Система для экспресс-анализа микробиологических параметров включает в себя контейнер для пробы, предназначенный для содержания образца жидкости, корпус, имеющий закрываемую камеру, форма которой позволяет вмещать контейнер для пробы, систему инкубации, установленную в корпусе, предназначенную для инкубации микробиологических материалов в образце жидкости, и систему спектрофотометра, установленную в корпусе для измерения света, поглощаемого, излучаемого или рассеиваемого жидкими образцами по мере инкубации микробиологических материалов системой инкубации с течением времени. Контейнер для пробы заполнен тестируемым образцом жидкости, смешанным с реагентом, который обеспечивает детектируемый параметр и размещен внутри устройства. Система инкубации нагревает образец жидкости и поддерживает его температуру в пределах заданного диапазона, в то время как система спектрофотометра пропускает свет через контейнер для пробы и отслеживает и регистрирует изменения света при распространении света через контейнер. Непрерывный неинтрузивный мониторинг и запись параметров тестирования выполняются в ходе инкубации. Любое существенное отклонение выходного сигнала представляет собой показатель присутствия детектируемого параметра, в то время как время, требуемое для достижения существенного отклонения, обеспечивает количественный анализ исследуемого микробиологического параметра.

[0001] Устройство для экспресс-анализа микробиологических материалов в образце жидкости, содержащее:

[0002] Устройство по п.1, в котором компоненты спектрофотометра содержат излучающий свет источник, расположенный так, что свет распространяется внутри контейнера для пробы, и детектор, установленный для детектирования изменений количества света при распространении света через микробиологические материалы и для получения сигнала детектора, который представляет собой показатель этих изменений.

[0003] Устройство по п.2, также содержащее контроллер спектрофотометра для управления излучающим свет источником и детектором, причем контроллер спектрофотометра содержит микропроцессор, предназначенный для обработки сигнала детектора и для формирования записи изменений света как функции времени.

[0004] Устройство по п.2, в котором излучающий свет источник распространяет свет, имеющий известную интенсивность, вдоль первого оптического пути в контейнере для пробы, и детектор детектирует изменения интенсивности света в пределах поля обзора в отношении первого оптического пути.

[0005] Устройство по п.3, в котором поле обзора расположено под углом 180 ° относительно первого оптического пути.

[0006] Устройство по п.3, в котором поле обзора расположено под углом 90 ° относительно первого оптического пути.

[0007] Устройство по п.2, в котором излучающий свет источник содержит светодиод, а детектор содержит фототранзистор.

[0008] Устройство по п.1, дополнительно содержащее первый спектрофотометр и второй спектрофотометр, причем первый спектрофотометр содержит первый излучающий свет источник, установленный внутри держателя контейнера и предназначенный для распространения первого луча света в контейнере для пробы, и первый детектор, установленный внутри держателя контейнера и предназначенный для детектирования изменений первого луча света, и второй спектрофотометр содержит второй излучающий свет источник, установленный внутри держателя контейнера и предназначенный для распространения второго луча света в контейнере для пробы, и второй детектор, установленный внутри держателя контейнера и предназначенный для детектирования изменений во втором луче света.

[0009] Устройство по п.8, дополнительно содержащее третий спектрофотометр, причем третий спектрофотометр содержит третий излучающий свет источник, установленный внутри держателя контейнера и предназначенный для распространения третьего луча света в контейнере для пробы, и третий детектор, установленный внутри держателя контейнера и предназначенный для детектирования изменений в третьем луче света.

[0010] Устройство по п.2, в котором корпус содержит основание, а держатель контейнера содержит продолжающуюся вверх, в общем, цилиндрическую стенку, установленную на основании, причем стенка имеет открытый верхний торец, сформированный для приема контейнера для пробы, и съемный колпак, соединенный съемным образом с основанием, причем съемный колпак имеет такую форму, что он окружает и закрывает держатель контейнера.

[0011] Устройство по п.10, в котором излучающий свет источник и детектор установлены в держателе контейнера в месте, расположенном в непосредственной близости к контейнеру для пробы, когда контейнер для пробы помещен в корпусе.

[0012] Устройство по п.10, в котором нижняя часть стенки держателя контейнера содержит по меньшей мере один продолжающийся внутрь вырез, и контейнер для пробы содержит по меньшей мере одну боковую выемку, имеющую такую форму, что она соответствует вырезу, когда контейнер для пробы помещен в держателе контейнера.

[0013] Устройство по п.10, в котором нижняя часть стенки держателя контейнера содержит пару диаметрально противоположных вырезов, и контейнер для пробы содержит пару диаметрально противоположных выемок, имеющих такую форму, что они соответствуют вырезам.

[0014] Устройство по п.1, в котором средства для инкубации содержат нагревательный элемент и датчик температуры.

[0015] Устройство по п.14, в котором датчик температуры продолжается вверх в держатель контейнера, и контейнер для пробы имеет нижнюю полость, имеющую такую форму, что в ней размещается датчик температуры.

[0016] Устройство по п.14, в котором нагревательный элемент продолжается вверх в держатель контейнера, и контейнер для пробы имеет нижнюю полость такой формы, что в ней размещается нагревательный элемент.

[0017] Устройство по п.8, также содержащее контроллер спектрофотометра для управления первым спектрометром и вторым спектрометром с тем, чтобы одновременно обнаруживать изменения в первом световом луче и изменения во втором световом луче.

[0018] Устройство по п.12, в котором по меньшей мере один детектор и излучающий свет источник установлены по меньшей мере в одной выемке.

[0019] Устройство по п.13, в котором детектор установлен в одной из двух выемок, а излучающий свет источник установлен в другой из двух выемок.

[0020] Устройство для инкубации и детектирования микробиологических материалов в образце жидкости, содержащее:

[0021] Устройство по п.20, в котором компоненты спектрофотометра содержат излучающий свет источник, расположенный вплотную к контейнеру для пробы и предназначенный для распространения луча света известной интенсивности вдоль первого оптического пути в контейнере для пробы, и детектор, расположенный вплотную к контейнеру для пробы и предназначенный для детектирования изменений интенсивности света вдоль второго оптического пути относительно первого оптического пути.

