приводит к полному или частичному ослаблению (т.е. супрессии) симптомов или течения заболевания или же к развитию полного или частичного иммунитета к данному заболеванию.

Инактивированный или аттенуированный вирус гриппа или полученная на его основе композиция, может быть введена любым способом, обеспечивающим достижение заданных целей, если она приготовлена в виде фармацевтической композиции, как описано ранее.

Например, введение такой композиции может осуществляться различным парентеральным путем, таким как подкожный, внутривенный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интраназальный, пероральный или чрескожный. Парентеральное введение может быть осуществлено в виде болюсной инъекции или путем последовательной перфузии. Предпочтительным способом введения заявленной фармацевтической композиции является внутримышечный или подкожный способ. См., например, Berkow et al., 1992; Avery, 1987 и Katzung, 1992.

Обычная схема предотвращения, супрессии или лечения инфекции, связанной с вирусом гриппа, включает однократное введение эффективного количества вакцинной композиции, как описано выше, или повторяющиеся введения бустерных доз в течение периода времени, составляющего от одной недели до 24 месяцев, а также любые другие режимы.

В соответствии с заявленным изобретением "эффективное количество" композиции представляет собой такое количество, которое достаточно для достижения желательного биологического эффекта. Следует понимать, что эффективная доза зависит от возраста пациента, пола, состояния здоровья, веса, терапии сопутствующего заболевания (если таковая имеет место быть), схемы лечения и природы того эффекта, который необходимо обеспечить. Количественные значения эффективных доз приведены ниже и не предназначены для ограничения объема изобретения; они отражают предпочтительные для использования дозы. Однако наиболее предпочтительные дозы должны подбираться индивидуально, как это всегда и происходит, специалистом в данной области знаний. См., например, Berkow et al., 1992; Avery's, 1987 и Katzung, 1992.

Доза аттенуированной вирусной вакцины для млекопитающих (например, человека) или птиц (имеется в виду взрослый организм) может составлять около 10 3 -10 7 бляшкообразующих единиц (PFU) на 1 кг веса или же может быть выражена в любых других единицах. Доза инактивированной вакцины может составлять около 0.1-200, например 50 мкг гемагглютининового белка. Однако доза должна быть безопасной и эффективной, что определяется соответствующими методами при использовании существующих вакцин в качестве стандарта.

Доза иммунореактивного НА в каждой дозе реплицированной вирусной вакцины может быть стандартизована для того, чтобы содержать подходящее количество, например, 1-50 мкг НА или же такое количество НА, которое рекомендовано Службой общественного здравоохранения США, а именно 15 мкг НА в расчете на компонент вакцины для детей старше трех лет и 7,5 мкг НА в расчете на компонент вакцины для детей менее трех лет. Количество NA также может быть стандартизовано, однако указанный гликопротеин может оказаться лабильным в процессе очистки и хранения (Kendal et al., 1980). Каждая 0.5-1 мл доза вакцины предпочтительно содержит примерно 1-50 млн вирусных частиц, более предпочтительно 10 млн вирусных частиц. Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.

Пример 1.

Материалы и методы.

Клетки и вирусы. Клетки 293 почки эмбриона человека и клетки почки собаки Madin-Darby (MDCK) поддерживают в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и в модифицированной среде Игла (MEM), содержащей 5% сыворотки новорожденного теленка, соответственно. Клетки культивируют при 37 °С в атмосфере 5% СО 2 . Вирусы гриппа A/WSN/33(H1N1) и A/PR/8/34(HlNl) размножают в 10-дневных куриных эмбрионах.

