1. Применение терапевтического агента ИФН- b для производства лекарственного средства для лечения или профилактики гломерулонефрита у млекопитающего, где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

2. Применение по п.1, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, нефротического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.

3. Применение по любому из пп.1-2, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

4. Применение по п.3, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

5. Применение по п.3, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

6. Применение по п.3, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

7. Применение по любому из пп.1-6, где млекопитающее представляет собой человека.

8. Применение терапевтического агента ИФН- b для производства лекарственного средства для лечения или профилактики хронической почечной недостаточности у млекопитающего, где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

9. Применение по п.8, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

10. Применение по п.8, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

11. Применение по п.9, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

12. Применение по п.9, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

13. Применение по любому из пп.8-12, где млекопитающее представляет собой человека.

14. Способ лечения гломерулонефрита у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего гломерулонефрит, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН- b , где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

15. Способ по п.14, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.

16. Способ по п.14 или 15, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

17. Способ по п.14 или 15, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

18. Способ по п.16, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

19. Способ по п.16, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

20. Способ по любому из пп.14-19, где млекопитающее представляет собой человека.

21. Способ лечения хронической почечной недостаточности у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего хроническую почечную недостаточность, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН- b , где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

22. Способ по п.21, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

23. Способ по п.21, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

24. Способ по п.22, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

25. Способ по п.22, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

26. Способ по любому из пп.21-25, где млекопитающее представляет собой человека.

 

(57) Реферат / Формула:
Применение терапевтического агента ИФН- b для производства лекарственного средства для лечения или профилактики гломерулонефрита у млекопитающего, где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

2. Применение по п.1, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, нефротического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.

3. Применение по любому из пп.1-2, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

4. Применение по п.3, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

5. Применение по п.3, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

6. Применение по п.3, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

7. Применение по любому из пп.1-6, где млекопитающее представляет собой человека.

8. Применение терапевтического агента ИФН- b для производства лекарственного средства для лечения или профилактики хронической почечной недостаточности у млекопитающего, где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

9. Применение по п.8, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

10. Применение по п.8, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

11. Применение по п.9, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

12. Применение по п.9, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

13. Применение по любому из пп.8-12, где млекопитающее представляет собой человека.

14. Способ лечения гломерулонефрита у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего гломерулонефрит, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН- b , где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

15. Способ по п.14, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.

16. Способ по п.14 или 15, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

17. Способ по п.14 или 15, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

18. Способ по п.16, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

19. Способ по п.16, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

20. Способ по любому из пп.14-19, где млекопитающее представляет собой человека.

21. Способ лечения хронической почечной недостаточности у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего хроническую почечную недостаточность, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН- b , где ИФН- b является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.

22. Способ по п.21, где ИФН- b представляет собой ИФН- b человека.

23. Способ по п.21, где ИФН- b по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН- b человека, имеющему SEQ ID NO:4.

24. Способ по п.22, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1a.

25. Способ по п.22, где ИФН- b представляет собой ИФН- b -1b.

26. Способ по любому из пп.21-25, где млекопитающее представляет собой человека.

 