[0022] Устройство по п.21, в котором корпус содержит основание, держатель контейнера, установленный на основании, для удержания контейнера для пробы, причем держатель контейнера имеет открытый верхний торец, сформированный для приема контейнера для пробы, и съемный колпак, соединенный съемным образом с основанием, причем съемный колпак имеет такую форму, что он окружает и закрывает держатель контейнера и тем самым формирует камеру.

[0023] Устройство по п.22, в котором средства для инкубации содержат нагревательный элемент, установленный внутри держателя контейнера, и датчик температуры, установленный внутри держателя контейнера.

[0024] Устройство для инкубации и анализа микробиологических материалов в образце жидкости, содержащее:

[0025] Устройство по п.24, в котором держатель контейнера содержит продолжающуюся вверх, в общем, цилиндрическую стенку, установленную на основании, причем нижняя часть стенки содержит пару диаметрально противоположных вырезов, причем детектор установлен в одной из двух выемок, а излучающий свет источник установлен в другой из двух выемок, и при этом контейнер для проб содержит пару диаметрально противоположных выемок, имеющих такую форму, что они соответствуют вырезам.

[0026] Способ экспресс-анализа микробиологических материалов в образце жидкости, содержащий этапы, на которых:

[0027] Способ по п.26, дополнительно содержащий этапы, на которых записывают изменения детектируемого параметра как функции времени.

[0028] Способ по п.26, в котором этап, на котором измеряют изменения детектируемого параметра, содержит этап, на котором пропускают свет через смесь образца/реагента в контейнере для пробы и детектируют изменения света.

[0029] Способ по п.27, дополнительно содержащий этапы, на которых:

[0030] Способ по п.26, в котором заданный диапазон температуры составляет ±1 °С.

[0031] Способ по п.26, в котором детектируемый параметр выбирают из группы, содержащей цвет, флуоресценцию и степень помутнения.

[0032] Способ по п.26, в котором детектируемый параметр содержит биолюминесценцию или хемилюминесценцию в результате наличия биологического или химического компонента в реагенте.

[0033] Способ количественного экспресс-анализа микробиологических материалов в образце жидкости, содержащий этапы, на которых:

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и устройству детектирования присутствия и количественных показателей микробиологических материалов в жидких образцах и, в частности, к способам и устройству количественного анализа патогенных микроорганизмов в образцах воды.

Уровень техники

Питьевую воду и рекреационную воду (воду на пляжах и в других заведениях, предназначенных для плавания) необходимо регулярно проверять, и результаты этих проверок должны быть доступны в течение короткого времени для защиты общества от опасных и заразных болезней.

В настоящее время большинство проверок образцов воды выполняют в лабораторных условиях вдали от водохозяйственных объектов или мест отбора. Множество способов и процедур, используемых в настоящее время в обычных микробиологических анализах, были разработаны более чем 100 лет назад. Эти процедуры являются трудоемкими и требуют значительного времени как при выполнении, так и при сборе данных. Результаты таких тестов обычно остаются недоступными для операторов водохозяйственных объектов в течение приблизительно 36-72 ч. Вследствие этого операторы часто не могут предпринять действия для очистки загрязненной воды в течение длительного времени после начала потребления или использования такой загрязненной воды.

Кроме того, большой проблемой остаются передаваемые через воду заболевания, несмотря на предпринимаемые во всем мире попытки ее решения. Эта проблема не ограничивается развивающимися и слаборазвитыми странами, но является глобальной по своей природе. Некоторые из основных ее причин представляют собой следующие:

1) применяемая в настоящее время частота проведения проверок является не достаточной для обеспечения раннего предупреждения, поэтому корректирующие воздействия не могут быть предприняты для предотвращения вспышек заболеваний; и

(2) используемые в настоящее время способы тестирования являются трудоемкими и требуют большого времени и, следовательно, не способствуют организации частых проверок.

В 1988 г. авторы Edberg S.C. и др. разработали новую технологию, которая основана на способе химически определенного субстрата MTF, известную как "Autoanalysis Colilert (AC): "National filed evaluation of a defined substrate method for the simultaneous evaluation of total coliforms and Escherichia coli from drinking water: comparison with standard multiple tube technique ″, Appl. Environ. Microbiol., 54 1595 (1988)." Это обеспечило возможность проведения одновременного детектирования и идентификации как общего количества колиформ, так и E.coli в воде при 1 CFU на 100 мл в течение менее чем 24 ч. Colilert ® представляет собой среду, содержащую хромогенный/флюорогенный реагент, в которой предусмотрены специфичные питательные вещества и ферментные субстраты с хромофорами и флуорофорами для одновременного детектирования общего количества колиформ и E.coli. В 1989 г. US EPA (Агентство по охране окружающей среды США) утвердило этот способ как средство качественного тестирования общего количества колиформ в питьевой воде.

Развитие хромогенных/флюорогенных реагентов для проведения микробного тестирования открыло возможность для повышения качества и ускорения протоколов тестирования. Кроме того, эти продукты обеспечивают дополнительную возможность использования такой технологии, как оптическая спектроскопия, для проведения биологического, микробиологического и химического анализа. Спектрофотометрический анализ является очень чувствительным и, следовательно, позволяет детектировать присутствие очень низкой концентрации представляющих интерес цветообразующих компонентов в жидких образцах (в частях на миллион). Визуально глаз человека может обнаружить цвет только тогда, когда его компоненты присутствуют при довольно высокой концентрации, что приводит к необходимости инкубационного периода в пределах от 18 до 72 ч. Время, требуемое для идентификации или оценки присутствия микробиологических индикаторов в воде, пище и образцах окружающей среды, может быть значительно уменьшено при комбинировании инкубации с фотометрическим анализом.

Использование и преимущество спектрофотометрических подходов к бактериологическому анализу в жидких образцах описано в литературе. Однако эти тесты выполнялись за пределами инкубационной камеры путем отбора аликвоты образца из инкубационного резервуара в фотометрические трубки через разные интервалы и проведения измерений с использованием стандартных спектрометров. При таком подходе необходимо не только длительное время, но и требуется использовать отдельные инкубаторы, спектрометры и технический персонал для проведения теста и в некоторых случаях роботизированные системы отбора образцов. При этом также возможен риск взаимных загрязнений и ошибок, вносимых человеком, если особые меры не будут предприняты при проведении анализа.

