1. Индуктор монопараиммунитета на основе ослабленного вируса миксомы или его компонентов.

2. Индуктор монопараиммунитета по п.1, отличающийся тем, что ослабленный штамм вируса миксомы имеет модификации в форме добавления, замены или делеции в одном или более сегментах гена, кодирующего продукцию рецепторов цитокинов, с утратой цитокиновыми рецепторами рецепторных свойств вследствие модификации.

3. Индуктор монопараиммунитета по п.2, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к интерферонам (IFN), интерлейкинам (IL) и фактору некроза опухолей (TNF).

4. Индуктор монопараиммунитета по п.3, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов IFN a -R, IFN g -R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.

5. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что компоненты вируса включают в себя вирусные оболочки или аберрантные формы вирусных оболочек ослабленного штамма вируса миксомы.

6. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что ослабленный штамм вируса миксомы выбран из группы, состоящей из штаммов М2, М7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/l.

7. Индуктор монопараиммунитета по п.6, отличающийся тем, что штамм вируса миксомы представляет собой штамм М-2 с депозитарным номером ECACC 03121801.

8. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что штамм вируса миксомы ослаблен в культуре клеток.

9. Индуктор монопараиммунитета по п.8, отличающийся тем, что культуры клеток включают в себя клетки почек обезьяны Vero и/или клетки AVIVER.

10. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что ослабленный вирус миксомы инактивирован.

11. Индуктор монопараиммунитета по п.10, отличающийся тем, что ослабленные вирусы миксомы инактивированы b -пропиолактоном.

12. Индуктор монопараиммунитета по п.11, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,01-1%.

13. Индуктор монопараиммунитета по п.12, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,05%.

14. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что вирусы миксомы лиофилизированы.

15. Применение индуктора монопараиммунитета по любому из пп.1-14 для производства фармацевтической композиции для активации параспецифической иммунной системы у человека и животных.

16. Применение индуктора монопараиммунитета по любому из пп.1-14 для производства фармацевтической композиции для парентерального лечения и/или профилактики дисфункций иммунной системы, иммуносупрессии, нарушений, связанных с иммунодефицитом, дисфункций гомеостаза между гормональной, циркуляторной, метаболической и нервной системами, представляющей угрозу неонатальной инфекции, опухолевых заболеваний, вирусных заболеваний, бактериальных заболеваний, устойчивых к терапии заболеваний, вызванных инфекционным фактором, вирусных и бактериальных смешанных инфекций, хронических проявлений инфекционных процессов, заболеваний печени различной этиологии, хронических заболеваний кожи, герпетических заболеваний, хронических гепатитов, гриппозных инфекций, повреждений, вызванных эндотоксином.

17. Применение по любому из пп.15-16, при котором указанное лечение проводят путем локального введения фармацевтической композиции через кожу или слизистые оболочки пациента.

18. Фармацевтическая композиция, включающая в себя индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

19. Фармацевтическая композиция по п.18 для локального или парентерального введения.

20. Фармацевтическая композиция по п.18, представленная в виде буккальных или рассасываемых таблеток.

21. Способ получения индуктора монопараиммунитета на основе штамма ослабленного вируса миксомы, включающий в себя стадии

выделения вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, типичным образом страдающего от генерализованного миксоматоза;

адаптации вируса к пермиссивной клеточной системе;

пассирования изолированных вирусов в культуре клеток Vero и бинарной культуре клеток до достижения ослабления вируса.

22. Способ по п.21, в котором выделенные вирусы инокулировали в хориоаллантоисную мембрану (САМ) инкубированного куриного яйца для адаптации.

23. Способ по п.22, в котором вирус реплицируется в ходе 2-6 пассажей, предпочтительно 3 пассажей, на САМ.

24. Способ по п.21, в котором вирусы миксомы, присутствующие в инфицированной ткани, изолированы путем репликации в пермиссивной клеточной системе.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что вирус выделяют путем культивирования на хориоаллантоисной мембране (САМ) инкубируемого куриного яйца.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что вирус последовательно адаптируют на САМ в ходе последующих пассажей, предпочтительно 2 последующих пассажей.

27. Способ по любому из пп.21-26, отличающийся тем, что ослабление вирусов миксомы происходит в культуре клеток Vero в ходе 80-150 пассажей, предпочтительно 120 пассажей.

28. Способ по любому из пп.21-27, отличающийся тем, что вирус пассируют в культуре клеток AVIVER.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пассирование происходит в ходе 10-50 пассажей, предпочтительно 25 пассажей.

30. Способ по любому из пп.21-29, в котором ослабленные вирусы миксомы дополнительно реплицированы в ходе добавочных ослабляющих пассажей.

31. Способ по п.30, в котором репликация происходит в клетках почек обезьяны Vero.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что дальнейший рост происходит в клетках Vero в ходе 100-200 пассажей.

33. Способ по любому из пп.30-32, отличающийся тем, что сбор вирусов в клеточной культуре имеет инфекционный титр от 10 ⁵ до 10 ^7,5 , предпочтительно по меньшей мере 10 ^6,5 , ТСID ₅₀ /мл.

34. Способ по любому из пп.21-33, в котором ослабленные вирусы миксомы дополнительно инактивированы.

35. Способ по п.34, в котором ослабленные вирусы миксомы для инактивации обрабатывают b -пропиолактоном.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,01-1%.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,05%.

38. Способ по любому из пп.21-37, включающий в себя стадии выделения вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, страдающего от миксоматоза, путем репликации на САМ инкубируемых куриных яиц и последующей

адаптации выделенного вируса миксомы на САМ в ходе 2 дальнейших пассажей,

ослабления выделенных вирусов путем

пассирования клеток Vero в культуре, предпочтительно в ходе 120 пассажей,

переноса вирусов в бинарную культуру клеток AVIVER с последующим ослаблением вируса в этой культуре клеток, предпочтительно в ходе 24 промежуточных пассажей,

последующего переноса вируса обратно на клетки Vero почек обезьяны и

репликации ослабленных вирусов миксомы путем последующих ослабляющих пассажей в клетках Vero, предпочтительно в ходе приблизительно 150 пассажей.

39. Ослабленный вирус миксомы, который можно получить способом по любому из пп.21-38.

40. Вирус миксомы по п.39, депонированный в Европейской Коллекции Клеточных Культур (ECACC) под депозитарным номером 03121801.

41. Вирус миксомы по п.39 или 40, отличающийся тем, что вирус миксомы генетически модифицирован.

42. Вирус миксомы по п.41, отличающийся тем, что имеет модификации в виде добавления, замены или делеции в одном или более сегментах гена, кодирующего продукцию цитокиновых рецептов, при этом рецепторные свойства цитокиновых рецептов при модификациях утрачиваются.

43. Вирус миксомы по п.42, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к интерферонам (IFN), интерлейкинам (IL) и фактору некроза опухолей (TNF).

44. Вирус миксомы по п.43, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к IFN a -R, IFN g -R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.

45. Ослабленный штамм М2 вируса миксомы М2 с депозитарным номером ECACC 03121801.

 

(57) Реферат / Формула:
Индуктор монопараиммунитета на основе ослабленного вируса миксомы или его компонентов.

2. Индуктор монопараиммунитета по п.1, отличающийся тем, что ослабленный штамм вируса миксомы имеет модификации в форме добавления, замены или делеции в одном или более сегментах гена, кодирующего продукцию рецепторов цитокинов, с утратой цитокиновыми рецепторами рецепторных свойств вследствие модификации.

3. Индуктор монопараиммунитета по п.2, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к интерферонам (IFN), интерлейкинам (IL) и фактору некроза опухолей (TNF).

4. Индуктор монопараиммунитета по п.3, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов IFN a -R, IFN g -R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.

5. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что компоненты вируса включают в себя вирусные оболочки или аберрантные формы вирусных оболочек ослабленного штамма вируса миксомы.

6. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что ослабленный штамм вируса миксомы выбран из группы, состоящей из штаммов М2, М7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/l.

7. Индуктор монопараиммунитета по п.6, отличающийся тем, что штамм вируса миксомы представляет собой штамм М-2 с депозитарным номером ECACC 03121801.

8. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что штамм вируса миксомы ослаблен в культуре клеток.

9. Индуктор монопараиммунитета по п.8, отличающийся тем, что культуры клеток включают в себя клетки почек обезьяны Vero и/или клетки AVIVER.

10. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что ослабленный вирус миксомы инактивирован.

11. Индуктор монопараиммунитета по п.10, отличающийся тем, что ослабленные вирусы миксомы инактивированы b -пропиолактоном.

12. Индуктор монопараиммунитета по п.11, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,01-1%.

13. Индуктор монопараиммунитета по п.12, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,05%.

14. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что вирусы миксомы лиофилизированы.

15. Применение индуктора монопараиммунитета по любому из пп.1-14 для производства фармацевтической композиции для активации параспецифической иммунной системы у человека и животных.

16. Применение индуктора монопараиммунитета по любому из пп.1-14 для производства фармацевтической композиции для парентерального лечения и/или профилактики дисфункций иммунной системы, иммуносупрессии, нарушений, связанных с иммунодефицитом, дисфункций гомеостаза между гормональной, циркуляторной, метаболической и нервной системами, представляющей угрозу неонатальной инфекции, опухолевых заболеваний, вирусных заболеваний, бактериальных заболеваний, устойчивых к терапии заболеваний, вызванных инфекционным фактором, вирусных и бактериальных смешанных инфекций, хронических проявлений инфекционных процессов, заболеваний печени различной этиологии, хронических заболеваний кожи, герпетических заболеваний, хронических гепатитов, гриппозных инфекций, повреждений, вызванных эндотоксином.

17. Применение по любому из пп.15-16, при котором указанное лечение проводят путем локального введения фармацевтической композиции через кожу или слизистые оболочки пациента.

18. Фармацевтическая композиция, включающая в себя индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

19. Фармацевтическая композиция по п.18 для локального или парентерального введения.

20. Фармацевтическая композиция по п.18, представленная в виде буккальных или рассасываемых таблеток.

21. Способ получения индуктора монопараиммунитета на основе штамма ослабленного вируса миксомы, включающий в себя стадии

выделения вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, типичным образом страдающего от генерализованного миксоматоза;

адаптации вируса к пермиссивной клеточной системе;

пассирования изолированных вирусов в культуре клеток Vero и бинарной культуре клеток до достижения ослабления вируса.

22. Способ по п.21, в котором выделенные вирусы инокулировали в хориоаллантоисную мембрану (САМ) инкубированного куриного яйца для адаптации.

23. Способ по п.22, в котором вирус реплицируется в ходе 2-6 пассажей, предпочтительно 3 пассажей, на САМ.

24. Способ по п.21, в котором вирусы миксомы, присутствующие в инфицированной ткани, изолированы путем репликации в пермиссивной клеточной системе.

25. Способ по п.24, отличающийся тем, что вирус выделяют путем культивирования на хориоаллантоисной мембране (САМ) инкубируемого куриного яйца.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что вирус последовательно адаптируют на САМ в ходе последующих пассажей, предпочтительно 2 последующих пассажей.

27. Способ по любому из пп.21-26, отличающийся тем, что ослабление вирусов миксомы происходит в культуре клеток Vero в ходе 80-150 пассажей, предпочтительно 120 пассажей.

28. Способ по любому из пп.21-27, отличающийся тем, что вирус пассируют в культуре клеток AVIVER.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пассирование происходит в ходе 10-50 пассажей, предпочтительно 25 пассажей.

30. Способ по любому из пп.21-29, в котором ослабленные вирусы миксомы дополнительно реплицированы в ходе добавочных ослабляющих пассажей.

31. Способ по п.30, в котором репликация происходит в клетках почек обезьяны Vero.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что дальнейший рост происходит в клетках Vero в ходе 100-200 пассажей.

33. Способ по любому из пп.30-32, отличающийся тем, что сбор вирусов в клеточной культуре имеет инфекционный титр от 10 ⁵ до 10 ^7,5 , предпочтительно по меньшей мере 10 ^6,5 , ТСID ₅₀ /мл.

34. Способ по любому из пп.21-33, в котором ослабленные вирусы миксомы дополнительно инактивированы.

35. Способ по п.34, в котором ослабленные вирусы миксомы для инактивации обрабатывают b -пропиолактоном.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,01-1%.

37. Способ по п.36, отличающийся тем, что концентрация b -пропиолактона составляет 0,05%.

38. Способ по любому из пп.21-37, включающий в себя стадии выделения вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, страдающего от миксоматоза, путем репликации на САМ инкубируемых куриных яиц и последующей

адаптации выделенного вируса миксомы на САМ в ходе 2 дальнейших пассажей,

ослабления выделенных вирусов путем

пассирования клеток Vero в культуре, предпочтительно в ходе 120 пассажей,

переноса вирусов в бинарную культуру клеток AVIVER с последующим ослаблением вируса в этой культуре клеток, предпочтительно в ходе 24 промежуточных пассажей,

последующего переноса вируса обратно на клетки Vero почек обезьяны и

репликации ослабленных вирусов миксомы путем последующих ослабляющих пассажей в клетках Vero, предпочтительно в ходе приблизительно 150 пассажей.

39. Ослабленный вирус миксомы, который можно получить способом по любому из пп.21-38.

40. Вирус миксомы по п.39, депонированный в Европейской Коллекции Клеточных Культур (ECACC) под депозитарным номером 03121801.

41. Вирус миксомы по п.39 или 40, отличающийся тем, что вирус миксомы генетически модифицирован.

42. Вирус миксомы по п.41, отличающийся тем, что имеет модификации в виде добавления, замены или делеции в одном или более сегментах гена, кодирующего продукцию цитокиновых рецептов, при этом рецепторные свойства цитокиновых рецептов при модификациях утрачиваются.

43. Вирус миксомы по п.42, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к интерферонам (IFN), интерлейкинам (IL) и фактору некроза опухолей (TNF).

44. Вирус миксомы по п.43, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к IFN a -R, IFN g -R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.

45. Ослабленный штамм М2 вируса миксомы М2 с депозитарным номером ECACC 03121801.

 