Конструирование плазмид. Для получения конструктов РНК-полимеразы I клонированную кДНК, полученную из вирусной РНК A/WSN/33 и A/PR/8/34 встраивают между промоторной и терминирующей последовательностями РНК-полимеразы I. Коротко говоря, клонированную кДНК амплифицируют с помощью PCR при использовании праймеров, содержащих сайты BsmBI, расщепляют BsmBI и клонируют в сайтах BsmBI вектора рНН21, который содержит промотор РНК-полимеразы I человека и терминатор РНК-полимеразы I мыши, разделенные сайтами BsmBI (фиг. 2). Гены РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, М и NS штамма A/WSN/33 амплифицируют с помощью PCR-реакции при использовании следующих плазмид: pSCWPB2, pGW-PB1 и pSCWPA (все плазмиды получают от д-ра Debi Nayak из Калифорнийского университета, Лос-Анжелес), pWH17, pWNP152, pT3WNA15 (Castracci et al., 1992), pGT3WM и pWNS1, соответственно. Ген РВ1 вируса A/PR/8/34 амплифицируют при использовании рсДНК774 (Perez et al., 1998) в качестве матрицы. На фиг. 6 приведены последовательности праймеров. Для подтверждения того, что гены свободны от нежелательных мутаций, полученные с помощью PCR фрагменты секвенируют на автоматическом секвенаторе (Applied Biosystem Inc., CA, USA) в соответствии с рекомендациями производителя. КДНК, кодирующую гены НА, NP, NA и Ml штамма A/WSN/33 клонируют, как описано в литературе (Huddleston et al., 1982) и субклонируют в эукариотическом векторе экспрессии pCAGGS/MCS (под контролем промотора бета-актина цыпленка) (Niwa et al., 1991) с получением pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15 и pCAGGS-WSN-M1-2/1, соответственно.

Гены М2 и NS2 из штамма A/WSN/33 амплифицируют с помощью PCR и клонируют в векторе pCAGGS/MCS с получением рЕР24с и pCA-NS2. На конечном этапе используют рсДНК774(РВ1), рсДНК762(РВ2) и рсДНК787(РА) для экспрессии белков РВ2, РВ1 и РА под контролем промотора цитомегаловируса (Perez et al., 1998).

Получение инфекционных частиц вируса гриппа. Клетки 293 (1 ×10 6 ) трансфицируют максимально 17 плазмидами в различных количествах при использовании транс IT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) согласно рекомендациям производителя. Коротко говоря, ДНК и реагент для трансфекции смешивают (2 мкл транс IT LT-1 на 1 мкг ДНК), инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин и добавляют к клеткам. Через шесть часов смесь ДНК и агента для трансфекции заменяют на среду Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland), содержащую 0.3% бычьего сывороточного альбумина и 0.01% эмбриональной телячьей сыворотки. В различное время после трансфекции вирусы собирают и титруют на клетках MDCK. Поскольку для осуществления указанной процедуры не требуются хелперные вирусы, полученные вирусы-трансфектанты анализируют без очистки методом бляшек.

Определение процентного содержания трансфицированных плазмидами клеток, продуцирующих вирусы. Через 24 ч после трансфекции клетки 293 диспергируют с помощью 0.02% EDTA до отдельных клеток. Затем клеточную суспензию разводят в 10 раз и переносят на слившийся монослой клеток MDCK в 24-луночные планшеты. Далее вирусы определяют в исследовании гемагглютинации.

Иммунологическое окрашивание. Через 9 ч после инфицирования вирусом гриппа клетки дважды отмывают фосфатно-буферным раствором (PBS) и фиксируют параформальдегидом (в PBS) в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки обрабатывают 0.1%-ным Тритоном Х-100 и исследуют, как описано Neumann et al. (1997).

Результаты.

Получение инфекционных вирусов при экспрессии плазмидами вирусных РНК-фрагментов, трех субъединиц полимеразы и белка NP. Несмотря на то что трансфекция клеток смесью RNPs, экстрагированных из очищенных вирионов, приводит к формированию инфекционных частиц вируса гриппа, описанная стратегия недостаточно эффективна, когда используются восемь различных RNPs, полученных in vitro. Для получения инфекционных вирусов гриппа полностью на основе кДНК восемь вирусных RNPs генерируют in vitro. Таким образом получают плазмиды, содержащие кДНК для полноразмерных вирусных РНК штамма A/WSN/33, фланкированную промотором РНК-полимеразы I человека и терминатором РНК-полимеразы I мыши. В принципе, трансфекция указанными 8 плазмидами эукариотических клеток должна приводить к синтезу всех восьми вРНК вируса гриппа. Белки РВ2, РВ1, РА и NP, полученные совместной трансфекцией плазмид, экспрессирующих белок, затем должны собираться вместе с вРНК в функционально активные vRNPs, которые затем должны реплицироваться и транскрибироваться, формируя инфекционные частицы вируса гриппа (фиг. 3). Клетки 293 в количестве 1 ×10 6 трансфицируют плазмидами, экспрессирующими белок (1 мкг рсДНК762(РВ2), 1 мкг рсДНК774(РВ1), 0.1 мкг рсДНК787(РА) и 1 мкг pCAGGS-WSN-NPO/14) и 1 мкг каждой из следующих плазмид для РНК-полимеразы I (pPo1I-WSN-PB2, pPo1I-WSN-PB1, pPo1I-WSN-PA, pPo1I-WSN-HA, pPo1I-WSN-NP, pPo1I-WSN-NA, pPo1I-WSN-M и pPo1I-WSN-NS). Решение использовать пониженное количество рсДНК787(РА) основано на предварительных наблюдениях (Mena et al., 1996) и данных по оптимальным условиям получения вирусоподобных частиц (VLPs) (данные не приведены). Через 24 ч после трансфекции клеток 293 7 ×10 3 PFU вируса на 1 мл было обнаружено в супернатанте (эксперимент 1, табл. 1). Это подтверждает, в первую очередь, что методы обратной генетики способны обеспечить получение вируса гриппа типа А полностью из плазмид.

