1. Антитело, содержащее вариант исходного человеческого участка Fc или его часть, причем вариант содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с исходным участком Fc, причем замена аминокислоты проведена в положении 247 последовательности Fc человека.

2. Антитело по п.1, в котором замена выбрана из группы, состоящей из 247L, 247Н и 247I.

3. Антитело по п.1, в котором по меньшей мере одна замена аминокислоты в варианте участка Fc представляет собой 247I.

4. Антитело по любому из пп.1-3, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Fc.

5. Антитело по п.4, причем антитело, содержащее вариант участка Fc, проявляет значения относительной удельной активности ADCC больше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Fc, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.

6. Антитело по любому из пп.1-5, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, опосредует зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Fc.

7. Антитело по п.6, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, проявляет значения относительной удельной активности CDC меньше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Fc, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.

8. Антитело по любому из пп.1-7, в котором исходный участок Fc относится к классу, выбранному из группы, состоящей из IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.

9. Антитело по любому из пп.1-8, в котором исходный участок Fc относится к подклассу, выбранному из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

10. Антитело по любому из пп.1-9, причем антитело представляет собой моноклональное антитело.

11. Моноклональное антитело по п.10, отличающееся тем, что содержит два идентичных полипептида тяжелой цепи и два идентичных полипептида легкой цепи.

12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что оно специфично связывается с CD20 человека.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-12.

 

(57) Реферат / Формула:
Антитело, содержащее вариант исходного человеческого участка Fc или его часть, причем вариант содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с исходным участком Fc, причем замена аминокислоты проведена в положении 247 последовательности Fc человека.

2. Антитело по п.1, в котором замена выбрана из группы, состоящей из 247L, 247Н и 247I.

3. Антитело по п.1, в котором по меньшей мере одна замена аминокислоты в варианте участка Fc представляет собой 247I.

4. Антитело по любому из пп.1-3, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Fc.

5. Антитело по п.4, причем антитело, содержащее вариант участка Fc, проявляет значения относительной удельной активности ADCC больше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Fc, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.

6. Антитело по любому из пп.1-5, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, опосредует зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Fc.

7. Антитело по п.6, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, проявляет значения относительной удельной активности CDC меньше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Fc, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.

8. Антитело по любому из пп.1-7, в котором исходный участок Fc относится к классу, выбранному из группы, состоящей из IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.

9. Антитело по любому из пп.1-8, в котором исходный участок Fc относится к подклассу, выбранному из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

10. Антитело по любому из пп.1-9, причем антитело представляет собой моноклональное антитело.

11. Моноклональное антитело по п.10, отличающееся тем, что содержит два идентичных полипептида тяжелой цепи и два идентичных полипептида легкой цепи.

12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что оно специфично связывается с CD20 человека.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-12.

 