В соответствии с этим, существует насущная необходимость в улучшенных способах и устройствах тестирования микробиологических материалов в питьевой воде, рекреационной воде, а также в сточных водах для обеспечения возможности лучшего управления водохозяйственными объектами, для защиты общественного здоровья и окружающей среды.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к системе, предназначенной для проведения быстрого количественного анализа бактерий в образцах жидкости, такой как вода. В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на систему, содержащую контейнер для пробы, в котором содержится проверяемый образец, и устройство, имеющее систему спектрофотометра, содержащую соответствующий излучающий свет источник и детектор, установленные рядом с контейнером для пробы в пределах корпуса устройства. Реагент, который обеспечивает детектируемый параметр (например, цвет, флуоресценцию и т.д.) добавлен к проверяемому образцу в контейнере для пробы. В то время как в образце происходит инкубация, детектор отслеживает свет от источника, проходящего через образец и контейнер для пробы. Детектор подключен к процессору спектрофотометра, который измеряет, обрабатывает, записывает и сохраняет информацию. Процессор также может быть подключен к соответствующему устройству измерения и записи, такому как компьютер, мультиметр или любое другое устройство, которое позволяет измерять и регистрировать выходные сигналы детектора. Это обеспечивает неинтрузивную непрерывную инкубацию и измерение роста сигнала исследуемого параметра.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на систему экспресс-анализа микробиологических параметров в образцах жидкости. Эта система содержит контейнер для пробы, предназначенный для содержания образца жидкости, причем этот контейнер для пробы изготовлен из материала, который обеспечивает возможность распространения света, корпус, образующий закрываемую камеру для содержания в ней контейнера для пробы, инкубационную систему, установленную внутри корпуса, для инкубации микробиологических материалов в образце жидкости и систему спектрофотометра, установленную в корпусе, для пропуска света через контейнер для пробы и измерения количества поглощенного, излучаемого или рассеянного света образцом жидкости, когда происходит инкубация микробиологических материалов в инкубационной системе с течением времени.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение направлено на устройство детектирования микробиологических материалов в образце жидкости. Устройство содержит корпус, имеющий закрываемую камеру такой формы, что в ней содержится прозрачный пластмассовый контейнер, который предназначен для содержания образца жидкости, устройство инкубации, установленное внутри корпуса, предназначенное для инкубации любых микробиологических материалов в образце жидкости, и устройство спектрофотометра, установленное внутри корпуса, предназначенное для измерения поглощаемого, излучаемого или рассеиваемого образцом жидкости света по мере инкубации микробиологических материалов устройством инкубации с течением времени.

Настоящее изобретение также направлено на способ экспресс-анализа микробиологических материалов в образце жидкости, содержащий этапы, на которых:

(а) смешивают образец жидкости, имеющий неизвестную исходную популяцию микробиологического материала, с реагентом в контейнере для пробы, причем реагент обеспечивает детектируемый параметр, показывающий микробиологический материал, создавая, таким образом, смесь образца/реагента;

(b) размещают контейнер для пробы внутри закрываемого корпуса, и корпус закрывают;

(c) выполняют инкубацию смеси образца/реагента внутри закрытого корпуса при температуре в пределах заданного диапазона температур в течение определенного периода времени и

(d) измеряют изменение детектируемого параметра по мере инкубации смеси образца/реагента в течение некоторого периода времени.

Настоящее изобретение дополнительно направлено на способ быстрого количественного анализа микробиологических материалов в образце жидкости. Способ содержит этапы, на которых:

(a) помещают образец жидкости, имеющий неизвестную исходную популяцию микробиологического материала, в контейнер для пробы, изготовленного из материала, который позволяет пропускать через него свет;

(b) создают смесь образца/реагента путем перемешивания образца жидкости с реагентом, в результате чего получают детектируемый параметр, показывающий микробиологический материал после экспозиции светом;

(c) выполняют инкубацию смеси образца/реагента в закрытом корпусе при температуре в пределах заданного диапазона температур в течение некоторого периода времени;

(d) измеряют изменения детектируемого параметра по мере инкубации смеси образца/реагента с пропусканием света известной интенсивности через смесь образца/реагента и измерением изменений интенсивности света с течением времени;

(e) выполняют запись изменений интенсивности света как функцию времени;

(f) записывают время существенного отклонения, при котором возникает экспоненциальное изменение детектируемого параметра; и

(g) определяют исходную популяцию путем корреляции времени существенного отклонения с известным временем экспоненциального роста детектируемого параметра для известных исходных популяций микробиологического материала.

Краткое описание чертежей

Изобретение будет описано ниже только в качестве примера со ссылкой на следующие чертежи, на которых:

на фиг. 1 показана схема системы в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 2 показан вид в перспективе устройства, выполненного в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения предмета изобретения;

на фиг. 3 показан вид в перспективе с покомпонентным представлением деталей устройства в соответствии с предметом изобретения, где представлены снятый колпак и контейнер для пробы, извлеченный из основного модуля;

на фиг. 4 показан вид устройства в соответствии с предметом изобретения в разрезе вдоль линии 4-4, обозначенной на фиг. 2;

на фиг. 5 показан вид устройства в соответствии с предметом изобретения в разрезе вдоль линии 5-5, обозначенной на фиг. 4;

на фиг. 6 показан вид сверху устройства в соответствии с предметом изобретения в разрезе вдоль линии 6-6, обозначенной на фиг. 4;

на фиг. 7 показан вид спереди в разрезе устройства, выполненного в соответствии с альтернативным вариантом выполнения настоящего изобретения;

на фиг. 8 показана блок-схема последовательности операций, иллюстрирующая способ в соответствии с предметом изобретения;

на фиг. 9 показан график, иллюстрирующий типичную кривую роста с течением времени;

на фиг. 10 показан график данных, отображающий примерные кривые роста для двух различных микробиологических параметров;

на фиг. 11 показана таблица данных, представляющая результаты, сформированные с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 12 показана примерная кривая линейной корреляции, используемая в способе работы устройства, которое соответствует предмету изобретения;

на фиг. 13 показан отчет об испытаниях, сформированный при выполнении способа, который соответствует предмету изобретения;

на фиг. 14а показана блок-схема последовательности операций, иллюстрирующая алгоритм управления нагревом в соответствии с настоящим изобретением; и

на фиг. 14b показана блок-схема последовательности операций, иллюстрирующая алгоритм управления температурой и сбором данных в соответствии с настоящим изобретением.

