1. Антитело или антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO: 5.

2. Антитело или антигенсвязывающий домен по п.1, который является химерным, гуманизированным антителом, или антигенсвязывающим доменом, или моноклональным или поликлональным антителом, или антигенсвязывающим доменом человека.

3. Антитело или антигенсвязывающий домен по п.1 или 2, которое является антителом или антигенсвязывающим доменом с одной цепью.

4. Антитело или антигенсвязывающий домен по любому из пп.1-3, который является моноспецифичным, биспецифичным, триспецифичным или мультиспецифичным антителом или антигенсвязывающим доменом.

5. Применение антитела или антигенсвязывающего домена по любому из пп.1-3 для диагностики шизофрении или биполярного расстройства.

6. Набор антисмысловых последовательностей, ингибирующих экспрессию полипептида ионного канала, кодируемого полинуклеотидом, показанным в виде SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащий фрагмент полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.

7. Набор антисмысловых последовательностей по п.6, которые являются рибозимами.

8. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по пп.1-4 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.

9. Применение набора антисмысловых последовательностей по п.6 или 7 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.

10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-4.

11. Фармацевтическая композиция, содержащая набор антисмысловых последовательностей по п.6 или 7.

12. Применение по крайней мере одного двухаллельного маркера (ДМ), связанного с ионным каналом, выбранного из группы двуаллельных маркеров, показанных ниже, для определения подвержен ли индивидуум риску или страдает ли больной шизофренией или биполярным расстройством.

13. Способ генотипирования, включающий стадии:

a) выделения нуклеиновой кислоты из биологического образца;

b) обнаружения наличия нуклеотида в одном или нескольких зависимых двухаллельных маркерах, связанных с ионным каналом, А1-А18, перечисленных в п.12.

14. Способ по п.13, где способ осуществляют с использованием анализа микросеквенирования.

15. Диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащий полинуклеотид, который является фрагментом полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащего один или несколько биаллельных маркеров А1-А18, как описано в п.12.

16. Диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащий:

a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом ионного канала, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или с фрагментом пептида или его вариантом, необязательно меченным;

b) реагент, с помощью которого осуществляется определение образовавшегося комплекса антиген-антитела, указанный реагент либо необязательно содержит метку, либо который может быть распознан меченным реагентом.

 

(57) Реферат / Формула:
Антитело или антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO: 5.

2. Антитело или антигенсвязывающий домен по п.1, который является химерным, гуманизированным антителом, или антигенсвязывающим доменом, или моноклональным или поликлональным антителом, или антигенсвязывающим доменом человека.

3. Антитело или антигенсвязывающий домен по п.1 или 2, которое является антителом или антигенсвязывающим доменом с одной цепью.

4. Антитело или антигенсвязывающий домен по любому из пп.1-3, который является моноспецифичным, биспецифичным, триспецифичным или мультиспецифичным антителом или антигенсвязывающим доменом.

5. Применение антитела или антигенсвязывающего домена по любому из пп.1-3 для диагностики шизофрении или биполярного расстройства.

6. Набор антисмысловых последовательностей, ингибирующих экспрессию полипептида ионного канала, кодируемого полинуклеотидом, показанным в виде SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащий фрагмент полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.

7. Набор антисмысловых последовательностей по п.6, которые являются рибозимами.

8. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по пп.1-4 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.

9. Применение набора антисмысловых последовательностей по п.6 или 7 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.

10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-4.

11. Фармацевтическая композиция, содержащая набор антисмысловых последовательностей по п.6 или 7.

12. Применение по крайней мере одного двухаллельного маркера (ДМ), связанного с ионным каналом, выбранного из группы двуаллельных маркеров, показанных ниже, для определения подвержен ли индивидуум риску или страдает ли больной шизофренией или биполярным расстройством.

13. Способ генотипирования, включающий стадии:

a) выделения нуклеиновой кислоты из биологического образца;

b) обнаружения наличия нуклеотида в одном или нескольких зависимых двухаллельных маркерах, связанных с ионным каналом, А1-А18, перечисленных в п.12.

14. Способ по п.13, где способ осуществляют с использованием анализа микросеквенирования.

15. Диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащий полинуклеотид, который является фрагментом полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащего один или несколько биаллельных маркеров А1-А18, как описано в п.12.

16. Диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащий:

a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом ионного канала, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или с фрагментом пептида или его вариантом, необязательно меченным;

b) реагент, с помощью которого осуществляется определение образовавшегося комплекса антиген-антитела, указанный реагент либо необязательно содержит метку, либо который может быть распознан меченным реагентом.

 

