1. Консенсусные праймеры для гена L1 папилломавируса человека (ПВЧ), которые содержат одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 37-40 или SEQ ID NO: 70-72.

2. Специфичные по типу вируса праймеры для гена L1 папилломавируса человека (ПВЧ), которые содержат одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 1-36.

3. Амплификационная смесь праймеров, которая состоит из L1C1, L1C2 или neewL1С2 праймеров (SEQ ID NOS: 73-75): SEQ ID NOS: 37-40 и SEQ ID NO: 35 и возможно дополнительно содержит один или несколько праймеров, которые выбраны из группы, включающей SEQ ID NOS: 70-72, SEQ ID NOS: 1-34 и 36.

4. Применение смеси праймеров по п.3 для амплификации следующих вариантов генотипа папилломавируса человека: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77.

5. Ампликон, который может быть получен путем амплификации с применением смеси праймеров по п.3, за исключением ампликонов папилломавируса человека следующих типов: HPV-6, -11, -16, -18,
-31, -33, -42, -52 и -58.

6. Ампликон по п.5, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 112-120.

7. Геномная область ампликонов следующих вариантов генотипа ПВЧ: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77, отличающаяся тем, что представляет собой характерный участок данных ампликонов, полученный путем амплификации с использованием смеси праймеров по п.3, причем данный геномный участок представляет собой вариабельный участок генома, характерный для индивидуальных вариантов генотипа ПВЧ и содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111.

8. Геномная область ампликона, полученная путем специфичной амплификации с использованием смеси праймеров по п.3, которая представляет собой консенсусный участок генома ПВЧ и имеет одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.

9. Гибридизационный зонд, который является генотип-специфичным для ПВЧ и гибридизуется с одной из последовательностей по п.7 и содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 50-67.

10. Гибридизационный зонд или праймер, который является консенсусным зондом или праймером для ПВЧ и гибридизуется с одной из последовательностей по п.8 и имеет одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 41-49.

11. Гибридизационный зонд по п.9 или 10, отличающийся тем, что представляет собой молекулу ДНК, РНК или PNA.

12. Способ обнаружения одного или нескольких вариантов генотипа ПВЧ из биологических образцов, который включает следующие стадии:

а) получение одного или нескольких ампликонов при использовании смеси праймеров по п.3 и выделенных из биологического образца молекул нуклеиновых кислот и

b1) гибридизацию ампликона полученного согласно (а) в строгих условиях с гибридизационным зондом, специфичным по роду ПВЧ; и/или

b2) гибридизацию ампликона, полученного согласно (а) в строгих условиях с гибридизационным зондом, специфичным по варианту генотипа ПВЧ.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный гибридизационный зонд, специфичный по роду ПВЧ, представляет собой зонд по п.10.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный гибридизационный зонд, специфичный по варианту генотипа ПВЧ, представляет собой зонд по п.9.

15. Способ по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что детектируют группы генотипов ПВЧ, относящихся к низкой или высокой степени риска.

16. Способ по любому из пп.12-15, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию обнаружения синтетического нуклеотида, используемого в качестве внутреннего контроля.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что в качестве внутреннего контроля используют последовательность SEQ ID NO: 68, а при ее обнаружении в качестве гибридизационного зонда используют последовательность SEQ ID NO: 69.

18. Набор реактивов для обнаружения и типирования ПВЧ, который содержит:

i) праймеры согласно п.1 или 2 и/или смесь праймеров по п.3;

ii) праймер для внутреннего контроля (если необходимо);

iii) гибридизационные зонды согласно п.9 или 10;

iv) гибридизационные зонды для обнаружения внутреннего контроля (если необходимо).

 

(57) Реферат / Формула:
Консенсусные праймеры для гена L1 папилломавируса человека (ПВЧ), которые содержат одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 37-40 или SEQ ID NO: 70-72.

2. Специфичные по типу вируса праймеры для гена L1 папилломавируса человека (ПВЧ), которые содержат одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 1-36.

3. Амплификационная смесь праймеров, которая состоит из L1C1, L1C2 или neewL1С2 праймеров (SEQ ID NOS: 73-75): SEQ ID NOS: 37-40 и SEQ ID NO: 35 и возможно дополнительно содержит один или несколько праймеров, которые выбраны из группы, включающей SEQ ID NOS: 70-72, SEQ ID NOS: 1-34 и 36.

4. Применение смеси праймеров по п.3 для амплификации следующих вариантов генотипа папилломавируса человека: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77.

5. Ампликон, который может быть получен путем амплификации с применением смеси праймеров по п.3, за исключением ампликонов папилломавируса человека следующих типов: HPV-6, -11, -16, -18,
-31, -33, -42, -52 и -58.

6. Ампликон по п.5, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 112-120.

7. Геномная область ампликонов следующих вариантов генотипа ПВЧ: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77, отличающаяся тем, что представляет собой характерный участок данных ампликонов, полученный путем амплификации с использованием смеси праймеров по п.3, причем данный геномный участок представляет собой вариабельный участок генома, характерный для индивидуальных вариантов генотипа ПВЧ и содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111.

8. Геномная область ампликона, полученная путем специфичной амплификации с использованием смеси праймеров по п.3, которая представляет собой консенсусный участок генома ПВЧ и имеет одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.

9. Гибридизационный зонд, который является генотип-специфичным для ПВЧ и гибридизуется с одной из последовательностей по п.7 и содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 50-67.

10. Гибридизационный зонд или праймер, который является консенсусным зондом или праймером для ПВЧ и гибридизуется с одной из последовательностей по п.8 и имеет одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 41-49.

11. Гибридизационный зонд по п.9 или 10, отличающийся тем, что представляет собой молекулу ДНК, РНК или PNA.

12. Способ обнаружения одного или нескольких вариантов генотипа ПВЧ из биологических образцов, который включает следующие стадии:

а) получение одного или нескольких ампликонов при использовании смеси праймеров по п.3 и выделенных из биологического образца молекул нуклеиновых кислот и

b1) гибридизацию ампликона полученного согласно (а) в строгих условиях с гибридизационным зондом, специфичным по роду ПВЧ; и/или

b2) гибридизацию ампликона, полученного согласно (а) в строгих условиях с гибридизационным зондом, специфичным по варианту генотипа ПВЧ.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный гибридизационный зонд, специфичный по роду ПВЧ, представляет собой зонд по п.10.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный гибридизационный зонд, специфичный по варианту генотипа ПВЧ, представляет собой зонд по п.9.

15. Способ по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что детектируют группы генотипов ПВЧ, относящихся к низкой или высокой степени риска.

16. Способ по любому из пп.12-15, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию обнаружения синтетического нуклеотида, используемого в качестве внутреннего контроля.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что в качестве внутреннего контроля используют последовательность SEQ ID NO: 68, а при ее обнаружении в качестве гибридизационного зонда используют последовательность SEQ ID NO: 69.

18. Набор реактивов для обнаружения и типирования ПВЧ, который содержит:

i) праймеры согласно п.1 или 2 и/или смесь праймеров по п.3;

ii) праймер для внутреннего контроля (если необходимо);

iii) гибридизационные зонды согласно п.9 или 10;

iv) гибридизационные зонды для обнаружения внутреннего контроля (если необходимо).