Осуществление изобретения

На фиг. 1 показана система экспресс-анализа микробиологических параметров, в которой используется неинтрузивная инкубация и детектирование в резервуаре, изготовленном в соответствии с предметом изобретения. Система 10 содержит устройство 12 инкубатор-детектор, контейнер 14 для пробы, предназначенный для содержания образца 11 жидкости, смешанной с реагентом 20, и внешний регистратор 80 данных. Устройство 12 инкубатор-детектор содержит корпус 15, имеющий камеру 65 детектирования такой формы, что в ней можно вместить контейнер 14 для пробы, систему 60 инкубации, установленную внутри корпуса 15, предназначенную для инкубации микробиологических материалов в образце 11 жидкости и систему 62 спектрофотометра, установленную в корпусе 15. Система 62 спектрофотометра измеряет количество света, поглощаемого, излучаемого или рассеиваемого образцом 11 жидкости в контейнере 14 для пробы, по мере инкубации микробиологических материалов в системе 60 инкубации.

Система 60 инкубации включает в себя контроллер 92 нагрева, и система 62 спектрофотометра включает в себя контроллер 94 спектрофотометра. Источник 90 питания обеспечивает питание для системы 60 инкубации и системы 62 спектрофотометра. Внешний регистратор 80 данных предпочтительно содержит компьютер 85, имеющий микропроцессор 86 и запоминающее устройство 88, а также выходное устройство, такое как принтер 82, которое подключено к компьютеру 85.

На фиг. 2-6 представлен предпочтительный вариант выполнения устройства 12 инкубатора-детектора. Корпус 15 устройства 12 выполнен, в общем, в виде цилиндрического кожуха, содержащего основание 16, держатель 18 контейнера, имеющий такую форму, что в нем удерживается контейнер 14 для пробы, и съемный колпак 50. Основание 16 включает в себя продолжающийся вертикально цилиндрический буртик 55, имеющий форму, в которой устанавливается колпак 50. В основании 16 установлен источник 90 питания, контроллер 92 нагрева и контроллер 94 спектрофотометра. Источник 90 питания может представлять собой любой соответствующий источник питания, известный в данной области техники, такой как перезаряжаемая батарея, установленная внутри основания 16, имеющая выходной разъем 99 для подключения к внешнему источнику питания с переменным напряжением 120 или 220 В или к источнику питания с постоянным напряжением. На внешней поверхности основания 16 установлен выключатель 13 питания, индикаторные светодиоды 97 и порт 98 данных.

Держатель 18 контейнера содержит основание 21 и цилиндрическую стенку 19 с открытым торцом, продолжающуюся вверх от основания 21. Стенка 19 выполнена с такой формой, что она окружает нижний участок контейнера 14 для пробы, когда контейнер 14 для пробы помещен внутри корпуса 15. Стенка 19 включает в себя пару продолжающихся внутрь, диаметрально противоположных, в общем, прямоугольных выемок 23.

Съемный колпак 50 имеет такую форму, что обеспечивается его плотная подгонка вокруг стенки 19 держателя 18 контейнера. Колпак 50 предпочтительно содержит теплоэффективную, цилиндрическую оболочку с двойными стенками, имеющую внешнюю стенку 51, внутреннюю стенку 59, закрытый верхний торец 52 и открытый нижний фланец 53. На внешней поверхности нижнего фланца 53 предусмотрена кромка 66, которая имеет такую форму, что завинчивается в канавку 67 на внутренней поверхности буртика 55 основания 16. Внутренняя поверхность внутренней стенки 59 включает в себя выступ 68, имеющий такую форму, что он герметично соединяется с кольцом 49, продолжающимся вокруг основания 21 держателя 18 контейнера. В случае необходимости, в пространстве между стенками 51 и 59 колпака 50 может быть образован вакуум или оно может быть заполнено инертным газом.

Когда колпак 50 устанавливают на держатель 18 контейнера, колпак 50 и держатель 18 контейнера образуют очень эффективную теплоизолированную камеру 65 инкубационного детектирования. Внутренняя поверхность стенки 19 держателя 18 образца предпочтительно зачернена так, что камера 65 образует эффективный "черный ящик" (темное помещение) для оптического детектирования и измерений.

Система 60 инкубации устройства 12 содержит нагревательный элемент 24, датчик 25 температуры и контроллер 92 инкубации. Нагревательный элемент 24 установлен внутри нагревательного штыря 57, продолжающегося вертикально вверх через отверстие в основании 21 держателя 18 контейнера. Датчик 25 температуры установлен внутри штыря 56 для измерения температуры, который продолжается вверх от основания 21 держателя 18 контейнера. Датчик 25 температуры может содержать термистор 26, расположенный рядом с верхней частью штыря 56.

Контроллер 92 нагрева управляет нагревом нагревательного элемента 24 и отслеживает температуру образца 11 жидкости, используя датчик 25 температуры. После того как температура достигнет оптимального значения, контроллер 92 нагрева поддерживает температуру образца 11 жидкости, находящегося внутри. Контроллер 92 нагрева предпочтительно содержит таймер (не показан), предназначенный для измерения времени инкубации от ее начала и для отключения нагрева в конце заранее установленного времени.

Контейнер 14 для пробы содержит колпак 42 для пробы и колбу 44 для пробы. Колба 44 для пробы выполнена, в общем, цилиндрической с нижней полостью 45 для установки в нее нагревательного штыря 57 и нижней полостью 46 для установки в нее штыря 56 датчика температуры. Колба 44 для пробы также имеет пару диаметрально противоположных, в общем, прямоугольных боковых вырезов 48, которые имеют такую форму, что в них устанавливаются выемки 23 стенки 19, когда контейнер 14 для пробы установлен внутри держателя 18 контейнера. Колба 44 для пробы изготовлена из материала, который обеспечивает возможность распространения световых сигналов, и предпочтительно изготовлена из прозрачной пластмассы или другого материала, который является оптически прозрачным.