---

008252
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему домену, специфически связывающимся с полипептидом потенциалзависимого воротного ионного канала, к их применению для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, к набору антисмысловых последовательностей, ингибирующих экспрессию ионного канала, к соединению, которое активирует или ингибирует экспрессию или активность ионного канала указанного полипептида, к фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент, набор антисмысловых последовательностей или такое соединение и к диагностическому набору для диагностики шизофрении или биполярного расстройства.
Уровень техники
Достижения в техническом оснащении лабораторий, занятых фундаментальными и клиническими исследованиями, в огромной мере способствовали более глубокому изучению влияния головного мозга и нервной системы на здоровье и болезни. Выдвинут ряд нейробиологических и фармакологических гипотез в отношении нейрохимических и генетических механизмов, имеющих место при нарушениях центральной нервной системы (ЦНС), включающих психические нарушения и нейродегенеративные заболевания. Однако нарушения ЦНС характеризуются сложным и недостаточным пониманием этиологии, а также симптомы, которые перекрываются, плохо описаны, и трудны для измерения. В итоге, будущие схемы лечения и усилия по созданию лекарств нуждаются в усовершенствовании и сосредоточении внимания на мультигенных причинах, а это требует проведения новых демографических исследований заболеваний и получения более точной диагностической и прогностической информации о пациентах, страдающих нарушениями ЦНС.
Нарушения ЦНС охватывают широкий ряд расстройств и соответствующую широкую группу генетических факторов. Примеры расстройств ЦНС включают нейродегенеративные нарушения, психотические расстройства, расстройства в эмоциональном состоянии, аутизм, зависимость от химических веществ и алкоголизм, нарушения болевых ощущений, эпилепсию, задержку психического развития и другие психические заболевания, включая когнитивную функцию, страх, нарушение функции приема пищи, нарушение функции мотивации и аномалии характера. Нарушения можно определить, используя классификацию Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition (Диагностический и Статистический Справочник Психических Нарушений) (DSM-IV).
Даже при рассмотрении всего лишь небольшой подгруппы нарушений ЦНС очевидно, что из-за недостатка адекватного лечения и для понимания молекулярной основы нарушений при шизофрении и биполярном расстройстве, нужны новые цели для создания лекарств и усовершенствования способов лечения. Что касается шизофрении и биполярного расстройства, все ныне известные молекулы, используемые для их лечения, обладают побочными эффектами и действуют только против симптомов данного заболевания. Существует, таким образом, очень большая потребность в новых молекулах, не вызывающих побочных эффектов и направленных против мишеней, которые вовлечены в причинные механизмы шизофрении и биполярного расстройства. Поэтому, инструментальные средства, облегчающие открытие и характеристику данных целей, необходимы и полезны.
Потенциалзависимые воротные ионные каналы
Потенциалзависимые воротные ионные каналы являются частью большого семейства макромолекул, функции которых включают контроль и поддержание электрического потенциала клеточных мембран, выделение и трансдукцию сигнала. Эти белки-каналы участвуют в контроле высвобождения ней-ромедиаторов из нейронов и играют существенную роль в регуляции разнообразных клеточных функций, включая мембранную возбудимость, мышечное сокращение и синаптическую передачу. Основные альфа-субъединицы №+-каналов и альфа-1-субъединицы Са+-каналов состоят, приблизительно, из 2000 аминокислот и составляют путь протекания ионов. Биохимический анализ показал, что физиологически активный ионный канал составлен из нескольких разных субъединиц. Существует две вспомогательные субъединицы, бета-1- и бета-2-субъединица, которые очищаются совместно с альфа-субъединицей N+-каналов. Что касается Са+-каналов, для них идентифицированы дополнительные субъединицы (альфа-2, бета, гамма и сигма) с модуляторным действием. Субъединицы альфа-2 и бета, похоже, усиливают функциональную активность альфа-1-субъединицы Са+-каналов. Альфа-субъединицы К+-каналов ассоциируются с бета-субъединицами в соотношении 1:1, что приводит к усложнению К+-каналов, проявляющих (альфа)4(бета)4 стехиометрию (Terlau и соавт., Naturwissenschaften 85:437-444 (1998)). Базовая структура и примеры кальциевых и натриевых ионных каналов рассматриваются, кроме того, например, у Williams, и соавт., Science 257:389-395 (1992); Mori, и соавт., Nature 350:398-402 (1991); и Koch, и соавт., J. Biol. Chem. 265 (29):17786-17791 (1990). Нуклеотидная последовательность Са+- и №+-ионного канала крысы обладает высоким уровнем гомологии с последовательностью CanIon-канала, впоследствии описанного у Lee и соавт., FEBS Lett. 445:231-236 (1999) .
Альфа-субъединица обладает последовательностью, характерной для всех потенциалзависимых ка-тионных каналов, и использует один и тот же структурный мотив, включающий пучок из 6 спиралей в доменах, предположительно пронизывающих мембрану. И в натриевых, и в кальциевых каналах данный мотив повторяется в указанной последовательности 4 раза, образуя пучок из 24 спиралей. Данные аминокислотные последовательности высококонсервативны у видов (например, человека и Drosophila), a также у разных ионных каналов.
- 1 -
008252
Существует несколько тканеспецифичных фармакологически и электрофизиологически различимых изоформ кальциевых каналов, кодируемых отдельными генами мультигенного семейства. В скелетной мышце каждая группа из плотно связанных альфа-, бета- и гамма-субъединиц ассоциирована с 4 другими с образованием пятичленной макромолекулы. Например, альфа-1-субъединицы кальциевого канала нейрона являются продуктом, по меньшей мере, семи разных генов, именуемых от А до Н. В иммуноци-тохимических исследованиях показано разное распределение альфа-1-субъединиц кальциевого канала. Альфа-1А и альфа-1В экспрессируются главным образом в дендритах и пресинаптических окончаниях, и альфа-1А обычно концентрируется в большем числе нервных окончаний, в альфа-1В. В нервно-мышечном соединении крысы и человека альфа-1А локализуется пресинаптически, тогда как альфа-1В, так и альфа-1А представлены в ассоциированных с аксоном швановских клетках. Альфа-1Е локализуется главным образом в клеточных телах, в некоторых случаях - в проксимальных дендритах, а также в дис-тальных ответвлениях клеток Пуркинье. Альфа-1С и альфа-Ш локализуются в клеточных телах и в проксимальных дендритах центральных нейронов.
Нативные кальциевые каналы классифицируются на основе их фармакологических и/или электрофизиологических свойств.
Классификация потенциалзависимых кальциевых каналов разделяет их на каналы, активируемые высоким потенциалом (HVA), включающие типы L, N, Р и О; промежуточным (^АД-тип); и активируемые низким потенциалом (LVA, Т-тип). (Могеш и соавт., Annals NY Acad. Sci. 102-117 (1999)).
Основные субъединицы (альфа-1) относятся к генному семейству, члены которого могут сами образовывать функциональные каналы при экспрессии в гетерологичных экспрессионных системах. (Zhang и соавт., Neuropharmacology 32 (11):1075-1088 (1993), включенный в данное описание путем ссылки). В нативных клетках альфа-1-субъединицы экспрессируются в виде мультисубъединичных комплексов вместе с вспомогательными субъединицами, которые модифицируют функциональные характеристики альфа-1-субъединицы. Во многих случаях коэкспрессия вспомогательных субъединиц влияет на биофизические свойства данных каналов. Бета-субъединицы, в частности, имеют тенденцию к существенному влиянию на альфа-1-субъединицы; было показано, что бета-субъединицы изменяют активационные свойства, стационарную инактивацию, кинетику инактивации и максимальное протекание тока.
Большое молекулярное разнообразие каналов получают благодаря существованию множественных форм альфа-1-субъединиц. Например, было показано, что по-разному сплайсированные формы кальциевых каналов и экспрессируются по-разному и обладают разной чувствительностью к фосфорилированию серин-треониновыми киназами. (Hell и соавт., Annals NY Acad. Sci. 747:282-293 (1994)). Установлено, что мутации генов ионных каналов вовлечены в целый ряд заболеваний, включая некоторые заболевания центральной нервной системы. Примеры мутаций ионных каналов, вызывающих ряд эпизодических нарушений, включая периодический паралич, эпизодическую атаксию, гемикранию, синдром удлинения от интервала QT, пароксизмальную дискинезию, рассматриваются в обзоре Bulman и соавт., Hum. Mol. Gen. 6(10):1679-1685 (1997). Некоторые нарушения, связанные с мутацией Са+-канала, представлены, например, в табл. А (из Moreno, выше).
Таблица А
1 Заболевание
Субъединица кальциевого канала
Модель
Семейная
гемиплегическая
мигрень
Альфа-1А
Человек
Эпизодическая атаксия, тип 2
Альфа-1А
Человек
Спинально-церебеллярная атаксия, тип 6
Альфа-1А
Человек
Фенотипы пьяного и беспомощного
Альфа-1А
Мышь
Синдром Ламберт-Итона
Альфа-1А, ex-IB
Человек
Гипокалиемический
периодический
паралич
Альфа-lS
Человек
Мышиная дисплазия
Альфа-lS
Мышь
Диабетические жировые фенотипы Цукер
(Х-1С; а-Ю
Крыса
Летаргический фенотип
Бета-4
Мышь
Злокачественна гипотермия
Альфа-2/5
Человек
Сзерцание
Гамма
Мышь
Модуляторы кальциевых и натриевых каналов обычно используются для лечения различных заболеваний и состояний. Например, было показано, что блокаторы кальциевого и/или натриевого канала могут использоваться для лечения или профилактики одного или нескольких симптомов, связанных с различными заболеваниями или состояниями, такими как различные заболевания и состояния сердца (например, стенокардия, аритмия), гипертензия, мигрени, неврологические эффекты нарушений мозгово
- 2 -
008252
го кровообращения, мания, нейролептически индуцированная поздняя дискинезия стенок миокарда, биполярное расстройство, боль, эпилепсия и другие.
Было показано, что между разными ионными каналами нервной системы имеются существенные функциональные различия. Кроме того, существенные различия имеются между разными мутациями в одном и том же гене ионного канала, а также между вариантами сплайсинга одного и того же ионного канала. Таким образом, несмотря на причастность ионных каналов к заболеваниям ЦНС, то, что касается конкретного заболевания, трудно определить какой ионный канал может представлять собой эффективную мишень для терапевтического вмешательства. Первоочередная задача состоит в том, чтобы предоставить ген ионного канала, причастный к шизофрении, биполярному расстройству или заболеваниям, связанными с ними.
Настоящее изобретение направлено на решение этих и других задач.
Краткое изложение существа изобретения
Настоящее изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему домену, специфически связывающемуся с полипептидом с последовательностью SEQ ID No 5. Антитело или антигенсвязываю-щий домен может быть химерным, гуманизированным антителом или антигенсвязывающим доменом, или моноклональным или поликлональным антителом или антигенсвязывающим доменом человека. В одном из вариантов осуществления антитело или антигенсвязывающий домен имеет одну цепь. В другом варианте осущетвления антитело или антигенсвязывающий домен является моноспецифичным, биспе-цифичным, триспецифичным или мультиспецифичным антителом или антигенсвязывающим доменом.
Настоящее изобретение также относится к применению антитела или антигенсвязывающего домена для диагностики шизофрении или биполярного расстройства.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к набору антисмысловых последовательностей, ин-гибирующих экспрессию ионного канала, кодируемого полинуклеотидом с SEQ ID No 1, 2, 3 или 4, содержащим фрагмент поликулеотида с последовательностью SEQ ID No 1, 2, 3 или 4, для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства. В одном из вариантов осуществления такой набор антисмысловых последовательностей представляет собой набор рибозимов.
Настоящее изобретение относится к применению соединения, которое активирует или ингибирует экспрессию или активность ионного канала полипептида, содержащего полипептид с последовательностью SEQ ID No 5 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вышеуказанный набор антисмысловых последовательностей или вышеупомянутое соединение, которое активирует или ингибирует экспрессию или активность ионного канала полипептида, содержащего полипептид с последовательностью SEQ ID No 5, и подходящий носитель или эксципиент.
Настоящее изобретение также относится к применению по крайней мере одного двуаллельного маркера (ДМ), связанного с ионным каналом, выбранного из группы двуаллельных маркеров, показанных в табл. 1' ниже, для определения подвержен ли индивидуум риску или страдает ли больной шизофренией или биполярным расстройством.
Таблица Г
Название маркер
Полиморфизм
Положение ДМ в SEQ ID
Аллель
Аллель
N0:1
N0 : 2
N0:3
N0:4
N0:06
99-62626-168
12642
99-62632-275
14088
99-62633-409
24981
99-62611-51
69248
99-62605-56
73428
99-62635-443
80250
99-79335-60
51090
99-79336-369
61293
99-79338-332
80602
А10
99-79314-201
100485
99-79314-225
100509
А12
99-79316-158
106725
1658
А13
99-79322-224
166087
А14
99-79322-473
166336
А15
99-79306-182
235894
А16
99-79310-29
31646
4481
А17
99-79311-50
42373
А18
99-62617-105
105
- 3 -
008252
Настоящее изобретение относится к способу генотипирования, включающему стадии:
a) выделения нуклеиновой кислоты из биологического образца;
b) обнаружения наличия нуклеотида в одном или нескольких зависимых двуаллельных маркерах, связанных с ионным каналом, А1-А18, перечисленных в п.13.
В одном из вариантов осуществления такой способ генотипирования осуществляют с использованием анализа микросеквенирования.
Настоящее изобретение относится к диагностическому набору для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащему полинуклеотид, который является фрагментом полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащего один или несколько биаллельных маркеров А1-А18. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержит
a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом ионного канала, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или с фрагментом пептида или его вариантом, необязательно меченным;
b) реагент, с помощью которого осуществляется определение образовавшегося комплекса антиген-антитела, указанный реагент либо необязательно содержит метку, либо который может быть распознан меченным реагентом.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображена диаграмма, представляющая ВАС-карту области хромосомы 13q, содержащей CanIon-ген.
На фиг. 2 изображен блок диаграмм типовой компьютерной системы.
На фиг. 3 изображена структурная схема, иллюстрирующая один из вариантов осуществления процесса 200 по сравнению новой нуклеотидной или белковой последовательности с базой данных последовательностей с целью установления уровней гомологии между новой последовательностью и соответствующей последовательностью базы данных.
На фиг. 4 изображена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов осуществления процесса 250 в компьютере, чтобы определить действительно ли две последовательности гомологичны.
На фиг. 5 изображена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов процесса-идентификатора 300 для выявления в последовательности наличия характерной особенности. Краткое описание последовательностей, представленных в списке последовательностей
SEQ ID No 1 содержит геномную последовательность Canlon, включающую 5'-регуляторную область ("левая" нетранскрибируемая область) и экзоны 1-7.
SEQ ID No 2 содержит геномную последовательность CanIon, включающую экзоны 8-27.
SEQ ID No 3 содержит геномную последовательность CanIon, включающую экзоны 28-44, а также 3'-регуляторную область ("правая" нетранскрибируемая область).
SEQ ID No 4 содержит кДНК-последовательность CanIon.
SEQ ID No 5 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую кДНК SEQ ID No 4. SEQ ID No 6 содержит нуклеотидную последовательность ампликона, который включает двуал-лельный маркер А18.
SEQ ID No 7 содержит праймер, включающий дополнительную 5'-последовательность PU, ниже описанную в примере 2.
SEQ ID No 8 содержит праймер, содержащий дополнительную 5'-последовательность RP, ниже описанную в примере 2.
В соответствии с правилами, относящимися к Спискам Последовательностей, в данном Списке Последовательностей используются коды, которые указывают расположение двуаллельных маркеров в данных последовательностях и которые идентифицируют каждый из аллелей, представленный по полиморфному основанию. Код "r" для данной последовательности свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой гуанин, а другой аллель представляет собой аде-нин. Код "у" для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой тимин, тогда как другой аллель представляет собой цитозин. Код "m" для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой аденин, а другой аллель представляет собой цитозин. Код "k" для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой гуанин, а другой аллель представляет собой тимин. Код "s" для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой гуанин, а другой аллель представляет собой цитозин. Код "w" для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой аденин, а другой аллель представляет собой тимин. Нуклеотидный код исходного аллеля для каждого двуаллельного маркера следующий:
Двуаллельный маркер Исходный аллель
5-124-273 А (например)
- 4 -
008252
В некоторых случаях полиморфные основания двуаллельных маркеров изменяют идентичность аминокислот в кодируемом полипептиде. Это указано в прилагаемом Списке Последовательностей с использованием элемента VARIANT, размещения Хаа в положении данной полиморфной аминокислоты и определения Хаа в виде двух альтернативных аминокислот. Например, если один аллель двуаллельного маркера представляет собой кодон САС, который кодирует гистидин, а другой аллель двуаллельного маркера представляет собой САА, который кодирует глутамин, то Список Последовательностей для кодируемого полипептида будет содержать Хаа в положении полиморфной аминокислоты. В данном случае Хаа должен определяться в виде гистидина или глутамина.
В других случаях Хаа может обозначать аминокислоту, идентичность которой неизвестна, вследствие неопределенности нуклеотидной последовательности. В данном случае использование элемента UNSURE размещает Хаа в положение неизвестной аминокислоты и значение Хаа считается любым из 20 аминокислот или ограниченным числом аминокислот, подсказанных генетическим кодом.
Подробное описание изобретения
Ассоциация шизофрении и биполярного расстройства в семьях, доказанная при изучении близнецов и усыновления, хотя изменчивость по всему миру отсутствует, свидетельствует о том, что шизофрения и биполярное расстройство в первую очередь представляют собой генетические состояния, хотя факторы риска окружающей среды также до некоторой степени рассматриваются в качестве необходимых, достаточных или воздействующих друг на друга причин. Например, шизофрения встречается у 1% от общей численности населения. Но при наличии шизофрении у одного из дедушек или бабушек риск возникновения данной болезни возрастает до примерно 3%; если же шизофренией страдает один из родителей, этот риск возрастает до примерно 10%. Если оба родителя больны шизофренией, тогда риск возрастает приблизительно до 40%.
Идентификация генов, связанных с характерным признаком, таким как специфическое нарушение центральной нервной системы, подобное шизофрении, может быть осуществлена с помощью двух основных подходов, используемых в настоящее время для генетического картирования: анализа сцепления и ассоциативные исследования (исследование сообществ). Анализ сцепления требует изучения семей, в которых заболеванием поражены многие их члены, и в настоящее время пригоден для выявления моно- и олигогенных наследственных признаков. И наоборот, в ассоциативных исследованиях анализируют частоту маркерных аллелей признака (Т+) у несвязанных родством индивидов, сравниваемых с негативным по данному признаку контролем (Т-) и обычно используемых для выявления полигенного наследования.
Генетическая связь или сцепление базируется на анализе, в котором две соседствующие последовательности на хромосоме содержат, по меньшей мере, рекомбинации в результате кроссинговера во время мейоза. Чтобы осуществить это хромосомные маркеры, подобные микросателлитным маркерам, тщательно локализуют в данном геноме. В анализе генетического сцепления рассчитывают вероятность рекомбинаций в данном гене-мишени с использованием хромосомных маркеров, в соответствии с генеалогическим древом, передачей данного заболевания и передачей данных маркеров. Таким образом, если отдельный аллель данного маркера передается вместе с заболеванием более часто, а не случайно (уровень рекомбинации находится между 0 и 0,5), то можно сделать вывод о том, что ген-мишень, о котором идет речь, обнаруживается поблизости от данного маркера. При использовании этого метода можно локализовать несколько генов, демонстрирующих генетическую предрасположенность семейных злокачественных опухолей. Для того чтобы иметь возможность включиться в изучение генетического сцепления, семьи, пораженные наследственной формой данного заболевания, должны удовлетворять критерию "информативности": несколько человек (конституциональная ДНК которых доступна) на поколение, должны быть поражены данным заболеванием, и в лучшем случае, обладать большим числом сибсов.
Результаты исследований по сцеплению подтверждают гипотезу о том, что хромосома 13, по-видимому, содержит локус предрасположенности к шизофрении на 13q32 (Blouin J.L. и соавт., 1998, Nature Genetics, 20:70-73; Lin M.W. и соавт., Hum. Genet., 99(3) (1997):417-420; Brzustowicz и соавт., Am. J. Hum. Genet. 65:1096-1103 (1999)). Однако, несмотря на то, что анализ сцепления представляет собой мощный метод выявления генов и связанного с ними признака, решение часто невозможно без уровня данной мегабазы данных, а соответствующие исследования часто нуждаются в уточнении анализа участков, первоначально идентифицированных с помощью данного способа.
ВАС-контиг, покрывающий предполагаемую геномную область локуса хромосомы 13q-31-q33, конструированы с использованием общедоступных STS, расположенных в данной области хромосомного локуса 13q31-q33, для скринирования запатентованной отдельной ВАС-библиотеки, эквивалентной 7-геномам. По данным материалам получали новые STS, позволяющие конструировать компактную физическую карту данной области. Определяли размер всех ВАС и картировали с помощью хромосомной гибридизации in situ для верификации. Идентифицировали минимальную группу ВАС и полностью сек-венировали по нескольким контигам, что приводило к получению конечного контига, превышающего 4 млн.п.н. Создание данной карты позволяет идентифицировать CanIon-ген, который локализуется в геномной области, демонстрирующей существенное сцепление с шизофренией.
Аминокислотная последовательность CanIon характерна для CACHANNEL, 7-элементного фингер-принта, который характеризует альфа-1-субъединицы кальциевых каналов (Ref. PR00167, BLOCK+база
- 5 -
008252
данных). Данный фингерпринт получали, исходя из первичного выравнивания 6 последовательностей: мотивы извлекали из консервативных областей петли, поддающихся различению между этими и другими катионными каналами; мотивы 1 и 2 кодируют последовательности между трансмембранными сегментами 4 и 5, а также 5 и 6 (первый внутренний повтор); мотив 3 соответствует последовательности между сегментом 6 повтора 1 и сегментом 1 повтора 2; мотив 4 кодирует последовательность между сегментами 5 и 6 повтора 2; мотив 5 соответствует последовательности между сегментом 6 повтора 3 и сегментом 1 повтора 4; а мотивы 6 и 7 кодируют последовательности между сегментами 4 и 5, а также между сегментами 5 и 6 повтора 4.
На фиг. 1 представлены ВАС-контиги, покрывающие представляющую интерес область хромосомы 13, которая включает CanIon-ген, и показано геномное расположение CanIon-гена относительно генетических маркеров, демонстрирующих наивысшую значимость в исследованиях по сцеплению. В частности, Blouin и соавт. (1998) осуществили широкое исследование генома на предмет выявления локусов предрасположенности к шизофрении, в 54 комплексных родословных, с использованием 452 микроса-теллитных маркеров. Наиболее значимое сцепление между шизофренией в семьях обнаруживалось на хромосоме 13q32 вблизи маркера D13S174. Brzustowicz и соавт. (1999) дали оценку микросателлитным маркерам, охватывающим хромосомы 8 и 13 в 21 обширных Канадских семьях. Маркеры для хромосомной области 13q дают позитивные оценки LOD в каждой используемой аналитической модели: аутосом-но-доминантной и аутосомно-рецессивной, с узким или широким определением шизофрении. Максимальные трехточечные LOD-оценки были получены с маркером D13S793 в рецессивно-широкой модели: 3,92 в рекомбинантной фракции (8) 0,1 при гомогенности и 4,42 с а=0,65 и 8=8 при гетерогенности. На указанной фиг. 1 CanIon-ген локализован частично в контиге, помеченном 'Region E' и частично в конти-ге, помеченном С0001А10. Данный CanIon-ген фланкирован двумя маркерами, демонстрирующими наивысшую значимость в исследованиях по сцеплению. Маркер D13S174 также находится в контиге С0001А10, а маркер D13S793 локализован, приблизительно 3,5 млн.п.н. центромернее к CanIon-гену.
Существует очень большая потребность в идентификации генов, связанных с шизофренией, биполярным расстройством и другими ЦНС, а также сердечно-сосудистыми заболеваниями и состояниями. Существует также необходимость в идентификации новых ионных каналов, связанных с заболеваниями. Такие гены и белки могут открыть новые перспективы в лечении шизофрении, биполярного расстройства или иных ЦНС-состояний, а также иных состояний, таких как, например, состояния сердца и гипер-тензия, и позволяют, кроме того, изучать и характеризовать CanIon-ген и связанные с ним биологические пути. Познание таких генов и связанных с ними биологических путей, вовлеченных в данные заболевания и состояния, позволит исследователям понять этиологию, например, шизофрении и биполярного расстройства, и приведет к разработке лекарственных средств и лекарственных препаратов, нацеленных против причины данных заболеваний. Например, соединения, которые блокируют CanIon-каналы, могут использоваться для лечения любых заболеваний и состояний, предпочтительно шизофрении или биполярного расстройства, и включающих также болевые нарушения, эпилепсию и различные сердечнососудистые нарушения, такие как сердечная аритмия, стенокардия и гипертензия. Существует также большая необходимость в новых способах выявления предрасположенности к шизофрении, биполярному расстройству и иным состояниям, а также для предотвращения или для наблюдения за развитием любого из этих заболеваний. Диагностические средства могли бы также оказаться в высшей степени полезными. В самом деле, в качестве примера, ранняя идентификация у людей с риском развития шизофрении сделает возможным раннее и/или профилактическое осуществление лечения. Кроме того, точные оценки эффективности лекарственного средства, а также толерантности пациента, даст возможность врачу-клиницисту улучшить соотношение между выгодой и риском, что касается схем лечения шизофрении и биполярного расстройства.
Определения
Перед более подробным описанием настоящего изобретения формулируются следующие ниже определения, которые иллюстрируют и задают значение и рамки терминов, используемых для описания представленного в данном описании изобретения.
Используемый в данном описании термин "CanIon-ген" включает в себя геномные, мРНК и кДНК последовательности, кодирующие CanIon-белок, в том числе и нетранслируемые регуляторные области геномной ДНК.
Используемый в данном описании термин "гетерологичный белок" предназначен для обозначения любого белка или полипептида, отличающегося от CanIon-белка. Например, гетерологичный белок может представлять собой соединение, которое можно использовать в качестве маркера в дополнительных экспериментах с регуляторной областью CanIon.
Термин "выделенный" требует, чтобы материал был удален из своей первоначальной окружающей среды (например, природной окружающей среды, если он является встречаемым в природе). Например, встречаемый в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живом организме животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или ДНК, или полипептид, отделенный от некоторых или от всех сосуществующих веществ в данной природной системе, является выделенным. Такой поли-нуклеотид может являться частью вектора и/или такой полинуклеотид или полипептид может являться
- 6 -
008252
частью композиции, и все же являться выделенным, вектор или композиция не являются частью его природного окружения.
Например, встречаемый в природе полинуклеотид, представленный в живом организме животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид, отделенный от некоторых или из всех сопутствующих веществ в природной системе, является выделенным. В частности, исключенными из определения " выделенный" являются: встречаемые в природе хромосомы (такие как хромосомные распределения), библиотеки искусственных хромосом, геномные библиотеки и кДНК-библиотеки, которые существуют либо в виде in vitro препарата нуклеиновой кислоты, либо в виде препарата трансфицирован-ной/трансформированной клетки-хозяина, где данные клетки-хозяева представляют собой либо гетерогенный in vitro препарат, либо посеянные в виде гетерогенной популяции из единичных колоний. Исключаются также, в частности, и указанные выше библиотеки, в которых конкретный полинуклеотид составляет менее 5% от числа вставок нуклеиновых кислот в векторные молекулы. Кроме того, исключаются, в частности, препараты геномной ДНК целых клеток или РНК целых клеток (включая указанные выше препараты целых клеток, которые механически нарезаются или энзиматически расщепляются). Кроме того, исключаются, в частности, препараты указанных выше целых клеток в виде либо in vitro препарата, либо в виде гетерогенной смеси, разделенной с помощью электрофореза (включая блотинг), где полинуклеотид настоящего изобретения не был дополнительно отделен от гетерологичных полинук-леотидов в электрофоретической среде (например, дополнительное отделение путем вырезания одиночной полосы из гетерогенной популяции полос в агарозном геле или в найлоновом блоте).
Термин "выделенный очисткой" не требует абсолютной степени очистки; скорее он предназначается в качестве относительного определения. Очистка исходного вещества или природного вещества до по меньшей мере одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков, и более предпочтительно четырех или пяти порядков, определенно предполагается. В качестве примера, очистка с 0,1% концентрации до 10% концентрации является очисткой на два порядка. В качестве примера, индивидуальные кДНК-клоны, выделенные из кДНК-библиотеки, были традиционно очищены до электрофорети-ческой гомогенности. Последовательности, полученные из данных клонов, невозможно было бы получить непосредственно из данной библиотеки или из тотальной ДНК человека. Данные кДНК-клоны не являются встречаемыми в природе как таковые, но скорее их получают с помощью операции частично выделяемого очисткой встречаемого в природе вещества (информационная РНК). Преобразование мРНК в кДНК-библиотеку включает в себя создание синтетического вещества (кДНК), а очищенные индивидуальные кДНК-клоны могут быть выделены из данной синтетической библиотеки с помощью клональной селекции. Таким образом, создание кДНК-библиотеки из информационной РНК и последовательное выделение индивидуальных клонов из данной библиотеки приводит, приблизительно, к 104-106-кратной очистке нативной РНК.
Кроме того, термин "выделенный очисткой" используют в данном описании для описания полипептида или полинуклеотида настоящего изобретения, который был отделен от других соединений, включая, но, не ограничиваясь ими, полипептиды или полинуклеотиды, углеводы, липиды и т.п. Термин "выделенный очисткой" можно использовать для конкретного отделения мономерных полипептидов настоящего изобретения от олигомерных форм, таких как гомо- или гетеродимеры, димеры, тримеры и т.п. Термин "выделенный очисткой" можно также использовать в отношении специфического отделения ко-валентнозамкнутых полинуклеотидов от линейных полинуклеотидов. Любой полинуклеотид является в значительной степени чистым, если, по меньшей мере, около 50%, предпочтительно 60-75% образца обнаруживает единственную полинуклеотидную последовательность и конформацию (например, линейную в сравнении с ковалентнозамкнутой). В значительной степени чистый полипептид или полинуклео-тид обычно включает около 50%, предпочтительно 60-90% масса/масса полипептидного или полинук-леотидного образца, соответственно, предпочтительно около 95% и более предпочтительно около 99% чистого продукта. Беспримесность полипептида или полинуклеотида или гомогенность показывают с помощью ряда способов, хорошо известных в данной области техники, таких, например, как электрофорез образца в геле агарозы или в геле полиакриламида, с последующей визуализацией единственной полосы после окрашивания геля. Для некоторых целей наибольшее разрешение можно получить с использованием ВЭЖХ или иных способов, хорошо известных в данной области техники. В качестве альтернативного варианта осуществления настоящего изобретения, очистка полипептидов и полинуклеотидов настоящего изобретения может быть выражена, по меньшей мере, в виде процентов чистого вещества по отношению к гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам (ДНК, РНК или обоим). В качестве предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, полипептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения обладают, по меньшей мере, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 98, 99 или 100% чистоты (беспримесности) относительно, соответственно, гетерологичных полипептидов и поли-нуклеотидов. В качестве еще более предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения данные полипептиды и полинуклеотиды обладают степенью очистки, колеблющейся от любого числа до тысячной доли, между 90 и 100% (например, полипептид или полинуклеотид, по меньшей мере, 99,995% чистоты) по отношению, соответственно, к их гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам, или в виде соотношения масса/масса по отношению ко всем соединениям и молекулам, отличным от сущест
- 7 -
008252
вующих в данном носителе. Каждое число, представляющее процент чистоты, до тысячной доли, можно заявлять в качестве индивидуального вида чистоты.
Термин "полипептид" относится к полимеру аминокислот, не принимая во внимание длину данного полимера; поэтому пептиды, олигопептиды и белки включены без определения полипептида. Данный термин также не определяет или исключает постэкспрессионные модификации полипептидов, например, полипептидов, которые имеют в своем составе ковалентно присоединенные гликозильные группы, ацетильные группы, фосфатные группы, липидные группы и им подобные, четко подпадаемых под термин полипептид. В данное определение включены также полипептиды, которые содержат один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, не встречаемые в природе аминокислоты, аминокислоты, которые встречаются в природе только в неродственной биологической системе, модифицированные аминокислоты из систем млекопитающих и т.п.), полипептиды с замещенными связями, а также иные модификации, известные в данной области техники, как встречаемые в природе, так и не встречаемые в природе.
Используемый в данном описании термин "рекомбинантный полипептид" относится к полипептиду, который искусственно создают и который включает, по меньшей мере, две полипептидные последовательности, которые не обнаруживаются в виде смежных полипептидных последовательностей в их природной среде, или относится к полипептидам, которые экспрессируются из рекомбинантного полинуклеотида.
Используемый в данном описании термин "животное, не принадлежащее человеческому роду", относится к любому позвоночному, не принадлежащему человеческому роду, птицам и, более предпочтительно, млекопитающим, предпочтительно приматам, сельскохозяйственным животным, таким как свинья, козы, овцы, ослы и лошади, кролики или грызуны, более предпочтительно крысы или мыши. Используемый в данном описании термин "животное" относится к любому позвоночному, предпочтительно млекопитающему. Оба термина "животное" и "млекопитающее" определенно включают человеческие существа, если не предшествует термин "не принадлежащий человеческому роду".
Используемый в данном описании термин "антитело" относится к полипептиду или к группе полипептидов, которые включают, по меньшей мере, один связывающий домен, отличающийся тем, что анти-телосвязывающий домен образуется из упакованных вариабельных доменов молекулы антитела с образованием трехмерного связывающего пространства с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарного особенностям антигенной детерминанты антигена, что позволяет иммунологи-чески реагировать с данным антигеном. Антитела имеют в своем составе рекомбинантные белки, включающие связывающие домены, а также фрагменты, включающие Fab, Fab', F(ab)2 и F(ab')2-фрагменты.
Используемая в данном описании "антигенная детерминанта" представляет собой часть молекулы антигена, в данном случае CanIon-полипептида, которая определяет специфичность взаимодействия антиген-антитело. "Эпитоп" относится к антигенной детерминанте полипептида. Эпитоп может включать не менее 3 аминокислот для пространственной конформации, которая уникальна для данного эпитопа. Как правило, эпитоп включает по меньшей мере 6 таких аминокислот, но более обычно, по меньшей мере, 8-10 таких аминокислот. Способы определения аминокислот, которые составляют эпитоп, включают рентгеновскую кристаллографию, 2-мерный ядерный магнитный резонанс и эпитопное картирование, например, способом Pepscan, описанном Geysen и соавт., 1984; публикация РСТ No WO84/03564; и публикация РСТ No WO84/03506.
На всем протяжении настоящего описания экспрессия "нуклеотидной последовательности" может употребляться для обозначения полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Более точно, экспрессия " нуклеотидной последовательности" охватывает собственно материал нуклеиновой кислоты и, следовательно, не ограничивается информацией о последовательности (т.е., последовательности букв, выбранной из четырех букв основания), которая биохимически характеризует специфичность молекулы ДНК или РНК.
Используемые в данном описании попеременно термины "нуклеиновые кислоты", "олигонуклеоти-ды" и " полинуклеотиды" включают РНК, ДНК или гибридные последовательности РНК/ДНК с более чем одной последовательностью в одноцепочечной или дуплексной форме. Термин "нуклеотид" используют в данном описании в качестве прилагательного к описанию молекул, включающих РНК, ДНК, или гибридных последовательностей РНК/ДНК любой длины в одноцепочечной или дуплексной форме. Термин "нуклеотид", также используемый в данном описании в качестве существительного, относится к индивидуальным нуклеотидам или к множеству нуклеотидов, подразумевая молекулу или индивидуальный элемент в большей молекуле нуклеиновой кислоты, включающей пурин или пиримидин, сахарную составляющую рибозы или дезоксирибозы и фосфатную группу, или фосфодиэфирную связь в случае нук-леотидов в олигонуклеотиде или полинуклеотиде. Хотя используемый в данном описании термин "нук-леотид" охватывает также "модифицированные нуклеотиды", которые включают, по меньшей мере, одну из модификаций (а) альтернативную связывающую группу, (b) аналоговую форму пурина, (с) аналоговую форму пиримидина или (d) аналоговый сахар, примеры аналоговых связывающих групп, пурина, пиримидинов и cахаров см., например, в публикации РСТ No WO95/04064. Полинуклеотидные последовательности настоящего изобретения могут быть получены любым известным способом, включая синтетический, рекомбинантный, ex vivo преобразование или их сочетанием, а также используя любые способы очистки, известные в данной области техники.
Последовательность, которую "функционально присоединяют" к регуляторной последовательности,
- 8 -
008252
такой как промотор, означает, что указанный регуляторный элемент находится в правильном положении и ориентации по отношению к нуклеиновой кислоте, для контролирования РНК-полимеразной инициации и экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Используемый в данном описании термин "функционально присоединенный" относится к связыванию полинуклеотидных элементов в функциональной взаимосвязи. Например, промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной кодирующей последовательности.
Термины "признак" и "фенотип" используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к любому видимому, обнаруживаемому или иначе измеряемому свойству организма, такому, например, как симптомы или предрасположенность к заболеванию. Обычно термины "признак" или "фенотип", используемые в данном описании, относят к симптомам или к предрасположенности к заболеванию, к положительному ответу или к побочным эффектам, связанным с лечением. Предпочтительно, указанный признак может представлять собой, без ограничения, психические расстройства, такие как шизофрения или биполярное расстройство, другие ЦНС или нейрональные расстройства, такие как эпилепсия или нарушения болевых ощущений, а также сердечно-сосудистые состояния, такие как стенокардия, гипертензия и аритмия, а также любой аспект, особенность или характеристику любого из данных заболеваний или состояний.
Термин "аллель", используемый в данном описании, относят к вариантам нуклеотидной последовательности. Двуаллельный полиморфизм имеет две формы. Диплоидные организмы могут быть гомозиготой или гетерозиготой по аллельной форме.
Термин "уровень гетерозиготности", используемый в данном описании, относят к доле индивидуумов в популяции, которые являются гетерозиготами по отдельному аллелю. В двуаллельной системе уровень гетерозиготности равен, в среднем, 2Ра(1-Ра), где Ра соответствует частоте наименее распространенного аллеля. Для использования в генетических исследованиях генный маркер должен обладать адекватным уровнем гетерозиготности, допускающим приемлемую вероятность того, что случайно выбранный субъект будет гетерозиготой.
Термин "генотип", используемый в данном описании, относят к тождественности аллелей, представленных у индивидуума или в образце. В контексте настоящего изобретения генотип предпочтительно относят к описанию двуаллельных маркерных аллелей, представленных у индивида или в образце, например, аллели двуаллельных маркеров в CanIon-гене или в геномной области. Термин "генотипиро-вание" образца или индивида по двуаллельному маркеру включает в себя определение конкретного алле-ля или конкретного нуклеотида, осуществляемое по индивидуальному двуаллельному маркеру.
Термин "мутация", используемый в данном описании, относят к различию в ДНК-последовательности между или среди разных геномов или индивидов, которые обладают частотой ниже 1%.
Термин "гаплотип" относят к сочетанию аллелей, представленных у индивида или в образце. В контексте настоящего изобретения гаплотип предпочтительно относят к сочетанию двуаллельных маркерных аллелей, обнаруживаемых у данного индивида, и которые могут быть ассоциированы с фенотипом.
Термин "полиморфизм", используемый в данном описании, относят к встречаемости одной или нескольких альтернативных геномных последовательностей или аллелей среди или у разных геномов или индивидов. "Полиморфный" относится к состоянию, в котором два или более вариантов конкретной геномной последовательности могут быть обнаружены в популяции. "Полиморфный сайт" представляет собой локус, по которому наблюдается изменчивость. Полиморфизм единственного нуклеотида представляет собой замещение одного нуклеотида другим нуклеотидом в данном полиморфном сайте. Деле-ция единичного нуклеотида или вставка единичного нуклеотида также приводит к возрастанию полиморфизма единственного нуклеотида. В контексте настоящего изобретения "полиморфизм единственного нуклеотида" предпочтительно относится к единичной нуклеотидной замене. Обычно у разных индивидов данный полиморфный сайт может быть занят двумя разными нуклеотидами.
Термины "двуаллельный полиморфизм" и "двуаллельный маркер" используются в данном описании взаимозаменямо и относятся к полиморфизму единственного нуклеотида, обладающего двумя аллелями с достаточно высокой частотой в популяции. "Двуаллельный маркерный аллель" относится к нуклеотид-ным вариантам, представленным по сайту двуаллельного маркера. Обычно частота малораспространенного аллеля двуаллельных маркеров настоящего изобретения, как оценка, составляет более чем 1%, предпочтительно его частота превышает 10%, более предпочтительно его частота составляет по меньшей мере 20% (т.е., уровень гетерозиготности составляет по меньшей мере 0,32), еще более предпочтительно его частота равна по меньшей мере 30% (т.е., уровень гетерозиготности достигает по меньшей мере 0,42). Двуаллельный маркер, в котором частота малораспространенного аллеля равна 30% или больше, называют "высококачественным двуаллельным маркером".
Положение нуклеотидов в полинуклеотиде относительно центра полинуклеотида описывается в данном описании следующим образом. Если полинуклеотид обладает нечетным числом нуклеотидов, то считают, что нуклеотид, равноотстоящий от 3' и 5' концов в данном полинуклеотиде, находится "в центре" данного полинуклеотида, и любой нуклеотид, непосредственно примыкающий к нуклеотиду в центре, или же сам нуклеотид в центре, считают находящимся "в 1 нуклеотиде от центра". При нечетном числе нуклеотидов в полинуклеотиде любую из пяти нуклеотидных позиций в средине полинуклеотида следует считать находящейся в 2 нуклеотидах от центра, и так далее. Если полинуклеотид обладает чет
- 9 -
008252
ным числом нуклеотидов, то в центре данного полинуклеотида будет находиться связь, а не нуклеотид. Таким образом, любой из двух центральных нуклеотидов следует считать находящимися "в 1 нуклеотиде от центра", а любой из четырех нуклеотидов в средине данного полинуклеотида следует считать находящимся "в 2 нуклеотидах от центра", и так далее. Что касается полиморфизма, который связан с заменой, вставкой или делецией 1 или более нуклеотидов, то данный полиморфизм, аллель или двуаллельный маркер находится "в центре" полинуклеотида, если разница между расстоянием от замещенных, вставленных или делетированных полинуклеотидов данного полиморфизма до 3'-конца данного полинуклео-тида, расстоянием от замещенных, вставленных или делетированных полинуклеотидов данного полиморфизма до 5'-конца данного полинуклеотида, равна нулю или одному нуклеотиду. Если данная разница равна 0-3, тогда данный полиморфизм считают находящимся "в 1 нуклеотиде от центра". Если эта разница составляет 0-5, данный полиморфизм считают находящимся "в 2 нуклеотидах от центра". Если же эта разница составляет 0-7, то данный полиморфизм считают находящимся "в 3 нуклеотидах от центра", и т.д.
Термин "левее", используемый в данном описании, относится к месту, которое находится около 5'-конца данного полинуклеотида от определенной точки отсчета, или, в случае гена, в направлении от кодирующей последовательности к промотору.
Термины "спаренные основания" и "спаренные основания Уотсона и Крика", используемые в данном описании взаимозаменяемо, относятся к нуклеотидам, которые могут быть связаны друг с другом водородной связью, благодаря идентичности их последовательностей, способом, подобным тому, который обнаруживает двухспиральная ДНК для остатков тимина или урацила, связанных с остатками аде-нина с помощью двух водородных связей, и остатков цитозина и гуанина, связанных с помощью трех водородных связей (См. Stryer, L., Biochemistry, 4th edition, 1995).
Термины "комплементарный" или "его комплемент", используемые в данном описании, относятся к последовательностям полинуклеотидов, которые способны образовывать пары оснований Уотсона и Крика с другим конкретным полинуклеотидом по всей полностью комплементарной области. Для данной цели настоящего изобретения первый полинуклеотид признают комплементарным второму полинуклео-тиду, если каждое основание первого полинуклеотида спаривается со своим комплементарным основанием. Комплементарными основаниями являются, как правило, А и Т (или А и U), или С и G. "Комплемент" используется в данном описании в качестве синонима "комплементарного полинуклеотида", "комплементарной нуклеиновой кислоты" и "комплементарной нуклеотидной последовательности". Данные термины, применяемые к парам полинуклеотидов, базируются исключительно на их последовательностях, а не на какой-либо конкретной совокупности условий, при которых данные два полинуклеотида были бы фактически связаны.
Варианты и фрагменты
1. Полинуклеотиды.
Варианты полинуклеотидов, в виде используемого в данном описании термина, представляют собой полинуклеотиды, которые отличаются от исходного полинуклеотида. Вариант полинуклеотида может быть встречаемым в природе вариантом, таким, например, как встречаемый в природе аллельный вариант, или он может быть вариантом, который не известен в качестве встречаемого в природе. Такие не встречаемые в природе варианты данного полинуклеотида можно создать методами мутагенеза, в том числе и теми, которые применимы к полинуклеотидам, клеткам или организмам. Обычно, различия столь невелики, что нуклеотидные последовательности исходного и вариантного полинуклеотидов почти полностью совпадают, а по многим участкам идентичны.
Варианты полинуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, включают, без существенного ограничения, нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 95% идентичны по-линуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nos 14, или полинуклеотидному фрагменту по меньшей мере из 12 последовательных нуклеотидов полинук-леотида, выбранного из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nos 1-4, и предпочтительно, по меньшей мере, идентичны на 99%, более предпочтительно, по меньшей мере, идентичны на 99,5%, и наиболее предпочтительны, по меньшей мере, идентичны на 99,8% полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nos 1-4, или любому полинуклеотидному фрагменту, по меньшей мере, из 12 последовательных нуклеотидов полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID No 1-4.
Нуклеотидные изменения, присутствующие в вариантном полинуклеотиде, могут быть молчащими, что означает, что они не изменяют аминокислоты, кодируемые данным полинуклеотидом. Однако нукле-отидные изменения могут также приводить и к аминокислотным заменам, добавлениям делециям, слияниям и укорочениям в данном полипептиде, кодируемом начальной последовательностью. В этих заменах, делециях или добавках могут участвовать один или более нуклеотидов. Данные варианты могут являться результатом изменений в кодирующей или некодирующей областях или в обоих. Изменения в кодирующих областях могут создавать консервативные или неконсервативные замены, делеции или добавки.
В контексте настоящего изобретения особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются те, в которых данные полинуклеотиды кодируют полипептиды, которые фактически сохраняют ту же биологическую функцию или активность, что и зрелый CanIon-белок, или те,
- 10 -
008252
в которых данные полинуклеотиды кодируют полипептиды, которые сохраняют или повышают основную биологическую активность, снижая в то же время вспомогательную (вторичную) биологическую активность.
Полинуклеотидный фрагмент представляет собой полинуклеотид, обладающий последовательностью, которая совершенно такая же, что и часть, но не вся данная нуклеотидная последовательность, предпочтительно нуклеотидная последовательность CanIon-гена, и его варианты. Данный фрагмент может представлять собой участок интрона или экзона CanIon-гена. Он может также представлять собой какую-нибудь часть из регуляторных областей CanIon. Предпочтительно, такие фрагменты включают, по меньшей мере, один из двуаллельных маркеров А1-А17 или его комплементов или двуаллельный маркер, сцепленный при нарушении равновесия с одним или несколькими двуаллельными маркерами А1-А17.
Такие фрагменты могут быть "автономными", т.е., не являться частью или слившимися с другими полинуклеотидами, или они могут быть включены в отдельный большой полинуклеотид, в котором они образуют сегмент или участок. Действительно, несколько таких фрагментов могут быть представлены в отдельном большом полинуклеотиде.
Факультативно, такие фрагменты могут состоять или состоять в основном из непрерывного участка последовательности, по меньшей мере, из 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов в длину. Совокупность предпочтительных фрагментов содержит, по меньшей мере, один из двуаллельных маркеров А1-А17 CanIon-гена, который описан в данном описании, или его комплементы.
2. Полипептиды.
Данный вариант может представлять собой 1) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком, и такой замещенный аминокислотный остаток может или может не кодироваться с помощью генетического кода, или 2) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают замещенную группу, или 3) вариант, в котором мутантный CanIon сливается с другим соединением, таким, например, как соединение, которое увеличивает время полужизни данного полипептида (например, полиэтиленгликоль), или 4) вариант, в котором дополнительные аминокислоты сливаются с мутантным CanIon, такой, например, как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которую употребляют для выделения очисткой мутантного CanIon, или препротеиновая последовательность. Такие варианты считаются находящимися в компетенции специалистов в данной области техники.
Полипептидный фрагмент представляет собой полипептид, обладающий последовательностью, которая идентична части, но не всей данной полипептидной последовательности, предпочтительно полипептид, кодируемый CanIon-геном и его вариантами.
Что касается аминокислотной замены в аминокислотной последовательности полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, одну или несколько аминокислот можно заменить "эквивалентными" аминокислотами. Выражение "эквивалентная" аминокислота используют в данном описании для обозначения любой аминокислоты, которая может быть заменена одной или несколькими аминокислотами, обладающими аналогичными свойствами, при условии, что специалисты в области химии пептидов могут предполагать вторичную структуру и гидропатичную природу данного полипептида, которые будут оставаться практически неизмененными. Большей частью следующие группы аминокислот соответствуют эквивалентным изменениям: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
Специфичный вариант осуществления представляющей интерес модифицированной пептидной CanIon-молекулы, в соответствии с настоящим изобретением, включает, но не ограничивается указанным, пептидную молекулу, которая устойчива к протеолизу, в которой пептидная связь -CONH- модифицирована и заменена восстановленной связью (CH2NH), связью retro inverso (NHCO), метиленоксис-вязью (QH2-O), тиометиленовой связью (CH2-S), карбосвязью (СН2СН2), ацетометиленовой связью (СО-СН2), гидроксиэтиленовой связью (СЖШ-СН2), N-N-связью, Е-ак^-связью или -СН=СН-связью. В настоящее изобретение включен CanIon-полипептид человека или его фрагмент, или его вариант, в котором по меньшей мере одна пептидная связь была модифицирована, как описано выше.
Такие фрагменты могут быть "автономными", т.е., не являться частью или слившимися с другими полипептидами, или они могут быть включены в отдельный большой полипептид, в котором они образуют сегмент или участок. Вместе с тем, несколько фрагментов можно включить в один большой полипептид.
В качестве репрезентативных примеров полипептидных фрагментов настоящего изобретения в данном описании можно указать на фрагменты, которые обладают длиной от примерно 5, 6, 7, 8, 9 или 1015, 10-20, 15-40 или 30-55 аминокислот. Предпочтительными являются фрагменты, содержащие, по крайней мере, мутацию одной аминокислоты в белок CanIon.
Идентичность нуклеиновых кислот или полипептидов
Термины "процент идентичности последовательностей" и "процент гомологии", используемые в данном описании взаимозаменяемо, применяют для сравнения полинуклеотидов или полипептидов, и определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может включать добавки или делеции (т.е. пробелы) при сравнении с исходной последовательностью (которая не включает добавки или делеции) для оптимального выравнивания двух данных последовательностей. Указанный
- 11 -
008252
процент вычисляют путем определения числа позиций, по которым у обеих последовательностей наблюдаются идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки, с получением соответствующих позиций, делением числа соответствующих позиций на общее число позиций в данном окне сравнения и умножением полученного результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Гомологию оценивают с использованием любого из множества разнообразных алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области техники. Такие алгоритмы и программы включают, но никоим образом не ограничиваются, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA и CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988; Altschul и соавт., 1990; Thompson и соавт., 1994; Higgins и соавт., 1996; Altschul и соавт., 1990; Altschul и соавт., 1993). В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гомологии последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивают с использованием Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), который хорошо известен в данной области техники (см., например, Karlin and Altschul, 1990; Altschul и соавт., 1990, 1993, 1997). В частности, пять специфичных BLAST-программ используются для выполнения следующей задачи:
(1) BLASTP и BLAST3 сравнивают запрашиваемую аминокислотную последовательность с последовательностью белка базы данных;
(2) BLASTN сравнивает запрашиваемую нуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью базы данных;
(3) BLASTX сравнивает воображаемые продукты трансляции шести рамок запрашиваемой нуклео-тидной последовательности (обе цепи) с последовательностью белка базы данных;
(4) TBLASTN сравнивает запрашиваемую последовательность белка с нуклеотидной последовательностью базы данных, транслированную со всех шести открытых рамках считывания (обе цепи); и
(5) TBLASTX сравнивает трансляцию шести рамок запрашиваемой нуклеотидной последовательности с трансляцией шести рамок нуклеотидной последовательности базы данных.
BLAST-программы идентифицируют гомологичные последовательности путем идентификации сходных сегментов, которые именуются в данном описании как "высокооцениваемые пары сегментов", между представляющей интерес аминокислотной или нуклеотидной последовательностью и тест-последовательностью, которую предпочтительно получают из последовательности белка или нуклеотид-ной последовательности базы данных. Высокооцениваемые пары сегментов предпочтительно идентифицируют (т.е. выстраивают) с помощью способов оценки матрицы, многие из которых хорошо известны в данной области техники.
Предпочтительно используемая матрица оценок представляет собой ВLOSUM62-матрицу (Connet и соавт., 1992; Henikoff and Henikoff, 1993). С меньшей предпочтительностью можно также использовать матрицы РАМ или РАМ250 (см., например, Schwartz and Dayhoff, eds., 1978). BLAST-программы оценивают статистическую значимость идентифицируемых высокооцениваемых пар сегментов и предпочтительно отбирают те сегменты, которые удовлетворяют порогу значимости, устанавливаемому пользователем, такому как устанавливаемый пользователем процент гомологии. Предпочтительно статистическая значимость высокооцененной пары сегментов оценивается с использованием формулы статистической значимости Карлина (см., например, Karlin and Altschul, 1990).
BLAST-программы могут использоваться со значениями параметров по умолчанию или с модифицированными параметрами, созданными пользователем.
Жесткие условия гибридизации
С целью охарактеризовать такую гибридизующуюся нуклеиновую кислоту, в соответствии с настоящим изобретением, жесткие условия гибридизации являются следующими:
стадию гибридизации осуществляют при 65°С в присутствии 6 х SSC-буфера, 5 х раствора Ден-хардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося.
Стадию гибридизации осуществляют с последующими четырьмя стадиями отмывки:
две отмывки по 5 мин, предпочтительно при 65°С в 2 х SSC и 0,1% SDS-буфере;
одна отмывка 30 мин, предпочтительно при 65°С в 2 х SSC и 0,1% SDS-буфере,
одна отмывка 10 мин, предпочтительно при 65°С в 0,1 х SSC и 0,1% SDS-буфере,
данные условия гибридизации пригодны для молекулы нуклеиновой кислоты длиной около 20 нук-леотидов. Нет необходимости говорить о том, что описанные выше условия гибридизации адаптируют в соответствии с длиной требуемой нуклеиновой кислоты, следуя методам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Подходящие условия гибридизации можно, например, адаптировать в соответствии с указаниями, изложенными в книге Hames и Higgins (1985).
Геномные последовательности CanIon-гена
Настоящее изобретение включает в себя CanIon-ген или геномные CanIon-последовательности, состоящие, или в основном состоящие из, или включающие последовательность SEQ ID Nos 1-3, комплементарную ей последовательность, а также ее фрагменты и варианты. Данные полинуклеотиды могут представлять собой полинуклеотиды, выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные.
Настоящее изобретение включает в себя также выделенный очисткой, выделенный или рекомби-нантный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90 или 95% нуклеотидной идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ
- 12 -
008252
ID Nos 1-3 или с ее комплементарной последовательностью, или с ее фрагментом. Нуклеотидные различия, что касается нуклеотидной последовательности SEQ ID Nos 1-3, могут быть, как правило, распределены случайно по всей длине нуклеиновой кислоты. Тем не менее, предпочтительными нуклеиновыми кислотами являются те из них, в которых нуклеотидные различия, что касается нуклеотидной последовательности SEQ ID Nos 1-3, преимущественно локализованы за пределами данных кодирующих последовательностей, содержащихся в экзонах. Данные нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, могут использоваться в качестве олигонуклеотидных праймеров или зондов с целью обнаружения наличия копии CanIon-гена в тест-выборке или, альтернативно, с целью амплифицировать нуклеотидную последовательность-мишень в CanIon-последовательностях.
Другой объект настоящего изобретения состоит из выделенной очисткой, выделенной или реком-бинантной нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью SEQ ID Nos 1-3 или с комплементарной ей последовательностью, или с ее вариантом, в жестких гибридизацион-ных условиях, как указано выше. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанная выделенная очисткой, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота специфически гибридизуется с полинуклеотидами CanIon-гена человека, более предпочтительно, если указанная нуклеиновая кислота способна гибридизоваться с нуклеотидами из CanIon-гена человека, но практически неспособна гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью CanIon-гена крысы.
Особенно предпочтительная нуклеиновая кислота настоящего изобретения включает выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 10000 нуклеотидов из SEQ ID Nos 1-3 или из ее комплементов. Следует отметить, что нуклеотидные фрагменты любого размера и последовательности могут также включаться в полинуклеотиды, описанные в данном разделе.
Геномная нуклеиновая кислота CanIon включает 44 экзона. Расположение экзонов в SEQ ID Nos 1-3 подробно представлено ниже в табл. В.
Таблица В
Экзон
Положение в SEQ ID Nol
Интрон
Положение в SEQ ID Nol
Начало
Конец
Начало
Конец
2001
2026
2027
19187
19188
19334
19335
22995
22996
23178
23179
39730
39731
39814
39815
41336
41337
41476
41477
41564
41565
41693
41694
73012
73013
73167
Экзон
Положение в SEQ ID No2
Интрон
Положение в SEQ ID
No2 1
Начало
Конец
Начало
Конец
43726
43868
43869
43997
43998
44102
44103
52092
52093
52179
52180
77567
77568
77699
77700
98225
98226
98393
98394
106566
106567
106758
106759
144108
144246
144246
144247
159793
159794
159868
159869
191291
191292
191428
191429
192966
192967
193108
193109
211539
211540
211613
211614
225005
225006
225107
225108
225543
225544
225613
225614
228449
228450
228541
228542
228629
228630
228752
228753
231288
231289
231345
231346
231588
231589
231709
231710
231812
231813
231944
231945
232899
232900
233067
233068
235354
235355
235459
- 13 -
008252
Экзон
Положение в SEQ ID No3
Интрон
Положение в SEQ ID No3
Начало
Конец
Начало
Конец
3895
4001
4002
9610
9611
9731
9732
9815
9816
9914
9915
15775
15776
15869
15870
16381
16382
16488
16489
16696
16697
16771
16772
17933
17934
18053
18054
23643
23644
23712
23713
24927
24928
25076
25077
25912
25913
26006
26007
30766
30767
30899
30900
31560
31561
31676
31677
34073
34044
34201
34202
37492
37493
3763
37644
39651
39652
39801
39802
41562
41563
41680
41681
44130
44131
45841
Таким образом, настоящее изобретение содержит выделенные очисткой, выделенные или рекоби-нантные полинуклеотиды, включающие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей, каждая, из 44 экзонов CanIon-гена и, каждая, - из комплементарной ей последовательности. В настоящем изобретении обеспечиваются также выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие сочетание, по меньшей мере, из двух экзонов CanIon-гена, в котором данные полинуклеотиды размещены в нуклеиновой кислоте, от 5'-конца до 3'-конца указанной нуклеиновой кислоты, в том же порядке, что и в SEQ ID No 1-3.
Интрон 1 относится к нуклеотидной последовательности, локализованной между Экзоном 1 и Эк-зоном 2, и так далее. Положение интронов детально представлено в табл. А. Таким образом, настоящее изобретение содержит выделенные очисткой, выделенные или рекобинантные полинуклеотиды, включающие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 43 интронов CanIon-гена, или комплементарную ей последовательность.
Хотя данный раздел называется "Геномные Последовательности CanIon", следует иметь ввиду, что нуклеотидные фрагменты любого размера и последовательности могут также включаться в полинуклеотиды, описанные в данном разделе, фланкируя данные геномные последовательности CanIon на любой стороне или между двумя или более такими геномными последовательностями.
кДНК-последовательности CanIon
Показано, что экспрессия CanIon-гена приводит к продуцированию по меньшей мере одного из видов мРНК, последовательности нуклеиновой кислоты, которая приведена в SEQ ID No 4.
Другой объект настоящего изобретения представляет собой выделенную очисткой, выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4, комплементарные ей последовательности, а также аллельные варианты, и ее фрагменты. Кроме того, предпочтительные полинуклеотиды настоящего изобретения включают выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные кДНК CanIon, состоящие, в основном состоящие из или включающие последовательность SEQ ID No 4. Особенно предпочтительные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов из SEQ ID No 4 или из ее комплементов. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности включает связанный с CanIon двуаллельный маркер; предпочтительно избранный из группы, состоящей из А12 или А16.
К настоящему изобретению относится также выделенная очисткой или выделенная нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 95% нуклеотидной идентичностью с полинуклеотидом SEQ ID No 4, преимущественно 99% нуклеотидной идентичностью, предпочтительно 99,5% нуклеотидной идентичностью и наиболее предпочтительно 99,8% нуклеотидной идентичностью с полинуклеотидом SEQ ID No 4, или комплементарная ей последовательность или ее биологически активный фрагмент.
Другая цель настоящего изобретения имеет отношение к выделенным очисткой, выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, включающим полинуклеотид, который гибридизуется в сформулированных в данном описании жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом SEQ ID No 4, или с комплементарной ему последовательностью или с его вариантом, или с его биологически активным
- 14 -
008252
фрагментом.
Дополнительная цель настоящего изобретения имеет отношение к выделенному, выделенному очисткой или рекомбинантному полинуклеотиду, который кодирует CanIon-полипептид, включающий непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот SEQ ID No 5, в котором указанный непрерывный участок последовательности включает, по меньшей мере, 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485,
1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 SEQ ID No 5. Включен также выделенный, выделенный
очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, который кодирует CanIon-полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или производные или ее биологически активные фрагменты, а также выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, который кодирует CanIon-полипептид, идентичный по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99,5 или 99% аминокислотной последовательности SEQ ID No 5.
кДНК SEQ ID No 4 включает 5'-UTR-область, начинающуюся от нуклеотида в положении 1 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 65 SEQ ID No 4. кДНК из SEQ ID No кДНК включает 3'-UTR-область, начинающуюся от нуклеотида в положении 5283 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 6799 SEQ ID No 4.
Следовательно, в настоящем изобретении рассматривается выделенная очисткой, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность 5'UTR из кДНК CanIon, комплементарную ей последовательность, или ее аллельный вариант. В настоящем изобретении рассматривается также выделенная очисткой, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность 3'UTR из кДНК CanIon, комплементарную ей последовательность, или ее аллельный вариант.
Хотя данный раздел называется "кДНК-последовательности CanIon", следует иметь ввиду, что нук-леотидные фрагменты любого размера и последовательность могут быть также включены в полинуклео-тиды, описанные в данном разделе, фланкируя геномные последовательности CanIon на любой стороне или между двумя или несколькими такими геномными последовательностями.
Кодирующие области
Открытая рамка считывания CanIon содержится в соответствующей мРНК из SEQ ID No кДНК. Точнее, эффективная CanIon-кодирующая последовательность (CDS) включает область между нуклеотидной позицией 66 (первый нуклеотид ATG-кодона) и нуклеотидной позицией 5282 (концевой нуклео-тид TGA-кодона) из SEQ ID No 4. Настоящее изобретение включает также выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8 или 10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 или 1000 аминокислот SEQ ID No 5.
Раскрытый выше полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность CanIon-гена, может экспрессироваться в требуемой клетке-хозяине или в требуемом организме-хозяине, если данный полинуклеотид поместить под контроль соответствующих экспрессионных сигналов. Экспрессионные сигналы могут представлять собой или экспрессионные сигналы, содержащиеся в регуляторных районах CanIon-гена настоящего изобретения, или в противоположность сигналы могут представлять собой экзогенные регуляторные последовательности нуклеиновых кислот. Такой полинуклеотид, помещенный под соответствующие экспрессионные сигналы, можно также встроить в вектор для его экспрессии и/или амплификации.
Регуляторные CanIon-последовательности
Как отмечено, геномная последовательность CanIon-гена содержит регуляторные последовательности как в некодирующей 5'-фланкирующей области, так и в некодирующей 3'-фланкирующей области, которые ограничивают CanIon-кодирующую область, содержащую 44 экзона данного гена.
Полинуклеотиды, полученные из 5'- и 3'-регуляторных областей, пригодны для того, чтобы выявить наличие, по меньшей мере, копии нуклеотидной последовательности CanIon или ее фрагмента в тестируемом образце.
Промоторную активность 5'-регуляторных областей, содержащихся в CanIon, можно оценить, как описано ниже. Для того чтобы идентифицировать релевантные биологически активные полинуклеотид-ные фрагменты или варианты SEQ ID No 1, специалистов в данной области техники можно отослать к Sambrook и соавт., 1989, которые описывают использование рекомбинантного вектора, несущего маркерный ген (т.е. бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу и т.п.), экспрессию которого можно обнаружить при помещении его под контроль биологически активных полинуклеотидных фрагментов или вариантов SEQ ID No 1. Геномные последовательности, локализованные "левее" первого эк-зона CanIon-гена, клонируют в соответствующий промоторный репортерный вектор, такие как доступные от Clontech Промоторные репортерные векторы pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pPgal-Basic, pPgal-Enhancer или pEGFP1, или беспромоторный репортерный вектор гена люциферазы от Promega pGL2-basic или pGL3-basic. Вкратце, каждый из этих промоторных репортерных векторов включает множество сайтов клонирования, позиционированных "левее" репортерного гена, кодирующего легко поддающийся
- 15 -
008252
анализу белок, такой как секретируемая щелочная фосфатаза, люцифераза, в-галактозидаза или зеленый флуоресцентный белок.
Последовательности, расположенные "левее" от кодирующей CanIon-области, встраивают в сайты клонирования "левее" данного репортерного гена в обоих ориентациях и вводят в соответствующую клетку-хозяина. Анализируют уровень репортерного белка и сравнивают с уровнем, полученным для вектора, у которого отсутствует вставка в сайт клонирования. Наличие повышенного уровня экспрессии в векторе, содержащем вставку, по сравнению с уровнем для контрольного вектора, свидетельствует о наличии промотора в данной вставке. При необходимости расположенные слева последовательности могут быть клонированы в векторы, которые содержат энхансер для увеличения уровней транскрипции под слабыми промоторными последовательностями. Существенный уровень повышенной экспрессии, которая наблюдается для вектора, не имеющего вставки, свидетельствует о том, что промоторная последовательность присутствует во встроенной слева последовательности.
Промоторную последовательность, расположенную "левее" геномной ДНК, можно также определить путем создания сгруппированных 5' и/или 3' делеций в расположенной слева ДНК с использованием традиционных методик, таких как обработка экзонуклеазой III или обработка соответствующей эндонук-леазой рестрикции. Полученные делеционные фрагменты можно встроить в данный промоторный ре-портерный вектор, чтобы определить, действительно ли данная делеция снижает или уничтожает промо-торную активность, как это описано, например, у Coles и соавт. (1998), раскрытие которой включено в данное описание путем ссылки во всей ее полноте. Таким способом можно определить границы промоторов. При желании можно идентифицировать потенциальные индивидуальные регуляторные сайты внутри промотора с использованием сайт-направленного мутагенеза или линкерного сканирования, которые аннулируют сайты связывания потенциальных транскрипционных факторов внутри промотора, индивидуально или в сочетании. Влияние таких мутаций на уровень транскрипции можно определить путем встраивания мутаций в сайты клонирования промоторных репортерных векторов. Данный вид анализа хорошо известен специалистам в данной области техники и описан в WO 97/17359, патенте США № 5374544; ЕР 582796; патенте США № 5698389; патенте США № 5643746; патенте США № 5502176; и патенте США № 5266488; раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки во всей их полноте.
Силу и специфичность промотора CanIon-гена можно оценить через уровни экспрессии детектируемого полинуклеотида, функционально присоединенного к данному CanIon-промотору, в разных типах клеток и тканях. Данный детектируемый полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, который специфически гибридизуется с заранее определенным олигонуклеотидным зондом, или поли-нуклеотид, кодирующий детектируемый белок, в том числе CanIon-полипептид или фрагмент или его вариант. Данный вид анализа хорошо известен специалистам в данной области техники и описан в патенте США № 5502176; и патенте США № 5266488; раскрытие которых включено путем ссылки во всей их полноте. Некоторые способы обсуждаются более подробно ниже.
Полинуклеотиды, несущие регуляторные элементы, локализованные на 5' или на 3'-конце CanIon-кодирующей области, можно преимущественно использовать для контроля транскрипционной и трансляционной активности представляющего интерес гетерологичного полинуклеотида.
Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается также выделенная очисткой или выделенная нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотид, который выбран из группы, состоящей из 5'-и 3'-регуляторных областей, или комплементарную ему последовательность, или ее биологически активный фрагмент или вариант. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения "5'-регуляторная область" локализована в нуклеотидной последовательности, расположенной между позициями 1 и 2000 SEQ ID No 1. "3'- регуляторная область" локализована в нуклеотидной последовательности, расположенной между позициями 45842 и 47841 SEQ ID No 3.
Настоящее изобретение относится также к выделенной очисткой или выделенной нуклеиновой кислоте, включающей полинуклеотид, обладающий, по меньшей мере, 95% нуклеотидной идентичности с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из 5' и 3' регуляторных областей, преимущественно 99% нуклеотидной идентичности, предпочтительно 99,5% нуклеотидной идентичности и наиболее предпочтительно 99,8% нуклеотидной идентичности с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из 5' и 3' регуляторных областей, или комплементарной ему последовательностью или его вариантом, или его биологически активным фрагментом.
Другой объект настоящего изобретения включает выделенные очисткой, выделенные или рекомби-нантные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который гибридизуется в установленных в данном описании жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 5' и 3' регуляторных областей, или с комплементарной ему последовательностью или с его вариантом, или с его биологически активным фрагментом.
Предпочтительные фрагменты 5'-регуляторной области обладают длиной около 1500 или 1000 нук-леотидов, предпочтительно около 500 нуклеотидов, более предпочтительно около 400 нуклеотидов, еще более предпочтительно около 300 нуклеотидов и наиболее предпочтительно около 200 нуклеотидов.
