1. Антитело против каспазы-8, полученное путем иммунизации животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, или его фрагмент, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4), способное совместно иммунопреципитировать указанную каспазу (как активную каспазу-8, так и прокаспазу-8) вместе со связанным с каспазой-8 белком р72 (SEQ ID NO: 3) и эффективно высвобождать каспазу и связанный белок из иммунного комплекса при элюции, с использованием указанного пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 4.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является поликлональным антителом.

3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является моноклональным антителом или его фрагментом.

4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является химерным антителом или его фрагментом.

5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является полностью гуманизированным антителом или его фрагментом.

6. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является анти-анти-Id-антителом или его фрагментом.

7. Антитело по любому из п.1-6, отличающееся тем, что пептид, используемый для иммунизации, связан с KLH.

8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что является изотипом иммуноглобулина IgG ₁ .

9. Антитело по любому из п.8, отличающееся тем, что запускает процессинг каспазы-8.

10. Применение антитела по любому из пп.1-9 для разработки ELISA-анализа.

11. Способ получения антитела по п.1 или 2, предусматривающий иммунизацию животного
С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4).

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что антитело является моноклональным.

13. Способ по любому из п.11 или 12, отличающийся тем, что пептид, используемый в качестве иммуногена, связан с носителем.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что носитель представляет собой KLH.

15. Способ очистки каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, предусматривающий обеспечение контактирования образца, содержащего каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок, с антителом по
любому из пп.1-9, совместную иммунопреципитацию каспазы и связанного с каспазой-8 белка, промывание образованного иммунного комплекса и извлечение каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка из иммунного комплекса с использованием пептида с аминокислотной последовательностью CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4) в качестве конкурентного пептида.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что образец выбран из жидкостей организма, клеточных экстрактов и библиотек экспрессируемых ДНК.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что клетки в образце стимулировали Fas-лигандом перед экстракцией.

18. Способ по любому из пп.15-17, отличающийся тем, что дополнительно обеспечивают контактирование образца с антителом, полученным путем иммунизации животного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 5, и/или антителом, полученным путем иммунизации животного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 6.

19. Применение С-концевого пептида субъединицы Sub-1 каспазы-8, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (эпитопа 179), для получения антитела по любому из пп.1-6, предусматривающее иммунизацию животного таким эпитопом.

20. Антитело против каспазы-8, полученное путем иммунизации животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, или его фрагмент, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6).

21. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является поликлональным антителом.

22. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является моноклональным антителом или его фрагментом.

23. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является химерным антителом или его фрагментом.

24. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является полностью гуманизированным антителом или его фрагментом.

25. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является анти-анти-Id антителом или его фрагментом.

26. Антитело по любому из пп.20-25, отличающееся тем, что пептид, используемый для иммунизации, связан с KLH.

27. Антитело по любому из пп.20-25, отличающееся тем, что является изотипом иммуноглобулина IgG ₁ .

28. Способ получения антитела по п.20 или 21, предусматривающий иммунизацию животного
С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, где пептид, используемый для иммунизации, имеет иммунизирующую последовательность SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6).

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пептид, используемый в качестве иммуногена, связан с носителем.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что носитель представляет собой KLH.

31. Способ очистки каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, предусматривающий обеспечение контактирования образца, содержащего каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок, с антителом по любому из пп.20, 21, в сочетании с антителом по любому из пп.1, 2, совместную иммунопреципитацию каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, промывание образованного иммунного комплекса и извлечение каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка из иммунного комплекса с использованием пептида с аминокислотной последовательностью CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4) в качестве конкурентного белка.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что образец выбран из жидкостей организма, клеточных экстрактов и библиотек, экспрессирующих ДНК.

33. Способ по любому из пп.31 и 32, отличающийся тем, что конкурентный пептид содержит аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4).

34. Способ по любому из пп.32, 33, отличающийся тем, что клетки в образце стимулировали Fas-лигандом перед экстракцией.

35. Применение С-концевого пептида субъединицы Sub-1 каспазы-8, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (эпитопа 183), для получения антитела по любому из пп.20-27, предусматривающее иммунизацию животного таким эпитопом.

36. Применение антитела по любому из пп.20-27 для разработки ELISA-анализа.

 

(57) Реферат / Формула:
Антитело против каспазы-8, полученное путем иммунизации животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, или его фрагмент, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4), способное совместно иммунопреципитировать указанную каспазу (как активную каспазу-8, так и прокаспазу-8) вместе со связанным с каспазой-8 белком р72 (SEQ ID NO: 3) и эффективно высвобождать каспазу и связанный белок из иммунного комплекса при элюции, с использованием указанного пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 4.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является поликлональным антителом.

3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является моноклональным антителом или его фрагментом.

4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является химерным антителом или его фрагментом.

5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является полностью гуманизированным антителом или его фрагментом.

6. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является анти-анти-Id-антителом или его фрагментом.

7. Антитело по любому из п.1-6, отличающееся тем, что пептид, используемый для иммунизации, связан с KLH.

8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что является изотипом иммуноглобулина IgG ₁ .

9. Антитело по любому из п.8, отличающееся тем, что запускает процессинг каспазы-8.

10. Применение антитела по любому из пп.1-9 для разработки ELISA-анализа.

11. Способ получения антитела по п.1 или 2, предусматривающий иммунизацию животного
С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4).

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что антитело является моноклональным.

13. Способ по любому из п.11 или 12, отличающийся тем, что пептид, используемый в качестве иммуногена, связан с носителем.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что носитель представляет собой KLH.

15. Способ очистки каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, предусматривающий обеспечение контактирования образца, содержащего каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок, с антителом по
любому из пп.1-9, совместную иммунопреципитацию каспазы и связанного с каспазой-8 белка, промывание образованного иммунного комплекса и извлечение каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка из иммунного комплекса с использованием пептида с аминокислотной последовательностью CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4) в качестве конкурентного пептида.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что образец выбран из жидкостей организма, клеточных экстрактов и библиотек экспрессируемых ДНК.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что клетки в образце стимулировали Fas-лигандом перед экстракцией.

18. Способ по любому из пп.15-17, отличающийся тем, что дополнительно обеспечивают контактирование образца с антителом, полученным путем иммунизации животного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 5, и/или антителом, полученным путем иммунизации животного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 6.

19. Применение С-концевого пептида субъединицы Sub-1 каспазы-8, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (эпитопа 179), для получения антитела по любому из пп.1-6, предусматривающее иммунизацию животного таким эпитопом.

20. Антитело против каспазы-8, полученное путем иммунизации животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, или его фрагмент, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6).

21. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является поликлональным антителом.

22. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является моноклональным антителом или его фрагментом.

23. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является химерным антителом или его фрагментом.

24. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является полностью гуманизированным антителом или его фрагментом.

25. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является анти-анти-Id антителом или его фрагментом.

26. Антитело по любому из пп.20-25, отличающееся тем, что пептид, используемый для иммунизации, связан с KLH.

27. Антитело по любому из пп.20-25, отличающееся тем, что является изотипом иммуноглобулина IgG ₁ .

28. Способ получения антитела по п.20 или 21, предусматривающий иммунизацию животного
С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, где пептид, используемый для иммунизации, имеет иммунизирующую последовательность SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6).

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пептид, используемый в качестве иммуногена, связан с носителем.

30. Способ по п.29, отличающийся тем, что носитель представляет собой KLH.

31. Способ очистки каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, предусматривающий обеспечение контактирования образца, содержащего каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок, с антителом по любому из пп.20, 21, в сочетании с антителом по любому из пп.1, 2, совместную иммунопреципитацию каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, промывание образованного иммунного комплекса и извлечение каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка из иммунного комплекса с использованием пептида с аминокислотной последовательностью CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4) в качестве конкурентного белка.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что образец выбран из жидкостей организма, клеточных экстрактов и библиотек, экспрессирующих ДНК.

33. Способ по любому из пп.31 и 32, отличающийся тем, что конкурентный пептид содержит аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4).

34. Способ по любому из пп.32, 33, отличающийся тем, что клетки в образце стимулировали Fas-лигандом перед экстракцией.

35. Применение С-концевого пептида субъединицы Sub-1 каспазы-8, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (эпитопа 183), для получения антитела по любому из пп.20-27, предусматривающее иммунизацию животного таким эпитопом.

36. Применение антитела по любому из пп.20-27 для разработки ELISA-анализа.

 

