1. Способ получения трансгенных растительных клеток с повышенной продукцией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), включающий трансформацию растительных клеток, способных экспрессировать ХФРТазу экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, и где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.

2. Способ по п.1, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является конститутивно активным.

4. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

5. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках коры корней растения.

6. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.

7. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.

8. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.1-7.

9. Способ по п.8, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.

10. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.9.

11. Способ повышения продукции ХФРТазы в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных клетках растения.

12. Способ по п.11, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.

13. Способ по п.11 или 12, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:

а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;

б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором;

в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.

14. Способ по п.13, где указанный промотор является конститутивно активным.

15. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

16. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.

17. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.11-16.

18. Способ по п.17, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.

19. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.18.

20. Способ получения трансформированных растительных клеток с повышенной продукцией никотина, включающий трансформацию растительных клеток, способных продуцировать ХФРТазу, экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' растительный функциональный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная ДНК-последовательность функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.

21. Способ по п.20, где указанные трансформированные клетки представляют собой клетки
Nicotiana tabacum.

22. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является конститутивно активным.

23. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

24. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.

25. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.

26. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.

27. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.20-26.

28. Способ по п.27, где растение предсталяет собой растение табака Nicotiana tabacum.

29. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.28.

30. Способ повышения продукции никотина в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных растительных клетках.

31. Способ по п.30, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.

32. Способ по п.30 или 31, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:

а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;

б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором; и

в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.

33. Способ по п.32, где указанный промотор является конститутивно активным.

34. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

35. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.

36. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.30-35.

37. Способ по п.36, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.

38. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.37.

39. Способ по любому из пп.8-38, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:

а) последовательность ДНК SEQ ID NO:1;

б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2;

в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3M NaCl, 0,03М цитрата натрия и 0,1% SDS при 70шС, и кодирует ХФРТазу растения табака и

г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.

40. Способ по п.39, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК SEQ ID NO:1.

41. Трансгенное растение табака рода Nicotiana с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированным контрольным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.1-9, 11-18.

42. Потомство трансгенного растения по п.41.

43. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по п.41.

44. Трансгенное растение табака рода Nicotiana с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.20-28, 30-37.

45. Потомство трансгенного растения по п.44.

46. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по п.44.

47. Табачный продукт, полученный из растения табака по пп.41, 42, 44 или 45.

48. Табачный продукт, содержащий клетки растения табака, полученные способом по любому из пп.2-40.

49. Табачный продукт, содержащий табак растения табака, полученного способом по пп.9, 18, 28 или 37.

50. Табачный продукт по пп.47-49, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:

а) последовательность ДНК SEQ ID NO:1;

б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2;

в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3M NaCl, 0,03М цитрата натрия и 0,1%SDS при 70шС, и кодирует ХФРТазу растения табака и

г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.

51. Табачный продукт по п.50, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК SEQ ID NO:1.

52. Табачный продукт по любому из пп.47-51, выбранный из группы, включающей табак для табачной трубки, табак для сигары, табак для сигареты, жевательный табак, сигареты и сигары.

53. Способ получения табачного продукта с повышенным содержанием никотина, включающий получение трансгенного растения табака по пп.41, 42, 44 или 45 и получение указанного табачного продукта из указанного растения табака.

 

(57) Реферат / Формула:
Способ получения трансгенных растительных клеток с повышенной продукцией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), включающий трансформацию растительных клеток, способных экспрессировать ХФРТазу экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, и где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.

2. Способ по п.1, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является конститутивно активным.

4. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

5. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках коры корней растения.

6. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.

7. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.

8. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.1-7.

9. Способ по п.8, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.

10. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.9.

11. Способ повышения продукции ХФРТазы в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных клетках растения.

12. Способ по п.11, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.

13. Способ по п.11 или 12, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:

а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;

б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором;

в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.

14. Способ по п.13, где указанный промотор является конститутивно активным.

15. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

16. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.

17. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.11-16.

18. Способ по п.17, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.

19. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.18.

20. Способ получения трансформированных растительных клеток с повышенной продукцией никотина, включающий трансформацию растительных клеток, способных продуцировать ХФРТазу, экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' растительный функциональный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная ДНК-последовательность функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.

21. Способ по п.20, где указанные трансформированные клетки представляют собой клетки
Nicotiana tabacum.

22. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является конститутивно активным.

23. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

24. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.

25. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.

26. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.

27. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.20-26.

28. Способ по п.27, где растение предсталяет собой растение табака Nicotiana tabacum.

29. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.28.

30. Способ повышения продукции никотина в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных растительных клетках.

31. Способ по п.30, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.

32. Способ по п.30 или 31, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:

а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;

б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором; и

в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.

33. Способ по п.32, где указанный промотор является конститутивно активным.

34. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.

35. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.

36. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.30-35.

37. Способ по п.36, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.

38. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.37.

39. Способ по любому из пп.8-38, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:

а) последовательность ДНК SEQ ID NO:1;

б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2;

в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3M NaCl, 0,03М цитрата натрия и 0,1% SDS при 70шС, и кодирует ХФРТазу растения табака и

г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.

40. Способ по п.39, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК SEQ ID NO:1.

41. Трансгенное растение табака рода Nicotiana с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированным контрольным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.1-9, 11-18.

42. Потомство трансгенного растения по п.41.

43. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по п.41.

44. Трансгенное растение табака рода Nicotiana с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.20-28, 30-37.

45. Потомство трансгенного растения по п.44.

46. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по п.44.

47. Табачный продукт, полученный из растения табака по пп.41, 42, 44 или 45.

48. Табачный продукт, содержащий клетки растения табака, полученные способом по любому из пп.2-40.

49. Табачный продукт, содержащий табак растения табака, полученного способом по пп.9, 18, 28 или 37.

50. Табачный продукт по пп.47-49, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:

а) последовательность ДНК SEQ ID NO:1;

б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2;

в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3M NaCl, 0,03М цитрата натрия и 0,1%SDS при 70шС, и кодирует ХФРТазу растения табака и

г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.

51. Табачный продукт по п.50, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК SEQ ID NO:1.

52. Табачный продукт по любому из пп.47-51, выбранный из группы, включающей табак для табачной трубки, табак для сигары, табак для сигареты, жевательный табак, сигареты и сигары.

53. Способ получения табачного продукта с повышенным содержанием никотина, включающий получение трансгенного растения табака по пп.41, 42, 44 или 45 и получение указанного табачного продукта из указанного растения табака.

 