---

009938
Уровень техники изобретения
Хроническая почечная недостаточность (ХПН) может быть определена как прогрессирующее, перманентное и существенное снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ), обусловленное значительной и продолжающейся потерей нефронов. Хроническая декомпенсированная почечная недостаточность обычно начинается с того момента, когда хроническая почечная недостаточность (т.е. перманентное снижение функции почек, по меньшей мере, на 50-60%), ведет к некоему повреждению почечной ткани, что вызывает существенную потерю нефронов. Исходное повреждение может быть связано или не связано с эпизодом острой почечной недостаточности, или оно может быть связано с любым количеством почечных нарушений, включая, но не ограничиваясь этим, конечную стадию почечного заболевания, хроническую диабетическую нефропатию, диабетическую гломерулопатию, диабетическую почечную гипертрофию, гипертензивный нефросклероз, гипертензивный гломерулосклероз, хронический гломеру-лонефрит, наследственный нефрит, почечную дисплазию и хроническое отторжение после трансплантации почечного аллотрансплантата. Независимо от природы исходного повреждения хроническая деком-пенсированная почечная недостаточность проявляется в виде "общих конечных проявлений" признаков и симптомов в результате прогрессирующей потери нефронов и прогрессивного снижения ХПН. Данное прогрессирующее ухудшение функции почек является медленным, обычно продолжающимся у больных людей многие годы или десятилетия, но, по-видимому, неизбежным.
У человека при прогрессировании декомпенсированной почечной недостаточности и продолжении снижения СКФ до менее 10% от нормы (например, 5-10 мл/мин) субъект входит в конечную стадию почечного заболевания (ESRD). В течение данной фазы неспособность оставшихся нефронов адекватно удалять отходы жизнедеятельности из крови при удержании полезных продуктов и поддержании баланса жидкости и электролитов ведет к ухудшению состояния, при котором может быстро развиться недостаточность многих систем органов и особенно сердечно-сосудистой системы. С этого момента почечная недостаточность будет быстро прогрессировать, приводя к смерти, пока субъект не начнет подвергаться почечной заместительной терапии (т.е. хроническому гемодиализу, постоянному перитонеальному диализу или трансплантации почки).
Одним почечным заболеванием, которое может вести к ХПН, является гломерулонефрит. Гломеру-лонефрит характеризуется воспалением и возникающим в результате этого увеличением клубочков, что обычно обусловлено образованием иммунных комплексов. Аккумуляция иммунных комплексов в клубочках ведет к воспалительным ответам, вовлекающим, среди прочего, гиперплазию клеток, которая может вызывать полную или частичную блокаду клубочковой фильтрации, среди других факторов, сужая просветы капилляров. Одним из результатов данного процесса является ингибирование нормальной фильтрационной функции клубочка. Блокада может возникать в большом числе клубочков, непосредственно ухудшая функцию почек и часто вызывая аномальное отложение белков в стенках капилляров, входящих в состав клубочка. Такое отложение может, в свою очередь, вызывать повреждение базальных мембран клубочков. В тех клубочках, которые не заблокированы, развивается повышенная проницаемость, позволяющая большому количеству белка поступать в мочу, состояние, обозначаемое как протеи-нурия.
Во многих случаях тяжелого гломерулонефрита в пространстве Боумена образуются патологические структуры, называемые серповидными, дополнительно препятствуя клубочковой фильтрации. Данные структуры могут быть обнаружены только при микроскопическом исследовании образцов ткани, полученных при биопсии или некропсии, и, таким образом, не всегда выявляются у тех больных, у которых они существуют. Серповидные структуры являются проявлением гиперплазии клеток и, как считается, возникают из-за экстенсивной аномальной пролиферации пристеночных эпителиальных клеток, клеток, которые образуют внутреннюю выстилку капсулы Боумена. Клиническое исследование показало, что существует приблизительная корреляция между процентом клубочков с серповидными структурами и тяжестью заболевания и, таким образом, прогнозом для больного. При присутствии в большом количестве серповидные структуры являются плохим прогностическим признаком.
Приблизительно 600 больных на миллион в США находятся на хроническом диализе каждый год при средней стоимости, приближающейся к 60000-80000$ на больного в год. Из новых случаев конечной стадии почечного заболевания каждый год приблизительно 28-33% обусловлено диабетической нефро-патией (или диабетической гломерулопатией или диабетической почечной гипертрофией), 24-29% обусловлено гипертензивным нефросклерозом (или гипертензивным гломерулосклерозом) и 15-22% обусловлено гломерулонефритом. 5-летний коэффициент выживаемости для всех больных на хроническом диализе составляет приблизительно 40%, но для больных старше 65 лет коэффициент снижается до приблизительно 20%. Следовательно, существует потребность в лечении, которое должно предотвратить прогрессирующую потерю почечной функции, которая заставляет почти двести тысяч больных только в США становиться зависимыми от хронического диализа и которая ведет к преждевременной смерти десятков тысяч больных каждый год.
Сущность изобретения
В одном из воплощений изобретение представляет собой способ лечения гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности у млекопитающего, у которого имеется гломерулонефрит или
- 1 -
009938
вероятность развития гломерулонефрита, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества ИФН-р-содержащего терапевтического агента. В изобретении также предлагается применение ИФН-р-содержащего терапевтического агента для производства лекарственного средства для лечения или профилактики гломерулонефрита. Гломерулонефрит может быть выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, заболевания с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, нефротического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломеруло-нефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммуно-комплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетического гломерулонефрита, хронического гломерулонефрита и наследственного гломерулонефрита. ИФН-р может быть зрелым или незрелым и может быть лишен начального метионина. ИФН-р может представлять собой ИФН-р человека, например, ИФН-р-1а и ИФН-р-Ш. ИФН-р может быть белком, который является, по меньшей мере, приблизительно на 95% идентичным полноразмерному зрелому ИФН-р человека, имеющему SEQ ID NO: 4. ИФН-р может быть полноразмерным зрелым ИФН-р человека, включающим или состоящим из SEQ ID NO: 4. ИФН-р может быть гликозилированным или не гликозилированным. Терапевтический агент ИФН-р может также быть полноразмерным зрелым ИФН-р человека, включающим SEQ ID NO: 4, соединенную с константной областью молекулы иммуноглобулина человека, например, с тяжелой цепью IgG1. Например, терапевтический агент ИФН-р может включать SEQ ID NO: 14. Терапевтический агент ИФН-р может также включать пэгилированный ИФН-р.
Терапевтический агент ИФН-р может включать стабилизирующий агент, который может представлять собой кислую аминокислоту. Он также может представлять собой аргинин. Терапевтический агент ИФН-р может иметь рН между приблизительно 4,0 и 7,2. В предпочтительном осуществлении терапевтический агент ИФН-р представляет собой AVONEX(r).
Терапевтический агент ИФН-р может вводиться парентерально, например, внутривенно (в.в.), подкожно и внутримышечно (в.м.). Способ может включать введение млекопитающему нескольких доз терапевтического агента ИФН-р. Терапевтический агент ИФН-р можно вводить в течение нескольких дней. Например, его можно вводить еженедельно в дозе 6 MIU. Его можно также вводить три раза в неделю в дозе 3, 6 или 12 MIU. Введение терапевтического агента ИФН-р может снизить, например, про-теинурию, пролиферацию клеток клубочков или воспаление клубочков у млекопитающего.
В предпочтительном осуществлении млекопитающим является человек. Человек может являться пациентом. Млекопитающим может быть млекопитающее, которое предрасположено к развитию гломе-рулонефрита, что выявляется, например, по признакам развития воспаления по меньшей мере одного клубочка. Млекопитающим может быть млекопитающее, которое предрасположено к развитию хронической тяжелой почечной недостаточности или иметь хроническую тяжелую почечную недостаточность, что выявляется, например, по наличию хронической почечной недостаточности. Млекопитающее идентифицируется как имеющее гломерулонефрит по присутствию воспаления по меньшей мере одного клубочка; гипертрофии клубочков; гипертрофии трубочек; гломерулосклероза; или тубулоинтерстициально-го склероза. В определенных осуществлениях "млекопитающее" в данном контексте не означает млекопитающее, которое является носителем вируса, например, вируса гепатита, такого как гепатит В или С, вызывающего гломерулонефрит, или млекопитающее, у которого гломерулонефрит был вызван вирусом. В других воплощениях млекопитающее не страдает конечной стадией тяжелой почечной недостаточности или почечно-клеточной карциномой.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлены последовательности нуклеотидов (SEQ ID NO: 11) и аминокислот (SEQ ID NO: 12) гибридного белка, состоящего из сигнальной последовательности VCAM, соединенной со зрелым полноразмерным ИФН-р человека (SEQ ID NO: 3 и 4), в котором глицин в аминокислоте 162 SEQ ID NO: 4 заменен на цистеин, соединенный с шарнирными СН2 и СН3 доменами IgG1Fc человека
(ZL5107).
На фиг. 2 представлены последовательности нуклеотидов (SEQ ID NO: 13) и аминокислот (SEQ ID NO: 14) гибридного белка, состоящего из сигнальной последовательности VCAM, соединенной со зрелым полноразмерным ИФН-р человека (SEQ ID NO: 3 и 4), в котором глицин в аминокислоте 162 SEQ ID NO: 4 заменен на цистеин, соединенный с линкером G4S, который соединен с шарнирными СН2 и СН3 доменами IgG1Fc человека (ZL6206).
На фиг. 3 представлен уровень протеинурии на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни у крыс, страдающих неф-ротоксическим небритом (NTN), получавших 3х105 единиц ИФН-р крыс в день, 6х105 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("контроль") 6 дней в неделю, начиная со дня 0.
На фиг. 4 представлен уровень протеинурии на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни у крыс, страдающих неф-ротоксическим нефритом (NTN), получавших 6х105 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("контроль") 6 дней в неделю, начиная со дня 0.
- 2 -
009938
На фиг. 5 представлено количество пролиферирующих клеток клубочков крыс, страдающих нефро-токсическим нефритом (NTN), получавших 6х105 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("RSA") 6 дней в неделю со дня 0 до 7-го дня.
На фиг. 6 представлен уровень протеинурии на 7-й и 10-й дни у крыс, страдающих гломерулонеф-ритом Thy 1, получавших 6х10 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("RSA") 6 дней в неделю, начиная со дня 0 до 10-го дня.
На фиг. 7 представлен уровень клиренса креатина на 7-й и 10-й дни у крыс, страдающих гломеру-лонефритом Thy 1, получавших 6х105 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("RSA") 6 дней в неделю, начиная со дня 0 до 10-го дня.
На фиг. 8 представлена шкала пролиферации клубочков на 10-й день у крыс, страдающих гломеру-лонефритом Thy 1, получавших 6х105 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("RSA") 6 дней в неделю, начиная со дня 0 до 10-го дня.
На фиг. 9 представлен уровень протеинурии на 7-й и 14-й дни у крыс, страдающих пуромицин-аминонуклеозидной нефропатией (PAN), получавших 6х102, 6х103, 6х104 или 6х105 единиц ИФН-р крыс в день или только вектор ("контроль").
Подробное описание изобретения
Изобретение, по меньшей мере, частично основывается на открытии того, что, по меньшей мере, определенного рода симптомы гломерулонефрита у млекопитающего могут быть облегчены введением ИФН-р млекопитающему. В частности, обнаружено, что протеинурия, пролиферация клеток клубочков и воспаление значительно снижаются при введении ИФН-р. Соответственно, в изобретении предлагаются способы и композиции для лечения гломерулонефрита у млекопитающих.
1. Определения
Для более ясного и краткого указания предмета обсуждения, заявленного в изобретении, предлагаются следующие определения специфических терминов, применяемых в описании и прилагаемой формуле изобретения.
Применяемые в описании и прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественные упоминания, если в контексте ясно не указано иначе.
"Скорость клубочковой фильтрации" или "СКФ" пропорциональна скорости клиренса в мочу вещества, находящегося в плазме, которое не связано с белками сыворотки, свободно фильтруется клубочками и не секретируется или не реабсорбируется почечными трубочками. СКФ (GFR) предпочтительно определяется следующим уравнением
U xV
GFR = -?2n?-
cone
где Uconc представляет собой концентрацию маркера в моче, Pconc представляет собой концентрацию маркера в плазме и V представляет собой скорость тока мочи в мл/мин. Необязательно СКФ корректируют на площадь поверхности тела. Следовательно, применяемые здесь величины СКФ могут быть рассмотрены как находящиеся в единицах мл/мин/1,73м2. Предпочтительным измерением СКФ является клиренс инсулина, но из-за трудности измерения концентраций данного вещества в клинической практике обычно применяют клиренс креатинина. Например, для здорового мужчины среднего размера (70 кг, 20-40 лет) типичная СКФ, измеренная по клиренсу креатинина, как ожидается, составляет приблизительно 12 5 мл/мин при концентрации креатинина в плазме 0,7-1,5 мг/дл. Для сравнения у женщины среднего размера типичная СКФ, измеренная по клиренсу креатинина, как ожидается, составляет приблизительно 115 мл/мин при уровне креатинина 0,5-1,3 мг/дл. В период хорошего самочувствия величины СКФ человека являются относительно стабильными до возраста приблизительно 40 лет, когда СКФ обычно начинает возрастное снижение. Для субъектов, выживших к возрасту 85 или 90 лет, СКФ может быть снижена до 50% по сравнению с величинами в возрасте 40 лет. Может быть предложено определение "ожидаемой СКФ" или "GFRexp" (СКФожидаемая) на основе учета возраста субъекта, массы, пола, площади поверхности тела и степени развития мускулатуры, а также концентрации в плазме некоего маркерного соединения (например, креатинина), определяемого по тестированию в крови. Таким образом, в качестве примера, ожидаемая СКФ или СКФехр может быть определена как
QJ?? (140 - возраст)х масса{кг) 12хРсопс(мг/дл)
Данное определение не принимает в расчет такие факторы, как площадь поверхности, степень развития мускулатуры или процент жировой ткани в организме. Однако при применении уровня креатинина в плазме в качестве маркера данная формула применялась для мужчин в качестве недорогого способа определения СКФ. Так как креатинин продуцируется почечно-полосатыми мышцами, ожидаемая СКФ или GFRexp женщин определяется с помощью того же уравнения, умноженного на 0,85 для учета ожидаемых различий в мышечной массе. (См. Lemann, et al., (1990) Am. J. Kidney Dis. 16 (3):2236-243.)
"Гломерулонефрит", "нефрит", "острый нефрит" и "гломерулярный нефрит" применяются здесь как взаимозаменяемые термины.
- 3 -
009938
"ИФН-р-Ы" относится к молекуле ИФН-р, имеющей аминокислотную последовательность ИФН-р человека дикого типа и гликозилированной.
"ИФН-р-Ш" относится к молекуле ИФН-р, имеющей аминокислотную последовательность ИФН-р дикого типа, в которой цистеин в положении 17 заменен серином; метионин в положении 1 ("начальный метионин") отсутствует и молекула не гликозилирована.
"Вариант ИФН-р" относится к белку ИФН-р дикого типа, имеющему одну или более модификаций, например делеций аминокислот, добавок, замен, посттрансляционную модификацию или введение одного или более не существующих в природе аминокислотных остатков или линкеров между ними. Части ИФН-р включаются в термин "вариант ИФН-р. "Биологически активный вариант ИФН-р" представляет собой вариант ИФН-р, который имеет, по меньшей мере, некоторую активность при лечении почечных нарушений, например, гломерулонефрита. Вариант ИФН-р может быть существующим в природе ИФН-р , имеющим, например, вставку, делецию или замену одной или более аминокислот по отношению к ИФН-р дикого типа, т. е. существующим в природе мутантом или полиморфным вариантом, или он может быть не существующим в природе ИФН-р.
"Выделенный" (применяемый взаимозаменяемо с "по существу чистый") при применении к полипептидам обозначает полипептид, который в силу своего происхождения или манипуляций: (i) присутствует в клетке-хозяине в качестве продукта экспрессии части экспрессионного вектора; (ii) связан с белком или другой химической частью, отличной от той, к которой он присоединен в природе; или (iii) не существует в природе, например белок, который химически модифицирован путем привешивания или добавки по меньшей мере одной гидрофобной части к белку, так что белок находится в форме, не существующей в природе. Под "выделенным" дополнительно подразумевается белок, который: (i) синтезируется химически или (ii) экспрессируется в клетке-хозяине и очищается от связанных или загрязняющих белков. Термин обычно обозначает полипептид, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он сосуществует в природе. Предпочтительно, чтобы полипептид был также отделен от веществ, таких как антитела или матриксы геля (полиакриламид), которые применяют для его очистки. "Выделенный" (применяемый взаимозаменяемо с "по существу чистый") при применении к нуклеиновым кислотам относится к полинуклеотиду РНК или ДНК, части геномного полинуклеотида, кДНК или синтетическому полинуклеотиду, который в силу своего происхождения или манипуляций: (i) не связан с полным полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, присутствует в клетке-хозяине в качестве экспрессионного вектора или его части); или (ii) связан с нуклеиновой кислотой или другой химической частью, отличной от той, к которой он присоединен в природе; или (iii) не существует в природе. Под "выделенной" дополнительно подразумевается полинуклеотидная последовательность, которая
(i) амплифицируется in vitro с помощью, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР); (ii) синтезируется химически;
(iii) продуцируется рекомбинантно путем клонирования или
(iv) очищается, как, например, путем отщепления и разделения на геле.
Нуклеиновая кислота является "оперативно связанной" с другой нуклеиновой кислотой, когда она размещена в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности лидера секреции (например, сигнальной последовательности сигнального пептида) оперативно связана с ДНК, кодирующей полипептид, если ДНК экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; и связывающий сайт рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что способствует трансляции. Обычно "оперативно связанные" обозначает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются соприкасающимися и в случае, например, лидера секреции соприкасаются в процессе считывания. Связывание сопровождается лигированием в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, могут быть использованы синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.
"Процент идентичности" или "процент сходства" относится к сходству последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же мономерной единицей основания или аминокислоты, то соответствующие молекулы являются идентичными по данному положению. Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа соответствующих или идентичных положений, имеющихся в двух последовательностях, разделенного на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях соответствуют или идентичны, то две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT проявляют 50% гомологию (3 из суммарных 6 положений соответствуют). Обычно сравнение делают, когда две последовательности выровнены для получения максимальной идентичности. Такое выравнивание может быть обеспечено при применении, например, способа Karlin и Altschul, описанного ниже более подробно. В отношении нуклеиновой кислоты "процент гомологии" и "процент идентичности" приме
- 4 -
009938
няется взаимозаменяемо, в то время как в отношении полипептида "процент гомологии" относится к степени сходства, когда аминокислоты, представляющие консервативные замены других аминокислот, рассматриваются как идентичные этим другим аминокислотам. "Консервативная замена" остатка в базовой последовательности представляет собой замену аминокислотой, которая физически или функционально сходна с соответствующим базовым остатком, например, имеет сходный размер, конфигурацию, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или тому подобное. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются те, которые удовлетворяют критериям, определенным для "принятых точечных мутаций" в Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978). Процент гомологии или идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот может быть определен с применением алгоритма выравнивания Karlin и Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 2264 (1990), модифицированного Karlin и Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 5873 (1993). Такой алгоритм включен в программы NBLAST или XBLAST у Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). BLAST поиски выполняются с помощью программы NBLAST, балльная оценка = 100, длина последовательности = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте изобретения. BLAST поиски белков выполняются с помощью программы XBLAST, балльная оценка = 50, длина последовательности = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных базовому полипептиду. Для получения выравниваний с пропусками для сравнений применяется BLAST с пропусками, как описано в Altschul et al., Nucleic Acid Res., 25: 3389 (1997). При применении BLAST и BLAST с пропусками применяются параметры соответствующих программ (XBLAST и NBLAST) по умолчанию. См. http://www/ncbi.nlm.nih.gov.
Терапевтический агент ИФН-р, как указывается, обладает "терапевтической эффективностью", и количество терапевтического агента ИФН-р, как указывается, является "терапевтически эффективным", если введение данного количества терапевтического агента ИФН-р достаточно для индукции клинически значимого улучшения стандартных маркеров функции почек при введении субъекту (например, на животной модели или человеку), страдающему или относящемуся к группе риска развития гломерулонеф-рита или хронической почечной недостаточности. Такие маркеры почечной функции хорошо известны в медицинской литературе и включают, не ограничиваясь этим, скорости увеличения уровней азота мочевины BUN, скорости увеличения креатинина сыворотки, статические измерения BUN, статические измерения креатинина сыворотки, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), отношения BUN/креатинин, сывороточные концентрации натрия (Na+), отношения моча/плазма для креатинина, отношения моча/плазма для мочевины, осмотическое давление мочи, суточную продукцию мочи и тому подобное (см., например, Brenner and Lazarus (1994) in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York; Luke and Strom (1994), in Internal Medicine, 4th Edition, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.). B предпочтительном осуществлении введение терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН-р ведет к снижению протеинурии, пролиферации клеток клубочков или к снижению присутствия воспалительных клеток, например, CD8+ T-клеток и макрофагов в клубочках.
2. Терапевтические агенты ИФН-р
Терапевтические агенты ИФН-р, которые могут быть применены по изобретению, включают ИФН-р дикого типа и их биологически активные варианты, например, существующие в природе и не существующие в природе варианты. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности существующего в природе человеческого ИФН-р дикого типа представлены в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно, которые идентичны номерам доступа GenBank NO: M28622 и ААА36040, соответственно. Данные ИФН описываются также, например, в Seghal (1985) J. Interferon Res. 5:521. Полноразмерный белок ИФН-р человека составляет в длину 187 аминокислот, и кодирующая последовательность SEQ ID NO: 1 соответствует нуклеотидам 7 6-639. Сигнальная последовательность соответствует аминокислотам с 1 по 21. Аминокислотная последовательность зрелой формы данного ИФН-р соответствует аминокислотам 22-187 (нук-леотиды 139-639 SEQ ID NO: 1). Зрелый белок ИФН-р человека и кодирующая его нуклеотидная последовательность представлены в SEQ ID NO: 4 и 3, соответственно.
ИФН-р, продуцируемый клетками млекопитающих, гликозилирован. Существующий в природе ИФН-р дикого типа гликозилирован по остатку 80 (Asn 80) зрелого полипептида SEQ ID NO: 4 или остатку 101 (Asn 101) незрелого полипептида SEQ ID NO: 2.
Терапевтические агенты ИФН-р также включают ИФН-р, не относящийся к человеку, например позвоночного, такого как млекопитающее, например, не человекообразных приматов, бычий, овечий, свиной, лошадиный, кошачий, собачий, крысиный и мышиный; или птиц, или амфибий. Последовательности ИФН-р данных видов могут быть получены из GenBank и/или публикаций, или они могут быть определены из нуклеиновых кислот, выделенных при мягких условиях гибридизации с геном ИФН-р других видов.
Варианты белков ИФН-р дикого типа включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична или гомологич
- 5 -
009938
на ИФН-р дикого типа, например ИФН-р человека, имеющему SEQ ID NO: 2 или 4. Варианты могут иметь одну или более замен аминокислот, делеций или добавок. Например, могут быть применены биологически активные фрагменты белков ИФН-р дикого типа. Такие фрагменты могут иметь 1, 2, 3, 5, 10 или 20 аминокислот, удаленных, добавленных или замененных на С- или N-конце белка. Варианты могут также иметь 1, 2, 3, 5, 10 или 20 аминокислотных замен, делеций или добавок. Некоторые варианты могут иметь менее чем приблизительно 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавок. Замены могут быть существующими в природе аминокислотами или их аналогами, например, D-стереоизомерными аминокислотами.
В объем изобретения также входят варианты ИФН-р, кодируемые нуклеиновыми кислотами, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей существующий в природе ИФН-р, например, представленный последовательностями SEQ ID NO: 1 или 3, или комплементарными им. Подходящая строгость условий, которые способствуют гибридизации ДНК, например, 6,0 х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45°C с последующим промыванием 2,0xSSC при 50°C, известны специалистам в данной области техники или могут быть найдены в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Например, концентрация соли на стадии промывки может быть выбрана от мягких условий гибридизации - приблизительно 2,0xSSC при 50°С до строгих условий - приблизительно 0,2xSSC при 50°C. Кроме того, температура на стадии промывки может быть увеличена от мягких условий - при комнатной температуре приблизительно 22°C, до очень строгих условий - при приблизительно 65°C. Как температуру, так и соль можно варьировать, или температуру и концентрацию соли можно поддерживать постоянными при изменении другой переменной. В предпочтительном осуществлении нуклеиновая кислота, кодирующая вариант ИФН-р, будет гибридизоваться с одной из SEQ ID NO: 1 или 3 или комплементарных им в умеренно строгих условиях, например, и, включая промывку при приблизительно 2,0xSSC и приблизительно 40°C. В особенно предпочтительном осуществлении нуклеиновая кислота, кодирующая вариант ИФН-р, будет связываться с одной из SEQ ID No: 1 или 3 или комплементарных им в очень строгих условиях, например, и включая промывку при приблизительно 0,2xSSC и приблизительно 65°С.
