1. Конъюгат с антиопухолевой активностью, включающий IL-12 и по меньшей мере 1 опухоленацеливающий модуль, содержащий NGR звено.

2. Конъюгат по п.1, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой опухолево-сосудистый нацеливающий модуль.

3. Конъюгат по п.1 или 2, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, циклоCVLNGRMEC, линейный или циклический CNGRC.

4. Конъюгат по одному из пп.1-3, в котором опухоленацеливающий модуль связан с IL-12 через спейсер.

5. Конъюгат по одному из пп.1-4, представленный в форме слитого белка.

6. Конъюгат по одному из пп.1-5, представленный в форме нуклеиновой кислоты.

7. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6.

8. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.7.

9. Способ получения конъюгата, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 при условиях, обеспечивающих экспрессию конъюгата.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая антиопухолевой активностью, содержащая конъюгат по одному из пп.1-6 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, содержащая в качестве другого противоопухолевого агента доксорубицин или мелфалан.

13. Применение конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12 для получения медикамента для лечения или диагностики рака.

14. Способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, эффективного количества конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12.

 

(57) Реферат / Формула:
Конъюгат с антиопухолевой активностью, включающий IL-12 и по меньшей мере 1 опухоленацеливающий модуль, содержащий NGR звено.

2. Конъюгат по п.1, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой опухолево-сосудистый нацеливающий модуль.

3. Конъюгат по п.1 или 2, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, циклоCVLNGRMEC, линейный или циклический CNGRC.

4. Конъюгат по одному из пп.1-3, в котором опухоленацеливающий модуль связан с IL-12 через спейсер.

5. Конъюгат по одному из пп.1-4, представленный в форме слитого белка.

6. Конъюгат по одному из пп.1-5, представленный в форме нуклеиновой кислоты.

7. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6.

8. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.7.

9. Способ получения конъюгата, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 при условиях, обеспечивающих экспрессию конъюгата.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая антиопухолевой активностью, содержащая конъюгат по одному из пп.1-6 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, содержащая в качестве другого противоопухолевого агента доксорубицин или мелфалан.

13. Применение конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12 для получения медикамента для лечения или диагностики рака.

14. Способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, эффективного количества конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12.

 