---

009937
Данное изобретение относится к индукторам монопараиммунитета на основе параиммунизирую-щих вирусов и вирусных компонентов, отличающихся тем, что вирусы и вирусные компоненты происходят из ослабленного штамма вируса миксомы, к способу получения индукторов монопараиммунитета и их применению в качестве медикаментов.
Эндогенная иммунная система высокоразвитых организмов, особенно таковая млекопитающих и птиц, включает в себя антигенспецифическую и антигеннеспецифическую части. Обе части иммунной системы связаны между собой и, более того, взаимодействуют друг с другом. Антигенспецифические механизмы ответственны за построение иммунитета, а антигеннеспецифические ответственны за построение параиммунитета. Понятие "параиммунитет" относится к состоянию тонко регулируемой и оптимально функционирующей системы неспецифической защиты, связанной с быстро развивающимся, ограниченным во времени усилением защиты от большого числа различных патогенов, антигенов и других пагубных для здоровья факторов. Основой развития параиммунитета являются, по историческим и функциональным причинам, неселективные или условно селективные параспецифические защитные механизмы, которые являются древними с филогенетической точки зрения и именуются примитивными.
Параспецифическая активность антигеннеспецифической иммунной системы (называемой также "генетически предетерминированным иммунитетом") включает в себя неселективные защитные элементы, такие, например, как органоиды, захватывающие чужеродные материалы, и условно селективные защитные элементы, такие, например, как микро- и макрофаги, природные клетки-киллеры, дендритные клетки и растворимые факторы, такие как цитокины, которые демонстрируют патогеннеспецифические или антигеннеспецифические реакции в соответствии с их происхождением.
Параспецифическая активность наблюдается в соответствующих организмах немедленно после контакта с антигеном, тогда как эффекты антигенспецифической иммунной системы возникают только через дни или недели.
В более высокоорганизованных формах жизни это время удлиняется в связи с организацией специфических защитных систем против вредоносных факторов, которые организму еще не удалось устранить и которые имеют антигенные свойства.
Польза параиммунизации, т.е. параспецифической активности иммунной системы в профилактике и терапии пациентов становится все более очевидной с момента начала ее развития (Anton Mayr, "Paramu-nisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med. edition 26(6):256-261, 1997). Параспецифические защитные механизмы дают организму возможность немедленно защищаться от широкого разнообразия чужеродных материалов, инфекционных патогенов, токсинов и трансформированных эндогенных клеток.
Существуют тесные взаимодействия между параспецифической и специфической активностью иммунной системы, с потоком обрабатываемой информации, идущим обычно от реагирующей в первую очередь параспецифической части к специфической, включающейся позже части иммунной системы (например, опосредованные антигеном). В случае инфекций особо вирулентными патогенами параспецифи-ческая защита организма способна, таким образом, охватить время, пока развивается специфический иммунитет (например, антитела, иммунные клетки).
Параспецифические иммунные системы защиты представляют собой физиологический процесс и могут быть определены как "первичный контроль" в конфликте с окружающей средой. Они незаменимы не только для низших организмов, но и для более высокоразвитых, в том числе высокоразвитых позвоночных. Первичные врожденные дефекты этой защитной биологической системы ведут к ситуациям, угрожающим жизни. В качестве примера может быть упомянута "болезнь Чедиака-Штейнбринка-Хигаши" у человека, которая характеризуется дефицитом гранулоцитов и дисфункциями природных клеток-киллеров (NK-клетки) и в большинстве случаев приводит к смерти пациента до 10-летнего возраста.
Состояние параиммунитета характеризуется повышенной скоростью фагоцитоза, повышенной функцией спонтанной клеточно-опосредованной цитотоксичности (NK-клетки) и повышенной активностью других лимфоретикулярных клеток. В то же время происходит выделение особых цитокинов, оказывающих стимулирующий и/или ингибирующий эффекты (например, через репрессорные механизмы) и на клеточные элементы, и друг на друга. Эта прочно связанная и поэтапно отвечающая биологическая система параиммунитета с ее разнообразными акцепторами, эффекторами и клетками-мишенями, а также передающими сигналы цитокинами, кроме того, тесно связана с гормональной и нервной системами. Она, таким образом, представляет собой важный компонент сети коммуникации, взаимодействия и регуляции.
Параиммунитет индуцируется параиммунизацией. Под этим имеется в виду фармакологическая активация клеточных элементов параспецифической части иммунной системы и связанная с ней продукция цитокинов с целью устранения дисфункций, быстрого усиления патогеннеспецифической и антигеннес-пецифической защиты организма (оптимальной биорегуляции), устранения иммуносупрессии или иммунодефицита, которые возникли вследствие стресса или иных причин (например, фармакологических), устраняя дефициты и/или действуя как регулятор иммунной, гормональной и нервной систем. Это означает, что определенные эндогенные защитные процессы могут быть усилены, дополнены или подавлены, в зависимости от типа параиммунизации и реактивности, такой, например, как состояние здоровья пациента.
- 1 -
009937
Индукторы параиммунитета используются для параиммунизации и должны отвечать определенным критериям безопасности и эффективности, отличаясь, таким образом, от иммуностимуляторов. Индукторы параиммунитета сами по себе не сравнимы ни с антителами, ни с химическими препаратами - антибиотиками, витаминами или гормонами. Напротив, они активируют через ступенчатый механизм пара-специфическую иммунную систему, так что последняя значительно мобилизует клеточные и гуморальные защитные механизмы. Индуктор параиммунитета в этом случае оказывает и регуляторное, и восстанавливающее воздействия на иммунную защиту. Что касается способа действия индукторов параимму-нитета, известно, что они захватываются фагоцитарными клетками (клетками-акцепторами), которые таким образом активируются и выделяют медиаторы, которые в свою очередь, мобилизуют эффекторные клетки. Последние осуществляют окончательный запуск регуляторных механизмов параспецифической защиты.
Многочисленные индукторы параиммунитета, основанные на комбинациях двух компонентов вируса оспы, происходящих из различных штаммов оспенного вируса с параиммунизирующими свойствами, описаны в европейском патенте EP 0 669 133 B1.
Данное изобретение основано на параиммунизирующих свойствах ослабленных вирусов миксомы и/или их вирусных составляющих.
Понятие "ослабленный" относится к модификации свойств инфекционного патогена, которая приводит к ослаблению патогена ("attenuate" = ослаблять, смягчать). Изменения инфекционных патогенов часто встречаются в природе спонтанно, и это возможно в течение промежутков времени, растянутых на многие столетия.
Способность инфекционных патогенов изменяться, адаптируясь к изменениям окружающей среды, может быть использована экспериментально, а промежуток времени, необходимый для ослабления, может быть резко сокращен путем, например, длительных пассажей в определенных системах-хозяевах. Ослабление использовалось до настоящего времени для получения авирулентных штаммов и безвредных индукторов параиммунитета.
Ослабление обычно ведет к утрате вирулентности и контагиозности, снижению иммунизирующих свойств и уменьшению спектра хозяев, а также к небольшим изменениям в геноме патогена, при которых встречаются делеции, предпочтительно в терминальных участках. Обычно параллельно усиливается па-раиммунизирующая активность модифицированного патогена.
В редких случаях ослабление также может приводить, особенно если предпринимается экспериментальное ослабление с помощью генетических манипуляций, к повышению вирулентности и контагиозно-сти.
Вирусы миксомы являются патогенами миксоматоза, контагиозного системного вирусного заболевания диких и домашних кроликов, которое, в отличии от других инфекционных болезней, прогрессирует циклически и характеризуется генерализованными, в некоторых случаях подкожными геморрагическими отеками на голове и по всему телу, особенно в анальной области, в области вульвы и труб. Интродукция миксоматоза в страну, ранее свободную от этого заболевания, приводит к ее быстрому и фатальному распространению. После того как вирус становится эндемичным, характер болезни изменяется до тех пор, пока инфекция не станет клинически неясной (Mayr A.: Medizinische Mikrobiologie, Infections-und Seuchenlehre, 7th edition, Enke-Verlag, Stuttgart, 2002).
Болезнь широко распространена среди американских кроликов рода Sylvilagus, которые обитают исключительно в Новом Свете. Эта форма диких кроликов представляет собой единственный природный резервуар заболевания. У этих животных инфекция принимает умеренные формы. Напротив, болезнь дает почти 100% смертность у европейских диких и домашних кроликов рода Oryctolagus, который также натурализовался в Австралии, когда туда был интродуцирован патоген.
Естественный спектр животных-хозяев для вируса миксомы (род Leporipoxvirus) имеет узкие рамки. В целом вирус реплицируется только в организме американского кролика, а также европейского домашнего и дикого кролика. Однако небольшое количество заражений наблюдалось и у европейских диких зайцев. Попытки переноса другим видам и человеку привели к отрицательным результатам.