Таблица 1Набор плазмид, используемых для получения вируса гриппа из клонированной кДНК*

* Клетки 293 трансфицировали указанными плазмидами. Через 24 ч (эксперименты 1и 2) и 48 ч (эксперименты 3-8) определяли титры вируса в супернатантах на клетках MDCK.

** Если не указано иное, плазмиды конструировали на основе кДНК, соответствующей РНК штамма A/WSN/33.

Эффективность образования вируса гриппа при совместной экспрессии всех вирусных структурных белков.

Несмотря на то что экспрессии вирусных NP и белков полимеразы достаточно для определяемого плазмидой продуцирования вирусов гриппа, возможно улучшение эффективности данного процесса. В предварительных исследованиях было показано, что экспрессия всех структурных белков вируса гриппа (РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, M1, M2 и NS) приводит к образованию VLPs, содержащих искусственную вРНК, кодирующую маркерный ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (Mena et al., 1996). Таким образом, доступность целой кДНК, кодирующей структурные белки, вместо той, которая требуется для репликации и транскрипции вРНК, может повысить эффективность продуцирования вирусов. С этой целью клетки 293 трансфицировали оптимальными количествами плазмид экспрессии вирусного белка (оценка с помощью образования VLP; неопубликованные данные): 1 мкг рсДНК762(РВ2) и рсДНК774(РВ1); 0.1 мкг рсДНК787(РА); 1 мкг pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NPO/14 и pCAGGS-WNA15; 2 мкг pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0.3 мкг pCA-NSA и 0.03 мкг рЕР24с (для М2) вместе с 1 мкг каждой плазмиды для РНК-полимеразы I (эксперимент 2, табл. 2). Вторую партию клеток трансфицировали тем же самым набором плазмид для РНК-полимеразы I, за исключением гена РВ1, для которого pPo1I-PR/8/34-PB1 была замещена для попытки получить реассортантный вирус, вместе с плазмидами, экспрессирующими PA, PB1, РВ2 и NP (эксперимент 3, табл. 1) или плазмидами, экспрессирующими все структурные белки (эксперимент 4, табл. 1). Выход вируса WSN не был существенно другим через 24 ч (эксперименты 1 и 2, табл. 1) и 36 ч (данные не приведены) после трансфекции. Однако более чем 10-кратное увеличение выхода вируса при использовании PR/8/34-PB1 было обнаружено, когда все структурные белки вируса гриппа были экспрессированы (эксперименты 3 и 4, табл. 1). Негативные контроли, в которых не было одной из плазмид экспрессии белков PA, PB1, РВ2 или NP, не продуцировали вирус (эксперименты 5-8, табл. 1). Таким образом, в зависимости от продуцируемого вируса, экспрессия всех структурных белков вируса гриппа типа А повышало эффективность метода обратной генетики.

Далее определяли кинетику продукции вируса после трансфекции клеток при использовании набора плазмид, содержащих ген A/PR/8/34-PB1, применяемых для получения вируса. В двух из трех экспериментах вирус впервые определялся через 24 ч после трансфекции. Титр, измеренный в данный момент времени, составил более 103 PFU/мл и затем он увеличился до более 106 PFU/мл через 48 ч после трансфекции (табл. 2). Для установления процента трансфицированных плазмидой клеток, продуцирующих вирусы, клетки 293Т обрабатывали EDTA (0.02%) через 24 ч после трансфекции для их диспергирования и проводили исследования методом лимитирующих разведений. В этом эксперименте на указанный момент времени не было обнаружено вирусов в культуральном супернатанте. Полученные результаты свидетельствуют, что одна из 103.3 клеток продуцирует инфекционные вирусные частицы.