Система 62 спектрофотометра представляет собой систему, предназначенную для измерения света, поглощаемого, излучаемого или рассеиваемого образцом жидкости, по мере того как с течением времени происходит инкубация микробиологических материалов. Как лучше всего показано на фиг. 4, система 62 спектрофотометра предпочтительно содержит три спектрофотометра, первый спектрофотометр, содержащий излучающий свет источник 30а и детектор 35а, второй спектрофотометр, содержащий излучающий свет источник 30b и детектор 35b, и третий спектрофотометр, содержащий излучающий свет источник 30с и детектор 35с. От излучающих свет источников 30а-с, лучи света распространяются с заданной интенсивностью вдоль выбранных оптических путей внутри контейнера 14 для пробы. Детекторы 35а-с света расположены так, что они детектируют изменение интенсивности лучей света в пределах выбранного поля зрения, сопоставленного с оптическими путями, полученных из света, который поглощается, излучается или рассеивается образцом 11 жидкости по мере инкубации с течением времени микробиологических материалов в системе инкубатора.

Каждый из источников 30а-с света, предпочтительно, содержит светодиод (СД) со специфичным максимумом длины волны, и каждый из детекторов 35а-с, предпочтительно, содержит фототранзисторный детектор. Источники 30а-с света и детекторы 35а-с установлены на печатных платах 33а-с, которые электрически соединены с контроллером 94 спектрофотометра.

Излучающие свет источники 30а, 30b продолжаются через отверстия 70а и 70b в основании держателя 18 контейнера.

Излучающие свет источники 30а, 30b установлены таким образом, что свет, излучаемый источниками, распространяется через отверстия 70а и 70b, соответственно, и вверх вдоль выбранного оптического пути внутри контейнера 14 для пробы. В случае излучающего свет источника 30а, 30b оптические пути показаны стрелкой 1 и стрелкой 4 соответственно. Держатель 18 контейнера также имеет отверстия 75а, 75b для детекторов 35а, 35b сигнала. Детекторы 35а, 35b расположены под углом 90 ° относительно излучающих свет источников 30а, 30b таким образом, что окно детектора обращено к колбе 44 для пробы для приема любого сигнала, распространяющегося в направлении детекторов 35а, 35b, и имеют поля обзора, показанные стрелкой 2 и стрелкой 5 соответственно.

Держатель 18 контейнера также включает в себя соответствующие отверстия 70с и 75с для излучающего сигнал источника 30с и детектора 35с сигнала соответственно. Свет, излучаемый источником 30с света, проходит через отверстие 70с вдоль горизонтального оптического пути с направлением распространения, показанным стрелкой 3, через контейнер 14 для пробы и отверстие 75с к детектору 35с. Детектор 35с установлен таким образом, что его поле обзора расположено под углом 180 ° относительно оптического пути источника 30с света.

Контроллер 94 спектрофотометра управляет работой системы спектрофотометра. Контроллер 94 управления спектрофотометра активирует и деактивирует излучающие сигнал источники 30а-с и может обеспечить их импульсную работу. Контроллер 94 спектрофотометра также измеряет и обрабатывает выходные сигналы, генерируемые детекторами 35а, 35b и 35с. Контроллер 94 спектрофотометра включает в себя микропроцессор 95, имеющий встроенные часы, который выполняет функцию регистратора данных и сохраняет измеренные детектором значения сигнала вместе с соответствующими значениями температуры образца 11 жидкости и времени измерений в определенном местоположении в запоминающем устройстве микропроцессора 95. Контроллер 94 спектрофотометра может показывать окончание теста, включая один или больше светодиодов 97 или устройство звуковой сигнализации (не показано). Контроллер 94 спектрофотометра также связывается через порт 98 передачи данных с внешним устройством 80 записи данных, таким как компьютер 85, мультиметр или другой внешний манипулятор сигнала.

Микропроцессор 95 контроллера 94 спектрофотометра включает в себя запоминающее устройство, предназначенное для сохранения программного обеспечения, в котором воплощен способ тестирования предмета изобретения. Способ тестирования определяет спецификации и условия, требуемые для проведения процесса тестирования. Благодаря использованию специализированных программных средств, этот способ может быть запрограммирован и загружен в запоминающее устройство микропроцессора 95 через порт 98 данных. Программное средство также позволяет стирать все области запоминающего устройства контроллера 94.

Для использования устройства 12 в соответствии с настоящим изобретением для тестирования образцов жидкости образец 11 жидкости помещают в контейнер 14 для образцов. Образец 11 жидкости не ограничивается водой и может содержать другие жидкости или другие жидкие среды, содержащие суспензии, такие как частицы продуктов питания, фильтровальная бумага и другие твердые вещества. Соответствующий реагент 20 затем добавляют к жидкому образцу 11 внутри контейнера 14 для пробы. Реагент 20 может быть химическим или биологическим по своей природе и может обеспечивать детектируемый параметр, такой как цвет, флуоресценция, степень помутнения и т.д., который обозначает присутствие или отсутствие исследуемого микробиологического материала.

Детектирование цвета, флуоресцентного сигнала или сигнала, представляющего степень помутнения, зависит от времени, и время детектирования увязывают с количеством бактерий, присутствующих в начале тестирования. Таким образом, можно получить количественные показатели детектируемых микробиологических параметров, таких как общее количество колиформ и E.coli в водном образце, путем измерения сигнала, полученного в результате изменения цвета, или флуоресцентного сигнала и времени, в течение которого они детектируются в заметных количествах.

Детектируемый цвет или детектируемый флуоресцентный сигнал измеряют, используя систему 62 спектрофотометра устройства 12. В предпочтительном варианте выполнения система 62 спектрофотометра содержит три спектрофотометра, которые обеспечивают колориметрическое детектирование для определения общего количества колиформ, детектирования флуоресценции для E.coli и степени помутнения, связанного с микробиологическим ростом, для нефелометрии соответственно.

Встроенные часы микропроцессора 95 контроллера 94 спектрофотометра предоставляют время роста, в то время как постоянная температура системы 60 инкубации обеспечивает как воспроизводимость роста микробов, так и оптическую воспроизводимость.

В предпочтительном варианте выполнения системы 10 в соответствии с настоящим изобретением система 62 спектрофотометра содержит три "спектрофотометра, измеряющих время роста" с одним инкубатором с постоянной температурой, то есть спектрофотометры, которые регистрируют рост определенных микробиологических параметров как функцию времени. Тип спектрофотометрического анализа, выполняемого каждым спектрофотометром, зависит от конфигурации и спецификации источника и детектора спектрофотометра. Конфигурация 180 ° пары 30с, 35с источника и детектора обеспечивает колориметрический анализ или анализ степени помутнения, в то время как конфигурацию 90 ° пар 30а, 35а и 30b, 35b источника-детектора обеспечивает либо флюорометрический или нефелометрический анализ.