---

009770
Область техники изобретения
Изобретение относится к антителам к определенной области в каспазе-8 и к их применению.
Предпосылки к созданию изобретения
Фактор некроза опухоли (TNF-альфа) и лимфотоксин (TNF-бета) являются полифункциональными провоспалительными цитокинами, продуцируемыми, главным образом, мононуклеарными лейкоцитами, которые оказывают многочисленные эффекты на клетки (Wallach, D. (1986), In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), p. 83-122, Academic Press, London и Beutler and Cerami (1987). TNF-альфа и TNF-бета начинают действовать в результате связывания со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Вероятно, некоторые из их эффектов оказываются полезными для организма: они могут, например, разрушать опухолевые клетки или инфицированные вирусами клетки и усиливать противобактериальную активность гранулоцитов. Таким образом, TNF участвует в защите организма против опухолей и инфекционных агентов и способствует восстановлению после повреждения. Так, TNF можно использовать как противоопухолевый агент, который при применении связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевой клетки и, тем самым, дает начало событиям, ведущим к гибели опухолевых клеток. TNF также можно использовать как противоинфекционный агент.
Однако TNF-альфа оказывает вредное действие. Имеются доказательства, что сверхпродукция TNF-альфа может играть основную патогенетическую роль при некоторых заболеваниях. Например, известно, что действие TNF-альфа, прежде всего, на сосудистую систему является главной причиной симптомов септического шока (Tracey et al., 1994). При некоторых заболеваниях TNF может вызывать чрезмерную потерю веса (кахексию), подавляя активность адипоцитов и вызывая анорексию, и поэтому TNF-альфа называют кахектин. Он также описан как медиатор поражения тканей при ревматоидных заболеваниях (Beutler and Cerami, 1987) и как основной медиатор поражения, наблюдаемого при реакциях "трансплантат против хозяина" (Grau G.E. et al., 1989). Кроме того, известно, что TNF участвует в процессе воспаления и многих других заболеваниях.
Два отдельных, независимо экспрессирующихся рецептора, TNF-рецепторы р55 (CD120a) и р75 (CD120b), которые специфически связывают как TNF-альфа, так и TNF-бета, инициируют и/или опосредуют описанные выше биологические эффекты TNF. Названные два рецептора содержат структурно непохожие внутриклеточные домены, позволяя предположить, что они различно передают сигнал (см. Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Loetscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990). Однако клеточные механизмы, например, различных белков и возможно других факторов, которые вовлечены во внутриклеточную передачу сигнала CD120a и CD120b, еще не установлены. Они включают внутриклеточную передачу сигнала, которая обычно осуществляется после связывания лиганда, т. е. TNF (альфа или бета) с рецептором, который является ответственным за начало каскада реакций, что в конце концов приводит к наблюдаемому ответу клетки на TNF.
Что касается вышеупомянутого разрушающего клетку эффекта TNF, в большинстве изученных до сих пор клеток упомянутый эффект запускается, главным образом, CD120a. Антитела против внеклеточного домена CD120a (лиганд-связывающий домен) сами могут запускать разрушающее клетку действие (см. EP 412486), которое коррелирует с эффективностью перекрестного связывания рецептора антителами, что, как полагают, является первой стадией в генерации процесса внутриклеточной передачи сигнала. Кроме того, мутационные исследования (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) показали, что биологическая функция CD120a зависит от целостности его внутриклеточного домена, и, соответственно, было высказано предположение, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, ведущей к разрушающему клетку эффекту TNF, происходит как следствие ассоциации двух или более внутриклеточных доменов CD120a. Кроме того, TNF (альфа или бета) встречается как гомотример и, как полагают, сам по себе индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через CD120a благодаря его способности связываться с рецепторными молекулами и сшивать их, то есть, вызывает агрегацию рецепторов (Engel-
mann Н. et al., 1990).
Другим представителем суперсемейства рецепторов TNF/NGF является рецептор FAS/APO1 (CD95). CD95 опосредует клеточную гибель в форме апоптоза (Itoh et al., 1991) и, как оказалось, служит как негативный селектор аутореактивных Т-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток. CD95 опосредует апоптотическую гибель Т-клеток, распознающих аутоантигены. Также установлено, что мутации в гене CD95 (Ipr) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, которое напоминает аутоиммунное заболевание человека, системную красную волчанку (SLE) (Watanabe-Fukanaga et al., 1992). Лиганд для CD95 представляет собой ассоциированную с клеточной поверхностью молекулу, переносимую, кроме других, Т-киллерами (или цитотоксическими Т-лимфоцитами - CTL), и, следовательно, когда такие CTL контактируют с клетками, несущими CD95, они способны индуцировать апоптотическую клеточную гибель CD95-несущих клеток. Кроме того, были получены моноклональные антитела, специфичные для CD95, которые способны индуцировать апоптотическую гибель клеток, несущих CD95, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей CD95 человека (например, Itoh et al., 1991).
- 1 -
009770
Рецептор TNF и Fas-механизмы передачи сигнала, включающие в себя различные рецепторы, их регуляцию и идентифицированные молекулы передачи сигнала, подробно рассмотрены Wallach et al., 1999.
Установлено, что определенные злокачественные клетки и ВИЧ-инфицированные клетки, которые содержат CD95 на своей поверхности, антитела против CD95 или лиганд CD95, могут быть использованы для запуска опосредованного CD95 цитотоксического действия в названных клетках и в связи с этим -для обеспечения средством для борьбы с такими злокачественными клетками или ВИЧ-инфицированными клетками (см., Itoh et al., 1991).
Поэтому открытие еще других путей увеличения цитотоксической активности CD95 может иметь терапевтическое значение.
Уже давно существует потребность в обеспечении способом модуляции клеточного ответа на TNF (альфа или бета) и лиганд CD95. Например, при упомянутых выше патологических ситуациях, когда TNF или лиганд CD95 сверхэкспрессируются, оказывается желательным ингибировать индуцированные TNF или лигандом CD95 эффекты, разрушающие клетки, в то время как в других ситуациях, например при применении для заживления ран, желательно усилить действие TNF, или в случае CD95, в опухолевых клетках или ВИЧ-инфицированных клетках, желательно усилить действие, опосредованное CD95.
Заявители использовали ряд подходов (см., например, описания европейских патентов № EP 186833, EP 308378, EP 398327 и EP 412486), чтобы регулировать вредные действия TNF посредством ингибирования связывания TNF с его рецепторами, применяя анти-TNF-антитела или используя растворимые рецепторы TNF (по существу, растворимые внеклеточные домены рецепторов), чтобы конкурировать со связыванием TNF с TNF-рецепторами, связанными с клеточной поверхностью (TNF-R). Далее, учитывая, что связывание TNF с его рецепторами является необходимым для TNF-индуцированных клеточных эффектов, использовали способы (см., например, EP 568925), позволяющие модулировать действие TNF модулированием активности TNF-R.
EP 568925 относится к способу модулирования трансдукции сигнала и/или расщепления TNF-R, при котором пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать или с самим рецептором, или с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, таким образом модулируя нормальную функцию TNF-R. В EP 568925 описывают конструкцию и свойства различных мутантных форм CD 120a, имеющих мутации во внеклеточном, трансмембранном и внутриклеточном доменах. Таким образом, области в вышеупомянутых доменах CD120a были идентифицированы как существенные для функционирования рецептора, т.е. связывания лиганда (TNF) и последующей трансдукции сигнала и внутриклеточной передачи сигнала, что в конечном счете приводит к наблюдаемому действию TNF на клетки. Кроме того, также описывают ряд способов выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, которые способны связываться с различными областями в вышеупомянутых доменах CD120a, белков, пептидов и других факторов, которые могут быть вовлечены в регуляцию или модулирование активности TNF-R. Также в EP 368925 описывают ряд способов
выделения и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды;
конструирования экспрессирующих векторов для получения названных белков и пептидов;
получения антител или их фрагментов, взаимодействующих с CD120a или с вышеупомянутыми белками и пептидами, которые связывают различные области CD120a.
Однако в EP 568925 не конкретизированы фактически существующие белки и пептиды, которые связываются с внутриклеточными доменами TNF-R. Аналогично, в EP 568925 не описаны специфические белки или пептиды, способные связывать внутриклеточный домен CD95.
Таким образом, если желательно ингибировать действие TNF или лиганда CD95, следует снизить количество или активность TNF-R или CD95 на поверхности клетки, в то время как оказывается необходимым увеличение количества или активности TNF-R или CD95, когда добиваются повышенного действия TNF или лиганда CD95. С этой целью секвенировали и анализировали промоторы как CD120a, так и CD120b и установили ряд мотивов ключевых последовательностей, которые являются специфичными в отношении различных факторов, регулирующих транскрипцию, и, по существу, оказалось возможным контролировать экспрессию названных TNF-R по уровню их промоторов, т.е. ингибирование транскрипции на промоторах для снижения количества рецепторов и повышения транскрипции на промоторах для увеличения количества рецепторов (EP 606869 и WO 9531206).
Тогда как известно, что рецепторы фактора некроза опухоли (TNF) и структурно родственный рецептор CD95 при стимуляции лигандами, продуцируемыми лейкоцитами, запускают в клетках деструктивную активность, которая приводит к их собственной гибели, механизмы упомянутого запуска еще недостаточно изучены.
Мутационные исследования показали, что в передачу сигнала CD95 и CD120a для цитотоксичности вовлечены отдельные области в их внутриклеточных доменах (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Названные области ("домены гибели") характеризуются сходством последовательностей. "Домены гибели" как CD95, так и CD120a имеют тенденцию к самоассоциации. Их самоассоциация очевидно стимулирует агрегацию рецепторов, которая является необходимой для инициации передачи сигнала (см. Bigda et al., 1994; Boldin et al., 1995), и при высоких уровнях экспрессии рецепторов может приводить к запуску лиганд-независимой передачи сигнала (Boldin et al., 1995).
- 2 -
009770
Некоторые из цитотоксических эффектов лимфоцитов опосредованы взаимодействием продуцируемого лимфоцитами лиганда с CD95 клетки-мишени (также см. Nagata and Goldstein, 1995). Гибель клеток под воздействием мононуклеарных фагоцитов вовлекает TNF и его рецептор CD120a (см. также Vandenabeele et al., 1995). Подобно другим рецептор-индуцированным эффектам, индукция клеточной гибели рецепторами TNF и CD95 осуществляется через серию белок-белковых взаимодействий, ведущих от лиганд-рецепторного связывания к конечной активации энзиматических эффекторных функций, которые, как было показано, включают неэнзиматические белок-белковые взаимодействия, которые иниции-рут передачу сигнала для гибели клетки: связывание молекул тримерного TNF или лиганда CD95 с рецепторами, последующее взаимодействие их внутриклеточных доменов (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993), усиленное склонностью мотивов "доменов гибели" к самоассоциации (Boldin et al., 1995а), и индуцированное связывание двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - MORT-1 (или FADD) с CD95 (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) и TRADD с CD120a (Hsu et al., 1996). Кроме их связывания с CD95 и CD120a, MORT-1 и TRADD также способны связываться с друг другом, а также с другими "доменами гибели", содержащими белки, такие как RIP (Stanger et al., 1995), что обеспечивает функциональное "перекрестное общение" между CD95 и CD120a. Упомянутые связывания осуществляются через мотив консервативной последовательности, "модуль домена гибели", общий с рецепторами и их ассоциированными белками. Кроме того, хотя на двугибридной дрожжевой системе показали, что MORT-1 спонтанно связывается с CD95, в клетках млекопитающих названное связывание имеет место только после стимуляции рецептора, позволяя предположить, что MORT-1 участвует в инициации явлений передачи сигнала CD95. MORT-1 не содержит какого-либо мотива последовательности, характерного для энзиматической активности и, поэтому оказалось, что его способность запускать клеточную гибель не вовлекает активность, свойственную самому MORT-1, а скорее активацию некого другого белка(ов), который связывает MORT-1 и действует далее в каскаде передачи сигнала. Показано, что клеточная экспресссия мутантов MORT-1, не содержащих N-концевую часть молекулы, блокирует индукцию цитотоксичности посредством CD95 или CD120a (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), означая, что названная N-концевая область передает сигнал для разрушающего клетку эффекта обоих рецепторов через белок-белковое взаимодействие.
Группа цитоплазматических тиоловых протеаз, которые являются структурно родственными про-теазе CED3 Caenorhabditis elegans и интерлейкин-1-бета-превращающему ферменту (ICE) млекопитающих, вовлечена в развитие различных физиологических процессов клеточной гибели (см. обзор Kumar, 1995 и Henkart, 1996). Также имеются доказательства, что протеаза(ы) названного семейства принимает участие в клеточной цитотоксичности, индуцированной CD95 и TNF-R. Обнаружено, что специфические пептидные ингибиторы протеаз и два кодированных вирусами белка, которые блокируют их функцию, белок crmA коровьей оспы и белок р35 бакуловируса, обеспечивают защиту клеток против названной цитотоксичности (Enari et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Быстрое расщепление некоторых специальных клеточных белков, очевидно опосредованное протеазой(ами) семейства CED3/ICE (каспаза), может быть продемонстрировано в клетках вскоре после стимуляции CD95 или
TNF-R.
Одна такая протеаза и ее различные изоформы (включая ее ингибиторы), известная как МАСН (новая каспаза-8), которая представляет собой MORT-1-связывающий белок, была выделена, клонирована, охарактеризована, а также описано ее возможное применение, что подробно изложено в описании, в частично принадлежащей заявителям заявке PCT/US96/10521 и в публикации заявителей (Boldin et al., 1996) и включено в качестве в полном объеме. Другая такая протеаза и ее различные изоформы (включая ее ингибиторы), обозначенная Mch4 (также называемая каспаза-10), была выделена и охарактеризована авторами изобретения (не опубликовано) и другими исследователями (Fernandes-Alnemri et al., 1996; Srini-vasula et al., 1996). Каспаза-10 также является MORT-1-связывающим белком. Таким образом, подробности, касающиеся всех аспектов, особенностей, характеристик и применений каспазы-10 изложены в указанных выше публикациях, все из которых включены в описание в их полном объеме цитированием.
Также следует отметить, что каспазы, каспаза-8 и каспаза-10, которые содержат похожие продоме-ны (см. Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Fernandes-Alnemri et al., 1996; Vincent and Dixit, 1997), взаимодействуют через свои продомены с MORT-1, названное взаимодействие осуществляется через "эффек-торный домен гибели", DED, присутствующий в N-концевой части MORT-1 и присутствующий в двух экземплярах в каспазе-8 и каспазе-10 (см. Boldin et al., 1995b; Chinnalyan et al., 1995).