---

009955
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции и ее использованию.
Предпосылки создания изобретения
Рост опухоли и масса представляют главные ограничивающие факторы для успешной иммунотерапии. Хирургическое лечение, химиотерапия и лучевое лечение используются обычно для уменьшения размеров опухолей с различным успехом, зависящим от локализации опухоли, ее диффузии и собственной устойчивости к лечению. Несмотря на измеримое улучшение в выживаемости пациентов, эти традиционные методы все еще имеют заметные недостатки. Уменьшение объема опухоли с помощью хирургии может быть эффективным при удалении первичной опухолевой массы, но является ограниченно пригодным при распространенных метастатических опухолях. С другой стороны, химиотерапия может быть связана с риском выбора резистентных вариантов, которые затем становятся неизлечимыми. Кроме того, химиотерапия обычно очень токсична для пациентов и имеет сильные иммунодепрессивные эффекты. По этим причинам необходимо развивать новые подходы к лечению рака, основанные на различных принципах, обладающие низкой токсичностью и высокой эффективностью в искоренении распространенных поражений.
Противоопухолевая активность некоторых цитокинов описана. Некоторые цитокины уже используются для лечения людей. Например, цитокины, такие как IL-2 и IFN-y, показали хорошую противоопухолевую активность у пациентов с различными типами опухолей, такими как метастатическая карцинома почки, лейкоз ворсистых клеток, саркома Капоши, меланома, множественная миелома и похожие. Другие цитокины, подобные IFNp, фактору некроза опухоли (TNF)a, TNFp, IL-1, 4, 6, 12, 15 и колониести-мулирующим факторам (CSFs), показали определенную противоопухолевую активность на некоторых типах опухолей.
Вообще, терапевтическое использование цитокинов сильно ограничено их системной токсичностью. TNF, например, был первоначально обнаружен по его способности вызывать геморрагический некроз некоторых опухолей и по его in vitro цитотоксическому эффекту на различных опухолевых линиях, но впоследствии доказали, что он имеет сильную провоспалительную активность, которая может, при определенных условиях, нанести серьезный вред телу человека.
Поскольку системная токсичность является основной проблемой в использовании фармакологически активных количеств цитокинов у человека, оцениваются новые производные и терапевтические стратегии, направленные на уменьшение токсических эффектов этого класса биологических действующих веществ при сохранении их терапевтической эффективности.
Некоторые новые подходы направлены на:
a) создание слитых белков, которые могут доставлять TNF в опухоль и повышать местную концентрацию. Например, были получены слитые белки, состоящие из TNF и опухолево-специфичных антител;
b) разработка мутантов TNF, которые сохраняют противоопухолевую активность и имеют пониженную системную токсичность. Таким образом, были получены мутанты, способные селективно распознавать только один рецептор;
c) использование анти-TNF антител, способных понижать некоторые токсические эффекты TNF без изменения его противоопухолевой активности. Такие антитела уже описаны в литературе;
d) использование производных TNF с повышенным периодом полураспада (например, TNF, конъю-гированный с полиэтиленгликолем).
В ЕР 251494 раскрыта система для ведения диагностического или терапевтического агента, которая содержит антитело, конъюгированное с авидином или стрептавидином, агент, способствующий комплек-сообразованию конъюгированного антитела, и вещество, состоящее из диагностического или терапевтического агента, конъюгированного с биотином, которые вводили последовательно и в достаточной мере медленно для того, чтобы сделать возможной локализацию терапевтического или диагностического агента через биотин-стрептавидиновое взаимодействие на клетке-мишени, распознаваемой антителом. Описанные терапевтические или диагностические агенты содержат хелаты металлов, в частности хелаты радионуклидов, и низкомолекулярные противоопухолевые агенты, такие как цисплатин, доксорубицин, и т.д.
В ЕР 496074 раскрыт способ, который предлагает последовательное введение биотинилированного антитела, авидина или стрептавидина и биотинилированного диагностического или терапевтического агента. Хотя, в общем, указывается цитотоксичность агентов, подобных рицину, заявка, главным образом, относится к радиолабильным соединениям.
В WO 95/15979 раскрыт способ локализации высокотоксичных агентов на клеточных мишенях, основанный на введении первого конъюгата, содержащего специфическую молекулу-мишень, конъюгиро-ванную с лигандом или антилигандом, с последующим введением второго конъюгата, состоящего из токсичного агента, связанного с антилигандом или лигандом.
В WO 99/13329 раскрыт способ направления молекулы к опухолевым ангиогенным сосудам, основанный на конъюгации указанной молекулы с лигандами NGR рецепторов. В качестве возможных кандидатов рассматривался ряд молекул, но подробно описан только доксорубицин. Не раскрыто использование лигандов NGR рецепторов в качестве носителей цитокинов для вызова иммунного ответа.
- 1 -
009955
В WO 01/61017 изобретатель описывает, как неожиданно он нашел, что терапевтический показатель определенных цитокинов может быть значительно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть усилены путем связывания с лигандом рецептора N-аминопептидазы (CD 13). CD 13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, который хорошо сохраняется в различных видах. Его экс-прессировали на нормальных клетках, а также в миелоидные опухолевые линии, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. CD13 рецептор обычно идентифицируется как "NGR" рецептор, так как его пептидные лиганды разделяют аминокислоты звена "NGR".
Halin С. et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 264-269 описывают слитый белок, состоящий из IL-12, слитый с фрагментом человеческого антитела, специфичного к ED-B домену фибронектина. Carnemolla et al. (2002) Blood 99 (5): 1659-65 описывают слитый белок из IL-2 и антитела к ED-B.
Corti A. et al. (1998) Cancer Research 58: 3866-3872 раскрывают непрямой подход или "преваритель-но нацеливающий" подход к хомингу TNF к опухолям, включающий предварительное нацеливание опухоли с биотинилированными антителами и авидином или стрептавидином с последующей замедленной доставкой биотинилированного TNF.
Hoogenboom et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 1027-1037 описывают слитый белок, сконструированный путем слияния части тяжелой цепи гена антитрансферринового рецептора mAb с TNF-a геном. Yang et al. (1995) Hum. Antibod. Hybrodomas 6: 129-136 описывают слияние N-конца TNF с С-концом шарнирной области mAb против опухолеассоциированного TAG72 антигена, экспрессируемого колоректальной аденокарциномой, аденокарциномами желудка и яичника. Yang et al. (1995) Mol. Immunol. 32: 873-881 описывают получение моновалентного Fv-TNF слитого белка с TAG72 антигеном. Насколько нам известно, не сообщалось никаких данных об активности этих конъюгатов in vivo.
Xiang et al. (1993) Cancer Biother. 8: 327-337 описывают рекомбинантную бифункциональную молекулу одноцепочечного Fv, направленную к TAG72 и IFN-y; и Xiang et al. (1994) Immun. Cell Biol. 72: 275285 описывают рекомбинантную бифункциональную молекулу одноцепочечного Fv, направленную к
TAG72 и IL-2.
Однако остается потребность в дальнейшем и в улучшенных фармацевтических композициях и в способах лечения и диагностики рака.
Мы нашли, что концепция нацеленной доставки цитокинов является широко применимой и неожиданно увеличивает терапевтический индекс химиотерапевтических лекарственных средств. Вследствие сложности мультивалентных взаимодействий, необходимых для работы этих конъюгатов (нацеливающий рецептор, TNF рецепторы), не очевидно, что сосудистые рецепторы, отличные от CD13, могут работать.
Изложение изобретения
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предлагается конъюгат цитокина и опухоленаце-ливающего модуля (ТТМ), при условии, что, когда цитокин является TNF-a, TNF-p или IFN-y, ТТМ является другим, чем CD13 лиганд; когда цитокин является IL-2 или IL-12, ТТМ является другим, чем антитело к фибронектину; когда цитокин является TNF, ТТМ является другим, чем антитело к трансферри-новому рецептору; когда цитокин является TNF, IFN-y или IL-2, ТТМ является другим, чем антитело к TAG72 антигену; когда цитокин является IFN, ТТМ является другим, чем лиганд avp3 интегрина; когда цитокин является TNF, ТТМ является другим, чем фибронектин.
В другом варианте осуществления конъюгат является небиотинилированным TNF.
Предпочтительно цитокин является воспалительным цитокином.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения цитокин является химиотерапев-тическим цитокином.
Предпочтительно цитокин является TNFa, TNFp, IFNa, IFNp, IFNy, IL-1, 2, 4, 6, 12, 15, EMAP II, сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), PDGF, PD-ECGF или хемокином.
В одном варианте осуществления изобретения цитокин представляет собой TNFa, TNFp или IFNy.
Соединение-мишень может быть экспрессированно либо на поверхности эндотелиальных клеток опухолевых сосудов, либо во внеклеточном матриксе в тесном контакте или по соседству с эндотелиаль-ными клетками.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является опухолево-сосудистым нацеливающим модулем (TVTM).
В другом варианте осуществления изобретения TVTM является связывающим партнером опухолевого сосудистого рецептора, маркера или другого внеклеточного компонента.
В другом варианте осуществления изобретения ТТМ является связывающим партнером опухолевого рецептора, маркера или другого внеклеточного компонента.
В другом варианте осуществления изобретения ТТМ представляет собой антитело или лиганд или их фрагменты.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит NGR или RGD звено, или представляет собой HIV-tat, аннексин V, остеопонтин, фибронектин, коллаген типа I или IV, гиалуронат, эфрин, или является связывающим партнером к онкофетальному фибронектину, или представляет собой их фрагменты. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является другим, чем HIV-tat.
- 2 -
009955
В предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит NGR звено.
Предпочтительно ТТМ представляет собой CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, циклоCVLNGRMEC, линейный или циклический CNGRC.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ТТМ содержит RGD звено.
В одном варианте осуществления изобретения ТТМ нацелен на VEGFR, ICAM 1, 2 или 3, РЕСАМ-1, CD31, CD13, VCAM-1, селектин, ActRII, ActRIIB, ActRI, ActRIB, CD44, аминопептидазу А, аминопеп-тидазу N (CD13), avp3 интегрин, avp5 интегрин, FGF-1, 2, 3, или 4, IL-1R, EPHR, MMP, NG2, тенасцин, онкофетальный фибронектин, PD-ECGFR, TNFR, PDGFR или PSMA. В другом варианте осуществления изобретения ТТМ не нацелен на VEGFR.
Предпочтительно конъюгат представлен в форме слитого белка.
В другом варианте осуществления изобретения конъюгат представлен в форме нуклеиновой кислоты.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предлагается способ получения конъюгата, включающий культивирование заявленной клетки-хозяина при условиях, обеспечивающих экспрессию конъюгата.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция дополнительно содержит другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.
Предпочтительно другим противоопухолевым агентом является доксорубицин или мелфалан.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предлагается использование конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения медикамента для лечения или диагностики рака.
Предлагая другой путь, настоящее изобретение предлагает способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, эффективного количества конъюгата или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Комбинации предпочтительных нацеливающих модулей и цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, приведены в нижеследующей табл. А.
Таблица А
Цитокин
Нацеливающий МОДУЛЬ
IFN-a
RGD- содержащий пептид
IFN-p
RGD- содержащий пептид
IL-2
RGD- содержащий пептид
IL-12
RGD- содержащий пептид
EMAP II
R.GD- содержащий пептид
VEGF
RGD- содержащий пептид
IL-1
RGD- содержащий пептид
IL-6
RGD- содержащий пептид
IL-12
RGD- содержащий пептид
PDGF
RGD- содержащий пептид
PD-ECGF
RGD- содержащий пептид
CXC хемокин
RGD- содержащий пептид
CC хемокин
RGD- содержащий пептид
С хемокин
RGD- содержащий пептид
IL-15
RGD- содержащий пептид
TNF-a
NGR- содержащий пептид
TNF-p
NGR- содержащий пептид 1
IFN-a
NGR- содержащий пептид
IFN-p
NGR- содержащий пептид
IFN-y
NGR- содержащий пептид
IL-2
NGR- содержащий пептид
IL-12
NGR- содержащий пептид
- 3 -
009955
EMAP 11
NGR- содержащий пептид
VEGF
NGR- содержащий пептид
IL-1
NGR- содержащий пептид
IL-6
NGR- содержащий пептид
IL-12
NGR- содержащий пептид
PDGF
NGR- содержащий пептид
PD-ECGF
NGR- содержащий пептид
CXC хемокин
NGR- содержащий пептид
CC хемокин
NGR- содержащий пептид
С хемокин
NGR- содержащий пептид
IL-15
NGR- содержащий пептид
TNF-a
Лиганд VEGFR
TNF-p
Лиганд VEGFR
IFN-a
Лиганд VEGFR
IFN-p
Лиганд VEGFR
IFN-y
Лиганд VEGFR
IL-2
Лиганд VEGFR
IL-12
Лиганд VEGFR
EMAP II
Лиганд VEGFR
VEGF
Лиганд VEGFR
IL-1
Лиганд VEGFR
IL-6
Лиганд VEGFR
IL-12
Лиганд VEGFR
PDGF
Лиганд VEGFR
PD-ECGF
Лиганд VEGFR
CXC хемокин
Лиганд VEGFR
CC хемокин
Лиганд VEGFR
С хемокин
Лиганд VEGFR
IL-15
Лиганд VEGFR
TNF-a
AT К VEGFR
TNF-p
AT К VEGFR
IFN-a
AT К VEGFR
IFN-p
ATкVEGFR
IFN-y
AT К VEGFR
IL-2
AT К VEGFR
IL-12
AT К VEGFR
EMAP II
AT К VEGFR
VEGF
AT к VEGFR
IL-I
AT К VEGFR
IL-6
ATкVEGFR
IL-12
AT К VEGFR
PDGF
AT К VEGFR
PD-ECGF
AT к VEGFR
CXC хемокин
AT К VEGFR
CC хемокин
AT К VEGFR
С хемокин
AT к VEGFR
IL-15
AT к VEGFR
TNF-a
HIV-tat
- 4 -
009955
TNF-P
HIV-tat
IFN-a
HIV-tat
IFN-P
HIV-tat
IFN-y
HIV-tat
IL-2
HIV-tat
IL-12
HIV-tat
EMAP II
HIV-tat
VEGF
HIV-tat
IL-1
HIV-tat
IL-6
HIV-tat
IL-12
HIV-tat
PDGF
HIV-tat
PD-ECGF
HIV-tat
CXC хемокин
HIV-tat
CC хемокин
HIV-tat
С хемокин
HIV-tat
IL-15
HIV-tat
TNF-a
Лиганд 1С AM 1,2 или 3
TNF-P
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IFN-a
Лиганд 1С AM 1,2 или 3
IFN-P
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IFN-y
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IL-2
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IL-12
Лиганд ICAM 1,2 или 3
EMAP II
Лиганд ICAM 1,2 или 3
VEGF
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IL-1
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IL-6
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IL-12
Лиганд ICAM 1,2 или 3
PDGF
Лиганд ICAM 1,2 или 3
PD-ECGF
Лиганд ICAM 1,2 или 3
CXC хемокин
Лиганд ICAM 1,2 или 3
CC хемокин
Лиганд ICAM 1,2 или 3
С хемокин
Лиганд ICAM 1,2 или 3
IL-15
Лиганд ICAM 1,2 или 3
TNF-a
АткГСАМ 1,2 илиЗ
TNF-p
АткГСАМ 1,2 или 3
IFN-a
АткГСАМ 1,2 или 3
IFN-p
АткГСАМ 1,2 или 3
IFN-y
Ат к ICAM 1,2 или 3
IL-2
АткГСАМ 1,2 или 3
IL-12
АткГСАМ 1,2 или 3 ]
EMAP II
Ат к ICAM 1,2 или 3
VEGF
АткГСАМ 1,2 или 3
IL-1
АткГСАМ 1,2 или 3
IL-6
Ат к ICAM 1,2 или 3
IL-12
АткГСАМ 1,2 или 3
PDGF
Ат к ICAM 1,2 или 3
- 5 -
009955
PD-ECGF
Ат к ICAM 1,2илиЗ
CXC хемокин
Ат к ICAM 1,2 или 3
CC хемокин
Ат к ICAM 1,2 или 3
С хемокин
Ат к ICAM 1,2 или 3
IL-15
Ат к ICAM 1,2 или 3
TNF-a
Лиганд PECAM-1/CD31
TNF-P
Лиганд PECAM-1/CD31
IFN-a
Лиганд PEC AM- 1/CD31
IFN-P
Лиганд PECAM-1/CD31
IFN-y
ЛигандРЕСАМ-1/С031
IL-2
Лиганд PECAM-1/CD31
IL-12
Лиганд PECAM-1/CD31
EMAP II
Лиганд PEC AM-1/CD31
VEGF
Лиганд PECAM-1/CD31
IL-1
Лиганд PECAM-1/CD31
IL-6
Лиганд PEC AM-1/CD31
IL-12
Лиганд PECAM-1/CD31
PDGF
Лиганд PECAM-1/CD31
PD-ECGF
Лиганд PECAM-1/CD31
CXC хемокин
Лиганд PECAM-1/CD31
CC хемокин
Лиганд PECAM-1/CD31
С хемокин
Лиганд РЕСАМ-1 /CD31
IL-15
Лиганд PECAM-1/CD31
TNF-a
Ат к PECAM-1/CD31
TNF-P
Ат к РЕСАМ-1 /CD31
IFN-a
Ат к PECAM-1/CD31
IFN-P
Ат к PECAM-1/CD31
IFN-y
Ат к PECAM-1/CD31
IL-2
Ат к PECAM-1/CD31
IL-12
Ат к РЕСАМ-1/CD31
EMAP II
ATKPECAM-1/CD31
VEGF
Ат к PECAM-1/CD31
IL-1
ATKPECAM-1/CD31
IL-6
ATKPECAM-1/CD31
IL-12
AT К PECAM-1/CD31
PDGF
Ат К РЕСАМ-1 /CD31
PD-ECGF
Ат к PECAM-1/CD31
CXC хемокин
Ат к PECAM-1/CD31
CC хемокин
ATKPECAM-1/CD31
С хемокин
Ат к PECAM-1/CD31
IL-15
ATKPECAM-1/CD31
TNF-a
Лиганд VCAM-1
TNF-P
Лиганд VCAM-1
IFN-a
Лиганд VC AM-1
IFN-P
Лиганд VCAM-1
IFN-y
Лиганд VCAM-1
IL-2
Лиганд VCAM-1
IL-12
Лиганд VCAM-1
- 6 -
009955
EMAP II
Лиганд VCAM-1
VEGF
Лиганд VCAM-1
IL-1
Лиганд VCAM-1
IL-6
Лиганд VCAM-1
IL-12
Лиганд VCAM-1
PDGF
Лиганд VCAM-1
PD-ECGF
Лиганд VCAM-1
CXC хемокин
Лиганд VCAM-1
CC хемокин
Лиганд VCAM-1
С хемокин
Лиганд VCAM-1
IL-15
Лиганд VCAM-1
TNF-a
Ат к VCAM-1
TNF-p
Ат к VCAM-1
IFN-a
Ат к VCAM-1
IFN-P
Ат к VCAM-1
IFN-y
Ат к VCAM-1
IL-2
Ат к VCAM-1
IL-12
Ат к VCAM-1
EMAP II
Ат к VCAM-1
VEGF
AT К VCAM-1
IL-1
Ат к VCAM-1
IL-6
Ат к VCAM-1
IL-12
Ат к VCAM-1
PDGF
_ _
Ат к VCAM-1
PD-ECGF
Ат к VCAM-1
CXC хемокин
Ат к VCAM-1
CC хемокин
Ат к VCAM-1
С хемокин
AT К VCAM-1
IL-15
AT К VCAM-1
TNF-a
Лиганд селектина
TNF-p
Лиганд селектина
IFN-a
Лиганд селектина
IFN-P
Лиганд селектина
IFN-y
Лиганд селектина
IL-2
Лиганд селектина
IL-12
Лиганд селектина
EMAP II
Лиганд селектина
VEGF
Лиганд селектина
IL-I
Лиганд селектина
IL-6
Лиганд селектина
IL-12
Лиганд селектина
PDGF
Лиганд селектина
PD-ECGF
Лиганд селектина
CXC хемокин
Лиганд селектина
CC хемокин
Лиганд селектина
С хемокин
Лиганд селектина
IL-15
Лиганд селектина
TNF-a
Ат к селектину
- 7 -
009955
TNF-P
AT К селектину
IFN-a
Ат К селектину
IFN-P
Ат К селектину
IFN-y
Ат к селектину
IL-2
Ат к селектину
IL-12
Ат к селектину
EMAP II
Ат к селектину
VEGF
Ат к селектину
IL-1
Ат к селектину
IL-6
Ат к селектину
IL-12
Ат к селектину
PDGF
Ат к селектину
PD-ECGF
Ат к селектину
CXC хемокин
Ат к селектину
CC хемокин
Ат к селектину
С хемокин
Ат к селектину
IL-15
Ат к селектину
TNF-a
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
TNF-P
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
IFN-a
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
IFN-P
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
IFN-y
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-2
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-12
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
EMAP II
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
VEGF
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-1
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-6
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
IL-12
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
PDGF
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
PD-ECGF
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
CXC хемокин
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
CC хемокин
Лиганд ActRII, ActPJIB, ActRI или ActRIB
С хемокин
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
- 8 -
009955
IL-15
Лиганд ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
TNF-a
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
TNF-p
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IFN-a
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IFN-P
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IFN-y
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-2
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-12
Ат К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
EMAP II
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
VEGF
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-1
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-6
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-12
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
PDGF
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
PD-ECGF
Ат К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
CXC хемокин
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
CC хемокин
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
С хемокин
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
IL-15
AT К ActRII, ActRIIB, ActRI или ActRIB
TNF-a
Аннексии V
TNF-P
Аннексии V
IFN-a
Аннексии V
IFN-P
Аннексии V
IFN-y
Аннексии V
IL-2
Аннексии V
IL-12
Аннексии V
EMAP II
Аннексии V
VEGF
Аннексии V
IL-1
Аннексии V
IL-6
Аннексии V
IL-12
Аннексии V
PDGF
Аннексии V
PD-ECGF
Аннексии V
CXC хемокин
Аннексии V
CC хемокин
Аннексии V
С хемокин
Аннексии V
IL-15
Аннексии V
TNF-a
Лиганд CD44
TNF-P
Лиганд CD44
IFN-a
Лиганд CD44
IFN-P
Лиганд CD44
IFN-y
Лиганд CD44
IL-2
Лиганд CD44
IL-12
Лиганд CD44
EMAP II
Лиганд CD44
VEGF
Лиганд CD44
IL-1
Лиганд CD44
- 9 -
009955
IL-6
Лиганд CD44
IL-12
Лиганд CD44
PDGF
Лиганд CD44
PD-ECGF
Лиганд CD44
CXC хемокин
Лиганд CD44
CC хемокин
Лиганд CD44
С хемокин
Лиганд CD44
IL-15
Лиганд CD44
TNF-a
Ат к CD44
TNF-P
Ат к CD44
IFN-a
Ат к CD44
IFN-p
Ат к CD44
IFN-y
Ат к CD44
IL-2
Ат к CD44
IL-12
Ат к CD44
EMAP II
Ат к CD44
VEGF
Ат к CD44
IL-1
Ат к CD44
IL-6
Ат к CD44
IL-12
Ат к CD44
PDGF
Ат к CD44
PD-ECGF
Ат к CD44
CXC хемокин
Ат к CD44
CC хемокин
Ат к CD44
С хемокин
Ат к CD44
IL-15
Ат к CD44
TNF-a
Остеопонтин
TNF-p
Остеопонтин
IFN-a
Остеопонтин
IFN-P
Остеопонтин
IFN-y
Остеопонтин
IL-2
Остеопонтин
IL-12
Остеопонтин
EMAP II
Остеопонтин
VEGF
Остеопонтин
IL-1
Остеопонтин
IL-6
Остеопонтин
IL-12
Остеопонтин
PDGF
Остеопонтин
PD-ECGF
Остеопонтин !
CXC хемокин
Остеопонтин
CC хемокин
Остеопонтин
С хемокин
Остеопонтин
IL-15
Остеопонтин
TNF-a
Фибронектин |
TNF-P
Фибронектин '
IFN-a
Фибронектин |
IFN-P
Фибронектин
- 10 -
009955
IFN-y
Фибронектин
IL-2
Фибронектин
IL-12
Фибронектин
EMAP II
Фибронектин
VEGF
Фибронектин
IL-1
Фибронектин
IL-6
Фибронектин
IL-12
Фибронектин
PDGF
Фибронектин
PD-ECGF
Фибронектин
CXC хемокин
Фибронектин
CC хемокин
Фибронектин
С хемокин
Фибронектин
IL-15
Фибронектин
TNF-a
Коллаген типа I или IV
TNF-p
Коллаген типа I или IV
IFN-a
Коллаген типа I или IV
IFN-P
Коллаген типа I или IV
IFN-y
Коллаген типа I или IV
IL-2
Коллаген типа I или IV
IL-12
Коллаген типа I или IV
EMAP II
Коллаген типа I или IV
VEGF
Коллаген типа I или IV
IL-1
Коллаген типа I или IV
IL-6
Коллаген типа I или IV
IL-12
Коллаген типа I или IV
PDGF
Коллаген типа I или IV
PD-ECGF
Коллаген типа I или IV
CXC хемокин
Коллаген типа I или IV
CC хемокин
Коллаген типа I или IV
С хемокин
Коллаген типа I или IV
IL-15
Коллаген типа I или IV
TNF-a
Гиалуронат
TNF-p
Гиалуронат
IFN-a
Гиалуронат
IFN-p
Гиалуронат
IFN-y
Гиалуронат
IL-2
Гиалуронат
IL-12
Гиалуронат
EMAP II
Гиалуронат
VEGF
Гиалуронат
IL-1
Гиалуронат
IL-6
Гиалуронат
IL-12
Гиалуронат
PDGF
Гиалуронат
PD-ECGF
Гиалуронат
CXC хемокин
Гиалуронат
CC хемокин
Гиалуронат
- 11 -
009955
С хемокин
Гиалуронат
IL-15
Гиалуронат
TNF-a
Лиганд FGF-1,2,3 или 4
TNF-p
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
IFN-a
Лиганд FGF-1,2, 3 или 4