Источник 30с колориметрического спектрофотометра предпочтительно содержит светодиод с максимумом длины волны на 620 нм, и детектор 35с предпочтительно представляет собой фототранзисторный детектор, имеющий отклик сигнала, располагающийся в видимой области света, включающий 620 нм. Источник 30а флуорометрического спектрофотометра предпочтительно представляет собой ультрафиолетовый светодиод с максимальной длиной волны на 380 нм, и детектор 35а, расположенный, в общем, под углом 90 ° к источнику 30b, предпочтительно представляет собой фототранзисторный детектор, имеющий отклик сигнала в видимом диапазоне, включающем в себя диапазон 400-500 нм. Конфигурация нефелометра аналогична конфигурации флуорометра, за исключением того, что источник 30b предпочтительно представляет собой светодиод с максимальной длиной волны на 400 нм.

После асептического добавления реагента 20 к образцу колпак 42 образца закрепляют на колбе 44 для пробы, и контейнер 14 для пробы осторожно взбалтывают для растворения реагента и формирования смеси образец/реагент. Для одновременного тестирования общего количества колиформ и E.coli в пробах воды обычные реагенты обеспечивают не только оптимальную питательную среду для роста, но также и изменение цвета в соответствии с общим количеством колиформ и сигнала флуоресценции для E.coli, если они присутствуют в каком-либо количестве в образце. Примеры типичных хромогенных/флюорогенных реагентов представляют собой

Merck KGaA - Readycult ®

IDEXX-Colilert ®

Контейнер 14 для пробы затем помещают внутри держателя 18 контейнера, как лучше всего показано на фиг. 2. После того как съемный колпак 50 будет помещен на основание 16, камера 65 инкубации-детектирования обеспечивает условия "черного ящика" (темного помещения), идеальные для роста микробов и спектрофотометрического детектирования.

После нажатия кнопки 13 пуска на основании 16 устройства 12 активируется цикл инкубации и процесс детектирования. В случае необходимости, можно использовать отдельную кнопку активации для активации процесса детектирования в заданный момент времени после начала инкубации.

Активация процесса детектирования может включать в себя включение питания излучающих сигнал источников 30а-с и детекторов 35а-с, включение импульсного излучения сигнала и отслеживания выходного сигнала детекторов 35а-с.

Контроллер 92 нагрева доводит и поддерживает температуру образца 11 жидкости на постоянном значении температуры в пределах предварительно установленного температурного диапазона. Для тестирования колиформ и E.coli в воде предпочтительно поддерживать температуру 36 ±1 °С. Однако температура зависит от используемого реагента и может изменяться от одного реагента к другому. Температура также зависит от спецификации способа испытаний. Например, E.coli можно тестировать либо при 36 °С или при 41 °С, используя один и тот же реагент.

Контроллер 94 спектрофотометра непрерывно отслеживает, регистрирует и сохраняет выходные сигналы детекторов 35а-с. В способе в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения контроллер 94 спектрофотометра также записывает и сохраняет время и температуру для каждого выходного сигнала. Контроллер 94 может быть подключен к внешнему регистратору 80 данных, который запрограммирован для регистрации сигнала либо постоянно или через заданные интервалы. Внешний регистратор 80 данных также может записывать время измерения каждого измеренного сигнала и соответствующую температуру образца и может генерировать "график сигнала роста в зависимости от времени" (ГСРЗВ, TDGSP) для исследуемых микробиологических параметров.

Колориметрические TDGSP общего количества колиформ и флюорометрические TDGSP E.coli предпочтительно одновременно записывают вместе с нефелометрическим TDGSP степень повышения помутнения в результате роста бактерий в воде.

Существенное отклонение выходного сигнала от исходной базовой линии представляет собой показатель присутствия исследуемого параметра, в то время как время, требуемое для достижения существенного отклонения от исходного положения, предоставляет показатель исходного количества тестируемого параметра.

Часы микропроцессора 95 представляют дату и время начала теста, время каждого сигнала измерения и соответствующей температуры, время, при котором тест был закончен или прекращен. Окончание теста может быть обозначено состоянием светодиодов 97 и/или звуковыми сигналами или его можно контролировать, используя программное приложение.

На фиг. 7 схематически представлен вид устройства 112, изготовленного в соответствии с альтернативным вариантом выполнения настоящего изобретения. Устройство 112, в общем, аналогично устройству 12 в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения, как показано на фиг. 2-6, за исключением нескольких модификаций.

Устройство 112 содержит контейнер 114 для пробы и корпус 115, содержащий основание 116, цилиндрический держатель 118 контейнера и съемный колпак 150. Держатель 118 контейнера имеет цилиндрическое основание 155 и цилиндрическую стенку 160 с открытым торцом. Цилиндрическое основание 155 держателя контейнера имеет штырь 156 контроллера температуры, продолжающийся вверх, предназначенный для установки в нем контроллера 180 температуры. Контроллер 180 температуры может представлять собой биметаллический переключатель или любое другое соответствующее устройство, которое может активировать и деактивировать нагревательный элемент.

Нагревательный элемент 124 установлен внутри цилиндрической стенки 160 с открытым торцом держателя 150 образца. Как показано на чертеже, нагревательный элемент 124 содержит резистивный провод 125. В качестве альтернативы, нагревательный элемент 124 может представлять собой резистивную катушку, резистивную фольгу и т.д. Длина резистивного провода определяется по температуре резистора и величине сопротивления в омах на длину в футах провода 125.

Контейнер 114 для пробы содержит колпак 142 для пробы и колбу 144 для пробы. Колба для пробы выполнена, в общем, цилиндрической с нижней полостью 145, форма которой позволяет устанавливать в нее штырь 156 контроллера температуры.

Контроллер 192 нагрева поддерживает в образце постоянный заданный температурный диапазон. В случае необходимости он может содержать таймер (не показан) для измерения времени инкубации от ее начала и до отключения нагрева в конце заданного времени.