 

---

008388
Область техники
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу обнаружения и генотипирования папил-ломавируса человека - ПВЧ.
Согласно одному аспекту изобретения определяют участки генома ПВЧ, которые подходят для создания видо-специфических и генотип-специфичных гибридизационных олигонуклеотидных зондов ПВЧ и которые преимущественно расположены близко друг к другу и в рамках одного ампликона.
Согласно другому аспекту изобретения предложена последовательность видо-специфических и генотип-специфических зондов.
Согласно еще одному аспекту изобретения предложены оптимизированные составы реагентов и способ, которые можно использовать для амплификации и обнаружения расширенного набора генотипов ПВЧ ("набор", "kit").
Уровень техники
Согласно литературным данным определено множество последовательностей (геномов) папилло-мавирусов, см., например, следующие публикации, включенные в настоящее описание по ссылке: HPV-6: de Villiers et al., J. Virology, 40 (1981); HPV-11: Dartmann et al., Virology 151, 124-130 (1986); HPV-16: Seedorf et al., Virology 145, 181-185 (1985); HPV-18: Cole and Danos, Journal of Molecular Biology 93, 599608 (1987); HPV-31: Goldsborough et al., Virology 171, 306-311 (1989); HPV-33: Cole and Streeck, J. Virology, 58, 991-995 (1986); HPV-54: Favre et al., J. Cancer 45, 40-46 (1990); HPV-56: Lorincz, J., Gen. Virol. 70,
3099(1989).
Во многих публикациях описаны способы обнаружения и определения типа ПВЧ, наряду с блот-тингом по Саузерну и другими гибридизационными методиками, при этом наиболее широко применяют методику полимеразной цепной реакции - ПЦР, поскольку эта методика обеспечивает одновременно и высокую чувствительность, и специфичность, и кроме того, ее можно легко адаптировать согласно требованиям анализа.
Папилломавирус человека, представитель семейства Papilloma viridae, является ДНК-содержащим онковирусом с кольцевым геномом размером около 8000 Ьр. Вирусу свойственен сильный тропизм к эпителиальным клеткам, и его пролиферацию наблюдают только в дифференцированных эпителиальных клетках. Предполагают, что папилломавирус является этиологическим фактором при развитии многих заболеваний человека, например, при возникновении многих кожных заболеваний, например бородавок, condyloma acuminatum (остроконечной кондиломы) и опухолей кожи и других состояний, например, таких как цервикальная карцинома, аногенитальная карцинома, карцинома гортани. Известно, что папил-ломавирус человека имеет прямое отношение к возникновению этих видов опухолей, так же как и некоторых предраковых состояний (CIN, VIN, VAIN, PIN, PAIN). ПВЧ обнаруживают у 99% пациентов, страдающих цервикальной карциномой. Вероятно, эта статистическая зависимость обусловлена тем, что ПВЧ является причиной возникновения цервикальной карциномы. В то же время, из эпидемиологических данных следует, что у пациентов, инфицированных ПВЧ различных генотипов, степень риска развития цервикальной карциномы не одинакова. На этом основании генотипы классифицируют по группам низкого, среднего и высокого риска, кроме того существуют и не классифицированные генотипы. Поскольку степень риска варьирует в широких пределах, а носители ПВЧ встречаются довольно часто, определение варианта генотипа вируса чрезвычайно важно.
Вирус ПВЧ невозможно культивировать. При диагностике ПВЧ используют серологические тесты, применение которых ограничено детекцией присутствия вируса (текущая или прошлая инфекция), но с помощью которых не могут с точностью определять вариант генотипа, поэтому применение таких тестов ограничено в основном эпидемиологическими исследованиями.
Серологической классификации папилломавирусов (серотипирования) не существует, поэтому для их классификации в основном используют генотипирование. Эти методы разделяют на две группы, в соответствии с тем, проводится ли амплификация перед детекцией, или не проводится. В последнем случае, одним из вариантов является использование в качестве зондов полноразмерных геномных РНК для обнаружения денатурированных ДНК геномов ПВЧ, с последующим выявлением гетеродуплекса специфичными антителами (Hybrid Capture - Digene). Согласно другому способу, для обнаружения и определения различных вариантов генотипа ПВЧ применяют технику блоттинга по Саузерну. Недостатками этих способов являются слабая чувствительность и частичное отсутствие специфичности. Многие публикации сообщают о различных кросс-реакциях, проходящих при применении способа Hybrid Capture и приводящих к появлению ложных положительных результатов при анализе в клинических условиях. Авторы сообщают, что при наличии кросс-реакций способ приемлем только при использовании в качестве контроля высоких концентраций (1 нг/мл) ДНК, что указывает на нежелательную взаимосвязь между чувствительностью и специфичностью метода.
При применении методики амплификации этой проблемы не возникает, поскольку реакцию, обеспечивающую чувствительность (т. е. реакцию амплификации) проводят отдельно.
В целом, различные способы амплификации отличаются тем, какие участки генома амплифициру-ют, числом праймеров и применяемым способом обнаружения. Чаще всего используют праймеры GP5+ -GP6+, MY9-MY11 и различные специфичные по типу ПЦР-реакции.
- 1 -
008388
Наиболее часто применяют следующие способы обнаружения: методику последовательность - специфичной (сиквенсспецифичной) гибридизации, анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (restriction fragment length polymorphism, RFLP), и гибридизация с линейно расположенными (на мембране) пробами/зондами (Line Probe Assay, (LiPA). Реже применяют определение последовательности (сик-венирование) ампликонов и определение положений тимидина после включения dUTP (дезоксиуридин-трифосфата).
Аналитические характеристики методов амплификации варьируют в широких пределах. Эти методики можно охарактеризовать по амплифицируемым вариантам генотипа, аналитической чувствительности при амплификации генотипов и специфичности и надежности обнаружения.
В этой области эталонной реакцией считается система вырожденных праймеров MY9-MY11. Для системы MY9-MY11 существует (коммерческая) система обнаружения способом LiPA (Innogenetics). Основным недостатком системы MY9-MY11 является то, что в ней трудно контролировать вырожденный синтез праймеров, поэтому показатель соотношения вариантов праймеров, полученных в результате синтеза, варьирует от синтеза к синтезу, что может привести к непредсказуемому изменению аналитического поведения ПЦР-метода; во-вторых, реакция MY9-MY11, по сравнению с другими распространенными реакциями, способна амплифицировать меньшее число вариантов генотипа. Из литературы хорошо известно, что данная система может амплифицировать генотип 51 только в случае, если в реакционную смесь будут добавлены праймеры, специфичные для ПВЧ генотипа 51. Кроме того, относительное соотношение вариантов праймеров нельзя изменить и, таким образом, невозможно варьировать соотношение праймеров для достижения большей точности анализа и сбалансированной амплификации различных вариантов генотипа.