IFN-P
Лиганд FGF-1,2, 3 или 4
IFN-y
Лиганд FGF-1,2,3 или 4
IL-2
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
IL-12
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
EMAP II
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
VEGF
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
IL-1
Лиганд FGF-1,2, 3 или 4
IL-6
Лиганд FGF-1, 2, 3 или 4
IL-12
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
PDGF
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
PD-ECGF
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
CXC хемокин
Лиганд FGF-1,2, 3 или 4
CC хемокин
Лиганд FGF-1,2,3 или 4
С хемокин
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
IL-15
Лиганд FGF-1, 2,3 или 4
TNF-a
ATKFGF-1,2, Зили4
TNF-p
ATKFGF-1,2, Зили4
IFN-a
Ат к FGF-1,2,3 или 4
IFN-P
ATKFGF-1,2,3MH4
IFN-y
ATKFGF-1,2, 3 или4
IL-2
Ат к FGF-1,2, Зили4
IL-12
Ат к FGF-1, 2,3 или 4
EMAP II
Ат к FGF-1,2,3 или 4
VEGF
ATKFGF-1,2, 3 или 4
IL-1
Ат к FGF-1,2,3 или 4
IL-6
Ат к FGF-1, 2,3 или 4
IL-12
ATKFGF-1,2, 3 или 4
PDGF
ATKFGF-1,2, 3 или4
PD-ECGF
ATKFGF-1,2, 3 или 4
CXC хемокин
ATKFGF-1,2, 3 или 4
CC хемокин
ATKFGF-1,2, 3 или 4
С хемокин
Ат к FGF-1,2,3 или 4
IL-15
ATKFGF-1,2,3(tm)H4
TNF-a
Лиганд IL-1 R
TNF-p
Лиганд IL-1 R
IFN-a
Лиганд IL-1R
IFN-p
Лиганд IL-1R
IFN-y
Лиганд IL-1R
IL-2
Лиганд IL-1R
IL-12
Лиганд IL-1 R
EMAP II
Лиганд IL-1R
VEGF
Лиганд IL-1R
IL-1
Лиганд IL-1 R
- 12 -
009955
IL-6
Лиганд IL-1 R
IL-12
Лиганд IL-1R
PDGF
Лиганд IL-1 R
PD-ECGF
Лиганд IL-1 R
CXC хемокин
Лиганд IL-1R
CC хемокин
Лиганд IL-1 R
С хемокин
Лиганд IL-1 R
IL-15
Лиганд IL-1R
TNF-a
ATKIL-1R
TNF-P
ATKIL-1R
IFN-a
ATKIL-1R
IFN-p
ATKIL-1R
IFN-y
ATKIL-1R
IL-2
AT К IL-1R
IL-12
ATKIL-1R
EMAP II
ATKIL-1R
VEGF
AT к IL-1 R
IL-1
ATKIL-1R
IL-6
ATKIL-1R
IL-12
ATKIL-1R
PDGF
ATKIL-1R
PD-ECGF
ATKIL-1R
CXC хемокин
ATKIL-1R
CC хемокин
ATKIL-1R
С хемокин
ATKIL-1R
IL-15
ATKIL-1R
TNF-a
Лиганд CD31
TNF-p
Лиганд CD31
IFN-a
Лиганд CD31
IFN-P
Лиганд CD31
IFN-y
Лиганд CD31
IL-2
Лиганд CD31
IL-12
Лиганд CD31
EMAP II
Лиганд CD31
VEGF
Лиганд CD31
IL-1
Лиганд CD31
IL-6
Лиганд CD31
IL-12
Лиганд CD31
PDGF
Лиганд CD31
PD-ECGF
Лиганд CD31
CXC хемокин
Лиганд CD31
CC хемокин
Лиганд CD31
С хемокин
Лиганд CD31
IL-15
Лиганд CD31
TNF-a
Ат к CD31
TNF-P
Ат к CD31
IFN-a
Ат к CD31
IFN-P
Ат к CD31
- 13 -
009955
IFN-y
AT К CD31
IL-2
ATKCD31
IL-12
ATKCD31
EMAP II
ATKCD31
VEGF
ATKCD31
IL-1
ATKCD31
IL-6
ATKCD31
IL-12
ATKCD31
PDGF
ATKCD31
PD-ECGF
ATKCD31
CXC хемокин
ATKCD31
CC хемокин
AT К CD31
С хемокин
ATKCD31
IL-15
ATKCD31
TNF-a
Лиганд EPHR
TNF-p
Лиганд EPHR
IFN-a
Лиганд EPHR
IFN-p
Лиганд EPHR
IFN-y
Лиганд EPHR
IL-2
Лиганд EPHR
IL-12
Лиганд EPHR
EMAP II
Лиганд EPHR
VEGF
Лиганд EPHR
IL-1
Лиганд EPHR
IL-6
Лиганд EPHR
IL-12
Лиганд EPHR
PDGF
Лиганд EPHR
PD-ECGF
Лиганд EPHR
CXC хемокин
Лиганд EPHR
CC хемокин
Лиганд EPHR
С хемокин
Лиганд EPHR
IL-15
Лиганд EPHR
TNF-a
AT К EPHR
TNF-p
AT К EPHR
IFN-a
AT К EPHR
IFN-p
AT К EPHR
IFN-y
AT К EPHR
IL-2
AT к EPHR
IL-12
AT К EPHR
EMAP II
AT К EPHR
VEGF
AT К EPHR
IL-1
AT К EPHR
IL-6
AT К EPHR
IL-12
AT К EPHR
PDGF
AT К EPHR
PD-ECGF
AT К EPHR
CXC хемокин
AT К EPHR
CC хемокин
AT К EPHR
- 14 -
009955
С хемокин
Ат к EPHR
IL-15
Ат к EPHR
TNF-a
Эфрин
TNF-p
Эфрин
IFN-a
Эфрин
IFN-P
Эфрин
IFN-y
Эфрин
IL-2
Эфрин
IL-12
Эфрин
EMAP II
Эфрин
VEGF
Эфрин
IL-1
Эфрин
IL-6
Эфрин
IL-12
Эфрин
PDGF
Эфрин
PD-ECGF
Эфрин
CXC хемокин
Эфрин
CC хемокин
Эфрин
С хемокин
Эфрин
IL-15
Эфрин
TNF-a
Лиганд ММР
TNF-p
Лиганд ММР
IFN-a
Лиганд ММР
IFN-p
Лиганд ММР
IFN-y
Лиганд ММР
IL-2
Лиганд ММР
IL-12
Лиганд ММР
EMAP II
Лиганд ММР
VEGF
Лиганд ММР
IL-1
Лиганд ММР
IL-6
Лиганд ММР
IL-12
Лиганд ММР
PDGF
Лиганд ММР
PD-ECGF
Лиганд ММР
CXC хемокин
Лиганд ММР
CC хемокин
Лиганд ММР
С хемокин
Лиганд ММР
IL-15
Лиганд ММР
TNF-a
АткММР
TNF-P
АткММР
IFN-a
Ат к ММР
IFN-P
Ат к ММР
IFN-y
Ат к ММР
IL-2
Ат к ММР
IL-12
Ат к ММР
EMAP II
Ат к ММР
VEGF
Ат к ММР
IL-1
Ат к ММР
- 15 -
009955
IL-6
АткММР
IL-12
AT К ММР
PDGF
АткММР
PD-ECGF
AT К ММР
CXC хемокин
АткММР
CC хемокин
Ат К ММР
С хемокин
Ат к ММР
IL-15
Ат к ММР
TNF-a
Лиганд NG2
TNF-P
Лиганд NG2
IFN-a
Лиганд NG2
IFN-P
Лиганд NG2
IFN-y
Лиганд NG2
IL-2
Лиганд NG2
IL-12
Лиганд NG2
EMAP II
Лиганд NG2
VEGF
Лиганд NG2
IL-1
Лиганд NG2
IL-6
Лиганд NG2
IL-12
Лиганд NG2
PDGF
Лиганд NG2
PD-ECGF
Лиганд NG2
CXC хемокин
Лиганд NG2
CC хемокин
Лиганд NG2
С хемокин
Лиганд NG2
IL-15
Лиганд NG2
TNF-a
Ат к NG2
TNF-p
Ат к NG2
IFN-a
ATKNG2
IFN-P
ATKNG2
IFN-y
ATKNG2
IL-2
ATKNG2
IL-12
AT К NG2
EMAP II
AT К NG2
VEGF
ATKNG2
IL-1
ATKNG2
IL-6
ATKNG2
IL-12
ATKNG2
PDGF
ATKNG2
PD-ECGF
AT К NG2
CXC хемокин
ATKNG2
CC хемокин
ATKNG2
С хемокин
ATKNG2
IL-15
ATKNG2
TNF-a
Лиганд тенасцина
TNF-P
Лиганд тенасцина
IFN-a
Лиганд тенасцина
IFN-p
Лиганд тенасцина
- 16 -
009955
IFN-y
Лиганд тенасцина
IL-2
Лиганд тенасцина
IL-12
Лиганд тенасцина
EMAP II
Лиганд тенасцина
VEGF
Лиганд тенасцина
IL-1
Лиганд тенасцина
IL-6
Лиганд тенасцина
IL-12
Лиганд тенасцина
PDGF
Лиганд тенасцина
PD-ECGF
Лиганд тенасцина
CXC хемокин
Лиганд тенасцина
CC хемокин
Лиганд тенасцина
С хемокин
Лиганд тенасцина
IL-15
Лиганд тенасцина
TNF-a
Ат к тенасцину
TNF-P
Ат к тенасцину
IFN-a
Ат к тенасцину
IFN-P
Ат к тенасцину
IFN-y
Ат к тенасцину
IL-2
Ат к тенасцину
IL-12
Ат к тенасцину
EMAP II
Ат к тенасцину
VEGF
Ат к тенасцину
IL-1
Ат к тенасцину
IL-6
Ат к тенасцину
IL-12
Ат к тенасцину
PDGF
Ат к тенасцину
PD-ECGF
Ат к тенасцину
CXC хемокин
Ат к тенасцину
CC хемокин
Ат к тенасцину
С хемокин
Ат к тенасцину
IL-15
Ат к тенасцину
TNF-a
Лиганд PD-ECGFR
TNF-p
Лиганд PD-ECGFR
IFN-a
Лиганд PD-ECGFR
IFN-P
Лиганд PD-ECGFR
IFN-y
Лиганд PD-ECGFR
IL-2
Лиганд PD-ECGFR
IL-12
Лиганд PD-ECGFR
EMAP II
Лиганд PD-ECGFR
VEGF
Лиганд PD-ECGFR
IL-1
Лиганд PD-ECGFR
IL-6
Лиганд PD-ECGFR
IL-12
Лиганд PD-ECGFR
PDGF
Лиганд PD-ECGFR
PD-ECGF
Лиганд PD-ECGFR
CXC хемокин
Лиганд PD-ECGFR
CC хемокин
Лиганд PD-ECGFR
- 17 -
009955
С хемокин
Лиганд PD-ECGFR
IL-15
Лиганд PD-ECGFR
TNF-a
Ат к PD-ECGFR
TNF-p
AT К PD-ECGFR
IFN-a
Ат к PD-ECGFR
IFN-p
AT К PD-ECGFR
IFN-y
AT К PD-ECGFR
IL-2
AT К PD-ECGFR
IL-12
AT К PD-ECGFR
EMAP II
Ат к PD-ECGFR
VEGF
AT К PD-ECGFR
IL-1
Ат к PD-ECGFR
IL-6
AT К PD-ECGFR
IL-12
AT К PD-ECGFR
PDGF
AT К PD-ECGFR
PD-ECGF
AT К PD-ECGFR
CXC хемокин
Ат к PD-ECGFR
CC хемокин
Ат к PD-ECGFR
С хемокин
AT К PD-ECGFR
IL-15
AT К PD-ECGFR
TNF-a
Лиганд TNFR
TNF-P
Лиганд TNFR
IFN-a
Лиганд TNFR
IFN-p
Лиганд TNFR
IFN-y
Лиганд TNFR
IL-2
Лиганд TNFR
IL-12
Лиганд TNFR
EMAP II
Лиганд TNFR
VEGF
Лиганд TNFR
IL-1
Лиганд TNFR
IL-6
Лиганд TNFR
IL-12
Лиганд TNFR
PDGF
Лиганд TNFR
PD-ECGF
Лиганд TNFR
CXC хемокин
Лиганд TNFR
CC хемокин
Лиганд TNFR
С хемокин
Лиганд TNFR
IL-15
Лиганд TNFR
TNF-a
AT К TNFR
TNF-p
AT К TNFR
IFN-a
Ат к TNFR
IFN-P
AT К TNFR
IFN-y
AT К TNFR
IL-2
AT К TNFR
IL-12
AT К TNFR
EMAP II
Ат к TNFR
VEGF
AT К TNFR
IL-1
AT К TNFR
- 18 -
009955
IL-6
AT К TNFR
IL-12
AT К TNFR
PDGF
Ат к TNFR
PD-ECGF
AT К TNFR
CXC хемокин
Ат к TNFR
CC хемокин
AT К TNFR
С хемокин
AT К TNFR
IL-15
AT К TNFR
TNF-a
Лиганд PDGFR
TNF-p
Лиганд PDGFR
IFN-a
Лиганд PDGFR
IFN-P
Лиганд PDGFR
IFN-y
Лиганд PDGFR
IL-2
Лиганд PDGFR
IL-12
Лиганд PDGFR
EMAP II
Лиганд PDGFR
VEGF
Лиганд PDGFR
IL-1
Лиганд PDGFR
IL-6
Лиганд PDGFR
IL-12
Лиганд PDGFR
PDGF
Лиганд PDGFR
PD-ECGF
Лиганд PDGFR
CXC хемокин
Лиганд PDGFR
CC хемокин
Лиганд PDGFR
С хемокин
Лиганд PDGFR
IL-15
Лиганд PDGFR
TNF-a
AT К PDGFR
TNF-p
AT К PDGFR
IFN-a
ATКPDGFR
IFN-P
AT К PDGFR
IFN-y
AT К PDGFR
IL-2
AT К PDGFR
IL-12
AT К PDGFR
EMAP II
AT К PDGFR
VEGF
AT К PDGFR
IL-1
AT К PDGFR
IL-6
AT К PDGFR
IL-12
AT К PDGFR
PDGF
AT К PDGFR
PD-ECGF
АткPDGFR
CXC хемокин
AT К PDGFR
CC хемокин
AT К PDGFR
С хемокин
AT К PDGFR
IL-15
AT К PDGFR
TNF-a
Лиганд PSMA
TNF-p
Лиганд PSMA
IFN-a
Лиганд PSMA
IFN-P
Лиганд PSMA
- 19 -
009955
IFN-y
Лиганд PSMA
IL-2
Лиганд PSMA
IL-12
Лиганд PSMA
EMAP II
Лиганд PSMA
VEGF
Лиганд PSMA
IL-1
Лиганд PSMA
IL-6
Лиганд PSMA
IL-12
Лиганд PSMA
PDGF
Лиганд PSMA
PD-ECGF
Лиганд PSMA
CXC хемокин
Лиганд PSMA
CC хемокин
Лиганд PSMA
С хемокин
Лиганд PSMA
IL-15
Лиганд PSMA
TNF-a
AT К PSMA
TNF-P
AT К PSMA
IFN-a
AT К PSMA
IFN-p
AT К PSMA
IFN-y
AT К PSMA
IL-2
AT К PSMA
IL-12
AT К PSMA
EMAP II
AT К PSMA
VEGF
Ат К PSMA
IL-1
Ат К PSMA
IL-6
Ат к PSMA
IL-12
AT К PSMA
PDGF
AT К PSMA
PD-ECGF
AT К PSMA
CXC хемокин
Ат К PSMA
CC хемокин
AT К PSMA
С хемокин
Ат К PSMA
IL-15
AT К PSMA
TNF-a
Витронектин
TNF-P
Витронектин
IFN-a
Витронектин
IFN-P
Витронектин
IFN-y
Витронектин
IL-2
Витронектин
IL-12
Витронектин
EMAP II
Витронектин
VEGF
Витронектин
IL-1
Витронектин
IL-6
Витронектин
IL-12
Витронектин
PDGF
Витронектин
PD-ECGF
Витронектин
CXC хемокин
Витронектин
CC хемокин
Витронектин
- 20 -
009955
С хемокин
Витронектин
IL-15
Витронектин
TNF-a
Ламинин
TNF-p
Ламинин
IFN-a
Ламинин
IFN-p
Ламинин
IFN-y
Ламинин
IL-2
Ламинин
IL-12
Ламинин
EMAP II
Ламинин
VEGF
Ламинин
IL-1
Ламинин
IL-6
Ламинин
IL-12
Ламинин
PDGF
Ламинин
PD-ECGF
Ламинин
CXC хемокин
Ламинин
CC хемокин
Ламинин
С хемокин
Ламинин
IL-15
Ламинин
TNF-a
Лиганд онкофетального фибронектина
TNF-p
Лиганд онкофетального фибронектина
IFN-a
Лиганд онкофетального фибронектина
IFN-p
Лиганд онкофетального фибронектина
IFN-y
Лиганд онкофетального фибронектина
IL-2
Лиганд онкофетального фибронектина
IL-12
Лиганд онкофетального фибронектина
EMAP II
Лиганд онкофетального фибронектина
VEGF
Лиганд онкофетального фибронектина
IL-1
Лиганд онкофетального фибронектина
IL-6
Лиганд онкофетального фибронектина
IL-12
Лиганд онкофетального фибронектина
PDGF
Лиганд онкофетального фибронектина
PD-ECGF
Лиганд онкофетального фибронекгина
CXC хемокин
Лиганд онкофетального фибронектина
CC хемокин
Лиганд онкофетального фибронектина
С хемокин
Лиганд онкофетального фибронекгина
IL-15
Лиганд онкофетального фибронектина
TNF-a
Ат к онкофетальному фибронектину
TNF-p
Ат к онкофетальному фибронектину
IFN-a
Ат к онкофетальному фибронектину
IFN-p
Ат к онкофетальному фибронектину
IFN-y
Ат к онкофетальному фибронектину
IL-2
Ат к онкофетальному фибронектину
IL-12
Ат к онкофетальному фибронектину
EMAP II
Ат к онкофетальному фибронектину
VEGF
Ат к онкофетальному фибронектину
IL-1
Ат к онкофетальному фибронектину
- 21 -
009955
IL-6
AT К онкофетальному фибронектин)'
IL-12
Ат К онкофетальному фибронектину
PDGF
Ат к онкофетальному фибронектину
PD-ECGF
Ат к онкофетальному фибронектину
CXC хемокин
Ат к онкофетальному фибронектину
CC хемокин
Ат к онкофетальному фибронектину
С хемокин
Ат к онкофетальному фибронектину
IL-15
Ат к онкофетальному фибронектину
Следует отметить, что в вышеуказанной таблице термин "Ат" означает антитело и что антитела и лиганды включают их фрагменты.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат содержит TNFa или TNFp и NGR-содержащий пептид или TNFa или TNFp и RGD-содержащий пептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат представлен в форме слитого белка.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество продукта конъюгации TNF и первого ТТМ или полинуклеотида, кодирующего таким же образом, и эффективное количество IFN-y и второго ТТМ или полинуклеотида, кодирующего таким же образом, где указанный первый ТТМ и указанный второй ТТМ конкурируют за различные рецепторы.
Некоторые ключевые преимущества изобретения
Для того, чтобы достигнуть раковых клеток в твердых опухолях, химиотерапевтические лекарстве-ные средства должны проникнуть в кровеносные сосуды опухоли, пересечь сосудистую стенку и окончательно мигрировать через интерстициому. Гетерогенная опухолевая перфузия, сосудистая проницаемость, и клеточная плотность, и увеличенное интерстициональное давление могут представлять существенные барьеры, что может ограничить проникновение лекарственного средства в неопластичные клетки, отдаленные от опухолевых сосудов, и, следовательно, эффективность химиотерапии (1). Стратегии, направленные на улучшение пенетрации лекарственного средства в опухоль, представляют, таким образом, большой экспериментальный и клинический интерес.
Растущий объем данных показывает, что фактор некроза опухоли a (TNF) и воспалительный цито-кин, наделенный потенциальной противоопухолевой активностью, могут использоваться для этой цели. Например, добавление TNF к регионарной изолированной перфузии конечности мелфаланом или доксо-рубицином привело к более высоким показателям отклика у пациентов с завершающей стадией саркомы мягких тканей или меланомы, чем полученным с единственным химиотерапевтическим лекарственным средством (2-6). Вызываемое TNF изменение эндотелиальной барьерной функции, снижение опухолевого интерстициального давления, увеличение пенетрации химиотерапевтического лекарственного средства и повреждения опухолевых сосудов подтверждают важность механизмов синергии между TNF и химиотерапией (3, 4, 7-10). К сожалению, системное введение TNF сопровождается чрезмерной токсичностью, максимально допустимая доза (8-10 мкг/кг) в 10-50 раз ниже, чем предполагаемая эффективная доза (11, 12). По этой причине отказались от системного введения TNF и клиническое применение этого цитокина ограничено местно-регионарным лечением. Тем не менее, некоторые особенности активности TNF, в частности селективность для опухолеассоциированных сосудов и синергия с химиотерапевтиче-скими лекарственными средствами, продолжают поддерживать надежды относительно возможности более широкого терапевтического применения (13).
Сосудистые эффекты TNF обеспечивают рациональное развитие стратегии " сосудистого нацеливания", направленной на увеличение локальной эффективности и на возможность системного введения терапевтических доз. Недавно мы показали, что нацеленная доставка TNF в опухолевые сосуды может быть достигнута путем связывания этого белка с CNGRC пептидом, лигандом аминопептидазы N (CD13), который определяет опухолевую неоваскулярность (14). В настоящей работе мы исследовали, действительно ли сосудистое нацеливание с другими конъюгатами может увеличить пенетрацию химио-терапевтических лекарственных средств в опухоль и улучшить их эффективность. Кроме того, мы проверили, действительно ли сосудистое нацеливание с конъюгатами может ослабить лекарственно-пене-трационные барьеры и увеличить количество химиотерапевтического средства, которое достигает раковых клеток.
Чтобы сократить опухолевые клетки до числа, которое может быть полностью разрушено противоопухолевыми эффекторными Т-клетками, мы должны предусмотреть такой способ уменьшения массы опухоли, который, в отличие от химиотерапии, не является иммунодепресантным.
В этом отношении, мы верим, что опухолесосудистое нацеливание для уничтожения опухолевых клеток является одним из наиболее перспективных терапевтических подходов к лечению рака. Опухоле-индуцированный сосудистый эндотелий составлен из нетрансформированных клеток, которые поэтому
- 22 -
009955
не подвергаются мутациям, вызываемым терапией. Таким образом, повторные обработки этого сосудистого эндотелия опухоли-мишени, в принципе, могут быть проведены без опасения выбора резистентных вариантов. Второе, разрушением относительно небольшого числа опухолевых сосудов может быть, возможно, уничтожено огромное количество опухолевых клеток, которые зависят от кровоснабжения при разрастании.
Биологическая терапия, которая повреждает функции опухолеассоциированных сосудов и разрушает формирование новых сосудов без вызывания иммунодепрессии, была бы, следовательно, очень привлекательным подходом к уменьшению массы опухоли перед иммунотерапией или другими терапевтическими воздействиями.
Среди различных цитокинов и биологических модуляторов, которые могут поражать опухолевые сосуды так же, как и имунная система, TNF-a, один или в комбинации с интерфероном гамма и химиотерапией, несомненно, является одним из наиболее эффективных. Массированный геморрагический некроз и уменьшение опухоли, которые этот цитокин может вызывать в течение 24 ч в опухолях животных, являются общепризнанными со времени его открытия. В настоящее время установлено, что TNF может разрушать опухолевую макро- и микроваскуляторность метастатических меланом конечностей у пациентов, когда вводится местно в высокой дозе в комбинации с интерфероном гамма и мелфаланом путем изолированной перфузии конечности. TNF может вызвать каскад событий, ведущих к повреждению эн-дотелиальных клеток, агрегации тромбоцитов, внутрисосудистому осаждению фибрина, и коагуляции, и кульминационной остановке опухолевого кровообращения. Удивительно, но нормальные сосуды около опухоли остаются неповрежденными, подтверждая, что TNF может каким-то образом различать сосудистую систему нормальных тканей и опухолевых. Следовательно, является заманчивой возможность использовать TNF, чтобы вызвать уменьшение опухоли перед другим терапевтическим вмешательством.
Другим потенциальным преимуществом уменьшения опухоли с помощью TNF перед традиционными химиотерапевтическими агентами является то, что он не является иммунодепрессантом, а, наоборот, он является важным активатором иммунного ответа. Действительно, TNF может активировать антиген предъявляемой клетки, который, в свою очередь, является важным ключевым медиатором иммунного ответа, так же, как и различные другие механизмы, которые вносят вклад в эффективный иммунный ответ.
К сожалению, клиническое использование TNF в качестве противоракового лекарственного средства ограничивалось до сих пор местным применением из-за ограничивающей дозу системной токсичности и низкого терапевтического индекса.
Растворимый биоактивный TNF является гомотримерным белком, который медленно диссоциирует на неактивные мономерные субъединицы при пикомолярных уровнях (1). Биологические активности вызываются тримерным TNF при взаимодействии и последующей гомотипической кластеризации двух различных рецепторов клеточной поверхности (2) в 55-60 кДа и 75-80 кДа, соответственно (p55TNFR и p75TNFR). p55TNFR считается посредником большинства TNF эффектов (3, 4, 5, 6, 7), тогда как p75TNFR благодаря его высокой аффинности (ЕС <1=0,1х10-9М против 0,5х10-9М для p55TNFR) играет важную роль в увеличении локальной концентрации TNF и в прохождении лиганда к p55TNFR (8, 9). Помимо этих поддерживающих или модулирующих эффектов прямой сигнализации p55TNFR может также внести вклад в различные клеточные реакции, подобные пролиферации тимоцитов, фибробластов и природных клеток-киллеров, секреции GM-CSF (2, 10, 11), и в определяющие локально ограниченные реакции, вызываемые эндогенной мембранно-связанной формой TNF (12).
Клинические испытания, выполненные для демонстрации противоопухолевой активности TNF, показали, что введение больших терапевтически эффективных доз TNF сопровождается недопустимо высокими уровнями системной токсичности, дозаограничивающей токсичностью обычно является гипотония. Поэтому попытки системного введения TNF опухолевому пациенту были, по существу, прекращены. Тем не менее, замечательная противоопухолевая активность TNF на некоторых животных моделях продолжала питать надежды относительно возможности терапевтического применения TNF у людей. Это подразумевало, однако, необходимость найти способы понижения токсичности TNF при системном введении или доставки TNF с относительной или абсолютной селективностью к действительной терапевтической мишени-опухоли.
Максимальная переносимая доза при болюсном введении TNF (внутривенно) у человека составляет 218-410 мкг/м2 (28), примерно в 10 раз ниже, чем эффективная доза у животных (29). Основываясь на данных, полученных на мышиных моделях, мы посчитали, что необходима по меньшей мере в 10 раз большая доза для достижения противоопухолевого эффекта у людей.
Одним из подходов, который выполнялся для того, чтобы использовать противоопухолевую активность TNF и в то же время избежать его системной токсичности, было регионарное или местное введение. Таким образом, местное введение TNF показало многообещающие уровни ответа при саркоме Ка-поши, плазмоцитомах, аденокарциномах яичника и различных метастатических опухолях в печени (30, 31). Что касается регионарного введения, поразительные результаты были получены, когда высокие дозы TNF использовались в комбинации с мелфаланом в изолированной перфузии конечности для лечения
- 23 -
009955
меланомы и саркомы конечности. Этот метод позволил достичь 90-100% полного ответа с опухолями, подвергающимися геморрагическому некрозу (32), это наблюдение согласуется с наблюдениями, полученными при доклинических изучениях некоторых экспериментальных животных опухолевых моделей.
Хотя эти результаты являются обнадеживающими, применимость этих подходов остается ограниченной по двум главным причинам. Первое, в большинстве случаев, где местно-регионарная терапия может быть предусмотрена, вероятно, что использование принятых способов вмешательства (например, хирургия, лучевая терапия), возможно, также и в будущем будет превалировать. Второе, по определению, злокачественность имеет тенденцию к распространению, и это означает, что в положении, где ме-стно-регионарная терапия ограничена, необходимость новых терапевтических подходов для медиков является наиболее острой. В первом клиническом изучении на гипертермической изолированной перфузии конечности высокие скорости ответа были получены с единичной дозой 4 мг TNF в комбинации с мелфаланом и интерфероном-у (32). Другие работы показали, что интерфероном-y можно пренебречь и что даже меньшие дозы TNF могут быть успешными для вызова терапевтического ответа (33, 34). Так как даже это лечение не свободно от риска токсичности (35), сосудистое нацеливание производных TNF может представлять альтернативный подход к снижению токсических эффектов.
Подробное описание изобретения
Теперь будут описаны различные предпочтительные особенности и варианты осуществления изобретения в виде нелимитирующих примеров.
Хотя, в основном, используемые здесь методики хорошо известны из уровня техники, можно сделать ссылку, в частности, на Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. (а также полная версия Current Protocols in Molecular Biology).
Конъюгат
Настоящее изобретение относится к конъюгату, который представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере один нацеливающий модуль/полипептид, связанный, по крайней мере, с цитоки-ном, образованный через генетическое слияние или химическое сдваивание. Под термином "связанный" мы подразумеваем, что первая и вторая последовательности ассоциированы так, что вторая последовательность способна транспортироваться первой последовательностью к клетке-мишени. Таким образом, конъюгаты включают слитые белки, в которых транспортный белок связан с цитокином через их полипептидные скелеты посредством генетической экспрессии молекулы ДНК, кодирующей эти белки, непосредственно синтезированные белки и спаренные белки, в которых первоначально образуемая последовательность ассоциирована структурирующим агентом. Этот термин также включает ассоциаты, такие как агрегаты, цитокина с нацеливающим белком. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения вторая последовательность может содержать полинуклеотидную последовательность. Этот вариант осуществления может рассматриваться как комплекс белок/нуклеиновая кислота.