Каспазы (цистеиновые аспартат-специфические протеиназы) составляют увеличивающееся семейство цистеиновых протеаз, которые характеризуются несколькими общими свойствами. Установлено, что большинство из каспаз участвует в инициации и осуществлении запрограммированной клеточной гибели или апоптоза, в то время как оказалось, что другие вовлечены в продукцию провоспалительных цитокинов (Nicholson D.W. et al., 1997, Salvesen G.S. et al., 1997, Cohen G.M., 1997). Они синтезируются в виде каталитически почти неактивных предшественников и обычно активируются в результате расщепления после специфических остатков аспарагиновой кислоты, расположенных в междоменных связях. Сайты расщепления каспаз определяются тетрапептидными последовательностями (X-X-X-D), а расщеп
- 3 -
009770
ление всегда происходит после аспарагиновой кислоты. В результате образуются определенные зрелые активные каспазы и активируют самих себя, а также другие неактивные предшественники (Fernandes-Alnemri T. et al., 1996, Srinivasula S.M. et al., 1996).
Активация процесса запрограммированной гибели клеток в основном является специфической и включает последовательный процессинг поздних каспаз, называемых каспазы-"эффекторы", который осуществляется ранними каспазами, называемыми каспазы-"инициаторы". Функциональные особенности двух классов каспаз также находят отражение в их структуре. Действительно, "каспазы-инициаторы" содержат более длинные продоменные области по сравнению с каспазами-"эффекторами" (Salvesen G.S. et al., 1997; Cohen G.M., 1997). Длинный продомен позволяет инициаторным или ''апикальным" каспазам активироваться при запуске рецепторов гибели из семейства рецепторов TNF. Во время индуцированной лигандом тримеризации рецепторов гибели, каспазы-инициаторы рекрутируются через их длинный N-концевой продомен для взаимодействия со специфическими адапторными молекулами, чтобы преобразовать инициирующий гибель комплекс передачи сигнала (Cohen G.M., 1997; Kischkel F.C. et al., 1995). Например, каспаза-8/МАСН и, возможно, каспаза-10, которые содержат два DED, рекрутируются в ре-цепторный комплекс адаптерными молекулами FADD/MORT-1, тогда как полагают, что каспаза-2 рекрутируется посредством CRADD/RAIDD и RIP (Nagata S. et al., 1997; MacFarlane M. et al., 1997; Ahmad M. et al., 1997; Dual H. et al., 1997). Полагают, что вследствие тримерной природы активированного ре-цепторного комплекса по крайней мере две каспазные молекулы подходят близко друг к другу, таким образом приводя к их активации в результате аутокаталитического процессинга (Yang et al., 1998; Muzio
et al., 1998).
Каспазы синтезируются в виде проферментов, состоящих из трех основных субъединиц, N-концевого продомена и двух субъединиц, которые иногда разделяются линкерным пептидом. Две субъединицы были названы "длинная" или субъединица 1 (Sub-1), содержащая главную часть активного центра фермента, и "короткая" или субъединица 2 (Sub-2). Для полной активации фермента он подвергается процессингу с образованием продомена и двух субдоменов. Две субъединицы образуют гетероди-мер. На основании выведенной трехмерной структуры каспазы-3 оказалось, что С-конец длинного домена, а также N-конец короткого субдомена должны быть свободными, а С-конец короткой субъединицы должен находиться в тесной близости с N-концом длинной субъединицы, чтобы образовался точно свернутый и активный фермент (Rotonda et al., 1996; Mittl et al., 1997; Srinivasula et al., 1998).
Хотя всегда считали, что метаболические пути, ведущие к апоптозу или некрозу, являются совершенно разными, последние данные позволяют предположить, что каспазы, которые являются главными медиаторами апоптоза, также могут быть причастны к некрозу как в негативном, так и в позитивном смысле. Действительно, показано, что сверхэкспрессия ингибитора каспаз CrmA в клетках L929 повышает в 1000 раз чувствительность названных клеток к некротической активности TNF (Vercammen et al., 1998), указывая на ингибиторное действие каспаз на TNF-индуцированную некротическую активность. Кроме того, недавно также было высказано предположение, что TNFR1- и Fas-ассоциированные "домены смерти", которые выполняют существенную роль в индукции апоптоза названными лигандами (рассмотрено Wallach et al., 1999), играют важную роль в индукции некроза (Boone et al., 2000). Показано, что FasL-индуцированный некроз печени блокируется ингибиторами каспаз (Kunstle et al., 1997).
Так как опосредованный каспазами протеолиз является решающим и центральным элементом апоп-тотического процесса [Nicholson D.W. and Thornberry, N.A. (1997), Villa et al. (1997) и Salvesen, G.S., and Dixit, V.M. (1997)], идентификация важных поздних молекулярных мишеней названных протеаз оказывается неизбежной для понимания трансдукции апоптотического сигнала. Показано, что различные структурные и сигнальные белки расщепляются каспазами во время апоптотической гибели [Nicholson D.W. and Thornberry, N.A. (1997), Villa P. et al. (1997)], включая ICAD, ингибитор активируемой каспазой D-назы, что является важным для межнуклеосомной деградации ДНК, но не для осуществления апоптоза (Enari, M. et al. (1998) и Sakahira et al. (1998)). Гельсолин, актин-регулирующий белок, который модулирует цитоплазматическую трансформацию актин-гельсоля (Yin, H.L. and Stossel, ТР. (1979), вовлечен в апоптоз, судя по (i) его расщеплению во время апоптоза in vivo [Kothakota, S. et al. (1997)], (ii) предотвращению апоптоза при его сверхэкспрессии [Ohtsu, M. et al. (1997)] и (iii) индукции апоптоза одним из расщепленных продуктов [Kothakota, S. et al. (1997)].
Гельсолин характеризуется активируемыми Са+2 многочисленными активностями, разъединяет ак-тиновые филаменты и быстро перекрывает растущие концы филаментов, а также образует ядро актино-вой полимеризации [Yin, H.L. and Stossel, T.P. (1980), Kurth, M. and Bryan, J. (1984), Janmey, P.A., and
Stossel, T.P. (1987)].
В заявке WO 0039160 описаны белки, взаимодействующие с каспазой-8, способные взаимодействовать с Sub-1 и/или Sub-2 каспазы-8. Белки, взаимодействующие с каспазой, обнаружены при двугибрид-ном скрининге с использованием одноцепочечной конструкции каспазы-8.
Обычно одновременная очистка каспазы-8 и белков, связанных с каспазой-8, включает модификацию меченого эпитопа каспазы-8 (например, НА-слияние с каспазой-8, Roth et al.) и применение антимеченых специфических антител. Однако эпитопное мечение белков может оказывать влияние на активность меченых белков.
- 4 -
009770
Имеются следующие антитела, специфические к каспазе-8.
Anti-Mach, каталожный № 218777, являются поликлональными куриными антителами фирмы Calbiochem, которые распознают как прокаспазу-8, так и активную каспазу-8. Для получения названного антитела в качестве иммуногена используют полноразмерный белок рекомбинантной каспазы-8 человека.
Каспаза-8 (D384) 6В6 является моноклональным антителом от Cell Signaling technology, полученным иммунизацией мышей синтетическим пептидом, связанным с KLH, который соответствует остаткам, картированным на аминоконце Sub-2 каспазы-8. Названные антитела специфически выявляют эндогенные уровни отщепленной небольшой субъединицы каспазы-8 10 кДа при вестерн-блоттинге. Названные Mab рекомендуют для вестерн-блоттинга, и они не дают перекрестной реакции с полноразмерной каспазой-8.
Антитело В9-2 является моноклональным антителом фирмы Pharmaingen (A Becton Dickinson Company), которое распознает полосу 55 кДа, соответствующую каспазе-8. Рекомбинантный белковый фрагмент каспазы-8 человека, соответствующий аминокислотам 335-469 каспазы-8, использовали как имму-ноген (Weaver et al., 2000). Упомянутое моноклональное антитело рекомендуют для контроля уровней каспазы-8 при анализе с помощью вестерн-блоттинга. Идентификацию активной каспазы-8 с применением описанных Mabs невозможно проводить вследствие того, что фрагмент, используемый для образования антител, оказывается интактным только в неактивной каспазе-8.
Каспаза-8 p10 (S-19):sc-6135 представляет собой аффинно-очищенное козье поликлональное антитело фирмы Santa Cruz biotechnology, индуцированное против пептида, картированного вблизи карбоксильного конца Sub-2 каспазы-8 человека. Названное поликлональное антитело взаимодействует с субъединицей р10 (Sub-2) и предшественником каспазы-8 человека при вестерн-блоттинге, иммунопреципи-тации и иммуногистохимии. Оно не дает перекрестной реакции с каспазой-8 р20 (Sub-1).
Каспаза-8 IC12 представляет собой моноклональное антитело фирмы Cell Signaling technology, полученное иммунизацией мышей синтетическим пептидом, связанным с KLH, который соответствует остаткам, картированным на карбоксильном конце Sub-1 каспазы-8. Названное антитело специфически распознает прокаспазу-8 и активную каспазу-8 при вестерн-блоттинге.
Точная последовательность пептида, использованного для иммунизации мышей для образования Mab, неизвестна.
Каспаза-8 р20 (Н-134):sc-7890 представляет собой кроличье поликлональное антитело фирмы Santa Cruz biotechnology, индуцированное против рекомбинантного белка, соответствующего аминокислотам 217-350, картированным в Sub-1 каспазы-8 человека. Названное поликлональное антитело взаимодействует с активной каспазой-8 и предшественником каспазы-8 мыши, крысы и человека при вестерн-блоттинге, иммунопреципитации и иммуногистохимии.
Однако не существует никакой информации относительно эффективности, при которой каспаза-8 иммунопреципитирует, и может ли связанный белок соосаждаться и, если так, возможно ли получение каспазы-8 и белков, связанных с каспазой-8, из иммунного комплекса.
Таким образом, в настоящее время не описаны поликлональные и моноклональные антитела против каспазы-8, которые обладают всеми следующими свойствами: способны эффективно иммунопреципити-ровать как прокаспазу-8, так и активную каспазу-8 и отделять каспазу-8 из иммунопреципитированного комплекса, допуская проведение одновременной очистки каспазы-8 и белков, связанных с каспазой-8.
Поэтому способ данного изобретения разрешает длительно существующую проблему в области сопреципитации и очистки каспазы-8 и белков, связанных с каспазой-8.
Краткое изложение излбретения
Антитело (поликлональное, моноклональное, химерное, полностью гуманизированное анти-анти-Id-антитело или его фрагмент), которое получают иммунизацией животного пептидом из С-конца Sub-1-единицы каспазы-8 (например, CQGDNYQKGIPVETD), и его фрагменты, способно соиммунопреципи-тировать названную каспазу (как активную каспазу-8, так и прокаспазу-8) вместе с белком, связанным с каспазой, и эффективно высвобождать каспазу и связанный белок из иммунного комплекса при элюции. В частности, пептид, используемый для иммунизации, предпочтительно может быть связан с KLH.
В одном аспекте антитело согласно изобретению представляет собой изотип иммуноглобулина
IgG1.
В другом аспекте антитело изобретения запускает процессинг каспазы-8.
В еще одном аспекте в изобретении представлено антитело, которое можно использовать для разработки ELISA-анализа.
В следующем аспекте в изобретении представлен способ получения антитела согласно изобретению и применения антитела в способе выделения ассоциированных с каспазой белков, более предпочтительно ассоциированного с каспазой белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, или изоформы, аллельного варианта, фрагмента, функционального аналога, слитого белка, их мутанта или производного, присутствующих в клеточных образцах, например клеточных экстрактах, библиотеках экспрессируемых кДНК и геномных или комбинаторных пептидных библиотеках. Более конкретно, изобретение имеет отношение к применению названного антитела для выделения ассоциированных с каспазой белков, причем каспазой является каспаза-8.
- 5 -
009770
В еще одном аспекте изобретения иммуноген, используемый для иммунизации, связывают с носителем, предпочтительно KLH.
В изобретении также представлен способ очистки каспазы, предпочтительно каспазы-8, и ассоциированных с каспазой белков, включающий контактирование материала, содержащего каспазу человека, с указанным моноклональным антителом. В частности, ассоциированные с каспазой белки, элюируют предпочтительно пептидом, использованным для иммунизации.
Кроме того, в изобретении представлен способ очистки регуляторных белков каспазы-8, связанных с С-концевым доменом каспазы-8, с помощью антител, полученных к С-концевому домену Sub-1 (например, Mab 179), в комбинации с антителами, полученными к N-концевому домену Sub-1 (например, Mab 182), включающий сначала соосаждение каспазы-8 и регуляторных белков антителами к N-концевому домену, а затем использование антител против С-концевого домена для элюции регулятор-ных белков каспазы-8.
Кроме того, в изобретении представлено применение эпитопа 179 (SEQ ID:4) для получения антитела согласно изобретению, включающее иммунизацию животного таким эпитопом.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность прокаспазы-8. Пептидные последовательности из каспазы-8, использованные для получения Mab, изображены жирным шрифтом и подчеркнуты.
Пептид 179 - пептид CQGDNYQKGIPVETD, соответствующий С-концу большой субъединицы каспазы-8 (Sub-1).
Пептид 182 - пептид LSSPQTRYIPDEAD, соответствующий N-концу малой субъединицы каспазы-8
(Sub-2, остатки Lys385-Gly399).
Пептид 183 - пептид SESQTLDKVYQMKSKPR, соответствующий N-концу Sub-1 (остатки Ser217-
Gly234).
На фиг. 2 продемонстрирована эффективная иммунопреципитация незначительных количеств кас-пазы-8, обнаруженных в лизатах клеток BJAB, с помощью моноклональных антител против эпитопа 179. Элиминация каспазы-8 из лизатов клеток BJAB (полученных до (-) и после (+) стимуляции рецептора Fas) иммунопреципитацией различными антителами представлена слева направо:
дорожки 3 и 4, Mab 179: моноклональное антитело, полученное против пептида, соответствующего С-концу Sub-1 (большая субъединица каспазы-8, остатки Cys360-Asp374);
дорожки 5 и 6, Mab 183.1 и дорожки 7 и 8, Mab 183.2: два моноклональных антитела, полученных против пептида, соответствующего N-концу Sub-1 (остатки Ser217-Gly234);
дорожки 9 и 10, Mab 182: моноклональное антитело, полученное против пептида, соответствующего N-концу Sub-2 (малая субъединица каспазы-8) (остатки Lys385-Asp399);
дорожка 11 NMS: нормальная мышиная сыворотка.
На фигуре представлены результаты оценки с помощью вестерн-блоттинга количеств каспазы-8, оставшихся в клеточных лизатах после иммунопреципитации указанными антителами и в неосажденных общих клеточных лизатах (дорожки 1 и 2).
На фиг. 3а изображена элюция каспазы-8, иммунопреципитированной, как показано на фиг. 2, посредством конкуренции с пептидами, против которых были получены различные антитела. Каспазу-8 в элюатах из иммунопреципитатов, образованных указанными антителами, определяли с помощью вестерн-блоттинг-анализа (как на фиг. 2).
На фиг. 3b изображена элюция каспазы-8, иммунопреципитированной, как показано на фиг. 2, в результате конкуренции с пептидами, против которых были получены различные антитела. Каспазу-8 в элюатах из иммунопреципитатов, образованных указанными антителами, выявляли окрашиванием серебром.
На фиг. 4 показана эффективная иммунопреципитация незначительных количеств каспазы-8, обнаруженных в лизатах клеток BJAB, при использовании поликлональной сыворотки, полученной при иммунизации пептидом, соответствующим С-концу Sub-1 (большая субъединица каспазы-8, остатки Cys360-Asp374). Элиминация каспазы-8 из лизатов клеток BJAB (полученных до (-) и после (+) стимуляции рецептора Fas) иммунопреципитацией различными антителами показана слева направо. Оставшуюся в лизате каспазу-8 определяли с помощью вестерн-блоттинг-анализа после иммунопреципитации следующими антителами:
дорожки 3 и 4, NMS: нормальная мышиная сыворотка;
дорожки 5 и 6, анти-179 поликлональное антитело, поликлональное антитело кролика, полученное против С-конца Sub-1 (большая субъединица каспазы-8, остатки Cys360-Asp374); дорожки 7 и 8, Mab 182; TL - общий клеточный лизат.
- 6 -
009770
На фиг. 5 представлена каспаза-8, иммунопреципитированная и элюированная из лизатов нестиму-лированных клеток BJAB при использовании различных антител. Уровни каспазы-8, представленные слева направо, определяли методом вестерн-блоттинга после элюции иммунопреципитатов, проведенного со следующими антителами:
дорожка 1, анти-183: поликлональная сыворотка против N-конца Sub-1 (остатки Ser217-Gly234);
дорожка 2, Mab183.2: моноклональное антитело против N-конца Sub-1 (остатки Ser217-Gly234);
дорожка 3, Mab179, моноклональное антитело против С-конца Sub-1 (большая субъединица каспа-зы-8, остатки Cys360-Asp374).
Небольшой (5,6 кДа) фрагмент каспазы-8, полученный с помощью нового режима процессинга, индуцированного Mab179, отмечен стрелкой.
На фиг. 6 представлены каспаза-8 и ассоциированный белок (P72/Cari), которые были иммунопре-ципитированы Mab179 из лизатов клеток Bjab перед или после одночасовой стимуляции Fas-лигандом и элюированы пептидом 179. Каспазу-8 и ассоциированные белки, иммунопреципитированные Mab179, элюировали (как показано на фиг. 3b), разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали серебром. На дорожках 1 и 2 представлены контроли, в которых клеточные лизаты иммунопреципитировали MIgG1 (иммуноглобулин мыши IgG1).
На фиг. 7 изображено схематическое представление мотивов белка Р72. Один свернутый спиральный мотив (С) и два расположенных друг за другом "мотива SURP" (S) расположены близко к N-концу белка, а один мотив, "G-участок", локализован на С-конце белка (G-мотив). Также указан остаток аспа-рагиновой кислоты D600, присутствующий внутри мотива G. D600 является мутантом, в котором остаток D600 в белке замещен остатком глутаминовой кислоты.
На фиг. 8 изображено схематическое представление подхода, используемого для получения полноразмерной кДНК р72. Клон EST IMAGE 2964545, приобретенный у фирмы Incyte Genomics, в котором отсутствует последовательность первых 21 нуклеотида (которые кодируют первые 7 аминокислот), использовали как матрицу для первой полимеразной цепной реакции (ПЦР) вместе с парой праймеров: прямой праймер, Р2, содержащий нуклеиновые кислоты, перекрывающиеся с клоном 5' EST, и дополнительные 15 нуклеотидов из 21 отсутствующего нуклеотида, и обратный праймер, P3, содержащий последовательности, перекрывающиеся с 3' EST. Полученный продукт ПЦР использовали как матрицу для второй ПЦР вместе с парой праймеров: прямой праймер P1, содержащий все 21 отсутствующие нуклео-тиды и 5 нуклеиновых кислот EST, и обратный праймер P3, содержащий последовательности, перекрывающиеся с 3' EST.
На фиг. 9 продемонстрирована соиммунопреципитация каспазы-8 и р72 посредством Mab179 из ли-затов клеток Bjab в нулевое время и после 20 мин стимуляции Fas-лигандом. Белки, элюированные после иммунопреципитации Mab179, разделяли в гелях SDS-PAGE и выявляли окрашиванием серебром. Зону с предположительной молекулярной массой приблизительно 72,5 кДа, соответствующую р72, соосаждали с прокаспазой-8 перед Fas-лигандной стимуляцией (дорожка 3). После 20-минутной стимуляции зона дорожки 72,5 кДа уменьшалась и обнаруживали новую зону, соответствующую белку с более низкой предположительной молекулярной массой приблизительно 68 кДа (дорожка 4).
На дорожках 1 и 2 представлены отрицательные контроли, включая иммунопреципитацию клеточных лизатов MIgGl, иммуноглобулин мыши IgGl.
На фиг. 10 продемонстрировано расщепление р72 активной каспазой-8. Белок, кодируемый кДНК Р72, экспрессировали in vitro в ретикулоцитных лизатах в присутствии S35-метионина, используя систему ретикулоцитных лизатов, связанную с TnT T7, и тестировали после инкубации в течение 1 ч при 37°С в присутствии и в отсутствие рекомбинантной активной каспазы-8. Кроме того, расщепление р72 изучали с продуктами TnT, кодируемыми 2 различными мутантами кДНК р72:
один, кодирующий р72, в котором остаток D600, как полагают, является остатком-мишенью для каспазы-8, мутировали в Е [р72 (D600E)], и
другой, в котором делетирован ген, а в полученном усеченном белке отсутствуют нижележащие остатки [D600 h72 (1-600)].
Полученные белки разделяли при SDS-PAGE, а результаты проявляли с помощью фосфовизуализации.
На фиг. 11 представлены каспаза-8 и р72, которые были соиммунопреципитированы Mab179 из ли-затов клеток Bjab до (0') или после 5, 10, 20, 40 и 60 мин стимуляции Fas-лигандом. Пептиды элюирова-ли, разделяли в гелях SDS-PAGE и выявляли окрашиванием серебром. До стимуляции (0') обнаружен пептид с предположительной молекулярной массой 72,5 кДа. После 5 и 10 мин стимуляции появлялся новый белок с более низкой предположительной молекулярной массой около 68 кДа. После 40 мин стимуляции зона дорожки 72,5 кДа полностью исчезала, а определяли только зону 68 кДа. На 60 мин ни один из упомянутых выше белков не сопреципитировал с каспазой-8.
- 7 -
009770
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к антителам, направленным против С-домена Sub-1 каспазы-8. Установлено, что антитела против названного домена представляют интерес благодаря их способности им-муноприципитировать каспазу-8 (прокаспазу-8 и активную каспазу) с высокой эффективностью, даже если каспаза присутствует в очень низкой концентрации. Названные антитела также можно применять для эффективного соосаждения и выделения белка, связанного с каспазой-8.
Антитела согласно изобретению могут быть поликлональными или более предпочтительно моно-клональными. В предпочтительном аспекте пептид, полученный из С-конца Sub-1 каспазы-8, содержащий остатки Cys360-Asp374 и последовательность CQGDNYQKGIPVETD (пептид 179 SEQ ID: 4), используют для иммунизации, чтобы получить антитела.
Применяемый для иммунизации пептид может быть синтезирован, очищен с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и соединен с любым носителем, таким как KLH, предпочтительно через его природный цистеин или через искусственно слитый цистеин, чтобы экспонировать пептид на поверхности носителя, и использован для иммунизации, например, мышей моноклональных антител и кролика для получения поликлональных антител.
В одном аспекте соиммунопреципитацию каспазы-8 и белков, связанных с каспазой-8, проводят с использованием антитела к каспазе-8, специфическому к эпитопу 179, обнаруженному на С-концевом домене Sub-1.
Соиммунопреципитацию согласно изобретению проводят на образцах, выбранных из клеточных лизатов покоящихся и стимулированных клеток или из библиотек экспрессируемых кДНК, из библиотек геномных или комбинаторных пептидов.
Клетки можно стимулировать перед лизисом и иммунопреципитацией, используя различные индуцирующие апоптоз агенты, такие как обработка лимфокинами, например Fas-лигандом, TNF, или факторами, связанными с окружающей средой, такими как голодание, тепловой шок и т.д.
Используя антитела для соиммунопреципитации согласно изобретению, можно эффективно элюи-ровать каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок из иммунопреципитированного комплекса и извлечь в супернатант в результате конкуренции с пептидом, полученным из CQGDNYQKGIPVETD каспазы-8, тем же пептидом, который использовали для иммунизации.
Пептид 179 или эпитоп 179 каспазы-8 с последовательностью CQGDNYQKGIPVETD и SEQ ID NO: 4 или мутеин, его фрагмент, слитый белок или его производное можно применять для иммунизации и образования антител согласно изобретению. Пептид для иммунизации может быть получен в результате химического синтеза, как описано выше, или технологией рекомбинантной ДНК в клетках млекипитающего, или в результате расщепления очищенного белка. Белок также может продуцироваться в клетках бактерий или насекомых, что подробно описано в Current Protocols in Molecular Biology, by F.M. Ausubel, ISBN: 047150338X, 1988, chapter 16.
Данное изобретение также относится к мутеинам вышеупомянутого эпитопа 179 (SEQ ID NO: 4) изобретения, которые в основном сохраняют те же свойства пептида, имеющего, по существу, только природно встречающиеся последовательности пептида. Такие "мутеины" могут быть мутеинами, в которых аминокислотные остатки могут быть делетированы, добавлены или замещены другими остатками так, что модификации данного вида существенно не изменяют биологические свойства пептидного му-теина по сравнению с самим пептидом.
Названные мутеины получают по известному способу синтеза и/или по способам сайт-направленного мутагенеза или любым другим известным способом, подходящим для этого.
Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с данным изобретением являются изменения, которые известны как "консервативные" замещения. Консервативные аминокислотные замещения включают схожие аминокислоты в пределах группы, которые имеют достаточно похожие физико-химические свойства, так что замещения между представителями группы будут сохранять биологические функции молекулы, Grantham, Science, vol. 185, p. 862-864 (1974). Ясно, что инсерции и делеции из аминокислот также могут быть осуществлены в описанных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если инсерции или делеции затрагивают только несколько аминокислот, например меньше 3 и предпочтительно меньше 2, и не удаляют или замещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации.
Предпочтительно схожими аминокислотными группами являются группы, обозначенные в табл. 1, более предпочтительно - группы, обозначенные в табл. 2, и наиболее предпочтительно - группы, обозначенные в табл. 3.
- 8 -
009770
Таблица 1
Предпочтительные группы схожих аминокислот
Аминокислота Схожая группа
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu fie, Phe, Туг, Met, Vol, Leu
Pro Gly,Afa, Thr, Pro
Thr Pro, Ser. Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Mel, Туг, Phe, lie, Leu, Val
Gly Ala, Thr, Pro, Ser. Gly
He Met,Tyr, Phe, Va!, Leu, lie
Phe Trp, Met, Туг, He, Val, Leu, Phe
Туг Tip, Met, Phe, He, Val, Leu, Туг
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn Gin, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met Phe, He, Val, Leu, Met
Trp Tip
- 9 -
009770
Таблица 2
Более предпочтительные группы схожих аминокислот
Аминокислота Схожая группа
Ser Ser
Arg His, Lys, Arg
Leu Ne, Phe, Met, Leu
Pro Ala, Pro
Thr Thr
Ala Pro, Ala
Val Met, He, Val
Gly Gly
He lie, Met, Phe, Val, Leu
Phe Met, Tyr, lie, Leu, Phe
Туг Phe, Tyr
Cys Ser, Cys
His Arg, Gin, His
Gin Glu, His, Gin
Asn Asp, Asn
Lys Arg, Lys
Asp Asn, Asp
Glu Gin, Glu
Mel Phe, He, Val, Leu, Met
Trp Tip
- 10 -
009770
Таблица 3
Наиболее предпочтительные группы схожих аминокислот
Аминокислота
Схожая группа
Ser
Ser
Arg
Arg
Leu
lie, Met, Leu
Pro
Pro
Thr
Thr
Ala
Ala ¦
Val
Val
Gly
Gly
lie, Met, Leu
Phe
Phe
Tyr
Tyr
Cys
Ser, Cys
His
His
Gin
Gin
Asn
Asn
Lys
Lys
Asp
Asp
Glu
Glu
Met
He, Leu, Met
Trp
Trp
Примеры осуществления аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для получения мутеинов белков для применения в данном изобретении, включают в себя любые известные стадии способов, такие как описанные в патентах США RE 33653, 4959314 и 4737462 (Mark et al.);
5116943 (Koths et al.); 4965195 (Namen et al.); 4879111 (Chong et al.); и 5017691 (Lee et al.); и лизин-
замещенные белки, описанные в патенте США № 4904584 (Straw et al.).
Затем белок или пептид очищают из синтезированной смеси или из клеток, в которых он продуцируется. Способы очистки белка известны специалистам в данной области и подробно описаны, например, в упомянутых выше Current Protocols in Molecular Biology, chapter 16, и в Current Protocols in Protein Science, Wiley and Sons Inc. Chapter 5 and 6. Оказывается благоприятно, если пептид можно получать в виде гибрида с KLH или глутатион-3-трансферазой или т.п., или с последовательностью-меткой, такой как гистидинмеченая последовательность. Применение слитых или меченых белков упрощает процедуру очистки, что подробно описано в упомянутых Current Protocols in Molecular Biology, chapter 16, и в инструкциях для указанной выше экспрессии His-метка-белка Qiagen, и в инструкции к набору для очистки.
Если белок или пептид экспрессируют в виде слитого белка, партнер слияния следует удалять перед применением белка для получения антител для того, чтобы избежать образования антител против партнера слияния. Расщепление партнеров слияния и выделение желаемого белка описаны в упомянутых Current Protocols in Molecular Biology, chapter 16. Векторы, протоколы и реагенты для экспрессии и очистки мальтоза-связывающего белка, слитого с рекомбинатными белками, также поставляются коммерчески.
- 11 -
009770
При получении пептида может не требоваться удаление партнера слияния, так как слитый белок может стимулировать продукцию антител против пептида.
Кроме того, как отмечено выше, пептид также можно синтезировать по химическим способам, известным в области химии.
Получение поликлональных антител против белков описано в chapter 2 of Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. Получение антител против пептидов может требовать некоторых изменений в протоколе вследствие обычно более низкой антигенности пептидов по сравнению с белками. Получение поликлональных антител против пептидов описано в указанных Current Protocols in Immunology, chapter 9.
Моноклональные антитела можно получать из В-клеток, взятых из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных животных, в частности крыс или мышей, посредством слияния с иммортализо-ванными В-клетками в условиях, которые способствуют росту гибридных клеток. Для слияния мышиных В-клеток предпочтительны клетки линии Ag-8.
Способ получения моноклональных антител описан во многих статьях и руководствах, таких как Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. Chapter 2. В главе 9 описывают иммунизацию животных пептидами. Клетки селезенки или лимфатических узлов названных животных можно использовать таким же образом, как используют клетки селезенки или лимфатических узлов иммунизированных белком животных для получения моноклональных антител, что описано в главе 2 там же.
Кроме того, способы, используемые для получения моноклональных антител, описаны Kohler and Milstein (1975) и в патенте США 4376110.
Получение антител из банка генов антител человека, у которых их гипервариабельные области замещают почти случайными последовательностями, описано в USP 5840479. Такие антитела являются предпочтительными, когда трудно иммунизировать животное данным пептидом или белком. Некоторые структуры являются плохими иммуногенами и могут оставаться такими, несмотря на добавление адъю-вантов и связывание с другими белками в слитых конструкциях. Кроме того, антитела, описанные в USP 5840479, оказываются предпочтительными, если желательно применять антитела со структурой подобной антителам человека, например, когда требуются антитела, которые имеют низкую иммуногенность у человека.
После идентификации подходящего антитела, может оказаться желательным изменить его свойства. Например, используя химерное антитело, можно достигнуть более высокого выхода в продуцировании. Кроме того, химерные антитела, в которых константные области замещают константными областями антител человека, требуются, когда желательно, чтобы антитело обладало низкой иммуногенностью у человека. Получение химерных антител описано в ряде публикаций, таких как Cabilly et al., 1984; Morrison et al., 1984; Boulianne et al., 1984; EP 125023, EP 171496, EP 173494, EP 184187, WO 86/01533, WO 87/02671 и Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