Таблица 2Кинетика продукции вируса после трансфекции плазмидами клеток 293Т*

*Клетки 293Т были трансфицированы 8 плазмидами для РНК-полимеразы I, кодирующими вирусные гены из штамма A/WSN/33, за исключением гена РВ1, происходящего из A/PR/8/34, и 9 плазмидами, экспрессирующими белки, как раскрыто в описании. В различные временные точки вирус титровали в клетках MDCK (ND - данные отсутствуют).

Выделение вируса гриппа, содержащего эпитоп FLAG в составе белка NA.

Для подтверждения того факта, что новая система обратной генетики обеспечивает встраивание мутаций в геном вируса гриппа типа А, был получен вирус, содержащий эпитоп FLAG в составе белка NA (Castrucci et al., 1992). Клетки 293Т трансфицировали плазмидой для РНК-полимеразы I (pPo1I-WSN-NA/FL79), содержащей кДНК, кодирующую как белок NA, так и эпитоп FLAG, находящийся в основании "головки" белка, а также плазмидами для РНК-полимеразы I и плазмидами, экспрессирующими белок. Для подтверждения того факта, что выделенный вирус (PR8-WSN-FL79) действительно экспрессирует белок NA-FLAG, проводили иммунологическое окрашивание клеток, инфицированных PR8-WSN-FL79 или A/WSN/33 дикого типа.

Моноклональное антитело к эпитопу FLAG выявляло клетки, инфицированные PR8-WSN-FL79, но не инфицированные вирусом дикого типа. Получение вируса PR8-WSN-FL79 было в такой же степени эффективным, что и получение вируса дикого типа, не являющегося в данном случае мишенью (сведения не приведены). Указанные результаты свидетельствуют, что новая система обратной генетики обеспечивает получение введение мутаций в геном вируса гриппа типа А.

Получение инфекционного вируса гриппа, содержащего мутации в гене РА.

Для получения вирусов, содержащих мутации в гене РА, были введены две молчащие мутации, создающие новые сайты распознавания рестрикционными эндонуклеазами (Bsp120I в положении 846 и PvuII в положении 1284 мРНК). Ранее было невозможно модифицировать указанный ген методом обратной генетики, поскольку не было действенной системы отбора. Были получены вирусы-трансфектанты РА-Т846С и РА-А1284. Эти вирусы были клонированы двумя последовательными лимитирующими разведениями. Для подтверждения того факта, что полученные вирусы действительно являются трансфектантами с мутациями в гене РА, методом обратной PCR-транскрипции была получена кДНК гена РА. Вирусы РА-Т846С и РА-А1284 содержали ожидаемые мутации в гене РА, что было показано наличием в их геноме новых введенных сайтов рестрикции. Осуществление PCR тех же самых вирусных образцов с теми же самыми праймерами, но без стадии обратной транскрипции, не приводило к получению каких-либо продуктов (данные не приведены), свидетельствуя о том, что кДНК РА действительно происходит из вРНК, а не из плазмиды, используемой для получения вирусов. Эти результаты показывают, каким образом вирусы с мутантными генами могут быть получены и выделены без использования хелперных вирусов.

Обсуждение результатов.