Предпочтительные фрагменты 3'-регуляторной области обладают, по меньшей мере, 50, 100, 150,
- 16 -
008252
200, 300 или 400 п.н. в длину.
"Биологически активные" полинуклеотидные производные SEQ ID Nos 1-3 представляют собой по-линуклеотиды, включающие или же состоящие из фрагмента указанного полинуклеотида, который является функционирующим в качестве регуляторной области для экспрессирования рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида в рекомбинантной клетке-хозяине. Он должен действовать либо в качестве энхансера, либо как репрессор.
Для цели настоящего изобретения нуклеиновая кислота или полинуклеотид являются "функциональными" в качестве регуляторной области для экспрессии рекомбинантного полипептида или реком-бинантного полинуклеотида, если указанный регуляторный полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, которые содержат информацию о регуляции транскрипции и трансляции, и такие последовательности "функционально связаны" с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют требуемый полипептид или требуемый полинуклеотид.
Регуляторные полинуклеотиды настоящего изобретения можно получить из нуклеотидной последовательности SEQ ID Nos 1 и 3 путем расщепления с использованием соответствующих ферментов рестрикции, что описано, например, в книге Sambrook и соавт. (1989). Регуляторные полинуклеотиды можно также получить путем обработки SEQ ID Nos 1 и 3 ферментом экзонуклеазой, такой как Ва131 (Wabiko и соавт., 1986). Такие регуляторные полинуклеотиды можно также получить с помощью химического синтеза нуклеиновых кислот, как описано в другом месте в данном описании.
Регуляторные полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой часть рекомбинантного экспрессионного вектора, который можно использовать для экспрессии кодирующей последовательности в требуемой клетке-хозяине или организме-хозяине. Рекомбинантные экспрессионные векторы, в соответствии с настоящим изобретением, описаны в другом месте настоящего описания.
Предпочтительный 5'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 5'-нетранс-лируемую область (5'-UTR) кДНК CanIon, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.
Предпочтительный 3'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 3'-нетранс-лируемую область (3'-UTR) кДНК CanIon, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.
Дополнительная цель настоящего изобретения включает выделенную очисткой или выделенную нуклеиновую кислоту, включающую:
a) нуклеиновую кислоту, включающую регуляторную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(i) нуклеотидной последовательности, включающей полинуклеотид из 5'-регуляторной области или комплементарную ей последовательность;
(ii) нуклеотидной последовательности, включающей полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 95% нуклеотидной идентичности с нуклеотидной последовательностью из 5'-регуляторной области или с комплементарной ей последовательностью;
(iii) нуклеотидной последовательности, включающей полинуклеотид, который гибридизуется в жестких гибридизационных условиях с нуклеотидной последовательностью из 5'-регуляторной области или с комплементарной ей последовательностью; и
(iv) биологически активного фрагмента или варианта полинуклеотидов в (i), (ii) и (iii);
b) полинуклеотид, кодирующий требуемый полипептид или представляющую интерес нуклеиновую кислоту, функционально присоединенную к нуклеиновой кислоте, указанной выше в (а);
c) факультативно, нуклеиновую кислоту, включающую 3'-регуляторный полинуклеотид, предпочтительно 3'-регуляторный полинуклеотид CanIon-гена.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота отличается тем, что указанная нуклеиновая кислота включает 5'-нетранслируемую область (5'-UTR) кДНК CanIon, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота отличается тем, что указанная нуклеиновая кислота включат 3'-нетранслируемую область (3'-UTR) кДНК CanIon, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.
Регуляторный полинуклеотид 5'-регуляторной области или его биологически активные фрагменты или варианты, функционально присоединяют по 5'-концу полинуклеотида, кодирующего требуемый полипептид или полинуклеотид.
Регуляторный полинуклеотид 3'-регуляторной области, или его биологически активные фрагменты или варианты, преимущественно функционально присоединяют по 3'-концу полинуклеотида, кодирующего требуемый полипептид или полинуклеотид.
Требуемый полипептид, кодируемый указанной выше нуклеиновой кислотой, может иметь разную природу или происхождение, включая белки прокариотического или эукариотического происхождения. Полипептиды, экспрессируемые под контролем CanIon-регуляторной области, включают антигены бактерий, грибов или вирусов. Включены также эукариотические белки, такие как внутриклеточные белки, подобные белки "домашнего хозяйства", связанные с мембраной белки, подобные рецепторам, и секре-тируемые белки, подобные эндогенным медиаторам, таким как цитокины. Требуемый белок может быть
- 17 -
008252
CanIon-белком, в частности, белком с аминокислотной последовательностью SEQ ID No 5, или фрагментом или его вариантом.
Требуемые нуклеиновые кислоты, кодируемые указанным выше полинуклеотидом, обычно РНК-молекулой, могут быть комплементарны требуемому кодирующему полинуклеотиду, например, CanIon-кодирующей последовательности, и таким образом использоваться в качестве антисмыслового полинук-леотида.
Такой полинуклеотид может включаться в рекомбинантный экспрессионный вектор, чтобы экс-прессировать требуемый полипептид или требуемую нуклеиновую кислоту в клетке-хозяине или в организме-хозяине. Соответствующие рекомбинантные векторы, которые содержит полинуклеотид, такой как описано в данном описании, рассматриваются в другом месте настоящего описания.
Полинуклеотидные конструкции
Термины "полинуклеотидная конструкция" и "рекомбинантный полинуклеотид", используемые в данном описании взаимозаменяемо, относятся к линейным или кольцевым, выделенным очисткой или выделенным полинуклеотидам, которые были искусственно созданы и которые включают, по меньшей мере, две нуклеотидные последовательности, которые не обнаруживаются в виде непрерывных нуклео-тидных последовательностей в их исходном природном окружении.
ДНК-конструкция, которая обеспечивает прямую временную и пространственную экспрессию CanIon-гена в рекомбинантных клетках-хозяевах и в трансгенных животных
Для того чтобы исследовать физиологические и фенотипические последствия отсутствия синтеза CanIon-белка, как на клеточном уровне, так и на уровне мультиклеточного организма, в настоящее изобретение включены также ДНК-конструкции и рекомбинантные векторы, обеспечивающие обусловленную экспрессию конкретного аллеля CanIon-геномной последовательности или кДНК, а также копии данной геномной последовательности или кДНК, содержащие замены, делеции или добавки из одного или более оснований, что касается CanIon-нуклеотидной последовательности SEQ ID Nos 1-4, или ее фрагмента, причем данные замены, делеции или добавки оснований локализованы в экзоне, интроне или регуляторной последовательности, но предпочтительно в 5'-регуляторной последовательности или в эк-зоне CanIon-геномной последовательности, или в CanIon-кДНК SEQ ID No 4. В предпочтительном варианте осуществления CanIon-последовательность включает двуаллельный маркер настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения CanIon-последовательность включает двуаллельный маркер настоящего изобретения, предпочтительно один из двуаллельных маркеров А1-А17.
Настоящее изобретение содержит рекомбинантные векторы, включающие любой один из полинук-леотидов, описанных в настоящем изобретении. В частности, полинуклеотидные конструкции, в соответствии с настоящим изобретением, могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделе "Геномные Последовательности CanIon-гена", в разделе "кДНК-последовательности CanIon", в разделе "Кодирующие Области" и в разделе "Олигонуклеотидные Зонды и Праймеры".
Первую предпочтительную ДНК-конструкцию создают на основе оперона устойчивости к тетрациклину tet из транспозона Tn10 E. coli для контроля экспрессии CanIon-гена так, как описано у Gossen и соавт. (1992, 1995) и у Furth и соавт. (1994). Такая ДНК-конструкция содержит семь tet-операторных последовательностей из Tn10 (tetop), которые сливаются с минимальным промотором или с 5'-регуляторной последовательностью CanIon-гена, причем указанный минимальный промотор или указанную CanIon-регуляторную последовательность функционально присоединяют к представляющему интерес полинуклеотиду, который кодирует смысловой или антисмысловой олигонуклеотид или полипептид, включая CanIon-полипептид или его пептидный фрагмент. Данная ДНК-конструкция является функциональной в качестве условной экспрессионной системы представляющей интерес нуклеотидной последовательности, где одна и та же клетка включает нуклеотидную последовательность, кодирующую репрес-сор дикого типа (tTA) или мутантный (ГТА) репрессор, слитый с активирующим доменом вирусного белка VP16 из вируса простого герпеса, помещенного под контроль промотора, такого как HCMVIE1 энхан-сер/промотор или MMTV-LTR. Фактически предпочтительная ДНК-конструкция настоящего изобретения включает как полинуклеотид, содержащий tet-операторную последовательность, так и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую репрессор tTA или ГТА.
В конкретном варианте осуществлении настоящего изобретения условная экспрессионная ДНК-конструкция содержит последовательность, кодирующую мутантный тетрациклиновый репрессор ГТА, причем экспрессия представляющего интерес полинуклеотида является молчащей в отсутствие тетрациклина и индуцируется в его присутствии.
ДНК-конструкции, обеспечивающие гомологичную рекомбинацию: замещающие векторы
Вторая предпочтительная ДНК-конструкция включает, от 5'-конца до 3'-конца: (а) первую нуклео-тидную последовательность, которая включена в CanIon-геномную последовательность; (b) нуклеотид-ную последовательность, включающую позитивный селективный маркер, такой как маркер устойчивости к неомицину (шо); и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая включена в CanIon-геномную последовательность и локализована в геноме справа от первой CanIon-нуклеотидной последовательности (а).
- 18 -
008252
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная ДНК-конструкция включает также негативный селективный маркер, расположенный слева от нуклеотидной последовательности (а) или справа от нуклеотидной последовательности (с). Предпочтительно, если негативный селективный маркер включает ген тимидинкиназы (tk) (Thomas и соавт., 1986), ген бета-гигромицина (Те Ricle и соавт., 1990), hprt-ген (Van der Lught и соавт., 1991; Reid и соавт., 1990) или фрагмент гена дифтерийного токсина A (Dt-A) (Nada и соавт., 1993; Yagi и соавт., 1990). Предпочтительно, если позитивный селективный маркер локализован в экзоне CanIon-последовательности так, что разрывает данную последовательность, кодирующую CanIon-белок. Данные замещающие векторы описаны, например, у Thomas и соавт. (1986; 1987), Mansour и соавт. (1988) и у Koller и соавт. (1992).
Безразлично где расположить первую и вторую нуклеотидные последовательности (а) и (с) - в CanIon-регуляторной последовательности, в интронной последовательности, в экзонной последовательности или в последовательности, содержащей и регуляторную и/или интронную и/или экзонную последовательности. Размер нуклеотидных последовательностей (а) и (с) колеблется от 1 до 50 т.п.н., предпочтительно от 1 до 10 т.п.н., более предпочтительно от 2 до 6 т.п.н. и наиболее предпочтительно от 2 до 4 т.п.н. ДНК-конструкции, обеспечивающие гомологичную рекомбинацию: Cre-LoxP-система
Такие новые ДНК-конструкции используют в сайт-специфичной рекомбинационной системе фага Р1. Фаг Р1 обладает рекомбиназой, именуемой Сге, которая специфически взаимодействует с 34 парами нуклеотидов loxP-байта. Данный loxP-сайт составлен из двух палиндромных последовательностей из 13 п.н., разделенных 8 п.н. консервативной последовательности (Hoess и соавт., 1986). Рекомбинация между двумя loxP-сайтами, обладающими идентичной ориентацией, с помощью Cre-фермента приводила к удалению ДНК-фрагмента.
Cre-loxP-система, используемая в сочетании с методом гомологичной рекомбинации, впервые была описана Gu и соавт. (1993, 1994). Вкратце, представляющую интерес нуклеотидную последовательность встраивают в намеченное место генома, содержащего по меньшей мере два loxP-сайта в одной и той же ориентации и расположенных на соответствующих концах нуклеотидной последовательности, которую вырезают из данного рекомбинантного генома. Данное экцизионное событие требует присутствия в ядре рекомбинантной клетки-хозяина фермента рекомбиназы (Сге). Фермент рекомбиназу можно внести в нужное время либо с помощью (а) инкубации данных рекомбинантных клеток-хозяев в культуральный среде, содержащей данный фермент, с помощью инъекции Cre-фермента прямо в нужную клетку так, как описано у Araki и соавт. (1995), или путем введения данного фермента в клетки-хозяева с помощью ли-посом так, как описано у Baubonies и соавт. (1993); (b) трансфекции клетки-хозяина с помощью вектора, включающего Сге-кодирующую последовательность, функционально присоединенную к функциональному в данной рекобинантной клетке-хозяине промотору, который необязательно является индуцируемым, причем указанный вектор внедряют в данную рекомбинантную клетку-хозяина так, как описано у Gu и соавт. (1993) и у Sauer и соавт. (1988); (с) введения в геном клетки-хозяина полинуклеотида, включающего Сге-кодирующую последовательность, функционально присоединенную к функциональному в данной рекомбинантной клетке-хозяине промотору, который необязательно является индуцируемым, а указанный полинуклеотид встраивается в геном клетки-хозяина либо в результате случайного встраивания, либо в результате гомологичной рекомбинации так, как описано у Gu и соавт. (1994).
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения векторную последовательность, содержащую последовательность, которую встраивают в CanIon-ген с помощью гомологичной рекомбинации, конструируют таким образом, чтобы селективные маркеры фланкировались бы loxP-сайтами в одной и той же ориентации в результате обработки Cre-ферментом возможно было осуществить удаление селективных маркеров, оставляя представляющие интерес CanIon-последовательности, которые были встроены с помощью гомологичной рекомбинации. Снова необходимы два селективных маркера: позитивный селективный маркер - для отбора по рекомбинационному событию, и негативный селективный маркер - для отбора по событию гомологичной рекомбинации. Векторы и способы с использованием Cre-loxP-системы описываются у Zou и соавт. (1994).
В соответствии с этим третья предпочтительная ДНК-конструкция настоящего изобретения включает, от 5'-конца до 3'-конца: (а) первую нуклеотидную последовательность, которая включается в CanIon-геномную последовательность; (b) нуклеотидную последовательность, включающую полинуклеотид, кодирующий позитивный селективный маркер, причем указанная нуклеотидная последовательность дополнительно включает две последовательности, определяющие сайт, узнаваемый рекомбиназой, такой как loxP-сайт, и данные два сайта размещаются в той же самой ориентации; и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая включается в CanIon-геномную последовательность и локализуется в данном геноме справа от первой CanIon-нуклеотидной последовательности (а).
Последовательности, определяющие сайт, узнаваемый рекомбиназой, такой как loxP-сайт, предпочтительно расположены в нуклеотидной последовательности (b) в соответствующих местах, граничащих с нуклеотидной последовательностью, которую необходимо вырезать. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения два loxP-сайта расположены с каждой стороны последовательности позитивного селективного маркера для того, чтобы обеспечить ее вырезание в нужное время после проявления события гомологичной рекомбинации.
- 19 -
008252
В предпочтительном варианте осуществления способа с использованием описанной выше третьей ДНК-конструкции, вырезание полинуклеотидного фрагмента, ограниченного двумя сайтами, узнаваемыми рекомбиназой, предпочтительно двумя ^хР-сайтами, осуществляют в нужный момент, обусловленный наличием в геноме рекомбинантной клетки-хозяина последовательности, кодирующей Cre-фермент, функционально присоединенный к промоторной последовательности, предпочтительно индуцируемому промотору, более предпочтительно к тканеспецифичной промоторной последовательности и наиболее предпочтительно к промоторной последовательности, которая одновременно является и индуцируемой, и тканеспецифичной, как это описано у Gu и соавт. (1994).
Наличие Cre-фермента в геноме рекомбинантной клетки-хозяина может явиться следствием скрещивания двух трансгенных животных, где первое трансгенное животное несет представляющую интерес созданную CanIon-последовательность, содержащую описанные выше loxP-сайты, а второе трансгенное животное несет Сге-кодирующую последовательность, функционально присоединенную к соответствующей промоторной последовательности, так как это описано у Gu и соавт. (1994).
Пространственно-временной контроль экспрессии Сге-фермента можно также осуществить на основе аденовирусного вектора, который содержит Cre-ген, обеспечивая тем самым заражение клеток или in vivo заражение органов, для доставки Cre-фермента, так как это описано у Anton and Graham (1995) и у Kanegae и соавт. (1995).
Описанные выше ДНК-конструкции можно использовать для введения требуемой нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, предпочтительно CanIon-геномной последовательности или кДНК-последовательности CanIon, но более предпочтительно - для введения измененной копии геномной или кДНК-последовательности CanIon, в заранее определенное местоположение целевого генома, приводящее либо к образованию измененной копии целевого гена (нокаутная гомологичная рекомбинация), либо к замене копии целевого гена другой копией, достаточно гомологичной, чтобы обеспечить прохождение гомологичной рекомбинации (гомологичная рекомбинация с вбиванием). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения описанные выше ДНК-конструкции могут использоваться для встраивания CanIon-геномной последовательности или кДНК-последовательности CanIon, включающей по меньшей мере один двуаллельный маркер настоящего изобретения, предпочтительно по меньшей мере один двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А17.
Ядерные антисмысловые ДНК-конструкции
Другие композиции содержат вектор настоящего изобретения, включающий олигонуклеотидный фрагмент нуклеотидной последовательности SEQ ID No 4, предпочтительно фрагмент, включающий старт-кодон CanIon-гена, в качестве антисмыслового средства, которое подавляет экспрессию соответствующего CanIon-гена.
Предпочтительные способы с использованием антисмыслового полинуклеотида, в соответствии с настоящим изобретением, представлены методиками, описанными у Sczakiel и соавт. (1995) или методиками, описанными в РСТ-заявке № WO 95/24223, раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки во всей их полноте.
Предпочтительно, антисмысловые средства выбраны среди полинуклеотидов (длиной 15-200 п.н.), которые комплементарны 5'-концу мРНК CanIon. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используется сочетание различных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных разным частям требуемого целевого гена.
Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, комплементарны последовательности многих мРНК CanIon, которые содержат либо кодон инициации трансляции ATG, либо сайт сплайсинга. Кроме того, предпочтительные антисмысловые полинуклеоти-ды, в соответствии с настоящим изобретением, комплементарны сайта сплайсинга мРНК CanIon.
Предпочтительно, если антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения обладают 3'-сиг-налом полиаденилирования, который заменен саморасщепляющейся рибозимной последовательностью так, чтобы транскрипты РНК-полимеразы II получались без поли(А) на их 3'-концах, причем эти антисмысловые полинуклеотиды оказываются неспособными выйти из ядра, что описано у Liu и соавт. (1994). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эти CanIon-антисмысло-вые полинуклеотиды включают также, в рибозимной кассете, гистоновую шпилечную структуру, которая стабилизирует расщепляемые транскрипты от 3'-5'-экзонуклеолитической деградации, такая структура описана у Eckner и соавт. (1991).
Олигонуклеотидные зонды и праймеры
Полинуклеотиды, полученные из CanIon-гена, пригодны для выявления присутствия в тестируемом образце, по меньшей мере, копии нуклеотидной последовательности SEQ ID Nos 1-4 и 6, или ее фрагмента, комплемента, или варианта.
Особенно предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 или 20000 нуклеотидов SEQ ID Nos 1-3 или их комплементов. Кроме того, предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или
- 20 -
008252
рекомбинантные полинуклеотиды, в которых указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А17.
Другая цель настоящего изобретения заключается в получении выделенной очисткой, выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID No 4, комплементарные ей последовательности, а также аллельные варианты и их фрагменты. Кроме того, предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенную очисткой, выделенную или рекомбинантную CanIon-кДНК, состоящую из, фактически состоящую из или включающую последовательность SEQ ID No 4. Особенно предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов SEQ ID No 4 или их комплементов. Кроме того, предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов SEQ ID No 4 или их комплементов, где указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А12 и А16.
В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов SEQ ID No 6 или их комплементов. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности SEQ ID No 6 включает двуаллельный маркер А18.
Таким образом, настоящее изобретение относится также к зондам нуклеиновых кислот, отличающимся тем, что они специфически гибридизуются в описанных выше жестких условиях с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из CanIon-нуклеотидных последовательностей SEQ ID No 13 человека, ее вариантов или последовательности, комплементарной ей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения включены выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полинуклеотиды, состоящие или в основном состоящие из непрерывного участка последовательности из 8-50 нуклеотидов какой-либо одной SEQ ID Nos 1-4 или 6, или его комплементов, где указанный участок включает связанный с CanIon двуаллельный маркер в указанной последовательности; где необязательно указанный связанный с CanIon двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18, и ее комплементов, или, необязательно, данные двуаллельные маркеры сцеплены при нарушении равновесия. Где, необязательно, указанный участок составляет в длину 18-35 нуклеотидов, а указанный двуаллельный маркер находится в пределах 4 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида; где необязательно указанный полинуклеотид состоит из указанного непрерывного участка последовательности и указанный непрерывный участок последовательности составляет 25 нук-леотидов в длину, а указанный двуаллельный маркер находится в центре указанного полинуклеотида; где необязательно 3'-конец указанного участка непрерывной последовательности представлен на 3'-конце указанного полинуклеотида; и где необязательно 3'-конец указанного непрерывного участка последовательности расположен на 3'-конце указанного полинуклеотида, а указанный двуаллельный маркер представлен на 3'-конце указанного полинуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные зонды включают, состоят или в основном состоят из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: Р1-Р18 и комплементарных им последовательностей.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полинуклеотиды, включающие, состоящие, в основном состоящие из непрерывного участка последовательности 8-50 нуклеотидов SEQ ID Nos 1-4, или их комплементов, где 3'-конец указанного непрерывного участка последовательности расположен на 3'-конце указанного по-линуклеотида, и где 3'-конец указанного полинуклеотида расположен в пределах 20 нуклеотидов слева от связанного с CanIon двуаллельного маркера в указанной последовательности; где, необязательно, указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, выбран из группы, состоящей из А1-А18, и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; где необязательно 3'-конец указанного полинуклеотида расположен в указанной последовательности 1 нуклеотидом "левее" от указанного двуаллельного маркера, связанного с CanIon; и где, необязательно, указанный полинуклеотид состоит, в основном, из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: D1-D18 и Е1-Е18.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие, состоящие, в основном состоящие, из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: В1-В17 и С1-С17.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя полинуклеоти-ды, используемые в гибридизационном анализе, секвенирующем анализе и в анализе ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания для определения нуклеотидной идентичности двуаллель
- 21 -
008252
ного маркера, связанного с CanIon, в SEQ ID Nos 1-4 и 6 или в их комплементах, а также полинуклеоти-ды, используемые для амплификации нуклеотидных сегментов, включающих двуаллельный маркер, связанный с CanIon, в SEQ ID Nos 1-4 и 6 или в их комплементах; где, необязательно, указанный двуаллель-ный маркер, связанный с CanIon, выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры сцеплены к тому же при нарушении равновесия.
В настоящем изобретении рассматривается использование полинуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, для определения нуклеотидной идентичности двуаллельного маркера, связанного с CanIon, предпочтительно в гибридизационном анализе, секвенирующем анализе, микросеквени-рующем анализе или методом ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания и амплификацией нуклеотидных сегментов, включающих двуаллельный маркер, связанный с CanIon.
Зонд или праймер, в соответствии с настоящим изобретением, обладает около 8-1000 нуклеотидов в длину или задан по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеоти-дами в длину. Более предпочтительно, длина таких зондов и праймеров может колебаться от 8, 10, 15, 20 или 30-100 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 50, более предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов. У коротких зондов и праймеров обычно недостаточно специфичности для целевой последовательности нуклеиновой кислоты и, как правило, нужны пониженные температуры для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Более длинные зонды и праймеры являются дорогостоящими в изготовлении и могут иногда самогибридизоваться с образованием шпилечных структур.
Надлежащую длину для праймеров и зондов под конкретный комплекс аналитических условий может эмпирически определить специалист в данной области техники. Предпочтительный зонд или прай-мер состоит из нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, выбранный из группы нуклеотидных последовательностей Р1-Р18 и их комплементарных последовательностей, В1-В17, С1-С17, D1-D18, Е1-Е18, для которых соответственные местоположения в списке последовательностей представлены в табл. 1, 2 и 3.
Образование стабильных гибридов зависит от температуры плавления (Тт) ДНК. Тт зависит от длины праймера или зонда, ионной силы данного раствора и содержания G+C. Чем выше содержание G+C праймера или зонда, тем выше температура плавления, потому что G:C пары удерживаются тремя Н-связями, тогда как А:Т пары удерживаются только двумя такими связями. GC-содержание в зондах настоящего изобретения, как правило, колеблется между 10 и 75%, предпочтительно между 35 и 60%, и наиболее предпочтительно между 40 и 55%.
Праймеры и зонды можно изготовить любым подходящим способом, включая, например, клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей, а также способом прямого химического синтеза, например, таким как фосфодиэфирный способ Narang и соавт. (1979), фосфодиэфирный способ Brown и соавт. (1979), диэтилфосфоамидитный способ Beaucage и соавт. (1981) и твердофазный способ,
описанный в ЕР 0707592.
Зонды для детекции представляют собой, как правило, последовательности нуклеиновых кислот или незаряженные аналоги нуклеиновых кислот, такие, например, как пептидонуклеиновые кислоты, которые раскрыты в международной патентной заявке WO 92/20702, морфолиновые аналоги, которые описаны в патентах США №№ 5185444; 5034506 и 5142047. Зонд может оказаться "не удлиняемым", поскольку дополнительные dNTP невозможно добавить к данному зонду. Внутри себя аналоги, как правило, не удлиняемы, и зонды нуклеиновых кислот могут оказываться неудлиняемыми из-за модификации 3'-конца данного зонда, так что гидроксильная группа уже не способна участвовать в элонгации. Например, 3'-конец данного зонда может быть функционализирован захватом или детекцией метки, чтобы таким образом истратить или иначе блокировать данную гидроксильную группу. С другой стороны, 3'-гидроксильная группа может попросту отщепиться, заместиться или модифицироваться, патентная заявка США, порядковый № 07/049061, поданная 19 апреля 1993 г., описывает модификации, которые могут использоваться для придания зонду неудлиняемости.
Любой полинуклеотид настоящего изобретения можно пометить при желании путем включения любой метки, известной в данной области техники, которая обнаруживается спектроскопическим, фотохимическим, биохимическим, иммунохимическим или химическим способом. Например, используемые
32 35 3 125
метки включают радиоактивные вещества (в том числе, Р32, S35, Н3, I125), флуоресцентные красители (в том числе, 5-бромдезоксиуридин, флуоресцеин, ацетиламинофтор, дигоксигенин) или биотин. Предпочтительно, полинуклеотиды метят по их 3'- и 5'-концам. Примеры нерадиоактивного мечения фрагментов нуклеиновых кислот описаны во французском патенте № FR-7810975 или у Urdea и соавт. (1988), или у Sanchez-Pescador и соавт. (1988). Кроме того, зонды, в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь структурные характеристики, которые делают возможным усиление сигнала, причем такими структурными характеристиками являются, например, разветвленные ДНК-зонды, как те, что описаны у Urdea и соавт. (1991) или в европейском патенте № ЕР0225807 (Chiron).
Метку можно также использовать для захвата данного праймера, с тем, чтобы обеспечить иммобилизацию на твердом носителе либо данного праймера, либо удлиненного продукта, такого как амплифи-цированная ДНК. Введенная метка присоединяется к праймерам или к зондам и может представлять собой связывающий член, который образует связывающую пару вместе со специфичным связывающим
- 22 -
008252
членом твердофазного реагента (например, биотин и стрептавидин). Поэтому, в зависимости от типа метки, переносимой полинуклеотидом или зондом, ее можно использовать для улавливания или для обнаружения ДНК-мишени. Кроме того, следует иметь в виду, что созданные в данном описании полинук-леотиды, праймеры или зонды могут, сами по себе, служить в качестве захватной метки. Например, в том случае, когда связывающий член твердофазного реагента представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, его можно выбрать так, чтобы он связывал комплементарную часть праймера или зонда с тем, чтобы иммобилизовать данный праймер или зонд на данную твердую фазу. В случае если полинуклеотидный зонд сам служит в качестве связывающего члена, специалисты должны знать, что данный зонд будет содержать последовательность или "хвост", который не комплементарен данной мишени. В том случае, если полинуклеотидный праймер сам служит в качестве захватной метки, по меньшей мере, часть данного праймера будет свободна для гибридизации с нуклеиновой кислотой на твердой фазе. Методы меченья ДНК хорошо известны квалифицированным специалистам.
Зонды настоящего изобретения пригодны для многих целей. Они могут, в частности, использоваться в Саузерн-гибридизации с геномной ДНК. Зонды могут также использоваться для обнаружения продуктов ПЦР-амплификации. При использовании других методик они могут также использоваться для обнаружения несоответствий в CanIon-гене или мРНК. Они могут также использоваться для обнаружения экспрессии CanIon-гена, например, в Нозерн-блоте.
Любой полинуклеотид, праймер или зонд настоящего изобретения можно удобно иммобилизовать на твердый носитель. Твердые носители хорошо известны специалистам в данной области техники и включают стенки лунок реакционной кюветы, пробирки, шарики из полистирола, магнитные шарики, полоски нитроцеллюлозы, мембраны, микрочастицы, такие как латексные частицы, эритроциты барана (или другого животного), duracytes и другие. Твердый носитель не является ключевым и его может выбрать специалист в данной области техники. Таким образом, латексные частицы, микрочастицы, намагниченные и ненамагниченные шарики, мембраны, пластмассовые пробирки, стенки лунок для микротитрования, стеклянное или силиконовое крошево, эритроциты барана (или иных подходящих животных) и duracytes (мозговые оболочки), все, представляют собой подходящие модели. Соответствующие способы иммобилизации нуклеиновых кислот на твердых фазах включают ионное, гидрофобное, ковалентное взаимодействие и т.п. Используемый в данном описании твердый носитель относится к любому нерастворимому материалу, или его можно сделать нерастворимым в последующей реакции. Твердый носитель можно выбрать в соответствии с его способностью притягивать и иммобилизовать захватный реагент. Или же, данная твердая фаза может удерживать дополнительный рецептор, который обладает способностью притягивать и иммобилизовать захватный реагент. Дополнительный рецептор может включать заряженное вещество, которое противоположно заряжено по отношению к собственно захватному реагенту или к заряженному веществу, конъюгированному с данным захватным реагентом. Согласно еще одной альтернативе, рецепторная молекула может представлять собой любой специфический связывающий член, который иммобилизуется на (присоединяется к) твердом носителе, и который обладает способностью иммобилизовать захватный реагент посредством специфичной реакции связывания. Рецеп-торная молекула делает возможным непрямое связывание захватного реагента с материалом твердого носителя перед осуществлением анализа или в течение осуществления данного анализа. Твердая фаза, таким образом, может быть представлена пластмассой, производными пластмассы, намагниченным или ненамагниченным металлом, стеклянной или силиконовой поверхностью пробирки, лункой для микротитрования, полоской, шариком, микрочастицей, крошкой, эритроцитами барана (или иных подходящих животных), duracytes(r) и другими формами, хорошо известными среднему специалисту в данной области техники. Полинуклеотиды настоящего изобретения можно присоединять или иммобилизовать на твердом носителе индивидуально или группами по меньшей мере из 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25 разных по-линуклеотидов настоящего изобретения с единственным твердым носителем. Кроме того, полинуклеоти-ды, отличающиеся от полинуклеотидов настоящего изобретения, можно присоединять к тому же твердому носителю, к которому присоединены один или несколько полинуклеотидов настоящего изобретения.
Следовательно, настоящее изобретение включает также способ для обнаружения присутствующей нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID Nos 1-4 и 6, ее фрагмента или варианта, и комплементарную ей последовательность, в образце, причем указанный способ включает следующие стадии:
a) приведение в контакт зонда нуклеиновой кислоты или совокупности зондов нуклеиновой кислоты, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nos 1-4 и 6, их фрагмента или варианта, и комплементарную ей последовательность, и анализируемого образца; и
b) выявление гибридного комплекса, образованного между зондом и нуклеиновой кислотой данного образца.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается набор для детектирования присутствующей нуклеиновой кислоты, включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей SEQ ID Nos 1-4 и 6, ее фрагмента или варианта, и комплементарную ей последовательность, в образце, причем указанный набор включает:
- 23 -
008252
a) зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nos 1-4 и 6, ее фрагмента или варианта, и комплементарной ей последовательности; и
b) необязательно, реагенты, необходимые для осуществления реакции гибридизации.
В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ детекции и набор отличаются тем, что указанный зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты метят с помощью детектируемой молекулы. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ и набор отличаются тем, что указанный зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты были иммобилизованы на субстрате. В третьем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты включают либо последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей Р1-Р18 и комплементарной им последовательности, В1-В17, С1-С17, D1-D18, Е1-Е18, либо двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.
Олигонуклеотидные наборы
Любой субстрат, включающий множество олигонуклеотидных праймеров или зондов настоящего изобретения, может использоваться либо для детекции или амплификации последовательностей-мишеней CanIon-гена, либо может также использоваться для детекции мутаций в кодирующих и некоди-рующих последовательностях CanIon-гена.
Любой созданный в данном описании полинуклеотид можно присоединить в области перекрывания или в случайные места данного твердого носителя. Альтернативно, полинуклеотиды настоящего изобретения можно присоединить в виде упорядоченного набора, где каждый полинуклеотид присоединяется к определенной области твердого носителя, которая не перекрывается с участком присоединения любого другого полинуклеотида. Предпочтительно, такой упорядоченный набор полинуклеотидов создают "адресным", где отдельные участки регистрируются и могут быть доступны как часть аналитического метода. Адресные полинуклеотидные наборы обычно включают множество различных олигонуклеотидных зондов, которые связаны с поверхностью субстрата в разных известных местах. Знание точного расположения каждого полинуклеотида делает эти "адресные" наборы особенно пригодными для методов гибридизации. Любая технология адресного набора, известная в данной области техники, может использоваться для полинуклеотидов настоящего изобретения. Один из конкретных вариантов осуществления данных полинуклеотидных наборов известен в качестве Genechips(tm), и в основном описан в патенте США №5143854; публикациях РСТ WO 90/15070 и 92/10092. Данные наборы обычно можно получить с использованием методов автоматизированного синтеза или методов светонаправленного синтеза, которые включают сочетание фотолитографических способов и твердофазного олигонуклеотидного синтеза (Fodor и соавт., 1991). Иммобилизация наборов олигонуклеотидов на твердых носителях представляется возможной благодаря развитию технологии, обычно идентифицируемой как "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis" (Крупномасштабный синтез иммобилизованного полимера) (VLSIPS(tm)), в которой, как правило, зонды иммобилизуются в виде набора с высокой плотностью на твердой поверхности чипа. Примеры технологий VLSIPS(tm) представлены в патентах США №№ 5143854; и 5412087, а также в публикациях РСТ WO 90/15070, WO 92/10092 и WO 95/11995, в которых описываются способы создания олигонуклеотидных наборов с помощью таких методов, как методы по светонаправленному синтезу. В разработанных методиках, предназначенных для создания наборов нуклеотидов, иммобилизованных на твердых носителях, дополнительно были разработаны методики представления для приведения в порядок и представления олигонуклеотидных наборов на чипах в попытке извлечь максимальную пользу из паттернов гибридизации и информации о последовательности. Примеры таких методик представления раскрыты в публикациях РСТ WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 и WO 97/31256, раскрытие которых включено путем ссылки во всей их полноте.
В другом варианте осуществления олигонуклеотидных наборов настоящего изобретения матрица олигонуклеотидного зонда может преимущественно использоваться для обнаружения мутаций, встречаемых в CanIon-гене и предпочтительно в его регуляторной области. Для этой конкретной цели специально создают зонды, которые обладают нуклеотидной последовательностью, обеспечивающей их гибридизацию с генами, которые несут известные мутации (в результате делеции, вставки или замены одного или нескольких нуклеотидов). Для известных мутаций это означает, что мутации в CanIon-гене были идентифицированы в соответствии, например, с методом, используемым Huang и соавт. (1996) и Samson и соавт. (1996).
В другом методе, который используется для обнаружения мутаций в CanIon-гене, используют набор ДНК высокой плотности. Каждый олигонуклеотидный зонд, составляющий единичный элемент набора ДНК высокой плотности, создается для сопоставления специфичной субпоследовательности геномной ДНК или кДНК CanIon. Таким образом, набор, состоящий из олигонуклеотидов, комплементарных субпоследовательностям из последовательности гена-мишени, используют для определения идентичности целевой последовательности с последовательностью природного гена, измерения его количества, обна
- 24 -
008252
ружения различий между целевой последовательностью и стандартной последовательностью природного гена из CanIon-гена. Одна такая конструкция, названная 4L-"плиточный" набор (4L tiled array), представляет собой группу из четырех зондов (А, С, G, Т), предпочтительно 15-нуклеотидных олигомеров. В каждой группе из четырех зондов полный комплемент будет гибридизоваться более интенсивно, чем комплементарно несогласованные зонды. Следовательно, целевая нуклеиновая кислота длиной L сканируется по мутациям с помощью "плиточного" набора, содержащего 4L-зонды, причем весь набор зондов содержит все возможные мутации в известной стандартной природной последовательности. Гибридизаци-онные сигналы группы 15-мерного зонда "плиточного" набора нарушаются из-за единственной замены основания в целевой последовательности. Вследствие этого происходит характерная утрата сигнала или " футпринта" для зондов, фланкирующих положение мутации. Данный метод описан Chee и соавт. (1996).
Следовательно, в настоящем изобретении рассматривается набор молекул нуклеиновых кислот, включающих, по меньшей мере, один полинуклеотид, описанный выше в качестве зондов и праймеров. Предпочтительно, в настоящем изобретении рассматривается набор нуклеиновой кислоты, включающей, по меньшей мере, два полинуклеотида, описанных выше в качестве зондов и праймеров.
Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в создании набора последовательностей нуклеиновых кислот, включающих, по меньшей мере, одну из последовательностей, выбранную из группы, состоящей из Р1-Р18, В1-В17, С1-С17, D1-D18, Е1-Е18, комплементарных ей последовательностей, ее фрагментов по меньшей мере из 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 или 40 последовательных нуклеотидов либо, по меньшей мере, одну последовательность, включающую двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18, и его комплементов.
Настоящее изобретение относится также к набору последовательностей нуклеиновых кислот, включающих либо, по меньшей мере, две последовательности, выбранные из группы, состоящей из Р1-Р18, В1-В17, С1-С17, D1-D18, Е1-Е18, комплементарных ей последовательностей, ее фрагмента, по меньшей мере, из 8 последовательных нуклеотидов, либо по меньшей мере две последовательности, включающие двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18, и его комплементов.
CanIon-белки и полипептидные фрагменты
Термин "CanIon-полипептиды" используется в данном описании для охвата всех белков и полипептидов настоящего изобретения. Кроме того, образующей частью настоящего изобретения являются полипептиды, кодируемые полинуклеотидами настоящего изобретения, а также слитые полипептиды, включающие такие полипептиды. В настоящем изобретении содержатся CanIon-белки людей, включая выделенные или выделенные очисткой CanIon-белки, состоящие, состоящие в основном или включающие последовательность SEQ ID No 5.
В настоящем изобретении рассматривается полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID No 1-4 и 6, комплементарной ей последовательностью или ее фрагментом.
В настоящем изобретении содержатся выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полипептиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 или 1700 аминокислот SEQ ID No 5. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения непрерывный участок из аминокислот включает участок с мутацией или функциональной мутацией, включающий деле-цию, добавку, перестановку, укороченные аминокислоты в белковой последовательности CanIon.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, настоящее изобретение содержит выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полипептиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 или 1700 аминокислот SEQ ID No 5, где непрерывный участок включает по меньшей мере 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 из SEQ ID No 5. Предпочтительно, указанный непрерывный участок SEQ ID No 5 включает остаток Аланина в положении 277; Серин в положении 338; Валин в положении 574; Лейцин в положении 678; Серин в положении 680; Треонин в положении 683; Гистидин в положении 691; Серин в положении 692; Серин в положении 695; Аланин в положении 696; Изолейцин в положении 697; Изолейцин в положении 894; Лизин в положении 1480; Аргинин в положении 1481; Глицин в положении 1483; Валин в положении 14 84; Изолейцин в положении 1485; Аспарагин в положении 1630; Серин в положении 1631; Метионин в положении 1632; Треонин в положении 1636; Аланин в положении 1660; Фенилаланин в положении 1667; Треонин в положении 1707; и/или Аланин в положении 1709. Обеспечены также полинуклеотиды, кодирующие любой из этих полипептидов.
Настоящее изобретение включает также в себя выделенные очисткой, выделенные или рекомби-нантные полипептиды, включающие аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% аминокислотной идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID No 5 или с ее фрагментом.
- 25 -
008252
CanIon-белки предпочтительно выделяют из тканевых образцов человека или млекопитающих или экспрессируют из генов человека или млекопитающих. CanIon-полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием стандартных способов экспрессии, известных в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий требуемый полипептид, лигируют в экспрессионный вектор, приемлемый для любого удобного хозяина. Эукариотическая и прокариотическая хозяйская система, та и другая, используются для создания рекомбинантных полипептидов, при этом кратко излагаются некоторые наиболее распространенные системы. Затем полипептид выделяют из лизированных клеток или из культуральной среды и выделяют очисткой до степени, необходимой для его предполагаемого использования. Очистку осуществляют с помощью любого метода, известного в данной области техники, например, дифференциальным экстрагированием, солевым фракционированием, хроматографией, центрифугированием и т.п. См., например, Methods in Enzymology для разнообразных способов по выделению очисткой белков.
Кроме того, короткие белковые фрагменты получают химическим синтезом. Альтернативно, белки настоящего изобретения экстрагируют из клеток или тканей людей или животных, не принадлежащих человеческому роду. Способы выделения очисткой белков известны в данной области техники и включают использование детергентов или хаотропных агентов, которые дезинтегрируют (разобщают) частицы, за которым следует дифференциальное экстрагирование и разделение полипептидов с помощью ионообменной хроматографии, хроматографии по сродству, осаждения в соответствии с плотностью и гель-электрофореза.
Любая кДНК CanIon, включая SEQ ID No 4, может использоваться для экспрессии CanIon-белков и полипептидов. Нуклеиновую кислоту, кодирующую экспрессируемый CanIon-белок или полипептид, функционально присоединяют к промотору в экспрессионном векторе с использованием традиционной техники клонирования. CanIon-вставка в данный экспрессионный вектор может включать полную кодирующую последовательность для CanIon-белка или его части.
Экспрессионный вектор представляет собой любую экспрессионную систему млекопитающего, дрожжей, насекомого или бактерии, известную в данной области техники. Коммерчески доступные векторы и экспрессионные системы можно получить от разных поставщиков, включая Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin) и Invitrogen (San Diego, California). При желании, для усиления экспрессии и обеспечения надлежащей упаковки белка, для конкретного экспрессионного организма, в который интродуцирован экспрессионный вектор, оптимизируют кодоновый фон и спаривание кодонов данной последовательности, в соответствии с разъяснениями Hat-field и соавт., патент США № 5082767, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полную кодирующую последовательность кДНК CanIon, включая полиА-сигнал кДНК, функционально присоединяют к промотору данного экспрессионного вектора. Альтернативно, если нуклеиновая кислота кодирует часть CanIon-белка, в котором отсутствует метионин, служащий в качестве сайта инициации, инициирующий метионин можно встроить рядом с первым кодоном данной нуклеиновой кислоты с использованием традиционных методов. Также, если в данной вставке из кДНК CanIon отсутствует полиА-сигнал, данную последовательность можно добавить в конструкцию, например, путем вырезания полиА-сигнала из pSG5 (Stratagene) с использованием эндонуклеаз рестрикции BglI и SalI и встраивания в экспрессионный вектор pXT1 (Stratagene) млекопитающего. pXT1 содержит LTR и часть gag-гена вируса лейкоза мышей Молони. Положение LTR в данной конструкции делает возможной эффективную стабильную трансфекцию. Данный вектор включает тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса и селективный ген неомицина. Нуклеиновую кислоту, кодирующую CanIon-белок или его часть, получают с помощью ПЦР из бактериального вектора, содержащего CanIon-кДНК SEQ ID No 5 с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных CanIon-кДНК или ее части и содержащих последовательность для рестрициро-ванной эндонуклеазы PstI, встраиваемую в 5'-праймер, и BglII-последовательность, встраиваемую в 5'-конец соответствующего 3'-праймера кДНК, обеспечивая данной последовательности, кодирующей CanIon-белок или его часть, надлежащее расположение относительно полиА-сигнала. Выделенный очисткой фрагмент, полученный в окончательной ПЦР-реакции, расщепляют с помощью PstI, затупляют по концам нуклеазой, расщепляют с помощью BglII, выделяют очисткой и лигируют с ХТ1, содержащем по-лиА-сигнал и расщепляют с помощью BglII.
Данный лигированный продукт можно трансфицировать в мышиные №Н3Т3-клетки с использованием Lipofectin (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) в условиях, вкратце изложенных в описании к данному продукту. Позитивные трансфектанты отбирают после выращивания трансфицирован-ных клеток в 600 ug/мл G418 (Sigma, St. Louis, Missouri).
Приведенные выше протоколы можно также использовать для экспрессии мутантного CanIon-белка, ответственного за обнаруживаемый фенотип, или его части.
Экспрессированный белок можно выделить очисткой с использованием традиционных методов очистки, таких как осаждение сульфатом аммония или хроматографическим разделением по размеру или заряду. Белок, кодируемый встроенной нуклеиновой кислотой, можно также выделить очисткой с ис
- 26 -
008252
пользованием стандартных иммунохроматографических методов. В таких протоколах раствор, такой как клеточный экстракт, содержащий экспрессированный CanIon-белок или его часть, наносят на колонку, содержащую антитела к CanIon-белку или его части, которые присоединяют к хроматографическому матриксу. Экспрессированному белку дают возможность связаться иммунохроматографической колонкой. Затем колонку промывают для удаления неспецифически связавшихся белков. После чего специфически связавшийся экспрессированный белок высвобождают из колонки и извлекают с использованием стандартных методов.
Для подтверждения экспрессии CaIon-белка или его части, белки, экспрессированные из клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, содержащий вставку, кодирующую CanIon-белок или его часть, можно сравнить с белками, экспрессированными из клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор без вставки. Наличие полосы в образцах клеток, содержащих экспрессионный вектор со вставкой, которая отсутствует в образцах из клеток, содержащих экспрессионный вектор без вставки, свидетельствует о том, что CanIon-белок или его часть экспрессируются. Как правило, данная полоса будет обладать подвижностью, ожидаемой для CanIon-белка или его части. Однако данная полоса может обладать подвижностью, отличающейся от ожидаемой из-за модификаций, таких как гликозилирование, убихитини-зиция или ферментативное расщепление.
Антитела, способные специфически распознавать экспрессированный CanIon-белок или его часть, описаны ниже.
Когда образование антител невозможно, нуклеиновые кислоты, кодирующие CanIon-белок или его часть, встраиваются в экспрессионный вектор, созданный для использования в схемах очистки, использующих химерные полипептиды. В таких методиках нуклеиновая кислота, кодирующая CanIon-белок или его часть, встраивается в открытую рамку считывания вместе с геном, кодирующим другую половину данной химеры. Другая половина химеры представляет собой последовательность в-глобина или последовательность, кодирующую полипептид, связывающий никель. Хроматографический матрикс, содержащий антитело к в-глобину или присоединенный к нему никель, используется для выделения очисткой химерного белка. Сайты протеазного расщепления создают генно-инженерным способом между геном в-глобина или никельсвязывающим полипептидом и CanIon-белком или его частью. Таким образом, два полипептида химеры отделяются друг от друга с помощью протеазного расщепления.
Пригодным экспрессионным вектором для образования в-глобиновых химерных белков является pSG5 (Stratagene), который кодирует в-глобин кролика. Интрон II кроличьего гена в-глобин обеспечивает сплайсинг экспрессируемого транскрипта, а сигнал полиаденилирования, встраиваемый в данную конструкцию, повышает уровень экспрессии. Эти методы хорошо известны в данной области молекулярной биологии. Стандартные способы опубликованы в руководствах, как например, Davies и соавт. (1986), но многие способы доступны от Stratagene, Life Technologies, Inc., или Promega. Полипептид можно дополнительно получить из конструкции с использованием in vivo трансляционных систем, таких как In vitro Express(tm) Translation Kit (Stratagene).
Антитела, которые связывают CanIon-полипептиды настоящего изобретения
Любой CanIon-полипептид или целый белок можно использовать для получения антител, способных специфически связываться с экспрессируемым CanIon-белком или его фрагментами, которые описаны.
Антительная композиция настоящего изобретения способна специфически или селективно связываться с вариантом CanIon-белка SEQ ID No 5. Для антительной композиции, которая специфически связывается с первым вариантом CanIon, необходимо продемонстрировать в ELISA, RIA или ином анализе по связыванию антител, по меньшей мере, на 5, 10, 15, 20, 25, 50 или 100% более высокое связывание по сродству для полноразмерного первого варианта CanIon-белка, чем для полноразмерного второго варианта CanIon-белка. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антительная композиция способна специфически связывать CanIon-белок человека.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваются антительные композиции, поликлональные или моноклональные, способные селективно связывать или селективно связываться с эпитопсодержащим полипептидом, включающим непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 или 1000 аминокислот SEQ ID No 5. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности включает, по меньшей мере, 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 SEQ ID No 5.
Любой CanIon-полипептид или целый белок можно использовать для получения антител, способных, как описано, специфически связываться с экспрессируемым CanIon-белком или его фрагментами.
Эпитоп может включать не менее 3 аминокислот для пространственной конформации, которая является уникальной для данного эпитопа. Как правило, эпитоп состоит, по меньшей мере, из 6 таких аминокислот, но чаще, по меньшей мере, из 8-10 таких аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антигенные эпитопы включают ряд аминокислот, которые составляют
- 27 -
008252
любое целое число между 3 и 50. Фрагменты, которые функционируют в качестве эпитопов, можно получить с помощью любого традиционного способа. Эпитопы можно определить в антигеном анализе Jameson-Wolf, например, применяя компьютерную программу PROTEAN с использованием значений параметров по умолчанию (Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI).
В настоящем изобретении рассматривается также выделенное очисткой или выделенное антитело, способное специфически связаться с мутантным CanIon-белком, его фрагментом или вариантом, включающим эпитоп мутантного CanIon-белка. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается антитело, способное связаться с полипептидом, включающим, по меньшей мере, 10 последовательных аминокислот CanIon-белка и включающего, по меньшей мере, одну из аминокислот, которая может кодироваться мутациями, определяющими данный признак.
Животные или млекопитающие, не принадлежащие человеческому роду, природные или трансгенные, которые экспрессируют разные виды CanIon, отличные от CanIon, к которому требуется связывание антитела, а также животные, которые не экспрессируют CanIon (т.е. CanIon-нокаутное животное, которое описано в данном описании), особенно пригодны для получения антител. CanIon-нокаутные животные будут распознавать все или большинство находящихся на поверхности участков CanIon-белка в качестве чужеродных антигенов и, вследствие этого, производить антитела с более широким набором CanIon-эпитопов. Кроме того, меньшие полипептиды, всего лишь с 10-30 аминокислотами, могут быть пригодны для получения специфичного связывания с одним из CanIon-белков. К тому же, гуморальная иммунная система животных, которая продуцируют виды CanIon, имеющие сходство с антигенной последовательностью, будет предпочтительно распознавать различия между нативными CanIon-видами животного и данной антигенной последовательностью, и продуцировать антитела к этим уникальным сайтам в последовательности данного антигена. Такой метод особенно пригоден для получения антител, которые специфически связываются с любым отдельным CanIon-белком.
Препараты антител, полученные в соответствии с любым протоколом, пригодны для количественного иммуноанализа, в котором определяют концентрации несущих антиген веществ в биологических образцах; их также используют, полуколичественно или количественно, для идентификации антигена, присутствующего в биологическом образце. Антитела можно также использовать в терапевтических композициях для уничтожения клеток, экспрессирующих данный белок или для снижения уровня данного белка в данном организме.
Антитела настоящего изобретения можно метить радиоактивной, флуоресцентной или ферментной меткой, известной в данной области техники.
Поэтому, настоящее изобретение относится также к способу детектирования специфически присутствующего в биологическом образце CanIon-полипептида в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный способ включает следующие стадии:
a) приведения в контакт данного биологического образца с поликлональным или моноклональным антителом, которое специфически связывает CanIon-полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или его пептидный фрагмент или вариант; и
b) детектирования образованного комплекса антиген-антитело.
В настоящем изобретении рассматривается также диагностический набор для детектирования в биологическом образце, в соответствии с настоящим изобретением, наличия in vitro CanIon-полипептида, где указанный набор включает:
a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывает CanIon-полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или его пептидный фрагмент или вариант, необязательно меченый;
b) реагент, обеспечивающий детекцию образованных комплексов антиген-антитело, причем указанный реагент необязательно несет метку или способен распознавать самого себя с помощью меченного реагента, в частности, в случае, если указанное выше моноклональное или поликлональное антитело само не является меченым.
Настоящее изобретение относится, таким образом, к антителам и Т-клеточным антигенным рецепторам (TCR), которые специфически связывают полипептиды и, в частности, эпитопы полипептидов настоящего изобретения, включая, но, не ограничиваясь ими, IgG (в том числе IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (в том числе IgA1 и IgA2), IgD, IgE или IgM и IgY. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные антитела, представляющие собой антительные фрагменты настоящего изобретения, связывающие антиген человека, включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab)2 и F(ab')2, Fd, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидной связью Fvs (sdFv) и фрагменты, включающие домен VL или VH. Антитела можно получить у любого животного, в том числе у птиц и млекопитающих. Предпочтительны антитела человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или обезьяны.
Антигенсвязывающие антительные фрагменты, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельную область(и), отдельно или в сочетании с полной или частичной: шарнирной областью, доменами CH1, CH2 и СН3. В настоящее изобретение включены также любые сочетания вариабельной об-ласти(ей) и шарнирной области, доменов CH1, CH2 и СН3. Кроме того, настоящее изобретение включает
- 28 -
008252
химерные, гуманизированные, а также моноклональные и поликлональные антитела человека, которые специфически связывают полипептиды настоящего изобретения. Настоящее изобретение к тому же включает антитела, которые являются антиидиотипическими к антителам настоящего изобретения.
Антитела настоящего изобретения могут быть моноспецифичными, биспецифичными, триспеци-фичными или обладать более высокой мультиспецифичностью. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичны для разных эпитопов полипептида настоящего изобретения или могут быть специфичны для полипептида настоящего изобретения, а также для гетерологичных композиций, таких как гете-рологичный полипептид или вещество твердого носителя. См., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt и соавт. (1991) J. Immunol. 147:60-69; патенты №№ 5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; Kostelny и соавт. (1992) J. Imminol. 148:1547-1553.
Антитела настоящего изобретения могут быть описаны или охарактеризованы в пределах эпито-па(ов) или эпитоп-несущей части(ей) полипептида настоящего изобретения, которые распознаются или специфически связываются с данным антителом. В случае белков настоящего изобретения, секретируе-мых белков, антитела могут специфически связывать полноразмерный белок, кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, зрелый белок (т.е., белок, образованный в результате отщепления сигнального пептида), кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, сигнальный пептид, кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, или любой другой полипептид настоящего изобретения. Поэтому, эпитоп(ы) или эпитоп, несущий часть(и) полипептида, можно точно определить, как описано в данном описании, например, по N-концевому и С-концевому положению, по размеру в контиге аминокислотных остатков или описать иначе (включая список последовательностей). Антитела, которые специфически связывают любой эпитоп или полипептид настоящего изобретения, можно также исключить в качестве индивидуальных видов. Таким образом, настоящее изобретение включает антитела, которые специфически связывают определенные (заданные) полипептиды настоящего изобретения, и позволяют исключить одинаковые.
Антитела настоящего изобретения можно также описать или точно определить в пределах их перекрестной реактивности. В настоящее изобретение включены антитела, которые специфически не связывают любой другой аналог, ортолог или гомолог полипептидов настоящего изобретения. В настоящее изобретение включены также антитела, которые не связывают полипептиды менее чем с 95%, менее чем с 90%, менее чем с 85%, менее чем с 80%, менее чем с 75%, менее чем с 70%, менее чем с 65%, менее чем с 60%, менее чем с 55%, менее чем с 50% идентичностью (что рассчитано с использованием способов, известных в данной области техники и описанных в данном описании) с полипептидом настоящего изобретения. Кроме того, в настоящее изобретение включены антитела, которые связывают лишь полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые гибридизуются с полинуклеотидом настоящего изобретения в жестких гибридизационных условиях (как описано в данном описании). Антитела настоящего изобретения могут быть также описаны или точно определены в терминах их связывания по сродству. Предпочтительное связывание по сродству проявляют антитела с константой диссоциации или Kd меньше 5Х10-6М, 10-6М, 5Х10-7М, 10-7М, 5Х10-8М, 10-8М, 5Х10-9М, 10-9М, 5Х10-10М, 10-10М, 5Х10-11М, 10-11М, 5Х10-12М, 10-12М, 5Х10-13М, 10-13М, 5Х10-14М, 10-14М, 5Х10-15М и 10-15М.
Используемые антитела настоящего изобретения включаются, но не ограничиваются ими, в известные в данной области техники способы по выделению очисткой, обнаружения и мишенирования полипептидов настоящего изобретения, в том числе in vitro и in vivo диагностические и терапевтические способы. Например, в иммуноанализе антитела используют для качественного и количественного измерения уровня полипептидов настоящего изобретения в биологических образцах. См., например, Harlow и соавт., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) (включенный в данное описание путем ссылки во всей его полноте).
Антитела настоящего изобретения могут использоваться отдельно или в сочетании с другими композициями. Данные антитела можно, кроме того, рекомбинантно сливать с гетерологичным полипептидом по N- или С-концу или химически конъюгировать (включая ковалентную и нековалентную конъюгацию) с полипептидами или с другими композициями. Например, антитела настоящего изобретения можно рекомбинантно слить или конъюгировать с молекулами, пригодными в качестве метки для детек-ционных анализов, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства или токсины. См., например, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США № 5314995; и ЕР О 396387.
Антитела настоящего изобретения можно получить любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, полипептид настоящего изобретения или его антигенный фрагмент можно вводить животному для того, чтобы индуцировать образование сыворотки, содержащей поликло-нальные антитела. Термин "моноклональное антитело" не ограничен антителами, получаемыми с помощью гибридомной техники. Термин "антитело" относится к полипептиду или к группе полипептидов, которые включают, по меньшей мере, один связывающий домен, где связывающий домен образуется из упакованных вариабельных доменов антительной молекулы с образованием трехмерного связывающего пространства, причем форма и заряд внутренней поверхности являются комплементарными элементам антигенной детерминанты антигена, что обеспечивает иммунологическое взаимодействие с антигеном.
- 29 -
008252
Термин " моноклональное антитело" относится к антителу, которое получают из одиночного клона, в том числе эукариотического, прокариотического или фагового клона, но не к способу, с помощью которого его получают. Моноклональные антитела можно получить с использованием весьма разнообразных методов, известных в данной области техники, в том числе с использованием гибридомной, рекомбинант-ной и фаговой дисплейной технологии.
Гибридомные методы включают методы, известные в данной области техники (см., например, Harlow и соавт. (1998)); Hammerling и соавт. (1981) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте). Фрагменты Fab и F(ab')2 можно получить, например, из гибридомно-полученных антител в результате протеолитического расщепления, с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для образования F(ab')2-фрагментов).
Альтернативно, антитела настоящего изобретения можно получить путем применения техники ре-комбинантных ДНК или с помощью химического синтеза с использованием способов, известных в данной области техники. Например, антитела настоящего изобретения можно получить с использованием разнообразных способов фагового дисплея, известных в данной области техники. В способах фагового дисплея функциональные антительные домены представлены на поверхности фаговой частицы, которая несет кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Фаг с требуемой связывающей способностью выбирают из набора или из комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши) путем прямого отбора по антигену, как правило, антигену, связанному или захваченному твердой поверхностью или шариком. Используемый в этих способах фаг обычно представляет собой нитчатый фаг, включающий fd и М13 с Fab, Fv или стабилизированные дисульфидной связью Fv-домены антитела, ре-комбинантно слитые с фаговым геном III фага или с белком гена VIII. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для создания антител настоящего изобретения, включают способы, которые описаны у Brinkman и соавт. (1995); Ames и соавт. (1995); Kettleborough и соавт. (1994); Persic и соавт. (1997); Burton и соавт. (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; W095/15982; WO 95/20401; и патенты США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 и 5733743 (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).
Как описано в указанных выше ссылках, после фаговой селекции кодирующие антитело области можно выделить из данного фага и использовать для образования целых антител, в том числе и антител человека, или любого другого требуемого антигенсвязывающего фрагмента и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, дрожжевые и бактериальные. Например, методы для рекомбинантного производства фрагментов Fab, Fab', F(ab)2 и F(ab')2, можно также употребить, используя способы, известные в данной области техники, способы, раскрытые в WO 92/22324; Mullinax и соавт. (1992); а также Sawai и соавт. (1995); а также Better и соавт. (1998) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).
Примеры методик, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fvs и антител, включают методики, описанные в патентах США №№ 4946778 и 5258498; Huston и соавт. (1991); Shu и соавт. (1993); и Skerra и соавт. (1988). Для определенного использования, включая in vivo использование антител у людей и in vitro детекционные анализы, предпочтительным может оказаться использование химерных, гуманизированных или антител человека. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области техники. См. например, Morrison (1985); Oi и соавт. (1986); Gillies, S.D. и соавт. (1989); и патент США № 5807715. Антитела можно гуманизировать с использованием разнообразных методов, включая CDR-трансплантацию (ЕР 0239400; WO 91/09967; патент США № 5530101; и № 5585089), облицовку или перекладку (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Padlan E.A. (1991); Studnicka G.M. и соавт. (1994); Roguska M.A. и соавт. (1994)) и перестановку цепи (патент США № 5565332). Антитела человека можно создать разнообразными способами, известными в данной области техники, включая описанные выше способы фагового дисплея. См. также патенты США №№ 4444887, 4716111, 5545806, и 5814318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735 и WO 91/10741 (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).
В настоящее изобретение дополнительно включены рекомбинантно слитые антитела или химически конъюгированные (включая ковалентную и нековалентную конъюгацию) с полипептидом настоящего изобретения. Данные антитела могут оказаться специфичными для антигенов, отличных от полипептидов настоящего изобретения. Например, антитела можно использовать для мишенирования полипептидов настоящего изобретения в отдельных типах клеток либо in vitro, либо in vivo, путем слияния или конъюгации полипептидов настоящего изобретения с антителами, специфичными к отдельным рецепторам клеточной поверхности. Антитела, слитые или конъюгированные с полипептидами настоящего изобретения, можно также использовать в иммуноанализе in vitro и в способах очистки с использованием способов, известных в данной области техники. См., например, Harbor и соавт. выше и WO 93/21232; ЕР 0439095; Naramura, H. и соавт. (1994); патент США № 5474981; Gillies S.O. и соавт. (1992); Fell H.P. и соавт. (1991) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).
Настоящее изобретение содержит также композиции, включающие полипептиды настоящего изобретения, слитые или конъюгированные с доменами антитела, отличными от вариабельных областей.
- 30 -
008252
Например, полипептиды настоящего изобретения можно соединить путем слияния или конъюгировать с Fc-областью антитела или ее частью. Данная антительная часть, соединенная путем слияния с полипептидом настоящего изобретения, может включать шарнирную область, ОгИ-домен, СН2-домен и СН3-домен или любое сочетание целых доменов или их частей. Полипептиды настоящего изобретения можно соединить путем слияния или конъюгировать с указанными выше частями антитела для повышения in vivo времени полужизни полипептидов или для использования в иммунном анализе с использованием способов, известных в данной области техники. Полипептиды можно также соединить путем слияния или конъюгировать с указанными выше частями антитела с образованием мультимеров. Например, Fc-сегменты, слитые с полипептидами настоящего изобретения, могут образовывать димеры в результате дисульфидного связывания между Fc-сегментами. Большие мультимерные формы можно создать путем слияния полипептидов с участками IgA или IgM. Способы слияния или конъюгации полипептидов настоящего изобретения с участками антител хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США №№ 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5112946; ЕР 0307434, ЕР 0367166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi А. и соавт. (1991); Zheng Х.Х. и соавт. (1995); и Vil H. и соавт. (1992) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые действуют в качестве агони-стов или антагонистов полипептидов настоящего изобретения. Например, настоящее изобретение включает антитела, которые частично или полностью нарушают рецептор/лигандные взаимодействия с полипептидами настоящего изобретения. Включены также рецепторспецифичные антитела и лигандспеци-фичные антитела. Включены также рецепторспецифичные антитела, которые не предотвращают лиганд-ное связывание, но предотвращают рецепторную активацию. Рецепторную активацию (т.е. сигнализацию) можно определить описанными в данном описании методами или другими методами, известными в данной области техники. Включены также рецепторспецифичные антитела, которые предотвращают как лигандное связывание, так и рецепторную активацию. Более того, включены нейтрализующие антитела, которые связывают данный лиганд и предотвращают связывание данного лиганда с данным рецептором, а также антитела, которые связывают данный лиганд и тем самым предотвращают рецепторную активацию, но не предохраняют данный лиганд от связывания данным рецептором. Кроме того, включены антитела, которые активируют данный рецептор. Эти антитела могут действовать в качестве агонистов в отношении либо всех или не всех биологических активностей, порождаемых лиганд-опосредованной рецепторной активацией. Антитела могут быть специализированными в качестве агонистов или антагонистов биологических активностей, включая описанные в данном описании специфические активности. Указанные выше антительные агонисты можно создать с использованием способов, известных в данной области техники. См., например, WO 96/40281; патент США № 5811097; Deng В. и соавт. (1998); Chen Z. и соавт. (1998); Harrop J.A. и соавт. (1998); Zhu, Z. и соавт. (1998); Yoon, D.Y. и соавт. (1998); Prat, M. и соавт. (1998); Pitard, V. и соавт. (1997); Liautard, J. и соавт. (1997); Carlson, N.G. и соавт. (1997); Taryman, R.E. и соавт. (1995); Muller, Y.A. и соавт. (1998); Bartunek, P. и соавт. (1996) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).
Как указано выше, антитела полипептидов настоящего изобретения могут, в свою очередь, утилизироваться с образованием антиидиотипических антител, которые "имитируют" полипептиды настоящего изобретения, с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. См., например, Greenspan and Bona (1989); Nissiniff (1991). Например, антитела, которые связывают и конкурентно ингибируют полипептидную мультимеризацию или связывание полипептида настоящего изобретения с лигандом, могут использоваться для получения антиидиотипов, которые "имитируют" полипептидную мультимеризацию или связывающий домен и, как следствие, связывают и нейтрализуют полипептид или его лиганд. Такие нейтрализующие антиидиотипические антитела можно использовать для связывания полипептида настоящего изобретения или для связывания его лигандов/рецепторов, и таким образом блокировать их биологическую активность.
Двуаллельные маркеры, связанные с CanIon Преимущество двуаллельных маркеров настоящего изобретения
CanIon-связанные двуаллельные маркеры настоящего изобретения обеспечивают ряд существенных преимуществ по сравнению с другими генетическими маркерами, такими как RFLP (Полиморфизм длины фрагментов рестрикции) и VNTR (Вариабельность числа тандемных повторов) маркеры.
Первым поколением маркеров явились RFPL, которые представляют собой вариации, модифицирующие длину рестрикционного фрагмента. Однако способы, используемые для идентификации и типи-рования RFLP, являются достаточно неэкономичными по материалам, усилиям и времени. Вторым поколением генетических маркеров были VNTR, которые можно распределить по категориям в качестве ми-нисателлитов или микросателлитов. Минисателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности ДНК, представленные блоками из 5-50 повторов, которые распределяются по областям хромосом человека в диапазоне длины от 0,1 до 20 т.п.н. Так как они представляют много возможных аллелей, их информативное содержание очень высоко. Минисателлиты оценивают, осуществляя Сау-зерн-блоттирование для идентификации числа тандемных повторов, присутствующих в образце нуклеиновой кислоты из отдельного тестируемого организма. Однако существует лишь 104 потенциальных