"Полностью гуманизированные антитела" представляют собой молекулы, содержащие как вариабельную, так и константную область иммуноглобулина человека. Полностью гуманизированные антитела потенциально можно использовать для терапевтического применения, когда требуется продолжительное лечение при хронических и рецидивирующих заболеваниях, таких как аутоиммунные заболевания. Один способ получения полностью гуманизированных антител человека состоит из "гуманизации" гуморальной иммунной системы мыши, т. е. получение мышиных линий, способных продуцировать Ig человека (ксеномыши) в результате введения локусов иммуноглобулина (Ig) человека мышам, у которых эндогенные гены Ig были инактивированы. Локусы Ig являются чрезвычайно сложными с точки зрения как их физической структуры, так и реаранжировки генов и способов экспрессии, требуемых, чтобы вызвать в конечном счете ярко выраженный иммунный ответ. Разнообразие антител достигается, главным образом, комбинаторной реаранжировкой между различными генами V, D и J, присутствующими в локу-сах Ig. Названные локусы также содержат разнообразные регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию антител, аллельное исключение, изменение классов и созревание аффинности. Введение нереаранжированных трансгенов Ig человека мышам продемонстрировало, что мышиный механизм рекомбинации является совместимым с генами человека. Кроме того, гибридому, секретирующую антиген-специфические hu-mAb различных изотипов, можно получать в результате иммунизации ксеномышей антигеном.
Полностью гуманизированные антитела и способы их получения известны в данной области (Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997); Buggemann et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 (2000), патент WO 98/24893.
Другим типом антитела является антиидиотипическое антитело. Антиидиотипическое (анти-Id) антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающим участком антитела. Id-антитело можно получать иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, мышиную линию) как источник Mab, к которому получают анти-Id. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела посредством продукции антитела к названным идиотипическим детерминантам (анти-Ы-антитело). См., например, патент США № 4699880, который полностью включен в
- 12 -
009770
описание путем ссылки.
Анти-Ы-антитело также можно использовать как "иммуноген", чтобы индуцировать иммунный ответ еще у другого животного, получая так называемое анти-анти-Ы-антитело. Анти-анти-Id может быть идентичным по антигенным детерминантам первоначальному mAb, которое индуцировало анти-Id. Таким образом, в результате использования антител к идиотипическим детерминантам mAb, оказывается возможным идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с идентичной специфичностью.
Соответственно, Mabs, полученные против С-концевой субъединицы каспазы-8, ее аналогов, фрагментов или производных данного изобретения можно использовать, чтобы индуцировать анти-Id-антитела у подходящих животных, таких как мыши BALB/c. Клетки селезенки от таких иммунизированных мышей применяют, чтобы получить анти-Ы-гибридомы, секретирующие анти-Id mAb. Кроме того, анти-Id mAb можно связывать с носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH), и использовать, чтобы иммунизировать дополнительных мышей BALB/c. Сыворотки от названных мышей будут содержать анти-анти-Id антитела, которые характеризуются связывающими свойствами исходных mAb, специфичных в отношении эпитопа упомянутой выше каспазы-8 или ее аналогов, фрагментов и производных.
Таким образом, анти-Id-mAb содержат свои собственные идиотипические эпитопы или "идиотопы", которые структурно похожи на оцениваемый эпитоп.
Термин "антитело" также подразумевает включение обеих интактных молекул, а также их фрагментов, таких как, например, Fab и F(ab')2, которые способны связывать антиген. Фрагменты Fab и F(ab')2 не содержат фрагмент Fc интактного антитела, более быстро выводятся из циркуляции и могут характеризоваться меньшим неспецифическим тканевым связыванием, чем интактное антитело (Wahl et al.,
1983).
Следует понимать, что Fab и F(ab')2 и другие фрагменты антител, используемые в данном изобретении, можно применять для обнаружения и количественного определения белка р72 в соответствии со способами, представленными в описании для интактных молекул антител. Обычно такие фрагменты получают в результате протеолитического расщепления, используя ферменты, такие как папаин (чтобы получить фрагменты Fab) или пепсин (чтобы получить фрагменты F(ab')2).
Как отмечено, антитело "способно связывать" молекулу, если оно может специфически взаимодействовать с молекулой, чтобы таким образом связать молекулу с антителом. Термин "эпитоп", как полагают, относится к той части любой молекулы, которая способна связываться антителом и которая также может быть распознана таким антителом. Эпитопы или "антигенные детерминанты" обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и обладают специфическими особенностями трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда.
" Антиген" представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться антителом, которая, кроме того, способна стимулировать животное к продукции антитела, способного связывать эпитоп такого антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов. Подразумевается, что упомянутая выше специфическая реакция указывает, что антиген будет реагировать высокоселективным способом со своим соответствующим антителом, а не с множеством других антител, которые могут быть индуцированы другими антигенами.
Эпитоп 179 изобретения можно использовать для создания поликлональных, моноклональных антител для выраженной иммунопреципитации и элюции каспазы-8 и белков, ассоциированных с каспазой-8. Антитела также можно использовать, чтобы индуцировать новый процессинг каспазы-8.
Антитела, полученные к С-концевому домену Sub-1, такие как Mab 179, можно применять в комбинации с антителами, полученными к N-концевому домену Sub-1, такими как Mab 183, чтобы специфически выделять регуляторные белки каспазы-8. Известно, что С-концевой домен Sub-1 является частью активного центра каспазы-8 и поэтому регуляторные белки могут связывать его (Thornberry et al., 1997). Соосаждение каспазы-8 и регуляторных белков, ассоциированное сначала с Mab 183, а затем с применением Mab 179, может высвобождать регуляторные белки от каспазы-8 в среду и приводить к идентификации ключевых белков, вовлеченных в регуляцию апоптоза.
В одном аспекте Cari, белок, связывающий прокаспазу-8, выделяют, используя иммунопреципита-цию по изобретению с Mab 179. Установлено, что Cari расщепляется активной каспазой-8 и вовлечен в активацию каспазы-8 и апоптоз.
Антитела (или их фрагменты), используемые в данном изобретении, можно применять гистологически в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии для выявления каспазы-8 in situ. Выявление in situ может быть достигнуто в результате удаления гистологического препарата у пациента и применения меченого антитела данного изобретения для такого препарата. Предпочтительно, антитело (или фрагмент) применяют, контактируя меченое антитело или покрывая им (или фрагментом) биологический препарат. Применяя данное изобретение, специалист в данной области должен понимать, что любой из большого разнообразия гистологических способов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать, чтобы успешно выполнить подобное выявление in situ.
- 13 -
009770
Биологический образец можно обрабатывать твердофазной подложкой или носителем, таким как нитроцеллюлоза или другой твердой подложкой или носителем, которые способны иммобилизовать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем подложку или носитель можно промывать подходящим буфером с последующей обработкой антителом, меченным выявляемой меткой, в соответствии с данным изобретением, как отмечено выше. Потом твердофазную подложку или носитель можно промывать буфером, чтобы второй раз удалить несвязанные антитела. Количество связанной метки на названной твердой подложке или носителе затем можно определять общепринятыми способами.
Под термином "твердофазная подложка", "твердофазный носитель", "твердая подложка", "твердый носитель", "подложка" или "носитель" подразумевают любую подложку или носитель, которые способны связывать антиген или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлоновые амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Для целей данного изобретения носитель может быть или растворимым до некоторой степени, или нерастворимым. Материал подложки фактически может иметь любую возможную структурную конфигурацию, пока связанная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки или носителя может быть сферической в виде гранул, цилиндрической как внутренняя поверхность пробирки или внешняя поверхность стержня. Альтернативно, поверхность может быть плоской как лист, тест-полоска и т.д. Предпочтительные подложки или носители включают в себя полистироловые гранулы. Специалистам в данной области хорошо известны многие другие подходящие носители для связывания антитела или антигена или они смогут их выбрать при обычном экспериментировании.
Как отмечено выше, связывающая активность данной партии антител изобретения может быть установлена с помощью хорошо известных способов. Специалисты в данной области смогут выбрать рабочие и оптимальные условия исследования для каждого определения в результате обычного экспериментирования.
Другие стадии, такие как промывание, перемешивание, встряхивание, фильтрование и т. п., могут быть добавлены к исследованию, так как являются обычными и необходимыми при определенной ситуации.
Одним из способов, при котором антитело в соответствии с данным изобретением можно эффективно метить, является связывание антитела с ферментом и применение в иммуноферментном анализе (EIA). В свою очередь, названный фермент при экспозиции с соответствующим субстратом, будет взаимодействовать с субстратом так, чтобы образовать химический фрагмент, который можно определять, например, спектрофотометрическим, флуориметрическим или визуальным способом. Ферменты, которые можно использовать для детектируемого мечения антитела, не ограничиваясь, включают малатде-гидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, алкогольдегидрогеназу дрожжей, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Выявление можно проводить колориметрическими способами, в которых применяют хромогенные субстраты для фермента. Выявление также можно осуществлять визуальным сравнением степени энзиматической реакции с субстратом по сравнению с реакцией, проведенной со стандартами.
Выявление можно проводить, используя любой из целого ряда других иммуноанализов. Например, с помощью радиоактивного мечения антител или фрагментов антител оказалось возможным определять R-PTP-азу посредством применения радиоиммуноанализа (RIA). Хорошее описание RIA представлено в Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), особенно это касается главы, озаглавленной "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard, Т., включенной в описание в виде ссылки. Радиоактивные изотопы можно выявлять такими способами, как применение g-счетчика или сцинтилляционного счетчика или с помощью авторадиографии.
Также оказывается возможным метить антитело в соответствии с данным изобретением флуоресцентным соединением. Когда меченное флуоресцентной меткой антитело подвергают действию излучения надлежащей длины волны, присутствие антитела затем можно определить по флуоресценции. К числу многих обычно используемых флуоресцентно меченых соединений относятся флуоресцеинизотио-цианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальальдегид и флуорескамин.
Антитело также можно эффективно метить, используя излучающие флуоресценцию металлы, такие как 152E или другие из ряда лантанидов. Названные металлы можно присоединять к антителу, применяя такие металл-хелатирующие группы, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ETPA).
Антитело также можно метить связыванием его с хемилюминесцентным соединением. Затем присутствие меченого хемилюминесценым соединением антитело обнаруживают по люминесценции, которая возникает во время химической реакции. Примерами особо подходящих хемилюминесцентно меченых соединений являются луминол, изолуминол, сложный ароматический эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.
- 14 -
009770
Аналогично, биолюминесцентное соединение можно применять для мечения антитела данного изобретения. Биолюминесценция является типом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка обнаруживают, определяя люминесценцию. Важным биолюминесцентным соединением для целей мечения являются люциферин, люцифераза и эхиорин.
Молекулу антитела данного изобретения можно адаптировать для применения в иммунометриче-ском анализе, также известном как "двухслойный" или "сэндвич" анализ. В типичном иммунометриче-ском анализе, количество немеченых антител (или фрагментов антител) связывают с твердой подложкой или носителем, а количество растворимых антител, связанных с выявляемой меткой, добавляют, чтобы иметь возможность обнаружить и/или количественно определить тройной комплекс, образованный между твердофазным антителом, антигеном и меченым антителом.
Типичный и предпочтительный иммунометрический анализ включает в себя "прямой" анализ, в котором антитело, связанное с твердой фазой, сначала контактирует с тестируемым образцом, чтобы экстрагировать антиген из образца посредством образования двойного твердофазного комплекса антитело-антиген. После соответствующего инкубационного периода, твердую подложку или носитель промывают, чтобы удалить остаток жидкого образца, включая непрореагировавший антиген, если он вообще имеется, а затем контактируют с раствором, содержащим неизвестное количество меченых антител (которые функционируют как "репортерная молекула"). После второго периода инкубации, во время которой меченое антитело имеет возможность образовать комплекс с антигеном, связанным с твердой подложкой или носителем через немеченое антитело, твердую подложку или носитель промывают второй раз, чтобы удалить непрореагировавшие меченые антитела.
В другом типе "сэндвич" анализа, который также можно применять с антигенами данного изобретения, используют так называемый "одновременный" и "обратный" анализ. Одновременный анализ включает одну стадию инкубации, при которой антитело, связанное с твердой подложкой или носителем, и меченое антитело одновременно добавляют к тестируемому образцу. После завершения инкубации твердую подложку или носитель промывают, чтобы удалить остаток жидкого образца и не включенные в комплекс меченые антитела. Затем присутствие меченых антител, ассоциированных с твердой подложкой или носителем, фактически определяют с помощью обычного "прямого" сэдвич-анализа.
В "обратном" анализе применяют сначала ступенчатое добавление раствора меченого антитела к жидкому образцу с последующим добавлением немеченого антитела, связанного с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второго периода инкубации твердую фазу промывают общепринятым способом, чтобы удалить из нее остаток тестируемого образца и раствора непрореагировавших меченых антител. Затем определение меченых антител, ассоциированных с твердой подложкой или носителем, проводят как в "одновременном" и "прямом" анализе.
Создание иммуноанализов, таких как RIA и ELISA, описано во многих статьях, руководствах и других публикациях. В качестве ссылки приведена WO 97/03998, с. 48, строка 4-с.52, строка 27.
Иммуноанализ изобретения может быть двух обычных типов:
во-первых, иммуноанализ, в котором используют иммобилизованную каспазу или эквивалент пептида, может быть применен для количественного определения каспазы-8;
во-вторых, для определения количества каспазных белков можно применять иммуноанализ, в котором используют иммобилизованные антитела, направленные против эпитопа каспазы.