Вторая последовательность может быть того же вида, что и первая последовательность, но в конъ-югате по настоящему изобретению, в некоторой степени, различны с природной ситуацией, или последовательности могут быть разного вида.
Конъюгаты по настоящему изобретению способны направляться к клетке так, что может иметь место эффекторная функция, соответствующая полипептидной последовательности, спаренной с транспортной последовательностью.
Пептид может быть спарен прямо с цитокином или опосредованно через спейсер, которым может быть единичная аминокислота, аминокислотная последовательность или органический остаток, такой как 6-шинокаприл^-гидроксисукцинимид.
Пептидный лиганд предпочтительно связан с N-концом цитокина, минимизируя, таким образом, любое вмешательство в связывание модифицированного цитокина с его рецептором. И, наоборот, пептид может быть связан с аминокислотными остатками, которые являются амидо- или карбоксильно-связанными акцепторами, которые могут быть на молекуле от природы или искусственно вставленными с помощью методов генной инженерии. Модифицированный цитокин преимущественно получают с использованием кДНК, содержащей 5'-прилегающую последовательность, кодирующую пептид.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагается продукт конъюгации между TNF и CNGRC последовательностью, в котором аминный конец TNF связан с CNGRC пептидом через спейсер G (глицин).
Цитокины
Пенетрация лекарственного средства в неопластичные клетки является основной для эффективности твердоопухолевой химиотерапии. Для того, чтобы достать раковые клетки в твердых опухолях, хи-миотерапевтические лекарственые средства должны проникнуть в кровеносные сосуды опухоли, пересечь сосудистую стенку и окончательно мигрировать через интерстициому. Гетерогенная опухолевая перфузия, сосудистая проницаемость, и клеточная плотность, и увеличенное интерстициональное давление могут представлять существенные барьеры, что может ограничить проникновение лекарственного средства в неопластичные клетки, отдаленные от опухолевых сосудов, и, следовательно, эффективность химиотерапии. Цитокины, которые влияют на подавление этих факторов, и используются в настоящем
- 24 -
009955
изобретении. Нелимитирующий список цитокинов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включает TNFa, TNFp, IFNa, IFNp, IFNy, IL-1, 2, 4, 6, 12, 15, EMAP II, сосудистый эндотелиаль-ный фактор роста (VEGF), PDGF, PD-ECGF или хемокин.
TNF
TNF действует как воспалительный цитокин и влияет на изменение эндотелиальной барьерной функции, снижение опухолевого интерстициального давления, и увеличение пенетрации химиотерапев-тического лекарственного средства, и повреждение опухолевых сосудов.
Первое предположение, что существует некротизирующая опухоль молекула, было сделано, когда было обнаружено, что у раковых пациентов иногда наблюдалась спонтанная регрессия опухолей после бактериальных инфекций. Последующие исследования в 1960-х подтвердили, что хозяин-ассоциирован-ные (или эндогенные) медиаторы, вырабатываемые в ответ на бактериальные продукты, были, вероятно, ответственны за наблюдаемые эффекты. В 1975г. было показано, что бактериально-индуцируемый циркулирующий фактор имел сильную противоопухолевую активность против опухолей, имплантированных в кожу мыши. Этот фактор, названный фактором некроза опухоли (TNF), был впоследствии выделен, клонирован и оказался прототипом семейства молекул, вовлеченных в иммунную регуляцию и воспаление. Рецепторы для TNF и других членов суперсемейства TNF также составляют суперсемейство родственных белков.
Родственные TNF лиганды обычно разделяют ряд общих свойств. Эти свойства не включают высокую степень гомологии общей аминокислотной последовательности. За исключением фактора роста нервов (NGF) и TNF-бета, все лиганды синтезированы в виде трансмембранных белков II типа (внеклеточный С-конец), которые содержат короткий цитоплазматический сегмент (10-80 аминокислотных остатков) и относительно длинную внеклеточную область (140-215 аминокислотных остатков). NGF, который структурно не родственный TNF, включен в это суперсемейство только потому, что его способность связывать TNFRSF ниже аффинности NGF рецептора (LNGFR). NGF имеет классическую сигнальную последовательность пептида и является секретированным. TNF-p, наоборот, хотя также полностью секре-тирован, имеет первичную структуру, намного более родственную трансмембранным белкам типа II. TNF-p можно рассматривать как белок типа II с нефункциональным, или неэффективным, трансмембранным сегментом. В общем, TNFSF члены образуют тримерные структуры, а их мономеры составлены из бета-цепей, которые ориентируют их в двухпластинчатую структуру. Как следствие тримерной структуры этих молекул, предположили, что лиганды и рецепторы TNSF и TNFRSF суперсемейств подвергаются " кластеризации" во время сигнальной трансдукции.
TNF-a
Человеческий TNF-a представляет собой негликозилированный полипептид из 233 аминокислотных остатков, который существует либо как трансмембранный, либо как растворимый белок. Когда выражен в виде мембранного связанного белка в 26 кДа, TNF-a состоит из цитоплазматического домена, включающего 29 аминокислотных остатков, трансмембранного сегмента, включающего 28 аминокислотных остатков, и внеклеточного участка, включающего 176 аминокислотных остатков. Растворимый белок создается путем протеолитического расщепления с помощью TNF-альфа конвертирующего фермента (ТАСЕ) в 85 кДа, который генерирует молекулу в 17 кДа, включающую 157 аминокислотных остатков, которая обычно циркулирует в виде гомотримера.
TNF-p/LT-a
TNF-p, по-другому известный как лимфотоксин-a (LT-a), является молекулой, клонирование которой было осуществлено одновременно с клонированием TNF-a. Хотя TNF-p циркулирует в виде глико-зилированного полипептида в 25 кДа, состоящего из 171 аминокислотного остатка, была найдена большая форма длиной 194 аминокислотных остатка. Человеческие TNF-p кДНК коды для открытого считывания составлены из 205 аминокислотных остатков (202 у мыши), и, очевидно, некоторая протеолитиче-ская переработка осуществляется во время секреции. Как и TNF-a, циркулирующий TNF-p существует в виде нековалентно связанного тримера, и известно, что он связывает те же рецепторы, что и TNF-a.
В одном варианте осуществления изобретения TNF представляет собой мутантную форму TNF, способную селективно связываться с одним из TNF рецепторов (Loetscher H. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 26350-7; Van Ostade X. et al. (1993) Nature 361: 266-9).
Были осуществлены различные подходы, направленные на снижение системной токсичности TNF при сохранении его противоопухолевой активности. Хотя конечной целью является та же, что и в предыдущей части, т.е. увеличение терапевтического индекса, основное направление значительно отличается. В предыдущем случае значительное повышение отдельной биологической активности, цитотоксичности, первоначально задумывалось представить как in vitro коррелят противоопухолевой активности TNF, в настоящем используется селективная модификация биологического профиля TNF, ведущая к сохранению некоторых активностей и потере других.
Работа по этому последнему направлению обещала преимущества, главным образом, возможность конструировать мутанты TNF, связанные только с одним из двух TNFR. Попытки работы в этом направлении были инициированы наблюдением, что человеческий TNF связывает только один (p55TNFR) из
- 25 -
009955
двух мышиных TNFR, взаимодействие с мышиным p75TNFR является видоспецифичным (2). Исследования in vivo показали, что системная токсичность человеческого TNF была приблизительно в 50 раз ниже, чем токсичность мышиного TNF, при введении нормальным мышам, в то время как противоопухолевая активность была эквивалентной (44). Эти наблюдения полагали, что мутанты TNF, которые сохраняют связывание с p75TNFR, должны иметь более благоприятный терапевтический индекс, чем природный TNF. Действительно, такие рецептор-селективные мутанты TNF были впоследствии получены с помощью методов сайт-специфического мутагенеза (4, 45). Исследования, проведенные с p55TNFR-специфичным мутантом, показали, что он был так же эффективен, как природный TNF, в отношении противоопухолевой активности in vivo, несмотря на то, что активности на нейтрофилах и эндотелиаль-ных клетках, двух типах клеток, верно, играющих важную роль в TNF-индуцированной системной токсичности, были сильно снижены (6).
Хотя эти результаты были сильно обнадеживающими ввиду возможного терапевтического использования этих мутантов в противоопухолевой терапии, надежды, которые выросли, были значительно ослаблены наблюдением, что у приматов также p55TNFR играет важную роль в системной токсичности (46) и что выгода на основе сниженной токсичности терялась, когда мутанты вводились в комбинации с агентом, который повышал восприимчивость к TNF, аналогу IL-1, LPS или, что наиболее важно в этом положении, в присутствии самой опухоли, которая делает организм восприимчивым к TNF способом, похожим на описанный для экзогенно введенных веществ в ссылке (47).
Принимая во внимание вышесказанное, мы решили, что связывание этих и других мутантов TNF с avp3 лигандом приведет в результате к улучшению их терапевтического индекса.
Многие другие воспалительные цитокины также обладают способностью увеличивать проницаемость эндотелиальных сосудов, и следует принимать во внимание, что изобретение может применять такие цитокины, вместе с агентами, которые увеличивают экспрессию таких цитокинов. Воспалительные цитокины, также известные как провоспалительные цитокины, представляют собой ряд полипептидов или гликопротеинов с молекулярными массами между 5 и 70 кДа. Они обладают стимулирующим эффектом на воспалительную реакцию. Наиболее важными воспалительными цитокинами являются TNF, IL-1, IL-6 и IL-8.
Таблица некоторых цитокинов, классифицированных как воспалительные цитокины, показана ниже.
Воспалительные цитокины
Группа
Индивидуальные цитокины
Эндогенные цитокины
IL-1, TNF-a, IL-6
Повышающая регуляция
IL-1, TNF-a, IL-6, IFN-a, INF-p, хемокины
Стимуляция продукта ревматических проб
IL-1, IL-6, IL-11, TNF-a, INF-y, T'GF-P, LIF, OSM, CNTF
Хемоаттрактантные цитокины
СХС хемокины
IL-8, PF-4, PBP, NAP-2, p-TG
СС хемокины
MlP-la, MIP-ip, MCP-1, MCP-2, MCP-3, RANTES
С хемокины
Лимфотактин
Стимуляция воспалительных цитокинов
IL-12
TGF-p: трансформирующий фактор роста, LIF: ингибиторный фактор лейкемии; OSM: онкостатин М; CNTF: цилиарный нейротрофический фактор; PF-4: тромбоцитарный фактор 4; РВР: тромбоцитарный основной белок; NAP-2: активирующий нейтрофилы белок 2; p-TG: p-тромбоглобулин; MIP: воспалительный белок макрофага; МСР: хемоаттрактантный белок моноцита.
Повышающая регуляция воспалительной реакции также выполняется IL-11, IFN-a, IFN-p и особенно членами суперсемейства хемокинов. TGF-p в некоторых ситуациях имеет ряд воспалительных активностей, включающих хемоаттрактантные эффекты на нейтрофилы, Т-лимфоциты и инактивированные моноциты.
- 26 -
009955
IL-2
Из-за центральной роли системы IL-2/IL-2R в опосредовании иммунного и воспалительного ответов очевидно, что контролирование и манипулирование этими системами имеют важные диагностические и терапевтические последствия. IL-2 показал себя как возможное противоопухолевое лекарственное средство в силу его способности стимулировать пролиферацию и активность опухолеатакующих LAK и TIL (опухолеинфильтрующие лимфоциты) клеток. Однако проблемы токсичности IL-2 по-прежнему беспокоят и заслуживают исследования. Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы.
IL-15
Интерлейкин 15 (IL-15) - это новый цитокин, имеющий многие биологические свойства, общие с IL-2, но не имеющий аминокислотной последовательности, гомологичной IL-2. IL-15 был первоначально идентифицирован в среде, кондиционированной с обезьяньей почечной эпителиальной клеточной линией (CVI/EBNA), исходя из его митогенной активности на мышиную Т-клеточную линию, CTLL-2. IL-15 также был независимо открыт как цитокин, продуцируемый человеческими зрелыми Т-клетками линии клеток лейкемии (HuT-102), который стимулировал пролиферацию Т-клеток и был обозначен IL-T. В силу его активности как стимулятора Т-клеток, NK клеток, LAK клеток и TILs, IL-2 в настоящее время проходит клинические испытания для определения его потенциального использования в лечении рака и вирусных инфекций. Из-за его похожих биологических активностей IL-15 должен иметь похожий терапевтический потенциал.
Хемокины
Хемокины являются суперсемейством очень маленьких секретированных белков, которые принимают участие в движении лейкоцита, рекрутинге и рециркуляции. Они также играют решающую роль во многих патофизиологических процессах, таких как аллергическая реакция, инфекционные и аутоиммунные заболевания, ангиогенез, воспаление, рост опухоли и кроветворное развитие. Приблизительно 80% этих белков имеют от 66 до 78 аминокислот в их природной форме. Остальные больше и содержат дополнительные аминокислоты, расположенные против ядра белка или в виде части удлиненного С-конце-вого сегмента. Все хемокины сигнализируют через 7 трансмембранных доменов G-протеин спаренных рецепторов. Известно по меньшей мере 17 хемокиновых рецепторов, и многие из этих рецепторов проявляют нерегулярные связывающие свойства, в результате чего самые различные хемокины могут сигнализировать через одинаковый рецептор.
Хемокины делят на подсемейства, исходя из консервативных звеньев аминокислотной последовательности. Члены наибольшего семейства имеют по меньшей мере 4 консервативных цистеиновых остатка, которые образуют 2 внутримолекулярные дисульфидные связи. Подсемейства определяют по положению первых двух цистеиновых остатков.
Альфа-подсемейство, также называемое СХС хемокины, имеет 1 аминокислоту, разделяющую первых два цистеиновых остатка. Эта группа может быть затем подразделена, исходя из присутствия или отсутствия glu-leu-arg (ELR) аминокислотного звена, предшествующего первому цистеиновому остатку. В настоящее время имеется 5 СХС-специфичных рецепторов, и они обозначены CXCR1-CXCR5. ELR+ хе-мокины связывают CXCR2 и, в основном, действуют как нейтрофильные хемоаттрактанты и активаторы. ELR хемокины связывают CXCR3-5 и действуют, в первую очередь, на лимфоциты. Во время написания этой работы в научной литературе были описаны 14 различных человеческих генов, кодирующих СХС хемокины, с некоторым дополнительным разнообразием, вносимым путем альтернативного сплайсинга.
В бета-подсемействе, также называемом СС хемокины, первых два цистеина являются смежными друг с другом без промежуточной аминокислоты. В настоящее время известны 24 индивидуальных члена человеческого бета-подсемейства. Рецепторы для этой группы обозначены CCR1-CCR11. Клетки-мишени для различных членов СС семейства включают большинство типов лейкоцитов.
Известны два белка с гомологией хемокина, которые выпадают из альфа- и бета-подсемейств. Лим-фотактин является единственным членом гамма-класса (С хемокин), который потерял первый и третий цистеины. Лимфотактиновый рецептор обозначен XCR1. Фракталкин, единственный известный член дельта-класса (СХ3С хемокин), имеет три промежуточные аминокислоты между первыми двумя цистеи-новыми остатками. Эта молекула уникальна среди хемокинов, так как является трансмембранным белком с N-концевым хемокиновым доменом, слитым с длинным муциноподобным звеном. Фракталкино-вый рецептор известен как CX3CR1.
VEGF
Настоящее изобретение также применимо к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF). Ангиогенез - это процесс развития новых кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой системы. Он играет существенную роль в эмбриональном развитии, нормальном росте тканей, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (т.е. овуляция, менструация и плацентарное развитие), а также главную роль во многих заболеваниях. Особый интерес сосредоточен на раке, так как опухоли не могут расти сверх нескольких миллиметров без развития нового кровоснабжения. Ангиогенез также необходим для распространения и роста опухолевых метастазов.
Одним из наиболее важных факторов роста и жизнеспособности эндотелия является VEGF. VEGF стимулирует ангиогенез и пролиферацию эндотелиальных клеток, и он играет важную роль в регуляции
- 27 -
009955
васкулогенеза. VEGF представляет собой гепаринсвязанный гликопротеин, который секретируется в виде гомодимера в 45 кДа. Большинство видов клеток, но обычно не сами эндотелиальные клетки, секре-тируют VEGF. Так как первоначально открытый VEGF, VEGF-A, увеличивает сосудистую проницаемость, он был известен как фактор сосудистой проницаемости. Кроме того, VEGF вызывает расширение сосудов, в некоторой степени через стимуляцию нитроксидсинтазы в эндотелиальных клетках. VEGF может также стимулировать клеточную миграцию и ингибировать апоптоз. Имеется несколько сплайс-вариантов VEGF-А. Главные из них включают 121, 165, 189 и 206 аминокислот, и каждый содержит специфичный экзон присоединения.
ЕМАР II
Эндотелиальный моноцитактивирующий полипептид-II (ЕМАР-II) является цитокином, который является антиангиогенным фактором в сосудистом развитии опухоли, и сильно ингибирует рост опухоли. Рекомбинантный человеческий ЕМАР-II представляет собой белок в 18,3 кДа, содержащий 166 аминокислотных остатков. Также было найдено, что ЕМАР-II увеличивает проницаемость эндотелиальных сосудов.
PDGF
Было сделано предположение, что антогонисты тромбоцитарного фактора роста (PDGF) должны увеличивать лекарственное накопление и терапевтические эффекты широкого ряда противоопухолевых агентов в обычных твердых опухолях. PDGF является цитокином в 30 кДа, и выделяется тромбоцитами на ране, и стимулирует близлежащие клетки к росту и заживлению раны.
PD-ECGF
Как предполагает его название, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF) был первоначально выделен на основании его способности вызывать митоз в эндотелиальных клетках. Его родственным белком является глиостатин.
Нацеливающий модуль
Мы нашли, что терапевтический индекс цитокинов может быть увеличен путем хоминга нацеливающего цитокина к опухолевым сосудам. Кроме того, так как известно, что опухолевые клетки могут формировать часть выстилки опухолевой сосудистой системы, настоящее изобретение охватывает нацеливание как прямо на опухолевые клетки, так и на опухолевую сосудистую систему. Любые подходящие нацеливающие модули на опухоли или опухолевую сосудистую систему (особенно эндотелиальные клетки) могут быть использованы в конъюгате по настоящему изобретению. Многие такие нацеливающие модули известны, эти фрагменты и любые другие, которые впоследствии станут доступны, охватываются объемом настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения нацелива-ющй фрагмент представляет собой связывающий партнер, такой как лиганд, рецептора, экспрессируемо-го опухолевой клеткой, или связывающий партнер, такой как антитело, к маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, ассоциированного с опухолевыми клетками. Наиболее предпочтительным нацеливающим модулем является связывающий партнер, такой как лиганд, рецептора, экспрессируемого опу-холево-ассоциированными сосудами, или связывающий партнер, такой как антитело, к эндотелиальному маркеру или компоненту внеклеточного матрикса, ассоциированного с ангиогенными сосудами. Термин связывающий партнер используется здесь в самом широком его смысле и включает как природные, так и синтетические связывающие домены, включая лиганды и антитела или их связывающие фрагменты. Таким образом, указанный связывающий партнер может быть антителом или его фрагментом, таким как Fab, Fv, одноцепочечный Fv, пептид или пептидомиметик, а именно пептидоподобная молекула, способная связываться с рецептором, маркером внеклеточного компонента клетки.
Далее представлены нелимитирующие примеры подходящих нацеливающих доменов и рецепторов/маркеров, на которые может быть нацелен конъюгат.
CD13
Неожиданно было найдено, что терапевтический индекс определенных цитокинов может быть заметно улучшен и их иммунотерапевтические свойства могут быть повышены путем спаривания с лиган-дом рецептора аминопептидазы-N (CD13). CD13 является трансмембранным гликопротеином в 150 кДа, высококонсервативным в различных биотипах. Он экспрессируется как на нормальных клетках, так и в миелоидных опухолевых линиях, в ангиогенный эндотелий и некоторый эпителий. CD13 рецетор обычно идентифицируют как "NGR" рецептор, в котором его пептидные лиганды разделяет аминокислотное "NGR" звено. Предпочтительно лиганд представляет собой прямой или циклический пептид, содержащий звено NGR, такой как CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, циклоCVLNGRMEC или циклоCNGRC или более предпочтительно пептид CNGRC. Более подробное описание можно найти в нашей заявке WO 01/61017, которая включена здесь в виде ссылки.
TNF рецептор
Как и члены TNF суперсемейства, члены суперсемейства TNF рецептора (TNFRSF) также разделяют ряд общих свойств. В частности, молекулы в TNFRSF - все типа I (N-концевые внеклеточные) глико-протеины, содержащие 1-6 лигандсвязывающих, цистеинобогащенных звеньев из 40 аминокислотных остатков во внеклеточном домене. Кроме того, функциональные члены TNFRSF обычно являются три-мерными или мультимерными комплексами, которые стабилизируются внутрицистеиновыми дисуль
- 28 -
009955
фидными связями. В отличие от большинства членов TNFSF, члены TNFRSF существуют и в мембран-но-связанной, и в растворимой формах. И, наконец, хотя гомология аминокислотной последовательности в цитоплазматических доменах членов суперсемейства не превышает 25%, ряд рецепторов способен трансдуцировать апоптотические сигналы в различные клетки, предполагая общие функции.
CD40
CD40 представляет собой трансмембранный гликопротеин в 50 кДа, содержащий 277 аминокислотных остатков, очень часто ассоциируемый с В-клеточной пролиферацией и дифференциацией. Экспрес-сированный на различных типах клеток CD40 кДНК кодирует 20 аминокислотных сигнальных последовательностей, 173 аминокислотные внеклеточные области, 22 аминокислотных трансмембранных сегмента и 62 аминокислотных цитоплазматических домена. Имеется 4 цистеинобогащенных звена во внеклеточной области, которые сопровождаются околомембранной последовательностью, богатой серинами и треонинами. Известные клетки для экспрессии CD40 включают эндотелиальные клетки.
