1. Полипептид, выбранный из группы, состоящей из AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44) и LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 45).

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1.

3. Нуклеиновая кислота по п.2, функционально связанная с последовательностью контроля экспрессии.

4. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.2 или 3.

5. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.2 или 3 или содержащая вектор по п.4.

6. Способ получения полипептида по п.1, предусматривающий стадии:

(a) культивирования клетки-хозяина по п.5 и

(b) извлечения полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.

7. Способ получения антитела, предусматривающий стадии:

(a) иммунизации хозяина полипептидом по п.1 или клеткой-хозяином по п.5 и

(b) извлечения антитела.

8. Антитело, полученное способом по п.7, или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом по п.1, где это антитело не является моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией НВ 7Е11 (АТСС ^R accession No. РТА-4587).

10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело:

(a) ингибирует коллапс конуса роста нейрона;

(b) уменьшает ингибирование выроста и разрастание нейритов в нейроне и

(c) ингибирует связывание Nogo-рецептора-1 с лигандом.

11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где вырост и разрастание нейритов является аксонным ростом.

12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.

13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является моноклональным антителом.

14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является мышиным антителом.

15. Антитело по п.8 или 9, где антитело выбрано из группы, состоящей из гуманизированного антитела, химерного антитела и одноцепочечного антитела.

16. Способ ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования Nogo-рецептора-1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по п.10.

17. Способ по п.16, где лиганд выбран из группы, состоящей из NogoA, NogoB, NogoC, MAG и OM-gp.

18. Способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.

19. Способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.

20. Способ по п.19, где вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.

21. Способ по п.18 или 19, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.

22. Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9.

23. Композиция по п.22, дополнительно содержащая один или несколько дополнительных терапевтических агентов.

24. Способ стимуляции выживания нейрона при риске умирания, предусматривающий контактирование этого нейрона с эффективным количеством антитела или антигенсвязывающего фрагмента против Nogo-рецептора-1 по п.8 или 9.

25. Способ по п.24, где нейрон является нейроном in vitro.

26. Способ по п.24, где нейрон находится в млекопитающем.

27. Способ по п.26, где млекопитающее обнаруживает признаки или симптомы рассеянного склероза, ALS, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматических повреждений головного мозга или повреждения спинного мозга.

28. Способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, где нейрон подвержен риску умирания, предусматривающий:

(a) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9; и

(b) введение этой клетки-хозяина млекопитающему в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона.

29. Способ генотерапии стимуляции выживания нейрона, подверженного риску умирания, который находится в млекопитающем, предусматривающий введение в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется из нуклеотидной последовательности в млекопитающем в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона.

 

(57) Реферат / Формула:
Полипептид, выбранный из группы, состоящей из AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44) и LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 45).

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1.

3. Нуклеиновая кислота по п.2, функционально связанная с последовательностью контроля экспрессии.

4. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.2 или 3.

5. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.2 или 3 или содержащая вектор по п.4.

6. Способ получения полипептида по п.1, предусматривающий стадии:

(a) культивирования клетки-хозяина по п.5 и

(b) извлечения полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.

7. Способ получения антитела, предусматривающий стадии:

(a) иммунизации хозяина полипептидом по п.1 или клеткой-хозяином по п.5 и

(b) извлечения антитела.

8. Антитело, полученное способом по п.7, или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом по п.1, где это антитело не является моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией НВ 7Е11 (АТСС ^R accession No. РТА-4587).

10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело:

(a) ингибирует коллапс конуса роста нейрона;

(b) уменьшает ингибирование выроста и разрастание нейритов в нейроне и

(c) ингибирует связывание Nogo-рецептора-1 с лигандом.

11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где вырост и разрастание нейритов является аксонным ростом.

12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.

13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является моноклональным антителом.

14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является мышиным антителом.

15. Антитело по п.8 или 9, где антитело выбрано из группы, состоящей из гуманизированного антитела, химерного антитела и одноцепочечного антитела.

16. Способ ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования Nogo-рецептора-1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по п.10.

17. Способ по п.16, где лиганд выбран из группы, состоящей из NogoA, NogoB, NogoC, MAG и OM-gp.

18. Способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.

19. Способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.

20. Способ по п.19, где вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.

21. Способ по п.18 или 19, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.

22. Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9.

23. Композиция по п.22, дополнительно содержащая один или несколько дополнительных терапевтических агентов.

24. Способ стимуляции выживания нейрона при риске умирания, предусматривающий контактирование этого нейрона с эффективным количеством антитела или антигенсвязывающего фрагмента против Nogo-рецептора-1 по п.8 или 9.

25. Способ по п.24, где нейрон является нейроном in vitro.

26. Способ по п.24, где нейрон находится в млекопитающем.

27. Способ по п.26, где млекопитающее обнаруживает признаки или симптомы рассеянного склероза, ALS, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматических повреждений головного мозга или повреждения спинного мозга.

28. Способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, где нейрон подвержен риску умирания, предусматривающий:

(a) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9; и

(b) введение этой клетки-хозяина млекопитающему в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона.

29. Способ генотерапии стимуляции выживания нейрона, подверженного риску умирания, который находится в млекопитающем, предусматривающий введение в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется из нуклеотидной последовательности в млекопитающем в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона.

 