Примерами модификаций являются консервативные модификации, которые оказывают минимальный эффект на вторичную и третичную структуру белка. Примеры консервативных замен включают описанные Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) и Argos в EMBO J., 8, 779-785 (1989). Например, аминокислоты, принадлежащие к одной из следующих групп, представляют собой консервативные замены: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe, lys, arg, his; и phe, tyr, trp, his.
Другие модификации включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой, что может необязательно представлять собой консервативную замену. Например, могут быть сделаны замены, которые существенно не влияют на трехмерную структуру ИФН-р. Трехмерная структура не гликозилиро-ванного ИФН-р человека описана, например, в Radhakrishnan et al. (1996) Structure 4: 1453, и трехмерная структура гликозилированного ИФН-р описана, например, в Karpusas et al. (1997) PNAS 94:11813). Существенно, что ИФН-р включает пять спиралей: спираль А, которая состоит из приблизительно аминокислот 2-22 SEQ ID NO: 4; спираль В, которая состоит из приблизительно аминокислот 51-71 SEQ ID NO: 4; спираль С, которая состоит из приблизительно аминокислот 80-107 SEQ ID NO: 4; спираль D, которая состоит из приблизительно аминокислот 118-136 SEQ ID NO: 4; и спираль E, которая состоит из приблизительно аминокислот 139-162 SEQ ID NO: 4 (Karpusas et al., выше). Спирали А, В, С и E образуют закрученную влево четырехспиральную связку типа 2. Существует длинная петля в виде клеверного листа, петля AB, которая связывает спирали А и В, и три более короткие петли (обозначаемые ВС, CD и DE), которые связывают оставшиеся спирали (Karpusas et al., выше). Предшествующие исследования показали, что N-концевая, C-концевая и гликозилированная области спирали С молекулы ИФН-р не лежат в пределах связывающего сайта для рецептора (см. WO 00/23472 и USSN 09/832659). Соответственно, мутации в данных областях не должны особенно неблагоприятно сказаться на биологической активности молекулы ИФН. Ранее также было показано, что мутации в спирали С (аминокислоты 81, 82, 85, 86 и 8 9 зрелого ИФН-р человека) ведут к молекуле, имеющей более высокую противовирусную активность по сравнению с ИФН-р дикого типа (см. WO 00/23472 и USSN 09/832659). Сходно, было показано, что мутанты по спирали А (аминокислоты 2, 4, 8 и 11 зрелого ИФН-р человека) и по петле CD (аминокислоты 110, 11, 113, 116 и 119) имеют более высокую связывающую активность в отношении рецептора и более высокую противовирусную и антипролиферативную активности по сравнению с существующим
в природе человеческим ИФН-р дикого типа (см. WO 00/23472 и USSN 09/832659).
Другие предпочтительные модификации или замены устраняют сайты межмолекулярных поперечных сшивок или образование неправильных дисульфидных мостиков. Например, ИФН-р, как известно, имеет три остатка cys в диком типе в положениях 17, 31 и 141 SEQ ID NO: 4. Один вариант ИФН представляет собой ИФН, в котором cys (С) в положении 17 заменен на ser (S), как описано в патенте США № 4588585. Другие варианты ИФН-р включают варианты ИФН-р, имеющие, например, один или более
- 6 -
009938
ser (S), замещающих cys (C) в положении 17 и val (V) в положении 101, замещенный phe (F) , trp (W) , tyr (Y) или his (H) , предпочтительно phe (F) при нумерации в соответствии с ИФН-р дикого типа, имеющего, например, SEQ ID NO: 4, такого как описанный, например, в патенте США 6127 332. Другие предпочтительные варианты включают полипептиды, имеющие последовательность ИФН-р дикого типа, например, SEQ ID NO: 4, где val (V) в положении 101 при нумерации в соответствии с ИФН-(3 дикого типа замещен на phe (F), tyr (Y), trp (W), his (H) или phe (F), так же, как описано, например, в патенте США
6127332.
Другими вариантами ИФН-р являются зрелые молекулы ИФН-р с отсутствием начального метио-нина, например, метионина 1 SEQ ID NO: 4. Иллюстративные варианты ИФН-р не имеют начального метионина и имеют, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, например, в положении 17 зрелой формы, как описано в патенте США № 4588585.
Молекулы ИФН-р могут также быть модифицированы путем замены одной или более аминокислот одной или более дериватизированными аминокислотами, которые являются природными или не природными аминокислотами, в которых существующая в норме боковая цепь или концевая группа модифицирована с помощью химической реакции. Такие модификации включают, например, гамма-карбоксилирование, бета-карбоксилирование, пэгилирование, сульфатирование, сульфонирование, фос-форилирование, амидирование, эстерификацию, N-ацетилирование, карбобензилирование, тозилирова-ние и другие модификации, известные в данной области техники.
Другие модификации включают применение аналогов аминокислот или дериватизированных аминокислот, в которых боковая цепь удлинена или укорочена при все еще сохраняющемся обеспечении карбоксильной, амино- или другой функциональной группой-предшественником для кристаллизации, а также аналогов аминокислот, имеющих вариантные боковые цепи с подходящими функциональными группами. Например, целевое соединение может включать аминокислотный аналог, такой как, например, цианоаланин, канаванин, дъенколевая кислота, норлейцин, 3-фосфосерин, гомосерин, дигидроксифени-лаланин, 5-гидрокситриптофан, 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, диаминопимелиновая кислота, орни-тин или диаминомасляная кислота. Другие существующие в природе метаболиты или предшественники аминокислот, имеющие подходящие здесь боковые цепи, должны быть известны специалистам в данной области техники и включаются в объем настоящего изобретения.
Другие варианты ИФН-р включают обратные или ретропептидные последовательности. "Обратной" или "ретро" пептидной последовательностью обозначают ту часть полной последовательности ко-валентно связанных аминокислотных остатков (или их аналогов или миметиков), в которой образование пептидной связи в нормальном направлении от карбоксила к амино в аминокислотном остове реверсировано так, что при считывании в общепринятом направлении слева направо аминочасть пептидной связи предшествует карбонильной части (а не следует за ней). См., обычно, Goodman, M. and Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423. Описанная здесь обратная ориентация пептидов включает (а) такую, когда один или более аминоконцевых остатков переведен в обратную ("rev") ориентацию (с получением, таким образом, второго "карбоксильного конца" в самом левом положении молекулы), и (b) такую, когда один или более карбоксильных концевых остатков переведен в обратную ("rev") ориентацию (с получением второго "аминоконца" в самом правом положении молекулы). Пептидная (амидная) связь не может быть образована на границе между остатком с нормальной ориентацией и остатком с обратной ориентацией. Следовательно, определенные обратные полипептиды изобретения могут быть образованы с помощью применения подходящего компонента в виде аминокислотного миметика для связи двух соседних частей последовательностей, использующих обратную пептидную (амидную) связь. В случае (а), представленном выше, центральный остаток дикетосоединения может быть легко применен для связи структур с двумя амидными связями с достижением структуры пептидомиметика. В случае (b), представленном выше, центральный остаток диаминосоединения будет также пригоден для связи структур с двумя амидными связями с образованием структуры пептидомиметика. Обратное направление связей в таких полипептидах должно обычно дополнительно требовать инверсии энантиомерной конфигурации обратных аминокислотных остатков для поддержания пространственной ориентации боковых цепей, которая сходна с таковой не обратного пептида. Конфигурация аминокислот в обратном положении пептидов представляет собой предпочтительно (D), и конфигурация не обратного положения представляет собой предпочтительно (L). Противоположные или смешанные конфигурации приемлемы, когда подходят для оптимизации связывающей активности. Модификации полипептидов дополнительно описаны, например, в патенте США № 6399075.
Терапевтические агенты ИФН-р включают также белки ИФН-р и их варианты (например, зрелый белок), соединенные с гетерологичным пептидом. Гетерологичный пептид может быть добавлен, например, с целью увеличения полупериода жизни белка ИФН-р или улучшения его продукции. Примеры ге-терологичных пептидов включают молекулы иммуноглобулинов (Ig) или их части, например, константный домен легкой или тяжелой цепи молекулы Ig. В одном осуществлении белок ИФН-р или его вариант присоединяют (или иным образом соединяют) ко всей или части шарнирной и константной областей легкой цепи иммуноглобулина, тяжелой цепи или к обеим. Таким образом, в данном изобретении оха
- 7 -
009938
рактеризована молекула, которая включает: (1) часть белка ИФН-р (т. е. ИФН-р или его вариант), (2) второй пептид, например, такой, который увеличивает растворимость или длительность жизни in vivo части ИФН-р, например, член суперсемейства иммуноглобулинов или его фрагмент, или часть, например, часть или фрагмент IgG, например, константную область тяжелой цепи IgG1 человека, например, СН2, СН3 и шарнирные области. Конкретно "ИФН-p/Ig гибрид" представляет собой белок, включающий биологически активную часть ИФН-р, соединенную с N-концом цепи иммуноглобулина. Виды ИФН-p/Ig гибрида представляют собой "ИФН-р/Fc гибрид", который является белком, включающим часть ИФН-р, соединенную с, по меньшей мере, частью константной области иммуноглобулина. Предпочтительный гибрид Fc включает часть ИФН-р, соединенную с фрагментом антитела, содержащего C-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина.
Соответственно, в одном осуществлении гибридный белок имеет общую формулу X-Y-Z, где X представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность ИФН-р или ее часть или вариант; Y представляет собой необязательный линкерный остаток, Z представляет собой полипептид, включающий по меньшей мере часть полипептида, отличную от части X интерферона бета. В других осуществлениях гибридный белок имеет общую формулу Z-Y-X, в которой полипептид, не являющийся ИФН-р, соединен с N-концевой частью линкера, который соединен с N-концевой частью полипептида ИФН-р или его частью или вариантом. Часть Z может быть частью полипептида, который содержит иммуноглобулиноподобные домены. Примеры таких других полипептидов включают CDl, CD2, CD4 и члены класса I и класса II антигенов главного комплекса гистосовместимости. См. патент США 5565335 (Capon et al.) для примеров таких полипептидов.
Часть Z может включать, например, множество гистидиновых остатков или, предпочтительно, Fc область иммуноглобулина, "Fc" определяется здесь как фрагмент антитела, содержащий С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина.
Часть Y может быть любым линкером, который позволяет части ИФН-р сохранять свою биологическую активность. Часть Y может быть длиной в одну аминокислоту или по меньшей мере в две аминокислоты. Y может также составлять от приблизительно 2 до приблизительно 5 аминокислот; от приблизительно 3 до приблизительно 10 аминокислот в длину или 10 или более аминокислот. В предпочтительном осуществлении Y состоит из или включает GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: 6), которая кодируется, например, нуклеотидной последовательностью GGCGGTGGTGGCAGC (SEQ ID NO: 5). Y может также состоять из или включать сайт узнавания энтерокиназой, например, AspAspAspAspLys (SEQ ID NO: 8), который кодируется, например, GACGATGATGACAAG (SEQ ID NO: 7). В другом осуществлении Y состоит из или включает SerSerGlyAspAspAspAspLys (SEQ ID NO: 10), которая кодируется, например, AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID NO: 9).
Кроме того, на соединение между частью ИФН-р (X) и второй не-ИФН-р частью Z (например, областью Fc иммуноглобулина) можно также повлиять с помощью любой химической реакции, которая должна связывать две молекулы вместе так, чтобы части X и Z сохраняли свои соответствующие активности. Данное химическое связывание может включать многие химические механизмы, такие как кова-лентное связывание, аффинное связывание, интеркалирование, координационное связывание и комплек-сирование. Примеры соединяющих агентов (т.е. линкеров "Y" в общей формуле) для создания ковалент-ного связывания между частью ИФН-р и частью Z могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные эфиры, диизоцианаты, такие как толилен-2,6-диизоцианат, глутеральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины, такие как бис-(п-диазоний-бензоил)-этилендиамин, бифункциональные производные имидоэфиров, такие как диметиладипимидат, и биоактивные соединения фтора, такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. Данное перечисление не рассматривается: как исчерпывающее для различных классов химических присоединяющих агентов, известных в данной области техники. Многие из них имеются в продаже, такие как №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (EDC); 4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)-толуол (SMPT: Pierce Chem. Co.,
Cat. # 21558G).
Предпочтительный гибридный белок ИФН-р/Ig состоит из или включает SEQ ID NO: 12, которая содержит полноразмерную зрелую форму ИФН-р человека, т.е. SEQ ID NO: 4, соединенную с IgG1Fc человека (ZL5107) (см. WO 00/23472 и USSN 09/832659) (см. фиг. 1). Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 11. ДНК, кодирующая ИФН-р человека, заканчивается нуклеотидным триплетом 568-570 (AAC, кодирующим аргинин), и ДНК, кодирующая константную область IgG1 человека, начинается с триплета (GAC, кодирующего аспарагиновую кислоту), начинающегося с нуклеотидного номера 574 SEQ ID NO: 11.
Другой предпочтительный гибридный белок ИФН-р/Ig представлен в SEQ ID NO: 14 и кодируется SEQ ID NO: 13 (см. WO 00/23472 и USSN 09/832659). Данный последний гибридный белок состоит из человеческого ИФН-р, соединенного с линкером G4S, который сам соединен с IgG1Fc человека (ZL6206). Линкер G4S (кодируемый нуклеотидами с 571 по 585 SEQ ID NO: 7) состоит из аминокислотной последовательности GGGGS (SEQ ID NO: 9). Способы получения данных белков описаны в WO
- 8 -
009938
00/23472 и USSN 09/8212659.
В предпочтительном осуществлении полипептид ИФН-р соединяют через его С-конец с по меньшей мере частью области Fc иммуноглобулина. ИФН-р образует аминоконцевую часть, а область Fc образует карбоксиконцевую часть. В данных гибридных белках область Fc предпочтительно ограничена шарнирным участком константного домена и доменами СН2 и СН3. Область Fc в данных гибридах может быть также ограничена частью шарнирного участка, причем часть способна образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики, и доменами СН2 и СН3 или их функциональными эквивалентами. Данные константные области могут происходить от любого вида млекопитающего (предпочтительно человека) и могут происходить из любого подходящего класса и/или изотипа, включая IgA, IgD, IgM, IgE
и IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют гибриды Ig, могут быть получены любым способом, известным в данной области техники (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) или получены из клонов, имеющихся в открытом доступе. Способы получения генов, которые кодируют константные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, указаны, например, Robinson, R. et al., заявка PCT, публикация № WO87/02671. Последовательность кДНК, кодирующая молекулу или фрагмент интерферона, может быть прямо соединена с кДНК, кодирующей константные области тяжелых цепей Ig, или может быть присоединена через линкерную последовательность. В дополнительных осуществлениях изобретения может быть создана система рекомбинантных векторов для адаптации последовательностей, кодирующих интерферон бета, к правильной рамке считывания с синтетическим шарнирным участком. Дополнительно может быть желательно включить в виде части рекомбинантной векторной системы нуклеиновые кислоты, соответствующие 3'-фланкирующей области гена иммуноглобулина, включая сайты расщепления РНК/полиаденилирования и нижележащие последовательности. Более того, может быть желательно сконструировать сигнальную последовательность выше последовательностей, кодирующих иммуноглобулиновый гибридный белок, для облегчения секреции гибридной молекулы из клетки, трансформированной рекомбинантным вектором.
В настоящем изобретении предлагаются димерные гибридные молекулы, а также мономерные или мультимерные молекулы, включающие гибридные белки. Такие мультимеры могут быть созданы с применением областей Fc или их частей, молекул Ig, которые обычно мультивалентны, таких как пентамеры IgM или димеры IgA. Понятно, что для образования и стабилизации пентамеров IgM и димеров IgA может быть необходима цепь J полипептида. Альтернативно, мультимеры гибридных белков ИФН-р могут быть образованы с применением белка с аффинностью к области Fc молекул Ig, такого как протеин А. Например, множество гибридных белков ИФН-р/иммуноглобулин может быть привязано к шарикам протеин А-агарозы.
Данные поливалентные формы полезны, так как они содержат множество интерферон-связывающих сайтов для рецептора. Например, двухвалентный растворимый ИФН-р может состоять из двух тандемных повторов аминокислот с 1 по 166 SEQ ID NO: 4 (или кодируемых нуклеиновыми кислотами под номерами с 1 по 498 SEQ ID NO: 3) (часть X в общей формуле), разделенных линкерной областью (часть Y), повторы связаны, по меньшей мере, с частью константного домена иммуноглобулина (часть Z). Могут быть также сконструированы альтернативные поливалентные формы, например, с помощью химического присоединения гибридов ИФН-р/Ig к любой клинически приемлемой молекуле-носителю, полимеру, выбранному из группы, состоящей из фиколла, полиэтиленгликоля или декстрана с применением общепринятых способов присоединения. Альтернативно, ИФН-р может быть химически присоединен к биотину, и затем биотин-интерферон бета-Fc конъюгату дают связаться с авидином, что дает четырехвалентные молекулы авидин/биотин/интерферон бета. Гибриды ИФН-р/Ig могут быть также ковалентно присоединены к динитрофенолу (DNP) или тринитрофенолу (TNP), и полученный конъюгат осажден анти^М^-или анти-TNP-IgM с образованием декамерных конъюгатов с валентностью 10 для связывающих сайтов рецепторов интерферона бета.
Производные белков изобретения также включают различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. Благодаря присутствию ионизируемых амино- и карбоксильных групп, например, белки ИФН-р и их варианты могут быть в форме солей кислоты или основания или могут быть в нейтральной форме. Индивидуальные аминокислотные остатки можно также модифицировать с помощью окисления или восстановления. Кроме того, первичную аминокислотную структуру (включая N- и/или С-концевые части) или гликан ИФН-р можно модифицировать ("деривати-зировать") с помощью образования ковалентных или агрегатных конъюгатов с другими химическими частями, такими как гликозильные группы, полимеры полиалкиленгликоля, такие как полиэтиленгли-коль, липиды, фосфат, ацетильные группы и тому подобное, или с помощью создания мутантных аминокислотных последовательностей.
Другие производные интерферона бета/Ig включают ковалентные или агрегатные конъюгаты интерферона бета или его фрагментов с другими белками или полипептидами, такими как дополнительные N-концы или С-концы, полученные синтезом в рекомбинантной культуре. Например, конъюгированный
- 9 -
009938
пептид может быть сигнальной (или лидирующей) полипептидной последовательностью N-концевой области белка, который котрансляционно или посттрансляционно направляет перенос белка из места его синтеза к месту его функции внутри или снаружи клеточной мембраны или стенки (например, дрожжевой лидер-альфа-фактор). Например, сигнальный пептид может быть от ИФН-р, т.е. аминокислоты с 1 по 21 SEQ ID NO: 2, соответствующие нуклеотидам 1-138 SEQ ID NO: 1. Сигнальный пептид может быть также от VCAM, т.е. аминокислоты 1-24 SEQ ID NO: 12, которые кодируются нуклеотидами 1-72 SEQ ID
NO: 11.
Гетерологичный полипептид (например, пептид) или другая молекула может также быть использована в качестве метки или для помощи в очистке терапевтического агента ИФН-р. Такие пептиды хорошо известны в данной области техники. Например, полинуклеотид настоящего изобретения может быть соединен в рамке считывания с маркерной последовательностью, обозначаемой здесь также как Tag-sequence ("таг-последовательность"), кодирующая "таг-пептид", что позволяет маркировать и/или очищать полипептид настоящего изобретения. В предпочтительном осуществлении маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый таг, например, поставляемый вектором PQE-9. Имеются в продаже другие многочисленные таг-пептиды. Другие часто применяемые таги включают эпитопы myc (например, см. Ellison et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:21150-21157), которые включают последовательность из 10 остатков от с-тус, систему pFLAG (International Biotechnologies, Inc.), систему pEZZ-протеин A (Pharmacia, NJ) и часть из 16 аминокислот от белка гемагглютинина Haemophilus influenza. Более того, любой пептид может быть использован в качестве тага при условии, что реагент, например, антитело, взаимодействующее специфически с таг-полипептидом, имеется в наличии или может быть получено или идентифицировано.
В одном осуществлении белок ИФН-р или его вариант соединяют на N- или С-конце с одним из следующих пептидов: HisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO: 16), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью СATCATCATCATCATCAT (SEQ ID NO: 15); SerGlyGlyHisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO: 18), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью TCCGGGGGCCATCAT-CATCATCATCAT (SEQ ID NO: 15) и SerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspAspAspLys (SEQ ID NO: 20), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью TCCGGGGGCCATCATCAT-CATCATCATAGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID NO: 19) .
Аминокислотная последовательность интерферона бета может быть также присоединена к пептиду AspTyrLysAspAspAspAspLys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 21) (Норр et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Последняя последовательность является высоко антигенной и обеспечивает эпитопом, обратимо связываемым специфическим моноклональным антителом, позволяя быстро тестировать и легко очищать экс-прессируемый рекомбинантный белок. Данная последовательность также специфически расщепляется энтерокиназой слизистой быка по остатку, следуемому сразу после пары Asp-Lys.
В другом осуществлении терапевтический агент ИФН-р включает белок ИФН-р или его вариант, соединенный с белком альбумином, его вариантом или частью. Такой гибридный белок может быть создан, как описано, например, в WO 01/77137.
Терапевтический агент ИФН-р может также включать молекулу, которая не является полипептидом. Например, белок ИФН-р или его вариант могут быть присоединены ковалентно или не ковалентно к полимеру, например, биодеградируемому полимеру. Например, белок ИФН-р или его вариант могут быть пэгилированы, например, присоединены к полиэтиленгликолю (ПЭГ), как описано в WO 00/23114.
В широких рамках настоящего изобретения единственная молекула полимера может быть применена для конъюгации с ИФН-р, хотя также предусматривается, что может быть присоединено также более одной полимерной молекулы. Должно быть понятно, что при конъюгации полимера могут применяться любые группы, части или другие варианты конъюгирующихся агентов, которые подходят для конечного использования при применении. В качестве примера, в некоторых применениях может быть пригодно ковалентное привязывание к полимеру функциональной части, придающей устойчивость к УФ-деградации или антиоксидантной, или имеющей другие свойства или характеристики. В качестве дополнительного примера, в некоторых применениях может быть выгодно функционализировать полимер, придавая ему реакционную способность или способность к поперечной сшивке, для усиления различных свойств или характеристик всего конъюгированного материала. Соответственно, полимер может содержать любую функциональную часть, повторяющиеся группы, связи или другие постоянные структуры, которые не препятствуют эффективности композиции конъюгированного ИФН-р в предназначенных для него целях.
ИФН-р конъюгируют наиболее предпочтительно через концевую реакционноспособную группу полимера, хотя конъюгации могут также быть ответвлены от не концевых реакционноспособных групп. Полимер с реакционноспособной(ными) группой(ами) обозначают здесь как "активированный полимер". Реакционноспособная группа избирательно взаимодействует со свободными амино- или другими реак-ционноспособными группами на белке. Активированный(ые) полимер(ы) взаимодействует(ют) так, что присоединение может осуществляться к любой доступной аминогруппе ИФН-р, такой как альфа-аминогруппы или эпсилон-аминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, подходящим обра
- 10 -
009938
зом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, окисленные углеводные части и мер-каптогруппы ИФН-р (если они доступны) также могут быть использованы в качестве сайтов присоединения.
Хотя полимер может быть присоединен где угодно на молекуле ИФН-р или его варианте, или других аминокислотах, присоединенных прямо или непрямо к молекуле ИФН-р, наиболее предпочтительный сайт для присоединения полимера представляет собой N-конец молекулы ИФН-р. Вторичный(ые) сайт(ы) находится(ятся) у или около С-конца и присоединены через остатки сахаров. Таким образом, изобретение охватывает в качестве своих наиболее предпочтительных осуществлений: (i) конъюгаты ИФН-р или его варианта, соединенные с полимером по N-концу; (ii) конъюгаты ИФН-р или его варианта, соединенные с полимером по С-концу; (iii) соединенные с сахарами конъюгаты полимерных конъю-гатов; (iv) а также конъюгаты белков ИФН-р или их вариантов, соединенные с полимером по N-, С-концам и по сахарам.
Обычно применяют от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество представляет собой баланс между максимализацией степени реакции при минимализации неспецифических модификаций продукта и при определении в то же время химического состава, который должен поддерживать оптимальную активность, наряду с этим при оптимизации в то же время, если это возможно, полупериода жизни белка.