- 31 -
008252
VNTR, которые можно типировать Саузерн-блоттингом. Кроме того, создание и анализ RFLP-маркеров и VNTR-маркеров в больших количествах являются дорогостоящим и трудоемким.
Полиморфизм единственного нуклеотида или двуаллельные маркеры можно использовать таким же образом, что и RFLP и VNTR, но он обладает некоторыми преимуществами. SNP густо распределены в геноме человека и представляет наиболее частый тип изменчивости. По имеющимся оценкам в геноме человека рассеяно более 107-сайтов по 3х109 пар оснований. Таким образом, SNP встречается с большей частотой и с большей однородностью, чем RFLP-маркеры и VNTR-маркеры, и это означает, что существует большая вероятность обнаружения такого маркера в непосредственной близости от представляющего интерес генетического локуса. SNP менее вариабельны, чем VNTR-маркеры, и мутационно более стабильны.
Кроме того, различные формы охарактеризованного полиморфизма единственного нуклеотида, такие как двуаллельные маркеры настоящего изобретения, часто легко различимы, в результате чего легче типируются стандартными методами. Двуаллельные маркеры обладают аллелями, отличающимися единственным нуклеотидом, и обладают только двумя общими аллелями, что обеспечивает параллельную детекцию и получение автоматизированной оценки. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения обеспечивают возможность быстрого, высокопроизводительного генотипирования большого числа индивидов.
Двуаллельные маркеры густо распределены в геноме, достаточно информативны и могут анализироваться в большом количестве. Объединенный эффект этих преимуществ делает двуаллельные маркеры чрезвычайно ценными в генетических исследованиях. Двуаллельные маркеры могут использоваться при изучении сцепления в семьях, в способах изучения общих аллелей, в исследованиях сцепления при нарушении равновесия в популяциях, в исследовании ассоциаций в популяциях заболевших и здоровых индивидов или в популяциях с позитивным признаком и в популяциях с негативным признаком. Существенный аспект настоящего изобретения заключается в том, что двуаллельные маркеры позволяют осуществлять ассоциативные исследования по идентификации генов, участвующих в комплексных признаках. В ассоциативных исследованиях анализируют частоту маркерных аллелей в несвязанных (неродственных) популяциях заболевших и здоровых индивидов и, как правило, используют для обнаружения полигенных или единичных признаков. Ассоциативные исследования можно осуществлять в общей популяции и они не ограничиваются исследованиями, выполняемыми на родственных индивидах в пораженных заболеванием семьях (исследования по сцеплению). Двуаллельные маркеры в разных генах можно скринировать параллельно для прямой ассоциации заболевания или ответа на лечение. Данный подход по множественным генам является мощным инструментом в разных генетических исследованиях человека, поскольку он определяет необходимость создания статистического показателя для проверки синергического эффекта множественных генетических факторов на отдельный фенотип, лекарственный ответ, спорадический признак или болезненное состояние со сложной генетической этиологией.
Ген-кандидат настоящего изобретения
Различные подходы можно применить для осуществления ассоциативных исследований: широкое ассоциативное исследование генома, ассоциативные исследования кандидатной области и ассоциативные исследования гена-кандидата. Широкое ассоциативное исследование генома опирается на скрининг равномерно распределенных и покрывающих весь геном генетических маркеров. Изучение гена-кандидата основано на исследовании генетических маркеров, специфически локализованных в генах, потенциально участвующих в биологическом пути, связанным с интересующим признаком. В настоящем изобретении ген-кандидат представлен CanIon. Анализ данного кандидатного гена отчетливо предоставляет упрощенный метод для идентификации генов и генных полиморфизмов, связанных с отдельными конкретными признаками при наличии определенной информации, касающейся биологии данного признака. Однако следует отметить, что все двуаллельные маркеры, раскрытые в настоящей заявке, можно использовать как часть или как часть ассоциированных исследований кандидатной области широких ассоциативных исследований генома, и такое использование специально рассматривается в настоящем изобретении и формуле изобретения.
Двуаллельные маркеры, связанные с CanIon, и связанные с ними полинуклеофиды
В настоящем изобретении рассматриваются также двуаллельные маркеры, связанные с CanIon. Используемый в данном описании термин "двуаллельный маркер, связанный с CanIon", относится к группе двуаллельных маркеров, сцепленных при нарушении равновесия с CanIon-геном. Термин "двуаллельный маркер, связанный с CanIon", включает двуаллельные маркеры, обозначенные А1-А17.
Часть двуаллельных маркеров настоящего изобретения раскрыты в табл. 2. Они также описаны в качестве полиморфизма единственного нуклеотида для признаков, связанных SEQ ID Nos 1-4 и 6. Пары праймеров, обеспечивающих амплификацию нуклеиновой кислоты, содержащей полиморфный нуклео-тид из одного CanIon-двуаллельного маркера, приведены в табл. 1 примера 2.
17 Двуаллельных маркеров, связанных с CanIon, A1-A17, локализованы в геномной последовательности CanIon. Двуаллельные маркеры А12 и А16 локализованы в экзонах CanIon. Двуаллельный маркер А18 фланкирует CanIon-ген.
Настоящее изобретение относится также к выделенной очисткой и/или выделенной нуклеотидной
- 32 -
008252
последовательности, включающей полиморфное основание двуаллельного маркера, связанного с CanIon. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения данный двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18, и их комплементов. Данная последовательность содержит около 8-1000 нуклеотидов в длину и предпочтительно включает, по меньшей мере, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID Nos 1-4 и 6, или ее варианта, или комплементарной ей последовательности. Эти нуклеотидные последовательности включают полиморфное основание либо из аллеля 1, либо из аллеля 2 рассматриваемого двуаллельного маркера. Указанный двуаллельный маркер может находиться, необязательно, в пределах 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидов от центра указанного поли-нуклеотида или в центре указанного полинуклеотида. 3'-Конец указанного непрерывного участка последовательности может присутствовать, необязательно, на 3'-конце указанного полинуклеотида. Двуал-лельный маркер может быть представлен, необязательно, на 3'-конце указанного полинуклеотида. Указанный полинуклеотид может дополнительно включать, необязательно, метку. Указанный полинуклео-тид можно присоединить, необязательно, к твердому носителю. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше полинуклеотиды можно использовать отдельно или в любом сочетании.
Настоящее изобретение относится также к выделенной очисткой и/или выделенной нуклеотидной последовательности, непрерывно включающей около 8-1000 нуклеотидов и/или предпочтительно, по меньшей мере, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID Nos 1-4 и 6, или ее варианта, или комплементарной ей последовательности. 3'-Конец указанного полинуклеотида может быть локализован, необязательно, в пределах по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов "левее" от связанного с CanIon двуаллельного маркера в указанной последовательности. Указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17. 3'-Конец указанного полинуклеотида может быть локализован, необязательно, в пределах по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов "левее" от связанного с CanIon двуаллельного маркера в указанной последовательности. 3'-Конец указанного полинуклеотида может быть локализован, необязательно, на 1 нуклеотид "левее" от связанного с Can-Ion двуаллельного маркера в указанной последовательности. Указанный полинуклеотид может дополнительно включать, необязательно, метку. Указанный полинуклеотид может быть присоединен, необязательно, к твердому носителю. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше полинуклеотиды можно использовать отдельно или в любом сочетании.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательности, включающие полиморфное основание одного из двуаллельных маркеров, перечисленных в табл. 2, выбраны из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, которые обладают непрерывным участком, который состоит из полинуклеотида, который включен в полинуклеотид или который включает полинук-леотид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, изложенных в виде ампликонов, перечисленных в табл. 1, или его вариант, или комплементарную ему последовательность.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается нуклеиновая кислота, кодирующая CanIon-белок, где указанная нуклеиновая кислота включает полиморфное основание двуаллельного маркера, выбранного из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов.
Настоящее изобретение включает также использование любого полинуклеотида для определения идентичности одного или более нуклеотидов в двуаллельном маркере, связанном с CanIon, или любой полинуклеотид для использования в указанном определении. Кроме того, полинуклеотиды настоящего изобретения, используемые для определения идентичности одного или нескольких нуклеотидов в двуал-лельном маркере, связанном с CanIon, включают полинуклеотиды с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже полинуклеотиды, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельных маркеров необязательно сцепленных к тому же при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или двуаллельных маркеров, необязательно сцепленных к тому же при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельных маркеров, необязательно сцепленных к тому же при нарушении равновесия. Указанный полинуклеотид может включать, необязательно, последовательность, раскрытую в настоящем описании. Указанный по-линуклеотид может состоять, необязательно, или в основном состоять из любого полинуклеотида, описанного в настоящем описании. Указанное определение можно осуществить, необязательно, в гибриди-зационном анализе, секвенирующем анализе, микросеквенирующем анализе или в анализе методом ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания. Указанный полинуклеотид можно присоединить, необязательно, к твердому носителю, матрице или адресной матрице. Указанный полинуклеотид, необязательно, может быть меченным. Предпочтительный полинуклеотид можно использовать в гибри-дизационном анализе для установления идентичности определенного нуклеотида в связанном с CanIon
- 33 -
008252
двуаллельном маркере. Другой предпочтительный полинуклеотид можно использовать в секвенирую-щем или микросеквенирующем анализе для определения идентичности нуклеотида в связанном с CanIon двуаллельном маркере. Третий предпочтительный полинуклеотид можно использовать в анализе методом ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания для определения идентичности нук-леотида в связанном с CanIon двуаллельном маркере. Четвертый предпочтительный полинуклеотид можно использовать для амплификации полинуклеотидного сегмента, включающего связанный с CanIon двуаллельный маркер. Любой из описанных выше полинуклеотидов можно присоединить, необязательно, к твердому носителю, матрице или к адресной матрице. Указанный полинуклеотид может быть, но необязательно, меченным.
Настоящее изобретение дополнительно включает в себя использование любого полинуклеотида для использования для амплификации нуклеотидного сегмента, включающего связанный с CanIon двуал-лельный маркер. Кроме того, полинуклеотиды настоящего изобретения, используемые для амплификации нуклеотидного сегмента, включающего связанный с CanIon двуаллельный маркер, включают в себя полинуклеотиды с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже полинуклеотиды, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельных маркеров необязательно, к тому же, находящихся в состоянии сцепления при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или указанные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; необязательно указанный двуаллельный маркер, связанный с Can-Ion, выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; указанный полинуклеотид может включать необязательно последовательность, раскрытую в настоящем описании; указанный полинуклеотид может необязательно состоять или в основном состоять из полинуклеотида, описанного в настоящем описании; указанная амплификация необязательно может осуществляться с помощью ПЦР или ЛЦР. Указанный полинуклеотид необязательно может присоединяться к твердому носителю, матрице или адресной матрице. Указанный полинуклеотид необязательно может быть меченным.
Праймеры для амплификации или реакции секвенирования полинуклеотида, включающего двуал-лельный маркер настоящего изобретения, может быть создан из раскрытых последовательностей с помощью любого способа, известного в данной области техники. Предпочтительный набор праймеров приспособлен так, что 3'-конец непрерывного участка последовательности, идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID Nos 1-4 и 6, или из последовательности, комплементарной им, или из ее варианта, присутствует на 3'-конце данного праймера. Такая конфигурация позволяет 3'-концу данного праймера гибридизоваться с выбранной последовательностью нуклеиновой кислоты и резко увеличивать эффективность данного праймера в амплификации или в реакциях секвенирования. Аллельспецифичные праймеры можно создать так, что полиморфное основание двуаллельного маркера находится на 3'-конце непрерывного участка последовательности, а непрерывный участок последовательности находится на 3'-конце данного праймера. Такие аллельспецифичные праймеры стремятся избирательно начать процесс амплификации или реакцию секвенирования, если они используются с образцом нуклеиновой кислоты, который содержит один из двух аллелей, представленный в двуаллельном маркере. 3'-Конец праймера настоящего изобретения может быть локализован в пределах или, по меньшей мере, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидами "левее" от связанного с CanIon двуаллельного маркера в указанной последовательности или в любом другом месте, которое соответствует их предполагаемому использованию в секвенировании, амплификации или расположению новых последовательностей или маркеров. Поэтому другой набор предпочтительных амплификационных праймеров включает выделенный полинуклеотид, в основном состоящий из непрерывного участка последовательности в 8-50 нуклеотидов в последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID Nos 1-4 и 6, или комплементарной ей последовательности, или ее варианта, где 3'-конец указанного непрерывного участка последовательности локализован по 3'-концу указанного полинуклеотида, и где 3'-конец указанного полинуклеотида локализован "левее" связанного с CanIon двуаллельного маркера в указанной последовательности. Предпочтительно, эти амплификационные праймеры включают последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей В1-В17 и С1-С17. Праймеры с 3'-концами, локализованными на 1 нуклеотид "левее" от двуаллельного маркера CanIon, особенно полезны в микросеквенирующем анализе.
Предпочтительные микросеквенирующие праймеры описаны в табл. 4. Указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуал-лельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; указанный двуаллель-ный маркер, связанный с CanIon, выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или дву-аллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; указанный двуал-лельный маркер, связанный с CanIon, выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия. Микросек-венирующие праймеры выбраны, но необязательно, из группы нуклеотидных последовательностей D1-
- 34 -
008252
D18 и Е1-Е18.
Зонды настоящего изобретения можно создать из раскрытых последовательностей любым способом, известным в данной области техники, в частности, с помощью способов, которые обеспечивают тестирование при наличии раскрытого в данном описании маркера. Предпочтительный набор зондов можно создать для использования в гибридизационном анализе настоящего изобретения любым способом, известным в данной области техники, так что они избирательно связываются с одним аллелем дву-аллельного маркера, но не с другим, в соответствии с любой конкретной совокупностью условий анализа. Предпочтительные гибридизационные зонды включают полиморфное основание из аллеля 1 или ал-леля 2 рассматриваемого двуаллельного маркера. Указанный двуаллельный маркер может находиться, необязательно, в пределах 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотида(ов) от центра гибридизационного зонда или в центре указанного зонда. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные зонды выбирают из группы, содержащей каждую из последовательностей Р1-Р18 и каждую из комплементарных им последовательностей.
Следует отметить, что полинуклеотиды настоящего изобретения не ограничиваются имеющими точные фланкирующие последовательности, окружающие полиморфные основания, которые перечислены в Списке Последовательностей. Следует иметь ввиду, что фланкирующие последовательности, окружающие двуаллельные маркеры, могут быть удлинены или укорочены до любого размера, сопоставимого с их предполагаемым использованием, и в настоящем изобретении, в частности, такие последовательности рассматриваются. Для фланкирующих областей вне непрерывного участка последовательности не требуется быть гомологичными нативным фланкирующим последовательностям, которые действительно встречаются у людей. Специально рассматривается добавление любой нуклеотидной последовательности, которая сопоставима с нуклеотидами, предназначенными для использования.
Праймеры и зонды можно пометить или иммобилизовать на твердом носителе, как описано в "Оли-гонуклеотидных зондах и праймерах".
Полинуклеотиды настоящего изобретения, которые присоединяют к твердому носителю, включают в себя полинуклеотиды с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже полинуклеотиды, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанные полинуклео-тиды могут быть определены, необязательно, как индивидуально присоединенные или в группах, по меньшей мере, из 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25 отдельных полинуклеотидов настоящего изобретения, к единственному твердому носителю. Полинуклеотиды, отличающиеся от полинуклеотидов настоящего изобретения, необязательно могут присоединяться к одному и тому же твердому носителю в качестве полинуклеотидов настоящего изобретения. Если к твердому носителю присоединяется множество поли-нуклеотидов, они могут присоединяться необязательно случайным образом или в виде упорядоченного набора. Указанный упорядоченный набор может быть необязательно адресным.
Настоящее изобретение включает в себя также диагностические наборы, включающие один или более полинуклеотидов настоящего изобретения вместе с частью или со всеми необходимыми реагентами и инструкциями для генотипирования обследуемого индивида для определения идентичности нуклеоти-да в связанном с CanIon двуаллельным маркере. Полинуклеотиды набора могут необязательно присоединяться к твердому носителю или являться частью набора или адресным набором полинуклеотидов. Данный набор можно создать для определения идентичности нуклеотида в позиции маркера любым способом, известным в данной области техники, включающим, но не ограничивающимся указанным, способ аналитического секвенирования, способ аналитического микросеквенирования, способ аналитической гибридизации или способ ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания.
Способы идентификации двуаллельных маркеров de novo
Для скринирования геномного фрагмента на полиморфизм единственного нуклеотида можно использовать различные способы, такие как дифференциальная гибридизация с олигонуклеотидными зондами, обнаружение изменений в подвижности, измеряемой с помощью гель-электрофореза, или прямым секвенированием амплифицированной нуклеиновой кислоты. Предпочтительный способ идентификации двуаллельных маркеров включает сравнительное секвенирование фрагментов геномной ДНК у соответствующего числа не связанных родством индивидов.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения образцы ДНК от не связанных родством индивидов объединяют вместе, после чего представляющую интерес геномную ДНК амплифицируют и секвенируют. Затем, полученные таким образом нуклеотидные последовательности анализируют, чтобы идентифицировать достоверный полиморфизм. Одно из основных преимуществ данного способа заключается в том, что объединение образцов ДНК в значительной степени снижает количество реакций амплификации и реакций секвенирования ДНК, которые следует осуществить. Кроме того, данный способ достаточно чувствителен, так что полученный таким образом двуаллельный маркер обычно демонстрирует достаточную частоту своего менее распространенного аллеля, который полезен для проведения ассоциативных исследований.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения образцы ДНК не объединяют и поэтому их амплифицируют и секвенируют индивидуально. Данный способ, как правило, предпочтителен, если двуаллельные маркеры нуждаются в идентификации, чтобы осуществить ассоциативные исследования в
- 35 -
008252
рамках кандидатных генов. Предпочтительно, в случае двуаллельных маркеров можно скринировать высокозначимые генные области, такие как промоторные области или экзонные области. Двуаллельный маркер, полученный с использованием данного способа, может проявить меньшую информативность для проведения ассоциативных исследований, например, если частота его наименее частого аллеля составляет менее чем около 10%. Вместе с тем, такой двуаллельный маркер будет достаточно информативным для проведения ассоциативных исследований и, кроме того, ценным из-за того, что включение менее информативных двуаллельных маркеров в исследования настоящего изобретения по генетическому анализу может обеспечить в некоторых случаях прямую идентификацию каузальных (определяющих данный признак) мутаций, которые могут, в зависимости от их пенетрантности, оказаться редкими мутациями.
Ниже следует описание различных параметров предпочтительного способа, используемого заявителями для идентификации двуаллельных маркеров настоящего изобретения.
Образцы геномной ДНК
Образцы геномной ДНК, из которых создают двуаллельные маркеры настоящего изобретения, предпочтительно получают от не связанных родством индивидов, соответствующих гетерогенной популяции с известным этническим фоном. Число индивидов, от которых получают образцы ДНК, может существенно варьировать, предпочтительно от около 10 до около 1000, предпочтительно от около 50 до около 200 индивидуумов. Как правило, предпочтительно собирать образцы ДНК, по меньшей мере, от около 100 индивидуумов, для того, чтобы обладать достаточно полиморфным разнообразием в данной популяции, чтобы идентифицировать столько маркеров, сколько возможно, и чтобы получить статистически значимые результаты.
Что касается источника геномной ДНК, которую подвергают анализу, то анализируемым образцом может быть любой образец без какого-либо особого ограничения. Такие анализируемые образцы включают биологические образцы, которые можно проанализировать описанными в данном описании способами настоящего изобретения, и включают жидкости организма человека и животного, такие как цельная кровь, сыворотка, плазма, спинно-мозговая жидкость, моча, лимфатическая жидкость и различные внешние выделения при дыхании, выделения кишечного и мочеполого трактов, слезы, слюну, молоко, лейкоциты, миеломы и тому подобное; биологические жидкости, такие как супернатанты клеточных культур; фиксированные тканевые образцы, включая злокачественную и незлокачественную ткань и ткани лимфатических узлов; пункции костного мозга и образцы фиксированных клеток. Предпочтительным источником геномной ДНК, используемой в настоящем изобретении, является периферическая венозная кровь каждого донора. Методы получения геномной ДНК из биологических образцов хорошо известны квалифицированным специалистам. Подробности предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения приведены в примере 1. Специалист в данной области техники может выбрать для амплификации объединенные или необъединенные ДНК-образцы.
Амплификация ДНК
Идентификации двуаллельных маркеров в образце геномной ДНК может способствовать использование способов амплификации ДНК. Для стадии амплификации образцы ДНК можно объединить или не объединять. Методы амплификации ДНК хорошо известны специалистам в данной области техники.
Методы амплификации, используемые в контексте настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, лигазную цепную реакцию (LCR), описанную в ЕР-А-320308, WO 9320227 и ЕР-А-439182, полимеразную цепную реакцию (PCR, RT-PCR) и такие методы, как амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), описанная у Guatelli J.С. и соавт. (1990) и у Compton J. (1991), Q-бета амплификация, которая описана в европейской патентной заявке №4544610, амплификация с замещением цепи, как описано у Walker и соавт. (1996) и ЕР А 684315, и опосредованная мишенью амплификация, как описано в публикации РСТ WO 9322461.
LCR и Gap LCR являются экспоненциальными амплификационными методами, обе зависят от ДНК-лигазы, которая соединяет смежные праймеры, отжигаемые к молекуле ДНК. В лигазной цепной реакции (LCR) используют пару зондов, которые включают два первичных [основных] (первый и второй) и два вторичных [вспомогательных] (третий и четвертый) зонда, которые все используются в молярном избытке к мишени. Первый зонд гибридизуется с первым сегментом данной цепи-мишени, а второй зонд гибридизуется со вторым сегментом данной цепи-мишени, причем первый и второй сегменты являются смежными, так что первичные зонды примыкают друг к другу в 5'фосфат-3'-гидроксильной взаимосвязи, и так что лигаза может ковалентно сочетать или лигировать два зонда в соединенный путем слияния продукт. Кроме того, третий (вторичный) зонд может гибридизоваться с частью первого зонда, а четвертый (вторичный) зонд может гибридизоваться с частью второго зонда путем аналогичного примыкания. Конечно, если данная мишень исходно состоит из двух цепей, то в первом случае вторичные зонды также будут гибридизоваться с комплементом-мишенью. После того, как лигированная цепь первичных зондов отделена от цепи-мишени, она будет гибридизоваться с третьим и четвертым зондом, которые могут быть лигированы с образованием комплементарного, вторичного лигированного продукта. Важно осознавать, что данные лигированные продукты функционально эквивалентны данной мишени или ее комплементу. В результате повторения циклов гибридизации и лигирования достигается амплификация последовательности-мишени. Описан также способ мультиплексной LCR (WO 9320227). Gap
- 36 -
008252
LCR (GLCR) представляет собой вариант LCR, в котором зонды не соседствуют, а разделены 2-3 основаниями.
Что касается амплификации мРНК, то в рамках настоящего изобретения мРНК обратно транскрибируют в кДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (RT-PCR); или с использованием в обоих стадиях единственного фермента, как описано в патенте США №5322770, или с использованием Асимметричной Gap LCR (RT-AGLCR), как описано у Marshall и соавт. (1994). AGLCR представляет собой модификацию GLCR, которая делает возможной амплификацию РНК.
Техника ПЦР является предпочтительной техникой амплификации, используемой в настоящем изобретении. Разнообразные методы ПЦР хорошо известны специалистам в данной области техники. Обзор техники ПЦР см. у White (1997) и в публикации, озаглавленной "PCR Methods and Applications" (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). В каждой из этих методик ПЦР-праймеры для каждой из сторон амплифицируемой последовательности нуклеиновой кислоты добавляются к соответствующим образом приготовленному образцу нуклеиновой кислоты вместе с dNTP и термостабильной полимеразой, такой как Taq-полимераза, Pfu-полимераза или Vent-полимераза. Нуклеиновую кислоту данного образца денатурируют и ПЦР-праймеры специфически гибридизуются с комплементарными нуклеотидными последовательностями в данном образце. Гибридизующиеся праймеры удлиняются. Поэтому инициируется очередной цикл денатурации, гибридизации и удлинения. Такие циклы повторяются много раз с образованием амплифицируемого фрагмента, содержащего нуклеотидную последовательность между праймер-ными сайтами. ПЦР дополнительно была описана в нескольких патентах, в том числе в патентах США №№4683195; 4683202 и 4965188, раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки во всей их полноте.
Техника ПЦР представляет собой предпочтительную технику амплификации, используемую для идентификации новых двуаллельных маркеров. Типичный пример реакции ПЦР, подходящей для целей настоящего изобретения, представлен в примере 2.
Одним из аспектов настоящего изобретения является способ амплификации CanIon-гена человека, в частности, фрагмента геномной последовательности SEQ ID No 1-3 или кДНК-последовательности SEQ ID No 4, ее фрагмента или ее вариант в анализируемом образце, предпочтительно с использованием ПЦР. Данный способ включает следующие стадии:
a) контактирования анализируемого образца с реагентами реакции амплификации, включающими пару праймеров амплификации, как описано выше, и локализованных на любой стороне амплифицируе-мого полинуклеотидного участка, и
b) необязательного детектирования продуктов амплификации.
В настоящем изобретении рассматривается также набор для амплификации последовательности CanIon-гена, в частности участка геномной последовательности SEQ ID No 1-3 или кДНК-последователь-ности SEQ ID No 4 или ее варианта в анализируемом образце, где указанный набор включает:
a) пару олигонуклеотидных праймеров, локализованных на любом участке амплифицируемого района CanIon;
b) необязательно реагенты, необходимые для выполнения реакции амплификации.
В одном из вариантов осуществления указанного выше способа амплификации и набора реагентов к нему продукт амплификации детектируют путем гибридизации с меченым зондом, обладающим последовательностью, которая комплементарна амплифицированному участку. В другом варианте осуществления указанного выше способа амплификации и набора реагентов к нему праймеры включают последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей В1-В17, С1-С17, D1-D18, и Е1-Е18.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения двуаллельные маркеры идентифицируют с использованием информации о геномной последовательности, которая создана заявителями. Фрагменты секвенированной геномной ДНК используют для создания праймеров для амплификации (500 п.н.)-фрагментов. (500 п.н.)-фрагменты амплифицируют из геномной ДНК и сканируют на наличие двуаллель-ных маркеров. Праймеры можно создать с использованием программного обеспечения OSP (Hillier L. and Green P., 1991). Все праймеры могут находиться "левее" специфичных оснований-мишеней, общий оли-гонуклеотидный хвост которых служит в качестве секвенирующего праймера. Специалистам в данной области техники хорошо известно удлинение праймеров, которое можно использовать для этих целей.
Предпочтительные праймеры, пригодные для амплификации геномных последовательностей, кодирующих CanIon-ген, фокусируются на промоторах, экзонах и сайтах сплайсинга генов. Двуаллельный маркер обнаруживает более высокую вероятность возможного появления каузальной мутации, если он локализован в этих функциональных участках данного гена. Предпочтительные праймеры амплификации настоящего изобретения включают нуклеотидные последовательности В1-В17 и С1-С17, дополнительно детализированные в примере 2, табл. 1.
Секвенирование амплифицированной геномной ДНК и идентификация полиморфизма единственного нуклеотида Продукты амплификации, полученные как описано выше, затем секвенируют с использованием любого способа, известного и доступного квалифицированным специалистам. Способы секвенирования
- 37 -
008252
ДНК с использованием дидезоксиопосредованного метода (метод Сэнгера) или метода Максам-Гилберта, широко известны специалистам в данной области техники. Такие методы раскрыты, например, у Sambrook и соавт. (1989). Альтернативные способы включают гибридизацию с набором зондов ДНК высокой плотности, как описано у Chee и соавт. (1996).
Предпочтительно, амплифицированную ДНК подвергают автоматизированным дидезокситермини-рующим секвенирующим реакциям с использованием протокола циклического секвенирования с прай-мером, меченым красителем. Продукты реакций секвенирования разделяют на секвенирующих гелях и полученные последовательности определяют с использованием анализа визуализации геля. Поиск полиморфизма основан на наличии накладывающихся пиков в электрофоретическом паттерне, полученном для разных оснований, встреченных в одной и той же позиции. Поскольку каждый дидезокситерминатор помечен отличающейся флуоресцентной молекулой, то два пика, соответствуя двуаллельному сайту, представлены разным цветом, соответствуя двум отличающимся нуклеотидам по одной и той же позиции в данной последовательности. Однако присутствие двух пиков может оказаться артефактом, обусловленным фоновым шумом. Чтобы исключить такой артефакт, секвенируют две цепи ДНК и сравнивают их по двум полученным пикам. Последовательность квалифицируют как полиморфную в том случае, если полиморфизм обнаруживается на обоих цепях.
Указанная выше методика позволяет идентифицировать те продукты амплификации, которые содержат двуаллельные маркеры. Граница выявления частоты двуаллельного полиморфизма, обнаруженного путем секвенирования пулов из 100 индивидов, составляет приблизительно 0,1 для минорного алле-ля, что подтверждается пулами секвенирования для известных аллельных частот. Однако более 90% дву-аллельного полиморфизма, обнаруженного методом объединения, характеризуется частотой минорного аллеля, превышающей значение 0,25. Поэтому, двуаллельные маркеры, выбранные с помощью данного метода, обладают частотой, по меньшей мере, 0,1 для минорного аллеля и менее 0,9 для основного алле-ля. Предпочтительно, если частота составляет, по крайней мере, 0,2 для минорного аллеля и менее 0,8 для основного аллеля, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,3 для минорного аллеля и менее 0,7 для основного аллеля, таким образом уровень гетерозиготности превышает 0,18, предпочтительно выше 0,32, более предпочтительно выше 0,42.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения двуаллельные маркеры детектируется путем секвенирования индивидуальных образцов ДНК, где частота минорного аллеля, такого как двуал-лельный маркер, может составлять менее 0,1.
Проверка достоверности двуаллельных маркеров настоящего изобретения
Полиморфизм оценивают по его пригодности в качестве генетических маркеров путем подтверждения того, что оба аллеля присутствуют в популяции. Проверка достоверности двуаллельных маркеров осуществляется путем генотипирования группы индивидов способом настоящего изобретения и демонстрации того, что оба аллеля присутствуют. Микросеквенирование является предпочтительным методом генотипирования аллелей. Проверка достоверности с помощью операции генотипирования осуществляют на индивидуальных образцах, полученных от каждого индивида данной группы или путем генотипи-рования объединенной выборки, полученной от более чем одного индивида. Данная группа может равняться одному индивиду, если этот индивид является гетерозиготой по аллелю, о котором идет речь. Предпочтительно группа содержит по меньшей мере три индивида, более предпочтительно данная группа содержит пять или шесть индивидов, так что единственный тест на достоверность, вполне вероятно, приведет к подтверждению существования большинства тестируемых двуаллельных маркеров. Следует, однако, иметь ввиду, что при осуществлении теста на достоверность в небольшой группе можно столкнуться с ложным отрицательным результатом, если в качестве результата ошибки выборки ни один из проверяемых индивидов не несет один из двух данных аллелей. Таким образом, метод проверки достоверности менее пригоден для демонстрации того, что отдельный исходный результат представляет собой артефакт, а не демонстрации того, что в конкретной позиции последовательности существует подлинный двуаллельный маркер. Методы изучения генотипирования, гаплотипирования, ассоциации и взаимодействия настоящего изобретения можно необязательно осуществлять исключительно в отношении достоверности двуаллельных маркеров.
Оценка частоты двуаллельных маркеров настоящего изобретения
Проверенные на достоверность двуаллельные маркеры далее оценивают на их пригодность в качестве генетических маркеров определения частоты менее распространенного аллеля в сайте двуаллельно-го маркера. Чем больше частота менее распространенного аллеля, тем выше пригодность двуаллельного маркера для исследований по ассоциации и взаимодействию. Определение наименее распространенного аллеля осуществляется путем генотипирования группы индивидов способом настоящего изобретения и демонстрацией присутствия обоих аллелей. Это определение частоты с помощью операции генотипиро-вания осуществляют на индивидуальных образцах, полученных от каждого индивида данной группы или путем генотипирования объединенной выборки, полученной от более чем одного индивида. Данная группа должна быть достаточно большой, чтобы представлять данную популяцию как целое. Предпочтительно данная группа содержит, по меньшей мере, 20 индивидов, более предпочтительно данная группа содержит, по меньшей мере, 50 индивидов, более предпочтительно данная группа содержит, по меньшей
- 38 -
008252
мере, 100 индивидов. Разумеется, большая группа увеличит точность определения частоты, вследствие снижения ошибки выборки. Двуаллельный маркер, у которого частота менее распространенного аллеля составляет 30% или больше, называют "высококачественным двуаллельный маркером". Методы изучения генотипирования, гаплотипирования, ассоциации и взаимодействия настоящего изобретения можно необязательно осуществлять лишь с двуаллельными маркерами высокого качества.
Способы индивидуального генотипирования по двуаллельным маркерам
Разработаны способы определения генотипа биологического образца по одному или нескольким двуаллельным маркерам настоящего изобретения, которые все могут осуществляться in vitro. Такие способы генотипирования включают определение идентичности нуклеотида в сайте CanIon-двуаллельного маркера любым способом, известным в данной области техники. Такие способы находят применение при генотипировании больных и здоровых популяций в ассоциативных исследованиях, а также при геноти-пировании индивидов в контексте выявления аллелей двуаллельных маркеров, которые, как установлено, ассоциированы с данным признаком, и в этом случае обе копии двуаллельного маркера, представленные в геноме индивида, определяются так, что индивид можно классифицировать как гомозиготу или гетеро-зиготу по отдельному аллелю.
Данные способы генотипирования осуществляют на образцах нуклеиновых кислот, полученных от отдельного индивида или на объединенных образцах ДНК.
Генотипирование можно осуществлять с использованием аналогичных способов, которые описаны выше для идентификации двуаллельных маркеров, или с использованием других способов генотипиро-вания, таких как описано ниже. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения сравнение последовательностей амплифицированных геномных фрагментов от разных индивидов используют для идентификации новых двуаллельных маркеров, а микросеквенирование используется при генотипировании известных двуаллельных маркеров для применения в диагностическом и ассоциативном исследовании.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя способы генотипиро-вания, включающие определение идентичности нуклеотида в CanIon-связанном двуаллельном маркере или в его дополнении в биологическом образце; где указанный CanIon-связанный двуаллельный маркер необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или необязательно двуал-лельные маркеры при этом неравновесно сцеплены; где указанный CanIon-связанный двуаллельный маркер необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или необязательно дву-аллельные маркеры при этом неравновесно сцеплены; где указанный CanIon-связанный двуаллельный маркер необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры при этом неравновесно сцеплены; где указанный биологический образец необязательно получен от отдельного индивида; где идентичность нуклеотидов в указанном двуаллельном маркере необязательно определяют по обоим копиям указанного двуаллельного маркера, представленного в указанном геноме индивида; где указанный биологический образец необязательно получен от многих индивидов. Способы генотипирования настоящего изобретения необязательно включают в себя способы с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанный способ необязательно осуществляют in vitro; кроме того, необязательно включение амплификации части указанной последовательности, включающей двуаллельный маркер, перед указанной стадией определения. Где указанную амплификацию необязательно осуществляют с помощью ПЦР, ЛЦР или репликацией рекомбинантного вектора, включающего ориджин репликации и указанный фрагмент, в клетке-хозяине; где указанное определение необязательно осуществляют с помощью гибридизационного анализа, секвенирующего анализа, микросеквенирующего анализа или метода ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания.
Происхождение нуклеиновых кислот для генотипирования
Любую нуклеиновую кислоту, выделенную очисткой или не выделенную очисткой, можно использовать в качестве исходной нуклеиновой кислоты, если содержит или предположительно содержит требуемую специфичную последовательность нуклеиновой кислоты. ДНК или РНК можно экстрагировать из клеток, тканей, жидкостей организма и тому подобное. Хотя нуклеиновые кислоты, используемые в способах генотипирования настоящего изобретения, можно получить от любого млекопитающего, под обследуемыми субъектами и индивидами, у которых взяты образцы нуклеиновой кислоты, подразумевают человека.
Амплификация фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры
Обеспечены способы и полинуклеотиды для амплификации сегмента нуклеотидов, включающие один или несколько двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что амплификация фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры, может осуществляться разными способами и для разных целей и не ограничивается генотипированием. Тем не менее, многие способы геноти-пирования, хотя и не все, требуют предварительной амплификации участка ДНК, несущего интересующий двуаллельный маркер. Такие способы специфически увеличивают концентрацию или общее количество последовательностей, которые включают двуаллельный маркер или включают такой участок, и последовательности, локализованные вблизи или на расстоянии от него. Диагностический анализ может
- 39 -
008252
быть также основан на амплификации сегментов ДНК, несущих двуаллельный маркер настоящего изобретения. Амплификацию ДНК можно осуществить любым способом, известным в данной области техники. Методы амплификации описаны выше в разделе, озаглавленном "Амплификация ДНК".
Некоторые из таких методов амплификации особенно подходят для обнаружения полиморфизма единственного нуклеотида и делают возможной одновременную амплификацию последовательности-мишени и идентификацию полиморфного нуклеотида, как это описано ниже.
Идентификация описанных выше двуаллельных маркеров позволяет создать соответствующие оли-гонуклеотиды, которые можно использовать в качестве праймеров для амплификации фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры настоящего изобретения. Амплификацию можно осуществить с использованием праймеров, первоначально используемых для открытия описанных в данном описании новых двуаллельных маркеров, или любого набора праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагмента ДНК, включающего двуаллельный маркер настоящего изобретения.
В некоторых вариантах настоящего изобретения созданы праймеры для амплификации фрагмента ДНК, содержащего один или несколько двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Предпочтительные амплификационные праймеры перечислены в примере 2. Следует иметь ввиду, что данные перечисленные праймеры являются лишь иллюстративными, и что также используют любой другой набор праймеров, который производит продукты амплификации, содержащие один или несколько двуаллель-ных маркеров настоящего изобретения.
Расстояние между праймерами определяет длину амплифицированного сегмента. В контексте настоящего изобретения амплифицированные сегменты, несущие двуаллельные маркеры, можно расположить по размеру по меньшей мере от около 25 п.н. до 35 т.п.н. Фрагменты амплификации с 25-3000 п.н. являются обычными, фрагменты с 50-1000 п.н. являются предпочтительными, а фрагменты со 100-600 п. н. являются высокопредпочтительными. Следует иметь в виду, что праймеры амплификации двуал-лельных маркеров могут представлять собой любую последовательность, которая делает возможной специфичную амплификацию любого фрагмента ДНК, несущего данные маркеры. Праймеры амплификации можно метить или иммобилизовать на твердом носителе, как описано в разделе "Олигонуклеотидные зонды и праймеры".
Способ генотипирования образцов ДНК по двуаллельным маркерам
Для идентификации нуклеотида, присутствующего в сайте двуаллельного маркера, можно использовать любой способ, известный в данной области техники. Поскольку данный детектируемый аллель двуаллельного маркера был идентифицирован и точно определен в настоящем изобретении, детекция оказывается простой для среднего специалиста в данной области техники, с применением любой из имеющихся методик. Многие способы генотипирования требуют осуществления предварительной амплификации области ДНК, несущей интересующий двуаллельный маркер. Хотя в настоящее время амплификация мишени или сигнала часто предпочтительна, сверхчувствительные способы детекции, которые не требуют амплификации, также включены в современные способы генотипирования. Способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, которые могут использоваться для выявления двуаллельного полиморфизма, включают такие способы, как стандартный дот-блот анализ, анализ однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP), описанного Orieta и соавт. (1989), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE), гетеродуплексный анализ, обнаружение расщепления ошибочного спаривания и другие традиционные методики, которые описаны у Sheffield и соавт. (1991), White и соавт. (1992), Grompe и соавт. (1989 и 1993). Другой способ определения идентичности нуклео-тида, присутствующего в конкретном полиморфном сайте, использует специализированное, устойчивое к экзонуклеазе, нуклеотидное производное, как описано в патенте США № 4656127.
Предпочтительные способы подразумевают прямое определение идентичности нуклеотида, присутствующего в сайте двуаллельного маркера, с помощью анализа секвенирования, анализа ферментного выявления дефекта комплементарно спаривания или гибридизационного анализа. Далее следует описание некоторых предпочтительных способов. Особо предпочтительным способом является метод микро-секвенирования. Используемый, в основном, в данном описании термин "секвенирование" относится к полимеразному удлинению дуплексных комплексов праймер/матрица и включает традиционное секве-нирование и микросеквенирование.
1) Секвенирующий анализ.
Нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте, можно определить с помощью способов секве-нирования. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения образцы ДНК перед секвенированием подвергают ПЦР-амплификации, как описано выше. Способы секвенирования ДНК описаны в разделе "Секвенирование амплифицированной геномной ДНК и идентификация полиморфизма единственного нуклеотида".
Предпочтительно, амплифицированную ДНК подвергают автоматизированному дидезокситерми-нирующему секвенированию с использованием протокола цикла секвенирования с праймером, меченным красителем. Секвенирующий анализ делает возможной идентификацию основания, присутствующего в сайте двуаллельного маркера.
2) Микросеквенирующий анализ.
- 40 -
008252
В микросеквенирующих способах нуклеотид полиморфного сайта в ДНК-мишени выявляют с помощью реакции однонуклеотидного праймерного удлинения. Данный способ включает в себя соответствующие микросеквенирующие праймеры, которые гибридизуются как раз "левее" от представляющего интерес полиморфного основания в нуклеиновой кислоте-мишени. Используют полимеразу, которая специфически удлиняет 3'-конец праймера на один-единственный ddNTP (терминатор цепи), комплементарный нуклеотиду полиморфного сайта. Затем идентичность включенного нуклеотида определяют любым подходящим образом.
Обычно реакции микросеквенирования осуществляют с использованием флуоресцентных ddNTP и достроенные микросеквенирующие праймеры анализируют с помощью электрофореза на секвенаторе ABI 377 для определения идентичности встроенного нуклеотида, как описано в ЕР 412883, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Альтернативно, можно использовать капиллярный электрофорез, для того, чтобы одновременно проанализировать большое число продуктов микросеквенирования. Пример типичной микросеквенирующей методики, которую можно использовать в контексте настоящего изобретения, представлен в примере 4.
Для меченья и детекции ddNTP можно применить разные методы. Способ гомогенно-фазной детекции основан на флуоресцентном переносе энергии резонанса, описанный Chen and Kwok (1997) и Chen и соавт. (1997). В данном способе амплифицированные фрагменты геномной ДНК, содержащие полиморфные сайты, инкубируют с праймером, меченным флуоресцеином по 5'-концу в присутствии аллель-ных меченных красителем дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов и модифицированной Taq-полимеразы. Меченный красителем праймер удлиняется на одно основание с помощью красителя-терминатора, специфичного для данного аллеля, представленного в данной матрице. В конце реакции генотипирования интенсивность флуоресценции двух красителей в данной реакционной смеси анализируют непосредственно без разделения или выделения очисткой. Все эти стадии можно осуществить в одной и той же пробирке, а изменения флуоресценции отслеживать в реальном времени. Альтернативно, удлиненный прай-мер можно анализировать с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Данное основание в полиморфном сайте определяют по массе, добавляемой к праймеру микросеквенирования (см. Haff and Smirnov,
1997).
Микросеквенирование можно осуществить с помощью ставшего традиционным или усовершенствованного способа микросеквенирования или с помощью его вариантов. Альтернативные способы включают несколько твердофазных методик микросеквенирования. Основным протоколом по микросеквени-рованию является тот же протокол, который описан выше, за исключением того, что данный способ осуществляют в виде анализа в гетерогенной фазе, в котором данный праймер или молекулу-мишень иммобилизуют или улавливают на твердый носитель. Чтобы упростить анализ отделения праймера и добавления терминирующего нуклеотида, олигонуклеотиды присоединяют к твердому носителю или модифицируют таким образом, чтобы позволить разделение по сродству, а также полимеразное удлинение. 5'-Концы и внутренние нуклеотиды синтетических олигонуклеотидов можно модифицировать несколькими разными путями, позволяющими применять разные методы разделения по сродству, например, биотинилирование. При использовании в олигонуклеотидах единственной аффинной группы, данные олигонуклеотиды можно отделить от встроенного терминирующего реагента. Это исключает необходимость физического разделения или разделения по размеру. При использовании более одной аффинной группы от данного терминирующего реагента можно отделить и анализировать одновременно более одного олигонуклеотида. Это позволяет проводить анализ нескольких видов нуклеиновой кислоты или получать больше информации о последовательности нуклеиновой кислоты на реакцию удлинения. Аффинная группа не является необходимой в праймировании олигонуклеотида, но могла бы быть альтернативно представлена на данной матрице. Например, иммобилизацию можно осуществлять путем взаимодействия между биотинилированной ДНК и микротитрационными лунками, покрытыми стрептавидином или частицами из полистирола, покрытыми авидином. Таким же образом, олигонуклеотиды или матрицы можно присоединить к твердому носителю в высокоплотном виде. В таких твердофазных микросеквени-рующих реакциях встроенные ddNTP могут быть радиоактивно меченными (Syvanen, 1994) или связаны с флуоресцеином (Livak and Hainer, 1994). Детекцию радиоактивно меченных ddNTP можно осуществлять с помощью сцинтилляционных методов. Детекцию флуоресцеинсвязанных ddNTP можно строить на связывании антифлуоресцеинового антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой, с последующей инкубацией с хроматографическим субстратом (таким как паранитрофенилфосфат). Другие возможные пары детекции репортера включают: ddNTP, связанный с динитрофенилом (DNP), и конъюгат анти-DNP щелочная фосфатаза (Harju и соавт., 1993) или биотинилированный ddNTP и стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена, с ортофенилендиамином в качестве субстрата (WO 92/15712, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте). Еще в одном альтернативном твердофазном методе микросеквенирования Nyren и соавт. (1993) описывают способ, основывающийся на детекции ДНК-полимеразной активности в энзиматическом люминометрическом анализе детекции неорганического пирофосфата (ELIDA).
Pastinen и соавт. (1997) описывают способ многократной детекции полиморфизма единственного нуклеотида, в котором принцип твердофазного микросеквенирования применяется к формату олигонук
- 41 -
008252
леотидного набора. Высокоплотные наборы ДНК-зондов, присоединенные к твердому носителю (ДНК-чип), описаны ниже.
Одним из аспектов настоящего изобретения является создание полинуклеотидов и способов гено-типирования одного или нескольких двуаллельных маркеров настоящего изобретения, осуществляемых с помощью анализа микросеквенирования. Предпочтительные праймеры микросеквенирования включают нуклеотидные последовательности D1-D18 и Е1-Е18. Следует иметь ввиду, что микросеквенирующие праймеры, перечисленные в примере 4, являются всего лишь иллюстративными, и что можно использовать любой праймер, обладающий 3'-концом, непосредственно примыкающим к данному полиморфному нуклеотиду. Подобно этому, следует иметь в виду, что микросеквенирующий анализ можно осуществлять для любого двуаллельного маркера или для любого сочетания двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Одним из аспектов настоящего изобретения является твердый носитель, который включает один или несколько микросеквенирующих праймеров, перечисленных в примере 4, или их фрагменты, включающие, по крайней мере, 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 их последовательных нуклеотидов, пока такие совместимые с описанным праймером и обладающие 3'-концом непосредственно "левее" от соответствующего двуаллельного маркера, для определения идентичности нуклеотида в сайте двуаллельного маркера.
3) Основанный на полимеразах и лигазах анализ выявления ошибочного спаривания.
Одним из аспектов настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотидов и способов для определения аллеля одного или нескольких двуаллельных маркеров настоящего изобретения в биологическом образце с помощью анализа по выявлению ошибочного спаривания, основанного на полимеразах и/или лигазах. Проведение таких анализов основывается на специфичности полимераз и лигаз. Реакция полимеризации определяет особенно жесткие требования к правильному спариванию оснований 3'-конца праймера для амплификации, а соединение двух олигонуклеотидов, гибридизующихся с последовательностью ДНК-мишени, является весьма чувствительным к несоответствиям вблизи сайта лигирования, особенно на 3'-конце. Кроме того, способы, праймеры и различные параметры для амплификации фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры настоящего изобретения, описаны выше в разделе "Амплификация фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры".
Аллельная специфичность праймеров амплификации
Дифференциацию аллелей двуаллельного маркера можно осуществлять с помощью специфической амплификации, селективной стратегии, при помощи которой один из аллелей амплифицируется в отсутствие амплификации другого аллеля. Для аллельспецифичной амплификации по меньшей мере один член пары праймеров является достаточно комплементарным области CanIon-гена, включающей полиморфное основание двуаллельного маркера настоящего изобретения, который к тому же гибридизуется и начинает амплификацию. Такие праймеры способны различать эти два аллеля двуаллельного маркера.
Это осуществляется путем помещения полиморфного основания на 3'-конец одного из праймеров амплификации. Поскольку удлинение начинается с 3'-конца праймера, ошибочное спаривание в данном положении или вблизи него обладает ингибирующим действием на амплификацию. Поэтому в соответствующих условиях амплификации праймеры направляют амплификацию только на комплементарный к нему аллель. Определение точного расположения ошибочного спаривания и соответствующих условий исследования находятся в пределах компетенции среднего специалиста в данной области техники. Способы, основанные на лигировании/амплификации
"Метод олигонуклеотидного лигирования" (OLA) использует два олигонуклеотида, которые создают способными гибридизоваться с примыкающими последовательностями однонитевых молекул-мишеней. Один из олигонуклеотидов биотинилирован, а другой поддается обнаружению благодаря метке. При обнаружении в молекуле-мишени точно комплементарной последовательности, данные олиго-нуклеотиды будут гибридизоваться так, что их концы соединятся впритык и создадут субстрат для лиги-рования, который можно захватить и детектировать. OLA способен детектировать полиморфизм единственного нуклеотида и может быть преимущественно объединен с ПЦР, как описано у Nickerson и соавт. (1990). В данном способе ПЦР используют для осуществления экспоненциальной амплификации ДНК-мишени, которую затем детектируют с использованием OLA.
Другие способы амплификации, которые особенно пригодны для обнаружения полиморфизма единственного нуклеотида, включают LCR (лигазную цепную реакцию), Gap LCR (GLCR), которые описаны выше в разделе "Амплификация ДНК". LCR использует две пары зондов для экспоненциальной амплификации конкретной мишени.
Последовательности каждой пары олигонуклеотидов выбраны таким образом, чтобы дать возможность паре гибридизоваться с примыкающими последовательностями одной и той же цепи данной мишени. Такая гибридизация образует субстрат для матрично-зависимой лигазы. В соответствии с настоящим изобретением LCR можно осуществить с олигонуклеотидами, обладающими проксимальной и дис-тальной последовательностями одной и той же цепи сайта двуаллельного маркера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения создают один из двух олигонуклеотидов, который включает сайт двуаллельного маркера. В таком варианте осуществления настоящего изобретения реакционные условия выбраны так, чтобы данные олигонуклеотиды могли быть лигированы вместе лишь в том случае, если
- 42 -
008252
данная молекула-мишень либо содержит, либо не содержит специфичный нуклеотид, который комплементарен двуаллельному маркеру в олигонуклеотиде. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения данные олигонуклеотиды не включают данный двуаллельный маркер, так что, когда они гибридизуются с молекулой-мишенью, создается "gap" (пробел), как описано в WO 90/01069, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Данный пробел "заполняется" комплементарными dNTP (при посредничестве ДНК-полимеразы) или с помощью дополнительной пары олигонуклеотидов. Таким образом, в конце каждого цикла, каждая одиночная цепь обладает комплементом, способным служить в качестве мишени в течение следующего цикла и получают экспоненциальную аллельспецифичную амплификацию желательной последовательности.
Ligase/Polymerase-mediated Genetic Bit Analysis(tm) (Анализ небольшого генетического фрагмента при посредничестве лигазы/полимеразы)(tm) представляет собой еще один способ определения идентичности нуклеотида в заранее выбранном сайте молекулы нуклеиновой кислоты (WO 95/21271). Данный способ включает в себя введение нуклеозидтрифосфата, который комплементарен нуклеотиду, присутствующему в заранее выбранном сайте на конце молекулы праймера, и их последующее лигирование со вторым олигонуклеотидом. Данную реакцию отслеживают путем детектирования специфической метки, присоединенной к твердой фазе данной реакции или путем детектирования в растворе.
4) Способы гибридизационного анализа.
Предпочтительный способ определения идентичности нуклеотида, присутствующего в сайте двуал-лельного маркера, включает гибридизацию нуклеиновых кислот. Гибридизационные зонды, которые удобно использовать в таких реакциях, предпочтительно включают указанные в данном описании зонды. Можно использовать любой гибридизационный анализ, включая Саузерн-гибридизацию, Нозерн-гибридизацию, дот-блот-гибридизацию и твердофазную гибридизацию (см. Sambrook и соавт., 1989).
Гибридизация относится к образованию дуплексной структуры двумя однонитевыми нуклеиновыми кислотами, вследствие комплементарности спариваемых оснований. Гибридизация может происходить между точно комплементарными цепями нуклеиновой кислоты или между цепями нуклеиновой кислоты, которая содержит минорные области ошибочного спаривания. Можно создать специфичные зонды, которые гибридизуются с одной формой двуаллельного маркера, но не с другой, и поэтому способны различать разные аллельные формы. Аллельспецифичные зонды часто используются парами, причем один член такой пары демонстрирует полное совпадение с последовательностью-мишенью, содержащей первоначальный аллель, а другой демонстрирует полное совпадение с последовательностью-мишенью, содержащий альтернативный аллель. Условия гибридизации должны быть достаточно жесткими, чтобы существовала существенная разница в интенсивности гибридизации между аллелями, и, в основном, предпочтителен по существу бинарный ответ, в силу чего зонд гибридизуется только с одним из таких аллелей. Жесткие, специфичные для последовательности, гибридизационные условия, в которых зонд гибридизуется только с точно комплементарной последовательностью-мишенью, хорошо известны в данной области техники (Sambrook и соавт., 1989). Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться при разных обстоятельствах. Как правило, жесткие условия выбирают таким образом, чтобы они были примерно на 5°С ниже температуры плавления (Tm) специфичной последовательности при определенной ионной силе и рН. Хотя такую гибридизацию можно осуществить в растворе, предпочтительно использовать твердофазный метод гибридизации. ДНК-мишень, включающую дву-аллельный маркер настоящего изобретения, можно амплифицировать перед реакцией гибридизации. Присутствие специфичного аллеля в данном образце определяют путем детектирования наличия или отсутствия стабильных гибридных дуплексов, образованных между данным зондом и данной ДНК-мишенью. Детекцию гибридных дуплексов можно осуществлять многими способами. Хорошо известны разные виды метода детекции, в которых используют детектируемые метки, связанные с данной мишенью или с данным зондом для детекции образованных гибридных дуплексов. Обычно, гибридизацион-ные дуплексы отделяют от негибридизованных нуклеиновых кислот, после чего метки, связанные с образовавшимися дуплексами, детектируются. Специалистам в данной области известно, что стадии отмывки можно использовать для отмывки избытка ДНК-мишени или зонда, а также несвязавшегося конъюгата. Кроме того, стандартные гетерогенные виды анализа являются подходящими для детекции полученных гибридов с использованием меток, присутствующих в праймерах и зондах.
Два усовершенствованных в последнее время метода позволяют дискриминировать аллели на основе гибридизации без необходимости разделений или отмывок (см. Landegren U. и соавт., 1998). Преимущество метода TaqMan в том, что в нем используется 5'-нуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq для расщепления ДНК-зонда, специфически отжигаемого с накапливающимся продуктом амплификации. TaqMan-зонды метят с помощью донор-акцепторной пары красителей, которые взаимодействуют путем флуоресцентного переноса энергии. Расщепление TaqMan-зонда, в результате продвижения полимеразы в течение амплификации, разъединяет донорный краситель от подавляющего красителя-акцептора, существенно увеличивая флуоресценцию донора. Все реагенты, необходимые для выявления двух аллель-ных вариантов, можно собрать к началу реакции, а результаты отследить в реальном времени (см. Livak и соавт., 1995). В альтернативном методе, основанном на гомогенной гибридизации, для различения аллелей используют молекулярные маяки. Молекулярные маяки представляют собой олигонуклеотидные
- 43 -
008252
зонды шпилечной формы, которые сообщают о наличии специфичной нуклеиновой кислоты в гомогенных растворах. При связывании со своими мишенями они подвергаются конформационной реорганизации, которая восстанавливает флуоресценцию внутренне потушенного флуорофора (Tyagi и соавт.,
1998).
Созданные в данном описании полинуклеотиды можно использовать для получения зондов, которые можно использовать в гибридизационном анализе для детекции аллелей двуаллельного маркера в биологических образцах. Данные зонды характеризуются тем, что они предпочтительно включают 8-50 нуклеотидов и тем, что они достаточно комплементарны последовательности, включающей двуаллель-ный маркер настоящего изобретения, с тем чтобы гибридизоваться с ней, и предпочтительно достаточно специфичны для различения последовательности-мишени всего с одним нуклеотидным изменением. Особенно предпочтительный зонд составляет 25 нуклеотидов в длину. Предпочтительно двуаллельный маркер находится в 4 нуклеотидах от центра данного полинуклеотидного зонда. В особенно предпочтительных пробах двуаллельный маркер находится в центре указанного полинуклеотида. Предпочтительные зонды включают нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из амплико-нов списка табл. 1 и комплементарных им последовательностей, или ее фрагмент, причем указанный фрагмент включает, по меньшей мере, около 8 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 10, 15, 20, более предпочтительно 25, 30, 40, 47 или 50 последовательных нуклеотидов и содержит полиморфное основание. Предпочтительные зонды включают нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Р1-Р18 и последовательностей, комплементарных им. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения полиморфное(ые) основание(я) находятся в пределах 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида, более предпочтительно - в центре указанного поли-нуклеотида.
Предпочтительно зонды настоящего изобретения являются меченными и иммобилизованными на твердом носителе. Метки и твердые носители описаны также в разделе "Олигонуклеотидные зонды и праймеры". Данные зонды могут быть не удлиняемыми, как описано в разделе "Олигонуклеотидные зонды и праймеры".
При анализе гибридизации аллельспецифичного зонда можно обнаружить присутствие или отсутствие аллеля двуаллельного маркера в данном образце. Высокопроизводительная параллельная гибридизация в виде набора специфически включена в "методы гибридизации" и описывается ниже.
5) Гибридизация с адресными наборами олигонуклеотидов.
Методы гибридизации, основанные на олигонуклеотидных наборах, зависят от различий в гибриди-зационной стабильности коротких олигонуклеотидов, которые полностью совпадают, и несовпадающих вариантов последовательности-мишени. Эффективный доступ к информации о полиморфизме получают через основную структуру, включающую высокоплотные наборы олигонуклеотидных зондов, присоединенных на выбранной позиции к твердому носителю (например, чип). Каждый ДНК-чип может содержать от тысяч до миллионов индивидуальных синтетических ДНК-зондов, выстроенных в подобную сетке структуру и миниатюризированную до размера монеты в 10 центов.
Технология чипа уже с успехом применяется во многих случаях. Например, в мутантных штаммах S. cerevisiae скринированию на наличие мутаций был подвергнут ген BRCA 1, протеазный ген в HIV-1-ви-русе (Hacia и соавт., 1996; Shoemaker и соавт., 1996; Kozal и соавт., 1996). Чипы разного вида для обнаружения двуаллельного полиморфизма можно получить на основании индивидуальных заказов у Affymetrix (GeneChip(tm)), Hyseg (HyChip and HyGnostics) и Protogene Laboratories.
В общем, в данных способах используют наборы олигонуклеотидных зондов, которые комплементарны сегментам последовательности-мишени нуклеиновой кислоты индивида, последовательности-мишени которого включают полиморфный маркер. ЕР 785280, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте, описывает "плиточную" стратегию для обнаружения полиморфизма единственного нуклеотида. Вкратце, наборы в основном могут быть "плиточными" для большого числа конкретных полиморфизмов. Под "плиточным" покрытием в основном подразумевается синтез определенного набора олигонуклеотидных зондов, которые создают последовательность, комплементарную представляющей интерес последовательности-мишени, а также заданную изменчивость этой последовательности, например, замена одной или нескольких данных позиций одним или несколькими членами базисного набора нуклеотидов. "Плиточные" стратегии описаны также в заявке РСТ № WO 95/11995. В конкретном аспекте наборы являются "плиточными" для ряда специфичных, идентифицированных последовательностей двуаллельного маркера. В частности, данный набор делают "плиточным" для включения ряда детекционных блоков, каждый из которых является специфичным для конкретного двуаллельного маркера или набора двуаллельных маркеров. Например, детекционный блок может быть " плиточным" для включения ряда зондов, которые охватывают участок последовательности, включающий специфичный полиморфизм. Чтобы обеспечить получение зондов, которые комплементарны каждому аллелю, зонды синтезируют парами, отличающимися по двуаллельному маркеру. Кроме зондов, отличающихся по полиморфному основанию, однозамещенные зонды также, как правило, укладывают " плитками" внутри данного детекционного блока. Такие монозамещенные зонды обладают определенным числом оснований или вплоть до определенного числа оснований в любом направлении от данного
- 44 -
008252
полиморфизма, замещенных на остающиеся нуклеотиды (выбранными из А, Т, G, С и U). Обычно зонды в "плиточном" детекционном блоке будут включать замены позиций последовательности вплоть до позиций и, включая позиции, которые находятся в 5 основаниях от двуаллельного маркера. Монозамещен-ные зонды обеспечивают внутренние контроли "плиточного" набора для распознавания действительной гибридизации от артефактной перекрестной гибридизации. По окончании гибридизации с последовательностью-мишенью и отмывки полученной матрицы, данную матрицу сканируют для определения в данной матрице позиции, с которой гибридизуется искомая последовательность-мишень. Затем данные гибридизации сканированной матрицы анализируют, чтобы идентифицировать наличие того или иного аллеля данного двуаллельного маркера в данном образце. Гибридизацию и сканирование можно осуществить так, как описано в заявке РСТ № WO 92/10092 и WO 95/11995 и в патенте США № 5424186.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чипы могут включать матрицу последовательностей нуклеиновых кислот с фрагментами длиной около 15 нуклеотидов. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения чип может включать матрицу, включающую по меньшей мере одну из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из амплико-нов, представленных в табл. 1, и комплементарных им последовательностей, или их фрагментов, причем указанный фрагмент включает по меньшей мере около 8 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 10, 15, 20, более предпочтительно 25, 30, 40, 47 или 50 последовательных нуклеотидов и содержит полиморфное основание. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанное полиморфное основание находится в пределах 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида, более предпочтительно - в центре указанного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чип может включать матрицу, по меньшей мере, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более из данных полинуклеотидов настоящего изобретения. Твердые носители и полинуклеоти-ды настоящего изобретения, присоединенные к твердым носителям, описаны также в разделе "Олиго-нуклеотидные зонды и праймеры".
6) Интегрированные системы.
Другой метод, который может использоваться для анализа полиморфизмов, включает многосоставные интегрированные системы, которые миниатюризируют и компартаментализуют такие технологические процессы, как ПЦР и реакции капиллярного электрофореза в одном функциональном устройстве. Например, такой метод раскрыт в патенте США № 5589136, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте, который описывает интеграцию ПЦР-амплификации и капиллярного электрофореза в чипах.
Интегрированные системы можно предусматривать, в основном, при использовании микрофлюи-дальных систем. Эти системы включают набор микроканалов, созданных в стекле, силиконе, кварце или в пластиковом тонком диске, включенным в микрочип. Передвижение образцов контролируется электрическими, электроосмотическими или гидростатическими силами, прикладываемыми к разным областям микрочипа для создания функциональных микроскопических волн и насосов в отсутствие движущихся частей.
Что касается генотипирования двуаллельных маркеров, то микрофлюидальная система может интегрировать амплификацию нуклеиновых кислот, микросеквенирование, капиллярный электрофорез и способ детекции, такой как флуоресцентная детекция, созданная лазерным излучением.
Способы генетического анализа с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения
Для генетического анализа сложных признаков доступны разные способы (см. Lander and Schork, 1994). Поиск генов, чувствительных к заболеванию, осуществляют с использованием двух основных способов: методом сцепления, в котором ищут доказательство совместной сегрегации локуса и предполагаемого локуса, контролирующего признак, с использованием исследования семей, и методом ассоциации, в котором ищут доказательство статистически значимой ассоциации между аллелем и признаком или аллелем, определяющим признак (Knoury и соавт., 1993). В целом, двуаллельные маркеры настоящего изобретения находят использование для любого способа, известного в данной области техники, для демонстрации статистически значимой корреляции между генотипом и фенотипом. Такие двуаллельные маркеры могут использоваться в параметрических и непараметрических способах анализа сцепления. Предпочтительно, двуаллельные маркеры настоящего изобретения используются для идентификации генов, ассоциированных с детектируемыми признаками, с использованием ассоциативных исследований, подхода, который не требует использовать пораженные семьи, и который позволяет идентифицировать гены, ассоциированные с комплексными и отдельными признаками.
Генетический анализ с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения можно осуществлять в любом масштабе. Можно использовать целую совокупность двуаллельных маркеров настоящего изобретения или любую подгруппу двуаллельных маркеров настоящего изобретения, соответствующую гену-кандидату. Кроме того, можно использовать любую совокупность генетических маркеров, включая двуаллельный маркер настоящего изобретения. Совокупность двуаллельных полиморфизмов, которую можно было бы использовать в качестве генетических маркеров в сочетании с двуаллель-ными маркерами настоящего изобретения, описана в WO 98/20165. Как указано выше, следует отметить, что двуаллельные маркеры настоящего изобретения могут быть включены в любую полную или непол
- 45 -
008252
ную генетическую карту генома человека. Эти различные применения конкретно рассматриваются в настоящем изобретении и формуле изобретения.
Анализ сцепления
Анализ сцепления основывается на установлении корреляции между переносом (передачей) генетических маркеров и тем, как конкретный признак передается в поколениях в пределах семьи. Таким образом, целью анализа сцепления является обнаружение маркерного локуса, который демонстрирует одновременное распределение представляющего интерес признака в родословных.
Параметрические способы
Если данные доступны в ряду последовательных поколений, существует благоприятная возможность исследовать степень сцепления между парами локусов. Оценки доли рекомбинаций делают возможным располагать и размещать локусы на генетической карте. Для локусов, которые представляют собой генетические маркеры, можно создать генетическую карту, после чего можно рассчитать силу сцепления между маркерами и признаками и использовать в качестве указания относительного расположения маркеров и генов, влияющих на эти признаки (Weir, 1996). Классический способ анализа сцепления представляет собой способ логарифмической оценки вероятности (lod) (см. Morton, 1955; Ott, 1991). Вычисление lod-оценок требует детализации схемы наследования для данного заболевания (параметрический способ). Как правило, длина идентифицируемой кандидатной области, с использованием анализа сцепления, составляет между 2 и 20 млн. п. н. После идентификации кандидатной области, как описано выше, анализ рекомбинантных индивидов, с использованием дополнительных маркеров, позволяет дополнительно очертить кандидатную область. Исследование анализа сцепления, в общем, рассчитано максимально на использование 5000 микросателлитных маркеров, ограничивая таким образом максимальную теоретически достигаемую разрешающую способность анализа сцепления в среднем до около 600 т. п. н.