---

009898
Исследования, спонсированные Федеральными органами
Данное изобретение осуществлено при поддержке Государства через Национальный фонд по научным исследованиям № МСВ-9206506. Государство имеет определенные права на данное изобретение.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к растительной хинолятфосфорибозил-трансферазе (ХФРТазе) и к ДНК, кодирующей этот фермент. В частности, данное изобретение относится к применению ДНК, кодирующей хинолятфосфорибозил-трансферазу для получения трансгенных растений с генетически измененным соединением никотина, и к растениям, полученным таким образом.
Предпосылки создания изобретения
Производство табака с пониженным содержанием никотина представляет интерес, учитывая способность никотина вызывать зависимость. Кроме того, растения табака с исключительно низким уровнем продуцирования никотина или не продуцирующие никотин привлекательны как реципиенты для трансгенов, экспрессирующих коммерчески ценные продукты, такие как фармацевтические средства, компоненты косметических средств или пищевые добавки. Разработаны различные способы удаления никотина из табака. Однако большинство этих способов удаляет другие ингредиенты из табака помимо никотина, что вредно влияет на табак. Классические методы выращивания культурных растений дают растения табака с более низким содержанием никотина (приблизительно 8%), чем содержание, обнаруженное в растениях табака дикого типа. Желательно получение растений табака и табак с еще меньшим содержанием никотина.
Один из подходов к снижению содержания биологического продукта состоит в необходимости уменьшения количества необходимого фермента в биохимическом каскаде, ведущего к образованию этого продукта. Когда предпочтительный фермент находится в природе в количестве, ограничивающем скорость (относительно других ферментов, необходимых в каскаде реакций), любое снижение представленности фермента будет уменьшать продуцирование конечного продукта. Если количество фермента в естественном состоянии не является ограничивающим скорость, его присутствие в клетке необходимо уменьшить до ограничивающего скорость содержания, чтобы снизить выход каскада реакций. Напротив, если в естественном состоянии количество фермента является ограничивающим скорость, тогда любое возрастание активности фермента приведет к возрастанию выхода конечного продукта биосинтетического каскада реакций. Никотин первоначально образуется в корнях растения табака и затем переносится в листья, где он накапливается (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, p. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)). Обязательной стадией при биосинтезе никотина является образование никотиновой кислоты из хинолиновой кислоты, которое катализируется ферментом хинолинфосфорибозил-трансферазой (ХФРТазой). Оказывается, что ХФРТаза является ограничивающим скорость ферментом в каскаде реакций, поставляющем никотиновую кислоту для синтеза никотина в табаке. См., например, Feth et al., "Regulation in Tobacco Callus of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, p. 402-07 (1986); Wagner et al., "The Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol. Plant., 68, p. 667-72 (1986). Изменение содержания никотина в растениях табака путем антисмысловой регуляции экспрессии путресценс-метилтрансферазы (ПМТазы) описывается в патентах США 5369023 и 5260205, Nakatani and Malik. B международной заявке PCT WO 94/28142, Wahad and Malik, описывается ДНК, кодирующая ПМТ, и применение смысловой и антисмысловой содержащих ПМТ конструкций.
Краткое изложение сущности изобретения
Первым аспектом настоящего изобретения является выделенная молекула ДНК, содержащая
последовательность № 1;
последовательности ДНК, кодирующие фермент с последовательностью № 2;
последовательности ДНК, гибридизирующие с такой ДНК и кодирующие фермент хинолятфосфо-рибозил-трансферазу, и
последовательности ДНК, отличающиеся от указанной выше ДНК вследствие вырождения генетического кода.
Пептид, кодированный такой ДНК, составляет другой аспект изобретения.
Другим аспектом настоящего изобретения является ДНК-конструкция, содержащая промотор, функционирующий в растительной клетке, и сегмент ДНК, кодирующий фермент хинолятфосфорибо-зил-трансферазу, расположенный в прямом направлении от промотора и функционально связанный с ним. ДНК, кодирующая фермент, может находиться в антисмысловом или смысловом направлении.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения трансгенной растительной клетки с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) путем предоставления растительной клетки типа, известного как экспрессирующего хинолятфосфорибозил-трансферазу; трансформации растительной клетки экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей промотор, и ДНК, содержащую часть последовательности, кодирующей мРНК хинолятфосфорибозил-трансферазы.
Другим аспектом настоящего изобретения является трансгенное растение вида Nicotiana с пониженной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) относительно нетрансформирован-ного контрольного растения. Клетки таких растений содержат ДНК-конструкцию, включающую сегмент
- 1 -
009898
последовательности ДНК, которая кодирует мРНК растительной хинолятфосфорибозил-трансферазы.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ снижения экспрессии гена хинолятфос-форибозил-трансферазы в растительной клетке путем выращивания растительной клетки, трансформированной с целью включения экзогенной ДНК, где транскрибирующая цепь экзогенной ДНК комплементарна к мРНК хинолятфосфорибозил-трансферазы, эндогенной для клетки. Транскрипция комплементарной цепи снижает экспрессию эндогенного хинолятфосфорибозил-гена.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения растения табака с пониженным содержанием никотина в листьях растения табака путем выращивания растения табака, клетки которого содержат последовательность экзогенной ДНК, где транскрибирующая цепь экзогенной ДНК комплементарна к эндогенной матричной РНК хинолятфосфорибозил-трансферазы в клетках.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения трансгенной растительной клетки с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) путем трансформации растительной клетки, известной как экспрессирующая хинолятфосфорибозил-трансферазу, экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей последовательность ДНК, кодирующую хинолятфосфорибозил-трансферазу.
Другим аспектом настоящего изобретения является трансгенное растение Nicotiana с повышенной экспрессией хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы), где клетки трансгенного растения содержат последовательность экзогенной ДНК, кодирующую растительную хинолятфосфорибозил-трансферазу.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ повышения экспрессии гена хинолят-фосфорибозил-трансферазы в растительной клетке путем выращивания растительной клетки, трансформированной с целью включения экзогенной ДНК, кодирующей хинолятфосфорибозил-трансферазу.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения растения табака с повышенным содержанием никотина в листьях путем выращивания растения табака, клетки которого содержат последовательность экзогенной ДНК, которая кодирует хинолятфосфорибозил-трансферазу, функциональную в клетках.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает каскад биосинтетических реакций при образовании никотина. Ферментативные активности, известные как регулируемые Nic1 и Nic2, представляют активность ХФРТазы (хинолятфос-форибозил-трансферазы) и ПМТазы (путресценс-метилтрансферазы).
На фиг. 2А приводится нуклеотидная последовательность кДНК NtQPTI (последовательность № 1) с кодирующей последовательностью (последовательность № 3), показанной заглавными буквами.
На фиг. 2Б приводится образованная аминокислотная последовательность (последовательность № 2) ХФРТазы табака, кодированной кДНК NtQPTI.
На фиг. 3 приводятся разложенные в ряд образованная аминокислотная последовательность NtQPTI и родственные последовательности Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, человеческая и Saccharomyces cerevisiae.
Фиг. 4 показывает результаты комплементации мутанта Escherichia coli, лишенного хинолятфосфо-рибозил-трансферазы (ТН265), с кДНК NtQPTI. Клетки трансформированы экспрессионным вектором, несущим NtQPTI; рост трансформированных клеток ТН265, экспрессирующих NtQPTI, на минимальной среде, лишенной никотиновой кислоты, показывает, что NtQPTI кодирует ХФРТазу.
На фиг. 5 сравниваются содержание никотина и относительное установившееся содержание мРНК NtQPTI в мутантах табака Nic1 и Nic2: Burley 21 дикого типа (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); Burley 21 Nic1-(nic1/nic1 Nic2/Nic2); Burley 21 Nic2- (Nic1/Nic1 nic2/nic2) и Burley 21 Nic1-Nic2- (nic1/nic1 nic2/nic2).
Сплошные прямоугольники показывают содержание транскриптов мРНК; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина.
Фиг. 6 является диаграммой относительного содержания мРНК NtQPTI со временем в растениях табака с прищипанной верхушкой по сравнению с неприщипанными контрольными растениями. Сплошные прямоугольники показывают содержание транскриптов мРНК; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина.
Подробное описание изобретения
Никотин продуцируется в растениях табака путем конденсации никотиновой кислоты и 4-метиламинобутанала. Каскад реакций биосинтеза, приводящий к образованию никотина, поясняется на фиг. 1. Два регуляторных локуса (Nic1 и Nic2) действуют как кодоминантные регуляторы образования никотина. Ферментные анализы корней простых и двойных мутантов Nic показывают, что активность двух ферментоз хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) и путресценс-метилтрансферазы (ПМТазы) прямо пропорциональна уровню бисинтеза никотина. Сравнение ферментативной активности в тканях табака (корень и каллюс) с различной способностью к синтезу никотина показывает, что активность ХФРТазы строго соотносится с содержанием никотина (Wagner and Wagner, Planta, 165:532 (1985)). Saunders и Bush (Plant Physiol., 64:236 (1979) показали, что содержание ХФРТазы в корнях мутантов с низким содержанием никотина пропорционально содержанию никотина в листьях.
Настоящее изобретение включает последовательность новой кДНК (последовательность № 1), кодирующей растительную хинолятфосфорибозил-трансферазу (ХФРТазу), последовательность № 2. Так
- 2 -
009898
как активность ХФРТазы строго соотносится с содержанием никотина, создание трансгенных растений табака, в которых содержание ХФРТазы в корнях понижено (по сравнению с содержанием в растениях дикого типа), приведет к растениям с пониженным содержанием никотина в листьях. Настоящее изобретение относится к способам и нуклеотидным конструкциям для получения таких трансгенных растений, а также к таким трансгенным растениям. Такие способы включают экспрессию антисмысловой РНК NtQPTI, которая снижает количество ХФРТазы в корнях табака. Кроме того, никотин обнаружен в видах и семействах растений, не относящихся к табаку, хотя его количество в них, как правило, значительно меньше, чем в N. tabacum.
Настоящее изобретение также относится к молекулам смысловой и антисмысловой рекомбинант-ной ДНК, кодирующим ХФРТазу, или к молекулам антисмысловой РНК ХФРТазы, и к векторам, содержащим эти молекулы рекомбинантной ДНК, а также к трансгенным растительным клеткам и растениям, трансформированным этими молекулами ДНК и векторами. Трансгенные клетки и растения табака по данному изобретению характеризуются более низким или более высоким содержанием никотина, чем в нетрансформированных контрольных клетках и растений табака.