---

008253
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к нейробиологии и молекулярной биологии. Более конкретно, данное изобретение относится к иммуногенным полипептидам Nogo-рецептора-!, антителам Nogo-рецепто-ра-1, их антигенсвязывающим фрагментам, растворимым Nogo-рецепторам и их слитым белкам и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Данное изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим такие антитела Nogo-рецептора, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуногенные полипептиды Nogo-рецептора-1, растворимые Nogo-рецепторы и их слитые белки и нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способам получения и применения таких антител Nogo-рецептора, их антигенсвязы-вающих фрагментов, иммуногенных полипептидов Nogo-рецептора-1, растворимых Nogo-рецепторов и их слитых белков и нуклеиновых кислот, кодирующих их.
Уровень техники
Аксоны и дендриты нейронов являются длинными клеточными отростками нейронов. Дистальный кончик простирающегося аксона или нейрита содержит специализированный район, известный как конус роста. Конус роста ощущает локальную среду и направляет рост аксона в направлении клетки-мишени нейрона. Конус роста отвечает на некоторые сигналы окружающей среды, например адгезионную способность поверхности, факторы роста, нейротрансмиттеры и электрические поля. Направление роста в конусе роста включает в себя различные классы молекул адгезии, межклеточные сигналы, а также факторы, которые стимулируют и ингибируют конусы роста. Конус роста растущего нейрита продвигается с различными скоростями, но обычно со скоростью 1-2 мм в день.
Конусы роста имеют форму руки, с широким плоским расширением (микровыступы или филопо-дии), которые дифференциально прикрепляются к поверхностям в эмбрионе. Эти филоподии являются постоянно активными, некоторые филоподии втягиваются обратно в конус роста, тогда как другие продолжают удлиняться через субстрат. Удлинения между различными филоподиями образуют ламеллоподии.
Конус роста исследует зону, которая находится перед ним и на каждой его стороне, при помощи его ламеллоподий и филоподий. Когда удлинение контактирует с поверхностью, которая является неблагоприятной для роста, он отступает. Когда удлинение контактирует с благоприятной поверхностью роста, оно продолжает удлиняться и ведет конус роста в этом направлении. Конус роста может направляться посредством небольших вариаций в свойствах поверхности субстратов. Когда конус роста достигает подходящей клетки-мишени, создается синаптическое соединение.
На функцию нервной клетки сильно влияет контакт между нейроном и другими клетками в его непосредственном окружении (U. Rutishauser, T.M. Jessell, Physiol. Rev. 1988, 68, p. 819). Эти клетки включают в себя специализированные глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и клетки Шванна в периферической нервной системе (ПНС), которые окутывают аксон нейрона миелином (изолирующей структурой многослойных мембран) (G. Lemke, in An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed. [Sinauer, Sunderland, Mass., 1992], p. 281).
Хотя нейроны ЦНС способны регенерироваться после повреждения, они при этом ингибируются вследствие присутствия ингибиторных белков, присутствующих в миелине, и, возможно, также другими типами молекул, обычно обнаруживаемыми в их локальном окружении (Brittis and Flanagan, Neuron 2001, 30, pp. 11-14; Jones et al., J. Neurosci. 2002, 22, pp. 2792-2803; Grimpe et al., J. Neurosci. 2002, 22,
pp. 3144-3160).
Несколько ингибиторных белков миелина, которые были обнаружены на олигодендроцитах, были охарактеризованы, например NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG, McKerracher et al., Neuron 1994, 13, 805811; Mukhopadhyay et al., Neuron 1994, 13, 757-767) и гликопротеин олигодендроцитов (OM-gp. Mikol and Stefansson, J. Cell. Biol. 1988, 106, 1273-1279). Было отдельно показано, что каждый из этих белков является лигандом для нейронного Nogo-рецептора-! (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Liu et al., Science, 2002, 297, 1190-93); Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 2000, 403, 434439; Domeniconi et al., Neuron, 2002, 35, 283-90).
Nogo-рецептор-1 является GPI-заякоренным мембранным белком, который содержит 8 богатых лейцином повторов (Fournier et al., Nature 2001, 409, 341-346). После взаимодействия с ингибиторным белком (например, NogoA, Mag и OM-gp) комплекс Nogo-рецептора-1 трансдуцирует сигналы, которые приводят к коллапсу конуса роста и ингибированию выроста нейритов.
Существует настоятельная потребность в молекулах, которые ингибируют связывание Nogo-рецеп-тора-1 с его лигандами и ослабляют опосредуемый миелином коллапс конуса роста и ингибирование выроста нейритов.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к растворимым полипептидам Nogo-рецептора-1 и слитым белкам, содержащим их, и к антителам и их антигенным фрагментам, направленным против специфических им-муногенных районов Nogo-рецептора-1. Данное изобретение относится также к иммуногенным полипептидам Nogo-рецептора-1, которые связываются с антителами данного изобретения. Данное изобретение относится также к полипептидам Nogo-рецептора-1, которые связываются с моноклональным антителом, которое связывается с Nogo-рецептором-1. Такие полипептиды могут быть использованы, inter alia, в
- 1 -
008253
качестве иммуногенов или для скрининга антител для идентификации антител со сходной специфичностью относительно антитела данного изобретения. Данное изобретение относится дополнительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды данного изобретения, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты, и способам получения этих пептидов. Эти антитела, растворимые рецепторы и слитые с рецептором белки данного изобретения противодействуют Nogo-рецептору-1 или блокируют его и применимы для ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с его лигандами, ин-гибирования коллапса конуса роста в нейроне и уменьшения ингибирования выроста нейритов или разрастания в нейроне.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает полипептид, выбранный из группы, состоящей из AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34);
LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37);
ADLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44) и LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 45).
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота функционально связана с регуляторной последовательностью экспрессии. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту или содержащую вектор данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения полипептида данного изобретения, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор данного изобретения, и извлечение этого полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ получения антитела, предусматривающий стадии иммунизации хозяина полипептидом данного изобретения или клеткой-хозяином, содержащей нуклеиновую кислоту или содержащей вектор данного изобретения, и выделение этого антитела. Данное изобретение обеспечивает также антитело, получаемое по этому способу, или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом данного изобретения, где это антитело не является моноклональным антителом, продуцируемым гибридомной клеточной линией НВ 7Е11 (АТСС(r) accession No. PTA-4587).
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения это антитело или его антигенсвязы-вающий фрагмент (а) ингибирует коллапс конуса роста нейрона; (b) уменьшает ингибирование выроста и разрастание нейритов в нейроне; и (с) ингибирует связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом. В некоторых вариантах осуществления вырост и разрастание нейритов являются аксонным ростом. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы.
В некоторых вариантах осуществления антитело данного изобретения является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело данного изобретения является мышиным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело данного изобретения выбрано из группы, состоящей из гуманизированного антитела, химерного антитела и одноцепочечного антитела.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования Nogo-рецептора-1 с антителом данного изобретения или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд выбран из группы, состоящей из NogoA, NogoB, NogoC, MAG и
OM-gp.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования нейрона с антителом данного изобретения или его антигенсвязывающим фрагментом.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ уменьшения инги-бирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом данного изобретения или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и антитело данного изобретения или его антигенсвязываю-щий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления эта композиция содержит дополнительно один или несколько дополнительных терапевтических агентов.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ стимуляции выживания нейрона в случае риска умирания, предусматривающий контактирование этого нейрона с эф
- 2 -
008253
фективным количеством антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения или его антигенсвязы-вающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон находится in vitro. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон находится в млекопитающем. В некоторых вариантах осуществления это млекопитающее проявляет признаки или симптомы рассеянного склероза, болезни Гентингто-на, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматических повреждений головного мозга или повреждения спинного мозга.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, нейрон которого находится при риске умирания, предусматривающий (а) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело против Nogo-рецепто-ра-1 данного изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент; и (b) введение этой клетки-хозяина в это млекопитающее в месте или вблизи от местоположения этого нейрона.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ генотерапии стимуляции выживания нейрона при риске умирания, причем нейрон находится в млекопитающем, предусматривающий введение в месте или вблизи места этого нейрона вирусного вектора, содержащего нук-леотидную последовательность, которая кодирует антитело против Nogo-рецептора-1 данного изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент, где это антитело против Nogo-рецептора-1 или антигенсвя-зывающий фрагмент экспрессируется из этой нуклеотидной последовательности в млекопитающем в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 является схематическим представлением структуры Nogo-рецептора-Т sNogoR310 человека содержит остатки 26-310, а sNogoR344 содержит остатки 26-344. sNogoR310 крысы содержит остатки 27310, a sNogoR344 содержит остатки 27-344.
Фиг. 2 изображает график антигенности для белка Nogo-рецептора-1 с использованием программного обеспечения Vector NTi(tm). P-617 крысы является SEQ ID NO: 10, а Р-618 крысы является SEQ ID NO: 11. Р-617 человека является SEQ ID NO: 47, а Р-618 человека является SEQ ID NO: 48.
Фиг. 3А является графиком, изображающим активность связывания антитела против Nogo-pe^mo-pa-1, 7Е11. Этот график представляет действие концентрации 7Е11 на связывание Nogo66 с Nogo-рецеп-тором-1.
Фиг. 3В изображает активность связывания антитела против Nogo-рецептора-1, 1Н2. Этот график представляет действие концентрации 1Н2 на связывание Nogo66 с sNogoR344-Fc (также называемым здесь и в заявке на патент Соединенных Штатов 60/402866 Fc-sNogoR344 или Ig-sNogoR344). Fc-MAG не конкурировал с Nogo66 за связывание с sNogoR344-Fc.
Фиг. 4 изображает результаты ELISA для антител против Nogo-R-1 1H2, 3G5 и 2F7. Определяли действие этих антител на OD450 в присутствии иммобилизованных антигенов. Иммобилизованными антигенами были sNogoR310-Fc (также называемый здесь и в заявке на патент Соединенных Штатов 60/402866 Fc-sNogoR310 или Ig-sNogoR310), sNogoR344-Fc, p-617, р-618, р-4, р-5 или овальбумин и БСА.
Фиг. 5 является диаграммой, изображающей действия моноклонального антитела, 7Е11, на вырост DRG-нейритов крысы в присутствии варьирующихся количеств миелина.
Фиг. 6А является диаграммой, изображающей действие связывания sNogoR310 с 125I-Nogo66 и 125I-Nogo40 в присутствии следующих конкурентов: Nogo66, Nogo40 и супернатантa моноклонального антитела против Nogo-рецептора-Т
Фиг. 6B изображает активность связывания 125I-Nogo66 с sNogoR310.
Фиг. 7 является графиком, изображающим действие sNogoR310-Fc на связывание 125I-Nogo40 с sNogoR310.
Фиг. 8 является графиком, изображающим активность связывания sNogoR310-Fc с 125I-Nogo40.
Фиг. 9А является диаграммой действия sNogoR310 на вырост нейритов на клетку в присутствии или в отсутствие миелина.
Фиг. 9В является диаграммой действия sNogoR310 на вырост нейритов в присутствии или в отсутствие миелина.
Фиг. 10А является графиком, изображающим действие sNogoR310-Fc на вырост DRG-нейритов крысы Р4 в присутствии или в отсутствие увеличивающихся количеств миелина.
Фиг. 10В изображает количество нейритов на клетку после обработки ЗФР, ЗФР + sNogoR310-Fc, 20 нг миелина и миелина + sNogoR310-Fc.
Фиг. 11 является графиком, изображающим действие моноклонального антитела 5В10 на вырост DRG-нейритов на клетку в присутствии увеличивающихся количеств миелина.
Фиг. 12 является графиком, изображающим действие sNogoR310-Fc на ВВВ-оценку до 30 дней после индукции повреждения в модели поперечного разреза спинного мозга крысы.
Фиг. 13 А и 13 В сообщают опорно-двигательную ВВВ-оценку как функцию времени после дорсального одностороннего разреза в мышах WT (дикого типа) или трансгенных мышах из Линии 08 или Линии 01.
Фиг. 13 С изображает график максимального переносимого угла наклоненной плоскости как функции времени после повреждания для мышей WT и трансгенных мышей.
- 3 -
008253
Фиг. 13D показывает рассогласования (ошибки) задних конечностей во время карабкания по наклоненной решетке как функции времени после повреждения. Во всех этих графиках сообщается среднее ±s.e.m. (стандартная ошибка среднего) из 7-9 мышей в каждой группе. Эти величины из трансгенных мышей являются статистически отличающимися от величин мышей WT (двойные звездочки, Р <0,01; t-критерий Стьюдента).
Фиг. 14А показывает опорно-двигательную ВВВ-оценку как функцию времени после дорсального одностороннего разреза в обработанных носителем или sNogoR310-Fc животных.
Фиг. 14В показывает рассогласования (ошибки) задних конечностей во время хождения по решетке как функцию времени после повреждения.
Фиг. 14С показывает анализ следов (отпечатков стоп), обнаруживающий более короткую длину шага и большую ширину шага в контрольных мышах в сравнении с неповрежденными или поврежденными + sNogoR310-Fc крысами. Во всех этих графиках сообщается среднее ±s.e.m. (стандартная ошибка среднего) из 7-9 мышей в каждой группе. Величины группы sNogoR310-Fc являются статистически отличающимися от контроля (фиг. 14А-В). Контрольные величины являются статистически отличающимися от варианта без SCI или SCI + sNogoR310-Fc на фиг. 14С (звездочка, р <0,05; двойные звездочки, р <0,01; t-критерий Стьюдента).
Подробное описание изобретения
Определения и общие способы
Если нет других указаний, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, которое понимается специалистом с обычной квалификацией в области, к которой относится данное изобретение. В случае противоречия, следует руководствоваться определениями, включенными в данную заявку. Кроме того, если контекст не требует другого понимания, термины, используемые в единственном числе, будут включать в себя множественное число, а термины, используемые во множественном числе, будут включать в себя единственное число. Все публикации, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде для всех целей.
Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные со способами и материалами, описанными здесь, могут быть использованы в практике или испытании данного изобретения, ниже описаны подходящие способы и материалы. Эти материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для того, чтобы быть ограничивающими. Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из данного подробного описания и из формулы изобретения.
Во всем этом описании и в формуле изобретения слово "содержат" или вариации этого слова, такие как "содержит" или "содержащий", должны пониматься как включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или любой другой группы целых чисел.
Для дополнительного определения данного изобретения здесь обеспечены следующие термины и определения.
В данном контексте "антитело" обозначает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязываю-щий фрагмент. Антитела данного изобретения могут быть антителами любого изотипа или класса (например, М, D, G, Е и А) или любого подкласса (например, G1-4, A1-2) и могут иметь легкую цепь либо каппа (к), либо лямбда (к).
В данном контексте "Fc" обозначает часть константной области тяжелой цепи антитела, которая может быть получена расщеплением папаином.
В данном контексте "слитый белок NogoR" обозначает белок, содержащий часть растворимого Nogo-рецептора-1, слитую с гетерологичным полипептидом.
В данном контексте "гуманизированное антитело" обозначает антитело, в котором по меньшей мере часть последовательностей не человека заменега последовательностями человека. Примеры того, каким образом могут быть получены гуманизированные антитела, могут быть найдены в патентах США 6054297,5886152 и 5877293.
В данном контексте "химерное антитело" обозначает антитело, которое содержит один или более районов из первого антитела и один или более районов из по меньшей мере одного другого антитела. Первое антитело и эти дополнительные антитела могут быть из одного и того же источника или из различных источников.
В данном контексте и в заявке на патент Соединенных Штатов 60/402866 "Nogo-рецептор", "NogoR", "NogoR-1", "NgR" и NgR-1", каждый, обозначают Nogo-рецептор-Т
Полипептиды Nogo-рецептора-1
В одном аспекте данное изобретение относится к полипептидам Nogo-рецептора-1, которые являются иммуногенными. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот иммуногенный полипептид состоит, по существу, из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: LDLSDNAQLRVVDPTT (крысы) (SEQ ID NO: 1); LDLSDNAQLRSVDPAT (человека)
(SEQ ID NO: 2); AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA (крысы) (SEQ ID NO: 3);
AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA (человека) (SEQ ID NO: 4) и CRLGQAGSGA (мыши) (SEQ ID NO: 5).
- 4 -
008253
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к полипептидам Nogo-рецепто-ра-1, которые связываются моноклональным антителом, связывающимся с Nogo-рецептором-Т В некоторых вариантах осуществления этот полипептид узнается моноклональным антителом 7Е11. В некоторых вариантах осуществления этот полипептид выбран из группы, состоящей из: LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34);
LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37);
ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43), LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44) и LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 45).
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 1-5, 26-27, 29-37 и 41-45. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения эта молекула нуклеиновой кислоты связана с регуляторной последовательностью экспрессии (например, pCDNA(I)).
Данное изобретение относится также к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот вектор является клонирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот вектор является экспрессирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения этот вектор содержит по меньшей мере один селектируемый маркер.
Данное изобретение относится также к клеткам-хозяевам, содержащим вышеописанные нуклеиновую кислоту или вектор.
Данное изобретение относится также к способу получения иммуногенного полипептида данного изобретения, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления эта клетка-хозяин является прокариотической. В некоторых вариантах осуществления эта клетка-хозяин является эукариотической. В некоторых вариантах осуществления эта клетка-хозяин является клеткой дрожжей.
Антитела
Далее, данное изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связывают полипептид Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывают полипептид, состоящий, по существу, из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-5, 26-27, 29-37 и 41-45. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения могут продуцироваться in vivo или in vitro. Получение антитела или антигенсвязывающего фрагмента обсуждается ниже.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения ингибирует связывание Nogo-рецептора-1 с лигандом (например, NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp) и уменьшает опосредованное миелином ингибирование выроста и разрастания нейритов, в частности аксонный рост, и ослабляет опосредуемый миелином коллапс конуса роста.
В некоторых вариантах осуществления антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент является мышиным. В некоторых вариантах осуществления Nogo-рецептор-1 является рецептором из крысы. В других вариантах осуществления Nogo-рецептор-1 является рецептором из человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязы-вающий фрагмент является рекомбинантным, генно-инженерным, гуманизированным и/или химерным.
В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из: моноклонального 7Е11 (АТСС(r) accession No. РТА-4587); моноклонального 1Н2 (АТСС(r) accession No. РТА-4587); моно-клонального 2F7 (АТСС(r) accession No. PTA-4585); моноклонального 3G5 (АТСС(r) accession No. PTA-4586) и моноклонального 5В10 (АТСС(r) accession No. PTA-4588). В некоторых вариантах осуществления антитело является поликлональным антителом 46.
Примерами антигенсвязывающих фрагментов являются Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb и фрагменты, содержащие фрагменты определяющего комплементарность района (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела, диатела и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, которая является достаточной для придания связывания специфического антигена этому полипептиду (например, иммуноадгезины).
В данном контексте, Fd обозначает фрагмент, который состоит из VH- и СН1-доменов; Fv обозначает фрагмент, который состоит из VL- и Vu-доменов одного плеча антитела; и dAb обозначает фрагмент, который состоит из Vu-домена (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989). В данном контексте, одноцепочечное антитело (scFv) обозначает антитело, в котором ^-район и Vu-район являются спаренными с образованием моновалентных молекул через синтетический линкер, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). В данном контексте, диатело обозначает биспецифическое антитело, в котором VH-и ^-домены экспрессируются на единой полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для создания возможности спаривания между этими двумя доменами на одной и той же цепи, что заставляет эти домены спариваться с комплементарными доменами другой це
- 5 -
008253
пи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993 и Poljak, R.J. et al., Structure 2:1121-1123, 1994). В данном контексте иммуноад-гезин, который специфически связывается с представляющим интерес антигеном, обозначает молекулу, в которой могут быть включены один или несколько CDR, либо ковалентно, либо нековалентно.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает полипептид субъединицы антитела Nogo-рецептора-1 данного изобретения, где этот полипептид субъединицы выбран из группы, состоящей из (а) тяжелой цепи или ее вариабельного района; и (b) легкой цепи или ее вариабельного района.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь или ее вариабельный район или легкую цепь или ее вариабельный район полипептида субъединицы антитела Nogo-рецептора-1 данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает гипервариабельный район (CDR) антитела Nogo-рецептора-1 данного изобретения или нуклеиновую кислоту, кодирующую СDR.
Иммунизация
Антитела данного изобретения могут быть получены иммунизацией подходящего хозяина (например, позвоночных, в том числе людей, мышей, крыс, овец, коз, свиней, крупного рогатого скота, лошадей, пресмыкающихся, рыб, земноводных и яиц птиц, пресмыкающихся и рыб). Такие антитела могут быть поликлональными или моноклональными.
В некоторых вариантах осуществления этого хозяина иммунизируют иммуногенным полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В других вариантах осуществления этого хозяина иммунизируют Nogo-рецептором-1, ассоциированным с клеточной мембраной интактной или разрушенной клетки и антитела данного изобретения идентифицируют по связыванию с полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления антиген Nogo-рецептора-1 вводят с адъювантом для стимуляции иммунной реакции. Адъюванты часто требуется вводить, наряду с антигеном, для индукции иммунной реакции на этот антиген. Эти адъюванты являются обычно нерастворимыми или недеградируе-мыми веществами, которые стимулируют неспецифическое воспаление с рекрутингом мононуклеарных фагоцитов в участке иммунизации. Примеры адъювантов включают в себя, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда, RIBI (мурамилдипептиды), ISCOM (иммуностимулирующие комплексы) или их фрагменты.