---

009746
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к вариантам участка Fc и олигонуклеотидам, кодирующим варианты участка Fc. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способам идентификации полезных вариантов участка Fc, а также к способам применения вариантов участка Fc (например, для лечения заболевания).
Уровень техники
У человека обнаружено пять типов иммуноглобулинов. Эти группы известны как IgG, IgM, IgD, IgA и IgE и различаются изотипами гена тяжелой цепи (гамма, мю, дельта, альфа и эпсилон соответственно). Наиболее распространенным изотипом является IgG, который состоит из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи и двух идентичных полипептидов легкой цепи. Две тяжелых цепи ковалентно связаны друг с другом с помощью дисульфидных связей, а каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью с помощью дисульфидной связи. Каждая тяжелая цепь содержит приблизительно 445 аминокислотных остатков, и каждая легкая цепь содержит приблизительно 215 аминокислотных остатков.
Каждая тяжелая цепь содержит четыре разных домена, которые обычно называют вариабельным доменом (VH), константным доменом 1 тяжелой цепи (СН1), константным доменом 2 тяжелой цепи (СН2) и константным доменом 3 тяжелой цепи (CH3). Домены СН1 и СН2 соединены шарнирным участком (междоменные секции), который придает иммуноглобулину гибкость. Каждая легкая цепь содержит два различных домена, которые обычно называют вариабельным доменом легкой цепи (VL) и константным доменом легкой цепи (CL).
Вариабельные домены тяжелых и легких цепей непосредственно связываются с антигеном и ответственны за разнообразие и специфичность иммуноглобулинов. Каждый VL и VH содержит три участка, определяющих комплементарность (CDR, также известны, как гипервариабельные участки). Если VL и VH сходятся в результате взаимодействия тяжелой и легкой цепи, то участки CDR формируют поверхность связывания, которая вступает в контакт с антигеном.
В то время как вариабельные домены вовлечены в связывание антигена, константные домены тяжелой цепи, в первую очередь СН2 и CH3, выполняют другие функции, помимо связывания антигенов. Этот участок, в основном известный как участок Fc, выполняет много важных функций. Например, участок Fc связывает комплемент, который может запускать фагоцитоз или опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC). Участок Fc также связывается с рецепторами Fc, которые могут запускать фагоцитоз или опосредованную антителами клеточную цитотоксичность (ADCC). Участок Fc также способствует удержанию иммуноглобулина в циркуляции и взаимодействует с протеином А, который обычно используется для сорбции иммуноглобулина.
В последнее время усилия направлены на улучшения иммуногенных качеств и антигенсвязываю-щих характеристик антител. Например, для иммунотерапии созданы моноклональные, химерные и гуманизированные антитела. Примеры антител, которые разрешены для иммунотерапии человека при соответствующих заболеваниях включают Ритуксан (RITUXAN, лимфома), Синагис (SYNAGIS, инфекционное заболевание), Зенепакс (ZENEPAX, пересадка почки), Ремикад (REMICADE, болезнь Крона и ревматоидный артрит), Герцептин (HERCEPTIN, карцинома молочной железы) и Эдреколомаб (EDRECOLO-MAB, рак толстого кишечника). Однако существует много антител, для которых были проведены клинические испытания, но которые не были разрешены из-за недостаточной эффективности или других проблем, связанных с их применением.
Для улучшения эффективности и ускорения разрешения к применению дополнительных лечебных антител необходимы композиции и способы изменения участков Fc для создания вариантов полипептидов с улучшенными свойствами.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к вариантам участка Fc полипептида и к олигонуклеотидам, кодирующим варианты участка Fc, а также их части. Конкретно настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способы идентификации полезных вариантов участка Fc и способы применения вариантов участка Fc.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, причем вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой P247L.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении
- 1 -
009746
251 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой L251F.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Т256М.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет
собой Н268Е.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет
собой D280A.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А330^
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет
собой I332E.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет
собой А339Т.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней (например, В-клеток) в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой A378D.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно,
- 2 -
009746
чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело (например, антитело против CD20). В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет
собой S440Y.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты P247L), который включает последовательность SEQ ID NO:15. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией P247L (например, SEQ ID NO:40). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией P247L, которая включает SEQ ID NO:15. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты L251F) с последовательностью SEQ ID NO:16. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией L251F (например, SEQ ID NO:41). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией L251F, которая включает SEQ ID NO:16.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Т256М), который включает последовательность SEQ ID NO:17. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Т256М (например, SEQ ID NO:42). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Т256М, которая включает SEQ ID NO:17. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты Н268Е), содержащему последовательность SEQ ID NO:20. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией Н268Е (например, SEQ ID NO:45). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией Н268Е, которая включает SEQ ID NO:20.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты D280A), который включает последовательность SEQ ID NO:21. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией D280A (например, SEQ ID NO:46). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией D280A, которая включает SEQ ID NO:21. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты А330Ю, содержащему последовательность SEQ ID NO:23. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией А330K (например, SEQ ID NO:48). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией А330^ которая включает SEQ ID NO:23.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты I332E), который включает последовательность SEQ ID NO:26. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией I332E (например, SEQ ID NO:51). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией I332E, которая включает SEQ ID NO:26. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты А339Т), содержащему последовательность SEQ ID NO:29. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией А339Т (например, SEQ ID NO:54). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией А339Т, которая включает SEQ ID NO:29.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты A378D), который включает последовательность SEQ ID NO:30. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией A378D (например, SEQ ID NO:55). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией S440Y, которая включает SEQ ID NO:30.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду (содержащему модификацию аминокислоты S440Y), который включает последовательность SEQ ID NO:31. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок СН2 с модификацией S440Y (например, SEQ ID NO:56). В до
- 3 -
009746
полнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности, кодирующей участок СН2 с модификацией S440Y, которая включает SEQ ID NO:31.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc, выбранную из Р247Н, P247I и P247L. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Fc, выбранную из L251F. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc, выбранную из Т256М и Т256Р. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc, выбранную из H268D и Н268Е. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc, выбранную из D280A и D280K. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc, выбранную из А330K и A330R. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc, выбранную из I332D и I332E. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc, выбранную из А339Т. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc, выбранную из A378D. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант (или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант) исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc, выбранную
из S440Y.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO:13. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID
- 4 -
009746
NO: 38 и/или SEQ ID NO: 39, и/или SEQ ID NO: 40, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 38 и/или SEQ ID NO: 39, и/или SEQ ID NO: 40. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 13, 14, 15, 38, 39 или 40.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Р247Н, P247I или P247L. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:16. В определенных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 41, или ее комплементарную последовательность, или последовательность, которая связывается с SEQ ID NO: 41 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 41. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 16 или 41.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является L251F. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело
- 5 -
009746
зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:17. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 42, и/или SEQ ID NO: 43, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 43 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 42 и/или SEQ ID NO: 43. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 17, 18, 42 или 43.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является Т256М или Т256Р. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:19. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 44, и/или SEQ ID NO: 45, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам CHO) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 44 и/или SEQ ID NO: 45. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 19, 20, 44 или 45.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффектор-ных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc. В конкретных вариантах осуществления по меньшей
- 6 -
009746
мере одна модификация аминокислоты представляет собой I332K или I332R.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная модификация представляет собой H268D или Н268Е. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:21. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 46, и/или SEQ ID NO: 47, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 46 и/или SEQ ID NO: 47. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 21, 22, 46 или 47.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является D280A или D280K. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т. д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется.
- 7 -
009746
В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:23. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 48, и/или SEQ ID NO: 49, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 48 и/или SEQ ID NO: 49. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 23, 24, 48 или 49.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является А330K или A330R. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В дополнительных вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:25. В некоторых вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 50, и/или SEQ ID NO: 51, или комплементарную последовательность любой из них, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 50 и/или SEQ ID NO: 51. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 25, 26, 50 или 51.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является I332D или
- 8 -
009746
I332E. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:29. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 54 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 54 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 54. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 29 или 54.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является А339Т. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксич-ность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 55 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 55 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 55. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует
- 9 -
009746
представление SEQ ID NO: 30 или 55.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует истощение клеток-мишеней в пробе цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликло-нальное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12. В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является A378D. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включающим вариант исходного полипептида, который содержит по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) композиции, которая включает вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 участка Fc, и ii) субъекта, у которого присутствует один или несколько симптомов заболевания; и b) введение композиции субъекту в таких условиях, что по меньшей мере один из симптомов ослабляется. В конкретных вариантах осуществления вариант включает антитело или иммуноадгезин, и у субъекта присутствуют симптомы заболевания, отвечающего на антитело или иммуноадгезин.
В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, 40, 50, 60, 80, 90% или больше участка Fc, содержащего модификацию аминокислот). В некоторых вариантах осуществления варианты полипептида включают участок СН2 или CH3. В других вариантах осуществления композиции включают аминокислотную последовательность, которая содержит SEQ ID NO:31. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит SEQ ID NO: 56 или ее комплементарную последовательность, или последовательности, которые связываются с SEQ ID NO: 56 в условиях высокой жесткости. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам (например, к клеткам СНО) и векторам, которые включают SEQ ID NO: 56. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к машиночитаемому носителю, причем машиночитаемый носитель кодирует представление SEQ ID NO: 31 или 56.
В определенных вариантах осуществления вариант полипептида опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает антитело или фрагмент антитела (например, поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или фрагмент Fc). В некоторых вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG человека. В дополнительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В других вариантах осуществления исходный полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-12.
В предпочтительных вариантах осуществления аминокислотной модификацией является S440Y. В определенных вариантах осуществления вариант полипептида включает вторую, третью, четвертую и т.д. модификацию аминокислот на участке Fc (см., например, табл. 1). В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой СНО-экспрессированный полипептид.
В дополнительных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты исходного полипептида, который включает по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания на участке Fc. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты Fc полипептида, который опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем исходный полипептид, где вариант Fc полипептида включает модификацию аминокислоты в положении аминокислоты 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания.
В дополнительных вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты исходного полипептида, который включает по меньшей мере часть участка Fc, где вариант опосредует истощение клеток-мишеней в образце цельной крови более эффек
- 10 -
009746
тивно, чем исходный полипептид, и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания на участке Fc. В некоторых вариантах осуществления композиции включают последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую варианты Fc полипептида, который опосредует истощение клеток-мишеней в образце цельной крови более эффективно, чем исходный полипептид, где вариант Fc полипептида включает модификацию аминокислоты в положении аминокислоты 247, 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 или 440 или их сочетания.
В определенных вариантах осуществления варианты по данному изобретению и нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты, представлены по меньшей мере еще одним компонентом в наборе. Например, набор может содержать по меньшей мере один тип варианта и инструкции по применению вариантов. Набор также может содержать буферы и другие используемые реактивы.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) клеток, экспрессирующих мишеневый антиген (например, CD20), ii) композиции, включающей вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, и iii) эффекторных клеток (обогащенных РВМС от донора(ов)-человека, например), и b) контакт клеток-мишеней с композицией и эффекторных клеток при таких условиях, что вариант связывается с клетками-мишенями (например, через лиганд, экспрессированный на поверхности клетки) и с) оценку гибели клеток-мишеней (по высвобождению ЛДГ или хрома 51, например).
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим: а) наличие i) образцов цельной крови, которые содержат клетки, экспрессирующие мишеневый антиген (например, В-клеток, экспрессирующих CD20) и ii) композиции, включающей вариант исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc и b) контакт клеток-мишеней с композицией при таких условиях, что вариант связывается с клетками-мишенями (например, через CD20 лиганд, экспрессиро-ванный на поверхности клетки) и с) измерение исчезновения клеток-мишеней (например, путем анализа Facs с другим маркером В-клетки, таким как CD19).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие i) клеток-мишеней, ii) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, и где вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффектор-ных клеток первого вида более эффективно, чем исходный полипептид, и iii) эффекторных клеток второго вида, и b) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клетками-мишенями, образуя, таким образом, клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, d) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариантом-кандидатом), е) определение того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает аналогичный скрининг исходного полипептида с эффекторными клетками второго вида. В дополнительных вариантах осуществления стадии b) и с) проводятся одновременно. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию f) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффек-торных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В других вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию f) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида приблизительно в 1,2 раза (или приблизительно в 1,5 раз, в 5 раз или приблизительно в 10 раз) более эффективно, чем исходный полипептид (например, наблюдается повышение лизиса клеток-мишеней приблизительно в 1,2 раза).
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие i) клеток-мишеней, ii) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, iii) эффекторных клеток первого вида, и iv) эффекторных клеток второго вида, и b) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клетками-мишенями, образуя, таким образом, клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток первого вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, d) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариантом-кандидатом), е) определение того, что вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффек-торных клеток первого вида более эффективно, чем исходный полипептид, f) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом (например, полученными на стадии b), g) измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, опосредованной вариан
- 11 -
009746
том-кандидатом), h) определение того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид.
В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию определения способности исходного полипептида опосредовать цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии первого вида и/или второго вида. Например, способы могут дополнительно предусматривать смешивание эффекторных клеток первого или второго вида с клетками-мишенями, связанными с исходным полипептидом, и затем измерение цитотоксичности клеток-мишеней (например, определение такого значения, которое является значением для сравнения вариантов).
В определенных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию g) введения улучшенного варианта с двойной специфичностью подопытному животному, где подопытное животное принадлежит второму виду. В других вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает перед стадией а) стадию скрининга варианта-кандидата в пробе связывания с Fc рецептором (FcR). В определенных вариантах осуществления анализ связывания FcR представляет собой анализ связывания с неонатальным рецептором Fc (FcRn).
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает перед стадией а) стадию скрининга варианта-кандидата в пробе CDC (см., например, раздел IV ниже). В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки первого вида представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС). В других вариантах осуществления эффекторные клетки первого вида представляют собой РВМС мыши или РВМС крысы. В определенных вариантах осуществления эффекторные клетки второго вида представляют собой РВМС мыши или РВМС крысы. В конкретных вариантах осуществления эффекторные клетки второго вида представляют собой РВМС человека.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые предусматривают: а) наличие i) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc, и где вариант-кандидат опосредует CDC более эффективно, чем исходный полипептид, и iii) источник комплемента второго вида; и b) инкубирование композиции с комплементом второго вида; и с) определение того, опосредует ли вариант-кандидат CDC более эффективно, чем исходный полипептид. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию d) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью.
В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой клетки человека (например, клетки со сверхэкспрессией одного или более следующих ассоциированных с опухолью антигенов: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, рецептор EGF, рецептор her-2, специфический для простаты мембранный антиген, углевод Y Льюиса, ганглиозиды GD2 и GD3, lamp-1, CO-029, L6 и ephA2). В определенных вариантах осуществления вариант включает антитело или его часть, специфичную для клеток-мишеней. В других вариантах осуществления вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида приблизительно в 1,2 раза более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления стадия е) включает проведение контрольной реакции с исходным полипептидом. В дополнительных вариантах осуществления измерение включает количественное определение гибели или лизиса клеток-мишеней. В других вариантах осуществления клетки-мишени инфицированы вирусом (например, ВИЧ, CMV, вирус гепатита В или RSV) или микробными организмами (например, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas и т.д.). В определенных вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой микробные организмы (например, Staphy-lococcus, Streptococcus, Pseudomonas и т.д.). В некоторых вариантах осуществления клетки мишени заменены вирусами (например, ВИЧ, CMV, вирус гепатита В или RSV).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) немодифицированную каркасную область человека (например, в природном каркасе человека не было сделано изменений), и ii) вариант участка Fc. В определенных вариантах осуществления немодифицированная каркасная область человека представляет собой каркас зародышевой линии человека.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) по меньшей мере одну рандомизированную CDR последовательность и ii) вариант участка Fc. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают полипептид, где полипептид включает: i) не-модифицированную каркасную область человека (например, каркас зародышевой линии человека), ii) по меньшей мере одну рандомизированную CDR последовательность и iii) вариант участка Fc.
Определения
Для лучшего понимания изобретения некоторые термины определены ниже.
Используемые в описании термины "субъект" и "пациент" обозначают любое животное, такое как млекопитающее, например собака, кошка, птица, домашний скот и предпочтительно человек (например, человек, страдающий заболеванием).
Используемые в настоящем описании термины "молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая",
- 12 -
009746
"последовательность ДНК, кодирующая" и "ДНК, кодирующая" обозначают порядок или последовательность дезоксирибонуклеотидов в цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты. Порядок этих дезоксирибонук-леотидов определяет порядок аминокислот в полипептидной (белковой) цепи. Последовательность ДНК, таким образом, кодирует аминокислотную последовательность.
Говорят, что молекулы ДНК имеют "5' концы" и "3' концы", поскольку мононуклеотиды взаимодействуют с образованием олигонуклеотидов или полинуклеотидов таким образом, что 5'-фосфат одного мононуклеотидного кольца пентозы присоединен к соседнему 3'-кислороду в одном направлении посредством фосфодиэфирной связи. Следовательно, конец олигонуклеотида или полинуклеотида называют "5'-концом", если его 5'-фосфат не связан с 3'-кислородом пентозного кольца мононуклеотида, и "3'-концом", если его 3'-кислород не связан с 5'-фосфатом следующего пентозного кольца мононуклеотида. В настоящем описании последовательность нуклеиновой кислоты, даже если она является внутренней по отношению к олигонуклеотиду или полинуклеотиду большего размера, также может называться последовательностью, содержащей 5'- и 3'-концы. В линейной или круговой молекуле ДНК отдельные элементы обозначают элементы, расположенные в направлении 3'-5' (или просто 5') или в направлении 5'-3' (или просто 3'). Такая терминология отображает тот факт, что транскрипция осуществляется по способу от 5' к 3' вдоль цепи ДНК. Промоторные и энхансерные элементы, которые осуществляют непосредственную транскрипцию связанного гена, в общем, расположены в направлении 5' (от) кодирующего участка. Однако энхансерные элементы могут оказывать свое влияние даже при расположении 3' от промоторного элемента и кодирующего участка. Терминация транскрипции и сигналы полиаденилирования расположены в направлении 3' (от) кодирующего участка.
Используемый в настоящем описании термин "кодон" или "триплет" относится к триплету трех смежных мономеров нуклеотида, который обозначает одну из двадцати природных аминокислот, обнаруженных в ходе биосинтеза полипептидов. Термин также включает несмысловые кодоны, которые не обозначают никакой аминокислоты.
Используемые в настоящем описании термины "олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид" "полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид" и "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид" обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит участок, кодирующий конкретный полипептид. Кодирующий участок присутствует в форме кДНК, геномной ДНК или РНК. Если кодирующий участок присутствует в форме ДНК, то олигонуклеотид или полинуклеотид может быть одноцепочечным (т. е. смысловая цепь) или двухцепочечным. Подходящие контролирующие элементы, такие как энхансе-ры/промоторы, экзон-интронное сочленение, сигналы полиаденилирования и т. д. при необходимости могут быть расположены в непосредственной близости от кодирующей области гена для осуществления надлежащей инициации транскрипции и/или правильного процессинга первичного транскрипта РНК.
Альтернативно, кодирующий участок, используемый в экспрессирующих векторах по данному изобретению, может содержать эндогенные энхансеры/промотеры, экзон-интронные сочленения, прерывающие последовательности, сигналы полиаденилирования и т. д. или комбинацию эндогенных и экзогенных контролирующих элементов.
В настоящем описании термины "комплементарный" или "комплементарность" используются для обозначения полинуклеотидов (т.е. последовательности нуклеотидов) в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов. Например, последовательность "A-G-T" комплементарна последовательности "Т-С-А". Комплементарность может быть "частичной", когда только некоторые из оснований нуклеиновых кислот совпадают в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов. Или может присутствовать "полная" комплементарность между нуклеиновыми кислотами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительное влияние на эффективность и прочность гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Это особенно важно для реакций амплификации, а также для способов обнаружения, которые зависят от связывания между нуклеиновыми кислотами.
В настоящем описании термин "комплемент" данной последовательности используется для обозначения последовательности, которая полностью комплементарна последовательности по всей длине. Например, последовательность A-G-T-A является "комплементом" последовательности Т-С-А-Т.
Термин "гомология" (в отношении последовательностей нуклеиновых кислот) относится к степени комплементарности. Может существовать частичная гомология или полная гомология (т.е. идентичность). Частично комплементарная последовательность представляет собой последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью и обозначается функциональным термином "по существу гомологичная". Термин "ингибирование связывания" в отношении связывания нуклеиновой кислоты относится к ингибированию связывания, вызванному конкуренцией гомологичных последовательностей за связывание с последовательностью-мишенью. Ингибирование гибридизации полностью комплементарной последовательности с последовательностью-мишенью может быть исследовано с использованием гибриди-зационного анализа (Саузерн- или Нозерн-блоттинг, жидкофазная гибридизация и т.п.) в условиях низкой жесткости. По существу гомологичная последовательность или зонд конкурируют за связывание и ингибируют связывание (т.е. гибридизацию) полностью гомологичной последовательности с мишенью в
- 13 -
009746
условиях низкой жесткости. Это не говоря о том, что условия низкой жесткости таковы, что разрешено неспецифическое связывание; условия низкой жесткости требуют, чтобы связывание двух последовательностей друг с другом было специфичным (т.е. селективным) взаимодействием. В отсутствии неспецифического связывания можно убедиться путем использования второй мишени, где отсутствует даже частичная степень комплементарности (например, идентичность менее приблизительно 30%); в отсутствие неспецифического связывания зонд не гибридизуется со второй некомплементарной мишенью.
Из уровня техники хорошо известно, что многочисленные эквивалентные условия могут использоваться для создания условий низкой жесткости; рассматриваются такие факторы, как длина и природа (ДНК, РНК, нуклеотидный состав) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, нуклеотидный состав, находится в растворе или иммобилизирован, и т.д.) и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, декстрана сульфата, полиэтиленгликоля), и раствор для гибридизации может варьироваться для создания условий гибридизации низкой жесткости, которые отличаются от приведенных выше условий, но эквивалентны им. Кроме того, из уровня техники известны условия, которые способствуют гибридизации в условиях высокой жесткости (например, повышение температуры гибридизации и/или стадии отмывки, использование формамида в гибридизационном растворе и т.д.).
Последовательность нуклеиновой кислоты (например, кодирующей вариант участка Fc или его часть) может образовывать множество типов РНК, которые создаются путем альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК. кДНК, которые являются вариантами сплайсинга одного гена, содержат идентичные или полностью гомологичные участки последовательности (являющиеся следствием наличия одинаковых экзона или части экзона в обеих кДНК) и участки полной неидентичности (например, являющиеся следствием наличия экзона "А" в кДНК 1, причем кДНК 2 вместо этого содержит экзон " В"). Поскольку две кДНК содержат участки идентичности последовательности, они оба будут гибриди-зоваться с зондом, полученным из целого гена или частей гена, содержащих последовательности, имеющиеся в обеих кДНК; два варианта сплайсинга, таким образом, являются по существу гомологичными с таким зондом и друг с другом.
Термин "по существу гомологичный" в отношении одноцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты относится к любому зонду, который может гибридизоваться (т.е. является комплементарным) с одноцепочечной последовательностью нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.
В настоящем описании термин "гибридизация" используется для обозначения спаривания комплементарных нуклеиновых кислот. На гибридизацию и прочность гибридизации (т. е. прочность связи между нуклеиновыми кислотами) влияют такие факторы, как степень комплементарности между нуклеиновыми кислотами, жесткость используемых условий, Тпл образованного гибрида и соотношение G:C в нуклеиновых кислотах.
В настоящем описании термин "Тпл" используется для обозначения "температуры плавления". Температура плавления представляет собой температуру, при которой популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты диссоциирует на одинарные цепи. Уравнение для расчета Тпл нуклеиновых кислот хорошо известно из уровня техники. Как указано в стандартных источниках, простая оценка значения Тпл может быть рассчитана по уравнению: Тпл=81,5+0,41(%G+C), если нуклеиновая кислота находится в водном растворе с 1 М NaCl (см., например, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]). В других источниках сообщается о более сложных вычислениях, которые принимают в расчет структурные характеристики и характеристики последовательности для расчета Тпл; и в некоторых случаях Тпл может быть определена эмпирически, исходя из расчетной Тпл путем повышения или понижения температуры с малым шагом и определения воздействия на популяцию молекул нуклеиновых кислот.
В настоящем описании термин "жесткость" в отношении условий температуры, ионной силы и присутствия других соединений, таких как органические растворители, при которых проводится гибридизация нуклеиновых кислот. Специалистам в данной области очевидно, что "жесткость" условий может быть изменена путем варьирования описанных выше параметров по отдельности или в совокупности. При условиях "высокой жесткости" спаривание оснований нуклеиновой кислоты будет происходить только между фрагментами нуклеиновой кислоты, имеющими высокую частоту комплементарных нук-леотидных последовательностей (например, гибридизация в условиях "высокой жесткости" может возникать между гомологами с идентичностью 80-100%, предпочтительно с идентичностью приблизительно 70-100%). При условиях средней жесткости спаривание оснований нуклеиновой кислоты будет происходить между нуклеиновыми кислотами со средней частотой комплементарных нуклеотидных последовательностей (например, гибридизация в условиях "средней жесткости" будет происходить между гомологами с идентичностью приблизительно 50-70%). Таким образом, условия "слабой" или "низкой" жесткости часто необходимы при использовании нуклеиновых кислот, которые получены из генетически отличных организмов, так как частота комплементарных последовательностей в них обычно меньше.