Целью данного изобретения является получение новых монопараиммунных индукторов для медицины и ветеринарной практики. Еще одной целью данного изобретения является разработка способа получения таких монопараиммунных индукторов. Дополнительной целью данного изобретения является получение фармацевтических композиций для использования в качестве медикаментов на основе моно-параиммунных индукторов.
Соответственно, данное изобретение относится к индукторам монопараиммунитета на основе пара-иммунизирующих вирусов или компонентов вирусов, отличающихся тем, что вирусы или компоненты вирусов происходят из ослабленных штаммов вируса миксомы кроликов. Компоненты вируса предпочтительно включают в себя вирусные оболочки или аберрантные формы вирусных оболочек ослабленных штаммов вируса миксомы. Предпочтительными штаммами, имеющими параиммунизирующие свойства, согласно изобретению являются штаммы М-2, М-7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/1. Штаммы М-7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/1 также пригодны для получения живых вакцин, поскольку они претерпели только частичное ослабление вирулентности для получения адекватного иммунизирующего эффекта.
- 2 -
009937
Особенно предпочтителен индуктор монопараиммунитета на основе штамма вируса миксомы М-2. Ослабленный штамм вируса миксомы, полученный способом согласно изобретению и описанный далее в данном документе, помещен в депозитарий Службы санитарно-гигиенических лабораторий (Public Health Laboratory Service, PHLS), Центр прикладной микробиологии и исследований (Centre for Applied Microbiology & Research), Европейская коллекция культур клеток животных (European Collection of Animals Cell Cultures, ECACC), Сэйлсбери, Уилтшир, Объединенное Королевство (Salisbury, Wiltshire, United Kingdom) под номером доступа 03121801.
Далее, данное изобретение относится к способу получения индукторов монопараиммунитета на основе ослабленного штамма вируса миксомы кролика. Для этой цели первоначально вирусы миксомы выделяют из инфицированной ткани кролика, страдающего от генерализованного миксоматоза. Вслед за этим вирус адаптируется к пермиссивной клеточной системе, т. е. к клеточному материалу, который позволяет репликацию вируса, такому, например, как клеточные культуры, инкубируемые куриные яйца или другие экспериментальные животные. В частности, для адаптации можно использовать клетки природного хозяина или видов, близких к хозяину. Примерами подходящих пермиссивных клеточных систем для вирусов миксомы являются фибробласты куриного эмбриона (CEF), также как и клеточные культуры, полученные из почек или семенников кролика.
Согласно данному изобретению, предпочтительно адаптировать выделенный вирус миксомы в хо-рионаллантоисной мембране (САМ) инкубируемых в течение одного или более пассажей куриных яиц, предпочтительно от 2 до 6 пассажей, особенно предпочтительно 3 пассажей. Для такой адаптации выделенные вирусы инокулируются в САМ и реплицируются на САМ.
Вирусы миксомы предпочтительно сначала выделяют из инфицированной ткани путем репликации в пермиссивной клеточной системе. Для этой цели можно инокулировать пермиссивную клеточную систему, например, гомогенатом инфицированной ткани, полученным в результате ее разрушения. Затем вирусы, полученные путем первоначальной репликации, далее адаптируются либо в той же самой пер-миссивной клеточной системе, которая уже использовалась для изоляции, либо в другой пермиссивной клеточной системе. Адаптация вируса в пермиссивной клеточной системе того же типа, которая использовалась для выделения, предпочтительна. Таким образом, предпочтительно вирусы миксомы из инфицированной ткани выделяют путем репликации в пермиссивной клеточной системе, а затем адаптируют в пермиссивной клеточной системе путем дальнейших пассажей. Первоначальное культивирование и выделение вирусов миксомы путем репликации на САМ инкубируемого куриного яйца и последующая адаптация вируса на САМ в течение последующих пассажей, предпочтительно в ходе 2 дальнейших пассажей, особенно предпочтительны. Однако в виде альтернативы также возможно использование аллан-тоисной жидкости инкубируемого куриного яйца для культивирования и/или адаптации.
Собственно ослабление затем имеет место в результате длительных пассажей в одной или более пермиссивных клеточных культурах, пока не будут достигнуты ослабление или желаемая степень ослабления. Для этой цели можно сначала протестировать пермиссивную клеточную систему на предмет репликации вируса, а затем выбрать одну или более клеточных систем, в которых достигается наиболее высокий титр инфекции, для дальнейших пассажей. И первичная, и вторичная клеточные культуры, также как и перманентные и непрерывные клеточные линии, пригодны для ослабления путем длительных пассажей. Таким образом, ослабление может иметь место при репликации в первичной или вторичной культурах фибробластов куриного эмбриона (CEF) или в культурах перманентных CEF-клеток.
Предпочтительным, в соответствии с данным изобретением, для ослабления вируса миксомы является пассаж или репликация вируса в перманентной клеточной культуре, в частности клеточной культуре Vero, предпочтительно в течение 80-150 пассажей, и особенно предпочтительно 120 пассажей. В порядке альтернативы или дополнительно вирус пассируется в соответствии с данным изобретением на бинарной перманентной клеточной линии, и в этом случае предпочтительно используют клетки AVIVER. Эти клетки или клеточная культура были получены путем клеточного слияния фибробластов куриного эмбриона (CEF) и клетки почек обезьяны Vero. Для ослабления вирусов миксомы согласно изобретению выделенные и адаптированные вирусы предпочтительно пассировали на первой стадии в клеточной культуре Vero, затем вирусы переносили в бинарную клеточную культуру AVIVER, где они реплицировались предпочтительно на протяжении 10-50 пассажей, в частности 20-30 пассажей, предпочтительно, в частности, на протяжении 25 пассажей.
Ослабленный вирус миксомы мог быть затем дополнительно реплицирован в ходе дополнительных ослабляющих пассажей. Дальнейшая репликация вирусов предпочтительно имела место в ходе дальнейших пассажей в клетках почек обезьяны Vero, в частности, на протяжении 100-200 пассажей.
Особенно предпочтительной дальнейшей стадией способа является дополнительная инактивация ослабленного вируса миксомы. Инактивация может иметь место вследствие химической обработки, облучения, действия тепла или рН, в частности, в результате химической обработки р-пропиолактоном. Обработка ослабленных вирусов миксомы р-пропиолактоном дополнительно повышает параспецифиче-скую активность, тогда как иммунизирующие свойства, все еще представленные после ослабления, утрачиваются.
- 3 -
009937
Особенно предпочтительный вариант реализации способа согласно изобретению включает в себя следующие стадии:
выделение вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, страдающего обычно от генерализованного миксоматоза, путем репликации на хорионаллантоисной мембране (САМ) инкубируемых куриных яиц и последующей адаптации вируса на САМ на протяжении 2 последующих пассажей;
ослабление выделенных вирусов путем пассирования в культуре клеток Vero, предпочтительно на протяжении 120 пассажей;
перенос вирусов в бинарную клеточную культуру клеток AVIVER, в которой клетки AVIVER были получены путем слияния клеток фибробластов куриного зародыша (CEF) и клеток почек обезьян Vero, и ослабление вируса в этой клеточной культуре на протяжении 10-50, предпочтительно 25, пассажей, последующий перенос вируса обратно на клетки почек обезьяны Vero и репликация вирусов путем последующих ослабляющих пассажей в клетках Vero, предпочтительно на протяжении приблизительно 150 пассажей; и необязательно инактивация ослабленных вирусов миксомы путем обработки р-пропиолак-тоном, эта обработка повышает параспецифическую активность, тогда как иммунизирующие свойства, все еще оставшиеся после ослабления, утрачиваются.
Ослабление путем долговременного пассирования обычно завершается 3-5 конечными разведениями бляшек. После того, как различные клоны были получены и тестированы, отбирали для дальнейшей репликации те клоны, у которых достигнуты наиболее высокие инфекционные титры и обнаружена высокая параиммунизирующая активность, например, по провокационному тесту на вирус везикулярного стоматита (VSV) у мышат. Эта процедура направлена на то, чтобы убедиться, в частности, что для дальнейшего использования получен генетически однородный материал.
Термин "ослабление", используемый в связи с данным изобретением, относится к экспериментальной модификации исходного вирулентного вируса миксомы в модифицированную форму, с одновременным повышением параиммунизирующих свойств. Ослабление определяется по одному или более из следующих свойств:
уменьшению или ослаблению или утрате вирулентности в отношении европейских домашних и диких кроликов (род Oryctolagus caniculus csp.), ослаблению или утрате контагиозности, ограничению спектра хозяев в клеточной культуре, изменению иммунизирующих свойств,
приобретению параиммунизирующей кратковременной защитной активности.
Ослабление может вести к делециям в терминальных участках генома вируса миксомы. Возрастающая степень ослабления часто наблюдается в связи с увеличением числа делеций в вирусном геноме.