Описанная здесь система обратной генетики, таким образом, обеспечивает эффективное получение вирусов гриппа типа А полностью из клонированной кДНК. Bridgen и Elliot (1996) также использовали метод обратной генетики для получения вируса Буньявьера (семейство Bunyaviridae), но он содержал только три фрагмента отрицательной смысловой РНК и эффективность его продукции была ниже, а именно 10 2 PFU/10 7 клеток. Несмотря на то что выход вируса варьировал от эксперимента к эксперименту, постоянно определялось более 10 3 PFU/106 клеток вирусов гриппа, содержащих восемь фрагментов генома. Существуют различные объяснения высокой эффективности описанной здесь системы обратной генетики. Вместо получения RNPs in vitro (Luytjes et al., 1989), RNPs были получены in vivo посредством внутриклеточного синтеза вРНК при использовании РНК-полимеразы I и посредством направляемого плазмидой экспрессии белков вирусной полимеразы и NP. Также использование клеток 293Т, которые легко трансфицируются плазмидами (Goto et al., 1997), позволило убедиться в том, что для продукции вируса необходима большая популяция клеток, получающих все плазмиды. Кроме того, большое количество транскриптов, продуцируемых РНК-полимеразой I, которая является одним из наиболее обильно экспрессируемых белков в растущих клетках, также способствовало превышающему все ожидания повышению эффективности используемой системы. Все это привело, в свою очередь, к изобилию транскриптов вРНК и синтезу адекватного количества вирусного белка, необходимого для инкапсулирования вРНК, формированию RNPs в ядре и экспорту указанных комплексов к клеточной мембране, где новые вирусы собирались и высвобождались из клеток.

Ранее созданные системы обратной генетики (Enami et al., 1990; Neumann et al., 1994; Luytjes et al., 1989; Pleschka et al., 1996) требуют инфицирования хелперным вирусом и, соответственно, таких способов селекции, которые позволяют выделить небольшое число трансфектантов из огромного количества хелперных вирусов. Такие стратегии использовались для получения вирусов гриппа, содержащих один из следующих происходящих из кДНК генов: РВ2 (Subbarao et al., 1993), НА (Enami et al., 1991; Horimoto et al., 1994), NP (Li et al., 1995), NA (Enami et al., 1990), M (Castracci et al., 1995; Yasuda et al., 1994) и NS (Enami et al., 1991). Большинство способов селекции, за исключением тех, которые применимы к генам НА и NA, основаны на температуре роста, природе хозяина, чувствительности к лекарственным препаратам и, таким образом, лимитируют использование системы обратной генетики для функционального анализа генных продуктов. Даже в случае генов НА и NA, для которых созданы системы селекции, основанные на антителах, трудно выделить вирус с явными ростовыми дефектами. В противоположность этому, описанная здесь система обратной генетики не требует хелперного вируса и позволяет получать вирусы-трансфектанты с мутациями в любом фрагменте гена или с тяжелыми дефектами роста. Владение технологией введения любой нужной мутации в геном вируса гриппа типа А позволяет исследователям осуществлять многочисленные долговременные исследования, такие, как установление природы регуляторных последовательностей в нетранслируемых участках вирусного генома, структурно-функциональных взаимодействий между вирусными белками и взаимозависимости между молекулярной основой рестрикции по организму-хозяину и патогенкостью вируса.

Несмотря на доступность инактивированных вакцин вируса гриппа, их эффективность является субоптимальной, что частично обусловлено их ограниченной способностью вызывать локальный IgA и цитотоксический Т-клеточный иммунный ответ. Текущие клинические испытания живых вакцин вируса гриппа на основе адаптированных к холоду штаммов позволяют предположить, что такие вакцины оптимальным образом аттенуированы и не вызывают симптомов гриппа, но в достаточной степени индуцируют протективный иммунитет (см. обзор в Keitel & Piedra, 1998). Однако предварительные результаты свидетельствуют, что указанные живые вакцины вируса гриппа не значительно более эффективны, чем наилучшие инактивированные вакцины генам (см. обзор в Keitel & Piedra, 1998), и оставляют пространство для дальнейшего улучшения. Одна из возможностей заключается в модификации вакцины на основе адаптированных к холоду штаммов при использовании описанной выше системы обратной генетики. Альтернативно, можно начать с применения системы обратной генетики для получения эффективного штамма вируса гриппа типа А со множественными аттенуированными мутациями в генах, кодирующих внутренние белки. Наиболее значимое применение описанной здесь системы обратной генетики может привести к быстрой продукции аттенуированных живых вирусных вакцин при ожидаемых пандемиях, обусловленных новыми НА- и NA-субтипами вируса гриппа.

Новая система обратной генетики будет способствовать применению вирусов гриппа в качестве вакцинных векторов. Вирусы могут быть сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать чужеродные белки или иммуногенные эпитопы помимо белков вируса гриппа. Возможно, например, получение вирусов с чужеродными белками, которые кодируются девятым сегментом вРНК (Enami et al., 1991), и применение их в качестве вакцин. Вирусы гриппа не только вызывают сильный клеточно-опосредованный и гуморальный иммунитет, но и "поставляют" широкий спектр поверхностных вирионных белков НА и NA (например, 15 НА и 9 NA субтипов и их эпидемических вариантов), обеспечивая возможность повторной иммунизации той же самой популяции индивидуумов.