Термин "условия высокой жесткости" в отношении гибридизации нуклеиновой кислоты включает условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% натрия доде-цилсульфата, 5Х реактив Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последую
- 14 -
009746
щей отмывкой в растворе, который включает 0,1 Х SSPE, 1,0% SDS при 42°С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов длиной. Термин "условия средней жесткости" в отношении гибридизации нуклеиновой кислоты включает условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH2PO4 H2O и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% натрия додецилсульфата, 5Х реактив Денхардта и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последующей отмывкой в растворе, который включает 1,0Х SSPE, 1,0% натрия додецилсульфата при 42°С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нук-леотидов.
" Условия низкой жесткости" включают условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°С в растворе, состоящем из 5Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaHPO4 H2O и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,1% натрия додецилсульфата, 5Х реактив Денхардта [50Х содержит на 500 мл: 5 г Ficoll (тип 400, Pharmacia), 5 г BSA (фракция V; Sigma)] и 100 г/мл денатурированной ДНК из молок лосося, с последующей отмывкой в растворе, который включает 5Х SSPE, 0,1% натрия додецил-сульфата при 42°С, когда используется зонд длиной приблизительно 500 нуклеотидов.
Следующие термины используются для описания соотношений последовательностей между двумя или больше полинуклеотидами: "ссылочная последовательность", "идентичность последовательностей" и "процент идентичности последовательности". "Ссылочная последовательность" представляет собой определенную последовательность, которая используется как основа для сравнения последовательностей; ссылочная последовательность может быть подмножеством последовательности большего размера, например, в качестве сегмента полноразмерной последовательности кДНК, приведенной в перечне последовательностей, или может включать полную последовательность гена. В общем, длина ссылочной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов, часто по меньшей мере 25 нуклеотидов, и часто по меньшей мере 50 нуклеотидов (например, любая из SEQ ID NO: 32-37 может использоваться как ссылочная последовательность). Поскольку каждый из двух полинуклеотидов (1) может содержать последовательность (т.е. часть полной последовательности полинуклеотида), которая является сходной для двух полинуклеотидов, и (2) может дополнительно включать последовательность, которая будет различной для двух полинуклеотидов, сравнение последовательностей между двумя (или несколькими) по-линуклеотидами обычно осуществляется путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов на протяжении "окна сравнения", предназначенного для идентификации сходства и сравнения локальных участков последовательностей. "Окно сравнения" в настоящем описании относится к схематичному сегменту длиной по меньшей мере 20 смежных нуклеотидных положений, причем полинуклеотидная последовательность может сравниваться с ссылочной последовательностью длиной по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов, и причем часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать добавление или делецию (т. е. промежутки), составляющие 20 или меньше процентов от длины ссылочной последовательности (которая не включает добавление или делецию) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может проводиться по алгоритму локальной гомологии Smith и Waterman [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)] по алгоритму гомологичного выравнивания Needleman и Wunsch [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], методом поиска сходства Pearson и Lipman [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)], с помощью компьютеризованных воплощений данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7,0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) или просмотром, и выбирают наилучшее выравнивание (т. е. приводящее к наибольшему проценту гомологии на протяжении окна сравнения) из полученных с помощью различных методов. Термин "идентичность последовательностей" означает, что две последовательности полинуклеотидов являются идентичными (т. е. по каждому "нук-леотиду") на протяжении окна сравнения. "Процент идентичности последовательностей" рассчитывают путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения, определения количества положений, при которых идентичные основания нуклеиновой кислоты (например, А, Т, С, G, U или I) встречаются в обеих последовательностях с получением количества соответствующих положений, делением количества соответствующих положений на общее количество положений в окне сравнения (т. е. размер окна) и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательности. Окно сравнения в данной заявке представляет собой полную длину упомянутой ссылочной последовательности (т.е. если SEQ ID NO:33 упоминается как ссылочная последовательность, процент идентичности последовательности сравнивают на протяжении полной длины SEQ ID NO:33).
В настоящем описании термин "зонд" относится к олигонуклеотиду (т.е. последовательности нук-леотидов), который встречается в природе и который получают в виде рестрикционного фрагмента или получен синтетическим путем, рекомбинантным способом или путем ПЦР амплификации, который способен гибридизоваться с другим интересующим олигонуклеотидом. Зонд может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Зонды применимы для обнаружения, идентификации и выделения последовательностей конкретных генов. Считается, что любой зонд, который используется в соответствии с настоящим изобретением, может быть помечен любой "репортерной молекулой", таким образом, что он может быть обнаружен в любой системе обнаружения, включая без ограничения ферментные (например, ELISA, а
- 15 -
009746
также гистохимические анализы на основе ферментов), флуоресцентные, радиоактивные и люминесцентные системы. Настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной системой обнаружения или меткой.
В настоящем описании термин "полимеразная цепная реакция" ("ПЦР") относится к способу, описанному в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4965188, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, в которых раскрыт способ увеличения концентрации сегмента последовательности-мишени в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Этот способ амплификации последовательности-мишени состоит из введения большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, которая содержит желаемую последовательность-мишень, с последующей точной последовательностью циклов термической обработки в присутствии ДНК-полимеразы. Два праймера комлементарны соответствующим цепям двухцепочечной последовательности-мишени. Для осуществления амплификации смесь денатурируют и праймеры затем отжигают с комплементарными последовательностями в молекуле-мишени. После отжига праймеры удлиняют с помощью полимеразы таким образом, чтобы образовать новую пару комплементарных цепей. Стадии денатурации, отжига праймера и полимеразного удлинения могут повторяться несколько раз (т. е. денатурация, отжиг и удлинение составляют один "цикл"; и может присутствовать много "циклов") для получения высокой концентрации амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени. Длину амплифицированного сегмента желаемой последовательности-мишени определяют по относительным положениям праймеров друг относительно друга, и, таким образом, эта длина является контролируемым параметром. Из-за аспекта повторяемости процесса способ называется "полимеразной цепной реакцией" (в настоящем описании "ПЦР"). Поскольку желаемые амплифицированные сегменты последовательности-мишени становятся преобладающими в смеси последовательностями (по концентрации), их называют "ПЦР-амплифицированными".
ПЦР позволяет амплифицировать единственную копию конкретной последовательности-мишени в геномной ДНК до уровня, который может быть обнаружен с помощью нескольких различных методик (например, гибридизации с меченым зондом; включения биотинилированных праймеров с последующим обнаружением с помощью авидин-ферментного конъюгата; включения меченых 32Р дезоксинуклеотид-трифосфатов, таких как дЦТФ или дАТФ, в амплифицированный сегмент). Помимо геномной ДНК, любая олигонуклеотидная или полинуклеотидная последовательность может быть амплифицирована с помощью подходящего набора молекул праймеров. Конкретно, амплифицированные сегменты, созданные с помощью процесса ПЦР, сами по себе являются эффективными матрицами для последующей ПЦР-амплификации.
Термин "выделенный" в отношении нуклеиновой кислоты, как в выражениях "выделенный олиго-нуклеотид" или "выделенный полипептид", относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей нуклеиновой кислоты, с которой она обычно встречается в их природном источнике. Выделенная нуклеиновая кислота находится в виде или состоянии, которое отличается от того, в котором она встречается в природе. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, таким образом, отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, которая существует в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, причем, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомном локусе, отличном от локуса в природных клетках. Выделенная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид может существовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если выделенная нуклеиновая кислота, олигонук-леотид или полинуклеотид используются для экспрессии белка, олигонуклеотид или полинуклеотид будет содержать по меньшей мере смысловую или кодирующую цепь (т. е. олигонуклеотид или полинук-леотид может быть одноцепочечным), но могут содержать смысловую и антисмысловую цепи (т.е. оли-гонуклеотид или полинуклеотид может быть двухцепочечным).
В настоящем описании термин "часть" в отношении нуклеотидной последовательности (как в выражениях "часть данной нуклеотидной последовательности") относится к фрагментам такой последовательности. Фрагменты могут варьировать по размеру от 10 нуклеотидов до полной нуклеотидной последовательности минус один нуклеотид (например, 10 нуклеотидов, 20, 30, 40, 50, 100, 200 и т.д.).
В настоящем описании термин "часть" в отношении аминокислотной последовательности (как в выражениях "часть данной аминокислотной последовательности") относится к фрагментам такой последовательности. Фрагменты могут варьировать по размеру от 6 аминокислот до полной аминокислотной последовательности минус одна аминокислота (например, 6 аминокислот, 10, 20, 30, 40, 75, 200 и т.д.).
В настоящем описании термин "очищенный" или "очищать" означает удаление загрязняющих веществ из образца. Например, антиген-специфические антитела могут быть очищены удалением загрязняющих белков, отличных от иммуноглобулинов; их также очищают удалением иммуноглобулина, который не связывается с тем же антигеном. Удаление белков, отличных от иммуноглобулинов, и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с конкретным антигеном, приводит к увеличению процентного содержания антиген-специфических иммуноглобулинов в образце. В другом примере ре-комбинантные антиген-специфические полипептиды экспрессируются в бактериальных клетках-хозяевах, и полипептиды очищают удалением белков клеток-хозяев; процент рекомбинантных антиген
- 16 -
009746
специфических полипептидов в образце таким образом повышается.
Термин "рекомбинантная молекула ДНК" в настоящем описании относится к молекуле ДНК, которая включает сегменты ДНК, соединенные вместе в соответствии с молекулярно-биологическими методиками.
Термин "рекомбинантный белок" или "рекомбинантный полипептид" в настоящем описании относится к молекуле белка, который экспрессируется молекулой рекомбинантной ДНК.
Термин "нативный белок" в настоящем описании показывает, что белок не содержит остатков аминокислот, кодируемых векторными последовательностями; т. е. нативный белок содержит только аминокислоты, присутствующие в белке, который обычно встречается в природе. Нативный белок может быть получен рекомбинатными средствами или может быть выделен из природного источника.
Термин "Саузерн-блоттинг" относится к анализу ДНК на агарозных или акриламидных гелях для фракционирования ДНК в соответствии с размером с последующим переносом ДНК из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированную ДНК затем зондируют меченым зондом для обнаружения молекул ДНК, комплементарных используемому зонду. ДНК может быть расщеплена рестриктазами до проведения электрофореза. После электрофореза ДНК может быть частично депуринирована и денатурирована до или во время переноса на твердую подложку. Сау-зерн-блоттинг представляет собой стандартный инструмент молекулярных биологов (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58 [1989]).
Термин "Нозерн-блоттинг" в настоящем описании относится к анализу РНК путем электрофореза РНК на агарозных гелях для фракционирования РНК в соответствии с размером с последующим переносом РНК из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммоби-лизированную РНК затем зондируют меченым зондом для выявления молекул РНК, комплементарных используемому зонду. Нозерн-блоттинг представляет собой стандартный инструмент молекулярных биологов (J. Sambrook, et al., supra, pp 7.39-7.52 [1989]).
Термин "Вестерн-блоттинг" относится к анализу белка(ов) (или полипептидов), иммобилизирован-ных на подложке, такой как нитроцеллюлоза или мембрана. Белки обрабатывают на акриламидных гелях для разделения, с последующим переносом белка из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Иммобилизированные белки затем контактируют с антителами, реагирующими с интересующим антигеном. Связывание антител можно выявить различными способами, включая использование радиоактивно меченых антител.
Термин "антигенная детерминанта" в настоящем описании относится к такой части антигена, которая контактирует с конкретным антителом (т.е. эпитопу). Если белок или фрагмент белка используют для иммунизации животного-хозяина, многочисленные участки белка могут индуцировать продукцию антител, которые специфически связываются с данным участком или трехмерной структурой белка; данные участки или структуры обозначают как антигенные детерминанты. Антигенная детерминанта может конкурировать с интактным антигеном (т. е. "иммуногеном", который используется для индукции иммунного ответа) за связывание с антителом.
Термин "трансген" в настоящем описании относится к чужеродному, гетерологичному или аутоло-гичному гену, который вводят в организм путем введения гена в только что оплодотворенные яйца или эмбрионы на ранних стадиях. Термин "чужеродный ген" относится к любой нуклеиновой кислоте (например, генной последовательности), которая введена в геном животного с помощью экспериментальных манипуляций и может включать генные последовательности, имеющиеся у такого животного при условии, что введенный ген имеет локализацию, отличную от таковой природного гена. Термин "аутоло-гичный ген" включает варианты (например, полиморфы или мутанты) природного гена. Термин "транс-ген", таким образом, включает замещение природного гена вариантной формой гена.
В настоящем описании термин "вектор" используется для обозначения молекул нуклеиновой кислоты, которые переносят сегмент(ы) ДНК от одной клетки к другой. Термин "носитель" иногда используется взаимозаменяемо с термином "вектор".
Термин "экспрессирующий вектор" в настоящем описании относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей желаемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии функционально присоединенной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине.
Последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии в прокариотах, обычно включают промотор, оператор (необязательно) и сайт связывания рибосомы, часто вместе с другими последовательностями. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования.
В настоящем описании термин "клетка-хозяин" относится к любой эукариотической или прокарио-тической клетке (например, бактериальным клеткам, таким как Е. coli, клетки СНО, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки амфибий, клетки растений, клетки рыб и клетки насекомых), находящейся in vitro или in vivo. Например, клетки-хозяева могут находиться в трансгенном животном.
Термины "трансфекция" и "трансформация" в настоящем описании означают введение чужеродной
- 17 -
009746
ДНК в клетки (например, эукариотические или прокариотические клетки). Трансфекция может достигаться с помощью разнообразных средств, известных из уровня техники, включая соосаждение фосфата кальция-ДНК, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, опосредованную полибреном транс-фекцию, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосомы, липофекцию, слияние протопласта, рет-ровирусную инфекцию и биолистику.
Термин "стабильная трансфекция" или "стабильно трансфицированный" относится к введению и интеграции чужеродной ДНК в геном трансфицированной клетки. Термин "стабильный трансфектант" относится к клетке, которая содержит чужеродную ДНК, стабильно встроенную в геномную ДНК.
Термин "временная трансфекция" или "временно трансфицированный" относится к введению чужеродной ДНК в клетку, где чужеродная ДНК не способна встроиться в геном трансфицированной клетки. Чужеродная ДНК сохраняется в ядре трансфицированной клетки в течение нескольких дней. В течение этого времени чужеродная ДНК подвергается регуляторному контролю, который управляет экспрессией эндогенных генов в хромосомах. Термин "временный трансфектант" относится к клеткам, которые захватили чужеродную ДНК, но оказались не способны интегрировать эту ДНК.
Термин "соосаждение с фосфатом кальция" относится к технике введения нуклеиновых кислот в клетку. Захват нуклеиновых кислот клетками усиливается, если нуклеиновая кислота присутствует в виде соосадка фосфат кальция-нуклеиновая кислота. Исходная методика Graham и van der Eb (Graham и van der Eb, Virol., 52:456 [1973]) была модифицирована несколькими группами для оптимизации условий для конкретных типов клеток. Эти многочисленные модификации хорошо известны из уровня техники.
Термин "композиция, которая включает данную последовательность полинуклеотида" в настоящем описании относится к любой композиции, включающей данную последовательность полинуклеотида. Композиция может включать водный раствор. Композиция, включающая последовательности полинук-леотида, кодирующие, например, вариант участка Fc или его фрагмент, может применяться как зонд гибридизации. В этом случае последовательности полинуклеотида, кодирующие вариант участка Fc, обычно применяются в водном растворе, содержащем соли (например, NaCl), детергенты (например, натрия до-децилсульфат) и другие компоненты (например, раствор Денхардта, сухое молоко, ДНК молоки лосося и т.д.).
Термины "исследуемое соединение" или "соединение-кандидат" обозначают любое химическое вещество, фармацевтический препарат, лекарственное средство и т.п., которые могут быть применены для лечения или профилактики заболевания, недомогания, болезни или расстройства функций организма или другим образом изменяет физиологический или клеточный статус образца. Исследуемые соединения включают известные и потенциальные лекарственные соединения. Терапевтические свойства исследуемого соединения могут быть определены путем скрининга с применением способа скрининга по данному изобретению. Термин "известное терапевтическое соединение" относится к соединению с доказанными лечебными свойствами (например, в результате исследований на животных или предварительного опыта введения людям) как эффективное для такого лечения или профилактики.
В настоящем описании термин "ответ" в отношении анализа относится к генерации детектируемого сигнала (например, накопление репортерного белка, повышение концентрации иона, накопление детектируемого химического продукта).
В настоящем описании термин "репортерный ген" относится к гену, кодирующему белок, который может быть обнаружен с помощью анализа. Примеры репортерных генов включают без ограничения люциферазу (см., например, deWet et al., Mol. Cell. Biol., 7:725 [1987] и патент США № 6074859, включенные в настоящее описание посредством ссылки), зеленый флуоресцентный белок (GFP, например, GenBank Accession Number U43284; множество вариантов GFP коммерчески доступны от CLONTECH Laboratories, Palo Alto, СА), хлорамфеникол ацетилтрансферазу, р-галактозидазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу хрена.
В настоящем описании термины "компьютерная память" и "устройство компьютерной памяти" обозначает любые средства для хранения, которые могут быть считаны процессором компьютера. Примеры компьютерной памяти включают без ограничения ПЗУ, ОЗУ, компьютерные микросхемы, цифровые видеодиски (DVD), компакт-диски (CD), жесткие диски (HDD) и магнитную ленту.
В настоящем описании термин "машиночитаемый носитель" относится к любому устройству или системе для хранения и доставки информации (например, данные и инструкции) процессору компьютера. Примеры машиночитаемых носителей включают без ограничения DVD, CD, жесткие диски, магнитную ленту и серверы для распределения носителей по компьютерным сетям.
В настоящем описании фраза "машиночитаемый носитель кодирует представление" последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности относится к машиночитаемому носителю, на котором хранится информация, которая при доставке процессору позволяет показать пользователю (например, распечатать или представить на экране дисплея) последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислот.
В настоящем описании термины "процессор" и "модуль центрального процессора" или "CPU" используются взаимозаменяемо и обозначают устройство, способное считывать программу из памяти компьютера (например, ПЗУ или другой вид компьютерной памяти) и выполнять набор шагов в соответст
- 18 -
009746
вии с программой.
В настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина использует формат индекса ЕС, как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), специально включенной в настоящее описание посредством ссылки. Термин "формат индекса ЕС согласно Kabat" относится к нумерации остатков антитела человеческого IgG1 EC.
В настоящем описании термин "исходный полипептид" представляет собой полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая может быть заменена или изменена (например, осуществлены замена, добавление или делеция аминокислоты) для создания варианта. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает по меньшей мере часть природного участка Fc или участок Fc с модификациями аминокислотной последовательности (например, добавление, делеция и/или замена). В некоторых вариантах осуществления конкретно рассматриваются варианты, которые короче или длиннее, чем исходный полипептид. В особенно предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид отличается по функции (например, эффекторная функция, связывание и т. д.) в сравнении с вариантом.
В настоящем описании термин "вариант исходного полипептида" относится к пептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая отличается от таковой исходного полипептида по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. В определенных вариантах осуществления вариант включает по меньшей мере часть участка Fc (например, по меньшей мере 40, 50, 75 или 90% или участок Fc). В предпочтительных вариантах осуществления вариант включает участок Fc исходного полипептида по меньшей мере с одной модификацией аминокислоты.
В настоящем описании термин "участок Fc" относится к С-концевому участку тяжелой цепи иммуноглобулина. "Участок Fc" может быть участком Fc с нативной последовательностью или вариантом участка Fc. Хотя общепринятые границы участка Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, участок Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяется промежутком от остатка аминокислоты в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления варианты включают только части участка Fc и могут включать или не включать карбоксильный конец. Участок Fc иммуноглобулина, в общем, включает два константных домена, СН2 и CH3. В некоторых вариантах осуществления рассматриваются варианты, содержащие один или несколько константных доменов. В других вариантах осуществления рассматриваются варианты без таких константных доменов (или только с частью таких константных доменов).
В настоящем описании "СН2 домен" (также обозначается как "Су2" домен), как правило, включает промежуток остатков, который продолжается приблизительно от аминокислоты 231 приблизительно до аминокислоты 340 на участке Fc (например, в человеческом участке Fc IgG). Домен СН2 является уникальным в том, что он не является тесно спаренным с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи встроены между двумя доменами СН2 интактной молекулы нативного IgG.
В настоящем описании "CH3 домен" (также обозначается как "Су3" домен), как правило, включает промежуток остатков С-концевого по отношению к СН2 домену участка Fc (например, приблизительно от остатка аминокислоты 341 приблизительно до остатка аминокислоты 447 участка Fc IgG человека).
В настоящем описании участок Fc может обладать "эффекторными функциями", которые ответственны за активацию или снижение биологической активности (например, у субъекта). Примеры эффек-торных функций включают без ограничения C1q: связывание; комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т. д. Такие эффекторные функции могут требовать, чтобы участок Fc был объединен с доменом связывания (например, вариабельный домен антитела), и могут быть оценены с применением различных анализов (например, анализа связывания Fc, анализа ADCC, анализа CDC, истощение клеток-мишеней из образцов цельной или фракционированной крови и т. д.).
В настоящем описании термин "натаивная последовательность участка Fc" или "участок Fc дикого типа" относится к аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотной последовательности участка Fc, обычно встречающейся в природе. Показательные нативные последовательности участка Fc человека и включают нативную последовательность участка Fc человеческого IgG1 (f и a, z аллоти-пы); нативную последовательность участка Fc человеческого IgG2; нативную последовательность участка Fc человеческого IgG3 и нативную последовательность участка Fc человеческого IgG4, а также их природные варианты. Другие последовательности также рассматриваются и могут быть легко получены с различных веб-сайтов (например, веб-сайт NCBI).
В настоящем описании термин "вариант участка Fc" относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от таковой участка Fc с нативной последовательностью (или их части) по меньшей мере одной модификацией аминокислоты (например, заменой, вставкой или делецией), включая гетеродимерные варианты, причем последовательности субъединиц тяжелой цепи могут отличаться друг от друга. В предпочтительных вариантах осуществления вариант участка Fc включает по меньшей мере
- 19 -
009746
одну замену аминокислоты в сравнении с участком Fc с нативной последовательностью (например, заменено приблизительно от 1 приблизительно до 10 аминокислот и предпочтительно заменено приблизительно от 1 приблизительно до 5 аминокислот в нативной последовательности участка Fc). В предпочтительных вариантах осуществления варианты участка Fc будут обладать по меньшей мере приблизительно 80% гомологии с нативной последовательностью участка Fc, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологии и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологии.
В настоящем описании термин "гомология" в отношении аминокислотных последовательностей относится к проценту остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые являются идентичными с нативной аминокислотной последовательностью после выравнивания последовательностей и введения при необходимости пропусков для достижения максимального процента гомологии.
Термин "полипептид, содержащий участок Fc" относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин (см. определения ниже), который включает участок Fc.
Термины "Fc-рецептор" и "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с участком Fc (например, участок Fc антитела или фрагмента антитела). Термин включает рецептор новорожденных, FcRn, который отвечает за перенос иммуноглобулинов IgG от матери плоду.
В настоящем описании фраза "антитело-зависимая клеточная цитотоксичность" и термин "ADCC" означают клеточно-опосредованную реакцию, в которой цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют FcRs (например, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клеток-мишеней. Основные клетки для опосредования ADCC, клетки NK, экспрессируют FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII.
В настоящем описании фраза "эффекторные клетки" относится к лейкоцитам, которые экспресси-руют один или больше FcRs и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспресси-руют по меньшей мере FcyRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника (например, из крови).
В настоящем описании фраза "цельная кровь" относится к образцам нефракционированной крови.
В настоящем описании вариант полипептида с "измененной" FcR связывающей активностью или ADCC активностью представляет собой такой, который обладает увеличенной (т.е. повышенной) или уменьшенной (т.е. сниженной) FcR-связывающей активностью и/или активностью ADCC в сравнении с исходным полипептидом или полипептидом, включающим участок Fc с нативной последовательностью. Вариант полипептида, который "демонстрирует повышенное связывание" с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с лучшим сродством, чем исходный полипептид. Вариант полипептида, который "демонстрирует сниженное связывание" с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с худшим сродством, чем исходный полипептид. Такие варианты, которые демонстрируют сниженное связывание с FcR, могут проявлять небольшое или не проявлять совсем заметного связывания с FcR, например 0-20% связывание с FcR в сравнении с исходным полипептидом. Вариант полипептида, который связывает FcR с " лучшим сродством", чем исходный полипептид, представляет собой полипептид, который связывает любой один или несколько из идентифицированных выше FcR с более высоким сродством связывания, чем исходное антитело, когда количества варианта полипептида и исходный полипептид в пробе связывания по существу являются сходными, и все другие условия являются идентичными. Например, вариант полипептида с улучшенным сродством связывания с FcR может демонстрировать приблизительно от 1,10-кратного приблизительно до 100-кратного (чаще приблизительно от 1,2-кратного приблизительно до 50-кратного) улучшения (т.е. повышения) сродства связывания с FcR в сравнении с исходным полипептидом, где FcR связывающую активность определяют, например, в анализе ELISA.
В настоящем описании "модификация аминокислоты" относится к изменению в аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности. Показательные модификации включают без ограничения замену, вставку и/или делецию аминокислоты. В предпочтительных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой замену (например, в участке Fc исходного полипептида).
В настоящем описании "модификация аминокислоты в" указанном положении (например, в участке Fc) относится к замене или делеции обозначенного остатка или вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка, смежного с обозначенным остатком. Вставка "смежного" с указанным остатка означает вставку с одним или двумя его остатками. Вставка может быть N-концевой или С-концевой по отношению к указанному остатку.
В настоящем описании "замена аминокислоты" относится к замене по меньшей мере одного существующего остатка аминокислоты в данной аминокислотной последовательности другим отличным "заменяющим" остатком аминокислоты. Заменяющий остаток или остатки могут представлять собой "природные остатки аминокислот" (т.е. кодируемые генетическим кодом) и выбранные из: аланина (Ala); аргинина (Arg); аспарагина (Asn); аспарагиновой кислоты (Asp); цистеина (Cys); глутамина (Gln); глутами
- 20 -
009746
новой кислоты (Glu); глицина (Gly); гистидина (His); изолейцина (lle); лейцина (Leu); лизина (Lys); ме-тионина (Met); фенилаланина (Phe); пролина (Pro); серина (Ser); треонина (Thr); триптофана (Trp); тирозина (Tyr) и валина (Val). Замена одним или несколькими остатками неприродных аминокислот также охватывается определением аминокислотной замены в настоящем описании. Термин "неприродный аминокислотный остаток" относится к остатку, отличному от природных аминокислотных остатков, перечисленных выше, который способен ковалентно связываться со смежным остатком(ами) аминокислот в полипептидной цепи. Примеры неприродных аминокислотных остатков включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги остатков аминокислот, такие как описаны в Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), включенной сюда посредством ссылки.
В настоящем описании термин "вставка аминокислоты" относится к включению по меньшей мере одной аминокислоты в данной аминокислотной последовательности. В предпочтительных вариантах осуществления вставка обычно представляет собой вставку одного или двух остатков аминокислот. В других вариантах осуществления вставка включает вставки большего пептида (например, вставку приблизительно от 3 приблизительно до 5 или даже приблизительно 10 аминокислотных остатков).
В настоящем описании термин "делеция аминокислоты" относится к делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка из данной аминокислотной последовательности.
Термин "аналитический сигнал" относится к выходу любого способа обнаружения белок-белкового взаимодействия, включая без ограничения измерение поглощения колориметрических анализов, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализов могут включать ELISA, Facs или другие способы. Изменение в "аналитическом сигнале" может отображать изменение жизнеспособности клеток и/или изменение в кинетике образования связей, кинетике диссоциации связей или обеих. Термин " более сильный аналитический сигнал" относится к измеренному значению выхода, большему, чем другое число (например, вариант может иметь более высокое (большее) измеренное значение в анализе ELISA в сравнении с исходным полипептидом). Термин "более слабый аналитический" сигнал относится к измеренному значению выхода, более низкому, чем другое число (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное значение в анализе ELISA в сравнении с исходным полипептидом).
Термин "связывающая активность" относится к константе равновесия диссоциации (выражается в единицах концентрации), связанной с каждым связывающим взаимодействием Fc рецептор-Fc. Сродство связывания имеет непосредственное отношение к соотношению кинетики образования связей (в общем регистрируется в единицах обратного времени, например с-1), разделенных на кинетику диссоциации связей (в общем регистрируется в единицах концентрации на единицу времени, например, мол./с). Обычно невозможно однозначно утверждать, являются ли изменения констант равновесия диссоциации следствием отличий в образовании связей, диссоциации связей или обоих параметрах, за исключением случая, когда каждый из этих параметров определен экспериментально (например, с помощью измерений BIACORE или SAPIDYNE).
В настоящем описании термин "шарнирный участок" относится к промежутку аминокислот в IgG1 человека, который простирается от Glu216 до Pro230 человеческого IgG1. Шарнирные участки других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 размещением первого и последнего остатков цистеина, образующих S-S связи между тяжелыми цепями в одних и тех же положениях.