Такой анализ может быть использован для диагностики, так как может требоваться оценить уровень каспазы и других белков, вовлеченных в апоптозные метаболические пути, при целом ряде нарушений или синдромов, при которых возможно вовлечение таких путей.
В одном аспекте белок, взаимодействующий с прокаспазой-8, обозначенный Cari, выделяют с помощью антител согласно изобретению. Однако, если желательно иммунопреципитировать белки, связанные с другой каспазой, применяя описанный выше способ иммунопреципитации, можно использовать антитело, специфичное к С-концевому домену Sub-1 другой каспазы, а не каспазы-8.
Так как антитела согласно изобретению способны осаждать прокаспазу-8 или каспазу-8, связывающие каспазу белки могут соосаждаться вместе с активной каспазой или прокаспазой при соиммунопре-ципитации.
Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, которые не ограничивают изобретение.
- 15 -
009770
Примеры
Пример 1.
Иммунизация мышей для образования моноклональных антител, специфичных к каспазе-8.
После активации каспазу-8 расщепляли и собирали в две субъединицы (Sub-1 и Sub-2).
Для образования антител, специфичных к новым возможным эпитопам, образованным после активации каспазы-8, синтетические пептиды, полученные из С-конца Sub-1 и N-конца Sub-1 и Sub-2, использовали для иммунизации мышей.
Для иммунизации мышей для получения моноклональных антител использовали следующие пептиды.
Пептид 179 - пептид CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4), соответствующий С-концу большой субъединицы каспазы-8 (Sub-1), (эпитоп, соответствующий остаткам Cys360-Asp374, фиг. 1), синтезировали, очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой и связывали с носителем KLH через его природный цистеин, чтобы экспонировать пептид на поверхности носителя.
Пептид 182 - пептид LSSPQTRYIPDEADC (SEQ ID NO: 5), соответствующий N-концу малой субъединицы каспазы-8 (Sub-2, остатки Lys385-Cly399), синтезировали, очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой и связывали с носителем KLH через C, который не получали из последовательности Sub-2.
Пептид 183 - пептид SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6), соответствующий N-концу Sub-1 (остатки Ser217-Gly234), синтезировали, очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой и связывали с носителем KLH через C, который не происходит из последовательности Sub-1.
Четыре иммунизации и две бустер-инъекции с одинаковым количеством антигена (пептид-KLH) вводили мышам следующим образом.
Для первой иммунизации 50 мкг пептида-KLH растворяли в 50 мкл PBS, гомогенизировали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда и вводили в подушечку стопы каждой из пяти самок мышей Balb/C в возрасте 7 недель.
Для второй иммунизации, которую проводили через 2 недели после первой иммунизации, мышам внутримышечно производили бустер-инъекцию с таким же количеством пептида в 50% (об./об.) растворе неполного адъюванта Фрейнда.
Для третьей иммунизации, которую проводили через две недели после второй иммунизации, мышам внутрибрюшинно вводили 50 мкг пептида-KLH в 50 мкл PBS.
Сыворотки мышей, которым делали инъекции, тестировали через 10 дней после второй и третьей иммунизаций.
Четвертую иммунизацию (выполняли только для пептидов 182 и 183) проводили через месяц аналогичным образом, как третью иммунизацию.
Через один месяц после четвертой иммунизации (или третьей иммунизации для мышей, стимулированных пептидом 179) проводили две бустер-инъекции (таким же способом, как третью и четвертую иммунизацию) с двухдневным интервалом.
Через четыре дня селезенку и паховые лимфотические узлы двух мышей, проявлявших наивысшую специфическую иммунореактивность, брали для соединения с клетками миеломы (Eshhar Z, 1985).
Пример 2.
Иммунизация кроликов для образования поликлональных антител, специфичных к каспазе-8. Кроликов иммунизировали 179-KLH и 183-KLH для образования специфических поликлональных антител.
Первую иммунизацию проводили с 100 мкг пептида-KLH, который растворяли в 50 мкл PBS, гомогенизировали с 50 мкл полного адъюванта Фрейнда и вводили подкожно. Вторую иммунизацию проводили через две недели с таким же количеством пептида-KLH и вводили внутримышечно с неполным адъювантом Фрейнда. За описанными двумя иммунизациями следовали две бустер-инъекции таким же количеством пептида-KLH, растворенного в PBS, и вводили подкожно с двухнедельным интервалом.
Пример 3.
Получение гибридомы, селекция клонов, продуцирующих антитела, и очистка антител из асцитных жидкостей.
Процесс слияния и отбор клеток гибридомы проводили согласно протоколу Eshhar Z, 1985. Кратко, проводили слияние смеси клеток селезенки и лимфатических узлов от 2 реактивных мышей 110х106 с 32х106 миеломных клеток варианта миеломы NSO/1 при кратковременной инкубации с PEG. Сначала PEG медленно разбавляли DMEM, а затем полностью удаляли центрифугированием. Клетки повторно суспендировали в среде DMEM-HAT, распределяли в 96-луночные планшеты при концентрации приблизительно 2,5х104 клеток/лунку и инкубировали в 8% СО2-термостате при 37°С. Среду во всех лунках с гибридомой заменяли на DMEM, дополненную 10% лошадиной сывороткой (HS). Образцы супернатанта гибридомной культуры через две недели после слияния проверяли относительно присутствия специфических Mab с помощью ELISA (описано в примере 12). Клетки из лунок, в которых в культуральном су-пернатанте обнаруживали присутствие специфических антител, переносили в 24-луночные планшеты. Позитивные клетки дважды субклонировали; обнаружено, что на описанной стадии все субклоны были позитивными. Клоны выращивали в 24 лунках, а потом в 25 см2 Т-колбах. Растущие культуры контроли
- 16 -
009770
ровали в отношении секреции специфических Mab. Ампулы с клетками из позитивных культур замораживали и хранили в жидком азоте.
Приблизительно из 700 клонов, подвергнутых скринингу на выявление специфических антител к пептиду 179, обнаружили только один позитивный клон (Mab 179), из 700 клонов, подвергнутых скринингу на выявление специфических антител к пептиду 182, обнаружили только 1 позитивный клон (Mab 182) и из 1100 клонов, подвергнутых скринингу на выявление специфических антител к пептиду 183, обнаружили только 2 позитивных клона (Mabs 183.1 и 183.2). Позитивные клоны субклонировали при ограничивающем разведении в 96-луночных планшетах. Супернатанты от растущих клонов несколько раз тестировали на специфические антитела с помощью ELISA (описано в примере 12).
Позитивные гибридомные клоны выращивали в тканевых культуральных колбах в DMEM, содержащей 15% лошадиную сыворотку, а ампулы с материалом от части культур замораживали. Параллельно, клетки различных гибридомных клонов вводили каждой из 2-4 мышей, чтобы получить асцитные жидкости. Антитела очищали из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии, используя гранулы аффигеля (аффигель 15 Biorad), сшитые с BSA (Pierce Cat 77116), связанные с синтетическим пептидом, используемым для иммунизации мышей (пептиды 179, 182 или 183).
Для очистки антител асциты, осажденные 50% сульфатом аммония, диализовали против PBS в течение 16 ч при 0°С. После диализа аликвоты инкубировали с 1 мл гранул аффигель-BSA-пептид в течение 16 ч при 0°С и предварительно инкубированные гранулы использовали для упаковки колонки 1 мл. Первоначально колонку промывали 10 мл PBS, за которым следовало промывание 10 мМ Трисом, pH 7,5, содержщим 1 М NaCl, и промывание PBS. Антитела элюировали с колонки раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl, pH 2,7, и 0,5 М NaCl. Фракции по 1 мл собирали в пробирки, содержащие 40 мкл основания Триса, для нейтрализации элюата. Из 25 мл асцита получали приблизительно 5-13,6 мг очищенных антител.
Пример 4.
Изотип моноклональных антител.
Изотип моноклональных антител определяли, используя коммерческий набор для изотипирования (Southern Biotechnology Associates, INC cat 5300-05), в соответствии с процедурой анализа производителя. Mabs 183 и 179 идентифицировали как IgGl, в то время как установили, что Mab 182 принадлежит к классу IgM.
Пример 5.
Иммунопреципитация каспазы-8 с Mab 179, 182 и 183.
Различные моноклональные антикаспаза-8 антитела, описанные выше в примере 3, тестировали относительно их способности иммунопреципитировать каспазу-8 (см. пример 12) из лизатов покоящихся и активированных клеток Bjab. Линия Bjab представляет собой стабильную линию клеток лимфомы, происходящую от африканской разновидности лимфомы Беркитта (Clements G.B. et al., 1975).
Клетки Bjab стимулировали Fas-лигандом в течение 1 ч. Лизаты клеток получали из клеток Bjab до и после стимуляции. После иммунопреципитации с Mab 179, 182 и 183 (как описано в примере 12) "истощенный лизат" и каспазу-8, элюированные соответствующими пептидами, анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром или с помощью вестерн-блоттинг-анализа, используя анти-Sub-! антитело как первое антитело (Cell Signaling Technology Caspase-8 ICI2 Cat 9746).
На фиг. 2 показан вестерн-блоттинг-анализ (проведенный, как описано в примере 10) целых клеточных экстрактов и "истощенных лизатов", полученных после иммунопреципитации с Mab 179, 183.1 и 183.2 и 182.
В нестимулированных клетках (дорожки 2, 4, 6, 8 и 10) удвоение полос, соответствующих изофор-мам а1 и а2 прокаспазы-8 (прокаспаза-8 53/55 кДа), наблюдали в целых клеточных экстрактах (дорожка 2) и в истощенных лизатах, полученных с анти-183 и анти-182 антителами (дорожки 6, 8 и 10), в противоположность этому прокаспазы-8 не обнаруживали в истощенных лизатах, полученных с Mab 179 (дорожка 4).
В стимулированных клетках уровни прокаспазы-8 в целом клеточном экстракте были более низкие (дорожка 1). Дополнительные более мелкие полосы, соответствующие фрагментам активированной кас-пазы-8, появлялись после активации, т.е. удвоение частично процессированной каспазы-8, соответствующий изоформам а1 и а2 (частично процессированная каспаза-8 p 41/43, отсутствие Sub-2), и небольшая полоса, соответствующая Sub-1 (p 20). Истощение небольших количеств прокаспазы-8 и фрагментов активированной каспазы-8 с помощью Mab исследовали на лизатах клеток, стимулированных Fas-лигандом (фиг. 2, дорожки 3, 5, 7, 9 и 11).
Следует отметить, что также исследовали истощение Sub-1 посредством Mab 182, специфичного к Sub-2, так как активированная каспаза-8 содержит Sub-1, связанный с Sub-2, и поэтому удаление Sub-2 в результате иммунопреципитации с Mab 182 должно, следовательно, приводить к истощению Sub-1.
Иммунопреципитация каспазы-8 из стимулированных клеточных лизатов показала, что Mab 182, 183.1 и 183.2 подобно контролю нормальной мышиной сыворотки (фиг. 2, дорожка 11), не удаляли небольшие количества оставшейся прокаспазы-8 или активных фрагментов каспазы-8 (дорожки 9, 7, 5 и 11
- 17 -
009770
соответственно). В противоположность этим результатам обработка клеточных лизатов Mab 179 (дорожка 3) эффективно приводила к удалению всей прокаспазы-8, а также активных фрагментов каспазы-8.
На фиг. 3а (вестерн-блоттинг-анализ) и 3b (определение белка окрашиванием серебром) показано, что прокаспаза-8 и активные фрагменты каспазы-8, иммунопреципитированные Mab 179, 182 и 183.1 и антителами 183.2, могут эффективно восстанавливаться в супернатанте в результате конкуренции с соответствующими пептидами, против которых были получены различные антитела (пример 12).
В нестимулированных клетках (фиг. 3а, дорожки 2, 4, 6, 8 и 10 и фиг. 3b, дорожки 2, 3, 6, 8 и 10) прокаспазу-8 эффективно восстанавливали иммунопреципитацией с Mab 179 и конкуренцией с пептидом 179 (фиг. 3а и 3b, дорожка 8). В стимулированных клетках, несмотря на небольшое количество прокаспа-зы-8, оставшееся после активации, иммунопреципитация с Mab 179 приводила к эффективному восстановлению белка (фиг. 3а и 3b, дорожка 9). Некоторое восстановление прокаспазы-8 посредством Mab 183.2 можно было наблюдать в неактивированных клетках (фиг. 3а, дорожка 6) и активированных клетках посредством Mab 183.1 (фиг. 3а, дорожка 5), где активные фрагменты каспазы-8 можно было восстанавливать в лизатах активированных клеток с помощью Mab 182 (фиг. 3а, дорожка 3), 183.1 (фиг. 3а, дорожка 5) и 183.2 (фиг. 3а, дорожка 7, только р20).
Полученные результаты показали, что Mab 179, полученное против пептида, соответствующего С-концу Sub-1 (эпитоп 179), является очень эффективным для иммунопреципитации и очистки прокаспа-зы-8, присутствующей даже в следовых количествах, а также активированной каспазы-8.
Поликлональное антитело, специфичное к тому же эпитопу 179 (получен, как описано в примере 1), получали, чтобы исследовать, обладает ли эпитоп 179 уникальной способностью индуцировать выработку антител, которые обычно можно использовать для эффективной иммунопреципитации и очистки про-каспазы-8 и активной каспазы-8. Сравнивали "истощенные лизаты", полученные иммунопреципитацией с поликлональными антителами, специфичными к эпитопу 179 (дорожки 5 и 6 для активированных и неактивированных клеток соответственно), или моноклональными антителами, специфичными к эпитопу 182 (дорожки 7 и 8 для активированных и неактивированных клеток соответственно). Результаты на фиг. 4 четко показали, что прокаспаза-8 и фрагменты каспазы-8 из лизатов стимулированных клеток действительно более эффективно удаляли из клеточных лизатов поликлональными анти-179 антителами, чем моноклональными анти-182 антителами.
Иммунопреципитацию и восстановление прокаспазы-8 из лизатов покоящихся клеток, проведенных с Mab 183 и поликлональным антителом, специфичным к эпитопу 183 (описано в примере 1), сравнивали с иммунопреципитацией и восстановлением, проведенными с Mab 179. На фиг. 5 показано, что иммуно-преципитация прокаспазы-8 посредством Mab 183 и поли-183 оказалась неэффективной, тогда как имму-нопреципитация прокаспазы-8 посредством 179 была в высшей степени превосходной.
Дополнительный фрагмент из каспазы-8 около 5,6 кДа наблюдали только в иммунопреципитатах, полученных с Mab 179 (дорожка 3). Антитела, полученные против области каспазы-8, которая соответствует С-концу большой Sub-1 каспазы, обладают уникальной способностью подвергать каспазу новому режиму процессинга.
Описанные выше результаты, указывают, что эпитоп 179 каспазы-8 в отличие от других эпитопов, характеризуется особой способностью распознавать специфические антитела, которые очень эффективны для иммунопреципитации прокаспазы-8 и активированной каспазы-8, и способны индуцировать ау-топроцессинг каспазы-8.
Пример 6.
Выделение и идентификация белка, связывающего каспазу-8, p72.
Использовали Mab 179 вследствие его способности эффективно иммунопреципитировать каспазу-8, чтобы иммунопреципитировать каспазу-8 и белки, ассоциированные с каспазой-8.
Клетки Bjab (Steinitz M., Klein G., 1975) стимулировали Fas-лигандом в течение 1 ч, а клеточные ли-заты получали из клеток до и после стимуляции. После иммунопреципитации и элюции, которые описаны в примере 12, извлеченные белки разделяли с помощью SDS-PAGE и определяли окрашиванием серебром. Иммунопреципитация с мышиным IgGl служила в качестве негативного контроля. Результаты, представленные на фиг. 6, показали, что белок с предположительной молекулярной массой около 72,5 кДа (называемый в описании р72) сопреципитировал с прокаспазой-8 (р53/55) в лизатах покоящихся клеток (дорожка 3), а не с активной каспазой-8 в лизатах стимулированных клеток (дорожка 4).
Кроме того, обнаружено, что белок р72 также соиммунопреципитировал с прокаспазой-8 в лизатах, полученных из нестимулированных клеток HeLa, Raji, H9, K562, HL-60, CEM и Hut78 (ATCC).
Приведенные результаты позволяют предположить, что обычно белок р72 связан с прокаспазой-8, а не с активной каспазой-8.