Система спектрофотометра устройства 112 аналогична этой системе устройства 12 в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения. Излучающий свет источник 130а излучает свет в направлении стрелки 1, и детектор 135а детектирует излучаемый или рассеянный свет, распространяющийся в направлении стрелки 2. Излучающий свет источник 130b излучает свет в направлении стрелки 4, и детектор 135b детектирует излучаемый или рассеянный свет, распространяющийся в направлении стрелки 5. Излучающий свет источник 130с излучает свет в направлении стрелки 3, и детектор 135 детектирует свет, распространяющийся в направлении стрелки 3. Система спектрофотометра также включает в себя контроллер 194 спектрофотометра, предназначенный для управления работой источниками 130а-с света и детекторами 135а-с, а также источниками 190 питания.

На фиг. 8-13 иллюстрируется предпочтительный вариант выполнения способа количественного анализа в соответствии с настоящим изобретением.

Способ количественного анализа в соответствии настоящим изобретением основан на понимании того, что существует взаимозависимость между исходной популяцией и популяцией, полученной с течением времени в результате роста. Интервал времени между началом теста (исходная популяция) и популяцией с фиксированным ростом представляет собой функцию исходной популяции, температуры инкубации и среды для роста. Таким образом, если поддерживать постоянными температуру инкубации и среду для роста, время, требуемое для достижения популяции с фиксированным ростом, представляет собой прямую функцию исходной популяции.

Хромогенный/флюорогенный реагент, такой как Readycult ® (Merck KgaA) или Colilert ® (IDEXX) обеспечивает механизм, с помощью которого в настоящем изобретении можно отслеживать и проверять, и измерять популяцию, полученную в результате роста микробов (общее количество колиформ и E.coli), используя процесс фотометрического детектирования. Удельное количество ферментов, образуемых этими организмами (например, галактозидаза (общее количество колиформ) и глюкуронидаза (специфичная для E.coli)), будет метаболизировать индикатор питательных веществ и высвобождать хромофор или флуорофор в жидкую среду. Концентрация хромофоров или флуорофоров в данный момент времени в среде детектирования пропорциональна росту популяции с течением времени, и, следовательно, изменение интенсивности сигнала в результате увеличения концентрации компонентов цвета представляет собой меру роста популяции в зависимости от времени.

Время (t _pop ) детектирования популяции, которое определяется как время, требуемое для достижения детектируемого размера популяции, используется для оценки параметров роста бактерий. Было определено, что время детектирования является обратно пропорциональным логарифму уровня инокулята (исходной популяции микробов).

где Х ₀ =исходная популяции бактерий.

Время существенного отклонения (ВСО, TSD) представляет собой время, при котором величина измеренного фотометрического сигнала выше сигнала базовой линии становится статистически существенной. TSD также зависит от исходной концентрации бактерий в образце и чем выше величина исходного подсчета бактерий, тем короче TSD. Так как увеличение размера популяции можно измерять, используя увеличение выходного сигнала, время, требуемое для получения существенного отклонения (TSD) выходного сигнала от базовой линии, должно соответствовать t _pop , если его измеряют на фазе роста.

Способ представляет собой

и поэтому

Такое уравнение кривой линейной корреляции (УКЛК, LCCE) между TSD и исходной популяцией исследуемых микробов (Х ₀ ) обеспечивает, в дополнение к детектированию присутствия, количественную информацию о популяции бактерий.

На фиг. 8 показана блок-схема последовательности операций, описывающая этапы способа, составляющего предмет изобретения. На этапе 200 реагент 20 смешивают с образцом 11 жидкости, имеющим неизвестную исходную популяцию микробиологического материала в контейнере 14 для пробы, создавая, таким образом, смесь образца/реагента. Реагент 20 обеспечивает детектируемый параметр, такой как цвет или флуоресценция, который представляет собой показатель микробиологического материала. На этапе 202 контейнер 14 для пробы размещают внутри корпуса 15, и колпак 50 устанавливают на корпус 15. На этапе 204 инициируют процесс инкубации, и смесь образца/реагента подвергают инкубации в закрытом корпусе при неизменной температуре в течение определенного периода времени.

На этапе 206 начинают сбор данных, и изменение детектируемого параметра измеряют по мере того, как происходит инкубация смеси образца/реагента с течением времени. Эти изменения измеряют путем пропускания света с известной интенсивностью через смесь образца/реагента в контейнере 14 для пробы и детектирования изменения интенсивности света в течение периода инкубации.

Во время периода инкубации данные, относящиеся ко времени, температуре и фотометрическому сигналу, обозначающему изменение интенсивности света, собирают с помощью контроллера 94 спектрофотометра. Увеличение популяции микробов с течением времени сопровождается увеличением фотометрического сигнала. Таким образом, формируют кривую роста микробов в режиме реального времени, такую, как показано на фиг. 9. На этапе 208 тестирование прекращают, и собранные данные сохраняют в запоминающем устройстве микропроцессора 95 контроллера 94 спектрофотометра.

На этапе 210 данные загружают во внешний регистратор 80 данных, предпочтительно компьютер 85, в котором установлено специализированное программное средство. В этапе 212 компьютер 80 обрабатывает данные и отображает результат как в графическом формате, так и в формате таблицы. На фиг. 10 иллюстрируются кривые роста всех выбранных параметров типичного образца, записанные в режиме реального времени или загруженные из устройства 12, а также профиль температуры инкубации. Вертикальные значения, расположенные с левой стороны, обозначают интенсивность сигнала (произвольные цифры). С правой стороны показана температура в °С (градусах Цельсия). Нижняя горизонтальная шкала представляет время в часах. На фиг. 11 иллюстрируется таблица данных, которая содержит значения сигналов параметра, вместе с временем и температурой для типичного образца.

На этапе 214 программное средство компьютера 85 автоматически рассчитывает TSD на основе заданного значения фотометрического сигнала, превышающего значение сигнала базовой линии, определенного лаборантом. На этапе 216 встроенное, заранее определенное уравнение кривой линейной корреляции используется для расчета исходной популяции (выраженной в колониеобразующих единицах (КОЕ, CFU) в заданном объеме образца) исследуемого микробиологического параметра. Для получения этого уравнения кривой линейной корреляции выполняют тесты с последовательностью разделенных образцов с различной исходной микробной популяцией (например, E.coli), одновременно используя способ в соответствии с настоящим изобретением и стандартный способ (мембранной фильтрации). Заданное уравнение кривой линейной корреляции (LCCE) формируют путем построения графика значений TSD, полученных в соответствии с настоящим изобретением, и соответствующих значений (Х ₀ ) исходной популяции, полученных с помощью способа мембранной фильтрации. Кривая линейной корреляции образца показана на фиг. 12.