Предпочтительно, чтобы сохранялось, по меньшей мере, приблизительно 50% биологической активности белка, и наиболее предпочтительно, чтобы сохранялось 100%.
Реакции можно осуществлять с помощью любого подходящего метода, применяемого для взаимодействия биологически активных материалов с инертными полимерами, предпочтительно приблизительно при рН 5-7, если реакционноспособные группы находятся на альфа-аминогруппе на N-конце. Обычно процесс включает получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу) и после этого взаимодействие белка с активированным полимером для получения растворимого белка, подходящего для состава. Модификации указанной выше реакции могут быть проведены несколькими способами, которые могут включать одну или более стадий.
Как указывалось выше, в наиболее предпочтительных осуществлениях изобретения в качестве линкера к полимеру применяется N-концевой участок ИФН-р. Одним иллюстративным способом является способ восстановительного алкилирования, в котором используется дифференциальная реакционная способность различных типов первичных аминогрупп (эпсилон-аминогрупп на лизине в сравнении с аминогруппами N-концевого метионина), доступных для дериватизации на ИФН-р. При подходящих избирательных условиях может быть достигнута по существу избирательная дериватизация ИФН-р по N-концу карбонильной группой, содержащей полимер. Реакцию проводят при рН, который позволяет достичь преимущества в различиях рКа между эпсилон-аминогруппами остатков лизина и альфа-аминогруппой N-концевого остатка ИФН-р. Данный тип химических превращений хорошо известен специалистам в данной области техники.
Например, может быть использована реакционная схема, в которой данная избирательность поддерживается с помощью проведения реакций при низком рН (обычно 5-6) при условиях, когда полимер ПЭГ-альдегид вводят в реакцию с ИФН-р в присутствии цианоборгидрида натрия. После очистки ПЭГ-ИФН-р и анализа с помощью ДДС-Na ПААГЭ, масс-спектрометрии MALDI и пептидного секвенирова-ния/картирования это дает ИФН-р, чей N-конец специфически помечен частью ПЭГ.
Кристаллическая структура ИФН-р указывает на то, что N- и С-концы локализованы близко друг к другу (см. Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818). Таким образом, модификации С-концевого участка ИФН-р также должны иметь минимальный эффект на активность. Так как не существует простой химической стратегии для целевого присоединения полиалкиленгликолевого полимера, такого как ПЭГ, к С-концу, следует прибегнуть прямо к генной инженерии сайта, который может быть применен в качестве мишени для полимерной части. Например, включение Cys в сайт, который находится у или около С-конца, должно позволить создать специфическую модификацию с применением малеи-мида, винилсульфона или галогенцетат-активированного полиалкиленгликоля (например, ПЭГ). Данные производные могут быть специфически применены для модификации сконструированных цистеинов, благодаря высокой избирательности данных реагентов для Cys. Другие стратегии, такие как включение гистидинового тага, который может быть мишенью (Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3: 551), или добавочного сайта гликозилирования, представляют собой другие альтернативы для модификации С-конца
ИФН-р.
Гликан на определенном ИФН-р находится также в положении, которое позволяет сделать дополнительную модификацию без изменения активности. Способы целевых сахаров как сайтов для химической модификации также хорошо известны и, следовательно, возможно, чтобы полиалкиленгликолевый полимер был добавлен прямо и специфично к сахарам на ИФН-р, которые были активированы окислением. Например, может быть создан полиэтиленгликоль-гидразид, который образует относительно стабильные гидразоновые связи путем конденсации с альдегидами и кетонами. Данное свойство было ис
- 11 -
009938
пользовано для модификации белков через окисленные олигосахаридные связи. См. Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. В частности, обработка ПЭГ-карбоксиметилгидразида нитритом дает ПЭГ-карбоксиметилазид, который представляет собой электрофильно активную группу, реакционноспо-собную в отношении аминогрупп. Данная реакция может быть использована также для получения белков, модифицированных полиалкиленгликолем. См. патенты США 4101380 и 4179337.
Химические модификации, опосредованные тиоловым линкером, могут дополнительно способствовать поперечным сшивкам белков. Это может быть выполнено, например, путем создания реакционно способных альдегидов на углеводных частях с помощью периодата натрия с образованием цистамино-вых конъюгатов через альдегиды и индукцией поперечных сшивок через тиоловые группы на цистами-нах (см. Pepinsky, В. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 и Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243). Соответственно, данный тип химических превращений, как ожидается, будет подходить для модификации полиалкиленгликолевыми полимерами, когда линкер включается в сахар и поли-алкиленгликолевый полимер присоединяется к линкеру. Тогда как содержащие аминотиол или гидразин линкеры способны допускать присоединение единичной полимерной группы, структура линкера может варьироваться так, чтобы присоединялось множество полимеров и/или чтобы пространственная ориентация полимера в отношении ИФН-р изменялась.
Примеры полимеров включают растворимый в воде полимер, такой как полиалкиленгликолевый полимер. Не ограничивающийся перечень таких полимеров включает другие полиалкиленоксидные го-мополимеры, такие как полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры. Другие примеры подходящих растворимых в воде и не пептидных полимерных остовов включают поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксипропилметакриламид), поли(а-гидрокси кислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолин, поли (N-акрилоилморфолин) и их сополимеры, триполимеры и смеси. В одном осуществлении полимерный остов представляет собой поли(этиленгликоль) или монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), имеющие среднюю молекулярную массу от приблизительно 200 Да до приблизительно 400000 Да. Должно быть понятно, что другие родственные полимеры также подходят для применения при осуществлении данного изобретения и что применение термина ПЭГ или поли(этиленгликоль) рассматривается как включающее, а не исключающее в данном отношении. Термин ПЭГ включает по-ли(этиленгликоль) в любой из его форм, включая алкоксиПЭГ, бифункциональный ПЭГ, "многорукий" ПЭГ, раздвоенный ПЭГ, разветвленный ПЭГ, подвешенный ПЭГ или ПЭГ с деградируемыми связями в нем.
В одном осуществлении полиалкиленгликолевые остатки С1-С4 алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), или поли(окси)алкиленгликолевые остатки таких гликолей включаются в интересующие полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединяется белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) или представлять собой полиоксиэтили-рованный полиол, предлагаемый во всех случаях так, что полимер является растворимым в воде при комнатной температуре. Не ограничивающие примеры таких полимеров включают полиалкиленоксид-ные гомополимеры, такие как ПЭГ или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и их блок-сополимеры, предлагаемые так, что поддерживается растворимость в воде блок-сополимера. Примеры полиоксиэтилированных полиолов включают, например, полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу или тому подобное. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина представляет собой тот же остов, что и существующий в природе, например, у животных и человека в моно-, ди- и триглицеридах. Следовательно, данное ветвление не должно обязательно рассматриваться как чужеродный агент в организме.
В качестве альтернативы полиалкиленовым оксидам могут быть применены декстран, поливинил-пирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов и тому подобное. Специалист в данной области техники должен знать, что предшествующий перечень является только иллюстративным и что охватываются все полимерные материалы, имеющие описываемые здесь качества.
Необязательно, чтобы полимер имел какую-либо конкретную молекулярную массу, но предпочтительно, чтобы молекулярная масса была между приблизительно 300 и 100000, более предпочтительно между 10000 и 40000. В частности, размеры 20000 или более являются наилучшими для предотвращения потери белка из-за фильтрации в почках.
Создание производных полиалкиленгликолей дает ряд выгодных свойств для состава конъюгатов полимер-ИФН-р при осуществлении настоящего изобретения, связанных со следующими свойствами производных полиалкиленгликолей: улучшение растворимости в воде при отсутствии в то же время антигенного или иммуногенного ответа; высокая степень биосовместимости; отсутствие биодеградации производных полиалкиленгликолей in vivo; и свободная экскреция живыми организмами.
Более того, в другом аспекте изобретения можно применять ИФН-р, ковалентно связанный с полимерным компонентом, в котором природа конъюгации включает расщепляемые химические ковалентные связи. Это позволяет осуществлять контроль в плане течения времени, за которое полимер может быть
- 12 -
009938
отщеплен от ИФН-р. Данная ковалентная связь между лекарством ИФН-р и полимером может быть расщеплена путем химической или ферментативной реакции. Продукт полимер-ИФН-р сохраняет приемлемый уровень активности. Одновременно части полиэтиленгликоля присутствуют в конъюгирующем полимере для наделения конъюгата полимер-ИФН-р высокой растворимостью в воде и увеличенной способностью к циркуляции в кровотоке. В результате данных улучшенных характеристик изобретение охватывает парентеральную, интраназальную и пероральную доставку обоих активных видов полимера-ИФН-р и, после гидролитического расщепления, биодоступность ИФН-р per se при применении in vivo.
Взаимодействие полимера с ИФН-р для получения конъюгатов, например, N-концевых конъюгиро-ванных продуктов, может быть легко осуществлено с применением широкого спектра реакционных схем. Активность и стабильность конъюгатов ИФН-р может варьироваться несколькими способами с помощью применения полимера с различным размером молекулы. Растворимость конъюгатов может варьироваться путем изменения пропорции и размера фрагмента полиэтиленгликоля, включенного в полимерную композицию.
В одном осуществлении конъюгаты по настоящему изобретению получают путем взаимодействия белка с активированным полиалкиленгликолевым соединением (PCG) . Например, ИФН может быть введен в реакцию с ПЭГ-альдегидом в присутствии восстанавливающего агента (например, цианоборгидри-да натрия) с получением через восстановительное алкилирование конъюгата ПЭГ-белок, соединенных через аминную связь. См., например, европейский патент 0154316 Bl и международную патентную заявку № PCT/US03/01559.
В определенных осуществлениях изобретения ИФН-р человека пэгилирован со следующими активированными полиалкиленгликолями: 20 кДа мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-п-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-м-метилфенил-О-2-метилпропион-альдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегидом и 20 кДа мПЭГ-О-м-фенилацетальдегидом, с получением ИФН-р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом, ИФН-P, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-п-метилфенил-0-2-метилпропиональдегидом, ИФН-р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-м-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, ИФН-р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом, ИФН-р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегидом, и ИФН-р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-м-фенилацетальдегидом, соответственно. Подробное описание получения и характеристика человеческого ИФН-р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-O-2-метилпропиональдегидом и 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом, представлено ниже и также предлагается в международной патентной заявке
No. PCT/US03/01559.
В одном осуществлении пэгилированный ИФН-р получают следующим образом. ИФН-р, например, сыпучий промежуточный продукт ИФН-р-Ы (клиническая партия сыпучего лекарства, которая проходит все тесты для применения у человека) в концентрации 250 мкг/мл в 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2, 200 мМ NaCl, разводят равным объемом 100 мМ MES, рН 5,0, и рН доводят до 5,0 с помощью HCl. Образец наносят на колонку FF SP-Сефарозы(r) (Pharmacia, Piscataway, NJ) при 6 мг ИФН-р/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и продукт элюируют 30 мМ фосфата натрия, рН 6,0, 600 мМ NaCl. Фракции элюата могут быть проанализированы на их величины поглощения при 280 нм, и концентрацию интерферона в образцах, определенную по поглощению с применением коэффициента экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл.
К раствору ИФН-р 1 мг/мл из элюата SP добавляют 0,5 M фосфат натрия, рН 6,0, до 50 мМ, циано-боргидрид натрия (Aldrich, Milwaukee, WI) добавляют до 5 мМ и 20К ПЭГ альдегида (Shearwater Polymers, Huntsville, AL) добавляют до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 20 ч. Пэгилированный интерферон очищают от продуктов реакции с помощью последовательных хрома-тографических стадий на колонке для FPLC Суперозы(r) 6 (Pharmacia), делящей по размеру, 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы, и на SP-Сефарозе(r) FF. Использование делящей по размеру колонки ведет к базисной линии разделения модифицированного и не модифицированного ИФН-р. Пул элюата с гель-фильтрации, содержащий ПЭГ-интерферон бета, разводят 1:1 водой и наносят на колонку SP-Сефарозы(r) 2 мг интерферона бета/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и затем пэгилированный интерферон бета элюируют с колонки 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 800 мМ NaCl. Фракции элюата анализируют на содержание белка по поглощению при 280 нм. Концентрацию пэгилированного интерферона представляют в эквивалентах интерферона, так как часть ПЭГ не вносит вклад в поглощение при 280 нм. Данный способ и характеристика полученного пэгилированного ИФН-р дополнительно описаны в WO 00/23114. Конъюгация ПЭГ с ИФН-р, очевидно, не изменяет его противовирусной активности. Кроме того, было обнаружено, что специфическая активность пэгилированного ИФН-р является более высокой (приблизительно в 10 раз), чем таковая не пэгилированного ИФН-р (WO 00/23114).
ИФН-р может быть также пэгилирован частью 5K ПЭГ, которая может быть приобретена, например, у Fluka, Inc. (Cat. № 75936, Ronkonkoman, NY), следуя тому же протоколу, что и описанный выше
- 13 -
009938
для 20K ПЭГ альдегида.
ИФН-р, модифицированный 20 кДа мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом, может быть получен следующим образом. 10 мл сыпучего промежуточного продукта ИФН-р-1 а (клиническая партия сыпучего лекарства, которая проходит все тесты для применения у человека), 250 мкг/мл, в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ NaCl, разводят 12 мл 165 мМ MES, рН 5,0, и 50 мл 5 н HCl. Образец наносят на 300 мкл колонку FF SP-Сефарозы (Pharmacia). Колонку промывают 3x300 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и белок элюируют 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 600 мМ NaCl. Фракции элюата анализируют на их поглощение при 280 нм, и концентрацию ИФН-р в образцах, определенную с применением коэффициента экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяют, что дает концентрацию ИФН-р 3,66 мг/мл, разводимую затем до 1,2 мг/мл водой.
К 0,8 мл ИФН-р из разведенного пула элюата с SP-Сефарозы добавляют 0,5 M фосфат натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборгидрид натрия (Aldrich) добавляют до 5 мМ и 20 кДа мПЭГЮ-2-метилпропиональдегид добавляют до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 16 ч в темноте. ПЭГилированный ИФН-р очищают из реакционной смеси на колонке FF SP-Сефарозы, 0,5 мл, следующим образом: 0,6 мл реакционной смеси разводят 2,4 мл 20 мМ MES, рН 5,0, и наносят на колонку SP-Сефарозы. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и затем ПЭГилированный ИФН-р элюируют с колонки 25 мМ MES, рН 6,4, 400 мМ NaCl. ПЭГилированный ИФН-р дополнительно очищают на колонке для FPLC Суперозы 6 HR 10/30, делящей по размеру, 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы. Скорость тока через делящую по размеру колонку (25 мл) составляет 20 мл/ч, и собирают фракции по 0,5 мл. Фракции элюата анализируют на содержание белка по поглощению при 280 нм, объединяют и определяют концентрацию белка пула.
Концентрацию ПЭГилированного ИФН-р представляют в эквивалентах ИФН, так как часть ПЭГ не вносит вклад в поглощение при 230 нм. Образцы пула отбирают для анализа, и оставшаяся часть может разводиться до 30 мкг/мл буфером состава, содержащим HSA, аликвотироваться по 0,25 мл/флакон и храниться при -70°C.
ИФН-р, модифицированный 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом, может быть получен следующим образом. 20 мл сыпучего промежуточного продукта ИФН-р(r) (клиническая партия сыпучего лекарства, которая проходит все тесты для применения у человека), 250 мкг/мл, в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ NaCl, разводят 24 мл 165 мМ MES, рН 5,0, 100 мкл 5 н HCl и 24 мл воды. Образец наносят на 600 мкл колонку FF SP-Сефарозы (Pharmacia). Колонку промывают 2x900 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и белок элюируют 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 600 мМ NaCl. Фракции элюата анализируют на их поглощение при 280 нм, и концентрацию ИФН-р в образцах определяют с применением коэффициента экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяют, что дает концентрацию ИФН-р 2,3 мг/мл. К 1,2 мл ИФН-р-1а из пула элюата с SP-Сефарозы добавляют 0,5 M фосфат натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборгидрид натрия (Aldrich) добавляют до 5 мМ и 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид добавляют до 10 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 18 час в темноте. Пэгилированный ИФН-р может быть очищен из реакционной смеси на колонке FF SP-Сефарозы, 0,75 мл, следующим образом: 1,5 мл реакционной смеси разводят 7,5 мл 20 мМ MES, рН 5,0, 7,5 мл воды и 5 мкл 5 н HCl и наносят на колонку SP-Сефарозы. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ NaCl, и затем ПЭГилированный ИФН-р элюируют с колонки 20 мМ MES, рН 6,0, 600 мМ NaCl. ПЭГилированный ИФН-р дополнительно очищают на колонке для FPLC Суперозы 6 HR 10/30, делящей по размеру, 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы. Скорость тока через делящую по размеру колонку (25 мл) составляет 20 мл/ч, и собирают фракции по 0,5 мл. Фракции элюата анализируют на содержание белка по поглощению при 280 нм, объединяют и определяют концентрацию белка пула. Концентрацию ПЭГилированного ИФН-р представляют в эквивалентах ИФН после учета вклада ПЭГ (20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид имеет коэффициент экстинкции при 280 нм 0,5 для раствора 1 мг/мл) в поглощение при 280 нм с применением коэффициента экстинкции 2 для раствора ПЭГилированного ИФН-р 1 мг/мл. Образцы пула могут быть отобраны для анализа, и оставшаяся часть может разводиться до 30 мкг/мл буфером состава, содержащим HSA, аликвотироваться по 0,25 мл/флакон и храниться при -70°C.
В способах изобретения может быть применен гликозилированный ИФН-р, соединенный с не существующим в природе полимером. Полимер может включать полиалкиленгликолевую часть. Полиал-киленгликолевая часть может быть присоединена к интерферону-бета с помощью группы, выбранной из альдегидной группы, малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы, множества гистидиновых остатков, гидразиновой группы и аминотиоловой группы. ИФН-р может быть присоединен к полиэтиленгликолевой части, где ИФН-р присоединяют к полиэтиленгликолевой части с помощью лабильной связи, где лабильная связь расщепляется путем биохимического гидролиза и/или про-теолиза. Полимер может иметь молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 40 кДа. Другой ИФН-р, который может быть применен, представляет собой физиологически активную компози
- 14 -
009938
цию интерферона-бета, включающую физиологически активный гликозилированный интерферон-бета, связанный на N-конце с полимером, включающим полиалкиленгликолевую часть, где физиологически активный интерферон-бета и полиалкиленгликолевая часть организованы так, что физиологически активный интерферон-бета в физиологически активной композиции интерферона-бета имеет по существу сходную активность по сравнению с физиологически активным интерфероном-бета, не имеющим указанной части, при тестировании на противовирусную активность.
Гетерологичные полипептиды или другие молекулы могут быть ковалентно или нековалентно связаны с белком ИФН-р или его вариантом. "Ковалентно связаны" означает, что различные остатки согласно изобретению либо прямо ковалентно связаны друг с другом, либо иначе непрямо ковалентно соединены друг с другом через промежуточную часть или части, такие как мостик, спейсер или линкерная часть или части. Промежуточная часть или части называют "присоединяющей группой". Термин "конъ-югированный" применяют взаимозаменяемо с "ковалентно связанным".
ИФН-р для применения в изобретении может быть гликозилированным или не гликозилированным (или без гликозилирования). Не гликозилированные ИФН-р могут быть получены, например, в прока-риотических клетках-хозяевах. Белки ИФН-р или их варианты также могут быть модифицированы путем присоединения полисахаридов, которые не присутствуют на ИФН-р в нормальных условиях.
3. Способы получения терапевтических агентов ИФН-р
Терапевтические агенты ИФН-р настоящего изобретения могут быть получены любыми подходящими способами, такими как способы, включающие конструирование нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический агент ИФН-р, и экспрессию данной нуклеиновой кислоты в подходящем трансформированном хозяине. Данный способ будет давать рекомбинантные терапевтические агенты ИФН-р. Терапевтические агенты ИФН-р могут также быть получены с помощью химического синтеза или сочетания химического синтеза и технологии рекомбинантной ДНК.
В одном осуществлении нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический агент ИФН-р, конструируют путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей ИФН-р или его вариант. Например, гибридный белок ИФН-р может быть получен, как описано, например, здесь. Существующая в природе нуклеиновая кислота ИФН-р может быть получена в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники. Например, нуклеиновая кислота может быть выделена с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с применением РНК, полученной из клетки, известной как экспрессирующая ИФН-р, например лейкоцита, и праймеров на основе последовательности гена ИФН-р, например, SEQ ID NO: 1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ИФН-р, могут также быть выделены с помощью скрининговых библиотек, например библиотек кДНК, созданных от клеток, экспрессирующих ИФН-р, с зондом, например, олигонуклеотидом, включающим часть последовательности ИФН-р.
Альтернативно, может быть использована полная аминокислотная последовательность для конструирования гена по обратной трансляции. Может быть синтезирован олигомер ДНК, содержащий нук-леотидную последовательность, кодирующую терапевтический агент ИФН-р. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого пептида, и затем связать их вместе. Индивидуальные нуклеотиды обычно содержат 5' или 3' выступающие концы для комплементарного объединения.
Изменения в нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ИФН-р, могут быть введены способами, хорошо известными в данной области техники. Например, изменения могут быть сделаны с помощью сайт-направленного мутагенеза, как описано, например, в Mark et al., "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984) и в патенте США №
4588585.
Другой способ конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический агент ИФН-р, заключается в химическом синтезе. Например, ген, который кодирует желаемый терапевтический агент ИФН-р, может быть синтезирован химическими способами с применением олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды создаются на основе аминокислотной последовательности желаемого терапевтического агента ИФН-р.
При выборе нуклеиновой кислоты для экспрессии в экспрессионной системе может быть желательным отбор тех кодонов, которые благоприятны для клетки-хозяина или экспрессионной системы, в которой рекомбинантный агент ИФН-р будет продуцироваться. Известно, например, что определенные кодо-ны экспрессируются предпочтительно по сравнению с другими в прокариотических клетках ("предпочтение кодонов").
Последовательность ДНК, кодирующая терапевтический агент ИФН-р, может также включать или не включать последовательность ДНК, которая кодирует сигнальную последовательность. Такая сигнальная последовательность, если она присутствует, должна быть такой, чтобы узнаваться клеткой, выбранной для экспрессии терапевтического агента ИФН-р. Сигнальная последовательность может быть прокариотической, эукариотической или сочетанием их двух. Сигнальные последовательности хорошо
- 15 -
009938
известны в данной области техники, и несколько различных представителей описано в данной области техники. Сигнальная последовательность может быть таковой от нативного (т. е. существующего в природе) ИФН-р. Включение сигнальной последовательности зависит от того, является ли желательным получение терапевтического агента ИФН-р, секретируемого рекомбинантными клетками, в которых он продуцируется. Если выбранные клетки являются прокариотическими, обычно предпочтительно, чтобы последовательность ДНК не кодировала сигнальную последовательность. Если выбранные клетки являются эукариотическими, обычно предпочтительно, чтобы сигнальная последовательность кодировалась, и наиболее предпочтительно, чтобы применялась сигнальная последовательность ИФН-р дикого типа.
Уже скомпонованную (с помощью синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический агент ИФН-р, вставляют в экспрессионный вектор, в котором она оперативно связана с контролирующей экспрессию последовательностью, подходящей для экспрессии терапевтического агента ИФН-р в желаемом трансформированном хозяине. Правильность компоновки может быть подтверждена с помощью секвенирования нуклеотидов, рестрикционного картирования и экспрессии биологически активного полипептида в подходящем хозяине или клетке-хозяине. Как хорошо известно в данной области техники, для того, чтобы получить высокие уровни экспрессии трансфицированного гена в хозяине или клетке-хозяине, ген должен быть оперативно связан с последовательностями, осуществляющими экспрессионный контроль транскрипции и трансляции, которые функционируют в выбранном экспрессионном хозяине.