Степень ослабления может быть проверена и оценена в ходе пассажей с помощью соответствующих тестов активности, известных в данной области (см., например, патент США № 6805870, колонка 12, и дальнейшие ссылки, приведенные в данном документе), и путем клонирования.
Данное изобретение также относится к ослабленным вирусам миксомы, получение которых доступно способом согласно изобретению, фармацевтическим композициям, включающим в себя ослабленный вирус миксомы или индуктор монопараиммунитета согласно изобретению, к использованию индукторов монопариммунитета для активации параспецифической иммунной системы у млекопитающего и к использованию ослабленного вируса для производства соответствующего медикамента.
Вследствие неожиденных параиммунизирующих свойств индукторы монопараиммунитета вируса миксомы согласно изобретению пригодны для лечения и/или профилактики дисфункций иммунной системы, иммуносупрессии, нарушений, связанных с иммунодефицитом, дисфункций гомеостаза между гормональной, циркуляторной, метаболической и нервной системами, угрожающей неонатальной инфекции, опухолевых заболеваний, вирусных заболеваний, бактериальных заболеваний, заболеваний, связанных с устойчивым к терапии инфекционным фактором, смешанных вирусно-бактериальных инфекций, хронических проявлений инфекционных процессов, заболеваний печени различной этиологии, хронических заболеваний кожи, герпетических заболеваний, хронических гепатитов, гриппозных инфекций, повреждений, вызванных эндотоксином.
Индукторы минопараиммунитета согласно изобретению в целом безвредны для окружающей среды и эффективны в отношении параиммунизации млекопитающих, таких, например, как человек, лошади, собаки, кошки, свиньи, а также птиц и рептилий, таких, например, как ящерицы, змеи, черепахи. Следовательно, они особенно пригодны для медицинского применения на человеке и в ветеринарной практике.
Кроме того, индукторы монопараиммунитета согласно изобретению демонстрируют очень хорошую параиммунизирующую активность с высокой эффективностью. Они могут быть получены способом согласно изобретению подходящим образом и безопасны для использования в области медицины. Ослабление вирусов миксомы снижает иммунизирующие свойства вирусов миксомы, тогда как их пара-специфическая активность возрастает. Индукторы монопараиммунитета согласно изобретению, следовательно, обладают параиммунизирующими, но не иммунизирующими, свойствами, делая тем самым возможным свое многократное и непрерывное использование. Эти параиммунизирующие свойства вируса миксомы кроликов и их вирусных компонентов неожиданны и не были предсказаны.
- 4 -
009937
Термин "параиммунизация", как он используется в связи с данным изобретением, относится к фармакологической активации клеточных элементов параспецифической иммунной системы и продукции или выделению, связанному с ней, цитокинов с целью устранения дисфункций, быстрого повышения не патоген- и не антигенспецифической защиты организма, оказывающих регуляторный эффект на взаимодействие иммунной, гормональной, нервной и сосудистой систем. Параиммунизация ведет к защитному состоянию параиммунитета.
Термин "параиммунитет", как он используется в связи с данным изобретением, относится к активно достигнутому состоянию оптимально регулируемой и функционирующей параспецифической защитной системы, связанной с быстро развивающейся ограниченной по времени защиты от большого количества патогенов, антигенов и других факторов, угрожающих здоровью. Темп фагоцитоза, функция клеток NK (природных клеток-киллеров) и активность других лимфоретикулярных клеток (например, дендритных клеток) повышается до физиологического оптимума.
Термин "индуктор параиммунитета", как он используется в связи с данным изобретением, относится к апирогенному нетоксическому медикаменту, который предназначен для применения на человеке и животных для получения и регуляции эндогенной защиты и защитных механизмов в смысле параимму-низации.
Термин "индуктор монопараиммунитета вируса миксомы", как он используется в связи с данным изобретением, относится к медикаменту, который основан на ослабленных вирусах миксомы или ослабленном штамме вируса миксомы, включая в себя параиммунизирующие компоненты вируса и его составляющие, которые вызывают в организме состояние параиммунитета, предпочтительно у млекопитающих (например, у человека).
Термин "вирус миксомы", как он используется в связи с данным изобретением, относится к видам вируса миксоматоза рода Leporipoxvirus. Вирус миксомы принадлежит подсемейству Chordopoxviridiae и семейству Poxviridae (оспенные вирусы).
Термин "параиммунизирующие вирусные компоненты", как он используется в связи с данным изобретением, включает в себя большое число вирусных структур, происходящих из вируса миксомы, имеющих параиммунизирующие свойства, например жизнеспособные или инактивированные свежевы-деленные вирусы миксомы, жизнеспособные или инактивированные рекомбинантные вирусы миксомы, происходящие из свежевыделенных вирусов миксомы, вирусные оболочки, удаленные оболочки и продукты их деградации, а также аберрантные формы этих оболочек, отдельные природные или рекомби-нантные полипептиды или белки, в частности, мембраны и поверхностные рецепторы, которые присутствуют в свежевыделенных вирусах миксомы или рекомбинантно экспрессируются генетическим модифицированным вирусом миксомы или частью его генетической информации.
В табл. 1-4 суммированы клинические результаты, полученные на человеке с помощью индуктора монопараиммунитета вируса миксомы PIND-MYXO на основе штамма М-2 вируса миксоматоза, ослабленного в культуре клеток.
В таблице 1 приведены клинические результаты профилактического применения индуктора моно-параиммунитета PIND-MYXO из вируса миксомы на человеке.
В табл. 2 показаны клинические результаты терапевтического применения индуктора монопараим-мунитета PIND-MYXO из вируса миксомы на человеке.
В табл. 3 показан эффект параиммунизации индуктором монопараиммунитета из вируса миксомы (PIND-MYXO) у пациентов с низкими иммунными показателями (через 7 дней после введения PIND-MYXO).
В табл. 4 показан эффект параиммунизации индуктором монопараиммунитета из вируса миксомы (PIND-MYXO) у пациентов с повышенными иммунными показателями (через 7 дней после введения PIND-MYXO).
Данное изобретение основано на неожиданном открытии того факта, что ослабленные вирусы мик-сомы или их параиммунизирующие составляющие способны индуцировать очень хорошие параиммун-ные свойства в организме реципиента, что приводит к защитному состоянию параиммунитета. Основой данного изобретения было, в первую очередь, успешное ослабление вирусов миксомы кроликов в клеточной культуре.
Индукторы монопараиммунитета согласно изобретению предпочтительно основаны на лиофилизи-рованных, ослабленных и интактивированных вирусах миксомы кроликов или их параиммунизирующих вирусных компонентах. Ослабленные вирусы миксомы или их вирусные компоненты согласно изобретению предпочтительно происходят из одного штамма вируса миксомы или из множества различных ослабленных штаммов вируса миксомы. В этой связи предпочтительно, чтобы индукторы монопараимму-нитета согласно изобретению включали в себя комбинации одного или более штаммов вируса миксомы или их параиммунизирующих вирусных компонентов.
Параиммунизирующие свойства, вызванные посредством введения индуктора монопараиммунитета вируса миксомы у млекопитающих, таких, например, как человек, особенно полезны для устранения дисфункций, для повышения антигеннеспецифической защиты организма, для устранения иммуносу-прессии или иммунодефицита, которые возникли как следствие стресса или иным путем (например,
- 5 -
009937
фармакологически) и для получения регуляторных эффектов взаимодействия иммунной, гормональной и сосудистой систем.
Данное изобретение основано также на успешном ослаблении штамма вируса миксомы путем пассирования клеток в культуре, при этом вирулентные и/или иммунизирующие свойства штамма вируса миксомы уменьшаются или утрачиваются. Кроме того, может иметь место дополнительная инактивация вируса миксомы путем облучения, теплового воздействия или действия рН или, что особенно предпочтительно, путем химической обработки р-пропиолактоном. Индукторы монопараиммунитета на основе ослабленных лиофилизированных вирусов миксомы с отдельными вирусными компонентами вируса миксомы, которые пригодны для индуцирования параиммунной активности в организме, также охватываются данным изобретением.
Ниже описан один из вариантов реализации способа производства индукторов монопараиммуните-та на основе выделенного и ослабленного штамма вируса миксомы кроликов путем пассирования в культуре клеток. Способ производства, кроме того, не ограничен данным предпочтительным штаммом, но может быть применен таким же образом с другими штаммами вируса миксомы кроликов. Также данное изобретение охватывает рекомбинантные формы штамма вируса миксомы, которые были получены в результате генетической модификации. В этой связи предпочтение отдается рекомбинантным штаммам вируса миксомы, в которых один или более сегментов генома, которые кодируют рецепторы цитокинов, были модифицированы путем добавления, замещения или делеции, так что рецепторные свойства рецептора цитокинов в результате модификации утрачиваются. Таковыми являются предпочтительно сегменты гена, которые кодируют рецепторы интерферонов (IFN), интерлейкинов (IL) и фактора некроза опухолей (TFN), в частности, Ш\Г-а-Е1(рецептор), IFNy-R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.