В настоящем описании термин "нижний шарнирный участок" участка Fc относится к промежутку аминокислотных остатков непосредственно С-концевых по отношению к шарнирному участку (например, остатки 233-239 участка Fc IgG1).
"C1q" представляет собой полипептид, который включает сайт связывания для участка Fc иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, С1Г и C1s, образует комплекс С1, первый компонент пути комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).
В настоящем описании термин "антитело" используется в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликло-нальные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.
В настоящем описании термин "фрагменты антител" относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают без ограничения линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; пептиды Fc или Fc', Fab и Fab фрагменты и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антител предпочтительно сохраняют по меньшей мере часть шарнирного и необязательно СН1 участка тяжелой цепи IgG. В других предпочтительных вариантах осуществления фрагменты антитела включают по меньшей мере часть участка СН2 или полностью участок СН2.
В настоящем описании термин "функциональный фрагмент" в отношении моноклонального антитела относится к части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может быть, например, антиген-связывающей активностью или специфичностью. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают, например, отдельные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как VL, VH и Fd; моновалентные фрагменты, такие как Fv, Fab, и Fab'; двухвалентные фрагменты, такие как F(ab')2; одноцепочечные Fv (scFv) и фрагменты Fc. Такие термины описаны, например, в Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference
- 21 -
009746
(Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluck-thun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) и в Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990), каждая из которых включена сюда посредством ссылки. Термин "функциональный фрагмент" включает, например, фрагменты, образованные путем расщепления про-теазой или восстановления моноклонального антитела и с помощью методов рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области.
В настоящем описании "гуманизированные" формы, отличные от человеческих (например, мышиных) антител, представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из отличного от человеческого иммуноглобулина, или она отсутствует. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в котором остатки гипервариабельного участка реципиента замещены остатками гипервариабельного участка отличных от человеческих видов (антитело-донор), таких как мышь, кролик или нечеловекообразный примат, имеющих желаемую специфичность, сродство и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека замещены соответствующими отличными от человеческих остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не содержатся в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации, как правило, осуществляют для дальнейшего улучшения функциональности антитела. Обычно гуманизированное антитело будет включать, по существу, все, по меньшей мере один и обычно два вариабельных домена, где все или, по существу, все гипервариабельные петли соответствуют таковым отличного от человеческого иммуноглобулина и все или, по существу, все остатки FR являются таковыми последовательности человеческих иммуноглобулинов. Гуманизированное антитело может также включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Примеры способов, которые используются для создания гуманизированного антитела, описаны в патенте США № 5225539, выданном Winter et al. (включен сюда посредством ссылки).
В настоящем описании термин "гипервариабельный участок" относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок включает аминокислотные остатки из "определяющего комплементарность участка" или "CDR" (т.е. остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или такие остатки из "гипервариабельной петли" (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). "Каркасные" или "FR" остатки являются остатками вариабельного домена, другими чем остатки гипервариабельного участка, как определено в настоящем описании.
В настоящем описании термин "иммуноадгезин" обозначает антитело-подобные молекулы, которые сочетают домен связывания гетерологичного "адгезина" белка (например, рецептор, лиганд или фермент) с константным доменом иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины включают гибрид аминокислотной последовательности с желаемой специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (антиген-связывающего сайта) антитела (т.е. является "гетерологич-ным") по отношению к последовательности константного домена иммуноглобулина.
В настоящем описании термин "лиганд-связывающий домен" относится к любому нативному рецептору или любому участку или его производному, которое сохраняет по меньшей мере качественную лиганд-связывающую способность соответствующего нативного рецептора. В определенных вариантах осуществления рецептор происходит из полипептида клеточной поверхности, который содержит внеклеточный домен и является гомологичным члену надсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются членами надсемейства иммуноглобулинов, но, тем не менее, конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы цитокинов, и, конкретно, рецепторы с тирозинки-назной активностью (рецепторы тирозинкиназы), члены надсемейств рецепторов гематопоэтинов и факторов роста нервов, и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, L- и Р- селектины).
В настоящем описании термин "рецептор-связывающий домен" относится к любому нативному ли-ганду рецептора, включая молекулы клеточной адгезии или любой участок или производное такого природного лиганда, сохраняющему по меньшей мере качественную способность к связыванию соответствующего нативного лиганда.
В настоящем описании термин "антитело-иммуноадгезиновая химера" включает молекулу, которая сочетает по меньшей мере один домен связывания антитела по меньшей мере с одним иммуноадгезином. Примеры включают без ограничения биспецифические CD4-IgG химеры, описанные в Berg et al., PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) и Charnow et al., J. Immunol., 153:4268 (1994), каждая из которых включена сюда посредством ссылки.
В настоящем описании "выделенный" полипептид представляет собой полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен от компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые будут мешать диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и
- 22 -
009746
другие белковые или небелковые вещества. В определенных вариантах осуществления выделенный полипептид очищают до (1) более 95 мас.% полипептидов, как определено по методу Лоури, и предпочтительно более 99 мас.%, (2) достаточной степени для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования колпачного секвенатора или (3) до гомогенности с помощью электрофореза на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси голубого или окрашивания серебром. Выделенный полипептид включает полипептид in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения полипептида будет отсутствовать. Обычно, однако, выделенный полипептид будет получен с помощью по меньшей мере одной стадии очистки.
В настоящем описании термин "лечение" относится к лечебным и профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, у кого уже имеется нарушение, а также тех, у кого нарушение должно быть предупреждено.
В настоящем описании термин "нарушение" относится к любому состоянию, при котором пациент будет получать пользу от лечения вариантом полипептида, включая хронические и острые нарушения или заболевания (например, патологические состояния, которые предрасполагают пациента к конкретному расстройству). В определенных вариантах осуществления нарушение представляет собой злокачественную опухоль.
В настоящем описании термины "злокачественная опухоль" и "злокачественный" относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественной опухоли включают без ограничения карциному, лим-фому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов злокачественной опухоли включают чешуйчатоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аде-нокарциному легкого, чешуйчатую карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак колорек-тальный, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени и различные виды рака головы и шеи.
В настоящем описании фраза "HER2-экспрессирующая злокачественную опухоль" обозначает вид злокачественной опухоли, включающий клетки, которые содержат белок HER2 рецептора (например, номер доступа Genebank X03363) на клеточной поверхности, таким образом, что антитело против HER2 способно связываться со злокачественной опухолью.
В настоящем описании термин "метка" относится к детектируемым соединению или композиции, конъюгированным непосредственно или непрямым способом с полипептидом. Метка может сама по себе обнаруживаться (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать химическое изменение детектируемых соединения-субстрата или композиции.
В настоящем описании термины "контрольный элемент", "контрольная последовательность" и "ре-гуляторный элемент" относятся к генному элементу, который контролирует определенный аспект экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, промотор представляет собой регуля-торный элемент, который способствует инициации транскрипции действующего присоединенного кодирующего участка. Другие регуляторные элементы включают сигналы сплайсинга, сигналы полиаденили-рования, сигналы терминации и т.д. Контрольные элементы, которые являются подходящими для прокариот, например, включают промотор, необязательно оператор последовательности, и сайт связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
В настоящем описании нуклеиновая кислота является "функционально присоединенной", если ее помещают в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если она расположена таким образом, что способствует трансляции. В предпочтительных вариантах осуществления "функционально связанный" означает, что присоединенные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторного лидера, смежными и в рамке считывания.
Однако энхансеры, например, не обязательно должны быть смежными. Присоединение может достигаться, например, путем лигирования в традиционных сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, могут использоваться синтетические адапторы или линкеры олигонуклеотида в соответствии с традиционной практикой.
В настоящем описании выражения "клетка", "линия клеток" и "культура клеток" используются
- 23 -
009746
взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают клетку первичного субъекта и полученные из нее культуры безотносительно к количеству переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по составу ДНК вследствие произвольных или случайных мутаций. Также предусмотрено му-тантное потомство, которое обладает такими же функциями или биологической активностью, которые были показаны скринингом для первоначально трансформированной клетки. Если подразумеваются разные обозначения, это будет понятно из контекста.
В настоящем описании термин "исследуемое вещество" относится к веществу, которое подлежит анализу. Предпочтительно исследуемое вещество представляет собой участок Fc, содержащий полипептид, который подлежит анализу на предмет способности связываться с рецептором Fc.
В настоящем описании термин "рецептор" относится к полипептиду, способному связываться по меньшей мере с одним лигандом. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор на поверхности клетки или растворимый рецептор, содержащий внеклеточный лиганд-домен связывания и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и/или мембранный якорь). Рецептор, подлежащий оценке в анализах, раскрытых в настоящем описании, может быть интактным рецептором, его фрагментом или производным (например, слитый белок, который включает домен связывания рецептора, который используется с одним или больше гетерологичными полипептидами). Более того, рецептор, подлежащий оценке на предмет свойств связывания, может существовать в клетке или изолированно и необязательно быть нанесенным на аналитический планшет или какую-либо другую твердую фазу или непосредственно помечен, и который используется как зонд.
В настоящем описании фраза "СНО-экспрессированный полипептид" относится к полипептиду, который был рекомбинантным способом экспрессирован в клетках яичника китайского хомяка (СНО).
В настоящем описании термин "заболевание, которое отвечает на антитело" относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, которое лечится, по крайней мере, частично с помощью лечения антителами. Примеры такого заболевания и медицинских состояний включают без ограничения лимфому (лечится с помощью RITUXAN), инфекционные заболевания (лечатся с помощью SYNAGIS), почечный трансплантат (ZENAPAX обладает полезным эффектом), болезнь Крона и ревматоидный артрит (лечится с помощью REMICADE), карциному молочной железы (лечится с помощью HERCEPTIN) и рак толстого кишечника (лечится с помощью EDRECOLOMAB). В настоящем описании термин "заболевание, которое отвечает на иммуноадгезин" относится к любому заболеванию или медицинскому состоянию, которое лечится, по меньшей мере, частично терапией иммуноадгезином.
В настоящем описании вариант полипептида, который "опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более эффективно", чем исходное антитело, представляет собой полипептид, который in vitro или in vivo значительно более эффективен в опосредовании ADCC, когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в анализе, по существу являются сходными. Например, такой вариант вызывает лизис большего количества клеток-мишеней в данном анализе ADCC, чем исходный полипептид в идентичном анализе ADCC. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением анализа ADCC, но другие анализы или методы определения активности ADCC также могут использоваться (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления вариант полипептида от приблизительно в 1,2, 1,5, 50, 100 раз, приблизительно в 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании ADCC, чем исходный полипептид.
В настоящем описании вариант полипептида, который "опосредует зависящее от антител истощение В-клеток из цельной крови более эффективно", чем исходное антитело представляет собой полипептид, который in vitro или in vivo значительно более эффективен в опосредовании истощения В-клеток, когда количества варианта полипептида и исходного антитела, которые используются в анализе, по существу являются сходными. Например, такой вариант вызывает более высокую степень истощения В-клеток в данном анализе, чем исходный полипептид в идентичном анализе. Кроме того, такой вариант может истощать В-клетки в такой же степени, но при более низких концентрациях, чем те, которых требует исходный полипептид в идентичном анализе. Такие варианты могут быть идентифицированы, например, с применением анализа ADCC, но также могут использоваться другие анализы или методы определения активности ADCC (например, модели на животных). В предпочтительных вариантах осуществления усиление истощения относительно исходного полипептида не зависит от генотипа FcRIIIa в положении 158 (V или F) и генотип FcRIIa в положении 131 (Н или R), и полипептидный вариант приблизительно в 1,2 раза, 1,5 раза, 50 раз, 100 раз, приблизительно в 500 раз или приблизительно в 1000 раз более эффективен в опосредовании истощения В-клеток, чем исходный полипептид.
Термин "симптомы заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин" относится к симптомам, как правило, связанным с конкретным заболеванием. Например, симптомы, которые обычно связаны с болезнью Крона, включают: боль в животе, диарею, ректальное кровотечение, снижение массы тела, лихорадку, снижение аппетита, обезвоживание, анемию, вздутие живота, фиброз, воспаление кишечника и истощение.
Фраза " при таких условиях, что симптомы ослабляются" относится к любой степени качественного
- 24 -
009746
или количественного ослабления детектируемых симптомов любого заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин, включая без ограничения детектируемое влияние на скорость выздоровления от заболевания (например, скорость увеличения массы тела) или ослабление по меньшей мере одного из симптомов, которые обычно сопровождают конкретное заболевание (например, если заболевание, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин, представляет собой болезнь Крона, ослабление по меньшей мере одного из следующих симптомов: боли в животе, диареи, ректального кровотечения, снижения массы тела, лихорадки, снижения аппетита, обезвоживания, анемии, вздутия живота, фиброза, воспаления кишечника и истощения).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает варианты участка Fc полипептида и олигонуклеотидов, кодирующие варианты участка Fc. Конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, которые включают новые варианты участка Fc, способы идентификации применяемых вариантов участка Fc и способы применения вариантов участка Fc для лечения заболевания. Описание изобретения изложено ниже в следующих разделах: I) участки Fc антитела; II) варианты участка Fc; III) комбинированные варианты; IV) анализы варианта полипептида; V) показательные молекулы, содержащие вариант участка Fc; VI) нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты участка Fc; VII) терапевтическое применение и препараты; VIII) дополнительное применение вариантов участка Fc.
I. Участки Fc антитела
Как описано выше, антитела содержат участки, в основном участки СН2 и CH3, которые принимают участие в других функциях, помимо связывания антигенов. Взятые вместе, такие участки собирательно известны как участок Fc и выполняют некоторые эффекторные функции, опосредованные связыванием эффекторных молекул.
Эффекторные функции, опосредованные участком Fc антитела, могут быть разделены на две категории: (1) эффекторные функции, которые выполняются после связывания антитела с антигеном (такие функции включают, например, участие каскада комплемента или клеток, несущих рецептор Fc (FcR)); и (2) эффекторные функции, которые выполняются независимо от связывания антигена (эти функции обеспечивают, например, удержание в циркуляции и способность проникать через клеточные барьеры путем трансцитоза). Например, связывание компонента С1 комплемента с антителами активирует систему комплемента. После опсокизации активация комплемента играет важную роль в лизисе клеточных патогенов. Активация комплемента стимулирует воспалительную реакцию и может также вовлекаться в аутоиммунные реакции гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками через участок Fc, с сайтом связывания с рецептором Fc на участке антитела Fc, который связывается с рецептором FcR (FcR) на клетке. Существует большое количество рецепторов Fc, которые являются специфичными для антител различных классов, включая IgG (гамма рецепторы), IgE (эта рецепторы), IgA (альфа рецепторы) и IgM (мю рецепторы). Хотя настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом, связывание антитела с рецепторами Fc на поверхности клеток запускает множество важных и разнообразных биологических реакций, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, выведение иммунных комплексов, лизис клетками-киллерами покрытых антителами клеток-мишеней (так называемую антитело-зависимую клеточную цитотоксичность или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль выработки иммуноглобулина.
Некоторые эффекторные функции антитела опосредуются рецепторами Fc (FcRs), которые связываются с участком Fc антитела. FcRs определяются их специфичностью по отношению к изотипам иммуноглобулина; Fc рецепторы антител IgG обозначают как FcyR, IgE как FceR, IgA как FcaR и т.д. Были идентифицированы три подкласса FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16).
Поскольку каждый подкласс FcyR кодируется двумя или тремя генами, и альтернативный сплайсинг РНК приводит к образованию множества транскриптов, существует широкое разнообразие изоформ FcyR. Три гена, кодирующие подкласс FcyRI (FcyRIA, FcyRIB и FcyRIC), собраны в кластер в области 1q21.1 длинного плеча хромосомы 1; гены, кодирующие FcyRII изоформы (FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIC), и два гена, кодирующие FcyRIII (FcyRIIIA и FcyRIIIB), собраны в кластер в области 1q22. Указанные различные подтипы FcR экспрессируются на различных типах клеток (см., например, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Например, у людей, FcyRIHB наблюдаются только на нейтрофи-лах, тогда как FcyRIIIA наблюдаются на макрофагах, моноцитах, природных клетках-киллерах (NK) и субпопуляции Т-клеток. Следует отметить, что FcyRIIIA присутствует на клетках NK, одном из видов клеток, вовлеченных в ADCC.
Рецептор FcyRIIIA (CD16) человека обладает распространенным полиморфизмом в положении 158 во внеклеточном домене, который кодирует фенилаланин или валин в этом положении. Аллель V FcyRIIIA имеет более высокое сродство к IgG1 человека, чем аллель F. Аллель V158 также опосредует ADCC более эффективно. Данные клинических исследований показали корреляцию между генотипом рецептора FcyRIII у пациентов, получающих лечение Ритуксаном (Rituxan), и терапевтическим ответом. Продемонстрировано, что клинический и молекулярный ответ, а также период до прогрессирования были лучше у пациентов, гомозиготных по генотипу FcyRIIIA-158V (приблизительно 20% населения). И
- 25 -
009746
наоборот, пациенты, гетерозиготные или гомозиготные по гену FcyRIIIA-158F, определяющим более низкое сродство (приблизительно 80% населения), отвечают хуже. Эти данные указывают на то, что мутации Fc, которые усиливают активность ADCC носителей 158F, могут усиливать клиническую эффективность лечения злокачественной опухоли с помощью антител. Генный полиморфизм также присутствует в рецепторе FcyRIIA (CD32) человека в положении 131 во внеклеточном домене, который кодирует гистидин (Н) или аргинин (R) в этом положении. Обнаружено, что полиморфизм в положении 131 влияет на способность связываться с IgG человека. Недавно полученные данные также показывают корреляцию между полиморфизмом FcyRIIA в положении 131 и клиническим ответом на Ритуксан (Rituxan). Пациенты, гомозиготные по аллели Н131, давали значительно более высокую частоту ответа, чем 2 другие группы.
FcyRI, FcyRII и FcyRIII представляют собой рецепторы надсемейства иммуноглобулинов (IgSF); FcyRI содержит три домена IgSF во внеклеточном домене, тогда как FcyRII и FcyRIII содержат только два IgSF домена среди внеклеточных доменов.
Другой тип рецептора Fc представляет собой рецептор Fc новорожденных (FcRn). FcRn является структурно сходным с главным комплексом гистосовместимости (МНС) и состоит из а-цепи, некова-лентно связанной с р2-микроглобулином.
II. Варианты участка Fc
Настоящее изобретение обеспечивает варианты полипептида, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты полипептида, и способы создания вариантов полипептида. Предпочтительно, варианты полипептида по данному изобретению отличаются от исходного полипептида по меньшей мере одной модификацией аминокислоты. "Исходный", "дикого типа", "начальный" или "невариантный" полипептид предпочтительно включает по меньшей мере часть участка Fc антитела и может быть получен с применением методик, доступных из уровня техники для создания полипептидов, включающих участок Fc или его часть. В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид представляет собой антитело. Исходный полипептид может, однако, быть любым другим полипептидом, который включает по меньшей мере часть участка Fc (например, иммуноадгезин). В определенных вариантах осуществления вариант участка Fc может быть создан (например, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем описании) и может использоваться для выбранного гетерологичного полипептида, такого как вариабельный домен антитела или домен связывания рецептора или лиганда.
В предпочтительных вариантах осуществления исходный полипептид включает участок Fc или его функциональную часть. Как правило, участок Fc исходного полипептида будет включать участок Fc с нативной последовательностью и предпочтительно нативную последовательность участка Fc человека. Однако участок Fc исходного полипептида может содержать одно или несколько предварительно существовавших изменений или модификаций аминокислотной последовательности в сравнении с нативной последовательностью участка Fc. Например, C1q-связывающая активность участка Fc может быть предварительно изменена или FcyR связывающая активность участка Fc может быть изменена. В дополнительных вариантах осуществления исходный участок Fc полипептида является схематичным (например, умственное размышление или визуальное представление на компьютере или на бумаге) и, хотя он физически не существует, конструктор антител может выбрать желаемый вариант аминокислотной последовательности участка Fc и создать полипептид, включающий такую последовательность или ДНК, кодирующую желаемый вариант аминокислотной последовательности участка Fc. Однако в предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая участок Fc исходного полипептида, доступна, и данную последовательность нуклеиновой кислоты изменяют для создания варианта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант участка Fc.
Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант исходного полипептида, может быть приготовлена способами, известными из уровня техники, с использованием указаний данного описания для конкретных последовательностей. Такие способы включают без ограничения получение путем сайт-специфического (или олигонуклеотид-опосредованного) мутагенеза, ПЦР-мутагекеза и кассетного мутагенеза ранее полученной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Сайт-специфический мутагенез представляет собой предпочтительный способ получения вариантов. Данная техника хорошо известна из уровня техники (см., например, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) и Kunkel et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987), каждая из которых включена посредством ссылки). Вкратце, при осуществлении сайт-специфического мутагенеза ДНК, исходную ДНК изменяют, во-первых, одновременно гибридизацией одного или больше олигонуклеотида(ов), кодирующего желаемую мутацию(и) для одной цепи такой исходной ДНК. После гибридизации ДНК-полимераза используется для синтеза полной второй цепи, с использованием гибридизованного олигонуклеотида(ов) в качестве праймера, с использованием одиночной цепи исходной ДНК в качестве шаблона, и ДНК-лигаза используется для лигирования второй цепи с образованием кольцевой, двухцепочечной ДНК. Таким образом, олигонуклеотид, кодирующий желаемую мутацию, встраивается в полученную двухцепочечную ДНК.
ПЦР-мутагенез также подходит для получения вариантов аминокислотной последовательности исходного полипептида (см., например, Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989), таким образом,
- 26 -
009746
включена как ссылка). Вкратце, если в качестве исходного материала для ПЦР используют малые количества матричной ДНК, праймеры, которые слегка отличаются по последовательности от соответствующего участка в матричной ДНК, могут быть использованы для получения относительно больших количеств специфичного фрагмента ДНК, который отличается от последовательности матрицы только в положениях, в которых праймеры отличаются от матрицы.
Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на методике, описанной Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985), которая включена сюда посредством ссылки. Исходное вещество представляет собой плазмиду (или другой вектор), который включает ДНК исходного полипептида, подлежащую мутации. Идентифицируют кодон(ы) в исходной ДНК, подлежащие мутации. С каждой стороны идентифицированного сайта(ов) мутации должен находиться уникальный сайт рестрикции. Если такие сайты рестрикции отсутствуют, они могут быть созданы с использованием описанного выше метода оли-гонуклеотид-опосредованного мутагенеза для введения их в надлежащие места в ДНК исходного полипептида. ДНК-плазмиды разрезают в этих местах для линеаризации. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий ДНК между сайтами рестрикции и содержащий желаемую мутацию(и), синтезируют с использованием стандартных методик, где две цепи олигонуклеотида синтезированы отдельно и затем гиб-ридизованы вместе с использованием стандартных техник. Этот двухцепочечный нуклеотид обозначается как кассета. Данная кассета сконструирована таким образом, что содержит 5'- и 3'-концы, совместимые с концами линеаризованной плазмиды, таким образом, что она может быть непосредственно лиги-рована в плазмиду. Данная плазмида теперь содержит мутантную последовательность ДНК.
Альтернативно или дополнительно, желаемая аминокислотная последовательность, кодирующая вариант полипептида, может быть определена, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая такой вариант аминокислотной последовательности, может быть создана синтетическим путем.
Аминокислотная последовательность исходного полипептида может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант участка Fc с измененной активностью связывания Fc рецептора или активностью in vitro и/или in vivo, и/или измененной активностью, зависящей от антител клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) in vitro и/или in vivo. Аминокислотная последовательность исходного полипептида также может быть модифицирована для того, чтобы создать вариант участка Fc с измененными свойствами связывания комплемента и/или периодом полувыведения из циркуляции.
Значительные модификации биологических свойств участка Fc могут достигаться путем выбора вариантов замены, которые значительно отличаются по действию на изменение (а) структуры скелета полипептида в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или объема боковой цепи, (d) взаимодействия с углеводом или (е) гибкости движений домена. Остатки природного происхождения делят на классы на базе общих свойств боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;
(3) кислые: asp, glu;
(4) основные: asn, gln, his, lys, arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и
(6) ароматические: trp, tyr, phe.
Неконсервативные варианты замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на член другого класса. Консервативные варианты замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на другого члена того же класса.
Как показано в примерах ниже, можно создать вариант участка Fc с измененной активностью (эф-фекторная функция (b) и фармакокинетика). Можно, например, модифицировать один или больше аминокислотных остатков участка Fc с целью изменения (например, увеличение или уменьшение) активности ADCC. В предпочтительных вариантах осуществления модификация включает один или больше остатков участка Fc, идентифицированных в настоящем описании (см., например, пример 2, и WO0042072, включена как ссылка для всех целей). В общем, будет осуществлено замещение аминокислоты в одном или более остатках участков Fc, идентифицированных в настоящем описании как влияющие на активность ADCC для того, чтобы создать такой вариант участка Fc. В предпочтительных вариантах осуществления не более чем от 1 до приблизительно 10 остатков на участке Fc будут удалены или заменены. В настоящем описании участок Fcs, который включает одну или больше модификаций аминокислот (например, замен), предпочтительно будет сохранять по меньшей мере приблизительно 80%, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, исходной последовательности участка Fc или нативной последовательности участка Fc человека.
Можно также приготовить варианты участка Fc с вставкой аминокислот, которые будут вариантами с измененной эффекторной функцией. Например, можно ввести по меньшей мере один аминокислотный остаток (например, один или два аминокислотных остатка и, в общем, не более 10 остатков) смежно с одним или больше положениями участка Fc, идентифицированными в настоящем описании как влияющие на связывание с FcR. "Смежно" означает в пределах одного или двух аминокислотных остатков уча
- 27 -
009746
стка Fc, идентифицированного в настоящем описании. Такие варианты участка Fc могут демонстрировать усиленное или ослабленное связывание с FcR и/или активности ADCC по отношению к исходной молекуле. С целью создания таких вариантов вставки можно оценить сокристаллическую структуру полипептида, который включает участок связывания с FcR (например, внеклеточный домен интересующего FcR) и участок Fc, в который должен быть вставлен аминокислотный остаток(ки) (см., например, Son-dermann et al. Nature 406:267 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-2370 (1981); и Burmeister et al., Nature 342: 379-383, (1994), все из которых включены как ссылки) с целью рационализации проектирования варианта участка Fc, например, с улучшенной способностью связывания FcR. В предпочтительных вариантах осуществления такая вставка(и) осуществлена на участке Fc петли, но не во вторичной структуре (т.е. в р-цепи) участка Fc.
Путем введения подходящей модификации(й) последовательности в исходном участке Fc можно создать вариант участка Fc, который (а) опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток человека более или менее эффективно, и/или (b) опосредует зависящую от комплемента цитотоксичность (CDC) в присутствии комплемента человека более или менее эффективно, и/или (с) связывает Fc гамма рецептор (FcyR) или рецептор Fc новорожденных (FcRn) с желаемым сродством при других значениях рН, чем исходный полипептид. Такие варианты участка Fc будут, в общем, включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc.
В предпочтительных вариантах осуществления исходный участок Fc полипептида представляет собой участок Fc человека, например природный участок Fc IgG1 человека (f и a, z аллотипы), IgG2, IgG3, IgG4 и все аллотипы, известные или обнаруженные в любых видах. Такие участки имеют последовательности SEQ ID NO:1-8, SEQ ID N0:9-12 и SEQ ID N0:32-37.
В определенных вариантах осуществления с целью создания участка Fc с улучшенной ADCC активностью исходный полипептид предпочтительно имеет предварительно существовавшую ADCC активность (например, исходный полипептид включает человеческий IgG1 или участок Fc человеческого IgG3). В некоторых вариантах осуществления вариант с улучшенным ADCC опосредует ADCC значительно более эффективно, чем антитело с нативной последовательностью IgG1 или участок Fc IgG3 (например, P247L и I332E варианты).
В предпочтительных вариантах осуществления модификацию(и) аминокислоты вводят в домены СН2 и/или CH3 участка Fc. Примененные положения аминокислот для модификации с целью создания варианта участка Fc IgG с измененной ADCC активностью включают любое одно или несколько положений аминокислот: 247, 251, 256, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294,
295, 296, 298, 300 301, 303, 305, 307, 309, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 360, 373, 376,
416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439 или 440 участка Fc. В предпочтительных вариантах осуществления исходный участок Fc, используемый как матрица для создания таких вариантов, включает участок Fc IgG человека.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 247 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой P247L. В других вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой P247I или Р247Н.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 251 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой L251F.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 256 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой Т256М или Т256Р.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 268 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой H268D или Н268Е.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 280 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой D280A или D280K.