VLPs вирусов гриппа, содержащие искусственную вРНК, кодирующую маркерный ген, были получены экспрессией вирусных структурных белков и вРНК с помощью полимеразной системы "вирус осповакцины-Т7" (Mena et al., 1996). Используя систему обратной генетики, в настоящее время можно получить VLPs, содержащие вРНК, кодирующую белки, необходимые для транскрипции и репликации вРНК (т.е. PA, PB1, РВ2 и NP), а также вРНК, кодирующую представляющие интерес белки. Такие VLPs могут быть полезными векторами доставки генов. Важно, что отсутствие в них генов, кодирующих вирусные структурные белки, позволяет утверждать, что инфекционные вирусы не будут образовываться после осуществления VLP-генной терапии. Поскольку геном вируса гриппа не интегрируется в хромосому хозяина, VLP-система подходит для генной терапии в случаях, требующих только кратковременной трансдукции клеток (например, для лечения рака). В противоположность аденовирусным векторам (Kovesdi et al., 1997) VLPs вируса гриппа могут содержать варианты как НА, так и NA, что обеспечивает возможность повторного лечения популяции индивидуумов.

Семейство Orthomyxoviridae включает вирусы гриппа типов А, В и С, а также недавно классифицируемые в составе этого семейства тоготовирусы. Стратегия получения инфекционных вирусов гриппа типа А полностью из клонированной кДНК, описанная здесь, может быть применена к любым ортомиксовирусам и, возможно, к другим вирусам с отрицательной смысловой РНК (например, Bunyaviridae, Arenaviridae). Возможность манипулирования вирусным геномом без технических ограничений имеет большое значение для изучения жизненного цикла вирусов и его регуляции, функционирования вирусных белков и молекулярных механизмов вирусного патогенеза.

Пример 2.

Для применения системы обратной генетики по отношению к вирусу гриппа A/Puerto Rico/8/34 вРНК экстрагировали из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), вариантом Madison с более высокой скоростью роста (PR8HG), при использовании набора РНКазы Qiagen в соответствии с рекомендациями производителя. КДНК синтезировали с помощью RTазы MMLV (Promega) и праймера Uni12. Затем кДНК амплифицировали в течение ночи с помощью PCR-реакции при использовании следующих реагентов.

Наборы праймеров

ДНК-полимераза: нативная ДНК-полимераза pfu (Stratagene).

PCR-продукты разделяют гель-электрофорезом и экстрагируют из агарозного геля с помощью набора фирмы Qiagen. Экстрагированные гены лигируют в слепой вектор pT7Blue (Novagen) при использовании набора для лигирования фирмы Takara ver. II. Через 5 ч лигированные гены переносят путем трансформации в клетки бактерий JM109 (гены РВ2, М и NS) или DH5 альфа (гены PA, PB1 и NP). Шесть колоний для каждого гена культивируют в среде ТВ в течение 8 ч. Плазмиды экстрагируют из бактериальных культур и секвенируют по четыре колонии на ген.

Гены PA, NP, М и NS вырезают из вектора рТ7Blue с помощью фермента BsmBI (New England Biolabs). Ген РВ1 вырезают с помощью Bsa I (New England Biolabs). Вырезанные гены лигируют в течение ночи в вектор pPolIR, содержащий промотор РНК-полимеразы I человека и терминатор РНК-полимеразы I мыши, расщепленный с помощью BsmBI. Передний фрагмент гена РВ2 из вектора рТ7В1ие вырезают с помощью Bsr GI (New England Biolabs) и Bam HI (Roche), а задний фрагмент - с помощью Bsr GI (New England Biolabs) и Spe I (Roche). Вырезанные фрагменты смешивают и расщепляют Bsa I. Через 6 ч расщепленные гены очищают при использовании набора для PCR-очистки фирмы Qiagen и лигируют в течение ночи между сайтами BsmBI вектора pPolIR.