Кроме того, численные значения, указанные в данном документе, касающиеся времени инкубации или количества пассажей в культуре клеток, не должны рассматриваться как ограничивающие. Небольшие модификации этих параметров и модификации, очевидные для специалистов в данной области и также ведущие к изготовлению ослабленных вирусов миксомы, в равной мере охватываются данным изобретением.
Предпочтительный вариант реализации данного изобретения относится к успешному ослаблению штамма M-2 вируса миксомы. Штамм М-2 вируса миксомы был выделен из организма европейского дикого кролика, страдающего от миксоматоза (Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Измененные клетки кожи, полученные из подкожной ткани больного кролика, после их разрушения инокулировали на хориоаллантоисную мембрану (САМ) куриных яиц, инкубировавшихся предпочтительно в течение 10-12 дней. Вирусы миксомы затем реплицировались и адаптировались в ходе 2-6 пассажей, предпочтительно 3 пассажей, на хориоаллантоисной мембране (пассажи на САМ; о способе см. Herrlich A., Mayr А. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Материал 2-го - 6-го пассажей, предпочтительно третьего пассажа на САМ, служил исходным для дальнейшего ослабления вируса миксомы в культуре клеток. Ослабление имеет место после адаптации вирусов на хориоаллантоисной мембране (очевидное по типичным фокусам на хорио-аллантоисной мембране) в 3 стадии. На стадии 1 проводится 80-150, предпочтительно 120 непрерывных так называемых пассажей конечного разведения на клетках Vero (клетки Vero, ATCC CCL-81). Вирулентность вируса миксомы, проходящего эти пассажи, ослабляется.
На 2-й стадии, после 80-го - 150-го пассажа, предпочтительно после 120-го пассажа на клетках Vero, вирусная суспензия переносится на так называемые клетки AVIVER, на которых проводят 10-50 пассажей, предпочтительно 20-30, особенно предпочтительно 25 пассажей. Клетки AVIVER получали путем слияния фибробластов куриного эмбриона (CEF) и клеток Vero, и рассматривали их как бинарную постоянную культуру клеток.
После последнего пассажа на клетках AVIVER, предпочтительно 25-го пассажа, переходят снова на клетки Vero, и на них продолжается 3-я стадия ослабления в ходе последующих 100-200 пассажей, предпочтительно около 157 пассажей на клетках Vero. Таким образом, вирус миксомы реплицируется в целом в ходе более чем 300 пассажей в культуре клеток. После 3-й стадии репликации вируса миксомы в культуре клеток вирус миксомы существенно ослабляется.
Культуры клеток Vero и клеток AVIVER предпочтительно культивируются с использованием полностью синтетической среды, особенно предпочтительно среды MEM (минимальная поддерживающая среда) с добавлением 5-20%, предпочтительно 10% BMS (среда, замещающая сыворотку) и 5-20, предпочтительно 10%, гидролизата лактальбумина. Вирусной средой, используемой после замены культу-ральной среды, предпочтительно является среда MEM с 5-20%, предпочтительно 10% гидролизата лак-тальбумина, без BMS или без фетальной телячьей сыворотки и без антибиотиков. Все способы производства реализуются предпочтительно при значениях рН 7,0-8,0, предпочтительно при рН 7,25. Сбор вирусов, выросших в культуре с титром от 105,0 до 107,5, предпочтительно по меньшей мере 106,5 TQD5CAra (TCID50 = 50%-ная инфекционная доза культуры тканей), предпочтительно пригоден в качестве стартового материала для получения индуктора монопараиммунитета PIND-MYXO согласно изобретению.
Репликация вируса миксомы в клетках Vero ведет к типичному цитопатическому эффекту (срЕ), ко
- 6 -
009937
торый в конечном счете характеризуется деструкцией (лизисом) инфицированных клеток. Инокуляция дозы приблизительно в 10 MOI (множественность заражения) приводит после короткой фазы округления (1-2 дня) к формированию сетчатых клеточных структур на приблизительно 3 дня и к лизису клеток через приблизительно 5 дней. 301-й пассаж на клетках Vero имел инфекционный титр около 106,5 ТСГО50/мл.
Ослабленный вирус миксомы инактивируется путем химической обработки р-пропиолактоном в концентрации 0,01-1% р-пропиолактона, предпочтительно в концентрации 0,05% р-пропиолактона. Инактивация ведет к полной утрате иммунизирующих свойств, которые в случае необходимости еще присутствуют, тогда как параспецифическая активность не только сохраняется, но и фактически значительно увеличивается.
Для дальнейшей переработки ослабленных и инактивированных вирусов миксомы в индуктор мо-нопараиммунитета вируса миксомы (PIND-MYXO) стартовый вирусный материал, используемый для вирусной инактивации, должен иметь вирусный титр приблизительно в 105,0 - 107,0, предпочтительно по меньшей мере 106,5, TCID50Ara.
Очистка предпочтительно проводится путем центрифугирования при низких оборотах (например, 1000 об/мин). После центрифугирования добавляли 0,5-10% сукцинилированного желатина (например, полижелин, например фирмы Hausmann, Санкт-Галлен/Швейцария), предпочтительно 5% сукцинилиро-ванного желатина. Образовавшаяся смесь может быть впоследствии лиофилизирована порциями по 1,5 мл в подходящих стерильных стеклянных флаконах или ампулах и, если требуется, растворена в дистиллированной воде. Объем 0,5-2 мл, предпочтительно 1,0 мл лиофилизата, растворенный в дистиллированной воде, соответствует инокуляционной дозе для внутримышечного введения человеку (см. также Mayr A. and Mayr В.: "Von der Empirie zur Wissenschaft", Tierarztl. Umschau, edition 56: 583-587, 2002).
Ослабление может быть обнаружено клинически по утрате вирулентности для европейского домашнего и дикого кроликов (род Oryctolagus caniculus csp.), по утрате контагиозности, по почти полному сужению спектра хозяев в культуре клеток и по изменению иммунизирующих свойств.
Лиофилизированный продукт может храниться при температурах предпочтительно около +4°C или более низких температурах, предпочтительно около -60°C, оставаясь стабильным неограниченное время.
С помощью исследований на полученных с использованием генных технологий ослабленных вирусах миксомы было показано, что в геноме вируса миксомы присутствуют многочисленные делеции. В случае исходного штамма M-2 геном вируса миксомы состоит из одиночной линейной дезоксирибонук-леиновой кислоты (ДНК) общей длиной около 160 тысяч нуклеотидов (т.н.), которая кодирует несколько сотен белков (Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Последовательности терминально расположенных инвертированных повторов (терминальные инвертированные повторы, TIR) занимают сегмент генома приблизительно в 11 т.н. (McFadden, G. and Graham K.: "Modulation of cytokine networks by pox virus", Virology, edition 5: 421-429, 1994).
Таким образом, обнаружено, что ослабление вирусов миксомы путем последовательных пассажей на клетках Vero привело к утрате сегментов генома, кодирующих рецепторы интерферона а и у (IFNa, IFNy), фактора некроза опухолей (TNF) и интерлейкинов (IL) 1, 2, 6 и 12. Интересно, что эти цитокины принадлежат к параспецифическим защитным факторам неспецифической иммунной системы. Цитоки-ны нейтрализуются путем связывания с соответствующими вирусными рецепторами, так что вирус способен реплицироваться беспрепятственно. Делеции сегментов гена, который кодирует упомянутые выше рецепторы цитокинов, относятся главным образом к терминальным участкам ДНК. Однако, помимо того, можно обнаружить и делеции, происходящие в ходе пассажей клеток AVIVER в консервативной части ДНК. Эти делеции относятся к двум генам, которые кодируют иммунный эпитоп, и гену вирулентности. Такие генетические модификации, вероятно, являются одной из причин снижения иммунизирующей, т. е. антигенспецифической, активности и одновременного повышения параспецифической активности ослабленного вируса миксомы.
Иммунизирующие эпитопы и параспецифический и неспецифический эпитопы конкурируют. Снижение [уровня] упомянутых первыми пептидов или белков приводит к повышению эффекта параспеци-фической активности. Остатки иммунизирующих и повышающих вирулентность белков устраняются при приготовлении индукторов монопараиммунитета способом, описанным выше для инактивации ослабленных вирусов миксомы.
Индуктор монопараиммунитета согласно изобретению, также именуемый PIND-MYXO, основан на использовании ослабленных вирусов миксомы или их параиммунизирующих компонентов и, по причине своих параиммунизирующих свойств, пригоден при нижеследующих показаниях у пациента:
заболеваниях, вызванных инфекционным фактором, и смешанных инфекциях, хронических проявлениях инфекционных процессов, стойких возвратных инфекций и устойчивых к химиотерапии бактериальных и вирусных инфекций, ослаблении защитных механизмов и нарушениях защитных систем организма, представляющей угрозу жизни неонатальной инфекции, адъювантной терапии при определенных опухолевых заболеваниях, например для предупреждения метастазов, уменьшения побочных эффектов химио- и рентгенотерапии, регуляции гомеостаза между гормональной, циркуляторной, метаболической
- 7 -
009937
и нервной системами.
Индукторы параиммунитета согласно изобретению могут быть введены млекопитающим, включая человека, парентерально или локально, а также птицам и рептилиям. Локальное введение индукторов параиммунитета специфически стимулирует параспецифические защитные механизмы в слизистых оболочках и в коже. Однако при этом присутствует и определенный системный эффект. Напротив, проведенная парентерально параиммунизация незначительно влияет на локальные защитные механизмы кожи и слизистых оболочек, оказывая предпочтительно системное влияние.