Растения табака с исключительно низким уровнем продуцирования никотина или не продуцирующие никотин привлекательны как реципиенты для трансгенов, экспрессирующих коммерчески ценные продукты, такие как фармацевтические средства, компоненты косметических средств или пищевые добавки. Табак привлекателен в качестве растения-реципиента для трансгена, кодирующего нужный продукт, так как табак легко поддается обработке методами генной инженерии и продуцирует весьма большую биомассу на акр; растения табака с пониженными ресурсами, предназначенными для продуцирования никотина, соответственно, будут иметь большие ресурсы, доступные для продуцирования трансгенных продуктов. Способы трансформации табака трансгенами, продуцирующими нужные продукты, известны в технике; любой подходящий метод можно использовать для растений табака с низким содержанием никотина настоящего изобретения.
Растения табака, в соответствии с настоящим изобретением, с пониженной экспрессией ХФРТазы и пониженным содержанием никотина будут нужны при получении табачных изделий с пониженным содержанием никотина. Растения табака по настоящему изобретению подойдут для применения в любом традиционном табачном изделии, включая, но не ограничиваясь перечисленным, трубочный, сигарный и сигаретный табак и жевательный табак, который может быть любой формы, включая листовой табак, скрошенный или резаный табак.
Конструкции настоящего изобретения также могут быть полезны при получении трансгенных растений с повышенной экспрессией ХФРТазы и повышенным содержанием никотина в растении. Такие конструкции, способы с использованием этих конструкций и растения, полученные таким образом, могут понадобиться при получении табачных изделий с измененным содержанием никотина или при получении растений с содержанием никотина, повышенным с целью получения инсектицидного действия.
Авторы обнаружили, что ген TobRD2 (см. Conkling et al., Plant Phys., 93, 1203 (1990)) кодирует ХФРТазу Nicotiana tabacum и снабжает его последовательностью кДНК NtQPTI (раньше названную TobRD2) и аминокислотной последовательностью кодируемого фермента. Сравнение аминокислотной последовательности NtQPTI с базой данных банка генов показывает ограниченное подобие последовательностей с бактериальными белками, которые кодируют ХФРТазу (фиг. 3).
Хинолятфосфорибозил-трансфераза необходима для биосинтеза de novo никотинадениндинуклео-тида (NAD) как в прокариотах, так и в эукариотах. В табаке высокое содержание ХФРТазы обнаруживается в корнях, но не в листьях. Для того чтобы определить, что NtQPTI кодирует ХФРТазу, авторы изобретения использовали штамм бактерий Escherichia coli (ТН265), являющийся мутантом с утраченной хинолятфосфорибозил-трансферазой (nadC-). Этот мутант не может расти на минимальной среде, не содержащей никотиновой кислоты. Однако экспрессия белка NtQPTI в этом бактериальном штамме предоставляет фенотип NadC+ (фиг. 4), что подтверждает, что NtQPTI кодирует ХФРТазу.
Авторы изобретения исследовали действие мутантов Nic1 и Nic2 в табаке и влияние прищипки верхушек растений табака на установившееся содержание мРНК NtQPTI и содержание никотина. Известно, что удаление апикального доминирования посредством прищипки верхушек в начале цветения приводит к повышенному уровню биосинтеза и переноса никотина в табаке и является обычной практикой в производстве табака. Если NtQPTI действительно участвует в биосинтезе никотина, следует ожидать, что (1) содержание мРНК NtQPTI будет ниже в двойных мутантах Nic1/Nic2, и (2) содержание мРНК NtQPTI будет возрастать после прищипки верхушек. Обнаружено, что содержание мРНК NtQPTI в двойных мутантах Nic1/Nic2 составляет приблизительно 25% от содержания в диком типе (фиг. 5). Кроме того, в течение 6 ч после прищипки верхушек содержание мРНК NtQPTI в растениях табака повышается примерно в восемь раз. Следовательно, установлено, что NtQPTI является ключевым геном-регулятором в каскаде реакций биосинтеза никотина.
Трансгенные растительные клетки и растения
Регуляции экспрессии гена в геномах растительной клетки можно достичь путем интеграции гете-рологичной ДНК под транскрипционным контролем промотора, который действует в хозяине и в котором транскрибирующаяся цепь гетерологичной ДНК комплементарна к цепи ДНК, которая транскриби
- 3 -
009898
руется от регулируемого эндогенного гена. Введенная ДНК, отнесенная к антисмысловой ДНК, обеспечивает последовательность РНК, комплементарную к естественно продуцируемой (эндогенной) мРНК и ингибирующую экспрессию эндогенной мРНК. Механизм такой регуляции экспрессии гена с помощью антисмысловой ДНК выяснен не до конца. Несмотря на отсутствие желания придерживаться какой-либо определенной теории, нужно отметить, что теория антисмысловой регуляции предполагает, что транскрипция антисмысловой ДНК продуцирует молекулы РНК, которые присоединяются и предупреждают или ингибируют транскрипцию молекул эндогенной мРНК.
В способах настоящего изобретения антисмысловой продукт может быть комплементарным к кодирующим или некодирующим (или к тем и другим) частям встречающейся в природе РНК-мишени. Антисмысловая конструкция может быть введена в растительные клетки любым подходящим способом и может быть интегрирована в растительный геном для индуцируемой или конститутивной транскрипции антисмысловой последовательности. См., например, патенты США № 5453566 и 5107065, Shew-maker et al. (включены в настоящее описание в качестве ссылок).
Как принято здесь, экзогенной или гетерологичной ДНК (или РНК) называется ДНК (или РНК), введенная в клетку (или в предшественника клетки) благодаря усилиям человека. Такая гетерологичная ДНК может являться копией последовательности, которая обнаружена в трансформируемой клетке как естественная, или ее фрагментов.
Для того чтобы получить растение табака с пониженным содержанием ХФРТазы и, таким образом, более низким содержанием никотина, чем в нетрансформированном контрольном растении табака, клетку табака можно трансформировать антисмысловой транскрипционной ХФРТ-единицей, содержащей неполную последовательность кДНК ХФРТ, полноразмерную последовательность кДНК ХФРТ, неполную хромосомную последовательность ХФРТ или полноразмерную хромосомную последовательность ХФРТ, в антисмысловой ориентации с соответствующими функционально связанными регуляторными последовательностями. Подходящими регуляторными последовательностями являются последовательность инициации транскрипции ("промотор"), функционирующая в трансформируемом растении, и последовательность терминации полиаденилирования/транскрипции. Затем для идентификации клонов, несущих последовательности ХФРТазы в антисмысловой ориентации, функционально связанные с регу-ляторными последовательностями, используют стандартные методы, такие как рестрикционное картирование, Саузерн-блоттинг и анализ нуклеотидной последовательности. Затем из успешно трансформированных клеток регенерируют растения табака. Наиболее предпочтительно, когда используемая антисмысловая последовательность комплементарна к эндогенной последовательности, однако небольшие изменения в экзогенной и эндогенной последовательностях можно допустить.
Предпочтительно, чтобы последовательность антисмысловой ДНК была достаточно подобна последовательности, способной к связыванию с эндогенной последовательностью в регулируемой клетке, в строгих условиях, как описано ниже.
Антисмысловую технологию используют в ряде лабораторий для создания трансгенных растений, характеризующихся количеством специфических ферментов ниже естественного. Например, растения с пониженным уровнем хальконсинтазы фермента биосинтетического каскада реакций образования цветкового пигмента получены путем инсерции антисмыслового гена хальконсинтазы в геном табака и петунии. Эти трансгенные растения табака и петунии образуют цветы с окраской слабее нормальной (Van der Krol et al., "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature, 333, p. 866-69 (1988)). Технология антисмысловых РНК также успешно используется для подавления образования фермента полигалактуроназы в томатах (Smith et al. "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature, 334, p. 724-26 (1988); Sheehy et al. "Reduction of Polygalacturonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, p. 8805-09 (1988)) и малой субъединицы фермента рибулозбисфосфаткарбоксилазы в табаке (Rodermel et al. "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, p. 673-81 (1988)). C другой стороны, трансгенные растения, отличающиеся количеством этого фермента, превышающим нормальное, можно создать путем трансформации растений геном для этого фермента в смысловой (т.е. в нормальной) ориентации. Содержание никотина в трансгенных растениях табака по настоящему изобретению можно определить посредством стандартных проб на никотин. Трансформированные растения, в которых содержание ХФРТазы снижено по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, соответственно, будут иметь пониженное содержание никотина по сравнению с контролем; трансформированные растения, в которых содержание ХФРТазы повышено по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, соответственно, будут иметь повышенное содержание никотина по сравнению с контролем.
Гетерологичную последовательность, используемую в антисмысловых способах настоящего изобретения, можно выбрать с таким расчетом, чтобы получить продукт РНК, комплементарный к полной последовательности мРНК ХФРТазы или к ее части.
Последовательность может быть комплементарной к любой следующей последовательности природной матричной РНК, т. е. она может быть комплементарной к последовательности эндогенной мРНК, ближайшей к 5'-концу сайта кэпирования, в прямом направлении от сайта кэпирования, между сайтом
- 4 -
009898
кэширования и инициирующим кодоном и может перекрывать всю или только часть некодирующей области, может быть мостиком между некодирующей и кодирующей областью, может быть комплементарной ко всей или к части кодирующей области, комплементарной к 3'-концу кодирующей области или комплементарной к 3'-нетранслируемой области мРНК. Соответствующие антисмысловые последовательности могут состоять по меньшей мере примерно из 13 до примерно 15 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 16 до примерно 21 нуклеотида, по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 50 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 75 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 100 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 125 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 150 нуклеотидов, по меньшей мере примерно из 200 нуклеотидов или из большего их числа. Кроме того, последовательности можно удлинить или укоротить по их 3'- или 5'-концам.
Конкретная антисмысловая последовательность и длина антисмысловой последовательности будут изменяться в зависимости от необходимой степени ингибирования, устойчивости антисмысловой последовательности и подобных факторов. Специалист в этой области техники при выборе соответствующих антисмысловых последовательностей ХФРТазы будет руководствоваться возможностью применения методов, доступных в технике, и приведенными здесь сведениями. В соответствии с фиг. 2А и приведенной на ней последовательности № 1 олигонуклеотид изобретения может представлять собой непрерывный фрагмент последовательности кДНК ХФРТазы в антисмысловой ориентации, любой длины, которой достаточно для достижения необходимого действия при трансформации в растительную клетку-реципиента.