Анализ сцепления был успешно применен для картирования простых генетических признаков, которые демонстрируют примеры четкого Менделевского наследования, и которые обладают высокой пе-нетрантностью (т.е. соотношение между числом позитивных носителей аллеля а признака и общим числом носителей а в данной популяции). Однако параметрический анализ сцепления страдает от различных недостатков. Во-первых, он ограничен надежностью в выборе генетической модели, подходящей для каждого исследуемого признака. Более того, как уже упоминалось, достигаемая разрешающая способность, с использованием анализа сцепления, ограничена, и исследование комплементарности требует усовершенствования анализа типичных областей в 2-20 млн.п.н., исходно идентифицированных с помощью анализа сцепления. Кроме того, доказано, что параметрические методы анализа сцепления трудны для применения к комплексным генетическим признакам, таким, которые связанные с объединенным действием множества генов и/или факторов окружающей среды. Очень трудно адекватно моделировать данные признаки методом подсчета lod-балла. В таких случаях требуются чрезмерно большое усилие и затраты для комплектования адекватного количества пораженных болезнью семей, необходимых для анализа сцепления, применительно к этим ситуациям, что недавно обсуждали Risen and Merikangas (1996).
Непараметрические способы
Преимущество так называемых непараметрических способов для анализа сцепления заключается в том, что они не требуют детализации схемы наследования для данной болезни, они способствуют большему использованию в анализе комплексных признаков. В непараметрических способах предпринимаются попытки доказать, что картина наследования хромосомной области не согласуется со случайным Менделевским расщеплением, демонстрируя, что пораженные болезнью родственники наследуют идентичные копии данной области чаще, чем при случайном ожидании. Пораженные болезнью родственники должны демонстрировать избыток "совместно используемого аллеля" даже в присутствии неполной пе-нетрантности и полигенном наследовании. В непараметрическом анализе сцепления уровень совпадения по маркерному локусу у двух индивидов можно измерить либо с помощью числа аллелей, идентичных по состоянию (IBS), либо с помощью числа аллелей, идентичных по происхождению (IBD). Анализ пораженных болезнью пары сибсов представляет собой хорошо известный специальный случай и является простейшей формой этих способов.
Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно использовать и в параметрическом и в непараметрическом анализе сцепления. Предпочтительно двуаллельные маркеры можно использовать в непараметрических способах, которые позволяют картировать гены, участвующие в комплексных признаках. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения могут использоваться в IBD- и IBS-способах для картирования генов, воздействующих на комплексный признак. В таких исследованиях, используя преимущество высокой плотности распределения двуаллельных маркеров, несколько смежных локусов дву-аллельных маркеров можно объединить для достижения эффективности, достигаемой мультиаллельны-ми маркерами (Zhao и соавт., 1998).
Популяционные ассоциативные исследования
Настоящее изобретение включает способы идентификации с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения в том случае, когда CanIon-ген ассоциирован с выявляемым признаком. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение включает способы выявления ассоциации между аллелем двуаллельного маркера или двуаллельным маркерным гаплотипом и признаком. Кроме
- 46 -
008252
того, настоящее изобретение включает способы идентификации аллеля, определяющего признак при неравновесии по сцеплению с любым аллелем двуаллельного маркера настоящего изобретения.
Как указано выше, для осуществления ассоциативных исследований можно использовать альтернативные подходы: широкое ассоциативное исследование генома, ассоциативное исследование кандидат-ной области и ассоциативное исследование гена-кандидата. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения двуаллельные маркеры настоящего изобретения используются для осуществления ассоциативных исследований кандидатного гена. Указанный метод гена-кандидата несомненно дает быструю оценку идентификации генов и генного полиморфизма, связанного с отдельным признаком, если доступны некоторые сведения по биологии данного признака. Кроме того, двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно встроить в любую карту генетических маркеров генома человека для того, чтобы осуществить широкие ассоциативные исследования генома. Способы создания высокоплотной карты двуаллельных маркеров описаны в предварительной патентной заявке США с порядковым номером 60/082614. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно, кроме того, встроить в любую карту конкретной кандидатной области генома (например, конкретной хромосомы или конкретного хромосомного сегмента).
Как указано выше, ассоциативные исследования можно осуществить в генеральной совокупности и не ограничиваться исследованиями, осуществляемыми на родственниках в пораженных болезнью семьях. Ассоциативные исследования представляются чрезвычайно ценными, поскольку позволяют анализировать отдельные или мультифакторные признаки. Более того, ассоциативные исследования представляют собой мощный способ картирования на малом участке гена, обеспечивая более тонкое картирование аллелей, контролирующих признак, чем исследования по сцеплению. Исследования, базирующиеся на родословных, часто лишь сужают местоположение аллеля, контролирующего данный признак.
Следовательно, ассоциативные исследования с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения можно применять для уточнения местоположения аллеля, контролирующего признак, в кан-дидатной области, идентифицируемой способами анализа по сцеплению. Более того, в том случае, если интересующий хромосомный сегмент, представляющий ген-кандидат, такой как ген-кандидат настоящего изобретения, был идентифицирован, для данной представляющей интерес области можно использовать упрощенную идентификацию аллеля, контролирующего данный признак.
Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно использовать для демонстрации ассоциации гена-кандидата с признаком. Такое использование, в частности, подразумевается в настоящем изобретении. Определение частоты аллеля двуаллельного маркера или гаплотипа двуаллельного маркера в популяции
Ассоциативными исследованиями выясняются взаимосвязи частот аллелей между локусами. Определение частоты аллеля в популяции
Аллельные частоты двуаллельных маркеров в популяциях определяют с использованием одного из способов, описанного выше под заголовком "Способы индивидуального генотипирования по двуаллельным маркерам", или любым методом генотипирования, подходящим для данной обозначенной цели. Ге-нотипирование объединенных образцов или индивидуальных образцов может определить частоту аллеля двуаллельного маркера в популяции. Один из путей по уменьшению числа требуемых операций геноти-пирования заключается в использовании объединенных образцов. Основным препятствием для использования объединенных образцов является ограничение точности и воспроизводимости при определении точных концентраций ДНК в собранных пулах. Индивидуальное генотипирование образцов предусматривает более высокую чувствительность, воспроизводимость и точность и является предпочтительным способом настоящего изобретения. Целесообразно генотипировать каждого индивида отдельно, и для определения частоты аллеля двуаллельного маркера или генотипа в данной популяции применяют простой генный подсчет.
Настоящее изобретение относится также к способам оценки частоты аллеля в популяции, включающим: а) генотипирование индивидов указанной популяции по указанному двуаллельному маркеру, в соответствии со способом настоящего изобретения; b) определение пропорционального представительства указанного двуаллельного маркера в указанной популяции. Кроме того, способы настоящего изобретения оценки частоты аллеля в популяции включают способы любого дополнительного ограничения, описанного в данном сообщении, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно обнаруживают нарушение равновесия по сцеплению; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или, к тому же, двуаллель-ные маркеры необязательно неравновесно сцеплены; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно обнаруживают нарушение равновесия по сцеплению. Определение частоты аллеля двуаллельного маркера в популяции можно осуществить, необязательно, в результате определения идентичности нуклеотидов обоих копий указанного двуаллельного маркера, присутствующего в данном геноме каждого индивида в указанной популяции, и вычисления для данной популяции пропорционального представительства указанного нуклеотида по указанному двуаллельному маркеру,
- 47 -
008252
связанному с CanIon. Определение пропорционального представительства можно, необязательно, осуществить в результате осуществления способа генотипирования настоящего изобретения в объединенном биологическом образце, полученным от представительного числа индивидов, или от каждого индивида, в указанной популяции, и вычисления пропорционального количества указанного нуклеотида в сравнении с общим количеством.
Определение частоты гаплотипа в популяции
Гаметическая фаза гаплотипов неизвестна, если диплоидные организмы являются гетерозиготами более чем по одному локусу. Иногда, при использовании генеалогических данных для семей, можно предположить гаметическую фазу (Perlin и соавт., 1994). Если генеалогические данные недоступны, можно применить разные методики. Одна из таких возможностей заключается в том, что гетерозигот-диплоидов по многим сайтам можно исключить из данного анализа, оставляя лишь гомозиготных и гетерозиготных по одному сайту индивидов, однако, данный метод может привести к возможной погрешности относительно структуры образца и недооценке низкочастотных гаплотипов. Другая возможность заключается в том, что одиночные хромосомы можно изучать самостоятельно, например, с помощью асимметричной ПЦР-амплификации (см. Newton и соавт., 1989; Wu и соавт., 1989) или в результате выделения отдельной хромосомы путем предельного разбавления с последующей ПЦР-амплификацией (см. Ruano и соавт., 1990). Кроме того, образец можно гаплотипировать по достаточно близким двуаллельным маркерам с помощью двойной ПЦР-амплификации специфичных аллелей (Sarkar, G. and Sommer S.S., 1991). Такие методы не являются вполне удовлетворительными из-за их технической сложности, влекущей за собой удорожание, их недостаточного обобщения в большом масштабе или из-за возможных смещений. Чтобы преодолеть данные трудности, можно использовать алгоритм для определения фазы генотипов ПЦР-амплифицированных ДНК, предложенный Clark, A.G. (1990). Вкратце, основная идея заключается в начальном заполнении списка гаплотипов, присутствующих в данном образце, в результате обследования индивидов, которые однозначно являются полными гомозиготами и гетерозиго-тами по одному сайту. Затем скринируют других индивидов в том же самом образце на возможную встречаемость ранее определенных гаплотипов. При каждой позитивной идентификации в список установленных гаплотипов добавляют комплементарный гаплотип до тех пор, пока информация по данной фазе для всех индивидов не будет разложена или не будет идентифицирована как далее неразлагаемая. Данным способом для каждого мультигетерозиготного индивида определяют единственный гаплотип, хотя, при наличии более чем одного гетерозиготного сайта, возможны и другие гаплотипы. Альтернативно, можно использовать способы, оценивающие частоты гаплотипов в популяции без определения гаплотипов каждого индивида. Предпочтительно, если способ основывается на алгоритме максимизации математического ожидания (ЕМ) (Dempster и соавт., 1977), лежащего в основе оценок максимального правдоподобия частот гаплотипов при использовании допущения равновесия Харди-Вайнберга (случайное скрещивание) (см. Excoffier L. and Slatkin М. 1995). Данный ЕМ-алгоритм обобщает итерационный метод максимального правдоподобия для оценки, пригодной для противоречивых данных и/или неполных. ЕМ-алгоритм используют для разложения гетерозигот на гаплотипы. Оценки гаплотипов дополнительно описываются ниже под заголовком "Статистические методы". Можно использовать любой другой метод, известный в данной области техники, для определения частоты гаплотипа в популяции.
Настоящее изобретение включает также способы определения частоты гаплотипа для совокупности двуаллельных маркеров в популяции, включающие следующие стадии: а) генотипирование по меньшей мере одного двуаллельного маркера, связанного с CanIon, в соответствии со способом настоящего изобретения для каждого индивида в указанной популяции; b) генотипирование второго двуаллельного маркера в результате определения идентичности нуклеотидов по указанному второму двуаллельному маркеру для обоих копий указанного второго двуаллельного маркера, представленного в геноме каждого индивида в указанной популяции: и с) применение способа определения гаплотипа к идентичным нуклео-тидам, установленным на стадиях а) и b) для получения оценки указанной частоты. Кроме того, способы определения частоты гаплотипа настоящего изобретения включают способы с любым дополнительным ограничением, описанным в данном сообщении, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании: где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, демонстрируют нарушение равновесия по сцеплению; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, неравновесно сцеплены. Указанный способ определения гаплотипа необязательно осуществляют с помощью асимметричной ПЦР-амплификации, двойной ПЦР-амплификации специфичных аллелей, алгоритма Clark или алгоритма максимизации математического ожидания.
Анализ сцепления при нарушении равновесия
Нарушение равновесия по сцеплению представляет собой неслучайную ассоциацию аллелей по двум или более локусам и является мощным инструментом для картирования генов, участвующих в кон
- 48 -
008252
троле признаков заболевания (см. Ajioka R.S. и соавт., 1997). Двуаллельные маркеры, поскольку они компактно расположены в геноме человека и могут быть генотипированы в большем числе случаев по сравнению с другими видами генетических маркеров (такими, как RFLP- или VNTR-маркеры), особенно пригодны для генетического анализа, основанного на изучении равновесия по сцеплению.
Когда мутация заболевания впервые внедряется в популяцию (посредством новой мутации или иммиграции носителя мутации), она непременно находится в отдельной (одной) хромосоме и, поэтому, в отдельной генетической "среде" или "анцестральном" (предковом, родовом) гаплотипом связанных маркеров. Следовательно, между такими маркерами и мутацией, контролирующей заболевание, существует полное нарушение равновесия: мутация, контролирующая заболевание, обнаруживается только в присутствии специфичной группы маркерных аллелей. В течение жизни последовательных поколений между мутацией, контролирующей заболевание, и таким маркерным полиморфизмом происходят рекомби-нантные события, и указанное нарушение равновесия постепенно исчезает. Скорость этого исчезновения является функцией частоты рекомбинации, так что маркеры, ближе всего расположенные к гену, контролирующему заболевание, будут обнаруживать более высокую степень нарушения равновесия, чем отдаленные маркеры. Если не происходит нарушения в результате рекомбинаци, то "анцестральные" гапло-типы и нарушение равновесия по сцеплению между маркерными аллелями разных локусов могут прослеживаться не только в родословных, но также и в популяциях. Нарушение равновесия по сцеплению обычно наблюдается в виде ассоциации между одним специфичным аллелем одного локуса и другим специфичным аллелем второго локуса.
Паттерн или кривая нарушения равновесия между заболеванием и маркерным локусом, как ожидается, демонстрирует максимум, который наблюдается по локусу, контролирующему заболевание. Следовательно, степень сцепления при нарушении равновесия между аллелем, контролирующим заболевание, и тесно связанными генетическими маркерами может давать ценную информацию, относящуюся к местоположению гена, контролирующего данное заболевание. Для тонкого картирования локуса, контролирующего заболевание, полезно обладать определенным знанием картины сцепления при нарушении равновесия, которое существует между маркерами в исследуемой области. Как указано выше, уровень картирования, осуществляемый посредством анализа сцепления при нарушении равновесия, представляется более высоким, чем в исследованиях по сцеплению. Высокая плотность распределения двуаллель-ных маркеров, сочетаемая с анализом сцепления при нарушении равновесия, создает мощный инструмент для тонкого картирования. Разные способы, которые рассчитывают сцепление при нарушении равновесия, описаны ниже под заголовком "Статистические методы".
Популяционные исследования ассоциаций признак-маркер у больных и здоровых
Как указано выше, встречаемость пар специфичных аллелей разных локусов в одной и той же хромосоме не является случайным, а отклонение от случайности называют нарушением равновесия по сцеплению или сцеплением при нарушении равновесия. Ассоциативные исследования сосредоточены на по-пуляционных частотах и опираются на феномен нарушении равновесия по сцеплению. Если специфичный аллель данного гена непосредственно контролирует конкретный признак, его частота будет статистически выше в пораженной болезнью популяции индивидов (признак позитивный), по сравнению с частотой в популяции с негативным признаком или в случайной контрольной (здоровой) популяции. Из-за наличия нарушения равновесия по сцеплению частота всех других аллелей, представленных в данном гаплотипе, несущем аллель, контролирующий признак, будет также повышенной у индивидов с позитивным признаком по сравнению с индивидами с негативным признаком или в рандомизированной контрольной выборке. Поэтому, ассоциация между данным признаком и любым аллелем (особенно, аллелем двуаллельного маркера) при нарушении равновесия по сцеплению с аллелем, определяющим признак, будет достаточной, чтобы предположить наличие гена, контролирующего признак, в этой конкретной области. Популяции больных и здоровых можно генотипировать по двуаллельным маркерам для идентификации ассоциаций, которые точно определяют местонахождение аллеля, определяющего признак. Так любой маркер при нарушении равновесия по одному данному маркеру, связанному с признаком, будет ассоциирован с данным признаком. Нарушение равновесия по сцеплению позволяет соответствующие частоты в популяциях больных и здоровых с ограниченным числом генетических полиморфизмов (особенно двуаллельных маркеров) анализировать в качестве альтернативных при скринировании всех возможных функциональных полиморфизмов для того, чтобы найти аллели, определяющие признак. Ассоциативные исследования сопоставляют частоту маркерных аллелей в несвязанных родством популяциях больных и здоровых, и представляют мощный инструмент для изучения комплексных признаков. Популяции больных и здоровых (критерии включения)
Популяционные исследования, основанные на ассоциации, не затрагивают наследование в семьях, а сопоставляют распространение отдельного генетического маркера, или группы маркеров, в популяциях больных и здоровых. Они представляют собой исследования больных и здоровых, основанные на сравнении не связанных родством больных (пораженных заболеванием или позитивные по признаку) индивидов и не связанных родством здоровых (непораженных, отрицательных по признаку или случайных) индивидов. Предпочтительно, если контрольная группа (здоровых) составлена из непораженных заболеванием или негативных по признаку индивидов. Кроме того, данная контрольная группа этнически со
- 49 -
008252
поставима с популяцией людей, пораженных заболеванием. Более того, данная контрольная группа предпочтительно сопоставима с популяцией больных по основному известному фактору смешения для данного признака в исследовании (например, подобрана по возрасту или по зависимому от возраста признаку). Теоретически, индивидов по двум образцам объединяют таким образом, чтобы между ними ожидались различия только по своему статусу заболевания. Термины "популяция с позитивным признаком", "популяция больных" и "популяция пораженных заболеванием" используются в данном описании как взаимозаменяемые.
Существенной ступенью в изучении комплексных признаков с использованием ассоциативных исследований является подбор популяций больных и здоровых (см. Lander and Schork, 1994). Основное действие при подборе популяций больных и здоровых заключается в клиническом определении данного признака или фенотипа. Любой генетический признак можно проанализировать ассоциативным способом, предложенным в данном описании, путем тщательного подбора индивидов, которые фенотипически включаются в группы с позитивным признаком и негативным признаком. Чаще используют четыре критерия: клинический фенотип, возраст при возникновении заболевания, история семьи и отягощенность. Процедура отбора непрерывных или количественных признаков (таких как, например, артериальное давление) включает отбор индивидов на краях распределения фенотипа при исследовании данного признака так, чтобы включить в данные позитивные и негативные популяции неперекрывающиеся фенотипы. Предпочтительно, если популяции больных и здоровых составляют фенотипически гомогенные популяции. Позитивные и негативные популяции по данному признаку включают фенотипически однородные популяции индивидов, соответствующие в исследовании, каждая, 1-98%, предпочтительно 1-80%, более предпочтительно 1-50%, еще более предпочтительно 1-30%, наиболее предпочтительно 1-20% от общей популяции, и предпочтительно выбраны из индивидов, демонстрирующих неперекрывающиеся фенотипы. Чем четче разница между двумя фенотипами по данному признаку, тем больше вероятность обнаружения ассоциации с двуаллельными маркерами. Отбор таких резко отличных и, вместе с тем, относительно однородных фенотипов делает возможным эффективное сравнение в ассоциативных исследованиях и вероятное обнаружение четких различий на генетическом уровне, при условии, что размеры по-пуляционных выборок для исследования довольно значительны.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения первая группа из 50-300 индивидов с позитивным признаком, предпочтительно около 100 индивидов, набрана в соответствии с их фенотипами. Аналогичное количество контрольных индивидов также включены в такие исследования.
Ассоциативный анализ
Настоящее изобретение включает также способы выявления ассоциации между генотипом и фенотипом, включающие следующие стадии: а) определение частоты, по меньшей мере, одного двуаллельно-го маркера, связанного с CanIon, в популяции с позитивным признаком, в соответствии со способом ге-нотипирования настоящего изобретения; b) определение частоты указанного двуаллельного маркера, связанного с CanIon, в контрольной популяции, в соответствии со способом генотипирования настоящего изобретения; и с) определение существования статистически значимой ассоциации между указанным генотипом и указанным фенотипом. Кроме того, указанные способы выявления ассоциации между генотипом и фенотипом в настоящем изобретении включают способы для любого дополнительного ограничения, описанного в данном описании, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании: где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены; указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены. Указанная контрольная популяция может необязательно представлять собой популяцию с негативным признаком или произвольную популяцию. Каждую из указанных стадий генотипирования а) и b) необязательно осуществлять на объединенном биологическом образце, полученном от каждой указанной популяции. Каждую из указанных стадий генотипирования а) и b) необязательно осуществлять отдельно на биологических образцах, полученных от каждого индивида в указанной популяции или в ее субвыборке.
Общая методология осуществления ассоциативных исследований с использованием двуаллельных маркеров, полученных из области, несущей ген-кандидат, заключается в обследовании двух групп индивидов (популяции больных и здоровых) с тем, чтобы измерить и статистически сравнить аллельные частоты двуаллельных маркеров настоящего изобретения в обоих группах.
Если статистически значимая ассоциация с признаком идентифицируется, по меньшей мере, для одного или более анализируемых двуаллельных маркеров, то следует предположить, что, либо ассоциируемый аллель непосредственно ответствен за определяемый им признак (т. е. ассоциированный аллель представляет собой аллель, определяющий данный признак), либо, что более вероятно, данный ассоциированный аллель неравновесно сцеплен с аллелем, определяющим данный признак. Специфические характеристики ассоциированного аллеля относительно функции гена-кандидата, как правило, дают до
- 50 -
008252
полнительное представление о взаимосвязи ассоциированного аллеля и данного признака (причинно-следственную взаимосвязь или сцепление при нарушении равновесия). Если данные факты указывают, что данный ассоциированный аллель в данном гене-кандидате, вероятнее всего, не является аллелем, определяющим данный признак, но вместе с тем, неравновесно сцеплен с подлинным аллелем, определяющим данный признак, тогда аллель, определяющий данный признак, можно обнаружить путем сек-венирования вблизи ассоциированного маркера и осуществить дальнейшие ассоциативные исследования полиморфизма, который обнаружен итеративным образом.
Ассоциативные исследования осуществляют, как правило, в две последовательные стадии. В первой фазе (на первой стадии) частоты приведенных двуаллельных маркеров гена-кандидата определяют для популяций с позитивным признаком и для контрольных популяций. Во второй фазе (на второй стадии) анализа позицию генетических локусов, ответственных за данный признак, дополнительно уточняют с использованием маркеров повышенной плотности из значимой области. Однако, если исследуемый ген-кандидат относительно невелик по длине, как в случае с CanIon, одной стадии может оказаться достаточно для установления значимых ассоциаций.
Анализ гаплотипов
Как указано выше, когда хромосома, несущая аллель заболевания, впервые появляется в популяции, то ли в результате мутации, то ли миграции, мутантный аллель непременно находится на хромосоме, обладающей группой сцепленных маркеров: анцестральный гаплотип. Данный гаплотип можно проследить в популяциях и проанализировать его статистическую ассоциацию с данным признаком. Исследования комплементирующей одиночной (аллельная) ассоциации вместе с мультиточечными ассоциативными исследованиями, именуемыми также гаплотипными исследованиями, повышают статистическую мощность ассоциативных исследований. Поэтому, изучение гаплотипной ассоциации позволяет определить частоту и тип анцестрального носителя гаплотипа. Анализ гаплотипа важен тем, что он повышает возможность статистического анализа рассматриваемых индивидуальных маркеров.
На первой стадии частотного анализа гаплотипов определяют частоту возможных гаплотипов на основе различных сочетаний идентифицированных двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Затем данную частоту гаплотипов сравнивают в отдельных популяциях индивидов с позитивным признаком и контрольными. Количество индивидов с позитивным признаком, в большинстве случаев между 30 и 300, с предпочтительной численностью индивидов, колеблющейся между 50 и 150, подвергают данному анализу для получения статистически значимых результатов. Эти же соображения применяют к используемым в данном исследовании численностям индивидов, непораженных заболеванием (или случайно выбранным здоровым индивидам). По результатам этого первого анализа получают частоты гап-лотипа для популяций больных и здоровых, для каждой определяют частоту гаплотипа, р-значение и рассчитывают соотношение баллов. При обнаружении статистически значимой ассоциации относительный риск для индивида, несущего данный гаплотип, который соответствует пораженному данным исследуемым признаком, может быть аппроксимирован (приблизительно точным).
Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способы обнаружения ассоциации между гаплотипом и фенотипом, включающими стадии: а) оценки частоты, по меньшей мере, одного гаплотипа в популяции с позитивным признаком, в соответствии со способом настоящего изобретения оценки частоты гаплотипа; b) оценки частоты указанного гаплотипа в контрольной популяции, в соответствии со способом настоящего изобретения оценки частоты гаплотипа; и с) определения статистически значимой ассоциации, существующей между указанным гаплотипом и указанным фенотипом. Кроме того, данные способы обнаружения ассоциации между гаплотипом и фенотипом настоящего изобретения включают способы с любым дополнительным ограничением, где указанный двуал-лельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или данные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, неравновесно сцеплены; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или данные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, обнаруживают нарушение равновесия по сцеплению; где указанный двуаллельный маркер, связанный с CanIon, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или данные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, неравновесно сцеплены. Указанная контрольная популяция необязательно представляет собой негативную по признаку популяцию или произвольную популяцию. Указанный способ необязательно включает дополнительные стадии определения фенотипа в указанной позитивной по признаку популяции и в указанной контрольной популяции перед стадией с).
Анализ взаимодействия
Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно также использовать для идентификации паттернов двуаллельных маркеров, ассоциированных с выявляемыми признаками, полученными в полигенном взаимодействии. Анализ генетического взаимодействия между аллелями несцепленных локусов требуют индивидуального генотипирования с использованием описанных в данном описании методов. Анализ аллельного взаимодействия в выбранной совокупности двуаллельных маркеров с соответствующим уровнем статистической значимости можно рассматривать в качестве гаплотипного анализа. Анализ взаимодействия включает стратификацацию популяций больных и здоровых относительно данного гаплотипа
- 51 -
008252
для первого локуса и осуществление гаплотипного анализа по второму локусу в каждой субпопуляции.
Статистические методы, используемые для исследования ассоциации, дополнительно описаны ниже. Проверка сцепления при наличии ассоциации
Двуаллельные маркеры настоящего изобретения могут использоваться, кроме того, в TDT (тест передача/нарушение равновесия). TDT проверяет сцепление и ассоциацию и не изменяется при популяци-онной стратификации. TDT нуждается в данных по пораженным заболеванием индивидам и их родителям или в данных от непораженных заболеванием сибсов, но не их родителей (см. Spielman S. и соавт., 1993; Schaid D.J. и соавт., 1996, Spielman S. and Ewens W.J., 1998). Такие объединенные тесты уменьшают, как правило, количество ложно-позитивных ошибок при раздельном анализе.
Статистические методы
Вообще, любой способ, известный в данной области техники, можно использовать для проверки статистически значимой корреляции признака и генотипа.
1) Способы анализа сцепления.
Статистические методы и компьютерные программы, пригодные для анализа сцепления, хорошо известны специалистам в данной области техники (см. Terwilliger J.D. and Ott J., 1994; Ott J., 1991).
2) Способы оценки частот гаплотипов в популяции.
Как указано выше, при подсчете генотипов часто невозможно отличить гетерозиготы так, чтобы можно было легко подсчитать частоты гаплотипов. Если гаметическая фаза неизвестна, то оценить гап-лотипные частоты можно из мультилокусных генотипических данных. Любой способ, известный специалисту в данной области техники, можно использовать для оценки гаплотипных частот (см. Lange К., 1997; Weir, B.S., 1996). Предпочтительно, максимально-правдоподобные частоты гаплотипов подсчитывают с использованием алгоритма максимизации математического ожидания (ЕМ) (см. Dempster и соавт., 1977; Excoffier L. and Slatkin M., 1995). Данная операция представляет собой итерационный процесс, нацеленный на получение максимально правдоподобных оценок частот гаплотипов по данным мультило-кусного генотипа, когда гаметическая фаза неизвестна. Гаплотипные оценки осуществляют, как правило, путем применения ЕМ-алгоритма с использованием, например, EM-HAPLO-программы (Hawley M.E. и соавт., 1994) или Arlequin-программы (Schneider и соавт., 1997). ЕМ-алгоритм представляет собой обобщенный итерационный метод максимального правдоподобия для оценивания и кратко описан ниже.
Следует учесть, что в представленном разделе "Способы оценки частот гаплотипов в популяции" фенотипы относятся к мультилокусным генотипам неизвестной гаплотипной фазы. Генотипы относятся к мультилокусным генотипам известной гаплотипной фазы.
Предположим, имеется выборка из N не связанных родством индивидов, типированных по К маркерам. Данные исследования представлены К-локусными фенотипами неизвестной фазы, которые можно распределить в качестве F разных фенотипов. Далее, допустим, что мы имеем H возможных гаплотипов (для случая К двуаллельных маркеров мы имеем максимальное число возможных гаплотипов Н=2К).
Для фенотипа] с Cj возможных генотипов имеем:
Р, =%РК*енотип(0) = i> (**A)
м Уравнение 1
где Pj означает вероятность фенотипа j, a P(hk,hi) означает вероятность генотипа i, составленного гап-лотипами hk и hi. При случайном скрещивании (т.е. равновесие Харди-Вайнберга), P(hk,hi) выражено в виде:
P(hk,hl) = P(hk)2для Ьь = Ь
P(hk ,h,) = 2P(hk )P(ht) для hk Ф h{ Уравнение 2
Е-М-алгоритм состоит из следующих стадий. Первая, генотипические частоты оценивают из совокупности исходных значений гаплотипных частот. Эти гаплотипные частоты обозначают как P1(0), Р2(0), Р3(0), Рн(0). Исходные значения гаплотипных частот можно получить с помощью генератора случайных чисел или каким-либо иным образом, хорошо известным в данной области техники. Данная стадия называется стадией Ожидания. Следующая стадия данного способа, названная стадией Максимизации, заключается в использовании оценок генотипических частот, которые пересчитаны для гаплотипных частот. Первая итерация оценок гаплотипной частоты обозначается при помощи P1(1), Р2(1), Р3(1), Рл(1). В итоге стадия Ожидания на итерации s состоит из вычисления вероятности размещения каждого фенотипа в различные вероятностные генотипы, основанные на гаплотипных частотах в предшествующей итерации:
Уравнение 3
где nj равно числу индивидов с фенотипом j, a Pj(hk,hi)(s) является вероятностью генотипа hk,hi в фенотипе j. На стадии Максимизации, которая эквивалентна методу подсчета генов (Smith, АПП. Hum. Genet., 21:254-276, 1957), гаплотипные частоты переоценивают на основании генотипических оценок:
- 52 -
008252
Jmi Уравнение 4
где 5it представляет собой показатель изменчивости, в котором подсчитывается величина встречаемости, с которой гаплотип t представлен в генотипе i; он имеет значения 0, 1 и 2.
ЕМ-итерации прекращают при достижении следующего критерия. При использовании расчетных оценок по методу максимального правдоподобия (MLE) можно допустить, что фенотипы j распределяются полиномиально. В каждой итерации s можно вычислить одну L-функцию правдоподобия. Сходимость достигается при разнице лог-правдоподобия между двумя последовательными итерациями, равной некоему малому числу, предпочтительно 10-7.
3) Способы вычисления сцепления между маркерами при нарушении равновесия.
Ряд методов могут использоваться для вычисления сцепления при нарушении равновесия по между любыми двумя генетическими позициями, практически сцепление при нарушении равновесия оценивают, используя статистический тест на ассоциацию для гаплотипных данных, взятых из популяции.
Сцепление при нарушении равновесия между любой парой двуаллельных маркеров, включающей по меньшей мере один из двуаллельных маркеров настоящего изобретения (Mi, Mj), имеющих аллели (ai/bi) по маркеру Mi и аллели (ajbj) по маркеру Mj, можно вычислить для каждой аллельной комбинации (a;,aj; a;,bj; и b;,aj), в соответствии с формулой Piazza:
Amj= V04 - V (94 + 63) (04 +92)
где
64=__=частоте генотипов, не обладающих аллелем ai для Mi и не обладающих аллелем aj для Mj
63=_+=частоте генотипов, не обладающих аллелем ai для Mi и обладающих аллелем aj для Mj 62=+_=частоте генотипов, обладающих аллелем ai для Mi и не обладающих аллелем aj для Mj Сцепление при нарушении равновесия (LD) между парами двуаллельных маркеров (Mi, Mj) можно также вычислить для каждой аллельной комбинации (ai, aj; ai, bj; bi,aj и bi,bj) в соответствии с оценкой максимального правдоподобия (MLE) для дельта (объединенный коэффициент нарушения генотипиче-ского равновесия), как описано у Weir (Weir B.S., 1996). MLE для объединенного коэффициента сцепления при нарушении равновесия равна:
Daiaj= (2nj + n2 + п3 + iu/2)/N - 2(рг(а;). pr(aj)) где n1=E фенотипа (ai/ai, aj/aj). n2=E фенотипа (ai/ai, aj/bj), n3=E фенотипа (ai/bi, aj/aj), n4=E фенотипа (ai/bi, aj/bj) и N равно числу индивидов в данной выборке.
Данная формула позволяет оценить нарушение равновесия по сцеплению между аллелями, только при наличии данных по генотипу, а не по гаплотипу.
Другой способ вычисления сцепления при нарушении равновесия между маркерами заключается в следующем. Для сцепленных двуаллельных маркеров, Mi(ai/bi) и Mj(aj/bj), аппроксимирующих равновесие Харди-Вайнберга, можно оценить частоты четырех возможных гаплотипов в данной популяции в соответствии с методом, описанным выше.
Оценка гаметического нарушения равновесия между ai и aj проста:
Daiaj = pr( womun (а,-, aj )) - pr (a f- ).pr(a j )
где pr(ai) означает вероятность аллеля a pr(aj) означает вероятность аллеля a, и где РГ( гаплотип (ai,aj)) оценивается, как указано выше в уравнении 3.
Для сцепленного двуаллельного маркера необходимо провести только одно измерение нарушения равновесия, чтобы описать ассоциацию между Mi и Mj.
Затем нормируют полученное выше значение и рассчитывают следующим образом: D'aiaj = Daiaj / ШЭХ (-prfa). prfcj) , -pr(bj). pr(bj)) при Daiaj <0
D'aiaj = Daiaj / max (pr(bj). pr(aj) , pr(aj). pr(bj)) при Daiaj> 0
Специалистам легко понять, что можно использовать и другие способы вычисления сцепления при нарушении равновесия.
Сцепление при нарушении равновесия в группе двуаллельных маркеров, обладающих адекватным уровнем гетерозиготности, можно определить путем генотипирования 50-1000 не связанных родством индивидов, предпочтительно 75-200, более предпочтительно около 100.
4) Проверка на ассоциацию.
Способы определения статистической значимости корреляции между фенотипом и генотипом, в данном случае аллеля в двуаллельном маркере или гаплотипа, слагаемых из таких аллелей, можно найти с помощью любого статистического теста, известного в данной области техники при любом приемлемом пороге статистической значимости, который требуется. Применение конкретных способов и порогов значимости находится в компетенции среднего специалиста в данной области техники.
Проверку на ассоциацию осуществляют путем определения частоты аллеля двуаллельного маркера в больной и контрольной популяциях и сравнения данных частот с помощью статистического критерия, чтобы определить является ли их различие частот статистически значимым, что должно указывать на
- 53 -
008252
корреляцию между исследуемым данным признаком и аллелем двуаллельного маркера. Подобным образом осуществляют анализ гаплотипа путем определения частот всех возможных гаплотипов для данной группы двуаллельных маркеров в больной и контрольной популяциях, и сравнивают эти частоты с помощью статистического критерия, чтобы определить, соответствует ли их статистически значимое различие корреляции между исследуемым гаплотипом и фенотипом (признаком). Можно использовать любой статистический инструмент, пригодный для проверки статистически значимой ассоциации между генотипом и фенотипом. В качестве статистического критерия предпочтительно использовать критерий хи-квадрат с одной степенью свободы. Вычисляют Р-значение (Р-значение является вероятностью того, что статистический результат большой или больше, чем наблюдаемая величина для случайного события).
Статистическая значимость
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, значимость для целей диагностики, либо в качестве позитивного основания для дальнейших диагностических тестов или в качестве предварительной начальной точки для ранней превентивной терапии, р-значение, связанное с ассоциацией двуаллельного маркера, составляет предпочтительно около 1 х 10-2 или меньше, более предпочтительно около 1 х 10-4 или меньше, для анализа одного двуаллельного маркера, и около 1 х 10-3 или меньше, еще более предпочтительно 1 х 10-6 или меньше и наиболее предпочтительно около 1 х 10-8 или меньше, для гаплотипного анализа, рассматривающего два или более маркера. Считают, что данные значения приложимы к любым исследованиям по ассоциации, рассматривающим одиночный маркер или их множественное сочетание.
Специалисты могут использовать область значений, изложенных выше, в качестве исходной точки для осуществления исследований по ассоциации с двуаллельными маркерами настоящего изобретения. При этом могут обнаружиться значимые ассоциации между двуаллельными маркерами настоящего изобретения и признаком, которые используются для целей диагностики и лекарственного скринирования.
Фенотипическая перестановка
Чтобы подтвердить обнаруженную выше статистическую значимость гаплотипного анализа на первой стадии, можно было бы осуществить последующий анализ, в котором данные по больным и здоровым индивидам объединяются и рэндомизируются в отношении данного фенотипического признака. Данные каждого индивидуального генотипирования распределяются случайным образом на две группы, которые содержат одинаковое число индивидов по больной и здоровой популяциям, используемых для составления данных, полученных на первой стадии. Вторая стадия гаплотипного анализа предпочтительно осуществляется на этих искусственных группах, предпочтительно по маркерам, включенным в данный гаплотипный анализ первой стадии, демонстрируя наивысший относительный коэффициент риска. Данный эксперимент повторяют, предпочтительно, по меньшей мере, 100-1000 раз. Повторяемые итерации позволяют определить вероятность случайного тестирования гаплотипа.
Определение статистической ассоциации
Обращаясь к проблеме ложных позитивов, можно осуществить сходный анализ для случайных геномных областей у тех же больных и контрольных популяциях. Результаты для случайных областей и кандидатной области сравнивают, как описано в находящейся на рассмотрении предварительной патентной заявке США с названием "Способы, программное и аппаратное обеспечение для идентификации геномных областей гена, ассоциированного с обнаруживаемым признаком", порядковый номер 60/107986, поданной 10 ноября 1998г., содержание которой включено в данное описание путем ссылки.
5) Оценка факторов риска.
Ассоциация между фактором риска (в генетической эпидемиологии фактор риска подразумевает наличие или отсутствии некоего аллеля или гаплотипа в маркерных локусах) и заболеванием измеряется соотношением шансов (OR) и относительным риском (RR). Когда P(R+) представляет собой вероятность развития заболевания у индивидов с R, a P(R-) представляет собой вероятность для индивидов в отсутствие фактора риска, тогда относительный риск равен просто соотношению двух вероятностей, то есть:
RR=P(R+)/P(R)
В исследованиях заболевание-контроль прямое измерение относительного риска осуществить невозможно из-за выборочного обследования. Однако соотношение шансов обеспечивает достаточно хорошую аппроксимацию относительного риска для редко встречающихся заболеваний и может быть вычислено:
" F+
1-F\
OR=(F+/(l-F+))/(FV(l-F-))
F+ представляет собой частоту выявляемости фактора риска в популяции больных, a F- представляет собой частоту выявляемости фактора риска в контроле. F+ и F- вычисляют с использованием аллельных или гаплотипных частот в данном исследовании и зависят от лежащей в основании генетической модели (доминантной, рецессивной, аддитивной...).
Можно также оценить атрибутивный риск, который описывает пропорцию индивидов в популяции, обнаруживающей признак, связанный с данным риском. Данное измерение представляется важным для
- 54 -
008252
количественного определения роли специфичного фактора в этиологии заболевания и в рамках влияния фактора риска на здравоохранение. Важность данного измерения для здравоохранения лежит в определении доли случаев заболевания в данной популяции, которые можно было бы предупредить, если бы не отсутствие проявления интереса. AR определяют следующим образом:
AR=PE (RR-1) / (РЕ (RR-1) +1)
AR означает риск, свойственный аллелю двуаллельного маркера или гаплотипу двуаллельного маркера. РЕ означает частоту проявления аллеля или гаплотипа в популяции в целом; a RR означает относительный риск, который, являясь аппроксимированным для соотношения шансов, при исследовании данного признака, обладает относительно низкой частотой в генеральной совокупности.
Идентификация двуаллельных маркеров при нарушении равновесия для двуаллельных маркеров настоящего изобретения
После идентификации первого двуаллельного маркера в представляющей интерес геномной области, специалисты в данной области техники, используя указания настоящего изобретения, могут легко идентифицировать дополнительные двуаллельные маркеры, сцепленные при нарушении равновесия с данным первым маркером. Как указано ранее, любой маркер, сцепленный при нарушении равновесия с первым маркером, ассоциированным с признаком, будет ассоциироваться с данным признаком. Поэтому, после ассоциации, продемонстрированной между данным двуаллельным маркером и признаком, обнаружение дополнительных двуаллельных маркеров, ассоциированных с данным признаком, представляет большой интерес для того, чтобы увеличить плотность двуаллельных маркеров в данной конкретной области. Каузальный ген или мутация будут обнаруживаться вблизи данного маркера или группы маркеров, демонстрируя наивысшую корреляцию с данным признаком.
Идентификация дополнительных маркеров в сцеплении при нарушении равновесия с данным маркером включает: (а) амплификацию геномного фрагмента, включающего первый двуаллельный маркер, у множества индивидов; (b) идентификацию вторых двуаллельных маркеров в данной геномной области, несущей указанный первый двуаллельный маркер; (с) проведение анализа нарушения равновесия сцепления между указанным первым двуаллельным маркером и вторыми двуаллельными маркерами; и (d) отбор указанного второго двуаллельного маркера, который сцеплен при нарушении равновесия с указанным первым маркером.
Рассматриваются также субкомбинации, включающие стадии (b) и (с).
Способы идентификации двуаллельных маркеров и проведения описанного в данном описании анализа сцепления при нарушении равновесия может осуществить специалист без чрезмерного экспериментирования. Настоящее изобретение рассматривает также двуаллельные маркеры, которые находятся в состоянии нарушения равновесия по сцеплению с двуаллельными маркерами А1-А18 и которые, как ожидается, представлены аналогичными характеристиками в рамках их соответствующей ассоциации с данным признаком.
Идентификация функциональных мутаций
Мутации по CanIon-гену, которые ответственны за выявляемый фенотип или признак, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей СаnIоn-гена индивидов с позитивным признаком и контрольных индивидов. После того, как позитивная ассоциация подтверждена с помощью двуал-лельного маркера настоящего изобретения, идентифицированный локус можно просканировать в отношении наличия мутаций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, функциональные области, такие как экзоны и сайты сплайсинга, промоторы и другие регуляторные области CanIon-гена, сканируют на наличие мутаций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность CanIon-гена сравнивают у индивидов с позитивным признаком и у контрольных индивидов. Предпочтительно, если показаны индивиды с позитивным признаком, несущие гаплотип, который ассоциирован с данным признаком, и индивиды с негативным признаком, не несущие гаплотип или аллель, ассоциированный с данным признаком. Обнаруживаемый признак или фенотип может включать различные проявления изменений CanIon-функции.
Метод выявления мутации в сущности аналогичен методу, используемому для идентификации дву-аллельного маркера. Способ, используемый для обнаружения таких мутаций, включает, как правило, следующие стадии:
амплификации области CanIon-гена, включающей двуаллельный маркер или группу двуаллельных маркеров, ассоциированных с данным признаком в образцах ДНК пациентов с позитивным признаком и образцах ДНК людей в контроле;
секвенирования амплифицированной области;
сравнения последовательностей ДНК индивидов с позитивным признаком и индивидов в контроле; определения мутаций, специфичных для пациентов с позитивным признаком.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов. Затем, путем скринирования целесообразно проверить более крупные популяции больных и здоровых с помощью любого метода генотипирования, который описан в данном описании, предпочтительно с использованием метода микросеквенирования в индивидуальном тест-варианте. Полиморфизм рассматривают в виде кандидатных мутаций при наличии
- 55 -
008252
частот у больных и в контроле, сопоставимых с ожидаемыми результатами по ассоциации. Полиморфизм рассматривают в виде кандидатных "признак-определяющих" мутаций, если они обнаруживают статистически значимую корреляцию с выявляемым фенотипом.
Двуаллельные маркеры настоящего изобретения в способах генетического диагностирования CanIon-последовательность нуклеиновой кислоты и двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно также использовать для создания диагностических тестов (диагностикумов), способных идентифицировать индивиды, генотипы которых несут риск развития выявляемого признака в последующее время. Такой диагноз может быть пригоден для определения, мониторинга, прогноза и/или профилактики или лечения многочисленных заболеваний или состояний, включая шизофрению, биполярное расстройство и другие нарушения ЦНС, такие как эпилепсия и нарушения болевых ощущений, сердечнососудистые состояния, такие как порок сердца, гипертензия, аритмия, и многочисленные другие заболевания и состояния.
Методы диагностики настоящего изобретения могут использовать различные методологии для определения присутствия у обследуемого человека паттерна двуаллельного маркера, ассоциированного с повышенным риском развития выявляемого признака, или у индивида, страдающего от выявляемого признака, как результата конкретной мутации, включая способы, которые делают возможным анализ индивидуальных хромосом для гаплотипирования, такие как исследование семей, ДНК-анализ отдельного спермия или соматических гибридов.
В настоящем изобретении созданы диагностические способы определения индивида с риском развития заболевания или страдающего от заболевания, возникшего в результате мутации или полиморфизма в CanIon-гене. В настоящем изобретении созданы также способы определения индивида, обладающего восприимчивостью к шизофрении и биполярному расстройству, или к любому другому состоянию, связанному с кальциевыми каналами, известному в данной области техники и описанному в данном описании.
Данные способы включают получение образца нуклеиновой кислоты от данного индивида и определение в образце нуклеиновой кислоты наличия по меньшей мере одного аллеля или по меньшей мере одного гаплотипа двуаллельного маркера, свидетельствующего о риске развития данного признака, или свидетельствующего о том, что у данного индивида проявляется данный признак из-за обладания конкретным CanIon-полиморфизмом или конкретной мутацией (аллельопределяющий признак).
Предпочтительно, для таких диагностических способов образец нуклеиновой кислоты получают от данного индивида и данный образец генотипируют с использованием способов, описанных выше в разделе "Способы генотипирования образцов ДНК по двуаллельным маркерам". Данная диагностика может основываться на одиночном двуаллельном маркере или на группе двуаллельных маркеров.
В каждом из этих способов образец нуклеиновой кислоты получают от обследуемого субъекта, после чего определяют паттерн двуаллельного маркера одного или нескольких двуаллельных маркеров А1-А18.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения на образце нуклеиновой кислоты осуществляют ПЦР-амплификацию, чтобы амплифицировать области, в которых идентифицируют полиморфизм, ассоциированный с выявляемым фенотипом. Полученные продукты амплификации секве-нируют для определения индивидуального обладания одним или несколькими CanIon-полиморфизмами, ассоциированными с выявляемым фенотипом. Праймеры, используемые для получения продуктов амплификации, могут включать праймеры, приведенные в табл. 1. Альтернативно, данный образец нуклеиновой кислоты подвергают реакциям микросеквенирования, как описано выше, для определения индивида, обладающего одним или несколькими CanIon-полиморфизмами, ассоциированными с выявляемым фенотипом, возникшим в результате мутации или полиморфизма в CanIon-гене. Праймеры, используемые в реакциях микросеквенирования, могут включать праймеры, приведенные в табл. 4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данный образец нуклеиновой кислоты контактирует с одним или несколькими аллельспецифичными олигонуклеотидными зондами, которые специфически гиб-ридизуются с одним или несколькими CanIon-аллелями, ассоциированными с выявляемым фенотипом. Зонды, используемые для гибридизационного анализа, включают зонды, приведенные в табл. 3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, данный образец нуклеиновой кислоты контактирует со вторым CanIon-олигонуклеотидом, способным произвести продукт амплификации при использовании с аллельспецифичным олигонуклеотидом в реакции амплификации. Присутствие продукта амплификации в данной реакции амплификации свидетельствует о том, что данный индивид обладает одним или несколькими CanIon-аллелями, ассоциированными с выявляемым фенотипом.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определяется идентичность определенного нуклеотида, присутствующего по меньшей мере в одном двуаллельном маркере, выбранном из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, и выявляемым признаком, является шизофрения и биполярное расстройство. Диагностический набор включает любой из полинуклеотидов настоящего изобретения.
Такие диагностические способы чрезвычайно полезны и при некоторых обстоятельствах могут использоваться для инициации превентивного лечения или для учета индивида, несущего значимый гапло-тип, который предвосхищает диагностические знаки, такие как минорные симптомы.
Диагностика, которая анализирует и предсказывает реакцию на лекарственное средство или побоч
- 56 -
008252
ные эффекты на лекарственное средство, может использоваться для определения индивида, нуждающегося в лечении с помощью конкретного лекарственного средства. Например, если диагноз указывает на вероятность того, что индивид будет положительно реагировать на лечение конкретным лекарственным средством, то данное лекарственное средство можно назначать данному индивиду. Напротив, если диагноз свидетельствует, что индивид, вероятно, реагирует отрицательно на лечение конкретным лекарственным средством, можно предписать альтернативный курс лечения. Отрицательную реакцию можно определить как отсутствие эффективной реакции или наличие токсических побочных эффектов.
Клинические испытания лекарственного средства представляют собой другое применение для маркеров настоящего изобретения. Один или несколько маркеров, показывающих реакцию на агент, действующий против шизофрении или биполярного расстройства или иного состояния, связанного с кальциевыми каналами, или показывающих реакцию в виде побочных эффектов на агент, действующий против шизофрении или биполярного расстройства, или иного состояния, связанного с кальциевыми каналами, можно идентифицировать с использованием описанных выше способов. Соответственно, потенциальных участников клинических испытаний такого агента можно скринировать для идентификации индивидов, которые вероятнее всего положительно отреагируют на данное лекарственное средство, и для исключения тех, которые, вероятно, испытают побочные эффекты. Таким образом, эффективность лекарственного лечения можно измерить у индивидов, которые положительно реагируют на данное лекарственное средство, без снижения измеряемости в результате включения индивидов, которые едва ли отреагируют положительно в данном исследовании, и без риска возникновения нежелательных проблем, связанных с безопасностью.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения данный признак, который представляет собой шизофрению или биполярное расстройство, анализируют с использованием представленных диагностик. Вместе с тем, настоящее изобретение также включает в себя любой из описанных в данном описании превентивных, диагностических, прогностических и терапевтических способов с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения в способах, предупреждающих, диагностирующих, управляющих или лечащих родственные заболевания, особенно связанные с расстройствами ЦНС. В примере осуществления родственные заболевания могут включать психотические нарушения, расстройства эмоционального состояния, аутизм, зависимость от химических веществ и алкоголизм, нарушение болевых ощущений, эпилепсию, задержку психического развития и другие психические заболевания, включая когнитивную функцию, страх, нарушение функции принятия пищи, нарушение функции мотивации и расстройство личности, которые определяются в соответствии с четвертым изданием классификации Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV). Другие нарушения включают сердечно-сосудистые расстройства, такие как стенокардия, гипертензия или аритмии.
Рекомбинантные векторы
Используемый в данном описании термин "вектор" подразумевает кольцевую или линейную молекулу ДНК или РНК, которая является двухцепочечной либо одноцепочечной, и которая включает, по меньшей мере, один полинуклеотид, представляющий интерес, который требуется перенести в клетку-хозяина или в одноклеточный, или в многоклеточный организм-хозяин.
Настоящее изобретение включает в себя семейство рекомбинантных векторов, которые включают регуляторный полинуклеотид, полученный из CanIon-геномной последовательности, и/или кодирующий полинуклеотид либо из CanIon-геномной последовательности, либо из кДНК-последовательности.
Как правило, рекомбинантный вектор настоящего изобретения может включать любой из описанных в данном описании полинуклеотидов, включая регуляторные последовательности, кодирующие последовательности и полинуклеотидные конструкции, а также любой CanIon-праймер или зонд, как указано выше. В частности, рекомбинантные векторы настоящего изобретения могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделе "Геномные последовательности CanIon-гена", в разделе "CanIon-кДНК-последовательности", в разделе "Кодирующие области", в разделе "Полинуклеотидные конструкции" и в разделе "Олигонуклеотидные зонды и праймеры".
В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный вектор настоящего изобретения используют для амплификации встраиваемого полинуклеотида, полученного из геномной последовательности SEQ ID No 1-3 или 6 или CanIon-кДНК, например, кДНК с SEQ ID No 4, в соответствующей клетке-хозяине, данный полинуклеотид амплифицируется каждый раз, когда происходит репликация данного рекомбинантного вектора.
Другой предпочтительный вариант осуществления рекомбинантных векторов, в соответствии с настоящим изобретением, включает экспрессионные векторы, включающие либо регуляторный полинук-леотид, либо кодирующую нуклеиновую кислоту настоящего изобретения, либо и тот, и другую. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессионные векторы используют для экспрессии CanIon-полипептида, который затем можно выделить очисткой и, например, использовать в анализе по скринированию лиганда или в качестве иммуногена с тем, чтобы вызвать продукцию специфичных антител, направленных против CanIon-белка. В других вариантах осуществления настоящего изобретения данные экспрессионные векторы используют для создания трансгенных животных, а также для генотерапии. Экспрессия требует, чтобы в векторах создавались соответствующие сигналы, причем ука
- 57 -
008252
занные сигналы включают различные регуляторные элементы, такие как энхансеры/промоторы из источников вируса и млекопитающих, которые приводят в действие в клетках-хозяевах экспрессию интересующих генов. Доминантные лекарственные селективные маркеры для создания долговременных стабильных клеточных клонов, экспрессирующих данные продукты, как правило, включены в экспрессион-ные векторы настоящего изобретения, так как они являются элементами, которые связывают экспрессию данных лекарственных селективных маркеров с экспрессией данного полипептида.
Более подробно, настоящее изобретение относится к экспрессионным векторам, которые включают нуклеиновые кислоты, кодирующие CanIon-белок, предпочтительно CanIon-белок аминокислотной последовательности SEQ ID No 5, или его варианты или фрагменты.
Настоящее изобретение относится также к рекомбинантному экспрессионному вектору, пригодному для экспрессии CanIon-кодирующей последовательности, где указанный вектор включает нуклеиновую кислоту SEQ ID No 4.
Рекомбинантные векторы, включающие нуклеиновую кислоту, содержащую двуаллельный маркер, связанный с CanIon, также являются частью настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.
Некоторые элементы, которые можно найти в векторах настоящего изобретения, описаны более подробно в нижеследующих разделах.
Настоящее изобретение включает также первичные, вторичные, иммортализованные гомологично рекомбинантные клетки-хозяева позвоночных, предпочтительно млекопитающих и, в частности, человека, которые были созданы биотехнологически для: а) встраивания экзогенных (гетерологичных) поли-нуклеотидов в эндогенную хромосомную ДНК гена-мишени, b) удаления эндогенной хромосомной ДНК, и/или с) замены эндогенной хромосомной ДНК экзогенными полинуклеотидами. Вставки, делеции и/или замены полинуклеотидных последовательностей могут представлять собой кодирующие последовательности гена-мишени и/или регуляторные области, такие как промоторные и энхансерные последовательности, функционально присоединенные к гену-мишени.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу создания гомологичной рекомбинантной клетки-хозяина in vitro или in vivo, в котором экспрессия гена-мишени, аномально экспрессируемого в данной клетке, изменяется. Предпочтительно изменение вызывает экспрессию данного гена-мишени в нормальных условиях роста или в условиях, пригодных для продуцирования полипептида, кодируемого данным геном-мишенью. Данный способ включает следующие стадии: (а) трансфицирования данной клетки in vitro или in vivo при помощи полинуклеотидной конструкции, причем данная полинуклеотид-ная конструкция включает: (i) нацеливающую последовательность; (ii) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; и (iii) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется, в результате чего продуцируется трансфицированная клетка; и (b) сохранения данной трансфи-цированной клетки in vitro или in vivo в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации.
Настоящее изобретение относится, кроме того, к способу изменения экспрессии гена-мишени в клетке in vitro или in vivo, где данный ген экспрессируется в данной клетке аномально, включающему следующие стадии: (а) трансфицирования данной клетки in vitro или in vivo полинуклеотидной конструкцией, причем данная полинуклеотидная конструкция включает: (i) нацеливающую последовательность; (ii) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; (iii) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется, в результате чего продуцируется трансфицированная клетка; и (b) сохранения данной трансфицированной клетки in vitro или in vivo в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации, посредством которой продуцируется гомологично рекомбинантная клетка; и (с) сохранения гомологично рекомбинантной клетки in vitro или in vivo в условиях, подходящих для экспрессии данного гена.
Кроме того, настоящее изобретение имеет отношение к способу создания полипептида настоящего изобретения путем изменения экспрессии целевого эндогенного гена в клетке in vitro или in vivo, где данный ген экспрессируется в данной клетке аномально, включающему следующие стадии: а) трансфи-цирования данной клетки in vitro полинуклеотидной конструкцией, включающей: (i) нацеливающую последовательность; (ii) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; и (iii) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется, продуцируя тем самым трансфицированную клетку; (b) сохранения данной трансфицированной клетки in vitro или in vivo в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации, продуцируя таким образом гомологично рекомбинантную клетку; и (с) сохранения гомологично рекомбинантной клетки in vitro или in vivo в условиях, подходящих для экспрессии данного гена, создавая таким образом данный полипептид.
Настоящее изобретение имеет также отношение к полинуклеотидной конструкции, которая изменяет экспрессию целевого гена в типичной клетке, в которой данный ген экспрессируется аномально. Это происходит в том случае, если данная полинуклеотидная конструкция встраивается в хромосомную ДНК клетки-мишени, где данная полинуклеотидная конструкция включает: а) нацеливающую последовательность; b) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; и с) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется. Дополнительно включаются полинуклеотидные конструк
- 58 -
008252
ции, как описано выше, где данная конструкция дополнительно включает полинуклеотид, который кодирует полипептид, и находится в рамке считывания с эндогенным геном-мишенью после гомологичной рекомбинации с хромосомной ДНК.
Композиции можно получить и способы осуществить с помощью методов, известных в данной области техники, которые описаны в патентах США №№: 6054288; 6048729; 6048724; 6048524; 5994127; 5968502; 5965125; 5869239; 5817789; 5783385; 5733761; 5641670;5580734;в международных публикациях №№: WO96/29411, WO94/12650; и научных статьях, включающих Roller и соавт., 86:8932-8935 (1989).
1. Основные характерные особенности экспрессионных векторов настоящего изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный вектор включает, но не ограничивается ими, YAC (искусственная хромосома дрожжей), ВАС (искусственная хромосома бактерий), фаг, фагеми-ду, космиду, плазмиду или даже линейную молекулу ДНК, которая может включать хромосомную, нехромосомную, полусинтетическую и синтетическую ДНК. Такой рекомбинантный вектор может включать транскрипционный элемент, включающий совокупность из:
(1) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль в экспрессии гена, например, промоторы или энхансеры. Энхансеры являются цис-действующими элементами ДНК, обычно длиной от около 10 до 300 п.н., которые действуют на промотор для увеличения транскрипции.
(2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в мРНК и, в конечном счете, транслируется в полипептид, причем указанная структурная кодирующая последовательность функционально присоединяется к регуляторным элементам, описанным в (1); и
(3) соответствующих последовательностей инициации транскрипции и терминации. Структурные единицы, предназначенные для использования в дрожжевой или эукариотической экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность, делающую возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. Альтернативно, если рекомбинантный белок экс-прессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать N-концевой остаток. Данный остаток может или не может быть впоследствии отщеплен от экспрессированного рекомби-нантного белка для создания конечного продукта.
В большинстве случаев рекомбинантные экспрессионные векторы будут включать ориджины репликации, селективные маркеры, позволяющие трансформировать клетку-хозяина, и промотор, полученный из высокоэкспрессируемого гена, который контролирует транскрипцию расположенного "правее" структурной последовательности. Гетерологичную структурную последовательность собирают в соответствующей фазе последовательностями инициации трансляции и терминации, и предпочтительно с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслируемого белка в периплазмати-ческое пространство или во внеклеточную среду. В специфичном варианте осуществления настоящего изобретения, в котором данный вектор адаптирован для трансфицирования и экспрессирования требуемых последовательностей в клетках-хозяевах млекопитающих, предпочтительные векторы будут включать ориджин репликации требуемого хозяина, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сигнал полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и нетранскрибируемые 5'-фланкирующие последовательности. Последовательности ДНК, полученные из генома вируса SV40, например, SV40-ориджина, раннего промотора, энхансера и сигналов сплайсинга и полиаденилирования, можно использовать для создания требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
In vivo-экспрессия CanIon-полипептида SEQ ID No 5, или его фрагментов или его вариантов, может оказаться пригодной для того, чтобы исправить генетический дефект, связанный с экспрессией нативно-го гена в организме-хозяине, или для получения биологически неактивного CanIon-белка.
Следовательно, настоящее изобретение включает также рекомбинантные экспрессионные векторы, созданные, главным образом, для in vivo-получения CanIon-полипептида SEQ ID No 5, или его фрагментов или его вариантов, путем введения соответствующего генетического материала в организм лечащегося пациента. Данный генетический материал можно вводят in vitro в клетку, которую раньше извлекли из данного организма, затем модифицированную клетку вновь ввели в указанный организм, непосредственно in vivo в соответствующую ткань.
2. Регуляторные элементы.
Промоторы
Подходящие промоторные области, используемые в соответствии с настоящим изобретением, в экспрессионных векторах, выбраны с учетом клетки-хозяина, в которой экспрессируется данный гетеро-логичный ген. Конкретный промотор, используемый для контроля экспрессии представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, не считается существенным, до тех пор, пока он способен управлять экспрессией нуклеиновой кислоты в данной клетке-мишени. Поэтому, если клетка человека является мишенью, предпочтительно поместить нуклеотидную кодирующую область по соседству и под контролем промотора, такого как, например, промотор человека или вирусный промотор, который способен экспрессироваться в клетке человека.
Подходящий промотор может быть гетерологичным по отношению к нуклеиновой кислоте, экспрессию которой он контролирует, или, альтернативно, он может быть эндогенным к данному нативному
- 59 -
008252
полинуклеотиду, содержащему кодирующую экспрессируемую последовательность. Кроме того, данный промотор, как правило, гетерологичен по отношению к рекомбинантным векторным последовательностям, в которые встраивается данная конструкция промотор/кодирующая последовательность.
Промоторные области можно выбрать из любого желаемого гена с использованием, например, CAT (хлорамфениколтрансферазных) векторов и более предпочтительно с использованием векторов рКК232-8 и рСМ7.
Предпочтительными бактериальными промоторами являются промоторы LacI, LacZ, РНК-полимеразные промоторы бактериофага Т3 или Т7, промоторы gpt, лямбда PR, PL и trp (ЕР 0036776), промотор гена полиэдрина или промотор белка р10 бакуловируса (Kit Novagen) (Smith и соавт., 1983; O'Reilly и соавт., 1992), промотор лямбда PR или также trc-промотор.
Эукариотические промоторы включают предранний CMV, тимидинкиназный HSV, ранний и поздний SV40, LTR из ретровируса и металлотионеин-L мыши. Выбор удобного вектора и промотора определяется на уровне специалиста в данной области техники.
Выбор промотора определяется квалификацией специалиста в области генной инженерии. Для этого, например, можно обратиться к Sambrook и соавт. (1989) или к методам, описанным также у Fuller и соавт. (1996).
Другие регуляторные элементы
Если используют кДНК-вставку, то, как правило, желательно включить сигнал полиаденилирова-ния, который осуществляет надлежащее полиаденилирование генного транскрипта. Природа сигнала полиаденилирования не считается ключевой для успешного осуществления настоящего изобретения, и можно использовать такую последовательность, как последовательность гормона роста человека и сигнал полиаденилирования SV40. В качестве элемента экспрессионной кассеты рассматривают также терминатор. Эти элементы могут служить для повышения уровней мРНК и для минимизации сквозного прочтения генетической информации из данной кассеты в другие последовательности.
3. Селективные маркеры.
Такие маркеры должны обеспечивать клетку идентифицируемым изменением, позволяющим легкую идентификацию клеток, содержащих данную экспрессионную конструкцию. Селективные маркерные гены для отбора трансформированных клеток-хозяев, обладают предпочтительно дигидрофолатре-дуктазной или неомициновой устойчивостью в культуре эукариотических клеток, TRPI для С. cerevisiae, или тетрациклиновой, рифампициновой или амплицилиновой устойчивостью для Е. coli, или левансаха-разной устойчивостью для микробактерий, данный последний маркер является негативным селективным маркером.
4. Предпочтительные векторы.
Бактериальные векторы
В качестве представительного, но не ограничивающего примера, пригодные экспрессионные векторы для бактериального применения могут включать селективный маркер и бактериальный ориджин репликации, полученный из коммерчески доступных плазмид, включающих генетические элементы pBR322 (ATCC 37017). Такие коммерческие векторы включают, например, рКК223-3 (Pharmacia, Uppsala, Швеция) и GEMI (Promega Biotec, Madison, WI, США).
Специалистам в данной области техники известно большое количество других подходящих и коммерчески доступных векторов, таких как следующие бактериальные векторы: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A
(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44,
pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).
Векторы бактериофага
Вектор бактериофага Р1 может содержать большие вставки в диапазоне от около 80 до около 100 т.п.н.
Конструкция векторов бактериофага Р1, таких как р158 или р158/nео8, полнее всего описана Sternberg (1992, 1994). Рекомбинантные клоны Р1, включающие CanIon-нуклеотидные последовательности, можно создать путем встраивания больших полинуклеотидов из более чем 40 т.п.н. (Linton и соавт., 1993). Для получения ДНК Р1 для трансгенных экспериментов предпочтительным протоколом является протокол, описанный McCormick и соавт. (1994). Вкратце, Е. coli (предпочтительно штамм NS3529), несущих плазмиду Р1, выращивают в течение ночи в соответствующей бульонной среде, содержащей 25 мкг/мл канамицина. ДНК Р1 получают из Е. coli путем щелочного лизиса с использованием набора Qiagen Plas-mid Maxi (Qiagen, Chatsworth, CA, США), в соответствии с инструкциями производителя. ДНК Р1 выделяют очисткой из полученного бактериального лизата на двух колонках Qiagen-tip 500 с использованием промывочного и элюирующего буферов, содержащихся в данном наборе. Затем, перед осаждением ДНК 70%-м этанолом, проводят экстрагирование смесью фенол/хлороформ. После солюбилизации осажденной ДНК в ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА), концентрацию солюбилизированной ДНК определяют на спектрофотометре.
Если целью является экспрессия клона Р1, включающего CanIon-нуклеотидные последовательно -сти, в трансгенном животном, обычно в трансгенных мышах, желательно удалить векторные последовательности из ДНК-фрагмента Р1, например, путем расщепления ДНК Р1 по редкоразрезаемым сайтам
- 60 -
008252
внутри Р1-полилинкера (SfiI, NotI или SalI). Затем Р1-вставку выделяют очисткой из векторных последовательностей, подвергнутых гель-электрофорезу в пульсирующем поле, с использованием методов, аналогичных методам, которые первоначально предлагались для выделения ДНК из YAC (Schedl и соавт., 1993а; Peterson и соавт., 1993). На этой стадии полученная, выделенная очисткой вставка ДНК может быть сконцентрирована, при необходимости, на фильтровальной установке Millipore Ultrafree-MC (Milli-pore, Bedford, MA, США - в пределах молекулярной массы 30000) и затем диализована против буфера для микроинъекций (10 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 250 мкМ ЭДТА), содержащего 100 мМ NaCl, 30 мкМ спермина, 70 мкМ спермидина, в мембране для микродиализа (тип VS, 0,025 мкМ от Millipore). Целостность выделенной очисткой ДНК-вставки Р1 определяют с помощью электрофореза в пульсирующем поле в 1%-м агарозном (Sea Kem GTG; FMC Bio-products) геле и окрашивают этидийбромидом.
Бакуловирусные векторы
Подходящим вектором для экспрессии CanIon-полипептида SEQ ID No 5 или его фрагментов или вариантов является бакуловирусный вектор, который можно размножить в клетках и в клеточных линиях насекомых. Специфичной подходящей хозяйской векторной системой является бакуловирусный трансфер-вектор pVL1392/1393 (Pharmingen), который используют для трансфицирования клеточной линии SF9 (АТСС N°CRL 1711), которую получают из Spodoptera frugiperda.
Другие подходящие векторы для экспрессии CanIon-полипептида SEQ ID No 5 или его фрагментов или вариантов в бакуловирусной экспрессионной системе включают векторы, описанные у Chai и соавт. (1993), Vlasak и соавт. (1983) и Lenhard и соавт. (1996).
Вирусные векторы
В одном из специфичных вариантов осуществления настоящего изобретения вектор получают из аденовируса. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные аденовирусные векторы представляют собой векторы, которые описаны у Feldman and Steg (1996) или у Ohno и соавт. (1994). Другой предпочтительный рекомбинантный аденовирус, в соответствии с осуществлением данного специфичного варианта, представленного в настоящем изобретении, представляет собой аденовирус человека тип 2 или 5 (Ad 2 или Ad 5) или аденовирус животного происхождения (см., например, французская патентная заявка № FR-93.05954).
Под ретровирусными векторами и аденоассоциированными вирусными векторами подразумевают, главным образом, рекомбинантные системы доставки генов, выбранные для переноса экзогенных поли-нуклеотидов in vivo, в частности, млекопитающим, включая людей. Данные векторы обеспечивают эффективную доставку генов в клетки, а перенесенные нуклеиновые кислоты стабильно интегрируются в хромосомную ДНК данного хозяина.