- 28 -
009746
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 330 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А330К или A330R.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 332 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой I332D, I332E, I332K или I332R.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 339 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой А339Т.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 378 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой A378D.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант опосредует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток и включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении 440 на участке Fc. В определенных вариантах осуществления модификация аминокислоты представляет собой S440Y.
Описанные выше варианты полипептида могут подвергаться дальнейшим модификациям, в зависимости от желаемого или предусмотренного применения полипептида. Такие модификации могут включать, например, дальнейшее изменение аминокислотной последовательности (замена, вставка и/или делеция аминокислотных остатков), модификации углеводов, слияние с гетерологичным полипепти-дом(ами) и/или ковалентные модификации. Такие дополнительные модификации могут быть осуществлены до, одновременно или после модификации аминокислоты(ы), раскрытой выше, которая ведет к изменению связывания с рецептором Fc и/или активности ADCC.
Альтернативно или дополнительно может быть полезно сочетать модификации аминокислот с одной или больше дополнительными модификациями аминокислот, которые изменяют связывание C1q и/или функцию зависящей от комплемента цитотоксичности участка Fc. Особенно интересный исходный полипептид в настоящем описании представляет собой такой, который связывается с C1q и который демонстрирует комплемент-зависящую цитотоксичность (CDC). Варианты замены аминокислот, раскрытые в настоящем описании, могут служить для изменения способности исходного полипептида связываться с C1q и/или модификации его функции комплемент-зависящей цитотоксичности (например, уменьшать и предпочтительно устранять такие эффекторные функции). Однако полипептиды, которые включают варианты замены в одном или более описанных положений с улучшенным связыванием C1q и/или функцию комплемент-зависящей цитотоксичности (CDC), рассматриваются в настоящем описании. Например, исходный полипептид может быть не способен связываться с C1q и/или опосредовать CDC и может быть модифицирован в соответствии с указаниями в настоящем описании таким образом, что он приобретает эти дополнительные эффекторные функции. Более того, полипептид с предварительно существующей активностью связывания C1q, необязательно дополнительно обладающий способностью опосредовывать CDC, может быть модифицирован таким образом, что один или оба из этих видов активности усиливаются. Аминокислотные последовательности, которые изменяют C1q и/или модифицируют его функцию комплемент-зависимой цитотоксичности, описаны, например, в WO0042072, которая, таким образом, включена как ссылка.
Как было описано выше, можно сконструировать участок Fc или его часть с измененной эффектор-ной функцией, например, путем модификации активности CDC и/или активности ADCC. Например, можно создать вариант участка Fc с улучшенной CDC активностью и улучшенной ADCC активностью (например, с улучшенной активностью ADCC и улучшенной активностью CDC). Альтернативно, если будет желательным снижение или устранение эффекторной функции, можно сконструировать вариант участка Fc со сниженной CDC активностью и/или сниженной ADCC активностью. В других вариантах осуществления можно повысить только один из этих видов активности и необязательно также снизить другой вид активности, например, для создания участка Fc с улучшенной ADCC активностью, но сниженной активностью CDC и наоборот. Кроме того, можно создать вариант участка Fc, обладающего модифицированным сродством связывания с FcRn, белком А и/или другими белками, которые связываются с Fc.
Другой вид замены аминокислот служит для изменения структуры гликозилирования полипептида.
- 29 -
009746
Это может быть достигнуто, например, путем удаления одного или больше углеводных остатков, связанных с полипептидом, и/или добавлением одного или больше сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в полипептиде. Альтернативно, этого можно достигнуть непрямым способом, путем изменения аминокислот, не являющихся сайтом гликозилирования или проектированием клеток. Гликозилирование полипептидов обычно является N-связанным или О-связанным. N-Связанный относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. Пептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих пептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-Связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалоктазамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут быть использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Добавление сайтов гликозилирования к полипептиду традиционно сопровождается изменением аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит один или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменения также могут быть осуществлены путем добавления (или замещения) одного или больше остатков серина или треонина к последовательности оригинального полипептида (для О-связанных сайтов гликозилиро-вания). Показательный вариант гликозилирования содержит замену аминокислоты остатка Asn 297 тяжелой цепи.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию остатка поверхностной аминокислоты (см., например, Deisenhofer, Biochemistry, 28;20(9):2361-70, April 1981, и W00042072, каждая из которых включена сюда посредством ссылки). В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, которые включают вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию остатка не поверхностной аминокислоты. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает вариант исходного полипептида, содержащего участок Fc, где вариант включает по меньшей мере одну модификацию поверхностной аминокислоты и по меньшей мере одну модификацию не поверхностной аминокислоты.
III. Комбинированные варианты
В некоторых вариантах осуществления варианты по настоящему изобретению включают две или больше модификаций аминокислот (например, замен). Такие комбинированные варианты могут быть получены, например, путем выбора двух или больше модификаций аминокислот, описанных выше. В таблице 1 ниже приведены примерные комбинации замен двух или больше аминокислот. Например, первый ряд таблице 1 показывает возможные комбинации Р247Н с заменой другой аминокислоты в положениях 251, 256, 268, 280, 330, 332, 339, 378 и 440 (таким образом, данный ряд показывает комбинации двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти и десяти модификаций аминокислот).
- 30 -
009746
Таблица 1. Примерные комбинированные варианты
Мутация
Положение
247
251
256
268
280
330
332
339
37S
440
Р247Н
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
P247I
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
P247L
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
L251F
Н, I,
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
Т256М
Н, I,
D, Е
А, К
К, R
D, Е
Т256Р
Н, I,
D, Е
А, К
К, R
D, Е
H268D
Н, I,
М, Р
А, К
К, R
D, Е
Н268Е
Н, I, L
М, Р
А, К
К, R
D, Е
D28 0A
Н, I, L
М, Р
D, Е
К, R
D, Е
D280K
Н, I, L
М, Р
D, Е
К, R
D, Е
АЗЗОК
Н, I, L
М, Р
D, Е
А, К
D, Е
A330R
Н, I, L
М, Р
D, Е
А, К
D, Е
I332E
Н, I, L
М, Р
Dr Е
А, К
К, R
I332D
Н, I,
М, Р
D, Е
А, К
К, R
А339Т
Н, I, L
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
A378D
Н, I, L
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
S440Y
Н, I,
М, Р
D, Е
А, К
К, R
D, Е
** Примечание: в данной таблице используется нумерация ЕС, как в соотетствии с Kabat.
Комбинации вариантов, приведенные в таблице 1, и другие комбинации вариантов (такие как раскрытые в WO004 2072) могут быть исследованы на предмет данной активности (например, FcR-связывающая активность, активность ADCC и активность CDC) в разнообразных анализах (см., Раздел IV ниже). В этой связи могут быть идентифицированы полезные комбинированные варианты.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления комбинированные варианты по данному изобретению содержат одну модификацию аминокислоты, которая повышает ADCC активность, и одну модификацию аминокислоты, которая повышает активность связывания с рецептором Fc новорожденных (FcRn) (например, при рН 6,0, но не при рН 7,0 или 7,4). В других вариантах осуществления комбинированные варианты по данному изобретению содержат одну модификацию поверхностной аминокислоты и одну модификацию не поверхностной аминокислоты. Дополнительные комбинированные варианты могут быть созданы путем комбинирования двух или больше модификаций аминокислот, раскрытых в настоящем описании или по меньшей мере одной модификации аминокислот, раскрытой в настоящем описании с описанными в WO0042072.
IV. Анализы варианта полипептида
Настоящее изобретение обеспечивает различные анализы для скрининга вариантов участка Fc. Скрининговые анализы могут использоваться для поиска или подтверждения полезных вариантов. Например, комбинированные варианты (см. табл. 1) могут подвергаться скринингу для поиска вариантов с измененным связыванием FcR, и/или измененной ADCC, и/или измененной CDC активностью (напри
- 31 -
009746
мер, повышенная или сниженная активность ADCC или активность CDC), и/или модифицированной способностью истощать клетки-мишени (например, В-клетки) из цельной крови. Кроме того, как описано ниже, пробы по данному изобретению могут применяться для поиска или подтверждения вариантов, которые обладают полезной терапевтической активностью для субъекта (например, такого как человек с симптомами заболевания, которое отвечает на антитело или иммуноадгезин). Разнообразные виды анализов могут применяться для оценки любого изменения в варианте в сравнении с исходным полипептидом (см. скрининговые анализы, приведенные в WO0042072, включена как ссылка). Кроме того, примерные анализы описаны ниже.
В предпочтительных вариантах осуществления варианты по данному изобретению представляют собой антитела, которые по существу сохраняют способность связывать антиген (через немодифициро-ванный антиген-связывающий участок или модифицированный антигенсвязывающий участок) в сравнении с невариантным (исходным) полипептидом (например, емкость связывания предпочтительно не менее чем приблизительно в 20 раз превышает или не менее чем приблизительно в 5 раз превышает таковую исходного полипептида). Емкость связывания варианта полипептида с антигеном может быть определена с использованием таких техник, как, например, ELISA, сортировочный анализ, флуоресценция активированных клеток (FACS) или радиоиммуноосаждение (RIA).
Анализы связывания рецептора Fc (FcR) могут применяться для оценки вариантов по данному изобретению. Например, связывание с Fc рецептором, таким как FcyRI, FcyRIIa, FcyPJIb, FcyRIII, FcRn и т.д., можно измерить титрованием варианта полипептида и измерением связанного варианта полипептида с использованием антитела, которое специфически связывается с вариантом полипептида в формате ELISA (см. примеры ниже). Например, может быть проведен скрининг варианта, который включает антитело, в стандартном анализе ELISA для определения связывания с FcRn при рН 6,0 и рН 7,0 или 7,4. Твердая поверхность, покрытая Стрептавидином или Нейтравидином, может использоваться для захвата меченного биотином FcRn любых видов, таких как мышь или человек. После блокирования захвата рецептор может инкубироваться с вариантами полипептида (антителами) разведенными в буферных растворах при рН 6,0 или рН 7,0. На следующей стадии добавляют молекулы, специфичные для человеческих антител (например, козьи (Fab')2 против человеческих-Fab, конъюгированные с ферментом). После этого можно добавлять субстрат для определения количества связывания варианта полипептида с иммобилизованным FcRn при рН 6,0, или рН 7,0, или рН 7,4. Результаты данного анализа можно сравнивать со способностью исходного полипептида (невариантного) связывать такой же FcR. В других предпочтительных вариантах осуществления компоненты для проведения ELISA (например, с FcRn) для скрининга вариантов упакованы в набор (например, с инструкцией по применению).
Анализ зависимой от антител клеточной цитотоксичности (ADCC) также может использоваться для скрининга вариантов по данному изобретению. Анализы ADCC могут проводиться in vitro или in vivo. Для оценки активности ADCC варианта полипептида анализ ADCC in vitro может проводиться с использованием различных соотношений эффектор/мишень. Примерный анализ ADCC может использовать линию клеток-мишеней, экспрессирующих один из следующих антигенов-мишеней: CD20, CD22, CD33, CD40, CD63, рецептор EGF, рецептор her-2, специфичный для предстательной железы мембранный антиген, углевод Льюиса Y, ганглиозиды GD2 и GD3, lamp-1, СО-029, L6 и ephA2. Эффекторные клетки могут быть получены от здорового донора (например, в день эксперимента) и РВМС очищены с использованием Histopaque (Sigma). Далее клетки-мишени предварительно инкубируют с вариантом IgG, например, с концентрацией 0,1-1000 нг/мл в течение приблизительно 30 мин перед смешиванием с эффек-торными клетками при соотношениях эффектор/мишень, например, 40:1, 20:1 и 10:1. Затем активность ADCC может быть измерена колориметрически с использованием Cytotoxicity Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals) для количественного определения гибели и лизиса клеток на базе измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобожденной из цитозоля поврежденных клеток в супернатант. Активность ADCC также может быть измерена в анализах нагруженных хромом 51 клеток-мишеней путем измерения результирующего высвобождения хрома 51. Независимая от антител клеточная цитоток-сичность может быть определена измерением активности ЛДГ из клеток-мишеней и эффекторных клеток в отсутствие антитела. Общее высвобождение может быть измерено после добавления 1% Тритона Х-100 к смеси клеток-мишеней и эффекторньгх клеток. Инкубация клеток-мишеней и эффекторных клеток может проводиться в течение оптимизированного периода времени (0,54-18 ч) при 37°С в 5,0% СО2, с последующим центрифугированием аналитических планшетов. Далее супернатант может быть перенесен в 96-луночные планшеты и инкубироваться с реактивом для обнаружения ЛДГ в течение 30 мин при 25°С. Затем измеряют поглощение образца при 490 нм с применением микропланшетного ридера. Затем рассчитывают процент цитотоксичности с использованием следующего уравнения: % цитотоксичности = экспериментальное значение - низкий контроль/высокий контроль - низкий контроль х 100. Процент ци-тотоксичности против CD20 и вариантом затем можно сравнить непосредственно с равным количеством Ритуксана для получения относительной эффективности. Примерный анализ ADCC может использовать клетки SKW6.4, избыточно экспрессирующие антиген CD20 (например, приобретенные у American Type Culture Collection) в качестве источника клеток-мишеней. Многие вариации данного анализа известны из уровня техники (см., например, Zuckerman et al., CRC Crit Rev Microbiol 1978; 7(1):1-26, включена как
- 32 -
009746
ссылка).
Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают без ограничения природные клетки-киллеры (NK), макрофаги и другие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). Альтернативно или дополнительно активность ADCC вариантов полипептида по данному изобретению может быть оценена in vivo, например на животной модели, такой как раскрыта в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998), которая включена сюда посредством ссылки.
Также может быть осуществлен скрининг вариантов настоящего изобретения на предмет активации комплемента. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ зависимой от комплемента цитотоксичности (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), включена как ссылка). Например, различные концентрации варианта полипептида и человеческого комплемента могут быть разбавлены буферным раствором. Клетки, экспрессирующие антиген, с которым связывается вариант полипептида, могут быть разбавлены до плотности приблизительно 1х106 клеток/мл. Смеси варианта полипептида, разбавленного человеческого комплемента и клеток, экспрессирующих антиген, могут быть добавлены в плоскодонный 96-луночный планшет для культуры клеток и инкубироваться в течение 2 ч при 37°С и 5% CO2 для облегчения опосредованного комплементом лизиса клеток. Затем добавляют 50 мкл аламара голубого (Accumed International) в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 37°С. Поглощение можно измерить с помощью флуориметра для 96-луночных планшетов с возбуждением при длине волны 530 нм и излучением при длине волны 590 нм. Результаты могут быть выражены в относительных единицах флуоресценции (RFU). Концентрация образца может быть рассчитана на основе стандартной кривой и для интересующего варианта может быть рассчитан процент активности в сравнении с невариантным пептидом.
В определенных вариантах осуществления варианты по данному изобретению не активируют комплемент. Например, вариант полипептида, который демонстрирует приблизительно 0-10% активность CDC в данном анализе в сравнении с контрольным антителом, содержит немутантный участок Fc IgG1.
Предпочтительно, вариант не проявляет никакой активности CDC (например, выше фоновой) в описанном выше анализе CDC. В других вариантах осуществления варианты по данному изобретению обладают усиленной активностью CDC в сравнении с исходным полипептидом (например, показывают от приблизительно в 2 раза до приблизительно в 100 раз (или больше) улучшение активности CDC in vitro или in vivo при сравнении значений IC50).
Также может быть проведен скрининг вариантов по данному изобретению на предмет истощения клеток-мишеней в образце цельной крови. Например, может быть проведен скрининг различных концентраций варианта полипептида со специфичностью к мишени CD20 на предмет истощения В-клеток в образце цельной крови с применением анализа Facs (Vugmeyster et al., 2003 Cytometry 52A, 101-109). Свежеотобранную кровь инкубируют с различными концентрациями варианта полипептида при 37°С и 5% CO2 в течение 4 ч (время может варьировать). После инкубации красные кровяные клетки лизируют согласно инструкции производителя с помощью реактива хлорида аммония (Beckton-Dickinson кат. №555899) и В-клетки определяют с помощью Facs с использованием флуоресцентно меченого антитела, специфичного для В-клеток (например, анти-С19). Результаты могут быть выражены как % истощения В-клеток относительно или необработанного образца, или образца, инкубированного с не относящимся к делу (неистощающим) антителом.
В предпочтительных вариантах осуществления вариант истощает В-клетки более эффективно, чем исходный полипептид. Вариант может истощать В-клетки, например, в 2 или больше раз сильнее, предпочтительно в 5 или больше раз сильнее. Также вариант может демонстрировать большую мощность в истощении В-клеток. Например, вариант может истощать такой же процент В-клеток, как и исходный полипептид, но при этом используется приблизительно в 5 раз меньше, и предпочтительно приблизительно в 10 раз меньше антител. Истощение клеток-мишеней, опосредованное вариантами, может быть от приблизительно в 5 раз до приблизительно в 100 раз, предпочтительно от приблизительно в 5 раз до приблизительно в 1000 раз улучшено в сравнении с исходным полипептидом.
Также может быть проведен скрининг вариантов по настоящему изобретению in vivo. Может применяться любой вид анализа in vivo. Конкретный пример одного вида анализа приведен ниже. Этот показательный анализ позволяет осуществить доклиническую оценку вариантов Fc in vivo. Вариант, подлежащий изучению, может быть встроен в участок Fc конкретного антитела, относительно которого известно, что оно обладает определенной активностью. Например, вариант может быть встроен в участок Fc против CD20 IgG путем мутагенеза. Это позволяет сравнить исходный IgG и вариант Fc IgG непосредственно с Ритуксаном (вещество, которое вызывает регресс опухоли). Доклиническая оценка может быть проведена в 2 фазы (фармакокинетическая и фармакодинамическая фаза). Цель фармакокинетиче-ских исследований в фазе I состоит в определении наличия расхождений в скорости клиренса между вариантом Fc IgG и антителом с доказанной активностью in vivo (например, Ритуксан). Различия в скорости клиренса могут быть причиной различий в уровне IgG в сыворотке в фазе плато. Соответственно, если обнаружены различия в концентрациях фазы плато, данные должны быть нормализованы для выполнения точных сравнений. Целью фармакодинамических исследований фазы II является определение влияния мутаций Fc, в данном случае, на рост опухоли. В предварительных исследованиях применялась
- 33 -
009746
однократная доза Ритуксана, которая полностью ингибировала рост опухоли. Поскольку это не позволяет измерить количественные различия, следует использовать интервал доз.
Фармакокинетическое сравнение в фазе I для варианта Fc, исходного Fc дикого типа и Ритуксана может быть выполнено следующим образом. Во-первых, 40 мкг может быть введено внутривенно каждому животному с количественным определением уровня IgG в плазме через 0, 0,25, 0,5, 1, 24, 48, 72, 96, 120, 168 и 336 ч. Эти данные могут быть обработаны, например, с использованием фармакокинетической программы (WinNonLin) и двухкомпартментной фармакокинетической модели со снижением до нуля для получения скорости клиренса. Скорость клиренса может использоваться для определения уровня концентрации в плазме в фазе плато по следующему уравнению: С=доза/(Скорость клиренса х т), где т представляет собой интервал между введением доз и С представляет собой уровень в плазме в фазе плато. Фармакокинетические эксперименты могут быть проведены на мышах без опухоли, например, с минимальным количеством 5 мышей в каждой временной точке.
Для следующей фазы модель на животных может быть использована следующим образом. В правый бок мыши CB17-SCID могут быть подкожно имплантированы 106 клеток Raji. Немедленно после имплантации вводят внутривенно болюс варианта Fc, дикого типа Fc или Ритуксана и продолжают введение препарата до достижения опухолью более 2 см в диаметре. Объем опухоли может определяться каждый понедельник, среду и пятницу путем измерения длины, ширины и глубины опухоли с использованием капилляра (объем опухоли = длина х ширина х глубина). График "объем опухоли-время" дает скорость роста опухоли для фармакодинамических расчетов. Должно использоваться по меньшей мере около 10 животных в каждой группе.
Фаза II фармакодинамического сравнения варианта Fc, дикого типа Fc и Ритуксана может проводиться следующим образом. На базе опубликованных данных Ритуксан в дозе 10 мкг/г 1 раз в неделю полностью ингибировал рост опухоли in vivo (Clynes et al., Nat. Med. 2000 Apr; 6(4):443-6, 2000, которая включена посредством ссылка). Таким образом, могут исследоваться еженедельные дозы в интервале 10 мкг/г, 5 мкг/г, 1 мкг/г, 0,5 мкг/г и 0 мкг/г. Уровень в плазме в фазе плато, при котором рост опухоли ин-гибируется на 50%, может быть определен графически на основе взаимосвязи между уровнем в плазме в фазе плато и эффективностью. Уровень в плазме в фазе плато может быть рассчитан, как описано выше. При необходимости % может корректироваться соответствующим образом для каждого варианта Fc и Fc дикого типа, в зависимости от их фармакокинетических свойств, для достижения сравнимой концентрации в плазме в фазе плато с Ритуксаном. Статистически улучшенные фармакодинамические значения для варианта Fc в сравнении с исходным полипептидом (например, Fc дикого типа) и Ритуксаном в целом будут показывать, что вариант Fc демонстрирует улучшенную активность in vivo.
Дополнительное фармакодинамическое сравнение вариантов Fc, Fc дикого типа и Ритуксана может быть проведено на обезьянах, как было описано ранее (Reff et al., Blood 83, 435-445, 1994). Зависимость "доза-ответ" для истощения периферических В-клеток и В-клеток лимфатического узла может использоваться для сравнения относительной мощности вариантов Fc с Fc дикого типа и Ритуксаном, которые вводятся внутривенно и/или подкожно. Статистически улучшенные фармакодинамические значения варианта Fc в сравнении с исходным полипептидом (например, Fc дикого типа) и Ритуксана в целом будут показывать, что вариант Fc демонстрирует улучшенную активность in vivo.
В дополнительных вариантах осуществления осуществляют скрининг вариантов по данному изобретению таким образом, что варианты, которые применимы для терапевтических целей, идентифицируют по меньшей мере в двух видах. Такие варианты обозначают в настоящем описании как "улучшенные варианты с двойной специфичностью", и они особенно применимы для идентификации вариантов, которые являются лечебными для людей, и также демонстрируют (или вероятно будут демонстрировать) эффективность на животной модели. В этой связи настоящее изобретение относится к способам идентификации вариантов, которые имеют высокие шансы быть одобренными для клинических испытаний на людях, поскольку данные на животных моделях, вероятно, будут поддерживать любые заявки на тестирование на людях в правительственные регулирующие органы (например, Управление лекарств и пищевых продуктов США).
В определенных вариантах осуществления улучшенные варианты с двойной специфичностью идентифицируют, во-первых, проведением анализа ADCC с использованием эффекторных клеток человека для поиска улучшенных вариантов и затем проведением второго анализа ADCC с использованием эф-фекторных клеток мышей, крыс или нечеловекообразных приматов для идентификации подмножества улучшенных вариантов, которые представляют собой улучшенные варианты с двойной специфичностью. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам для идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые включают: а) наличие :i) клеток-мишеней,
ii) композицию, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc и где вариант-кандидат опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток первого вида (например, человека) более эффективно, чем исходный полипептид, и
iii) эффекторные клетки второго вида (например, мыши, крысы или нечеловекообразного примата), и b)
- 34 -
009746
инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клетками-мишенями, таким образом, образуя клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание эффекторных клеток второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, и d) измерение цитотоксичности клеток-мишеней, опосредованной вариантом-кандидатом. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) определения того, опосредует ли вариант-кандидат цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию f) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует цитотоксичность клеток-мишеней в присутствии эффек-торных клеток второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления идентифицированные варианты с двойной специфичностью затем подвергают скринингу in vivo в одном или нескольких анализах на животных.
В определенных вариантах осуществления улучшенные варианты с двойной специфичностью идентифицируют, во-первых, проведением анализа цельной крови с использованием крови человека для поиска улучшенных вариантов и затем проведением второго анализа цельной крови с использованием крови мыши, крысы или нечеловекообразного примата для идентификации подмножества улучшенных вариантов, которые представляют собой улучшенные варианты с двойной специфичностью. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам для идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью, которые включают: а) наличие i) клеток-мишеней, ii) композиции, которая включает вариант-кандидат исходного полипептида, содержащий по меньшей мере часть участка Fc, где вариант-кандидат включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты на участке Fc и где вариант-кандидат опосредует истощение клеток-мишеней в присутствии крови первого вида (например, человек) более эффективно, чем исходный полипептид, и iii) крови второго вида (например, мыши, крысы или нечеловекообразного примата), и b) инкубирование композиции с клетками-мишенями при таких условиях, что вариант-кандидат связывается с клетками-мишенями, таким образом, образуя клетки-мишени, связанные с вариантом-кандидатом, с) смешивание крови второго вида с клетками-мишенями, связанными с вариантом-кандидатом, и d) измерение истощения клеток-мишеней опосредованной вариантом-кандидатом. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) определения того, опосредует ли вариант-кандидат истощение клеток-мишеней в присутствии крови второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию f) идентификации варианта-кандидата как улучшенного варианта с двойной специфичностью, который опосредует истощение клеток-мишеней в присутствии крови второго вида более эффективно, чем исходный полипептид. В предпочтительных вариантах осуществления идентифицированные варианты с двойной специфичностью затем подвергают скринингу in vivo в одном или нескольких анализах на животных.
В определенных вариантах осуществления улучшенные варианты с двойной специфичностью идентифицируют проведением любым из описанных выше анализов с использованием человеческих компонентов (например, клетки человека, рецепторы Fc человека и т. д.) для идентификации улучшенных вариантов и затем выполняют такой же анализ (или другой анализ) с компонентами отличных от человека животных (например, мышиные клетки, мышиные Fc рецепторы и т.д.). В этой связи может быть идентифицировано подмножество вариантов, которые показывают хороший эффект в соответствии с данными критериями как в анализе, на основе человеческих материалов, так и в анализе, на основе материалов второго вида.
Примерный процесс для идентификации улучшенных вариантов с двойной специфичностью представляет собой следующее. Во-первых, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере часть участка Fc IgG, мутирована таким образом, что аминокислотная последовательность экспрессирует по меньшей мере одно изменение аминокислоты, таким образом, образуя вариант. Экс-прессированный IgG вариант затем характеризуют в анализе ADCC с использованием РВМС человека или их подмножества (например, NK клетки или макрофаги). Если обнаружена повышенная ADCC активность, то осуществляют скрининг варианта во втором анализе ADCC с использованием мышиных или крысиных РВМС.
Альтернативно или дополнительно, анализ может быть выполнен с вариантом для связывания с клонированными рецепторами грызунов или клеточными линиями. В конечном итоге, если найденный вариант является улучшенным по данным второго анализа, что делает его вдвойне улучшенным, то осуществляют скрининг варианта in vivo на мышах или крысах.
V. Показательные молекулы, содержащие вариант участка Fc
Вариант Fc участка по данному изобретению может быть частью молекулы большего размера. Молекулы большего размера могут быть, например, моноклональными антителами, поликлональными антителами, химерными антителами, гуманизированными антителами, биспецифическими антителами, иммуноадгезинами, что предоставляет широкий спектр применения для вариантов участка Fc по данному изобретению.
- 35 -
009746
А. Антитела, содержащие вариант участков Fc
В предпочтительных вариантах осуществления молекула, содержащая вариант участка Fc (например, полипептид) представляет собой антитело. Техники создания антител описаны ниже.
(i) Выбор и подготовка антигена
Как правило, если вариант участка Fc, содержащий молекулу, представляет собой антитело, антитело направлено против интересующего антигена. Предпочтительно антиген представляет собой полипептид и введение антитела млекопитающему, которое страдает от заболевания или нарушения, может приводить к терапевтической пользе для такого млекопитающего. Однако также могут применяться антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как связанные с опухолью гликоли-пидные антигены; см. патент США № 5091178, включенный посредством ссылки).
Примеры антигенов включают без ограничения такие молекулы, как ренин; гормон роста, включая гормон роста человека и бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратиреоидный гормон; тироидстимулирующий гормон; липопротеиды; альфа-1-антитрипсин; инсулина А-цепь; инсулина В-цепь; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин, лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор (TF) и фактор вон Виллебранда; противосвертывающие факторы, такие как Протеин С; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа, или моча человека, или активатор плазминогена тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназа; RANTES (регулирует активацию нормальной экспрессии и секреции Т-клетки); воспалительный протеин макрофага человека (MIP-1-альфа); альбумин сыворотки, такой как альбумин сыворотки человека; ингибирующая субстанция Мюллера; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; цитотоксический Т-лимфоцит ассоциированный антиген CTLA, такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3,-4,-5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и PFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 или TGF-5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дес(1-3)-IGF-1 (мозговой IGF-I), белки, связывающиеся с инсулиноподоб-ным фактором роста; белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктив-ные факторы; иммунотоксины; костный морфогенный белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутаза; рецепторы Т-клеток; поверхностные белки мембраны; фактор ускорения кариеса; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки ВИЧ; транспортные белки; домашние рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11 a, CD11 b, CD11 с, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; ассоциированный с опухолью антиген, такой как HER2, HER3 или HER4 рецептор; звено пути апоптоза; и фрагменты любого из перечисленных пептидов.
Предпочтительные антигены включают без ограничения белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 и CD34; члены семейства рецепторов ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы адгезии клеток, такие как LFA-1, Mac1, р150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, а4/р7 ин-тегрин и (Х^р3 интегрин, включая их или их субъединицы (например, анти-CDHa, анти-CD18 или анти-CD11b антитела); факторы роста, такие как VEGF; фактор роста (TF); альфа-интерферон (a-IFN); интер-лейкин, такой как IL-8; IgE; антигены групп крови; рецептор flk2/flk3; рецептор ожирения (ОВ); рецептор mpl; CTLA-4, белок С и т.д.
Растворимые антигены или их фрагменты необязательно конъюгированы с другими молекулами, могут применяться как иммуногены для создания антител. Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, их фрагменты (например, внеклеточный домен рецептора) могут применяться как иммуноге-ны. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, могут применяться как им-муноген. Такие клетки могут быть получены из природного источника (например, линии злокачественных клеток) или могут быть клетками, которые трансформируются в соответствии с рекомбинантными методами для экспрессии трансмембранной молекулы. Другие антигены и их формы полезны для приготовления антител, будут понятны специалистам в данной области.
(ii) Поликлональные антитела
Настоящее изобретение обеспечивает поликлональные антитела с вариантами участка Fc. Например, репертуар человеческого иммуноглобулина, содержащий модифицированные константные участки G1, может быть пересажен активированным иммуноглобулином мышам, что приведет к экспрессии мышами репертуара IgG, содержащего модифицированные участки Fc (см., например, Mendez, MJ et al., Nature Genetics 15:146 (1997), включена посредством ссылки). Предпочтительно повышение уровня по-ликлональных антител у животных вызывают множественными подкожными (п/к) или внутрибрюшин-ными инъекциями соответствующего антигена и вспомогательного вещества. Может быть полезно конъ-югировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным для вида, подлежащего