Лигированные гены РВ1-, РА-, NP-, М- и NS-pPolIR используют для трансформации клеток JM109 (гены М и NS) или DH5 альфа (гены PA, PB1 и NP) в течение ночи. Колонии трансформированных бактерий культивируют в среде LB в течение ночи. Лигированные гены PB2-pPolIR используют для трансформации клеток JM109 в течение ночи.

Плазмиды экстрагируют из бактериальных культур и правильность вставки генов подтверждают расщеплением ферментами. Колонии бактерий, трансформированные РВ2-рРо1IR, культивируют в LB в течение 8 ч. Затем плазмиды экстрагируют и правильность вставки генов подтверждают расщеплением ферментами. Все pPo1I-конструкты секвенируют для того, чтобы убедиться в том, что они не содержат нежелательных мутаций.

pPolIR-конструкты для PR8HG переносят путем трансфекции в эмбриональные клетки почки человека 293Т с помощью pPolI-конструктов A/WSN/33(WSN)-HA и NA, A/HongKong/483/97(HK)-HAavir и NA или A/Kawasaki/01(Kawasaki)-HA и NA и четырех конструктов, экспрессирующих белки, для белков полимеразы и NP A/WSN/33. Супернатанты из трансфицированных клеток 293Т последовательно разводят (до 10 -7 ) и инфицируют ими аллантоисную полость 9-дневных куриных эмбрионов. Аллантоисную жидкость инфицированных эмбрионов затем собирают и титруют вирус в исследовании НА (табл. 3).

Таблица 3

Позитивные по НА образцы (вирус с WSN-HA NA при разведении 10 -2 и вирус с HK-HAavir NA при отсутствии разведения) разводят последовательно от 10 -2 до 10 -8 и 100 мкл каждого разведения инфицируют куриные эмбрионы. Аллантоисную жидкость инфицированных куриных эмбрионов собирают и титруют вирус в исследовании НА (табл. 4). 50%-ная доза инфицированных эмбрионов (EID 50 ) для A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), полученная из плазмиды, составляет 10 10.33 /мл, а титр вируса равен 1:3200.

Получают рекомбинантный вирус, содержащий гены НА и NA A/HongKong/213/2003 (H5N1) и остальные гены вируса гриппа типа А из штамма PR8HG. Для данного вируса EID 50 составляет 10 10.67 /мл, а титр вируса равен 1:1600.

Таблица 4

Последовательности генов PR8:

Пример 3.

Вирус гриппа A/HongKong/213/2003(H5N1, HK213) систематически реплицируется в организме цыплят, вызывая летальную инфекцию. Более того, этот вирус вызывает гибель и куриных эмбрионов. Таким образом, хотя поверхностные белки указанного вируса близкородственны циркулирующим в настоящее время патогенным штаммам вируса гриппа птиц, HK213 не может быть использован в качестве вакцинного штамма, поскольку попытки его выращивания в куриных эмбрионах заканчиваются получением аллантоисной жидкости, практически не содержащей вирус. Также использование высоковирулентного вируса с целью получения вакцины небезопасно для персонала. Для тестирования возможности использования A/PR/8/34 в качестве эффективного вакцинного вирусного штамма сайт расщепления гена НА НК 213 (содержащий многочисленные основные аминокислоты) подвергали мутированию от вирулентного до авирулентного фенотипа [от RERRRKR (SEQ ID NO: 9) к TETR]. Вирус, содержащий мутированный ген НА, не вызывал летальной, локализованной инфекции в организме цыплят. Кроме того, мутированный вирус не вызывал гибель куриных эмбрионов. Таким образом, выращивание мутированного вируса в куриных эмбрионах приводит к получению аллантоисной жидкости, содержащей большое количество вируса, и в такой аттенуированной форме он безопасен для применения в вакцинах.

В куриных эмбрионах получали рекомбинантный вирус, содержащий ген NA и мутированный ген НА из штамма HK213 и остальные гены из штамма высокого титра A/PR/8/34 (H1N1, HG-PR8) (пример 2), который растет в куриных эмбрионах в 10 раз с большей скоростью, чем другие штаммы A/PR/8/34 PR8 (10 10 EID 50 /мл; титр НА равен 1:8 000). Этот рекомбинантный вирус, экспрессирующий поверхностные белки, которые близкородственны циркулирующим в настоящее время патогенным штаммам вируса гриппа птиц, в куриных эмбрионах размножается в высоких титрах (фиг. 4). Таким образом, замена генов НА и NA HG-PR8 на гены циркулирующих в настоящее время патогенных штаммов вируса гриппа приводит к получению вакцинного штамма, который безопасен и позволяет использовать HG-PR8 в качестве эффективного вакцинного штамма.