Особенно предпочтительные препараты ретровирусов или ретровирусные конструкции-переносчики настоящего изобретения для доставки генов in vitro или in vivo включают ретровирусы, выбранные из группы, состоящей из вируса, индуцирующего очаг клеток норки, вируса саркомы мышей, вируса рети-кулоэндотелиоза и вируса саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы лейкоза мышей включают вирусы 4070А и 1504А, Abelson (ATCC No VR-999), Friend (ATCC No VR-245), Gross (ATCC No VR-590), Rauscher (ATCC No VR-998) и вирус лейкоза мышей Молони (ATCC No VR-190; Заявка PCT № WO 94/24298). Особенно предпочтительные вирусы саркомы Рауса включают Bryan с высоким титром (ATCC Nos VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 и VR-728). Другие предпочтительные ретровирусные векторы представляют собой ретровирусы, которые описаны у Roth и соавт. (1996), заявка РСТ № WO 93/25234, заявка PCT № WO 94/06920, Roux и соавт., 1989, Julan и соавт., 1992 и Neda и соавт., 1991.
Еще одна вирусная векторная система, которая рассматривается в настоящем изобретении, включает аденоассоциированный вирус (AAV). Аденоассоциированный вирус представляет собой встречаемый в природе дефектный вирус, который нуждается в другом вирусе, таком как аденовирус или герпес-вирус, в качестве вируса-помощника для эффективной репликации и продуктивного жизненного цикла (Muzyczka и соавт., 1992). Это один из немногих вирусов, который может интегрировать свою ДНК в неделящиеся клетки и проявляют высокую частоту устойчивой интеграции (Flotte и соавт., 1992; Samul-ski и соавт., 1989; McLaughlin и соавт., 1989). Отличительной чертой AAV является его уменьшенная эффективность в отношении трансдуцирования первичных клеток по сравнению с трансформированными клетками.
ВАС векторы
Клонирующая система бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) (Shizuya и соавт., 1992) была создана для устойчивого сохранения в Е. coli больших фрагментов геномной ДНК (100-300 т.п.н.). Предпочтительный ВАС-вектор включает вектор pBeloBAC11, который был описан Kim и соавт. (1996). С помощью данного вектора получают ВАС-библиотеки, а с использованием отобранной по размеру геномной ДНК, которую частично расщепляют ферментами, их можно лигировать в сайты Ват HI или HindIII данного вектора. Фланкирование этих клонирующих сайтов осуществляют Т7 и SP6 РНК-полимеразными сайтами инициации транскрипции, которые можно использовать для создания концевых зондов с помощью методов РНК-транскрипции или ПЦР. После создания ВАС-библиотеки в Е. coli, ДНК ВАС выделяют очисткой из клетки-хозяина в виде сверхспирализованной кольцевой молекулы. Преобразованию таких кольцевых молекул в линейную форму предшествует определение размера и введение
- 61 -
008252
ВАС в реципиентные клетки. Клонирующие сайты фланкируют с помощью двух Not I-сайтов, что позволяет вырезать клонированные сегменты из данного вектора в результате расщепления Not I. Альтернативно, ДНК-вставку, содержащую вектор pBeloBAC11, можно линеализировать путем обработки ВАС-вектора коммерчески доступным ферментом лямбда-терминаза, что приводит к расщеплению уникального cosN-сайта, но данный способ расщепления дает полноразмерный ВАС-клон, содержащий последовательности и ДНК-вставки и ВАС.
5. Доставка рекомбинантных векторов.
Для того чтобы эффективно экспрессировать полинуклеотиды и полинуклеотидные конструкции настоящего изобретения, данные конструкции необходимо доставить в клетку. Такую доставку можно осуществить in vitro, как в лабораторных методах трансформирования клеточных линий или in vivo, или ex vivo, так и при лечении некоторых болезненных состояний.
Одним из механизмов является вирусная инфекция, при которой экспрессионная конструкция инкапсулируется в вирусные частицы, вызывающие заражение.
В настоящем изобретении рассматривается также несколько невирусных способов переноса поли-нуклеотидов в культивируемые клетки млекопитающих, которые включают, без ограничения, осаждение кальцийфосфатом (Graham и соавт., 1973; Chen и соавт., 1987), DEAE-декстраном (Gopal, 1985), электро-порацией (Tur-Kaspa и соавт., 1986; Potter и соавт., 1984), прямой микроинъекцией (Harland и соавт., 1985), нагруженными ДНК липосомами (Nicolau и соавт., 1982; Fraley и соавт., 1979) и рецептор-опосредованной трансфекцией (Wu and Wu, 1987; 1988). Некоторые из таких методов можно успешно адаптировать для in vivo или ex vivo использования.
После доставки в клетку экспрессионный полинуклеотид можно стабильно интегрировать в геном реципиентной клетки. Данная интеграция может произойти в соответствующем месте и ориентации с помощью гомологичной рекомбинации (замещение гена) или его можно интегрировать произвольно, не помещая в конкретное место (аугментация гена). Еще в одних вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту можно стабильно сохранять в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновых кислот или "эписомы" кодируют последовательности, достаточные для сохранения и репликации синхронно с циклом клетки-хозяина или независимо от указанного цикла.
Один из специфичных вариантов способа доставки in vivo белка или пептида внутрь клетки позвоночного включает стадию введения препарата, включающего физиологически приемлемый носитель и " голый" полинуклеотид, оперативно кодирующий представляющий интерес полипептид во внутритканевом пространстве ткани, включающей данную клетку, посредством чего "голый" полинуклеотид помещается внутрь клетки, и обладающей физиологическим действием. Это особенно применимо для переноса in vitro, но можно также применить и для in vivo.
Композиции для использования in vitro и in vivo, включающие "голый" полинуклеотид, описаны в заявке РСТ № WO 90/11092 (Vical Inc.), а также в заявке РСТ № WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa), а также в статьях Tacson и соавт. (1996) и Huygen и соавт. (1996).
Еще в одном варианте настоящего изобретения перенос "голого" полинуклеотида настоящего изобретения, включающего полинуклеотидную конструкцию настоящего изобретения, в клетки, можно задействовать с помощью бомбардировки микрочастицами (биолистика), причем указанные частицы, покрытые ДНК, ускоряются до высокой скорости, что позволяет им пронзать клеточные мембраны и проникать в клетки без их повреждения так, как описано Klein и соавт. (1987).
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид настоящего изобретения может быть включен в липосому (Ghosh and Bacchawat, 199;: Wong и соавт., 1980; Nicolau и
соавт., 1987).
В специфичном варианте осуществления настоящего изобретения создана композиция для получения in vivo описанного в данном описании CanIon-белка или полипептида. Она включает "голый" поли-нуклеотид, оперативно кодирующий данный полипептид, в растворе физиологически приемлемого носителя, и подходящего для введения в ткань, что определяет появление клеток данной ткани, которые экс-прессируют указанный белок или полипептид.
Количество вектора, которое инъецируется в желаемый организм-хозяин, варьирует в соответствии с местом инъекции. В качестве примерной дозы, в тело животного, предпочтительно тело млекопитающего, например тело мыши, следует инъецировать 0,1-100 мкг вектора.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения вектор в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в клетку-хозяина in vitro, предпочтительно в клетку-хозяина, предварительно взятую у животного, подвергающегося лечению, и более предпочтительно в соматическую клетку, такую как клетка мышц. На следующей стадии клетку, которую трансформировали вектором, кодирующим требуемый CanIon-полипептид или требуемый его фрагмент, реинтродуцируют в тело животного для того, чтобы доставить рекомбинантный белок в данное тело либо местно, либо системно.
Клетки-хозяева
Другая цель настоящего изобретения включает клетки-хозяева, трансформированные или трансфи-цированные описанными в данном описании полинуклеотидами, и, в частности, полинуклеотидом,
- 62 -
008252
включающим CanIon-регуляторный полинуклеотид или кодирующую последовательность CanIon-полипептида, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID Nos 1-4 или их фрагментов или вариантов. Включены также клетки-хозяева, которые трансформируют (прокариотические клетки) или которые трансфицируют (эукариотические клетки) рекомбинантным вектором, таким как один из тех, которые описаны выше. В частности, клетки-хозяева настоящего изобретения могут включать любой из полинук-леотидов, описанных в разделе "Геномные последовательности CanIon-гена", в разделе "CanIon-кДНК-последовательности", в разделе "Кодирующие области", в разделе "Полинуклеотидные конструкции" и в разделе "Олигонуклеотидные зонды и праймеры".
Кроме того, рекомбинантная клетка-хозяин, в соответствии с настоящим изобретением, включает полинуклеотид, содержащий двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.
Дополнительная рекомбинантная клетка-хозяин, в соответствии с настоящим изобретением, включает любой из описанных в данном описании векторов, в частности, любой из векторов, описанных в разделе "Рекомбинантные векторы".
Предпочтительными клетками-хозяевами, используемыми в качестве реципиентов для экспресси-онных векторов настоящего изобретения, являются следующие:
a) прокариотические клетки-хозяева: штаммы Escherichia coli (штамм I.E.DH5-a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и штаммы видов, подобных Pseudomonas, Streptomyces и Staphilococcus;
b) эукариотические клетки-хозяева: HeLa-клетки (АТСС N°CCL2; N°CCL2.1; N°CCL2.2), Cv 1-клетки (АТСС N°CCL70), COS-клетки (АТСС N°CRL1650; N°CRL1651), Sf-9-клетки (АТСС N°CRL1711), C127-клетки (АТСС N°CRL-1804), 3T3 (ATCCC N°CRL-6361), CHO (ATCC N°CCL-61), 293-клетки почек человека (АТСС N°45504; N°CRL-1573) и ВНК (ЕСАСС N° 84100501; N° 84111301);
c) другие клетки-хозяева млекопитающих.
Экспрессия CanIon-ген в клетках млекопитающих, прежде всего человека, может оказаться дефектной или же она может осуществляться в результате вставки геномной CanIon-последовательности или кДНК-последовательности CanIon с заменой копии CanIon-гена в геноме клетки животного на CanIon-полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Такие генетические изменения можно осуществить путем гомологичных рекомбинационных событий с использованием специфических ДНК-конструкций, которые были описаны выше.
Одним из видов клеток-хозяев, которые можно использовать, являются зиготы млекопитающих, такие как мышиные зиготы. Например, мышиные зиготы можно подвергнуть микроинъекции выделенной очисткой, представляющей интерес молекулой ДНК, например, выделенной очисткой молекулой ДНК, которая предварительно доведена до концентрации 1 нг/мл для ВАС-вставок до 3 нг/мкл для вставок бактериофага Р1 в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 250 мкМ ЭДТА, содержащего 100 мМ NaCl, 30 мкМ спермина и 70 мкМ спермидина. При микроинъекции ДНК большого размера можно использовать полиамины и высокие концентрации соли для того, чтобы исключить механическое повреждение данной ДНК, как описано Schedl и соавт. (1993b).
Любой из полинуклеотидов настоящего изобретения, включая описанные в данном описании ДНК-конструкции, можно ввести в эмбриональную стволовую (ES) клеточную линию, предпочтительно мышиную ES-клеточную линию. ES-клеточные линии получают из плюрипотентных, некоммитированных клеток внутренней клеточной массы преимплантированных бластоцист. Предпочтительными ES-кле-точными линиями являются следующие: ES-E14TG2a (ATCC n°CRL-1821), ES-D3 (ATCC n°CRL-1934 и n°CRL-11632), YS001 (ATCC n°CRL-11776), 36,5 (ATCC n°CRL-11116). Для сохранения ES-клеток в не-коммитированном состоянии, их культивируют в присутствии фидерных клеток с подавленным ростом, которые создают соответствующие сигналы, предохраняющие этот эмбриональный фенотип и служат в качестве матрикса для адгезии ES-клетки. Предпочтительными фидерными клетками являются первичные эмбриональные фибробласты, которые создаются из ткани 13-14-дневных эмбрионов практически любого мышиного штамма, которые поддерживаются в культуре так, как это описано у Abbondanzo и соавт. (1993), и рост которых подавляется в результате облучения так, как описано у Robertson (1987), или в присутствии ингибирующей концентрации LIF так, как описано у Pease and Williams (1990).
Конструкции для клеток-хозяев можно использовать традиционным образом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью.
После трансформации соответствующего хозяина и роста данного хозяина до надлежащей клеточной плотности, выбранный промотор индуцируют подходящими средствами, такими как температурный сдвиг или химическая индукция, и клетки культивируют в течение дополнительного периода.
Клетки собирают, как правило, центрифугированием, разрушением с помощью физических или химических средств, и полученный неочищенный экстракт оставляют для последующей очистки.
Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушить любым удобным способом, включая циклическое замораживание-оттаивание, ультразвуковую обработку, механическое разрушение или используя агенты, лизирующие клетки. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области техники.
- 63 -
008252
Трансгенные животные
Термины "трансгенные животные" или "животные-хозяева" используют в данном описании для обозначения животных, которые, обладая своим геном, подвергаются генетическому и искусственному воздействию так, что включают одну из нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Предпочтительными животными являются млекопитающие, не относящиеся к человеческому роду, и включают млекопитающих, принадлежащих роду, выбранному из Mus (например, мыши), Rattus (например, крысы) и Oryctogalus (например, кролики), геном которых искусственно и генетически изменяют встраиванием нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение включает в себя млекопитающих-хозяев, не принадлежащих человеческому роду, и животных, включающих рекомбинантный вектор настоящего изобретения или CanIon-ген, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора.
Трансгенные животные настоящего изобретения, все, включают во множестве своих клеток клонированную рекомбинантную или синтетическую ДНК-последовательность, одну из выделенных очисткой или выделенных нуклеиновых кислот, включающих CanIon-кодирующую последовательность, CanIon-регуляторный полинуклеотид, полинуклеотидную конструкцию или ДНК-последовательность, кодирующую антисмысловой полинуклеотид, такой как описанный в настоящем подробном описании.
Как правило, трансгенное животное, в соответствии с настоящим изобретением, включает любой один из полинуклеотидов, рекомбинантных векторов и клеток-хозяев, описанных в настоящем изобретении. В частности, трансгенные животные настоящего изобретения могут включать любой из полинук-леотидов, описанных в разделе "Геномные последовательности CanIon-гена", в разделе "CanIon-кДНК-последовательности", в разделе "Кодирующие области", в разделе "Полинуклеотидные конструкции", в разделе "Олигонуклеотидные зонды и праймеры", в разделе "Рекомбинантные векторы" и в разделе "Клетки-хозяева".
Кроме того, трансгенные животные, в соответствии с настоящим изобретением, содержат в своих клеточных телах и/или в своих линиях зародышевых клеток полинуклеотид, включающий двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.
В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенные животные могут представлять собой хорошие экспериментальные модели с целью изучения разнообразных патологий, связанных с клеточной дифференциацией, в частности, трансгенные животные, в геном которых встраивают одну или несколько копий полинуклеотида, кодирующего нативный CanIon-белок, или, альтернативно, мутантный CanIon-белок.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенные животные могут экспрессировать представляющий интерес требуемый полипептид под контролем регулятор-ных полинуклеотидов CanIon-гена, приводя к хорошему выходу в синтезе данного, представляющего интерес белка и, в конечном счете, к тканеспецифичной тканевой экспрессии данного, представляющего интерес белка.
Создание трансгенных животных настоящего изобретения можно осуществить в соответствии с общепринятыми методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники. Дополнительные подробности, относящиеся к получению трансгенных животных и специфически трансгенных мышей, можно найти, например, в патентах США №№ 4873191, 5464764 и 5789215, каждый из которых включен здесь путем ссылки.
Трансгенные животные настоящего изобретения получают путем применения методов, которые дают животное с геномом, в который введен экзогенный генетический материал. Данный метод включает получение генетического материала или его части, который кодирует CanIon-кодирующую последовательность, CanIon-регуляторный полинуклеотид либо ДНК-последовательность, кодирующую CanIon-антисмысловой полинуклеотид, такой как описано в настоящем описании.
Рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения встраивают в эмбриональную или в ES-стволовую клеточную линию. Данную вставку предпочтительно осуществляют с использованием элек-тропорации так, как описано у Thomas и соавт. (1987). Указанные клетки подвергают электропорации и скринируют (например, путем отбора с помощью селективных маркеров, ПЦР или с помощью Саузерн-блот-анализа), чтобы обнаружить позитивные клетки, которые интегрировали экзогенный рекомбинант-ный полинуклеотид в свой геном, предпочтительно с помощью гомологичного рекомбинантного события. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать иллюстративный позитивно-негативный метод отбора, описанный Mansour и соавт. (1988).
Затем позитивные клетки выделяют, клонируют и инъецируют в 3,5-дневные бластоциты мышей так, как описано у Bradley (1987). Данные бластоцисты вводят затем самке животного-хозяина и позволяют расти до условного момента.
Альтернативно, позитивные ES-клетки приводят в контакт с 2,5-дневными эмбрионами на 8-16-клеточной стадии (морула) так, как описано у Wood и соавт. (1993) или у Nagy и соавт. (1993), ES-клетки, которые интернализуются с обширной колонизацией бластоцисты, включают клетки, которые дадут начало зародышевой линии.
Потомство хозяйской самки тестируют, чтобы определить, какие животные являются трансгенны
- 64 -
008252
ми, например, включают экзогенную ДНК-последовательность, а какие представляют собой дикий тип.
Таким образом, настоящее изобретение включает также в себя трансгенное животное, содержащее нуклеиновую кислоту, рекомбинантный экспрессионный вектор или рекомбинантную клетку-хозяина, в соответствии с настоящим изобретением.
Рекомбинантные клеточные линии, полученные от трансгенных животных настоящего
изобретения
Дополнительная цель настоящего изобретения включает рекомбинантные клетки-хозяева, полученные от описанных в данном описании трансгенных животных. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя клетки, полученные от млекопитающих-хозяев, не принадлежащих человеческому роду, и от животных, содержащих рекомбинантный вектор настоящего изобретения или CanIon-ген, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора.
Рекомбинантные клеточные линии можно основать in vitro из клеток, полученных из любой ткани трансгенного животного в соответствии с настоящим изобретением, например, путем трансфекции культуры первичных клеток с помощью векторов, экспрессирующих оnс-гены, таких как большой Т-антиген на основе SV40, как описано у Chou (1989) и Shaw и соавт. (1991).
Способы скринирования CanIon-модуляторов и CanIon взаимодействующих соединений
Для многих вариантов осуществления настоящего изобретения созданы соединения, которые взаимодействуют, связывают, активируют или подавляют экспрессию или активность CanIon-полипептидов, каналов и полинуклеотидов. Такие соединения могут представлять собой какое-либо органическое или неорганическое соединение, включая, но, не ограничиваясь ими, полипептиды, полинуклеотиды, липи-ды, углеводы, нуклеотиды, аминокислоты или малые молекулы ингибиторов или активаторов. Как указано в другом месте данной заявки, такие соединения пригодны для лечения или предупреждения любого из большого числа заболеваний или состояний. Для лечения или предупреждения психических нарушений, таких как шизофрения или биполярное расстройство, предпочтительно использовать ингибиторы CanIon-активности или экспрессии.
Способы скринирования модуляторов CanIon-канала
Соединения, способные связываться с CanIon, и соединения, способные модулировать CanIon-функцию, имеют важное применение в лечении заболевания. Хорошо установлено, что потенциал-зависимые воротные ионные каналы, как правило, являются лекарственными мишенями, потому что они фармакологически доступны, кодируются разными генами и, как правило, функционируют в виде сообществ мультимерных белков, обеспечивающих высокую степень функциональной и анатомической специфичности. Более того, поскольку ионный канал, открываясь и закрываясь, двигает заряженные потен-циалчувствительные аминокислоты, что приводит к изменению конформационного состояния, ионные каналы позволяют создать состояние, зависящее от молекул, которые, например, свяжут лишь каналы, находящиеся в состоянии токопроведения (активированные) или нетокопроведения (инактивированные).
Кроме того, было показано, что множество модуляторов кальциевых каналов эффективны для лечения или предупреждения многих заболеваний и состояний. Например, было показано, что ингибиторы кальциевых каналов эффективны против сердечно-сосудистых заболеваний и состояний (например, стенокардии, аритмий, гиперетензии), а также расстройств ЦНС и нейрональных нарушений (например, мигреней, неврологических последствий инсульта, мании, индуцированной нейролептиками поздней дискинезии, шизофрении, биполярного расстройства, нарушении болевых ощущений, эпилепсии и других). Кроме того, было показано, что агонисты кальциевых каналов эффективны для различных применений, таких как уменьшение продолжительности и иным способом истощающего действия местной анестезии. Антагонисты и агонисты CanIon-каналов аналогичным образом пригодны для лечения или предупреждения таких и иных заболеваний и состояний. Например, CanIon-антагонисты пригодны для лечения или предупреждения шизофрении и биполярного расстройства.
Поскольку активация потенциалзависимых воротных ионных каналов не требует связывания с аго-нистами, соединения предпочтительно скринируют против функциональных CanIon-каналов. Анализ может включать методы функционального и радиолигандного связывания, применяемые к клеткам (пузырькам или мембранам), экспрессирующим нативные или клонированные каналы, или проверку целых клеток. Для анализа функциональных целых клеток можно использовать электрофизиологические методы, такие как метод фиксации потенциала. В анализе можно использовать любой тип потенциал-зависимого воротного канала, предпочтительно каналы типов L, N и Т. Можно измерить также кинетику протекания ионов через данный канал, например, с использованием методов флуоресценции, конечного радиоактивного индикатора или методов клеточной выживаемости.
Анализ можно осуществить с использованием различных токсинов, ядов или соединений, которые, связываясь, открывают или закрывают каналы (Denyer и соавт., Drug Disc. Today 3(7):323-332 (1998), включенный в данном описании путем ссылки во всей его полноте). Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя использование любого из большого числа известных агонистов и антагонистов кальциевых каналов, например, в качестве позитивного или негативного контроля. Примеры подходящих известных антагонистов кальциевых каналов включают фенилалкиламины (например, верапамил), бензотиазепины (например, дилтиазем) и дигидропиридины (например, нифедипин); агони
- 65 -
008252
сты кальциевых каналов включают FPL-64176 и BAY К 8644; агонисты натриевых каналов включают Batrachotoxin; а антагонисты натриевых каналов включают спирадолин, мексилетин, U-54494A (+/-)-цис-3,4-дихлор-N-метил-N-[2-(1-пирролидинил)циклогексил]бензамид. Такие соединения можно также использовать в качестве "проводящих" соединений, т.е. служащих в качестве стартовых молекул для создания или обнаружения производных молекул, которые специфически связываются с CanIon-каналами или модулируют их.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения анализ настоящего изобретения включает способ скрининга кандидатного вещества, включающий следующие стадии:
a) создания (i) образца или клетки-хозяина, содержащих полипептид, включающий, в основном состоящий, или состоящий из CanIon-белка или его фрагмента, или (ii) рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из CanIon-белка или его фрагмента;
b) получения кандидатного вещества;
c) приведения в контакт указанной клетки-хозяина с указанным кандидатным веществом;
d) определения эффекта указанного кандидатного вещества на CanIon-активность.
Определение эффекта кандидатного вещества на CanIon-активность можно осуществить в соответствии с хорошо известными способами. Предпочтительно, эффект кандидатного вещества на CanIon-активность представляет собой агонистический или антагонистический эффект. Как правило, соединение подавляет CanIon, если его способность транспортировать ионы (например, Са2+ или Na+) снижается. Соединение стимулирует CanIon, если повышается его способность транспортировать ионы.
CanIon-активность можно обнаружить при использовании любого подходящего способа. В предпочтительных примерах CanIon-активность выявляют путем измерения сигнального события. Хотя сигнальное событие может включать любое соответствующее изменение молекулярной характеристики или параметра клетки, неограничивающие примеры сигнального события включают изменения потока ионов, такого как изменение образования потока Са2+ или Na+, или К+, или ферментной активности.
Один из аспектов состоит в отслеживании ионного потока путем измерения электрофизиологических свойств CanIon-канала с использованием, например, методов измерения потока в одной клетке или на небольшом участке мембраны. В других примерах используют флуоресцентную или радиоактивную метки для выявления перемещения известного CanIon-связывающего соединения или для выявления ионного потока через клетку (например, меченный Са2+ или Na+). Можно использовать индикатор физиологических параметров клетки, такой, например, как флуоресцентный индикатор клеточной жизнеспособности. В других примерах можно выявлять изменение физического положения индикатора с тем, чтобы использовать активированный флуоресценцией клеточный сортинг для идентификации исключения или поглощения физиологического индикатора.
Образец, используемый для анализа настоящего изобретения, содержит полипептид или клетку-хозяина, экспрессирующую полипептид, включающий, в основном состоящий, состоящий из CanIon-белка или его фрагмента, или (ii) рекомбинантную клетку-хозяина, экспрессирующую полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий, в основном состоящий, состоящий из CanIon-белка или его фрагмента. Предпочтительно, CanIon-анализ настоящего изобретения включает использование рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей функциональный CanIon-полипептид. Клетки-хозяева могут экспрессировать или включать функциональную альфа-субъединицу CanIon-канала или могут экспрес-сировать или включать одну или несколько дополнительных субъединиц ионного канала, или комплексный ионный канал, включающий CanIon. Предпочтительно используется клетка-хозяин, которая обладает низкой эндогенной экспрессией ионного канала или обладает низкой фоновой проводимостью, в частности Са2+ и/или Na+.
Радиолигандное связывание
Одним из аспектов настоящего изобретения является скринирование CanIon-канала путем идентификации высокоаффинного лиганда, который связывается с представляющим интерес сайтом CanIon и предпочтительно обладает требуемым модулирующим эффектом, и выявления способности испытываемого соединения замещать указанный меченный лиганд. Список токсикологических/фармакологических агентов, используемых в анализах потенциал-зависимых воротных (Са2+, Na+ и К+) каналов приведен у Denyer и соавт. (выше). Данный способ в основном пригоден для выявления соединений, которые связываются с одним и тем же сайтом или аллостерически соединяются с указанным сайтом, в виде меченного лиганда, однако, не предоставляют информацию о свойствах данного соединения как об агонисте или антагонисте.
Анализы, основанные на флуоресцентной и радиоактивной индикации клетки
В другом анализе CanIon-функцию можно проследить путем измерения изменения внутриклеточной концентрации проницаемого иона с использованием флуоресцентно индикаторных ионов или радиоактивно индикаторных ионов.
Обычно ионные каналы, такие как №+-каналы инактивируются в течение миллисекунд после стимуляции потенциала. Са2+-каналы не инактивируются или в меньшей степени инактивируются и могут открываться при высокой К+-деполяризации. В анализах, основанных на флуоресценцентной и радиоак
- 66 -
008252
тивной индикации клетки, CanIon-канал можно, как правило, активировать с помощью токсина или любого испытываемого соединения, или высокой К+-деполяризацией, так, чтобы данный канал оказался открытым в течение длительного периода времени (вплоть до нескольких минут).
В анализах с флуоресценцией используют доступные флуоресцентные Са2+-красители (например, Fluo-3, Calcium green-1, Молекулярные Зонды, OR, США) . Са2+-каналы можно активировать деполяризацией мембраны с помощью изотоничного раствора, a №+-каналы - с помощью токсина или иного соединения, и полученное в результате нестационарное передвижение флуоресценции в данной клетке можно измерить на протяжении 20-60 с. Системы по измерению флуоресценции и приборы дополнительно описываются у Denyer и соавт. (выше). Радиоактивные индикаторы 22Na+ и 14С-гуанидин обычно используют для анализа №+-каналов, а 45Са2+ используют для анализа Са2+-каналов. В предпочтительном варианте, описанном у Denyer и соавт. (выше), высокопроизводительный клеточный анализ Can-Ion осуществляют с использованием сцинтилляционных Cytostar-T-микроплашек (Amersham International, U.K.).
В последующих анализах функцию Са2+-ионного канала отслеживают путем измерения мембранного потенциала с помощью индикатора мембранного потенциала. Высокое электрическое сопротивление биологических мембран позволяет малым ионным потокам через плазматическую мембрану вызывать большие изменения мембранного потенциала. Таким образом, анализ потенциала удобно использовать для выявления общего ионного потока через мембраны.
Клеточные линии, как правило, выбирают так, чтобы минимизировать действие эндогенных ионных каналов. Ряд красителей, доступных в качестве индикаторных красителей мембранного потенциала, делятся на красители быстрого и медленного ответа, а также на потенциал-сенсорные красители, основанные на FRET (Aurora Biosciences, CA, США; обзор Gonzalez и соавт., Drug Disc. Today 4(9):431-439 (1999)).
Жизнеспособность клеток
В анализах жизнеспособности клеток активность ионных каналов и поток ионов непосредственно связаны с жизнеспособностью клетки. Клеточные системы дрожжей и млекопитающих пригодны для тестирования ионного канала-мишени. Например, используют дрожжевую систему, представленную ион-специфичной, дефицитной по поглощению К+ клеточной линией Saccharomyces cerevisiae, в которой представляющий интерес функциональный К+-канал экспрессируется в данной клеточной линии, восстанавливая тем самым поглощение К+ и способствуя клеточному выживанию (Anderson и соавт. Symp. Soc. Exp. Biol. 48:85-97 (1994)). Такой анализ для Са2+ или №+-каналов можно применять для идентификации соединений, способных блокировать CanIon-функцию. Доступны также клеточные системы млекопитающих, такие как №+-каналы, анализируемые с использованием колориметрических данных по жизнеспособности нейробластомных клеток млекопитающих. Клетки обрабатывают с помощью открывателя №+-каналов и ингибитора №+/К+-насоса, чтобы способствовать созданию летального избытка внутриклеточного Na+. Обработка с помощью испытываемого соединения, способного блокировать данные каналы, будет увеличивать клеточную жизнеспособность, а соединения, которые усиливают открывание каналов, в последующем будут способствовать гибели клеток (Manger и соавт., Anal. Biochem. 214:190-194 (1993)).
Электрофизиология
Электрофизиологические методы фиксации потенциала включают измерение ионного тока, протекающего через один или множество каналов. Единственным микроэлектродом контролируют мембранный потенциал, когда электрический ток измеряют в отдельной клетке или на небольшом участке мембраны (Hamill, Pfugers Arch. 391, 85-100 (1981)). Ионный ток можно, следовательно, измерить в присутствии или в отсутствие представляющего интерес испытываемого соединения. Была создана система для скрининга большого числа соединений (Neurosearch A/S, Glostrup, Дания; Olesen и соавт., Voltage gated ion channel modulators, 7-8 December, Philadelphia PA, США (1995); Denyer и соавт., выше).
Способы скринирования веществ, взаимодействующих с CanIon-полипептидом
Для цели настоящего изобретения под лигандом подразумевают молекулу, такую как белок, пептид, антитело или любое синтетическое химическое соединение, способное связаться с CanIon-белком или с одним из его фрагментов или вариантов, или модулировать экспрессию полинуклеотида, кодирующего CanIon, его фрагмент или вариант.
В соответствии с настоящим изобретением в способе скринирования лиганда биологический образец или указанную молекулу, которую испытывают в качестве предполагаемого лиганда CanIon-белка, приводят в контакт с соответствующим выделенным очисткой CanIon-белком, например, с соответствующим очищенным рекомбинантным CanIon-белком, полученным с помощью рекомбинантной клетки-хозяина, как описано выше, с тем, чтобы создать комплекс между данным белком и испытываемой предполагаемой лигандной молекулой.
В качестве иллюстративного примера, для изучения взаимодействия CanIon-белка или фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 аминокислот SEQ ID No 5, с лекарственным средством или с малыми молекулами, такими как молекулы, полученные с помощью методов комбинаторной химии, могут
- 67 -
008252
быть использованы метод микродиализа, соединенный с ВЭЖХ, описанный Wang и соавт. (1997), или метод капиллярного электрофореза по сродству, описанный Bush и соавт. (1997), раскрытие которых включено путем ссылки.
В дополнительных способах пептиды, лекарственные средства, жирные кислоты, липопротеины или малые молекулы, которые взаимодействуют с CanIon-белком или с фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5, могут быть идентифицированы с использованием анализов, таких как следующие ниже. Испытываемую на связывание молекулу метят детектируемой меткой, такой как флуоресцентная, радиоактивная или ферментная метка, и помещают для контактирования с иммобилизованным CanIon-белком или его фрагментом в условиях, позволяющих происходить специфическому связыванию. После удаления неспецифически связавшихся молекул, связавшиеся молекулы детектируют с использованием подходящих средств.
Другая цель настоящего изобретения включает способы и наборы для скринирования кандидатных веществ, которые взаимодействуют с CanIon-полипептидом.
Настоящее изобретение относится к способам скринирования представляющих интерес веществ, которые взаимодействуют с CanIon-белком или с каким-либо его фрагментом или вариантом. Исходя из их способности связываться ковалентно или нековалентно с CanIon-белком или с его фрагментом или вариантом, данные вещества или молекулы могут преимущественно использоваться in vitro и in vivo.
Указанные взаимодействующие молекулы могут использоваться in vitro в качестве детекционных средств идентификации присутствия CanIon-белка в образце, предпочтительно в биологическом образце.
Способ для скринирования кандидатного вещества включает следующие стадии:
a) создания полипептида, включающего, в основном состоящего, состоящего из CanIon-белка или фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5;
b) получения кандидатного вещества;
c) приведения в контакт указанного полипептида с указанным кандидатным веществом;
d) выявления комплексов, образованных между указанным полипептидом и указанным кандидат-ным веществом.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается набор для скринирования кандидатного вещества, взаимодействующего с CanIon-полипептидом, где указанный набор включает:
a) CanIon-белок, обладающий аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательности SEQ ID No 5 или ее пептидного фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5;
b) факультативно, средства, пригодные для выявления комплекса, образованного между CanIon-белком или его пептидным фрагментом или вариантом и кандидатным веществом.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в описанном выше наборе, детекционные средства включают моноклональные или поликлональные антитела, направленные против CanIon-белка или его пептидного фрагмента или варианта.
Можно проанализировать разнообразные кандидатные вещества на взаимодействие с CanIon-полипептидом. Данные вещества или молекулы включают, без ограничения, природные или синтетические органические соединения или молекулы биологического происхождения, такие как полипептиды. Если кандидатное вещество или молекула включает полипептид, то полипептид может представлять собой экспрессионный продукт, полученный из фагового клона, относящегося к произвольно созданной пептидной библиотеке на основе фага, или, альтернативно, данный полипептид может представлять собой экспрессионный продукт, полученный из кДНК-библиотеки, клонированной в вектор, пригодный для осуществления дигибридного скринирующего анализа.
Настоящее изобретение относится также к наборам, пригодным для осуществления описанного выше способа скринирования. Предпочтительно, такие наборы включают CanIon-полипептид или его фрагмент или вариант и, факультативно, средства, пригодные для выявления комплекса, образованного между CanIon-полипептидом или его фрагментом или вариантом и данным кандидатным веществом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения детекционные средства включают моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к соответствующему CanIon-полипептиду или его фрагменту или варианту.
А. Лиганды-кандидаты, полученные из произвольных пептидных библиотек.
В конкретном варианте осуществления способа скринирования настоящего изобретения, предполагаемый лиганд представляет собой экспрессионный продукт ДНК-вставки, содержащейся в фаговом векторе (Parmley and Smith, 1988). В данном случае используются произвольные пептидные библиотеки на основе фагов. Произвольные ДНК-вставки кодируют пептиды длиной 8-20 аминокислот (Oldenburg K.R.
- 68 -
008252
и соавт., 1992; Valadon P., и соавт., 1996; Lucas А.Н., 1994; Westerink M.A.J., 1995; Felici F. и соавт., 1991). В соответствии с этим конкретным вариантом, рекомбинантные фаги, экспрессирующие белок, который связывается с иммобилизованным CanIon-белком, сохраняется, а комплекс, образованный между CanIon-белком и рекомбинантным фагом, можно впоследствии иммунопреципитировать с помощью поликлонального или моноклонального антитела, специфичного к CanIon-белку.
После того как лигандную библиотеку в рекомбинантных фагах сконструировали, фаговую популяцию приводят в контакт с иммобилизованным CanIon-белком. Затем полученные комплексы отмывают для того, чтобы удалить неспецифически связавшиеся рекомбинантные фаги. Фаги, которые специфически связались с CanIon-белком, элюируют буфером (кислый рН) или иммунопреципитируют монокло-нальным антителом, продуцированным в гибридомой анти-CanIon, и данную фаговую популяцию впоследствии размножают с помощью сверхинфицированных бактерий (например, Е. coli). Селекционную стадию можно повторить несколько раз, предпочтительно 2-4 раза, для того, чтобы отобрать более специфичные рекомбинантные фаговые клоны. Последняя стадия включает характеристику данного пептида, продуцированного рекомбинантным фаговым клоном, либо путем экспрессии в инфицированных бактериях и выделения, экспрессируя фаговую вставку в другой системе "хозяин-векторная ДНК", либо секвенированием данной вставки, содержащейся в отобранных рекомбинантных фагах.
B. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью конкурентных экспериментов. Альтернативно, пептиды, лекарственные средства или малые молекулы, которые связываются с
CanIon-белком или фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5, можно идентифицировать в конкурентных экспериментах. В таких анализах CanIon-белок или его фрагмент, иммобилизуют на поверхности, такой как пластмассовый планшет. Увеличивающиеся количества пептидов, лекарственных средств или малых молекул контактируют с иммобилизованным CanIon-белком или его фрагментом в присутствии обнаруживаемого с помощи метки известного лиганда CanIon-белка. Например, CanIon-лиганд можно пометить меткой с помощью флуоресцентной, радиоактивной или ферментной метки. Способность испытываемой молекулы связывать CanIon-белок или его фрагмент, определяют измерением количества обнаруживаемой метки в известном лиганде, связавшемся в присутствии данной тест-молекулы. Уменьшение количества известного лиганда, связавшегося с CanIon-белком или его фрагментом, при наличии тест-молекулы, свидетельствует о том, что данная тест-молекула способна связываться с CanIon-белком или его фрагментом.
C. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью аффинной хроматографии.
Белки или иные молекулы, взаимодействующие с CanIon-белком или фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мерее 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5, можно индуцировать с помощью аффинной хроматографии. В таком анализе CanIon-белок или его фрагмент можно присоединить к колонке с использованием традиционных методов, в том числе химически связать с соответствующим связующим веществом колонки, таким как агароза, Affi Gel(r) или с иными матрицами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Для некоторых вариантов осуществления данного способа аффинная колонка содержит химерные белки, в которых CanIon-белок или его фрагмент соединен путем слияния с глутатион^-трансферазой (GST). Смесь клеточных белков или пул экспрессированных белков, которые описаны выше, наносят на аффинную колонку. Белки или другие молекулы, взаимодействующие с CanIon-белком или его фрагментом, присоединяемые к данной колонке, можно затем выделить и проанализировать 2D-гель-электрофорезом, как описано у Ramunsena и соавт. (1997), раскрытие которого включено путем ссылки. Альтернативно, белки, удерживаемые на данной аффинной колонке, можно выделить очисткой способами, основанными на электрофорезе, и секвенировать. Тот же самый способ можно использовать для выделения антител, для скринирования продуктов фагового дисплея или для скринирования антител человека фагового дисплея.
D. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью способов оптического биосенсора.
Белки, взаимодействующие с CanIon-белком или с фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5, можно также скринировать с использованием Оптического Биосенсора, как описано у Edwards and Leatherbarrow (1997), а также у Szabo и соавт. (1995), раскрытие которых включено путем ссылки. Данный способ позволяет обнаруживать взаимодействие между молекулами в реальном времени, без необходимости метить молекулы. Данный метод основан на явлении поверхностного плазменного резонанса (SPR). Вкратце, тестируемую молекулу лиганда-кандидата присоединяют к поверхности (такой как карбоксиметилдекстрановая матрица). Луч света, направленный на сторону поверхности, которая не содержит тестируемого образца, отражается указанной поверхностью. Эффект SPR вызывает уменьшение интенсивности отраженного света, что взаимосвязано с определенным углом и длиной волны. Связывание молекул лиганда-кандидата обуславливает изменение коэффициента преломления на поверхности, изменение которого обнаруживается в виде изменения SPR-сигнала. Для скринирования молекул лиган
- 69 -
008252
да-кандидата или веществ, которые способны взаимодействовать с CanIon-белком или его фрагментом, CanIon-белок или его фрагмент иммобилизуют на поверхности. Данная поверхность включает одну сторону клетки, через которую протекает анализируемая молекула-кандидат. Связывание молекулы-кандидата к CanIon-белку или его фрагменту обнаруживается в виде изменения SPR-сигнала. Тестируемые молекулы-кандидаты могут представлять собой белки, пептиды, углеводы, липиды или малые молекулы, образованные с помощью комбинаторной химии. Данный метод можно также осуществлять путем иммобилизации эукариотических или прокариотических клеток или липидных везикул, демонстрирующих на своей поверхности эндогенно или рекомбинантно экспрессируемый CanIon-белок.
Основное преимущество данного способа заключается в том, что он позволяет определить скорость связывания CanIon-белка и молекул, взаимодействующих с CanIon-белком. Таким образом представляется возможным специально выбрать лигандные молекулы, взаимодействующие с CanIon-белком или с его фрагментом, благодаря константам сильной или, наоборот, слабой ассоциации.
Е. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью дигибридного скринирующего анализа.
Для изучения in vivo взаимодействий белок-белок создана дрожжевая дигибридная система (Fields and Song, 1989), основывающаяся на слиянии белка-затравки с ДНК-связытающим доменом дрожжевого Gа14-белка. Данный метод описан в патентах США №№ 5667973 и 5283173 (Fields и соавт.), представленные там методические указания включены путем ссылки.
Основную операцию скринирования библиотеки с помощью дигибридного анализа можно осуществить как описано у Harper и соавт. (1993), у Cho и соавт. (1998) или у Fromont-Racine и соавт. (1997).
Затравочный белок или полипептид включает, состоит в основном или состоит из CanIon-полипептида или фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот SEQ ID No 5.
Более точно, нуклеотидную последовательность, кодирующую CanIon-полипептид, его фрагмент или вариант, соединяют путем слияния с полинуклеотидом, кодирующим ДНК-связывающий домен GAL4-белка, причем полученную слитую нуклеотидную последовательность встраивают в соответствующий экспрессионный вектор, например, pAS2 или рМ3.
Затем в специально созданном векторе конструируют кДНК-библиотеку человека так, чтобы кДНК-вставка человека сливалась с нуклеотидной последовательностью в векторе, который кодирует транскрипционный домен GAL4-белка. Предпочтительно, данный используемый вектор представляет собой рАСТ-вектор. Полипептиды, кодируемые нуклеотидными вставками из кДНК-библиотеки человека, являются полипептидами-"добычами".
Третий вектор содержит детектируемый маркерный ген, такой как бета-галактозидазный ген или САТ-ген, который помещают под контроль регуляторной последовательности, которая ответственна за связывание полноразмерного Gа14-белка, содержащего домен активации транскрипции и ДНК-связывающий домен. Можно использовать, например, pG5EC-вектор.
Используются также два разных дрожжевых штамма. В качестве иллюстративного, но не ограничивающего примера, два разных дрожжевых штамма могут являться следующими штаммами:
Y190, фенотип которого представляет собой (МАТа, Leu2-3, 112 ura3-12, trp1-901, his3-D200, ade2-101, ga14Dgal180D URA3 GAL-LacZ, LYS GAL-HIS3, cyh');
Y187, фенотип которого представляет собой (МАТа gа14 gа180 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3, -112URA3 GAL-lacZmet-), который представляет собой тип спаривания противоположный Y190.
Вкратце, 20 мкг pAS2/CanIon и 20 мкг рАСТ-кДНК-библиотеки котрансформируют в дрожжевой штамм Y190. Полученные трансформанты отбирают по росту на минимальной среде без гистидина, лейцина и триптофана, но содержащей ингибитор синтеза тистидина 3-АТ (50 мМ). Позитивные колонии скринируют на бета-галактозидазу с помощью анализа отпечатков на фильтре. Затем двойные позитивные колонии (His+, beta-gal+) выращивают на чашках без гистидина, лейцина, но с триптофаном и цикло-гексимидом (10 мг/мл) для отбора колоний с утраченными pAS2/CanIon-плазмидами, но сохранившими плазмиды рАСТ-кДНК-библиотеки. Полученные Y190-штаммы спаривают с Y187-штаммами, экспрес-сирующими CanIon или неродственные контрольные белки; такие как циклофилин В, ламин или SNF1, в виде GaM-химер, как описано у Harper и соавт. (1993) и у Bram и соавт. (Bram R.J. и соавт., 1993), и скринируют на бета-галактозидазу с помощью анализа скринирования колоний на фильтре. Дрожжевые клоны, которые представляют собой beta gal- после спаривания с контрольными GaW-химерами, считают ложнопозитивными.
В другом варианте осуществления дигибридного способа, в соответствии с настоящим изобретением, взаимодействие между CanIon или его фрагментом или вариантом с клеточными белками можно оценить с помощью Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalog No K1604-1, Clontech). Как описано в инструкции, прилагаемой к Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catalog No K1604-1, Clontech), раскрытие которой включено в данное описание путем ссылки, нуклеиновые кислоты, кодирующие CanIon-белок или его часть, встраивают в экспрессионный вектор так, чтобы они находились в рамке считывания с ДНК, кодирующей ДНК-связывающий домен дрожжевого транскрипционного активатора GAL4. Требуемая кДНК, предпочтительно кДНК человека, встраивается во второй экспрессионный вектор так, чтобы они
- 70 -
008252
находились в рамке считывания с ДНК, кодирующей активаторный домен GAL4. Две данные экспресси-онные плазмиды трансформируют в дрожжи и трансформированные дрожжи высевают на селективную среду, которая селектирует по экспрессии селективных маркеров в каждом экспрессионном векторе, а также GAL4-зависимой экспрессии HIS3-гена. Трансформанты, способные расти на среде без гистидина, скринируют на GAL4-зависимую lacZ-экспрессию. Те клетки, которые оказываются позитивными при гистидиновом отборе и lacZ-анализе, удерживают взаимодействие между CanIon и белком или пептидом, кодируемым исходно выбранной кДНК-вставкой.
Способ скринирования веществ, взаимодействующих с регуляторными последовательностями
CanIon-гена
В настоящем изобретении рассматривается также способ скринирования веществ или молекул, которые способны взаимодействовать с регуляторными последовательностями CanIon-гена, такими как, например, промоторная или энхансерная последовательности.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, которые способны взаимодействовать с регуляторными последовательностями CanIon-гена, более предпочтительно с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из полинуклеотидов 5'- и 3'-регуляторной области или ее фрагмента или варианта, и предпочтительно варианта, включающего один из двуаллельных маркеров настоящего изобретения, могут быть идентифицированы с использованием моногибридной системы, такой, которая описана в проспекте, прилагаемом к набору Matchmaker One-Hybrid System от Clontech (Catalog Ref n° K1603-1), методические указанная которого, представленные в данном описании, включены путем ссылки. Вкратце, нуклеотидную последовательность-мишень клонируют слева от селективной репортерной последовательности, а полученную ДНК-конструкцию интегрируют в дрожжевой геном (Saccharomyces cerevisiae). Дрожжевые клетки, содержащие в своем геноме данную репортерную последовательность, трансформируют затем с помощью библиотеки, включающей кДНК, кодирующие белки-кандидаты для связывания с регуляторными последовательностями CanIon-гена, слитые с последовательностями, кодирующими активаторный домен дрожжевого фактора транскрипции, такого как GAL4. Рекомбинантные дрожжевые клетки высевают в культуральный бульон для селекции клеток, экспрессирующих указанную репортерную последовательность. Отобранные таким образом рекомбинантные дрожжевые клетки содержат слитый белок, который способен связываться с регуляторной последовательностью-мишенью CanIon-гена. После чего кДНК, кодирующие слитые белки, секвенируют и их можно клонировать in vitro в экспрессионный или транскрипционный векторы. Связывание кодируемых полипептидов с регулятор-ными последовательностями-мишенями CanIon-гена можно подтвердить методами, известными специалистам в данной области техники, такими как метод задержки в геле или метод защиты от ДНКазы.
Метод задержки в геле можно также осуществить независимо для того, чтобы скринировать молекулы-кандидаты, которые способны взаимодействовать с регуляторными последовательностями CanIon-гена так, как описано у Fried and Crothers (1981), у Garner and Revzin (1981) и у Dent and Latchman (1993), методические указания представленных там публикаций включены путем ссылки. Данные методы основываются на принципе, согласно которому фрагмент ДНК, который связывается с белком, мигрирует медленнее, чем такой же несвязавшийся ДНК-фрагмент. Вкратце, метят нуклеотидную последовательность-мишень. Затем меченную нуклеотидную последовательность-мишень приводят в контакт либо с тотальным ядерным экстрактом из клеток, содержащим факторы транскрипции, либо с разными тестируемыми молекулами-кандидатами. Взаимодействие между регуляторной последовательностью-мишенью CanIon-гена и молекулой-кандидатом или фактором транскрипции выявляют после гелевого или капиллярного электрофореза благодаря задержке миграции.
Способы скринирования лигандов, которые модулируют экспрессию CanIon-гена
Другим объектом рассмотрения настоящего изобретения является способ скринирования молекул, которые модулируют экспрессию CanIon-белка. Такой способ скринирования включает следующие стадии:
a) культивирования прокариотической или эукариотической клетки, которую трансформировали нуклеотидной последовательностью, кодирующей CanIon-белок, его вариант или фрагмент, помещенной под контроль своего собственного промотора;
b) приведения в контакт данной культивируемой клетки и тестируемой молекулы;
c) количественной оценки экспрессии CanIon-белка или его варианта или фрагмента.
В варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая CanIon-белок или его вариант или фрагмент, включает аллель, по меньшей мере, одного из двуаллельных маркеров А12 или А16 и их комплементов.
Используя методы рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалистам в данной области техники, последовательность ДНК, кодирующую CanIon-белок, встраивают в экспрессионный вектор, справа от его промоторной последовательности. В качестве иллюстративного примера, промоторная последовательность CanIon-гена содержится в нуклеиновой кислоте 5'-регуляторной области.
Количественную оценку экспрессии CanIon-белка можно осуществить либо на уровне мРНК, либо на белковом уровне. В последнем случае можно использовать поликлональные или моноклональные антитела для измерения количества синтезированного CanIon-белка, например, в ELISA или RIA-анализом.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения количественное измерение
- 71 -
008252
CanIon-мРНК осуществляют с помощью количественной ПЦР-амплификации кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции тотальной мРНК из культивированных клеток-хозяев, трасфицирован-ных CanIon, с использованием пары праймеров, специфичных для CanIon.
В настоящем изобретении рассматривается также способ скринирования веществ или молекул, которые способны повысить или понизить уровень экспрессии CanIon-гена. Такой способ может позволить специалисту в данной области техники выбрать вещества, проявляющие регулирующее действие на уровень экспрессии CanIon-гена, и которые могут быть пригодны в качестве активных ингредиентов, включаемых в фармацевтические композиции для лечения пациентов, страдающих от любой описанной в данном описании болезни.
Таким образом, в настоящем изобретении создан также способ скринирования кандидатного вещества или молекулы, которые модулируют экспрессию CanIon-гена, причем данный способ включает следующие стадии:
создания рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области или ее биологически активный фрагмент или вариант, локализованную "левее" полинуклеотида, кодирующего выявляемый белок;
получения кандидатного вещества; и
определения способности кандидатного вещества модулировать уровень экспрессии полинуклеоти-да, кодирующего выявляемый белок.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области или ее биологически активный фрагмент или вариант, включает также 5'UTR-область CanIon-кДНК SEQ ID No 4 или ее биологически активные фрагменты или варианты.
Среди предпочтительных полинуклеотидов, кодирующих выявляемый белок, можно привести по-линуклеотиды, кодирующие бета-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFR) и хлорамфени-колацетилтрансферазу (CAT).
Настоящее изобретение относится также к наборам, пригодным для осуществления описанного в данном описании способа скринирования. Предпочтительно, такие наборы включают рекомбинантный вектор, который обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности 5'-регуляторной области или ее биологически активного фрагмента или варианта, локализованной "левее" и функционально присоединенной к полинуклеотиду, кодирующему выявляемый белок или CanIon-белок или его фрагмент или вариант.
В другом способе скринирования кандидатного вещества или молекулы, которые модулируют экспрессию CanIon-гена, данный способ включает следующие стадии:
a) создания рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота включает 5' UTR-последовательность CanIon-кДНК SEQ ID No 4 или один из ее биологически активных фрагментов или вариантов, причем 5'UTR-последовательность или ее биологически активный фрагмент или вариант функционально присоединен к полинуклеотиду, кодирующему выявляемый белок;
b) получения кандидатного вещества; и
c) определения способности кандидатного вещества модулировать уровни экспрессии полинуклео-тида, кодирующего выявляемый белок.
В конкретном варианте осуществления указанного выше способа скринирования, нуклеиновая кислота, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5' UTR-последовательности CanIon-кДНК SEQ ID No 4 или из ее биологически активных фрагментов или вариантов, включает промоторную последовательность, которая является эндогенной относительно Can-Ion-5'UTR-последовательности.
В другом конкретном варианте осуществления указанного выше способа скринирования нуклеиновая кислота, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'UTR-последовательности CanIon-кДНК SEQ ID No 4 или одного из ее биологически активных фрагментов или вариантов, включает промоторную последовательность, которая является экзогенной по отношению к указанной в данном описании CanIon-5'UTR-последовательности.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, включающая 5'UTR-последовательность CanIon-кДНК или SEQ ID No 4 или ее биологически активные фрагменты, включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А12 или А16 или их комплементов.
Кроме того, настоящее изобретение включает набор для скринирования кандидатного вещества, модулирующего экспрессию CanIon-гена, где указанный набор включает рекомбинантный вектор, который включает нуклеиновую кислоту, включающую 5'UTR-последовательность CanIon-кДНК SEQ ID No 4 или один из ее биологически активных фрагментов или вариантов, причем данная 5'UTR-последовательность или ее биологически активный фрагмент или вариант функционально присоединен к полинуклеотиду, кодирующему выявляемый белок.
- 72 -
008252
Уровни экспрессии и паттерны CanIon можно анализировать в гибридизационном растворе с помощью длинных зондов, как описано в международной патентной заявке № WO 97/05277, полное содержание которой включено в данное описание путем ссылки. Вкратце, CanIon-кДНК или геномная ДНК Can-Ion, описанные выше, или их фрагменты встраивают в клонирующий сайт сразу "правее" от промотора РНК-полимеразы бактериофага (Т3, Т7 или SP6) для получения антисмысловой РНК. Предпочтительно, CanIon-вставка включает, по меньшей мере, 100 или более последовательных нуклеотидов из геномной ДНК-последовательности или из кДНК-последовательностей. Полученную плазмиду линеаризуют и транскрибируют в присутствии рибонуклеотидов, включающих модифицированные рибонуклеотиды (т.е. биотин-UTP и DIG-UTP). Избыток такой вдвойне меченной РНК гибридизуют в растворе с мРНК, выделенной из представляющих интерес клеток или тканей. Гибридизацию осуществляют в стандартных жестких условиях (40-50°С в течение 16 ч в 80% формамиде, 0,4 М NaCl-буфере, рН 7-8). Непрогибриди-зовавшийся зонд удаляют путем расщепления рибонуклеазами, специфичными для одноцепочечной РНК (т.е. РНКазы CL3, T1, Phy M, U2 или А). Наличие биотин-UТР-модификации делает возможным поглощение гибрида на планшете для микротитрования, покрытого стрептавидином. Наличие DIG-модификации делает возможным выявление гибрида и его количественную оценку в ELISA с использованием антитела к DIG, соединенного со щелочной фосфатазой.
Количественный анализ экспрессии CanIon-гена можно также осуществить с использованием наборов. Используемый в данном описании термин "набор" означает одномерное, двухмерное или мульти-мерное расположение множества нуклеиновых кислот достаточной длины, которые позволяют специфически обнаруживать экспрессию мРНК, способных гибридизоваться с ними. Например, наборы могут содержать множество нуклеиновых кислот, полученных из генов, для которых оценивают уровни экспрессии. Данные наборы могут включать геномную ДНК CanIon, кДНК-последовательности CanIon или последовательности, комплементарные им или их фрагментам, в частности, последовательности, включающие по меньшей мере один из двуаллельных маркеров, в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно по меньшей мере один из двуаллельных маркеров А1-А17. Предпочтительно, фрагменты составляют по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину. В других вариантах осуществления настоящего изобретения данные фрагменты содержат по меньшей мере 25 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные фрагменты содержат по меньшей мере 50 нуклео-тидов в длину. Более предпочтительно, если данные фрагменты содержат по меньшей мере 100 нуклео-тидов в длину. В других предпочтительных вариантах фрагменты содержат более 100 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные фрагменты могут содержать более 500 нуклеотидов в длину.
Например, количественный анализ экспрессии CanIon-гена можно осуществлять с помощью микронабора комплементарной ДНК, как описано у Schena и соавт. (1995 и 1996). Полноразмерные кДНК CanIon или их фрагменты амплифицируют с помощью ПЦР и выкладывают из 96-луночного планшета для микротитрования на силилированные предметные стекла для микроскопа с использованием высокоскоростной роботехники. Отпечатанные наборы инкубируют во влажной камере, чтобы обеспечить обводнение элементов набора, и ополаскивают однократно в 0,2% SDS в течение 1 мин, дважды в воде в течение 1 мин и однократно в течение 5 мин в растворе борогидрида натрия. Данные наборы погружают в воду на 2 мин при 95°С, переносят в 0,2% SDS на 1 мин, дважды ополаскивают водой, сушат на воздухе и хранят в темноте при 25°С.
Клеточную или тканевую мРНК выделяют или закупают, а зонды получают с помощью обратной транскрипции за один цикл. Зонды гибридизуют с 1 см2 микронабором под стеклянным покровным стеклом с размером 14 х 14 мм в течение 6-12 ч при 60°С. Наборы отмывают в течение 5 мин при 25°С в нежестком промывочном буфере (1 х SSC/0,2% SDS), затем в течение 10 мин при комнатной температуре в очень строгом промывочном буфере (0,1 х SSC/0,2% SDS). Наборы сканируют в 0,1 х SSC с использованием флуоресцентного лазерного сканирующего устройства, совпадающего с обычным фильтровальным набором. Точные измерения дифференциальной экспрессии получают благодаря средним соотношениям двух независимых гибридизаций.
Количественный анализ экспрессии CanIon-гена можно также осуществить с помощью полноразмерных кДНК CanIon или их фрагментов в наборе комплементарных ДНК, как описано у Pietu и соавт. (1996). Полноразмерную CanIon-кДНК или ее фрагменты амплифицируют ПЦР и распределяют на мембранах. Затем мРНК, происходящие из разных тканей или клеток, метят радиоактивными нуклеотидами. После гибридизации и отмывки в контролируемых условиях с помощью фосфорной визуализации или радиоавтографией выявляют гибридизованные мРНК. Проводят повторные эксперименты и затем осуществляют количественный анализ по разному экспрессируемых мРНК.
Альтернативно, экспрессионный анализ с использованием геномной ДНК CanIon, кДНК CanIon или ее фрагментов можно сделать с помощью нуклеотидных наборов высокой плотности, как описано у Lockhart и соавт. (1996) и Sosnowsky и соавт. (1997). Олигонуклеотиды в 15-20 нуклеотидов из последовательностей геномной ДНК CanIon или кДНК-последовательностей CanIon, особенно тех из них, которые включают по меньшей мере один из двуаллельных маркеров, в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно по крайней мере один из двуаллельных маркеров, выбранных из группы, состоя
- 73 -
008252
щей из А1-А17 или комплементарных им последовательностей, синтезируют непосредственно на чипе (Lockhart и соавт., выше) или синтезируют и затем переносят на чип (Sosnowski и соавт., выше). Предпочтительно, длина олигонуклеотидов составляет около 20 нуклеотидов.
Зонды кДНК CanIon, меченые с помощью соответствующего соединения, такого как биотин, дигок-сигенин или флуоресцентный краситель, синтезируют из соответствующей мРНК-популяции и затем фрагментируют случайным образом на куски размером 50-100 нуклеотидов. Затем данные зонды гибри-дизуют с чипом. После отмывки, как описано у Lockhart и соавт., выше, и приложения разных электрических полей (Sosnowski и соавт., 1997) красители или меченные соединения выявляют и количественно определяют. Осуществляют повторные гибридизации. Сравнительный анализ интенсивности сигнала, идущего от кДНК-зондов на одном и том же олигонуклеотиде-мишени в разных образцах кДНК, свидетельствует о разной экспрессии мРНК CanIon.
Способы ингибирования экспрессии CanIon-гена
Другие терапевтические композиции, в соответствии с настоящим изобретением, включают олиго-нуклеотидный фрагмент нуклеиновой последовательности CanIon в качестве антисмыслового инструмента или трехспирального инструмента, который ингибирует экспрессию соответствующего CanIon-гена. Предпочтительный фрагмент нуклеиновой последовательности CanIon включает аллель по меньшей мере одного из двуаллельных маркеров А1-А17.
Антисмысловой способ
Предпочтительные способы использования антисмысловых полинуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, представлены методами, описанными у Sczakiel и соавт. (1995).
Предпочтительно, антисмысловые инструменты выбраны из полинуклеотидов (длиной 15-200 т.п.н.), которые комплементарны 5'-концу CanIon-мРНК. В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют сочетание разных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных разным частям требуемого гена-мишени.
Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, комплементарны последовательностям мРНК CanIon, которые содержат кодон инициации трансляции ATG либо донорный, либо акцепторный сайт сплайсинга.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты должны обладать длиной и температурой плавления, позволяющими образовать внутриклеточный дуплекс достаточной стабильности для ингибирования экспрессии CanIon-мРНК в этом дуплексе. Методология создания антисмысловых нуклеиновых кислот, пригодных для использования в генной терапии, приводится у Green и соавт. (1986) и Izant and Weintraub (1984), раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки.
В некоторых методах антисмысловые молекулы получают путем изменения ориентации CanIon-кодирующей области относительно промотора так, чтобы транскрибировать цепь, противоположную той, которая нормально транскрибируется в данной клетке.
Антисмысловые молекулы можно транскрибировать с использованием in vitro систем транскрипции, таких как те, которые используют Т7- или SР6-полимеразу для создания транскрипта. Другой подход включает в себя транскрипцию антисмысловых нуклеиновых кислот CanIon in vivo в результате функционального присоединения ДНК, содержащей антисмысловую последовательность, к промотору в соответствующем экспрессионном векторе.
Альтернативно, подходящие антисмысловые методы представляют собой те методы, которые описаны у Rossi и соавт. (1991), в международных заявках №№ WO 94/23026, WO 95/04141, WO 92/18522 и в европейской патентной заявке № ЕР 0572287А2.
Альтернатива антисмысловой технологии, которая используется в соответствии с настоящим изобретением, включает использование рибозимов, которые связываются с последовательностью-мишенью с помощью их комплементарных полинуклеотидных хвостов, которые расщепляют соответствующую РНК в результате гидролиза ее сайта-мишени (а именно рибозимов в форме "головки молотка"). Вкратце, упрощенный цикл рибозима в форме "головки молотка" включает (1) последовательность, специфически связывающуюся с РНК-мишенью с помощью комплементарных антисмысловых последовательностей; (2) сайт-специфичный гидролиз расщепляемого мотива цепи-мишени; и (3) высвобождение расщепляемых продуктов, которые дают начало другому каталитическому циклу. Действительно, использование длинноцепочечного антисмыслового полинуклеотида (по меньшей мере, длиной 30 оснований) или ри-бозимов с длинными антисмысловыми плечами дает преимущество. Предпочтительная система доставки для антисмыслового рибозима осуществляется в результате ковалентного связывания таких антисмысловых рибозимов с липофильными группами или с использованием липосом в качестве удобного вектора. Предпочтительные антисмысловые рибозимы, в соответствии с настоящим изобретением, получают как описано у Sczakiel и соавт. (1995), причем специфические методы получения, на которые ссылаются в указанной статье, включены здесь путем ссылки.
Трехспиральный метод
Геномную ДНК CanIon можно также использовать для подавления экспрессии CanIon-гена на основе внутриклеточного трехспирального образования.
Трехспиральные олигонуклеотиды используются для подавления транскрипции из генома. Они осо
- 74 -
008252
бенно пригодны для изучения изменений клеточной активности при их ассоциации с конкретным геном.
Аналогично, часть геномной ДНК CanIon можно использовать для изучения эффекта ингибирова-ния транскрипции CanIon в клетке. Традиционно гомопуриновые последовательности считают наиболее пригодными для трехспиральных методов. Но и гомопиримидиновые последовательности также могут подавлять экспрессию гена. Такие гомопиримидиновые олигонуклеотиды связываются с большой бороздкой в гомопурин: гомопиримидиновых последовательностях. Поэтому, в рамках настоящего изобретения рассматриваются оба типа последовательностей геномной ДНК CanIon.
Для осуществления методов генной терапии с использованием трехспирального подхода, последовательности геномной ДНК CanIon прежде всего сканируют для того, чтобы идентифицировать 10-мерные - 20-мерные гомопиримидиновые или гомопуриновые участки, которые могли бы использоваться в методах, основанных на трех спиралях, для подавления экспрессии CanIon. После идентификации кандидатных гомопиримидиновых или гомопуриновых участков, их эффективность в подавлении экспрессии CanIon определяют путем введения в клетки тканевой культуры, в которой экспрессируется Can-Ion-ген, изменяющихся количеств олигонуклеотидов, содержащих последовательности-кандидаты.
Данные олигонуклеотиды можно вводить в клетки с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, включающих, но не ограниченных ими, кальций-фосфатное осаждение, DEAE-Декстран, электропорацию, липосом-опосредованную трансфекцию или нативное поглощение.
Обработанные клетки отслеживают по измененной клеточной функции или сниженной CanIon-экспрессии с использованием таких методов, как Нозерн-блоттинг, метод защиты от РНКазы или методы на основе ПЦР для определения уровней транскрипции CanIon-гена в клетках, которые были обработаны данным олигонуклеотидом.
Олигонуклеотиды, которые оказываются эффективными в подавлении генной экспрессии в клетках тканевой культуры, можно затем ввести in vivo с использованием описанных выше методов антисмыслового подхода в дозе, рассчитанной на основе результатов in vitro, как описано для антисмыслового подхода.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения природные (бета) аномеры олиго-нуклеотидных элементов можно заменить альфа-аномерами для придания данному олигонуклеотиду большей устойчивости к нуклеазам. Кроме того, интеркалирующий агент, такой как бромистый этидий и т.п., можно присоединить к 3'-концу альфа-олигонуклеотида, чтобы стабилизировать трехнитевую структуру. Информацию об образовании олигонуклеотидов, подходящих для трехнитевого образования, см. в работе Griffin и соавт. (1989), которая таким образом включена с помощью данной ссылки.
Фармацевтические композиции и рецептурные составы Соединения, модулирующие CanIon
С использованием описанных в данном описании способов можно идентифицировать соединения-агонисты или антагонисты Canlon, которые селективно модулируют активность Canlon in vitro и in vivo. Настоящее изобретение включает, таким образом, способы лечения шизофрении, биполярного расстройства или любые иные описанные в данном описании заболевания или состояния пациентов, включающие введение эффективного количества соединения, модулирующего CanIon. Предпочтительно, указанное соединение представляет собой селективно CanIon-модулирующее соединение. Соединения, идентифицируемые способом настоящего изобретения, включают, например, антитела, обладающие связывающей специфичностью для CanIon-полипептида человека. Предполагается, что гомологи CanIon могут быть пригодны для модулирования CanIon-опосредованной активности и связанного с ней физиологического состояния, ассоциированного с шизофренией или биполярным расстройством. Кроме того, вообще предполагается, что способы анализа настоящего изобретения, базирующиеся на роли CanIon в нарушении центральной нервной системы, могут быть пригодны для идентификации соединений, способных воздействовать на каскадный анализ настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пациента, страдающего шизофренией или биполярным расстройством, лечат путем введения данному пациенту фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество антагониста CanIon.
Показания
Несмотря на то, что CanIon связан с геномной областью, ассоциированной с шизофренией и биполярным расстройством, показания на использование CanIon могут включать различные нарушения центральной нервной системы. Предполагается, что нарушения нервной системы обладают комплексной генетической основой и часто характеризуются общими симптомами. В частности, как описано в данном описании, показания могут включать шизофрению и другие психические расстройства, социальные расстройства, аутизм, зависимость от химических веществ и алкоголизм, нарушения болевых ощущений, эпилепсию, задержку психического развития, и другие психические заболевания, включая когнитивную функцию, страх, нарушение функции принятия пищи, нарушение функции мотивации и расстройство личности, которые определяются в соответствии с четвертым изданием классификации Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV). Кроме того, много сердечно-сосудистых расстройств, такие как стенокардия, гипертензия и аритмии, можно также лечить с использованием модуляторов Can-Ion, предпочтительно антагонистов.
- 75 -
008252
Фармацевтические рецептурные составы и способы введения
Соединения, идентифицированные с использованием способов настоящего изобретения, можно вводить млекопитающему, в том числе больному человеку, отдельно или в виде фармацевтических композиций, в которых они смешаны с подходящими носителями или наполнителем(ями) в терапевтически эффективных дозах, для лечения или улучшения состояния больного шизофренией или биполярным расстройством и близкими расстройствами.
Терапевтически эффективная доза относится еще и к такому количеству соединения, которое достаточно для улучшения симптомов, как определено описанными в данном описании способами. Предпочтительно, терапевтически эффективная дозировка применима для продолжительного периодического использования или введения. Методы подбора состава и введения соединений настоящей заявки можно найти в "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание.
Способы введения
Подходящие способы введения включают пероральное, ректальное, трансмукозальное или инте-стинальное введение, парентеральную доставку, в том числе внутримышечные, подкожные, внутримоз-говые инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшин-ные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Особенно пригодный способ введения соединения для лечения заболевания центральной нервной системы включает хирургическую имплантацию устройства для доставки соединения в течение продолжительного периода времени. В частности, рассматривается длительное высвобождение рецептурных составов заявляемых лекарственных средств.
Композиция/Рецептурная смесь
Фармацевтические композиции и лекарственные средства для применения в соответствии с настоящим изобретением формируют традиционным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества. Оптимальный рецептурный состав зависит от выбранного способа введения.
Для инъекции, агенты настоящего изобретения можно ввести в водные растворы, предпочтительно физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой раствор, такой как фосфатный или бикарбонатный буфер. Для трансмукозального введения в рецептурной смеси можно использовать смачивающие вещества, подходящие для прохождения через буфер. Такие смачивающие вещества в большинстве случаев известны в данной области техники.
Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, включают сделанные из желатины раздвижные капсулы, а также сделанные из желатины и пластификатора, такого как глицерин или сорбит, герметичные капсулы. Раздвижные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связывающими веществами, такими как крахмалы, и/или лубри-кантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах данные активные соединения могут находиться в растворенном состоянии, или быть суспендированными в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленовые гликоли. Кроме того, можно добавить стабилизаторы. Все рецептурные смеси для перорального введения должны быть дозированы для такого введения.
Для трансбуккального введения данные композиции можно создавать в виде таблеток или лепешек традиционным способом.
Для введения путем ингаляции используемые соединения настоящего изобретения удобно доставлять в виде распыляемого аэрозоля, находящегося в герметичной упаковке или в аэрозольном аппарате, с использованием соответствующего газа-вытеснителя, например, диоксида углерода. В случае герметизированного аэрозоля дозированную единицу можно определить с помощью клапана, обеспечивающего получение любого контролируемого количества аэрозоля. Капсулы и ампулы, например, из желатины, для использования в ингаляторе или инсуффляторе, можно создать в виде рецептурной смеси, содержащей порошок данного соединения и соответствующую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