В отношении обзора способов получения антител, см., например, Harlow and Lane (1988), "Antibodies: A Laboratory Manual", Yelton, D.E. et al. (1981); Ann. Rev. of Biochem., 50, pp. 657-80, и Ausubel et al. (1989); Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley and Sons). Определение иммунореак-тивности с иммуногенным полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения может быть выполнено любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области, в том числе, например, иммуно-блот-анализом и ELISA.
Получение антител и продуцирующие антитела клеточные линии
Моноклональные антитела данного изобретения могут быть получены стандартными процедурами, описанными, например, в Harlow and Lane (1988), supra.
Вкратце, в подходящий период времени животное умерщвляют и клетки лимфатического узла и/или В-клетки селезенки иммортализуют любым из нескольких способов, которые хорошо известны в данной области, в том числе, но не только, трансформацией, например, с использованием EBV или слиянием с иммортализованной клеточной линией, такой как клетки миеломы. После этого клетки клонально разделяют и супернатанты каждого клона испытывают на продуцирование антитела, специфического в отношении иммуногенного полипептида Nogo-рецептора-1 данного изобретения. Способы отбора, клонирования и размножения гибридом хорошо известны в данной области. Подобным образом, способы идентификации нуклеотидной и аминокислотной последовательности генов иммуноглобулинов известны в данной области.
Другие подходящие способы получения антитела данного изобретения включают в себя подверга-ние in vitro лимфоцитов действию Nogo-рецептора-1 или иммуногенного полипептида данного изобретения или, альтернативно, отбор библиотек антител в фаговых или подобных им векторах. См. Huse et al., Science, 246, pp. 1275-81 (1989). Антитела, применимые в данном изобретении, могут быть использованы с модификацией или без модификации.
Антигены (в этом случае Nogo-рецептор-1 или иммуногенный полипептид данного изобретения) и антитела могут быть помечены ковалентным или нековалентным присоединением вещества, которое обеспечивает детектируемый сигнал. В данной области известны различные метки и способы конъюгации, и они могут быть использованы в практике данного изобретения. Подходящие метки включают в себя, но не ограничиваются ими, радионуклеотиды, ферменты, хемилюминесцентные агенты, магнитные частицы и т. п. Патенты, описывающие применение таких меток, включают в себя патенты США 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241. Могут быть получены также рекомби-нантные иммуноглобулины (см. патент США 4816567).
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело имеет множественные спе
- 6 -
008253
цифичности связывания, например бифункциональное антитело, полученное любым из ряда способов, известных специалистам с квалификацией в данной области, в том числе включающих в себя получение гибридных гибридом, дисульфидный обмен, химическое перкрестное сшивание, присоединение пептидных линкеров между двумя моноклональными антителами, введение двух наборов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина в конкретную клеточную линию и т.д. (см. ниже в отношении более подробного обсуждения).
Антитела данного изобретения могут быть также моноклональными антителами человека, например моноклональными антителами, которые продуцируются иммортализованными клетками человека, мышами SCID-hu или другими животными (не человеком), способными продуцировать антитела "человека".
Библиотеки фагового дисплея
Антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения могут быть выделены скринингом реком-бинантной комбинаторной библиотеки антител. Примером комбинаторных библиотек для связывания с иммуногенным полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения является, например, библиотека фагового дисплея scFv, полученная с использованием VL- и Vjj-кДНК, полученных из мРНК, происходящей из животного, иммунизированного иммуногенным полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения. Методологии получения и скрининга таких библиотек известны в данной области. Имеются коммерчески доступные способы и материалы для генерирования библиотек фагового дисплея (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 27-9400-01; набор для фагового дисплея Stratagene SurZAP(tm), catalog no. 240612 и др. из MorphoSys). Имеются также другие способы и реагенты, которые могут быть использованы в генерировании и скрининге библиотек дисплея антител (см., например, Ladner et al., U.S. Pat. No. 5213409; Kang et al., PCT Publication No. WO 92/18619; Dower et al., PCT Publication No. WO 91/17271; Winter et al., PCT Publication No. WO 92/20791; Markland et al. PCT Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. PCT Publication No. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT Publication No. WO 92/01047; Garrard et al. PCT Publication No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4133-4137 и Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.
После скрининга и выделения антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения из библиотеки дисплея рекомбинантных иммуноглобулинов нуклеиновая кислота, кодирующая выбранное антитело, может быть извлечена из упаковки-дисплея (например, из генома фага) и субклонирована в другие экспрессирующие векторы стандартными способами рекомбинантых ДНК. Если желательно, эта нуклеиновая кислота может быть подвергнута дополнительным манипуляциям для создания других форм антител данного изобретения, как описано ниже. Для экспрессии антитела, выделенного скринингом комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь этого антитела или их вариабельные области, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводят в клетку-хозяина млекопитающего, как описано выше.
Переключение класса
Антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения могут быть антителами любого изотипа. Антитело любого желаемого изотипа может быть получено переключением класса. Для переключения класса нуклеиновые кислоты, кодирующие VL или VH, которые не включают в себя никаких нуклеотидных последовательностей, кодирующих CL или Си, выделяют с использованием способов, хорошо известных в данной области. Затем нуклеиновые кислоты, кодирующие VL или VH, функционально связывают с ну-клеотидной последовательностью, кодирующей CL или Си, из желаемого класса молекулы иммуноглобулина. Это может быть достигнуто с использованием вектора или нуклеиновой кислоты, которая кодирует CL- или Си-цепь, как описано выше. Например, антитело против Nogo-рецептора-1 данного изобретения, которое было первоначально IgM, переключают в IgG. Далее, переключение класса может быть использовано для превращения одного подкласса IgG в другой подкласс IgG, например из IgG1 в IgG2.
Мутированные антитела
В других вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты данного изобретения могут быть мутированы в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей для изменения свойства связывания данного антитела. Например, мутация может быть произведена в одном или нескольких CDR-районах для увеличения или уменьшения KD антитела в отношении Nogo-рецептора-1, для увеличения или уменьшения Koff или для изменения специфичности связывания данного антитела. Способы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook et al. и Ausubel et al., supra. В предпочтительном варианте осуществления мутации получают в аминокислотном остатке, о котором известно, что он является измененным в сравнении с зародышевой линией в вариабельной области антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления мутации получают в одном или нескольких аминокислотных остатках, о которых известно, что они являются измененными в сравнении с зародышевой линией в вариабельной области антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота,
- 7 -
008253
кодирующая вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, является мутированной в одном или нескольких каркасных районах. Мутация может быть произведена в каркасном районе или константном домене для увеличения времени полужизни. Мутация в каркасном районе или константном домене может быть также произведена для изменения иммуногенности антитела для обеспечения сайта для кова-лентного или нековалентного связывания с другой молекулой или для изменения таких свойств, как фиксация комплемента. Мутации могут быть произведены в каждом из каркасных районов, константного домена и вариабельных областей в мутированном один раз антителе. Альтернативно, мутации могут быть произведены только в одном из каркасных районов, вариабельных областей или константного домена в мутированном один раз антителе.
Слитые антитела и иммуноадгезины
В другом варианте осуществления может быть произведено слитое антитело или иммуноадгезин, которое содержит все антитело против Nogo-рецептора-1 данного изобретения или часть антитела против Nogo-рецептора-1, связанные с другим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления только вариабельная область антитела против Nogo-рецептора-1 связана с этим полипептидом. В других вариантах осуществления Vjj-домен антитела Nogo-рецептора-1 данного изобретения связан с первым полипептидом, тогда как Vi^-домен этого антитела связан со вторым полипептидом, который связывается с первым полипептидом таким образом, что позволяет представляющим интерес VH- и ^-доменам взаимодействовать друг с другом с образованием сайта связывания антитела. В других вариантах осуществления Vu-домен отделен от V^-домена линкером, который позволяет этим VH- и ^-доменам взаимодействовать друг с другом (см. ниже в разделе "Одноцепочечные антитела"). Затем это ^-линкер-^-антитело связывают с представляющим интерес полипептидом. Это слитое антитело применимо для направления полипептида в клетку или ткань, которая экспрессирует лиганд Nogo-рецептора-Т
Представляющим интерес полипептидом может быть терапевтический агент, такой как токсин, или может быть диагностический агент, такой как фермент, который может быть визуализирован, такой как пероксидаза хрена. Кроме того, могут быть созданы слитые антитела, в которых два (или более) одноце-почечных антител связаны друг с другом. Это является полезным, если желательно создать двухвалентное или поливалентное антитело на единой полипептидной цепи или если желательно создать биспеци-фическое антитело.
Одноцепочечные антитела Данное изобретение включает в себя одноцепочечное антитело (scFv), которое связывает полипептид Nogo-рецептора-1 данного изобретения. Для получения scFv VH- и ^-кодирующую ДНК функционально связывают с ДНК, кодирующей гибкий линкер, например, кодирующей аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 10), так что VH- и ^-последовательности могут экспрессировать-ся в виде непрерывного одноцепочечного белка с VL- и Vu-областями, соединенными этим гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426, 1988; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если используют только единственные VH и VL, бивалентным, если используют два VH и VL, или поливалентным, если используют более чем два VH и VL.
Химерные антитела
Данное изобретение включает в себя также биспецифическое антитело или его антигенсвязываю-щий фрагмент, в котором одной специфичностью является специфичность в отношении полипептида Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В одном варианте осуществления может быть получено химерное антитело, которое специфически связывается с полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения через один домен связывания и со второй молекулой через второй домен связывания. Это химерное антитело может быть получено рекомбинантными способами молекулярной биологии или может быть физически конъюгировано вместе. Кроме того, может быть получено одноцепочечное антитело, содержащее более чем один VH и VL, которое связывается специфически с полипептидом данного изобретения и с другой молекулой, которая ассоциирована с аттенуированием опосредованного миелином коллапса конуса роста и ингибирования выроста и разрастания нейритов. Такие биспецифические антитела могут быть получены с использованием способов, которые хорошо известны, например, Fanger et al., Immunol. Methods 4: 72-81 (1994) и Wright and Harris, supra, и в связи с (iii) см., например, Traunecker et al., Int. J. Cancer (Supp;.) 7: 51-52 (1992).
В некоторых вариантах осуществления химерные антитела получают с использованием одного или нескольких вариабельных областей из антитела данного изобретения. В другом варианте осуществления химерное антитело получают с использованием одного или нескольких CDR-районов из указанного антитела.
Дериватизованные и меченые антитела
Антитело или антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения могут быть дериватизованы или связаны с другой молекулой (например, другим пептидом или белком). Обычно антитело или антиген-связывающий фрагмент дериватизуют таким образом, что эта дериватизация или мечение не влияет негативным образом на полипептид данного изобретения. Например, антитело или часть антитела данного изобретения могут быть функционально связаны (химическим связыванием, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или другим образом) с одной или несколькими другими молекулярными
- 8 -
008253
частицами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемый агент, цитотоксический агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, который может опосредовать ассоциацию этого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой (такой, как внутренний район стрептавидина или полигистидиновая метка).
В некоторых вариантах осуществления дериватизованное антитело получают сшиванием двух или более антител (одного и того же типа или различных типов, например, для создания биспецифических антител). Подходящие сшивающие агенты включают в себя агенты, которые являются гетеробифункцио-нальными, имеющими две различные реактивные группы, разделенные подходящим спейсером (например, сложным эфиром м-малеимидобензоил^-гидроксисущинимида) или гомобифункциональным спейсером (например, дисукцинимидилсубератом). Такие линкеры доступны из Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.
В некоторых вариантах осуществления это дериватизованное антитело является меченым антителом. Например, детектирующие агенты, которыми могут быть дериватизованы антитело или часть антитела данного изобретения, являются флуоресцентными соединениями, включающими в себя флуоресце-ин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин, лантанидные (флуресцентные) фосфоры и т. п. Антитело может быть также помечено ферментами, которые применимы для детектирования, такими как пероксидаза хрена, в-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т. п. В вариантах, которые метят детектируемым ферментом, антитело детектируют добавлением дополнительных реагентов, которые использует данный фермент для образования детектируемого продукта реакции. Например, пероксидаза хрена использует пероксид водорода и диаминобензидин. Антитело может быть также помечено биотином и детектировано опосредованным измерением связывания авидина или стрептавидина. Антитело может быть также помечено предварительно определенными полипептидными эпитопами, узнаваемыми вторичным репортером (например, спаренными лейциновой молнией последовательностями, сайтами связывания для вторичных антител, доменами связывания металлов, эпитопными метками).
Антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть также помечены радиоактивной аминокислотой. Радиоактивная метка может быть использована как для диагностических, так и для терапевтических целей. Радиоактивно меченое антитело против Nogo-рецептора-1 может быть использовано диагностически, например, для определения уровней Nogo-рецептора-1 в субъекте. Далее, радиоактивно меченое антитело против Nogo-рецептора-1 может быть использовано терапевтически для лечения повреждения спинного мозга. Примеры меток для полипептидов включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие радиоизотопы или радионуклеотиды: 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
Антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть также де-риватизованы химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метильная или этильная группа или углеводная группа. Эти группы могут быть полезными для улучшения биологических свойств антитела, например для увеличения времени полужизни в сыворотке или для увеличения связывания с тканью.
Характеристика антител против Nogo-рецептора-1
Класс и подкласс антител против Nogo-рецептора-Т
Класс и подкласс антител против Nogo-рецептора-1 может быть определен любым известным в данной области способом. Обычно класс и подкласс антитела может быть определен с использованием антител, которые являются специфическими в отношении конкретного класса и подкласса антитела. Такие антитела являются коммерчески доступными. Класс и подкласс антител может быть определен ELISA, Вестерн-блоттингом, а также другими способами. Альтернативно, класс и подкласс может быть определен секвенированием всех константных доменов или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей этих антител, сравнением их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов и определением класса и подкласса этих антител.
Аффинность связывания антитела против Nogo-рецептора-1 с Nogo-рецептором-Т Аффинность связывания и скорость диссоциации антитела против Nogo-рецептора-1 данного изобретения с полипептидом Nogo-рецептора-1 данного изобретения могут быть определены любым способом, известным в данной области. Например, аффинность связывания может быть измерена конкурентными ELISA, RIA, технологией BIAcore или KinExA. Аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют посредством резонанса поверхностных плазмонов с использованием, например, BIAcore. Было определено, что KD 7E11 и 1 Н2 равны 1 х10-7 М и 2х10-8 М, соответственно. Ингибирование активности Nogo-рецептора-1 антителом против Nogo-рецептора-Т В некоторых вариантах осуществления антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент данного изобретения ингибирует связывание Nogo-рецептора-1 с лигандом. IC50 такого ингибирования может быть измерена любым способом, известным в данной области, например ELISA, RIA или Функциональным Антагонизмом. В некоторых вариантах осуществления IC50 находится между 0,1 и 500 нм. В некоторых вариантах осуществления IC50 находится между 10 и 400 нМ. В других вариантах осуществления это антитело или его часть имеет IC50 между 60 и 400 нМ. Было определено, что IC50 7E11 и 1 Н2 равны 400 и 60 нМ, соответственно, в анализе связывания. См. также табл. 3, infra.
- 9 -
008253
Таким образом, специалист с квалификацией в данной области, используя содержание данного изобретения, имеет в своем распоряжении различные способы, которые могут быть использованы для изменения биологических свойств антител данного изобретения, в том числе способы, которые будут увеличивать или уменьшать стабильность или время полужизни в сыворотке, иммуногенность, токсичность, аффинность или выход конкретной молекулы антитела, или изменения их любым другим путем, который может сделать их более подходящими для конкретного применения.
Композиции, содержащие антитела данного изобретения, и применения антител данного изобретения описаны ниже.
Растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1
Белок.
Полноразмерный Nogo-рецептор-1 состоит из сигнальной последовательности, N-концевого района (NT), восьми богатых лейцином повторов (LRR), района LRRCT (С-конец из восьми богатых лейцином повторов домена богатых лейцином повторов), С-концевого района (СТ) и GPI-якоря (см. фиг. 1).
Некоторые варианты осуществления данного изобретения обеспечивают растворимый полипептид Nogo-рецептора-^ Растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1 данного изобретения содержат NT-домен; 8 LRR и LRRCT-домен и лишены сигнальной последовательности и функционального GPI-якоря (т.е. не имеют GPI-якоря или имеют GPI-якорь, который не способен эффективно связываться с клеточной мембраной).
В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 содержит гете-рологичный LRR. В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 гетерологичных LRR. Гетерологичный LRR обозначает LRR, полученный из белка, отличного от Nogo-рецептора-^ Примерами белков, из которых могут быть получены гетеро-логичные LRR, являются toll-подобный рецептор (TLR1.2); активирующий Т-клетки богатый лейцино-выми повторами белок; декорин; ОМ-gp; кислотолабильная субъединица slit белка, связывающего инсу-линподобный фактор роста, и robo; и toll-подобный рецептор-4.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 из 319 аминокислот (растворимый Nogo-рецептор-1 344, sNogoR1-344 или sNogoR344) (остатки 26-344 SEQ ID NO: 6 и 8 или остатки 27-344 SEQ ID NO: 8). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 из 285 аминокислот (растворимый Nogo-рецептор-1 310, sNogoR1-310 или sNogoR310) (остатки 26-310 SEQ ID NO: 7 и 9 или остатки 27-310 SEQ ID NO: 9). См. фиг. 1.
Таблица 1
Последовательности полипептидов Nogo-рецептора-! человека и крысы
SEQ ID NO: б (1-344 человека)
MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACT^ IPAASQRIFLHGlffilSHVTPAASFI^
QLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQ
DNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAH
VTO?HAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEAL^
LWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAftOT
TDEEPLGLPKCCQPDAADKA
SEQ ID NO: 7 (1-310 человека)
MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVC^
IPAAS QRIFLHGNRISHVPAAS FRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGIiALLE QLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLH^
DNALQALPDDTFRDLGOTJTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAH
VHPHAFRDlH3RLMTLYbFA^LSALPT
LWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRIAGRDLKRIAANDLQGCA
SEQ ID NO: 8 (1-344 крысы)
MKRASSGGSRLPITmiWLQAWRVATPCP
I PAS S QRI FLHGNRI S Y\)TAASFQSCRMjTIL^jHSNALAGIDAAAFTGIiTLbE QLDLSDNAQ^VVDPTTFRGLGHLHIbHL^ DNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRI^ VHPHAFRDLGRLMTLYLFA^LSMLPAEVLVPLRS
LWAWLQKFRGSSSGVPSNLPQRIAGRDLKRLATSDIiEGCAVASGPFRPFQTNQL TDEELLGLPKCCQPDAADKA
SEQ ID NO: 9 (1-310 крысы)
MKEiASSGGSRLPTWVLWLQAWRVATPCPGACVCYOT
IPASSQRIFШGШlISYVPAASFQSCRNLTILWIlHSNALAGIDAAAFTGLTLLE Q^LSDNAQLRVVDPTTFRGIJGHLHTLHL
DNNL QAL PDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIP S VPEHAFRGШS LDRLLLHQNHVAR VHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLS№PAEVLVPLRSLQYLRL^3NPWVCDCRARP LWAWLQKFRGSSSGVPSNLPQRLAGRDLKRIIATSDLEGCA
- 10 -
008253
В некоторых вариантах осуществления данного изобретения растворимые полипептиды Nogo-ре-цептора-1 данного изобретения используют для ингибирования связывания лиганда с Nogo-рецептором-1 и действия в качестве антагониста лигандов Nogo-рецептора-Т В некоторых вариантах осуществления данного изобретения растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1 данного изобретения используют для уменьшения ингибирования выроста и разрастания нейритов в нейроне, такого как аксонный рост, и для ингибирования опосредованного миелином коллапса конуса роста в нейроне. В некоторых вариантах осуществления этим нейроном является нейрон центральной нервной системы.
Неожиданным образом, sNogoR310 и sNogoR344 блокируют связывание NogoA, NogoB, NogoC, MAG и OM-gp с Nogo-рецептором-Т
В некоторых вариантах осуществления растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 данного изобретения является компонентом слитого белка, который дополнительно содержит гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления этим гетерологичным полипептидом является константный домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления этим константным доменом иммуноглобулина является константный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гетеро-логичным полипептидом является Fc-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Fc присоединен к С-концевой стороне растворимого полипептида Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот слитый белок Nogo-рецептора-1 является димером.
Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения
Данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид данного изобретения, в том числе полипептиды любой из SEQ ID NO: 1-9, 26-27, 29-37 и 41-45. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 26-344 Nogo-рецептора-1, показанных в SEQ ID NO: 6 и 8, или аминокислотных остатков 27-344 Nogo-рецептора-1, показанных в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления эта молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 26-310 Nogo-рецептора-1, показанных в SEQ ID NO: 7 и 9, или аминокислотных остатков 27-310 Nogo-рецептора-1, показанных в SEQ ID NO: 9. В данном контексте, "нуклеиновая кислота" обозначает геномную ДНК, кДНК, мРНК и антисмысловые молекулы, а также нуклеиновые кислоты на основе альтернативных скелетов молекул или включающие в себя альтернативные основания, независимо от того, получены ли они из природных источников или синтезированы. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор транскрипции и необязательно сигнальную последовательность, каждый их которых функционально связан с нуклеотид-ной последовательностью, кодирующей полипептиды данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок Nogo-рецептора-1 данного изобретения, в том числе слитый белок, содержащий полипептид, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 26-344 Nogo-рецеп-тора-1, показанных в SEQ ID NO: 6 и 8, или аминокислотных остатков 27-344 SEQ ID NO: 8 и аминокислотных остатков 26-310 Nogo-рецептора-1, показанных в SEQ ID NO: 7 и 9, или аминокислотных остатков 27-310 SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота кодирует слитый белок Nogo-рецептора-1, содержащий полипептиды, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26-27, 29-37 и 41-45. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок Nogo-рецептора-1, дополнительно содержит промотор транскрипции и необязательно сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеотидная последовательность дополнительно кодирует константную область иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина является константной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеотидная последовательность дополнительно кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенную с шарнирной областью. В некоторых вариантах осуществления эта нуклеиновая кислота дополнительно кодирует Fc. В некоторых вариантах осуществления слитые белки Nogo-рецептора-1 содержат Fc-фрагмент.
Эти кодирующие нуклеиновые кислоты данного изобретения могут быть дополнительно модифицированы таким образом, что они содержат детектируемую метку для целей диагностики и зондирования. Разнообразные подобные метки известны в данной области и могут быть легко использованы с описанными здесь кодирующими молекулами. Подходящие метки включают в себя, но не ограничиваются ими, биотин, радиоактивно меченные нуклеотиды и т.п. Специалист с квалификацией в данной области может использовать любую из известных в данной области меток для получения меченой молекулы нуклеиновой кислоты.
Композиции
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-5, 26-27, 29-37 и 41-45.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие антитело против Nogo-рецептора-1, или его антигенсвязывающий фрагмент, или растворимый полипептид Nogo-рецептора-1, или слитый белок данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение может содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие эксципиенты и вспомогательные вещества, которые об
- 11 -
008253
легчают процессинг активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически для доставки к месту действия. Подходящие формы для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например водорастворимых солей. Кроме того, могут вводиться суспензии активных соединений в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, и эти вещества включают в себя, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и декстран. Необязательно, эта суспензия может также содержать стабилизаторы. Липосомы могут быть также использованы для инкапсулирования молекул данного изобретения для доставки в клетку. Примерами "фармацевтически приемлемых носителей" являются любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми, вода, солевой раствор, забу-ференный фосфатом раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как увлажнители, или минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие и эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают время хранения или эффективность антител, антигенсвязывающих фрагментов, растворимых Nogo-рецепторов или слитых белков данного изобретения.
Композиции данного изобретения могут быть в различных формах, в том числе, например, жидких, полутвердых и твердых дозированных формах, таких как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузируемые растворы), дисперсии или суспензии. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического назначения в одном варианте осуществления, композиции находятся в форме инъекционных или инфузируемых растворов, таких как композиции, сходные с композициями, используемыми для пассивной иммунизации людей другими антителами.
Эта композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены включением антитела против Nogo-ре-цептора-1 в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или с комбинацией из ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии готовят включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит дисперсионную среду-основу и требуемые ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которая дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент, из их предварительно стерильно-отфильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например моностеаратных солей и желатина.
В некоторых вариантах осуществления активное соединение может быть приготовлено в носителе, который будет защищать это соединение от быстрого высвобождения, например композиции регулируемого высвобождения, включающие в себя имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсули-рованные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких форм запатентованы или обычно известны специалистам с квалификацией в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В композиции могут быть также включены дополнительные активные соединения. В некоторых вариантах осуществления антитело против Nogo-рецептора-1, или его антигенсвязывающие фрагменты, или растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1, или слитые белки данного изобретения готовят вместе или вводят вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами.
Фармацевтические композиции данного изобретения могут включать в себя "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела, антигенсвязывающе-го фрагмента, полипептида (полипептидов) или слитого белка данного изобретения. "Терапевтически эффективным количеством" называют количество, эффективное, при дозах и в течение необходимых периодов времени, достаточное для достижения терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающего фрагмента, растворимого полипептида Nogo-рецептора-1 или слитого белка Nogo-рецептора может варьироваться в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума. Терапевтически эффективным количеством является также количество, в котором любые токсичные или вредные
- 12 -
008253
эффекты антитела против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающего фрагмента, растворимого полипептида Nogo-рецептора-1 или слитого белка Nogo-рецептора перевешиваются терапевтически выгодными эффектами. "Профилактически эффективным количеством" называют количество, эффективное, при дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют в субъектах перед заболеванием или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Схемы введения доз могут быть приспособлены для обеспечения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической или профилактической реакции). Например, может вводиться единственная болюсная доза, могут вводиться несколько разделенных доз на протяжении времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, в зависимости от острой необходимости терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно готовить парентеральные композиции в дозированной унифицированной форме для легкости введения, и однородность дозированной унифицированной формы обозначает, в данном контексте, физически дискретные единицы, подходящие для единичных доз для проходящих лечение субъектов-млекопитающих, причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического действия, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для дозированных унифицированных форм данного изобретения диктуется (а) уникальными характеристиками антитела, антиген-связывающего фрагмента и растворимого полипептида Nogo-рецептора-1 или слитого белка Nogo-рецеп-тора и конкретным терапевтическим или профилактическим эффектом, который должен быть достигнут, и (b) ограничениями, присущими в данной области компаундированию такого антитела, антигенсвязы-вающего фрагмента и растворимого полипептида Nogo-рецептора-1 или слитого белка Nogo-рецептора, для лечения чувствительности в индивидуумах, и непосредственно зависит от перечисленных условий. В некоторых вариантах осуществления диапазон терапевтически эффективных доз для антител против Nogo-рецептора-1 или их антигенсвязывающих фрагментов находится в пределах 0,1-4,0 мг/кг в день. В некоторых вариантах осуществления диапазон терапевтически эффективных доз для антител против Nogo-рецептора-1 или их антигенсвязывающих фрагментов находится в пределах 0,2-4,0 мг/кг в день. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза для антител против Nogo-рецеп-тора-1 или их антигенсвязывающих фрагментов равна 0,2 мг/кг в день.
Применения антител, антигенсвязывающих фрагментов, растворимых рецепторов и слитых белков
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы ингибирования активности Nogo-рецептора-1 введением антител против Nogo-рецептора-1, антигенсвязывающих фрагментов таких антител, растворимых полипептидов Nogo-рецептора-1 или слитых белков, содержащих такие полипептиды, млекопитающему, нуждающемуся в этом.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования Nogo-рецепто-ра-1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд выбран из группы, состоящей из NogoA, NogoB, NogoC, MAG и OM-gp.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или антигенсвязы-вающим фрагментом данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы. В некоторых из этих способов вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, который находится при риске умирания, предусматривающий (а) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей (i) антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент; или (ii) растворимый полипептид Nogo-рецептора-1; и (b) введение клетки-хозяина в млекопитающее в месте или вблизи места этого нейрона. Almudena Ramon-Cueto, M. Isabel Cordero, Fernando F. Santos-Benito and Jesus Avila (2000), Functional recovery of paralegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheating cells. Neuron 25, 425-435.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ генотерапии стимуляции выживания нейрона при риске умирания, который находится в млекопитающем, предусматривающий введение в месте или вблизи места этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотид-ную последовательность, которая кодирует (а) антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент; или (b) растворимый полипептид Nogo-рецептора-1, где это антитело против Nogo-рецептора-1, антигенсвязывающий фрагмент или растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 экспресси-руется из нуклеотидной последовательности в млекопитающем, в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона. Вирусные векторы и способы, применимые для этих экспериментов, описаны, например, в Noel et al., Human Gene Therapy, 13, 1483-93 (2002).
- 13 -
008253
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий контактирование этого лиганда с растворимым полипептидом Nogo-рецептора-1 или слитым белком Nogo-рецептора-1 данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ модуляции активности лиганда Nogo-рецептора-1, предусматривающий стадию контактирования лиганда Nogo-рецептора-1 с растворимым полипептидом Nogo-рецептора-1 или слитым белком Nogo-рецептора-1 данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования лиганда Nogo-рецепто-ра-1 с растворимым полипептидом Nogo-рецептора-1 или слитым белком Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования лиганда Nogo-рецептора-1 с растворимым полипептидом Nogo-рецептора-1 или слитым белком Nogo-рецептора-1 данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот нейрон является нейроном центральной нервной системы. В некоторых вариантах осуществления этот лиганд выбран из NogoA, NogoB, NogoC, MAG и OM-gp. В некоторых вариантах осуществления вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.
Любой из типов антител или рецепторов, описанных здесь, может быть использован терапевтически. В некоторых вариантах осуществления антитело против Nogo-рецептора-1 является антителом человека. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим является пациент-человек. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят млекопитающему-не человеку, экспрессирующему Nogo-рецептор-1, с которым это антитело перекрестно реагирует (например, примату, собакоголовой обезьяне или мартышке-резус) для ветеринарных целей или в качестве животной модели заболевания человека. Такие модели животных могут быть применимы для оценки терапевтической эффективности антител данного изобретения.
В некоторых вариантах осуществления введение антитела против Nogo-рецептора-1, или антигенсвязывающего фрагмента, или растворимого полипептида, или слитого белка Nogo-рецептора-1 используют для лечения повреждения спинного мозга для облегчения аксонного роста через поврежденный участок.
Антитела против Nogo-рецептора-1, или антигенсвязывающие фрагменты, или растворимые полипептиды, или слитые белки Nogo-рецептора-1 данного изобретения могут быть обеспечены по отдельности, или в комбинации, или в последовательной комбинации с другими агентами, которые модулируют конкретный патологический процесс. Например, противовоспалительные агенты могут вводиться одновременно после инсульта в качестве средства для блокирования дополнительного повреждения нейронов и ингибирования регенерации аксонов. В данном контексте, говорят, что антитела против Nogo-рецепто-ра-1, антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1 и слитые белки Nogo-рецептора вводят в комбинации с одним или несколькими терапевтическими агентами, когда эти два ингредиента вводят одновременно, последовательно или независимо.
Антитела против Nogo-рецептора-1, антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1, слитые белки Nogo-рецептора-1 данного изобретения могут вводиться парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, трансдермальным, ингаляционным или буккальным способами. Например, агент может быть введен локально в место повреждения посредством микроинфузии. Типичные места включают в себя, но не ограничиваются ими, поврежденные зоны спинного мозга, возникающие в результате повреждения. Вводимая доза будет зависеть от возраста, здоровья и массы реципиента, типа сопутствующего лечения, если оно имеется, частоты введения и характера желаемого эффекта.
Соединения данного изобретения могут быть использованы in vivo, обычно в млекопитающих, таких как люди, овцы, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, собаки, крысы и мыши, или in vitro.
Векторы данного изобретения
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает рекомбинантные молекулы ДНК (рДНК), которые содержат кодирующую последовательность. В данном контексте, молекулой рДНК является молекула ДНК, которая была подвергнута молекулярной манипуляции. Способы генерирования молекул рДНК хорошо известны в данной области, например, см. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. В некоторых молекулах рДНК кодирующая последовательность ДНК функционально связана с регуляторными последовательностями экспрессии и векторными последовательностями.
В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды данного изобретения. Выбор вектора и регуляторных последовательностей экспрессии, с которыми нуклеиновые кислоты данного изобретения функционально связаны, зависят непосредственно, как это хорошо известно в данной области, от желаемых функциональных свойств (например, экспрессии белка и подлежащей трансформации клетки-хозяина). Вектор данного изобретения может быть, по меньшей мере, способен направлять репликацию или инсерцию в хромосому хозяина и предпочтительно также экспрессию структурного гена, включенного в эту молекулу рДНК.
Регуляторные элементы экспрессии, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии
- 14 -
008253
функционально связанной кодирующей белок последовательности, известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Предпочтительно индуцируемый промотор легко регулируется, будучи чувствительным к питательному элементу в среде клетки-хозяина.
В одном варианте осуществления вектор, содержащий кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, будет включать в себя прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, имеющую способность управлять автономной репликацией и поддержанием этой рекомбинантной молекулы ДНК вне-хромосомно в прокариотической клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка-хоязин, трансформированная им. Такие репликоны хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают в себя прокариотический репликон, могут также включать в себя ген, экспрессия которого придает детектируемый или селектируемый маркер, такой как устойчивость к лекарственному средству. Типичными бактериальными генами устойчивости к лекарственному средству являются гены, которые сообщают устойчивость к ампициллину или тетрациклину.
Векторы, которые включают в себя прокариотический репликон, могут дополнительно включать в себя прокариотический промотор или промотор бактериофага, способные управлять экспрессией (транскрипцией и трансляцией) кодирующих последовательностей генов в бактериальной клетке-хозяине, такой как Е. coli. Промотор является регуляторным элементом экспрессии, образуемым последовательностью ДНК, которая делает возможным связывание РНК-полимеразы и осуществление транскрипции. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно обеспечены в плазмидных векторах, содержащих удобные сайты рестрикции для инсерции сегмента ДНК данного изобретения. Примерами таких векторных плазмид являются pUC8, pUC9, pBR322 и pBR329 (Bio-Rad(r) Laboratories), pPL и рКК223 (Pharmacia). Любой подходящий прокариотический хозяин может быть использован для экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, кодирующей белок данного изобретения.
Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно векторы, совместимые с клетками позвоночных, могут быть также использованы для образования молекул рДНК, которые содержат кодирующую последовательность. Экспрессирующие векторы эукариотических клеток хорошо известны в данной области и доступны из нескольких коммерческих источников. Обычно такие векторы обеспечены удобными сайтами рестрикции для инсертирования желаемого сегмента ДНК. Примерами таких векторов являются pSLV и pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pML2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC(r) 31255) и другие эукариотические экспрессирующие векторы.
Экспрессирующие векторы эукариотических клеток, используемые для конструирования молекул рДНК данного изобретения, могут дополнительно включать в себя селектируемый маркер, который является эффективным в эукариотической клетке, предпочтительно селектируемый маркер устойчивости к лекарственным средствам. Предпочтительным маркером устойчивости к лекарственным средствам является ген, экспрессия которого приводит к устойчивости к неомицину, т.е. ген неомицинфосфотрансеразы (neo) (Southern et al., (1982) J. Mol. Anal. Genet. 1, 327-341). Альтернативно, этот селектируемый маркер может присутствовать на отдельной плазмиде, эти два вектора вводят котрансфекцией клетки-хозяина и транс-фектанты отбирают культивированием в подходящем лекарственном средстве на селектируемый маркер.
Для экспрессии антител или частей антител данного изобретения ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, инсертируют в экспрессирующие векторы таким образом, что эти гены функционально связаны с регуляторными последовательностями транскрипции и трансляции. Экспрессирующие векторы включают в себя плазмиды, ретровирусы, космиды, YAC, полученные из EBV эписомы и т.п. Ген антитела лигируют в вектор таким образом, что регуляторные последовательности транскрипции и трансляции в этом векторе выполняют присущую им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела.
Экспрессирующий вектор и регуляторные последовательности транскрипции выбирают таким образом, что они являются совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в раздельные векторы. В некоторых вариантах осуществления оба гена инсертируют в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антител инсертируют в экспрес-сирующий вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).
Удобным вектором является вектор, который кодирует функционально полную последовательность CH или CL иммуноглобулина, причем подходящие сайты рестрикции конструируют таким образом, что любая последовательность VH или VL может быть легко инсертирована и экспрессирована, как описано выше. В таких векторах обычно происходит сплайсинг между донорным сайтом сплайсинга в инсерти-рованном J-районе и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим С-району человека, а также в районах сплайсинга, которые имеются в экзонах Сн человека. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в нативных хромосомных сайтах справа от кодирующих районов. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может также кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Этот ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что этот сигнальный пептид связан в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Этот сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигналь- 15
008253
ным пептидом (т. е. сигнальным пептидом из белка, не являющегося иммуноглобулином).
Кроме этих иммуногенных полипептидов, антитела Nogo-рецептора-1, антигенсвязывающих фрагментов растворимых полипептидов Nogo-рецептора-1 и слитых белков растворимого Nogo-рецептора-1 данного изобретения, рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения несут регулятор-ные последовательности, которые регулируют их экспрессию в клетке-хозяине. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора, в том числе выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии клетки-хозяина млекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые запускают высокие уровни экспрессии белков в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, промо-тор/энхансер CMV), вируса 40 обезьяны (SV40) (такие, как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)), промоторы полиомы и сильные промоторы млекопитающих, такие как промоторы иммуноглобулина и актина. В отношении дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, см., например, U.S. Pat. No. 5,168,062 Stinski, U.S. Pat. No. 4,510,245 Bell et al. и U.S. Pat. No. 4,968,615 Schaffner et al.
Кроме гетерологичных генов и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспресси-рующие векторы данного изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, U.S. Pat. No. 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017, by Axel et al.). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен этот вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в dhfr- клетках-хозяевах с отбором с использованием метотрексата/амплификации) и ген neo (для отбора с использованием G418).
Клетки-хозяева и способы рекомбинантного получения белка данного изобретения
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела против Nogo-рецептора-1, иммуно генные пептиды, растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1, слитые белки растворимого Nogo-рецептора-1 данного изобретения и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот, могут быть использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина. Трансформация может выполняться любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных по-линуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают в себя опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном транс-фекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами.
Трансформацию подходящих клеток-хозяев молекулой рДНК данного изобретения выполняют хорошо известными способами, которые обычно зависят от типа используемого вектора и используемой системы хозяина. Что касается трансформации прокариотических клеток-хозяев, могут быть использованы электропо-рация и способы солевой обработки (см., например, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cohen et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). Что касается трансформации клеток позвоночных векторами, содержащими рДНК, могут быть использованы электропорация, способы с использованием катионного липида или солевой обработки (см., например, Graham et al., (1973) Virology 52, (456-467; Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373-1376).
Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу рДНК данного изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, в том числе отбором на селектируемый маркер. Например, клетки, полученные из введения рДНК данного изобретения, могут быть клонированы с получением отдельных колоний. Клетки из этих колоний могут быть собраны, лизирова-ны, и содержание их ДНК может быть тестировано на присутствие рДНК с использованием такого способа, как способ, описанный Southern et al., (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517, или белки, полученные из этой клетки, могут быть анализированы иммунологическим способом.
Клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают в себя многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС(r)). Они включают в себя, inter alia, клетки яичника китайского хомячка (СНО), NSO, клетки SP2, клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки печеночноклеточной карциномы человека (например, Hep G2), клетки А549 и ряд других клеточных линий. Особенно предпочтительные клеточные линии выбирают посредством определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как клетки Sf9. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие иммуногенные полипептиды, антитела против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Nogo-рецеп
- 16 -
008253
тора-1 и слитые белки растворимого Nogo-рецептора-1 вводят в клетки-хозяева млекопитающих, они продуцируются культивированием этих клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для возможности экспрессии этих антитела, полипептида и слитого полипептида в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секреции этих иммуногенных полипептидов, антител Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающих фрагментов, растворимых полипептидов Nogo-рецептора-1 и слитых белков растворимого Nogo-рецептора-1 данного изобретения в культуральную среду, в которой эти клетки-хозяева вьфапшвают. Иммуногенные полипептиды, антитела против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающие фрагменты, растворимые полипептиды Nogo-рецептора-1 и слитые белки растворимого Nogo-рецептора-1 могут быть извлечены из этой культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков.
Далее, экспрессия иммуногенных полипептидов, антител против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающих фрагментов, растворимых полипептидов Nogo-рецептора-1 и слитых белков растворимого Nogo-рецептора-1 данного изобретения (или других их частей) из продукционных клеточных линий может быть усилена с использованием ряда известных способов. Например, система экспрессии гена глу-таминсинтетазы (система GS) является обычным подходом для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с европейскими патентами с номерами 0216846, 0256055 и 0323997 и заявкой на европейский патент с номером 89303964.4.
Клетки-хозяева
Далее, данное изобретение обеспечивает клетки-хозяева, трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело против Nogo-рецептора-1, антигенсвязывающий фрагмент, растворимый полипептид Nogo-рецептора-1 и/или слитый белок растворимого Nogo-рецептора-1 данного изобретения. Эта клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической. Эукариотиче-ские клетки, применимые для экспрессии белка данного изобретения, не ограничиваются, пока эта клеточная линия является совместимой со способами культивирования клеток и совместимой с размножением экспрессирующего вектора и экспрессии генного продукта. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки дрожжей, насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, такие как линия клеток из мыши, крысы, обезьяны или человека. Примеры применимых эукариотических клеток-хозяев включают в себя клетки яичника китайского хомячка (СНО), доступные из АТСС(r) в виде CCL61, эмбриональные клетки NIH-3T3 мыши NIH Swiss, доступные из АТСС в виде CRL1658, клетки почки детеныша хомячка (ВНК) и подобные эука-риотические клеточные линии культуры ткани.
Получение рекомбинантных белков с использованием молекулы рДНК
Далее, данное изобретение обеспечивает способы получения антитела против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающего фрагмента, растворимого полипептида Nogo-рецептора-1 и/или слитого белка растворимого Nogo-рецептора-1 с использованием описанных здесь молекул нуклеиновых кислот. В общем виде, получение рекомбинантной формы белка обычно включает в себя следующие стадии.
Сначала получают молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок данного изобретения. Если эта кодирующая последовательность не прерывается интронами, она непосредственно пригодна для экспрессии в любом хозяине.
Затем эту молекулу нуклеиновой кислоты необязательно помещают в функциональную связь с подходящими регуляторными последовательностями, как описано выше, для образования экспрессионной единицы, содержащей открытую рамку считывания белка. Эту экспрессионную единицу используют для трансформации подходящего хозяина и этот трансформированный хозяин культивируется при условиях, которые делают возможной продуцирование рекомбинантного белка. Необязательно, этот рекомбинант-ный белок выделяют из среды или из клеток; извлечение и очистка этого белка может не быть необходимой в некоторых случаях, в которых могут быть допущены некоторые примеси.
Каждая из предыдущих стадий может быть выполнена различными способами. Например, желаемые кодирующие последовательности могут быть получены из геномных фрагментов и использованы непосредственно в подходящих хозяевах.
Конструирование экспрессирующих векторов, которые являются функциональными в различных хозяевах, выполняют с использованием подходящих репликонов и регуляторных последовательностей, как описано выше. Эти регуляторные последовательности, экспрессирующие векторы и способы трансформации зависят от типа клетки-хозяина, используемой для экспрессии данного гена, и обсуждались подробно ранее. Подходящие сайты рестрикции, если они не были в норме доступными, могут быть добавлены на концах этой кодирующей последовательности для обеспечения вырезаемого гена для инсер-тирования в эти векторы. Специалист с квалификацией в данной области может легко адаптировать любую систему хозяина/экспрессии, известную в данной области, для использования с молекулами нуклеиновых кислот данного изобретения для получения рекомбинантного белка.
Для лучшего понимания данного изобретения представлены следующие примеры. Эти примеры приведены только для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем данного изобретения.
Пример 1. Получение мышиных моноклональных антител против Nogo-рецептора-Т
Антитела Nogo-рецептора-1, которые специфически связывают иммуногенный полипептид Nogo
- 17 -
008253
рецептора-1 данного изобретения, получали с использованием следующих способов и процедур.
Иммунизации Использовали два подхода иммунизации.
1. Клетки COS-7 или клеточные мембраны, содержащие Nogo-рецептор-1 (NogoR-1) в качестве им-муногена.
Ген Nogo-рецептора-1 крысы (GenBank(tm) No. AF 462390) субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих pEAG1256 (Biogen(r)), который содержал промотор CMV и ген устойчивости к гене-тицину для отбора с лекарственным средством. Эту рекомбинантную плазмиду трансфицировали в клетки COS-7 с использованием Superfect (Qiagen(r)). Трансфектанты отбирали с использованием генетицина (Gibco(tm), 2 мг/мл), клонировали и проверяли в отношении поверхностной экспрессии белка Nogo-рецеп-тора-1 при помощи FACS. Мембраны COS-7 получали из этих клеток в соответствии с описанными процедурами [Wang et al., J. Neurochem., 75:1155-1161 (2000)] с двумя промывками и хранили при концентрации белка 1 мг/мл в 10% глицерине при -70°С.
Восьминедельных самок мышей RBF (Lackson Labs, Bar Harbor, ME) иммунизировали внутрибрю-шинно либо эмульсией, содержащей 50 мкг Nogo-рецептор-1-COS-7-мембран, либо целыми клетками COS, экспрессирующими на поверхности Nogo-рецептор-1, и 50 мкл адъюванта RIBI MPL+TDM+CWS (Sigma(r) Chemical Co., St. Louis, MO) 1 раз каждые 2 недели (Lipman et al., 1992). Сыворотки из иммунизированных мышей собирали перед первой иммунизацией, спустя 7 дней после второй и третьей иммунизации и спустя 38 дней после третьей иммунизации и титры антител против Nogo-рецептора-1 измеряли с использованием ELISA, как описано ниже.
2. Специфические пептиды Nogo-рецептора-1 в качестве иммуногена.
Последовательность гена Nogo-рецептора-1 крысы подвергали анализам антигенности с использованием программы Vector NTi(tm) (фиг. 2). Антигенные пептиды, идентифицированные в этих анализах, конъюгировали с гемоцианином фиссуреллы (KLH) с использованием стандартных процедур с использованием глутарового альдегида.
Восьминедельных самок мышей RBF (Lackson Labs, Bar Harbor, ME) иммунизировали внутрибрю-шинно эмульсией, содержащей 50 мкг KLH-конъюгированных пептидов и 50 мкл полного адъюванта Фрейнда (Sigma(r) Chemical Co., St. Louis, МО) 1 раз каждые 2 недели. Сыворотки из иммунизированных мышей собирали перед первой иммунизацией, спустя 1 неделю после второй и третьей иммунизации и измеряли титры антитела против Nogo-рецептора-Т После третьей иммунизации вводили бустерную дозу. Спустя 3 дня после этой иммунизации бустерной дозой начинали эксперименты по слиянию.
Получение и скрининг гибридом
Сыворотки из мышей, иммунизированных антигенными пептидами Nogo-рецептора-1, подвергали скринингу с использованием ELISA, тогда как сыворотки из мышей, иммунизированных клетками COS, экспрессирующими Nogo-рецептор-1, подвергали скринингу проточной цитометрией. Мышей, которые были положительными в отношении антител, которые специфически связывали Nogo-рецептор-1-COS-7-клетки, идентифицировали проточной цитометрией и умерщвляли. Из этих мышей выделяли спленоциты и сливали с миеломой FL653 (APRT- производным Ig-/HGPRT- миеломы мыши Balb/c, поддерживаемой в DMEM, содержащей 10% ФТС, 4500 мг/л глюкозы, 4 мМ L-глутамин и 20 мг/мл 8-азагуанина), как описано (Kennett et al., 1993. Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis. Plenum Press, New York). Слитые клетки высевали в 24- или 48-луночные планшеты (Corning Glass Works, Corning, NY) и подпитывали содержащей аденин, аминоптерин и тимидин культуральной средой. ААТ-устойчи-вые культуры подвергали скринингу с использованием ELISA или проточной цитометрии на связывание либо с Nogo-рецептор-1-COS-7-клетками, либо с антигенным пептидом Nogo-рецептора-1, как описано ниже. Клетки в положительных лунках дополнительно субклонировали лимитирующим разведением.
Для скрининга на связывание антитела с антигенным пептидом Nogo-рецептора-1 пептиды, которые использовали в качестве иммуногенов, конъюгировали с БСА. 0,5 мкг конъюгированного пептида в 50 мкл 0,1 М натрий-бикарбонатного буфера, рН 9,0 добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета MaxiSorp(tm) (Nunc(tm)). Затем этот планшет инкубировали при 37°С в течение 1 ч или при 4°С в течение 16 ч и неспецифическое связывание блокировали с использованием 25 мМ HEPES, рН 7,4, содержащего 0,1% БСА, 0,1% овальбумин, 0,1% blotto и 0,001% азид. Гибридомный супернатант добавляли и инкубировали при 25°С в течение 1 ч. После промывания 3 раза ЗФР разведение 1:10000 конъюгированного с перокси-дазой хрена козьего антимышиного вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch Inc.) добавляли в каждую лунку и инкубировали дополнительно в течение 1 ч. После трех промывок окраску развивали при помощи ТМВ (Pierce) и останавливали 2М серной кислотой. Интенсивность окраски подвергали мониторингу в спектрофотометре при 450 нм.
Антитела подвергали скринингу на связывание с полноразмерным Nogo-рецептором-1 следующим образом. Клетки COS-7 метили 0,1 мкМ CellTracker(tm) Green CMFDA (Molecular Probes, Eugene, OR), как описано изготовителем. Равные объемы меченых CellTracker(tm) контрольных клеток смешивали с промытыми Nogo-рецептор-1-COS-7-клетками перед инкубированием с тест-сыворотками против Nogo-рецеп-тора-1. 50 мкл этой клеточной смеси помещали в каждую лунку 96-луночных V-донных полистироловых планшетов (Costar(r) 3877, Corning, NY) и добавляли 100 мкл гибридомного супернатанта или контроль
- 18 -
008253
ного антитела против Nogo-рецептора-^ После инкубирования при 4°С в течение 30 мин эти клетки промывали и инкубировали с 50 мкл конъюгированного с R-фикоэритрином аффинно чистого фрагмента F(ab')2 вторичного козьего антитела против мышиного Fc IgG гамма (1:200, Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, PA) в ЗФР. В конце инкубирования эти клетки промывали дважды ЗФР и суспендировали в 200 мкл ЗФР, содержащего 1% ФТС, и подвергали FACS-анализам. Альтернативно, Nogo-ре-цептор-1-COS-7-клетки смешивали с гибридомным супернатантом и затем обрабатывали конъюгирован-ным с R-фикоэритрином козьим антимышиным вторичным антителом и непосредственно подвергали стандартным FACS-анализам.
Авторы изобретения получали 25 антител против Nogo-рецептора-1 с использованием различных иммуногенов. Авторы генерировали два антитела, 7Е11 и 5В10, с использованием пептидной последовательности, соответствующей остаткам 110-125 №^^^^1X^-1 в качестве иммуногена. Авторы генерировали три антитела, 1Н2, 3G5 и 2F7, с использованием мембран, полученных из клеток COS, транс-фицированных полноразмерным крысиным Nogo-рецептором-1 в качестве иммуногена. Авторы генерировали 13 антител с использованием sNogoR310-Fc в качестве иммуногена (1D9.3. 1Е4.7, 1В4.3, 2С4.3, 1F10.3, 2Н1.4, 1Н3.3, 1G4.1, 1Е4.1, 2G7.1, 2С4.1, 2F11.1 и 1Н4.1) и 7 антител с использованием пептидной последовательности, соответствующей остаткам 423-434 крысиного Nogo-рецептора-1 в качестве иммуногена (2Е8.1, 2G11.2 и 1В5.1).
Анализ последовательности моноклональных антител 7Е11 и 5В10
Авторы изобретения экстрагировали тотальную РНК с использованием мининабора (Qiagen)(r) RNeasy(r) и генерировали кДНК из выделенной РНК. Авторы амплифицировали последовательность легкой цепи при помощи ПЦР с использованием праймеров 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' (SEQ ID NO: 12) и 5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3' (SEQ ID NO: 25). Авторы амплифицировали последовательность тяжелой цепи при помощи ПЦР с использованием праймеров 5'-GGGGATATCCAC-CATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 13 и 5'-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCC-WGCTCAGYTYCTKGGA-3' (SEQ ID NO: 14). Эти праймеры содержат следующие вырожденные нукле-отиды: S представляет G или С; М представляет А или С; K представляет G или Т; и Y представляет Т или С. Авторы клонировали эти ПЦР-фрагменты в секвенирующий вектор и определяли последовательность ДНК CDR способом дидезокситерминации цепи с использованием праймеров, специфических в отношении этого секвенирующего вектора. Авторы умозрительно транслировали эти последовательности ДНК, и частичные аминокислотные последовательности CDR-районов тяжелой или легкой цепей моноклональных антител 7Е11 и 5В10 показаны в табл. 2. 3 CDR из тяжелой и легкой цепей этих mAb подчеркнуты в табл. 2. Легкие цепи 7Е11 и 5В10 имеют 94% идентичность аминокислотных последовательностей, а тяжелые цепи имеют 91% идентичность аминокислотных последовательностей. mAb 7E11 и 1Н2 являются IgG1-изотипом, a mAb 3G5 и 2F7 являются IgG2а-изотипом. Каждое из этих пяти mAb имеет легкую цепь изотипа каппа. Авторы изобретения анализировали последовательность других моно-клональных антител с использованием этого подхода.
Таблица 2
Аминокислотная последовательность mAb 7Е11 и 5В10
Последовательность
SEQ
NO:
Легкая
цепь
7Е11
MKLPVRLLVLMFWI PAS SSDWMTQTPLSLPVSLGDQAS ISC RS SQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQS PKLLIYKVSNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGGGT KLEIKRADAAPTVSISHH
Легкая
цепь
5В10
MKLPVRLLVLMFWI PASSSDWMTQTPLSLPVSLGDQASISC RSSQSLVHSNGYTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVDAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGT KLEIKRADAAPTVSISHH
Тяжелая
цепь
7Е11
GLEWIGAIDPSDS YS SYNQNFKGKATLTVDGS S STAYMQLS S LTSEDSAVYYCARRITEAGAWFAYWGQGTTVT
Тяжелая
цепь
5В10
LQXSGAEIVMPGTAVTMSCKASGYTFTDFWMHWVKQRPGQGL' EWIGAIDPSDSYSRINQKFKGKATLTVDESSSTAYMQLSSLT S EDSAVYYCARRI TEAGAWFAYWGQGTTVT
- 19 -
008253
Картирование эпитопов моноклонального антитела 7Е11
mAb 7E11 связывает NgR1 как крысы, так и человека. Для определения эпитопа, ответственного за связывание 7Е11, авторы генерировали фрагменты и синтетические пептиды крысиного NgR1 и испытывали их на связывание 7Е11.
Рекомбинантный фрагмент крысиного NgR1, который содержит все 8 доменов LRR и N- и С-конце-вые кэпы (sNogoR310), обрабатывали либо кислотой, либо цианогенбромидом (CNBr) и разделяли эти фрагменты гель-электрофорезом. Необработанный sNogoR310 мигрирует со средней молекулярной массой 42 кДа. Обработка кислотой sNogoR310 давала два основных продукта расщепления 15 кДа (аминокислота 27 - аминокислота 122) и 30 кДа (аминокислота 123 - аминокислота 310). Обработка CNBr давала три фрагмента, дублет 33/35 кДа (аминокислота 27 аминокислота 220), который может представлять фрагменты с гетерогенным гликозилированием, продукт 10 кДа (аминокислота 241 - аминокислота 310) и фрагмент из 11 аминокислот (аминокислота 230 - аминокислота 240), который не удерживается на этом геле. Вестерн-блот этого геля зондировали 7Е11 и показали, что антитело 7Е11 связывалось с интактным NgR1 крысы (аминокислота 27 - аминокислота 310), кислотным фрагментом 15 кДа (аминокислота 27 -аминокислота 122) и CNBr-фрагментом 35 кДа (аминокислота 27 - аминокислота 239). 7Е11 не связывалось с кислотным фрагментом 30 кДа (аминокислота 123 - аминокислота 310) или CNBr-фрагментом 10 кДа (аминокислота 241 - аминокислота 310). Как кислотный фрагмент 15 кДа, так и CNBr-фрагмент 35 кДа содержали последовательность LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 1), что согласуется со связыванием 7Е11 с единственным эпитопом на NgR1.
Сайт связывания 7Е11 дополнительно анализировали тестированием пептидных продуктов расщепления трипсином sNogoR310. ВЖХ-анализы показали несколько фрагментов, что свидетельствует о том, что в последовательности NgR1 были несколько чувствительных к трипсину остатков лизина и аргинина. Антитело 7Е11 связывалось только с единственным пептидом продукта расщепления трипсином, обеспечивая дополнительное доказательство того, что 7Е11 связывается с единственным эпитопом на NgR1. Последующая масс-спектроскопия (MS) и анализы последовательности идентифицировали связанный пептид как AAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26).
Пептид LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 1) подвергали дополнительному анализу картирования. Этот пептид расщепляли трипсином, что дает два основных фрагмента, LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27) и WDPTT (SEQ ID NO: 28), и испытывали способность 7Е11 связывать их. МС-анализ выявил, что это антитело связывало пептид LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27), и, следовательно, этот пептид содержит связывающий эпитоп для 7Е11. В этой фракции пептидов подробный МС-анализ идентифицировал несколько перемешанных пептидов, которые также связывали 7Е11, в том числе пептидов с дезаминирова-нием при Asn115 и Gln117, добавлением аланина в положениях 112 или 113 или добавлением серина в положении 114 (табл. 3). Эти данные указывают на то, что несколько аминокислотных остатков, расположенных в этом пептидном фрагменте, могут не быть критическими для связывания антитела 7Е11.
Таблица 3
Мутантные пептиды, связываемые 7Е11
Связанные пептиды
Аминокислотная последовательность
Фрагмент дикого типа Дезаминированный
LDLSDNAQLR (SEQ ID N0:27) LDLSDDAELR (SEQ ID N0:29)
Перемешанный фрагмент №1 Дезаминированный
LDLASDNAQLR (SEQ ID N0:30) LDLASDDAELR (SEQ ID N0:31)
Перемешанный фрагмент №2 Дезаминированный
LDALSDNAQLR (SEQ ID N0:32) LDALSDDAELR (SEQ ID N0:33)
Перемешанный фрагмент №3 Дезаминированный
LDLSSDNAQLR (SEQ ID N0:34) LDLSSDEAELR (SEQ ID N0:35)
Пептид LDLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 1) расщепляли также эндопротеазой Asp-N и тестировали связывание 7Е11. Эндопротеаза Asp-N расщепляла этот пептид на 3 пептидных фрагмента, L, DLS и DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 36). Из этих продуктов 7Е11 связывало пептид DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 36). Взятые вместе, данные расщепления трипсином и Asn-N дополнительно определяют местоположение эпитопа, связывающего 7Е11, в последовательности, общей между ними, DNAQLR (SEQ ID NO: 37).
Аминокислотные последовательности NgR1, NgR2 и NgR3 из различных видов анализировали для предсказания критических остатков в 7Е11-связывающем эпитопе на основе наблюдения, что 7Е11 свя
- 20 -
008253
зывало NgR1 крысы и человека, но не NgR1 мыши, NgR2 человека или NgR3 мыши. Сопоставление последовательностей обнаружило, что аминокислоты 110-125 крысиного NgR1 и соответствующая последовательность NgR1 человека являются идентичными и что последовательность мышиного NgR1 отличается только одной аминокислотой в положении 119 (Arg119 в NgR1 крысы и человека и His119 в NgR1 мыши; табл. 4).
Таблица 4
Сопоставление последовательностей NgR из разных видов
Белок (белки)
Последовательность аа 110 - аа 119
SEQ ID N0:
NgRI крысы и человека
LDLSDNAQLR
NgR! мыши
LDLSDNAQLH
NgR2 крысы и человека
LDLGDNRHLR
NgR3 крысы, человека и мыши
LDLGDNRQLR
Arg119 на NgR1 способствует связыванию антитела 7Е11, так как оно связывается хорошо с NgR1 крысы и человека, но слабо с NgR1 мыши. Подобным образом, поскольку антитело 7Е11 не связывается хорошо с NgR3, Ala116 участвует в этом эпитопе, так как в последовательности DNAQLR (SEQ ID NO: 37) NgR3 отличается от NgR1 только аргинином в соответствующей последовательности. В последовательности DNAQLR 4 из 6 остатков в NgR2 являются идентичными NgR1 крысы. А1а116 и Gln117 заменены аргинином и гистидином, соответственно. Это подтверждает, что А1а116 является важным аминокислотным остатком, способствующим связыванию антитела 7Е11, но не должен обязательно мешать участию Gln117.
Для подтверждения этих точек контакта генерировали несколько пептидов, содержащих точковые мутации в последовательности LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27), и тестировали их на связывание антитела 7Е11. Эти пептиды иммобилизовали на планшете MaxiSorp(tm)(Nunc(tm)) и наносили несколько разведений антитела 7Е11. Полученные величины ЕС50 показаны в табл. 5.
Антитело 7Е11 связывалось с мутантами Leu110Ala и Asp111Ala с величинами EC50, сходными с величинами исходного пептида. При испытании Gln117Ala EC50 увеличивалась в 30 раз, и при испытании Arg119His EC50 увеличивалась в 25 раз. Наиболее значительное изменение ЕС50 наблюдали при мутации Arg119 в аланин.
Таблица 5
7Е11 связывается с мутантными пептидами с различными ЕС50
Изменение в пептиде
Последовательность
ЕС50
SEQ ID NO:
Нет изменений
LDLSDNAQLRWDPTT
0, 55
L110A
ADLSDNAQLRWDPTT
0, 62
D111A
LALS DNAQLRVVDPTT
0,31
Q117A
LDLS DNAALRWDPTT
R119H
LDLSDNAQLHWDPTT
R119A
LDLSDNAQ LAW D Р Т Т
Положение эпитопа связывания 7Е11 определяли также в недавно выясненной кристаллической структуре sNogoR310. Как и ожидалось, эта структура показывает, что эпитоп 7Е11 экспонирован на поверхности этой молекулы. Остатки Arg119, Gln117, Ala116 и Asp114 выступают наружу из этой структуры, в то время как Leu118 и Asn115 расположены вовнутрь. Этот эпитоп опускается на верхнюю часть кислотного "пластыря" в вогнутой поверхности этой структуры и основной поверхности, которая обращена к одной из этих сторон.
Ингибирование связывания лиганда с растворимым Nogo-рецептором-! моноклональным антителом
против Nogo-рецептора-1
Моноклональные антитела против Nogo-рецептора-!, полученные, как описано выше, испытывали для определения, ингибировали ли они связывание лиганда с Nogo-рецептором-1.
0,5 мкг слитого белка растворимого Nogo-рецептора-1, содержащего аминокислотные остатки 26344 Nogo-рецептора-1 крысы и шарнирную область и Fc-район молекулы IgG1 крысы (sNogoR344-Fc),
- 21 -
008253
полученного, как описано ниже, иммобилизовали на 250 мкг конъюгированных с белком А или агглютинином зародышей пшеницы гранул SPA (Amersham Pharmacia Biotech) в течение 2 ч при 25°С. Гранулы SPA, связанные с Fc-sNogoR-1, mAb против Nogo-рецептора-!, и 1 мкл 125I-Nogo66 (Amersham, 2000 Ки/ммоль, 1 нМ), в 50 мкл забуференной HEPES инкубационной среды (10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% овальбумин, 2 мМ MgCl2, 2 мМ СаС12 и ингибиторы протеаз) добавляли в каждую лунку с пробой. Спустя 16 ч радиоактивность измеряли в четврех повторностях проб с использованием TopCount(r) (Packard). Величины 1С50 рассчитывали из анализа вычерчивания кривых (фиг. 3) (PRISM, GraphPad Software, NJ). В некоторых экспериментах авторы использовали также конъюгаты АР-лиганд (например, AP-Nogo66) и детектировали связывание мониторингом активности щелочной фосфа-тазы. Авторы анализировали также способность этих mAb блокировать связывание лигандов MAG-Fc и АР-ОМ-gp с Nogo-рецептором-Е
Все моноклональные антитела 7Е11, 5В10, 1Н2, 3G5 и 2F7 ингибировали связывание Nogo66, MAG и ОМ-gp с sNogoR344-Fc. Рассчитанные IC50 для Nogo66 в отношении 7Е11 и 1Н2 были равны 400 и 60 нМ, соответственно. Данные из ELISA-мониторинга mAb-опосредованного ингибирования связывания этих трех лигандов с Nogo-рецептором-1 суммированы в табл. 6.
Таблица 6
mAb ингибируют связывание Nogo66, MAG и OM-gp с Nogo-рецептором-!
mAb
MAG + sNogoR344-Fc
Nogo66 + sNogoR344-Fc
OM-gp + sNogoR344-Fc
7Е11
30 нМ (60%) EC5o=0, 5 мкм
ЕС50=1,7 мкм
ЕС50=150 нМ
1Н2
30 нМ (60%)
3G5
30 нМ (60%)
ЕС50=9 нМ
2F7
30 нМ (55%)
ЕС5о=Ю нМ
ЕС50=5 нМ
1D9. 3
30 нМ (70%) ЕС5о=2,7 нм
ЕС50=13 нМ
ЕС50=5,2 нМ
2G7.1
30 нМ (84%)
ЕС50=18 нМ