- 36 -
009746
иммунизации (например, гемоцианин, альбумин сыворотки, бычий тироглобулин или соевый ингибитор трипсина) с использованием бифункционального или дериватизирующего агента (например, малеимидо-бензоил сульфосукцинимидного эфира для конъюгации через остцистеиновые остатки, N-гидроксисукцинимид для конъюгации через лизиновые остатки, глутаральдегид, сукциновый ангидрид, SOCl2 или R1N=C=NR, где R и R1 представляют собой различные алкильные группы.
Примеры общего протокола иммунизации для кролика и мыши следующие. Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем комбинирования, например 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (например, для кролика или мыши, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда, и раствор вводят внутрикожно во множество мест. Через месяц животным вводят усиливающую дозу 1/5 или 1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъю-ванте Фрейнда путем подкожной инъекции во множество мест. Через 7-14 дней животных забивают и определяют титр антител в сыворотке. Животным вводят усиливающие дозы до достижения титром антител фазы плато. Предпочтительно животному вводят усиливающие дозы конъюгата того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или через различный сшивающий реагент. Конъюгаты также могут быть приготовлены в культуре рекомбинантных клеток, например, слиянием с белками. Кроме того, для применения с целью увеличения иммунного ответа подходящими являются агрегирующие агенты.
(iii) Моноклональные антитела
Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные антитела с вариантами участка Fc. Моно-клональные антитела могут быть приготовлены многими способами, включая использование гибридом-ного метода (например, описанного в Kohler et al., Nature, 256: 495, 1975, включена посредством ссылки) или методов рекомбинантных ДНК (например, патент США № 4 816567, включенный посредством ссылки).
В гибридомном методе мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк или обезьяна-макак, иммунизируют для образования лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфично связываться с белком, который использовался для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы, используя подходящий агент для слияния, такой как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы. Клетки гибридомы, приготовленные таким образом, засевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание не слитых исходных клеток миеломы. Например, если в исходных клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для таких гибридом, как правило, будет включать гипоксантин, аминопте-рин и тимидин (среда HAT), что будет предупреждать рост HGPRT-дефицитных клеток.
Предпочтительными клетками миеломы являются клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную продукцию антител на высоком уровне выбранными антитело-продуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. Среди них предпочтительными клеточными линиями миеломы являются клетки миеломы мышей, такие как происходящие из мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, доступных от Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные от American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши/человека также описаны для продукции человеческих моноклональных антител (например, Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984), включена как ссылка).
Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, подбирают для продукции монокло-нальных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моно-клональных антител, продуцированных клетками гибридомы, определяют с помощью иммунопреципи-тации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). После того как определено, что клетки гибридомы продуцируют антитела с желаемой специфичностью, сродством и/или активностью, могут быть субклонирова-ны клоны с помощью методик ограниченного разведения и выращены стандартными способами. Подходящие для этой цели среды культивирования включают, например, D-MEM или среду RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены in vivo как асцитные опухоли у животного. Монокло-нальные антитела, которые секретируют субклоны, подходящим способом отделяют от среды культивирования, асцитной жидкости или сыворотки путем традиционных методик очистки иммуноглобулина, таких как, например, очистка белка с помощью А-сефарозы, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.
ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко выделяется и секвенируется с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфично с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые
- 37 -
009746
иначе не продуцируют белок иммуноглобулин, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантная продукция антител более подробно описана ниже.
В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител выделяют из фаговых библиотек антител с применением техник, описанных, например, в McCafferty et al., Nature, 348: 552554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) описывают выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. Последующие публикации описывают продукцию человеческих антител (интервал нМ) с высоким сродством путем цепи SHUFFLING (Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)) а также сочетанную инфекцию и рекомбинацию in vivo как стратегию конструирования очень больших фаговых библиотек (например, Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, эти техники и подобные техники представляют собой жизнеспособные альтернативы традиционным гибридомным методам для выделения моноклональных антител.
Также молекула ДНК может быть модифицирована, например, заменой кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека на гомологичные последовательности мыши (например, патент США № 4816567 и Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA, 81: 6851 (1984), каждая из которых включена сюда в качестве ссылки) или ковалентным присоединением ко всей или к части кодирующей последовательности иммуноглобулина кодирующей последовательности неиммуног-лобулинового полипептида.
Как правило, такие неиммуноглобулиновые полипептиды замещены константными доменами антитела или они замещены вариабельными доменами одного антиген-сочетающего сайта антитела для создания химерного двухвалентного антитела, которое включает один антиген-сочетающий сайт, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антиген-сочетающий сайт, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.
(iv) Гуманизированные и человеческие антитела
Настоящее изобретение относится к гуманизированным и человеческим антителам с вариантами участка Fc. В предпочтительных вариантах осуществления гуманизированное антитело включает аминокислотные последовательности человеческого антитела вместе с остатками аминокислот, которые не происходят из организма человека. В некоторых вариантах осуществления человеческие последовательности в гуманизированном антителе включают каркасные участки (FR) и последовательности или остатки, которые не происходят из организма человека, включающие один или несколько определяющих ком-плементарность участков (CDR).
FR и CDR могут быть определены на основе нумерации остатков аминокислоты в вариабельных участках тяжелой и легкой цепи. Термин "определяющий комплементарность участок" или "CDR" предназначен для обозначения несмежных антиген-связывающих сайтов, содержащихся в вариабельных участках полипептидов тяжелой и легкой цепей. Такие участки были определены Kabat et al. (J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977) и Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991); "Kabat"), Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); "Chothia") и MacCallum et al. (J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); "MacCallum"), где определения включают перекрывание или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. В любом случае, применение любого из этих определений отдельно (например, определение Kabat) или в сочетании (например, комбинированное определение Kabat и Chothia) относится к CDR антител (включая гуманизированное антитело), обозначенным в рамках термина, который используется в настоящем описании. Остатки аминокислот, которые включают CDR, как определено каждой из цитированных выше ссылок, приведены ниже в сравнительной табл. 6.
Таблица 6. Определения CDR
Kabat
Chothia
MacCallum
VH CDR1
31-35
26-32
30-35
VH CDR2
50-65
53-55
47-58
VH CDR3
95-102
96-101
93-101
Vb CDR1
24-34
26-32
30-36
VL CDR2
50-56
50-52
46-55
VL CDR3
89-97
91-96
89-96
Кроме того, термин "каркас" в отношении вариабельного участка антитела означает все остатки аминокислот вне участков CDR в вариабельном участке антитела. Следовательно, длина каркаса вариабельного участка составляет приблизительно 100-120 аминокислот, но он предназначен только для обозначения аминокислот вне CDR. Термин "каркасный участок" предназначен для обозначения каждого домена каркаса, отличного от CDR. Следовательно, для конкретного примера вариабельного участка тяжелой цепи и для CDR, как определено Rabat, каркасный участок 1 (FR1) соответствует домену вариабельного участка, который охватывает аминокислоты 1-30; участок 2 (FR2) соответствует домену вариа
- 38 -
009746
бельного участка, который охватывает аминокислоты 36-49; участок 3 (FR3) соответствует домену вариабельного участка, который охватывает аминокислоты 66-94, а участок 4 (FR4) соответствует домену вариабельного участка от аминокислоты 103 до конца вариабельного участка. Каркасные участки легкой цепи подобным образом отделены от CDR вариабельного участка каждой легкой цепи. Подобным образом, с использованием определения CDR Chothia или MacCallum или любой комбинации определений CDR, границы каркаса определяются соответствующими концами CDR, как описано выше. Несмотря на многочисленные определения CDR, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно использовать определение Kabat для определения CDR.
Остатки в гуманизированном антителе, которые не происходят из организма человека, могут быть остатками или последовательностями, привнесенными или происходящими от других видов (включая без ограничения мышь), или данные последовательности могут быть случайными последовательностями аминокислот (например, созданными из случайных последовательностей нуклеиновой кислоты), которые встроены в последовательность гуманизированного антитела. Как отмечено выше, аминокислотные последовательности в гуманизированном антителе предпочтительно представляют собой каркасные области, хотя остатки, которые не происходят от человеческого антитела (происходящие из других видов или случайные аминокислотные последовательности), предпочтительно соответствуют CDR. Однако в некоторых вариантах осуществления одна или несколько каркасных областей могут содержать один или несколько остатков аминокислот, не встречающихся в организме человека. В случае изменений или модификаций (например, путем введения остатка, не встречающегося в организме человека) каркас, в остальном являющийся человеческим, может в случае измененной или модифицированной каркасной области располагаться смежно с модифицированным CDR из других видов или случайной последовательностью CDR, хотя в других вариантах осуществления измененный каркасный участок не является смежным с измененной последовательностью CDR из других видов или случайной последовательности CDR. В некоторых вариантах осуществления каркасные последовательности гуманизированного антитела являются полностью человеческими (т.е. никаких изменений каркаса человеческого антитела не произведено). В предпочтительных вариантах осуществления каркасные последовательности гуманизированного антитела являются полностью человеческой зародышевой линией (т.е. никаких изменений не осуществлено в каркасе зародышевой линии человека).
Остатки аминокислот, не встречающиеся в организме человека, из других видов или случайную последовательность часто называют "импортированными" остатками, которые обычно берут в "импортном" вариабельном домене. Гуманизация может быть осуществлена в значительной степени в соответствии со способом Winter и соавт. (например, Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки), с замещением CDR грызуна (или другого млекопитающего) или соответствующей последовательностью CDR человеческого антитела. Кроме того, могут быть созданы антитела, в которых значительно меньшая часть, чем интактный вариабельный домен человека, замещена соответствующей последовательностью, происходящей от вида, отличного от человека (например, патент США № 4816567, включенный в настоящее описание посредством ссылки). На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов или, как отмечено выше, в которых последовательности CDR заменены случайными последовательностями. Например, но без ограничения, способы обеспечения связывающей активности CDR-донора на каркасе вариабельного участка антитела-акцептора описаны в WO 01/27160 А1, включенном в настоящее описание посредством ссылки, и в заявках США 09/434,870 и 09/982,464, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки.
При выборе вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей человека, которые используются в получении гуманизированных антител, важно снизить антигенность. В соответствии с так называемым методом "наилучшего соответствия" осуществляют скрининг последовательности вариабельного домена антитела грызуна, подлежащего гуманизации, против полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Затем человеческая последовательность, ближайшая к последовательности грызуна, принимается как человеческий каркас (FR) для гуманизированного антитела (например, Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993), и Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки). В другом способе используется конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Такой же каркас может использоваться для нескольких различных гуманизированных антител (например, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки).
В других представленных вариантах осуществления нет необходимости в "предварительном выборе" конкретного каркаса антитела человека (т.е. нет необходимости выбирать человеческий каркас с максимальной гомологией или последовательность, идентичную с данным антителом-кандидатом, которое должно быть гуманизировано). В таких вариантах осуществления общий или универсальный человече
- 39 -
009746
ский каркас может использоваться для принятия одного или нескольких отличных от человеческих CDR. В предпочтительном варианте осуществления единый универсальный полностью человеческий каркас используется в качестве каркаса для всех антител, которые должны быть гуманизированы, независимо от его гомологичности с каркасной последовательностью(ями) антител-кандидатов. В этой связи гуманизированные антитела могут быть созданы без внесения изменения в каркасную область. Данный универсальный полностью человеческий каркас может затем принять одну или несколько последовательностей CDR. В одном варианте осуществления одна или несколько последовательностей CDR представляют собой последовательности CDR антител из других видов (например), мыши или крысы), которые должны быть модифицированы в сравнении с соответствующим CDR в интактном антителе других видов (т.е. одновременное введение CDR и модификация CDR, введенного в универсальный человеческий каркас). Модификация соответствует одному или нескольким изменениям аминокислот (в модифицированном CDR) в сравнении с соответствующим CDR в интактном антителе другого вида. В одном варианте осуществления все остатки аминокислот CDR включены в библиотеку, хотя в других вариантах осуществления в библиотеку включены не все остатки аминокислот CDR. В другом варианте осуществления одна или несколько последовательностей CDR представляют собой случайные последовательности, заменившие последовательности CDR.
В предпочтительных вариантах осуществления антитела гуманизированы с сохранением высокого сродства к антигену и других полезных биологических свойств. В некоторых вариантах осуществления сродство гуманизированного антитела к антигену выше, чем сродство соответствующего негуманизиро-ванного интактного антитела или фрагмента или его части (например, антитела-кандидата грызуна). В этой связи, в некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела получают с помощью анализа исходной последовательности и различных схематичных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходной и гуманизированной последовательности. Трехмерные модели иммуноглобулина широко доступны и хорошо знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и демонстрируют вероятные трехмерные конформа-ционные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Их проверка позволяет провести анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким способом, остатки FR могут быть выбраны, а последовательности реципиента объединены с импортированными последовательностями, которые обладают желаемыми характеристиками антитела, такими как повышенное сродство к целевому антигену(ам). Обычно, остатки CDR непосредственно и наиболее значительно влияют на связывание антигена.
Разнообразные конкретные способы, хорошо известные специалистам в данной области из уровня техники, могут применяться для введения CDR антитела (или случайной последовательности, заменяющей CDR антитела) в каркасы антител (см., например, заявки на выдачу патента США 09/434 379 и 09/982464). В некоторых вариантах осуществления перекрывание олигонуклеотидов может использоваться для синтеза гена антитела или его части (например, гена, кодирующего гуманизированное антитело). В других вариантах осуществления может быть осуществлен мутагенез матрицы антитела с использованием способа Kunkel (ниже), например, для введения модифицированного CDR или случайной последовательности для замены CDR. В некоторых вариантах осуществления вариабельные участки легкой и тяжелой цепи гуманизированы отдельно, а затем коэкспрессированы как гуманизированные вариабельные участки. В других вариантах осуществления гуманизированные вариабельные участки маскируют вариабельный участок интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления участок Fc ин-тактного антитела, который включает гуманизированный вариабельный участок, модифицирован (например, по меньшей мере одна модификация аминокислоты осуществлена в участке Fc). Например, антитело, гуманизированное случайным CDR и без изменений каркаса, может включать по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в участке Fc.
В других вариантах осуществления применяются трансгенные животные (например, мыши), которые способны после иммунизации вырабатывать полный репертуар человеческих антител в отсутствие выработки эндогенного иммуноглобулина. Например, была описана гомозиготная делеция гена соединяющего участка (JH) тяжелой цепи антитела в химерной и зародышевой мутантных мышах, приводящая к полному ингибированию эндогенной выработки антител. Перенос генного массива зародышевой линии человеческого иммуноглобулина в зародышевую линию мутантных мышей будет приводить к выработке человеческих антител при антигенной нагрузке (см., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993), и Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки). Человеческие антитела могут также быть произведены из фаговодисплейных библиотек (например, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991), и Vaughan et al. Nature Biotech 14: 309 (1996), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки).
Настоящее изобретение относится к способам создания гуманизированных антител (и фрагментов антител), которые включают по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в участке Fc (в сравнении с исходным полипептидом, содержащим участок Fc). Ниже обсуждаются дополнительные способы
- 40 -
009746
создания такого гуманизированного антитела. Настоящее изобретение также обеспечивает композиции, которые включают антитела и фрагменты антител, созданные такими способами. Важно, что обсуждаемые ниже способы гуманизации и другие способы гуманизации (например, обсужденные выше), могут сочетаться с вариантами Fc по настоящему изобретению. В этой связи, гуманизированные антитела с измененными уникальными Fc участками могут быть сконструированы в соответствии с данным изобретением.
В некоторых вариантах осуществления обеспечивается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифицированной; и b) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, причем первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ii) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизо-ваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеотидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененным вариабельным участком тяжелой цепи кодирующей нуклеиновой кислоты, являются немодифици-рованными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии d) включает удлинение с помощью полимеразы.
В других вариантах осуществления обеспечивается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифициро-ванной; и b) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, причем первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ii) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеоти-дов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и d) обработку перекрывающихся олигонуклео-тидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицирован-ными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно
- 41 -
009746
включает стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи с вариабельным участком тяжелой цепи, кодирующий нуклеиновую кислоту таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии d) включает удлинение с помощью полимеразы.
В некоторых вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, который предусматривает: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Ka-bat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых оли-гонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего компле-ментарность участка, выбранного из группы, которая состоит из HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементар-ность участками донора первой ссылочной последовательности; и b) вторых олигонуклеотидов, кодирующих i) части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными, и ii) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизо-ваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и D) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененной нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, являются не-модифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии D) включает удлинение с помощью полимеразы.
В других вариантах осуществления обеспечивается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и b) вторых олигонуклеотидов, кодирующих i) части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ii) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых оли-гонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами для создания перекрывающихся олигонуклеотидов и D) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.
В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой це
- 42 -
009746
пи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления обработка на стадии D) включает удлинение с помощью полимеразы.
В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, вторая ссылочная последовательность включает вариабельный участок тяжелой цепи; b) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененным вариабельным участком тяжелой цепи, где каркасные области измененных вариабельных участков тяжелой цепи являются идентичными каркасным участкам второй ссылочной последовательности и по меньшей мере первый CDR измененных вариабельных участков антитела был модифицирован, где модифицированный первый CDR включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующим донором CDR первой ссылочной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления CDR определены согласно определению Kabat.
В некоторых вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез популяции генных последовательностей измененного вариабельного участка легкой цепи антитела, где каркасные области измененных вариабельных участков легкой цепи являются идентичными каркасным участкам второй ссылочной последовательности и по меньшей мере первый CDR измененного вариабельного участка легкой цепи антитела был модифицирован, где модифицированный первый CDR включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующим донором CDR первой ссылочной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов.
В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененным вариабельным участком тяжелой цепи, где каркасные области измененных вариабельных участков тяжелой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной последовательности и по меньшей мере первый CDR измененных вариабельных участков антитела включает случайную аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления CDR определены согласно определению Kabat.
В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеино
- 43 -
009746
вых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез популяции генных последовательностей измененного вариабельного участка легкой цепи антитела, где каркасные области измененных вариабельных участков легкой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной последовательности и по меньшей мере первый CDR измененного вариабельного участка легкой цепи антитела включает случайную аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления CDR определены согласно определению Kabat.
В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, причем ссылочная последовательность включает человеческую последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез популяции генных последовательностей антитела с измененным вариабельным участком тяжелой цепи, где каркасные области измененных вариабельных участков тяжелой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной человеческой последовательности и по меньшей мере первый CDR измененных вариабельных участков антитела включает случайную аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной человеческой последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления CDR определены согласно определению Kabat.
В других вариантах осуществления рассматривается способ конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления ссылочной аминокислотной последовательности, ссылочная последовательность включает человеческую последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез популяции генных последовательностей измененного вариабельного участка легкой цепи антитела, где каркасные области измененных вариабельных участков легкой цепи являются идентичными каркасным участкам ссылочной человеческой последовательности и по меньшей мере первый CDR измененного вариабельного участка легкой цепи антитела включает случайную аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления представление ссылочной последовательности существует в электронной форме. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления синтез включает использование перекрывающихся олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления CDR определены согласно определению Kabat.
В некоторых вариантах осуществления одна или несколько каркасных областей модифицированы одновременно с введением одного или нескольких модифицированных CDR. В других вариантах осуществления модифицированные каркасы являются смежными с модифицированными CDR.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; причем вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок модифицированного вариабельного участка тяжелой цепи или его часть, где вариабельный участок тяжелой цепи, каркасный участок или его часть, содержит множество измененных амино
- 44 -
009746
кислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; и b) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и ii) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В других вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) коэкс-прессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В дополнительных вариантах осуществления синтез включает химический синтез. В некоторых вариантах осуществления акцептор является человеком. В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько различных популяций измененных гетеромерных вариабельных участков представляют собой часть антитела, которая включает участок Fc, где участок Fc включает по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в сравнении с исходным полипептидом, содержащим участок Fc.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, который предусматривает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированный каркасный участок вариабельного участка легкой цепи или его часть, где вариабельный участок легкой цепи, каркасный участок или его часть, содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности и b) второй популяции олигонукле-отидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере один модифицированный определяющий ком-плементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементар-ность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементар-ность участка донора и ii) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи. В других вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.
В некоторых вариантах осуществления способы предусматривают а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок модифицированного вариабельного участка тяжелой цепи или его часть, где вариабельный участок тяжелой цепи, каркасный участок или его часть, содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с
- 45 -
009746
ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны из положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; и b) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и ii) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизоваться с первой популяцией олиго-нуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) удлинение перекрывания олигонуклеотидов с помощью ДНК полимеразы при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первой популяции олигонуклеотидов, которая включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированный каркасный участок вариабельного участка легкой цепи или его часть, где вариабельный участок легкой цепи каркасный участок или его часть содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; и b) второй популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере один модифицированный определяющий комплемен-тарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность или его часть, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора и ii) одну или несколько частей смежных каркасных участков, которые способны гибридизовать-ся с первой популяцией олигонуклеотидов; и с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеоти-дов таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) удлинение перекрывания олигонуклеотидов с помощью ДНК полимеразы при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления одну или несколько модификаций вводят в каркас, одновременно с введением одного или нескольких модифицированных CDR. Модифицированный CDR может включать одно или несколько изменений аминокислот в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью CDR. В определенных вариантах осуществления способы конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, включают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез i) первой популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок, где модифицированный участок, определяющий компле-ментарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и ii) второй популяции олигонуклеотидов, который включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированную часть вариабельного участка тяжелой цепи каркаса, модифицированная часть содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов при таких условиях, что по меньшей мере часть олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой
- 46 -
009746
цепи. В определенных вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дальнейших вариантах осуществления способы дополнительно предусматривают стадию (е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков. В других вариантах осуществления акцептор является человеком.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез i) первой популяции олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере один модифицированный определяющий комплементарность участок, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементар-ность участка донора; и ii) второй популяции олигонуклеотидов, который включает олигонуклеотиды, кодирующие модифицированные части вариабельного участка легкой цепи каркаса, модифицированная часть содержит множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с ссылочной последовательностью каркасного участка акцептора, где положения каркаса, которые были изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркаса донора первой ссылочной последовательности; с) смешивание первой и второй популяции олигонуклеотидов при таких условиях, что по меньшей мере часть олигонуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи.
В определенных вариантах осуществления могут быть созданы антитела или фрагменты антител, которые включают вариант Fc и вариант участка измененной тяжелой цепи. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез А) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является немодифицированной; и В) популяцию вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ii) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклео-тидов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и d) обработку перекрывающихся олигонукле-отидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененным вариабельным участком тяжелой цепи кодирующей нуклеиновой кислоты, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромер-ных вариабельных участков.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного
- 47 -
009746
участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; b) синтез а) первых олигонуклеотидов, кодирующих части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где последовательность части каркасных областей при сравнении со второй ссылочной последовательностью является не-модифицированной; и b) популяции вторых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует i) по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, который был модифицирован, первый определяющий комплементарность участок выбран из группы, которая состоит из LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности и ii) одну или несколько частей немодифицированного каркасного участка, которые способны гибридизоваться с первыми олигонуклеотидами; с) смешивание первых олигонуклеотидов с популяцией вторых олигонуклеоти-дов для создания перекрывающихся олигонуклеотидов; и d) обработку перекрывающихся олигонуклео-тидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифицирован-ными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и b) вторых олиго-нуклеотидов, кодирующих i) части каркасных областей вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифици-рованными и ii) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых оли-гонуклеотидов со вторыми олигонуклеотидами, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и D) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что создается популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, где каркасные области, которые кодируются измененным вариабельным участком тяжелой цепи кодирующей нуклеиновой кислоты, являются немодифицированными в соответствии со второй ссылочной последовательностью. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию (Е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, которые предусматривают: А) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) каркасные области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает каркасные участки; В) синтез а) популяции первых олигонуклео-тидов, каждый из которых кодирует по меньшей мере часть первого определяющего комплементарность участка, выбранного из группы, которая состоит из LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где модифицированный первый определяющий комплементарность участок включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующими определяющими комплементарность участками донора первой ссылочной последовательности; и b) вторых олигонуклеотидов, кодирующих i) части каркасных областей вариабельного участка легкой цепи акцептора, где части каркасных областей при сравнении с ссылочной последовательностью являются немодифицированными и ii) одну или несколько частей определяющего комплементарность участка, которые способны гибридизоваться с популяцией первых олигонуклеотидов; С) смешивание популяции первых олигонуклеотидов со вторыми олигонуклео