Побочных эффектов не возникает даже при многократных парентеральных введениях, проводимых постоянно человеку и животным. Показания для использования PIND-MYXO на человеке и животных одинаковы. В то же время в сложных случаях, в частности, при ведении лошадей, свиней, собак и кошек, рекомендуется параиммунизация новорожденных немедленно, в день рождения, предпочтительно в первый и возможно также во второй день после рождения. Единичная доза составляет около 0,5-5 мл разведенного лиофилизата, для лошадей и свиней разовая доза предпочтительно составляет 2 мл, а для собак и кошек предпочтительно 0,5 мл при парентеральном введении. Также рекомендуется в соответствии с данным изобретением вводить PIND-MYXO парентерально за один день до и/или одновременно со специфическими защитными прививками, чтобы устранить вторичные реакции и облегчить иммунизацию при введении вакцин.
Один из вариантов реализации данного изобретения относится к производству фармацевтической композиции для локального введения с целью вызвать параиммунитет в коже и слизистых оболочках. Фармацевтическая композиция предпочтительно относится к буккальным или рассасываемым таблеткам, основанным на компонентах ослабленного и инактивированного в культуре клеток вируса миксомы. Буккальные таблетки согласно изобретению предпочтительно производятся с добавлением сорбита, по-лиэтиленгликоля - 6,00, кислого фосфорнокислого калия, эссенции для таблеток Tyrospirol, Kollidon 25 и стеарата магния. PIND-MYXO может быть, однако, также введен назально, ректально или вагинально на подходящем носителе.
Нижеследующие примеры являются предпочтительными вариантами реализации данного изобретения и служат для дальнейшего объяснения предмета данного изобретения.
Пример 1. Вирус миксомы из подкожного отека европейского дикого кролика (род Oryctolagus), характерным образом страдающего от миксоматоза, выделяли в качестве исходного материала для получения индуктора монопараиммунитета PIND-MYXO согласно изобретению путем культивирования на хо-риоллантоисной мембране (САМ) куриных яиц (яйца Valo), инкубировавшихся 10 дней, и адаптировали три раза способом Herrlich et al. пассажами на САМ (Herrlich A., Mayr A. and Munz E.: "Die Pocken", 2nd edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Третий пассаж на САМ адаптировали на 1-й стадии на клетках Vero 120 пассажами (ATCC CCL-81, ВОЗ (WHO), Американская коллекция типовых культур), реплицировали на 2-й стадии путем 24 промежуточных пассажей на культуре клеток AVIVER и затем культивировали на 3-й фазе в клетках Vero. B целом проводили около 300 пассажей, направленных на ослабление [вируса]. После таких последовательных пассажей конечного разведения исходно вирулентный вирус миксомы ослаблялся.
Ослабленный вирус миксомы реплицировали в клетках Vero. Культуру клеток Vero культивировали с использованием полностью синтетической среды, состоящей из MEM (минимальной поддерживающей среды) с добавлением 10% BMS (среда, замещающая сыворотку) и 10% гидролизата лактальбумина. Вирусная среда, использованная после замены культуральной среды, представляет собой только MEM с добавлением 10% гидролизата лактальбумина без BMS или без фетальной телячьей сыворотки и без антибиотиков. Все способы производства применяли при значениях рН выше 7,25. Собранные вирусы с титром выше 106,5 ТСГО5о/мл служили исходным материалом для получения индуктора монопараимму-нитета PIND-MYXO согласно изобретению. После инактивации собранных вирусов 0,05% р-пропиолактоном и низкоскоростного центрифугирования к вирусному материалу перед лиофилизацией добавляли 5% сукцинилированного желатина (полижелина).
Лиофилизированный продукт стабилен при комнатной температуре и при температурах около 4°С --80°C и может храниться неограниченное время предпочтительно при температуре около 4°C или около -60°C. Объем в 1 мл лиофилизата, растворенного в стерильной дистиллированной воде, соответствует дозе для инокуляции. Проводят глубокое внутримышечное или локальное введение (см. примеры 3, 4 и
5).
Пример 2. Индуктор PIND-MYXO согласно изобретению вводят аналогично тому, как описано в примере 1, в сухой форме (лиофилизат не растворен) локально на слизистые оболочки верхних дыхательных путей, предпочтительно назально, три раза в день, для профилактики или терапии (1 мл на аппликацию) многофакторных инфекций (например, гриппозных инфекций).
Пример 3. Индуктор PIND-MYXO в жидкой форме, как в примере 1, аналогичным образом втирают в кожу для улучшения кровоснабжения кожи, для ускорения заживления ран и для лечения варикоза вен и хронической венозной недостаточности (трофическая язва ног) у человека. Для этой цели лиофилизат может быть взят, например, в виде жирного крема (например, Bepanthen, Linola fat), в этом случае рН
- 8 -
009937
должен быть слегка щелочным. Такой препарат должен быть свежеприготовленным для каждого использования. Введение производят несколько раз в день путем втирания руками в неповрежденную кожу. Открытые раны можно обрабатывать капельной аппликацией свежерастворенного продукта в область раны. Лечение должно проводиться каждый день, вплоть до заживления.
Пример 4. Индуктор монопараиммунитета PIND-MYXO, полученный, как в примере 1, аналогичным образом вводят парентерально для предупреждения вторичных реакций и для улучшения результатов прививок за один день до или одновременно с защитной прививкой общепринятыми специфическими вакцинами.
Пример 5. Индуктор монопараиммунитета PIND-MYXO, полученный, как в примере 1, обрабатывается аналогичным образом в буккальные или рассасываемые таблетки. Производство и использование рассасываемых таблеток для локальной параиммунизации слизистых оболочек уха, носа, горла и рта является оригинальным и представляет собой составную часть данного изобретения. Через активированные слизистые оболочки рта реализуется не только хоминг-эффект (миграция защитных клеток в слизистые оболочки и в другие системы органов), но также и частичная парентеральная параиммунизация. Доказано, что нижеследующий способ производства пригоден для производства буккальных и рассасываемых таблеток.
Для лиофилизации к жидкому материалу индуктора вместо желатина добавляли 5% Kollidon 25 (поливинилпирролидон). Мочевина, сорбит, полиэтиленгликоль 6000 и стеарат магния требуются для производства окончательной формы таблеток. Рекомендуемая форма таблеток весом 500,5 мг по весу распределяется так:
PIND-MYXO лиофилизат 65 мг
Мочевина 50 мг
Сорбит 2 67 мг
Полиэтиленгликоль 6000 118 мг
Стеарат магния 0,5 мг
Вес таблетки 500,5 мг
Пациент должен принимать 4-6 таблеток с одинаковым интервалом каждый день до достижения
оптимальной параиммунизации.
Нижеследующая формула фармацевтической композиции признана пригодной для производства
буккальных таблеток:
PIND-MYXO лиофилизат 155 мг
Сорбит 360 мг
Полиэтиленгликоль 6000 300 мг
Кислый фосфорнокислый калий (КН2РО4) безводный 2 мг
Гидрофосфат натрия (Na2HP04) безводный 8 мг
Таблеточная эссенция Tyrospirol 0,8 мг
Стеарат магния 20 мг
Вес таблетки 805,8 мг
Таблетки медленно растворяются во рту у пациента и могут быть проглочены после растворения.
Результаты клинических испытаний индуктора монопараиммунитета согласно изобретению на основе лиофилизата штамма М-2 вируса миксомы сведены в таблицы 1-4 и свидетельствуют об очень хорошей параиммунизирующей активности лиофилизатов вируса миксомы на человеке. Эти данные в равной мере приложимы и к другим млекопитающим, а также к птицам и рептилиям.
- 9 -
009937
Таблица 1. Клинические результаты действия индуктора монопараиммунитета из ослабленного в культуре клеток вируса миксомы на организм человека - профилактическое применение -(лиофилизированный индуктор 1 OP (1 мл) внутримышечно)_
Показания
Подходящий способ введения
Периоды высокого инфекционного пресса Стресс
Путешествия, экзамены и сходные стрессы до или одновременно с защитными прививками
2 инъекции перед стрессом с интервалом в 24 часа
Химиотерапия, облучение (уменьшение или предупреждение
вторичных реакций) Операции (улучшение заживления ран)
1 инъекция каждый день или
каждый второй день до завершения лечения или до излечения
Поддержание оптимального уровня защиты и гемодинамики Профилактика рака и гепатитов Улучшение состояния здоровья
1-2 инъекции в месяц с интервалом в 24 часа
Таблица 2. Клинические результаты действия индуктора монопараиммунитета из ослабленного в культуре клеток вируса миксомы на человеке - терапевтическое применение (лиофилизированный индуктор 1 OP (1 мл) внутримышечно)__
Показания
Подходящий способ введения
Герпетические заболевания
(опоясывающий лишай, инфекционный мононуклеоз, простой герпес и т.д.)
1 инъекция в день в течение 3-5
дней или до исчезновения симптомов; затем одна инъекция каждый 2-й или 3-й день, до полного выздоровления
Хронические гепатиты
Курс каждый месяц: 3 инъекции с интервалом в 24 часа
Гриппозные инфекции Вирусные и бактериальные смешанные инфекции (в комбинации с антибиотиками или химиотерапией)
1 введение в день до исчезновения симптомов, затем 1 инъекция каждый 2-й день, до полного выздоровления
Иммунодефициты и нарушение регуляции защитных систем (например, в ходе химиотерапии)