Настоящее изобретение также можно использовать при способах смысловой косупрессии продуцирования никотина. Смысловые ДНК, используемые при осуществлении настоящего изобретения, имеют достаточную длину, чтобы, когда экспрессируются в растительных клетках, подавлять в этой растительной клетке нативную экспрессию растительного белка ХФРТазы, как описано здесь. Такие смысловые ДНК могут представлять собой, по существу, полную геномную или комплементарную ДНК, кодирующую фермент ХФРТазу, или ее фрагмент, причем такие фрагменты, как правило, имеют длину по меньшей мере в 15 нуклеотидов. Способы установления длины смысловой ДНК, которая приведет к подавлению экспрессии нативного гена в клетке, доступны специалистам в этой области техники.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения клетки растения Nicotiana трансформируются ДНК-конструкцией, содержащей сегмент ДНК, кодирующий молекулу ферментной РНК (т.е. "рибозим"), которая направлена против (т.е. расщепляет) транскрипта мРНК ДНК, кодирующей растительную ХФРТазу, как описано здесь. Рибозимы содержат связывающие субстрат домены, которые связываются с доступными областями мРНК-мишени, и домены, которые катализируют расщепление РНК, предотвращая трансляцию и продуцирование белка. Связывающие домены могут содержать антисмысловые последовательности, комплементарные к последовательности мРНК-мишени; каталитический мотив может представлять собой молотообразный мотив или другие мотивы, такие как шпилькообраз-ный мотив. Сайты рибозимного расщепления в пределах РНК-мишени сначала можно идентифицировать путем сканирования молекулы-мишени на сайты расщепления рибозимом (например, последовательности GUA, GUU или GUC). Сразу после идентификации можно оценить короткие последовательности РНК из 15, 20, 30 или большего числа рибонуклеотидов, соответствующие области гена-мишени, содержащей сайт расщепления, на предсказанные структурные особенности. Пригодность предполагаемых мишеней также можно оценить путем тестирования их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами, с использованием анализов с рибонуклеазной защитой, известных в технике. ДНК, кодирующую молекулы ферментной РНК, можно получить в соответствии с известными методами. См., например, T. Cech et al., патент США № 4987071; Keene et al., патент США № 5559021; Donson et al., патент США № 5589367; Torrence et al., патент США № 5583032; Joyce, патент США № 5580967; Gold et al., патент США № 5595877; Wagner et al., патент США № 5591601 и патент США № 5622854 (все патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок). Продуцирование такой молекулы ферментной РНК в растительной клетке и срыв продуцирования белка ХФРТазы снижает активность ХФРТазы в растительных клетках, по существу, таким же образом, как продуцирование молекулы антисмысловой РНК, т. е. путем разрыва трансляции мРНК в клетке, продуцирующей фермент. Термин "ри-бозим" здесь используется для описания содержащей РНК нуклеиновой кислоты, которая функционирует как фермент (такой как эндорибонуклеаза) и может использоваться для реципрокного обмена с "молекулой ферментной РНК". Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей рибозимы, ДНК, кодирующей рибозимы, которая вставлена в экспрессионный вектор, клеткам-хозяевам, содержащим такие векторы, и способам снижения продуцирования ХФРТазы в растениях с использованием рибозимов.
Нуклеотидные последовательности, используемые при осуществлении настоящего изобретения, включают последовательности, подобные последовательности № 1 и кодирующие белок, обладающий активностью хинолятфосфорибозил-трансферазы. Это определение подразумевает охват природных ал-лельных вариаций в белках ХФРТазах. Таким образом, последовательности ДНК, которые гибридизиру-ют с ДНК последовательности № 1 и кодируют экспрессию ХФРТазы, в частности, растительных ферментов ХФРТаз, также могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения.
- 5 -
009898
Могут существовать многие формы фермента ХФРТ табака. Может существовать множество форм фермента из-за посттрансляционной модификации одного генного продукта или из-за множества форм
гена NtQPTI.
Условия, которые позволяют последовательностям других ДНК, кодирующих экспрессию белка с активностью ХФРТазы, гибридизировать с ДНК последовательности № 1 или с другими последовательностями ДНК, кодирующими белок, данный в виде последовательности № 2, можно определить обычным способом. Например, гибридизацию таких последовательностей можно осуществить в условиях менее строгих или даже в строгих условиях (например, в условиях, представленных строгой промывкой раствором 0,3 M NaCl, 0,03 M цитрата натрия, 0,1% ДСН, при 60°С или даже при 70°С, ДНК, кодирующей белок, приведенный здесь как последовательность № 2, in situ при стандартном анализе гибридизации; см., например, J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed., 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Вообще, такие последовательности будут по меньшей мере на 65% подобны, на 75% подобны, на 80% подобны, на 85% подобны, на 90% подобны или даже на 95% или больше подобны последовательности, приведенной здесь как последовательность № 1, или последовательностям ДНК, кодирующим белки последовательности № 2. (Определения подобия последовательностей проводятся с двумя разложенными в ряд последовательностями по их максимальному совпадению; причем гэпы в любой из двух последовательностей при максимальном соответствии подходят под пару. Длина гэпов 10 или меньше является предпочтительной, более предпочтительна длина гэпов 5 или меньше и еще предпочтительнее длина гэпов 2 или меньше).
Пригодны различные процедуры гибридизации, предусматривающие выделение клонов кДНК, в которых содержание мРНК низкое - примерно 0,05% поли (A+) РНК. См. M. Conkling et al. Plant Physiol., 93, 1203-1211 (1990). Коротко, библиотеки кДНК скринируют с использованием одноцепочечных кДНК-зондов обратно транскрибирующейся мРНК из растительной ткани (например, корней и/или листьев). Для дифференциального скрининга нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану смачивают в 5xSSC, помещают в 96-луночный планшет с отсосом, в каждую лунку помещают 150 мкл стационарной ночной культуры, перенесенной с основного планшета, и применяют вакуум до тех пор, пока вся жидкость не пройдет через фильтр. В каждую лунку помещают 150 мкл денатурирующего раствора (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) с использованием многопозиционной пипетки и оставляют примерно на 3 мин. Применяют отсос, как описано выше, и фильтр удаляют и нейтрализуют в 0,5 M трис-HCl (рН 8,0), 1,5 M NaCl. Затем его сушат в течение 2 ч в вакууме и инкубируют с соответствующими зондами. При использовании мембранных нейлоновых фильтров и хранении основных планшетов при -70°С в 7% ДМСО фильтры можно скринировать много раз со многими зондами и извлекать соответствующие клоны после нескольких лет хранения.
Используемый здесь термин "ген" относится к последовательности ДНК, включающей:
(1) регуляторные сигналы в обратном направлении (5'), в том числе промотор;
(2) кодирующую область, определяющую продукт, белок или РНК гена;
(3) области в прямом направлении (3'), в том числе сигналы транскрипции, терминации и полиаде-нилирования;
(4) ассоциированные последовательности, необходимые для эффективной и специфичной экспрессии. Последовательность ДНК настоящего изобретения может состоять, по существу, из полученной
здесь последовательности (последовательность № 1) или эквивалентных нуклеотидных последовательностей, представляющих аллели или полиморфные варианты этих генов, или их кодирующих областей.
Использование фразы "значительное подобие последовательностей" в настоящем описании и в формуле изобретения означает, что последовательности ДНК, РНК или аминокислотные последовательности, в которых есть незначительные и не имеющие значения отклонения последовательностей от фактических последовательностей, описанных и заявленных здесь, рассматриваются как эквивалентные последовательностям настоящего изобретения. С этой точки зрения фраза "незначительные и не имеющие значения отклонения последовательностей" означает, что "подобные" последовательности (т.е. последовательности, в которых имеется значительное подобие последовательностей с ДНК, РНК или белками, описываемыми и рассматриваемыми здесь) будут функционально эквивалентны последовательностям, описанным и заявленным в настоящем изобретении. Функционально эквивалентные последовательности будут функционировать, по существу, одинаково, с образованием, по существу, таких же композиций, что композиции нуклеиновых кислот и аминокислот, описанные и заявленные здесь.
Описанные здесь последовательности ДНК можно трансформировать во многие клетки-хозяева. Многие подходящие клетки-хозяева с нужными свойствами в отношении роста и обработки легко доступны в технике.
Использование фразы "выделенный" или "по существу, чистый" в настоящем описании и формуле изобретения в отношении модификатора ДНК, РНК, полипептидов или белков, означает, что ДНК, РНК, полипептиды или белки с таким определением выделены из своей in vivo клеточной окружающей среды посредством приложения усилий человека.
- 6 -
009898
Используемые здесь выражения "нативная последовательность ДНК" или "природная последовательность ДНК" относятся к последовательности ДНК, которую можно выделить из нетрансгенных клеток или ткани. Нативные последовательности ДНК представляют собой последовательности, которые не изменены искусственно, например путем сайтнаправленного мутагенеза. Когда нативные последовательности ДНК идентифицированы, молекулы ДНК с нативными последовательностями ДНК можно синтезировать химически или получить с использованием известных в технике процедур с рекомбинант-ными ДНК. Используемая здесь нативная последовательность ДНК растения является последовательностью, которую можно выделить из нетрансгенных растительных клеток или ткани. Используемая здесь нативная последовательность ДНК табака является последовательностью, которую можно выделить из нетрансгенных клеток или ткани табака.
ДНК-конструкции или "транскрипционные кассеты" настоящего изобретения включают в направлении транскрипции 5'-3' промотор, описанный здесь, описанную здесь последовательность ДНК, функционально связанную с промотором, и, необязательно, последовательность терминации, включающую стоп-сигнал для РНК-полимеразы и сигнал полиаденилирования для полиаденилазы. Все эти регулятор-ные области должны быть способны работать в клетках трансформируемой ткани. Любой подходящий сигнал терминации может быть использован при осуществлении настоящего изобретения, причем его примерами являются, но не ограничиваются перечисленным, терминатор нопалин-синтаза (nos), терминатор октапин-синтаза (osc), терминатор CaMV или нативные сигналы терминации, полученные от того же гена, что и область инициации транскрипции, или полученные от другого гена. См., например, Rezian et al. (1988) или Rodermel et al. (1988).
Используемый здесь термин "функционально связанные" относится к последовательностям ДНК в молекуле отдельной ДНК, которые связаны таким образом, что функция одной влияет на функцию другой. Таким образом, промотор является функционально связанным с ДНК, когда он способен воздействовать на транскрипцию этой ДНК (т. е. ДНК находится под транскрипционным контролем промотора). Говорят, что промотор находится "в обратном направлении" от ДНК, о которой, в свою очередь, говорят, что она находится "в прямом направлении" от промотора.
Транскрипционная кассета может быть представлена в ДНК-конструкции, которая также имеет по меньшей мере одну репликационную систему. Для удобства обычно получают репликационную систему, функциональную в Escherichia coli, такую как ColE1, pSC101, pACYC184, или подобную систему. При этом на каждой стадии после каждой манипуляции полученную конструкцию можно клонировать, сек-венировать и определить правильность манипуляции. Кроме того, вместо репликационной системы Escherichia coli можно использовать широкий ряд хозяев репликационной системы, таких как реплика-ционные системы несовместимых плазмид P-1, например pRK290. B дополнение к репликационной системе часто будет присутствовать по меньшей мере один маркер, который может быть полезным в одном или нескольких хозяевах, или разные маркеры для отдельных хозяев. Иными словами, можно использовать один маркер для селекции в прокариотном хозяине, в то время как другой маркер можно использовать для селекции в эукариотном хозяине, в частности в хозяине-растении. Маркеры могут быть защитой от биоцидов, таких как антибиотики, токсины, тяжелые металлы или подобные; могут обеспечивать комплементацию путем придания прототрофности ауксотрофному хозяину или могут давать видимый фенотип через продуцирование нового соединения в растении.