ЕС50=1 нМ
1Е4 .1
30 нМ (75%) ЕС50=2,8 нм
ЕС50=9,1 нМ
1G4. 1
30 нМ (90%) ЕС50=9,9 нм
ЕС5о=8,2 нМ
2С4 . 1
30 нМ (50%)
2F11.1
30 нМ (45%)
1Н4. 1
2Е8 . 1
30 нМ (87%) ЕС50=9,2 нм
ЕС50=1,5 нМ
ЕС50=42, 9 нМ
2G11.2
30 нМ (80%)
1В5.1
30 нМ (0%)
Процентное вытеснение показано при 30 нМ антителе и ЕС50 для некоторых mAb определяли из анализа вычерчивания кривых, как описано. "-" указывает отсутствие детектируемой активности, a "ND" обозначает "не определяли".
Пример 2. Получение антител против Nogo-рецептора-1 в виде Fab-фагов.
Антитела против Nogo-рецептора-1 в виде Fab-фагов, которые специфически связывают иммуно-генный полипептид Nogo-рецептора-1 данного изобретения, получали также скринингом Fab-фаговой библиотеки следующим образом.
Библиотеку MorphoSys Fab-фагов HiCAL(r) GOLD подвергали скринингу против крысиного растворимого sNogoR310-Fс-белка и клеток COS-7, экспрессирующих крысиный Nogo-рецептор-Е Fab-фаги, которые специфически связывались с Nogo-рецептором-1, очищали и характеризовали. Тяжелую цепь 14D5 получают из гена VH2, а легкую цепь получают из гена VK1. Аминокислотные последовательности CDR тяжелой цепи и легкой цепи одного из этих Fab-фагов 14D5 показаны в табл. 7.
- 22 -
008253
Таблица 7
Аминокислотная последовательность CDR 14D5
Аминокислотная последовательность
SEQ ID N0:
CDR1 тяжелой цепи
GFSLSTSGGSVG
CDR2 тяжелой цепи
LIYSNDTKYYSTSLKT
CDR3 тяжелой цепи
SRFWTGEYDV
CDR1 легкой цепи
RASQNIAITLN
CDR2 легкой цепи
LASSLQS
CDR3 легкой цепи
QQYDNYPL
14D5 связывается с крысиным Nogo-рецептором-1 как в моновалентной, так и в бивалентной форме. Кроме того, 14D5 связывается с Nogo-рецептором-1 мыши и человека и М^-рецептором^ человека, но не с Nogo-рецептором-3 мыши.
Пример 3. Иммунопреципитация Nogo-рецептора-1 моноклональными антителами против Nogo-рецептора-1.
Для выполнения иммунопреципитации 100 мкл лизированных клеток или 50 мкл PiPLC-обработан-ных клеток смешивали с 400 или 450 мкл буфера для экстракции [10 мМ Трис-HCl, рН 7,2, 0,5% Твин-20(tm), 0,2 мМ PMSF] или буфера RIPA, соответственно, в присутствии 30 мкл белка А или G и 1-2 мкг антитела. Эту смесь инкубировали в шейкере при 4°С в течение 16 ч.
Пробы откручивали осторожно для осаждения связанных с белком А или белком G гранул. Эти гранулы промывали 3 раза 1 мл промывочного буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,2, 0,1 Твин-10(tm)). Конечную промывку выполняли с использованием 10% исходного промывочного буфера.
Гранулы ресуспендировали в 100 мкл 2х ДСН с 10% бета-меркаптоэтанолом. Пробы инкубировали при комнатной температуре перед прохождением на 4-20% Трис-глициновом геле для электрофореза в ДСН-ПААГ. Как определено анализом геля электрофореза в ДСН-ПААГ, моноклональные антитела, 3G5 и 2F7, иммунопреципитируют Nogo-рецептор-Г
Пример 4. Определение специфичности антител с использованием ELISA.
Для определения специфичности моноклональных и Fab-фаговых антител, полученных в примерах 1 и 2, авторы выполняли ELISA с использованием панели полипептидов Nogo-рецептора-Г Эта панель состояла из sNogoR310-Fc (слитого белка, содержащего аминокислоты 26-310 крысиного Nogo-рецептора-1 и крысиный Fc-фрагмент), sNogoR344-Fc (см. supra), полипептида р-617 (SEQ ID NO: 1), полипептида р-618 (полипептида из 19 аминокислот из района LRR7 крысиного Nogo-рецептора-1; фиг. 2; SEQ ID NO: 11) и полипептидов р-4 и р-5 (полипептидов из районов LRR5 и LRRCT Nogo-рецептора-1, соответственно). Овальбумин и БСА использовали в качестве контролей. Как показано на фиг. 4, все mAb 1H2, 3G5 и 2F7 специфически связывались с sNogoR344-Fc. В сходных экспериментах эти антитела также специфически связывали полипептид, состоящий из аминокислот 310-344 крысиного Nogo-рецептора-1 (SEQ ID NO: 3), a mAb 7E11 и 5В10 специфически связывали полипептид р-617 (SEQ ID NO: 1).
Десять из этих антител (1D9.3, 1Е4.7, 1В4.3, 2С4.3, 1F10.3, 2Н1.4. 1Н3.3, 1G4.1, 1Е4.1 и 2G7.1), полученные из иммунизации sNogoR310-Fc, вытесняли друг друга в отношении связывания, что свидетельствует о том, что они узнают сходные или перекрывающиеся эпитопы на sNogoR310-Fc. Три других антитела из иммунизации sNogoR310-Fc (2C4.1, 2F11.1 и 1Н4.1) узнают разные эпитопы, расположенные в аминокислотных остатках 26-310.
Авторы изобретения выполняли также анализы связывания ELISA с использованием Fab-фага 14D5. Когда лигандам AP-Nogo66, AP-OM-gp и MAG-Fc давали связываться с иммобилизованным sNogoR344-Fc, 1 мкМ 14D5 полностью ингибировал связывание MAG. Требовалось 10 мкМ 14D5 для полного ингибирования связывания ОМ-gp с sNogoR344-Fc.
Пример 5. Анализ выроста нейритов.
Для испытания способности моноклональных антител и Fab-фаговых антител, полученных, как описано выше, ослаблять ингибиторное действие миелина ЦНС на нейроны культуральные предметные стекла Lab-Tek(r) (4 лунки) покрывали 0,1 мг/мл поли^-лизина (Sigma(r)). Миелин ЦНС или ЗФР наносили в виде капель по 3 мкл. Флуоресцентные микросферы (Polysciences) добавляли к миелину/ЗФР для
- 23 -
008253
создания возможности последующей идентификации этих капель (Grandpre et al., Nature 403, 2000). Затем предметные стекла Lab-Tek(r) промывали и покрывали 10 мкг/мл ламинина (Gibco(tm)). Дорсальные корешковые ганглии (DRG) из детенышей крыс Р3-4 Sprague-Dawley диссоциировали 1 мг/мл коллагена-зы типа 1 (Worthington), растирали с использованием отполированных оплавлением Пастеровских пипеток, предварительно высевали для обогащения нервных клеток и, наконец, высевали при 23000 клеток на лунку на предварительно покрытые Lab-Tek(r) культуральные предметные стекла. Культуральной средой была среда F12, содержащая 5% инактивированную нагреванием донорскую лошадиную сыворотку, 5% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку и 50 нг/мл mNGF и инкубированная при 37°С и 5% CO2 в течение 6 ч. 15 мкг/мл mAb 7E11 добавляли сразу же после посева.
Предметные стекла фиксировали в течение 20 мин 4% параформальдегидом, содержащим 20% сахарозу, и окрашивали на нейронный маркер анти-бета-Ш-тубулин-антителом (Covance TUJ1), разведенным 1:500. В качестве вторичного антитела, антитело против мышиного Ig Alexa Fluor(r) 594 (Molecular Probes) разводили 1:300 и предметные стекла покрывали Gel/Mount(tm) (Biomeda(tm)). Получали 5 цифровых изображений с использованием программного обеспечения OpenLab(tm) и анализировали их с использованием программного обеспечения MetaMorph(r) для количественного определения выроста нейритов.
mAb 7E11 защищали DRG-нейроны от опосредованного миелином ингибирования выроста нейритов (фиг. 5). Сходные результаты наблюдали с mAb 1H2 и 3G5.
В анализе защиты выроста нейритов, в котором DRG-нейроны крыс Р7 культивировали на миели-новом субстрате ЦНС, бивалентное антитело 14D5 также эффективно стимулировало вырост нейритов.
Пример 6. Иммунохимия с 7Е11 на клетках, трансфицированных Nogo-рецептором-Т
Для дополнительной характеристики свойств связывания mAb против Nogo-рецептора-1, полученных, как описано в примере 1, авторы изобретения сравнивали связывание как с фиксированными, так и с живыми клетками COS-7 или 293, экспрессирующими Nogo-рецептор-1 крысы или человека.
Фиксированные клетки.
Трансфицированные и не трансфицированные Nogo-рецептором-1 клетки высевали в 8-луночных культуральных предметных стеклах Lab-Tek(r), фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин, блокировали 10% нормальной козьей сывороткой, 0,1% Тритоном Х-100 в ЗФР в течение 1 ч. mAb 7E11 добавляли при 15 мкг/мл и 1,5 мкг/мл в блокирующем растворе и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре: А!еха(r)-конъюгированное вторичное антимышиное антитело (Molecular Probes) инкубировали при разведении 1:300 в блокирующем растворе в течение 1 ч; DAPI добавляли при 5 мкг/мл ко вторичному антителу для мечения всех ядер.
Живые клетки.
Трансфицированные и не трансфицированные Nogo-рецептором-1 клетки высевали в 8-луночных культуральных предметных стеклах Lab-Tek(r), блокировали FACS-буфером (содержащим 4% донорскую лошадиную сыворотку) в течение 30 мин при 4°С, инкубировали с 7Е11 при 15 мкг/мл и 1,5 мкг/мл в FACS-буфере в течение 1 ч при 4°С, промывали и инкубировали со вторичным антимышиным антителом Alexa(r) (1:300 в FACS-буфере) в течение 30 мин при 4°С.
Эксперименты с иммуногистохимическим окрашиванием показали, что все mAb связывали клетки, экспрессирующие крысиный Nogo-рецептор-Т mAb 7E11, 2G7.1 и 2С4.1 связывали как фиксированные, так и живые клетки, экспрессирующие Nogo-рецептор-1 человека.
Пример 7. Мышиная модель повреждения контузией спинного мозга.
Для испытания действия mAb Nogo-рецептора-1, полученных, как описано в примере 1, на нейроны in vivo авторы изобретения используют модель повреждения контузией спинного мозга.
Самок мышей (18-22 г) обрабатывали профилактически анальгезирующими и антибиотическими агентами. Мышей анестезировали и помещали в стереотаксический аппарат с фиксацией позвоночника под стереомикроскопом. Травму позвоночника вводят модифицированной версией weight-drop-способа (способа с падением груза) (М. Li et al., Functional role and therapeutic implications of neuronal caspase-1 and -3 in mouse model of traumatic spinal cord injury. Neuroscience. Vol. 99, pp. 333-342, 2000).
Вкратце, выполняют ламинэктомию Т9 и Т10 и позвоночник стабилизируют с использованием пары мышиных поперечных зажимов, поддерживающих билатерально поперечные выступы Т9-Т10. Ударный стержень из нержавеющей стали с диаметром 1,4 мм и массой 3 г поднимают на 2,5 см выше твердой мозговой оболочки и роняют на спинной мозг на уровне Т10. Во время хирургии мышей держат на согревающем одеяле при 37°С и 1 мл подогретого стерильного солевого раствора вводят подкожно каждой мыши после хирургии во избежание обезвоживания. Мочевой пузырь вручную отжимают 1 раз в день, пока не восстанавливается рефлекторный контроль мочевого пузыря.
Все животные получают послеоперационную анальгезию каждые 8-12 ч после хирургии и антибиотическую обработку 2 раза в день в течение 7 дней после этого. Животные имеют свободный доступ к корму и воде в течение всей продолжительности этого исследования. Антитела Nogo-рецептора-1 доставляют к месту повреждения посредством подоболочечной инъекции в течение 28 дней, как описано в крысиной модели рассечения спинного мозга ниже.
Пример 8. Характеристика слитых белков растворимого Nogo-рецептора-Т
Для характеристики полипептидов растворимого Nogo-рецептора-1 (sNogoR-1) и слитых белков
- 24 -
008253
растворимого Nogo-рецептора-1 (Fc-sNogoR-1) авторы выполняли следующий эксперимент.
3 мкг растворимых Nogo-рецепторов (sNogoR310-Fc и sNogoR34 4-Fc) иммобилизовали на 250 мкг гранул WGA-SPA, и они получали 0,5 мкл радиоактивного лиганда (конечная концентрация 0,5 нМ) в конечном объеме 100 мкл буфера для связывания (20 мМ HEPES, рН 7,4, 2 мМ Са, 2 мМ Mg, 0,1% БСА, 0,1% овальбумин и ингибиторы протеаз). Лиганды включали в себя 10 мкМ Nogo66, 10 мкМ 125I-Nogo40 (аминокислоты 1-40 NogoA) и 10 мкл супернатанта антитела против Nogo-рецептора-1 для каждого набора лигандов. Три тирозина на Nogo40 иодинировали по отдельности и обозначали Nogo40-A, -В и -С соответственно. Средние величины трех повторностей представлены в виде нормализованной % связанной радиоактивности (фиг. 6-8). Столбики ошибок указывают SEM. Связанную радиоактивность в отсутствие ингибиторов принимали за 100%, а самую низкую связанную радиоактивность в присутствии 10 мкМ Nogo40 принимали за 0% для нормализации данных.
Пример 9. Ингибирование связывания лиганда со слитым белком растворимого Nogo-рецептора-Т
Использовали анализ связывания, сходный с анализом связывания примера 8 для испытания способности двух mAb, полученных в примере 1, ингибировать связывание 125I-Nogo66 с sNogoR344-Fc. Моноклональные антитела (mAb) 2F7 и 3G5 ингибировали связывание 125I-Nogo66 с sNogoR344-Fc.
Пример 10. Анализ выроста нейритов.
Культуральные предметные стекла Lab-Tek(r) (4 лунки) покрывали 0,1 мг/мл поли^-лизина (Sigma(r)). Миелин ЦНС, отдельно или смешанный с sNogoR310, слитым белком sNogoR310-Fc, mAb 5B10 или контроль ЗФР наносили в виде капель по 3 мкл. Флуоресцентные микросферы (Polysciences) добавляли к миелину/ЗФР для создания возможности последующей идентификации этих капель (Grandpre et al., Nature 403, 2000). Затем предметные стекла Lab-Tek(r) промывали и покрывали 10 мкг/мл ламинина (Gibco(tm)).
Дорсальные корешковые ганглии (DRG) из детенышей крыс Р3-4 Sprague-Dawley диссоциировали 1 мг/мл коллагеназы типа 1 (Worthington), растирали с использованием отполированных оплавлением Пастеровских пипеток, предварительно высевали для обогащения нервных клеток и, наконец, высевали при 23000 клеток на лунку на предварительно покрытые Lab-Tek(r) культуральные предметные стекла. Культуральной средой была среда F12, содержащая 5% инактивированную нагреванием донорскую лошадиную сыворотку, 5% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку и 50 нг/мл mNGF и инкубированная при 37°С и 5% OO2 в течение 6 ч. 15 мкг/мл mAb 7E11 добавляли сразу же после посева.
Предметные стекла фиксировали в течение 20 мин 4% параформальдегидом, содержащим 20% сахарозу, и окрашивали на нейронный маркер анти-бета-Ш-тубулин-антителом (Covance TUJ1), разведенным 1:500. В качестве вторичного антитела, антитело против мышиного Ig Alexa Fluor(r) 594 (Molecular Probes) разводили 1:300 и предметные стекла покрывали Gel/Mount(tm) (Biomeda(tm)). Получали 5 цифровых изображений с использованием программного обеспечения OpenLab(tm) и анализировали их с использованием программного обеспечения MetaMorph(r) для количественного определения выроста нейритов.
sNogoR310, sNogoR310-Fc и mAb 5B10 защищали DRG-нейроны от опосредованного миелином ингибирования выроста нейритов (фиг. 9, 10). sNogoR310 использовали в сходном анализе с использованием куриных нейронов, и было обнаружено, что он является защитным.
Авторы испытывали также нейропротективное действие растворимых Nogo-рецепторов проведением экспериментов с клетками, выращиваемыми в присутствии и в отсутствие ламинина. Рост нервных клеток в средах без ламинина является слабым и моделирует условия нейронного стресса.
Ганглии DRG иссекали из постнатальных 6-7-дневных детенышей крыс (Р6-7), диссоциировали их на отдельные клетки и высевали на 96-луночных планшетах, предварительно покрытых поли^-лизином, как описано выше. В некоторые лунки 2 мкг/мл ламинина добавляли в течение 2-3 ч и ополаскивали перед высевом этих клеток. После 18-20 ч инкубирования эти планшеты фиксировали 4% параформальде-гидом, окрашивали анти-бета-Ш-тубулин-антителом, разведенным 1:500 (Covance(r)), и анти-HuC/D-анти-телом, разведенным 1:100 (Molecular Probes), и добавляли флуоресцентные вторичные антитела (Molecular Probes) при разведении 1:200. ArrayScan(r) II (Cellomics(r)) использовали для улавливания 5х цифровых изображений и для количественного определения выроста нейритов в виде среднего выроста нейритов/нейрон на лунку посредством использования приложения Neurite outgrowth application. Анализировали девять 5х изображений из 3 лунок/условие варианта.
В некоторых вариантах осуществления использовали субклон клеток РС12 (Neuroscreen(tm)) (Cellomics(r)). Клетки Neuroscreen(tm) предварительно дифференцировали в течение 7 дней 200 нг/мл NGF (фактора роста нервов), разделяли и повторно высевали на 96-луночные планшеты, предварительно покрытые поли-D-лизином. В некоторые лунки 5 мкг/мл ламинина добавляли в течение 2-3 ч и ополаскивали перед высевом этих клеток. После 2 дней инкубирования эти планшеты фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали кроличьим анти-бета-Ш-тубулин-антителом, разведенным 1:500 (Covance(r)), и Hoechst (ядерным красителем). ArrayScan(r) II (Cellomics(r)) использовали для количественного определения выроста нейритов, как и в клетках DRG.
sNogoR344-Fc или крысиные IgG добавляли в раствор для DRG-нейронов Р6-7 и к дифференцированным клеткам Neuroscreen(tm) в момент высева.
Нейропротективное действие sNogoR344-Fc наблюдали при 1 и 10 мкМ, когда DRG-нейроны Р6
- 25 -
008253
выращивали в отсутствие ламинина. Количественное определение выроста нейритов показало зависимое от дозы увеличение с добавлением sNogoR344-Fc. Добавление sNogoR344-Fc в той же самой концентрации к DRG-нейронам, выращиваемым на ламининовом субстрате, не давало какого-либо необычного эффекта, указывая на то, что sNogoR344-Fc является активным только на подвергнутых стрессу клетках. Нейропротективное действие sNogoR344-Fc при той же самой концентрации в отсутствие ламинина наблюдали также с клетками Neuroscreen(tm).
Пример 11. Получение и очистка слитого белка Fc-sNogoR-1.
Конструкцию кДНК, кодирующую аминокислоты 1-310 крысиного Nogo-рецептора-1, сливали с крысиным Fc IgG1, содержащимся в экспрессирующем векторе млекопитающего, и этот вектор вводили электропорацией в клетки яичника китайского хомячка (СНО) (DG44). Клетки поддерживали в альфа-MEM, дополненной 10% диализованной фетальной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамином и антибио-тическими-противомикробными реагентами. Спустя 2 дня после трансфекции кондиционированную среду собирали и анализировали Вестерн-блоттингом при восстанавливающих условиях. Полосу белка приблизительно 60 кДа детектировали с использованием поликлонального кроличьего антитела против Nogo-рецептора-Т Клетки размножали и подвергали сортингу с использованием R-PE-конъюгирован-ного козьего антитела против IgG крысы. После второго сортинга клетки высевали при плотности одна клетка на лунку в 96-луночных планшетах. Определяли уровни секретируемого растворимого белка Nogo-рецептора-1 из индивидуальных лунок и сравнивали с использованием Сэндвич-ELISA. Планшет ELISA покрывали козьим FcK-специфическим антителом против крысиного Fab IgG. Использовали кондиционированную среду. Связанный растворимый белок Nogo-рецептора-1 детектировали HRP-конъю-гированным ослиным Fc-специфическим антителом против Fab IgG крысы. Клон 4С12 имел наивысший уровень секреции. 4С12 размножали и выращивали в среде СНO-М7 во вращающейся колбе. Уровень секреции был приблизительно 10 мг/л при 37°С.
Клетки СНО, экспрессирующие слитый белок sNogoR310-Fc, культивировали в крупном масштабе. 1,7 л концентрированной кондиционированной среды получали из опыта с биореактором на 10 л. рН повышали добавлением 1/10 объема 1,0 М Трис-HCl, рН 8,9. Твердые хлорид натрия и глицин добавляли до 3,0М и 1,5М, соответственно. Готовили белок А-сефарозную колонку 60 мл, уравновешенную 10 мМ Трис-HCl, 3М хлоридом натрия, 1,5М глицином, рН 8,9. Концентрированную кондиционированную среду наносили на эту колонку при скорости 1,5 мл/мин с использованием перистальтического насоса. Колонку промывали 300 мл 10 мМ Трис-НО, 3М хлорида натрия, 1,5М глицина, рН 8,9, и затем 120 мл 5 мМ Трис-НО, 3М хлорида натрия, рН 8,9. Белок элюировали 25 мМ фосфатом натрия, 100 мМ хлоридом натрия, рН 2,8. Фракции по 10 мл собирали в пробирки, содержащие 1,0 мл 1,0М HEPES, рН 8,5. Белковые фракции объединяли и диализовали против 3х2 л 5 мМ фосфата натрия, 300 мМ NaCl, рН 7,4.
Пример 12. Анализ поперечного разреза спинного мозга.
Для испытания его способности стимулировать функциональное восстановление in vivo слитый белок sNogoR-1 испытывали в анализе поперечного разреза спинного мозга крысы.
Осмотические насосы Alzet(r) загружали тест-раствором (sNogoR310-Fc в ЗФР), свежеприготовленным в день использования. Было рассчитано, что концентрация загрузки была 5 и 50 мкМ. Насосы прай-мировали в течение > 40 ч при 37°С перед имплантацией в животных. Самки крыс Long Evans получали предоперационную анальгезию и транквилизатор и были анестезированы изофлураном (3% в O2).
Крыс помещали в стереотаксическую рамку и двигательную область коры головного мозга обнажали для инфузии прослеживающего путь агента BDA (молекулярная масса 10000) билатерально. Затем крыс подвергали дорсальному одностороннему разрезу спинного мозга на уровне Т5-Т6 с последующей имплантацией подоболочечного катетера и системы насоса для доставки тест-соединения (n=11 на группу).
Крысам давали восстанавливаться и выживать до 28 дней после хирургии. Поведенческую оценку с использованием ВВВ-системы регистрировали до 28 дней после индукции повреждения, как раз перед окончанием прижизненной фазы данного исследования. После перфузии и фиксации спинной мозг удаляли, криопротектировали, делали срезы, окрашивали и выполняли счет аксонов.
Шкалу двигательных оценок Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso et al., 1996, Neurotrauma 13, 343359), тест наклонной плоскости и тест хождения по наклонной решетке (Li and Strittmatter, 203, J. Neirosci. 2003, 23, 4219-27) проводили посредством мониторинга в крысах и мышах после нанесения травмы. Для теста наклонной плоскости авторы изобретения измеряли максимальный угол, на который может быть наклонена доска 50х60 см в течение 5 с без соскальзывания мыши. Для хождения по наклоннной решетке мышей обучали карабкаться по проволочной решетке (длиной 35 см, площадью 2,54 кв.см) при наклоне 45°. Количество случаев, в которых задняя лапка проваливалась ниже плоскости решетки, оценивали для каждого перемещения от нижней части до верхней части. Для поведенческого тестирования крыс использовали локомоторную шкалу ВВВ, хождение по решетке и анализ следов. Для хождения по наклонной решетке крыс обучали ходить по проволочной решетке (длиной 70 см, площадью 2,54 кв.см) и подсчитывали количество случаев, в которых задняя лапка проваливалась ниже плоскости решетки. Для анализа следов картины хождения задних лапок крысы регистрировали с использованием чернил во время непрерывного передвижения через огороженное место 90 см и длину шага на каждой стороне и ширину шага рассчитывали (Metz et al., 2000, Brain Res., 883, 165-177). Все эти поведенческие тесты вы
- 26 -
008253
полнялись по меньшей мере двумя индивидуумами. Во время хирургии, поведенческого тестирования и гистологического анализа исследователи были "слепыми" относительно идентичности конкретного соединения в мининасосе.
sNogoR310-Fc стимулировал функциональное восстановление (фиг. 12).
Пример 13. Анализ контузии спинного мозга крыс.
Действие растворимых полипептидов Nogo-рецептора-1 и слитых белков Nogo-рецептора-1 на нейронах in vivo испытывали в анализе контузии спинного мозга крыс.
Самок крыс Long Evans (170-190 г), помещенных в бокс, обрабатывают профилактически анальте-зирующими и антибиотическими агентами. За 10 мин перед хирургией животным вводят внутрибрю-шинно (i.p.) транквилизатор в виде 2,5 мг/кг мидозолама и анестезируют их 2-3% изофлурана в O2. Затем крыс бреют, обтирают спиртом и бетадином и в их глаза вносят глазное смазывающее вещество. Затем делают разрез вниз по срединной линии и обнажают позвонки Т7-Т12.
Дорсальную ламнэктомию выполняют при 79 1.2 и Т10 для обнажения спинного мозга. Крысу помещают на импактор (устройство для нанесения ударов). Сначала фиксируют сегменты Т7 и Т8, а затем сегменты Т11 и Т12 прикрепляют к каудальному зажиму. Под грудью крысы помещают мягкий материал. Стержень импактора устанавливают в положение нуля и электрически опускающиеся скобки присоединяют к краю раны. Затем стержень импактора поднимают на 25,0 мм и корректируют должным образом до положения, находящегося непосредственно над обнаженным спинным мозгом. Затем стержень импактора высвобождают для удара по обнаженному спинному мозгу и немедленно поднимают стержень импактора.
Затем крысу снимают с прибора и на рану помещают Gelfoam(r). Мышцу над раной зашивают и разрез хирургически ушивают. Животных помещают в инкубатор до восстановления от анестезии. По мере необходимости крысам вводят антибиотики, анальгетики и солевой раствор. Мочевые пузыри отжимают каждое утро и каждый вечер после этого, пока функция не восстанавливается.
Растворимый слитый белок Nogo-рецептора-1 (например, sNogoR310-Fc) вводят подоболочечно, как описано в модели поперечного разреза спинного мозга крыс выше. ВВВ-оценивание выполняют спустя 1 день после хирургии, затем каждую неделю после этого до 4-6 недель.
Пример 14. Экспрессия sNogoR310 в трансгенных мышах.
Авторы изобретения получали трансгенных мышей, экспрессирующих растворимый белок Nogo-рецептора-1, для испытания его действия при экспрессии in vivo.
Авторы изобретения клонировали кДНК sNogoR310 мыши (соответствующую аминокислотам 1310 Nogo-рецептора-1) в сайт NotI вектора С-3123. В этом векторе экспрессия sNogoR310 находится под контролем регуляторных элементов глиального фибриллярного кислого белка (gfap), которые делают возможным высокий уровень экспрессии с увеличенной секрецией из реактивных астроцитов в месте повреждения. Авторы изобретения расщепляли полученный вектор последовательно AatII и SfiI и выделяли конструкцию gfap::sNogoR310 на фрагменте 3,4 т.п.н. Авторы изобретения микроинъецировали этот фрагмент в зародыши для генерирования трансгенных мышей. Авторы подтвердили при помощи ПЦР, что этот трансген был интегрирован, и идентифицировали пять линий-основателей. Авторы изобретения скрестили гетерозиготных самцов двух линий-основателей с наивысшими уровнями экспрессии с самками мышей C57BL/6J. Авторы подтвердили, что GFAP-положительные клетки экспрессируют и секретируют sNogoR310 в гетерозиготных трансгенных мышах, при помощи Вестерн-блот-анализа с использованием антитела, индуцированного против Nogo-рецептора-Т