Реакция GP5+ - GP6+ решает ту же проблему посредством использования всего двух тщательно подобранных пар праймеров - специфичных к последовательностям генитального ПВЧ - с системами из двух праймеров легко работать, однако, гибкость таких систем ниже. С помощью GP5+ - GP6+ системы, можно амплифицировать множество известных генотипов ПВЧ, однако, аналитические характеристики системы не оптимальны (чувствительность не сбалансирована по различным вариантам генотипа), и систему из двух праймеров трудно оптимизировать, например, в отношении выравнивания чувствительности определения индивидуальных вариантов генотипа (за исключением возможности незначительного изменения температуры плавления праймеров и концентрации Мg2+). Адаптировать систему GP5+ -GP6+ к амплификации других вариантов генотипа трудно, что повлияет несомненно на ее применение в будущем, поскольку необходимость определения новых вариантов генотипа возникает постоянно. Таким образом, проблема идентификации вариантов генотипа не решена адекватно.
Другим широко применямым методом генотип-специфичной амплификации является способ LC1, который представляет собой систему, содержащую два праймера, в двух вариантах, при этом в одном варианте (вместе с LC1 праймером) используется L1C2 или newL1C2 праймер для амплификации дополнительных вариантов генотипа. Подробное описание LC1 ампликона встречается в литературе [Jpn. J. Cancer Research 82, 524-531 (1991)].
Детекция после применения способов амплификации должна отвечать двум основным критериям, а именно, обеспечивать, во-первых, возможность применения в рутинной диагностике (простота, стоимость, продолжительность) и, во-вторых, достаточнаую эффективность различения различных вариантов генотипа (discrimination power). Значительная группа способов не отвечает требованию эффективности различения, в связи с чем использование RFLP ограничено, поскольку из-за короткого амплифицируемо-го участка он содержит недостаточное количество участков рестрикции, необходимых для диагностики, и зачастую генотипы можно классифицировать лишь по группам. Аналогично, результаты способа SSCP сложно интерпретировать и соотнести с конкретными вариантами генотипа, и кроме того, выполнение этих реакций достаточно трудоемко.
Эффективность различения особенно важна с диагностической точки зрения в связи с необходимостью соответствия требованиям контролирующих организаций. С точки зрения соответствия критериям простоты и эффективности различения сиквенирование (определение последовательности) представляет собой идеальный подход, поскольку решена проблема его автоматизации, и с его помощью можно детектировать любые варианты генотипа (и даже их подтипы), если образец не содержит смесь вирусов с различными вариантами генотипа. Но этот подход не так широко применяется на практике из-за высокой стоимости и временных затрат; он не приемлем для обычных диагностических лабораторий, а в случае смешанных образцов не определяется ни один из присутствующих генотипов.
Преимущество способов гибридизации состоит в том, что их эффективность различения или строгость реакции (число детектируемых вариантов генотипа) легко можно изменить, поскольку некоторые параметры реакции можно варьировать в широких пределах; некоторые его разновидности легко автоматизировать, стоимость их ниже, а в случае параллельной реализации (вместе с другими разновидностями) даже время, необходимое для его проведения, незначительно.
Поэтому существует необходимость поиска нового способа выявления ПВЧ посредством амплифи-кации/детекции(обнаружения), в котором устранены недостатки используемых способов, который дешев, легко воспроизводится и автоматизируется. Согласно изобретению предложена система амплифи
- 2 -
008388
кации и гибридизации, в которой праймеры являются независимо синтезируемыми молекулами, поэтому их соотношение легко контролировать и оптимизировать, а амплификация сбалансирована по чувствительности (определения индивидуальных вариантов генотипа). Реакции гибридизации проводят параллельным образом, что согласуется с требованиями низкой стоимости, быстроты, гибкости и возможностей автоматизации реакции.
Сущность изобретения
Согласно одному аспекту настоящее изобретение описывает (и тем самым определяет) участки генома вируса папилломы человека, которые находятся внутри консенсусного ампликона (ампликон - участок ДНК вируса, амплифицируемый при помощи праймеров, связывающихся с консервативными последовательностями, фланкирующими указанный ампликон). При этом данные участки (вирусного) генома содержат генотип-специфичную последовательность ДНК, которую используют для создания генотип-специфичных гибридизационных зондов.
В другом своем аспекте настоящее изобретение описывает (и тем самым определяет) другой участок генома ПВЧ, который также находится внутри данного консенсусного ампликона и содержит родо-специфичную консервативную последовательность ДНК ПВЧ, которую используют для создания родо-специфичных гибридизационных зондов.
Существенным признаком настоящего изобретения является выявление внутри одного консенсус-ного ампликона двух геномных сегментов, которые используют для создания родо- и генотип-специфичных гибридизационных зондов.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение описывает использование праймеров в реакции амплификации. При этом (нуклеотидные) последовательности ДНК (праймеров) и их концентрации, а также условия цикла реакции оптимизируют для сбалансированной чувствительности амплификации по отношению к различным вариантам генотипа папилломавируса человека.
Согласно настоящему изобретению предложены способы обнаружения и генотипирования папил-ломавируса человека (ПВЧ), которые включают в себя следующие этапы:
а) амплифицируют молекулы нуклеиновой кислоты, выделенные из биологических образцов, с помощью смеси праймеров согласно настоящему изобретению с получением двунитевых продуктов амплификации, которые
b1) или гибридизуют в строгих (жестких) условиях с родо-специфичным гибридизационным зондом для ПВЧ, или со смесью таких зондов, при этом детектируют наличие консенсусного ампликона ПВЧ в конкретном образце; и/или
b2) гибридизуют в строгих условиях со смесью генотип-специфичных гибридизационных зондов согласно настоящему изобретению и детектируют (определяют) соответствующие группы генотипов ПВЧ; и/или
b3) гибридизуют в строгих условиях со специфичным по типу гибридизационным зондом или со смесью таких зондов согласно настоящему изобретению, после чего устанавливают наличие и определяют вариант генотипа ПВЧ в конкретном образце.
В целом, способ согласно настоящему изобретению используют для амплификации/детекции некоторой группы генотипов ПВЧ, результатом чего является детектирование геномной ДНК ПВЧ при помощи родо-специфичных зондов, а также коллективное (по группам) или индивидуальное генотипирова-ние геномов ПВЧ. Настоящий способ может быть использован для определения степени риска или для определения принадлежности пациента, инфицированного ПВЧ, к (определенной) группе риска последующего возникновения или развития заболеваний, вызванных или связанных с вирусом ПВЧ, обнаруженным у пациента в данный момент времени, и, в частности, с использованием детекции специфичной по типу вируса. Помимо этого, способ согласно настоящему изобретению используют для скрининга некоторой популяции на наличие ПВЧ и для усиления или подтверждения диагноза, поставленного на основании цитологических исследований, у конкретного индивидуума (скрининг).
Подробное описание изобретения
Для более полного понимания сущности изобретения ниже определены некоторые термины.
Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" обозначают зонды, праймеры, а также другие короткие молекулы ДНК, РНК, PNA (peptide nucleic acid) и иные химические олигомеры, способные сик-венс-специфичным образом связываться с ДНК, РНК или PNA матрицей (молекулами-мишенями).
Термин "гибридизация" относится к сиквенс-специфичному связыванию двух последовательностей нуклеиновых кислот. Используемые условия в значительной степени определяют специфичность (строгость) гибридизации, поэтому при менее строгих условиях гибридизация может осуществляться, даже если нуклеиновые кислоты не являются полностью комплиментарными друг другу. В некоторых случаях необходимо, чтобы зонд нуклеиновой кислоты связывался с набором последовательностей, которые в той или иной степени гомологичны друг другу. Обладание определенными навыками владения технологией, связанной с нуклеиновыми кислотами, позволяет подобрать условия, при выполнении которых связывание будет необходимым образом специфичным или неспецифичным.
Термин "зонд" обозначает набор олигонуклеотидов, которые сиквенс-специфичным образом гибри-дизуются с комплиментарными или частично комплиментарными нуклеиновыми кислотами. Структура
- 3 -
008388
олигонуклеотидов может быть модифицирована с тем, чтобы сделать возможным осуществление этапов, следующих за гибридизацией, или для изменения их гибридизационных свойств.
Термин "специфичный по типу вируса зонд" относят к набору олигонуклеотидов, которые при строгих условиях (гибридизации) связываются только с полностью комплиментарным им участком-мишенью. Условия гибридизации, которые используют для этой задачи, хорошо известны из литературы (см., например, Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. USA). При этом, как правило, температуру проведения гибридизации при строгих условиях подбирают таким образом, чтобы она была примерно на 5°С меньше точки плавления (температура плавления) (Тщ) специфичной последовательности с известной ионной силой и рН. При этом ТЩ -это температура (при известных значениях ионной силы и рН), при которой 50% молекул зонда связано с соответствующими комплиментарными молекулами-мишенями. Смягчение строгих условий гибридизации (например, увеличение концентрации соли или уменьшение температуры) делает возможным связывание и не полностью комплиментарных последовательностей. При гибридизации последовательностей, которые не полностью комплиментарны друг другу, нуклеотиды, которые не могут связаться с матричной нуклеиновой кислотой, называют "неспаренными нуклеотидами".
Термин "праймер" относят к нуклеотидам, способным выступать в роли точки инициации синтеза ДНК (праймирование) в условиях, при которых синтез комплиментарного к нити нуклеиновой кислоты продукта реакции удлинения праймера инициируется на матрице нуклеиновой кислоты, т.е. в присутствии четырех различных нуклеозид трифосфатов и агента для полимеризации (т. е. ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы) в соответствующем буфере и при подходящей температуре. Как правило, праймер - это однонитевая молекула ДНК. Длина праймера обычно варьирует в пределах от 15 до 40 нуклеотидов. Праймер не обязательно точно соответствует последовательности матрицы, поэтому при изменении температуры связывания (температуры реакции) группа схожих молекул-мишеней может выступать в качестве матрицы (консенсусный ампликон) для синтеза. Химические группы с определенными полезными характеристиками используют для мечения олигонуклеотидного праймера для того, чтобы праймер получил возможность связываться с твердым носителем, а также для других целей.
В настоящем изобретении термин "праймер" также относят к группе олигонуклеотидов, обладающих схожей последовательностью, при этом указанная группа олигонуклеотидов способна выступать в роли праймеров (в вышеописанном значении) на определенном наборе матричных последовательностей. Кроме того, члены этой группы могут представлять собой олигонуклеотиды, которые образуют неспа-ренные участки (нуклеотиды) с некоторыми или со всеми представителями заданного набора матричных нуклеиновых кислот. Но при соответствующих условиях данные праймеры также участвуют в прайми-ровании. Термин "консенсусные праймеры" относится к праймеру или группе праймеров, которые используют для праймирования определенных участков, родственных матричных нуклеиновых кислот. Особенность данных участков заключается в том, что их вариабельность значительно ниже, чем вариабельность нуклеиновой кислоты в целом, т. е. они являются консервативными, и поэтому на этих последовательностях при помощи подобранного набора консенсусных праймеров осуществляют праймирова-ние для всей группы матричных последовательностей нуклеиновых кислот. Консенсусный праймер может быть как единичным праймером, так и группой праймеров.
Термин "фермент термостабильная полимераза" относят к ферменту, который относительно стабилен при 95°С и катализирует полимеризацию нуклеозид трифосфатов с образованием продуктов реакции удлинения праймера, комплиментарных одной из нитей последовательности-мишени. Очищенный фермент термостабилен посредством ссылки и коммерчески доступен, например, от Applera.
В настоящем изобретении амплификацию ДНК осуществляют при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанной в патентах США 4683195, 4683202 и 4965188.
Для амплификации большого количества различных генотипов ПВЧ настоящее изобретение оптимизирует условия проведения ПЦР, за счет оптимизации концентрации праймеров, последовательности праймеров и условий цикла. Первую часть амплификации осуществляют с постоянно возрастающей строгостью (условий гибридизации) с той целью, чтобы амплификация генотипов, для которых прайме-ры содержат больше неспаренных нуклеотидов, начиналась с той же эффективностью, что и амплификация остальных генотипов. Далее увеличивают температуру связывания, что изменяет реакцию таким образом, что в реакции используются праймеры, находящиеся в большем количестве. Теоретически, с оптимизированной смесью праймеров данный процесс приводит к тому, что в качестве последовательности связывания праймеров начинает выступать консенсусная последовательность, что, таким образом, создает возможность осуществления сбалансированной по чувствительности амплификации различных генотипов.
Несмотря на то, что полимеразная цепная реакция является предпочтительным способом амплификации, описанные геномные участки и нуклеотиды используют и в других известных способах. Например, лигазная цепная реакция (Wu and Wallace 1989, Genomics 4:560-569), система амплификации TAS (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177) и самоподдерживаемая репликация последовательностей нуклеиновых кислот (Guatelli et. al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878) также могут быть использованы для правильной амплификации последовательности-мишени. Также сиквенс
- 4 -
008388
специфичные зонды могут быть амплифицированы в системе, использующей QP-репликазу (Kramer and Lizardi, 1989, Nature 339:401-402).
Согласно настоящему изобретению праймеры выбирают из группы более или менее комплиментарных последовательностей, которые подходят для амплификации консенсусных ампликонов ПВЧ. В условиях наличия неспаренных нуклеотидов эффективное праймирование достигается при помощи аккуратного подбора температур отжига и относительных концентраций праймеров.