Различные фрагменты, содержащие различные конструкции - транскрипционные кассеты, маркеры и подобное, можно ввести последовательно с помощью расщепления рестрикционными ферментами соответствующей репликационной системы и вставки определенной конструкции или фрагмента в доступный сайт.
После лигирования и клонирования ДНК-конструкцию можно выделить для дальнейших действий. Примеры всех эти методов широко представлены в литературе, например в работе J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Векторы, которые можно использовать для трансформации растительной ткани нуклеотидными конструкциями настоящего изобретения, включают как векторы Agrobacterium, так и баллистические векторы, а также векторы, пригодные для опосредованной ДНК трансформации.
Термин "промотор" относится к области последовательности ДНК, которая включает необходимые сигналы для эффективной экспрессии кодирующей последовательности. Промотор может включать последовательности, с которыми связывается PHK-полимераза, но не ограничивается такими последовательностями, и может включать области, с которыми связываются другие регуляторные белки, вместе с областями, участвующими в контроле трансляции белка, и может включать кодирующие последовательности.
Промоторы, используемые при осуществлении настоящего изобретения, могут быть конститутивно активными промоторами. Доступны многие конститутивно активные промоторы, функционирующие в растениях. Предпочтительным примером является промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), который экспрессируется конститутивно в большинстве растительных тканей. С другой стороны, промотор может быть специфическим для корней промотором или промотором, специфическим для кортекса корней, что подробнее поясняется ниже.
- 7 -
009898
Антисмысловые последовательности экспрессируются в трансгенных растениях табака с использованием промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV). См., например, e.g., Cornelissen et al. "Both RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco", Nucleic Acids Res. 17, p. 833-43 (1989); Rezaian et al. "Anti-Sense RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus", Plant Molecular Biology 11, p. 463-71 (1988); Rodermel et al. "Nuclear-Organelle Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell 55, p. 673-81 (1988); Smith et al. "Antisense RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic Tomatoes", Nature 334, p. 724-26 (1988); Van der Krol et al. "An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature 333,
p. 866-69 (1988).
Для экспрессии ХФРТазы в трансформированных клетках и растениях табака данного изобретения предпочтительно применение промотора 35S CaMV. Подробно описано применение промотора CaMV для экспрессии других рекомбинантных генов в корнях табака (Lam et al. "Site-Specific Mutations Alter In Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants", Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, p. 7890-94 (1989); Poulsen et al. "Dissection of 5' Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8B Gene", Mol. Gen. Genet., 214, p. 16-23 (1988)).
Другие промоторы, активные только в тканях корней (специфические для корней промоторы) также, в частности, подходят для способов настоящего изобретения. См., например, патент США № 5459252, Conkling et al.; Yamamoto et al. The Plant Cell, 3:371 (1991). Также используется промотор, специфический для кортекса корней. См., например, заявку на патент США, per. № 08/508786, Conklinq et al., теперь принятую на рассмотрение; PCT WO 9705261. Все цитированные здесь патенты включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Молекулы рекомбинантной ДНК ХФРТазы и векторы, используемые для получения трансформированных клеток и растений табака данного изобретения, также могут содержать доминантный селектируемый ген-маркер. Подходящие для применения в табаке доминантные селектируемые гены-маркеры включают, среди прочих, гены устойчивости к антибиотикам, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу (NPTII), гидромицин-фосфотрансферазу (HPT) и хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT). Другим хорошо известным доминантным селектируемым геном-маркером, подходящим для применения в табаке, является мутантный ген дигидрофолат-редуктазы, который кодирует устойчивую к метотрексату дигид-рофолат-редуктазу. Векторы ДНК, содержащие подходящие гены устойчивости к антибиотикам, и соответствующие антибиотики являются коммерчески доступными.
Трансформированные клетки табака отбирают из ближайшей популяции нетрансформированных клеток, помещая смешанную популяцию клеток в культуральную среду, содержащую соответствующую концентрацию антибиотика (или другого соединения, естественно токсичного для клеток табака), устойчивость против которого придает продукт выбранного селектируемого гена-маркера. Таким образом, только эти трансформированные клетки табака будут выживать и размножаться.
Способы получения рекомбинантных растений настоящего изобретения, вообще, включают, во-первых, предоставление растительной клетки, способной к регенерации (причем растительная клетка, как правило, находится в ткани, способной к регенерации). Затем растительную клетку трансформируют ДНК-конструкцией, содержащей транскрипционную кассету настоящего изобретения (описанную здесь), и из трансформированной растительной клетки регенерируют рекомбинантное растение. Как поясняется ниже, стадию трансформации осуществляют методами, известными в технике, включая, но не ограничиваясь перечисленным, бомбардировку растительной клетки микрочастицами, несущими транскрипционную кассету, инфицирование клетки Agrobacterium tumefaciences, содержащим Ti-плазмиду, несущую транскрипционную кассету, или любым другим методом, подходящим для получения трансгенного растения.
Известны многие векторные системы Agrobacterium, полезные при осуществлении настоящего изобретения. Например, в патенте США № 4459355 описывается способ трансформации восприимчивых растений, включая двудольные, штаммом Agrobacterium, содержащим Ti-плазмиду. Трансформация древесных растений вектором Agrobacterium описывается в патенте США № 4795855. Кроме того, в патенте США № 4940838, Schilperoort et al. описывается бинарный вектор Agrobacterium (т.е. вектор, в котором Agrobacterium содержит одну плазмиду, имеющую vir-область Ti-плазмиды, но не T-область, и вторую плазмиду, имеющую Т-область, но не vir-область), полезный при осуществлении настоящего изобретения.
Микрочастицы, несущие ДНК-конструкцию настоящего изобретения, подходящие для баллистической трансформации растительной клетки, также полезны для получения трансформированных растений настоящего изобретения.
Микрочастица продвигается в растительную клетку для получения трансформированной растительной клетки, из которой восстанавливают растение. В практике настоящего изобретения можно использовать любую подходящую методологию баллистической трансформации клетки и аппаратуру для ее осуществления. Примеры аппаратуры и процедур описываются в патентах США № 4945050, Sanford and Wolf и № 5015580, Christou et al. При использовании процедур баллистической трансформации транскрипционная кассета может быть введена в плазмиду, способную к репликации или интеграции в трансформируемую клетку. Примерами микрочастиц, пригодных для применения в таких системах, яв
- 8 -
009898
ляются 1-5-микронные золотые шарики. ДНК-конструкцию можно осадить на микрочастицу любым подходящим способом, например путем преципитации.
Вид растения можно трансформировать ДНК-конструкцией настоящего изобретения путем опосредованной ДНК трансформации протопластов растительной клетки и последующей регенерации растения из трансформированных протопластов в соответствии с процедурами, хорошо известными в технике. Слияние протопластов табака с помощью содержащих ДНК липосом или посредством электропорации известно в технике. (Shillito et al. "Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyle-donous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation", Methods in Enzymoloqy, 153, p. 313-36
(1987)).
Здесь трансформация представляет введение экзогенной ДНК в клетки с тем, чтобы получить трансгенные клетки, устойчиво трансформированные экзогенной ДНК.
Трансформированные клетки индуцируют для регенерации интактных растений табака посредством применения к культуре клеток и ткани табака методов, хорошо известных в технике. Способ регенерации растения выбирают таким образом, чтобы он был совместим со способом трансформации. Устойчивое присутствие и ориентацию последовательности ХФРТазы в трансгенных растениях табака можно проверить с помощью менделирующей наследственности последовательности ХФРТазы, которая обнаруживается стандартными методами анализа ДНК, применяемыми к потомству, получаемому при контрольных скрещиваниях. После регенерации трансгенных растений табака из трансформированных клеток введенная последовательность ДНК легко переносится в другие сорта табака обычными методами выращивания растений и без чрезмерного экспериментирования.
Например, для того чтобы проанализировать расщепление трансгена, можно вырастить регенерированные трансформированные растения (R0) до зрелости, проверить на содержание никотина и размножить инбридингом для получения растений R1. Процент растений R1, содержащих трансген, составляет гомозиготы для трансгена. Для идентификации гомозиготных растений R1 трансгенные растения R1 выращивают до зрелости и размножают инбридингом. Гомозиготные растения R1 будут давать потомство R2, где каждое растение-потомок несет трансген; потомство гетерозиготных растений R1 будет расщепляться 3:1.
Никотин служит в качестве природного пестицида, который помогает защитить растения табака от повреждения вредителями. Поэтому также может оказаться желательной дополнительная трансформация полученных данными способами растений с низким содержанием никотина, или не содержащих никотин, трансгеном (таким как Bacillus thurigiensis), что будет создавать дополнительную защиту от насекомых.
Предпочтительным растением для применения в способах настоящего изобретения является вид Nicotiana или табак, в том числе N. tabacum, N. rustica и N. glutinosa. Можно использовать любой штамм или сорт табака. Предпочтительны штаммы, в которых содержание никотина уже низкое, такие как двойные мутанты Nic1/Nic2.
Любую растительную ткань, способную к последующему размножению клона путем органогенеза или эмбриогенеза, можно трансформировать вектором настоящего изобретения.
Используемый здесь термин "органогенез" означает процесс, по которому из меристиматического центра последовательно развиваются побеги и корни; используемый здесь термин "эмбриогенез" означает процесс, по которому побеги и корни развиваются вместе, согласованно (не последовательно), из соматических клеток или из гамет. Конкретная выбранная ткань будет меняться в зависимости от систем размножения клонов, доступных и наиболее подходящих для конкретного трансформируемого вида. Примерами тканей-мишеней являются листовые диски, пыльца, зародыши, семядоли, гипокотили, ткань каллюса, имеющаяся метистиматическая ткань (например, верхушечные меристемы, пазушные почки и корневые меристемы) и индуцированная меристематическая ткань (например, меристема семядоли и гипокотильная метистема).
Растения настоящего изобретения могут принимать множество форм. Растения могут представлять собой химеры трансформированных и нетрансформированных клеток; могут быть клональными трансформантами (например, все трансформированные клетки содержат транскрипционную кассету); могут содержать привитые части трансформированных и нетрансформированных тканей (например, трансформированный корневой побег, привитый на нетрансформированный привой вида цитрусового растения). Трансформированные растения можно размножать многими способами, такими как размножение клона или классические методы выращивания. Например, первую генерацию (или T1) трансформированных растений можно вырастить инбриндингом и получить гомозиготную вторую генерацию (или Т2) трансформированных растений, а затем растения Т2 размножать классическими методами выращивания. Для облегчения выращивания транскрипционную кассету можно соединить с доминантным селектируемым маркером (таким как nptII).