Выбор последовательности, контролирующей экспрессию, и экспрессионного вектора должен зависеть от выбора клетки-хозяина. Может быть применено широкое разнообразие сочетаний хозяина экспрессии/вектора. Пригодные экспрессионные векторы для эукариотических хозяев, например, эукарио-тических клеток-хозяев, включают, например, векторы, включающие последовательности, контролирующие экспрессию, от SV40, вируса папилломы быка, аденовируса и цитомегаловируса, например, следующие векторы: векторы, происходящие от pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo и pHyg. Альтернативно, производные вирусов, таких как вирус папилломы быка (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, происходящие от pREP и р205) могут быть применены для временной экспрессии белков в эукариотических клетках. Различные способы, применяемые для получения плазмид и трансформации организмов-хозяев, хорошо известны в данной области техники. По поводу других экспрессионных систем см. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritisch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) главы 16 и
17.
Пригодные для бактериальных хозяев экспрессионные векторы включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды от E. coli, включая E1, pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, широкий диапазон хозяйских плазмид, таких как RP4, ДНК фагов, например многочисленные производные фага лямбда, например, NM989, и другие ДНК фагов, такие как М13 и односпиральные ДНК нитчатых фагов. Пригодные экспрессионные векторы для дрожжевых клеток включают плазмиду 2.mu. и ее производные. Пригодные векторы для клеток насекомых включают pVL 941. См. также Cate et a1., "Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In
Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986).
Кроме того, любая из широкого разнообразия последовательностей, контролирующих экспрессию, может быть применена в данных векторах. Такие пригодные последовательности, контролирующие экспрессию, включают контролирующие экспрессию последовательности, связанные со структурными генами указанных выше экспрессионных векторов. Примеры пригодных последовательностей, контролирующих экспрессию, включают, например, ранние и поздние промоторы SV40 или аденовируса, систему lac, систему trp, систему TAC или TRC, области главного оператора и промотора фага лямбда, например PL, контролирующие области оболочечного белка fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гли-колитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, Pho5, промоторы а-сопрягающей системы дрожжей и другие последовательности, известные как контролирующие экспрессию генов про-кариотических или эукариотических клеток, или их вирусов и их различные сочетания.
Для получения терапевтических агентов ИФН-р может быть применен любой подходящий хозяин, включая бактерии, грибы (включая дрожжи), растение, насекомое, млекопитающее или другие подходящие клетки животных или клеточные линии, а также трансгенные животные или растения. Примеры хозяев включают штаммы E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, грибы, дрожжи, клетки насекомых, таких как Spodoptera fruaiperda (SF9), клетки животных, такие как клетки яичников китайского хомячка (CHO), и клетки мышей, такие как NS/0, клетки африканской зеленой мартышки, такие как COS 1, COS 7, BSC 40 и BMT 10, и клетки человека, а также клетки растений в тканевой культуре. Такие клетки могут быть получены из американской коллекции типовых культур (ATCC). Предпочтительные клетки-хозяева для экспрессии в клетках животных включают клетки CHO и клетки COS 7 и особенно клеточную линию CHO-DDUKY-р 1.
Должно быть, конечно, понятно, что не все векторы и последовательности, контролирующие экспрессию, будут функционировать одинаково хорошо в отношении экспрессии описанных здесь последо
- 16 -
009938
вательностей ДНК. Не все хозяева функционируют одинаково хорошо с той же самой экспрессионной системой. Однако специалист в данной области техники может сделать отбор среди данных векторов, последовательностей, контролирующих экспрессию, и хозяев без чрезмерных экспериментов. Должны также рассматриваться число копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессия любых других белков, кодируемых вектором, таких как маркеры антибиотиков. Например, предпочтительные векторы для применения в данном изобретении включают те, которые позволяют ДНК, кодирующей терапевтический агент ИФН-р, амплифицироваться в ряд копий. Такие амплифици-руемые векторы хорошо известны в данной области техники. Они включают, например, векторы, способные к амплификации с помощью амплификации DHFR (см., например, Kaufman, патент США № 4470461, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)), или амплификации глута-минсинтетазы ("GS") (см., например, патент США № 5122464 и европейскую опубликованную заявку
338841).
При выборе последовательности, контролирующей экспрессию, должны быть рассмотрены разнообразные факторы. Они включают, например, относительную прочность последовательности, ее контролируемость и совместимость с действующей последовательностью ДНК, кодирующей терапевтический агент ИФН-р, особенно в отношении потенциальных вторичных структур. Хозяева должны быть выбраны при рассмотрении их совместимости с выбранным вектором, токсичности кодируемого продукта для последовательностей ДНК данного изобретения, характеристик их секреции, их способности правильно укладывать белки, требований к их ферментации или культивированию и легкости очистки продуктов, кодируемых последовательностями ДНК.
В рамках данных параметров специалист в данной области техники может выбрать различные сочетания вектор/контролирующая экспрессию последовательность/хозяин, что приведет к экспрессии желаемых последовательностей ДНК при ферментации или в крупномасштабной животной культуре, например, с применением клеток CHO или клеток COS. Применение клеточной линии CHO CHO-KUKX-B1 sup для экспрессии вариантов ИФН-р дополнительно описано в патенте США № 6127332.
Терапевтический агент ИФН-р может быть также получен в системе in vitro, например, в трансляционной системе in vitro, например, клеточном лизате, например, лизате ретикулоцитов. Термин "трансляционная система in vitro", который применяется здесь взаимозаменяемо с термином "бесклеточная трансляционная система" относится к трансляционной системе, которая представляет собой бесклеточный экстракт, содержащий, по меньшей мере, минимум элементов, необходимых для трансляции молекулы РНК в белок. Трансляционные системы in vitro обычно включают макромолекулы, такие как ферменты, факторы трансляции, инициации и элонгации, химические реагенты и рибосомы. Например, трансляционная система in vitro может включать, по меньшей мере, рибосомы, тРНК, инициирующую метионил-тРНКмет, белки или комплексы, вовлеченные в трансляцию, например, eIF2, eIF3, кеп-связывающий (CB) комплекс, включающий кеп-связывающий белок (СВР) и эукариотический фактор инициации 4F (eIF4F). Множество трансляционных систем in vitro хорошо известно в данной области техники, и они включают имеющиеся в продаже наборы. Примеры трансляционных систем in vitro включают эукариотические лизаты, такие как лизаты ретикулоцитов кролика, лизаты ооцитов кролика, лизаты клеток человека, лизаты клеток насекомых и экстракты зародышей пшеницы. Лизаты имеются в продаже у производителей, таких как Promega Corp., Madison, Wis.; Stratagene, La Jolla, Calif.; Amsterdam, Arlington Heights, Ill.; и GIBCO/BRL, Grand Island, N. Y. РНК для применения в трансляционных системах in vitro может быть получена in vitro, например, с применением промоторов SP6 или Т7, в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В другом способе терапевтический агент ИФН-р экспрессируется эндогенным геном клетки-хозяина. Данный способ может включать введение гетерологичного промотора выше кодирующей области гена ИФН-р, например индуцируемого промотора, экспрессию эндогенного гена ИФН-р и открытие продуцируемого ИФН-р. Гетерологичный промотор может быть введен в клетки с помощью "нокин-га" в соответствии со способами, известными в данной области техники или альтернативно путем введения промотора в ген ИФН-р.
Терапевтический агент ИФН-р, полученный по настоящему изобретению, может быть гликозили-рованным или не гликозилированным в зависимости от организма хозяина, применяемого для продукции терапевтического агента. Если в качестве хозяина выбраны бактерии, то продуцируемый терапевтический агент ИФН-р будет не гликозилированным. С другой стороны, эукариотические клетки будут гли-козилировать терапевтические агенты ИФН-р.
Терапевтический агент ИФН-р, продуцируемый трансформированным хозяином, может быть очищен в соответствии с любым подходящим способом. Для очистки ИФН-р известны различные способы. См., например, патент США № 4289689, 4359389, 4172071, 4551271, 5244655, 4485017, 4257938, 4541952 и 6127332. В предпочтительном осуществлении терапевтический агент ИФН-р очищают иммуноаффин-ным способом, как описано, например, в Okamura et al., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence." Biochem., 19, pp. 3831-35 (1980).
- 17 -
009938
Например, белки ИФН-р и их варианты могут быть выделены и очищены в соответствии с общепринятыми условиями, таким как экстракция, преципитация, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез или тому подобное. Например, белки и фрагменты интерферона могут быть очищены путем пропускания их раствора через колонку, имеющую иммобилизованный на ней рецептор интерферона (см. патент № 4725669). Связавшуюся молекулу интерферона можно затем элюировать путем обработки хаотропной солью или путем элюции водным раствором уксусной кислоты. Гибридные белки с иммуноглобулином могут быть очищены путем пропускания раствора, содержащего гибридный белок, через колонку, которая содержит иммобилизованный протеин А или протеин G, которые селективно связывают Fc часть гибридного белка. См., например, Reis, K. J., et al., J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); заявку PCT W087/00329. Гибридное антитело может быть затем элюировано путем обработки хаотропной солью или путем элюции водным раствором уксусной кислоты.
Альтернативно, белки интерферона и гибридные молекулы с иммуноглобулином могут быть очищены на колонках с антителами против интерферона или на колонках с антителами против иммуноглобулина с получением по существу чистого белка. Под термином "по существу чистый" подразумевается, что белок свободен от загрязнений, которые связаны с ним в природе. Доказательством существенной чистоты может быть одна полоса на электрофорезе.
ИФН-р, который был получен и очищен, может быть охарактеризован, например, с помощью пептидного картирования. Например, образец терапевтического агента ИФН-р может быть гидролизован эндопротеиназой Lys-C и проанализирован на ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано, например, в патенте США № 6127332.
В предпочтительном осуществлении терапевтический агент ИФН-р является по существу свободным от другого клеточного материала, например, белков. Термины "очищенные препараты терапевтического агента ИФН-р" относятся к препаратам терапевтического агента ИФН-р, имеющим менее чем приблизительно 20% (по сухой массе) загрязняющего клеточного материала, например, нуклеиновых кислот, белков и липидов, и предпочтительно имеющим менее чем приблизительно 5% загрязняющего клеточного материала. Предпочтительные препараты терапевтического агента ИФН-р имеют менее чем приблизительно 2% загрязняющего клеточного материала; даже более предпочтительно менее чем приблизительно 1% загрязняющего клеточного материала и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,5; 0,2; 0,1; 0,01; 0,001% загрязняющего клеточного материала.
Предпочтительные композиции терапевтического агента ИФН-р являются также по существу свободными от других клеточных белков (также обозначаемых здесь как "загрязняющие белки"), т.е. композиции имеют менее чем приблизительно 20% (по сухой массе) загрязняющего белка, и предпочтительно имеют менее чем приблизительно 5% загрязняющего белка. Предпочтительные препараты целевых полипептидов имеют менее чем приблизительно 2% загрязняющего белка; даже более предпочтительно менее чем приблизительно 1% загрязняющего белка и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,5; 0,2; 0,1; 0,01; 0,001% загрязняющих белков.
Чистота и концентрация препаратов ИФН-р может быть определена в соответствии со способами, известными в данной области техники, например, путем гель-электрофореза образцов, и, как описано, например, в Robert K. Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, Third Ed., Springer Verlag New York, 1993, и цитируемых там ссылках.
Биологическую активность терапевтических агентов ИФН-р можно проанализировать с помощью любого подходящего способа, известного в данной области техники, например по нейтрализации антителами противовирусной активности, по индукции протеинкиназы, по активностям в отношении олигоаде-нилат 2,5-А синтетазы или фосфодиэстеразы, например, как описано в патенте ЕР-В1-41313 и WO 00/23472. Такие тесты также включают оценки иммуномодуляторной активности (см., например, патент США № 4753795), тесты на торможение роста и измерение связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы интерферона. Примеры противовирусных тестов дополнительно описаны в патенте США 6127332 и WO 00/23472.
Способность терапевтических агентов ИФН-р лечить гломерулонефрит может быть также оценена на животных моделях, например тех, которые описаны здесь далее в примерах. Тестирование может быть проведено, например, как описано в примерах.
Терапевтические агенты ИФН-р могут быть также приобретены коммерчески под следующими торговыми марками: AVONEX(r) (ИФН-р-Ы) (Biogen, Inc., Cambridge, MA); REBIF(r) (ИФН-р-Ы) (Serono, S. A., Geneva, Switzerland); BETAFERON(r) или Bferon (ИФН-р-Ш) (Schering Aktiengesellschaft, Berlin, Germany); и BETASERON(r) или Bseron (Berlex, Montville, NJ, ИФН-р-Ш). AVONEX(r) и REBIF(r) являются рекомбинантным гликозилированным ИФН-р человека, продуцируемым в клетках яичника китайского хомячка. BETAFERON(r) и BETASERON(r) продуцируются в бактериях.
4. Способы лечения с помощью терапевтических агентов ИФН-р
В изобретении предлагаются способы лечения гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности у субъекта, имеющего или имеющего предположительно развивающийся гломерулонеф-рит, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества терапевтического агента
- 18 -
009938
ИФН-р. Субъектом может быть субъект с выявленными гломерулонефритом или хронической почечной недостаточностью.
Гломерулонефрит, обозначаемый также как "острый нефрит" или "острый гломерулонефрит", представляет собой острый, но преходящий воспалительный процесс, затрагивающий клубочки, приводящий к острым реакциям СКФ, в результате чего возникает дисбаланс жидкости и отклонение от нормы электролитов. Симптомы гломерулонефрита включают: протеинурию; сниженную скорость клубочковой фильтрации (СКФ); изменения электролитов сыворотки, включая азотемию (уремия, избыточный азот мочевины в крови - BUN) и задержку соли, что ведет к задержке воды, приводящей к гипертензии и отеку; гематурию и аномальные осадки мочи, включающие сгустки эритроцитов; гипоальбуминемию; ги-перлипидемию; и липидурию.
Ряд заболеваний, например приводимые ниже, включают гломерулонефрит. При достаточной тяжести острый гломерулонефрит может вызывать острую или быстро развивающуюся почечную недостаточность. Острый гломерулонефрит, ассоциированный с быстро развивающейся почечной недостаточностью, является обычным сценарием, который может быть назван быстро развивающимся гломерулонеф-ритом из-за его клинического проявления. Поскольку повреждение стенки клубочка представляет собой постоянный фактор при остром гломерулонефрите, эритроциты и альбумин обычно проникают в пространство Боумена и поступают в мочу. Сочетание наличия эритроцитов в моче, почечной недостаточности и аномалий гомеостаза жидкости называют нефритическим синдромом. Массивная потеря белков плазмы может вести к состоянию, называемому нефротическим синдромом, когда потеря белков с мочой ведет к нарушению белкового баланса сыворотки, что сопровождается низким уровнем альбумина в сыворотке, аномалиями липидов и отеком. Таким образом, для диагноза острого гломерулонефрита требуются лабораторные данные, свидетельствующие о протеинурии (альбуминурии) и гематурии, обычно со сгустками эритроцитов, в то время как отсутствие таких данных указывает на иной диагноз. Например, тубулоинтерстициальный нефрит включает преходящее острое воспаление почечных канальцев и интер-стиция, не затрагивающее капилляры клубочков. Как и при остром гломерулонефрите, имеют место гематурия, сгустки эритроцитов и снижение СКФ, но протеинурия менее выражена и включает преимущественно низкомолекулярные белки вместо альбумина.
За синдром острого гломерулонефрита может быть ответственен ряд составляющих заболевания. Обычно для оценки больных с острым гломерулонефритом требуется почечная биопсия, независимо от степени и наличия почечной недостаточности. Диагноз, прогноз и терапия определяются точными гистологическими и ультраструктурными особенностями, выявленными на материале почечной биопсии. Более того, биопсийные ткани могут быть подвергнуты анализу для определения типов иммунных комплексов, иммуноглобулинов и других веществ, вовлеченных в конкретный гломерулонефрит, причем обычно проводят иммунофлуоресцентный анализ. Заболевания, повреждающие почки, могут быть разделены на категории в соответствии с их патогенезом, независимо от того, приводят ли они к повреждению нефрона, достаточному для нарушения скорости клубочковой фильтрации, вызывая тем самым появление некоторых типов почечной недостаточности.
Для описания различных особенностей заболевания клубочков разработана традиционная номенклатура. В литературе могут применяться взаимозаменяемо заболевание клубочков, гломерулопатия и гломерулонефрит, хотя термин "гломерулонефрит" часто подразумевает воспалительный процесс, как обсуждалось выше. Заболевания клубочков классифицируют как первичные, когда патология возникает в почках и отсюда вызывает системные проявления; заболевания клубочков называют вторичными, когда они возникают в результате некоторого другого, мультисистемного расстройства. Патологические особенности, видимые при световой микроскопии, обеспечивают дополнительную характеристику типа заболевания клубочков. Повреждение, затрагивающее часть структуры клубочков, называют сегментарным, а повреждение, затрагивающее почти всю структуру клубочков, называют глобальным. Аномалии, характеризуемые увеличением количества клеток в клубочке, называют пролиферативными, независимо от того, обусловлено ли увеличение количества клеток инфильтрацией лейкоцитов или пролиферацией резидентных клеток клубочков. Клеточную пролиферацию, включающую клетки капсулы Боумена, называют экстракапиллярной; пролиферацию, включающую эндотелиальные или мезангиальные клетки, называют интракапиллярной или эндокапиллярной. Скопление клеток, собирающихся в пространстве Боумена, и имеющее серповидную форму, называют серповидной структурой, и обычно оно состоит из пролиферирующих париетальных эпителиальных клеток и инфильтрованных моноцитов. Серповидный гломерулонефрит представляет собой тип острого гломерулонефрита, отличающегося образованием серповидных структур в клубочках. Поскольку данное состояние часто ассоциировано с быстро прогрессирующей почечной недостаточностью, термин "серповидный гломерулонефрит" может применяться взаимозаменяемо с быстро прогрессирующим гломерулонефритом. Если заболевание клубочков отличается утолщением базальной мембраны клубочка за счет иммунных отложений, то его называют мембраноз-ным. Сочетания указанных выше терминов применяют для описания составных частей заболевания клубочков на основании их основных патологических особенностей. Пролиферативные гломерулопатии, называемые также воспалительными гломерулопатиями, включают такие состояния, как фокальный про-лиферативный гломерулонефрит, диффузный пролиферативный гломерулонефрит, мезангиальный про
- 19 -
009938
лиферативный гломерулонефрит и серповидный гломерулонефрит, причем каждый термин предполагает локализацию и/или тип пролиферирующих клеток. Данные состояния отличаются наличием клеток крови и белков в осадке мочи, но отсутствием потери белков, которая могла бы вызывать нефротический синдром, так называемую "нефритическую" картину. Мембранозные гломерулопатии включают изменение в клубочковом фильтрационном барьере для белков, включающем базальную мембрану клубочков и висцеральные эпителиальные клетки. Данные нарушения, включая мембранную гломерулопатию, болезнь с минимальным изменением и фокальный и сегментарный гломерулосклероз, ведут к тяжелой потере белка и могут приводить к нефротическому синдрому. Как предполагается названием, мембрано-пролиферативный гломерулонефрит представляет собой смешанное заболевание с клиническими особенностями, предполагающими как клеточную пролиферацию, так и повреждение барьера клубочковой фильтрации. Данные заболевания, отличающиеся выраженным внесосудистым отложением белкового или фибриллярного вещества, называют болезнями клубочкового отложения. Они могут включать как нефритические, так и нефротические компоненты, что, таким образом, перекрывается с имеющим место при пролиферативных или мембранозных заболеваниях. К последней категории заболеваний, затрагивающих почки, относятся тромботические микроангиопатии, заболевания, при которых свертывание происходит внутри почечной сети микрососудов. Каждая из данных категорий обладает особым типом этиологии.
Существует спектр пролиферативных гломерулопатий, что предполагает то, что разные гистопато-логические особенности возникают в результате различных воспалительных процессов. Например, диффузный пролиферативный гломерулонефрит может представлять собой острый иммунный ответ на неожиданное мощное поступление антигена. Серповидный гломерулонефрит может включать менее драматичный иммунный ответ на меньшее поступление антигена у презентированных индивидуумов. Фокальный пролиферативный или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит представляют собой последнюю агрессивную форму спектра, когда больные могут страдать лишь от медленно прогрессирующей почечной недостаточности.
Иммунофлуоресцентные исследования биопсийного материала почек помогают различать основные причины пролиферативной гломерулопатии. Существуют три широкие диагностические категории, каждая из которых связана с конкретной особенностью отложения иммуноглобулинов, обнаруживаемого по иммунофлуоресценции в сочетании с сильной клеточной пролиферацией. Гранулярные отложения иммуноглобулина отличают первую категорию: иммунокомплексный гломерулонефрит. Линейное отложение иммуноглобулина вдоль базальной мембраны клубочка отличает вторую категорию: болезнь анти-GBM. Минимальное отложение иммуноглобулина отличает третью категорию: олиго-иммунный гломерулонефрит. Иммунокомплексный гломерулонефрит может представлять собой ответ на известный антигенный стимул (например, постстрептококковый гломерулонефрит) или может образовывать часть мультисистемного заболевания с иммунными комплексами (например, волчанки, криоглобулинемии или бактериального эндокардита); в некоторых случаях причину не удается установить, и заболевание рассматривается как идиопатическое. Болезнь анти-GBM является редким заболеванием, при котором образуются антитела, атакующие коллаген типа IV. У большинства больных болезнью анти-GBM имеется также геморрагия легких, состояние, называемое синдромом Гудпасчера. Олиго-иммунный гломеруло-нефрит отличается аномальным уровнем антител в кровяном русле против цитоплазмы нейтрофилов, что подразумевает некоторую дисрегуляцию гуморального иммунитета.
Иммунологически опосредуемый гломерулонефрит составляет большую часть приобретенного заболевания почек. Обычно имеется отложение антител в клубочковом пучке, часто аутоантител. Механизмы клеточного иммунитета, вовлеченные в опосредуемый антителами гломерулонефрит, дополнительно модулируют образование антител и индуцируют зависимую от антител цитотоксичность. Большая часть гломерулонефрита у больных инициируется взаимодействием циркулирующих антител с ауто-антигенами.
Антитела могут быть обнаружены в клубочке как результат нескольких различных процессов. Во-первых, циркулирующие аутоантитела могут взаимодействовать с внутренними аутоантигенами, которые являются компонентами нормального клубочка. Во-вторых, циркулирующие аутоантитела и внешние антигены, которые были отложены внутри клубочка, могут обеспечивать образование in situ клубоч-ковых иммунных комплексов. В-третьих, иммунные комплексы, образованные в системном кровяном русле, могут быть захвачены в клубочек. Локализация отложения антител обычно в значительной мере определяет клинические особенности заболевания клубочков. Острое отложение антитела в субэндоте-лиальном пространстве или мезангиуме может вызывать сильный нефритический ответ, отличающийся быстрым рекрутированием лейкоцитов и тромбоцитов из капилляров клубочков. Отложение антител в субэпителиальном пространстве обычно вызывает ответ нефротического типа, отличающийся протеину-рией с менее выраженной инфильтрацией клеток воспаления.
Любой из данных иммунологических процессов может индуцировать каскад воспалительных реакций в клубочке, приводящих к повреждению клубочка и последующему восстановлению. Способность аутоантител к взаимодействию с внутренними антигенами или антигенами пересаженного клубочка ведет к образованию комплемента, хемоаттрактантов, хемокинов и цитокинов. Тем самым инициируются
- 20 -
009938
зависимые от комплемента и независимые от комплемента механизмы, приводящие к повреждению клеток клубочка. В клубочек рекрутируются также лейкоциты и тромбоциты, вызывая дополнительное повреждение. Устойчивое отложение иммунного комплекса на протяжении от месяцев до лет может также провоцировать значительное увеличение образования базальной мембраны. Процесс восстановления для любой иммунологически опосредуемой гломерулопатии не может произойти до тех пор, пока не прекратится локальная иммунная активность с прекращением дальнейшей продукции иммунного комплекса с удалением отложенных и циркулирующих иммунных комплексов, с предотвращением дальнейшего рекрутирования клеток воспаления, с удалением медиаторов воспаления в тканях почек и с нормализацией сосудистого тонуса и адгезивности эндотелия.
После повреждения клубочка может наступить выздоровление с рубцеванием. Выздоровление может быть полным без остаточного повреждения. Чаще рубцевание клубочка происходит более широко с нарушением функции почек. Было обнаружено, что трансформирующий фактор роста р (TGF-р), цито-кин, способствующий процессу заживления в клубочках, стимулирует образование внеклеточного мат-рикса и ингибирует синтез тканевых протеаз, которые разрушают белки матрикса, тем самым усиливая образование рубца после повреждения клубочка. Образование рубца после повреждения клубочка дополнительно повреждает оставшиеся жизнеспособные нефроны, что ведет к прогрессирующей потере нефронов. По мере утраты функционирующих нефронов оставшиеся нефроны их компенсируют, что, как описано выше, представляет собой процесс, разрушающий их самих. Конечным результатом может быть прогрессивное снижение функции почек, завершающееся хронической почечной недостаточностью с ее финальной стадией конечной стадии болезни почек.