Источники информации.

Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3rd edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987).

Aymard-Henry et al., Virology: A Practical Approach, Oxford IRL Press, Oxford, 119-150(1985).

Bachmeyer, Intervirology, 5:260 (1975).

Berkow et al., eds. The Merck Manual. 16th edition, Merck & Co., Rahway, NJ (1992).

Bridgen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 93:15400 (1996).

Castrucci et al., J. Virol., 66:4647 (1992).

Castrucci et al., J. Virol., 69:2725 (1995).

Conzelmann et al., J. Gen. Virol., 77:381 (1996).

Conzelmann et al., Trends Microbiol., 4:386 (1996).

Conzelmann, Annu. Rev. Genet., 32:123 (1998).

Cozelmann et al., J. Virol., 68:713 (1994).

Edwards, J. Infect. Dis., 169: 68 (1994).

Enami et al., J. Virol., 65:2711 (1991).

Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:3802 (1990).

Enami et al., Virology, 185:291 (1991).

Fodor et al., J. Virol., 73:9679 (1999).

Goto et al., Virology. 238:265 (1997).

Grand and Skehel, Nature. New Biology. 238:145 (1972).

Hatta et al., Science. 293:1840 (2001).

Horimoto et al., J. Virol., 68:3120 (1994).

Huddleston et al., Nucl. Acids Res., 10:1029 (1982).

Keitel et al., in Textbook of Influenza, eds. Nickolson, K.G., Webster, R.G., and Hay, A. (Blackwell, Oxford), pp. 373-390 (1998).

Kendal et al., Infect. Immunity, 29:966 (1980).

Kilbourne, Bull. M2 World Health Org., 41: 653 (1969).

Kovesdi et al., J. Curr. Opin. Biotechnol., 8:583 (1997).

Laver & Webster, Virology, 69:511 (1976).

Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:4477 (1995).

Li et al., Virus Res., 37:153 (1995).

Luytjes et al., Cell, 59:1107 (1989).

Marriott et al., Adv. Virus Res., 53:321 (1999).

Mena et al., J. Virol., 70:5016 (1996).

Mizrahi, (ed.), Viral Vaccines. Wiley-Liss, New York, 39-67 (1990).

Murphy, Infect. Dis. Clin. Pract., 2: 174 (1993).

Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5177 (1991).

Munoz et al., Antiviral Res., 46:91 (2000).

Nagai et al., Microbiol. Immunol. 43:613 (1999).

Nagai, Rev. Med. Virol., 9:83 (1999).

Neumann et al., Adv. Virus Res., 53:265 (1999).

Neumann et al., J. Gen. Virol., 83:2635 (2002).

Neumann et al., J. Virol., 71:9690 (1997).

Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:9345 (1999).

Neumann et al., Virology, 202:477 (1994).

Neumann et al., Virology, 287:243 (2001).

Niwa et al., Gene. 108:193 (1991).

Ogra et al., J. Infect. Dis., 134: 499 (1977).

Osol (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1324-1341 (1980).

Parks et al., J. Virol., 73:3560 (1999).

Pekosz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 96:8804 (1999).

Perez et al., Virology, 249:52 (1998).

Pleschka et al., J. Virol., 70:4188 (1996).

Radecke et al., EMBO J., 14:5773 (1995).

Roberts et al., Virology, 247:1 (1998).

Robertson et al., Biologicals, 20:213 (1992).

Robertson et al., Giornale di Igiene e Medicina Preventiva, 29:4 (1988).

Rose, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 93:14998 (1996).

Schnell et al., EMBO J., 13:4195 (1994).

Subbarao et al., J. Virol. 67:7223 (1993).

World Health Organization TSR No. 673 (1982).

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящее описание исключительно в качестве ссылок. В то время как в настоящем описании раскрыты наиболее предпочтительные варианты осуществления заявленного изобретения и многие детали приведены в целях иллюстрации изобретения, специалисту в данной области очевидно, что возможны дополнительные варианты осуществления изобретения, а многие приведенные здесь детали могут существенно варьировать, не выходя за рамки основных принципов изобретения.

Список последовательностей