В предпочтительном способе реализации настоящего изобретения праймеры (SEQ. ID. NO: 1-40, 7072) согласно настоящему изобретению используют с уже известными праймерами (SEQ. ID. NO: 73-75) в форме соответствующих реактивов. Это позволяет детектировать расширенный набор генотипов ПВЧ, по крайней мере 47 известных генотипов. Из примера 4 видно, что согласно изобретению амплификацию генотипа ПВЧ-35 осуществляют при использовании в реакции праймера SEQ. ID. NO. 37. Если в реакции присутствуют только известные праймеры, а этого праймера нет, генотип ПВЧ-35 не амплифицируется. В другом своем аспекте настоящее изобретение описывает праймеры, специфичные по типу для гена L1 ПВЧ, которые содержат нуклеотидные последовательности, описанные в SEQ. ID. NO: 1-36.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена смесь праймеров, содержащая праймеры L1C1, L1C2 или newL1C2, а также праймеры, которые выбраны из SEQ. ID. NO: 1-40, 70-72. Кроме этого, настоящее изобретение относится к применению такой смеси праймеров для амплификации генотипов ПВЧ 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77.
Согласно другому аспекту изобретения предложены ампликоны, которые получают в процессе амплификации согласно настоящему изобретению с использованием смеси упоминаемых выше праймеров, за исключением ампликонов HPV-6, -11, -16, -18, -31, -33, -42, -52 и -58.
Существенным признаком данного изобретения является присутствие общих (для различных вариантов генотипа ПВЧ), а также специфичных по типу вируса, геномных сегментов внутри указанных ам-пликонов. Эти геномные сегменты позволяют осуществлять высокоспецифичную гибридизацию и детекции. Таким образом, настоящее изобретение также относится к геномному сегменту ампликонов, который характеризуется разнообразными (вариабельными) генотип-специфичными геномными участками, расположенными в 3' - 5' направлении от 3'-конца ампликона (в 3' - 5' направлении) в области с -80 пары нуклеотидов (п.н.) по -30 п.н. Эти геномные двунитевые участки (вирусной) ДНК имеют длину около 40 п.н., а их последовательности приведены в SEQ. ID. NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение описывает другой геномный сегмент амплико-нов, который простирается в 3' - 5' направлении от 3'-конца ампликона в области с -150 по -105 п.н. Данный геномный сегмент характеризуется последовательностями ДНК с простой структурой, которые имеют высокую консервативность между генотипами ПВЧ. Данные сегменты обладают общей специфичностью по роду ПВЧ. Данные двунитевые геномные участки (вирусной) ДНК как правило содержат 23 п. н., а их верхняя нить имеет одну из следующих последовательностей: SEQ. ID. NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.
Во время гибридизационной детекции ампликонов используют зонды общей специфичности или специфичные по типу вируса гибридизационные зонды, разработанные для геномных сегментов, описанных выше. Олигонуклеотидные зонды общей специфичности обычно используют для обнаружения ампликона ПВЧ, который представляет собой амплифицированную ДНК ПВЧ, тогда как зонды, специфичные по типу вируса, используют для последующей детекции индивидуальных генотипов. И те, и другие зонды могут являться молекулами ДНК, РНК или PNA.
Зонды общей специфичности, которые используют в способе согласно настоящему изобретению, имеют свойства, схожие со свойствами консенсусных праймеров, с тем отличием, что область их 5'-конца не является предпочтительной для расположения неспаренных нуклеотидных пар. В настоящем изобретении их используют в качестве зондов, но эти видоспецифичные зонды могут быть использованы как в качестве гибридизационных зондов, так и в качестве праймеров.
Поэтому изобретение относится к гибридизационным зондам или праймерам общей специфичности (консенсусным), которые содержат одну из последовательностей, указанных в SEQ. ID. NO: 41-49.
В предпочтительном способе согласно настоящему изобретению в качестве зондов общей специфичности используют следующие зонды: SEQ. ID. NO: 41-49.
Зонды, специфичные по типу вируса, на 100% комплиментарны последовательности соответствующего генотипа. Их конструируют таким образом, чтобы исключить возможность того, что другие генотипы будут иметь высокий уровень комплиментарности с зондом целиком или с какой-либо его частью. Поскольку в ампликонах согласно настоящему изобретению специфичный по типу вируса сегмент имеет длину около 40 п. н., существует возможность подбора зондов, наиболее подходящих как теоретически, так и экспериментально, даже если их последовательности перекрываются. В примере 5 показано, что необходимые для решения конкретной задачи зонды могут быть сконструированы и использованы, причем эти зонды имеют высокую специфичность (по сравнению с 70 изученными генотипами), которую они сохраняют даже при комнатной температуре при используемых условиях гибридизации. Поскольку
- 5 -
008388
гибридизация разных зондов проходит специфично при одних и тех же условиях гибридизации, можно также использовать смесь зондов. Поэтому с точки зрения практического применения можно использовать более унифицированные условия реакции. Таким образом, изобретение описывает последовательности специфичных по типу вируса зондов, которые можно использовать для амплификации ПВЧ, а также для тестов на обнаружение и определение варианта генотипа вируса. Последовательности этих зондов приведены в SEQ. ID. NO: 50-67.
Хотя настоящее изобретение описывает различные варианты гибридизации, предпочтение из коммерческих соображений отдается твердофазной гибридизации.
В процессе так называемой твердофазной (прямой) гибридизации происходит связывание зондов с иммобилизованной нуклеиновой кислотой-мишенью (ампликоном), тогда как при обратной гибридизации нуклеиновая кислота (ампликон) связывается с иммобилизованными зондами. Несвязавшиеся продукты реакции удаляют в процессе отмывки различными растворами. Для последующего обнаружения в случае прямой гибридизации в зонды вводят метку, тогда как при обратной гибридизации метят ампли-кон. При работе с обеими системами используют микротитр-планшеты. Поскольку возможности иммобилизации ограничены, в настоящем исследовании в основном используют системы прямой гибридизации, так как при этом используют смесь зондов, которая содержит большое количество индивидуальных (вариантов) зондов.
Также используют способ, описанный в US 6214979. При этом зонды добавляют в реакцию во время амплификации. Благодаря своей 5'-3' экзонуклеазной активности Taq-полимераза расщепляет зонды, а образовавшиеся продукты расщепления используют для обнаружения наличия нуклеиновой кислоты-мишени. Также известны другие, так называемые системы "детектирования в реальном времени", которые, главным образом, основаны на гибридизации. Данные системы отличаются только по виду их осуществления и способу обнаружения, но не отличаются по тому, как реализуется теоретически различное сиквенс-специфичное связывание зонда с ампликоном.
Для иммобилизации ампликонов они могут быть помечены. В настоящем изобретении из разных способов мечения отдают предпочтение мечению праймеров биотином. При этом меченные праймеры используют в реакции амплификации. В присутствии авидина или стрептавидина, абсорбированного на твердой фазе, биотин иммобилизует ампликон за счет высокоспецифичного и очень стабильного связывания авидина с биотином. В данной реакции биотинилируются только те праймеры, которые гибриди-зуются либо с одной, либо с другой нитью, таким образом, негибридизуемая нить может быть удалена до гибридизации.