Терапевтические агенты ИФН-р могут быть также применены для лечения фокального гломеру-лосклероза и коллапсирующих гломерулопатий, включая идиопатические и вторичные формы, обусловленные инфекцией ВИЧ. Коллапсирующий гломерулонефрит представляет собой быстро прогрессирующее заболевание, ведущее к почечной недостаточности, для которой нет эффективной терапии. Данное заболевание имеет место главным образом у больных ВИЧ. Поскольку при данных заболеваниях главную роль играет протеинурия, ожидается, что терапевтические агенты ИФН-р, которые значительно снижают протеинурию, должны оказывать значительное улучшающее влияние на данные заболевания. Другой болезнью, при которой протеинурия играет главную роль и при которой, как ожидается, пригодны терапевтические агенты ИФН-р, является болезнь с минимальным изменением, называемая также нефропатией с минимальным изменением (MCN) и нефротическим синдромом с минимальным изменением (MCNS).
Соответственно, терапевтические агенты ИФН-р могут применяться для лечения состояний почек, связанных с воспалением клубочков, например, любых из следующих состояний почек: фокальный гло-мерулосклероз и коллапсирующие гломерулопатии, болезнь с минимальными изменениями, острый гло-мерулонефрит, серповидный гломерулонефрит, нефритический синдром, нефротический синдром, первичный гломерулонефрит, вторичный гломерулонефрит, пролиферативный гломерулонефрит, мембра-нозный гломерулонефрит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, иммунокомплексный гломеру-лонефрит, гломерулонефрит с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунный гломерулонефрит, диабетическая гломерулопатия, хронический гломерулонефрит и наследственный нефрит. Любое заболевание или состояние, возникающее в результате заболеваний почек, таких как хроническая болезнь почек и болезнь почек конечной стадии, также может лечиться в соответствии со способами изобретения.
5. Субъекты для лечения
В целом способы настоящего изобретения могут быть применены к любому млекопитающему субъекту, имеющему гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или имеющему риск их развития или риск вследствие почечной заместительной терапии (т.е. хронического диализа или трансплантации почки). "Субъектом, имеющим риск развития гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности" является субъект, который, как обоснованно ожидается, будет страдать от прогрессирующей утраты функции почек, связанной с прогрессирующей утратой функциональных нефроновых единиц. Имеет ли субъект гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность, или имеет риск их развития, является предметом определения, которое может быть обычным образом произведено специалистом в соответствующей области медицинской или ветеринарной техники. Субъекты, имеющие гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или имеющие риск их развития (или риск вследствие необходимости почечной заместительной терапии), включают, но не ограничиваются этим, следующих: субъекты, которых можно рассматривать как страдающих хронической почечной недостаточностью, конечной стадией болезни почек, хронической диабетической нефропатией, гипертензивным нефросклерозом, хроническим гломерулонефритом, наследственным нефритом и/или почечной диспла-зией; субъекты, имеющие протеинурию, изменения электролитов сыворотки, например, азотемию (уремию, т.е. избыточный азот мочевины в крови или "BUN"); задержку соли, приводящую к гипертензии и отеку, гематурию и аномальные осадки мочи, включающие сгустки эритроцитов; гипоальбуминемию, гиперлипидемию и липидурию; субъекты с биопсией, указывающей на гипертрофию клубочков, гипер
- 21 -
009938
трофию канальцев, хронический гломерулосклероз и/или хронический тубулоинтерстициальный склероз; субъекты, подвергнутые ультразвуковому, MRI, CAT сканированию или другому неинвазивному обследованию, указывающему на почечный фиброз или меньший по сравнению с нормой размер почек. Дополнительные указания на субъектов, имеющих гломерулонефрит или ХПН или риск их развития, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, все следующее может служить критерием для определения того, имеет ли субъект гломерулонефрит или ХПН или риск их развития: субъекты с необычным количеством больших сгустков, находящихся в осадке мочи; субъекты с СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50% и особенно менее приблизительно 40, 30 или 20% от ожидаемой СКФ для субъекта; субъекты-мужчины с массой по меньшей мере приблизительно 50 кг и имеющие СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50 мл/мин и особенно менее приблизительно 40, 30 или 20 мл/мин; субъекты-женщины с массой, по меньшей мере, приблизительно 40 кг и имеющие СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40 мл/мин и особенно менее приблизительно 30, 20 или 10 мл/мин; субъекты с количеством функциональных нефроновых единиц, составляющим менее чем приблизительно 50% и особенно менее приблизительно 40, 30 или 20% от количества функциональных нефроновых единиц, имеющегося у здорового, но в остальных отношениях сходного субъекта; субъекты, имеющие одну почку; и субъекты, являющиеся реципиентами почечного трансплантата.
Млекопитающие субъекты, которые могут быть подвергнуты лечению, включают, но не ограничиваются этим, субъектов-людей или пациентов. Кроме того, изобретение может быть применено для лечения одомашненных млекопитающих, которые содержатся в качестве компаньонов человека (например, собак, кошек, лошадей), которые имеют значительную коммерческую ценность (например, дойные коровы, мясной крупный рогатый скот, спортивные животные), которые имеют значительную научную ценность (например, плененные или свободные представители вымирающих видов), или которые имеют иную ценность. Субъекты для лечения не нуждаются в предоставлении показаний для лечения терапевтическими агентами ИФН-р, отличными от тех показаний, которые связаны с риском гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности и болезни почек конечной стадии, например, при необходимости заместительной почечной терапии. То есть, ожидается, что субъекты для лечения в прочих отношениях свободны от показаний для лечения терапевтическими агентами ИФН-р. В некоторых случаях, однако, могут существовать субъекты с другими симптомами (например, вирусным заболеванием, таким как инфекция гепатита), для которых лечение терапевтическими агентами ИФН-р могло бы быть показано. В таких случаях лечение должно быть соответствующим образом адаптировано с тем, чтобы избежать избыточной дозировки.
Специалист в области медицинской или ветеринарной техники обучен распознавать субъектов, которые могут иметь значительный риск гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или значительный риск заместительной почечной терапии. В частности, клинические и неклинические испытания, а также накопленный опыт, касающиеся раскрытых здесь и других способов лечения, как ожидается, должны дать опытному профессионалу информацию при решении вопроса о том, имеет ли данный субъект гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости заместительной почечной терапии, и того, является ли любое конкретное лечение наиболее соответствующим потребностям субъекта, включая лечение согласно настоящему изобретению.
В целом, млекопитающий субъект может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или риск их развития, или риск необходимости заместительной почечной терапии, если у данного субъекта уже было диагностировано поражение, или если данного субъекта можно было бы рассматривать как пораженного состоянием, которое обычно ведет к прогрессирующей утрате функции почек, связанной с прогрессирующей утратой функциональных нефроновых единиц. Такие состояния включают, но не ограничиваются этим, болезнь почек конечной стадии, хроническую диабетическую нефропатию, диабетическую гломерулопатию, диабетическую почечную гипертрофию, гипертензивный нефросклероз, гипертензивный гломерулосклероз, хронический гломеруло-нефрит, наследственный нефрит, почечную дисплазию и хроническое отторжение после пересадки почечного аллотрансплантата и тому подобное. Данные и другие заболевания и состояния, известные в данной области техники, обычно ведут к прогрессивной утрате функциональных нефронов и наступлению хронической почечной недостаточности.
Часто специалист в области медицины или ветеринарии может обосновать прогноз, диагноз или решение о лечении на основании обследования биопсийного образца почек. Такие биопсии обеспечивают богатую информацию, полезную для диагностики заболеваний почек. Субъекты, имеющие гломеру-лонефрит, хроническую почечную недостаточность или риск их развития, или риск необходимости заместительной почечной терапии, могут быть выявлены по гистологическим показаниям на основе почечных биопсий, включая, но не ограничиваясь этим, наличие клеток воспаления, например, Т-клеток и макрофагов, в клубочках, клубочковой гипертрофии, канальцевой гипертрофии, гломерулосклероза, ту-булоинтерстициального склероза и тому подобного.
Менее инвазивные способы оценки морфологии почек включают MRI, CAT и ультразвуковое ска
- 22 -
009938
нирование. Пригодны также способы сканирования, при которых применяют контрастирующие или формирующие изображение агенты (например, радиоактивные красители), однако следует отметить, что некоторые из них являются особенно токсичными для тканей и структур почек и, следовательно, их применение может быть неблагоразумным у субъектов, имеющих гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития. Такие неинвазивные способы сканирования могут применяться для определения таких состояний, как почечный фиброз или склероз, фокальный почечный некроз, почечные кисты и почечная массивная гипертрофия, которые обычно имеются у субъекта, относящегося к категории имеющих риск развития гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или риск необходимости заместительной почечной терапии.
Часто прогноз, диагноз и/или решения о лечении основываются на клинических показателях функции почек. Одним из таких показателей служит наличие в осадке мочи необычного количества "больших" или "связанных с почечной недостаточностью" сгустков, являющееся указанием на канальцевую гипертрофию и предполагающее компенсаторную почечную гипертрофию, которая типична для хронической почечной недостаточности. Другим показателем почечной функции язляется скорость клубочко-вого потока (СКФ), которая может быть измерена прямо путем количественного определения скорости клиренса конкретных маркеров, или которая может быть выведена из непрямых измерений.
Способы лечения согласно настоящему изобретению не должны быть ограничены субъектами, имеющими любые конкретные значения СКФ или любого другого конкретного маркера почечной функции. Действительно, нет необходимости в том, чтобы СКФ у субъекта или любой другой конкретный маркер почечной функции определялись до осуществления лечения в соответствии с настоящим изобретением. Тем не менее, измерение СКФ рассматривают как предпочтительный инструмент оценки почечной функции.
Как хорошо известно в данной области техники, СКФ отражает скорость клиренса референтного или маркерного соединения из плазмы в мочу. Рассматриваемое маркерное соединение обычно представляет собой соединение, которое свободно фильтруется клубочками, но которое не секретируется активно или реабсорбируется почечными канальцами и которое не связывается в значительной мере белками в кровеносном русле. Скорость клиренса обычно определяют по формуле, представленной выше, в которой соотносят объем мочи, образованной за двадцатичетырехчасовой период, и относительные концентрации маркера в моче и плазме. Для большей точности СКФ следует также откорректировать на площадь поверхности тела. Референтным соединением "золотого стандарта" служит инсулин благодаря его фильтрационным свойствам и отсутствию связывания в сыворотке. Однако трудно количественно измерить концентрацию данного соединения в крови или моче. Поэтому вместо инсулина часто используют скорости клиренса других соединений, включая креатинин. Кроме того, часто применяют формулы, в которых для упрощения определения действительной СКФ опускают рассмотрение действительных концентраций маркера в моче, действительных суточных объемов образованной мочи и действительной площади поверхности тела. Данные величины могут быть заменены величинами, основанными на других факторах, базовыми величинами, установленными для того же самого субъекта, или стандартными величинами для сходных субъектов. Данные величины, однако, следует применять с осторожностью, поскольку они могут вести к неоправданным заключениям, основанным на почечной функции нормальных или здоровых субъектов. Кроме того, для определения скорости почечного клиренса применяют п-аминогиппурат (РАН).
В данной области техники были разработаны разные способы и формулы, которые описывают ожидаемую величину СКФ у здорового субъекта с определенными показателями. В частности, имеются формулы, которые дают ожидаемую величину СКФ на основе уровня креатинина в плазме, возраста, массы и пола (см., например, раздел "Определения" здесь). Конечно, могут быть применены другие формулы, и могут быть созданы таблицы стандартных величин для субъектов данного возраста, массы, пола и/или концентрации креатинина в плазме. В настоящее время в данной области техники доступны также и более новые способы измерения или установления СКФ (например, с применением способов ЯМР или MRI), и они могут быть применены согласно настоящему изобретению (см., например, патенты США № 5100646 и 5335660).
В целом, независимо от способа измерения или установления СКФ, субъект можно рассматривать как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости в заместительной почечной терапии, когда субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50% от ожидаемой СКФ для данного субъекта. При большем снижении СКФ риск считается большим. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40, 30 или 20% от ожидаемой СКФ. Субъект-мужчина с массой, по меньшей мере, приблизительно 50 кг может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости в заместительной почечной терапии, когда субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50 мл/мин. При большем снижении СКФ риск считается большим. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40, 30 или 20 мл/мин. Субъект-женщина с
- 23 -
009938
массой по меньшей мере приблизительно 40 кг может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости в заместительной почечной терапии, когда субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40 мл/мин. При большем снижении СКФ риск считается большим. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 30, 20 или 10 мл/мин. В целом, субъект может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или их риск или риск необходимости в заместительной почечной терапии, если у субъекта количество функциональных нефроновых единиц составляет менее чем приблизительно 50% от количества функциональных нефроновых единиц, имеющегося у здорового, но в остальных отношениях сходного субъекта. Как указано выше, риск считается большим по мере дальнейшего снижения количества функциональных нефронов. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет количество функциональных нефронов, которое составляет менее чем приблизительно 40, 30 или 20% от количества у сходного, но здорового субъекта.
Наконец, следует отметить, что субъекты, имеющие одну почку, независимо от истории утраты второй почки (например, физической травмы, хирургического удаления, дефекта при рождении), могут рассматриваться как имеющие, в отсутствие доказательств в пользу противного, риск гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или необходимости в заместительной почечной терапии. Это особенно верно в отношении тех субъектов, у которых одна почка была утрачена из-за заболевания или состояния, которое может повредить оставшуюся почку. Сходным образом, субъекты, которые уже являются реципиентами почечного трансплантата или которые уже подвергаются хроническому диализу (например, хроническому гемодиализу или продолжительному амбулаторному перитонеальному диализу), могут рассматриваться как имеющие риск гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или необходимости в дальнейшей заместительной почечной терапии.
Субъекты, которые могут лечиться согласно способам изобретения, включают также тех, которые имеют состояние или заболевание, которое, как известно, может лечиться ИФН-р, например рассеянный склероз и вирусные инфекции. Типичные вирусные инфекции включают гепатит, например, инфекции гепатита В. В таких ситуациях может быть разработан режим введения терапевтического агента ИФН-р, адаптированный для лечения обоих состояний. Субъектами могут быть также субъекты, у которых нет вирусной инфекции, которую можно лечить ИФН-р, или вирусной инфекции, вызывающей гломеруло-нефрит.
Соответственно, типичные примеры субъектов включают тех, которые не являются носителями вируса гепатита, например, вируса гепатита В или С, или тех, у которых гломерулонефрит не был вызван вирусом гепатита, например, вирусом гепатита В или С. Альтернативно, субъектом может быть также субъект, имеющий гломерулонефрит или имеющий вероятность его развития, вызванный вирусной инфекцией. В других осуществлениях у субъекта нет почечной недостаточности конечной стадии или по-чечно-клеточной карциномы.
6. Составы и способы лечения
Терапевтические агенты ИФН-р могут вводиться любым путем, который совместим с конкретным применяемым терапевтическим агентом для почек. Так, в качестве подходящего может быть перораль-ное или парентеральное введение, включая внутривенный, внутрибрюшинный или внутрикапсульный почечный пути введения. Кроме того, введение может производиться путем периодических инъекций болюса агента (агентов), описанных здесь (т. е. терапевтических агентов ИФН-р), или производиться более продолжительно путем внутривенного или внутрибрюшинного введения из резервуара, который является внешним (например, в.в. мешок) или внутренним (например, биоэродируемый имплантат или имплантированный насос). В способе согласно изобретению терапевтические агенты ИФН-р предпочтительно вводят парентерально. Применяемый здесь термин "парентеральный" включает аэрозольный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставный, внутрисиновиальный, внутригрудин-ный, внутриоболочечный, внутрипеченочный, внутрь повреждения и внутричерепной способы инъекции или инфузии.
Агенты изобретения могут вводиться индивидууму с помощью любых подходящих средств, предпочтительно прямо (например, локально, в виде инъекции или местного нанесения на локус ткани) или системно (например, парентерально или перорально). Когда агент предназначен для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное или внутримышечное введение, агент предпочтительно включает часть водного раствора. Раствор является физиологически приемлемым, так что в дополнение к доставке желаемого агента субъекту раствор не оказывает в прочих отношениях неблагоприятного действия на электролитный и/или объемный баланс у субъекта. Водная среда для агента, таким образом, может включать нормальный физиологический солевой раствор (например, 0,9% NaCl, 0,15 M, рН 7-7,4).
Терапевтические агенты ИФН-р предпочтительно вводят в виде стерильной фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, который может быть любым из множества хорошо известных носителей, таких как вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой
- 24 -
009938
раствор, декстроза, глицерин, этанол и тому подобное, или их сочетанием. Терапевтические агенты ИФН-р могут быть получены в композиции, включающей один или более других белков, например, для стабилизации терапевтического агента ИФН-р. Например, терапевтические агенты ИФН-р могут быть смешаны с альбумином.
Фармацевтические композиции могут включать терапевтический агент ИФН-р вместе с любым фармацевтически приемлемым носителем. Применяемый здесь термин "носитель" включает приемлемые адъюванты и растворители. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут применяться в фармацевтических композициях данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, ионообменни-ки, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как альбумин сыворотки человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси частичных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как про-таминсульфат, динатрийфосфат, дикалийфосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза натрия, полиакрилаты, воска, полиэтилен-полиоксипропилен-блок-полимеры, полиэтиленгликоль и жир шерсти.
ИФН-р или его варианты можно также вводить в форме липосомных систем доставки, таких как малые однослойные пузырьки, большие однослойные пузырьки и многослойные пузырьки. Липосомы могут быть образованы из множества фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфа-тидилхолины. В некоторых осуществлениях пленку из липидных компонентов гидрируют водным раствором лекарства с образованием липидного слоя, заключающего лекарство в капсулу, как описано в
патенте США № 5262564.
ИФН-рБ или их варианты могут быть также присоединены к растворимым полимерам в качестве направляемых носителей лекарства. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, пирановый сополимер, полигидроксипропилметакриламидфенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэти-леноксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. ИФН-рБ или их варианты могут быть также присоединены к белкам, таким как, например, рецепторные белки и альбумин. Более того, ИФН-рБ или их варианты могут быть также присоединены к классу биодеградируемых полимеров, пригодных для достижения контролируемого высвобождения лекарства, например, полимолочной кислоте, полиэп-силон-капролактону, полигидроксимасляной кислоте, полиортоэфирам, полиацеталям, полидигидропи-ранам, полицианоакрилатам и поперечно-сшитым или амфипатическим блок-сополимерам гидрогелей.
Согласно изобретению фармацевтические композиции могут находиться в форме стерильного препарата для инъекций, например стерильной водной или маслянистой суспензии для инъекций. Данная суспензия может быть составлена согласно способам, известным в данной области техники, с применением подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может быть также стерильным раствором или суспензией для инъекций в нетоксичном, парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть применены, находятся вода, раствор Рингера и изотоничный раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно применяют стерильные, твердые масла. Для данной цели может быть применено любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для получения препаратов для инъекций пригодны такие жирные кислоты, как олеиновая кислота и ее гли-церидные производные, а также природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, в особенности в их полиоксиэтилированном варианте. Данные масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергирующий агент.
Фармацевтические композиции, включающие терапевтические агенты ИФН-р, можно также вводить перорально. Например, их можно вводить в любой перорально приемлемой лекарственной форме, включая, но не ограничиваясь этим, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения носители, которые обычно применяют, включают лактозу и кукурузный крахмал. Обычно также добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перораль-ного введения в форме капсул подходящие разбавители включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального применения необходимы водные суспензии, активный ингредиент соединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании, могут быть также добавлены некоторые подсластители, отдушки или красители. Могут применяться также местные чрескожные пластыри.
В предпочтительном осуществлении ИФН-р или его вариант вводят в виде жидкой композиции, включающей стабилизирующий агент. Стабилизирующий агент может находиться в количестве от 0,3 до 5% от массы ИФН-р или его варианта. Стабилизирующий агент может представлять собой аминокислоту, такую как кислая аминокислота (например, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), или аргинин или глицин. Если стабилизирующий агент представляет собой аргинин-HCl, его концентрация должна предпочтительно находиться в диапазоне от 0,5% (мас./об.) до 5%, и наиболее предпочтительно
- 25 -
009938
3,13% (эквивалентно 150 мМ аргинин-HCl). Если стабилизирующий агент представляет собой глицин, его концентрация должна предпочтительно находиться в диапазоне от 0,5% (мас./об.) до 2,0%, и наиболее предпочтительно 0,52% (эквивалентно от 66,7 до 266,4 мМ, и наиболее предпочтительно 70 мМ). Если стабилизирующий агент представляет собой глутаминовую кислоту, его концентрация должна предпочтительно находиться в диапазоне от 100 до 200 мМ, и наиболее предпочтительно 170 мМ (что эквивалентно мас./об.% в диапазоне от 1,47 до 2,94%, и наиболее предпочтительно 2,5% мас./об.). Предпочтительный диапазон концентраций ИФН-р или его варианта в жидких составах составляет от приблизительно 30 до приблизительно 250 мкг/мл. Предпочтительный диапазон концентраций составляет от 48 до 78 мкг/мл, и наиболее предпочтительной концентрацией является приблизительно 69 мкг/кг. В терминах Международных Стандартных величин внутренний стандарт Biogen был стандартизован по отношению к Международному Стандарту WHO для интерферона, Природный #Gb-23-902-531, так что диапазон концентраций в IU (для 0,5 мл объема для инъекции) составляет от приблизительно 6 до 50 IMU, и наиболее предпочтительная концентрация равна 12 IMU.
Предпочтительно, чтобы аминокислотным стабилизирующим агентом был аргинин, который включают в его кислотной форме (аргинин-HCl) в растворах с рН приблизительно 5,0.
Соответственно, предпочтительны полиионные наполнители.
Предпочтительно, чтобы жидкая композиция находилась в сосуде, например шприце, в котором сосуд имеет поверхность, находящуюся в контакте с жидкостью, которая покрыта веществом, инертным в отношении ИФН-р, например, силиконом или политетрафторэтиленом. Еще более предпочтительны композиции, имеющие рН от 4,0 до 7,2. Предпочтительно чтобы раствор, включающий стабилизирующий агент, не был лиофилизован и не подвергался действию содержащего кислород газа во время получения и хранения.
Буферы органических кислот и фосфата для применения в настоящем изобретении для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,2 и предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5 и наиболее предпочтительно 5,0, могут быть традиционными буферами органических кислот и их солей, такими как цитратные буферы (например, смесью мононатрийцитрат-динатрийцитрат, смесью лимонная кислота-тринатрийцитрат, смесями лимонная кислота-мононатрийцитрат и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесью янтарная кислота-мононатрийсукцинат, смесью янтарная кислота-гидроксид натрия, смесью янтарная кислота-динатрийсукцинат и т.д.), тартратные буферы, фумаратные буферы, глюконатные буферы, оксалатные буферы, лактатные буферы, фосфатные буферы и ацетатные буферы, как дополнительно раскрыто в WO