Можно создать составные соединения для парентерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывного вливания. Рецептурные смеси для инъекции можно представить в виде дозированной формы, например, в ампулах или в виде упаковки лекарственного средства для многократного приема с добавлением консерванта. Данные композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в водных носителях, и могут содержать фармакологические агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
Фармацевтические рецептурные смеси для парентерального введения включают водные растворы данных активных соединений в водорастворимой форме. Водные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость данной суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декст-ран. Факультативно указанная суспензия может также содержать соответствующие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость данных соединений, обеспечивая получение высококонцентрированных растворов.
Альтернативно, данный активный ингредиент может находиться в порошковой или лиофилизован-ной форме для связывания перед использованием с соответствующим растворителем, таким как стерильная апирогенная вода.
- 76 -
008252
Кроме того, помимо описанных выше рецептурных смесей, данные соединения можно составить в виде препаратов-депо. Такие рецептурные смеси длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Поэтому, например, данные соединения можно включить в препарат вместе с полимерным или гидрофобным веществом (например, в виде эмульсии в соответствующем масле) или с ионообменными смолами, или с малорастворимыми производными, например, в виде малорастворимой соли.
Кроме того, данные соединения можно доставлять с использованием системы с замедленным высвобождением, такой как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих данный терапевтический агент. Были созданы различные вещества с замедленным высвобождением, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Капсулы с замедленным высвобождением, в зависимости от их химической природы, могут высвобождать данные соединения в течение нескольких недель вплоть до 100 дней.
В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического агента можно применять дополнительные методы для стабилизации белка.
Фармацевтические композиции могут также включать соответствующую твердую или гелевую фазу-носитель или фазу-наполнитель. Примеры таких носителей или наполнителей включают, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатину и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.
Эффективное дозирование
Фармацевтические композиции, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в эффективном количестве для достижения их предполагаемой цели. В частности, терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное для предотвращения развития или смягчения существующих симптомов подвергнутого лечению больного. Определение эффективных количеств находится в рамках возможностей специалиста в данной области техники, особенно в свете представленного в данном описании подробного описания.
Для любого соединения, используемого в данном способе настоящего изобретения, терапевтически эффективную дозу можно исходно определить в клеточной культуре и дозу можно разработать для животных моделей. Такие сведения можно использовать для более точного определения пригодных доз для человека.
Терапевтически эффективная доза имеет отношение к такому количеству данного соединения, которое приводит к ослаблению симптомов у больного. Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (летальная доза для 50% тестируемой популяции) и ED50 (терапевтически эффективная доза для 50% тестируемой популяции). Дозовое соотношение между токсическим и терапевтическим эффектами соответствует терапевтическому индексу лекарства и может быть выражено в виде соотношения между LD50 и ED50. Соединения, которые проявляют высокие терапевтические индексы, предпочтительны.
Данные, полученные в этих исследованиях клеточных культур и животных, можно использовать для определения диапазона дозирования применительно к человеку. Дозирование таких соединений находится предпочтительно в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED50, с небольшой или в отсутствие токсичности. Дозировка может варьировать в зависимости от вида используемой дозы и способа ее введения. Точный состав, способ введения и дозировку может выбрать каждый врач, обследующий состояние пациента (См., например, Fingl и соавт. 1975, в "Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1).
Варианты осуществления настоящего изобретения, связанные с применением компьютера
Используемый в данном описании термин "коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения" включают в себя нуклеотидные последовательности, включающие, в основном состоящие, состоящие из любого нижеследующего: а) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 10000 нуклеотидов SEQ ID No 1-3; b) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов SEQ ID No 4 или ее комплементов; с) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, где указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А17; d) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов SEQ ID No 6; е) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов SEQ ID No 6, где указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер А18; и f) нуклеотидной последовательности, комплементарной любой из предшествующих нуклеотид-ных последовательностей.
Кроме того, "коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения" включают нуклеотидные последовательности, гомологичные: а) непрерывному участку последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 10000 нуклео
- 77 -
008252
тидов SEQ ID No 1-3; b) непрерывному участку последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов SEQ ID No 4; с) непрерывному участку последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов SEQ ID No 6; и d) последовательностям, комплементарным любой предшествующей последовательности.
Гомологичные последовательности относятся к последовательности, обладающей по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80 или 75% гомологией с данными непрерывными участками последовательности. Гомологию можно определить с использованием любого описанного в данном описании способа, в том числе BLAST2N со значениями параметров по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами. Гомологичные последовательности могут также включать РНК-последовательности, в коде нуклеиновых кислот которых настоящего изобретения уридины заменяют тимином. Следует иметь ввиду, что коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть представлены традиционным односимвольным форматом (См. внутреннюю заднюю сторону книги Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd edition. W.H.Freeman & Co., New York) или любым иным форматом или кодом, который регистрирует идентичность нуклеотидов в последовательности.
Используемый в данном описании термин "полипептидные коды настоящего изобретения" включает в себя полипептидные последовательности, включающие непрерывный участок последовательности,
по меньшей мере, из 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400,
1600 или 1700 аминокислот SEQ ID No 5. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности включает, по меньшей мере, 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481,
1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 SEQ ID No 5. Следует иметь ввиду, что
полипептидные коды настоящего изобретения могут быть представлены в традиционном односимвольном формате или трехбуквенном формате (См. внутреннюю заднюю сторону книги Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd edition. W.H. Freeman & Co., New York) или в любом ином формате или коде, который регистрирует идентичность полипептидов в последовательности.
Для специалистов в данной области техники является понятным, что коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения и полипептидные коды настоящего изобретения могут сохраняться, регистрироваться и обрабатываться на любом носителе, который может быть прочитан с помощью компьютера и предоставлен ему. Используемые в данном описании термины "регистрировать" и "сохранять" относятся к способу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалистам в данной области техники легко усвоить любой из ныне известных способов записи информации на компьютерном носителе в пригодном для чтения виде, созданном производителями, включающим один или несколько кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или один или несколько полипептидных кодов настоящего изобретения. Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что компьютерный носитель, пригодный для чтения, обладает записью на нем, по меньшей мере, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что компьютерный носитель, пригодный для чтения, обладает записью на нем, по меньшей мере, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 полипептидных кодов настоящего изобретения.
Компьютерный носитель, пригодный для чтения, включает магнитный носитель, пригодный для чтения, оптический носитель, электронный носитель, пригодный для чтения, и магнитнооптический носитель. Например, компьютерный носитель, пригодный для чтения, может быть представлен жестким диском, дискетой, магнитной лентой, CD-ROM, цифровым универсальным диском (DVD), запоминающим устройством прямого доступа (RAM) или постоянными запоминающими устройствами (ROM), а также другими видами носителей, известных специалистам в данной области техники.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают системы, в частности компьютерные системы, которые сохраняют и контролируют описанную в данном описании информацию о последовательности. Один из примеров компьютерной системы 100 иллюстрируется в виде блока диаграмм на фиг. 2. Используемый в данном описании термин "компьютерная система" относится к компонентам технического обеспечения, а данные компонентов сохранения используются для анализа нуклеотидных последовательностей кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или аминокислотных последовательностей полипептидных кодов настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100 представляет собой сервер Sun Enterprise 1000 (Sun Microsystems, Palo Alto, CA). Компьютерная система 100 предпочтительно включает процессор для обработки данных, а также доступа и контроля данных о последовательности. Процессор 105 может представлять собой любой из хорошо известных типов процессорных элементов, такой как Pentium III от Intel Corporation, или аналогичный процессор от Sun, Motorola, Compaq or International Buisness Machines.
Предпочтительно, компьютерная система 100 представляет собой основную целевую систему, которая включает процессор 105 и один или несколько внутренних компонентов 110 хранения данных для сохранения данных и одно или несколько поисковых устройств для поиска данных, сохраняемых в компонентах хранения данных. Специалистам в данной области следует иметь ввиду, что годится любая из ныне существующих компьютерных систем.
- 78 -
008252
В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100 включает процессор 105, который соединен шиной, которая соединяется с основным запоминающим устройством 115 (предпочтительно представленным в виде RAM) и одним или несколькими внутренними устройствами 110 сохранения памяти, такими как накопитель на жестких дисках и/или иные компьютерные носители для чтения, обладающие записанными данными. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100, кроме того, включает одно или несколько поисковых устройств 118 для чтения сохраненных данных на внутренних устройствах 110 сохранения данных.
Поисковое устройство данных 118 может представлять собой, например, дисковод для дискеты, дисковод для компакт-диска, накопитель для магнитной ленты и т.д. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения внутреннее устройство 110 для сохранения данных представляет собой съемный компьютерный носитель для чтения, такой как дискета, компакт-диск, магнитная лента и т. д., содержащий логическую схему управления и/или записанные данные. Компьютерная система 100 может преимущественно включать или программироваться с помощью соответствующего программного обеспечения для прочтения логической схемы управления и/или данных из компонента хранения данных, однажды введенных в устройство поиска данных.
Компьютерная система 100 включает дисплей 120, который используется для выведения данных на экран пользователя компьютера. Следует также иметь в виду, что компьютерную систему 100 можно подсоединить к другим компьютерным системам 125а-с в сеть или в глобальную сеть для создания централизованного доступа в компьютерную систему 100.
Программное обеспечение для доступа и обработки данных по нуклеотидным последовательностям кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или по аминокислотным последовательностям полипептидных кодов настоящего изобретения (таких как инструменты поиска, инструменты сравнения и инструменты моделирования и т.п.) могут постоянно храниться в основной памяти 115 в период исполнения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100 может, кроме того, включать программу сравнения последовательности для сравнения указанных выше кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидных кодов настоящего изобретения, сохраняемых на компьютерном носителе для прочтения, со стандартной нуклеотидной или полипептидной последовательностями, сохраняемыми на компьютерном носителе для прочтения. "Программа сравнения последовательности" относится к одной или нескольким программам, которые выполняются на компьютерной системе 100 для сравнения нуклеотидной или полипептидной последовательностей с другими нуклеотидными или полипептидными последовательностями и/или соединениями, включающими, но не ограничивающимися ими, пептиды, пептидомиметики и химические агенты, хранимые в средствах хранения данных. Например, программа сравнения последовательности может сравнить нуклеотидные последовательности кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или аминокислотные последовательности полипептидных кодов настоящего изобретения, сохраняемые на компьютерном носителе для прочтения, со стандартными последовательностями, сохраняемыми в компьютерном носителе для прочтения, чтобы идентифицировать гомологи, мотивы, вовлеченные в биологическую функцию, или структурные мотивы. Разнообразные программы сравнения последовательности, идентифицированные в данном патентном описании, подразумевают в частности использование данного аспекта настоящего изобретения.
На фиг. 3 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов процесса 200 для сравнения новой нуклеотидной или полипептидной последовательности с последовательностями базы данных с тем, чтобы определить уровень гомологии между данной новой последовательностью и последовательностями из базы данных. Последовательности из базы данных могут представлять собой собственную базу данных, сохраняемую в компьютерной системе 100, или общедоступную базу данных, такую как GENBANK, PIR OR SWISSPROT, которые доступны через Интернет.
Процесс 200 начинают со стартового положения 201 и затем перемещают в положение 202, в котором сравниваемая новая последовательность хранится в памяти компьютерной системы 100. Как указано выше, память может быть представлена памятью любого типа, в том числе RAM или внутренним запоминающим устройством.
Затем процесс 200 перемещается в положение 204, в котором последовательности базы данных открыты для анализа и сравнения.
Процесс 200 затем перемещается в положение 206, в котором первая последовательность, хранимая в базе данных, прочитывается в память данного компьютера. Затем осуществляют сравнение в положении 210, чтобы определить является ли первая последовательность той же, что и вторая последовательность. Важно отметить, что данный шаг не ограничивается осуществлением точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью базы данных. Хорошо известные способы для сравнения двух нуклеотидных или полипептидных последовательностей, даже если они не идентичны, известны специалистам в данной области техники. Например, в одну из последовательностей можно ввести пробелы для того, чтобы повысить уровень гомологии между двумя тестируемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют ввод пробелов и иных особенностей в последовательность во время сравнения, обычно вводит пользователь данной компьютерной системы.
После осуществления сравнения двух последовательностей в положении 210, определение произ
- 79 -
008252
водят в положении 210, являются ли две данные последовательности одинаковыми. Понятно, что термин " одинаковые" не ограничивается абсолютно идентичными последовательностями. Последовательности, которые находятся в гомологичных параметрах, введенных пользователем, будут помечены в процессе 200 как "одинаковые".
Если сделано определение, что данные две последовательности являются одинаковыми, процесс 200 перемещают в положение 214, в котором название последовательности из базы данных выводится пользователем на дисплей. Данное положение извещает пользователя о том, что последовательность с выведенным названием удовлетворяет введенной ограниченной гомологии. После того как наименование сохраняемой последовательности демонстрируется пользователю, процесс 200 перемещается в положение 218, в котором определяют, имеются ли еще в базе данных последовательности. Если в базе данных нет больше последовательностей, тогда процесс 200 завершают в конце положения 220. Однако, если в базе данных имеются еще последовательности, то процесс 200 перемещают в положение 224, где курсор передвигают к следующей последовательности базы данных так, что ее можно сравнить с новой последовательностью. Таким образом, новую последовательность выравнивают и сравнивают с каждой последовательностью базы данных.
Следует отметить, что если определение выполнено в положении 212, в котором последовательности не является гомологами, тогда процесс 200 следует двигать сразу в положение 218 для того, чтобы определить, доступны ли другие последовательности базы данных для сравнения.
Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения представляет собой компьютерную систему, включающую процессор, устройство сохранения данных, обладающее сохраненным в нем кодом нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидным кодом настоящего изобретения, устройство для сохранения данных, обладающее восстановимо сохраненными стандартными нуклеотидны-ми последовательностями или полипептидными последовательностями, сравниваемыми с кодом нуклеиновых кислот настоящего изобретения или с полипептидным кодом настоящего изобретения, и программой сравнения последовательности для осуществления сравнения. Программа сравнения последовательности может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать мотивы, вовлеченные в биологическую функцию, а также структурные мотивы кода нуклеиновых кислот настоящего изобретения и полипептидных кодов настоящего изобретения, или она может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с данными кодами нуклеиновых кислот и с полипептидными кодами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения устройство сохранения данных может хранить в себе последовательности, по меньшей мере, из 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидных кодов настоящего изобретения.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ определения уровня гомологии между кодом нуклеиновых кислот настоящего изобретения и стандартной нуклеотидной последовательностью, включающей стадии прочтения кода нуклеиновых кислот и стандартной нуклеотидной последовательности путем использования компьютерной программы, которая определяет уровень гомологии, и определяет гомологию между кодом нуклеиновых кислот и стандартной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы.
Компьютерная программа может представлять собой любую из числа компьютерных программ по определению уровней гомологии, включая те, которые перечислены в данном описании, включая BLAST2N со значениями параметров по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами. Данный способ можно реализовать с использованием описанных выше компьютерных систем. Данный способ можно также осуществить путем прочтения 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 описанных выше кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения через использование данной компьютерной программы и определения гомологии между кодами нуклеиновых кислот и стандартными нуклеотидными последовательностями.
На фиг. 4 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов осуществления процесса 250 в компьютере для определения гомологичности двух последовательностей. Процесс 250 начинают с запуска в положении 252, а затем перемещают в положение 254, в котором первую сравниваемую последовательность сохраняют в память. Затем и вторую сравниваемую последовательность сохраняют в память в положении 256. После этого процесс 250 перемещают в положение 260, в котором прочитывают первый символ первой последовательности, и перемещают в положение 262, в котором прочитывают первый символ второй последовательности. Следовало бы иметь в виду, что если данная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, то, как правило, символ должен быть либо А, Т, С, G, либо U. Если же данная последовательность представляет собой белковую последовательность, то она должна находиться в однобуквенном аминокислотном коде с тем, чтобы можно было легко сравнить первую и последующие последовательности.
Затем определяют тождественность двух символов в положении 264. Если они тождественны, то процесс 250 перемещают в положение 268, в котором прочитывают очередные символы в первой и второй последовательностях. Затем определяют тождество следующих символов. Если они тождественны, то процесс 250 продолжает этот цикл до двух символов, которые не тождественны. Если определят, что
- 80 -
008252
эти следующие два символа не тождественны, процесс 250 перемещают в положение 274, чтобы еще определить наличие символов для прочтения в любой последовательности.
Если символы для прочтения отсутствуют, то процесс 250 перемещают в положение 276, в котором уровень гомологии между первой и второй последовательностями выводится данному пользователю. Уровень гомологии определяют путем вычисления доли символов в последовательностях, которые были одинаковыми из общего числа символов для первой последовательности. Таким образом, если каждый символ первой 100 нуклеотидной последовательности совместить с каждым символом второй последовательности, то уровень гомологии составит 100%.
Альтернативно, компьютерная программа может представлять собой компьютерную программу, которая сравнивает нуклеотидные последовательности кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения со стандартной последовательностью нуклеиновой кислоты по одной или нескольким позициям. Факультативно такая программа регистрирует длину и идентичность встроенных, делетированных или замещенных нуклеотидов по отношению к последовательности стандартного полинуклеотида, либо кода нуклеиновых кислот настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет в нуклеотид-ных последовательностях кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения присутствие одного или нескольких полиморфизмов единственного нуклеотида (SNP) по отношению к стандартной нуклеотид-ной последовательности. Каждый полиморфизм единственного нуклеотида может включать замену, вставку или делецию единственного основания.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ определения уровня гомологии между полипептидным кодом настоящего изобретения и последовательностью стандартного полипептида, включающий стадии прочтения полипептидного кода настоящего изобретения и последовательности стандартного полипептида путем использования компьютерной программы, которая определяет уровни гомологии, и определения гомологии между полипептидным кодом и последовательностью стандартного полипептида, используя компьютерную программу.
Соответственно, другой аспект настоящего изобретения представляет способ определения кода нуклеиновых кислот, отличающегося по одному или нескольким нуклеотидам от стандартной нуклео-тидной последовательности, включающий стадии прочтения кода данной нуклеиновой кислоты и стандартной нуклеотидной последовательности путем использования компьютерной программы, которая идентифицирует различия между последовательностями нуклеиновой кислоты, и идентификации различий между кодом данной нуклеиновой кислоты и данной стандартной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данная компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует полиморфизмы единственных нуклеотидов. Данный способ можно осуществить с помощью описанных выше компьютерных систем и способа, проиллюстрированного на фиг. 4. Данный способ можно также осуществить в результате прочтения, по меньшей мере, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения и стандартных нуклеотидных последовательностей, через использование данной компьютерной программы, и идентификации различий между кодами данной нуклеиновой кислоты и данными стандартными нуклеотидными последовательностями с помощью данной компьютерной программы.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения компьютерная система, кроме того, может включать идентификатор, идентифицирующий элементы в нуклеотидных последовательностях кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или в аминокислотных последовательностях полипептидных кодов настоящего изобретения.
"Идентификатор" относится к одной или нескольким программам, которые идентифицируют определенные элементы в описанных выше нуклеотидных последовательностях кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или в аминокислотных последовательностях полипептидных кодов настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения идентификатор может включать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания в кДНК-кодах настоящего изобретения.
На фиг. 5 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов идентификатора процесса 300 по выявлению присутствия элемента в последовательности. Процесс 300 начинается с начального положения 302 и затем перемещается в положение 304, в котором первая последовательность, проверенная по элементам, сохраняется в памяти 115 компьютерной системы 100. Затем процесс 300 перемещается в положение 306, в котором открываются элементы последовательности базы данных. Такая база данных должна включать список символов каждого элемента в соответствии с наименованием данного элемента. Например, названный элемент мог бы представлять собой "Кодон Инициации", а символом мог бы быть "ATG". Другой пример элемента мог бы именоваться "ТААТАА Box", а символ данного элемента был бы "ТААТАА". Пример такой базы данных выпускается University of Wisconsin Genetics Computer Group (www.gcg.com).
После того, как базу данных элементов открыли в положении 306, процесс 300 перемещается в положение 308, в котором первый элемент прочитывается из данной базы данных. Сравнение символа первого элемента с первой последовательностью затем осуществляют в положении 310. Затем осуществляют определение в положении 316 по нахождению символа элемента в первой последовательности. Если
- 81 -
008252
символ обнаруживается, тогда процесс 300 перемещается в положение 318, в котором наименование найденного элемента выводится на экран дисплея пользователя.
Затем процесс 300 перемещается в положение 320, в котором определяют движущиеся элементы, существующие в данной базе данных. Если элементов больше нет, то процесс 300 завершают в конце положения 324. Однако, если в данной базе данных имеются еще элементы, то процесс 300 прочитывает элемент следующей последовательности в положении 326 и цикл возвращают в положение 310, в котором символ следующего элемента сравнивают с символом элемента первой последовательности.
Следует отметить, что если символ элемента не обнаруживается в первой последовательности в положении 316, то процесс 300 перемещается сразу в положение 320 для того, чтобы определить существование других элементов в данной базе данных.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения идентификатор может включать программу молекулярного моделирования, которая определяет 3-мерную структуру полипептидов и кодов настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения программа молекулярного моделирования идентифицирует последовательности-мишени, которые в большинстве своем совместимы с профилями, представляющими структурную конфигурацию остатков в известных трехмерных белковых структурах (см., например, патент США № 5436850). В другом методе известные трехмерные структуры белков данного семейства накладывают одну на другую, чтобы определить структурно консервативные области в этом семействе. Эта белок-моделирующая методика также использует известную трехмерную структуру гомологичного белка для аппроксимации структуры полипептидных кодов настоящего изобретения (см., например, патент США №5557535). Традиционные методы моделирования гомологии использовали, как обычно принято, для построения моделей протеаз или антител (Sowdhamini и соавт. (1997)). Сравнительные подходы могут также использоваться для построения трехмерных моделей белка, если представляющий интерес белок обладает последовательностью, плохо идентифицирующейся с матричными белками. В некоторых случаях белки свернуты в сходные трехмерные структуры, несмотря на то, что их последовательности характеризуются очень низкой идентичностью. Например, трехмерные структуры ряда спиральных цитокинов скручены в сходную трехмерную топологию, несмотря на слабую гомологию последовательностей.
Недавно созданные способы поточной обработки данных в настоящее время делают возможной идентификацию паттернов вероятностной упаковки для ряда ситуаций, где структурная связанность между мишенью и матриц(ей)ами не выявляется на уровне последовательностей. В гибридных способах, в которых распознавание укладки осуществляется с использованием Multiple Sequence Threading (Поточная обработка данных для множества последовательностей), структурная эквивалентность выводится по данным поточной обработки с использованием программы метрической геометрии DRAGON для создания модели с низким разрешением, а полностью атомизированное отображение создают с использованием пакета молекулярного моделирования, такого как QUANTA.
В соответствии с данным 3-стадийным методом матрицы-кандидаты сначала идентифицируют с использованием нового алгоритма распознавания упорядоченной укладки MST, который способен осуществлять одновременную поточную обработку множества совмещенных последовательностей в одну или несколько 3-D структур. На второй стадии структурные эквиваленты, полученные по выходным данным MST, преобразуют в ограничения промежутков между остатками и вводят в программу метрической геометрии DRAGON, вместе с вспомогательной информацией, полученной из прогноза о вторичной структуре. Данная программа объединяет ограничения для несмещенного способа и быстро создает большое число подтверждений модели с низким разрешением. На третьей стадии эти подтверждения модели с низким разрешением преобразуют в полностью атомизированные модели и подвергают энергетической минимизации с использованием пакета молекулярного моделирования QUANTA (см., например, Aszodi и соавт. (1997)).
Результаты анализа молекулярного моделирования используют затем в методах по рациональному созданию лекарственного средства, чтобы идентифицировать агенты, которые модулируют активность полипептидных кодов настоящего изобретения.
В соответствии с этим другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ идентификации элемента в кодах нуклеиновых кислот настоящего изобретения или в полипептидных кодах настоящего изобретения, включающий прочтение кода(ов) или полипептидного кода(ов) нуклеиновых кислот через использование компьютерной программы, которая идентифицирует элементы в ней, и идентификацию элементов в коде(ах) нуклеиновых кислот или в полипептидном(ых) коде(ах) с помощью данной компьютерной программы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная программа включает компьютерную программу, которая идентифицирует открытые рамки считывания. В другом варианте осуществления настоящего изобретения компьютерная программа идентифицирует структурные мотивы полинуклеотидной последовательности. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения данная компьютерная программа включает программу молекулярного моделирования. Данный способ можно осуществить путем прочтения отдельной последовательности или, по меньшей мере, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения, либо полипептидных кодов настоящего изобретения через использование данной компьютерной
- 82 -
008252
программы и идентификации элементов в данных кодах нуклеиновых кислот или полипептидных кодах с помощью данной компьютерной программы.
Коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидные коды настоящего изобретения можно сохранять и управлять разнообразными программами процессорных данных в разных форматах. Например, их можно сохранять в виде текста в файле обработки текста, таком как Microsoft-WORD или WORDPERFECT или в виде ASCII-файла для разнообразных программ базы данных, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как DB2, SYBASE или ORACLE. Кроме того, многие компьютерные программы и базы данных можно использовать в качестве программ сравнения последовательностей, идентификаторов или поставщиков стандартных нуклеотидных или полипептидных последовательностей для сравнения с кодами нуклеиновых кислот настоящего изобретения или с полипептидными кодами настоящего изобретения.
Нижеследующий список не следует рассматривать как ограничение настоящего изобретения, но как руководство к программам и базам данных, которые пригодны для кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или для полипептидных кодов настоящего изобретения. Программы и базы данных, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются перечисленным: MacPattern (EMBL), Dis-coveryBase (Molecular Application Group), GeneMine (Molecular Application Group), Look (Molecular Application Group), MacLook (Molecular Application Group), BLAST и BLAST2 (NCBI), BLASTN и BLASTX
(Altschul и соавт., 1990), FASTA (Pearson and Lipman, 1988), FASTDB (Brutlag и соавт., 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), Del-Phi (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), the EMBL/Swissprotein database, the MDL Available Chemicals Directory database, the MDL Drug Data Report data base, the Comprehensive Medicinal Chemistry database, Derwents's World Drug Index database, the BioByteMasterFile database, the Genbank database и Genseqn базы данных. Многие другие программы и базы данных будут очевидны специалистам в данной области техники с учетом настоящего описания.
Мотивы, которые можно выявлять с использованием указанных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновые застежки, мотивы спираль-поворот-спираль, сайт гликозилиро-вания, сайты убихитинизации, альфа-спирали и бета-конфигурации, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые управляют секрецией кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, кислотные участки, энзиматически активные сайты, связывающие субстрат сайты и ферментативно расщепляемые сайты.
В данной заявке приводятся ссылки на различные публикации, патенты и опубликованные патентные заявки. Раскрытие данных публикаций, патентов и опубликованных описаний изобретений к патентам, на которые ссылаются в данной заявке, включены путем ссылки в представленном изложении для наиболее полного удовлетворительного описания области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Примеры
Пример 1. Идентификация двуаллельных маркеров - экстрагирование ДНК.
Доноры не связаны родством и здоровы. Они были представлены достаточным разнообразием для типичной Французской гетерогенной популяции. От 100 индивидов была получена ДНК и проверена на наличие двуаллельных маркеров.
От каждого донора брали 30 мл периферической венозной крови с добавлением ЭДТА. Клетки (осадок) собирали центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об./мин. Эритроциты лизировали с помощью лизирующего раствора (50 мл конечный объем: 10 мМ Трис рН 7,6; 5 мМ MgQ2; 10 мМ NaCl). Данный раствор центрифугировали (10 мин, 2000 об./мин) столько раз, сколько необходимо для удаления остаточных эритроцитов в супернатанте, после ресуспендирования клеточного осадка в данном ли-зирующем растворе.
Осадок лейкоцитов лизировали в течение ночи при 42°С 3,7 мл лизирующего раствора, состоящего из 3 мл ТЕ 10-2 (Трис-НО 10 мМ, ЭДТА 2 мМ)/№0 0,4M; 200 мкл SDS 10%;
500 мкл K-протеиназы (2 мг К-протеиназы в ТЕ 10-2/NaCl 0,4М).
Для экстрагирования белков добавляли 1 мл насыщенного NaCl (6 М) (1/3,5 v/v). После энергичного перемешивания данный раствор центрифугировали в течение 20 мин при 10000 об./мин.
Для осаждения ДНК к полученному супернатанту приливали 2-3 объема 100% этанола и раствор центрифугировали в течение 30 мин при 2000 об./мин. Полученный раствор ДНК трижды промывали 70%-м этанолом для удаления солей и центрифугировали в течение 20 мин при 2000 об./мин. Полученный осадок сушили при 37°С и ресуспендировали в 1 мл ТЕ 10-1 или в 1 мл воды. Концентрацию ДНК определяли путем измерения ОП при 260 нм (1 единица ОП=50 мкг/мл ДНК).
Чтобы определить присутствие белков в данном растворе ДНК, определяли отношение ОП 260/ОП
- 83 -
008252
280. В последующих описанных ниже примерах использовали только препараты ДНК, обладающие ОП 260/ОП 280 между 1,8 и 2.
Объединенную ДНК получали смешиванием эквивалентных количеств ДНК от каждого индивида.
Пример 2. Идентификация двуаллельных маркеров: амплификация геномной ДНК с помощью ПЦР.
Амплификацию образцов специфичных геномных последовательностей ДНК примера 1 осуществляли на объединенной ранее полученной ДНК. Кроме того, аналогичным образом амплифицировали 50 индивидуальных образцов.
ПЦР-анализ осуществляли с использованием следующего протокола:
Конечный объем 25 мкл
ДНК 2 нг/мкл
MgСl2 2 мМ
dNTP (каждого) 200 мкМ
Праймер (каждого) 2,9 нг/мкл
Ampli Taq Gold ДНК-полимераза 0,05 единиц/мкл
ПЦР-буфер (10х=0,1М ТрисНС! рН 8,3 0,5М Ка) 1х
Каждую пару первых праймеров создавали с использованием информации о последовательности из описанного в данном описании CanIon-гена и OSP-программного обеспечения (Hillier & Green, 1991). Длина первой пары праймеров составляла около 20 нуклеотидов и обладала последовательностью, раскрытой в табл. 1 в колонке, помеченной PU и RP.
Таблица 1
Ампликон
Диапазон позиций ампликона в SEQ ID 1
Название праймера
Диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 1
Название праймера
Комплементарный диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 1
99-62626
12343
12810
12343
12363
12793
12810
99-62632
13814
14296
13814
13832
14279
14296
99-62633
24863
25396
24863
24881
25378
25396
99-62611
69198
69650
69198
69218
69632
69650
99-62605
73005
73483
73005
73022
73466
73483
99-62635
79808
80334
79808
79826
80314
80334
Ампликон
Диапазон позиций ампликона в SEQ ID 2
Название праймера
Диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 2
Название праймера
Комплементарный диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 2
99-79335
51031
51559
51031
51051
51539
51559
99-79336
60925
61374
60925
60945
61354
61374
99-79338
80271
80720
80271
80290
80700
80720
99-79339
91037
91486
В10
91037
91056
91466
91486
99-79314
100285
100784
В11
100285
100305
100764
100784
99-79316
106568
107020
В12
106568
106585
С12
107000
107020
99-79322
165864
166401
В13
165864
165884
С13
166381
166401
99-79306
235713
236210
В14
235713
235732
С14
236190
236210
Ампликон
Диапазон позиций ампликона в SEQ ID 3
Название праймера
Диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 3
Название праймера
Комплементарный диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 3
99-79310
31618
32100
В15
31618
31635
С15
32080
32100
99-79311
42324
42723
В16
42324
42344
С16
42704
42723
Ампликон
Диапазон позиций ампликона в SEQ ID 6
Название праймера
Диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 6
Название праймера
Комплементарный диапазон позиций амплификационного праймера в SEQ ID No 6
99-62617
В17
С17
435
453
Предпочтительно, праймеры содержали общий олигонуклеотидный хвост "левее" от специфичных оснований, намеченных для амплификации, который пригоден для секвенирования.
Праймеры PU содержат следующую дополнительную PU 5'-последовательность: TGTAAAACGACGGCCAGT; праймеры RP содержат следующую RP 5'-последовательность: CAGGAAACAGCTATGACC. Праймер, содержащий дополнительную PU 5'-последовательность, приведен в SEQ ID No 7. Прай
- 84 -
008252
мер, содержащий дополнительную RP 5'-последовательность, приведен в SEQ ID No 8.
Синтез данных праймеров осуществляли с помощью фосфорамидитного способа в синтезаторе GENSET UFPS 24.1.
Амплификацию ДНК осуществляли в амплификаторе Genius II. После нагревания до 95°С в течение 10 мин проводили 40 циклов. Каждый цикл включал: 30 с при 95°С, 54°С в течение 1 мин и 30 с при 72°С. Конечное удлинение, 10 мин 72°С, завершало амплификацию. Количества полученных продуктов амплификации определяли в 96-луночных планшетах для микротитрования с использованием флуоро-метра и Picogreen в качестве интеркалирующего агента (Molecular Probes).
Пример 3. Идентификация двуаллельных маркеров - секвенирование амплифицированной геномной ДНК и идентификация полиморфизмов.
Секвенирование амплифицированной ДНК, полученной в примере 2, осуществляли на секвенаторе ABI 377. Последовательности продуктов амплификации определяли с использованием автоматизированных реакций дидезокситерминирующего секвенирования согласно протоколу цикла секвенирования, терминированного красителем. Продукты реакций секвенирования разделяли в секвенирующих гелях и последовательности определяли с использованием анализа визуализацией геля (ABI Prism DNA Sequencing Analysis software (2.1.2 version)).
Затем оценивали данные о последовательностях, чтобы в полученных амплифицированных фрагментах обнаружить присутствие двуаллельных маркеров. Поиск полиморфизма основан на присутствии наложенных пиков в электрофоретической картине, полученных для разных оснований, встреченных в одной и той же позиции, как описано раньше.
В 17 амплифицированных фрагментах выявлено 18 двуаллельных маркеров. Локализация этих дву-аллельных маркеров показана в табл. 2.
Таблица 2
Ампликон
Название маркера
Полиморфизм
Позиция ВМ в SEQ ID
Ал1
Ал2
Nol
No 4
99-6226
99-62626-168
12642
99-62632
99-62632-275
14088
99-62633
99-6263-409
24981
99-62611
99-62611-51
69248
99-62605
99-62605-56
73428
99-62635
99-62635-443
80250
Ампликон
Название маркера
Полиморфизм
Позиция ВМ в SEQ ID
Ал1
Ал2
No2
No4
99-79335
99-79335-60
51090
99-79336
99-79336-369
61293
99-79338
99-79338-332
80602
99-79314
А10
99-79314-201
100845
99-79314
99-79314-225
100509
99-79316
А12
99-79316-158
106725
1658
99-7932
А13
99-79322-224
166087
99-79322
А14
99-79322-473
166336
99-79306
А15
99-79306-182
235894
Ампликон
Название маркера
Полиморфизм
Позиция ВМ в SEQ ID
Ал1
Ал2
No3
No 4
99-79310
А16
99-79310-29
31646
4481
99-79311
А17
99-79311-50
42373
Ампликон
Название маркера
Полиморфизм
Позиция ВМ в SEQ ID
Ал1
Ал2
No 6
99-62617
А18
99-62617-105
105
- 85 -
008252
ВМ относится к "двуаллельному маркеру". Ал1 и ал2 относятся, соответственно, к аллелю 1 и алле-лю 2 данного двуаллельного маркера.
Таблица 3
Название маркера
Диапазон позиций Зондов в SEQ ID No 1
Зонды
99-62626-168
12630
12654
99-62632-275
14076
14100
99-62633-409
24969
24993
99-62611-51
69236
69260
99-62605-56
73416
73440
99-62635
80238
80262
Название маркера
Диапазон позиций Зондов в SEQ ID No 2
Зонды
99-79335-60
51078
51102
99-79336-369
61281
61305
99-79338-332
80590
80614
А10
99-79314-201
100473
100497
Р10
99-79314-225
100497
100521
Р11
А12
99-79316-158
106713
106737
Р12
А13
99-79322-224
166075
166099
Р13
А14
99-79322-473
166324
166348
Р14
А15
99-79306-182
235882
235906
Р15
Название маркера
Диапазон позиций Зондов в SEQ ID No 3
Зонды
А16
99-79310-29
31634
31658
Р16
А17
99-79311-50
42361
42385
Р17
Название маркера
Диапазон позиций Зондов в SEQ ID No 6
Зонды
А18
99-62617-105
117
Р18
Пример 4. Проверка достоверности полиморфизма с помощью микросеквенирования.
Двуаллельные маркеры, идентифицированные в примере 3, в последующем получали подтверждение, а их соответствующие частоты были определены с помощью микросеквенирования.
Микросеквенирование осуществляли для каждого индивидуального образца ДНК, описанного в примере 1.
Амплификацию геномной ДНК индивидов осуществляли с помощью ПЦР, как описано выше, для выявления двуаллельных маркеров с одним и тем же набором ПЦР-праймеров (табл. 1).
Предпочтительные праймеры, используемые для микросеквенирования, составляли в длину около 19 нуклеотидов и гибридизовались непосредственно слева от рассматриваемого полиморфного основания. В соответствии с настоящим изобретением, данные праймеры, используемые для микросеквениро-вания, подробно представлены в табл. 4.
- 86 -
008252
Таблица 4
Наименование маркера
Двуалле льный маркер
Mis. 1
Диапазон позиций микросеквенирующего праймера mis 1 в SEQ ID No 1
Mis. 2
Диапазон комплементарных позиций микросеквенирующего праймера mis. 2 в SEQ ID No 1
99-62626-168
12623
12641
12643
12661
99-62632
14069
14087
12642
12661
99-62633-409
24962
24980
24982
25000
99-62611-51
69229
69247
69249
69267
99-62605-56
73409
73427
73429
73447
99-62635-443
80231
80249
80251
80269
Наименование маркера
Двуалле льный маркер
Mis. 1
Диапазон позиций микросеквенирующего праймера mis 1 в SEQ ID No 1
Mis. 2
Диапазон комплементарных позиций микросеквенирующего праймера mis. 2 в SEQ ID No 2
99-79335-60
51071
51089
51091
51109
99-79336-369
61274
61292
61294
61312
99-79338-332
80583
80601
80603
80621
99-79314-201
А10
D10
100466
100484
100486
100504
99-79314-225
Dll
100490
100508
Ell
100510
100528
99-79316-158
А12
D12
106706
106724
E12
106726
106744
99-79322-224
А13
D13
166068
166086
E13
166088
166106
99-79322-473
А14
D14
166317
166335
E14
166337
166355
99-79306-182
А15
D15
235875
235893
E15
235895
235913
Наименование маркера
Двуалле льный маркер
Mis. 1
Диапазон позиций микросеквенирующего праймера mis 1 в SEQ ID No 3
Mis. 2
Диапазон комплементарных позиций микросеквенирующего праймера mis. 2 в SEQ ID No 3
99-79310-29
А16
D16
31627
31645
E16
31647
31665
99-79311-50
А17
D17
42354
42372
E17
42374
42392
Наименование маркера
Двуалле льный маркер
Mis. 1
Диапазон позиций микросеквенирующего праймера mis 1 в SEQ ID No 6
Mis. 2
Диапазон позиций микросеквенирующего праймера mis. 2 в SEQ ID No 6
99-62617-105
А18
D18
104
E18
106
124
Mis 1 и Mis 2 относятся, соответственно, к микросеквенирующим праймерам, которые гибридизу-ются с некодирующей цепью CanIon-гена или с кодирующей цепью CanIon-гена. Реакцию микросеквенирования осуществляли следующим образом.
После выделения очисткой продуктов амплификации реакционную микросеквенирующую смесь получали путем добавления, в конечном объеме 20 мкл: 10 пмолей микросеквенирующего олигонуклео-тида, 1 Ед. Термосеквеназы (Amersham E79000G), 1,25 мкл термосеквеназного буфера (260 мМ Трис НС1 рН 9,5, 65 мМ MgСl2) и два соответствующих ddNTP (Perkin Elmer, Dye Terminator Set 401095), комплементарных нуклеотидам по полиморфному сайту каждого тестируемого двуаллельного маркера, следуя рекомендациям производителя. Через 4 мин при 94°С в амплификаторе Tetrad РТС-225 (MJ Research) осуществляли 20 ПЦР-циклов из 15 с при 55°С, 5 с при 72°С и 10 с при 94°С. Затем с помощью этаноль-ного осаждения удаляли невключенный терминирующий краситель. Образцы окончательно ресуспенди-ровали в формамид-ЭДТА-буфере для насыщения и нагревали в течение 2 мин при 95°С перед загрузкой в полиакриламидный секвенирующий гель. Данные получали с помощью ДНК-секвенатора ABI PRISM 377 и обрабатывали с использованием программного обеспечения CanIonSCAN (Perkin Elmer).
После гелевого анализа данные автоматизированно обрабатывали с помощью программного обеспечения, которое позволяет определять аллели двуаллельного маркера, представленные в каждом ам-плифицированном фрагменте.
Данная программа оценивает такие факторы, как насколько интенсивность сигналов, получаемых в осуществленных выше операциях микросеквенирования, является слабой, нормальной или интенсивной или же данные сигналы являются неоднозначными. Кроме того, данная программа идентифицирует существенные пики (по форме и высоте). В числе существенных пиков, пики, соответствующие сайту-мишени, идентифицировали по их положению. Если два существенных пика обнаруживаются в одном и том же положении, каждый образец относят к категории гомозиготного или гетерозиготного типа на ос
- 87 -
008252
нове соотношения высоты пика.
Пример 5. Получение антительных композиций к CanIon-белку.
Из трансфицированных или трансформированных клеток, содержащих экспрессионный вектор, кодирующий CanIon-белок или его часть, выделяют практически чистый белок или полипептид. Концентрацию белка конечного препарата доводят, например, путем концентрирования на устройстве с Amicon-фильтром, до уровня нескольких микрограмм/мл. Затем моноклональные или поликлональные антитела к данному белку можно получить следующим образом.
A. Получение моноклональных антител путем гибридомного слияния.
Моноклональные антитела к эпитопам CanIon-белка или к его части можно получить из мышиных гибридом в соответствии с классическим способом Kohler, G. and Milstein, С. (1975) или производными от него способами. См. также Harlow, E. and D. Lane, 1988.
Вкратце, мышь периодически инокулируют несколькими микрограммами CanIon-белка или его части на протяжении нескольких недель. Затем мышь умерщвляют и выделяют клетки селезенки, продуцирующие антитела. Выделенные клетки селезенки сливают с помощью полиэтиленгликоля с мышиными миеломными клетками, а излишек неслившихся клеток разрушают выращиванием на селективной среде, включающей аминоптерин (НАТ-среда). Успешно слившиеся клетки разбавляют и аликвоты разбавления помещают в лунки планшета для микротитрования, где данная культура продолжает расти. Ан-тителопродуцирующие клоны идентифицируют путем выявления антител в супернатантной жидкости лунок с помощью методов иммунологического анализа, таких как ELISA, впервые описанного Engvall (1980), и его производного способа. Отобранные позитивные клоны можно увеличить в объеме и собрать для использования их продукт в виде моноклональных антител. Подробные методы получения монокло-нальных антител описаны у Davis L. и соавт. Basic Methods in Molecular Biology (Основные методы молекулярной биологии), Elsevier, New York, Section 21-2.
B. Получение поликлональных антител с помощью иммунизации.
Поликлональную антисыворотку, содержащую антитела к гетерогенным эпитопам CanIon-белка или его части, можно получить путем иммунизации животного, не принадлежащего человеческому роду, CanIon-белком или его частью, который может быть немодифицированным или модифицированным для усиления иммуногенности. Подходящим животным, не принадлежащим человеческому роду, предпочтительно является выбранное млекопитающее, обычно, мышь, крыса, кролик, коза или лошадь. Альтернативно, неочищенный препарат, который обогащали по концентрации CanIon, можно использовать для образования антител. Такие белки, фрагменты или препараты вводят не принадлежащему человеческому роду млекопитающему в присутствии соответствующего адъюванта (например, гидроксида алюминия, RIBI и т. п.), который известен в данной области техники. Кроме того, белок, фрагмент или препарат может быть предварительно обработан агентом, который повышает антигенность, такие агенты известны в данной области техники и включают, например, метилированный бычий сывороточный альбумин (mBSA), бычий сывороточный альбумин (BSA), поверхностный антиген гепатита В и гемоцианин улитки фиссурелии (KLH). Собирают сыворотку иммунизированного животного, обрабатывают и тестируют в соответствии с известными методами. Если собранная сыворотка содержит поликлональные антитела с нежелательными эпитопами, тогда поликлональные антитела можно выделить очисткой с помощью им-муноаффинной хроматографии.
На получение эффективных поликлональных антител влияют многие факторы, связанные с антигеном и видовым статусом хозяина. Кроме того, животные-хозяева по-разному отвечают на место инокуляции и дозу, причем несоответствующие или чрезмерные дозы антигена приводят к снижению титра антисыворотки. Небольшие дозы (на уровне нг) вводимого антигена во многие интрадермальные места оказываются более надежными. Методы получения и обработки поликлональной антисыворотки известны в данной области техники, см. например, Mayer and Walker (1987). Протокол эффективной иммунизации кроликов можно найти у Vaitukaitis J. и соавт. (1971).
Повторные инъекции можно осуществлять с регулярными интервалами и собирать антисыворотку, когда титр ее антител, определяемый полуколичественно, например, с помощью двойной иммунодифузии в агаре против известных концентраций данного антигена, начинает падать. См., например, Ouchterlony О. и соавт. (1973). Плато кривой концентрации антител обычно находится в пределах от 0,1 до 0,2 мг/мл сыворотки (около 12 мкМ). Сродство антисыворотки по антигену определяют путем получения конкурентных кривых связывания, как описано, например, Fisher D. (1980).
Препараты антител, полученные в соответствии с моноклональным или поликлональным протоколом, пригодны для количественного иммунологического анализа, в котором определяют концентрации веществ, несущих антиген, в биологических образцах; их также используют полуколичественно или количественно для идентификации наличия антигена в биологическом образце. Данные антитела могут также использоваться в терапевтических композициях для уничтожения клеток, экспрессирующих данный белок или для снижения уровня данного белка в данном организме.
Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны, следует иметь ввиду, что специалисты в данной области техники могут внести в него различные изменения, не выходя за рамки существа и объема настоящего изобретения.
- 88 -
008252
Ссылки
Abbondanzo S.J. et al., 1993, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, pp. 803-823.
Ajioka R.S. et al., Am. J. Hum. Genet., 60:1439-1447, 1997.
Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3):403-410.
Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3:266-272.
Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402.
Ames R.S. et al. J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995).
Anderson et al., Symp. Soc. Exp. Biol. 48: 85-97 (1994).
Anton M. et al., 1995, J. Virol., 69 : 4600-4606.
Araki K. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(1): 160-4.
Ashkenazi, A. et al. PNAS 88:10535-10539 (1991).
Aszodi et al., Proteins:Structure, Function, and Genetics, Supplement 1:38-42 (1997). Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley In-terscience, N.Y.
Bartunek P. et al. Cytokine 8(l):14-20 (1996). Baubonis W. (1993) Nucleic Acids Res. 21(9):2025-9. Beaucage et al., Tetrahedron Lett 1981,22: 1859-1862. Better, M. et al. Science 240:1041-1043 (1988). Blouin J.L. et al. Nature Genetics, 20: 70-73 (1998).
Bradley A., 1987, Production and analysis of chimaeric mice. In: E.J. Robertson (Ed.), Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL Press, Oxford, pp.113. Bram R.J. et al., 1993, Mol. Cell Biol., 13 : 4760-4769. Brinkman U. et al. J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995).
Brown E.L., Belagaje R., Ryan M.J., Khorana HG, Methods Enzymol. 1979; 68:109-151.
Brutlag et al. Согпр. Арр. Biosci. 6:237-245, 1990.
Brzustowicz et al., Am. J. Hum. Genet. 65:1096-1103 (1999).
Bulman et al., Hum. Mol. Gen. 6(10) 1679-1685 (1997).
Burton D.R. et al. Advances in Immunology 57:191-280 (1994).
Bush et al., 1997, J. Chromatogr., 777 : 311-328.
Carlson, N.G. et al. J. Biol. Chem. 272(17): 11295-11301 (1997).
Chai H. et al. (1993) Biotechnol. Appl. Biochem. 18:259-273.
Chee et al. (1996) Science. 274:610-614.
Chen and Kwok, Nucleic Acids Research 25:347-353, 1997.
Chen et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752.
Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94/20 10756-10761, 1997.
Chen, Z. et al. Cancer Res. 58(16): 3668-3678 (1998).
Cho R.J. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(7):3752-3757.
Chou J.Y., 1989, Mol. Endocrinol., 3: 1511-1514.
Clark A.G. (1990) Mol. Biol. Evol. 7:111-122.
Coles R., Caswell R., Rubinsztein D.C., Hum. Mol. Genet. 1998; 7:791-800. Compton J. (1991) Nature. 350(6313):91-92.
Davis L.G., M.D. Dibner, and J.F. Battey, Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY,
1986.
Dempster et al., (1977) J. R. Stat. Soc., 39B:1-38. Deng B. et al. Blood 92(6): 1981-1988 (1998).
Dent D.S. & Latchman D.S. (1993) The DNA mobility shift assay. In: Transcription Factors: A Practical Approach (Latchman D.S., ed.) pp.1-26. Oxford: IRL Press. Denyer et al., Drug Disc. Today 3(7): 323-332 (1998). Eckner R. et al. (1991) EMBO J. 10:3513-3522. Edwards et Leatherbarrow, Analytical Biochemistry, 246, 1-6 (1997). Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980).
Excoffier L. and Slatkin M. (1995) Mol. Biol. Evol., 12(5): 921-927. Feldman and Steg, 1996, Medecine/Sciences, synthese, 12:47-55. Felici F., 1991, J. Mol. Biol., Vol. 222:301-310. Fell, H.P. et al. J. Immunol. 146:2446-2452 (1991). Fields and Song, 1989, Nature, 340 : 245-246.
Fisher, D., Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980).
Flotte et al. (1992) J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356. Fodor et al. (1991) Science 251:767-777. Fraley et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:3348-3352. Fried M., Crothers D.M., Nucleic Acids Res. 1981; 9:6505-6525.
- 89 -
008252
Fromont-Racine M. et al., 1997, Nature Genetics, 16(3): 277-282.
Fuller S.A. et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds, John
Wiley & Sons, Inc., USA.
Furth P.A. et al. (1994) Proc. Natl. Acad..Sci. USA. 91:9302-9306. Garner M.M., Revzin A., Nucleic Acids Res. 1981; 9:3047-3060. Geysen H. Mario et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002.
Ghosh and Bacchawat, 1991, Targeting of liposomes to hepatocytes, IN: Liver Diseases, Targeted diagnosis and therapy-using specific receptors and ligands. Wu et al. Eds., Marcel Dekeker, New York, pp. 87-104. Gillies, S.D. et al. J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989). Gillies, S.O. et al. PNAS 89:1428-1432 (1992). Gonnet et al., 1992, Science 256:1443-1445. Gonzalez et al., Drug Disc. Today 4(9): 431:439 (1999). Gopal (1985)Afol. Cell. Biol., 5:1188-1190. Gossen M. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:5547-5551. Gossen M. et al. (1995) Science. 268:1766-1769. Graham et al. (1973) Virology 52:456-457.
Green et al., Ann. Rev. Biochem. 55:569-597 (1986). Greenspan and Bona, FASEB J. 7(5):437-444 (1989). Griffin et al. Science 245:967-971 (1989).
Grompe, M. (1993) Nature Genetics. 5:111-117.
Grompe, M. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5855-5892.
Gu H. et al. (1993) Cell 73:1155-1164.
Gu H. et al. (1994) Science 265:103-106.
Guatelli J.C et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 35:273-286.
Hacia J.G., Brody L.C., Chee M.S., Fodor S.P., Collins F.S., Nat. Genet. 1996; 14(4):441-447. Hall L.A. and Smirnov I.P. (1997) Genome Research, 7:378-388. Hames B.D. and Higgins S.J. (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach. Hames and Hamill, Pfugers Arch. 391, 85-100 (1981).
Hammerling, et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (Elsevier,
N.Y., 1981).
Harju L., Weber T., Alexandrova L., Lukin M., Ranki M., Jalanko A., Clin. Chem. 1993; 39(1 IPt 1):2282-
2287.
Harland et al. (1985) J. Cell. Biol. 101:1094-1095.
Harlow, E. and D. Lane. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 53242.
Harper J.W. et al., 1993, Cell, 75 : 805-816.
Harrop J.A. et al. J. Immunol. 161(4): 1786-1794 (1998).
Hawley M.E. et al. (1994) Am. J. Phys. Anthropol. 18:104.
Hell et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 747:282-293 (1994).
HenikoffandHenikoff, 1993, Proteins 17:49-61. Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402. Higgins Ed., IRL Press, Oxford. Hillier L. and Green P. Methods Appl., 1991, 1: 124-8. Hoess et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:2287-2300. Huang L. et al. (1996) Cancer Res. 56(5):1137-1141. Huston et al. Methods in Enzymology 203:46-88 (1991). Huygen et al. (1996) Nature Medicine. 2(8):893-898.
Izant J.G., Weintraub H., Cell 1984 Apr; 36(4):1007-15. Julan et al. (1992) J. Gen. Virol. 73:3251-3255.
Kanegae Y. et al., Nucl. Acids Res. 23:3816-3821 (1995).
Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268. Kettleborough, C.A. et al. Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994).
Khoury J. et al., Fundamentals of Genetic Epidemiology, Oxford University Press, NY, 1993. Kim U-J. et al. (1996) Genomics 34:213-218. Klein et al. (1987) Nature. 327:70-73.
Koch et al., J. Biol. Chem. 265 (29): 17786-17791 (1990). Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495 (1975).
Koller et al. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:705-730.
Kozal M.J., Shah N., Shen N., Yang R., Fucini R., Merigan T.C., Richman D.D., Morris D., Hubbell E., Chee M., Gingeras T.R., Nat. Med. 1996; 2(7):753-759.
Lander and Schork, Science, 265, 2037-2048, 1994. Landegren U. et al. (1998) Genome Research, 8:769-776.
- 90 -
008252
Lange K. (1997) Mathematical and Statistical Methods for Genetic Analysis. Springer, New York. Lee et al., FEBS Lett. 445 231:236 (1999). Lenhard T. et al. (1996) Gene. 169:187-190.
Liautard, J. et al. Cytokinde 9 (4):233-241 (1997).
Lin M.W. et al. Hum. Genet., 99(3): 417-420 (1997).
Linton M.F. et al. (1993) J. Clin. Invest. 92:3029-3037.
Liu Z. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:4528-4262.
Livak et al., Nature Genetics, 9:341-342, 1995.
Livak K.J., Hainer J.W., Hum. Mutat. 1994; 3(4):379-385.
Lockhart et al. Nature Biotechnology 14: 1675-1680, 1996.
Lucas A.H., 1994, In : Development and Clinical Uses of Haempophilus b Conjugate.
Manger et al., Anal. Biochem. 214: 190-194 (1993).
Mansour S.L. et al. (1988) Nature. 336:348-352.
Marshall R.L. et al. (1994) PCR Methods and Applications. 4:80-84.
McCormick et al. (1994) Genet. Anal. Tech. Appl. 11:158-164.
McLaughlin B.A. et al. (1996) Am. J. Hum. Genet. 59:561-569.
Morena et al., Annals NY Acad. Sci. 102-117 (1999).
Mori, et al., Nature 350: 398-402 (1991).
Morrison, Science 229:1202 (1985).
Morton N.E., Am. J. Hum. Genet., 7:277-318, 1955.
Muller, Y.A. et al. Structure 6(9): 1153-1167 (1998).
Mullinax, R.L. et al. BioTechniques 12 (6) :864-869 (1992).
Muzyczka et al. (1992) Curr. Topics in Micro, and Immunol. 158:97-129.
Nada S. et al. (1993) Cell 73:1125-1135.
Nagy A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8424-8428. Naramura, M. et al. Immunol. Lett. 39:91-99 (1994).
Narang S.A., Hsiung H.M., Brousseau R., Methods Enzymol. 1979; 68:90-98.
Neda et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146.
Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2503-2516.
Nickerson D.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8923-8927.
Nicolau С. et al., 1987, Methods Enzymol., 149:157-76.
Nicolau et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta. 721:185-190.
Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991).
Nyren P., Pettersson B., Uhlen M., Anal. Biochem. 1993; 208(1): 171-175.
O'Reilly et al. (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. W.H. Freeman and Co., New
York.
Ohno et al. (1994) Science. 265:781-784. Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986).
Oldenburg K.R. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:5393-5397.
Olesen et al., Voltage gated ion channel modulators, 7-8 December, Philadelphia PA, USA (1995). Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 2776-2770.
Ott J., Analysis of Human Genetic Linkage, John Hopkins University Press, Baltimore, 1991. Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973). Padlan E.A., Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991). Parmley and Smith, Gene, 1988, 73:305-318. Pastinen et al., Genome Research 1997; 7:606-614.
Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8):2444-2448.
Pease S. and William R.S., 1990, Exp. Cell. Res., 190: 209-211. Perlin et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55:777-787. Persic, L. et al. Gene 187 9-18 (1997).
Peterson et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7593-7597.
Pieru et al. Genome Research 6:492-503, 1996.
Pitard, V. et al. J. Immunol. Methods 205 (2):177-190 (1997).
Potter et al. (1984) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 81 (22):7161-7165.
Prat, M. et al. J. Cell. Sci. 11 l(Pt2): 237-247(1998).
Ramunsen et al., 1997, Electrophoresis, 18 : 588-598.
Reid L.H. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4299-4303.
Risch, N. and Merikangas, K. Science, 273:1516-1517, 1996.
Robertson E., 1987, Embryo-derived stem cell lines. In: E.J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford, pp. 71. Roguska M.A. et al. PNAS 91:969-973, (1994).
Rossi et al., Pharmacol. Ther. 50:245-254, (1991).
- 91 -
008252
Roth J.A. et al. (1996) Nature Medicine. 2(9):985-991.
Roux et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9079-9083.
Ruano et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 87:6296-6300.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and T. Maniatis. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Samson M., et al. (1996) Arotore, 382(6593):722-725. Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828. Sanchez-Pescador R. (1988) J. Clin. Microbiol. 26(10): 1934-1938. Sarkar G. and Sommer S.S. (1991) Biotechniques. Sauer B. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5166-5170. Sawai, H. et al. AJRI 34:26-34 (1995). Schedl A. et al., 1993a, Nature, 362: 258-261. Schedl et al., 1993b, Nucleic Acids Res., 21: 4783-4787.
Schena et al. Science 270:467-470, 1995.
Schena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(20):10614-10619.
Schneider et al.( 1997) Arlequin: A Software For Population Genetics Data Analysis. University of Geneva. Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation. Sczakiel G. et al. (1995) Trends Microbiol. 3(6):213-217. Shay J.W. et al., 1991, Biochem. Biophys. Acta, 1072: 1-7. Sheffield, V.C. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 49:699-706. Shizuya et al. (1992) Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 89:8794-8797. Shoemaker D.D., et al., Nat . Genet. 1996;14 (4):450-456. Shu L. et al. PNAS 90:7995-7999 (1993). Skerra A. et al. Science 240:1038-1040 (1988). Smith (1957) Ann. Hum. Genet. 21:254-276. Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165. Sosnowski R.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:1119-1123. Sowdhamini et al., Protein Engineering 10:207, 215 (1997). Spielmann S. and Ewens W.J., Am. J. Hum. Genet., 62:450-458, 1998.
Spielmann S. et al., Am. J. Hum. Genet., 52:506-516, 1993.
Steinberg N.L. (1992) Trends Genet. 8:1-16.
Sternberg N.L. (1994) Mamm. Genome. 5:397-404.
Stryer L., Biochemistry, 4th edition, 1995.
Studnicka G.M. et al. Protein Engineering 7(6):805-814 (1994).
Syvanen A.C., Clin. Chim. Acta 1994; 226 (2):225-236.
Szabo A. et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705 (1995).
Tacson et al. (1996) Nature Medicine. 2(8):888-892.
Taryman, R.E. et al. Neuron 14(4):755-762(1995). Schaid D.J. et al., Genet. Epidemiol.,13:423-450,1996.
Те Riele et al. (1990) Nature. 348:649-651.
Terlau et al., Naturwissenschaften 85: 437-444 (1998).
Terwilliger J.D. and Ott J., Handbook of Human Genetic Linkage, John Hopkins University Press, London,
1994.
Thomas K.R. et al. (1986) Cell. 44:419-428.
Thomas K.R. et al. (1987) Cell. 51:503-512.
Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2):4673-4680.
Tur-Kaspa et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:716-718.
Tyagi et al. (1998) Nature Biotechnology. 16:49-53.
Urdea M.S. (1988) Nucleic Acids Research. 11:4937-4957.
Urdea M.S. et al. (1991) Nucleic Acids Symp. Ser. 24:197-200.
Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971).
Valadon P., et al., 1996, J. Mol. Biol., 261:11-22.
Van der Lugt et al. (1991) Gene. 105:263-267.
Vil H. et al. PNAS 89:11337-11341(1992).
Vlasak R. et al. (1983) Eur. J. Biochem. 135:123-126. Wabiko et al. (1986). D № 4.5(4):305-314. Walker et al. (1996) Clin. Chem. 42:9-13. Wang et al. (1997), Chromatographia, 44: 205-208.
Weir B.S. (1996) Genetic data Analysis II: Methods for Discrete population genetic Data, Sinauer Assoc,
Inc., Sunderland, MA, U.S.A.
Westerink M.A.J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:4021-4025. White M.B. et al. (1992) Genomics. 12:301-306.
- 92 -
008252
White M.B. et al. (1997) Genomics. 12:301-306. Williams, et al. Science 257: 389-395 (1992). Wong et al. Gene. 10:87-94 (1980).
Wood S.A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4582-4585.
Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432.
Wu and Wu (1988) Biochemistry. 27:887-892.
Wu et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2757.
Yagi T. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:9918-9922.
Yoon, D.Y. et al. J. Immunol. 160(7): 3170-3179 (1998).
Zhang et al., Neuropharmacology 32 (11): 1075-1088 (1993).
Zhao et al., Am. J. Hum. Genet., 63:225-240, 1998.
Zheng, X.X. et al. J. Immunol. 154:5590-5600 (1995).
Zhu Z. et al. Cancer Res. 58(15): 3209-3214 (1998).
Zou Y. R. et al. (1994) Curr. Biol. 4:1099-1103.
Список последовательностей
<110> GENSET
<120> Связанный с шизофренией ген и белок потенциал-зависимого
воротного ионного канала <130> 93.W01
<141> 2001-12-04
<150> US 60/251,317 <151> 2000-12-05
<160> 8
<170> Patent.pm
<210> 1
<211> 82293
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> признак ошибки копирования <222> 1..2000
<223> 5'регуляторная область <220>
<221> экзон <222> 2001..2026 <223> экзон 1
<220>
<221> экзон <222> 19188..19334 <223> экзон 2
<220>
<221> экзон <222> 22996..23178 <223> экзон 3
<220>
<221> экзон <222> 39731..39814 <223> экзон 4
<220>
<221> экзон <222> 41337..41476 <223> экзон 5
<220>
<221> экзон <222> 41565..41693 <223> экзон 6
<220>
<221> экзон <222> 73013..73167 <223> экзон 7
<220>
- 93 -
008252
<221> аллель <222> 12642
<223> 99-62626-168 : полиморфное основание А или Т <220>
<221> аллель <222> 14088
<223> 99-62632-275 : полиморфное основание А или G <220>
<221> аллель <222> 24981
<223> 99-62633-409 : полиморфное основание А или Т <220>
<221> аллель <222> 69248
<223> 99-62611-51 : полиморфное основание А или С <220>
<221> аллель <222> 73428
<223> 99-62605-56 : полиморфное основание А или G <220>
<221> аллель <222> 80250
<223> 99-62635-44 3 : полиморфное основание А или G <220>
<221> связанный праймер <222> 12343..12363 <223> 99-62626.гр
<220>
<221> связанный праймер
<222> 12793..12810
<223> 99-62626.ри комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 13814..13832 <223> 99-62632.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 14279..14296
<223> 99-62632.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 24863..24881 <223> 99-62633.гр
<220>
<221> связанный праймер
<222> 25378..25396
<223> 99-62633.ри комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 69198..69218 <223> 99-62611.ри
- 94 -
008252
<220>
<221> связанный праймер
<222> 69632..69650
<223> 99-62611.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 73005..73022 <223> 99-62605.гр
<220>
<221> связанный праймер
<222> 73466..73483
<223> 99-62605.ри комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 79808..79826 <223> 99-62635.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 80314..80334
<223> 99-62635.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 12623..12641 <223> 99-62626-168.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 12643..12661
<223> 99-62626-168.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 14069..14087 <223> 99-62632-275.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 14089..14107
<223> 99-62632-275.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 24962..24980 <223> 99-62633-409.mis <220>
<221> связанный праймер
<222> 249Э2..25000
<223> 99-62633-409.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 69229..69247 <223> 99-62611-51.mis
<220>
<221> связанный праймер <222> 69249..69267
- 95 -
008252
<223> 99-62611-51.mis комплемент <220>
<221> связанный праймер <222> 73409..73427 <223> 99-62605-56.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 73429..73447
<223> 99-62605-56.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 80231..80249 <223> 99-62635-443.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 80251..80269
<223> 99-62635-443 .mis комплемент
<220>
<221> ошибка связывания <222> 12630..12654 <223> 99-62626-168.зонд
<220>
<221> ошибка связывания <222> 14076..14100 <223> 99-62632-275.зонд
<220>
<221> ошибка связывания <222> 24969..24993 <223> 99-62633-409.зонд
<220>
<221> ошибка связывания <222> 69236..69260 <223> 99-62611-51.зонд
<220>
<221> ошибка связывания <222> 73416..73440 <223> 99-62605-56.зонд
<220>
<221> ошибка связывания <222> 80238..80262
<220>
<221> признак ошибки копирования
<222> 2375, 2377, 4041..4042, 5180, 7138, 7174 ,10118 , 12577, 12637, 1264 8, 13556 15322,15341,15357,15383,15409,15994,16064..16065,16077,16237 16264, 17751, 19182, 19424,20735, 20840,21865, 21885,21900, 22814, 23954 24969,24985,25001,25005.-25006,25017,25040, 25057,26646,27478 274 96,29278, 30793, 31122, 31125, 34 515, 34541, 34 563,34572, 34884, 34 915 36809,36834,3694 4, 37011,39862,39881,39895, 39903,39921, 39948 39954..39955, 41108, 4 2572,4 34 23, 44122, 53546, 53634, 55777,56140 56160,56182,56185, 56200,56206,56219,56234,56258,56268,56280,56290 56324,56561, 57259, 58256, 58297, 58910, 59321, 60724 , 60743,68789, 68803
- 96 -
008252
68871, 69936, 77190, 774 84,78780,78891, 7 934 3, 80394, 81773,817 95, 82232 <223> n=a, g, cmt
<400> 1
catcaatgca
aacaaaagaa
gttttttaaa
tgtgctggat
attgggattg
aggacagaga
atcactgcct
atttactaac
tatatatata
aaagccgcaa
gtagatttag
ttgtttaaaa
tctcgcatga
aaacgtacta
gattaattaa
acttctatac
tcttgtagag
gatgtctaaa
attccagacc
gcatggtgct
tcagatgcag
ctgaatagac
cctatttaga
acttgaggtg
gcacagtctg
gtaccccgcg
agacccccga
tggcagccgg
cagcctcctc
ttaaaaattt
cccccagcct
ccccagccgg
ccgcccgccc
ccgccgcccg
ccggtgcccg
cgcgctcgtt
agaggggctg
cgcctccacc
gcgatgcgcc
tgggctggct
agcaggtgtt
acctgccccc
gggaggtggg
cccaccccca
cttgttaagc
aacaccattt
ctgggggccc
gaatgctgaa
gtacaatttt
tcagaaggtt
ggtggtgaaa
tctaataggg
atatatatat
gagaggagcg
tttaaattca
tgcaacgaga
tcgatttttc
gaagacaaaa
ttctgtgttc
ctccaggcta
gagagatact
atgattgtct
tccatgactt
tttggctcat
aaggtctgaa
tgaccactfcc
agataattcg
gctatatatt
ataaagatga
cattgtttaa
cctggctttt
ctctgtattt
atatggatta
atatctgtaa
cttgccacat
aaagcttcat
tcactggtca
caaagtaaac
taggaggcca
tctgctgtcc
tttgtctcat
aaactataag
aacggtttca
acctcacgct
tgtgcccggc
gaggagctcg
caagaaggaa
tgcggtgccc
aaataaaata
gcccggcggc
gccgagcgcg
tgggcgccgc
cgggcaccat
ggaggctgcg
agttccttgg
ctagaggggc
cgagagcggg
ctccctattc
tgggaagccc
ggggggcagg
tcggcaccag
ggtgggcagc
tgctcctgtg
agccgtcatt
tgtcactgaa
agatcgcagt
ctcagaccct
tcagacactg
ttactcttaa
tgtgggttga
gatcaaaaat
gtgtgtgatt
gtttcactat
aagataaggt
aacatttact
gttcttctgt
tccagctttg
atagaagaca
ggcaacggag
gagcaggtag
actccaatac
ccttgaagcc
gagcatgaat
atgcctgttg
aaaacattat
aacgaatgtc
tcagtttgtg
tgaaacaagt
attactgtca
gacacagttt
catgaaatac
tgaatgtgaa
ccagaaaata
aacattttgt
tcagttgttt
ggagttccct
ctttcagaga
gatttcccta
aggtatactc
ccacacgaca
tgtgactgat
ccctttcata
cgcacgctgg
ggactcccgt
cagatgagag
ctgccagtac
gcccttcggc
ataatttttt
ggcggcgctc
ctgcctgagc
gcctggcact
gacagctctg
gcgcggccgg
ccggtccggg
tgcgggcggg
gcggtggggt
ctgcgcgtgg
agggccggcg
tggctgagga
ggccgctgcc
ctggctccag
gattgctcct
agggtggcta
tctttaagac
cattttgctg
tagtgcttga
tattattaag
tctggtgttc
ggaccagtga
taacaggtgg
tgtatgttca
ggtagttacc
ttccacagtt
ccctaactgg
agtatacttt
gagaaaaact
taatctgttt
ataggccttg
aaggggtact
acagtgaatc
catgaattct
tatagagact
ggtgaggagt
aaataaatgt
aaggaataac
aaataaacta
tggtaaatac
attttttctt
ttctgaagtc
caatatttta
caaattgtga
catttttaaa
gatagacaaa
ctttcccttt
ggggattttc
gtgggaatga
aacctgctct
acagggtatg
acatatttta
gcattcatta
ctcaggaatg
gctcccggcc
gcacaccgcc
cctagctgtt
cgaccctggc
atcactgcag
aaaggcccga
agtgagtgac
tgagccgccg
gatcctgccg
.agcgctgggg
ctccgtgccc
ccaggacggc
ggccccgcgc
ccttgccggc
gtgtcggggg
acacntnggg
cgaggccact
tgggtaaacc
caggtctccg
tgctaaatgt
caccgaacgc
accagcaagg
acttaatgtt
aataccttag
gatgtgtgaa
gtgtggtcat
ccttcgtgtt
cgattttgaa
taactacaac
cctgaggcag
ctaaataaaa
ttggctgtca
gacctagcca
taaaaagtga
gcagaataaa
tctctaaaaa
atgatatttt
cctatgcatt
ctgagactgt
taacagaggt
ggcactgaga
t taaatattt
acactatcat
gtatttagaa
tttttctaag
atgaggagtg
tttagaaatt
acatttccct
atggactttt
atgtaggttt
tgctctttgt
atttatatgc
gtatctgact
gtgggaggat
gctgggagcc
gggtggggga
attttaaagg
tttaataact
gaactagtcc
tcctggcagt
gccgtgctgt
gctgtgagac
gctccccacc
tccctgtagc
aaactccggc
acggcgagcg
taggtgaggg
gtcgcccact
ttacaggttg
tgcgcccgag
tcaggggcgc
gggggagggg
ctggccgggg
cgcctgccgc
cctgccccgc
gggcatcact
tctgggccaa
cgggggctcc
cccttatgat
aaaacagtgt
atggcctggc
cctctttcag
aataaatctt
tacacgctca
cagctaggcc
agtagttggt
atatatatgt
tgtgatttga
atgcatctca
atcatggctt
ttctgcgtgc
ctgctaaaac
aaaggttcag
tgtgccgtca
taacaaagaa ggatgtacct ataggatgag ctccatcatc agttcaacca ttagtaaaaa
tcagctacca
caagcaattg
caaactggtt
atttcatcat
tgaaaaatta
gtaaacaata
taagaaagta
gtgtagtttt
ttagaatttc
ctgtgtgcat
acatggcaag
gtcgccctgg
ctaggaagcc
ctgtcaattt
cgaacgtcaa
ccggggtgaa
tcggtaccgt
gcacttaagt
tgagtacgaa
tgactgcggg
aactgcggcg
aaagctaact
tcccacccct
tgagccgcgg
gcccgcgtcc
gtcgccgccg
gtcaccgccg
gcccgcgatg
tggggctgcg
tggggagggg
cgcgggagcc
gggatgcccc
ctgggcatct
acagcgctgc
cgcgcgggtg
gcggccttgc
attcattggc
cctgccaagc
tgggatccct
gatggtgtga
tcagtttcag
ctttcaggcc
cgactgccct
ggataacacc
atgtatatat
tatggcctgg
ggactggctt
cccaaacatc
ttttctagag
cagacagtgt
ttggatcctc
ctgataagga
- 97 -
008252
ctatgctaaa cacttataac tacttaaaaa ttgagtagca ttatcattcc tttatcattt cccaggtcag tatatcctaa taaactgaga tgagatgtct agaatggtcc ccaaggcagg ccccgtctct agttacttgg aggctatgat ttaaaaataa catgttatac tatgcaaatg agagatgata atgaccacaa tcatcgtggc ttaaaatatt cccagtaaat cagtttttca ttatgttttt ttcaaattgg tatgtctttg tgatttccta taaatctacc agaaggtaac caaaaatcac
= V "nf ¦"+• =