TNFRI/p55/CD120a
TNFRI представляет собой трансмембранный гликопротеин в 55 кДа, содержащий 455 аминокислотных остатков, который, вероятно, экспрессируется практически всеми содержащими ядро клетками млекопитающих. Молекула имеет 190 аминокислотных внеклеточных областей, 25 аминокислотных трансмембранных сегментов и 220 аминокислотных цитоплазматических доменов. Оба, и TNF-a, и TNF-p , связываются с TNFRI. Среди ряда клеток, экспрессирующих TNFRI, имеются эндотелиальные клетки.
TNFRII/p75/CD120b
Человеческий TNFRII представляет собой трансмембранный гликопротеин в 75 кДа, содержащий 461 аминокислотный остаток, первоначально выделенный из библиотеки человеческих легочных фиб-робластов. Этот рецептор состоит из 240 аминокислотной внеклеточной области, 27 аминокислотных трансмембранных сегментов и 173 аминокислотных цитоплазматических доменов. Были идентифицированы растворимые формы TNFRII, являющиеся, вероятно, результатом протеолитического расщепления с помощью металлопротеиназы, названной TRRE (энзим, высвобождающий TNF-рецептор). Процесс выпадения происходит независимо от растворимости TNFRII. Среди множества клеток, экспрессирую-щих TNFRII, имеются эндотелиальные клетки.
CD134L/OX40L
ОХ40, рецептор для OX40L, является маркером активации Т-клеток с ограниченной экспрессией, который, по-видимому, промотирует выживание (и возможно пролонгирует иммунный ответ) CD4+ Т-клеток на сайтах воспаления. OX40L также проявляет ограниченную экспрессию. Недавно сообщалось, что только активированные CD4+, CD8+ Т-клетки, В-клетки и сосудистые эндотелиальные клетки экспрес-сируют этот фактор. Человеческий лиганд представляет собой гликозилированный полипептид в 32 кДа, содержащий 183 аминокислотных остатка, который состоит из 21 аминокислотного цитоплазматического домена, 23 аминокислотных трансмембранных сегментов и 139 аминокислотных внеклеточных областей.
Семейство VEGF рецептора
Имеется 3 рецептора в семействе VEGF рецептора. Они имеют общие свойства мультиплетных IgG-подобных внеклеточных доменов и активность тирозинкиназы. Домены энзимов VEGF рецептора 1 (VEGF R1, также известный как Flt-1), VEGF R2 (также известный как KDR или Flk-1) и VEGF R3 (также известный как Flt-4) делятся инсерционной последовательностью. Эндотелиальные клетки также экс-прессируют дополнительные VEGF рецепторы, нейрофиллин-1 и нейрофиллин-2. VEGF-A связывается с VEGF R1 и VEGF R2 и нейрофиллином-1 и нейрофиллином-2. P1GF и VEGF-B связывают VEGF R1 и нейрофиллин-1. VEGF-C и -D связывают VEGF R3 и VEGF R2. Также было найдено, что HIV-tat и производные от него пептиды нацеливают VEGFR.
PDGF рецепторы
PDGF рецепторы экспрессировали в стромальный компартмент в большинство обычных твердых опухолей. Ингибирование стромально экспрессированных PDGF рецепторов на модели рака ободочной кишки у крыс понижало давление опухолевой интерстециальной жидкости и увеличивало опухолевый транскапиллярный транспорт.
PSMA
Простатаспецифичный мембранный антиген (PSMA) также является превосходным опухолевым эн-дотелиальным маркером и может генерировать PSMA антитела.
Молекулы клеточной адгезии (CAMs)
Молекулы клеточной адгезии (CAMs) представляют собой белки клеточной поверности, вовлеченные в связывание клеток, обычно лейкоцитов, друг с другом, эндотелиальными клетками или внеклеточным матриксом. Специфические сигналы, продуцируемые в ответ на ранение и инфекцию, контролируют экспрессию и активацию определенных из этих молекул адгезии. Взаимодействия и ответы, затем инициированные путем связывания этих CAMs с их рецепторами/лигандами, играют важные роли в опосредовании воспалительных и иммунных реакций, которые составляют одну линию защиты тела против этих поражений. Большинство охарактеризованных до сих пор CAMs распадаются на три основных семейства белков: суперсемейство иммуноглобулина (Ig), семейство интегрина и семейство селектина.
- 29 -
009955
Член семейства селектина молекул клеточной поверхности L-селектин состоит из №Н2-концевого лектинового типа С-домена, EGF-подобного домена, 2 комплементных контрольных доменов, 15 аминокислотных спейсеров, трансмембранной последовательности и короткого цитоплазматического домена.
Были идентифицированы 3 лиганда для L-селектина на эндотелиальных клетках, все содержащие О-гликозилированный муцин или муцинподобные домены. Первый лиганд, GlyCAM-1, экспрессируется почти исключительно в высокоэндотелиальные венулы периферийных и брыжеечных лимфатических узлов. Вторым лигандом L-селектина, первоначально названным sgp90, как теперь показано, является CD34. Этот сиаломуцинподобный гликопротеин, часто используемый как поверхностный маркер для очистки плюрипотентных стволовых клеток, проявляет сосудистую экспрессию в широком диапазоне нелимфоидных тканей, а также на капиллярах периферийных лимфоузлов. Третьим лигандом для L-селектина является MadCAM 1, муцинподобный гликопротеин, найденный на высокоэндотелиальных венулах лимфатических узлов слизистой оболочки.
Р-Селектин, член семейства селектина молекул клеточной поверхности, состоит из №Н2-концевого лектинового типа С-домена, EGF-подобного домена, 9 комплементных контрольных доменов, трансмембранного домена и короткого цитоплазматического домена.
Тетрасахаридсиалил Lewisx (sLex) был идентифицирован как лиганд для Р- и Е-селектина, но Р-, Е-и L-селектины могут все связывать sLex и sLea при определенных условиях. Также сообщалось, что Р-се-лектин селективно связывается с гликопротеином в 160 кДа, присутствующим на мышиных миелоидных клетках, и с гликопротеином на миелоидных клетках, кровяных нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах, названным гликопротеиновым лигандом Р-селектина (PSGL-1), этот лиганд может также связывать Е-се-лектин. Р-Селектинопосредованный роллинг лейкоцитов может быть полностью ингибирован монокло-нальным антителом, специфичным для PSLG-1, предполагается, что, хотя Р-селектин может связываться с различными гликопротеинами в условиях in vitro, похоже, что физиологически важное связывание сильно ограничено. Ряд доказательств подтверждает, что Р-селектин вовлекается в адгезию миелоидных клеток, а также В- и субпопуляции Т-клеток с активированным эндотелием.
Ig суперсемейство CAMs
Ig суперсемейство CAMs представляет собой кальцийнезависимые трансмембранные гликопротеи-ны. Члены Ig суперсемейства включают молекулы внутриклеточной адгезии (ICAMs), молекулу сосудисто-клеточной адгезии (VCAM-1), молекулу тромбоцит-эндотелиально-клеточной адгезии (РЕСАМ-1) и молекулу нейроклеточной адгезии (NCAM). Каждый член Ig суперсемейства САМ имеет внеклеточный домен, который содержит несколько Ig-подобных внутрицепочечно дисульфидно-связанных цепей с консервативными цистеиновыми остатками, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, который взаимодействует с цитоскелетом. Обычно они связывают интегрины или другие члены Ig суперсемейства CAMs. Нейронные CAMs могут вовлекаться в нейронный паттернинг. Эндотелиальные CAMs играют важную роль в иммунном ответе и воспалении.
Более подробно, молекула сосудисто-клеточной адгезии (VCAM-1, CD106, или INCAM-110), молекула тромбоцит-эндотелиально-клеточной адгезии (РЕСАМ-1/CD31) и молекулы внутриклеточной адгезии 1, 2 и 3 (ICAM-1, 2 и 3) являются 5 функционально родственными CAM/IgSF молекулами, которые существенно вовлечены в лейкоцитсвязывающая ткань/эндотелиальная клетка взаимодействия. Экспрес-сированные, главным образом, на эндотелиальных клетках, эти молекулы, в основном, регулируют миграцию лейкоцитов через стенки кровеносных сосудов, и предоставляют точки крепления для развития эндотелия во время ангиогенеза, и все являются пригодными для нацеливания в настоящем изобретении.
Человеческий CD31 является трансмембранным гликопротеином типа I (внеклеточный N-конец) в 130 кДа, который принадлежит к молекулам клеточной адгезии (САМ) или С2-подобной подгруппе IgSF1. Зрелая молекула имеет 711 аминокислотных остатков в длину и содержит внеклеточную область из 574 аминокислотных остатков, трансмембранный сегмент из 19 аминокислотных остатков и цитоплаз-матический хвост из 118 аминокислотных остатков. Во внеклеточной области имеется 9 потенциальных N-взаимносвязанньгх сайтов гликозилирования, и, с прогнозируемой молекулярной массой от 80 кДа, многие из этих сайтов оказались занятыми. Наиболее замечательной чертой этой внеклеточной области является наличие шести Ig-гомологических единиц, которые похожи на С2 домены IgSF. Хотя они отличаются, присутствие этих модулей является общей чертой всех IgSF адгезионных молекул (ICAM-1, 2, 3 и VCAM-1).
Интегрины
Интегрины являются нековалентно связанными гетеродимерами из a и р субъединиц. На настоящее время идентифицированы 16 a субъединиц и 8 р субъединиц. Их можно объединять различными путями с образованием разных типов интегриновых рецепторов. Лигандами для различных интегринов являются адгезивные внеклеточные матриксные (ЕСМ) белки, такие как фибронектин, витронектин, коллагены и ламинин. Многие интегрины распознают аминокислотную последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), которая присутствует в фибронектине или других адгезивных белках, с которыми они связываются. Петиды и белковые фрагменты, содержащие RGD последовательность, могут использоваться для того, чтобы модулировать активность RGD-распознающих интегринов. Таким образом,
- 30 -
009955
настоящее изобретение может применять в качестве нацеливающего модуля пептиды, распознаваемые интегринами. Эти пептиды условно известны как "RGD-содержащие пептиды". Эти пептиды могут включать пептиды, звенья которых были идентифицированы как связывающиеся с интегринами. Эти звенья включают аминокислотные последовательности: DGR, NGR и CRGDC. Пептидные звенья могут быть линейными или циклическими. Такие звенья описаны более детально в следующих патентах, которые здесь включены путем ссылки в отношении описания RGD пептидов: патент США 5536814, в котором описаны CRGDCL, CRGDCA и GACRGDCLGA; патент США 4578079, относящийся к синтетическим пептидам формулы X-RGD-T/C-Y, где X и Y являются аминокислотами. В патенте США 5547936 описан пептид, содержащий последовательность X-RGD-XX, где X - аминокислота. В патенте США 4988621 описан ряд RGD-содержащих пептидов. В патенте США 4879237 описан общий пептид формулы RGD-Y, где Y - аминокислота, и пептид G-RGD-AP. В патенте США 5169930 описан пептид RGDSPK, который связывается с av р1 интегрином. Патенты США 5498694 и 5700908 относятся к цито-плазматическому домену субъединицы р3 интегрина, который, строго говоря, не является RGD-содержа-щим пептидом, хотя он содержит последовательность RGD. В WO 97/08203 описаны циклические пептиды, которые являются структурными миметиками или RGD-связанными сайтами. В патенте США 5612311 описаны 15 RGD-содержащих пептидов, которые являются циклизируемым эфиром через С-С связывание или через другие группы, такие как аналоги пенициламина или меркаптопропионовой кислоты. В патенте США 5672585 описана общая формула обобщающих RGD-содержащих пептидов. Предпочтительной группой пептидов являются те, где остаток аспарагиновой кислоты RGD превращен в О-метокситирозиновое производное. В патенте США 5120829 описаны RGD сайт связывания, промоти-рующий прилипание клеток, и гидрофобный домен прилипания. D-форма описана в патенте США 5587456. В патенте США 5648330 описан циклический RGD-содержащий пептид, который имеет высокое сродство к GP Iib/IIIa.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий модуль является лигандом av р3 или av р5 интегрина.
Ранее сообщалось о применении avp3 лигандов для транспортировки цитотоксических химиотера-певтических лекарственных средств к опухолям (WPI 99-215158/199918). Однако в этой заявке идея заключалась в доставке к опухолевым сосудам токсичных соединений, таких как химиотерапевтические лекарственные средства, или токсины, или антиангиогенные соединения.
И, по контрасту, TNF является активатором эндотелиальных и имунных клеточных функций, лучшим, чем ингибитор или токсическое соединение.
Например, TNF, верно, является проангиогенной молекулой, а не антиангиогенной молекулой. Кроме того, несмотря на то, что TNF был открыт благодаря его цитотоксичности против некоторых линий опухолевых клеток, хорошо известно, что TNF редко может убивать клетки в культуре, если защитные механизмы не блокированы (например, ингибиторами транскрипции/трансляции).
Поэтому казалось, что противоопухолевая активность TNF основана на его активирующих эффектах на разных клетках и мало или не направляет цитотоксические эффекты на опухолевые клетки или эндотелиальные клетки. В этом контексте TNF выглядел бы как модификатор биологического ответа, а не как классическое цитотоксическое соединение.
Таким образом, терапевтические свойства TNF, доставленного avp3, являются неочевидными только на основании раскрытия в патенте WPI 99-215158/199918.
Молекулы, содержащие ACDCRGDCFCG звено, предполагались для нацеливания активированных мышиных, а также человеческих сосудов (72). Таким образом, можно ожидать, что человеческий RGD-TNF обладает лучшими противоопухолевыми свойствами, чем человеческий TNF у пациентов, как мы наблюдали с мышиными аналогами у мышей.
Максимально допустимая доза при болюсном введении TNF (внутривенно) у человека составляет 218-410 мкг/м2 (28), примерно в 10 раз ниже, чем эффективная доза у животных (29). Основываясь на данных, полученных на мышиных моделях, мы посчитали, что необходима в 10-50 раз большая доза для достижения противоопухолевого эффекта у людей (35). В первом клиническом изучении на гипертермической изолированной перфузии конечности высокие скорости ответа были получены с единственной дозой 4 мг TNF в комбинации с мелфаланом и интерфероном-у (32). Другие работы показали, что интер-фероном-у можно пренебречь и что даже меньшие дозы TNF могут быть успешными для вызова терапевтического ответа (33, 34). Так как даже это лечение не свободно от риска токсичности (35), использование RGD-TNF может представлять альтернативный подход к снижению токсических эффектов, по меньшей мере, в этом положении.
Кроме того, RGD-TNF кДНК могла бы быть использована для целей генной терапии вместо гена TNF (76), тогда как биотинилированный RGD-TNF мог бы применяться, в принципе, в комбинированном опухолевом предварительном нацеливании с биотинилированным антителом и авидином (71) для дальнейшего увеличения его терапевтического индекса.
Активин
Клетки, известные для экспрессии ActRII, включают эндотелиальные клетки. ActRIIB экспрессия
- 31 -
009955
очень похожа на экспрессию ActRII и также была найдена в эндотелиальных клетках. Клетки, известные для экспрессии ActRI, включают сосудистые эндотелиальные клетки. ActRIB также был идентифицирован в эндотелиальных клетках.
Ангиогенин
Ангиогенин (ANG) является негликозилированным полипептидом с молекулярной массой 14 кДа, названным так за его способность вызывать рост новых кровеносных сосудов.
Аннексин V
Аннексин V является членом семейства кальциевых и фосфолипидных связанных белков с сосудистой антикоагулянтной активностью. Существуют различные синонимы аннексина V: плацентарный протеин 4 (РР4), плацентарный антикоагулянтный протеин I (РАР I), калфобиндин I (CPB-I), кальцийза-висимый фосфолипидсвязывающий протеин 33 (СаВР33), сосудистый антикоагулянтный протеин альфа (VACa), анхорин CII, липокортин-V, эндонексин II и ингибитор тромбопластина. Ряд сайтов связывания для аннексина V был описан как 6-24х106/клетка в опухолевых клетках и 8,8х106/клетка для эндотели-альных клеток.
CD44
Другой молекулой, возможно вовлеченной в адгезию лейкоцитов (белых клеток), является CD44, молекула, повсеместно экспрессированная как на кроветворных, так и некроветворных клетках. CD44 замечательна ее способностью генерировать альтернативно сплайсированные формы, многие из которых различаются по их активности. Их выдающаяся пластичность привела к предположению, что CD44 через ее изменяющуюся природу играет роль в некоторых способах, которые используют опухолевые клетки для успешного развития в течение роста и метастазирования. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I (внеклеточный N-конец) в 80-250 кДа. Клетки, известные для экспрессии CD44H, включают сосудистые эндотелиальные клетки.
Имеется множество лигандов для CD44, включая остеопонтин, фибронектин, коллаген типов I и IV и гиалуронат. Сообщается, что связывание с фибронектином ограничивается вариантами CD44, экспрес-сирующими хрондроитин сульфат, с сайтом прилипания хрондроитина сульфата, локализованным в эк-зонах v8-v11. Предполагается, что гиалуронатное связывание возможно практически со всеми CD44 изоформами. Предполагается, что один из основных сайтов связывания сосредоточен в экзоне 2 и включает остатки лизина и аргинина. Обнаружены также другие, чем простая экспрессия известного гиалуро-натсвязывающего звена, факторы, необходимые для связывания гиалуроната. Успешному связыванию гиалуроната способствует объединение экспрессируемых экзонов, особенности цитоплазматического хвоста, гликозилированные структуры и состояние активности клеток. Таким образом, на основе его гиа-луронатсвязывающей функции, большая доля "потенциальной" пластичности существует внутри каждой CD44-экспрессирующей клетки.
Фактор роста фибробластов (FGF) Название "фактор роста фибробластов" (FGF) является ограничивающим описанием для этого семейства цитокинов. Функция FGF не ограничивается ростом клеток. Хотя некоторые FGFs, действительно, вызывают пролиферацию фибробластов, первоначальная молекула FGF (FGF-2 или основная FGF), как теперь известно, также вызывает пролиферацию эндотелиальных клеток, хондроцитов, гладких мышечных клеток, меланоцитов, а также других клеток. Он может также промотировать дифференциацию адипоцитов, вызывать продуцирование IL-6 макрофагами и фибробластами, стимулировать миграцию астроцита и пролонгировать нейронное выживание. На настоящее время суперсемейство FGF состоит из 23 членов, все из которых содержат консервативную центральную область из 120 аминокислотных остатков, которая содержит 6 идентичных вставленных аминокислот.
FGF-1.
Человеческий FGF-1 (также известный как FGF кислотный, FGFa, ECGF и HBGF-1) представляет собой негликозилированный полипептид в 17-18 кДа, который экспрессируется разными клетками всех трех зародышевых слоев. Связывающей молекулой может быть любой FGF рецептор. Клетки, известные для экспрессии FGF-1, включают эндотелиальные клетки.
FGF-2.
Человеческий FGF-2, также известный как FGF основной, HBGF-2 и EDGF, представляет собой не-гликозилированный полипептид в 18 кДа, который проявляет и внутриклеточную и внеклеточную активность. После секреции FGF-2 секвестируется на любой клеточной поверхности HS или матриксных гликозаминогликанах. Хотя FGF-2 секретируется как мономер, клеточная поверхность HS, кажется, ди-меризует мономерный FGF-2 в нековалентную бок-в-бок конфигурацию, которая вспоследствии способствует димеризации и активации FGF рецепторов. Клетки, известные для экспрессии FGF-2, включают эндотелиальные клетки.
FGF-3.
Человеческий FGF-3 представляет собой продукт int-2 гена (т. е. извлеченный из области интеграции 2, области на хромосоме 7 мыши, которая содержит ген (int-2/FGF-3), случайно активированный последующей ретровирусной инсерцией). Молекула синтезирована как гликопротеин с молекулярной массой 28-32 кДа, состоящий из 222 аминокислот, который содержит ряд пептидных звеньев. Сообщалось,
- 32 -
009955
что клетки для экспрессии FGF-3 ограничены развивающимися клетками и опухолями. Опухоли для экспрессии FGF-3 включают клеточные линии карциномы молочной железы и рака ободочной кишки.
FGF-4.
Человеческий FGF-4 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 22 кДа, состоящий из 176 аминокислот, который является продуктом развивающе-регуляторного гена. Молекула была синтезирована как предшественник из 206 аминокислот, который содержит большую неопределенную 30 аминокислотную сигнальную последовательность плюс два гепаринсвязанных звена (при аминокислотах 51-55 и 140-143). Гепаринсвязанные участки непосредственно связаны с активностью FGF-4; гепа-рин/гепаран регулирует способность FGF-4 к активации FGFR1 и FGFR2. Клетки, известные для экспрессии FGF-4, включают опухолевые клетки и эмбриональные клетки. Его идентификация в раке желудка человека дала толчок к одному альтернативному обозначению (/hst-1/hst), в то время как его выделение из саркомы Капоши заложило основу для другого названия (K-FGF).
IL-1R
IL-1 проявляет свое влияние путем связывания специфических рецепторов. Были идентифицированы два отдельных белка, связывающих IL-1 рецептор, плюс один несвязывающий сигнализирующий акцессорный белок.
Каждый имеет три внеклеточных иммуноглобулиноподобных (Ig-подобных) домена, квалифицирующих их в качестве членов семейства рецепторов цитокинов типа IV. Два связывающих рецептор белка определены как IL-1 рецептор типа I (IL-1 RI) и IL-1 рецептор типа II (IL-1 RII), соответсвенно. Человеческий IL-1 RI представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 80 кДа, состоящий из 522 аминокислот, который был выделен из эндотелиальных клеток.
RTK
Было найдено, что новое семейство тирозинкиназных рецепторов (RTK), Eph рецепторы и лиганды эфринов вовлечены в сосудистую сборку, ангиогенез, опухолегенез и метастазирование. Было также найдено, что Eph рецепторы класса А и их лиганды повышаются в опухоли и ассоциированной сосудистой системе.
ММР
Матриксные металлопротеиназы (MMPs) вовлечены в рост опухоли, ангиогенез, инвазию и мета-стазирование. Они также были предложены для использования в качестве опухолевых маркеров.
NG2
NG2 представляет собой большой полностью мембранный хондроитинсульфат протеогликан, который был впервые идентифицирован как молекула клеточной поверхности, экспрессируемая незрелыми невральными клетками. Впоследствии было найдено, что NG2 экспрессируется широким рядом незрелых клеток, а также разными типами опухолей с высокой злокачественностью. NG2 был предложен в качестве молекулы-мишени в опухолевой сосудистой системе. В частности, коллагеназа-1 (С1) является преобладающей матриксной металлопротеиназой, присутствующей во вновь образованных микрососудах, и служит как маркер неоваскуляризации.
Онкофетальный фибронектин
Также было найдено, что экспрессия онкофетального фрагмента фибронектина (Fn-f) увеличивается во время ангиогенеза, и он был предложен в качестве маркера опухолевого ангиогенеза. В одном варианте осуществления изобретения ТТМ является антителом или его фрагментом к онкофетальному ED-В домену фибронектина. Получение такого антитела и его конъюгация с IL-12 описаны Halin et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 264-269.