В свете вышеуказанного очевидно, что растения, которые можно использовать при практическом применении настоящего изобретения, включают растения рода Nicotiana.
Специалистам, знакомым с методами рекомбинантных ДНК, описанными выше, будет понятно, что для создания трансгенных клеток и растений табака можно использовать полноразмерную молекулу кДНК ХФРТазы или полноразмерный хромосомный ген ХФРТазы, присоединенный в смысловой ориен
- 9 -
009898
тации, с соответствующими функционально соединенными регуляторными последовательностями. (Специалистам в этой области техники также будет понятно, что соответствующие регуляторные последовательности для экспрессии генов в смысловой ориентации включают любую из известных эукариотных последовательностей начала трансляции, в дополнение к промотору и последовательностям терминации полиаденилирования транскрипции, описанным выше.) Такие трансформированные растения табака характеризуются повышенным содержанием ХФРТазы и, таким образом, более высоким содержанием никотина, чем нетрансформированные контрольные растения табака.
Следовательно, следует иметь в виду, что использование последовательностей ДНК ХФРТазы для снижения или повышения содержания ХФРТ-фермента и, посредством этого, для снижения или повышения содержания никотина в растениях табака входит в объем настоящего изобретения.
Используемый здесь термин "культура" включает множество растений настоящего изобретения и одного и того же рода, выращенных вместе на участке для агрокультуры. Под "участком для агрокультуры" подразумевается обычная делянка или теплица.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения культуры растений с измененной активностью ХФРТазы и, следовательно, с повышенным или пониженным содержанием никотина по сравнению с подобной культурой нетрансформированных растений того же вида и сорта.
Приведенные далее примеры даются для пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как его ограничение.
Пример 1.
Выделение и секвенирование.
Здесь как последовательность № 1 представлена установленная последовательность кДНК TobRD2 (Conkling et al., Plant Phys., 93, 1203, 1990), а расшифрованная аминокислотная последовательность представлена как последовательность № 2. Было предсказано, что расшифрованная аминокислотная последовательность представляет собой цитозолевый белок. Хотя гены растительной ХФРТазы не описаны, сравнение аминокислотной последовательности NtQPTI с базой данных банка генов (фиг. 3) показывает ограниченное подобие последовательностей с определенными бактериальными и другими белками; активность хинолятфосфорибозил-трансферазы (ХФРТазы) показана в случае генов S. typhimurium, E. coli и N. tabacum. Кодированная NtQPTI ХФРТаза имеет подобие с расшифрованным пептидным фрагментом, кодированным последовательностью EST (метка экспрессионной последовательности) Arabi-dopsis (инвентарный номер банка генов F20096), который может представлять часть гена ХФРТазы Arabidopsis.
Пример 2.
Гибридизация in situ.
Для того чтобы определить пространственное распределение транскрипта мРНК TobRD2 в различных тканях корня, осуществляют гибридизацию in situ в нетрансформированных растениях. Гибридизацию in situ антисмысловой цепи TobRD2 с мРНК TobRD2 в ткани корня проводят с использованием методов, описанных в Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep., 5, 242 (1987) и в Smith et al. Plant Mol. Biol. Rep., 5, 237 (1987). Корни семидневных всходов табака (Nicotiana tabacum) фиксируют в забуференном фосфатом глутаральдегиде, заливают парапластом-плюс (Monoject Inc., Сент-Луис, Миссури) и делают срезы толщиной 8 мм, чтобы получить поперечные срезы, а также продольные срезы. Антисмысловые транскрипты TobRD2, синтезированные in vitro в присутствии 35S-ATP, используют в качестве зондов. Меченную РНК перед применением гидролизуют путем обработки щелочью и получают среднюю длину в 100-200 оснований.
Гибридизацию проводят в 50% формамиде в течение 16 ч при 42°C с меченной РНК с числом импульсов в минуту (чим) приблизительно 5х106 на 1 мл раствора для гибридизации. После выдержки предметные стекла проявляют и рассматривают в светлом и темном поле микроскопа.
Сигнал гибридизации локализуется в кортикальном слое клеток в корнях (результаты не приводятся). Сравнение изображений одних и тех же срезов как в светлом, так и в темном поле показывает локализацию транскриптов TobRD2 в паренхиматозных клетках кортикального слоя корней. Сигнал гибридизации в эпидермисе или стеле не обнаруживается.
Пример 3.
Содержание мРНК TobRD2 в мутантах табака Nic1 и Nic2 и корреляция с содержанием никотина.
Проверяют стационарное содержание мРНК TobRD2 в мутантах растений табака Nic1 и Nic2. Известно, что Nic1 и Nic2 регулируют активность хинолятфосфорибозил-трансферазы и активность пут-ресценс-метилтрансферазы и являются кодоминантными регуляторами продуцирования никотина.
Полученные результаты приводятся на фиг. 5 и показывают, что экспрессия TobRD2 регулируется
Nic1 и Nic2.
Выделяют РНК из корней растений табака Burley 21 дикого типа (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); корней Nic1- Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); корней Nic2- Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2) и корней Nic1-Nic2-Burley 21 (nic1/nic1 nic2/nic2).
Четыре линии табака Burley 21 (nic) выращивают из семян в почве в течение месяца и на один месяц переносят в камеры для гидропоники в аэрированный питательный раствор в теплице. Эти линии
- 10 -
009898
являются изогенными, за исключением двух локусов с низким содержанием никотина, и имеют генотипы
Nic1/Nic1 Nic2/Nic2, Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2.
Корни собирают у примерно 20 растений для каждого генотипа и объединяют для выделения РНК. Полную РНК (1 мкг) от каждого генотипа подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем 1,1 M формальдегида, и переносят на нейлоновую мембрану в соответствии с Sambrook et al. (1989). Мембраны гибридизируют с фрагментами меченной 32P кДНК TobRD2. Относительную плотность транс-криптов TobRD2 измеряют посредством денситометрии. Фиг. 5 показывает относительное содержание транскриптов (по сравнению с Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) для каждого из четырех генотипов. Относительное содержание никотина (по сравнению с Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) в четырех генотипах показано заштрихованными прямоугольниками.
На фиг. 5 дается графическое сравнение относительного стационарного содержания мРНК TobRD2 с использованием содержания, обнаруженного в Burley 21 дикого типа (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2), в качестве ссылочного количества. Содержание мРНК TobRD2 в двойных мутантах Nic1/Nic2 составляет приблизительно 25% от содержания в табаке дикого типа. На фиг. 5 также сравнивается относительное содержание никотина в почти изогенных линиях табака, исследуемых в этом примере (темные прямоугольники показывают содержание транскрипта TobRD2; заштрихованные прямоугольники показывают содержание никотина). Существует тесная корреляция между содержанием никотина и содержанием транскрипта TobRD2.
Пример 4.
Влияние прищипки верхушек на содержание мРНК TobRD2.
В технике хорошо известно, что удаление цветочной головки растения табака (прищипка верхушки) усиливает рост корней и повышает содержание никотина в листьях растения. Прищипка верхушки растения является обычной практикой при выращивании табака, и специалист в этой области техники может легко определить оптимальное время для прищипки верхушки данного растения табака при известном наборе условий.
Растения табака (N. tabacum SR1) в течение месяца выращивают из семян в почве и переносят в горшки, содержащие песчаную почву. Растения еще в течение двух месяцев выращивают в теплице до тех пор, пока они не начинают образовывать цветки. Затем у четырех растений удаляют цветочные головки и два узла (прищипка верхушек). Через определенное время часть корней от каждого растения собирают и объединяют для экстракции РНК. Контрольные растения не прищипывают. Полную РНК (1 мкг) на каждый момент времени подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем 1,1 M формальдегида, и переносят на нейлоновую мембрану в соответствии с Sambrook et al. (1989). Мембраны гибридизируют с фрагментами меченной 32P кДНК TobRD2. Относительную плотность транскриптов измеряют посредством денситометрии. Фиг. 6 иллюстрирует относительное содержание транскрипта (по сравнению со временем ноль) для каждого отмеченного времени при прищипке верхушек (темные прямоугольники) и без прищипки (заштрихованные прямоугольники).
Относительное содержание TobRD2 в ткани корней определяют через 24 ч; результаты приводятся на фиг. 6 (темные прямоугольники показывают содержание транскрипта TobRD2 в прищипанных растениях; заштрихованные прямоугольники показывают содержание транскрипта TobRD2 в неприщипанных контрольных растениях). В течение 6 ч после прищипки верхушек растений табака содержание мРНК TobRD2 в прищипанных растениях возрастает приблизительно в 8 раз; в контрольных растениях за это же время возрастания не наблюдается.
Пример 5.
Комплементация бактериального мутанта, лишенного ХФРТазы с ДНК последовательности № 1.
Штамм Escherichia coli TH265 является мутантом, лишенным хинолятфосфорибозил-трансферазы (nadC-), и поэтому не может расти на среде, лишенной никотиновой кислоты.
Клетки ТН265 трансформируют экспрессионным вектором (pWS161), содержащим ДНК последовательности № 1, или трансформируют только экспрессионным вектором (pKK233). Рост трансформированных бактерий сравнивают с ростом трансформантов ТН265 (pKK233) и с ростом нетрансформиро-ванного мутанта ТН265 nadC-. Рост сравнивают на минимальной среде ME (лишенной никотиновой кислоты) и на минимальной среде ME с добавлением никотиновой кислоты.
Штамм Е. coli с мутацией ХФРТазы (nadC) TH265 любезно предоставлен д-ром K.T. Hughes (Hughes et al. J. Bact., 175:479, 1993). Клетки хранятся на среде LB, а компетентные клетки получают так, как описано в Sambrook et al. (1989). Экспрессионную плазмиду создают в pKK2233 (Brosius, 1984) с кДНК TobRD2, клонированной под контролем Тас-промотора. Полученную плазмиду pWS161 трансформируют в клетки ТН265. Затем трансформированные клетки высевают на агаровые пластины в минимальную среду (Vogel and Bonner, 1956) без никотиновой кислоты или с добавлением никотиновой кислоты (0,0002%). На подобные пластины для использования в качестве контроля высевают одни клетки ТН265 и клетки ТН265, трансформированные pKK2233.
Результаты приводятся на фиг. 4. Только клетки ТН265, трансформированные ДНК последовательности № 1, растут на среде, лишенной никотиновой кислоты. Эти результаты показывают, что экспрессия ДНК последовательности № 1 в бактериальных клетках ТН265 придает этим клеткам фенотип
- 11 -
009898
NadC+, что подтверждает, что эта последовательность кодирует ХФРТазу. Поэтому название TobRD2 заменяют на NtQPTI. Пример 6.
Трансформация растений табака.
ДНК последовательности № 1 в антисмысловой ориентации функционально связана с растительным промотором (35S CaMV или специфическим для кортекса корней промотором TobRD2), и получают две различные ДНК-кассеты: промотор CaMV353/антисмысловая последовательность № 1 и промотор TobRD2/антисмысловая последовательность № 1.
Отбирают для трансформации линию табака дикого типа и линию табака с низким содержанием никотина, например, табак дикого типа Burley 21 (Nic1+/Nic2+) и гомозиготный Burley 21 nic1-/nic2-. Трансформируют много клеток растений табака от каждой линии с использованием каждой содержащей ДНК кассеты. Трансформацию проводят с использованием вектора Agrobacterium, например, бинарного вектора Agrobacterium, несущего Ti-пограничные последовательности и ген nptII (придающий устойчивость к канамицину и под контролем nos-промотора (nptII)).