Авторы изобретения гомогенизировали кору головного мозга и спинной мозг в забуференном Три-сом солевом растворе, дополненном ингибиторами протеаз (Roche) и центрифугировали этот гомогенат при 40000 об./мин в течение 20 мин при 4°С. Авторы изобретения обрабатывали супернатант 4% пара-формальдегидом в течение 20 мин для увеличения специфичности антител и диализовали перед имму-ноблоттингом. Авторы гомогенизировали фракцию частиц обработкой ультразвуком в буфере RIPA (1% Тритон(r) Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% ДСН в ЗФР), центрифугировали полученный гомогенат и обрабатывали этот супернатант (растворимую детергентом фракцию частиц), как описано выше. Авторы анализировали 20 мкг белка головного мозга или спинного мозга иммуноблоттингом с использованием кроличьей антисыворотки, индуцированной против Nogo-рецептора-1, при разведении 1:2000. Авторы изобретения визуализировали иммунореактивность инкубированием с АР-конъюгированными антителами против кроличьего IgG и субстратами АР (кислой фосфатазы) NBT/BCIP.
Авторы изобретения детектировали секретированный sNogoR310 в не содержащих детергента растворимых экстрактах коры головного мозга и спинном мозге из двух трансгенных линий Tg08 и Tg01, но малое количество, если оно вообще детектировалось, растворимого белка Nogo-рецептора-1 при 37 или 81 кДа присутствовало в однопометных мышах дикого типа (WT). Испытание фракций частиц показало, что уровни эндогенного Nogo-рецептора-1 как в мышах WT, так и в трансгенных мышах были сравнимыми.
Пример 15. Экспрессия sNogoR310 в трансгенных мышах после повреждения.
Авторы изобретения испытывали действие повреждения ЦНС на экспрессию sNogoR310 в трансгенных мышах выполнением повреждения посредством дорсального глубокого одностороннего разреза. Получали sNogoR310-трансгенных и нетрансгенных контрольных животных спариванием гетерозигот
- 27 -
008253
ных самцов с самками C57/BL6, как описано в примере 14.
Взрослых самок гетерозиготных трансгенных мышей или однопометных мышей дикого типа (WT) (10-16-недельного возраста) глубоко анестезировали и выполняли полную ламинэктомию, полностью обнажая дорсальную часть спинного мозга на уровне позвонков Т6 и Т7. Выполняли дорсальный глубокий односторонний разрез при Т6 с использованием иглы 30 G и пары микроножниц для полного разъединения дорсального и дорсолатерального кортикоспинальных (корково-спинно-мозговых) (пирамидных) путей (CST). Помеченную иглу проводили через дорсальную часть спинного мозга несколько раз для гарантии того, что это повреждение имело глубину 1,0 мм. Мышечные слои зашивали над ламинэк-томиями и кожу на спинке закрывали хирургическими скобками. Для прослеживания кортикоспиналь-ных (корково-спинно-мозговых) делали трепанационное отверстие над корой головного мозга с правой стороны в череп спустя 14 дней после повреждения спинного мозга. Вводили индикатор BDA (молекулярная масса 10000, 10% в ЗФР) (Molecular Probes, Eugene, OR) в 4 места инъекции при глубине 0,7 мм от поверхности коры головного мозга. Спустя 4 недели после повреждения этих мышей перфузировали через сердце ЗФР и затем 4% параформальдегидом.
Мыши, используемые для экспериментов по экспрессии sNogoR310, не получали инъекции индикатора.
Для мышей, используемых для Вестерн-блот-анализа, спинной мозг на уровне между Т3 и L3 собирали без перфузии спустя 14 дней после повреждения. Мышей, используемых для иммуногистохимиче-ского окрашивания, перфузировали 4% параформальдегидом спустя 10 дней после одностороннего разреза и поврежденный спинной мозг удаляли для приготовления срезов. Для испытания экспрессии sNogoR310 в поврежденном головном мозге трансгенных мышей и мышей дикого типа (WT) уколочное повреждение коры головного мозга выполняли с использованием лезвия скальпеля номер 11, удерживаемого в стереотаксическом аппарате (David Kopf, Tujunga, CA). Делали парасагиттальный разрез 4 мм, в 0,5 мм сзади относительно брегмы, в 1,5 мм латерально от срединной линии и на глубину 3,5 мм.
Увеличенные уровни sNogoR310 детектировали в растворимых экстрактах спинного мозга спустя 10 дней после повреждения в трансгенных мышах, но не в мышах дикого типа (WT), что согласуется с повышающей регуляцией после повреждения GFAP вокруг повреждения. Для подтверждения, что это не обусловлено компенсаторной повышающей регуляцией Nogo-A, авторы испытывали его экспрессию и обнаружили, что она является одинаковой либо в интактной, либо в поврежденной коре головного мозга и в спинном мозгу либо из мышей дикого типа, либо из трансгенных мышей.
Клеточную экспрессию sNogoR310 в поврежденной ЦНС испытывали иммуноокрашиванием поврежденного головного мозга и спинного мозга, содержащих зоны повреждения, с антителами против Nogo-рецептора-1 и GFAP. Общая морфология реактивной астроцитарной глии не различается между мышами WT и трансгенными мышами, но плотность, окрашенная на Nogo-рецептор-1 как во внутриклеточном, так и во внеклеточном пространстве, является явно более высокой в gfар::sNogoR310-трансген-ных мышах, чем в мышах WT, что указывает на увеличенную экспрессию sNogoR310 вокруг повреждения в трансгенных мышах. Белок Nogo-рецептора-1 колокализуется с астроцитарным маркером GFAP (глиальным фибриллярным кислым белком) только в трансгенных мышах. Имеется также в значительной степени увеличенное диффузное неклеточное окрашивание в трансгенных пробах, что согласуется с присутствием sNogoR310 во внеклеточном пространстве. Окрашивание Nogo-рецептора-1 тела нейрона детектируется как в мышах WT, так и в трансгенных мышах.
Пример 16. Секретированный sNogoR310 индуцирует разрастание CST в трансгенных мышах.
Авторы изобретения исследовали, приводит ли увеличенная экспрессия sNogoR310 около повреждения в трансгенных мышах к регенерации поврежденных аксонов.
Авторы исследовали целостность корково-спинно-мозговых путей (CST) инъекцией антероградного индикатора биотиндекстранамина (BDA) в двигательную область коры головного мозга, как описано в Li and Strittmatter, 2003, J. Neurosci., 23, 4219-27. В однопометных мышах дикого типа рельефный дорсальный CST (dCST) прочно связан рострально с повреждением и несколько дорсолатеральных волокон CST видны ипсилатерально. Небольшое количество BDA-меченых коротких коллатеральных выростов выступают в серое вещество, в частности, в вентральном тяже, но это разрастание в значительной степени ограничено стороной этого тяжа, контралатеральной относительно инъекции индикатора. Однако срезы рострального-дорсального одностороннего разреза из поврежденной sNogoR310-трансгенной мыши обнаруживают совершенно другую картину распределения мечения. Высокая плотность BDA-волокон CST наблюдается снаружи от рельефных dCST во всех трансгенных мышах из линии Tg08 или линии Tg01. Эктопические волокна простираются через зону серого вещества, и некоторые волокна доходят в латеральное и дорсолатеральное белое вещество. Несколько волокон (4-12 ответвлений на поперечный срез) видны на противоположной стороне спинного мозга (ипсилатерально относительно места инъекции индикатора). Микроденситометрическое измерение коллатеральных разрастаний указывает на приблизительно десятикратное увеличение плотности разрастания в sNogoR310-трансгенных мышах. Исследование парасагиттальных продольных срезов от 1 до 4 мм рострально относительно повреждения обнаруживает большое количество ветвящихся выростов в вентральную зону серого вещества в sNogoR310-трансгенной мыши, в противоположность однопометным животным WT. В общем, картина и степень разрастания, рострального относительно повреждения в трансгенных мышах, являются сходными с кар
- 28 -
008253
тиной и степенью разрастания, наблюдаемыми в мышах, обработанных системно пептидом-антагонистом NEP1-40 Nogo-рецептора-1 (Li and Strittmatter, 2003).
Эти результаты демонстрируют, что секретируемый sNogoR310 индуцирует разрастание CST в трансгенных мышах.
Пример 17. Регенерирующие аксоны CST обходят место повреждения в дистальный спинной мозг в sNogoR310-трансгенных мышах.
Авторы изобретения выделили спинной мозг, рострально в 4 мм и каудально в 4 мм относительно места повреждения (длиной, в целом, 8 мм) из трансгенных мышей, и залили его в полимеризованный глутаровым альдегидом альбуминовый матрикс, и сделали срезы парасагиттально на вибратоме (толщиной 30 мкм). Поперечные срезы (50 мкм) брали из спинного мозга в 5-7 мм рострально и в 5-7 мм кау-дально относительно места повреждения. Для экспериментов с инъекцией sNogoR310-Fc на крысах спинной мозг, простирающийся от 10 мм рострально до 10 мм каудально от места повреждения, нарезали парасагиттально (50 мкм) на вибрирующем микротоме. Поперечные срезы собирали из спинного мозга рострально в 11-16 мм и каудально в 11-16 мм относительно места повреждения. Эти срезы инкубировали с комплексом авидин-биотин-пероксидаза и визуализировали индикатор BDA усиленной никелем диаминобензидин-НРR-реакцией (Grandpre, 2002, Nature, 417, 547-551). Авторы изобретения обрабатывали некоторые срезы для иммуногистохимии с использованием серотонина (анти-5-НТ-антитело) посредством опосредованной иммунофлуоресценции. Для визуализации зоны повреждения некоторые срезы окрашивали двойным окрашиванием антителами, направленными против GFAP (Sigma(r), St. Louis, МО). Эти срезы монтировали, дегидратировали и покрывали средой для гистологических препаратов.
Авторы изобретения исследовали, индуцировались ли волокна sNogoR310, экспрессируемые в трансгенных мышах после повреждения (см. пример 16), через зону повреждения в каудальный спинной мозг для обеспечения функционального восстановления.
Последовательные парасагиттальные срезы через место повреждения, взятые в camera lucida, показывают общую картину распределения регенерирующих волокон CST в нескольких миллиметрах от повреждения. Срезы из мышей WT не показывавают волокон CST за местом повреждения. Подобные срезы из sNogoR310-трансгенных мышей показывают многочисленные волокна CST, которые пересекают эту зону рассечения и выступают в дистальные зоны серого и белого вещества в виде высокоразветвленной картины. Непосредственно рострально относительно одностороннего разреза высокая плотность BDA-меченого разрастания CST, происходящая из рельефных dCST, выступает в зону повреждения, но большинство разрастаний CST не могут проходить зону разреза, где образование рубцов и образование полостей в ткани являются очень заметными. Небольшая, но высоко значимая фракция регенерирующих аксонов обходит место повреждения через мостики оставшейся ткани вентрального и вентролатерально-го серого и белого вещества. Кроме того, небольшое количество волокон CST, по-видимому, пересекают саму зону разреза через поврежденный дорсальный и дорсолатеральный спинной мозг в дистальные участки. Вблизи от повреждения ход регенерирующих волокон был обычно извилистым и очень отличающимся от нормальных прямых волокон в ростральных CST. Боковые и древовидные волокна наиболее часто наблюдаются в зоне серого вещества дистального спинного мозга. Реконструирования демонстрируют 5-15 BDA-меченых регенерирующих волокон, идущих в рострально-каудальной оси при любом уровне в 1-4 мм каудально относительно повреждения в каждой трансгенной мыши. Количества волокон для трансгенных мышей указывают на приблизительно сходное количество BDA-меченых волокон относительно проксимальных уровней в сагиттальных срезах.
Кроме волокон CST, другие нисходящие пути, такие как рафеспинальные волокна, также способствуют опорно-двигательной функции в мышах. В этой мышиной модели дорсального глубокого одностороннего разреза поперечный разрез повреждает большинство серотонергических волокон, уменьшая плотность этих волокон приблизительно на 80% в переднем роге. Анализ общей длины серотониновых волокон в переднем роге каудального спинного мозга показывает гораздо большее количество этих волокон в трансгенных мышах, чем в мышах дикого типа, что указывает на то, что стимулирующие рост эффекты sNogoR310 в трансгенных мышах не ограничиваются одним нисходящим путем аксонов.
Пример 18. Трансгенная экспрессия sNogoR310 улучшает локомоторное восстановление.
Прослеживание аксонов CST и анализ серотонергических волокон показывают, что sNogoR310, высвобождаемый из астроцитов в трансгенных мышах, стимулирует интенсивную анатомическую регенерацию поврежденных нисходящих аксонов в спинном мозге. Авторы выполняли несколько поведенческих тестов, как описано в примере 12, для определения, извлекают ли эти регенерированные волокна пользу в виде функционального восстановления.
Как было оценено в ВВВ-тесте, мыши WT частично восстанавливали опорно-двигательную функцию во время 4-недельного периода выживания. При 4 неделях после повреждения большинство мышей WT восстанавливают уровень, характеризуемый стойкой плантарной походкой со стойким поддержанием массы, но обнаруживают лишь случайную частую координацию передних/задних конечностей, с периодической переменой преобладающего положения лапок при начальном контакте с поверхностью. В противоположность этому, ВВВ-оценки sNogoR310-трансгенных мышей как из линии Tg08, так и из линии Tg01 являются значимо более высокими, чем в контрольной группе на протяжении 7-28-дневного
- 29 -
008253
периода наблюдения (фиг. 13А и 13В). При 28 днях после повреждения большинство трансгенных мышей показывают стойкую координацию передних-задних конечностей, и преобладающее положение лапок является параллельным телу.
Авторы изобретения использовали два поведенческих теста для дополнительной характеристики двигательной активности sNogoR310-трансгенных мышей. Во-первых, авторы измерили максимальный угол, на который может быть наклонена доска без потери мышью ее крепкого удерживания в пределах 5 с. Перед дорсальным односторонним повреждением как трансгенные мыши, так и мыши WT могут поддерживать свое положение тела (позу) на доске, наклоненной под углом 55°. В дни 7-28 после повреждения выдерживаемый угол наклона уменьшается для всех мышей, но углы, выдерживаемые трансгенными мышами, являются значительно большими, чем углы, выдерживаемые контрольной группой (фиг. 13С). В другом поведенческом тесте мыши взбирались на решетку, помещенную под углом 45° к вертикали, и проводился подсчет попаданий задних конечностей ниже поверхности этой решетки (Metz et al., 2000). Ни одна из мышей не ошибалась в этом тесте во время тренировки перед обучением. Имелись многочисленные ошибки с промахами лапок всего лишь с минимальным улучшением в мышах дикого типа во время 2-6-недельного периода после повреждения. В отличие от этого, sNogoR310-трансгенные мыши обнаруживают прогрессирующее улучшение при вскарабкивании на решетке во время этого периода, причем большинство улучшений имеют место между 1-3 неделями после повреждения (фиг. 13D). Таким образом, трансгенные мыши, секретирующие sNogoR310 из астроцитов, проявляют регенерацию CST, рафеспинальное разрастание и улучшенную двигательную функцию после торакального одностороннего разреза спинного мозга.
Пример 19. Подоболочечное введение белка sNogoR310-Fc индуцирует разрастание CST.
В качестве второго теста стимулирующей рост пользы растворимого Nogo-рецептора-1 после травмы спинного мозга авторы изобретения вводили этот очищенный белок подоболочечно (интратекально).
Авторы изобретения сливали лигандсвязывающий домен (27-310) крысиного Nogo-рецептора-1 с Fc-доменом крысиного IgG1 для улучшения стабильности и очистки. Белок очищали из стабильно трансфицированных клеток СНО. Этот белок блокирует действие Nogo-66, MAG и миелина in vitro, как показано ранее для мышиного sNogoR310-Myc-His (Fournier et al., 2002, J. Neurosci., 22, 8876-8883; Liu et al., 2002, Science, 297, 1190-1193). Белок sNogoR310-Fc доставляли подоболочечно крысам с использованием повреждения срединным торакальным дорсальным односторонним разрезом посредством осмотического мининасоса. Во время 4-недельного периода выживания после повреждения в каждую крысу вводили локально 1,2 мг белка sNogoR310-Fc. В крысах, получавших обработку носителем (1,2 мг крысиного IgG), срезы, ростральные относительно одностороннего разреза, обнаруживают прочно связанные в пучок рельефные дорсальные CST и очень мало эктопических BDA-меченых волокон CST выше места повреждения. Срезы, ростральные относительно повреждения, из поврежденных крыс, получавших белок sNogoR310-Fc, обнаруживают совершенно другую картину распределения мечения. Многочисленные эктопические волокна, разрастающиеся из BDA-меченых CST, наблюдаются из поперечных и пара-сагиттальных срезов. В некоторых случаях выступы пересекают участок от зоны dCST вблизи срединной линии до периферии спинного мозга, становясь перемешанными с дорсолатеральными CST. Разрастание аксонов простирается через серое вещество в большей степени, чем через белое вещество. Измерение эктопических разрастающихся волокон (> 100 мкм в поперечных срезах, > 200 мкм в сагиттальных срезах) рядом с dCST выявило большее увеличение в обработанных sNogoR310-Fc крысах.
Пример 20. Аксоны CST регенерируют в дистальный спинной мозг в обработанных sNogoR310-Fc крысах.
Авторы изобретения глубоко анестезировали самок крыс Sprague-Dawley (190-250 г) и проводили ламинэктомию при спинальных уровнях Т6-7 с обнажением спинного мозга. Дорсальную половину спинного мозга разрезали с использованием иглы 30 G и пары микроножниц для разъединения дорсальных частей путей CSGT и гарантировали глубину повреждения (1,8 мм) проведением острой части лезвия номер 11 через дорсальную половину спинного мозга (Grandpre et al., 2002, Nature, 417, 547-551). Осмотический мининасос (Alzet(r) 2ML4 с объемом 2 мл, 2,5 мкл/ч, доставка в течение 28 дней), который был наполнен 1,2 мг крысиного IgG в ЗФР или 1,2 мг слитого белка sNogoR3-Fc в ЗФР, зашивали в мышцы под кожей на спинке этих животных. Катетер, соединенный с выходом этого мининасоса, вставляли в подоболочечное пространство спинного мозга на уровне Т7-8 через небольшое отверстие в твердой мозговой оболочке.
Инфузия белка-антагониста Nogo-рецептора-1 индуцировала интенсивное разрастание рострально относительно одностороннего разреза крысы, но более критической проблемой является, выступает ли разрастание волокон CST до дистального спинного мозга и способствует ли оно локомоторному восстановлению. Продольные срезы через место повреждения из обработанных носителем крыс не обнаруживают детектируемого количества или обнаруживают очень малое количество BDA-меченых вентральных волокон CST ниже уровня повреждения (Grandpre et al., 2002; Weidner et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3513-3518). Подобные срезы из обработанных sNogoR310-Fc крыс демонстрируют многочисленные BDA-меченые волокна, которые обходят место повреждения и выступают до каудального спинного мозга, в основном, через мостиковые ткани вентрального и вентролатерального спинного мозга.
- 30 -
008253
Иммуноокрашивание на маркер астроцитов GFAP показывает, что достигалась степень разреза более глубокая, чем зона центрального канала. В отличие от линейного профиля ростральных волокон в выступающем дорсальном CST, регенерированные волокна CST обычно идут по траектории высокого разветвления в дистальном спинном мозге, в частности в зоне серого вещества. Эти волокна детектируются во многих участках спинного мозга, но они более легко видны в центральной части и дорсальной половине спинного мозга по всему спинному мозгу. Количество волокон CST из сагиттальных срезов показывает приблизительно 20 BDA-меченых аксонов в 1-2 мм каудально относительно повреждения и 15 меченых аксонов в 7-8 см дистально относительно повреждения из каждой обработанной sNogoR310-Fc крысы.
Обычно картина ветвления этих волокон является сходной с картиной ветвления, наблюдаемой из обработанных локально пептидом NEP1-40 животных, но большее коллатеральное (боковое) ветвление в каждом выросте наблюдается из срезов из обработанных белком sNogoR310-Fc животных. Измерение выростов из дистального спинного мозга демонстрирует, что общая длина коллатеральных ветвлений каждого выроста в обработанных sNogoR310-Fc крысах является в 2 раза большей, чем эта длина из обработанных NEP1-40 животных. Количество выростов (> 200 мкм в длину) в 1-10 мм каудально относительно спинного мозга в обработанных обоими антагонистами Nogo-рецептора-1 группах является приблизительно в 20-40 раз большим, чем в контрольной группе. Больше выростов наблюдают из обработанных sNogoR310-Fc крыс, чем при локальной обработке NEP1-40 (~50 в сравнении с 25 выростами на крысу), но это различие не является статистически значимым (р=0,1713, t-критерий Стьюдента).
Регенерацию аксонов CST наблюдают в поперечных срезах спинного мозга в 11-12 мм каудально относительно одностороннего разреза в крысах, получающих обработку sNogoR310-Fc. Эти волокна детектируются как в сером веществ, так и в белом веществе спинного мозга. Волокна, детектируемые в сером веществе, часто обнаруживают большее боковое ветвление, чем в зоне белого вещества. В противоположность этому, в поперечных срезах из обработанной носителем группы только случайные BDA-меченые волокна видны в вентральной зоне белого вещества, что согласуется с неповрежденными вентральными аксонами CST. На этом уровне дистального спинного мозга среднее количество BDA-меченых волокон CST из групп, обработанных обоими антагонистами Nogo-рецептора-1 [sNogoR310-Fc и NEP1-40] приблизительно в 20 раз больше, чем это количество в обработанных носителем крысах. Взятые вместе, оба антагониста Nogo-рецептора-1, белок sNogoR310-Fc и пептид NEP1-40 приводят к разительной регенерации аксонов CST в дистальном спинном мозге, но разрастание, индуцируемое первым антагонистом, обнаруживает более высоко разветвленную картину разрастания.
Пример 21. Локальная обработка sNogoR310-Fc индуцирует разрастание руброспинальных и серо-тонергических аксонов в поврежденном спинном мозгу крысы.
Спустя 14 дней после одностороннего разреза трепанационное отверстие делали на каждой стороне черепа над сенсорно-моторной корой задних конечностей для прослеживания волокон CST. Антероград-ный нейронный индикатор BDA (10% в ЗФР, 3,5 мкл на кору) наносили в семи местах инъекций при глубине 1,5 мм от твердой мозговой оболочки на каждой стороне (Grandpre, 2002). Для прослеживания руб-роспинального пути в крысах индикатор BDA (1 мкл; молекулярная масса 10000; 10% в ЗФР) инъецировали в красное ядро на левой стороне (на 5,8 мм за брегмой, на 0,7 мм латерально, на 7,0 мм вентрально относительно поверхности черепа). Спустя 2 недели после инъекции BDA этих животных перфузировали ЗФР, затем 4% параформальдегидом и ткань собирали для гистологии.
Восстановление порежденных волокон руброспинального пути (RST) способствует функциональным улучшениям после повреждения спинного мозга (Liu et al., 1999, J. Neurosci., 19, 4370-4387). Широко распространенное распределение Nogo-рецептора-1 в нейронах ЦНС (Wang et al., 2002, J. Neurosci., 22, 5505-5515) делает возможным то, что ингибирование Nogo-рецептора-1 его антагонистом может приводить к повторному росту аксонов RST после повреждения. Для испытания действий sNogoR310-Fc на поврежденный RST целостность этого пути прослеживали инъекцией BDA в левое красное ядро. На уровне спинного мозга волокна RST обычно локализованы в дорсолатеральной зоне белого вещества спинного мозга и разрезаются дорсальными односторонними разрезами этого исследования. В поперечных срезах из контрольных крыс в 11-15 мм рострально относительно повреждения видно небольшое количество коротких BDA-меченых волокон между выступающим RST и серым веществом дорсального рога. Срезы на том же уровне, обработанные sNogoR310-Fc, обнаруживают много связывающих волокон между основным RST и серым веществом дорсального рога. Поперечные срезы в 11-15 мм дистально относительно SCI не обнаруживают BDA-меченых волокон RST в обработанных носителем крысах. В противоположность этому, срезы на том же самом уровне, получавшие обработку sNogoR310-Fc, показывают много BDA-меченых волокон RST как в сером, так и в белом веществе, контралатеральном относительно инъекции индикатора. Некоторые выросты с картиной ветвления видны в сером веществе, ип-силатеральном относительно инъекции BDA.
Руфеспинальные волокна спинного мозга также исследовали в обработанных sNogoR310-Fc, имеющих повреждение в спинном мозгу крыс. Иммуноокрашивание демонстрирует плотность серотонергиче-ских волокон в 11-15 мм рострально относительно повреждения, что является сходным между обработанными носителем и sNogoR310-Fc группами. В срезах в 11-15 мм ниже этого повреждения серотонер
- 31 -
008253
гические волокна в обработанных sNogoR310-Fc крысах находятся в количествах, в 2 раза больших, чем эти волокна в контрольной группе. Эти результаты демонстрируют, что чувствительность к ингибирова-нию Nogo-рецептора-1 белком sNogoR310-Fc не ограничивается волокнами CST и что другие нисходящие пути, такие как руброспинальные и серотонергические аксоны, являются также чувствительными к антагонистам Nogo-рецептора-Т
Пример 22. Локальная обработка sNogoR310-Fc улучшает функциональное восстановление у крыс.
Подоболочечное введение белка sNogoR310-Fc стимулирует регенерацию аксонов в нескольких нисходящих путях после травматического повреждения спинного мозга. Авторы исследовали, улучшает ли этот белок также функциональное восстановление в поврежденном спинном мозгу.