Тенасцин
Тенасцин является матриксным гликопротеином, встречающимся в злокачественных опухолях, включая рак мозга и рак молочной железы и меланому. Его экспрессия является злокачественной, но не вполне дифференцированные опухоли и ассоциация с кровеносными сосудами опухолей делают его не только важной мишенью для понимания биологии злокачественных опухолей и ангиогенеза, но и терапевтической раковой мишенью, а также маркером.
Нацеливающий модуль является предпочтительно полипептидом, который способен к связыванию с опухолевой клеткой или молекулой опухолевой сосудистой поверхности. Как и указанные выше, другие такие поверхностные молекулы, которые известны или становятся доступными, также могут быть нацелены в первую очередь.
Будет высоко оценен тот, кто сможет использовать обычное белковое связывание в способе идентификации молекул, которые связываются с поверхностными молекулами. Будет также высоко оценен тот, кто сможет использовать структурно-основанную лекарственную конструкцию для определения последовательностей, которые связывают поверхностные молекулы.
Высокопроизводительный скрининг, как описанный выше для синтетических соединений, также может быть использован для идентификации нацеливающих молекул.
Настоящее изобретение также предполагает использование конкурентоспособных методов скрининга лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные к связыванию мишени, специфически конкурируют с тестовыми соединениями для связывания мишени.
- 33 -
009955
Связывающий партнер (ВР) Нацеливающий модуль, главным образом, имеет форму связывающего партнера (ВР) с поверхностной молекулой, содержащего или состоящего из одного или более связывающих доменов.
Лиганд
Нацеливающий модуль по настоящему изобретению может иметь форму лиганда. Лиганды могут быть природными или синтетическими. Термин "лиганд" также относится к химически модифицированным лигандам. Один или более связывающих доменов ВР могут состоять, например, из природного ли-ганда для рецептора, причем природный лиганд может быть молекулой адгезии, или лигандом рецептора фактора роста (например, эпидермального фактора роста), или фрагментом природного лиганда, который сохраняет связывающую способность к рецептору.
Синтетические лиганды включают конструктивные лиганды. Используемый здесь термин "конструктивные лиганды" относится к агентам, которые, вероятно, связываются с рецептором на основе сравнения их трехмерной формы и трехмерной формы рецептора.
Антитела
Альтернативно, связывающие домены могут быть получены из последовательностей тяжелых и легких цепей из вариабельной области иммуноглобулина (Ig). Такая вариабельная область может быть получена из природного человеческого антитела или антитела другого вида, например антитела грызунов. Альтернативно, вариабельная область может быть получена из конструированного антитела, такого как гуманизированное антитело, или из библиотеки демонстрации фагов из иммунизированных или не-иммунизированных животных или библиотеки демонстрации мутагенных фагов. В качестве второй альтернативы, вариабельная область может быть получена из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). BP может содержать другие последовательности для достижения мультимеризации или действовать как спейсер между связывающими доменами или образуется в результате инсерции рестрикцион-ных сайтов в генах, кодирующих Вр, включая последовательности Ig петли или новые спейсеры и конструированные линкерные последовательности.
ВР может содержать дополнительно одну или более вариабельных областей иммуноглобулина, всю или часть константной области тяжелой цепи Ig и также может содержать природный целый Ig, конст-руктированный Ig, конструктированную Ig-подобную молекулу, одноцепочечный Ig или одноцепочеч-ную Ig-подобную молекулу. Альтернативно или в дополнение, ВР может содержать один или более доменов из другого белка, такого как токсин.
Используемый здесь термин "антитело" относится к белку, содержащему один или более полипети-дов, в основном, кодируемых генами иммуноглобулина или фрагментами генов иммуноглобулина. Антитела могут существовать как в виде интактного иммуноглобулина, так и в виде ряда фрагментов, включая полноохарактеризованные фрагменты, получаемые перевариванием с различными пептидазами. В то время как различные фрагменты антител определены на основе переваривания интактных антител, был бы высоко оценен тот специалист, который смог бы синтезировать фрагменты антител de novo или химически, или используя технологию рекомбинантных ДНК. Таким образом, используемый здесь термин " антитело" также включает фрагменты антител, или полученные модификацией целого антитела, или синтезированные de novo с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Фрагменты антител, охватываемые термином "антитела", включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv diabody и Fd фрагменты.
Изобретение также включает моноклональные или поликлональные антитела к поверхностным белкам. Таким образом, настоящее изобретение далее включает способ получения моноклональных или поликлональных антител к полипептидам по изобретению.
Если желательны поликлональные антитела, выбранное млекопитающее (например, мышь, кролик, коза, лошадь и т. д.) иммунизируют иммуногенным полипептидом, несущим эпитоп(ы). Сыворотку от иммунизированного животного собирают и обрабатывают по известным методикам. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела к эпитопу, содержит антитела к другим антигенам, то поликло-нальные антитела могут быть очищены иммуноаффинной хроматографией. Методики продуцирования и выделения поликлональной антисыворотки известны из уровня техники. Для того, чтобы такие антитела могли быть получены, изобретение также включает полипептиды по изобретению или их фрагменты, гаптенизированные другим полипептидом для использования в качестве иммуногена у животного или человека.
Моноклональные антитела, направленные против связывания эпитопов клеточной поверхности в полипептидах, могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методология для изготовления моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Иммортализованная анти-телопродуцирующая линия клеток может быть создана слиянием клеток, а также другими методиками, такими как прямая трансформация В-лимфоцитов с онкогенной ДНК или трансфекция вирусом Эпштей-на-Барр. Панели моноклональных антител, полученных против эпитопов, могут быть исследованы на различные свойства, например изотопное и эпитопное сродство.
Альтернативный метод включает скрининг библиотек демонстрации фагов, где, например, фаг экс-прессирует scFv фрагменты на поверхности их оболочек с большим рядом комплементарно детермини
- 34 -
009955
рующих областей (CDRs). Это метод хорошо известен из уровня техники.
Для целей этого изобретения термин "антитело", если не указано противоположное, включает фрагменты целых антител, которые сохраняют их связывающую активность для антигена-мишени. Как указывалось выше, такие фрагменты включают Fv, F(ab') и F(ab')2 фрагменты, а также одноцепочечные антитела (scFv). Кроме того, антитела и их фрагменты могут быть гуманизированными антителами, например, как описано в ЕР-А-239400.
Скрининг
Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу скрининга агента, способного к связыванию с опухолью или молекулой опухолевой сосудистой клеточной поверхности, способу, включающему контактирование молекулы клеточной поверхности с агентом и детерминирование, если указанный агент связывает указанную молекулу клеточной поверхности.
Используемый здесь термин "агент" включает, но не ограничивается им, соединение, такое как тестовое соединение, которое может быть доступно или получено любым подходящим путем, природным или нет. Агент может быть сконструирован или доступен из библиотеки соединений, которая может содержать пептиды, а также другие соединения, такие как малые органические молекулы и особенно новые соединения свинца. Для примера, агент может быть природным веществом, биологической макромолекулой или экстрактом, полученным из биологических материалов, таких как бактерии, грибки или животные (предпочтительно млекопитающих) клетки или ткани, органической или неорганической молекулой, синтетическим тестовым соединением, полусинтетическим тестовым соединением, структурным или функциональным миметиком, пептидом, пептидомиметиком, производным тестового соединения, пептидом, отщепленным из целого белка, или пептидом, синтезированным искусственно (так, как в примере, или используя пептидный синтезатор) или рекомбинантными методиками или их комбинацией, рекомбинантным тестовым соединением, природным или неприродным тестовым соединением, слитым белком или его эквивалентом или мутантами, производными или их комбинациями.
Агент может быть аминокислотной последовательностью или их химическим производным. Вещество может быть даже органическим соединением или другим химикатом. Агент может быть нуклеотид-ной последовательностью, которая может быть смысловой последовательностью или антисмысловой последовательностью.
Белок
Термин "белок" включает одноцепочечные полипептидные молекулы, а также мультиплетные полипептидные комплексы, где индивидуальные составные полипептиды связаны ковалентным или неко-валентным способом. Термин "полипептид" включает пептиды из 2 или более кислот в длину, обычно имеющие более 5, 10 или 20 аминокислот.
Гомологи полипептидов
Следует понимать, что последовательности полипептидов для использования в настоящем изобретении не ограничиваются индивидуальными последовательностями или их фрагментами, но также включают гомологичные последовательности, полученные любым путем, например родственные вирусно/бак-териальные белки, клеточные гомологи или синтетические пептиды, а также варианты и их производные. Последовательности полипептидов по настоящему изобретению также включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по настоящему изобретению.
Варианты полипептидов, производные и фрагменты
Термины "вариант" или "производное" в отношении аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению включают любое замещение, вариацию, модификацию, перемещение, делецию или добавление одной (или более) аминокислот из или в последовательность, при условии, что результирующая аминокислотная последовательность предпочтительно имеет нацеливающую активность, предпочтительно имея по меньшей мере 25-50% активностиполипептидов, представленных в перечне последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, по существу, такую же активность.
Таким образом, последовательности могут быть модифицированы для использования в настоящем изобретении. Обычно модификации делают, чтобы сохранить активность последовательности. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотное замещение может быть выполнено, например, 1, 2 или 3 и до 10, 20 или 30 замещений, при условии, что модифицированная последовательность сохраняет по меньшей мере около 25-50% активности или, по существу, имеет такую же активность. Однако в альтернативном варианте осуществления изобретения модификации аминокислотных последовательностей полипептидов по изобретению могут быть выполнены с целью снизить биологическую активность полипетида. Например, могут быть полезными усеченные полипептиды, которые сохраняют способность связывания с молекулой-мишенью, но теряют функциональные эффекторные домены.
В основном, предпочтительно менее чем 20, 10, 5% аминокислотных остатков вариантов или производных изменяются по сравнению с соответствующей областью, отображенной в перечне последовательности.
Аминокислотное замещение может включать использование не встречающихся в природе аналогов, например, чтобы увеличить период полураспада в плазме крови терапевтически введенного полипептида
- 35 -
009955
(см. ниже подробностим получения производных пептидов для использования в терапии).
Консервативное замещение может быть выполнено, например, в соответствии с нижеприведенной таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке второй колонки и предпочтительно в одной линии третьей колонки могут быть замещены друг другом.
Алифатическая
Неполярная
GAP
ILV
Полярная-незаряженная
CSTM
Полярная-заряженная
К R
Ароматическая
HFWY
Полипептиды по изобретению также включают фрагменты вышеуказанных полипептидов и их варианты, включая фрагменты последовательностей. Предпочтительные фрагменты включают те, которые включают эпитоп. Подходящие фрагменты будут по меньшей мере около 5, например 10, 12, 15 или 20 аминокислот в длину. Они могут быть также менее чем 200, 100 или 50 аминокислот в длину. Полипептидные фрагменты белков и аллельные и видовые варианты их могут содержать 1 или более (например, 2, 3, 5 или 10) замещений, делеций или инсерций, включая консервативные замещения. При выполнении замещений, делеций и/или инсерций, например, посредством рекомбинантной технологии предпочтительно изменяется менее чем 20, 10 или 5% аминокислотных остатков, отображенных в перечне последовательности.
Белки по изобретению обычно изготавливают рекомбинантными способами, например, как описано ниже. Однако они могут быть также изготовлены синтетическими способами с использованием методик, хорошо известных специалистам, таких как твердофазный синтез. Различные методики химического синтеза пептидов рассматривались Borgia and Fields, 2000, TibTech. 18: 243-251 и описаны подробно в содержащихся там ссылках.
Получение
Способы получения CD13 L-IFN конъюгатов были описаны в WO 01/61017. Например, интерферон гамма может быть слит с CNGRC пептидом методом генной инженерии или путем химического синтеза. Данная димерная структура интерферона гамма, конъюгаты, несущие два CNGRC звена при N-конце или С-конце, предпочтительна для обеспечения мультивалентных высоко авидностных взаимодействий.
Используя похожие методы, можно получить CRGDC-IFN-y конъюгаты для использования в комбинации с CNGRC-TNF.
Специалист в данной области техники может легко получить конъюгаты avp3L-TNF с антителом или фрагментами антитела, которые нацеливают опухолевые клетки или опухолеассоциированные сосуды, для дальнейшего увеличения хоминга к опухоли этих производных TNF. Например, avp3L-TNF можно спарить с антителами против опухолеспецифических антигенов или против других опухолевых ангиогенных маркеров, например матриксные металлопротеазы (57) или сосудистый эндотелиальный фактор роста (58), или направленных против компонентов внеклеточного матрикса, такими как антитела антитенасцина или антифибронектиновый EDB домен.
Конъюгат avp3L-TNF может быть получен многими путями. Например, avp3L является антителом или его фрагментом, предпочтительно человеческого происхождения или несущим гуманизированный клеточный каркас. В предпочтительном варианте осуществления изобретения avp3L является пептидом. Например, недавно с использованием фагопептидных библиотек был открыт пептид, который связан с avp3. Этот пептид характеризуется наличием последовательности CRGDC. Пептиды или антитела могут быть спарены с TNF с использованием хорошо известных технологий рекомбинантных ДНК или с помощью химической конъюгации. Эти молекулы могут быть также получены непрямой конъюгацией, например они могут быть обе биотинилированы и спарены с использованием четырехвалентного авиди-на в качестве нековалентного кросс-линкера.
Терапевтические пептиды
Пептиды по настоящему изобретению могут быть введены терапевтически пациенту. Предпочти
- 36 -
009955
тельно использовать пептиды, которые не состоят исключительно из встречающихся в природе аминокислот, но которые модифицированы, например, с пониженной иммуногенностью, с повышенным цир-куляторным полупериодом в теле пациента, с улучшенной биопереносимостью и/или повышенной эффективностью и/или специфичностью.
Был использован ряд подходов для модификации пептидов для терапевтического применения. Один из подходов заключается в связывании пептидов или белков с различными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (PEG) и полипропиленгликоль (PPG) - см., например, патенты США №№ 5091176, 5214131 и 5264209.
Замена встречающихся в природе аминокислот различными некодированными или модифицированными аминокислотами, такими как D-аминокислоты и N-метиламинокислоты, также может быть использована для модификации пептидов.
Другой подход заключается в использовании бифункциональных кросс-линкеров, таких как N-сук-цинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (см. патент США 5580853).
Было бы желательно использовать производные пептидов по изобретению, которые являются кон-формационно ограниченными. Конформационное ограничение связано со стабильностью и предпочтительной конформацией трехмерной формы, принимаемой пептидом. Конформационные ограничения включают локальные ограничения, включающие ограничивание конформационной подвижности единичного остатка в пептиде; региональные ограничения, включающие ограничивание конформационной подвижности группы остатков, которые могут образовывать некоторую вторичную структурную единицу; и общие ограничения, включающие полную структуру пептида.
Активная конформация пептида может быть стабилизирована посредством ковалентной модификации, такой как циклизация, или внедрением гамма-лактамных или другого типа мостиков. Например, боковые цепи могут быть циклизованы в скелет, чтобы создать L-гамма-лактамное звено на каждой стороне сайта взаимодействия. См., в основном, Hruby et al., "Applications of Synthetic Peptides," in Synthetic Peptides: A User's Guide: 259-345 (W.H. Freeman & Co. 1992). Циклизация также может быть достигнута, например, образованием цистеиновых мостиков, связыванием амино- и карбоксиконцевых групп соответствующих концов аминокислот или связыванием аминогрупп остатка Lys или соответствующего гомолога с карбоксигруппой Asp, Glu или соответствующего гомолога. Связывание альфа-аминогрупп полипептида с эпсилон-аминогруппами остатка лизина с использованием иодацетангидрида также может быть осуществлено. См. Wood and Wetzel, 1992, Int'l J. Peptide Protein Res. 39: 533-39.
Другой подход, описанный в US 5891418, включает введение скелета с комплексообразующим ионом металла в структуру пептида. Обычно предпочтительный металлопептидный скелет основан на необходимом количестве частных координирующих групп, требуемых координационной сферой данного ком-плексообразующего иона металла. В основном, большинство ионов металлов, которые могут использоваться, имеют координационное число от 4 до 6. Природа координирующих групп в пептидной цепочке включает атомы азота аминной, амидной, имидазольной или гуанидиновой функциональных групп, атомы серы тиолов или дисульфидов и атомы кислорода гидроксильной, фенольной, карбонильной или карбоксильной функциональных групп. Кроме того, пептидная цепочка или индивидуальные аминокислоты могут быть химически изменены включением координирующих групп, таких как, например, оксим, гид-разино, сульфидрил, фосфат, циано, пиридино, пиперидино или морфолино. Структура пептида может быть и линейной, и циклической, однако, линейная структура обычно предпочтительна. Примером малого линейного пептида является Gly-Gly-Gly-Gly, который имеет 4 азота (N4 комплексобразующая система) в скелете, за счет чего может образовывать комплекс с ионом металла с координационным числом 4.
Другой методикой улучшения свойств терапевтических пептидов является использование непептидных пептид омиметиков. Широкий ряд используемых методик может быть применен для установления точной структуры пептида. Эти методики включают определение последовательности аминокислот, рентгеноструктурную кристаллографию, масс-спектроскопию, спектроскопию ядерно-магнитного резонанса, компьютерное молекулярное моделирование, составление генетической карты пептида и их комбинации. Структурный анализ пептидов обычно приводит к большому объему данных, которые включают аминокислотную последовательность пептида, а также трехмерное расположение его атомов. На основании этой информации могут быть изображены непептидные пептидомиметики, которые имеют требуемую для терапевтической активности химическую функциональность, но являются более стабильными, например менее подвержены биологической деградации. Пример такого подхода приведен в US 5811512.
Методики химического синтеза терапевтических пептидов по изобретению описаны в вышеприведенных ссылках, а также в обзоре Borgia and Fields, 2000, TibTech. 18: 243-251 и подробно описаны в содержащихся там ссылках.
Бифункциональные производные Следующий вариант осуществления изобретения относится к бифункциональным производным, в которых цитокины, модифицированные с ТТМ, конъюгированы с антителами или их фрагментами, против опухолевых антигенов или других опухолевых ангиогенных маркеров, например av интегрины, ме-таллопротеазы или фактор сосудистого роста, или антителами или их фрагментами, направленными про
- 37 -
009955
тив компонентов внеклеточного матрикса, такими как антитела антитенасцина или антифибронектина EDB домен. Недавно сообщалось о получении продукта слияния между TNF и шарнирной областью mAb против опухолеассоциированного TAG72 антигена, экспрессируемого желудочной и яичниковой аденокарциномой.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к опухолевому предварительному нацеливанию с системой биотин/авидин. Согласно этому подходу на опухолевом антигенном сайте в несколько различный стадий получают трехкомпонентный комплекс, который сформирован: 1) биотини-лированным mAb, 2) авидином (или стрептавидином) и 3) бивалентным цитокином, модифицированным с ТТМ и биотином. Ряд сообщений утверждают, что предварительное нацеливание по сравнению с традиционным нацеливанием с иммуноконъюгатами может, действительно, увеличить отношение активных молекул, нацеленных на мишень, к свободным активным молекулам, понижая таким образом токсичность лечения. Этот метод показал благоприятные результаты с биотинилированным TNF, который был способен стимулировать цитотоксичность in vitro и уменьшать рост опухолевых клетов в условиях, в которых обычный TNF был неактивен. Метод предварительного нацеливания также может быть осуществлен по двухфазной процедуре путем использования биспецифичного антитела, которое одновременно связывается с опухолевым антигеном и модифицированным цитокином. Использование биспецифичного антитела, направленного против карциноэмбрионального антигена и TNF, недавно было описано как способ для TNF опухолевого предварительного нацеливания.