Полосу в SDS-PAGE, соответствующую р72, вырезали, расщепляли трипсином и подвергали ограниченному секвенированию и масс-спектроскопическому анализу. 7 пептидов, полученных при трипсиновом расщеплении, использовали, чтобы исследовать базу данных по структуре белков, выведенных из нуклеотидных последовательностей (или EST). Белковая последовательность, соответствующая части предсказанной последовательности белка клона EST человека (SEQ ID NO: 1), обнаружена в банке генов (номер доступа gi/2988397/gbAAC08052.1/(AC004475), функция которого неизвестна.
- 18 -
009770
Пример 8.
Получение полноразмерной кДНК, кодирующей р72.
Полноразмерную кДНК, кодирующую р72, получали следующим образом:
EST из (примера 6) использовали, чтобы скринировать генный показатель TIGR человека и данные ТНС (THC510568 SEQ ID NO: 1), содержащие консенсусные последовательности всех EST, чтобы установить соответствие этих последовательностей.
Клон ДНК, кодирующий часть предсказанного белка, приобретали у фирмы Incyte Genomics (IMAGE # 2964545). Клон не содержал нуклеотидных последовательностей, кодирующих первый метио-нин и 6 последующих аминокислот (т.е. 21 нуклеотид). Установлено, что последовательности мыши и человека упомянутых белков характеризуются высоким сходством (около 90% идентичности), таким образом, нуклеотидные последовательности, кодирующие первый метионин и 6 последующих аминокислот мышиного белка, которые отсутствовали в EST мыши, сравнивали с рабочей предполагаемой последовательностью генома человека для того, чтобы восполнить отсутствующую последовательность человека. Получили попадание, соответствующее последовательности хромосомы 19 Homo sapiens, клон LLNLR-232E12. Названный клон подтвердил нуклеотидную последовательность, которая кодирует отсутствующие 7 аминокислот р72. Полноразмерную кДНК р72 получали в результате двух циклов ПЦР (использовали Takara ExTag, Takara, cat # R001A), которые схематично представлены на фиг. 8.
В первой ПЦР клон, полученный от фирмы Incyte Genomics, использовали как матрицу
с прямым праймером: синтезированный CTCAAGATGGACAACCGGGATGTTGCAGGAAAGG, который содержит 15 (подчеркнуты) из 21 отсутствующего нуклеотида вместе с существующей последовательностью р72 (фиг. 8, праймер 2); и
обратным праймером: CCACTCGAGTCAGTAGTAAGGCCGTCTGGGATT, содержащим 3' область, кодирующую со стоп-кодоном (фиг. 8, праймер 3).
Во второй ПЦР как матрицу использовали продукт ПЦР из первого цикла ПЦР и прямой праймер: AATGGATCCATGAGTCTCAAGATGGACAACCGGGA, содержащий все 21 отсутствующих нуклеотида и 5 существующих нуклеотидов (фиг. 7, праймер 1) и тот же обратный праймер (фиг. 7, праймер 3). Целую кДНК, кодирующую p72, выделяли и секвенировали (SEQ ID NO: 2), а аминокислотную последовательность предсказывали из нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 3).
Установлено, что белок p72 содержит три консервативных мотива (фиг. 7): мотив С, спирально свернутый мотив, два расположенных друг за другом "SURP" (так называемые мотивы "SWAP", обозначенные как S на фиг. 7) (Denhez F. and Lafyatis R., 1994) близко к N-концу белка, и один G-участок, локализованный на С-конце (фиг. 8, обозначен как G) (Aravind L. and Koonin E.V., 1999). Считается, что мотивы как SURP, так и G-участока участвуют в связывании РНК, позволяя предположить, что мишенью р72 может быть молекула РНК.
Пример 9.
Расщепление р72 каспазой-8.
Как показано в примере 8, после 1 ч стимуляции р72 связан только с прокаспазой-8, а не с активной каспазой-8. Некоторое количество прокаспазы-8 еще можно было выявлять после 20 мин стимуляции. Для того чтобы определить, может ли р72 сопреципитировать с каспазой-8 при более коротких периодах стимуляции, клетки Bjab, активированные только в течение 20 мин, лизировали и иммунопреципитиро-вали с Mab 179. После иммунопреципитации и элюции каспазу-8 и связанные белки разделяли с помощью SDS-PAGE, а белки определяли окрашиванием серебром. Одна полоса 72,5 кДа (фиг. 9, дорожка 3), соответствующая р72, иммунопреципитировала в лизатах клеток до стимуляции, тогда как после 20 минутной стимуляции определяли белок с более низкой предположительной молекулярной массой около 68 кДа (фиг. 9, дорожка 4). Оба белка, 72,5 и 68 кДа, иммунопреципитированные из клеток Bjab, подвергали масс-спектроскопическому анализу. После трипсинизации оба белка проявляли одинаковый пептидный профиль за исключением одного четкого различия: дополнительный пептид с последовательностью FRPNPLNNPR (остатки 632-641) присутствовал в белке 72,5 кДа на С-конце, но отсутствовал в белке 68 кДа.
Результаты позволяют предположить, что при стимуляции клетки фрагмент, около 4,5 кДа, удалялся с С-конца р72, возможно при активации каспазы-8, приводя в результате к образованию белка меньшего размера с предположительной молекулярной массой 68 кДа, который еще связан с оставшейся про-каспазой-8.
Понятно, что остаток D600, локализованный на С-конце р72 (фиг. 8), может быть кандидатом на остаток для расщепления, так как предполагаемые фрагменты, полученные после такого расщепления, имеют такие же молекулярные массы, что и фрагменты р72, выявленные in vivo после 20 мин стимуляции.
Для того чтобы выяснить, является ли, как предполагали, р72 субстратом каспазы-8 и является ли D600 остатком-мишенью для расщепления, транскрибированный-транслированный и меченый радиоактивным изотопом (S35)p72 (TnT-система) подвергали in vitro действию рекомбинантной активной каспа-зы-8. Белок, кодируемый кДНК р72, экспрессировали in vitro в ретикулоцитных лизатах в присутствии 3^-метионина, используя связанную систему ретикулоцитных лизатов TnT Т7, и подвергали расщеплению рекомбинантной активной каспазой-8 (каждую субъединицу 1 и 2 получали отдельно в E.coli, сме
- 19 -
009770
шивали и повторно складывали вместе in vitro). Кратко, р72, in vitro синтезированные 3^-меченные белки, инкубировали в течение 30 мин в протеазном буфере (25 мМ Hepes, pH 7,5, 0,1% CHAPS, 5 мМ EDTA и 2 мМ DTT) при 37°С в присутствии продуцированной бактериями каспазы-8. Белки и их фрагменты разделяли при SDS-PAGE, а результаты оценивали фосфовизуализацией. Результаты (фиг. 10) показали, что в отсутствие каспазы-8 определяли только зону 72,5, соответствующую р72 (дорожка 1). Названная зона исчезала после добавления активированной каспазы-8 в течение 1 ч и появлялся новый меньший по размеру фрагмент, соответствующий 68 кДа (дорожка 4). Полученные результаты показали, что белок, кодируемый кДНК р72, использованный как субстрат, эффективно расщеплялся каспазой-8. Кроме того, также использовали систему транскрипции-трансляции ТПТ, чтобы продуцировать in vitro 2 различных мутанта р72: р72, в котором остаток D600, как предполагали по данным экспериментов in vivo, является остатком-мишенью каспазы-8, мутировали в Е (D600E), и р72 с делецией, отсутствие остатков ниже D600 (т.е. экспрессированный белок будет иметь остатки 1-600).
Исследовали расщепление описанных выше двух мутантов р72 в присутствии (фиг. 10, дорожки 5 и 6 соответственно) или в отсутствие (дорожки 2 и 3 соответственно) активированной рекомбинантной каспазой-8. Как показано на фиг. 10 (дорожки 3 и 6 соответственно), одинаковый белковый профиль мутанта D600E р72 наблюдали в присутствии или в отсутствие каспазы-8, что свидетельствует о том, что каспаза-8 не расщепляет мутант D600E р72. Мутант 1-600 р72 мигрировал вместе с фрагментом 68 кДа, образованным после расщепления дикого типа р72, и далее не расщеплялся при добавлении каспазы-8 (дорожки 2 и 5). Полученные результаты показали, что после активации каспаза-8 расщепляла р72 по остатку D600.
Проведенные in vivo исследования позволили предположить, что расщепление р72 происходит в клетках быстро в течение 5-20 мин после обработки Fas-лигандом (фиг. 11) и что расщепленный белок (или, скорее, его более крупный фрагмент) может оставаться ассоциированным с прокаспазой-8.
Пример 10.
Вестерн-блоттинг-анализ для определения иммунореактивной сыворотки каспазы-8.
Смесь рекомбинантных очищенных Sub-1 и Sub-2 использовали для вестерн-блоттинг-анализа антител, полученных к синтетическим пептидам. Кратко, на 12% SDS-полиакриламидный гель наносили 100 нг/дорожку смеси Sub-1 и Sub-2 при восстанавливающих условиях (40 мМ DTT). На одну дорожку наносили низкомолекулярные стандарты (LMW). Разделенные на гелях белки переносили посредством электроэлюции на PVDF-мембраны с высоким содержанием P (Amersham). Мембраны инкубировали в PBS, содержащем 5% молоко с низким содержанием жира, 0,05% Твин 20, в течение 16 ч. Мембраны разрезали на полоски и каждую полоску инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мышиной антисывороткой (разведенной 1/2000). Полоски мембраны промывали PBS, содержащим 0,05% Твин 20 (3x15 мин) и инкубировали в течение 1 ч со вторым антителом - козьим антимышиным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (разведенные 1:10000, Jakson) в течение 1 ч при комнатной температуре.
Полоски промывали PBS, содержащим 0,1% Твин 20 (3x15 мин). Позитивные полосы определяли по повышению хемилюминесценции (ECL, Amersham).
Для вестерн-блоттингов, проведенных в примере 5, использовали антитела, специфичные к Sub-1 (Cell Signaling Technology Caspase-8 IC12 9746).
Пример 11.
ELISA для скрининга гибридомных клонов.
Прямой ELISA для скрининга гибридомы, продуцирующей специфические антитела, проводили следующим образом: 96-луночные планшеты покрывали 50 мкл/лунку BSA-пептидом (или только BSA для контрольных планшетов) в концентрации 2,5 мкг/мл в связывающем растворе (0,1 M Na2HPO4, pH 9) в течение 1 ч при 37°С или 16 ч при 4°С. Впоследствии планшеты промывали 3 раза PBS-Т (PBS с 0,05% Твин 20) и вносили по 200 мкл/лунку блокирующего раствора (1% гемоглобин в PBS) в течение 1 ч при 37°С и промывали 3 раза PBS. 50 мкл супернатанта гибридомных культур или разбавленных стандартов (с PBS-Т) вносили на лунку и инкубировали в течение 1 ч при 37°С или 4 ч при 22°С. После указанного периода инкубации лунки промывали 6 раз PBS-Т. Второе антитело, антимышиное антитело, конъюги-рованное с HRP (Jackson 115-025-100), разбавляли 1:5000 в PBS-Т, инкубировали в течение 1 ч при 37°С и вымывали путем шестикратной промывки PBS-Т. Субстрат для HRP готовили свежий (2,2 мл 0,2 М Na2HPO4, pH 9,2, 1,4 мл 0,2 М лимонной кислоты, pH 4,35, 6,4 мл H2O, 10 мг ABTS и 1 мкл Н2О2) и 50 мкл/лунку вносили и инкубировали при 22°С до тех пор, пока не появлялось окрашивание (около 5-80 мин). Цветную реакцию останавливали добавлением 50 мкл/лунку 0,2 М лимонной кислоты. Планшеты считывали при 405 нм.
В качестве позитивных контрольных антител использовали позитивные мышиные антисыворотки, разведенные 1:1000, а также как негативные контрольные среды.
- 20 -
009770
Пример 12.
Иммунопреципитация каспазы-8.
Для каждой иммунопреципитации использовали 108 клеток. Клетки собирали и лизировали инкубацией в 1% лизирующем буфере NP-40 и с полным протеазным ингибитором (таблетки полного протеаз-ного ингибиторного коктейля от фирмы Roche Molecular Biochemicals) при 0°С в течение 40 мин. Клеточные лизаты переносили в виде аликвот в пробирки Эппендорфа, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин при 4°С и отбирали супернатант в новые пробирки. Клеточные лизаты подвергали стадии предварительного осветления, предназначенной для удаления белков, которые не специфически связываются с протеин-G-сефарозой. Для предварительного осветления клеточный лизат преинкубировали с предварительно промытой PBS протеин^-сефарозой (Pharmacia) и мышиным IgG в течение 2-3 ч при 4°С. После описанной инкубации лизаты центрифугировали в пробирках Эппендорфа при 14000 об/мин в течение 30 с, протеин^-сефарозу отбрасывали, а преосветленный супернатант собирали. Очищенные моноклональные антитела (или мышиный IgG, 1 каппа для негативных контролей) и протеин-G-сефарозу, предварительно промытую PBS, смешивали и инкубировали с преосветленным супернатантом в течение 4-16 ч при 4°С. После указанного периода инкубации несвязанный материал, обозначенный "истощенный лизат", собирали центрифугированием (30 с при 14000 об/мин), связанный материал элюировали промыванием гранул сефарозы 6 раз лизирующим буфером и инкубацией с "элюирующим раствором", содержащим 0,2% лизирующего буфера NP-40, протеазные ингибиторы и 400 мкг/мл пептида, используемого для иммунизации (300 мкл элюирующего буфера/100 мкл сефарозы) в течение 2 ч при 22°C. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об/мин, а супернатант, обозначенный "элюат каспазы-8", переносили в новые пробирки.
Ссылки
Adelman Jp. et al. 1983, DNA 2: 183. Ahmad M. et al. Cancer Res. 1997; 57(4): 615-9. Akagi Y. et al. 1997. Kidney Int. 51, p. 1265-9. Aravind L. and Koonin E.V. 1999, TIBS 24: 342-344. Artelt P. et al. 1988. Gene 68, 213-9.
Barnikol-Watanabe S. et al. Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1994; 375(8): 497-512. Beidler Dr. et al. 1995. J. Biol. Chem. 1995, Jul. 14; 270(28): 16526-8. Beutler and Cerami. 1987. N. Engl. J. Med. 1987, Feb. 12; 316(7): 379-85. Bigda J. et al. 1994. J. Exp. Med. 1994, Aug 1; 180(2): 445-60. Boldin M.P. et al. 1995. J. Biol. Chem. 1995, Apr. 7; 270(14): 7795-8. Boldin M.P. et al. 1995a. Biol. Chem. 1995, Jan. 6; 270(1): 387-91. Boldin M.P. et al. 1995b. FEBS Lett. 1995, Jun. 19; 367(l): 39-44. Boldin M.P. et al. 1996. Cell. 1996, Jun. 14; 85(6): 803-15. Boone, E. et al. J. Biol. Chem. 275, 37596-603.
Boulianne G.L. et al. 1984. Nature. 1984, Dec. 13-19; 312(5995): 643-6.
Brakebusch C. et al. 1992. EMBO J. 1992, Mar; 11(3): 943-50.
Brockhaus M. et al. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990, Apr; 87(8): 3127-31.
Cabilly S. et al. 1984. PNAS 81, 3273.
Cantor et al. 1993. PNAS 90, 109-32.
Cao X. et al. 1998. J. Immunol. 161, 6238-44.
Chen C.J. et al. 1992. Ann. NY. Acad. Sci. 660, 271-3.
Chinnaiyan A.M. et al. 1995. Cell. May 19; 81(4): 505-12.
Chinnaiyan A.M. et al. 1996. J. Biol. Chem. Mar. 1; 271(9): 4961-5.
Clements G.B. et al. 1975. Int. J. Cancer. 16: 125-33.
Cohen O.M. 1997. Biochem. J.; 326 (Pt. 1). 1-16.
Daniel R. et al. 1998. J. Biomed. Sci. 5, 383-94.
Denhez F. and Lafyatis R. 1994. J. Biol. Chem. 269: 16170-16179. Dirks, Wirth and Hauser. 1983. Gene 128, 247-249.
Duan H. and Dixit V.M. Nature l997; 385(6611): 86-9.
Durfee Т. el al. Genes Dev. 1993; 7(4). SSS-69.
Edamatsu H., Kaziro Y., Itoh H. 1997, Gene 187, 289-94.
Edinger A.L. et al. 1998. Virology. 249, p. 367-78.
Enari M. et al. 1995. Nature. May 4; 375(6526): 78-81.
Enari M. et al. 1998. Nature (London). 391, 43-50.
Engelmann H. et al. 1990. J. Biol. Chem. Jan. 25; 265(3): 1531-6.
Engelmann H. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, p. 14497-504.
Eshhar Z., 1985 in "Hybridoma technology in the bioscience and medicine", Edited by Timothy A. Springer (Plenum Publishing Corporation, 1985; Chapter 1). Everett R.D. et al. 1983. Nucleic Acids Res. 11. 2447-64. Fernandes-Alnemri Т. et al. 1996. Proc. Nati Acad. Sci. USA; 93(15): 7464-9.
- 21 -
009770
Fields S. et al. 1989; Nature 340(6230): 245-6.
Flanagan, 1998, Cancer Metastasis Rev. 17, 169-76.
Furth P.A. et al. 1994. Proc. Nati Acad. Sci. USA. 91, 9302-6.
Gerster M. et al. 1998. Anal. Biochem. 262, 177-84.
Graham A. et al. 1991, Biochem Biophys Res. Commun. 177, 8-16.
Grau G.E. 1989. Schweiz. Med. Wochenschr. Dec. 9; 119(49): 1756-61.
Griscelli F. et al. 1998, Hum Gene Ther. 9, 1919-28.
Guang-Lin M. et al. 1998. Transplant. Proc. 30, 2923-4.
Guinot and Temsamani, 1998. Pathol. Biol. (Paris), 46, p. 347-54.
Haendler B. et al. E. EMBO J. 1987; 6(4); 947-50.
Hemmi S. et al. 1998. Hum. Gene Ther. 9, p. 2363-73.
Henkart P.A. 1996. Immunity. Mar; 4(3): 195-201.
Hohmann H.P. et al. 1989. J. Biol. Chem. Sep. 5; 264(25): 14927-34.
Hsu H. et al. 1996. Cell. Jan 26; 84(2): 299-308.
Huang M.T. and Gorman C.M. 1990. Nucleic. Acids Res. 18, 937-47.
Ihle J.N. Cell. 1996; 84(3), 331-4.
Iioh N. el al. 1991. Cell. Jul 26; 66(2): 233-43.