При 2 неделях после одностороннего разреза локомоторная оценка ВВВ в обработанных носителем крысах достигает стабильного уровня 12 (фиг. 14А). При 4 неделях после повреждения большинство контролей (6 из 7) имеют часто стойкую плантарную походку со стойким поддержанием массы и часто стойкую координацию передних-задних конечностей, но они имеют периодическую перемену преобладающего положения лапок при начальном контакте с поверхностью. В противоположность этому, в крысах, получавших обработку белком sNogoR310, опорно-двигательная оценка продолжает улучшаться между 2-4 неделями после травмы. При 4 неделях после повреждения большинство обработанных sNogoR310-Fc животных имели стойкую координацию передних-задних конечностей и параллельное положение лапок при начальном контакте с тестирующей поверхностью.
Хождение по решетке использовали для оценки недостатков в нисходящем тонком двигательном контроле после повреждения спинного мозга (Metz et al., 2000). Эта активность требует координации передних-задних конечностей и произвольного контролирования движения, опосредуемого вентролате-ральными, корково-спинно-мозговыми (кортикоспинальными) и руброспинальными волокнами. Во время предварительного обучения все крысы точно помещают их задние конечности на стержни решетки. При 2-4 неделях после повреждения контрольные крысы делают 8-9 ошибок на одну попытку лишь с минимальным улучшением во времени. В противоположность этому, крысы, обработанные sNogoR310-Fc, проявляют прогрессирующее улучшение в хождении по решетке и делают значимо меньше ошибок (4-7 на одну попытку, в среднем). Большая часть улучшения имеет место при 2-3 неделях после повреждения. Анализ следов задних лапок в контрольной группе показывает, что длина шага является значимо уменьшенной и ширина положения лапок является увеличенной при 4 неделях после одностороннего повреждения в сравнении с неповрежденными крысами или поврежденными животными, получающими обработку sNogoR310-Fc (фиг. 14С). Таким образом, эти множественные поведенческие тесты демонстрируют, что блокада функции Nogo-рецептора-1 локальной инъекцией белка-антагониста улучшает локомоторное восстановление после повреждения.
Биологические депозиты
Гибридомы НВ 7Е11 (АТСС(r) accession No. PTA-4587), HB 1H2 (АТСС(r) accession No. PTA-4586), НВ 5В10 (АТСС(r) accession No. РТА-4588) и НВ 2F7 (АТСС(r) accession No. PTA-4585) были депонированы Американской Коллекцией Типовых Культур ("АТСС(r)"), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, 9 августа 2002г.
Как будет понятно специалистам с квалификацией в данной области, многочисленные изменения и модификации могут быть произведены в отношении предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения без отклонения от идеи данного изобретения. Предполагается, что все такие вариации находятся в рамках данного изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид, выбранный из группы, состоящей из AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 26); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 27); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 29); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 30); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 31); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 32); LDALSDDAELR (SEQ ID NO:
33); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 34); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 35); DNAQLRVVDPTT (SEQ ID
NO: 36); DNAQLR (SEQ ID NO: 37); ADLSDNAQLRVVDPTT (SEQ ID NO: 41); LALSDNAQLRVVDPTT
(SEQ ID NO: 42); LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ ID NO: 43); LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO: 44) и LDLSDNAQLAVVDPTT (SEQ ID NO: 45).
2. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1.
3. Нуклеиновая кислота по п.2, функционально связанная с последовательностью контроля экспрессии.
4. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.2 или 3.
5. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.2 или 3 или содержащая вектор по п.4.
6. Способ получения полипептида по п.1, предусматривающий стадии:
(a) культивирования клетки-хозяина по п.5 и
(b) извлечения полипептида из клетки-хозяина или культуральной среды.
7. Способ получения антитела, предусматривающий стадии:
(a) иммунизации хозяина полипептидом по п.1 или клеткой-хозяином по п.5 и
- 32 -
008253
(b) извлечения антитела.
8. Антитело, полученное способом по п.7, или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом по п.1, где это антитело не является моноклональным антителом, продуцируемым гибридом-ной клеточной линией НВ 7Е11 (АТСС(r) accession No. РТА-4587).
10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело:
(a) ингибирует коллапс конуса роста нейрона;
(b) уменьшает ингибирование выроста и разрастание нейритов в нейроне и
(c) ингибирует связывание Nogo-рецептора-1 с лигандом.
11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где вырост и разрастание нейритов является аксонным ростом.
12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.
13. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является моноклональ-ным антителом.
14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где антитело является мышиным антителом.
15. Антитело по п.8 или 9, где антитело выбрано из группы, состоящей из гуманизированного антитела, химерного антитела и одноцепочечного антитела.
16. Способ ингибирования связывания Nogo-рецептора-1 с лигандом, предусматривающий стадию контактирования Nogo-рецептора-1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по п.10.
17. Способ по п.16, где лиганд выбран из группы, состоящей из NogoA, NogoB, NogoC, MAG и OM-
18. Способ ингибирования коллапса конуса роста в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.
19. Способ уменьшения ингибирования выроста или разрастания нейритов в нейроне, предусматривающий стадию контактирования этого нейрона с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.10.
20. Способ по п.19, где вырост или разрастание нейритов является аксонным ростом.
21. Способ по п.18 или 19, где нейрон является нейроном центральной нервной системы.
22. Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и антитело или антигенсвя-зывающий фрагмент по п.8 или 9.
23. Композиция по п.22, дополнительно содержащая один или несколько дополнительных терапевтических агентов.
24. Способ стимуляции выживания нейрона при риске умирания, предусматривающий контактирование этого нейрона с эффективным количеством антитела или антигенсвязывающего фрагмента против Nogo-рецептора-1 по п.8 или 9.
25. Способ по п.24, где нейрон является нейроном in vitro.
26. Способ по п.24, где нейрон находится в млекопитающем.
27. Способ по п.26, где млекопитающее обнаруживает признаки или симптомы рассеянного склероза, ALS, болезни Гентингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, диабетической невропатии, инсульта, травматических повреждений головного мозга или повреждения спинного мозга.
28. Способ стимуляции выживания нейрона в млекопитающем, где нейрон подвержен риску умирания, предусматривающий:
(a) обеспечение культивируемой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9; и
(b) введение этой клетки-хозяина млекопитающему в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона.
29. Способ генотерапии стимуляции выживания нейрона, подверженного риску умирания, который находится в млекопитающем, предусматривающий введение в местоположение или вблизи местоположения этого нейрона вирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело против Nogo-рецептора-1 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.8 или 9, где это антитело против Nogo-рецептора-1 или антигенсвязывающий фрагмент экспрессируется из нуклеотидной последовательности в млекопитающем в количестве, достаточном для стимуляции выживания этого нейрона.
- 33 -
008253
Схематическая структура Nogo-рецептора
Сигнальная последовательность
LRRCT С-концевой GPI N-концевой | район Якорь
район
Восемь богатых лейцинами повторов т
аа 126 58-81 82-105106-130 131-154 155-178 179-202 203-226 227-250 310 344 434
sNogoR310-sNogoR344-
Фиг. 1
Человек: Н
крыса: RVHPHAPRDLGRLMTLYLF
1 200 400
Количество аминокислот
Фиг. 2
-20Н--,-,-,-1-h-,
Ю"90 ЮГ*-5 Ю"*0 10"7-5 10"70 10"6-5 Ю"60 Ингибитор [М]
Фиг. 3В
- 34 -
008253
1.5т
1.0--
ю 6
О 0.5+
0.O
ELISA для anti-NogoR: 1H2, 3G5, 2F7
ES31H2 EZ23G5
M2F7
I I без первичного антитела
стержни ошибок указывают SEM (стандартную ошибку среднего)
п вдп ваш ftain нмп вот
<
Иммобилизованный антиген
Фиг. 4
Вырост DRG-нейритов крыс: действия моноклонального антитела 7Е11
700
ЗФР 20 нг миелина 30 нг миелина
Фиг. 5
50 нг миелина
Связывание | 120-1
| 100
лигандов Nogo с растворимым NogoR-1 [SPA]
8060-II
8 8 40-|1 20-I О
я я а.
s z
О *
II! t
VD О) О ОТ
^ О СО
К tQ О О.
IS J 3
S ?о о:
= а 4
О S
*" о
а; (О О О. jo go 0Г
О s *;
ro5
E=3l25l~Nogo66 D 125l-Nogo1-40-B
¦¦ 125l-Nogo1-40-A ш 125l-Nogo1-40-C
Фиг. 6А
- 35 -
008253
ЗООО-i
Концентрация Nogo66 [М]
Фиг. 6В
* 1001
lg-sNogoR1-310 [мкг]
Фиг. 7
Предметные стекла 211 юоо
ON: действия растворимого NgR310 на вырост DRG-нейритов, 1,5 мкг
ЗФР
300 нг миелина
Фиг. 9А
- 36 -
008253
12345678
sNogoR310 или NgREcto
? ЗФР ¦ NgREcto
50 150 Миелин (нг)
p <0.05
Фиг. 9В
Предметные стекла 494 ON: действия Ig-NgRl-310 на вырост DRG-нейритов (п=6)
ЗФР
20 нг миелина
Фиг. 10А
30нг миелина
РО.05
750-1
(В X
а. 500-
250
ЗФР+ 0.5 мкм ЗФР Ig-sNogoR 20нг
Фиг. 10В
Ig-sNogoR
- 37 -
008253
Моноклональное антитело против NogoR, 5В10, защищает вырост DRG-нейритов от ингибирования миелином
Столбики ошибок указывают SEM (стандартную ошибку среднего)
ЗФР 20 нг миелина 30 нг миелина 50 нг миелина
Фиг. 11
б 15
со ш
Контроль (п=6, 3 смерти) NgR310-Fc (п=9, 0 смертей)
-г- 15
-г-20
~г- 25
Дни после SCI
Фиг. 12
Время (дни после SCI)
Фиг. 13А
Время (дни после SCI)
Фиг. 13В
- 38 -
008253
I о 4-.-.-.-.
I О 7 14 21 28 Время (дни после SCI)
Фиг. 13C
Время (дни после SCI)
Фиг. 13D
5 О -I-1-1-1-1
О 0 7 14 21 28 Время (дни после SCI)
Фиг. 14А
ii12
ii9
Si .
из *
а? з
х go •"-Контроль -"-NgRecjto
7 14 21 28
Время (дни после SCI)
Фиг. 14В
длина ширина
Фиг. 14C
- 39 -
008253
Список последовательностей
<110> БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК. ЙЕЙЛ ЮНИВЕРСИТИ ЛИ, Дэниел, Х.,С. ПЕПИНСКИ, Р., Блейк ЛИ, Вэйвэй
РАБАККИ, Сильвия, А. РЕЛТОН, Джейн, К. УОРЛИ, Дейн, С. СТРИТТМЭТТЕР, Стефен, М. САХ, Динах, Й.,В.
<120> АНТАГОНИСТЫ NOGO-РЕЦЕПТОРА
<130> А170 CIP PCT
<140> PCT/US04/02702 <141> 2004-01-30
<150> PCT/US03/25004 <151> 2003-08-07
<150> 60/402,866 <151> 2002-08-10
<160> 48
<170> Patentln Ver. 3.2
<210> 1 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 1
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr 15 10 15
<210> 2 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Человек
<400> 2
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr 1 5 10 15
<210> 3
- 40 -
008253
<211> 35 <212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 3
Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Phe Gin Thr Asn Gin Leu Thr 15 10 15
Asp Glu GIu Leu Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys Gin Pro Asp Ala Ala 20 25 30
Asp Lys Ala 35
<210> 4 <211> 35 <212> БЕЛОК <213> Человек
<400> 4
Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro lie Trp Thr Gly Arg Ala Thr 1 5 10 15
Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys Gin Pro Asp Ala Ala 20 25 30
Asp Lys Ala 35
<210> 5 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Домовая мышь
<400> 5
Cys Arg Leu Gly Gin Ala Gly Ser Gly Ala 1 5 10
<210> 6 <211> 344 <212> БЕЛОК <213> Человек
<400> 6
Met Lys Arg Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu 15 10 15
Ггр Leu Gin Ala Trp Gin Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30
- 41 -
008253
Cys Туг Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45
Gin Ala Val Pro Val Gly He Pro Ala Ala Ser Gin Arg He Phe Leu 50 55 60
His Gly Asn Arg He Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys 65 70 75 80
Arg Asn Leu Thr He Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg He 85 90 95
Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110
Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly 115 120 125
Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140
Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160
Leu Gin Asp Asn Ala Leu Gin Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp 165 170 175
Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg He Ser Ser 180 185 190
Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205
Leu His Gin Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220
Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala 225 230 235 240
Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255
Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270
Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser 275 280 285
Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn 290 295 300
- 42 -
008253
Asp Leu Gin Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro He Trp 305 310 315 320
Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335
Gin Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala 340
<210> 7 <211> 310 <212> БЕЛОК <213> Человек
<400> 7
Met Lys Arg Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu 15 10 15
Trp Leu Gin Ala Trp Gin Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30
Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45
Gin Ala Val Pro Val Gly He Pro Ala Ala Ser Gin Arg He Phe Leu 50 55 60
His Gly Asn Arg He Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys 65 70 75 80
Arg Asn Leu Thr He Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg He 85 90 95
Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110
Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly 115 120 125
Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140
Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160
Leu Gin Asp Asn Ala Leu Gin Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp 165 170 175
Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg He Ser Ser 180 185 190
- 43 -
008253
Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205
Leu His Gin Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220
Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala 225 230 235 240
Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255
Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270
Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser 275 280 285
Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn 290 295 300
Asp Leu Gin Gly Cys Ala 305 310
<210> 8 <211> 344 <212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 8
Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Pro Thr Trp Val Leu 15 10 15
Trp Leu Gin Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30
Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Arg Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45
Gin Ala Val Pro Ala Gly He Pro Ala Ser Ser Gin Arg He Phe Leu 50 55 60
His Gly Asn Arg He Ser Tyr Val Pro Ala Ala Ser Phe Gin Ser Cys 65 70 75 80
Arg Asn Leu Thr He Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Gly He 85 90 95
Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110
- 44 -
008253
Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr Phe Arg Gly 115 120 125
Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140
Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160
Leu Gin Asp Asn Asn Leu Gin Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp 165 170 175
Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg He Pro Ser 180 185 190
Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205
Leu His Gin Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220
Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met 225 230 235 240
Leu Pro Ala Glu Val Leu Val Pro Leu Arg Ser Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255
Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270
Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Gly Val Pro Ser Asn 275 280 285
Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Thr Ser 290 295 300
Asp Leu Glu Gly Cys Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Phe Gin 305 310 315 320
Thr Asn Gin Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335
Gin Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala 340
<210> 9 <211> 310 <212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 9
- 45 -
008253
Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Pro Thr Trp Val Leu 15 10 15
Trp Leu Gin Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30
Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Arg Pro Gin Gin Gly Leu 35 40 45
Gin Ala Val Pro Ala Gly He Pro Ala Ser Ser Gin Arg He Phe Leu 50 55 60
His Gly Asn Arg He Ser Tyr Val Pro Ala Ala Ser Phe Gin Ser Cys 65 70 75 80
Arg Asn Leu Thr He Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Gly He 85 90 95
Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu 100 105 110
Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr Phe Arg Gly 115 120 125
Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gin Glu 130 135 140
Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gin Tyr Leu Tyr 145 150 155 160
Leu Gin Asp Asn Asn Leu Gin Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp 165 170 175
Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg He Pro Ser 180 185 190
Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205
Leu His Gin Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220
Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met 225 230 235 240
Leu Pro Ala Glu Val Leu Val Pro Leu Arg Ser Leu Gin Tyr Leu Arg 245 250 255
Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270
Ala Trp Leu Gin Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Gly Val Pro Ser Asn
- 46 -
008253
275 280 285
Leu Pro Gin Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Thr Ser 290 295 300
Asp Leu Glu Gly Cys Ala 305 310
<210> 10 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетический линкер <400> 10
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 11 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 11
Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu 15 10 15
Tyr Leu Phe
<210> 12 <211> 34 <212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: праймер <400> 12
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34
<210> 13 <211> 37 <212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность <220>
- 47 -
008253
<223> Описание синтетической последовательности: праймер <400> 13
ggggatatcc accatgaagt tgcctgttag gctgttg 37
<210> 14 <211> 40 <212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: дегенеративный праймер
<400> 14
ggggatatcc accatgaggk ccccwgctca gytyctkgga 40
<210> 15 <211> 144 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность легкой цепи пептида
<400> 15
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp He Pro Ala 15 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys He Ser Arg Val Asp Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110
Ser Gin Ser Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125
- 48 -
008253
Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser He Ser His His 130 135 140
<210> 16 <211> 144 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность легкой цепи пептида
<400> 16
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp He Pro Ala 15 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45
Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Arg Pro
Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys He Ser Arg Val Asp Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110
Ser Gin Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125
Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser He Ser His His 130 135 140
<210> 17 <211> 116 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность тяжело й цепи пептида
- 49 -
008253
<400> 17
Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly Ala Ser 15 10 15
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp 20 25 30
Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly 35 40 45
Ala He Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ser Ser Tyr Asn Gin Asn Phe Lys 50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gly Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80
Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Arg He Thr Glu Ala Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr 115
<210> 18 <211> 114 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность тяжело й цепи пептида
<220>
<221> MOD RES <222> (3)
<223> Вариабельная аминокислота <400> 18
Leu Gin Хаа Ser Gly Ala Glu He Val Met Pro Gly Thr Ala Val Thr 15 10 15
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Phe Trp Met His 20 25 30
Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Ala He 35 40 45
- 50 -
008253
и цепи пептида
- 51 -
008253
<400> 21
Ser Arg Phe Trp Thr Gly Glu Tyr Asp Val 1 5 10
<210> 22 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность легкой цепи пептида
<400> 22
Arg Ala Ser Gin Asn He Ala He Thr Leu Asn 1 5 10
<210> 23 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность легкой цепи пептида
<400> 23
Leu Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5
<210> 24 <211> 8 <212> БЕЛОК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: синтетическая последовательность легкой цепи пептида
<400> 24
Gin Gin Туг Asp Asn Туг Pro Leu 1 5
- 52 -
008253
<210> 25 <211> 22 <212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: дегенеративный праймер праймер
<400> 25
aggtsmarct gcagsagtcw gg 22
<210> 26 <211> 22 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 26
Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gin Leu Asp Leu Ser Asp 15 10 15
Asn Ala Gin Leu Arg 20
<210> 27 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 27
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg 1 5 10
<210> 28 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм
- 53 -
008253
<220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 28
Val Val Asp Pro Thr Thr 1 5
<210> 29 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 29
Leu Asp Leu Ser Asp Asp Ala Glu Leu Arg 1 5 10
<210> 30 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 30
Leu Asp Leu Ala Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg 1 5 10
<210> 31 <211> 11 <212> БЕЛОК
^i^' iJL^ujDbvinDin upi anujin
<220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 31
Leu Asp Leu Ala Ser Asp Asp Ala Glu Leu Arg
- 54 -
008253
1 5 10
<210> 32 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 32
Leu Asp Ala Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg 1 5 10
<210> 33 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 33
Leu Asp Ala Leu Ser Asp Asp Ala Glu Leu Arg 15 10
<210> 34 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 34
Leu Asp Leu Ser Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg 15 10
<210> 35 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм
- 55 -
008253
<220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 35
Leu Asp Leu Ser Ser Asp Glu Ala Glu Leu Arg 15 10
<210> 36 <211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 36
Asp Asn Ala Gin Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr 1 5 10
<210> 37 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 37
Asp Asn Ala Gin Leu Arg 1 5
<210> 38 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 38
- 56 -
008253
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu His 15 10
<210> 39 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 39
Leu Asp Leu Gly Asp Asn Arg His Leu Arg 1 5 10
<210> 40 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 40
Leu Asp Leu Gly Asp Asn Arg Gin Leu Arg 15 10
<210> 41 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 41
Ala Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr 15 10 15
<210> 42 <211> 16 <212> БЕЛОК
- 57 -
008253
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 42
Leu Ala Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr 15 10 15
<210> 43 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 43
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Ala Leu Arg Val Val Asp Pro Thr Thr 15 10 15
<210> 44 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 44
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr 15 10 15
<210> 45 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
- 58 -
008253
<400> 45
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Ala Val Val Asp Pro Thr Thr 15 10 15
<210> 46 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 46
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Ala Val Val Asp Pro Thr Thr 1 * 5 * 10 15
<210> 47 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 47
Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala Gin Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr 15 10 15
<210> 48 <211> 19 <212> БЕЛОК
<213> Неизвестный организм <220>
<223> Описание неизвестного организма: Эпитон, распознаваемый моноклональным антителом 7Е11
<400> 48
His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu 15 10 15
Tyr Leu Phe
^^j) Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 59 -