На этапе 218 исходные значения популяции отображают на экране компьютера, так как показано на фиг. 13.

Способ в соответствии с настоящим изобретением соответствующим образом обеспечивает непрерывный, неинтрузивный мониторинг и запись одного или больше детектируемых параметров по мере того, как проходит процесс инкубации. Существенное отклонение выходного сигнала представляет собой показатель присутствия детектируемого параметра, в то время как время, требуемое для достижения существенного отклонения, обеспечивает количественный анализ этого параметра.

На фиг. 14а и 14b иллюстрируются алгоритмы управления нагревом и температурой и сбора данных контроллеров 92 и 94. При нажатии на выключатель 13 питания на командном этапе 300 инициируется программа 92 контроллера.

На командном этапе 305 контроллеры 92 и 94 выполняют проверку качества для проверки правильности функционирования систем инкубации и детектирования и компонентов.

На командном этапе 310, если присутствует логическое "Да", контроллеры 92 и 94 переходят к этапу 320. Если присутствует логическое "Нет", контроллеры включают соответствующие светодиоды для подачи сигнала "Неисправный модуль".

На командном этапе 320 контроллер 92 через элемент 24 нагрева нагревает образец 11 в контейнере 14 и в течение заданного интервала отслеживает температуру образца 11 через датчик 25 температуры.

Если на командном этапе 330 присутствует логическое "Нет", контроллер 92 продолжает нагрев и мониторинг температуры образца 11 в контейнере 14.

Если на командном этапе 330 присутствует логическое "Да", тогда температура образца 11 достигла заданного значения температуры, измеренного с помощью датчика 25 температуры. Контроллер 92 тогда устанавливает нулевое время теста и продолжает отслеживать температуру образца 11 в контейнере 14. Контроллер 92 также начинает отслеживать время.

Если на командном этапе 350 получают логическое "Нет", контроллер 95 продолжает нагрев и мониторинг температуры образца 11.

Если на командном этапе 350 получают логическое "Да", контроллер 92 переводит обработку на этап 355 и прекращает нагрев образца 11 в контейнере 14, и переводит обработку на командный этап 365.

На командном этапе 365 контроллер 92 начинает сбор значений температуры и данных времени, в то время как контроллер 94 начинает сбор данных сигнала. Контроллер 92 также инициирует цикл 1 управления температурой для поддержания температуры инкубации в заданном диапазоне. Если на этапе 400 внутри цикла 1 присутствует логическое "Да", тогда контроллер возвращает обработку назад на этап 355 и продолжает работу цикла.

Если на этапе 400 присутствует логическое "Нет", тогда контроллер переводит обработку на командный этап 410 и инициирует нагрев образца 11 в контейнере 14. Цикл 2 продолжается до тех пор, пока на этапе 400 не появится логическое "Да" и обработка возвратится обратно к циклу 1.

Независимо от логических циклов 1 и 2 оба контроллера 92 и 94 продолжают собирать свои соответствующие данные через заданные интервалы времени и сохранять эти данные в запоминающем устройстве процессора.

На этапе 370 показания индикаторных светодиодов 97 обновляют для индикации хода тестирования.

Если на командном этапе 375 получают логическое "Нет", контроллеры 92 и 94 возвращают обработку на командный этап 365 и продолжают сбор данных, инициируя таким образом цикл сбора данных - цикл 3. Если на этапе 375 получают логическое "Да", тогда тест считается законченным и контроллеры 92 и 94 прекращают мониторинг и сбор данных и выключают как систему инкубации, так и систему детектирования, и переходят на командный этап 385 в режим ожидания (дежурный режим), и ожидают дальнейших инструкций от пользователя или лаборанта.

Способы и устройство изобретения в соответствии с предметом изобретения обеспечивают множество преимуществ по сравнению со стандартными способами мембранной фильтрации. Способы и устройство в соответствии с предметом изобретения обеспечивают быстрый, но простой, надежный и точный выполняемый на месте тест микробиологического материала в различных типах образцов жидкости, включая питьевую воду и рекреационную воду. Другие преимущества включают в себя меньшее количество помех, связанных со степенью помутнения, отсутствие необходимости в разбавлении благодаря большому динамическому аналитическому диапазону, упрощенной работе, благодаря полной автоматизации и встроенному контролю качества (КК, QC), что обеспечивает автоматический QC для каждого теста.

Следует понимать, что различные модификации могут быть выполнены в отношении описанных здесь вариантов выполнения способов и устройств. Хотя система спектрофотометра в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения содержит три спектрофотометра, следует понимать, что устройство может содержать другое количество спектрофотометров. Кроме того, пространственная конфигурация источников-детекторов может быть существенно изменена без выхода за пределы настоящего изобретения. Кроме того, каждый спектрофотометр может быть выполнен с возможностью детектирования разных параметров теста и может работать независимо или одновременно.

Также следует понимать, что излучающие свет источники не ограничиваются светодиодами (вместо них также можно использовать лазеры или лазерные диоды), и детекторы не ограничиваются фототранзисторами (вместо них можно использовать фотодиоды, фоторезисторы, CCD (ПЗС, прибор с зарядовой связью) и т.д.).

Кроме того, способ в соответствии с настоящим изобретением не ограничивается детектируемыми параметрами в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения, поскольку настоящий способ можно использовать для детектирования излучения света, получаемого в результате процессов биолюминесценции или хемилюминесценции, в результате наличия биологического или химического компонента в реагенте 20, в контейнере 14 для пробы. Это может обеспечить возможность использования способа и устройства в соответствии с настоящим изобретением для исследований токсичности с применением биолюминесцентных бактерий.

Кроме того, излучающий свет источник и детектор любого или всех спектрофотометров может быть расположен за пределами камеры 65 инкубации-детектирования, но внутри устройства 10, и может использоваться для мониторинга роста сигнала с применением оптоволоконных средств, в общем, установленных внутри камеры 65.

В соответствии с этим, различные модификации могут быть выполнены в описанных и представленных здесь вариантах выполнения изобретения без выхода за пределы настоящего изобретения, объем которого определен в приложенной формуле изобретения.