Iioh and Nagata. 1993. J. Biol. Chem. May 25; 268(15): 10932-7.
Janmey P.A., and Stossel, T.P. 1987. Nature (London). 352, 362-364.
Joseph and Burke, 1993. J. Biol. Chem. 268, 24515.
Kamine J. et al. Feb. 15; 216(2): 357-66.
King P. and Goodbourn S. J. Biol. Chem. 1998; 273(15): 8699-704. Kischkel F.C. et al. EMBO J. 1995; 1 4(22): 5579-88.
Kohler and Milstein, 1975. Nature. 256 ,495-497.
Kondo S. et al. 1998. Oncogene. 17, 2585-91.
Kothakota, S. et al. 1997. Science. 278, 294-298.
Kozak, M., 1984. Nucleic Acids Res. 12, p. 857-72.
Kumar, 1995. Trends Biochem. Sci. May; 20(5): 198-202.
Kumar, 1997. Science. 278(5343): 1630-2.
Kunstle, G. et al. 1997. Immunol Lett. 55, 5-10.
Kurth, M., and Bryan, J. 1984. J. Biol. Chem. 259, 10895-10903.
Loetscher H. et al. 1990. J. Biol. Chem. 1990, Nov 25; 265(33): 20131-8.
MacFarlane M. et al. J. Biol. Chem. 1997; 272(41): 25417-20.
Meinkoth et al. (1984).
Meiri N. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 15037-15042.
Mittl P.R. et al. J. Biol. Chem. 1997; 272(10): 6539-47.
Miura K. et al. Biochem Blophys Res Commun. 1992; 1 87(1), 375-80.
Morrison et al., 1984. PNAS. 81, 6851.
Muranishi et al., 1991. Pharm. Research. 8, 649.
Muzio et al. 1996. Cell. Jun. 14; 85(6): 817-27.
Muzio M. et al. J. Biol. Chem. 1998. 273(5): 2926-30.
Nagata and Goldstein. 1995.
Nagata S. el al. Cell, 1997; 88(3): 355-65.
Nakashima A. et al. J. Biol. Chem. 1997; 272(14): 9567-72.
Narumi et al., 1998. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 19, 936-941.
Nicholson D.W. and Thornberry, N.A. 1997. Trends Biochem. Sci. 22, 299-306.
Nishida et al., 1998. Spine 23, 2437-42.
Nophar et al. 1990.
Ohtsu, Metal. 1997. EMBO J. 16, 4650-4656. Pederson et al., 1998. J. Gastrointest Surg. 2, 283-91. Quelle F.W. et al. J. Biol. Chem. 1995; 270(35): 20775-80.
Rotonda J. et al. Nat. Struct. Siol. 1996; 3(7): 619-25. Ruzicka et al. 1993. Science. 260: 487.
Sakahira, H., et al. (1998). Nature (London). 391, 96-99.
Salvesen, G.S., and Dixit, V.M. (1997). Cell 91, 443-446.
Sambrook et al., 1989.
Sano et al. (1991). Biotechniques. 9: 1378.
Sano et al. (1992). Science. 258: 120.
Schall et al. 1990.
Schek et al., Mol. Cell. Biol., p. 5386-93, 1992.
Schwarzenberger et al., 1998. J. Immunol. 161, 6383-9.
Shevchenko A., et al. 1997. Rapid Commun Mass Spectrom. 11, p. 1015-24.
- 22 -
009770
Shimayama et al., 1993. Nucleic. Acids Symp. Ser. 29, 177.
Shoji et al., 1998. J. Drug. Target. 5, 261-73.
Shore el al., 1993. Oncogene 8, 3183.
Smilh et al. 1990. J. Infect. Dis. Dec.; 162(6): 1349-53.
Soukchareun et al., 1998. Bioconjug Chem. 9, 466-75.
Srinivasula S.M. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 93(25): 14486-91.
Srinivasula S.M. et al. J. Biol. Chem. 1998; 273(17):10107-11.
Stanger et al. 1995. Cell. May 19; 81(4): 513-23.
Stcinitz M. and Klein G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975 Sep; 72(9): 35l8-20.
Stix, 1998, Sci Am. 279: 46-50.
Surinya et al. J. Biol. Chem. 273, p. 16798-809, 1998.
Tartaglia et al. 1993. Cell. Sep 10; 74(5): 845-53.
Teoh et al., 1998. Blood. 92, 4591-4601.
Tewari et al. 1995. Cell. Jun 2; 81(5): 801-9.
Thomsen, et al. 1984. PNAS 81. 659-63.
Thornberry N.A. et al. J. Biol. Chem. 1997; 272(29): 17907-11
Tirode F. et al. J. Biol. Chem. 1997; 272(37): 22995-9.
Tokushige, et al., 1997. J. Virol. Methods. 64, p. 73-80.
Tracey et al. 1986. Annu Rev Med. 45: 491-503.
Vandenabeele et al. 1995. J. Immunol. Mar. 15; 154(6): 2904-13.
Vercammen, D., et al. 1998. J. Exp. Med. 4, 1477-85.
Vielkind and Swierenga. 1989. Histochemistry; 91(1): 81-8.
Villa, P. et al. (1997). Trends Biochem. Sci. 22, 388-393.
Vincenz С. and Dixit V.M. 1997. J. Biol. Chem. Mar. 7; 272(10): 6578-83.
Wahl et al., 1983. J. Nucl. Med. 24: 316-325.
Wallach, D. et al. 1999. Annu Rev. Immunol. 17, 331-67.
Wang, J. 1998. Controlled Release. 53, 39-48.
Weaver et al. 2000 Hybridoma Apr; 19(2): 167-9.
Xue et al. 1995. Nature. Sep. 21; 377(6546): 248-51.
Yamamoto et al. 1980. Cell. 22, 787-97.
Yamamoto Т. et al. J. Biol. Chem. 1997; 272(49): 30595-8.
Yang X. et al. Mol. Cell. 1998; 1(2): 319-25.
Yeh el al. 1998. J. Bone Miner Res. 13, p. 1870-9. Yin, H.L. and Stossel, T.P. (1979). Nature (London). 281, 583-586. Yin, H.L. and Stossel, T.P. (1980). J. Biol. Chem. 255, 9490-9493. Zacharia et al., 1991. Eur. J. Pharmacol. 203, 353.
Zhang et al. 1998. Clin Cancer Res. 4, 2669-76. Zhao and Pick, 1993. Nature. 365, 448.
- 23 -
009770
Список последовательностей <110> Yeda Research and Development Co. Ltd
Wallach, David
Goncharov, Tanya
Kolumara, Ganesh
<120> Антитепа прошв каспазы-8, их получение и применение
<130> 484
<150> 145279 <151> 2001-04-09
<160> б
<170> Patentin версия 3.1
<210> 1
<211> 616
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Arg Gly Arg Asp Val Ala Gly Lys Ala Asn Arg Trp phe Gly val 15 10 15
Ala Pro Pro Lys Ser Gly Lys Met Asn Met Asn lie Leu His Gin Glu 20 25 30
Glu Leu lie Ala Gin Lys Lys Arg Glu lie Glu Ala Lys Met Glu Gin 35 40 45
Lys Ala Lys Gin Asn Gin val Ala Ser Pro Gin Pro Pro His Pro Gly 50 55 60
- 24 -
009770
- 25 -
009770
- 26 -
009770
<400> 2
atgagtctca
agatggacaa
ccgggatgtt
gcaggaaagg
ctaaccggtg
gtttggggtt
gctcccccta
aatctggaaa
aatgaacatg
aacatccttc
accaggaaga
gctcatcgct
120
cagaagaaac
gggaaattga
agccaaaatg
gaacagaaag
ccaagcagaa
tcaggtggcc
180
agccctcagc
ccccacatcc
tggcgaaatc
acaaatgcac
acaactcttc
ctgcatttcc
240
aacaagtttg
ccaacgatgg
tagcttcttg
cagcagtttc
tgaagttgca
gaaggcacag
300
accagcacag
acgccccgac
cagtgcgccc
agcgcccctc
ccagcacacc
cacccccagc
360
gctgggaaga
ggtccctgct
catcagcagg
cggacaggcc
tggggctggc
cagcctgccg
420
ggccctgtga
agagctactc
ccacgccaag
cagctgcccg
tggcgcaccg
cccgagtgtc
480
ttccagtccc
ctgacgagga
cgaggaggag
gactatgagc
agtggctgga
gatcaaagtt
540
tcacccccag
agggagccga
gactcggaaa
gtgatagaga
aattggcccg
ctttgtggca
600
gaaggaggcc
ccgagttaga
aaaagtagct
atggaggact
acaaggataa
cccagcattt
660
gcatttttgc
acgataagaa
tagcagggaa
ttcctctact
acaggaagaa
ggtggctgag
720
ataagaaagg
aagcacagaa
gtcgcaggca
gcctctcaga
aagtttcacc
cccagaggac
780
gaagaggtca
agaaccttgc
agaaaagttg
gccaggttca
tagcggacgg
gggtcccgag
840
gtggaaacca
ttgccctcca
gaacaaccgt
gagaaccagg
cattcagctt
tctgtatgag
900
cccaatagcc
aagggtacaa
gtactaccga
cagaagctgg
aggagttccg
gaaagccaag
960
gccagctcca
caggcagctt
cacagcacct
gatcccggcc
tgaagcgcaa
gtcccctcct
1020
gaggccctgt
cagggtcctt
acccccagcc
accacctgcc
ccgcctcgtc
cacgcctgcg
1080
cccactatca
tccctgctcc
agctgccccc
gggaagccag
cctccgcagc
caccgtgaag
1140
- 27 -
009770
aggaagcgga
agagccggtg
ggggcctgaa
gaggataagg tagagctcct acctgctgaa
1200
ctggtgcaga
gggacgtgga
tgcctctccc
tcgcctctgt cagttcagga cctcaagggg
1260
ctcggctatg
agaaggggaa
gcctgtgggt
ctagtgggcg tcacagagct ttcagacgcc
1320
cagaagaagc
agctgaagga
gcagcaggag
atgcagcaga tgtacgacat gatcatgcag
1380
cacaagcggg
ccatgcagga
catgcagctg
ctgtgggaga aggcagtcca acagcaccag
1440
cacggctatg
acagtgatga
ggaggtggac
agcgagctgg gcacctggga gcaccagctg
1500
cggcgcatgg
agatggataa
gaccagggaa
tgggccgagc agctgacaaa gatgggccgg
1560
ggcaagcact
tcatcggaga
cttcctgcct
ccagacgagc tggaaaagtt tatggagacc
1620
ttcaaggccc
tgaaggaggg
ccgtgagcct
gactactcag agtacaagga gttcaagctg
1680
actgtggaga
acatcggcta
ccagatgctg
atgaagatgg gctggaagga gggcgagggg
1740
ctgggctcag
agggccaggg
catcaagaac
ccagtgaaca agggcaccac cacagtggac
1800
ggcgctggct
tcggcattga
ccggccggcg
gagctctcca aggaggacga cgagtatgag
1860
gcgttccgca
agaggatgat
gctggcctac
cgcttccggc ccaaccccct gaacaatccc
1920
agacggcctt
actactga
1938
<210> 3
<211> 645
<212> Белок
<213> Homo sapiens
- 28 -
009770
- 29 -
009770
- 30 -
009770
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело против каспазы-8, полученное путем иммунизации животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, или его фрагмент, где пептид, используемый для иммунизации, имеет аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4), способное совместно им-мунопреципитировать указанную каспазу (как активную каспазу-8, так и прокаспазу-8) вместе со связанным с каспазой-8 белком р72 (SEQ ID NO: 3) и эффективно высвобождать каспазу и связанный белок из иммунного комплекса при элюции, с использованием указанного пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 4.
- 31 -
009770
2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является поликлональным антителом.
3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является моноклональным антителом или его фрагментом.
4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является химерным антителом или его фрагментом.
5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является полностью гуманизированным антителом или его фрагментом.
6. Антитело по п.1, отличающееся тем, что является анти-анти-Ы-антителом или его фрагментом.
7. Антитело по любому из п.1-6, отличающееся тем, что пептид, используемый для иммунизации, связан с KLH.
8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что является изотипом иммуноглобулина
IgGb
9. Антитело по любому из п.8, отличающееся тем, что запускает процессинг каспазы-8.
10. Применение антитела по любому из пп.1-9 для разработки ELISA-анализа.
11. Способ получения антитела по п.1 или 2, предусматривающий иммунизацию животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, где пептид, используемый для иммунизации, имеет
аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4).
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что антитело является моноклональным.
13. Способ по любому из п.11 или 12, отличающийся тем, что пептид, используемый в качестве им-муногена, связан с носителем.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что носитель представляет собой KLH.
15. Способ очистки каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, предусматривающий обеспечение контактирования образца, содержащего каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок, с антителом по любому из пп.1-9, совместную иммунопреципитацию каспазы и связанного с каспазой-8 белка, промывание образованного иммунного комплекса и извлечение каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка из иммунного комплекса с использованием пептида с аминокислотной последовательностью
CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4) в качестве конкурентного пептида.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что образец выбран из жидкостей организма, клеточных экстрактов и библиотек экспрессируемьгх ДНК.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что клетки в образце стимулировали Fas-лигандом перед экстракцией.
18. Способ по любому из пп.15-17, отличающийся тем, что дополнительно обеспечивают контактирование образца с антителом, полученным путем иммунизации животного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 5, и/или антителом, полученным путем иммунизации животного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 6.
19. Применение С-концевого пептида субъединицы Sub-1 каспазы-8, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (эпитопа 179), для получения антитела по любому из пп.1-6, предусматривающее иммунизацию животного таким эпитопом.
20. Антитело против каспазы-8, полученное путем иммунизации животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, или его фрагмент, где пептид, используемый для иммунизации, имеет
аминокислотную последовательность SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6).
21. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является поликлональным антителом.
22. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является моноклональным антителом или его фрагментом.
23. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является химерным антителом или его фрагментом.
24. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является полностью гуманизированным антителом или его фрагментом.
25. Антитело по п.20, отличающееся тем, что является анти-анти-Id антителом или его фрагментом.
26. Антитело по любому из пп.20-25, отличающееся тем, что пептид, используемый для иммунизации, связан с KLH.
27. Антитело по любому из пп.20-25, отличающееся тем, что является изотипом иммуноглобулина IgG1.
28. Способ получения антитела по п.20 или 21, предусматривающий иммунизацию животного С-концевым пептидом субъединицы Sub-1 каспазы-8, где пептид, используемый для иммунизации, имеет
иммунизирующую последовательность SESQTLDKVYQMKSKPRC (SEQ ID NO: 6).
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что пептид, используемый в качестве иммуногена, связан с носителем.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что носитель представляет собой KLH.
31. Способ очистки каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка, предусматривающий обеспечение контактирования образца, содержащего каспазу-8 и связанный с каспазой-8 белок, с антителом по любому из пп.20, 21, в сочетании с антителом по любому из пп.1, 2, совместную иммунопреципитацию каспа-зы-8 и связанного с каспазой-8 белка, промывание образованного иммунного комплекса и извлечение каспазы-8 и связанного с каспазой-8 белка из иммунного комплекса с использованием пептида с аминокислотной последовательностью CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4) в качестве конкурентного белка.
- 32 -
009770
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что образец выбран из жидкостей организма, клеточных экстрактов и библиотек, экспрессирующих ДНК.
33. Способ по любому из пп.31 и 32, отличающийся тем, что конкурентный пептид содержит аминокислотную последовательность CQGDNYQKGIPVETD (SEQ ID NO: 4).
34. Способ по любому из пп.32, 33, отличающийся тем, что клетки в образце стимулировали Fas-лигандом перед экстракцией.
35. Применение С-концевого пептида субъединицы Sub-1 каспазы-8, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (эпитопа 183), для получения антитела по любому из пп.20-27, предусматривающее иммунизацию животного таким эпитопом.
36. Применение антитела по любому из пп.20-27 для разработки ELISA-анализа.
М D F5RNLY DIGEQLDSЕ DLAS LK FLS L DYIPQRKQEPIKDALMLFQRLQEKRMLEESNLS FLKE LL FRINRLDLLITYLNTRKEEMERELQTPGRAQI5AYRFH FC RM S W AE AN S QCQ TO SVPFWRRVDHLLIRVMLYQISEEVSRSELRSFKFLLQEEISKCKLDDDMHLLDIFIEMEK RVILGEGKLDILKRVCAQINKS LLK11NDYEEFSKGEELCGУМTISPS PREQDSESQ TLD KyYgWKSKPRGYCLIlMWHKFAKAREKVPKLHSIRDRHGTHLDAGALTTTFEELHFEIKP H H DCTVEQIYEILKIYQLMDHSNMDCFICCILSHGDKG11YGTDGQEAPIYELTSQFTGL KCPS LAGKPKVFFIQACQGDNYQKGIPVETD5E5QPYLEMDL3SPQTRYIPDEADFLLGM AT VN N СV S Y RN РАЕ G TW YIQSLCQSLRERCPRGDDILTILT EVNYEVSNKDDKKNMGKQM PQPTFTLRKKLVFPSD
Фиг. 1
IP TL a1?9 183.1 183.2 182 NMS FasL+ - ~- ~~ ~" +~~- +
каспаза-8 mm m *m~- p 53/55 - <*- p 41/43
p20
1 23458789 1011
Фиг. 2
ЭЛЮИрован ИЗ IP 182 183.1 183.2 179 NMS "О"пооо я
......... - ...... ........... ___ кэспэза-о
FasL _ + _ + _+.+ _ +
97 -64 -• 51 -39 -
28 -19 ~
123 45 6789 1011
Фиг. 3а
p 53/55 p41/43
p 20
._ CVJ CM
элюирован ИЗ IP 2183.2 $2 183.1 179 NMS
FasL --+ + -+ - +
каспаза-8
p 53/55 p41/43
19 m
1 23 456789 10 11
Фиг. 3b
p 20
- 33 -
009770
поли моно
IP JTL^ NMS |79 i[82
FasL +- + - + - + - каспаза-8
¦ * - ' - p 53/55
" 8" - ss p 41/43
^ " ' - - P 20
1 2 3 4 5 6 7 8
Фиг. 4
СТ) ГО О) Ш Ш N
Элюированы s о о
пептидом из IP § о о 0 с s s каспаза-8
•~> "'"§1 * Р 53/55
" Ш Р 5.6 (часть из р 20) 1 2 3 Фиг. 5
IP MlgGI 179
Fast - + - +
р72
каспаза-8
р 53/55
р20
12 3 4 Фиг. 6
27 61 183 243
264 318
Фиг. 7
560'
(645)
участок расщепления
- 34 -
009770
if"-#?j 5' олиго для второго цикла ПЦР итшт*ш" 5' олиго для первого цикла ПЦР
EST done
3' олиго для обоих ЦИКЛОВ ПЦР 1*1- РЗ
1* I" ^feSiSi
Фиг. 8
IP MfgGI а179 FasL - -f - +
p72
72.5 кДа '68 кДа
12 3 4
Фиг. 9
экспрессированный ? Д ? Л g
белок: а ^ f> j а К; К|
рекомбинантная ? а. о. ? о. а.
каспаза 8: ... + + +
1 2 3 4 5 6
Фиг. 10
FasL 60' 40' 20 ID'S' а
72J5 кДа 68 кДа
1 2 3 4 5 6
Фиг. 11
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 35 -