Трансформированные клетки отбирают и регенерируют в трансгенные растения табака (R0). Растения R0 выращивают до зрелости и проверяют на содержание никотина; подгруппа трансформированных растений табака обнаруживает существенно сниженное содержание никотина по сравнению с нетранс-формированными контрольными растениями.
Затем растения R0 размножают инбриндингом, и анализируют расщепление трансгена в потомстве R1. Потомство R1 выращивают до зрелости и размножают инбриндингом; расщепление трансгена в потомстве R2 указывает, что растения R1 являются гомозиготными.
- 12 -
009898
Список последовательностей
(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ
(I) ЗАЯВИТЕЛЬ: Conkling, Mark А.
Mendu, Nadihi Song, Wen
(II) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Регуляция экспрессии
хинолятфосфорибозил-трансферазы
(III) ЧИСЛО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 4
(IV) АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:
(A) АДРЕСАТ: Kenneth Sibley, Bell Seltzer Park
& Gibson
(Б) УЛИЦА: Post Office Drawer 34009
(B) ГОРОД: Charlotte
(Г) ШТАТ: Северная Каролина (Д) СТРАНА: США (Е) ZIP: 28234
(V) ФОРМА КОМПЬЮТЕРНОГО СЧИТЫВАНИЯ:
(A) ТИП СРЕДЫ: дискета
(Б) КОМПЬЮТЕР: совместимый с системой IBM PC
(B) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (Г) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Patent-In
Realease #1.0, версия #1.30
(VI) СВЕДЕНИЯ О ТЕКУЩЕЙ ЗАЯВКЕ:
(A) НОМЕР ЗАЯВКИ:
(B) ДАТА РЕГИСТРАЦИИ:
- 13 -
009898
(В) КЛАССИФИКАЦИЯ:
(VIII) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ:
(A) ИМЯ: Sibley, Kenneth D.
(Б) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: 31665
(B) НОМЕР ДЕЛА/РЕЕСТРА: 5051-338Р
(IX) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (А) ТЕЛЕФОН: 919-420-2200
(Б) ТЕЛЕФАКС: 919-881-3175 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 1
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 1399 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота
(B) ЧИСЛО ЦЕПОЧЕК: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК (IX) ПРИЗНАК:
(А) ИМЯ/КЛЮЧ: CDS (Б) ЛОКАЦИЯ: 52..1104 (XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 1
57 105 153 201 249 297 345 393 441 489 537 585
- 14 -
САААААСТАТ ТГТССАСААА АТТСАТТТСА СААССССССС АААААААААС С ATG ТТТ
Met Phe 1
AGA GCT ATT CCT TTC ACT GCT АСА GTG CAT CCT TAT GCA ATT АСА GCT Arg Ala He Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala He Thr Ala 5 10 15
CCA AGG TTG GTG GTG AAA ATG TCA GCA ATA GCC ACC AAG AAT АСА AGA Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala lie Ala Thr Lys Asn Thr Arg 20 25 30
GTG GAG TCA TTA GAG GTG AAA CCA CCA GCA CAC CCA ACT TAT GAT TTA Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr Asp Leu 35 40 45 50
AAG GAA GTT ATG AAA CTT GCA CTC TCT GAA GAT GCT GGG AAT TTA GGA Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu-Asp Ala Gly Asn Leu Gly 55 60 65
GAT GTG ACT TGT AAG GCG АСА ATT CCT' CTT GAT ATG GAA TCC GAT GCT Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr He Pro Leu-Asp Met Glu Ser Asp Ala 70 75 80
CAT ТТТ СТА GCA AAG GAA GAC GGG АТС ATA GCA GGA ATT GCA CTT GCT His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly He He Ala Gly He Ala Leu Ala 85 90 95
GAG ATG ATA TTC GCG GAA GTT GAT CCT TCA TTA AAG GTG GAG TGG TAT Glu Met He Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu Trp Tyr 100 105 110
GTA AAT GAT GGC GAT AAA GTT CAT AAA GGC TTG AAA TTT GGC AAA GTA Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly Lys Val 115 120 125 130
CAA GGA AAC GCT TAC AAC ATT GTT ATA GCT GAG AGG GTT GTT CTC AAT Gin Gly Asn Ala Tyr Asn lie Val lie Ala Glu Arg Val Val Leu Asn 135 140 145
TTT ATG CAA AGA ATG AGT. GGA ATA GCT АСА СТА ACT AAG GAA ATG GCA Phe Met Gin Arg Met Ser Gly He Ala Thr Leu Thr Lys Glu Met Ala 150 155 160
GAT GCT GCA CAC CCT GCT TAC АТС TTG GAG ACT AGG AAA ACT GCT CCT Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr He Leu Glu Thr Arg Lys Thr Ala Pro 165 170 175
009898
GGA TTA CGT TTG GTG GAT AAA TGG GCG GTA TTG АТС GGT GGG GGG AAG 633 Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu He Gly Gly Gly Lys 180 185 190
AAT CAC AGA ATG GGC TTA TTT GAT ATG GTA ATG ATA AAA GAC AAT CAC 681 Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met He Lys Asp Asn His -195 200 205 210
ATA TCT GCT GCT GGA GGT GTC GGC AAA GCT СТА AAA TCT GTG GAT CAG 729 He Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val Asp Gin 215 220 225
TAT TTG GAG CAA AAT AAA CTT CAA ATA GGG GTT GAG GTT GAA ACC AGG 777 Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin He Gly Val Glu Val Glu Thr Arg 230 235 240
АСА ATT GAA GAA GTA CGT GAG GTT СТА GAC TAT GCA TCT CAA АСА AAG 825 Thr He Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin Thr Lys 245 250 255
ACT TCG TTG ACT AGG ATA ATG CTG GAC AAT ATG GTT GTT CCA TTA TCT 873 Thr Ser Leu Thr Arg He Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro Leu Ser 260 265 270
AAC GGA GAT ATT GAT GTA TCC ATG CTT AAG GAG GCT GTA GAA TTG АТС 921 Asn Gly Asp He Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu Leu He 275 280 285 290
AAT GGG AGG TTT GAT ACG GAG GCT TCA GGA AAT GTT ACC CTT GAA АСА 969 Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu Glu Thr 295 300 305
GTA CAC AAG ATT GGA CAA ACT GGT GTT ACC TAC ATT TCT AGT GGT GCC 1017 Val His Lys He Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr He Ser Ser Gly Ala 310 315 320
CTG ACG CAT TCC GTG AAA GCA CTT GAC ATT TCC CTG AAG АТС GAT АСА 1065 Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp He Ser Leu Lys He Asp Thr 325 330 335
GAG CTC GCC CTT GAA GTT GGA AGG CGT АСА AAA CGA GCA TGAGCGCCAT 1114 Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala 340 345 350
TACTTCTGCT ATAGGGTTGG AGTAAAAGCA GCTGAATAGC TGAAAGGTGC AAATAAGAAT 1174
CATTTTACTA GTTGTCAAAC AAAAGATCCT TCACTGTGTA ATCAAACAAA AAGATGTAAA 1234
TTGCTGGAAT ATCTCAGATG GCTCTTTTCC AACCTTATTG CTTGAGTTGG TAATTTCATT 1294
ATAGCTTTGT TTTCATGTTT CATGGAATTT GTTACAATGA AAATACTTGA TTTATAAGTT 1354
TGGTGTATGT AAAATTCTGT GTTACTTCAA ATATnTGAG ATGTT 1399
- 15 -
009898
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 2
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(А) ДЛИНА: 351 аминокислота (Б) ТИП: аминокислота (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок ¦
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 2
Met Phe Arg Ala He Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala He 1 5 10 15
Thr .Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala He Ala Thr Lys Asn 20 25 30
Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr 35 40 45
Asp Leu Lys Glu Val Met Lys Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn 50 55 60
Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr He Bpe- Leu Asp Met Glu Ser 65 70 75 80
Asp Ala His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly He He Ala Gly He Ala 85 90 95
Leu Ala Glu Met He Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu 100 105 110
Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly 115 120 125
Lys Val Gin Gly Asn Ala Tyr Asn He Val He Ala Glu Arg Val Val 130 135 140
Leu Asn Phe Met Gin Arg Met Ser Gly He Ala Thr Leu Thr Lys Glu 145 150 155 160
Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr He Leu Glu Thr Arg Lys Thr 165 170 ¦ 175
Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu He Gly Gly 180 185 190
Gly Lys Asn His Arg Met'Gly Leu Phe Asp Met Val Met He Lys Asp 195 200 205
Asn His He Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val 210 215 220
Asp Gin Tyr Leu Glu Gin Asn Lys Leu Gin He Gly Val Glu Val Glu 225 230 235 240
- 16 -
009898
Thr Arg Thr He Glu Glu Val Arg Glu Val Leu Asp Tyr Ala Ser Gin 245 250 255
Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg He Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro 260 265 270
Leu Ser Asn Gly Asp He Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu 275 280 285
Leu He Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu 290 295 300
Glu Thr Val His Lys He Gly Gin Thr Gly Val Thr Tyr He Ser Ser 305 310 315 320
Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp He Ser Leu Lys He 325 330 335
Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala 340 345 350
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕД. № 3
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 1053 пар оснований (Б) ТИП: нуклеиновая кислота
(B) ЧИСЛО ЦЕПОЧЕК: одноцепочечная (Г) ТОПОЛОПИЯ: линейная
(II) ТИП МОЛЕКУЛЫ: кДНК
(XI) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ПОСЛЕД. № 3
ATGTTTAGAG СТАТТССТТТ CACTGCTACA GTGCATCCTT ATGCAATTAC AGCTCCAAGG 60
TTGGTGGTGA AAATGTCAGC AATAGCCACC AAGAATACAA GAGTGGAGTC ATTAGAGGTG 120
AAACCACCAG САСАСССААС TTATGATTTA AAGGAAGTTA TGAAACTTGC ACTCTCTGAA 180
GATGCTGGGA ATTTAGGAGA TGTGACTTGT AAGGCGACAA TTCCTCTTGA TATGG1AATCC 240
GATGCTCATT TTCTAGCAAA GGAAGACGGG ATCATAGCAG GAATTGCACT TGCTGAGATG 300
ATATTCGCGG AAGTTGATCC TTCATTAAAG GTGGAGTGGT ATGTAAATGA TGGCGATAAA 360
GTTCATAAAG .GCTTGAAATT TGGCAAAGTA CAAGGAAACG СТТАСААСАТ TGTTATAGCT 420
GAGAGGGTTG ТТСТСААТТТ TATGCAAAGA ATGAGTGGAA TAGCTACACT AACTAAGGAA 480
ATGGCAGATG CTGCACACCC TGCTTACATC TTGGAGACTA GGAAAACTGC TCCTG6ATTA 540
CGTTTGGTGG ATAAATGGGC GGTATTGATC GGTGGGGGGA AGAATCACAG AATGGGCTTA 600
TTTGATATGG TAATGATAAA AGACAATCAC ATATCTGCTG CTGGAGGTGT CGGCAAAGCT 660
CTAAAATCTG TGGATCAGTA TTTGGAGCAA ААТАААСТТС AAATAGGGGT TGAGGTTGAA 720
ACCAGGACAA TTGAAGAAGT ACGTGAGGTT CTAGACTATG САТСТСАААС AAAGACTTCG 780
TTGACTAGGA TAATGCTGGA CAATATGGTT GTTCCATTAT CTAACGGAGA TATTGATGTA 840
TCCATGCTTA AGGAGGCTGT AGAATTGATC AATGGGAGGT TTGATACGGA GGCTTCAGGA 900
AATGTTACCC TTGAAACAGT ACACAAGATT GGACAAACTG GTGTTACCTA CATTTCTAGT 960
GGTGCCCTGA CGCATTCCGT GAAAGCACTT GACATTTCCC TGAAGATCGA TACAGAGCTC 1020
GCCCTTGAAG TTGGAAGGCG TACAAAACGA GCA 1053
- 17 -
009898
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения трансгенных растительных клеток с повышенной продукцией хинолятфосфо-рибозил-трансферазы (ХФРТазы), включающий трансформацию растительных клеток, способных экс-прессировать ХФРТазу экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, и где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированными растительными клетками.
2. Способ по п.1, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.
3. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является конститутивно активным.
4. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
5. Способ по п.1 или 2, где указанный промотор является избирательно активным в клетках коры корней растения.
6. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.
7. Способ по любому из пп.1-5, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.
8. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.1-7.
9. Способ по п.8, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.
10. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.9.
11. Способ повышения продукции ХФРТазы в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных клетках растения.
12. Способ по п.11, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.
13. Способ по п.11 или 12, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:
а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;
б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором;
в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.
14. Способ по п.13, где указанный промотор является конститутивно активным.
15. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
16. Способ по п.13, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.
17. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией ХФРТазы, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.11-16.
18. Способ по п.17, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.
19. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.18.