1. интенсивное лечение в течение 5-10 дней: 1 инъекция в день, 2. затем 2 инъекции в неделю с интервалом в 24 часа (возможно лечение в течение длительного периода времени)
Поражение эндотоксином
1 инъекция в день в течение 7 дней, до выздоровления
- 10 -
009937
Таблица 3. Эффект параиммунизации индуктором из миксомы (PIND-MYXO) у пациентов с низкими иммунными параметрами (7 дней после введения PIND-MYXO)__
Пациент
Данные о пациенте Диагноз/Терапия
параметр (нормальный диапазон)
День 0
День 7
A.S.
Женщина, 52 года
Подавленный иммунитет
Лейкоциты (4000-10000/мкл)
4000
9400
D.B.
Женщина 54 года
Язвенный колит Кортизоновая терапия
лимфоциты (900-3000/мкл)
клетки CD4 (500-1800/мкл)
клетки CD8 (100-1000/мкл)
620 400 80
1360 920 210
U.S.
мужчина, 38 лет
Иммунологическое нарушение
Лейкоциты (4 000-10000/мкл)
3800
7400
S.C.
мужчина, 43 года
Радиотерапия метастазирующего рака простаты
Лейкоциты (4000-10000/мкл)
3800
9900
В.М.
женщина, 56 лет
Восприимчивость к инфекциям
Цитотоксические клетки (30-360/мкл)
248
Таблица 4. Влияние параиммунизации индуктором из миксомы (PIND-MYXO) у пациентов с повышенными иммунными параметрами (7 дней после введения PIND-MYXO)__
Пациент
Диагноз/Терапия
Параметр (нормальный
День 0
День 7
диапазон)
G.P.,
Рак шейки матки,
Лейкоциты (4000-
женщина,
рак молочной
10000/мкл)
12600
8600
59 лет
железы,
гранулоциты
восприимчивость к
(2400-6400/мкл)
8420
5930
инфекциям
С.Н.
Психосоматический
Лейкоциты
женщина,
синдром, ожирение
(4000-10000/мкл)
12700
6000
51 год
гранулоциты (2400-
6400/мкл)
9270
4760
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Индуктор монопараиммунитета на основе ослабленного вируса миксомы или его компонентов.
2. Индуктор монопараиммунитета по п.1, отличающийся тем, что ослабленный штамм вируса миксомы имеет модификации в форме добавления, замены или делеции в одном или более сегментах гена, кодирующего продукцию рецепторов цитокинов, с утратой цитокиновыми рецепторами рецепторных свойств вследствие модификации.
3. Индуктор монопараиммунитета по п.2, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из
- 11 -
009937
группы рецепторов к интерферонам (IFN), интерлейкинам (IL) и фактору некроза опухолей (TNF).
4. Индуктор монопараиммунитета по п.3, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов IFNa-R, IFNy-R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.
5. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что компоненты вируса включают в себя вирусные оболочки или аберрантные формы вирусных оболочек ослабленного штамма вируса миксомы.
6. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что ослабленный штамм вируса миксомы выбран из группы, состоящей из штаммов М2, М7, Lausanne, Aust/Uriarra/Verg-86/1.
7. Индуктор монопараиммунитета по п.6, отличающийся тем, что штамм вируса миксомы представляет собой штамм М-2 с депозитарным номером ECACC 03121801.
8. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что штамм вируса мик-сомы ослаблен в культуре клеток.
9. Индуктор монопараиммунитета по п.8, отличающийся тем, что культуры клеток включают в себя клетки почек обезьяны Vero и/или клетки AVIVER.
10. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что ослабленный вирус миксомы инактивирован.
11. Индуктор монопараиммунитета по п.10, отличающийся тем, что ослабленные вирусы миксомы инактивированы р-пропиолактоном.
12. Индуктор монопараиммунитета по п.11, отличающийся тем, что концентрация р-пропиолактона составляет 0,01-1%.
13. Индуктор монопараиммунитета по п.12, отличающийся тем, что концентрация р-пропиолактона составляет 0,05%.
14. Индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что вирусы миксомы лиофилизированы.
15. Применение индуктора монопараиммунитета по любому из пп.1-14 для производства фармацевтической композиции для активации параспецифической иммунной системы у человека и животных.
16. Применение индуктора монопараиммунитета по любому из пп.1-14 для производства фармацевтической композиции для парентерального лечения и/или профилактики дисфункций иммунной системы, иммуносупрессии, нарушений, связанных с иммунодефицитом, дисфункций гомеостаза между гормональной, циркуляторной, метаболической и нервной системами, представляющей угрозу неонатальной инфекции, опухолевых заболеваний, вирусных заболеваний, бактериальных заболеваний, устойчивых к терапии заболеваний, вызванных инфекционным фактором, вирусных и бактериальных смешанных инфекций, хронических проявлений инфекционных процессов, заболеваний печени различной этиологии, хронических заболеваний кожи, герпетических заболеваний, хронических гепатитов, гриппозных инфекций, повреждений, вызванных эндотоксином.
17. Применение по любому из пп.15-16, при котором указанное лечение проводят путем локального введения фармацевтической композиции через кожу или слизистые оболочки пациента.
18. Фармацевтическая композиция, включающая в себя индуктор монопараиммунитета по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Фармацевтическая композиция по п.18 для локального или парентерального введения.
20. Фармацевтическая композиция по п.18, представленная в виде буккальных или рассасываемых таблеток.
21. Способ получения индуктора монопараиммунитета на основе штамма ослабленного вируса миксомы, включающий в себя стадии
выделения вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, типичным образом страдающего от генерализованного миксоматоза;
адаптации вируса к пермиссивной клеточной системе;
пассирования изолированных вирусов в культуре клеток Vero и бинарной культуре клеток до достижения ослабления вируса.
22. Способ по п.21, в котором выделенные вирусы инокулировали в хориоаллантоисную мембрану (САМ) инкубированного куриного яйца для адаптации.
23. Способ по п.22, в котором вирус реплицируется в ходе 2-6 пассажей, предпочтительно 3 пассажей, на САМ.
24. Способ по п.21, в котором вирусы миксомы, присутствующие в инфицированной ткани, изолированы путем репликации в пермиссивной клеточной системе.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что вирус выделяют путем культивирования на хориоаллан-тоисной мембране (САМ) инкубируемого куриного яйца.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что вирус последовательно адаптируют на САМ в ходе последующих пассажей, предпочтительно 2 последующих пассажей.
27. Способ по любому из пп.21-26, отличающийся тем, что ослабление вирусов миксомы происхо
- 12 -
009937
дит в культуре клеток Vero в ходе 80-150 пассажей, предпочтительно 120 пассажей.
28. Способ по любому из пп.21-27, отличающийся тем, что вирус пассируют в культуре клеток AVIVER.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пассирование происходит в ходе 10-50 пассажей, предпочтительно 25 пассажей.
30. Способ по любому из пп.21-29, в котором ослабленные вирусы миксомы дополнительно репли-цированы в ходе добавочных ослабляющих пассажей.
31. Способ по п.30, в котором репликация происходит в клетках почек обезьяны Vero.
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что дальнейший рост происходит в клетках Vero в ходе 100200 пассажей.
33. Способ по любому из пп.30-32, отличающийся тем, что сбор вирусов в клеточной культуре имеет инфекционный титр от 105 до 107,5, предпочтительно по меньшей мере 106,5, ТСГО50/мл.
34. Способ по любому из пп.21-33, в котором ослабленные вирусы миксомы дополнительно инак-тивированы.
35. Способ по п.34, в котором ослабленные вирусы миксомы для инактивации обрабатывают р-пропиолактоном.
36. Способ по п.35, отличающийся тем, что концентрация р-пропиолактона составляет 0,01-1%.
37. Способ по п.36, отличающийся тем, что концентрация р-пропиолактона составляет 0,05%.
38. Способ по любому из пп.21-37, включающий в себя стадии выделения вирусов миксомы из инфицированной ткани кролика, страдающего от миксоматоза, путем репликации на САМ инкубируемых куриных яиц и последующей
адаптации выделенного вируса миксомы на САМ в ходе 2 дальнейших пассажей, ослабления выделенных вирусов путем
пассирования клеток Vero в культуре, предпочтительно в ходе 120 пассажей,
переноса вирусов в бинарную культуру клеток AVIVER с последующим ослаблением вируса в этой культуре клеток, предпочтительно в ходе 24 промежуточных пассажей,
последующего переноса вируса обратно на клетки Vero почек обезьяны и
репликации ослабленных вирусов миксомы путем последующих ослабляющих пассажей в клетках Vero, предпочтительно в ходе приблизительно 150 пассажей.
39. Ослабленный вирус миксомы, который можно получить способом по любому из пп.21-38.
40. Вирус миксомы по п.39, депонированный в Европейской Коллекции Клеточных Культур (ECACC) под депозитарным номером 03121801.
41. Вирус миксомы по п.39 или 40, отличающийся тем, что вирус миксомы генетически модифицирован.
42. Вирус миксомы по п.41, отличающийся тем, что имеет модификации в виде добавления, замены или делеции в одном или более сегментах гена, кодирующего продукцию цитокиновых рецептов, при этом рецепторные свойства цитокиновых рецептов при модификациях утрачиваются.
43. Вирус миксомы по п.42, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к интерферонам (IFN), интерлейкинам (IL) и фактору некроза опухолей (TNF).
44. Вирус миксомы по п.43, отличающийся тем, что рецепторы цитокинов выбраны из группы рецепторов к IFNa-R, IFNy-R, TNF-R, IL-1-R, IL-2-R, IL-6-R и IL-12-R.
45. Ослабленный штамм М2 вируса миксомы М2 с депозитарным номером ECACC 03121801.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 13 -