98/28007.
Типичные составы, которые могут быть получены, как описано в WO 98/38007, включают:
(i) 20 мМ ацетатный буфер с рН 5,0, буфер, который предпочтительно ранее не лиофилизовали, где буфер включает ИФН-р и по меньшей мере один ингредиент, выбранный из (а) 150 мМ аргинин-HCl; (b) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина; (с) 150 мМ аргинин-HCl и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека; (d) 150 мМ аргинин-HCl и 0,1% Pluronic F-68; (е) 140 мМ хлорида натрия; (f) 140 мМ хлорида натрия и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека; и (д) 140 мМ хлорида натрия и 0,1% Pluronic F-68;
(ii) жидкость с рН 5,0, которая включает ИФН-р или его вариант, 170 мМ L-глутаминовую кислоту и 150 мМ гидроксид натрия, жидкость, которая предпочтительно ранее не была лиофилизована; и
(iii) 20 мМ фосфатный буфер с рН 7,2, причем буфер предпочтительно ранее не был лиофилизован, где буфер включает ИФН-р и по меньшей мере один ингредиент, выбранный из: (а) 140 мМ аргинин-HCl и (b) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина.
Предпочтительные композиции также включают полисорбат, например 0,005% полисорбат 20.
ИФН-р могут быть составлены в форме сухого порошка, который может быть, но может и не быть солюбилизирован или суспендирован перед введением субъекту. В частности, было показано, что ИФН-ре, присоединенные к полимеру, например ПЭГ, особенно стабильны в сухой форме (см., например, WO 00/23114 и PCT/US/95/06008).
Фармацевтические композиции данного изобретения могут также вводиться с помощью назального аэрозоля или ингаляции с применением распылителя, ингалятора сухого порошка или ингалятора с отмеряемой дозой. Такие композиции получают согласно способам, хорошо известным в области техники фармацевтических составов, и могут быть получены в виде растворов в солевом растворе с применением бензилового спирта или других подходящих консервантов, стимуляторов абсорбции для повышения биологической доступности, фторуглеродов и/или других традиционных солюбилизирующих или диспергирующих агентов. Согласно другому осуществлению композиции, содержащие соединение данного изобретения, могут также включать дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из корти-костероидов, противовоспалительных агентов, иммуносупрессорных агентов, агентов, тормозящих метаболизм, и иммуномодуляторов. Соединения внутри каждого из данных классов могут быть выбраны из любых, перечисленных в соответствующих групповых рубриках в "Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Pxford, pp. 970,986 (1990), раскрытие которых включено здесь в качестве ссылки. Конкретными соединениями являются теофиллин, сульфасалазин и аминосалицилаты (противовоспалитель
- 26 -
009938
ные агенты); циклоспорин, FK-506 и рапамицин (иммуносупрессорные агенты); циклофосфамид и ме-тотрексат (агенты, тормозящие метаболизм); стероиды (для ингаляции, перорального или местного применения) и другие интерфероны (иммуномодуляторы).
Подходящие для парентерального введения растворы могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтической техники, описанными, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed), Mack Pub., 1990.
Парентеральное введение в виде инъекции обычно применяют для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и инфузий. Например, когда применяют подкожную инъекцию для доставки 0,01-100 мкг/кг, или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг ИФН-р, например, пэгилированного ИФН-р, в течение одной недели можно вводить две инъекции по 0,005-50 мкг/кг или более предпочтительно 0,005-5 мкг/кг, соответственно, через 0 и 72 ч. Кроме того, в одном подходе для парентерального введения применяют имплантацию системы с медленным высвобождением или постоянным высвобождением, которая обеспечивает поддержание постоянного уровня дозы, согласно патенту США № 3710795, включенному здесь в качестве ссылки.
Как должно быть понятно специалисту в данной области техники, составленные композиции содержат терапевтически эффективные количества терапевтических агентов ИФН-р. То есть, они содержат количества, которые обеспечивают подходящие для тканей почек или других подходящих тканей концентрации терапевтического агента ИФН-р на протяжении времени, достаточного для профилактики, торможения, задержки или смягчения постоянной или прогрессирующей утраты функции почек, или обеспечивают терапевтическую эффективность другим образом. Как это должно быть ясным для специалиста в данной области техники, концентрация соединений, описанных в терапевтической композиции настоящего изобретения, должна варьировать в зависимости от ряда факторов, включая биологическую эффективность выбранного агента, химические свойства (например, гидрофобность) применяемых соединений, состав наполнителей для соединения, путь введения и предполагаемое лечение, включая то, будет ли активный ингредиент вводиться прямо в почку или почечную капсулу, или он будет вводиться системно. Предпочтительная доза для введения, очевидно, также должна зависеть от таких переменных, как состояние тканей почек, степень утраты почечной функции и общее состояние здоровья конкретного субъекта. Дозы можно вводить непрерывно или ежедневно, но в настоящее время предпочтительно, чтобы дозы вводились один, два или три раза в неделю столько времени, сколько продолжается удовлетворительный ответ (измеряемый, например, по стабилизации и/или улучшению почечной функции с помощью подходящих медицинских показателей и/или по показателям качества жизни). Могут применяться также менее частые дозы, например, ежемесячные дозы. Для субъектов, для которых в других условиях требовались бы постоянные, дважды или трижды в неделю сессии гемодиализа, постоянные, дважды или трижды в неделю внутривенные или внутрибрюшинные инфузии нельзя рассматривать как чрезмерно неудобные. Кроме того, для облегчения постоянных инфузий может быть целесообразной имплантация полуперманентного стента (например, внутривенного, внутрибрюшинного или внутрикапсулярного).
Режим доз с применением ИФН-р выбирают в соответствии с множеством факторов, включая тип, вид, возраст, массу, пол и медицинское состояние больного; тяжесть подлежащего лечению состояния; путь введения; функцию почек и печени больного; применяемое конкретное соединение или его соль. Учитывают также активность соединений изобретения и чувствительность больного к побочным эффектам. Опытный врач или ветеринар может легко определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для профилактики, преодоления или остановки прогрессирования состояния.
Пероральные дозы настоящего изобретения, предпочтительно для пэгилированных терапевтических агентов ИФН-р, обычно находятся в диапазоне между приблизительно 0,01-100 мкг/кг/день перо-рально, или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг/день перорально. Композиции предпочтительно предлагаются в форме таблеток с насечками, содержащими 0,5-5000 мкг, или более предпочтительно 0,5-500 мкг активного ингредиента. Для любого пути введения можно применять разделенные или единичные дозы. Например, соединения настоящего изобретения можно вводить ежедневно или еженедельно в единичной дозе, или суммарную дозу можно вводить в виде дозы, разделенной на две, три или четыре части.
Любая из приведенных выше фармацевтических композиций может содержать 0,1-99,9%, 1-70% или, предпочтительно, 1-50% активных соединений изобретения в качестве активных ингредиентов.
Течение болезни и ее ответ на лечение лекарством могут быть отслежены с помощью клинического обследования и лабораторных данных. Эффективность терапии изобретения определяют по степени, в которой смягчаются ранее описанные признаки и симптомы состояния, например хронического гепатита, и по степени, в которой исключаются или существенно снижаются обычные побочные эффекты интерферона (т.е. сходные с гриппом симптомы, такие как лихорадка, головная боль, озноб, миалгия, утомление и т. д., и симптомы, связанные с центральной нервной системой, такие как депрессия, парестезии, нарушенное внимание и т. д.).
Терапевтические агенты ИФН-р можно вводить отдельно или в сочетании с другими молекулами с известным благоприятным действием в лечении описанных здесь состояний, например, противовоспалительными лекарствами. При применении в сочетании с другими агентами может возникнуть необходи
- 27 -
009938
мость соответствующего изменения доз терапевтических агентов ИФН-р.
Количество активного ингредиента, которое может быть соединено с веществами-носителями для получения единицы лекарственной формы, обычно варьирует в зависимости от подвергаемого лечению хозяина и конкретного способа введения. Следует понимать, однако, что конкретная доза и режим лечения для каждого конкретного больного обычно зависят от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, скорости экскреции, сочетания лекарств и решения лечащего врача и тяжести подлежащего лечению конкретного заболевания. Количество активного ингредиента может также зависеть от терапевтического или профилактического агента, с которым, если это имеет место, совместно вводят ингредиент.
Эффективная доза и скорость введения дозы терапевтических агентов ИФН-р обычно зависят от множества факторов, таких как природа ингибитора, размеры больного, цель лечения, природа патологии, подлежащей лечению, конкретная фармацевтическая композиция и решение лечащего врача. Пригодны уровни дозы между приблизительно 0,001 и приблизительно 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно между приблизительно 0,1 и приблизительно 50 мг/кг массы тела соединения активного ингредиента. Наиболее предпочтительно, чтобы терапевтический агент ИФН-р вводился в дозе между приблизительно 0,1 мг/кг массы тела и приблизительно 20 мг/кг массы тела, предпочтительно в диапазоне между приблизительно 1 мг/кг массы тела и приблизительно 3 мг/кг массы тела с интервалами каждые 1-14 дней. Предпочтительные дозы состоят из инъекции приблизительно 6 MIU в неделю или три раза в неделю. Оптимизация дозировки может быть определена, например, путем введения терапевтических агентов ИФН-р с последующей оценкой концентрации терапевтического агента ИФН-р в кровеносном русле или локально.
В наиболее предпочтительном осуществлении нуждающимся в этом субъектам вводят AVONEX(r). AVONEX(r) имеется в продаже в виде лиофилизованного порошка, состоящего из следующего: Состав на 1 мл дозы:
30 мкг интерферона-b-Ia (6 млн международных единиц (MIU))
50 мМ фосфата натрия
100 мМ хлорида натрия
15 мг альбумина сыворотки человека
рН 7,2 (r)
Удельная активность AVONEX(r) интерферона составляет 2х108 единиц/мг, т.е. 200 MU антивирусной активности на миллиграмм белка ИФН-b-Ia. Больной добавляет к порошку стерильную воду перед внутримышечной инъекцией 1 мл один раз в неделю. AVONEX(r) можно также получать в виде жидкого состава, состоящего из следующего:
30 мкг ИФН-b-Ia (6 миллионов международных единиц (MIU))
20 мМ ацетата (ацетата натрия и уксусной кислоты)
150 мМ аргинина HCl
0,005% полисорбата 20
воды для инъекций
pH 4,8
Данный состав может быть помещен в предварительно наполненный шприц. Больной может применять шприц либо вручную, либо с помощью автоинжектора. Режим дозировки составляет 6 MUI (т.е. 30 мкг) внутримышечно один раз в неделю.
В другом осуществлении ИФН-р представляет собой Rebif, который поставляется в виде лиофили-зованного порошка и в виде жидкого состава. Лиофилизованный порошок состоит из следующего:
Состав на дозу 2,0 мл:
3 MIU ИФН-b-Ia маннит ЧСА
Ацетат натрия
рН 5,5
Удельная активность Rebif интерферона составляет 2,7х108 единиц/мг, т.е. 270 MU антивирусной активности на миллиграмм белка ИФН-b-Ia. Больной добавляет к порошку раствор хлорида натрия (0,9% NaCl) перед подкожной инъекцией три раза в неделю.
Состав жидкого Rebif является следующим:
6 или 12 MIU ИФН-b-Ia
4 или 2 мг ЧСА 27,3 мг маннита
0,4 мг ацетата натрия вода для инъекций
Жидкий состав может быть помещен в предварительно наполненный шприц и введен с применением аутоинжекторного устройства (Rebiject) или без него 3 раза (6 или 12 MIU, соответствующих 66
- 28 -
009938
мкг/неделю или 132 мкг/неделю, соответственно) в неделю подкожно.
В еще одном осуществлении ИФН-р представляет собой BETASERON(r) (от Berlex), ИФН-р, содержащий мутацию cys-17 вместо ser, полученный в E. coli. Данный негликозилированный ИФН-р является менее активным по сравнению с AVONEX(r) или REBIF(r), оба которых продуцируются в клетках CHO. Дозы продаются в вице доз 250 мкг (8 MIU) как в лиофилизованных, так и в жидких составах для подкожной инъекции через каждые два дня. Другим имеющимся в продаже ИФН-р является BETAFERON(r), который можно вводить подкожно в соответствии с инструкциями производителя.
ИФН-р или его вариант может также вводиться вместе с растворимым рецептором ИФН типа I или его частью, такой как ИФН-связывающая цепь рецептора, как описано, например, в патенте США № 6372207. Как описано в патенте, введение ИФН типа I в форме комплекса с ИФН-связывающей цепью рецептора улучшает стабильность ИФН и увеличивает эффективность ИФН. Комплекс может быть неко-валентным комплексом или ковалентным комплексом.
Терапевтические агенты ИФН-р могут быть тестированы на моделях гломерулонефрита у животных. Модели гломерулонефрита у млекопитающих, например, у мышей, крыс, морских свинок, кошек, собак, овец, коз, свиней, коров, лошадей и отличных от человека приматов, могут быть получены путем индукции прямого или непрямого повреждения или инсульта тканей почек животного. Модели гломеру-лонефрита у животных могут быть получены, например, путем инъекции антител против базальной мембраны клубочков, как в случае животной модели нефротоксичного нефрита (NTN) у крыс, описанной в примерах. Другие животные модели могут быть получены путем инъекции антител против Thy1, как дополнительно описано в примерах. Еще один тип животных м: оделей получают иммунизацией аутоло-гичной базальной мембраной клубочков или односторонней обструкцией уретры (UUO).
Терапевтические агенты ИФН-р можно оценивать по их терапевтической эффективности в индукции клинически значимого улучшения стандартного маркера почечной функции при введении млекопитающему субъекту (например, больному человеку), имеющему риск развития гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности. Такие маркеры почечной функции хорошо известны в медицинской литературе и включают, но не ограничиваются этим, скорость повышения протеинурии, уровень BUN, скорость повышения креатинина сыворотки, статические измерения BUN, статические измерения креатинина сыворотки, скорость клубочковой фильтрации (СКФ), отношение BUN/креатинин, концентрацию натрия (Na+) в сыворотке, отношение креатинина в плазме/моче, отношение мочевины в плазме/моче, осмолярность мочи, суточное образование мочи и тому подобное (см., например, Brenner and Lazarus (1994), in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие каким-либо образом. Содержание всех цитированных источников (включая литературные ссылки, изданные патенты, опубликованные патентные заявки в качестве цитированных посредством этого заявок) ясно включены здесь в качестве ссылки.
При осуществлении настоящего изобретения обычно используют, если это не указано иначе, традиционные способы клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках данной области техники. Такие способы полностью объяснены в литературе. См., например, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent № 4683195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 и 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir и С. С. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Примеры
Пример 1. ИФН-р вызывает значительное снижение протеинурии при почечной недостаточности.
В данном примере описывается то, что ИФН-р значительно снижает протеинурию на животной модели NTN (нефротоксичного нефрита) у крыс, которая представляет собой модель воспаления, которая гистологически близка к серповидному гломерулонефриту человека, ведущему к хронической почечной недостаточности.
Заболевание индуцируют у крыс с помощью в. в. инъекции нефротоксичной (NTS) сыворотки, которую получают иммунизацией кроликов препаратом лиофилизированной базальной мембраны клубочков (GBM). NTS быстро связывается с GBM, что ведет к энергичному внутриклубочковому воспалительному ответу с повышением уровня провоспалительных цитокинов и молекул адгезии. Происходит приток лейкоцитов в клубочек. Затем в клубочках развиваются области некроза с отложением фибрина и
- 29 -
009938
разрушением капиллярных петель. Это ведет к развитию серповидных структур - аккумуляции клеток воспаления и пролиферирующих эпителиальных клеток клубочка в пространстве Боумена. Данное пространство воспаления отличается потерей большого количества белка с мочой. В клубочках развивается прогрессирующее рубцевание с накоплением коллагена в пучке и фиброзной трансформацией серповидных структур. Затем у крыс развивается конечная почечная недостаточность. Таким образом, при данной модели крысы отвечают на антитела против GBM острым, но преходящим заболеванием почек, и затем 100% животных прогрессирует до ХПН четко определенным образом. Разные линии крыс обладают варьирующей подверженностью данной форме повреждения почек, причем чрезвычайно чувствительными являются крысы Wistra-Kyoto (WKY). Данная животная модель дополнительно описана, например, в Tam et al. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14:1658 и Allen et al. (1999) J. Immunol. 162:5519.
Примененный в данном исследовании ИФН-р представлял собой ИФН-р крысы, соответствующий аминокислотам 22-184 из GenBank с регистрационным № Р70499. ИФН-р экспрессировали в клетках S-32 яичников китайского хомячка (CHO), адаптированных к росту в суспензии и осуществляющих секрецию в среду. Клетки выращивали в среде, содержащей сыворотку, в ферментерных культурах. ИФН-р очищали из стандартизованной культуральной среды с применением последовательной хроматографии на Pharmacia SP-сефарозе, голубой сефарозе и смолах супероза 12, Biorad Bio-Scale керамическом гидро-ксилапатите и смолах Bio-Scale S. После этого ИФН-р интенсивно диализовали против 25 мМ цитрата/150 мМ NaCl (рН 4,5) и стерилизовали фильтрацией (0,2 мкм) . Препарат ИФН-р имел > 99% чистоту по данным денситометрии окрашенных кумасси невосстанавливающих ДДС-Na ПАГЭ гелей. По результатам измерения на клетках RATEC крысы было определено, что удельная активность составляет приблизительно 3х108 единиц/мг.
В данном примере NTN индуцировали у 28 крыс WKY, полученных от Charles River Laboratories. Четыре крысы забивали на 14-й день для базовой гистологии, а остальных рандомизировали для получения или ИФН-р 3х105 единиц/день внутрибрюшинно (в.б.), или ИФН-р 6х105 единиц/день в.б., или только растворителя. Инъекции производили 6 дней в неделю, и лечение продолжали до 30-го дня. Протеи-нурию измеряли на 7-й день и затем еженедельно. У крыс брали кровь на 14-й день, 28-й день и при забое. При забое почки, легкие, печень и селезенку фиксировали в формалине, а почки быстро замораживали.
Оценивали следующие функциональные параметры, определенные в данном и/или последующих примерах.
Альбуминурию/протеинурию: данный показатель отражает утечку в клубочках и, в меньшей степени, недостаточность канальцевого метаболизма фильтрованных белков. Интерпретация таких данных может быть затруднена, поскольку они являются результирующей двух независимых переменных; повышенная проницаемость GBM ведет к большей протеинурии, но пониженная скорость клубочковой фильтрации снижает клубочковую протеинурию.
Мочу собирали в метаболических клетках за 24 ч до забоя. Концентрацию альбумина мочи определяли рокетным иммуноэлектрофорезом. Концентрацию белка мочи определяли осаждением сульфосали-циловой кислотой.
Сывороточный креатинин и клиренс креатинина (CrCI): Периферическую кровь получали при забое для определения концентрации креатинина сыворотки с применением реактивов Olympus и анализатора Olympus AU600 (Olympus, Eastleigh, U.K.). Измеряли также концентрацию креатинина в моче (Bayer RA-XT, Newbury, U.K.) для осуществления расчетов клиренса креатинина.
Выживание. Конечной точкой данных исследований является либо неожиданная смерть, либо забой для выявления дистресса. Животные осматриваются ежедневно непосвященным, независимым наблюдателем, и погибающих животных забивают по решению третьей стороны. На практике приблизительно половина животных в исследованиях на выживание достигала конечной точки "забоя".
Для грубой оценки рубцевания клубочков, выпадения канальцев, интерстициальных воспалительных инфильтратов и интерстициального фиброза с применением условных балльных шкал получали срезы, окрашенные гематоксилином и эозином.
Фиброз клубочков: с помощью компьютера устанавливали % площади коры почек, окрашенной в зеленый цвет с помощью гистохимии Masson-Trichrome, которая предполагает способ оценки "нагрузки" коллагеном в почках. Для количественной оценки интерстициального фиброза в клубочках заключенные в парафин срезы почек окрашивали с помощью стандартного трехцветного способа (Martius Yellow, Brilliant Crystal Scarlet и Aniline Blue). Для количественной оценки отложения фибрина в клубочках (например, фибриноидного некроза) заключенные в парафин срезы почек окрашивали с помощью Martius Yellow, который окрашивает фибрин в красный/оранжевый цвет. Срезы исследуют при увеличении Х200 с помощью микроскопа Olympus BX40 (Olympus Optical, London, U.K.), соединенного с цифровым фотонным фотоаппаратом (Photonic Science, East Sussex, U.K.). Изображения фиксировали и анализировали с помощью программы Image-Pro Plus(tm) (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Количественное определение % площади коры почек, окрашенной коричневым цветом после им-мунопероксидазного окрашивания домена ED(A) фибронектина на срезах почек, по-видимому, обеспе
- 30 -
009938
чивает различение ХПН с различной функциональной тяжестью. Сходным образом иммуногистохимия коллагена типа III позволяет рассчитать % окрашенной площади коры почек.
Экспрессию альфа-гладкомышечного актина (SNA) в клубочках измеряли с помощью иммуноф-луоресценции. Данный белок определяет популяцию "миофибробластных" клеток в клубочках, которые, как полагают, занимают ведущее место в фиброзе клубочков. Количественное определение окрашивания альфа-^MA) хорошо коррелирует с показателями фиброза клубочков Masson-trichome.
Результаты, которые показаны на фиг. 3, указывают на значительное снижение протеинурии на 21-й и 28-й дни у животных, подвергнутых лечению обеими дозами ИФН-р. Не обнаружено различий в сывороточном креатинине, клиренсе креатинина, клубочковом или тубулоинтерстициальном рубцевании по отношению к "слепому" срезу Н &Е (т.е. гистологическому рубцеванию); в количестве макрофагов или CD8 в клубочках; или отложении фибронектина ED(A) или коллагена типа IV в клубочках.
Пример 2. ИФН-р значительно снижает протеинурию в острой фазе почечной недостаточности.
Данный пример показывает, что в дополнение к снижению протеинурии на более поздних стадиях почечной недостаточности ИФН-р также снижает протеинурию в острой фазе почечной недостаточности.
Для данного примера NTN индуцировали у 32 крыс с помощью инъекции 0,1 мл NTS в.в., как описано выше. Восемь крыс лечили ИФН-р крысы 6х 105 единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 14-й день. Восемь крыс лечили RSA в.б. 6 дней в неделю с 0-го по 14-й день. Восемь крыс лечили ИФН-р крысы 6х105 единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 28-й день. Восемь крыс лечили RSA в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 28-й день. Мочу собирали в метаболических клетках на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни для измерения протеинурии и креатина. У всех крыс брали кровь на 14-й день и при забое для определения креатина сыворотки. Половину крыс каждой группы забивали на 14-й день и половину - на 28-й день. За час до забоя крыс на 28-й день вводили BrdU для оценки клеточной пролиферации. Для гистологии в формалине фиксировали следующие ткани: почки, легкие, печень и селезенку. Срезы почек фиксировали в фиксаторе Carnoy для окрашивания BrdU. Почки также быстро замораживали. Рубцевание клубочков, атрофию канальцев и фиброз оценивали полуколичественно на окрашенных Н &Е срезах.
Результаты, представленные на фиг. 4, указывают на то, что ИФН-р вызывает значительное снижение протеинурии на 14-й, 21-й и 28-й дни. Не было различий в креатинине сыворотки и клиренсе креати-нина на 14-й и 28-й дни. Гистологически имелось значительное снижение макрофагов клубочков (клетки ED1+) и клеток CD8+ на 14-й день, но большее количество - на 28-й день. Происходило также значительное снижение гладкомышечного актина в клубочках на 28-й день. Таким образом, лечение ИФН-р оказывало влияние на протеинурию, вызывало снижение воспаления, но не оказывало выраженного действия на рубцевание.
В другом примере NTN индуцировали у 16 крыс WKY, восемь из которых лечили ИФН-р крысы 6х 105 единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 7-й день, а других восемь крыс лечили лишь носителем (альбумином сыворотки крысы - RSA) в.б. 6 дней в неделю с 0-го по 7-й день. Крыс содержали в метаболических клетках на 6-й и 7-й дни. Всех крыс забивали на 7-й день. За один час до забоя крысам вводили BrdU для оценки клеточной пролиферации. При забое в формалине фиксировали почки, легкие, печень и селезенку. Почки фиксировали в фиксаторе Carnoy для окрашивания BrdU и быстро замораживали. Результаты показывают отсутствие значительных различий в протеинурии, гистологии клубочков или количестве макрофагов или CD8 клеток в клубочках. Однако показатель фибриноида на 7-й день у животных, лечившихся ИФН-р, был ниже, чем у контрольных животных. Кроме того, количество пролифери-рующих клеток в клубочках было значительно ниже у лечившихся ИФН-р животных по сравнению с контрольными животными (см. фиг. 5).
Пример 3. ИФН-р вызывает значительное снижение протеинурии при почечной недостаточности на животной модели Thy гломерулонефрита.
Данный пример показывает, что протеинурия также значительно снижается под действием ИФН-р при мезангиальном пролиферативном гломерулонефрите.
Для данного примера применяли животную модель Thy1 гломерулонефрита. Она представляет собой модель мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, который отличается повышенной про-теинурией, пролиферацией мезангиальных клеток и накоплением мезангиального матрикса. Данная модель зависит от того, что мезангиальные клетки экспрессируют антиген Thy1. Крысам Lewis вводят однократную в. в. инъекцию моноклонального антитела против Thy1. Это ведет к быстрому и воспроизводимому опосредуемому комплементом некрозу мезангиальных клеток клубочков (мезангиолизису). Про-теинурия становится явной к 24 ч и продолжается по меньшей мере в течение 10 дней. Мезангиолизис сменяется фазой репарации, в которой мезангиальные клетки пролиферируют, и происходит образование избытка мезангиального матрикса. Это представляет собой модель протеинурии и пролиферации мезан-гиальных клеток.