Зонды могут быть помечены с целью последующей детекции. При этом метки детектируют при помощи различных способов, основанных на флуоресценции, радиоактивности, колориметрии, дифракции Х-лучей, абсорбции, магнетизме, ферментативной активности и т. д. Поэтому для мечения используют флуорофоры, хромофоры, изотопы, электроплотные вещества, ферменты или лиганды, способные осуществлять специфичное связывание и другие системы. Помимо этого также могут быть использованы комбинации описанных выше систем. В настоящем изобретении отдается предпочтение специфичному связыванию флуоресцеина с антителами к флуоресцеину, конъюгированными с пероксидазой хрена (anti-fluorescein-HRPO antibody), которую детектируют при помощи реакции окисления ферментом пероксидазой хрена в присутствии НРРА-субстрата и Н2О2 (см. пример 2). В настоящем изобретении используют биотинилированные прямые и обратные праймеры. Как меченые зонды, так и антитела anti-fluorescein-HRPO коммерчески доступны. Также широко доступны и химические реактивы, необходимые для отмывок и приготовления различных растворов. Кроме этого, также можно конструировать и применять систему, использующую щелочную фосфатазу или какой-либо другой фермент, активность которого может быть детектирована. Для применения системы в медицинской диагностике для детекции, помимо флуоресцентной детекции, также используют люминометрию и колориметрию.
При использовании способа согласно настоящему изобретению для диагностики вводят внутренний контроль, который позволяет выявлять ложные негативные реакции (ложные отрицательные результаты), что с точки зрения диагностики является предпочтительным. Для внутреннего контроля используют различные искусственные или природные молекулы ДНК. Причем предпочтение отдают тем системам, которые не увеличивают числа используемых в реакции праймеров и в которых количество и аналитические свойства нуклеиновой кислоты-мишени, используемой для внутреннего контроля, соответствующим образом стандартизированы. В настоящем изобретении к образцу добавляют искусственную последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ. ID. NO: 68) в виде рекомбинантной плазмиды (пример 6). В настоящем изобретении детекцию внутреннего контроля осуществляют параллельно с гибридизацион-ной детекцией ДНК ПВЧ, только субстраты для этих детекций готовят раздельно. Зонд метят дигитокси-генином (SEQ. ID. NO: 69), а его детекцию проводят при помощи антител к дигитоксигенину, конъюги-рованных с щелочной фосфатазой. Однако для детекции внутреннего контроля также используют и другие способы обнаружения.
Детекцию внутреннего контроля также проводят, используя различия в подвижности (образцов), при помощи электрофореза в агарозном геле или другого подходящего метода.
Используемый для амплификации и обнаружения ДНК ПВЧ способ согласно настоящему изобре
- 6 -
008388
тению подходит для создания гармонизированного набора реактивов. В этом виде указанный набор содержит или все перечисленные ниже компоненты: праймеры, смесь праймеров, буферные растворы, термостабильную полимеразу, позитивный контроль ДНК ПВЧ, ДНК, не имеющую отношения к ПВЧ, ДНК для внутреннего контроля, зонды или смесь зондов, антитела, конъюгированные с ферментами, или какую-либо их комбинацию с другими реактивами.
Описание последовательностей праймеров и зондов согласно настоящему изобретению носит лишь иллюстративный характер. При помощи общей или специфичной по типу вируса геномной области ПВЧ может быть разработано множество вариантов как зондов общей специфичности, так и специфичных по типу вируса, зондов. Все эти варианты, так же как и варианты геномных участков, которые выбирают согласно настоящему изобретению, попадают в обасть охвата настоящего изобретения.
Далее приведено более подробное описание изобретения посредством примеров. Несмотря на то, что способ, лежащий в основе изобретения, применим для амплификации любого генома ПВЧ, в последующих примерах используют геномы только генитальных форм ПВЧ, которые с медицинской точки зрения представляют наибольший интерес. Необходимо отметить, что примеры носят только иллюстративный характер и не ограничивают область охвата изобретения.
Пример 1. Синтез олигонуклеотидных праймеров.
Олигонуклеотидные праймеры, которые используют в способе согласно настоящему изобретению, были синтезированы на заказ фирмой IDT, USA. К 5'-концу праймеров были пришиты аминогруппы. Сложный эфир NHS использовали для мечения биотином, флуоресцеином и дигитоксигенином. Меченые нуклеотиды очищали при помощи HPLC.
Пример 2. Обработка образцов, приготовление ДНК.
Образцы были взяты гинекологами при помощи щеточки Cytobrush, далее образцы помещали в буферный раствор PBS (10 мМ фосфатный буфер (Phosphate buffered Saline) pH=7,4, Sigma, NaCl 138 мМ, KCl 2,7 мМ). Проводили следующую предварительную обработку образцов в пробирках: перед лизисом образцы центрифугировали (10 мин при 2000 g), убирали надосадочную жидкость и добавляли 1 мл раствора PBS, далее вортексировали, снова центрифугировали и убирали надосадочную жидкость. После этого к образцам добавляли 250 мкл лизирующего раствора (Proteinase-K 0,5 мг/мл, 0,01 М TRIS-HCl рН=8, 0,001 М EDTA рН=8, в дистиллированной воде), содержащий также внутренний контроль ПВЧ-теста (SEQ: ID. NO: 68). Далее образцы вортексировали и инкубировали 30 мин при 56°С. Начиная с этого момента все последующие манипуляции (с образцами), осуществляли при помощи автомата TECAN RSP150. Добавляли связывающий раствор (5,5 М GUSCN, 20 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН=6,5, 65 млМ дитиотреитол, силикат 40 г/л, SIGMA Cat. No.: 28,851-3, дистиллированная вода) и отделяли силикат от растворимых компонентов при помощи вакуумной фильтрации. Далее, используя вакуумную фильтрацию, силикат дважды промывали связывающим раствором без силиката (5,5 М GUSCN, 20 мМ EDTA, 10 мМ TRIS-HCl рН=6,5, 65 мМ дитиотреитол, дистиллированная вода) в объеме 200 мкл, дважды раствором для промывки (1/4 об. изопропиловый спирт, 1/4 об. 96% этанол, 1/2 об. дистиллированная вода, 0,1 М NaCl) в объеме 200 мкл и после этого 96%-ным этанолом в объеме 200 мкл. Далее силикат высушивали на воздухе и после этого проводили элюцию ДНК в 200 мкл 10 M раствора TRIS, рН=8,0. Элюированную ДНК хранили для последующего использования при -20°С.
Пример 3. Общее описание способа обнаружения ПВЧ.
Амплификация.
Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал следующие компоненты: 10 мкл ДНК, 2,5 мкл 10Х полимеразного буфера (конечные концентрации: 10 мМ TRIS-HCl (рН=9,0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100 (Promega), 2 мМ MgCl2, 250 мМ каждого dNTP (ATP, CTP, GTP, ТТР), 4 мкМ смеси праймеров: SEQ. ID. NO: 35, 37-40, 73-75, и 1 единицу (U) ДНК-полимеразы Taq (Promega). Реакцию проводили в ПЦР-термоциклере GeneAmp 9700 со следующими параметрами:
Цикл 1: 4 мин при 95°С;
Циклы 2-40: 30 с при 94°С, 1 мин при 48°С и 45 с при 72°С; Цикл 41: 3 мин при 72°С. Гибридизация и детекция.