- 48 -
009746
тидами, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и D) обработку перекрывающихся олиго-нуклеотидов при таких условиях, что конструируется популяция нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где каркасные области, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, кодирующими измененный вариабельный участок легкой цепи, являются немодифициро-ванными в соответствии со второй ссылочной последовательностью.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам улучшения связывающей активности вариабельного участка мутированного гуманизированного антитела, которые предусматривают: а) обеспечение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей первый вариабельный участок мутантного гуманизированного антитела, мутантный вариабельный участок включает (i) каркас антитела человека дикого типа, (ii) три отличных от человеческих определяющих комплемен-тарность участка тяжелой цепи и (iii) три отличных от человеческих определяющих комплементарность участка легкой цепи, где определяющие комплементарность участки определяются согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia, где по меньшей мере один определяющий комплементарность участок представляет собой содержащий мутацию определяющий комплементарность участок легкой цепи, который включает по меньшей мере одну отличную аминокислоту по меньшей мере в одном положении в сравнении с соответствующим отличным от человеческого определяющим комплементар-ность участком дикого типа, и где первый вариабельный участок мутантного антитела обладает более высокой связывающей активностью, чем соответствующий вариабельный участок немутантного антитела; b) мутацию последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей первый вариабельный участок мутантного антитела при таких условиях, что кодируется второй вариабельный участок мутантного гуманизированного антитела, второй вариабельный участок мутантного гуманизированного антитела, который включает по меньшей мере одну дополнительную отличную аминокислоту по меньшей мере в одном положении в определяющем комплементарность участке легкой цепи, содержащей мутацию, дополнительная мутация в сочетании с первой мутацией приводит к более высокой связывающей активности. В некоторых вариантах осуществления определяющий комплементарность участок содержащей мутацию легкой цепи первого вариабельного участка мутантного гуманизированного антитела представляет собой определяющий комплементарность участок 3 (LCDR3). В других вариантах осуществления по меньшей мере один из определяющих комплементарность участков отличной от человеческой тяжелой цепи первого мутантного вариабельного участка гуманизированного антитела включает мутацию, таким образом, другая аминокислота кодируется по меньшей мере в одном положении в сравнении с соответствующим отличным от человеческого определяющим комплементарность участком дикого типа. В дополнительных вариантах осуществления мутация определяющего коплементарность участка находится в
HCDR3.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам одновременной модификации по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (CDR) и по меньшей мере одной каркасной области (FR) при конструировании популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи, которые предусматривают: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи донора, вариабельный участок донора включает i) четыре каркасных области и ii) три определяющих комлементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, который включает четыре каркасных области, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; b) синтез i) для каждой каркасной области, которая подлежит модификации, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный каркасный участок или его часть, содержащую множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей каркасной областью в ссылочной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи акцептора, где положения каркасного участка, которые изменены, выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркасной области донора первой ссылочной последовательности; и ii) для каждого определяющего комплементарность участка, который должен быть модифицирован, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и iii) для каждой из любых оставшихся и немодифицированных каркасных областей, олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок или его часть, с такой же последовательностью, как и соответствующая каркасная область второй ссылочной последовательности акцептора; и iv) для каждого из любых оставшихся и немодифицированных определяющих комплементар-ность участков, олигонуклеотиды, кодирующие определяющий комплементарность участок или его часть, с такой же последовательностью, как соответствующий определяющий комплементарность участок первой ссылочной последовательности донора, где отдельные олигонуклеотиды от (i) до (iv), кото
- 49 -
009746
рые кодируют смежные участки вариабельного участка тяжелой цепи, содержат перекрывание последовательности на концах; и с) смешивание олигонуклеотидов и популяций олигонуклеотидов, синтезированных на стадии b) при таких условиях, что перекрывающие последовательности отдельных олигонук-леотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что популяция нуклеотидов, кодирующих измененный вариабельный участок тяжелой цепи образуется. В определенных вариантах осуществления представление первой и второй ссылочных последовательностей существует в электронной форме. В дополнительных вариантах осуществления каркасная область, подлежащая модификации, выбирается из группы, которая состоит из HFR1, HFR2 и HFR3. В других вариантах осуществления определяющий комплементарность участок, подлежащий модификации, представляет собой HCDR3. В других вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи, с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных ге-теромерных вариабельных участков. В различных вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок легкой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.
В других вариантах осуществления применяются способы одновременной модификации по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (CDR) и по меньшей мере одной каркасной области (FR) при конструировании популяции нуклеиновых кислот, кодирующих измененный вариабельный участок легкой цепи, где указанный способ включает: а) обеспечение представления первой и второй ссылочных последовательностей аминокислот, причем первая ссылочная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи донора, вариабельный участок донора, который включает i) четыре каркасных области и ii) три определяющих комплементарность участка, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; вторая ссылочная аминокислотная последовательность включает последовательность вариабельного участка легкой цепи акцептора, который включает четыре каркасных области, как определено согласно комбинированным определениям Kabat и Chothia; b) синтез i) для каждой каркасной области, которая подлежит модификации, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный каркасный участок или его часть, модифицированная каркасная область или ее часть, содержащая множество измененных аминокислот в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей каркасной областью в ссылочной последовательности вариабельного участка легкой цепи акцептора, где измененные положения каркасного участка выбраны среди положений каркаса акцептора второй ссылочной последовательности, которая отличается в соответствующих положениях в сравнении с положениями каркасной области донора первой ссылочной последовательности; и ii) для каждого определяющего комплементарность участка, который должен быть модифицирован, популяцию олигонуклеотидов, каждый из которых кодирует модифицированный определяющий комплементарность участок или его часть, где модифицированный участок, определяющий комплементарность, включает различные аминокислоты в одном или нескольких положениях в сравнении с соответствующей ссылочной последовательностью аминокислот определяющего комплементарность участка донора; и iii) для каждой из любых оставшихся и немодифицирован-ных каркасных областей, олигонуклеотиды, кодирующие каркасный участок или его часть, с такой же последовательностью, как и соответствующая каркасная область второй ссылочной последовательности акцептора; и iv) для каждого из любых оставшихся и немодифицированных определяющих комплемен-тарность участков, олигонуклеотиды, кодирующие определяющий комплементарность участок или его часть, с такой же последовательностью, как соответствующий определяющий комплементарность участок первой ссылочной последовательности донора, где отдельные олигонуклеотиды от (i) до (iv), которые кодируют смежные участки вариабельного участка легкой цепи, содержат на концах перекрывающиеся последовательности, и с) смешивание олигонуклеотидов и популяций олигонуклеотидов, синтезированных на стадии b) при таких условиях, что перекрывающие последовательности отдельных олиго-нуклеотидов гибридизуются таким образом, чтобы создать перекрывающиеся олигонуклеотиды; и d) обработку перекрывающихся олигонуклеотидов при таких условиях, что популяция нуклеотидов кодирует измененный вариабельный участок легкой цепи. В определенных вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию е) коэкспрессии популяции нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок легкой цепи с популяцией нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи, таким образом, чтобы создать разнообразную популяцию измененных гетеромерных вариабельных участков.
(v) Мультиспецифические антитела
Настоящее изобретение относится к мультиспецифическим антителам, включающим вариант участка Fc. Тогда как мультиспецифические антитела в норме связывают только два антигена (т.е. биспеци-фические антитела, BsAb), антитела с дополнительной специфичностью, такие как триспецифические антитела, также охватываются данным термином при его использовании. Примеры BsAb включают без
- 50 -
009746
ограничения антитела с одним плечом, направленным против антигена опухолевой клетки, тогда как другое плечо направлено против молекулы цитотоксического триггера, такие как анти-ЕсyRI/анти-CD15, анти-p185HER2/FcYRШ (CD16), анти-CD3/антитело против злокачественной В-клетки (1d10), анти-CD3/анти-р185HER2, анти-CD3/анти-р97, анти-CD3/антитело против почечноклеточной карциномы, ан-ти-CD3/анти-OVCAR-3, анти-CD3/L-D1 (антитело против карциномы толстого кишечника), анти-CD3/антитело против аналога меланоцитостимулирующего гормона, анти-EGF рецептор/анти-CD3, анти-CD3/анти-САМА1, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/MoV18, антитело против молекулы нейрональной клеточной адгезии (NCAM)/анти-CD3, антитело против фолатсвязывающего белка (FBP)/анти-CD3, антитело против ассоциированного с карциномой антигена (АМОС-31)/анти-CD3; BsAb с одним плечом связывается специфично с антигеном опухоли и вторым плечом связывается с токсином, таким как анти-сапорин/анти^-1, анти-CD22/антисапорин, анти-CD7/антисапорин, анти-CD33/антисапорин, анти-СЕА/антирицин А цепь, антиинтерферон-альфа (ШЧ-альфа)/против идиотипа гибридомы, анти-СЕА/против алкалоид барвинка; BsAb для превращения активированных ферментом пролекарств, таких как анти-CD30/против щелочной фосфатазы (которая катализирует превращение пролекарства митоми-цина фосфата до митомицинового спирта); BsAb, которые могут использоваться как фибринолитические агенты, такие как антифибрин/против тканевого активатора плазминогена (tPA), антифибрин/против активатора плазминогена типа урокиназы (uPa); BsAb для направления иммунных комплексов к рецепторам на поверхности клеток, таких как антитело против липопротеина низкой плотности (?1)1^)^(tm)^ рецептор (например, FcyRI, FcyRII или FcyRIII); BsAb для применения в лечении инфекционных заболеваний, такие как анти-CD3/против вируса простого герпеса (HSV), против рецептора Т-клеток: CD3 комплекс/против вируса гриппа, анти^суШанти-ВИЧ; BsAb для обнаружения опухоли in vitro или in vivo, такие как анти-СЕА/анти-EOTUBE, анти-СЕА/анти-DPTA, анти-р185НЕР2/анти-гаптен; BsAb, как адъю-ванты вакцины; и BsAb, как диагностические инструменты, такие как анти-кроличий IgG/анти-ферритин, против пероксидазы хрена (HRP)/антигормон, анти-соматостатин/против вещества Р, анти-HRP/анти-FITC, анти-СЕА/против р-галактозидазы. Примеры триспецифических антител включают, не ограничиваясь ими, анти-CD3/анти-CD4/анти-CD37, анти-CD3/анти-CD5/анти-CD37 и анти-CD3/анти-CD8/анти-CD37. Биспецифические антитела могут быть получены как полноразмерные антитела или фрагменты антител (например, биспефицические антитела F(ab)'2).
Способы получения биспецифических антител известны из уровня техники. Традиционная продукция биспецифических полноразмерных антител основана на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, где две цепи имеют различную специфичность (например, Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983), включена в настоящее описание посредством ссылки). Из-за случайной сортировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, только одна из которых имеет правильную биспецифическую структуру. Выделение правильной молекулы может быть проведено в соответствии с методом аффинной хроматографии. Подобные методики раскрыты в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10: 36553659 (1991), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки.
В другом подходе вариабельные домены антитела с желаемой специфичностью связывания (сайты сочетания антитело-антиген) используются для последовательностей константных доменов иммуноглобулина. Слияние предпочтительно производится с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, который включает по меньшей мере часть шарнира, участки СН2 и CH3. Предпочтительным является включение первого константного участка тяжелой цепи (СН1), содержащей сайт, необходимый для связывания легкой цепи, по меньшей мере в один из гибридов. ДНК, кодирующие гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, встроены в отдельные экспрессирую-щие векторы и котрансфицированы в подходящие организмы-хозяева. Это обеспечивает большую гибкость в коррекции взаимного расположения трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей используются в конструировании для обеспечения оптимального выхода. Однако можно встроить последовательности, кодирующие две или все три полипептидные цепи в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего подхода биспецифи-ческие антитела составлены из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и гибридной парой тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина (обеспечение второй специфичности связывания) на другом плече (см., например, WO 94/04690, включена как ссылка). В соответствии с другим подходом, описанным в WO96/27011 (таким образом, включена как ссылка), граница между парой молекул антител может быть сконструирована для максимизации процента гетеродимеров, которые извлекаются из культуры рекомбинантных клеток. Биспецифические антитела также включают сшитые или "гетероконъюгированные" антитела. Например, одно антитело в гетеро-конъюгате может быть спарено с авидином, а другое - с биотином.
В. Молекулы иммуноадгезина
Настоящее изобретение также относится к молекулам иммуноадгезина, которые включают вариант
- 51 -
009746
участка Fc. Один вид конструирования иммуноадгезина сочетает домен связывания адгезина (например, внеклеточный домен (ECD) рецептора) с участком Fc тяжелой цепи иммуноглобулина (например, вариант участка Fc). Обычно при получении иммуноадгезинов по настоящему изобретению нуклеиновая кислота, кодирующая домен связывания адгезина, будет использоваться С-концом по отношению к нуклеиновой кислоте, кодирующей N-концевую последовательность константного домена иммуноглобулина, однако N-концевые слияния также возможны.
Типично, при таком слиянии закодированный химерный полипептид будет сохранять по меньшей мере функционально активный шарнир, домены СН2 и CH3 константного участка тяжелой цепи иммуноглобулина. Слияние также осуществляют с С-концом части константного домена Fc или непосредственно N-конца с СН1 тяжелой цепи или соответствующим участком легкой цепи. Выбор сайта, у которого осуществляется слияние, не является критичным; конкретные сайты хорошо известны и могут быть выбраны с целью оптимизации биологической активности, секреции или параметров связывания имму-ноадгезина.
В некоторых вариантах осуществления последовательность слита с N-концом варианта участка Fc иммуноглобулина G1. Возможно слияние целого константного участка тяжелой цепи с последовательностью адгезина. Однако в предпочтительных вариантах осуществления в слиянии используется последовательность, которая начинается в шарнирном участке непосредственно выше сайта расщепления папаи-ном, который химически определяет Fc IgG (т.е. остаток 216, принимая первый остаток константного участка тяжелой цепи как 114) или аналогичные сайты других иммуноглобулинов. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность аминоадгезина используется для слияния с (а) шарнирным участком и СН2 и CH3 или (b) CH1, шарниром, доменами СН2 и CH3 тяжелой цепи IgG. В некоторых вариантах осуществления иммуноадгезины являются биспеци-фичными.
Альтернативно, последовательности адгезина могут быть вставлены между последовательностями тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, таким образом, что иммуноглобулин, включает образованную химерную тяжелую цепь. В таких вариантах осуществления последовательность адгезина может использоваться с 3'-концом тяжелой цепи иммуноглобулина в каждом плече иммуноглобулина, между шарниром и доменом СН2 или между доменами СН2 и CH3 (см., например, Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991), включена как ссылка).
Хотя присутствие легкой цепи иммуноглобулина не является необходимым в иммуноадгезинах по настоящему изобретению, легкая цепь иммуноглобулина может присутствовать ковалентно связанной с полипептидом слияния адгезина-тяжелой цепи иммуноглобулина или непосредственно использоваться для адгезина. В последнем случае ДНК, кодирующая легкую цепь иммуноглобулина, обычно коэкспрес-сируется с ДНК, кодирующей белок слияния адгезина - тяжелой цепи иммуноглобулина. В процессе секреции гибридная тяжелая цепь и легкая цепь будут ковалентно связаны для обеспечения иммуноглобулин-подобной структуры, которая включает две пары тяжелой цепи - легкой цепи иммуноглобулина, связанных дисульфидными связями. Способы, подходящие для получения таких структур, раскрыты, например, в патенте США № 4816567, включенном в настоящее описание посредством ссылки.
В предпочтительных вариантах осуществления иммуноадгезины сконструированы с использованием последовательности кДНК, кодирующей часть адгезина с последовательностью кДНК иммуноглобулина. Также может применяться слияние с геномными фрагментами иммуноглобулина. Как правило, последний тип слияния требует присутствия регуляторной последовательности Ig для экспрессии. кДНК, кодирующие константные участки тяжелой цепи IgG, могут быть выделены на базе опубликованной последовательности из библиотек кДНК, полученных из селезенки или лимфоцитов периферической крови, с помощью гибридизации или полимеризационной цепной реакции (ПЦР). кДНК, кодирующие "адгези-новую" и "иммуноглобулиновую" части иммуноадгезина, могут быть встроены в тандеме в плазмидный вектор, который направляет эффективную экспрессию в выбранных клетках-хозяевах.
VI. Нуклеиновые последовательности, кодирующие варианты участка Fc
Настоящее изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим варианты участка Fc, а также композициям, векторам и клеткам-хозяевам, которые включают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты участка Fc. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным способам создания вариантов участка Fc.
В общем, для создания рекомбинантных вариантов нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант, выделяют и встраивают в вектор. Клетки-хозяева могут быть трансфицированы вектором, что позволяет амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты и/или получение варианта пептида. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты пептида по настоящему изобретению, могут быть выделены и секвенированы с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться конкретно с нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант). В общем, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант, действующим образом связана с другими элементами, такими как сигнальная последовательность (например, секреторные сигнальные последовательности), источник репликации, по меньшей мере один маркерный ген, энхансер, промотор или терминатор транскрипции. В определенных вариантах осуществления клетки
- 52 -
009746
хозяева стабильно трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей вариант для создания клеточной линии, экспрессирующей конкретный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления варианты экспрессируются в клетках СНО, NSO, Sp2/0, PER.C6 или НЕК293. Способы рекомбинирования хорошо известны из уровня техники.
Последовательности нуклеиновых кислот могут быть мутированы таким образом, что могут быть получены варианты участка Fc. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая исходный участок Fc (например, SEQ ID N0:32), может быть мутирована таким образом, что по меньшей мере одна аминокислота изменена, если экспрессируется последовательность нуклеиновой кислоты. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере часть исходного участка Fc, могут мутировать с образованием аминокислотной последовательности, которая включает по меньшей мере часть варианта участка Fc. Например, SEQ ID NO:32 может быть мутирована таким образом, что по меньшей мере одна аминокислотная последовательность образуется (см., например, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41, SEQ ID N0:42, SEQ ID N0:43, SEQ ID N0:44, SEQ ID N0:45, SEQ ID N0:46, SEQ ID N0:47, SEQ ID N0:48, SEQ ID N0:49, SEQ ID N0:50, SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:52, SEQ ID N0:53, SEQ ID N0:54, SEQ ID N0:55, и SEQ ID N0:56).
В определенных вариантах осуществления синтез на базе кодонов используется для создания му-тантной последовательности. Примеры синтеза на базе кодонов включают, например, описанные в патентах США №№ 5264563, 5523388 и 5808022, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, синтез на базе кодонов может быть выполнен последовательным взаимодействием мономеров на отдельных подложках с образованием по меньшей мере двух разных наборов. Взаимодействие может быть осуществлено в отдельных реакционных сосудах с последующим смешиванием подложек реакционных сосудов и разделением смешанных подложек на два и более реакционных сосудов с повторением стадий взаимодействия, смешивания и разделения один или несколько раз в реакционных сосудах с конечной стадией смешивания или разделения. Кроме того, олигонуклеотиды могут быть сняты с подложек.
VII. Терапевтические применения и композиции
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к лекарственным составам, которые включают варианты, раскрытые в настоящем описании. Такие варианты не предназначены для ограничения настоящего изобретения конкретной природой терапевтической композиции. Например, такие композиции могут включать вариант полипептида (или его часть) вместе с физиологически приемлемыми жидкостями, гелями, твердыми носителями, разбавителями, адъювантами и вспомогательными веществами, а также их комбинациями (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, 0sol, A. Ed. (1980), включена в настоящее описание посредством ссылки).
Кроме того, варианты полипептида могут использоваться вместе с другими терапевтическими агентами, включая без ограничения салицилаты, стероиды, иммуносупрессанты, антитела или антибиотики. Конкретные лекарственные средства, которые могут использоваться с вариантами по настоящему изобретению, включают без ограничения следующие соединения: соединения азобензола (патент США № 4312806, включен в настоящее описание посредством ссылки), бензил-замещенные производные родамина (патент США № 5216002, включен в настоящее описание посредством ссылки), соли цинк ?-карнозина (патент США № 5238931, включен в настоящее описание посредством ссылки), 3-фенил-5-карбоксипиразолы и изотиазолы (патент США № 5294630, включен в настоящее описание посредством ссылки), IL-10 (патент США № 5368854, включен в настоящее описание посредством ссылки), хиноли-новые ингибиторы синтеза лейкотриена (патент США № 5391555, включен в настоящее описание посредством ссылки), 2'-галоген-2'-дезоксиаденозин (патент США № 5506213, включен в настоящее описание посредством ссылки), соединения фенола и бензамида (патент США № 5552439, включен в настоящее описание посредством ссылки), трибутирин (патент США № 5569680, включен в настоящее описание посредством ссылки), некоторые пептиды (патент США № 5756449, включен в настоящее описание посредством ссылки), омега-3-полиненасыщенные кислоты (патент США № 5792795, включен в настоящее описание посредством ссылки), VLA-4 блокаторы (патент США № 5932214, включен в настоящее описание посредством ссылки), преднизолона метасульфобензоат (патент США № 5834021, включен в настоящее описание посредством ссылки), ингибиторы цитокинов (патент США № 5888969, включен в настоящее описание посредством ссылки) и никотин (патент США № 588 9028, включен в настоящее описание посредством ссылки).
Варианты полипептида могут использоваться вместе со средствами, которые снижают жизнеспособность или пролиферативный потенциал клетки. Средства, которые снижают жизнеспособность или пролиферативный потенциал клетки, могут функционировать множеством способов, включая, например, ингибирование синтеза ДНК, ингибирование деления клетки, индуцирование апоптоза или индуцирование неапоптотической гибели клеток. Конкретные примеры цитотоксических и цитостатических агентов, включают без ограничения: противовирусный белок лаконоса, абрин, рицин и каждую из их А-цепей, доксорубицин, цисплатин, йод-131, иттрий-90, рений-188, висмут-212, таксол, 5-фторурацил, VP-16, бле-омицин, метотрексат, виндезин, адриамицин, винкристин, винбластин, DCNU, митомицин, циклофосфа-мид и некоторые цитокины, такие как фактор некроза опухоли (TNF-a и TNF-P). Таким образом, цито
- 53 -
009746
токсические или цитостатические агенты могут включать, например, радионуклиды, химиотерапевтиче-ские средства, белки и лектины.
Терапевтические композиции могут содержать, например, такие обычно применяемые добавки, как связующие агенты, наполнители, носители, консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и вспомогательные вещества, например манит, лактозу, крахмал, магния стеарат, натрия сахаринат, целлюлозу, магния карбонат и т.п. фармацевтической чистоты. Эти композиции обычно содержат 1-95% активного ингредиента, предпочтительно 2-70% активного ингредиента.
Варианты полипептида по настоящему изобретению можно также смешивать с разбавителями или вспомогательными веществами, которые являются совместимыми и физиологически приемлемыми. Подходящие разбавители и вспомогательные вещества представляют собой, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин и т.п., а также их комбинации. Кроме того, при желании, композиции могут содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, стабилизирующие или забуферивающие агенты.
В некоторых вариантах осуществления терапевтические композиции по настоящему изобретению приготовлены в виде жидких растворов или суспензий, спреев или твердых форм. Препараты для перо-рального применения обычно включают такие широко применяемые добавки, как связующие агенты, наполнители, носители, консерванты, стабилизирующие агенты, эмульгаторы, буферы и вспомогательные вещества, например маннит, лактоза, крахмал, магния стеарат, натрия сахаринат, целлюлоза, магния карбонат и т.п. фармацевтической чистоты. Эти композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов длительного высвобождения или порошков и обычно содержат 195% активного ингредиента, предпочтительно 2-70%. Один из примеров композиции для перорального применения, полезной для введения терапевтических композиций по настоящему изобретению, описан в патенте США № 5643602 (включен в настоящее описание посредством ссылки).
Дополнительные препараты, применимые для других способов введения, таких как местное применение, включают мази, настойки, кремы, лосьоны, чрескожные пластыри и суппозитории. Для мазей и кремов традиционные связующие вещества, носители и вспомогательные вещества могут включать, например, полиалкенгликоли или триглицериды. Пример способа местного применения описан в патенте США № 5834016 (включен в настоящее описание посредством ссылки). Другие способы липосомальной доставки также могут использоваться (см., например, патенты США №№ 5851548 и 5711964, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки).
Препараты также могут содержать больше одного активного соединения, если это необходимо для конкретного показания, которое подлежит лечению, предпочтительно с дополняющей активностью, причем активные соединения не вступают в нежелательные взаимодействия. Такие молекулы могут присутствовать в количествах, которые являются эффективными для достижения поставленной цели.
Также могут быть приготовлены препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, которые содержат вариант полипептида, причем такие матрицы имеют определенную форму, например, пленки или микрокапсулы. Примеры матриц замедленного высвобождения включают, не ограничиваясь ими, полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или по-ли(виниловый спирт)), полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил^-глутамата, непере-вариваемый этилвинилацетат, перевариваемые сополимеры молочной кислоты/гликолевой кислоты, такие как LUPR0N DEP0T (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кисло-ты/гликолевой кислоты сополимера и лейпролида ацетата) и поли^-(-)-3-гиброксимасляная кислота. Если полимеры, такие как этилвинилацетат и молочная кислота/гликолевая кислота, позволяют высвобождение молекул на протяжении периода 100 дней, то некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие промежутки времени.
Варианты полипептида по настоящему изобретению могут применяться для лечения субъекта. Такое лечение может вводиться субъекту с заболеванием или может вводиться субъекту профилактически (например, субъекту, склонному к заболеванию). Примеры состояний, которые могут поддаваться лечению, включают без ограничения злокачественную опухоль (например, если вариант полипептида связывается с рецептором HER2, CD20 или фактором роста эндотелия сосудов (VEGF)); аллергические состояния, такие как астма (с анти-IgE антителом); и LFA-1-опосредованные заболевания (например, если вариант полипептида представляет собой анти-LFA-1 или анти-ICAM-1 антитело) и т.д.
В предпочтительных вариантах осуществления варианты, применяемые для лечения субъектов, включают антитела или иммуноадгезины. Также в предпочтительных вариантах осуществления заболевания, которые лечат, представляют собой заболевания, которые отвечают на антитело или иммуноадге-зин. Примеры заболеваний, которые отвечают на антитело или иммуноадгезин, включают такие заболевания и медицинские состояния, как лимфома (лечится с помощью RITUXAN, анти-CD20 антитело), инфекционное заболевание (лечится с помощью SYMAGIS, антитело, направленное на F белок респираторного синцитиального вируса), почечный трансплантат (ZENAPAX, анти-П^-2 рецептор антитело), болезнь Крона и ревматоидный артрит (лечится с помощью REMICADE, анти-TNF альфа антитело), карцинома молочной железы (лечится с помощью HERCEPTIN, анти-НЕР2 антитело) и рак толстого кишеч
- 54 -
009746
ника (лечится с помощью EDREC0L0MAB, анти-17-1А антитело).
В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида с улучшенной ADCC активностью (например, вариант P247L или I332E) используется в лечении заболеваний или нарушений, где разрушение или выведение ткани или чужеродного микроорганизма является желаемым. Например, вариант может использоваться для лечения злокачественных опухолей; воспалительных заболеваний; инфекций (например, бактериальных, вирусных, грибковых или дрожжевых инфекций); и других состояний (таких как зоб), где удаление ткани является желаемым. В других вариантах осуществления вариант полипептида обладает сниженной активностью ADCC (например, вариант I332R или I332K). Такие варианты могут применяться для лечения заболевания или нарушения, где полипептид, содержащий участок Fc, с длительным периодом полувыведения является желаемым, но полипептид предпочтительно не обладает нежелательными эффекторными функциями. Например, полипептид, содержащий участок Fc, может быть антителом против тканевого фактора (TF); анти-IgE антителом; и анти-интегриновым антителом (например, анти-а4р7 антитело). Желательный механизм действия такого полипептида, содержащего участок Fc, может быть блокирован связыванием пары лиганд-рецептор. Более того, полипептид, содержащий Fc участок со сниженной ADCC активностью, может быть антителом-агонистом.
Варианты полипептида по настоящему изобретению могут вводиться любым пригодным способом, в том числе парентерально, подкожно, местно, внутрибрюшинно, внутрилегочно и интраназально, а также непосредственно в очаг поражения (например, для местного иммуносупрессивного лечения).
Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутри-брюшинное или подкожное введение. Кроме того, для введения варианта полипептида может подходить пульсирующая инфузия, конкретно, с уменьшением доз варианта полипептида. Предпочтительно дозы вводятся инъекционным способом, наиболее предпочтительно путем внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, будет ли введение кратким или хроническим.
Для профилактики или лечения заболевания подходящая схема дозирования варианта полипептида будет зависеть от вида заболевания, которое подлежит лечению, выраженности и протекания заболевания, вводится ли вариант полипептида для профилактических или лечебных целей, предыдущего лечения, анамнеза пациента и ответа на вариант полипептида, а также частоты посещения врача. Вариант полипептида пригоден для введения пациенту однократно или в виде курсового лечения.
Например, в зависимости от вида и выраженности заболевания около 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,120 мг/кг) варианта полипептида составляет начальную дозу-кандидат для введения пациенту в виде одного или нескольких приемов или путем непрерывной инфузии. Типичная дневная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до достаточного уменьшения или устранения симптомов. Прогресс такого лечения легко контролировать с помощью традиционных методик и анализов, которые могут использоваться для коррекции дозы с целью достижения терапевтического эффекта. Терапевтически эффективное количество варианта полипептида для введения представляет собой уровень доз, необходимый пациенту, таким образом, чтобы уменьшить симптомы заболевания, подлежащего лечению. Вариант полипептида необязательно может сочетаться с одним или несколькими агентами, которые в настоящее время используются для профилактики или лечения данного нарушения. Эффективное количество таких агентов зависит от количества варианта полипептида, присутствующего в препарате, вида нарушения или лечения и других факторов, которые обсуждались выше.