Опухолевое предварительное нацеливание является другим подходом, который стал недавно развиваться. Предварительное нацеливание может быть выполнено с рядом разных классов соединений в со-отвествии с "двухшаговым" или "трехшаговым" подходом (59). Специфический пример, основанный на авидин-биотиновой системе, предложенной для иммуносцинтиграфии опухолей, может быть полезным для иллюстрации принципа. В этом случае биотинилированный mAb, специфичный к опухолеассоции-рованному антигену, вводится первым ("нацеливающая" молекула, первый шаг). На следующий день вводится авидин или стрептавидин ("преследующая" молекула, второй шаг), четырехвалентные макромолекулы, которые образуют комплекс с биотинилированным mAb и способствуют быстрому удалению избытка циркулирующих молекул. Еще днем позже вводится меченный радионуклидом биотин ("эффек-торная" молекула, третий шаг). Это время, когда и "нацеливающая", и "преследующая" макромолекулы эффективно удалены из циркуляции. Это делает возможными быструю диффузию и локализацию эффектора в опухоли, а также быстрое выведение избытка циркулирующих свободных молекул. Это явно отличается от непосредственно меченных mAb, которые циркулируют значительно более длинный период времени, увеличивая таким образом фон в иммуносцинтиграфии и токсические побочные явления в радиоиммунотерапии. Несколько сообщений показывают, что подход предварительного нацеливания, действительно, может сильно улучшить отношение мишень/кровь по сравнению с традиционным нацеливанием с иммуноконъюгатами и уменьшить токсичность лечения (60, 61, 62, 63).
Применение стратегии предварительного нацеливания в опухолевой терапии с биотинилированным TNF вызывало особый интерес из-за явно высшей аффинности биотин-авидин взаимодействия (10-15) по сравнению с аффинностью TNF-TNFR взаимодействий. Это предполагало допустить эффективное преимущественное связывание биотинилированного TNF с предварительно нацеленными клетками над клетками, экспрессирующими TNF, и продлить его персистенцию на опухолевом сайте. На основании этого подхода недавно было описано использование трехшаговой mAb/авидин системы для нацеливания биотинилированного TNF (Moro, 1997). Клетки мышиной RMA лимфомы, которые были трансфектиро-ваны с Thy 1.1 аллелью, созданы Gasparri et al. (71). Аналогичный подход может быть использован для дальнейшего увеличения терапевтического индекса биотинилированного avp3L-TNF.
Стратегия avp3L-TNF предварительного нацеливания вовсе не обязательно ограничивается "трех-шаговым" подходом. Например, "двухшаговый" подход, описанный в литературе, основан на использовании биспецифичного антитела, с одной стороны, специфичного для опухолевого антигена и, с другой, для TNF. В частности, недавно было описано использование биспецифичного антитела, направленного против онкофетального антигена, и TNF, чтобы нацелить TNF на опухоли (64).
Согласно следующему варианту осуществления изобретение включает цитокин, конъюгированный с ТТМ и антителом или его фрагментом (прямо или опосредованно через мостик биотин-авидин), на различных TNF субъединицах, где антитело или его фрагменты направлены против антигена, экспрессиро-ванного на опухолевых клетках или других компонентах опухолевой стромы, например тенацин или фибронектин EDB домене. Результаты - в дальнейшем улучшении опухолевых хоминговых свойств модифицированного цитокина и в слабом высвобождении последнего в опухолевую микросреду через три-мер-мономер-тример переходы. Модифицированные субъединицы, например, TNF конъюгатов могут диссоциировать из нацеливающих комплексов и реассоциировать с образованием немодифицированных тримерных TNF молекул, которые затем диффундируют в опухолевую микросреду. Было показано, что высвобождение биоактивного TNF осуществляется через 24-48 ч после нацеливания.
Получение цитокинов в форме липосом может улучшить их биологическую активность. Действительно, наблюдали, что ацилирование аминогрупп TNF приводит к увеличению его гидрофобности без
- 38 -
009955
потери биологической активности in vitro. Кроме того, сообщалось, что TNF, связанный с липидами, имеет неповрежденные цитотоксичность in vitro, иммуномодулирующие свойства и пониженную токсичность in vivo.
Инкапсулирование avp3L-TNF в липосомы может быть еще одним путем улучшения, в качественном отношении, его биологического профиля. Осуществимость этого подхода была подсказана наблюдением, что ацилирование некоторых аминогрупп TNF ведет к увеличению его гидрофобности без потери его биологической активности in vitro. Эти данные были использованы, чтобы без труда интегрировать TNF в липосомы. Сообщалось, что такой липидно-связанный TNF сохраняет неизмененными in vitro цитотоксичность на опухолевых клетках и иммуномодулирующие свойства и в то же время имеет меньшие токсические эффекты in vivo (48, 49).
Получение производных avp3L-TNF с полиэтиленгликолем (пэгулирование) может рассматриваться как предпочтительный выбор для удлинения его периода полураспада.
Во многих случаях измеренный период полураспада TNF in vivo может быть более кажущимся, чем реальным. Таким образом, наблюдали, что этот параметр сильно зависит от введенной дозы, и заметили диспропорциональное удлинение периода полураспада при увеличении доз TNF (50). Одним объяснением этого феномена является то, что при низких дозах TNF эффективно связывается растворимым циркулирующим TNFR (51). Содержание такого растворимого TNFR быстро возрастает в сыворотке пациента, леченного системно TNF (52), и является результатом протеолитического расщепления поверхностно-связанных рецепторов. TNF, связанный с циркулирующим TNFR, может избежать обнаружения в большинстве анализов, обычно используемых для измерения уровней TNF. Измерения для определения несвязанного циркулирующего TNF начинают при уровне выше порогового, при котором все растворимые TNFR, и базальные, и TNF-индуцируемые, становятся насыщенными, отражая таким образом, более точно, действительный in vivo период полураспада TNF.
Очевидно, что пэгулирование TNF не предполагает избавления от этих мешающих эффектов TNFR, и, таким образом, любой подход, направленный на удлинение периода полураспада TNF, и, в целом, при уменьшении доз вводимого TNF, должен учитывать тот факт, что, для того, чтобы быть активным, уровень TNF должен превышать связывающую способность растворимого циркулирующего TNFR. Тем не менее, одной из возможностей справиться с этой проблемой является мутагенез CD13L-TNF, чтобы ослабить его способность взаимодействовать с природными TNF рецепторами, делая, таким образом, возможным введение более высоких доз.
Комбинированный подход
Один из легчайших подходов, который позволяет достичь наиболее благоприятного терапевтического индекса для системного введения TNF, заключается в объединении TNF с другими агентами. Была надежда достичь терапевтических методов, позволяющих вводить низшие дозы TNF, которые при одновременном сохранении противоопухолевой активности имели меньшие системные токсические эффекты. Этот подход был сильно спекулятивным, потому что нельзя было исключить возможность, что такие методы привели бы к синергетическому эффекту также в отношении токсичности и, вследствие этого, к терапевтическому индексу, идентичному тому, который наблюдали с одним TNF. Действительно, во всех случаях, в которых такая комбинация терапевтических методов была изучена на людях, эта последняя ситуация, как было доказано, оказалась верной.
Один из этих подходов, который был изучен наиболее подробно, заключался в объединенном использовании TNF и IFN-y (36, 37), особенно из-за синергизма действия на эндотелиальные клетки этих цитокинов. Второй подход заключается в объединении с химиотерапией.
Методы объединения TNF и некоторых соединений, описанных как синергисты TNF, были изучены на некоторых экспериментальных опухолевых моделях. К сожалению, это лечение сопровождалось повышенной системной токсичностью.
Нацеленная доставка TNF к опухолевым сосудам является подходом, который недавно был предложен для увеличения терапевтического индекса TNF. WO 01/61017 описывает производное TNF с улучшенным терапевтическим индексом, полученное связыванием TNF с лигандом аминопептидазы N (CD13), мембранной протеазой, экспрессированной в опухолевых сосудах. Этот цитокин взаимодействует очень сложным образом с CD13 и TNF-рецепторами, селективно активируя при низких дозах опухолевые эндотелиальные клетки. Получив синергетический эффект TNF и IFN-y на эндотелиальных клетках, было бы целесообразно нацелить на эндотелиальные клетки оба цитокина, конъюгированных с CD13 лигандами. Однако можно было ожидать, что эти модифицированные цитокины конкурируют за один и тот же рецептор (CD13) на эндотелиальных клетках, приводя к потере нацеливания и активности. WO 01/61017 показывает, как получить конъюгаты этого цитокина с CD13 лигандами, например NGR-TNF и NGR-IFN-y. Эксперименты, выполненные в нашей лаборатории, основанные на введении TNF и IFN-y, обоих конъюгированных с CD13 лигандом (CNGRC), показали, что, действительно, когда эти модифицированные цитокины вводились животным моделям, их терапевтическая активность была ниже, чем когда они вводились одни, вероятно потому, что они конкурируют за один и тот же нацеливающий рецептор.
- 39 -
009955
Мы нашли, что эти цитокины могут быть нацелены к сосудам без перекрестного вмешательства в связывание, например, путем нацеливания TNF к опухолевому сосудистому рецептору, отличному от CD13, и IFN-y к CD13 (например, спариванием его с CNGRC пептидом) или наоборот.
В этом предпочтительном варианте осуществления изобретения TNF спарен с лигандами avp3, такими как пептиды, содержащие CRGDC звено. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается объединенное использование avp3L-IFN-производного и CD13 лиганд-TNF. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается объединенное использование avp3L-TNF производного и CD13 лиганд-IFN-y.
Полинуклеотиды
Полинуклеотиды для использования в изобретениии содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные конъюгаты по изобретению. Специалисту должно быть понятно, что ряд различных полинуклеотидов может кодировать один и тот же полипептид как результат дегенерации генетического кода. Кроме того, следует понимать, что специалист может, используя общепринятые методики, выполнить нуклеотидные замещения, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемого полинуклеотидами по изобретению, чтобы отразить использование кодона любого индивидуального организма-хозяина, в котором полипептиды по изобретению экспрессируются.
Полинуклеотиды по изобретению могут содержать ДНК или РНК. Они могут быть однонитевыми или двунитевыми. Они могут быть также полинуклеотидами, которые включают внутри них синтетические или модифицированные нуклеотиды. Из уровня техники известен ряд различных типов модификации олигонуклеотидов. Они включают метилфосфонилирование и фосфоротиолирование скелета, добавление акридиновой и полилизиновой цепей при 3 и/или 5 концах молекулы. Для целей настоящего изобретения понятно, что полинуклеотиды, описанные здесь, могут быть модифицированы любым методом, доступным из уровня техники. Такие модификации могут быть выполнены для того, чтобы усилить активность in vivo или продолжительность жизни полинуклеотидов по изобретению.
Нуклеотидные векторы
Полинуклеотиды по изобретению могут быть инкорпорированы в рекомбинантный способный к репликации вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Таким образом, в следующем варианте осуществления изобретения предложен метод получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в способный к репликации вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяин и выращивания клетки-хозяина при условиях, которые вызывают репликацию вектора. Вектор может быть получен обратно из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, такие как Е. coli, дрожжи, линии клеток млекопитающих и другие эукариотические линии клеток, например клетки насекомых Sf9.
Предпочтительно полинуклеотид по изобретению в векторе является операбельно связанным с контрольной последовательностью, обеспечивающей экспрессию кодирующей последовательности клеткой-хозяином, т. е. вектор является вектором экспрессии. Термин "операбельно связанный" означает, что описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предназначенным им способом. Регуляторная последовательность, "операбельно связанная" с кодирующей последовательностью, перекрестно связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условии совместимости с контрольной последовательностью.
Контрольные последовательности могут быть модифицированы добавлением последующих транскрипционных регуляторных элементов, чтобы сделать уровень транскрипции, направляемый контрольными последовательностями, более чувствительным к транскрипционным модуляторам.
Векторы по изобретению могут быть трансформированы или трансфектированы в подходящую клетку-хозяин, как описанные ниже, предусматривающие экспрессию белка по изобретению. Этот процесс может включать культивирование клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, как описанный выше, при условиях, предусматривающих экспрессию вектором кодирующей последовательности кодирующего белка, и необязательно, выделение экспрессированного белка.
Векторами могут быть, например, плазмида или вирусный вектор, полученный с источником репликации, необязательно промотором экспрессии указанного полинуклеотида и необязательно регулятором промотора. Векторы могут содержать один или более селективных маркерных генов, например устойчивый к ампициллину ген в случае бактериальной плазмиды или устойчивый к неомицину ген для вектора млекопитающих. Векторы могут быть использованы, например, для трансфекции или трасфор-мации клетки-хозяина.
Контрольные последовательности, операбельно связанные с последовательностью кодирующего белка по изобретению, включают промоторы/энхансеры и другие сигналы регуляции экспрессии. Эти контрольные последовательности могут быть подобраны по совместимости с клеткой-хозяином, в которой вектор экспрессии будет использоваться. Термин "промотор" хорошо известен из уровня техники и охватывает области нуклеиновых кислот, распределенных по размеру и сложности от минимальных промоторов до промоторов, включающих высшие элементы и энхансеры.
Промоторы обычно выбирают из промоторов, которые являются функциональными в клетках мле
- 40 -
009955
копитающих, хотя могут быть использованы прокариотические промоторы и промоторы, функциональные в других эукариотических клетках. Промотор обычно извлекают из последовательности промотора вирусных или эукариотических генов. Например, возможен промотор, извлеченный из генома клетки, в которой осуществлена экспрессия. Что касается эукариотических промоторов, они могут быть промоторами, которые функционируют повсеместно (такие, как промоторы а-актина, b-актина, тубулина) или, альтернативно, тканеспецифично (такие, как промоторы генов пируваткиназы). Могут быть также использованы тканеспецифичные промоторы, специфичные к различным клеткам. Они могут быть также промоторами, которые реагируют на специфичные стимулы, например промоторами, которые связывают рецепторы стероидных гормонов. Могут также использоваться вирусные промоторы, например длинно-концевой повторный промотор вируса лейкемии мыши Молони (MMLV LTR), LTR промотор вируса саркомы Рауса (RSV) или IE промотор цитомегаловируса человека (CMV).
Также может быть благоприятным, если промоторы будут индуцибельными, для того чтобы уровни экспрессии гетерологичных генов можно было регулировать на протяжении времени жизни клетки. Ин-дуцибельный означает, что уровни экспрессии, полученные, используя промотор, могут регулироваться.
Кроме того, любой из этих промоторов может быть модифицирован добавлением других регуля-торных последовательностей, например энхансерной последовательности. Могут также использоваться химерные промоторы, содержащие элементы последовательности из двух или более различных промоторов, описанных выше.
Клетки-хозяева
Векторы и полинуклеотиды по изобретению могут быть внедрены в клетку-хозяин для целей репликации векторов/полинуклеотидов и/или экспрессии белков по изобретению, кодированных полинук-леотидами по изобретению. Хотя белки по изобретению могут быть продуцированы с использованием прокариотических клеток в качестве клеток-хозяев, предпочтительно использовать эукариотические клетки, например дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих, в частности клетки млекопитающих.
Векторы/полинуклеотиды по изобретению могут быть внедрены в подходящую клетку-хозяин с использованием различных методик, известных из уровня техники, таких как трансфекция, трансформация и электропорация. Известны различные методики из уровня техники, где векторы/полинуклеотиды по изобретению вводятся животным, например инфицирование рекомбинантными вирусными векторами, такими как ретровирусы, вирусы герпеса и аденовирусы, прямая инъекция нуклеиновых кислот и биоли-тическая трансформация.
Экспрессия белка и очистка
Клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут быть использованы для экспрессии белков по изобретению. Клетки-хозяева могут культивироваться в соответствующих условиях, которые позволяют экспрессию белков по изобретению. Экспрессия белков по изобретению может быть конститутивной при условии, чтобы они непрерывно продуцировались, или индуцибельной, требующей стимуляции для инициирования экспрессии. В случае индуцибельной экспрессии продуцирование белка может быть инициировано, когда требуется, например, добавлением вещества индуктора в культураль-ную среду, например дексаметазона или IPTG.
Белки по изобретению можно экстрагировать из клеток-хозяев различными методиками, известными из уровня техники, включая энзиматический, химический и/или осмотический лизис и физическое разрушение.
Введение
Белки по изобретению предпочтительно могут быть объединены с различными компонентами для получения композиций по изобретению. Предпочтительно композиции объединяются с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем с получением фармацевтической композиции (которые могут использоваться для людей или животных). Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например фосфатно-буферный солевой раствор. Подробное описание наполнителей можно найти в The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edn, Eds Wade & Weller, American Pharmaceutical Association. Композиция по изобретению может быть введена прямой инъекцией. Композиция может быть выполнена в форме для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного, орального или трансдермального введения.
Обычно конъюгат может быть введен в дозе от 1 до 10 мг.
Композиция может быть выполнена в такой форме, что введение ежедневно, еженедельно или ежемесячно будет достигаться желаемой ежедневной дозировкой. Должно быть по достоиству оценено то, что композиция может быть легко выполнена в форме, вводимой менее часто, например каждые 2, 4, 6, 8, 10 или 12 ч.
Полинуклеотиды/векторы, кодирующие компоненты полипептидов, могут быть введены непосредственно в виде голой конструкции нуклеиновой кислоты, предпочтительно содержащей фланкирующие последовательности, гомологичные геному клетки-хозяина.
Поглощение голой конструкции нуклеиновой кислоты клетками млекопитающих повышают различными известными методиками трансфекции, например методиками, вкючающими использование трансфекционных агентов. Пример этих агентов включает катионные агенты (например, кальцийфосфат
- 41 -
009955
и DEAE-декстран) и липофектанты (например, липофектам(tm) и трансфектам). Обычно конструкции нуклеиновых кислот смешивают с трансфекционным агентом с получением композиции.
Предпочтительно полинуклеотид или вектор по изобретению объединяют с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем с получением фармацевтической композиции. Подходящие носители и разбавители включают изотонические солевые растворы, например фосфатно-буферный солевой раствор. Композиция может быть выполнена в форме для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного или трансдермального введения.
Пути введения и описанные режимы дозировки приведены только как рекомендации, поскольку специалист-практик будет способен легко определить оптимальный путь введения и режимы дозирования для любого конкретного пациента и условий.
Вирусные векторы
В предпочтительном варианте осуществления конъюгат вводится с использованием вирусного вектора, более предпочтительно ретровирусного вектора.
Ретровирусы
Ретровирусный вектор может быть полученным или извлекаемым из любого подходящего ретрови-руса. Был идентифицирован большой ряд различных ретровирусов. Примеры включают вирус лейкемии мышей (MLV), вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус иммунодефицита обезьяны, Т-клеточный вирус лейкемии человека (HTLV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), вирус саркомы Рауса (RSV), вирус саркомы Фуджинами (FuSV), вирус лейкемии мышей Молони (Mo-MLV), FBR вирус остеосаркомы могшей (FBR MSV), вирус саркомы мышей Молони (Mo-MSV), вирус лейкемии мышей Абельсона (A-MLV), вирус-29 миелоциматоза птиц (МС29) и вирус эритробластоза птиц (AEV). Подробный список ретровирусов можно найти в Coffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: J.M. Coffin, S.M. Hughes, H.E. Varmus, pp. 758-763.
Подробности геномной структуры некоторых ретровирусов можно найти в уровне техники. Например, подробности о HIV и Mo-MLV можно найти в NCBI Genbank (Genome Accession Nos. AF033819 и AF033811, соответственно).
Ретровирусы можно широко разделить на две категории, а именно "простые" и "комплексные". Рет-ровирусы можно далее разделить на 7 групп. 5 из этих групп представляют ретровирусы с онкогенным потенциалом. Оставшиеся 2 группы являются лентивирусами и спумавирусами. Обзор этих ретровиру-сов представлен в Coffin et al., 1997 (там же).
Группа лентивирусов может быть далее подразделена на "главные" и "неглавные". Примеры главных лентивирусов включают вирус иммунодефицита человека (HIV), возбудитель синдрома ауто-имму-нодефицита человека (AIDS) и вирус иммунодефицита обезьяны (SIV). Группа неглавных лентивирусов включает "медленный вирус" visna/maedi вирус (VMV), а также родственный козлиный артрит-энцефалитный вирус (CAEV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) и совсем недавно описанные вирус иммунодефицита кошек (FIV) и вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV).
Это изобретение также относится к использованию векторов для доставки конъюгата в форме нук-леотидной последовательности в кроветворную стволовую клетку (HSC).