20. Способ получения трансформированных растительных клеток с повышенной продукцией никотина, включающий трансформацию растительных клеток, способных продуцировать ХФРТазу, экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' растительный функциональный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная ДНК-последовательность функционально связана с указанным промотором и указанные трансформированные растительные клетки обладают повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансформирован-ными растительными клетками.
21. Способ по п.20, где указанные трансформированные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.
22. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является конститутивно активным.
23. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
- 18 -
009898
24. Способ по п.20 или 21, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.
25. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем бомбардировки растительных клеток микрочастицами, несущими указанную ДНК-конструкцию.
26. Способ по любому из пп.20-24, где указанную стадию трансформации осуществляют путем инфицирования растительных клеток бактериями Agrobacterium tumefaciens, содержащими Ti-плазмиду, несущую указанную ДНК-конструкцию.
27. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, полученных способом по пп.20-26.
28. Способ по п.27, где растение предсталяет собой растение табака Nicotiana tabacum.
29. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.28.
30. Способ повышения продукции никотина в растительных клетках, способных продуцировать ХФРТазу, включающий трансформацию указанных клеток экзогенной ДНК-конструкцией, содержащей в направлении 5'-3' функциональный растительный промотор, и последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу растения табака, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором, в условиях, когда указанная ДНК-конструкция экспрессирует и продуцирует ХФРТазу в указанных трансформированных растительных клетках.
31. Способ по п.30, где указанные трансформированные растительные клетки представляют собой клетки Nicotiana tabacum.
32. Способ по п.30 или 31, где указанная экзогенная ДНК-конструкция интегрируется в геном указанных растительных клеток и содержит в направлении транскрипции:
а) промотор, функционирующий в указанных растительных клетках;
б) последовательность ДНК, кодирующую ХФРТазу, функционирующую в указанных клетках, где указанная последовательность ДНК функционально связана с указанным промотором; и
в) область терминации транскрипции, функционирующую в указанных клетках.
33. Способ по п.32, где указанный промотор является конститутивно активным.
34. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани корней растения.
35. Способ по п.32, где указанный промотор является избирательно активным в клетках ткани коры корней растения.
36. Способ получения трансгенного растения с повышенной продукцией никотина, включающий регенерацию растения из трансформированных клеток, указанных в пп.30-35.
37. Способ по п.36, где растение представляет собой растение табака Nicotiana tabacum.
38. Способ получения семян растения табака, включающий сбор семян растения табака, полученного способом по п.37.
39. Способ по любому из пп.8-38, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:
а) последовательность ДНК SEQ ID NO:1;
б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2;
в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3M NaCl, 0,03М цитрата натрия и 0,1% SDS при 70°С, и кодирует ХФРТазу растения табака и
г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.
40. Способ по п.39, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК SEQ
ID NO:1.
41. Трансгенное растение табака рода Nicotiana с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с нетрансформированным контрольным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.1-9, 11-18.
42. Потомство трансгенного растения по п.41.
43. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией ХФРТазы по сравнению с не-трансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по
п.41.
44. Трансгенное растение табака рода Nicotiana с повышенной продукцией никотина по сравнению с нетрансгенным растением, содержащее трансгенные растительные клетки, раскрытые в пп.20-28, 30-37.
45. Потомство трансгенного растения по п.44.
46. Семена трансгенного растения табака с повышенной продукцией никотина по сравнению с не-трансгенным растением, где указанное трансгенное растение представляет собой потомство растения по
п.44.
47. Табачный продукт, полученный из растения табака по пп.41, 42, 44 или 45.
- 19 -
009898
48. Табачный продукт, содержащий клетки растения табака, полученные способом по любому из пп.2-40.
49. Табачный продукт, содержащий табак растения табака, полученного способом по пп.9, 18, 28 или 37.
50. Табачный продукт по пп.47-49, где последовательность ДНК, кодирующая ХФРТазу растения табака, выбрана из группы, включающей:
а) последовательность ДНК SEQ ID NO:1;
б) последовательность ДНК, которая кодирует ХФРТазу растения табака, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2;
в) последовательность ДНК, которая гибридизируется с последовательностью ДНК (а) или (б) в условиях, определяемых жесткостью промывки в 0,3M NaCl, 0,03М цитрата натрия и 0,1%SDS при 70°С, и кодирует ХФРТазу растения табака и
г) последовательность ДНК, которая отличается от последовательности ДНК (а) или (б) из-за вырожденности генетического кода и кодирует ХФРТазу растения табака.
51. Табачный продукт по п.50, где последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК SEQ ID NO:1.
52. Табачный продукт по любому из пп.47-51, выбранный из группы, включающей табак для табачной трубки, табак для сигары, табак для сигареты, жевательный табак, сигареты и сигары.
53. Способ получения табачного продукта с повышенным содержанием никотина, включающий получение трансгенного растения табака по пп.41, 42, 44 или 45 и получение указанного табачного продукта из указанного растения табака.
Глицеральдегид-З-фосфат
ХФРТаза
р > р Хинолиновая ' Никотиновая
кислота кислота
Аспарагиновая кислота
Никотин
ПМТаза
•" Орнитин -> Путресцин ->
N-Метилпутресцин > . 4-Метиламинобутаналь
Фиг. 1
caaaaactat tttccacaaa attcatttca caaccccccc aaaaaaaaac cATGTTTAGA 60 GCTATTCCTT TCACTGCTAC AGTGCATCCT TATGCAATTA CAGCTCCAAG GTTGGTGGTG 120 AAAATGTCAG CAATAGCCAC CAAGAATACA AGAGTGGAGT CATTAGAGGT GAAACCACCA 180 GCACACCCAA CTTATGATTT AAAGGAAGTT ATGAAACTTG CACTCTCTGA AGATGCTGGG 240 TTTCTAGCAA AGGAAGACGG GATCATAGCA GGAATTGCAC TTGCTGAGAT GATATTCGCG 360 GAAGTTGATC CTTCATTAAA GGTGGAGTGG TATGTAAATG ATGGCGATAA AGTTCATAAA 420 GGCTTGAAAT TTGGCAAAGT ACAAGGAAAC GCTTACAACA TTGTTATAGC TGAGAGGGTT 480 GTTCTCAATT TTATGCAAAG AATGAGTGGA ATAGCTACAC TAACTAAGGA AATGGCAGAT 540 GCTGCACACC CTGCTTACAT CTTGGAGACT AGGAAAACTG CTCCTGGATT ACGTTTGGTG 600 GATAAATGGG CGGTATTGAT CGGTGGGGGG AAGAATCACA GAATGGGCTT ATTTGATATG 660 GTAATGATAA AAGACAATCA CATATCTGCT GCTGGAGGTG TCGGCAAAGC TCTAAAATCT 720 GTGGATCAGT ATTTGGAGCA AAATAAACTT CAAATAGGGG TTGAGGTTGA AACCAGGACA 780 ATTGAAGAAG TACGTGAGGT TCTAGACTAT GCATCTCAAA CAAAGACTTC GTTGACTAGG 840 ATAATGCTGG ACAATATGGT TGTTCCATTA TCTAACGGAG ATATTGATGT ATCCATGCTT 900 AAGGAGGCTG TAGAATTGAT CAATGGGAGG TTTGATACGG AGGCTTCAGG AAATGTTACC 960 CTTGAAACAG TACACAAGAT TGGACAAACT GGTGTTACCT ACATTTCTAG TGGTGCCCTG 1020 ACGCATTCCG TGAAAGCACT TGACATTTCC CTGAAGATCG ATACAGAGCT CGCCCTTGAA 1080 GTTGGAAGGC GTACAAAACG AGCATGAgcg ccattacttc tgctataggg ttggagtaaa 1140 agcagctgaa tagctgaaag gtgcaaataa gaatcatttt actagttgtc aaacaaaaga 1200 tccttcactg tgtaatcaaa caaaaagatg taaattgctg gaatatctca gatggctctt 1260 ttccaacctt attgcttgag ttggtaattt cattatagct ttgttttcat gtttcatgga 1320 atttgttaca atgaaaatac ttgatttata agtttggtgt atgtaaaatt ctgtgttact 1380 tcaaatattt tgagatgtt 1399
Фиг. 2А
- 20 -
009898
MFRAIPFTAT VHPYAITAPR LVVKMSAIAT KNTRVESLEV KPPAHPTYDL 50
KEVMKLALSE DAGNLGDVTC KATIPLDMES DAHFLAKEDG IIAGIALAEM 100
IFAEVOPSLK VEWYVNDGDK VHKGLKFGKV QGNAYNIVIA ERVVLNFMQR 150
MSGIATLTKE MADAAHPAYI LETRKTAPGL RLVDKWAVLI GGGKNHRMGL 200
FDMVMIKDNH ISAAGGVGKA LKSVDQYLEQ NKLQIGVEVE TRTIEEVREV 250
LDYASQTKTS LTRIMLDNMV VPLSNGDIDV SMLKEAVELI NGRFDTEASG 300
NVTLETVHKI GQTGVTYISS GALTHSVKAL DISLKIDTEL ALEVGRRTKR 350
A 351 Фиг. 2Б
N. tabacum
R. rubrum
M. leprae
S. typhi murium
E. coli
H. sapien
S. cerevisiae
MFRAIPFTATVHPYAITAPRLWKMSAIATKNTRVESLEVKPPAHPTYOL
*--------RPMH-----------------------PVAALS*F----AI
.....LSOC.......................EFDAAR........
*--......PPRR*NPDDR*...........DALL*RINLDI*A----AV
*--......PPRR*NPDTR*-----------DELL*RINLDI*G----AV
*---------------D*EG*ALLLPPVTLAALVDSWLREDC*G------
*.......- - - - - - - PVYE - HLLP VNGAWRQDVTNWLSEDV*S------
N. tabacum KEVMKLALSEDAGNLGDVTCKATIPLDMESDAHFLAKEDGIIAGIA----
R. rubrum D*AVRR**A**L*RA**I*ST****AATRAH*RFV*RQP**L**LGCA--
M. leprae -DTIRR**H**LRYGL*I*TQ**V*AGTVVTGSMVPR*P*VIAGVDVALL
S. typhi muri urn AQALREDLGGEVDAGN*I*AQL-L*A*TQAH*TVITR*D*VF- ---CGKR
E. coli AOALREDLGGTVDANN*PA*L-L*ENSR*H*TVITR*N-VF----CGKR
H. sapien -----------------LNYAALVSGAGP*QAALWAKSP*VL----AGQP
S. cerevisiae .....-..........-FDFGGYVVGSDLKEANLYCKQD*ML----CGVP
N. tabacum -LAEMIFAEVDPSLKVEWYVNDGDKVHKGLK------FGKVQGNAYNIVI
R. rubrum - -RSAF-ALLDDTVTFTTPLE**AEIAA*QT......VAE*A*A*RT*LA
M. 1eprae VLO*VF-GVDGYRVLY--R*E**ARLQS*QP......LLTVQAA*RGLLT
S. typhimuri urn WVE*VFIQLAGDDVRLT*H*D***AI*ANQT-- ----VFELN*PARVLLT
E. coli WVE*VFIQLAGDDVTII*H*D***VINANQS------LFELE*PSRVLLT
H. sapien FFDAIFTQL---Nn}VS*FLPE*S*LVPVAR......VAEVR*P*HDLLL
S. cerevi si ae FAW*VFNQC---ELQVE*LFKE*SFLEPSKNDSGKIVVAKIT*P*K**LL
N. tabacum AERVVLNFMQRMSGIATLTKEMAD--AAH--PAYILETRKTAPGLRLVDK
R. rubrum ***TA***LGHL*****R*RRFG*AI*HT- -R*RLTC****T****GLE*
M. 1eprae ***TM***VCHM*****V*VAWV*AVRGT--K*KIRD****L****ALQ*
S. typhi muri urn G**TA***V*TL**VASEVRRYVGLL*GT-QTQL*D****L****TAL*
E. col i G*PTA***V*TL**VASKVRHYVELLEGT--NTQL*D****L****SAL*
H. sapien G*^A^TLARC^*SAAAAAVEAARGAGWTGHVAG^^T**F***E*
S. cerevisiae ***TA**ILSRS****TASHKIISLARSTGYKGTIAG****T****RLE*
N. tabacum WAVLIGGGKNHRMGLFDMVMIKDNHISAAGGVGKALK.SVDQYLEQNKLQI
R. rubrum Y**RC***S***F**D*A*L******AVA***SA**SRAR-AGVGHMVRI
M. leprae Y^RV***V^4^GnAL^**VA*V*S*VD**RA*R-AAAPEL-PC
S. typhi muri urn Y^C^*A^L^TWL*^^I*S*S*RQ*VEKAF-W*HPD- APV
E. coli Y***C***A***L**S*AFL******I*S*S*RQ*VEKAS-W*HPD-APV
H. sapien YGL*V**MS**YD*GGLVML*0**VVPP***EK*VRAARQ---AADFAL
S. cerevisiae YSM*V**CDT**YD*SS**ML*D***W*T*SITN*V*NARA---VCGFAV
N. tabacum GVEVETRTIEEVREVLDYASQTKTSLTRIMLDNMVVPLSNGDIDVSMLKE
R. rubrum EI****--L*QLA***AVGGAEV-----VL****-----DAPT----*TR
M. leprae E****S--L*QLDAM*A-EEPEL-----*L***F--*VWQTQV----AVQ
S. typhi murium ' E****N--LDELDDA*K-*GADI-----*****F-----NTDQ----MR*
E. coli E****N--L**LD*A*K-*GADI.....*****F-----ETEQ----MR*
H. sapien K****CSSLQ**VQAAE-*GADL-----VL***F------KPEELHPTAT
S. cerevi si ae KI***CLSED*AT*AIE-*GADV-----*****F------KGDGLK*CAQ
N. tabacum
R. rubrum
M. leprae
S. typhimuriurn
E. coli
H. sapien
S. cerevisiae
N. tabacum R. rubrum M. leprae S. typhimuri urn E. coli H. sapien S. cerevisiae
AVELI ---NGRFDTEASGNVTLETVHKIG-QTGVTYISSGALTHSVKALD
**QMV___Д**|_у-Ь1г***?*2*у*^ДД|^_[Г5**^
RROIR---APTVLL*S**GLS**NAAIYA-G***DYLAV*******RI** **KRV - - -**QARL*y*^**A?*LREPA.?***|3p**vG******R*** **KRT---**KALL*V*****DK*LREFA-E***DF**V*******Q*** *LKAQFPSVA- --VEA**GIT*DNLPQF-CGPHIDV**M*M**QA*P*** SLKNKWNGKKHFLLEC**GLN*DNLEEYLCD-DIDIY*TSSIHQGTPVI*
ISKLIDTEL AL EVGRRTKRA
*G*D*VVA.....PPKAERA
*G*DL LSMRFC LSMRFR p***l____
F***LAH
F*K*VAPVP*IH
Идентичность,
15.9 18.3 18.2 17.9 16.8 14.6
Подобие, 43.2 37.3 34.8 32.8 31.7 27.8
Фиг. 3
- 21 -
009898
Штамм Е. coli ТН2 65
(NadC-;
2. Экспрессирующий NtQPTI ТН265 (pWS161)
3. ТН265 (рКК2233)
Минимальная среда ME Ч_
Минимальная среда ME + никотиновая кислота
Фиг. 4
1.25
0.75
Относительное содержание 0 5 Н
0.25 -
f\] Транскрипты TobRD2 Г/| Никотин
Nicl+ Nicl- Nicl+ Nicl-Nic2+ Nic2+ Nic2- Nic2-
Фиг. 5
0тноотпель]*5е
содержание
'транскриптов TobRD2
^ Транскрипты TobRDS 0 Никотин
Часы после прищепки верхушек
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 22 -