VIII. Дополнительные виды применения варианта участка Fc
Варианты и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты по настоящему изобретению, могут применяться множеством способов. Например, варианты по настоящему изобретению могут применять в анализах скрининга лекарственных средств. Например, соединения-кандидаты могут оцениваться на предмет способности изменять или препятствовать эффекторным функциям Fc путем контакта варианта с соединением-кандидатом и определения связывания соединения-кандидата с вариантом. Вариант может быть иммобилизирован с применением способов, известных из уровня техники, таких как связывание белка GST-варианта, слитого с полимерными гранулами, содержащими глутатион. Химерный ген, кодирующий слитый белок GST, конструируется путем слияния ДНК, кодирующей интересующий вариант, с ДНК, кодирующей карбоксильный конец GST (см., например, Smith et al., Gene 67:31 [1988]). Слитым конструктом затем трансформируют подходящую экспрессирующую систему (например, Е. coli XA90), в которой экспрессия слитого GST белка может быть индуцирована с помощью изоггоопил-р^-тиогалактопиранозида (IPTG). Индукция с помощью IPTG должна давать слитый белок как основную составляющую растворимых клеточных белков. Слитые белки могут быть очищены способами, известными специалистам в данной области, включая очистку глутатион-аффинной хроматографией. Связывание соединения-кандидата с вариантом коррелирует со способностью соединения разрушать одну или несколько эффекторных функций.
В другом способе скрининга вариант или выбранный FcR иммобилизируют с использованием способов, известных из уровня техники, таких как адсорбция на пластиковом планшете для микротитрова
- 55 -
009746
ния или специфического связывания белка слияния GST с полимерными гранулами, содержащими глу-татион. Например, вариант GST связывают с глутатион-сефарозными гранулами. Иммобилизированный вариант затем контактирует с рецептором Fc и соединением-кандидатом. Далее несвязанный пептид удаляют и комплекс солюбилизируют и анализируют для определения количества связанного меченого пептида. Уменьшение связывания является показателем того, что соединение-кандидат ингибирует взаимодействие варианта с рецептором Fc. Этот способ скрининга является особенно применимым при использовании вариантов по настоящему изобретению, которые демонстрируют повышенный уровень связывания с рецептором Fc (например, поскольку многие исходные рецепторы Fc представляют собой рецепторы с низким сродством, такие как FcyRIII, FcyRIIb и FcyRIIa). Вариация данного способа позволяет скрининг соединений, которые способны разрушать предварительно образованный комплекс вариант/рецептор Fc. Например, в некоторых вариантах осуществления комплекс, включающий вариант, связанный с рецептором Fc, иммобилизируют, как описано выше, и приводят в контакт с соединением-кандидатом. Растворение комплекса соединением-кандидатом коррелирует со способностью соединения разрушать или ингибировать взаимодействие между исследуемым вариантом и рецептором Fc. С этой точки зрения соединения с терапевтическим потенциалом (например, у людей) могут быть идентифицированы (например, соединения, полезные для лечения заболеваний у человека, таких как аутоиммунные заболевания).
Другая техника скрининга обеспечивает высокопроизводительный скрининг для соединений, обладающих подходящей связывающей способностью с вариантами пептида, и подробно описана в W0 84/03564, включена как ссылка. Вкратце, большое количество различных исследуемых пептидных соединений небольшого размера синтезируется на твердом субстрате, таком как пластиковые иглы или другая поверхность. Исследуемые пептидные соединения затем вводят в реакцию с вариантами пептида и промывают. Далее связанные варианты пептида обнаруживают с помощью способов, хорошо известных из уровня техники.
В другой технике используют антитела, направленные на вариантные пептиды. Такие антитела способны специфически связываться с вариантными пептидами, конкурируя с исследуемым соединением за связывание с данным вариантом. Таким способом антитела могут применяться для обнаружения присутствия любого пептида, который разделяет одну или несколько антигенных детерминант вариантного пептида.
Настоящее изобретение рассматривает многие другие средства скрининга соединений. Приведенные выше примеры представлены только для иллюстрации спектра существующих техник. Средний специалист в данной области будет понимать, что могут применяться многие другие способы скрининга.
Конкретно, настоящее изобретение относится к применению линий клеток, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один вариант участка Fc для скрининга соединений на предмет активности и конкретно для высокого производительного скрининга соединений из комбинаторных библиотек (например, библиотеки, содержащие свыше 104 соединений). Линии клеток по настоящему изобретению могут применяться в разнообразных способах скрининга.
Варианты по настоящему изобретению могут применяться как агент для аффинной очистки. Например, вариант может быть иммобилизирован на твердой фазе, такой как смола Sephadex или фильтровальная бумага, с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Иммобилизированный вариант затем вводится в контакт с образцом, содержащим антиген, который подлежит очистке, и после этого подложку промывают подходящим растворителем, который удаляет по существу все вещества образца за исключением антигена, который подлежит выделению, связанного с иммобилизированным вариантом полипептида. В конечном итоге подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который будет высвобождать антиген из варианта полипептида.
Вариант полипептида также может быть полезным в диагностических анализах (например, для определения экспрессии интересующего антигена в специфических клетках, тканях или сыворотке). Для диагностического применения вариант, как правило, метят детектируемым фрагментом (такие метки также применимы в анализах участка Fc, описанных выше). Существуют многочисленные метки, в том числе без ограничения радиоизотопы (например, 35S, 14C, 125I, 3Н и 131I), флуоресцентные метки (например, хелаты редкоземельных металлов (хелаты европия) или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, лиссамин, фикоэритрин и техасский красный), различные фермент-субстратные метки (см., например, патент США № 4275149, включенный в настоящее описание посредством ссылки, люцифераза, люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, перок-сидаза, такая как пероксидаза хрена (HRP0), щелочная фосфатаза, р-галактозидаза, глюкоамилаза, лизо-цим, оксидазы сахаров (например, глюкозооксидаза, галактозоосидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактоперок-сидаза, микропероксидаза и т.п.). Примеры фермент-субстратных комбинаций включают, например, (i) пероксидазу хрена (HRP0) с пероксидом водорода в качестве субстрата, где пероксид водорода окисляет предшественник красителя (например, ортофенилендиамин (0PD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорид (ТМВ)), (ii) щелочную фосфатазу (АР) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного
- 56 -
009746
субстрата и (iii) D-галактозидаза (R-D-Gai) с хромогенным субстратом или флуорогенным субстратом.
Варианты настоящего изобретения также могут применяться для диагностических анализов in vivo. Например, полипептидный вариант, помеченный радионуклидом таким образом, что локализация антигена или экспрессирующих его клеток может быть определена с помощью иммуносцинтиографии.
Экспериментальная часть
Следующие примеры приведены с целью демонстрации и дальнейшей иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления и аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.
В нижеследующем описании экспериментов применяются следующие сокращения: н (нормальный), М (молярный), мМ (миллимолярный), мкМ (микромолярный), моль (моль), ммоль (миллимоль), мкмоль (микромоль), нмоль (наномоль), пмоль (пикомоль); г (граммы), мг (миллиграммы), мкг (микрограммы), нг (нанограммы); л (литры)/ мл (миллилитры), мкл (микролитры), см (сантиметры), мм (миллиметры), мкм (микрометры), нм (нанометры), DS (декстрана сульфат) и °С (градусы по шкале Цельсия).
Пример 1. Скрининг вариантов в анализах ADCC
Данный пример описывает скрининг вариантов в анализе ADCC. Все варианты, для которых проводился скрининг, представляли собой анти-CD20 антитела (на основе специфичности вариабельного участка).
i. Выделение РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови)
Около 50 мл периферической крови, полученной от здорового донора, разбавляли в соотношении 1:2 фосфатно-буферным раствором (FBS) с рН 7,0. Растворы смешивали осторожным вращением пробирки. Около 12 мл Histopaque-1077 (Sigma кат. № 1077-1) аккуратно наслаивают под разбавленный образец крови с последующим центрифугированием в центрифуге Sorvall RT6000B с качающимся черпач-ным ротором при 1000 об./мин в течение 10 мин. Верхнюю фазу градиента отбрасывали с помощью аспирации и межфазную поверхность белого цвета, содержащую РМВС, собирали и промывали трижды сбалансированным солевым раствором Хэнкса (Gibco кат. № 14025-092). Промытые гранулы клеток суспендировали приблизительно в 20 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Omega Scientific кат. № FB-01). Ресуспендированные РВМС делили на две колбы культуры Т-175 и 30 мл RPMI, содержащей 10% FBS, добавляли в каждую из них с последующей инкубацией в течение ночи при 37°С в инкубаторе с содержанием 5% CO2. На следующий день неклейкие РВМС собирали в пробирки Фалкона объемом 50 мл, центрифугировали, как описано выше, и ресуспендировали в RPMI, содержащей 1% FBS без фенольного красного. Малую порцию ресуспендированных клеток разбавляли в 10 раз и подсчитывали с использованием гемоцитометра. Оставшиеся РВМС помещали в инкубатор до использования.
ii. Линия клеток-мишеней (специфичны для анализов анти-CD20 ADCC)
Wil.2 и SKW6.4 CD20-экспрессирующие линии В-клеток получали из АТСС и вьгращивали в соответствии с инструкциями. За день перед использованием клетки разделяли на 2 части. На следующий день количество клеток доводили до 4х105 клеток/мл и аликвоты 50 мкл (20000 клеток/ячейку) добавляли в 96-луночный культуральный планшет.
iii. Разведения IgG
Перед скринингом варианты IgG экспрессировали и количественно определяли с использованием стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Для первичного точечного скрининга ADCC варианты IgG разбавляли до 40 нг/мл в среде RMPI, содержащей 1% FBS без фенольного красного. Конечная концентрация IgG в анализе разбавлена в 4 раза (т.е. конечная концентрация 10 нг/мл). Али-квоты 50 мкл IgG добавляли к клеткам-мишеням и инкубировали в течение 15 мин при 37°С перед добавлением эффекторных клеток к опсонизированным клеткам-мишеням.
При проведении титрования IgG концентрацию IgG варьировали в интервале от приблизительно 0,0001 до 1 мкг/мл. Готовили разведения IgG с использованием 96-луночного микротитровального планшета путем разведения образцов в RPMI, содержащей 1% FBS без фенольного красного. Разбавленные образцы IgG затем добавляли в аналитический планшет, содержащий клетки-мишени.
iv. Эффекторные клетки
Концентрацию РВМС корректировали таким образом, чтобы соотношение эффекторные клетки/клетки-мишени находилось в интервале 10-20:1 (т.е. 2-4 х 106 клеток/мл). 100 мкл ресуспендирован-ных РВМС добавляли в каждую лунку опсонизированных клеток-мишеней. Планшеты инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 в течение 3-4 ч.
v. Определение высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
Лизис клеток-мишеней измеряли определением высвобождения фермента лактатдегидрогеназа из цитоплазмы поврежденных клеток в супернатант культуры. После инкубирования опсонизированных клеток-мишеней с эффекторными клетками аналитические планшеты центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин. Около 75 мкл супернатанта клеточной культуры осторожно извлекали, избегая гранулированных клеток и мусора. Данный супернатант добавляли непосредственно на микротитроваль-ный планшет и к полученному раствору добавляли 75 мкл реактива для обнаружения ЛДГ (Roche, кат. №
- 57 -
009746
1644793). Затем планшет инкубировали в течение приблизительно 15-30 мин и считывали поглощение при 490 нм с использованием микропланшетного ридера Vmax Kinetic от Molecular Devices.
vi. Анализ данных
Все точечные анализы скрининга ADCC проводили в двух повторениях. Каждый аналитический планшет содержал контроль для определения спонтанного лизиса клеток-мишеней, спонтанного лизиса эффекторных клеток плюс спонтанного лизиса клеток-мишеней в отсутствие IgG и общего лизиса клеток-мишеней. Общий лизис клеток мишеней получали добавлением 1% Тритон Х-100 к клеткам-мишеням. Три контроля дикого типа включали в каждый анализ на аналитическом планшете и сигнал анализа ADCC усредняли. Базовое значение, полученное для контроля спонтанного лизиса, вычитали из каждого образца. Базовое значение, полученное для разведенного IgG, вычитали для каждого образца. Данные конвертировали из значений поглощения в процент специфического лизиса на базе контроля спонтанного и общего лизиса. Процент специфического лизиса рассчитывали на основе следующего уравнения: процент специфического лизиса (экспериментальный А490 - базовый А490)/(максимальный А490 - базовый А490)х100, где базовый А490 представляет собой сумму значений А490, полученных для эффекторных клеток и клеток-мишеней в отсутствие IgG и базового значения IgG вследствие загрязнения ЛДГ, присутствующей в сырых супернатантах IgG. Процент активности варианта Fc нормализовали относительно средних значений контроля дикого типа. Процент нормализованной активности для двойных аналитических планшетов усредняли и для каждого образца рассчитывали стандартное отклонение между индивидуальными аналитическими планшетами.
vii. Результаты
Относительная специфическая активность ADCC показана в табл. 2. Значения CDC, приведенные в данной таблице, были получены, как описано в примере 4, и значения анализа связывания FcRn, приведенные в данной таблице, получены, как описано в примере 5.
Таблица 2
Вариант
ADCC
FcRn 6,0
FcRn 7,0
CDC
Исходный
100
100
100
100
Р247Н
161
P247I
163
P247L
166
L251F
123
102
100
138
T256M
126
167
T256P
115
132
121
315
H268D
127
137
H268E
129
108
D280A
144
141
D280K
140
103
144
A330K
129
104
A330R
123
101
I332D
145
102
146
I332E
161
150
I332K
109
I332R
A339T
130
115
109
189
A378D
101
122
S440Y
116
106
102
199
В данном эксперименте клетки SKW6.4 опсонизировали с использованием одинарных и двойных вариантов аминокислот участка Fc с последующим добавлением РВМС в соотношении 15:1. Аналитический планшет инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 в течение 3 ч с последующим центрифугированием. Часть супернатанта собирали и переносили на планшет для микротитрования и активность ЛДГ в супернатанте определяли с помощью добавления равного объема субстрата ЛДГ. После образования окрашивания измеряли поглощение при 490 нм. Измеряли базовое значение в результате загрязнения
- 58 -
009746
ЛДГ сырых IgG супернатантов и эти базовые значения вычитали из сырых данных А490. Эти данные показывают, что в сравнении с диким типом анти-CD20 антитела активность ADCC А330К, A330R и I332E одиночных вариантов аминокислот повышена. Комбинация А330К или A330R с вариантом I332E дополнительно улучшает активность ADCC. Неспецифический IgG не проявляет активности в этих условиях анализа. Активность варианта 1332 может быть далее усилена с изменением гликозилирования (например, путем повышения содержания двухсекционного GlcNAc).
Процент цитотоксичности рассчитывали на основе следующего уравнения: % цитотоксичности = (экспериментальный А490 базовый А490)/(максимальный А490 - базовый А490)х100, где базовый А490 получен на основе эффекторных клеток и клеток-мишеней в отсутствие IgG. Данные показывают, что активность ADCC вариантов I332D и I332E усилена в сравнении с диким типом. В данном эксперименте использовали клетки-мишени SKW6.4 и в стандартном 3-часовом анализе ADCC соотношение эффек-торных клеток/клеток-мишеней 15:1.
Активность ADCC с данной конкретной анти-CD20-специфичностью и клеточные линии Wil-2 и SKW6.4 являются независимыми от сродства вариабельного участка.
Внеклеточную часть человеческого рецептора Fc гамма RI (CD64) с С-концом 6-his свободного конца добавляли вместо предполагаемого трансмембранного домена, экспрессировали в клетках НЕК-293А и очищали с использованием Ni-колонки. Рецептором покрывали в течение ночи при 4°С планшет ELISA и затем планшет блокировали с использованием Superblock. После блокирования и промывания готовили разведения IgG и добавляли на покрытый рецепторами планшет с последующей инкубацией при 37°С в течение 2 ч. Несвязанный IgG удаляли путем промывания и связывания обнаруженного антитела с использованием вторичного конъюгированного антитела против человеческой каппа щелочной фосфатазы 1:1000. После промывания связанный IgG определяли добавлением субстрата фосфатазы (фенолфталеин монофосфат) (РРМР) (JBL Scientific) с поглощением, определенным колориметрически при 560 нм с помощью микропланшетного ридера VMAX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Данные изображали в виде графика зависимости логарифма концентрации IgG от поглощения.
Пример 2. Анализ скрининга вариантов на предмет истощения В-клеток в цельной крови
В этом примере описан анализ скрининга вариантов на предмет истощения В-клеток в цельной крови.
i. Генотипирование FcyRIIA
Геномную ДНК выделяли из образцов периферической крови с использованием набора QiaAmp (Qiagen, кат. № 51104). FcyRIIA амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров (5' GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC 3' - SEQ ID NO:61) и (5'CAACAGCCTGACTACCTATTACGG 3' -SEQ ID NO:62). Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки MinElute PCR (Qiagen, кат. № 28006) и расщепляли рестриктазой BstUI при 60°С в течение 12 ч. Расщепленные образцы анализировали на 3% агарозных гелях. Все продукты ПЦР разрезали по внутреннему сайту BstUI, независимому от генотипа Н или R. Продукты, которые демонстрировали R аллель, разрезали по дополнительному сайту BstUI. Это приводило к генотипу Н/Н, идентифицированному по одному фрагменту размером 337 п.н., H/R был идентифицирован по двум фрагментам размером 337 п.н. и 316 п.н. и R/R идентифицирована по одному фрагменту размером 316 п.н.
ii. Генотипирование FcyRIIIA
Геномную ДНК выделяли из образцов периферической крови с применением набора QiaAmp (Qiagen, кат. № 51104). FcyRIIIA амплифицировали из геномной ДНК с помощью ПЦР с использованием
праймеров (5' ATATTTACAGAATGGCA 3' - SEQ ID NO:63) и (5' GGTGATGTTCACAGTCTCTGA
GACACATTTTTACTGTCAA 3' - SEQ ID N0:64). Продукты ПЦР очищали с использованием набора очистки MinElute PCR (Qiagen, кат. № 28006) и расщепляли рестриктазой HincII при 37°С в течение 16 ч. Расщепленные образцы анализировали на 3% агарозных гелях NuSieve. HincII разрезает V аллель, но не F аллель. Следовательно, F/F дает один фрагмент размером 148 п.н., F/V дает три фрагмента размером 148, 109 и 39 п.н., и V/V дает два фрагмента размером 109 и 39 п.н.
iii. Анализ истощения В-клеток (с использованием цельной крови)
Гепаринизированную периферическую кровь отбирали у здоровых добровольцев. Кровь смешивали с вариантом, Ритуксаном или неспецифическим IgG (отрицательный контроль), разведенными в буфере FACS (фосфатный буферный солевой раствор + 2% эмбриональной бычьей сыворотки). Пробирки инкубировали в течение 4 ч при 37°С и затем окрашивали флуоресцеин-анти-CD45 (для идентификации лейкоцитов) (BD, кат. № 555482) и фикоэритрин-анти-CD19 (для идентификации В-клеток) (ВС, кат. № 555413) в течение 30 мин при комнатной температуре. Красные кровяные клетки лизировали добавлением BD PharmLyse, (BD, кат. № 555899), образцы промывали и ресуспендировали в буфере для анализа FACS в проточном цитометре Becton Dickinson. Непосредственно перед анализом к образцам добавляли пропидия йодид (PI) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл для распознавания живых и мертвых клеток. Контроль включает клетки, инкубированные только с буфером FACS, неокрашенные и окрашенные одним цветом образцы. Каждое определение проводили в трех повторениях и собирали 10000 PI-отрицательных событий, которые приходились внутри интервала разброса лимфоцитов (FSCSSC). Дан
- 59 -
009746
ные анализировали с использование программного обеспечения WinMDI. Для анализа живые лимфоциты идентифицировали по положительному окрашиванию с помощью CD45, негативного результата PI и характеристик FSC/SSC. В каждом образце процент клеток CD19+ с этими характеристиками идентифицировали. Данные выражали как средний % клеток CD19+ плюс/минус 1 стандартное отклонение. Альтернативно, для облегчения сравнения между донорами, данные выражали как % от начального количества клеток CD19+ оставшийся, т.е. (% лимфоцитов CD19+, оставшиеся после обработки)/(% лимфоцитов CD19+ в образце, обработанном буфером FACS) х 100%.
Вариант I332E истощает В-клетки более мощно и в большей степени, чем Ритуксан, в образце цельной крови, содержащей генотип VV (высокое сродство) рецептора FcyRIIIa.
Вариант I332E истощает В-клетки более мощно и в большей степени, чем Ритуксан, в образце цельной крови, содержащем генотип FF (низкое сродство) рецептора FcyRIIIa. Подобные результаты получены для анализа цельной крови, с генотипом VF (гетерозиготный) рецептора FcyRIIIa или генотипами НН, HR или RR рецептора FcyRIIa (табл. 3).
Таблица 3. Процент оставшихся В-клеток при максимальном истощении
Рецептор
Генотип
I332E
Ритуксан
Неспецифический IgG
FcyRII1а
FcyRIIa
Вариант A378D неожиданно истощает В-клетки более мощно и в большей степени, чем варианты с равной или большей активностью в анализах ADCC и CDC in vitro. Пример 3. Определение сродства варианта
Данные примеры описывают, каким образом определяли сродство (Kd) взаимодействия между FcyRIIIa (генотип FF) и дикого типа или исходного Fc и варианта I332E.
i. Анализ Kd FcyRIIIa (158F)
Растворимый внеклеточный домен человеческого FcyRIIIa (158F) экспрессировался в клетках 293 и его очищали с помощью смолы Ni-NTA, связанной с 6-гистидиновым свободным концом.
Одну пробирку гранул Azlactone (Sapidyne) спаривали с 1 мг FcyRIIIa (158F) в натрий бикарбонат-ном буфере с рН 9,3. Суспензию встряхивали в течение ночи при 4°С, дважды промывали FBS и блокировали с помощью блокирующего буфера (1 М трис рН 7,4 + 1% BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем гранулы трижды промывали FBS и ресуспендировали в 50 мл FBS с 0,01% азида. Двенадцать равновесных образцов, каждый из которых содержал 7,5 нМ IgG и FcyRIII, титровали от 4 мкМ до 1,95 нМ, готовили в аналитическом буфере (FBS рН 7,4, 0,1% BSA 0,01% азида) и уравновешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Все эксперименты проводили в аналитическом буфере при комнатной температуре со скоростью потока 0,5 мл/мин. После помещения гранул FcyRIII в проточную кювету прибора свободный IgG захватывался из первого равновесного образца. Затем гранулы промывали и связанный IgG определяли с использованием конъюгата козьего антитела против человеческого Fc (Fab')2-FITC (Jackson Immunochemicals). Затем процесс повторяли для оставшихся 11 равновесных образцов и после анализа определяли Kd с помощью программного обеспечения Kinexa Pro. С применением такого подхода сродство (Kd) взаимодействия между FcyRIIIa (генотип FF) и диким типом (или исходным) Fc определяли на уровне 387 нМ, тогда как сродство варианта I332E составляло 52 нМ. Глико-сконструированное антитело (GnTIII) показывает Kd 83 нМ, тогда как комбинаторный вариант (L256P, I332E) показывает Kd 21 нМ.
Пример 4. Характеристика активности CDC вариантов
Данный пример описывает, как определяли активность различных вариантов участка Fc. i. Анализ
Данный анализ проводили с использованием комплемента человека (Quidel Corp., кат. №А113) на клетках Ramos (RA №1) (АТСС кат. № CRL-1596). Клетки Ramos культивировали в среде Gibco RPMI1640, содержащей 10% FBS при 37°С и 5% C02. За день до пробы клетки засевали при 1х 106 клетки в колбу Т175. На следующий день клетки ресуспендировали в количестве 3,57х105 клеток/мл в среде RPMI1640 без фенольного красного, содержащей 1% FBS. Клетки распределяли по 70 мкл в лунке плоскодонного планшета Costar 3917. Для кривой титрования вариант IgG готовили с 3-кратным серийным разведением в среде RPMI1640. Для точечного библиотечного скрининга анализа временно экспрессиро
- 60 -
009746
ванный вариант IgG в супернатанте культуры нормализовали до 1 мкг/мл среды. 30 мкл варианта IgG (конечная концентрация 200 нг/мл) и 50 мкл комплемента человека (Quidel Corp., кат №А113) 1:5 разбавляли средой RPMI1640 + 1% FBS и добавляли к клеткам-мишеням, осторожно и тщательно перемешивая пипетированием. Планшеты инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 в течение 1,5 ч. После добавления 15 мкл на лунку аламара голубого (Serotec, кат. №BUF012B) инкубацию продолжали в течение ночи. На следующее утро сигнал флуоресценции измеряли с помощью многометочного ридера Perkin Elmer Envision 2100 с возбуждением при 560 нм и эмиссией при 590 нм. ii. Анализ данных
Все одноточечные анализы проводили в двойном повторении. Каждый аналитический планшет содержал контроль для определения спонтанного лизиса клеток-мишеней комплементом человека в отсутствие IgG и максимального лизиса в присутствии 1% Тритона Х-100.
Три контроля дикого типа включали в каждый анализ на аналитическом планшете и сигнал пробы ADCC усредняли. Базовое значение, полученное для контроля спонтанного лизиса, вычитали из каждого образца. Базовое значение, полученное для разведенного IgG, вычитали для каждого образца. Данные конвертировали из значений поглощения в процент специфического лизиса на основе контроля спонтанного и общего лизиса. Процент специфического лизиса рассчитывали на основе следующего уравнения: процент специфического лизиса = (экспериментальный сигнал флуоресценции - базовый сигнал флуо-ресценции)/(максимальный сигнал лизиса - спонтанный сигнал) х 100. Оценку активности варианта Fc рассчитывали относительно средних значений трех контролей дикого типа. Процент нормализованной активности для дикого типа для двойных аналитических планшетов усредняли и для каждого образца рассчитывали стандартное отклонение между индивидуальными аналитическими планшетами.
Репрезентативные данные CDC получены после титрования вариантов IgG. В данном эксперименте клетки Ramos лизировали с применением вариантов участка Fc IgG с по одной или двум аминокислотам и комплемента человека. Аналитический планшет инкубировали при 37°С в присутствии 5% CO2 в течение 1,5 ч с последующим добавлением 15 мкл на лунку аламара голубого и инкубацией в течение ночи. Сигнал флуоресценции измеряли и строили кривую зависимости от концентрации. Полученные данные выявили, что в сравнении с анти-CD20 антителами дикого типа активность CDC слегка выше в случае одинарных аминокислотных вариантов I332D, I332E и значительно выше в случаях повышены Т256Р и S440Y и комбинации Т256Р с I332E. В случае варианта A378D активность CDC снижена (табл. 2).
Пример 5. Характеристика связывания с FcRn
Данный пример описывает анализы связывания рецептора Fc новорожденных (FcRn) с вариантом IgG. На покрытый 96-луночный планшет для ELISA с U-образным дном (Costar) наносили 50 мкл на лунку 2 мкг/мл Нейтравидина (Pierce Biotechnology, кат. №31000) в 50 мМ карбонатного буфера (рН 9,3) при 4°С в течение ночи. Несвязанный Нейтравидин удаляли и планшет трижды промывали FBST (FBS, содержащий 0,1% Твина 20). 50 мкл на лунку меченого биотином растворимого FcRn при 2,5 мкг/мл в FBS наносили и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. 75 мкл казеинового блокирующего буфера (Pierce Biotechnology, кат. №37528) затем добавляли на планшет на 1 ч. Затем планшет ELISA промывали PBST и инкубировали с 50 мкл на лунку варианта IgG. Для построения кривой титрования вариант IgG готовили путем 3-кратного серийного разведения в буфере связывания с FcRn (100 мМ NaPO4, 0,05% Твина 20 при различных рН (от 6,0 до 7,4)). Для одноточечного скрининга временно экспрессированный вариант IgG в супернатанте культуры нормализовали до конечной концентрации 50 нг/мл (связывание 200 нг/мл при рН 7,4) и рН доводили с помощью буфера связывания FcRn до 6,0. На следующей стадии буфер связывания FcRn при соответствующих значениях рН использовали для промывания планшета и разбавления реактивов. Реакцию связывания проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. После трех промываний связанный IgG определяли с помощью козьего антитела против человеческого (Fab')2 Fab-HRP конъюгата в течение 1 ч. Активность HRP развивается в субстрате HRP Пирса (Turbo TMB-ELISA, кат. №34022) в течение 5-30 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2 М H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм с помощью микропланшетного ридера VMAX (Molecular Devices).
Пример 6. Лечение человека анти-CD20-I332Е вариантом Fc
Исследования in vitro и на мышиных моделях опухолей (Clynes RA, et al. Nat Med. 6:443 (2000)) обеспечивают доказательство того, что ADCC играет роль в противоопухолевых эффектах анти-CD20 антител, таких как Ритуксан. Пациентов-людей можно лечить вариантом Fc антител анти-CD20-1332Е или Ритуксаном, по способу, сходному с раскрытым в работе Cartron et al., Blood 99:754 (2002), включенной в настоящее описание посредством ссылки. Например, пациентов со стадией II-IV заболевания в соответствии с классификацией Анн-Арбор, которые имеют по меньшей мере один измеряемый очаг заболевания и низкую опухолевую нагрузку в соответствии с критериями GELF, можно лечить в целом приблизительно четырьмя дозами 375 мг/м2 анти-CD20-I332E Fc варианта или Ритуксана, которые вводят внутривенной инфузией (в дни 1, 8, 15 и 22). Первичная конечная точка эффективности представляет собой частоту объективного ответа, т.е. долю пациентов, достигших или полного выздоровления (CR), неподтвержденного CR (Cru), или частичного ответа (PR) в соответствии с критериями, недавно предложенными международным экспертным комитетом. Клинический ответ может быть оценен через 1-2 мес
- 61 -
009746
(М2). Пациенты также могут быть оценены на предмет прогресса через 1 год (М12).
Объективная частота ответа в точках М2 и М12 для пациентов, леченных Ритуксаном или анти-CD20-1332E, может сравниваться таким образом, что улучшенные значения ADCC активности, обеспеченные вариантами I332E, могут быть оценены количественно. Этот пример может быть повторен с другими анти-CD20 вариантами (например, I332D, P247L А330К, А339Т, A378D или комбинаторные, как показано в табл. 1).
Кроме того, повышенная эффективность вариантов может позволять различные способы введения, меньшую частоту инъекций и/или введение меньших доз.
Все публикации и патенты, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящее описание посредством ссылки.
Различные модификации и вариации описанного способа и системы изобретения будут очевидны специалистам в данной области без выхода за рамки объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение, изложенное в пунктах формулы, не должно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Наоборот, подразумевается, что различные модификации описанных режимов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в области химии и молекулярной биологии или родственных областях, подпадают под объем следующей формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, содержащее вариант исходного человеческого участка Fc или его часть, причем вариант содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с исходным участком Fc, причем замена аминокислоты проведена в положении 247 последовательности Fc человека.
2. Антитело по п.1, в котором замена выбрана из группы, состоящей из 247L, 247Н и 247I.
3. Антитело по п.1, в котором по меньшей мере одна замена аминокислоты в варианте участка Fc представляет собой 247I.
4. Антитело по любому из пп.1-3, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии эффекторных клеток более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Fc.
5. Антитело по п.4, причем антитело, содержащее вариант участка Fc, проявляет значения относительной удельной активности ADCC больше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Fc, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.
6. Антитело по любому из пп.1-5, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, опосредует зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) более эффективно, чем антитело, содержащее исходный участок Fc.
7. Антитело по п.6, причем антитело, содержащее вариант исходного участка Fc, проявляет значения относительной удельной активности CDC меньше 100, тогда как антитело, содержащее исходный участок Fc, проявляет относительную удельную активность, равную 100, при измерении в том же анализе.
8. Антитело по любому из пп.1-7, в котором исходный участок Fc относится к классу, выбранному из группы, состоящей из IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.
9. Антитело по любому из пп.1-8, в котором исходный участок Fc относится к подклассу, выбранному из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
10. Антитело по любому из пп.1-9, причем антитело представляет собой моноклональное антитело.
11. Моноклональное антитело по п.10, отличающееся тем, что содержит два идентичных полипептида тяжелой цепи и два идентичных полипептида легкой цепи.
12. Антитело по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что оно специфично связывается с CD20 человека.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-12.
- 62 -
009746
Список последовательностей
<110>
Applied Molecular Evolution
<120>
Варианты участка Fc
<130>
Х-16757
<150>
60/535,764
<151>
2004-01-12
<160>
<170>
Patentln version 3.3
<210>
<211>
2ie
<212>
ЕЕПОК
<213>
Человеческий
<400>
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 15 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 Z70 175
- 63 -
009746
- 64 -
009746
- 65 -
009746
- 66 -
009746
- 67 -
009746
- 68 -
009746
- 69 -
009746
- 70 -
009746
- 71 -
009746
- 72 -
009746
- 73 -
009746
- 74 -
009746
- 75 -
009746
- 76 -
009746
- 77 -
009746
- 78 -
009746
<210> 30
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Человеческий
<400> 30
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Asp Val Glu Trp Glu 15 10 15
Ser Asn Gly Gin Pro Glu
<210> 31
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Человеческий
<400> 31
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Tyr
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 20
<210> 32
<211> 990
<212> ДНК
<213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ
<400> 32
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ISO
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 24 0
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 460
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagqc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggacgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 7Я0
- 79 -
009746
- 80 -
009746
- 81 -
009746
- 82 -
009746
- 83 -
009746
<400> 55
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgacgtgg agtgggagag caatgggcag 60 ccggag 66
<210> 56
<211> 69
<212> ДНК
<213> ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ
<400> 56
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac ccgggtaaa cactacacgc agaagtacct ctccctgtct 60
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 84 -