Гибридизацию проводили на твердой фазе. За 24 ч перед использованием 96-луночные (черные) полистиреновые планшеты (Costar) покрывали стрептавидином (0,2 мг/мл стрептавидина в PBS). Планшеты инкубировали 24 ч при комнатной температуре и затем дважды промывали раствором для промывки (25 мМ TRIS рН=7,5, 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 3% Tween-20). К 20 мкл продукта ПЦР-реакции добавляли 140 мкл дистиллированной воды, 5 мкл полученного раствора смешивали с 45 мкл связывающего буфера (25 мМ TRIS рН=7,5, 125 мМ NaCl, 5 мМ EDTA-Na2, 5X раствор Denhardt, 0,1% Tween-20), распределяли по лункам покрытого стрептавидином планшета и инкубировали 30 мин при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Затем к смеси добавляли 50 мкл буфера для элюции (100 мМ NaOH, 300 мМ NaCl) и инкубировали 3 мин при комнатной температуре, после чего планшеты 3 раза промывали раствором для промывки (25 мМ TRIS pH=7,5, 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 3% Tween-20) в объеме 250 мкл. После промывки в лунки добавляли 50 мкл гибридизационного буфера (5xSSC (0,3 М цитрат Na рН=7, 3 М NaCl), раствор 1xDenhardt, 0,1% SDS), содержащего меченые флуоресцеином зонды
- 7 -
008388
(50 нМ каждого зонда). Данную смесь инкубировали 30 мин при 50°С при постоянном встряхивании и 6 раз промывали раствором для усиленной (high stringency) промывки (0,05 х SSC, 0,3% Tween-20). Затем в реакцию добавляли 50 мкл буфера для конъюгации (25 мМ TRIS рН=7,5, 125 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 0,3% Tween-20, 1% BSA), содержащего антитела Anti-Fluorescence-POD (Roche) (0,0015 Е на реакцию). Планшеты инкубировали 30 мин при комнатной температуре со встряхиванием и промывали 6 раз раствором для усиленной промывки (25 мМ TRIS рН=7,5, 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 3% Tween-20). Затем добавляли 135 мкл раствора субстрата (5 об. раствора [45 мМ гидроксифенилпропионовая кислота, hy-droxiphenyl-propionic acid (HPPA), растворенная в буфере 0,1 М TRIS-HCl рН=9,0], + 1 об. [0,6 г/л Н2О2 в 20 мМ цитратно-фосфатном буфере]). Для остановки реакции через 20 мин к реакционной смеси добавляли 65 мкл стоп-раствора (0,75 М глицин рН=10,3). Флуоресцентный сигнал измеряли при помощи флуориметра для планшетов SpectraMax при длинах волн 324/410 нм. Образцы считали положительными, если величина их флуоресцентного сигнала была более чем в три раза выше, чем средняя величина флуоресценции образцов трех независимых негативных контролей. Пример 4. Сравнительный анализ амплификации.
В образцы шприцем вносили плазмиды (10 нг на реакцию), которые содержат клонированные области L1 ПВЧ, принадлежащие разным вариантам генотипа вируса и использовали для амплификации и обнаружения ДНК ПВЧ при помощи способа согласно настоящему изобретению. ПЦР и реакцию гибридизации проводили в соответствии с условиями согласно примеру 3 с тем отличием, что состав прайме-ров был изменен. Реакция в отсутствии праймера L1F2 (SEQ. ID. NO: 37) не приводила к амплификации генотипа ПВЧ 35, тогда как при наличии L1F2 генотип ПВЧ 35 эффективно детектировался.
Пример 5. Детекция различных вариантов генотипа ПВЧ.
В образцы шприцем вносили плазмиды (10 нг на реакцию), которые содержат клонированные области L1 ПВЧ, принадлежащие разным вариантам генотипа вируса и использовали для амплификации и обнаружения ДНК ПВЧ при помощи способа согласно настоящему изобретению. ПЦР и реакцию гибридизации проводили в соответствии с условиями, согласно примеру 3. Затем проводили амплификацию и типирование следующих вариантов генотипа ПВЧ: 1-24, 26-42, 45, 47-68, 72-74, 76-77, 86. При помощи электрофореза в агарозном геле продемонстрировали (выявили) амплификацию следующих вариантов генотипа: 3, 6-7, 10-11, 13-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-36, 39-40, 42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72. При помощи смеси родо-специфичных гибридизационных зондов SEQ. ID. NO: 41-49 (используя условия, согласно примеру 3) удалось детектировать следующие варианты генотипа: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Полученные результаты показывают, что часть вариантов генотипа может быть детектирована только при помощи гибридизации. Это не удивительно, поскольку гибридизация примерно в 10-100 раз более чувствительна, чем электрофорез в агарозном геле. Полученные результаты также говорят о том, что при помощи родо-специфичной гибридизации детектировали не все позитивные генотипы, выявленные при помощи электрофореза в агарозном геле, что свидетельствует об их истинной родо-специфичной природе.
Пример 6. Детекция типа ПВЧ-35.
В образцы шприцем вносили плазмиды (10 нг на реакцию), которые содержат клонированные области L1 ПВЧ, принадлежащие разным вариантам генотипа вируса и использовали для амплификации и обнаружения ДНК ПВЧ при помощи способа согласно настоящему изобретению. ПЦР и реакцию гибридизации проводили в соответствии с условиями, согласно примеру 3. В качестве гибридизационного зонда использовали олигонуклеотид, разработанный для генотипа ПВЧ 35 (SEQ. ID. NO: 58). Затем проводили детекцию ампликонов следующих вариантов генотипа ПВЧ: 3-4, 6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29, 3037, 39-42, 45, 51, 52-55, 58-62, 66-68, 72, 74, 77. Зонд детектировал только ампликон, соответствующий генотипу ПВЧ 35.
Пример 7. Детекция ПВЧ с внутренним контролем.
Детекцию образцов, приготовленных в соответствии с условиями согласно примеру 2, проводили так же, как описано в примере 3, за тем отличием, что использовали зонд внутреннего контроля, меченый дигитоксигенином (его брали в том же количестве, что и зонды, специфичные по типу вируса) с зондами, специфичными по типу вируса. Также отличие от примера 3 заключалось в том, что на стадии конъюгации одновременно присутствовали антитела anti-fluorescein-POD и anti-alp-ALP [1:2000, Jackson Immuno Research]. После проведения реакции (детекции) POD (см. пример 3) проводили реакцию (детекции) ALP согласно следующим условиям: субстратный раствор содержал 6,25 мг на 100 мл 4-метил-умбеллиферил-фосфата в 100 мМ TRIS рН=9,0, 0,5 тМ MgCl2 буферного раствора. После использования НРРА микротитровочные планшеты промывали один раз раствором (25 мМ TRIS рН=7,5, 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 3% Tween-20), после чего в каждую реакционную смесь (ячейку) добавляли по 150 мкл субстратного раствора. Затем 30 мин инкубировали и измеряли флуоресцентный сигнал при помощи флуориметра для планшетов SpectraMax при длинах волн 355/460 нм. Образцы считали положительными, если величина их флуоресцентного сигнала была более чем в три раза выше, чем средняя величина флуоресценции образцов трех независимых негативных контролей.
Специфичные по типу вируса зонды детектировали только соответствующие варианты генотипа. Детекция для внутреннего контроля была положительна во всех реакциях, за исключением тех, в кото
- 8 -
008388
рых возникала сильная конкуренция между амплификацией ПВЧ и внутренним контролем. Ингибиро-ванных реакций не наблюдалось (ДНК ПВЧ или ДНК внутреннего контроля амплифицировались во всех образцах). Внутренний контроль исключал возможность получения ложных негативных результатов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Консенсусные праймеры для гена L1 папилломавируса человека (ПВЧ), которые содержат одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 37-40 или SEQ ID NO: 70-72.
2. Специфичные по типу вируса праймеры для гена L1 папилломавируса человека (ПВЧ), которые содержат одну из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO: 1-36.
3. Амплификационная смесь праймеров, которая состоит из L1C1, L1C2 или neewL1 С2 праймеров