Thyl гломерулонефрит индуцировали у 16 крыс Lewis и 4 крыс WKY путем инъекции 0,2 мл (2,5 мг/кг) антитела ER4 против Thy1. Восемь крыс Lewis получали ИФН-р крысы 6х105 единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 10-й день. Восемь крыс Lewis получали носитель (альбумин сыворотки крысы -
- 31 -
009938
RSA) в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 10-й день. Четыре крысы WKY не получали лечения, и прогрессиро-вание заболевания отслеживали с 0-го по 10-й день. Крыс содержали в метаболических клетках на 6-й и 7-й и 9-й и 10-й дни. Крыс забивали на 10-й день. За один час до забоя крысам вводили BrdU для оценки клеточной пролиферации. При забое в формалине фиксировали почки, легкие, печень и селезенку. Почки фиксировали в фиксаторе Carnoу для окрашивания BrdU и быстро замораживали.
Результаты, показанные на фиг. 6, указывают на то, что протеинурия значительно снижалась на 7-й и 10-й дни. Не выявлено каких-либо различий в креатинине сыворотки, однако клиренс креатина проявлял тенденцию к снижению в группе, подвергнутой лечению (фиг. 7). Не было различий в повреждении клубочков, оцениваемом по наличию микроаневризмов клубочков. Однако гиперклеточность клубочков была значительно снижена у крыс, лечившихся ИФН-р (фиг. 8).
Пример 4. ИФН-р вызывает значительное снижение протеинурии на животной модели пуромици-наминонуклеозидной нефропатии (PAN).
PAN индуцировали у 4 самцов крыс Wistar по 200 г каждая. Две крысы получали 20 мг пуромици-наминонуклеозид (PA;) внутрибрюшинно (в.б.) на 0-й день, и две крысы получали 20 мг PA внутрисосу-дисто (в.в.) на 0-й день. Крыс содержали в метаболических клетках на 3-4-й и 7-8-й дни. Всех крыс забивали на 8-й день. Результаты показали, что средняя величина протеинурии составляет 46 (мг/24 ч) и 287 на 4-й и 8-й дни, соответственно, у крыс, инъецированных в.б., и 122 и 194 на 4-й и 8-й дни, соответственно, у крыс, инъецированных в. в.
Действие ИФН-р на данной животной модели было показано следующим образом. PAN индуцировали у крыс, как указано выше. Крысы получали 6х102, 6х103, 6х104, 6х105 единиц ИФН-р крысы или только буфер. Результаты, которые показаны на фиг. 9, указывают на то, что введение ИФН-р значительно снижает протеинурию на 7-й и 14-й дни, даже при наименьшей дозе ИФН-р.
Таким образом, результаты данного примера указывают на то, что ИФН-р снижает воспаление при заболевании почек, о чем свидетельствует снижение протеинурии и пролиферации клубочков, а также снижение клеток воспаления, например, макрофагов и CD8+ клеток в клубочках. Таким образом, ИФН-р может быть применен для лечения, например, профилактики гломерулонефрита, острой и хронической почечной недостаточности.
Эквиваленты
Специалисты в данной области техники должны понимать или быть способны убедиться с применением лишь обычного экспериментирования, что имеется много эквивалентов конкретных осуществлений описанного здесь изобретения. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение терапевтического агента ИФН-р для производства лекарственного средства для лечения или профилактики гломерулонефрита у млекопитающего, где ИФН-р является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
2. Применение по п.1, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломеру-лосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, нефротического синдрома, первичного гломерулонефри-та, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонеф-рита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломе-рулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломе-рулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.
3. Применение по любому из пп.1-2, где ИФН-р представляет собой ИФН-р человека.
4. Применение по п.3, где ИФН-р по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-р человека, имеющему SEQ ID NO:4.
5. Применение по п.3, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-Ы.
6. Применение по п.3, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-Ш.
7. Применение по любому из пп.1-6, где млекопитающее представляет собой человека.
8. Применение терапевтического агента ИФН-р для производства лекарственного средства для лечения или профилактики хронической почечной недостаточности у млекопитающего, где ИФН-р является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
9. Применение по п.8, где ИФН-р представляет собой ИФН-р человека.
10. Применение по п.8, где ИФН-р по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-р человека, имеющему SEQ ID NO:4.
11. Применение по п.9, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-Ы.
12. Применение по п.9, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-Ш.
13. Применение по любому из пп.8-12, где млекопитающее представляет собой человека.
- 32 -
009938
14. Способ лечения гломерулонефрита у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего гломерулонефрит, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН-р, где ИФН-р является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
15. Способ по п.14, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломеру-лосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломеруло-нефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролифе-ративного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-GBM), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.
16. Способ по п.14 или 15, где ИФН-р представляет собой ИФН-р человека.
17. Способ по п.14 или 15, где ИФН-р по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-р человека, имеющему SEQ ID NO:4.
18. Способ по п.16, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-^.
19. Способ по п.16, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-1К
20. Способ по любому из пп.14-19, где млекопитающее представляет собой человека.
21. Способ лечения хронической почечной недостаточности у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего хроническую почечную недостаточность, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН-р, где ИФН-р является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
22. Способ по п.21, где ИФН-р представляет собой ИФН-р человека.
23. Способ по п.21, где ИФН-р по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-р человека, имеющему SEQ ID NO:4.
24. Способ по п.22, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-^.
25. Способ по п.22, где ИФН-р представляет собой ИФН-р-1К
26. Способ по любому из пп.21-25, где млекопитающее представляет собой человека.
Открытая рамка считывания конструкции прямого соединения ИФН Э
и G162C-lg
1 ATGCCTGGGAAGAT <^TCGTGATCCTTGGAGCCTCAAATATACTTTGGATAATGTTTGCA 60 MPGKMVVILGASNILWIM-FA
61 GCTTCTCAAGCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAG 120 ASQAMSYNLLGFLQRSSNFQ
121 TGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTCCCTCAAGGACAGG 180 CQKLLWQ LN GRLEYCL KDRM
181 AACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCA 240 NFDI PEE I, KQLQQFQKEDAA
241 TTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCATCTAGC 300 LT I YEM L QNIFAI FRQDS S S
301 ACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAAC 360 т G w N E T I V E N L L A N V Y H Q I N
361 CATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTC 420 HL KTVLEEKLEKE DFTRGKL
421 ATGAGCAGTClKXIACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAG 480 MS S L H LKRYYGR I LHY'LKAK
Фиг. 1А
- 33 -
009938
481 GAGTACAGTCACTGTGCCTG6ACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTC 540 EYSHCAWTIVRVEI L RNFYF
541 ATTAACAGACTTACATGTTACCTCCGAAACGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC 600 INRLTCYLRNVD KTHTCPPC
601 CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC 660 PAPELLGGPSVFLFPPKPKD
661 ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA 720 TLMI SRTPEVTCVVVDVSHE
721 GACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA 780 DP EVKFNW YV DGVEVHNAKT
781 AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG 840 KPREEQYNSTYRVVSVLTVL
841 CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA 900 H Q DWLNG KEYKCKVSNKALP
901 GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGGAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC 960 A P I EKT I SKAKGQPREPQVY
Фиг. 1В '
961 ACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGGCTGGTC 1020 TL P P S RDEL TKNQVS LT C L V
1021 AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC 1080 KG F Y P SD IAVEW. E'SNGQ P EN
1081 AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG 1140 NYKTTPPVL DSDGSFFLYSK
1141 CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT 1200 LTVDKSRWQQGNVFSCSVMH
1201 GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGA 1257 EALHNHYTQKSLS LSP GK*
Фиг. 1С
Открытая рамка считывания линкерной конструкции G4S соединения ИФНр
и G162C-lg
1 ATGCCTGGGAAGATGGTCGTGATCCTTGGAGCCTCAAATATACTTTGGATAATGTTTGCA 60 MPGKMVVILGASNILWI MFA
61 GCTTCTCAAGCCATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAG 120 AS QAMSYN LLGFLQRSSNFQ
121 TGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATG 180 CQ KLLWQ LNGRLE YCLKDRM
181 AACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCA 240 N FDI PEEIKQLQQFQKEDA A
241 TTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCATCTAGC 300 LT IYEMLQNI FA I FRQD S S S
301 ACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGATAAAC 360 TO WNET IVENLLANVY HQ IN
361 CATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACTC 420 HLKTVLEEKLEKEDFTRGKL
Фиг. 2А
- 34 -
009938
421 AT43AGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTC 480 MS S L HLKRYYGJ3.I LHYLKAK
481 GAGTACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTC $40 EYSHCA WTIVRVEILRNFYF
541 ATTAACAGACTTACATGTTACCTCCGAAACGGCGGTGGTGGCAGCGTCGACAAAACTCAC 600 I N RL TCYLRNGGGG SVDKTH
601 ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCG 660 TC PPCPAPELLGGPSVFLFP
661 CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG 720 P К P KDTLM.I S RT P EVT.CVVV
721 GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG 780 DV S H EDP EVKFNWYVDGV EV
781 CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC 840 HNAK TKPREE QYNS TYRVVS
841 GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGSCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC 900 VLTVLHQDWLNGKEYKCKVS
901 AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA 960 NKAL PAP I E KTI S KAKGQ PR
Фиг. 2В
961 GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGC ДО 2 0 E PQVYTL P PSRDE. LTKNQVS
1021 CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT 1080 LT CLVKGFYPSDIAVEWESN
1081 GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTC 1140 GQPEN NYK TTPPVLDSDGSF
1141 TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA 1200 F L YS KLTVDKSR WQQGNVF S
1201 TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT 1260 C SVMHEALHNHYTQKSLSLS
1261 CCCGGGAAATGA 1272 P G К *
Фиг. 2С
_ 200n
ИФН-В -о- Контроль
§ 150-
-*-Зх108ИФНр -+-6х105ИФНр
о 7 14 21 28 35
Дни
Фиг. 3
- 35 -
009938
200-1
100-
CD V-
о о.
-*- Контроль 1ФНр
-1-г-
14 21
Дни
Фиг. 4 28 35
3" 2
¦в- о
15^
ИФН-Р при NTN (0-7 дни)
р=0.0087
RSA ИФН -Р
Фиг. 5
100
? 75-
50-
? 25-о
Протеинурия
-RSA ¦ИФН'р
Дни нефрита
Фиг. 6
- 36 -
009938
CD 1.11.0-0.9-J
S 0.8-
Q. О
1. 0.7-
0.6-
Контроль
Фиг. 7
ИФН"р
§ о.
5 3
? 2.
CL С _0
CD 1-
ё о-
4 р=0.014
^^^^^
Контроль
Фиг. 8
ИФНр
Дни нефрита
Фиг. 9
" Контроль
'ИФН-р 6х102 "ИФН-р 6x10* "ИФН-Р 6х104 "ИФН-р 6х106
- 37 -
009938
Перечень последовательностей
<110> BIOGEN, INC.
<120> Терапевтические агенты для лечения почечной
недостаточности с применением интерферона-бета
<130> BII-001.25
<140> PCT/US03/22440 <141> 2003-07-17
<150> US 60/396,393 <151> 2002-07-17
<160> 21
<170> Патент в версии 2.1
<210> 1
<211> 840
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (76)..(636)
<400> 1
acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60
gttcgtgttg tcaac atg acc aac aag tgt etc etc caa att get etc ctg 111 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gin lie Ala Leu Leu 15 10
ttg tgc ttc tec act аса get ctt tec atg age tac aac ttg ctt gga 159 Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly 15 20 25
ttc eta caa aga age age aat ttt cag tgt cag aag etc ctg tgg caa 207 Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin 30 35 40
ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc etc aag gac agg atg aac ttt gac 255 Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp 45 50 55 60
ate cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gee 303 lie Pro Glu Glu lie Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala 65 70 75
gca ttg acc ate tat gag atg etc cag aac ate ttt get att ttc aga 351 Ala Leu Thr lie Tyr Glu Met Leu Gin Asn lie Phe Ala lie Phe Arg 80 85 90
caa gat tea tct age act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac etc 399 Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr lie Val Glu Asn Leu 95 100 105
- 38 -
009938
ctg get aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg Leu Ala Asn Val Tyr His Gin lie Asn His Leu 110 115
gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly 125 130 135
ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg lie Leu 145 150
aag аса gtc ctg gaa Lys Thr Val Leu Glu 120
aaa etc atg age agt Lys Leu Met Ser Ser 140
cat tac ctg aag gee His Tyr Leu Lys Ala 155
491
543
aag gag tac agt cac tgt gee tgg acc ata gtc Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr He Val 160 165
agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt аса ggt Arg Asn Phe Tyr Phe He Asn Arg Leu Thr Gly 175 180
tgaagatctc ctagcctgtg cctctgggac tggacaattg
geagatgetg tttaagtgac tgatggctaa tgtactgeat
tttgaaattt ttattaaatt atgagttatt tttatttatt
aaattatttt tggtgcaaaa gtca
aga gtg gaa ate eta 591 Arg Val Glu He Leu 170
tac etc cga aac 63 6
Tyr Leu Arg Asn 185
cttcaagcat tcttcaacca 696 atgaaaggac actagaagat 7 56 taaattttat tttggaaaat 816 840
<210> 2
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gin lie Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 15 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg 20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg 35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp He Pro Glu Glu 50 55 60
He Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr He 65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gin Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin Asp Ser Ser 85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr He Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110
Tyr His Gin He Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125
- 39 -
009938
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg He Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr He Val Arg Val Glu He Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175
Phe He Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185
<210> 3 <211> 501 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (498)
<400> 3
atg age tac aac ttg ctt gga ttc eta caa aga age age aat ttt cag 48
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin 15 10 15
tgt cag aag etc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc etc 96 Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30
aag gac agg atg aac ttt gac ate cct gag gag att aag cag ctg cag 144 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp He Pro Glu Glu He Lys Gin Leu Gin 35 40 45
cag ttc cag aag gag gac gec gca ttg acc ate tat gag atg etc cag 192 Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr He Tyr Glu Met Leu Gin 50 55 60
aac ate ttt get att ttc aga caa gat tea tct age act ggc tgg aat 240 Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80
gag act att gtt gag aac etc ctg get aat gtc tat cat cag ata aac 288 Glu Thr He Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gin He Asn 85 90 95
cat ctg aag аса gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 336 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110
agg gga aaa etc atg age agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125
- 40 -
009938
att ctg cat tac ctg aag He Leu His Tyr Leu Lys 130
ata gtc aga gtg gaa ate He Val Arg Val Glu He 145 150
аса ggt tac etc cga aac Thr Gly Tyr Leu Arg Asn gec aag gag tac agt cac Ala Lys Glu Tyr Ser His 135 140
eta agg aac ttt tac ttc Leu Arg Asn Phe Tyr Phe 155
tga tgt gec tgg acc 432 Cys Ala Trp Thr
att aac aga ctt 480 He Asn Arg Leu 160
501
<210> 5 <211> 15 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 41 -
009938
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Линкерный олигонуклеотид <400> 5
ggcggtggtg gcagc
<210> 6 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Линкерный пептид
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
<210> 7 <211> 15 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Олигонуклеотид сайта, узнаваемого энтерокиназой
<400> 7
gacgatgatg acaag
<210> 8 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> . Описание искусственной последовательности: Сайт, узнаваемый энтерокиназой
<400> 8
Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 9
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Модифицированный олигонуклеотид сайта, узнаваемого энтерокиназой
- 42 -
009938
<400> 9
agctccggag acgatgatga caag 24
<210> 10 <211> 8 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Модифицированный сайт, узнаваемый энтерокиназой
<400> 10
Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 11 <211> 1257 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (1254)
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Нуклеотидная последовательность синтетической конструкции прямого соединения ИФН-бета с G162C-lg
<400> н
atg cct ggg aag atg gtc Met Pro Gly Lys Met Val 1 5
ata atg ttt gca get tct He Met Phe Ala Ala Ser 20
eta caa aga age age aat Leu Gin Arg Ser Ser Asn
aat ggg agg ctt gaa tac
Asn Gly Arg Leu Glu Tyr 50
cct gag gag att aag cag
Pro Glu Glu He Lys Gin 65 70
ttg acc ate tat gag atg Leu Thr He Tyr Glu Met 85
- 43 -
009938
gat tea tct age act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac etc ctg Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr He Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110
get aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg aag аса gtc ctg gaa gaa Ala Asn Val Tyr His Gin He Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125
aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa etc atg age agt ctg Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140
cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gec aag
Hi-ч I.em Lvs Jro Tvr Tvr Glv Ara Т1Й Leu His Tvr T.en I.vs Ala I.vs
145
150
155
160
gag tac agt cac tgt gee tgg acc ata gtc aga gtg gaa ate eta agg Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr He Val Arg Val Glu He Leu Arg 165 170 175
aac ttt tac ttc att aac aga ctt аса tgt tac etc cga aac gtc gac Asn Phe Tyr Phe He Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Val Asp 180 185 190
aaa act cac аса tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 195 200 205
ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He 210 215 220
tec egg acc cct gag gtc аса tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 225 230 235 240
gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 245 250 255
aat gec aag аса aag ccg egg gag gag cag tac aac age acg tac cgt Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 260 265 270
gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 275 280 285
gag tac aag tgc aag gtc tec aac aaa gee etc cca gec ccc ate gag Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu 290 295 300
aaa acc ate tec aaa gee aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 305 310 315 320
- 44 -
009938
acc ctg ccc cca tec egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
325 330 335
acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gec gtg gag tgg
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
340 345 350
gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
355 360 365
ttg gac tec gac ggc tec ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
370 375 380
aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tec gtg atg cat
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
385 390 395 400
gag get ctg cac aac cac tac acg cag aag age etc tec ctg tct ccc
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
405 410 415
ggg aaa tga Gly Lys
<210> 12 <211> 418 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая конструкция гибридного белка с прямым соединением ИФН-бета с G162C-lg
<400> 12
Met Pro Gly Lys Met Val Val lie Leu Gly Ala Ser Asn He Leu Trp 15 10 15
He Met Phe Ala Ala Ser Gin Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30
Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu 35 40 45
Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp He 50 55 60
Pro Glu Glu He Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80
Leu Thr He Tyr Glu Met Leu Gin Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin 85 90 95
Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr He Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110
- 45 -
009938
- 46 -
009938
Gly Lys
<210> 13 <211> 1272 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <221> CDS <222> (1).
(1269)
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Нуклеотидная последовательность синтетической конструкции соединения ИФН-бета с G162-lg
<400> 13
atg cct ggg aag atg gtc gtg ate ctt gga gec tea aat ata ctt tgg 4
Met Pro Gly Lys Met Val Val He Leu Gly Ala Ser Asn He Leu Trp 15 10 15
ata atg ttt gca get tct caa gee atg age tac aac ttg ctt gga ttc 9 He Met Phe Ala Ala Ser Gin Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30
eta caa aga age age aat ttt cag tgt cag aag etc ctg tgg caa ttg 1 Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu 35 40 45
aat ggg agg ctt gaa tac tgc etc aag gac agg atg aac ttt gac ate 1 Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp He 50 55 60
cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gee gca 2 Pro Glu Glu He Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80
ttg acc ate tat gag atg etc cag aac ate ttt get att ttc aga caa 2 Leu Thr He Tyr Glu Met Leu Gin Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin 85 90 95
gat tea tct age act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac etc ctg 3 Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr He Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110
get aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg aag аса gtc ctg gaa gaa 3 Ala Asn Val Tyr His Gin He Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125
aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa etc atg age agt ctg 4 Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140
cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gec aag His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg He Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 145 150 155 160
- 47 -
009938
gag tac agt cac tgt gec tgg acc ata gtc aga gtg gaa ate eta agg Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr He Val Arg Val Glu He Leu Arg 165 170 175
aac ttt tac ttc att aac aga ctt аса tgt tac etc cga aac ggc ggt Asn Phe Tyr Phe He Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Gly Gly 180 185 190
ggt ggc age gtc gac aaa act cac аса tgc cca ccg tgc cca gca cct Gly Gly Ser Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
gaa etc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
210 215 220
gac acc etc atg ate tec egg acc cct gag gtc аса tgc gtg gtg gtg
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
225 230 235 240
gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
245 250 255
ggc gtg gag gtg cat aat gec aag аса aag ccg egg gag gag cag tac
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr
260 265 270
aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
275 280 285
tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tec aac aaa gee etc
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
290 295 300
cca gee ccc ate gag aaa acc ate tec aaa gee aaa ggg cag ccc cga
Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
305 310 315 320
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tec egg gat gag ctg acc aag
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
325 330 335
aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
340 345 350
ate gec gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
355 360 365
acc acg cct ccc gtg ttg gac tec gac ggc tec ttc ttc etc tac age Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 370 375 380
- 48 -
009938
aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea 1200 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 385 390 395 400
tgc tec gtg atg cat gag get ctg cac aac cac tac acg cag aag age 1248 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 405 410 415
etc tec ctg tct ccc ggg aaa tga 1272 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420
<210> 14 <211> 423 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая конструкция гибридного белка с соединением ИФН-бета с G162C-lg
<400> 14
Met Pro Gly Lys Met Val Val lie Leu Gly Ala Ser Asn He Leu Trp 1 5 10 15
He Met Phe Ala Ala Ser Gin Ala Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe 20 25 30
Leu Gin Arg Ser Ser Asn Phe Gin Cys Gin Lys Leu Leu Trp Gin Leu 35 40 45
Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp He 50 55 60
Pro Glu Glu He Lys Gin Leu Gin Gin Phe Gin Lys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80
Leu Thr He Tyr Glu Met Leu Gin Asn He Phe Ala He Phe Arg Gin 85 90 95
Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr He Val Glu Asn Leu Leu 100 105 110
Ala Asn Val Tyr His Gin He Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu 115 120 125
Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu 130 135 140
His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg He Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys 145 150 155 160
Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr He Val Arg Val Glu He Leu Arg 165 170 175
Asn Phe Tyr Phe He Asn Arg Leu Thr Cys Tyr Leu Arg Asn Gly Gly 180 185 190
- 49 -
009938
- 50 -
009938
<400> 15
catcatcatc atcatcat
<210> 16 <211> 6 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> иписание искусственной последовательности: 6-His таг
<400> 16
His His His His His His 1 5
<210> 17 <211> 27 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Модифицированный олигонуклеотид His таг
<400> 17
tccgggggcc atcatcatca tcatcat
<210> 18 <211> 9 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Модифицированный His таг
<400> 18
Ser Gly Gly His His His His His His 1 5
<210> 19 <211> 51 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Модифицированный олигонуклеотид His таг
<400> 19
tccgggggcc atcatcatca tcatcatagc tccggagacg atgatgacaa g 51
- 51 -
009938
<210> 20 <211> 17 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Модифицированный His таг
<400> 20
Ser Gly Gly His His His His His His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp 15 10 15
Lys
<210> 21 <211> 8 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептидный эпитоп
<400> 21
Asp Туг Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 52 -