Перенос гена включает доставку в клетки-мишени, такие как HSCs, кассеты экспрессии, слагаемой из одной или более нуклеотидных последовательностей и последовательностей, контролирующих их экспрессию. Это может быть осуществлено ex vivo по методике, по которой кассету переносят в клетки в лаборатории и модифицированные клетки затем вводят реципиенту. Альтернативно, перенос гена может быть осуществлен in vivo по методике, по которой кассету экспрессии переносят непосредственно в клетки внутри индивидуума. По обеим методикам, процесс переноса обычно поддерживается вектором, который помогает доставить кассету к соответствующему внутриклеточному сайту.
Костный мозг был традиционным источником HSCs для трансдукции, самые последние исследования предполагают, что периферийные стволовые клетки крови или хордовые клетки крови могут быть равно хорошими или лучшими клетками-мишенями (Cassel et al., 1993, Exp. Hematol. 21: 585-591; Bregni et al., 1992, Blood 80: 1418-1422; Lu et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 2089-2096).
Другие противораковые агенты
Конъюгат по настоящему изобретению может быть использован в комбинации с одним или более другими активными агентами, такими как одно или более цитотоксических лекарственных средств. Таким образом, в одном из вариантов настоящего изобретения способ содержит введение другого активного фармацевтического ингредиента, такого как цитотоксическое лекарственное средство, либо в объединенной дозировочной форме с конъюгатом, либо в раздельной дозировочной форме. Такая раздельная дозировочная форма цитотоксического лекарственного средства может включать твердую оральную, оральный раствор, сироп, эликсир, инъекционную, трансдермальную, трансмукосальную (через слизистую оболочку) и другие дозируемые формы. Конъюгат и другой активный фармацевтический ингредиент могут быть объединены в одной дозируемой форме или поставлены в раздельных дозируемых формах, которые используются вместе или последовательно.
Примеры цитотоксических лекарственных средств, которые могут использоваться в настоящем изо-бретениии, включают алкилированные лекарственные средства, такие как циклофосфамид, ифосфамид,
- 42 -
009955
хлорамбуцил, мелфалан, бусульфан, ломустин, кармустин, хлормесхин (мустин), эстрамустин, треосуль-фан, тиотеф, митобронитол; цитотоксические антибиотики, такие как доксорубицин, эпирубицин, акла-рубицин, идарубицин, даунорубицин, митоксантрон (митозантрон), блеомицин, дактиномицин и мито-мицин; атниметаболиты, такие как метотрексат, капецитабин, цитарабин, флударабин, кладрибинин, гемцитабин, фторурацил, ралтитрексед, меркаптопурин, тегафур и тиогуанин; алкалоиды vinca, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин, и этопозид; другие неопластические лекарственные средства, такие как амсакрин, альтретамин, крисантаспас, дакарбазин и темозоломид, гидроксикарбамид (гидроксимочевина), пентостатин, соединения платины, включающие карбоплатин, цисплатин и оксали-платин, порфимер натрия, прокарбазин, разоксан, таксаны, включающие доцетаксель и паклитаксель, ингибиторы топоизомеразы I, включающие иринотекан и топотекан, трастузумаб и третиноин.
В предпочтительном варианте осуществления другим цитотоксическим лекарственным средством является доксорубицин или мелфалан.
Конъюгат по настоящему изобретению может также применяться в диагностических целях с использованием проницаемости опухолевых клеток и сосудов для соединений. Например, конъюгат может быть использован для повышения поглощения опухолью радиолабильных антител или гормонов (опухо-левизуализирующие соединения) в радиоиммуносцинтиграфии или радиотерапии опухоли.
Чертежи и примеры
Настоящее изобретение далее будет описано путем ссылок на следующие неограничивающие примеры и чертежи, где фигура иллюстрирует определение терапевтической и токсической активности TNF и RGD-TNF в комбинации с NGR-IFN на модели аденокарциномы молочной железы мыши T/SA. Более подробно показано, что противоопухолевая активность RGD-mTNF в комбинации с NGR-mIFN-y сильнее, чем активность mTNF, введенного в комбинации с NGR-mIFN-y, или чем активность одного NGR-mIFN-y. Эти результаты показывают, что нацеленная доставка TNF и IFN-y к разным рецепторам опухолевой сосудистой системы может привести к синергетическому эффекту.
Примеры
Пример 1. Получение TNF и RGD-TNF.
Мышиные рекомбинантный TNF и ACDCRGDCFCG -TNF (RGD-TNF) были получены экспрессией цитоплазматической кДНК в E. coli. кДНК, кодирующая мышиный Met-TNF1-156 (66), была получена обратной транскриптазо-полимеразной цепной реакцией (RT-PCR) на мРНК, выделенной из липополи-сахаридстимулированных мышиных RAW-264.7 моноцит-макрофаговых клеток, с использованием 5'-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCaG-3' и 5 '-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3' в качестве 3'- и 5'-праймеров.
Амплифицированный фрагмент был обработан с Nde I и Bam HI (New England Biolabs, Beverley, MA) и клонирован в pET-11b (Novagen, Madison, WI), предварительно обработанным с теми же энзимами (pTNF).
кДНК, кодирующая ACDCRGDCFCG-TNF1-156, была амплифицирована PCR на pTNF с использованием 5'-TGCAGATCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCTCAGATCATCTTCTC-3'
в качестве 5'-праймера и вышеуказанного 3'-праймера.
Амплифицированный фрагмент был обработан и клонирован в рЕТ-Hb, как описано выше, и использован для трансформации клеток E. coli BL21(DE3) (Novagen). Экспрессия TNF и RGD-TNF была выполнена с изопропил^-тиогалактозидом согласно инструкции производителей РЕТ11Ь. Растворимые TNF и RGD-TNF были выделены из 2 л культур путем разрушения ультразвуком бактерий в 2 мМ эти-лендиаминтетрауксусной кислоте, 20 мМ Tris-HCl, рН 8,0, с последующим центрифугированием (15000х г, 20 мин, 4°С). Оба экстракта смешивали с сульфатом аммония (25% насыщения), оставляли на 1 ч при 4°С и затем центрифугировали, как указано выше. Содержание сульфата аммония в супернатантах затем доводили до 65% насыщения, оставляли при 4°С на 24 ч и затем центрифугировали. Каждый осадок растворяли в 200 мл 1 М сульфата аммония, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, и очищали с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий на Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (градиентное элюиро-вание, буфер А: 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0, содержащий 1М сульфат аммония; буфер В: 20% глицерин, 5% метанол, 50 мМ фосфат натрия, рН 8,0). Фракции, содержащие TNF иммунореактивные материалы (метод вестерн-блоттинга), были объединены, диализованы в 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте, 20 мМ Tris-HCl, рН 8,0, и затем очищены ионообменной хроматографией на DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (градиентное элюирование, буфер А: 20 мМ Tris-HCl, рН 8,0; буфер В: 1 М хлорид натрия, 20 мМ Tris-HCl, рН 8,0). Фракции, содержащие TNF иммунореактивные материалы, были объединены и очищены гель-хроматографией на Sephacryl-S-300 HR (Pharmacia-Upjohn), предварительно уравновешены и элюированы 150 мМ хлоридом натрия, 50 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7,3 (PBS). Фракции, содержащие 40000-50000 Mr продуктов, объединяли, делили на аликвоты и хранили замороженными при -20°С. Все растворы, используемые на хроматографичеких стадиях, готовили с использованием стерильной и свободной от токсинов воды (Salf, Bergamo, Italy).
Молекулярная масса очищенного TNF и RGD-TNF была измерена с помощью электроаэрозольной масс-спектрометрии, как описано (65). Содержание белка измеряли с помощью коммерческого набора
- 43 -
009955
реактивов для количественного анализа белка (Pierce, Rockford, IL).
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ) и вес-терн-блоттинг анализ выполняли с использованием 12,5 или 15% полиакриламидного геля по стандартным методикам.
Не редуцирующий ДСН-ПЭГ TNF показал единственную полосу при 17-18 кДа, как предполагалось для мономерного TNF. А не редуцирующий ДСН-ПЭГ и вестерн-блоттинг анализ RGD-TNF показали различные иммунореактивные формы в 18, 36 и 50 кДа, вероятно, соответствующие мономерам, димерам и тримерам. При редуцирующих условиях большинство полос в 50 и 36 кДа были превращены в 18 кДа формы, что указывает на присутствие RGD-TNF молекул с межцепочечными дисульфидными мостиками. Полоса 18 кДа составляла почти 1/2 от общего материала. Эти электрофоретические диаграммы предполагают, что RGD-TNF был смесью тримеров, составленных 3 мономерными субъединицами с правильными внутрицепочечными дисульфидами (10-20%), и оставшаяся большая часть составлена тримерами с 1 или более межцепочечных дисульфидов.
Молекулярная масса мономеров TNF и RGD-TNF была 17386,1+2,0 Да и 18392,8 Да, соответственно, по результатам электроаэрозольной масс-спектрометрии. Эти значения очень хорошо соответствуют массам, предполагаемым для Met-TNF1-156 (17386,7 Да) и для ACDCRGDCFCG-TNF1-156 (18392,9 Да).
Пример 2. Цитотоксическая активность TNF и RGD-TNF in vitro.
Биологическую активность TNF и RGD-TNF устанавливали с помощью стандартного цитолитиче-ского анализа, основанного на L-M фибробластах мыши (АТСС CCL1.2), как описано (67). Цитолитиче-ская активность TNF и RGD-TNF на RMA-T клетках была тестирована в присутствии 30 нг/мл актино-мицина D (68). Каждый образец анализировали в 2 экземплярах при 3 различных разбавлениях. Результаты выражали как значение +SD 2-3 независимых анализов.
Цитотоксическая активность in vitro TNF и RGD-TNF была (1,2+0,14)х108 ед./мг и (1,7+1)+108 ед./мг, соответственно, установленная стандартным цитолитическим анализом с L-M клетками. Эти результаты показывают, что ACDCRGDCFCG звенья в RGD-TNF молекуле не мешают сворачиванию, олигомериза-ции и связыванию с TNF рецепторами.
В предыдущем исследовании мы показали, что RMA-T клетки могут быть разрушены TNF в присутствии 30 нг/мл актиномицина D, тогда как в отсутствие ингибиторов транскрипции эти клетки являлись устойчивыми к TNF даже после нескольких дней инкубации (68). Цитоксическая активность in vitro RGD-TNF на RMA-T клетках в присутствии актиномицина D была (1,6+1,3)+108 ед./мг, измеренная с ипользованием TNF ((1,2+0,14)+108 ед./мг) в качестве стандарта.
Пример 3. Определение терапевтической и токсической активности TNF и RGD-TNF.
Вирусиндуцированную RMA лимфому C57BL/6 происхождения (69) поддерживали in vitro в RPMI 1640, 5% эмбриональной бычей сыворотки (FBS), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина В, 2 мМ глутамина и 50 мкМ 2-меркаптометанола. RMA-T получали из линии клеток RMA трансфекцией конструкцией, кодирующей Thy 1.1 аллель, и культивировали, как описано [Moro, 1997 #28]. Клетки T/SA аденокарциномы молочной железы мыши культивировали, как описано.
Исследования in vivo на животных моделях были одобрены Этическим комитетом Сан-Рафаэлевского научного института и выполнены в соответствии с установленными нормами. C57BL/6 мышам (Charles River Laboratories, Calco, Italy) (16-18 г) были введены 5х104 живых клеток RMA-T или TSA, соответственно, подкожно в левый бочок. Через 10-12 дней после имплантации опухоли мышей обрабатывали внутрибрюшинно (i.p.) 250 мкл растворов TNF или RGD-TNF, разбавленных свободным от эндотоксинов 0,9% хлоридом натрия. Предварительные эксперименты показали, что противоопухолевая активность не изменялась при добавлении к растворам TNF или RGD-TNF в качестве носителя человеческого сывороточного альбумина. Каждый эксперимент выполнялся с 5 мышами на группу. Рост опухоли контролировался ежедневно путем измерения кронциркулем. Площадь опухоли оценивали путем вычисления r1xr2n, тогда как объем опухоли оценивали путем вычисления r1xr2xr3x4/3n, где r1 и r2 означают продольный и поперечный радиусы и r3 - толщина опухолей, выдающихся из поверхности нормальной кожи. Животных умерщвляли прежде, чем опухоль достигала 1,0-1,5 см в диаметре. Размеры опухоли показывали как значения +SE (5-10 животных на группу) и сравнивали с t-тестом.
Противоопухолевую активность и токсичность RGD-TNF сравнивали с противоопухолевой активностью и токсичностью TNF, используя модели RMA-T лимфомы и T/SA на C57BL6 мышах.
Мышиный TNF, введенный животным, несущим введенные s.c. RMA-T опухоли, вызывал через 24 ч уменьшение массы опухоли и геморрагический некроз в центральной части опухоли, следующий за существенной остановкой роста опухоли в течение нескольких дней (71). Единичная обработка TNF не вызывает полной регрессии этой опухоли даже при дозах, близких к LD50, поскольку живые клетки, остающиеся вокруг некротической области, вновь начинают расти через несколько дней после обработки. На первом этапе экспериментов исследовали влияние разных доз (i.p.) TNF или RGD-TNF на выживаемость животных. Чтобы избежать непомерных страданий, животных умерщвляли, когда опухоль достигала в диаметре более 1-1,3 см. Летальность от TNF и RGD-TNF через 3 после обработки была различной (LD50, 6 и 12 мкг, соответственно), поскольку их противоопухолевая активность была заметно различной.
- 44 -
009955
Например, 1 мкг RGD-TNF приостанавливает рост опухоли более эффективно, чем 2 мкг TNF. Интересно, что некоторые животные были излечены 16 мкг RGD-TNF, тогда как ни одно животное из всех не было излечено с помощью TNF. Излеченных отсортированных животных затем заражали канцерогенными дозами клеток или RMA-T или RMA дикого типа, предположив, что единичная обработка RGD-TNF была способна вызвать защитный иммунитет.
Таким образом, рассчитанное отношение эффективность/токсичность RGD-TNF при этих условиях было в 4 раза больше, чем для TNF. Учитывая, что форма с правильными дисульфидными мостиками при получении RGD-TNF составляет около 10-20%, можно рассчитать, что терапевтический индекс RGD-TNF на 20-40% выше, чем терапевтический индекс TNF.
Кроме того, RGD-TNF может вызывать защитные иммунные реакции более эффективно, чем TNF.
Так как RMA-T клетки не экспрессируют альфа v интегрин (FACS с анти-альфа v антителом), в то время как эндотелиальные клетки могут экспрессировать этот интегрин, то результаты предполагают, что механизм действия основан на нацеливании клеток, других, чем опухолевые клетки, например эндо-телиальные клетки.
Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены здесь путем ссылки. Различные модификации и вариации описанных методов и систем изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отклонения от объема и духа изобретения. Хотя изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными вариантами осуществления, должно быть понятно, что изобретение, как оно изложено в формуле изобретения, будет неверно ограничивать такими специфическими вариантами осуществления. Несомненно, различные модификации описанных методов для осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в молекулярной биологии и родственных областях, подразумеваются в объеме следующей формулы изобретения.
Ссылки
1. Corti A., et al. Biochemical Journal. 1992; 284: 905-10.
2. Tartaglia L.A., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.
1991; 88: 9292-6.
3. Espevik T., et al. Journal of Experimental Medicine. 1990; 171: 415-26.
4. Loetscher H., et al. Journal of Biological Chemistry. 1993; 268: 26350-7.
5. Van Ostade X., et al. European Journal of Biochemistry. 1994; 220: 771-779.
6. Barbara J.A., et al. EMBO Journal. 1994; 13: 843-50.
7. Engelmann H., et al. J. Biol. Chem. 1990; 265: 14497.
8. Bigda J., et al. Journal of Experimental Medicine. 1994; 180: 445-60.
9. Tartaglia L.A., et al. Journal of Biological Chemistry. 1993; 268: 18542-8.
10. Vandenabeele P., et al. Journal of Experimental Medicine. 1992; 176: 1015-24.
11. Naume B., et al. Journal of Immunology. 1991; 146: 3045-8.
12. Grell M., et al. Cell. 1995; 83: 793-802.
13. Carswell E.A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975; 72: 3666-70.
14. Helson L., et al. Nature. 1975; 258: 731-732.
15. Tracey K.J. and Cerami A. Annual Review of Cell Biology. 1993; 9: 317-43.
16. Elliott M.J., et al. International Journal of Immunopharmacology. 1995; 17: 141-5.
17. Palladino M.A., Jr., et al. Journal of Immunology. 1987; 138: 4023-32.
18. Clauss M., et al. Journal of Biological Chemistry. 1990; 265: 7078-83.
19. Nawroth P.P. and Stern D.M. Journal of Experimental Medicine. 1986; 163: 740-5.
20. Clauss M., et al. Journal of Experimental Medicine. 1990; 172: 1535-45.
21. Mcintosh J.K., et al. Cancer Research. 1990; 50: 2463-9.
22. Meulders Q., et al. Kidney International. 1992; 42: 327-34.
23. van de Wiel P.A., et al. Immunopharmacology. 1992; 23: 49-56.
24. Nawroth P., et al. Journal of Experimental Medicine. 1988; 168: 637-47.
25. Stryhn Hansen A., et al. European Journal of Immunology. 1993; 23: 2358-64.
26. Taylor A. FASEB Journal. 1993; 7: 290-8.
27. Shipp M.A. and Look A.T. Blood. 1993; 82: 1052-70.
28. Fraker D.L., Alexander H.R. and Pass H.I. Biologic therapy with TNF: systemic administration and isolation-perfusion in Biologic therapy of cancer: principles and practice. V. De Vita, S. Hellman and S. Rosenberg, ed. J.B. Lippincott Company: Philadelphia. 1995. 329-345.
29. Fiers W. Biologic therapy with TNF: preclinical studies in Biologic therapy of cancer: principles and practice. V. De Vita, S. Hellman and S. Rosenberg, ed. J.B. Lippincott Company: Philadelphia. 1995. 295-327.
30. Sidhu R.S. and Bollon A.P. Pharmacological Therapy. 1993; 57: 79-128.
31. Hieber U. and Heim M.E. Oncology. 1994; 51: 142-53.
32. Lienard D., et al. World Journal of Surgery. 1992; 16: 234-40.
33. Hill S., et al. British Journal of Surgery. 1993; 80: 995-7.
34. Eggermont A.M., et al. Annals of Surgery. 1996; 224: 756-65.
35. Schraffordt Koops H., et al. Radiotherapy and Oncology. 1998; 48: 1-4.
- 45 -
009955
36. Williamson B.D., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 1983; 80: 5397-401.
37. Fransen L., et al. European Journal of Cancer & Clinical Oncology. 1986; 22:419-26.
38. Ruff M.R. and Gifford G.E. Tumor Necrosis Factor. in Lymphokines. E. Pick, ed. Academic Press: New York. 1981. 235-272.
39. Beyaert R., et al. Cancer Research. 1993; 53: 2623-30.
40. Beyaert R., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.
1989; 86: 9494-8.
41. Balkwill F.R., et al. Cancer Research. 1986; 46: 3990-3.
42. Schiller J.H., et al. Cancer. 1992; 69: 562-71.
43. Jones A.L., et al. Cancer Chemotherapy & Pharmacology. 1992; 30: 73-6.
44. Brouckaert P., et al. Lymphokine & Cytokine Research. 1992; 11: 193-6.
45. Van Ostade X., et al. Nature. 1993; 361: 266-9.
46. Van Zee K.J., et al. Journal of Experimental Medicine. 1994; 179: 1185-91.
47. Bartholeyns J., et al. Infection & Immunity. 1987; 55: 2230-3.
48. Debs R.J., et al. Journal of Immunology. 1989; 143: 1192-7.
49. Debs R.J., et al. Cancer Research. 1990; 50: 375-80.
50. Kimura K., et al. Cancer Chemotherapy & Pharmacology. 1987; 20: 223-9.
51. Aderka D., et al. Cancer Research. 1991; 51: 5602-7.
52. Lantz M., et al. Cytokine. 1990; 2: 402-6.
53. Hoogenboom H.R., et al. Molecular Immunology. 1991; 28: 1027-37.
54. Yang J., et al. Human Antibodies & Hybridomas. 1995; 6: 129-36.
55. Yang J., et al. Molecular Immunology. 1995; 32: 873-81.
56. Pasqualini R., et al. Nature Biotechnology. 1997; 15: 542-6.
57. Koivunen E., et al. Nature Biotechnology. 1999; 17: 768-774.
58. Brekken R.A., et al. Cancer Research. 1998; 58: 1952-1959.
59. Goodwin D.A. Journal of Nuclear Medicine. 1995; 36: 876-9.
60. Paganelli G., et al. Cancer Research. 1991; 51: 5960-6.
61. Modorati G., et al. British Journal of Ophtalmology. 1994; 78: 19-23.
62. Colombo P., et al. Journal of Endocrinological Investigation. 1993; 16: 841-3.
63. Paganelli G., Magnani P., Siccardi A. and Fazio F. Clinical application of the avidin-biotin system for tumor targeting. in Cancer therapy with radiolabeled antibodies. D. Goldenberg, ed. CRC Press: Boca Raton.
1995. 239-253.
64. Robert B., et al. Cancer Research. 1996; 56: 4758-4765.
65. Corti A., et al. Cancer Research. 1998; 58: 3866-3872.
66. Pennica D., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.
1985; 82: 6060-4.
67. Corti A., et al. Journal of Immunological Methods. 1994; 177: 191-198.
68. Moro M., et al. Cancer Research. 1997; 57: 1922-8.
69. Ljunggren H.G. and Karre K. Journal of Experimental Medicine. 1985; 162: 1745-59.
70. Celik C., et al. Cancer Research. 1983; 43: 3507-10.
71. Gasparri A., et al. Cancer Research. 1999; 59: 2917-23.
72. Arap W., et al. Science. 1998; 279: 377-80.
73. Talmadge J.E., et al. Cancer Research. 1987; 47: 2563-70.
74. Pfizenmaier K., et al. Journal of Immunology. 1987; 138: 975-80.
75. Asher A.L., et al. Journal of Immunology. 1991; 146: 3227-34.
76. Mizuguchi H., et al. Cancer Research. 1998; 58: 5725-30.
77. Gasparri A., et al. Journal of Biological Chemistry. 1997; 272: 20835-43.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Конъюгат с антиопухолевой активностью, включающий IL-12 и по меньшей мере 1 опухоленаце-ливающий модуль, содержащий NGR звено.
2. Конъюгат по п.1, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой опухолево-сосудистый нацеливающий модуль.
3. Конъюгат по п.1 или 2, в котором опухоленацеливающий модуль представляет собой CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, циклоCVLNGRMEC, линейный или циклический CNGRC.
4. Конъюгат по одному из пп.1-3, в котором опухоленацеливающий модуль связан с IL-12 через спейсер.
5. Конъюгат по одному из пп.1-4, представленный в форме слитого белка.
6. Конъюгат по одному из пп.1-5, представленный в форме нуклеиновой кислоты.
7. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6.
- 46 -
009955
8. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.7.
9. Способ получения конъюгата, включающий культивирование клетки-хозяина по п.8 при условиях, обеспечивающих экспрессию конъюгата.
10. Фармацевтическая композиция, обладающая антиопухолевой активностью, содержащая конъю-гат по одному из пп.1-6 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, дополнительно содержащая другой противоопухолевый агент или диагностическое опухолевизуализирующее вещество.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, содержащая в качестве другого противоопухолевого агента доксорубицин или мелфалан.
13. Применение конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12 для получения медикамента для лечения или диагностики рака.
14. Способ лечения или диагностики рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении или диагностике, эффективного количества конъюгата по одному из пп.1-6 или фармацевтической композиции по одному из пп.10-12.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 47 -