(SEQ ID NOS: 73-75): SEQ ID NOS: 37-40 и SEQ ID NO: 35 и возможно дополнительно содержит один
или несколько праймеров, которые выбраны из группы, включающей SEQ ID NOS: 70-72, SEQ ID NOS: 1-34 и 36.
4. Применение смеси праймеров по п.3 для амплификации следующих вариантов генотипа папил-
ломавируса человека: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39,
39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77.
5. Ампликон, который может быть получен путем амплификации с применением смеси праймеров по п.3, за исключением ампликонов папилломавируса человека следующих типов: HPV-6, -11, -16, -18, -31, -33, -42, -52 и -58.
6. Ампликон по п.5, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 112-120.
7. Геномная область ампликонов следующих вариантов генотипа ПВЧ: 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 или 77, отличающаяся тем, что представляет собой характерный участок данных ампликонов, полученный путем амплификации с использованием смеси праймеров по п.3, причем данный геномный участок представляет собой вариабельный участок генома, характерный для индивидуальных вариантов генотипа ПВЧ и содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111.
8. Геномная область ампликона, полученная путем специфичной амплификации с использованием смеси праймеров по п.3, которая представляет собой консенсусный участок генома ПВЧ и имеет одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.
9. Гибридизационный зонд, который является генотип-специфичным для ПВЧ и гибридизуется с одной из последовательностей по п.7 и содержит одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO:
50-67.
10. Гибридизационный зонд или праймер, который является консенсусным зондом или праймером для ПВЧ и гибридизуется с одной из последовательностей по п.8 и имеет одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 41-49.
11. Гибридизационный зонд по п.9 или 10, отличающийся тем, что представляет собой молекулу
ДНК, РНК или PNA.
12. Способ обнаружения одного или нескольких вариантов генотипа ПВЧ из биологических образцов, который включает следующие стадии:
а) получение одного или нескольких ампликонов при использовании смеси праймеров по п.3 и выделенных из биологического образца молекул нуклеиновых кислот и
b1) гибридизацию ампликона полученного согласно (а) в строгих условиях с гибридизационным зондом, специфичным по роду ПВЧ; и/или
b2) гибридизацию ампликона, полученного согласно (а) в строгих условиях с гибридизационным зондом, специфичным по варианту генотипа ПВЧ.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный гибридизационный зонд, специфичный по роду ПВЧ, представляет собой зонд по п.10.
14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный гибридизационный зонд, специфичный по варианту генотипа ПВЧ, представляет собой зонд по п.9.
15. Способ по любому из пп.12-14, отличающийся тем, что детектируют группы генотипов ПВЧ, относящихся к низкой или высокой степени риска.
16. Способ по любому из пп.12-15, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию обнаружения синтетического нуклеотида, используемого в качестве внутреннего контроля.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что в качестве внутреннего контроля используют последовательность SEQ ID NO: 68, а при ее обнаружении в качестве гибридизационного зонда используют последовательность SEQ ID NO: 69.
18. Набор реактивов для обнаружения и типирования ПВЧ, который содержит: i) праймеры согласно п.1 или 2 и/или смесь праймеров по п.3;
- 9 -
008388
ii) праймер для внутреннего контроля (если необходимо);
iii) гибридизационные зонды согласно п.9 или 10;
iv) гибридизационные зонды для обнаружения внутреннего контроля (если необходимо).
Список последовательностей
<110> Jeney, Csaba Takacs, Tibor
<120> Amplification and hybridisation method for detecting and typing of human papilloma virus
<130> P36945WO
<140> PCT/HU03/00020 <141> 2003-03-10
<150> HU Р0200Э31 <151> 2002-03-14
<160> 120
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<2U> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer (L1CF6)
<400> 1
cgtaaacgta ttcccttatt tttt 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer (L1CR6)
<400> 2
caatacaggg tatttaaggt g 21
<210> 3
<211> 25
<212> DMA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> PCR primer (L1CF11)
<400> 3
cgtaaacgta ttcccttatt tttta 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
- 10 -
008388
- 11 -
008388
- 12 -
008388
- 13 -
008388
- 14 -
008388
- 15 -
008388
- 16 -
008388
- 17 -
008388
- 18 -
008388
- 19 -
008388
- 20 -
008388
- 21 -
008388
- 22 -
008388
- 23 -
008388
- 24 -
008388
- 25 -
008388
- 26 -
008388
- 27 -
008388
- 28 -
008388
- 29 -
008388
- 30 -
008388
- 31 -
008388
- 32 -
008388
<221> misc_feature <223> HPV-4 4 amplicon
<40G> 112
cgtaaacgtg tttccttgtt ttttgcagat gtggcggcct agtgaaaacc aggtatatgt 60
gcctcctccc gccccagtat ccaaagtaat acctacggat gcctatgtca aacgcaccaa 120
catatattac catgctagca gttctagact tcttgctgtg (jgcaaccctt attttgccat 180
acgaccagca aacaagacac ttgtgcctaa ggtttcggga tttcaatata gggtttttaa 240 gatg 24 4
<210> 113
ШЙШ 253
<212> DWA
<213> Human papillomavirus type 35 <220>
<221> misc__f eature
<223> HPV-35 amplicon
<400> 113
cgtaaagcta
tcccatattt
ttttgcagat
gtctctgtgg
cggtctaacg
aagccactgt
ctacctgcct
ccagtgtcag
tgtctaaggt
tgttagcact
gatgaatatg
taacacgcac
120
aaacatctac
tatcatgcag
gcagttctag
gctattagct
gtgggtcacc
catactatgc
180
tattaaaaaa
caagattcta
ataaaatagc
agtacccaag
gtatctggtt
tgcaatacag
240
agtatttaga
gta
253
<210> 114
<21l> 253
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 39
<220>
<221> misc_feature
<223> HPV-39 amplicon
<400> 114
cgtaaacgta
ttccctattt
tttttcagat
ggctatgtgg
cggtctagtg
acagcatggt
gtatttgcct
ccaccttctg
tggcgaaggt
tgtcaatact
gatgattatg
ttacacgcac
120
aggcatatat
tattatgctg
gcagctctag
attattaaca
gtaggacatc
catattttaa
180
agtgggtatg
aatggtggtc
gcaa gcagga
cattccaaag
gtgtctgcat
atcaatatag
240
ggtatttcgc
gtg
253
<210> 115
<211> 256
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 45
- 33 -
008388
<220>
<221> misc_feature <223> HPV-4 5 amplicon
<400> 115
cgtaaacgta ttccctattt ttttgcagat ggctttgtgg cggcctagtg acagtacggt 60
atatcttcca ccaccttctg tggccagagt tgtcagcact gatgattatg tgtctcgcac 120
aagcatattt tatcatgcag gcagttcccg attattaact gtaggcaatc catattttag 180
ggttgtacct aatggtgcag gtaataaaca ggctgttcct aaggtatccg catatcagta 240
tagqgtgttt agagta 256
<210> 116
<211> 250
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 51 <220>
<221> misc^feature
<223> HPV-51 amplicon
<400> 116
cgtaaacgta
taccctattt
ttttacagat
ggcattgtgg
cgcactaatg
acagcaaggt
gtatttgcca
cctgcacctg
tgtctcgaat
tgtgaataca
gaagaatata
tcacacgcac
120
cggcatatat
tactatgcag
gcagttccag
actaataaca
tLaggacat с
cctattttcc
180
aatacctaaa
acctcaacgc
gtgctgctat
tcctaaagta
tctgcatttc
aatacagggt
240
atttagggta
250
<210> 1П
<211> 250
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 56 <220>
<221> misc_feature
<223> HPV-56 amplicon
<400> 117
cgtaaacgta
ttccctattt
ttttgcagat
ggcgacgtgg
cggcctagtg
aaaataaggt
gtatctacct
ccaacacctg
tttcaaaggt
tgtggcaacg
gattcctatg
taaaacgcac
120
tagtatattt
tatcatgcag
gcagttcacg
attgcttgcc
jtaggacatc
cctattactc
iao
tgtgactaag
gacaatacca
aaacaaacat
tcccaaagtt
agtgca tatc
aatatagggt
240
atttagggta
250
<210> 118 ' <211> 253
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 34 -