tggctgttgt atgatcaaaa atctttcttt caggactgat aaaaatacgg tggaagcagg agccataccg ggggtaggcc gccaagagaa aagagatgaa gagacacacc tgttttaaag gatgaaaata agcctgataa tgatcaaatg tcctctctaa atatcagtag agaaatacat tcagaaaaca agttgctatc attatagtat tcccagcact tggccaacat ggtgggcacc acccaggagg agggcaagac aagcggaagc attgggagtc ggataaagtt atctgatagc gtatatttaa atctctacag tttggatagg aagtctactc ttttcttctt ggcatgcttt atcgatgatg agtcacatgt gataagctaa gcctaagaat tattttctag ccaaggccac cctattgctt acaaaaaaaa gaggctgagg ggcaccactg aaaaagaatg aattctcgcc cttaaatttt gaatgataga tatctgtgtg attggacaac tctatataat acagcctcat tcattataaa cagtataaat tttcctgaaa aaaaaagaag aagaattcan cttttacaaa ataataattt ctgaaaacca
attcaggagt gggcttacat cctaggctgc aggaaaagct aagagagacc cttttgtaaa gaatatgttc tccgcagcag tcatttatga aagaggatgt aataaatgtt tgagataaga agttatcatg aaactttgga cttcagaaat aattatcagc acaattctct actaggcaag gttcaaaaaa tttaatacat gcacagtcaa ttgggaggcc ggtgaaaccc tgtaatctca cagaggttgc tccgtctcaa atgcccacag agcatttcat ttaagaatga aaaaactgag ggtaaattag aactctagga acttgcaaga aaaatagtgt cttgggtatg gtgtgtgcat ttcagataat ggatttcaag gcactgggcc nnttcaggaa ttttgctgtg acacggtggc gaacccaaga aaaaaattca tggaaggatc tactctagaa cccctgtccc tgtctcaagg tttaattgat gaaaaaagag ttttttgtag ttttatactg tttcttactt atatttaacc cagtgtcctg atccaaatat aattcagatt tatctgaatt gattataatt aagtgttggt ggatgtttga gatgctaaaa
ctaattctgc agtgagaaat agaatccaag aaagttcagt ctggaagagc acagaattgc tgaagacagg gagtggaaga agagatcaag tgtttggaga tttcctgaca ttcttttttt taccaaaaca tttgaaaacc tacttatcca aaacataaaa tacgttgtaa tgatatcagt ttgtttgatt ttataactac aagcataatg gagatgggtg cgtccctgct gctactcggg agcgagccga aaaaaaaaaa actcaatatc cttaagaagt aaacatgaat agctacagca aatgccaaca gaaagcatgt tattcaaagg catttagttg gcatttcttt gtatgtgtat ttcagaattt tttgtgaatg agaagctggg agacaaatat gaaactatga tcatgcctat gtccagacca ccaagtgtag gcgtgagccc tgggcgactg aaaatgttat accagcacag tttttgaatt taaacagcta tctttttaag tttttaccac aaaaattgta atacctctat atagttataa gtccatatct ataatttatt attatagaga ttgaataaat ggatcacatt cctttgtgct tatacctctt
tttttgcttt
ctgtaccccc
gcttttctgg
tcacaatttc
cccttagtat
ttgtttctcc
gactgacccc
attagaagta
agtgagaatt
gagaatgata
gagaggatca
cttttagatt
attaataaaa
aataaaaaga
caaagagaaa
taacgtcctg
atgagtcaaa
aaaaaaaaat
aaatgagaaa
aggcttccca
ctggccgggc
gatcacgagg
aaaaatacaa
aggggaggct
gatcacgcat
aaagtctgat
tttttaaaga
acaaaaaaaa
gaanttcact
ttccaatctg
aattggaatg cttataaaat agaaatgtac caatttagtg gaaatggttt acacaaatgt ccatagctgt aaaattcaca tggtgagtga gtaagcaggt tagtgagctt aatcccagca gcctgggcaa tggtgtacac agagatgtca ggcacagagt caacatttta attttcatac ttaaagtaac gttttaataa ggcttgactt tgaatattta aatggctgta cattggacat tgtagagatt gtcacctatt tatgataaat tatattgtat tgcttaatct ccctctttta atataaaaac agagtaaagc
+- лпэ о "-i rir> ^ w" " ^ u LWV
cctactcaga acaggtaaag tagattcagt ctttctaaga gaaggagcga atgagatccc acaggtccag ggatagacca atttccaatt tagatggaag cagtgcatgg aaaaacaatc cttagccaac aaaatatttc atttagatta aaaatctgta agtgaaaaat gaggtagaag aaagaccgta tatataccaa gcggtggctc tcaggagttt aaaaattagc gaggcaggcg tacactctag gcttatttta gttttgtgac aagaaaaaaa atgacataga ggaggaatat atgacaagga agtggttgta ttaaaaaatg aactgaagat ccaggtgatt acacatttgt ataaatttat tctacacctc gaaaaagaga ggatatacag aaacatatta ctttgggagg catggtgaaa ctgtagcccc aggctgcagc gagactctgt gagcttcact cttcaaactc caaagttgat ccgaagacag caggtagttg ttataaatat taacaccata ttgctgtttc tatttctatt tttccatatc ttccagtaat gtctttaaat gcttttgagg cagaaataaa ttgaccttta caaaatagga
+-+•+¦ => /Т =t 9 a s *>
cttcaagtaa gaagaagagg atagatggaa tcagtgtaca agttgaaagt agggcaaggc ggtgggggca gaacactgaa atgcaaagaa acagccaaca aacacagcca caaatcttca atctacatat accagcattg atgttatact gtcctgaaaa aaataggtga tgtgtaaata aagtcataaa cgatcagagc acgcctgtaa gagaccagcg taggtgtgat aatcatttga cctgggcgac ggggaaatgg ctaaaatggt aaagaaanga taaactctaa tgatctacag ggttagtgaa
- 98 -
008252
gaaatgcact ggagaaattg gatatacaat tccaagattg aagaactgga atcagattgc 7380
agtaatggaa atgaagaggt ggatggtaaa gatatatcca caaaaactaa tgctaccacg 7440
tcttagtgat ggaaggaaga gaatgaaagg gagtcctagg ttaaaaataa tttccgatca 7500
tcgagcttgg gtgattgtgc tattgtattc tattaagtct agttaaaaga aattgttacg 7560
gctttatctt tcagttaata gtatctacag ggtaaatcct ttgcttcatt cccttttcta 7620
gttgttttat tgttattttg aaattcacat gagattactt ccagaggcaa tatcgttttg 7680
cttcctttct ttgaaggcat tgaatggcaa tttaaaggtg tagtctagac tagaaaatca 7740
taacagaaac cccaacaaaa actcaaatat cttagttatc cttttataaa acaaaaattt 7800
aattcctgta tacaatgcaa gttagttatt ttaaaagtaa attctgaaga tttctgagga 7860
aagaatagaa tatcctgtat atacatacaa ttataaatca aaatttttgt ctcagacata 7920
ttttgcctgt gttgcttata attagactct cttattcttt tccacacaga gccatgacta 7980
tgcaatgtga actctctaag tgttctcttc tgagcatcta ggctagtgat gcctcattaa 804 0
tttggaaaca gtgatgggag aggtgtgcag ggatcacctg aagatgtttt taaaaaaata 8100
caatgtcctg ttttccaccc ttaaagattc tgatttagta tgtctgaggt gaaggaggcc 8160
tcagcttgag tgtcttagtt agcttgggct gctgtaacaa atagcacaga ctaggtggct 8220
taaactccag actttggttt tatacagtct ggagactaag aagtccaaga tcaaggtgct 8280
ggctgattcc tgtgagggct gtcttcctgg tccacagacc attcagctgc ctccgttctt 8340
cttatagatt cgctagtccc attcatgggg tctccacctt catggcctca tgacctccca 8400
aaggccccac ctccaaatac attagagata agagcttcaa catatgactt gaggaaggca 8460
gaaccattca gtttatagtg ttgagaatgt ttctgaacct cccttgataa ttcatatgtt 8520
aagcagtctt taggaattac tattttaaac catccccttt tgagcaaatt tgtggattca 8580
tattgcaaaa tttaacaaac acaaaaacat aatctccctt tgatcttctg ttatgtttaa 8640
atatagtagc aaattttgaa aaccactgtt ttaaaccatc caccttcttt atctaacctt 8700
tacagattca tattataaga ttaaacaacc acaatcaaaa taagtatccc ctttctggtt 8760
tttcataata tataaatgat agtagcagct catcaaaata aaatatccaa cactggataa 8820
ttaatataga gtaggatata tactcagcac agggtaggac ggtggtggcc aggggctggg 8880
aggaggggaa aatggggagt tgttaattac tgggtagaac gtttcagtta tgcaagatga 8940
gtgagctcga gagatctgtg ttatgacatt gtgcctgtag ttaacatttt atagtgaatg 9000
taaaaatctg ttaagacagt tctcgtgtta aatgctccta ctacaatgaa acaaaaataa 9060
aaattactgt gatgtaggtg acaaaaatac gacccagttc cctctcatac tgcttgacag 9120
ttttagtttg ggcatgtagg tgcaatgaca gttttagttt gggcgtgcag ggtgcaatga 9180
^-i-,-^-!^^^,^-. nfnn(*Mf/Tf ^4-^9 -" +¦ /-.^^4- ^-i QOitft
u" и ua <^ <^ ч^ч"са u ^. -v^L. i- v-a m- ^-a w *_ ^ с- -я v
аааддссада gaaaattcaa ttttcacaat taaaaaataa aacaaaacag aatccttgga 9300
gaagtaatga cagttttgga gtttttctag aaataaccag agaaaaataa cctgctgttt 9360
tactttggga tttaagaaat agacttataa aaagtgggga accatttttt atttctaatc 9420
agtaccttga caaaaggaaa acagaagagt ctgtttttgg agatggttct ttgaaacatt 9480
tgccttcccc tatgtggtca ccaccttggg tagcccttga agtctgctgg gactggacca 9540
tgcatgcaaa attctgtttt ttgcagagct acattattta gtgagggcca agacacagat 9600
gaatgagtac cccaaaagaa aagtggcagg tggcatttgg aggagagaga gagaaggaga 9660
gaggcagaaa gaaaaagaga aggaagaaca aagaaaacca ggcagccaaa tcagggtctt 9720
gacttttgta caaaattaga ttgaaaatca accacaacaa tccactacct gcaggggcag 9780
gggagtgggc cgctgttctg ttgtggagac acgcattgcc gctgtgatgc ccagggtgtc 9840
agttttttga tgctgtctta gttctcctgc taacatgttc tctgctgtgt tgctggggga 9900
gacgcaggac tccaggctaa gtttaagaga gaaaacatag agctgctgcc tttcctctga 9960
gcagaggcca gattacaggg aatgatgcat ccagctcatt gaagttcaca agctaaggat 10020
acgcggagga gaggcttgct tgagagggcc cggaaggact ggcattgtaa gtctagtggc 10080
aggcatgctc taatttggtt ttattactta gacgtggnaa taggcaggaa cttggagatt 10140
cccgtctctg ttctctggga aagaagactg ttctatttac aaagacttga aagggtcaga 10200
ctgaaagaag acatggacag caaagtattc ctggggtggc aatcagaaag acctggctcc 10260
ctcgtggttt atcacagcta accatgtgac ctcagacaag gcacttatct tctccaaaac 10320
tcagtttcac ctgtaaaatc agaataacag agagagagac acttacctca ttgaggcatg 10380
gtgagaaata ggtaacaatt agcctcacac ttaataaacc ctcagcaaat gttaggtgta 10440
art +¦ rrt- t-+• = = = <~+- rr = = = = *• t- t- -t- f = = 4- rrb bffafH-rrtt fraaanaaat- t- a t- a a a f- a a a 1 ПЧПП
acacatcatc tttgtgaaca tgtacagaag ttcgtgtttg tgaaatgtac aaaagttctt 10560
aaggttaaaa agtgaaagtc aaatgcttca ccatttctct ccctccctct gttctcccaa 10620
caaatagact acttggattc taaacttgct tccaattcat gtgggtctgg gcatgtttgc 10680
ctccaatttt taatctctgt agtgggaata atactaaaaa ctacttcaga gaggtgtcaa 10740
atgcttagaa tagtgcctgg catggagtaa gctttcaata atatttgttc tcatctttca 10800
agttaaaaaa atgagtacat aatgtctaag cttgcttcta ttctataatt atgcacagta 10860
gtttatggac tttcattcta ccctgagaaa tgatcaaatg cataaaaatc tgagcagtgt 10920
caagagtatt aatcactttt atcattggaa gtcactttgg atatcatcta ttgcaaagtc 10980-
ccagacagag gagaaatctt ttctgcaaac tctaaaatgt gtagtcattc cctctgagag 11040
tatccataaa ggagtttacc accttttggg atattccaac atattatgat tggaaactta 11100
- 99 -
008252
tagagtagat atttctattt taacaactgt ccttttaatt tcataggtgg gagactaaaa gtctcttcac tctttaccaa cctcaaggaa gatagattta gtgtggtgag tgagaaatgt ggctatatga atacttaatt taagtttcct ttttcttttt tatgatcttg ctcctgagta tttttttttt actcaagcga cacatggcct aacatttttg caaccagtga tggggtatat aagcattctg cccttaaatt ggagacagca ggaggccgtg atgatctggg tcagctgggc gttcttttta tgtctgcatt gttctgggct gctcttgcac aatctatttt ctaactctag tacatggggt atttagagaa aaaggaataa atgagaggtt
tcaaataaac ttccttgcta ttggattttg aatctctgta ttagttttca gaagtgaaga gagattatca aaaaataatg taaatggata tgatgatttc
agtcacctct tgataaactt
gaagaacaga gagcactaca
ggtatgacag aaaaactttc
gaaaattaca tacattcttt
tattcttagc ctagtcagtc
aatctgtcat tttaggaaat
aatgggagtt agtaaatatg
aaggtataat agaatatttc
ataccttcag aaacttgaaa
taccagaaaa aaattgacat
ttgttagaga aaacaaatca tcaatacata tagccatgta aagaaattac ggagagatct tttttctcat taggattcat gggttattta ttttataagt
?aaaaL^aua aa
ctgtactatt tttaaatata tttgattcaa catctgtaaa ttctttttga gctcattgca gctgggacta tgtagagatg tccactgcct gaaaatgtat ttagaaggac gctcactatt gtgtgtgtgc agtaggagat gtcgtgatga gagttgctgg agaggtgacc ctcagagaaa agagggaggt
attggaggac ggcagagtgg
tgcacaaaaa ttgaaaaagt tagttctgtc atggttcttg gacagagtct gcctctactt caggtgcatg ggttttctcc cagcttccct gatattatta tctgtttttg ttaacatgga aagtgtgtgt aacattcatt ttgaaatctc attctggtct tcatggaggg gaggggaagt gcaggtatca gcagggatgg
jQuaQLQQaa a l.
ataattgatg ccaagagttt cattttctca tttcctgtcc aggcacattg tcccgtcttg tgaaaatgga atgacatagt cactctgtca cccaggctga cccaggctca agtgagcctc ccagtactcc cagctaattt atgttgccca ggctggtctc aaatgctagg attacaagtg aacagactgg cacataataa catgacagta aacgtaattt aactctcatg tatcccaaag gagctactga aggctatttt tttacangca acttctgttt aaggcangtc awtgagcnag ggaaagtgcc cagtgcgtgt agaggaagag cgtgagcatg tcatacactc aagatgcaca gtagctctga ggctcaaatg tgacacatga ggcaggtgga
gtaaacacca attctgtaat tctctgtgcc gcatattctt ggggcagtag ccacctcaga tttgtatttt gaactcctgg ggagccacca cccctcaacc gggttgaaat cactttttca cctttggaga ttaacacttt cccctaaatg gagaggctgt caggacacag gagaggacac ggccctggga tggatgttgg
atgtatgatg agcaagcaaa ccttttgtcg atatagggaa agttctgtgg atattgtaat gggtaatgcc tatatcagct gaaagacaag ctgcacatgt atctggttac atatgtggca cctaaagaaa tggcagacac tggaatccct ttctacaaca cttctaactt ctcctggatt actgctcaat ataagaaaac
----------3
gggaaaagac ggatagtcaa atgctggttg gttattgaac agagataaaa gataaacaat agagtggttg gtcaatgact caagttgtat caaatcacac ctacattcat attgacagtc tcaagttttc aggacaggaa ctattggaac gcctacatta tttctcagat caccttgtaa gaaggggcac gtatttattg aaaaccatgt aagaaagtcc attccacaag aatgtatgtg gatggctttc aacctgtatt aatttaaggt tttgcatgaa attccttgcc cactagatgg
ttgctctgaa aaactttaca actgtggtgt gctcttgttc taaaaagagg acaaattggt acaaatttaa ggccttgcac agatgtttga acagaggatg gtaagcagcc taaaagagat agaccataac ctcaacaaat atttttgttt acttgtgtta ttaagtattt tctcattatg tagggaggta acgttgaaga
tggacatgtc ttctgtctga gaaacaaggc catcttgctg attgaggtaa aactgaagat aaatgtagat tttagtggtt aagaaataaa aacatttgaa aacatcaaat acatgtgtct cactgggaac ctaatctgga gtataagcat gtaaatgagc aggtagtgtt tacttacagt atgttcacag aatatggcta atttaaaaat aaatgtatgc acaattcata tcctcttgga taattacttc atctgcagcc tctttgcaaa aatgattgag cttattttgt ttatatagtt atgaaaataa aataagaata gagatctagg caaagaaaga cccgatagca cagaaacrtg gtatggagcc agcagtaagg
gaaggaactt ttaagcatcg gtaaatgtgc tgttgttttg ataagaatta tcaaaatatg aagctgtgct tatgggacaa taggantttt gatttaaaaa atggaaaaat gagtaagcac ccttgttcgg tctctagaag tttctaattt gaattatttt ccagtcagct ttgggaatcc tactgaagga
gaaagtgcgc cacactagag gctctctttt
rt* a^t* nt nrr tftaaaf ara rrt я t* rrt" +• rrt-r ttrrAtnfnfl
ctagtatgtt aaaacaaaac gtttcccaaa attttctttt acccaccatt ttcacttgca ttggtattga tctgtcttct gtttatcttc acatagacaa
ttgttcaatg aattatgcaa gacatgaaag cttaatttcc aagtgtgtat ctcctaaaga tgtattgaca ttggggcttt tcacatcttt agtcttcatg
ttaaatccac gtcacttaac acatgaatga atgagaaact tcagagtttg aggtgaagag ttctcaaact gtgccaggga gtgtgtgtct gtgtctgcaa ccccacagtt tatgcacaaa accttaataa cacctaatga ttagaatgaa atagatgctt attcccaaat attaagtttt agttaagtga gggaattagg
aaaatggtca tctgctagca tcccggagat tactaagcaa tagcgcggtt agttatcaga ttaaaaatga tcattttata tcagttataa aaagactgat
- 100 -
008252
gtgggattgg cattggataa caaagaggac atggcttgga taaagggttt gaattagttg 14 940
agtaaaggtt gcaggatggt gaataatggt atgtttagcc aacctgagtg cagcatgtgg 15000
tatgagtgtg aaaggaaggg caggtacaaa tcagtgggac tcagggtcct ggaaacataa 15060
ggttaaataa agtaggcagt tcgtaagctt caagaatgcc ttcatattca gtgctgtata 15120
cccagcacat accgcagtgc ctgataccac agtggatgca taatatttgc tgtgtgaatg 15180
aatgaatgaa caaatgagtg agtgaatgag aaataagaag atacactgag gttttctggg 15240
ctacaaagga gacctacagt gtgtttggaa gctgattttt ttttatataa aagagggaac 15300
attttgaaag gcatcccaga cntgagggcc catggcctac ntagaaagga gtctagnaaa 15360
tggggatagg tgaaaaaggc cgnttgtaca tatatggaat gaatgagcna agaaaacaat 15420
ccactgctga gagtgggtgc aaagagaacc tgctgggcct tcccgctgca catggggaac 15480
ctgaagagtt tagagcagta gggtctggga catgagagga aggagaaaag caggatgcct 15540
ggctcatgtc gctctctcag gctgaatctt cattcatgat ggtgttggca ccgtcttcct 15600
acatctgcgg gggaagcagc accgatacct ctctaaatta gtagctggac acagatggta 15660
atggaaactg taacaacagg tgatcactta aggggttaag tagagaagac aggcaagaag 15720
ggcatgctgt gaaccataat ttggaagaca ggagaagatt caaaagactt taatactgaa 15780
cccaagagag ctgcaaggga aagaaatgac ccatagtgtt gcaagggcgc tgcagttaaa 1584 0
gaaaatggaa tattttaatt ttaatactgt gaagacgggg ctggaatgaa gtagggaaag 15900
tatataccaa tagaaatgaa attgctatca cagaatacaa aaactgggtc ttaaccattt 15960
aaaacagcaa tgaacatggg atgaatgagt ttcntgagtt gctataagct gtttctgagt 16020
aaaagattta ttaatggata cattgtgaac tgtgtagcct ctcnnccgat attgaantat 16080
ttaaatacca actactttta ataaatgtcg gaaacctttt gaaagccatg tttttcaaac 1614 0
tttgtgtact gtcttatgaa ggacactttg gtaaacagaa aaaagagata ttggcttata 16200
aaaacataat aatgataagg ctcagataca caggaancaa tttcctatca aaataataaa 16260
cttnacctag gatacttaaa tatccctact ggtttttatc agagaaataa taggtctgct 16320
gtatgcagtt ttattgattc aacatgaatg aaggcataaa acaatatttc tgtttgcaaa 16380
ggaaaattat tacaatcaac cacctcaaat taattttgaa ttcctcatgt gtttgtaact 16440
taaatttatt ttactacttg aatgctttat ataatattta atagtattaa attaaatcta 16500
gagatccagg agctagttgt tgagttttta tgtatgtgtg gattagccag gtatctttgg 16560
agcttagatc atttcttggg cactgtgaga tttagtggca cctgggagca ggtaaagtga 16620
aggtaaatgt gagtgacagc taatgtcatt cagttataat tgcactattt tggttggtca 16680
gatataacca aagtgggaat tttttaaaaa acaataaatt ctggacatgt atttttctag 16740
ataaacaaat ccataatcaa aaatgatttt tgctttaggt ggcgtattga taataaaggt 16800
gcatggaatt catatgccca ttgtctccac tgctcagtga aagaggaatt gtggacagat 16860
ctctaaaatt ccttatataa tctttgaagt gaaaccactc ttttacttgc tcctttgtat 16920
gtgtcatctt gaaggatttc taaaagattg tatctacact cagtatttgg gtggatagga 16980
gactgtcatt gaagaggcat ctcaaattga ggccaccaga tttccttccc cactaccagt 17040
acatcagaga aaaaaaaaac actttaaata ctctgtatac attaacatgg gatatcaaag 17100
agtcccaaac tccaattata taacataaat .taattagtgc agcctactgc aaagcccata 17160
ttcaaactca atattcagag caataacagc ctggaaatac ccagcatgtc ttcaagccag 17220
ttagcttgtt ttcttctggg aataggaggt gaatccgtcc gttttcacac ttctataaag 17280
aaatacctga cgacgctggc taatttataa aggaaagagg tttaattgac tccattctgc 17340
atggctgggg aggcctcagg aaacttacaa tcatggtcga agacaccttc ttcacaaggc 17400
ggcaggagaa agagtgtgtg aagtaggaac tgtcaaacac ttataaaacc atcagatctt 17460
gtgagaactc actccctatc atgagaacag catgggggaa accgccacca taattcaacc 17520
cctctctcca cacgtgggga ttgtggggat tataattcaa gatgaaattt tggggggtgg 17580
gaggacacag ccaacccata tcaggagagt taggcagaga tacctgccca ggtagataaa 17640
ggagcacata gcgatgggga taggtgctca atacaggcaa tcagattcgg agctgctttg 17700
ttctgagttt ctgtgtttta ttctcttttc cagtaaaaac tgcatctgtg ngcgcgcgca 17760
cacacgcgcg cgcacacaca cacacacaca cacacacaca cacacactgc aaacatgttc 17820
ttgtactcca gtgaggacta agtggcaccc attgtgcttg gttaggtttc tttctctaga 17880
cccatggagc accagatagg agagccagtg aacccgcctg atgttaaaac tgcagtgcta 17 94 0
cgttttcctg actcagcctc ttttttttgc ctgaagcgct cttttttttc tgttacccgc 18000
rftnanaaat' tntrrfaafa ntrtnranrt- t- г-д гтг"э t-nrrt- raartrfaaa rrrrtt-anar
----7 - -?---------------n----эч, - ww.--, v~ *2 ^ -----• ----v ~ .----" -----
attgtagtca aacagagctt attttaaatt tcaagtttgc ttggatggcc ttggtcaagt 18120
tattacctgc cttgaggcta gcttttctca tttttctcat gcatgtgtaa gaagatgagt 18180
tttttgtttt ttgttttttt ttggttaggg ctgttgtaaa gatcaaataa aatatcattg 18240
ctaagtgtcc caaacatagt atatgcccat agctgttagt tcctcacctt cctttaagac 18300
tcaatccagg tgctaatcaa atgggaagtc tcacagtcga ctcagggatc atcaggtacc 18360
acctgccttt ataacaattc ttctcacatt gtattgcact tatttgctat ttgtgtcctg 18420
agggctgaca tataatagcc ccccttcaag tgactgctga gttgtggaag gcagtagcaa 18480
tggccatagg gaggtaacgt ctatcacagg atgtagatgt ttcagaattg tggaaattta 18540
agcagttagc aggcatctca tctcccacct caatgtaatt tcatgaacaa tttacttcag 18600
agtagctgga agaatttaga taatcactgc attcataaaa caacatctcc atttagggga 18660
- 101 -
008252
ggttcttccc ctactgttgg tggggaagat tatgtggaga tctgccctaa cttttgaagt attaatttat tagaacacat agggcaagat gcttgctcac
ccattctttc aagtaagaga ctgtgcattt cagctttagg gaagcaaccc acataaaata ctcatccttt atatgcctta ggtttagatg caaagctaac
tgacctccct cgtctgtgaa catctgtatt tataagagca attttactct atccattgct taaagtttct caaataagta acaaatacaa ctcagcatgc
i-n-ayvtayL ^at.LijautLL yytui-iyaLy
ggattaacaa aaatgtgatt gtagaatatg tgtcgctatg cacgctgtgc gatccaaagc tcaacgttcc atttgcaaaa tcaccttcac actgtgtgcc tgctggaatc atgctgaagt ccatgataca aatctgccct attcacatca taaaatacgt ctgctccttt tctaggctct gaccctttcc tgtcacctct
actgtatttt gtgtgtatat tgttatatac attacacata aaatatcatg tgtatgtata gtatatatgt catgttttat cctaaccatg tctttctcta cataatatat tgtgtgtata aggtgtttta ttctccattc ggaatagaga tacaaactta ataattcttc tatttggaag ttcacacacc aagtaaactg
accagtaagt
gacaaattca
gatgaggttc
agttactcac
accctgtcct
tggggtccaa
tgaatccgtg
tttgagtaaa
cgcctaatta
agaaagcata
tcagctctgc
aacaaaagga
cacatgatct
ccaggttact
cgcttctgct
tagtgtgaca
cctgtgtcag
ctggattgtt
cagctcctct
ggcatcctcc ^ -i ^ +- f- A-.
tatatgtatc ttatataata acatacatat cacatatatg tgtatataan atgtgtacat tatatacgtg aatgttatat atacatgcag atctgccttc acatacatat tatatatata cttcttggac ccagcattct atgaagcacc tgaagaaggt attaaaatta ctcttttgta aatgtttatt aatcatcagt
ttcttctttg aatatcatgt agagtctgga ataggaagat cagagtcaca gatgagcaac agacaatatg aggtcaatga agttgatgag gtaaccagaa aaaaccaagc aatggcctgt gcttggactc ttccctgcct ttataatcat ttcctgcttc cacactgtcc cacattgctt gatgagtcaa tctgaaaggc
4- 4-4- -a 4- 9 4-4-^wwUw"LCiww
atatattatg tacatatatt aaacatataa ttatatgtgt catatataca atatttatat agactataca aatgtgacat gatctgcatg cagactacat aacatgctat tatatatata tgcaaagcag gacacatagt cctaactttt agtataaaag tgtctttaaa taattagatt gaagtgcttc ggcttatgtg
cccctcccaa tgtcgtatta actcagcagt tacatctaaa agctattcta ttgggagaaa attttcatat gatatatgtg cttttccttt tcaaaaggaa agtctctgtc agtatggaga acctttggct agtagagaac gcactgggta tggtgtagag ctgttctgaa cacatgtttg gataatggat gatttgagaa ctaagcctga aggatcaact tccctcttgc tttgctgtcc gctcacattt ggaagcatcc ttttcattca acttgagccc tccctgctcg atcctcctca ttatttccgc
fnf^b^f & a
tgtatattta tatggatcta caggnttata taacatatat tgtcgcatat gtgcatgcat tgatatatgt gtttttgcct gactctttgt gtgtttacat gtgtatatgc tatatatata gagtcagaag aggccttcat tcttagtgtc atgtggcctt ctaaaaacac ctttatgttg caaattgcat gtatggaatt
gttgggagat aattaacact gttctagcac aagattttcc aatagctagc aaaatcaagc gtttattata gggaactcaa tncccagact gcagagttcc ggataatgct agcatatgtg tcgnaaatat aatccaatga gtctgatccc atgataccac tgaacctcct gaattaaagg ggtatctctg gaactgctag caggcatgca tcttactcat agtgcttgtc ttcccagtct ctttctatat ctattacctt ggacctaacc catcagcagc tactgctccc tccattagga cacagacaga
4- s <- = = = nfn?
cattatatac ttgtcttagg tgtatatcac gcatattacc gcatatacat ataacatgta atattatgtc cttgcagtgc tgtccttccc gtatgtgtat acacattata tatatatata tgtgttgctt tcatacttag catcttatta ggaggcactt ttttgttgtt aaagtccaga gaaaaataca agcagcaaaa
caacttgggg ggggaaacca aaagcacctc caagaatatg ctctaaactg ttctgttggt cactatggag ttttttgatg gtggttttgt agggtggaag
+- яя at- a+- +- a +- aaf^trrfTan r*+" nra a rrt n-t"
tgaaagttct ctgcagaatc tcataatttc ttgtatacta ttaagtattt tgtatgtcct tttggggtta ttttgtggaa aagagaaaaa ctttgtattt
gacagtcttt catctactac atatatgtcc attgattaac ttttaatcct gtatatatat aagaaaatct ttttgaaaga tctatgcatt ttatacaaag
tctanttttt aagactaaaa cagatagtca tggtaatatt agatactagt tcatgttaac tcagacagca tgtctgggct tttttcaaat gcattatata
catcttgagt tttttttcag ataaaaacgt aattgtggtg tttcataaaa acacacttat gacatgcctg aaatttgtat gtaggatgag tcagatacaa
gtttngctag agtattatat atttggatta ggtttagcat aaatattgag ctttaattct tagtgttgca aaaatgtgtt accagatttt atagaaagga
gatgtgagat ctgagctgca aatagtgaga ctcccctccc ttctcaggct ttacttgttg tctccttctg aagaactttg gccaggcacg tatccatgag ctcatggttg cttcccccaa ctcttcctct ttctattttt cattgcaaat tgtccagcaa ctcctactcc tggccccagt ctggatgaga atgtacctct
V r**r I-.4- a a ^4- a
attgtaggtc tatatataca atatatacac cacacatata atatattata tatgtaatat ttatctagaa ttgtctttcc agtctgtctt ttacatgaaa tatatgtatg atacattcat ccatattttg agaattgaat cagagctttc actaaaatta gaagaactta tggggctaaa tcaaccttta tatcttcatg
nf-г?эгт+- r"t-r"r-
- - -"www
tatatatagn taaagaatta tgtttaagaa ggagatgcag tatgagtgat ttcttcttat cagaaagtta ctccaaaata taaaaagttt aattctaaat
- 102 -
008252
atgggatgtg
ttgtgctaga
tagtacaaaa
cacatatttt
agatgtttgg
cacagaaatg
aattaaatga
gatttcttct
acttagtgtg
ggaccatcat
tctgtttgta
ttcactttgg
atccggggca
tgaaagtctt
tttatcttat
ttgttgcatg
atctgagaag
catgccactt
ttatttgttg
tattgcagca
aggacatgag
agtaccaatt
aaaggaagaa
ggttaaacat
cagtaatagg
tttcacttac
attttgtaca
atttcattgc
acagacaatg
cccaaagtat
atttagccaa
apf *— r*-t- +-+-¦*-/* -- - --r>
aaatataata
taatgtaggc
tatggttggt
ttgttttcgt
gatctcagct
ccaagtagct
agagatgggg
ggcctcccac
cttttcacat
ttgtcttgtg
aatagtttnc
tgcacacagg
tttgccagtc
ttgagagtga
tcattcaatt
caattgtttt
acaattctta
gagttttgta
attttattta
ttttaaatga
gttctagatt
tgatcatatc
agttgctttt
taaatactag
atctctagtg
attggattaa
ttaatttgtc
aagagaagag
tgggtcaaca
ttccttattt
gtgggtggcg
ttatatatca tgctagggaa atgaaaaaaa aattgaacca gagagcctga cctccacctt tatnaaaaac tcttcacctc gttcataata tgcagtgggt tgaatacgcc atacattatt ttgtcaaggt aatcccttta acatatggaa agactatttt gaacaagatg agggctgagc acttagggag cgatgtcatt atggaaaaaa ggaaacaaaa aatttctgtc atgtagatga agtgcagatt tggnttgtat aggattttga ttccctttta cattaatagg attacagtta ttctgtttca
+¦ a i" +¦ nrr-r+- мал
atattttacg taatacttaa ttcttcaact ttttgggagg cactgcaacc gggattacaa cttctccatg ttatgtttct cctgcaaaaa gaagattcta tgtgtactcc tgcttctttn tgaagggtgg ggttagatgg ttggccactc tcccagtttg tccaaatcat ggtttcctca atcattttgt aggctgttgg cttgtattag atattcaaat acttacttaa tagaggtagt tttcttcatt gtgaataaac aaatgtttat atttttaaat tacattttta taaatttggt ggcatgtatg attcatttaa gttatggtaa agtaatggca gaatcttcct tcaggttccg tctgtcttag gtgaaaatat catattagta caagtttgag tcactctttg aatgaccttc gatgtttctc gagcacttcc atcatatttt gtccttttta aaaagttaaa gtttgactaa ccacaaccca tgcagaatca tacttgatgt tgtctggggc tagatataaa actggatatc tgctgtccct ttagagtttg cagcatctca gaatctactg tacataatta ttcttgttta taatgtgaat ttttaaagca
tatgataaaa
cccaccgttc
caagactcag
gaggttcact
tctgcctcct
ggcctaagcc
ttggtcttga
taagtctcct
attttcctat
catttgagat
wtgtncctct
cccacatggt
gaaacggtaa
gattttatgt
tgtgtgtgtt
ccattgtcat
ggacaaactt
tacagatttt
tatttgtatg
tttctataca
tcataatagt
aaagaaagat
agtaaaataa
gaacattttt
aactagttca
tttaatttca
ttttaatttg
attgagttat
ttctatttta
ctaatctttg
cacactataa aaagcatttc
atatagtatg
catcaagttc
atattgtagt
tctatgcttt
tgtgtttatg
ttgtagcaca
aactatttta
atatcagtta
ctgcgcatct
gagcactatc
tacacggcag
atgtcattta
cttgttcatt
aaaaggcata
taaattttgt
tgactgtgtg
gcacaggggc
gagtcccatg
gttttgaaaa
caaaaggaaa
atgttttaaa
ttttccttcc
agagtattta
acaaatgaca
agttagctaa
agacaatata
attgtgtgcc
actttttatt
ccctgtaact
aatctgagaa
ttaactacta cccctaattc ctatgtgact ctgatgccca gggtctttgt tggaaaatag ttatatgcac acctcagtat tggtgccgtg gtgccatcat ctccacttca agatgatagc aactaagaac tcagtaaaac actccagaga aagtcacaaa aagtctcgag tggcccagag atagagttag tacaaaagga attatgtgtc agggtaaaga atagcactaa aattgtacta gacgactcag ttttggtgag taacacataa atccttgaaa gtggacttta acacatcaac accaagtcat
tgataggccc taggtactta aaattacaaa ggaggttatc aacgcatggc gtgccttgag ttagatgtta tatgttttcc tagtaactct cagcgtcatt gtatgtgacc aaaaatgcac ctaaatgtgt aaaacatcat ctgggagaaa ctcttggaat tagggttatt aagcacctta agcatgatat taaaaaaaaa atgtgaaatt aagggaaaga tctttacata tttggggaag atcttagttc aaagtgtttt ttatttgtca gacagagatc aaaaatttac aattatcaat ttcagaaata
tatttgtaac atatttccta acaaggttta tttgttgccc gcattcaagc accaccccgg actcccgacc ttaagtctct gtcattgatc ttggctgatt gaactgcttt cacctcnaaa tccactgtag atcaagagcc agaagtatca tggctttgtt tctattgtct gcacattctt aggtcttcta ttaatattat tttcctgcta ttgtcttttt atgaattgac attttgtttt aaaaattggg cattttgaga tcaaattatt ccttccattc atgtgttgtt tcaggttttg aatagtctga
aagacttagc
atattgtcac
catagtatac
aggctggagt
aattctcctg
gctaattttg
tcaggtgatc
gtaagtccac
cattggaaga
gcttccagat
ngtanntttt
atatgtcaga
ttttaatttg
atttttaagt
gctgtttgtg
tgtggttatt
gcattttatg
ggttatattt
ttacatgttc
attctgctac
attcttttga
ctttgtaatt
taacactgcc
gtttttggtt
atttgaagta
gttgtagcac
attttttcct
cgataaagaa
ttgttatata
atattagatt
gcactctcag
aataattcct
aaattttttt
ttgattgttt
gcaatggcac
cctcagcctc
tattttcagt
tgcccgcctc
taagtttcag
catgcgtctt
ggtgctcttg
gaccagncaa
cttctggata
catttccctt
tactattttt
atataagttg
tgtaccatac
tcatacagga
atgctttggt
taacttgttc
tttactaaat
tgcttccata
tttatgccct
ggtaaaattt
tatctagaac
tgtgtacatt
aactagcttt
tagtgcttgt
aaatccctac
tgttattatt
tttcatgtgt
aattgttttc
- 103 -
008252
actttaaaag
gggttccttt
tattttttat
ctcttgtcac
ccaggttcaa
caccacgcct
ggatggtctc
ttacanggcg
ttgctctgtt
tcttgggatc
ccaccatgtg
aggctggtct
ggattacagg
tattggggtc
taattatttg
ctaattttgt
gtattttttg
ttttttttaa
aaaaatattt
acatatgtat
gtatatttcc
tgatgttccc
tttactttat
gagactctta
gttaaccagc
ctcttttctc
gagaatgtat
gatatttatt
tatggtttgg
tttctacatt
tgtatttcac
gtttttgttc
tttctagttt
tcatattcga
tattatttta
cggagtacag
ctcctgcctc
tttttgtatt
tgacctcagg
accatgcccg
tcatcatgat
ccacacattg
ttatcctgat
ctgcctctgg
tgccctactg
tgtcctttgg
ttggtagtca
taccagttta
tgctcagcat
tggaagaggt
gtctgtatct
ataggttcag
gagaatgcta
acattctgtg
gtgtgtagtg
tctgggtgaa
gaatgaaaca
ataaagactt
ctaatgataa
acagagcagt
taaaagagaa
tccagtattt
tttttttttt
tttggtatca
gcagtatttc
tttttgtttt
ccaggctgga
gcgattctcc
ggctaacttt
aatctcctga
tgagccactg
gcccaggctg
aagagatctc
tggctgattc
ccaactccca
cgtgagtcac
tatttggtga
gtaacataga
atttttttgt
tttgttccat
aaagaatcag
ttattatact
acatgtgcca
taatgctatc
cttccntgtg
gggtctgttt
aatctgctgc
agcataaaat
ctgaatacgg
gttatctttt
ttattgcatt
tctttccttt
ctctttccct
tcctctttct
tttctttttt
tgtgattctt
ttatagtctt
tttttacttt
tggtgcaatc
agcctcctga
tttagtagag
tgattcgcct
gcctatgtat
ccgtttgttt
ggtagagtag
gggtaaacat
actgctggcc
aattgccatt
agtttctaat
tttgtttttg
catttctaca
tccacacgta
gggcatcctc
tccacaatgt
aaaactggaa
acatctctgt
tagttgcccg
gttattgggg
gcattttatg
aataagtgac
agatttcaca
aaagaacaga
gagagaacac
agaaatgact
tcacatttcc
tattttcaat
gttcccggtg
ctatttcttc
ttttttgttt
gtgcagtggt
tgccttagcc
ttgtgtgttt
ccttgtgatc
tggcagacct
gagtgtagtg
ccacctcatc
ttaaaacttt
gactcaagcg
agtgttcagt
agtatatttt
cctgtgtaaa
tattttggtt
tttgttttag
cttaattaac
ttaagttcta
tgttggtgtg
cctcctccct
tccaagtgca
ctaacttttc
ttccttgcct
gttactgctg
aaagagactt
tgttgatagt
gttttcagga
cctttgtttt
tgcttcactc
caaatacttt
cagtctctta
ttggagcttc
catctgcttt
tattattttt
ttggctcact
gtagctgaga
atggggtttc
gccttggcct
tatttcattc
ggttgttctt
cctctgcata
ggagcttttc
caattatcga
ctaaacatgg
attccattgc
ttttgttcct
aatgttgcca
tttattagtg
catagcttca
ggctaggcta
cctgtctcag
tattcacagt
gccctagctc
ccatggcaac
attgaaattg
atgttcctac
tcactaaaat
ggcatactta
aagttttaat
taggaccaaa
atcaacattt
ctgtaagagg
aaatcatctg
tatggaaatt
ttgtttttgt
tcattttcgg
tcccgagtag
agtagagatg
cacctgtctt
atgtcttcat
gtgtgatcat
ctcccatgta
ttttagagac
atcctcccac
caaaactgtc
cttaggaaat
tagcttttct
agcattttgt
gttagccaat
ttattaattt
gggtacatgt
ctgcacccat
cccccgaccc
tttattagtt
gaaggtgttt
cgtggttaaa
agaatgtttt
tccctttatt
tacggatata
ttccttttgt
ctttccatgt
ctcatgctgt
tttcatttct
tcatttagac
tatttgttta
gagtgtttat
tgagacagaa
gcaacctcca
ttacaggcac
accacgttgg
cccaaggtgc
atcttattct
cttgttgttc
ttgtcagtac
tgtgtaccga
atatttctta
ggctgtggtc
ctctgatctt
ttgttttaca
tttattttaa
attttggggt
atgaacagat
gtttttataa
gaggccatct
actcccctgg
actagagggc
ctttgcccat
ccatgtgttg
aagaaaactt
gatagtaggc
atatataaat
aatgtaaatg
tcgttttcaa
gggtgatgag
tgaaatttaa
gtcctgttgc
gtctgtttta
tttttcgaga
ctcactgcaa
ctgggactac
cggtttcact
ggcttcccaa
tttttagtag
agctcactgc
gctgggacta
agggtcttgc
ctcggcctcc
tgtttcagac
tatcccctat
ttcctctgtt
tgtcatcagg
tggtttgctc
ttgtttaatt
gcataacatg
taacttgtca
catgacaggc
tctttctttg
gtctcacatt
atgttaacca
ttttccctcg
gttcaagtca
ttttcctagt
attctaatta
atttccctct
cccctcactc
ttttcatcat
atcatttctg
aatttctttt
tttctgttta
cctcgctctg
ccttctgggt
gcaccaccac
ccaggccagt
tgggattcca
gtaatgtttt
acatgaaatg
gaggggtccc
ccgtcaggtt
cccactggcc
tggaaagggt
tctgcagttt
ttaacctgca
ggttcacctt
tttggaaatc
ttcaggatga
gcactaggtt
tgggagaaag
acgttgcccg
catgaatggc
gcattgaaag
acttcttaag
ttgttttttt
attctgctag
tatatactca
ttagaagttg
aatgctgtaa
ctatttacta
aatgaaaatc
gtttttgtgg
tttttatttt
tggagtctca
cctctgtccc
aagcgtgtgc
gtgttggcca
agtgctggga
agacaagatc
aacctccagc
caggtgtgtg
tatgttgccc
caaagtgctg
ttgcttggtc
ttattttgtt
tgattttctc
ttggctagca
attttgttga
tttttccttt
caggtttgtt
tttacattag
cccggttntg
ctttatttgg
ttcatttctt
caaggataat
aagtggcttg
gcagctctat
ttcatcatgt
taccaggatc
gtttttatgt
ctctgtcccc
ttcctgaaca
tgttttctta
ggtcatgttg
tacgtttatg
tcacccaggc
tcaagcaatt
acccggctaa
ctcagactcc
ggcgtgagcc
tacaagggct
ggagtttttc
tccactgttg
ctgagctctg
ccagtgtccc
ttttgttggg
cttggggaca
acttgcagcc
ctgagatatc
tactggttta
ttccaaaatt
tagataangc
ttggtcttgg
gccctagctc
cctgtcactt
atctgaatat
ggttccattt
aagtcattaa
ttgtcacagt
ttccaagtga
aatcaatagt
attagccatt
caaccaaaaa
aaataaggtt
- 104 -
008252
ttctggtttt ttgcactgtt attctatgtt tatcctgaac tattgttaga agccacagtt acagctcaaa aataagactt attttattag aaatttgtac
tcaactctac
tttttcatac
ctttagtccc
taagcttgta
tcttcaggtt
atgaaatgtt
agttattgag
tgatgtacac
ttttttttga
aatctcggct
ccgagtagct
tagagacggg
cccgcctcgg
tgttattttt
tatagaagca
cctagccaat
tgttatccaa
attttttcaa
gacctagtaa
atatgaaaat
aaacccaagt
tacaatgagc
gtcctcagag
attttcaaca
cacttctctt
tttctccaaa
gcaaaataaa
tggatgtttt
aatacattaa
aaaaatggca
tactttgact
tccagaattg
gataaaatgg
ggggaaaggt
acaatgctgg
actatacctt
tcattatggt
aaatagcaaa
aaagggcttt
accaaaactg
tgccttgaag
agggatctca
atgccgagct
ggagtttgtg
tctgactttg
atctgatttg
gagaaactga
aatgcatttg
gcccatcaat
ggaagcattt
tctgtgttgt
gttgtctatt cattcagaaa
aacattatct
taaatgctag
caagctttaa
gggtaataat
ttattatttt
gagtatattg
tattttagca
ctttgcattt
atattgtagg
cclllcaggg
cataattttt
tttttctacc
ttncacccag
ttttttcata
acacttttca
taatattcac
tgagcagtac
atatgccagt
gacggagtct
cactgcaagc
gggactacag
gtttcacctt
cctcccaaag
taaagagtct
aaccaatgta
tttggcaatg
tgatacctag
aacaaacgtg
tttgccaaat
gtttaagata
acagtttcca
tcatctctgt
aaaacctggt
tccaatatat
tcactaattt
tatcactgca
aagcatttaa
atatgtgccc
agtaccatcc
tcacttcaca
gtaagatgta
tgcaactgtg
gcctgggttg
aagacagagg
tacaagattg
tggcagaatc
ggttcttcta
tattagtata
aatagtggtc
tctgcttggg
gatgagtaag
cggagaaaga
caaagtagtc
aaactagacc
ttctgtggtc
tgtttgaata
agcagaaagt
ttttaagtgt
tcccactcct
tcactcacca
tgcagagcac
tcacatctgg
taattggatc tgaagtagtc ctaacgtttt atgtatcaac tatatcagta tatactacag ggcttgatat aaatgtcctt ttgtatttgt tgtttaagtt
aaatacaact agctcaactt agttaaatat tcactaaatt agtactgtca acttcttcaa tattttctta tgtcacatta aaatttgttt acatcataat
gtaatgcaat catagctcag agttaaatat tttaccatca ttttcatgat acatgcatgt tattcaaaac aatgtatgtt tgcttttata aaaaacacac
aaaacttttg
ttaatacatt
aataatttgc
cataaatagg
tagtaagttt
tgatttccaa
ctgttagcca
gatttgcgaa
cgctctgtcg
tccgcttccc
gcgcccgcca
gttagccagg
tgctgggatt
tttccatgca
ttttttgccc
ttatggtgta
tttataaaat
tcaaagctgt
atattaaaat
tttaagatat
agttttcctt
ccttggagaa
tcactctgtg
ttctgaaaac
atatgggaaa
ttaccatcta
aacatccctt
aacaataaca
accatatttt
gattcacggg
agattttaat
ttggagcagg
gtaaactcaa
aagatatcaa
ggcccaaaag
cactggcaac
ggttcatagt
atgagaatct
tgtaaaagct
gatatcagag
tgtggtctgt
aaaggaatat
agaagtggca
tggctgcatc
agtaaagatg
gttcactctg
ccttccagca
tttccatctt
caacagcttt
aatccctaga
ttcatgcatt
caatagatac
ttaagcactt
tgccaatagc
aaatatgtgc
aacgttatga
tcacattgtt
ctaaaatatt
tgtgttctgg
atgctaacct
cccaggccgg
gggttcacgc
ccgcgcccgg
atggtctcga
acaggcgtga
taaaactatg
agctgtcatg
cctaagagtc
tatgcacgac
ggcttcctag
atgtataaat
aaatgtaata
tagtcatcca
gggaaacaga
ggacagactt
atggtggata
actaataatg
atacctatac
acccaattat
ggaagtttct
attgaattgt
tctctaagaa
tgaagcatca
gtagggtgtg
tttttggatc
tgcactagta
gtgaacaaca
tttaatgtct
gattctgggg
acatagagag
atgggggagg
aagtcttgaa
ggcaggggtg
gaggcacaaa
gatgggctgt
atggagggcc
catggaggat
gaagttacat
agaaatgtct
ttataatatt
cttctaattg
ggtgaaaaga
gcagactgtg
aagtaaaagt
gtctgctgaa
actgcagtta
tgcattttct
atatacatgt
tggaacagag
tctaaggaat
gtggaaaagt
gntanttttt
actgcggact
cattctcctg
ctaatttttt
tctcctgacc
gccaccgcgc
ttagtccata
cacagttctt
atacctaatc
aaaccaaacc
cattgcctac
ataaatataa
taagaatgag
gcaaccattt
caaaaccaag
agcacataca
gcatattttc
tattagggga
aagtcaacct
ttgcactaat
gttattaagt
tgatatcatc
ataataaagg
attagaagat
ttttagaatt
ttttgaaagg
ttaaatagtt
gagatacacc
ccattggcac
caaacatttt
ggaccttctt
caggcataaa
gaaagaggaa
atggaagtaa
ggagtggaac
gcacaggagg
cagcaggctc
tttcatctga
gctggatgca
ttaacaattt
cccaaagctt
cctccctaat
aactatttgg
agttctttag
agcatgcatc tttagtaata taaaactggt gaaatctgtt tggcctctat attaaatcta cataacagat ttaaactttt cctaatttat cttacatgag tgtcacatcg
waugCwtuCt
aacctcatca
tctctcaatt
cactaacatt
tctattttaa
ttgtgcaaat
agtcaaattt
gtgtgtgagt
tttttttttt
gcagtggcgc
cctcagcctc
gtatttttag
tcatgatcca
ctggccaacc
agaaaatatt
taaaattata
gttaaagtag
cagaaacttt
taagtttatt
aatatgtaag
ttatattctt
attgaacact
cagagctcct
ggcactcttc
agaaaatagg
gctcgactga
gcatatttct
caaaccacag
aaatttaaaa
aattgtaaaa
cttctaatta
gcatgctgaa
ggtgaaatat
ctaactttca
aagtaggtaa
tgcattgcac
acgtgcaaag
ttgcagatat
tttttttatg
aaagaaaaac
cgtgaaacaa
gatagaagta
agcaaggtac
cagctggaga
tgcaaggagt
gagtggtaca
cagctgggga
ttgttggagg
gaaggtgctt
tcctcttgct
atgatacatg
accattctca
ctttaagcac
- 105 -
008252
tgttgaagta acaataaatc tatccctata tttcttacct tacagctctt aagcactctc atttaaggtg gcatatttta aaggatctgg tctgacgata gtgtcagatt tagcaattat tttacaatca ttnagttctg tctcatctgt gcatataaat ctgacatctt agacatggtt tactgggtgc catcttcaga tgtaactcca gatccaataa ggcatattct ttgttgcatg ggaaaggttg gaacattaaa gtatcttggg aacatgagcc tgggaaaata gcttgttggt tccaaacaaa
atatataatg ctgttctcat aatgtgtttc tatcgttgat gaagcactcc tgccctccat ttaaaatatc gaattgggtt ccatgcttat atttgataaa tcaaggtctg tgataatgat tggtnaatgt cnttatgcaa gatctttcat aatttcagtg gctgtataca catgtaccta tgcaaacaca atacactcaa gagaatacgt gttggagaga gcgagtaaca acgcctgagt gcacagactt aagccaaaga tcataactct aaaaagtaat aaaagaggtc gacacaggaa acaattaaat
atgctaagac gaaactgtac ctttttctgc tggcagtctt tctcctcagc ttcttgttga ttgagtacca gcaaatatta aaatggaatc tgtgccagat cattctactt taatatgata ataaaatatg actatgctaa ggttacaaag aatagatgga ttgtatatta tctcatcatt accnttaaat acatttacca tcagagaaga ccaaatataa caagatgcac taaggtgatc ggcagaattt ttttttacaa gcttataaaa acatgaaact aattctgatt tgccactata tacttcctat
atagtgacag cagtgcatat ttgttaaata caagtgttta caccaaagtc tggaacaaac ctgggcattc taacttgagc aaagcaactt acaaaacata atttaaaagt gtaattttaa taaaccgtaa tccaggaagt gagccagaaa tggatggatg actgacatct catttaatat tatccgactt tgagagatag tttaagtagg attcatgaaa attatttata agaggaggct ttcgggaaga atggaaaaat gatgtttatg tatgcccaga gaccactgca tgtttctgaa ggaaaagaaa agg ucgu ucg aaaatgattt acaacattaa atagcttttc actggagaag atttttaaaa .agcatgtctc acacaaaggg taatggtgaa agcaattaaa gaaataaaat ccgtgtactc cccaatttta ttctttgcct gatacttttc gtccatttga tgaatatttt tttgttcacc gctgagggaa tttaaataat agtcaatttt
ni- rrt- rrraaf л
--~J w~~ -w ¦--
acacaactat cgttatttgt agcatcggta tgataatcac agtttgcttt gattaccttg ctaaactccc ttttgcttta ggttgttggt gcattatata atgggccctg cattttgtca cttgcatgat ccgttataaa ctgatttttg aaattaaaac atatgtgtta ctcaatacag tgactactat atccaagatt attataaact ttcctaccag nctgtatttg atccataagt ggaataattt cattcattaa tgctgtatac ctgctatatg aaagtctcag acttcttttt aaactcaaac taaccaatat tacatgagct gtagtcagat tggacagcat gctgagggtt aatattgaat ggattatttc taccatctag aagtccaagg gttttctaca
gaaacttggg
ctgcaaaata
atgttgttac
aattgacata
cgcatagctc
attttttcat
gcttctggtt
tagaatttta
ggctagggct
gtattgcaaa
tattgtgcct
ttcaattgta
catggcatgt
catctcataa
ctttttagaa
gaaatattaa
actgtatcta
tcacccactg
ggtgnttact
ttttttctaa
ttcaccatca
ggattacaaa
gagttgtcag
cactctggaa
gaaaaacaat
gctggccttt
gactcttgga
catacttcac
catgtgctga
cagaagacat
ttacatggta
^aa " u u u uy \~ uacay vvay u u LLtauaouLij
ttctaatttc tgatcaccac tggtgcttct
atagtttgaa atgtagtgtg ggccagtttt gaaacaaaaa ttcagtcaca tctgttattg
caatttttaa atttaaattt atttttgcca
tgtccaactt aaaaaaaaaa ttgaaaagct
tccaaaaaca tatcagaata cattgtgaaa
gccattcact tgcccgcccc cctccccata
atttgttaac attgtaaatg tacctcattg
gagtttaatt catttctaaa gcaaattatg
gctacatata acattgttaa tgacaaaaat
gtacaatata aattcatcct atttgggtgc
ttcctgccta atatgtactc attcattgct
cccataaaat ttcagttttc gtttttggaa
tctgcctagt tcttaaaata aagatgaagt
aagtaaaaaa catttgttca tttaataaaa
cttcatgaca cttgtcaaca tataacataa
tgtaaattgc ttaaagacag aagcgtttgt
acactgccta ggttaaaggg atgcttatga
gagagggagg aaggaatgaa gggcacaanc
tgggtattaa tcaaatttag gctcagaaaa
дт-т-1-дгтлИ-д +¦ да(*+ a a t-+- f- arar't-htraa
tatagttaaa aaagttgaag tgcgtttatg tctcttcctt tccttcttgt tcccaaaccc ccgttcattt ctttcccacc acatctgttt tgtgtgtgtg
gatcctctgt atgactataa tgtagcacat gggtataaat cacccagagc aggagtcacc gggaattaac atgtttatag ttctacaaga tgtgtgtgtg
gagatcttta aaaatcctta aaacaccagt cttcatatga caagcttcag aagtttggtt attggtttct ctttaagtta ctgttctttt tgttagctag
aaaataattc
tttccttagc
attctgaatt
tgattttgtt
atttaacatg
tcctccacct
aagtatcact
ctctcattca
aagagggtaa
agtaatactg
aacgatctat
acatagttct
ttttaaaaac
tttttttttc
aaatatacac
atattttatt
ctcgtatccc
agaaggaagt
tcatcttcta
atatgggcta
tacnaggcaa
taaaaaatgc
tatatatgta
gcatcctaag
acaatttaat
catatctctt
cccctgaaaa
catagaatta
tatactagct
ggtggtgatg
tcctctaatg
attattttat aaagaaatca ggtgaggccc aaagctaaaa taagcattgg ttggctcctg gtttatcctc atgttccacc ttgtagtgct ttttgaaaaa aattactctt ctgctgagtc aagtgacaac cctaacacac ttttattttt tcattcagaa tagttcttga aagggaggga ttanccttct tgttatctgt
rrt* at- nrat- rrr-h
~D---~D--~3--
nactataaaa acctttgtga atgcagcttt aaggccattg ttgtgagtct cattatttgt atcttaccat ggatgtgttc gtggtgtgtg taaaacaggc
- 106 -
008252
acttacccag taagtgtttt aaggagatat acatgtttta aggtttaatc gattacagaa agtttctaat attcccatgt ggtacatctt ttttccttgc tttttattac tgagagatgt gaaaaaatgt tgtagatgtc gtcaaggtgt agaacttgct gggtcttttt cacgtgccat atgctatccc tgtgtccata ttttctgttc tcaagaaaca acattttctt ttgtgaatag aatcctttgg gatccttgag aacagtgtaa ttttaatgat ttctctaatg tgaatgcctt tgttgaccac
aaaaatagtg ttttataaat aaagtctgtt attttcctcc ttatttttag ggtcttttgc gcaggtattc canaaatata tattttaaca tttaattgat caaggtgtaa gttagaaaag ctcaatcaga tatattccct attgaactta aaatactata agacttacag gacatgattt tgttttgatt aattgtacaa
tgttcattaa
atcatagtgt
ttggatactt
tcatttgatt
agaggaggta
ttcatgattt
ttttaacctc
tattaaagca
tatctttctt
aaattaagac
actgtggtcc
tttatgtctg
atatatatat
tatcaggtgc
tgaaatctcc
ttataaattt
ttattattat
ggtggtttgc
tctcctagcc
tgttctcatt
ctgtgttagt
tgaactcatc
taaccagttt
tgctgcaata
gtatatatcc
gaatcgccac
aagtgttcct
caccattaaa
accagtgatg
gttagttttc
agtgcactct
acaatggctt
atattttccc
tatttttctt
ctattatgat
acagattgtt
ggggatagtt
ctttgggttt
tccaaaatgg
tatcaaatgt
gatgtgatta
acgtaatact
tgatcaaatc
tcaatagctg
aacgaaaatc
gaaatgaagg
aaaatttaaa
ttgcaaatat
gacagatttg
tgccttttaa
tggttgtggt
taaattattg
catcatagtg aatttaattt acattaatgt ttattttgcc actttatttt catacttact agacaggnaa agatagctat tggctaaatt ctataagcaa
wt-wUdwU-acv
tttgttgata catcactcat gttcttttcc tgttagtaaa ctagatattc atatattcta atgaataaga agcttcaaaa cagagtagag tgctaaggga gttgagttta tagttttgca atttgttact tgaaatcttg atgatatatg aatgggatag atgaagtttt ttctaatgtc ttacatatgc aagtttcttc aagagaatgg attaagtgtt atgtgtatat atttgatctt caatattatg gggtgttcct aaaaaatttg tgcaccatca ccccacctct gttcgactcc ttggctgaga cttttttatg atcattgatg aacatacgtg agtaatggga actgtctttc agttctctac ctggcgtgag atgagctttt ctactaacgg tggttcttgt
u -у у - к.V.U u -
tttgcatgaa ataagtaatg acaaaaattg ctttaaaata cctatgtgaa ctttggtgct gnaattattt ngattgtgta gtctgtttac tgtatgtatt tgcataatta taatatctta aatactatag aaacaatgtg gtctagtctc taaatgcttt attggaaaat ttcaactaaa aagaatgcct ttaactgtag
333 v_ u С 3 Cf S 3
agctttcctt atattttttt atttaataac tagtgcaatt aaaagcctcc agttggcact ttaatgttgt tatactcaaa gtgcacctac aaatccaacc tacttcattt
tacaccataa
aaaggtagag
acattttatt
tgactgaatt
tcctaaaaaa
ctgttttatt
agaatagata
aatcccaatt
ttcacttttt
ttgttttgat
gatgttagaa
atacatccac
tgggggtttt
cagaactgta
gtgtaaagtg
cagaatgtgc
acctgtcatc
tgacaggccc
cacttatgag
gtgatggttt
gctgcatagt
ggcatttgga
tgcatgtgtc
ttgctaggtc
acaatggttg
atcctctcca
atggtatctc
tttcttcttc
tgctaaacct
aggcagggag
aagt.gut.aga
ttaaatattt
ctacttaaaa
tagatagctt
tttgctttgc
agatcgctgg
acaggtaatt
tgcattaaaa
attgcctaca
tctgacatat
tatgggggac
gcaattttat
attattgtca
aaaattatta
gagcaatatt
cccatatttg
attataagtg
aagtagaatt
gttactatat
aacatgaaat
gtacaatgtt
tcatattttt aatcagcttt tattatgtga cttttttaat actaaagaac tcttgtaact tcttattagt agaaagtgga ttatgctgct tcatttaccc ttgggtcaaa
actatttcca
gcttatgtca
tctattttca
cagaattgac
gcaaaggctt
attccaaagg
ccctattaaa
aaaattaaag
tttgttagtc
ttcagttatt
tatgtgctat
atatatacag
tgccttaatg
agtctctttg
catatatagt
agttttgtta
tacgttaggt
gtgtgtgatg
tgagaacatg
ccagcttcat
attccatagt
ttgattccaa
cttgtactag
aaatggtatt
aactaattta
gcatctgttg
attgtggttt
actttttaat
agcagtttta
ctggcttagg
atttgtgtgg
tacctgcaaa
tgctaaactt
ttattgaaat
ctaataatgc
tgtgtttttg
aaatattttt
ngtctaaata
acattttnat
ttgaaatttg
tgagtgatat
atcacctcaa
gttatgattg
gctgttaatc
tctgtatttg
gataggtatt
atggggaacg
aatttctgtg
tctattgatt
ctactgtttt
gtacaggtct
CaCayCCCat
ataaagttca gtcaggttga ttgacaaaca attttaaccc gttattaaca aaaaactgtc ttatgtattt ttttggtgga aacatctgta atcttttaat taacttccat
gaaacctctc
atatcctgca
tttccctagc
ttacatggat
ttctgtttaa
cattttttaa
aaatgaaagt
tcaatatgtg
ttgaattcta
ttgcattttc
gtgacaatga
tggaaagttc
atctaatact
aacatctcta
taggatagtt
cacaggtata
gtttctccta
ttcccctccc
cagtgtttgg
ccatgtccct
atattgggcc
gtctttgcta
aatgatttgt
tctggttcta
cactcccacc
tttcctgact
tgatttgcat
cagcttgaag
aagaccttcc
acctacatag
ctgagaaaaa
gttgcttgtc
attccttgtg
aatatttgac
catgtaaaat
atggatttat
taaattacaa
gaaantatta
tttnnatttt
aaaaattaat
ttgatgtata
acattttatt
tgaattattt
agatataaaa
taaataaaaa
agccaacata
tacattaaaa
cattcattca
tgatttgatc
aatgaatttt
ctagagttca
cctctcccac attgtttctc tttcaaatta tttctctatt agaaagacag ttaacgaacg gtttctgtta aaataatgta tgttccatga ttgtaggtgt
- 107 -
008252
ttgaaattgc
cactgattat
ttacaaatat
ttttttgtaa
atatggagtg
cagatgtttg
tatctattaa
gaataacctc
gcttcctcgg
atggagtctc
ctccgcatcc
ggcgtgcacc
aagacaggac
gtacatttag
tagagcttca
tcatttttat
aacatcattt
gtaagataga
tcttctactt
cagagtggga
tagagtttgg
cagggcagca
ataggaattt
tgattcaaat
gcagccattc
tatataagga
gaggatttct
ataagtgaat
tattttatga
gacatacttt
tgatatagtt gatccgagca tttaaagtga gttttatgta tttccatttt gaacatttac ctgcatttta tatgtcagat tattgttttt gctctgtcat cgggttcaag accatgcccg agattggaaa aaaccttagt ctgtggaagc tattatttac ctagactaaa atgtatgtac ggctgatcat tgttggcccc ggttccaagc gggattgggg gtctatttat cttagaaatt atcttcaaaa tcattgagtt ttttcataaa atctctgtga gtttgcataa ctagaggcat
gatcagatgt ttccggattt gcgctgcttt ctttacctac tctacttttc ttatcactgt atctagttga tttttaaaca gtccaatttt gaggctgggg cgtttctcct actaattttt atgtaacctg gtggcaaaat ttttcatatt ttttgtcatc cactattatc tttaattacc tgttaatata tggatggtcc acaacccaga ataatacaat aaatgaagaa agatttaaag tatttttaat taaaaacatt gtctatatac gtatagacat attatttagg caggaagagc
caccttgggg atttccgatt acaataagtt ttttgtttct tttctacttc gttgtaaatg ttaacaaaga gtgcttatgt tattttattt tgcagtggcg tcctcagcct gttttgtcca gtggaaaagt ggggagtgtg agaatgagtt attccctaaa tgttgcattt tattatgtat caactccagg agaagtgtcc angtgcaaca tgattttata ctcatccata cactttgtaa atatcaatat gaaagggtta ttgtatatat catgataagc ttactcctca aaatgaggga
ggcattcact gtatgccagc
agtaaccagc acatagtaaa
tagagataac atggttaaaa aaaaggaaag agcaataaag taagagtgtg aaaggaaaac atctatgagt aactcatggc gtaactaaat taattctgag tttatttcac atttataatg ctcacagaaa taaatttaat aattgaattt ctaattcatg tatgcaactc ctaataatta tataatgttc taaaaactaa tgttgcacca ccccaaagaa tgtcaactcc aaaaaggtag ttcagaccag gaggcatgtg caagtttcta ggaaaatatg aacatcagta taatttcact ggttaaatgt taaacagtaa gccttaatta attttatttt tatttagaag gcatgcatct ccagaggggg ctgtgcacag tggctcacac ctgtaatctc agggtagata acctgaggtc aggagttcca gaccagcctg tctctactaa aaatatgaaa attagccggg catggtggca aggcacctgt gatcgggagg ctgagacaag agaattgctt gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc cagcctggac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa angaaagaaa tttaccttag ataccatgcc ttccttgatt atccatagta ttatgttgaa tgttttttaa tataactttt atttttgcat gatgtgagtg ttttaaaaga aaaatactgt tgctactaac cccactccta aaatagcctt ggaaaataac tttttgataa ccattttctg tattattgaa attatgtctc tactttaacc actttattga tctttacata tttattatat atgtcttgag ggaactattt atccagagag taagttattg catttattat tctacttcct aattaacttg tatatttctt atgaggtact tcctgaaaat tttgtgtatt tcttatgagg tacgggtcaa gatgtagtct acatcggtat cttaggagaa gctctcagta tttccgttaa ttttcaaagt gaggaagtta cctttaattc ctatagtgcc gtatgctaaa ttttgtccag tgcttttccg ttttgttcag attgactttt taaatagaaa ccaatcttgc atttctggta tgtattcctc tttatacatt ggaagatttg atttgctaat catctttgtt cacaaggagc attattttta ggttttttaa tcttgaaatc cgggtaatgc tgtcctcata aaacaagtgg
catgttgcgg tgaactgcca aagaggaaaa ctaggcgatc tttatggaat acacaaagcc tatctctgta cctctttgtt tattttattt cgatctcggt gccaagtagc atttttaaag agattaagca ctaacataat acatgttcgg atagtttcct gactgttgta tatgcaatag gatgtgatgg cattaggtgt gatatgacta ccttatattc aattaccgat aattcaaaaa ctacttacaa tgttgtgttt acaaagtaaa ttggctcaat atgaagtaga atgaatgtaa tgtcattatt
aagaccaaaa
tatgttattt
gtncatttaa
cacaaacagt
aagtgaattt
agattttgtt
aatgtattca
agcataatct
catacctact
agcactttag
accaatacgg
caggcacctg
gaatccagaa
cacagagcaa
gttcacagaa
gtaaagatct
aataatctat
atcttcatta
gacatattat
gattttggtg
cctttttctg
gaaaattatg
aatgatcctc
taacttagtg
gtgggatgtg
aagagttttt
ttaatgtaat
tattgctaat
gtttttgtta
attgaaatat
aacatgtttc
attccacggc
41400
aggaccagaa
41460
gtttatgaag
41520
gggagaacaa
41580
tttaggagtt
41640
agggtaagtt
41700
attttcataa
41760
ctgtgtctct
41820
tatttttgag
41880
tcactgcaac
41940
tgggactaca
42000
acaagtattc
42060
aatgcaaagt
42120
aacataaacc
42180
gaaaaaaagc
42240
aaatgattat
42300
gggttggtgg
42360
agcacctgcc
42420
caggagagag
42480
tagctagata
42540
tgccagattt
42600
aaatcttcac
42660
tgaaaaatct
42720
gagattacaa
42780
accaattggg
42840
tctgcagttg
42900
taaaccacaa
42960
tccaacactt
43020
ttaataacag
43080
agacaagcaa
43140
ttgttgtcat
43200
^ /-> a a a a
43260
tttaaacttg
43320
tactgacaaa
43380
ttattagtct
43440
atatgtatat
43500
agttgtttgc
43560
tccacgtgtt
43620
gtaacttcaa
43680
attagtcaag
43740
tagaaattta
43800
gaggctgagg
43860
tgaaaccccc
43920
taatgccagg
43980
ggcggaggtt
44040
gactccgtct
44100
gtgtggacag
44160
cattttttct
44220
tcaaaattat
44280
ttattgttca
44340
tattttcccc
44400
aatataaaaa
44460
tcagaattaa
44520
atccttctca
44580
ctcaaattaa
44640
gttggaatgg
44700
agctgtagag
44760
gatcattgat
44820
gaattacatg
44880
ttggtcatat
4 4 940
caaattattg
45000
ctttaccggg
45060
caagggttaa
45120
- 108 -
008252
tataagattc gcctgaaatt agctatggag cttacctatt tcttttgaat tcctgacatt ttcttttcac ttttcatgtt ctttttcatc taatttaaaa
atattctttc ttctttgtga ttgttatctt tttataattt gtctgattat gataatttgt acacacacaa gattttttat tttcataaaa atataatttt
tttcttaaat
gaacgttttt
tcttgttctg
gtcaatattg
ctttttaaca
acctttctct
gaatctttgc
cttcattatt
tgaaggtata
cctctaagca
tgttgtatuu
acctgtaggt
gggtgcataa
gaaattcatt
gagaatttga
accaaagtca
atcagggttg
attttcaatc
gcgcataacg
aatttttttc
ttcaaatttt
atttaatcat
tttagaccat
catgggctgc
gcgtaaatga
atcagcaact
gaagtgaatc
caacattaac
tacaaatatc
tttaaaaaaa
ctcagcactt
gtgagctatg
agaagtaaaa
ccactccagg
gaatgcccac
aacagataga
ataatgaact
aataaagcca
aaatgcaaac
gtggtgggaa
ttcattatct
tatgtgcagt
gaagtagaaa
ctattaccca
gtctgttcct
atcacactct
gctttcagct
aggcattagc
tactgctttc
atgcggagtt
ccatcttgcc
gtccttgagg
ccttactacc
gttgagaaca
atgaaataaa
aaaaaataga
aagaaaattg
atgcatggaa
aatatgccta
gagacaatca
agtactgcag
atgtgagagt
aaagctcata
gtttgataga cattacaaat ttaagttggt cataatgttt tctgtagaat ccattttttt cctatttaat tccttatttc tagacatctt ctgttttagc
attcatgagt taaatgtatt aaattttgct atacaaatgc agtggtaata atgtcttctc gttctctatt tgctttttag ttaacatttt ctctaagcac
aaaactcagg caacttacag tttcaaagag cctctgatta agccattttt aattgtatta gttagtctgt tttttgtttt tctaatacaa tgttttagct
tatatgtgat
attttctaaa
ctgtgaaatt
tgaattggtg
gtataatatc
tatccttctt
attttctaga
taattttcaa
ttttatcgtc
atgggtcaag
actctaaaat
ccacaattac
acaaattctt
aattaagccc
ccaactggtc
tgtatgtttt
ctgcatcagt
tttgggggaa
caaaacacag
cagtggcaca
cccaggagtt
agagtgagac
cctgccacat
ccatagaaag
tgacaaccca
atactgttta
caaaataatt
catttacata
gttgcctagt
ctttggggtt
tatcaaactg
tgcttaaaat
cctgcactat
aattccctgt
tggactacct
cacatggggt
tcacatgggc
tccttctgtt
gttttgtatt
ggagttgaat
tttttctatt
tgttatattc
aactatttat
atgacaaatt
gcaggaaagg
aattagttca
gtgggtgagg
ttagtgtatg
aaaagatatt
ggataagaaa
tttattaaaa
aggcattatg
ecu. у u uya ua
ttctcctttg
aatgttattt
teagectttt
aaaattccat
tataaatgtc
ggtttttaaa
catgacagaa
ctttaattag
atgaattttg
aacatgacgt
aatttatttt
ttacgtgtac
agttttagag
agtactaaga
agatgetcta
ttaaataggt
gcgtggcata
tagaggatgg
tttggcagtt
cacctgtaat
tgagactaga
ccagtctcta
ctcatttatt
atttacacat
aatttccatc
ataataataa
atgatgactg
aaattctaga
gataaaggtt
tattgacatg
tacactttcg
gtctcagtgt
ttattgtgtg
ctatacgtgg
etttgecaat
catatttcca
attaaaaccc
cctactcatt
gtgagcctaa
ttggtgtagt
tttgtctaag
atctttttat
tgaaggcatg
gataaagaag
agaaatggct
tataeggagt
gaagagacaa
taggctgtag
gtgtgggttg
gcagctgtgt
ccaagtcaga
ctggcaaacg
LLdLLdLLdL u i-'ctct u - .add uai.i_i_L.wUaa
tatttagaag
ttttattctg
aggaatcatt
aaagaaaaaa
agttggctga
ttctagcaat
tctcttattt
tgtcattgta
ctaattagct
tcagtaatca
cttttatctt
tcctggattg
acaatcctga
agaagaaact
ctcattccac
aagtggtgcc
aatgagaagc
acaactttac
taaaaataaa
tgggagactg
attgegtcac
atgaaagaaa
tatttaacca
agcaacttta
taaactaatg
attgatgtat
gatttaaaaa
ttatctttaa
ttaagggatt
tgactgtgct
ttatgttatg
tctaattttt
ctgagtttag
gtggggctct
gaaagtcttt
ttacatgggc
tcccattcat
cttcttatgt
tttaatgeta
acaaccagga
acaegtatga
tagtatccta
tattctattt
aaagaaacag
aaaacaaagt
aagcaagtgg
gaaaatctgt
gattgttcta
atatggagat
tgggtacaga
tataaaactt
ttggcacata
tgcattttta
ttgtggtcag
ttaaggacca
gtgaaatctg
taatttgttc
tgctgagaga
ttgtcagttt
tctttcagat
tegggatgee
taactctaaa
attaatcaat
acagtaaaag
gcccagcctg
cagtagtaag
tgtcaaaacc
taccaaattt
aactaactcc
agcaaatatt
agagttgatc
aggtgggatg
tgcactccag
gaaaaaaagt
aaataaataa
ttcatagtac
atggtatatc
acagcatctt
gaggacatgt
tgatagaaaa
acaaaggggc
tctgtacatg
tcagttacac
catatggtta
tttcacctgt
gttgtgcttc
cagattacaa
tcaagacctg
aacactatgt
tttgacattt
tctatttgtt
ctcacatcca
gaaaggtaaa
acacagaata
agacagataa
agaaaagtaa
ttaagcagaa
tgagtaaggg
aggtagttgg
tgagtgaata
gaagaacagg
ggctggcttc
gtaaatgcag
aatgatcgea
gaaggatgag
acaatagtcc
gtatatggtc
cagtttttga
tgggtatttc
gtactattca
ttgetttcta
gggctgacct
agggtatatg
gtaatgtgta
tgatttgttc
ggagcacatg
gtggtgatga
agagtgtgga
ttggagattt
attttgtcct
tataagctat
acaactcctt
aagctgggta
atcacttgag
cctgggtgat
tggacaggca
aaatgtatgt
tccaaactgg
catataataa
ggataaatct
tctattattc
gaaatcagca
ctcaagaaac
tgecaaaact
ccactgaaac
agcaattgtg
ctcattcact
actggtctat
tctggcttta
gtcttccgcc
caactcatgt
tggaatgcag
tgtagtggaa
tagctatttt'
gaggatattg
aataattagt
tattaacatg
gttgctaaaa
agaagcagtg
agttgactgt
atttattttt
tgaaaatgga
gaaatcttct
aaattaccgt
ctagaagatc
gaaattgaga
- 109 -
008252
acagatacac gaatgtcttc tgaactcatg accctagagt tgcttcagta agtattcttt gctagttcca cgctgtattt ggtaccaaga aaagaatgat actgaaaaaa tgcatgaaaa catgccttgt gatctaaata ttagctccag ctcattactt tattctaaaa atgaagttca ccatgaaaaa tttcataaat gttgacagaa tgcttagtta cctgagacat agccattatg gtgaaatggc tgcatttttc tctttcccat atgtgtaaaa cctgcctagt agcatacaca cacacacaca cacacacaca cacacacatt tattttgtct tctttttatg tgactctttg tttactattt aagaagaaaa tgcttaacta gccacatggt agtaatgttg ctcataatca caactgttat agctttgata attcatttca agaatctatc aataatatct tttttgttgt tgtttttttg agacagactc tcactctgac acccaggctg gagtgcagtg gcatgatctc agcttactga aacatccatc tcccaggttc aagagattct cctgcttcag ccccccaagt agctgggact acaggcgtgt gccaccacac ccgggtaatt tttgtatttt tagcagagac agggcttcat catgttggcc aggctggtct cgaactcctg acctcaagag atctgcctgc ctcagcctcc caaagtgctg ggattaaagg cctgagccac catgtccagc cttattttta aaaaaaaatt tcagttcaat attactgcat tttaaagccc cacacataag cagaaaaact gtcagcacca ttttaccgtt actattagcc cagacataaa tgtagtttta ctcttagaga ctcaagaaat atccaaactc aaaataaaac agaaaatgtt aattgatttg aaaattttta aacttttctg tttccttttg tagcctctaa actatgactt tttttgctgc tataaagaca catgcacacg tatgtttatt gcagcactat tcacaatagc aaagacttgg aaccaaccca aatgtccaac aatgatagac tggattaaga aaatgtggca catatacacc atggaatact atgcagccat aaaaaatgat gagttcatgt ccttggtagg gacgtggatg aaattggaaa tcatcattct cagtaaacta tcgcaagaac aaaaaaccaa acaccgcata ttctcactca taggtgggaa ttgaacaatg agaacacatg gatacaggaa ggagaacatc acactctggg gactgttgtg gggtgggggg aggggggagg gatagcttta ggagatatac ctaatgctaa atgatgagtt aatgggtaca gcacaccagc atggcacatg tatacatatg taactaacct gcacattgtg cacatgtacc ctaaaactta aagtataata ataataaaat aaaataaaat aaaataaaat aaatttcaaa aaagtcaaaa aaagaattcc ctgtgtaaga acattcaaag tgaaaggagc atcataggga aaagacaaac cgtgaaagca gagaaatagg agacgccaca tcaagacacc accatgctta caagttggca ttttattctg aagaccataa tgaactgcca aagaagctga aacctaaaat aaaattattg tttttacata taaagatgat ttttcacatc tatatttatg atctcacctt ttaaatcagt atctactttt gaaaatgtac atgtaacctt caacatatac acagaaaata agataaacta atttatatag ttttgtttca atcctacaca attagagttg atttttactc catatttaga tttccagaat cccagctcat taatttaata tttattaagc ataaaagctt taagacctag aatgcatggg acgtggaatt aagcactagg gataaaagag gaagaaaaaa ataggtcatg tcctggagga gctcacactt gaggcagcca aagattaatt accttaggca ttgattagta ataataataa taattagtta gaaagtgtta tcagatgtca aaaaagagag aaaatgtgag ttttatagtc tttgtaaaga atatgacctt tgagcaaact ctagaattag gaatggagtg tttgaattgg aaattaaggc aggataatac ctttcagatg aaacaatgta atagagtact.aggatgtata atagaatgct ggccccaaac tgggatggta gatttaagtt gtgagtttct ttctacaact gcagagtcca ttgaataaat acaactttat atattaaaat taaaaaaata aaaaaaaata aaaaaagaaa ttctgtcatt tggaataaca ggaatgaatc tagaggacat tatgctaagt gaaataagcc aggcacagaa agatcaatac tgcatgatct cacgcatatg tggaatccta accagttaat tcattgaagt agagaggaca atggtggtta tcaggggctg cggcgagaag gagatggagc tgcaagggaa tgaggagctg ctgatcaaag ggtacaaagt ttcagctagg cagtaagagt aagttttgag atccatgcac aacagggtga caatggtcaa taataatgcg ttatatatgt caacataact aagaaagtaa atttcaaatg tatcatcaca aaaaagttaa gtgatatgat ggatatatta attggcccga tgtaaccatt atgtcttgta tacatacatc aaaacatcac atggtgctgc attaaagtaa tacaattatg atttgtcaat taaaatacta ttatttaaaa aatgtattat acacatctcc gagtcacata ttaagctaag gtatgatggc tgtgttttca gcaatcagtg ttaccagcta ctgccgtgac ctcatttctc ttaatcattt aagagaaacg attaagagaa gttgttaaca attgttccaa gttctgccta attgatttgc atgtattata gcctaatcat gacagagatt tcagaccaga aacttgcata tcttgggttt catagttgac ctccagaact gattgtgttt aatatgtgag gcaaacaaga taaagaagca acacaatata tacagttttg cttttaaatg gaacttagtt cctgtaaggc ccaatagcag gaaatcttag ttatgtcttc agtagcagta ctagtaaagc tttagattct tctctgttaa tgaatggaga cctaaggcaa ttatgaaaag agtaatgaga tttgactaag caaagcagct catttcctaa agaaagttga ggagagcaat ggcttgtagc agaaacaggt gttgtgaaat accaactgtg atggcagaaa tctccccgaa gctggaacag gaatgtttaa aaatgagctg gcaggttaaa tagaaaagat gaagacttac ctgacacctt attatcattc ctgaaaaaga agggaaacat attcatagct cggtatcaaa taatgaaatc ttatttccaa gagtgagata attagaaaaa ctttaaggta agtaagtgta accattaaat atatgaaagt ttaatataga gagagcagga ttcaaacagg aactcaggaa catattcgcg atggctggac cactagcttt aagcccagag gttgggtgat cacacatcac agatgcccag gacaatcttg gcttatccct actgtttcaa agtaatcact
- 110 -
008252
aacagcctgt
tgcccagggg
agataatata
tttattaaaa
ctttagggta
gaggtttttt
caacatgaat
aataccgctt
aaggcaacaa
gaaaaactac
cgctcgcatg
aataaaagtt
ttttaatttc
ccccaaattc
atatgtttat
attgatgtaa
ttttcttaat
aattactgtt
atctgactgt
cttccccttc
ggcctaaata
aacataatga
atggctgaat
atttatccat
agtcaacatg
acccaatagt
actgtttttc
gtttctctac
gtgacatgat
catttttata
ttttgcccat
tatattctgg
gtgggctgtc
tgcaattcca
aaaaatttgc
atagattcag
gaggtaggag
gttgaagaga
taaaagcatg
tttaccagta
gtgtgatgcc
tgtgttttaa
ttttgataga
tattgattct
ttctttcatc
tattcctagg
atttttcaga
tgtatcctgc
ggattttcta
ccaatttgga
agtatgttga
aaggctttca
ctttattgtt
acatgttgaa
ttcctggttt
tcatttctgg
tcaagtctaa
tctacattca
ataatatatg
ccctatgtat
tgatatattn
ttgatctcca
tattaataaa
tattcgattt
aagtttatag
aagttggatt
taaatacatt
cttggcaaat
catggaatgc
gaagctggag
gttctcactt
cagacactgg
ctatcgggtg
acacgcagtt
aaaagaaaaa
taaggacttt
atgcaacggt
tgacacaata
ggcataataa
actgggaaca
tactatagtc
atttttgtac
tctggtaaca
tgagtgagat
cctccagttc
agtattaaca
tggtgggcag
tgagtgctgc
gaaattgctg
acagtggctg
attctcacca
atttcactgt
tacctacttg
ttcttaatca
ttattaatcc
acttcaattt
tttatctatt
ccagtccagt
ttcttagatt
cataatttta
ctgtcctttc
tatttatttc
ccatgctggt
tccagctttg
tataaatttt
gattgcattg
tccaattcat
agagtgttat
catttttaat
ttgttcactg
aatttactga
agtgtaagat
tgtcgtttat
ataaatctga
atttttccgc
ttgaggtata
ttttaccaaa
atttatgtaa
gaggttaaat
cttccaagcc
taaacctata
tagtataatt
atgnttatgt
atatattttt
agatgtgaac
gtaaatataa
taaggaatct aacttggtat tttttgcagt aaaatttatc aagtgaagta tatgcagcca gccgttatcc atgaatgaga agcctacctg ctatgcttat
caatgtagac tttataaaat ttgctcttgc aactaaatta ttgtcttata tgagaaagaa taagcaaact gctaaacact agggtggagg tagctgagtg acaaacctgc tggaaacata agttttgtag ttcttgattc atttttggag gcaattggca tctctactag tttatcaaac acctttcttc tttctatctt ttgtctttct gctgcaaacg gtatatatac tccgtatttg atatatagat ttgttccatg cattaccacc tcttttttat tgcatttccc gtcttctttt tttttcccat gaatcatttg tcctttgctg ttgcctgtgc atttacccaa atcctttatt catggatatc .ttgatacctt attccattcc tagctttgta acgagattgc tttatattcc ttgcttcggg tatctttcca gtagagatct atattgtaaa taaatgctat catttctaac gcaaatgagg tatctgattg tgtcctgatc atgttangcc actcaatttt gcatctattg ttattgattt gatggtaagt ttaccatttg gatccacatn aaagtttttn tcgacttnca atatatctct gccagaaacc cagaataaat aatgcatttt
atcaccaaga
tggtccaaat
aaatttattt
aattttgttg
tgagactatg
aacacaggaa
gagtacatac
atgagaggaa
gcgaaacaat
acatgtatcc
ctggaattta
aatatgtaaa
ctatgtattt
tacatatgat
tatccatcac
ctattttgaa
gcttaggtct
atccaaccct
cataagatcc
gtgcttggct
tcaggatttc
atatcacatt
gctatttgga
ttcctccctt
tttagttttt
aacagtgtat
aaaagccatt
tgatgattag
gagaaatgtc
tgagttattt
cagacatttt
tgccgaagtt
ttttcagatt
tgttttcttc
atttgatttt
catttttccc
tgtcaagaat
attgggatat
gcatattttg
tttggctatt
tgtgaagaat
tagtgttgac
ttttttgtgt
ttcacttctt
tggcattgct
taatttttgt
agtttttggt
ataattttat
ctctggctag
ttgttccaga
atgggtttgt
ttagtgtttt
aaataataac
ccatatgtta
aagaaagcca
agaaacttct
ccatatgtat
attaangtct
tctaaatnct
tttnaaaatt
agcctttcat
tgaactttca
atggtcacct
gttgaattag
acattttaca
gtcacgtatt
acaaaataaa
tcctttgtag
gagaaaacca
agacacaaag
ggtgaggact
ctgtacgcca
ctgaatctaa
gagcattaat
atcataattg
atttatttac
atttcgatac
ctgnaaacat
atatgtaata
tatttatttt
ggcctttacc
acttacttaa
tatttctttt
actcattttt
ttctttatcc
atagtgctgc
ttggatatat
ttcagtccgt
gagtgttcct
ttaacttggg
tgatgttaac
tattcagatt
gagttcttta
cccttattct
ttgagcttaa
ttgccccccc
taggagtttc
tatatgatga
agcaccattt
gaattggctg
tttctgtttt
aagtcagtta
cagaatcttt
gtcattggta
attttaacaa
ccacttcaat
tagtcacaat
ttcttgattt
atgttggttt
ggagtcttta
ttcttccttc
aacttccagt
tcttagcaga
caaatatggt
gataataaag
atggtttttg
agccatcctt
ggattttaac
gtattttaat
aaactgtttn
ggtttctant
ataaactagn
gttctgcaca
atgataataa
gatgaaaatt
gaaatacaaa
atcaagagac
ctatgacgtc
gatgtnaagt
tcaaatcagg
tttgaattat
accctactga
ccattcacca
accaatctac
catgtgatat
tgtccatgca
ctgtgtgtgt
ttaggttgat
tatctcttaa
gatcatagag
tcagaatttg
gcactcactg
agcttttatt
ccatttgtat
gattattaga
tttgtcagtt
gttgattgtt
tttgctttag
gtcctggagc
taagtcttta
ttcttctgca
cttaatgttc
tgggttttct
ttggttgcta
ttctttttgc
aggatagttt
aaactgtaga
gagcatcgaa
agttttcatt
tttttaataa
ttggtgtata
gtttgcttat
catgtcgtct
ttctttctct
tgaaaatggg
ctttggtatg
ccccttttat
tgctttttct
tgtatcatgt
aatatgtcca
tatgtacgtt
gacatataga
tnctnacatt
ttcatgggat
agtactatct
cacctgaggt
gaatatattt
- 111 -
008252
aataccagca
aaagaaaacc
cttttgatca
tcttattttt
aatacttata
aaattgaagc
aagactagac
tgtatgagat
ttcctttagt
agtggttaat
tgaacatcct
gtttactgta
acccaaccag
gcaccaagag
tcacctggca
aggcaaggct
tttgcaatta
aaaaaaatag
ctgcccaagg
ggagcaccag
ttttctggga
ttctagagat
gcattggcac
tttgtaaatc
ctcatgcctg
agttcaagac
agctgggaat
tcgttggagc
gcctgggtca
agagagagag
gaaaaaaaga
gaaagaaaga
cttatttctt
tatttttcag
caataaactg
cagtttctga
attttgtcaa
tgtaaacaaa
aaagaagggc
cctaataatt
taaccaagtg
cacacagaag
taaatttaac
tgttctgtaa
tcctaataat
ttctactttt
tactttaagt
gccatggtgg
tagctatttg
tgtgttgtat
tttctgatcc
caaaggatat
acattttctt
tgtaaatagt
ttcttttggg
atccttgatg
acagtgtaaa
tttaataatc
ttccctagtg
cttttgagaa
tcttgcaaat
agattgcaaa
ttcttttgct
tgatttttac
atgcagtttg
tatgtttact
agtggtaaat
acaacccgat
tgagtaaagt
ccatttctcc
aaccttcctt
tacaaggagc
tacgattgct
ctgtgagtgt
gccgcctcca
cttggttttc
taaattttng
aaagttgtaa
gagattctca
aactccaaaa
accttgagtc
gtagcatgcc
aggtaattag
cggacaacca
tgaattgggc
ttttaaaatc
cattctttca
taatcccagc
caacctgggc
ggtactgtgc
cgggaggtga
cagagtgaaa
agagagagag
gagaaagaaa
gaaagaaaga
ttattacatt
atggaaaaga
gagatcgtgt
atttttaaca
aaattcagta
gatgagagtt
agctgccaga
aagagaaaaa
aatcataaac
gacgcagcat
cataaagaga
tttgtaatgt
ttttttcaga
tttcctgctt
tgtgggatac
tttgctgcac
tcctaatgct
gttctcattg
tgtgttacgt
gatctcattt
я nl" с гя rrt' r-t" -------I---
gttgcaagaa tgtataccca aatcatcaca agcgttccta gccgttctga atcagtggtg gagtctgttc ttgtttacat aattttctcc gtgcataagc cagaatagca
aatgggggtc
tcccaaaaag
aacttttatt
aagttatgtt
taaacaaagt
ctcacactgc
caacatgtgt
ctattcttaa
tattttaaga
ggaatgagga
cagaatcgat
cccatgatag
aaaattaatt
aaaatactga
gaattggcca
gatatgttat
ttcaaagaaa
tgtcctcttc
agcctcctgt
tctcaatttt
tggtgtactt
cctcactgac
ttgctataaa
actttgagag
aatatggtgg
acctgtgatc
gggaggttgc
ctccatcgaa
aggaagagag
gaaaaaagaa
aagaaaaaga
tttgggtcct
aatattgact
taatgtagat
agctcaccag
agtggaagag
ttcatttacc
ttaaatgtga
taattaactc
attaactgca
cactgctgtg
catcagtttt
tgattttaag
actttctggg
tgtatccatt
atgggcagaa
ctgtcaaccc
ctccctcccc
ttcaactccc
ttgctgaagg aaaatgtttg
taaaaggaaa
aagataatgt
gaacaattgc
ccatttttac
ggctgagatg
tttctatgct
gtccaaaatg
aagacaagtt
ctgaattcta
gctctaccta
atttactatc
aaaccataat
tttaggatga
ttccaagcca
ggttagaaat
agagtagaac
tgttagtctt
ccttaagact
ctttcctgca
atttatttag
tgtggttgag
tttacttttc
gaaatacctg
gtcaagacgg
aaccccatct
ccagctactt
agtgagccga
ggaaggaagg
gaagagagga
aggaaangaa
aagagaaaaa
atatttgtat
taaaaggtac
tattttttca
taatgtcaat
cctgtgtttc
aaagacagat
tggtttatgc
tgtagtgcga
ctaggacaaa
atattgcccc
atgcgaagct
tagtctttag
taataaatgc
tattcacttg
tgtgcaggtt
atcatctatg
ctgcccctca
acttatgagt
tgatggcttc
ctttttatgg ctgcatagta atccttgatg acatacgtgt gtaatgggat ttgtcttcca tttctccaca ctggtgtgag ttgagctttt atatcctttg ttcttatagg tattctattc tctttagtac
acatgtatct tgctgtgtca cagtggttga tcctcgccag atggtactgc tttcatgttt ttcacttttt ttgtggatat tgtaggttgc ttctagttta
tgagagtctt
ngtaacttat
aatattatag
tgtatgttat
actgtatatt
aaacagcttg
ttcagttgta
tttgaataaa
ctcagtggga
aaggcatgca
tfcctgtccct
acttttgtat
aagtatgcat
aatctctttg
catttgtgat
caatcgttta
acaaaattac
ctagctagct
atttccccag
aagaggcagg
tgactcttac
tgtggttgga
gtgttcacat
aaactggcag
gcagatgact
ctactgaaaa
gggaggctga
gatcatgcca
aaggaaggag
agaaagagaa
aaagagaaag
gaaaaactga
catacagaat
ctctcaaatc
gaagatctgg
gtttttggcc
tttttctagt
atatgcaaag
acatcagctg
cagtctgtca
tttttatgan
ctcaaaagta
caagatacac
caccctaggg
catcctgtta
tttgcttttt
tgctacctag
nttttcagcc
ccccgcgaca
gagaacatgc
cagcttcatc
ttccatggtg
t nrtt-1 nr-rrt-n - - -л ----^--3
ttatagtaga aattttattt actaatttac catttattgt attgtggttt tttggctgca gatggggttg tagacctttg ctgttcactc attagatccc cagtatacca
tttgatccat
gttataagat
tttctcactt
acagccaagg
tatcagaagc
acttgttcag
atatttagtt
cgcatgagta
ctggaacttc
cacaaatagt
ctcaggttcc
aactacagca
gtaaagaaaa
tcgtattttt
aaattttagt
atggcttttt
gcttactgcc
aaatgtccaa
tatgtctttg
atgttcttat
gtcgtcaggg
cattggggag
ggcacggtgg
tgagactagg
tacaagaaat
ggcacaagaa
ctgcattcta
agagagagag
agaaangaaa
agaaagaaaa
gactgggtat
gagttctgta
ttaatgtgta
aagaaagcct
aaagaagaat
ttttctggct
aaaacctaag
cataaagata
gagagctctt
tgtgctgatg
cattatagtc
gtatctttca
agcaagcatc
aataagtatt
aaaaaatttt
gtatacatgt
ccgcatgcat
gaccccagta
gctgtttggt
catgtccctg
tatatgtccc
tctttgctat
atgatgtcta
ctggttctag
attcctacca
ttcttgactt
tggtttgcat
taaatatctt
tttctttttt
tcagatgggt
tgatgatagt
atttgtctgt
- 112 -
008252
tttggctttt cttgccattg cttttagcat tttcatcatg aaatcactgt ccatgtctat gtcctgaata gtattgccta agttttcttc tagggttttt atggttatgg gtttaacatt taagtcttta atccatctcg atttaatttt tgtctaaggt ataaggggtc cagttttagt tttctgcaca tggctagcaa gttttctcag caccatttat taaataggga atcctttccc cactgcttgt ttttgtcagg tttgtcaaag atcagatggt tgtagatgcg tgatgtgatt tctgaggtct ctgttctgtt ccattggtct atatggctgt tttggtacca gtgccatgct gttttggtta ctctagcctt gtagtatagt ttgaagtcag gtagcatgat gcctccagct ttgttctttt tcctaaggat tgtcttggtt atacaggctc ttttttggtt ccatatgaaa tttnagggta gtttttttct aanttctgtg aagaatgtca atggtagttt gatgggaata gcattgaatc tataatttat tttgggcagt atggccattt tcatgatatt gattcttcct atccatgagg atggaatgtt tttccatttg tttgtgtcgt ctcttatttc cttgagcagt gatttgtagt tctccttgaa gaggtccttc acgtcctttg taagttgtat tcctaagtat tttattctct ttgtagcaat tgtgaatggg agttcattca tgatttggct ctctgcttgt gtatttttgg tgtataggaa tacttgtgat ttttgcacat ccattttgta tcctgagatt tgctgaagtt gcttatcagg ttaaggagtt ttcgggctga gatgatgggg ttttctaact atagaatcac gacatctgga aacagaaaat ttcacttcct ctcttcctat ttaaataccc tttatttctt tctcttgact gattgctctg gccagaacat ccaatactat gttgaatagg agtggtgaga gagggcatcc ttgtcttgtg ccagttttca aaaagaatgc ttccagcttt ttcccattca gtatgatact ggctgtgggt ttgtcacaaa tagcacttat tattttgaga tatgttccat caatacctag tttattgaaa gcttttaaca tgaagagttg ttgaatttta tcaaaggcct tttctgcatc tattgagaat catgtggctt ttgtctctgg ttctgtttat gtgatgaatt acgtttattg atttgtgtat gctgaaccag ccttacactt cagggatgaa gccgacttga ttgtggtggg taagcttttt gatgtgctgt tggattcggt ttgccagtat tttattgagg atttttgcat tgatgttcat cagggatatt ggcctgaagt tttatttttg ttgttgttgt gtctctgcca ggttttcgta tcgggatgat gctgacctca taaaatgagt taggaaggag tccctccttt tcaattcttt tggaatagtt tcagaaggaa tgataccagc tcctctttgt acctctggta gaatttggct gtgaatctgt ctggtcctgg gctttttttg gttggtaggc tattaattac tacctcaatt tcagaacttg ttattggttt atttagggag ccaacttctt gggagggtgc gtgtgtccaa gaatttatcc atttcttcta gattttctag tttatttagg tagacatgtt tatagtattc tgatggtatt ttgtatttct gtggggtcag tggtgatatc cccgttatca ttttttattg tgtctatttg attcttctct cttttcttct ttatcagttt agctagcagt ctgtctatct attttgttaa ttttttcaaa aactagctcc tgaattcatt aattttttga atggcttctt gtgtcactgt ctccttcaat tctgctctga tcttagttat ttcttgtctt ctgctagctt ttagattttt ttgctcttgc ttctctagtt cttttcattg tgatgttagg gtatccattt gagatatttc tagctttctg atgtgggcat ttagtactat aaatttcctt cttaacactg ctttagttcc cagatattct ggtacgttgt ctctttgttc tcattggttt caaagaactt cttgatttgt gccttaactt cattatttac tcaggagtca ttcagcagca ggttgttcaa tttccttgta attgtgttgt tttgagtgag tttcttaatc ctgagttcta atttgattgc actgtggtct gagagactgt ttgttatgag ttcagttctt ttgcatttgc tgagcagtgt tttacttcca attatgtggt tgattttaga ataagtgcca tgtcgcactg agaagaatgt atattctgtt gatttggggt tgagagttct atagatgtcc attaggtcca cttgatccag agctgagttc aagtcctgaa tatccttgtt aattttctgt ctcgttaatc tgtctaatat tgacagtggg gtgttaaatt ctcccactat tattttgtgg gagtctaagt ctctttgtgg atctctaaga acttgtttta tgaatctggg tgctcctgta ttgggtgcat atatatttag gatagttagc tcttcttgtt gaattgatcc ctttaccttt aagtaatgcc attctttgtc tttttttatc tttgtttgtt taaagtccgt tttctcagag gctaggattg caacccctga tttttttttt ttctttccat ttgcttggta ggtcttcctc catcccttta ttttgagcct atgtgtgtct ttgcacatga gattggtccc ctgaatacag cataccaatg gatcttaact ctttatccaa gttggagact gggtatttta taaagaagaa aggtttaatt ggctcatggt tctccaggct gtacaggaag catggcacca ggcacctgct cagcttctga tgaggcctca ggaagcttac aatcatggca gaaggcagac ggggagcagg cacatcacgt gacaagaatg aacacgagag agagatagtg gaggggaggt gccctacact tgtaaatgac cagatcccct gtgaactcag agcaggagct cattgatcac ctaggagttg gctcaagcca ttcatgaggg ttctgcccct gtgatccaat cacctcccac caggccccac ctccagcgct gaggagtata cttcgatgag atttgcgcaa ggacaaatat ccaaactata tcagggagtc gttagtatgt ctggccacct tgaaaggatg aaagcttatt ggagtggaaa aaaaattgcc tctctccagc catacaactc agtcaaacca cattcaatta acataaatat attttgacct ccaagtatgt aagaggtgat ttatattcac aatttctaat ttataataca gtttcataaa tttgatcttc acaagaaaga tgagcaaatt gctccttgcc aaagttaatt ggctgaatta ccaactgaag ttctgttatg cttggcccca aattctggtg gcccctttcc attatgtcaa ctggctctct ttacatatag attctcaccc tgtagtttcc agttcctaag gcaaaaggag aaaagttgct gcgtgaggat ctcttggccc agattttaaa agtcaaagac agtggactgc cttataacct caaacggttt cacatttcag tttggagctg
- 113 -
008252
atcagtgcat
atctcactct
acccgctggg
tacgctacca
ccaggctggt
tgggattgca
ttcatgccct
cactgtccct
attttaaaaa
atcatgtact
ttaccatttt
gaatgggtga
agaaaaaatg
tgcttcagaa
agttttccaa
ggattagtat
aattaatcct
agtgaagctg
ggaaaacctc
atatctgcca
tctcttgagt
ttctccatgg
tatataaata
gtgttatctg
cttatggaat
acaaatgggt
taacaaaaaa
tatatgtttt
gacctttttt
gtcacagtat
taacagtgta
atctcactaa
ctctttcttt
ttccagaatg
atagtcactc
gtagtcatag
tcttaaagca
gcagtaaagt
gtggcataga
acaattaagt
taagcatagt
cagaagccat
gaggaatctt
gaggagaact
tatatccctt
cagctggaaa
tctcccaagg
tatacagctc
gaggtcctga
attttcttag
attaaaaaca
ttagctgctc
atttaaaaca
caacaggatc
ttaaataatg
aaacatctac
atgtatgtgt
agatacagat
aagaccaaaa
ggctctgcca
ctattaataa
tcaatttaag
caaccaaaca
cctctgtgtc gttgcccagg ttcaagtgat aacctggcta ctcgaattcc ggcgtgagcc ctcattgcct tatccatact gctattcaga gcattgtcac tatgcatgat aaggagtggg tgccaggtta tatttatctt aatcaataaa tccaaagcat gaccagagga gaaggcggta tcaatctagg caaaaggcaa gcaaaagagt gtttatttag aaaatgaagc ttgcatgtgg gccgacttca caaatttcga aggtaataac gaaaatctag gtcctttctc ccatttaggg gtttaaaaat а с а у с t з с а с ctgtcactct ttatgctgtt caagcaacac ttgatgtttc ttcatcacac ccctgagtcc gtaggcttgt gcccccctac catattcatt gatggtagtt aacatgaagt atgcacagtg ttcttttata gtttctcatt taattaagtt agtgctctgc ggtattgttt atctcaaact aacaagcaaa ccagggattc
ttQ323"tC3
cacttattaa gtagaaagac tatatattag atatacatat ataaagagat tcttcagggc aagatgtggt gatgagtccc tgttaatcac gccaggcacc ctgatgctta ctgtagttca tctcctgcct atttttgtat tgaccttagg actgcacccg tatcctaacc ggcaaagtag tataacaaga ttaaatttca ggctacaatt aaaatcatat acttgtttat gttttgcagt taatttatct ccagcattag agctaaataa acagccagac ggtcagcttt gacaagcacc ctgtgtctgt aattgtgttc cttacagatg atttgttggg gaaatgtatt taccaagaag aatgtaaaca caagtaaatt acctactagg tagcacgaat tgcttttgta ucaccaQa^a ctctctctca tattccatcc cctattgcaa cgctttgaac tctcctgtgg attttattcc caaaaataat gaatacagga aatgacagtg ccatatctgt cttaagctat aagcatatgt tgaaagcgtt tttcagatga ggttaatcac accgctagga gtggccatta cctacaaaat catatgctag tagtactcat
rtt- ппе-яя h f +¦
•3"-3 — — — —~"-
agagtttctg acattcattc gtttctccag atgtatgttg ttactttaag agcctggaaa aggccagtga actcacatta aactgtaaaa atactttagt acttttcttt gtggcatgat cagcctccca ttttagtaga tgatccgccc accaactttt caactgcagt ttgagggagt taactattta tagtcacaat ctttacaact taaaatactc taaaagaggt tccactaaaa ctgcaaataa aattagctag gagtgaaaat taagttttct tagcaagata acgtaaggta gtctatgtat ctctattttt caatcaaaaa ctacttattt gtagcttgga tcatccttag aaattgctat tagtaataat aacagtttat ccttgtcttt tgataacaac aaaggtgaaa tatgcaaatg ctagaactag ggttttccca ttcagttaac tcattccttt .ttttattcat tattatgaat aaatttttct attacagaag agagaaagac tgcctttgtc tgaattatgg atgaggtcct ggaaactgaa cgaactgaga gtggtgaata tcaacaattt gttatttgta gaggataatt tttgatacat
П+ ПГТаа t* Y at" - -•Э'З — - - -
tagtttacaa attcattcat agagaatata gcttagctca gaattggctc tttcagcaga cctctccctg tggagggtaa taccttcaca caagttgata
tcttttcttt
gttggctcag
agtagctggg
gatgggtttt
gcctcggcct
ctgatattat
cttctggctt
caacttgggg
aaatattcct
atttgaaaaa
ttgcctacca
agttttacaa
gtgatgtcaa
gtccaggcgg
gactcttgct
accaattcat
gaagtcagat
gtaagtacat
atgtgtcttg
tcaaaggcta
gattgtgtgt
gatgtatttc
caaaatgctc
atttacatca
ctctgcaaat
cctgtttgtc
gtataaattc
ttattttgtg
aatcagctca
taccctaatc
tgcttgttaa -.+- ~*+-
ayy UV.I.V.V.-W,
caggctctga tacgtgtgca gtacccacca atcaggagca tttattctct ctccattcct taataaacag gaaaagaggc gccaacacta gatattgtga gttggtgagt ggcacatgct tctgggaatt gctcaaatgt tgatcatctt acttaaaacc tagtaacaag aatagaatgt gaaggctttt ggaagctact acaCwtaaaa ataaataatt ttattcagaa gaatagaata aaagatatgt atgtaatttt agctgatgtg cagagaagtc catgctttac gcaacatcta cataaattta
ttgaggtgga
64080
r tgcaacctct
64140
attacaggca
64200
actgtgttgg
64260
cccaaagtgc
64320
tttgaatatg
64380
ctgtcaggtg
64440
aacatatatt
64500
ttaaaataaa
64560
atacttaatt
64620
accctttcag
г t r- r* r\ OIOOU
cttatttcct
64740
tattatttcc
64800
agccattgaa
64860
ttccagggtg
64920
aggagtttat
64980
gattgtctga
65040
gcaatgacca
65100
ctaaattttt
65160
tattcattat
65220
gggtgtaatt
65280
tagaacatac
65340
aagttgtata
65400
ctgacaattt
65460
gtcttttaca
65520
tttagctttt
65580
ctatcatagg
65640
agtatctttt
65700
tgctgcatca
65760
tataaatctc
65820
caatccttgt
65880
*- +-
65940
cattttcact
66000
tcctttaata
66060
tctgccaccc
66120
tatagatagc
66180
ctcatactaa
66240
agcatgctgt
66300
acattcaaat
66360
taagtcatca
66420
agtgcagtgc
66480
ataacgaaga
66540
cttgtggtga
66600
tttgcttaag
66660
gttttttaaa
66720
ttcaagtgaa
66780
tgtgttgtga
66840
acaggactct
66900
ttcagaacac
66960
tttgttaaga
67020
aaaaaaacaa
67080
aaagccagaa
67140
nhpiraf яяаа
67200
caccatagat
67260
aataattatt
67320
tattatatat
67380
ctatagatac
67440
gtaggctgtt
67500
gcaggccaaa
67560
aaaatctttc
67620
tcaaagtcta
67680
gactggtgtt
67740
actatcatag
67800
- 114 -
008252
acgctgtgtc
gacatccaat
caaaaagtga
tggagtggct
gttaaccaaa
agctgggaga
gggtgtttga
ttgccactgt
tgtatcagaa
tgtgtagaga
ggagaacgtg
agacttcaag
ggtttaggat
aagtggagaa
ggatgacaga
aaaagagaaa
tagaggagat
gccagcagag
atgatcactg
ctcccaaatt
gcaacattat
tttttctcta
ctaaaatttt
ggagtcacag
aagaaatmtg
attaccactg
tccaccccac
atgactacgg
ctgaaaaaaa
aatttttaaa
cttctaataa
tcaagcctgc
aaaatgagta
aaaatactct
taacttattt
ccctacaaag
cacagggctg
taacatctag
cttacgtctc
taaagcatgc
gctccaaagt
atgtagacag
taaaaatata
cttcaagagt
tgaacatgct
ctgggattta
tttgagtaca
tacttaaccc
aggaagctga
gagctgggat
tcttactgtt
agtatttgta
tfcggcctaca
tatctttctg
tacagatggg
cttatttcct
taaaggaata
tgagaagtgg
gtgtgtaaaa
caattaggtg
cataagaagg
ctcacgtgac
atgtagtggg
agggacttca gaacagatga gggtaccttg cccccgagaa gaaaacagga aggccaacgt agtgtgggag taaggtagga aggctaagag gggagatgga acgattactt tttgctccac ttcaaattga atctaataag gaattgagaa ggtcaaagac ggaaaagcag ttgcatctgt ttagtgattc taatgtcttt ctactcacag ccacaaaaac tctgattggg aaatgggcta tgagtaagaa aaagaatcat ccccaactcc aaataattaa tgaaacaaag aacagtaatt atgtgtttct tgcctctgaa tcagcactaa aatatttata ttggcaccat aatgcaataa gagtttcaat cattgattgt accccaggct ttaagtcaca ccaatttctt agtgttatct tgtaattttg aaatgaagaa aaagtttctt tgctacattg gtacttgcaa tcacatgagc gcttagaggc caaacccaga atattgtagg ccacacattc
-------J
acccacccaa gtccaaagga gagaccagca gcttagggtg gcaaagtatc ctatgtacgt tcagacttta tattaaagaa tgaggctgtc aaattagtgt tggaattgga
ccacacaaac
agaagttata
aatgatagtt
gagacttcca
ggtcagacac
gagccagatc
cagtgattat
tgggaggcag
gagaatggaa
atgagggttg
ggtttggaag
ataagggacc
cagttggaca
atcatgaaag
agagctcaga
aatggcctna
gtcttcctcc
atggagttag
agccttaatc
gttccatatg
aacaattcag
tatatcatat
aaaagttaaa
atgctggtct
tgtctatgtc
agagagtcac
ggttaatgaa
attaacaaat
accttgtggt
aataaacatt
gccaaagact
tatgaaagaa
aattaattta
tctgagtgtt
ctatcctcat
ctaggaaatc
ctatcaagta
tatgaggtag
catgtaataa
ctccaaatat
tagacatttc
atgggctagt
ctaggtgatc
ctcctctttt
tattattgta
cacattaggt
tttgctttta
ccttagagcc
aagcctcact
taccaaatca
tgaaacagag
апаяаЬ nncin —-,---— zi ~ zi z>
ttgtggtaat ccagcttaaa gacagatgag tttgaatcat accagccatg gtgtgtatgc gagaaagcat aaagagtcat ttagggttgt aacacaatta aattacacta
atgaattgcc
gcagggaaac
aagctggggc
agtggaggag
tgggatactt
cttcagtatc
gaagggtctc
ggtggccagt
ttagctcaaa
agggagaagt
ctggtcctgt
tattgagctg
tgtagctcta
tggatgagat
gcagctcatg
agaaatatgg
catactcaca
gttgggtcca
acacctataa
ttagaatggg
agcactgctg
ggaagtgaac
agagggagat
tgaaacccgt
caggattttc
ttgttctcta
taaaaataaa
atatattctg
tttagataca
tgctaataac
tcaaaataat
aaagcaaata
aaaaatcata
gcacattatc
tttggnaagt
tacaactttc
cctgttttat
acgttttcac
gtaggtcaga
ctgaaatatg
tgctattgta
agacccttcc
catatagtat
aacaagtctt
atgattaata
gctatgcaaa
attatgatta
ttatttaagt
ctgaaactca
ttgatgacaa
tcagatcaga
agatatacac
ttccacaatt
atatgactag
ctcatctgct
gggtgaagtt
gggtgtgtgt
gtggtggcag
attataaaag
ctggtaagtc
tctccattta
tggatttaga
aggaacagtt
tttgtctcaa
ctggcccagt
ctgaaggcta
aagaccctgc
gggggaaagg
ttgcagacca
tccatatgct
gaggaggcca
agatattttg
aggtatcaag
ttgttatgac
gaggtacttg
agactctaca
tgcctgggag
actaaaggtc
acnaaaccag
tctctctcca
cctggataat
ctttagttcc
gacatcttta
agaggtcaca
aaaagtaatt
tacaagtaga
ttaaacatga
ctggtggggc
tccaaagtac
ctctggaaga
aaactcttga
tgtgttccag
ttgatgttgg
atctagtgag
taataggaag
atcattaaca
taatttaatc
gggataactg
aaactgtcaa
acaatttaca
accattatgg
actcacagcc
atttttttgg
tttttaaaag
ctctctgaac
ctcttagctg
tattgttctg
atcatttaga
gtgcattact
ctctctgtac
cacacaacca
gaagcccagt
gcatcgttga
ctgaagcaaa
nabnt- rb n
agagcctttc agggagcaat gctgacaaag tctggagctt gtgtgtgtgt caaatagcta ggatggaagc tacctcaatt agaaattcct aggcttctga gagtttggaa
gtgccagaaa
ggaaggcact
caaaaatggg
attaggcagg
gggtacaaag
tgttacaggt
ttgtgccaaa
gataagagtg
agaatatgtt
catgattcta
agggaactct
tggtgtagcc
acgatgtaaa
agttatcatg
agctcacgac
caccttcaaa
naccacagcc
tcaggatcat
cttttgctat
ggggaccagt
gaagataaaa
tcattgtctt
tactttattc
gtggatattt
aagaattcca
ctgagggaaa
ttcttgttaa
cattcatttc
ggcaattaat
taaaaatgtt
agttgtgctt
aaaaaaggaa
gttgagtgat
attaaaatgc
aggctataca
taacagtagg
gatgtaaata
attggaaaac
aagaagattg
aaactttttc
tatttggaat
ttcaccttgc
catagttcta
tttttacatg
tcaagcatta
tggtttactt
cttacagatg
gtaaatggca
ctccttacca
tgaggttaat
gatgaatcat
tctaaaataa
ccttgggttt
gatttaacca
ggcagaaccc
tgtttatggc
gtgtgtgtgt
agggattgca
agcaactgaa
tggtcagaaa
agaaacattg
aatcatcaag
- 115 -
008252
cccagacttt
ccatttttaa
ttgctgtcag
ttcttaagaa
agagctatca
catttctcct
aagtatcatt
acattgctta
tcacaatgac
ttgcttatct
aagagctatt
tatgaatatc
ttgcaaataa
agagagagag
ttaccacagt
ctcatttctc
tctatatttc
gtgatttggt
tctccctctc
tagatagata
tgctctgttg
cctgggctca
caacctcact
tcaacattta
cctggaatag
agtgcccacc
tgggctacag
ctattttgtg
ctggctgtag
tattctaccc
atggagttac
ttaaaaatat
tggtttcctt
actgtaatac
caattaatga
tgtgcatgag
taaaatgtgc
ttgtattttt
aattccaaac
atttcttcaa
tagtactgaa
gttttcatct
gcattcttcc
caactgatgt
tagtcttaaa
cttttaggca
ataggctgtg
cttatcagag
agtggtcacc
atcatgtagc
tcaaaatgca
ttgcttaata
ttgagaggac
ttatcttact
ggaagtgcat
agccctccat
taaccaggca
ttgttctttt
cttcctttct
ctgtatgact
aaatggtcgt
tagatacaca
aaaatgagga
ggcgtctgct
ggtcaaccca
gaaagccatt
ggataaaaat
ctaaatcacc
tatttgtctg
gatgagtttc
gaagtgggga
tcctcagaca
gggtctcagt
gtggggatga
atttatggat
catcatatat
agagagagag
tgggtgggcc
attcttatat
aaagtgtgtg
atctacaaca
taaatatata
gatagataga
cccaggctag
agggattctc
tggccagata
tgattgttga
tttagctatt
tggatttaaa
tggctttaat
atgtttatga
tatagaagaa
gacagtgcgt
agatctctca
ttgtttgttg
tcatatgtaa
taggtattga
actacttagt
aactatgtgc
cattacatac
ataattccat
aagtatttta
gtgtcaggcc
cgtgggctga
ttatgtttta
atctcttttg
gaagcaattt
tccttccctc
tgaggaagaa
cggaataagc
tctgcagctc
attccagggt
taaagcacct
gcattatatt
tagggtagaa
cagttctagg
atagctgtac
cttttcgtct
aaatatttac
tgtttgtatg
gcctgatttt
atacaggctt
aattgttaga
tataatttag
aactactata
aaataaaata
caatctgtgt
gaatgagagt
acatatctaa
gggttatgtc
tcataatctc
gttatttcta
gtagtattcg
agtaaaatgt
agttaacgtt
ctgtaatggc
atcagatatc
tatgaatctt
atatatatat
agagagaaag
agaaagatat
gtaagccaaa
gtacaaatat
taagagcaag
tatatatata
tagatagata
aatgcagtgg
ctgcctatgc
catagatatt
aattgtctaa
ccagacacac
tgcatggacc
gagataggtc
agtggacaga
atacaaatat
agcatacaag
tttttgacta
aacagggttc
ctatgtaact
tgagtgcatt
gaatatgcat
tcaaatgtgt
ataatgaaag
gcaagttgcg
tgccttgaga
tgcgtgctaa
tggtatcttt
gtatttcctc
accagtaata
caattttcta
tgtctcaaaa
atcacagatg
ttcaggagtt
tttcttttag
taaggttgcc
cataccctca
caagttgatt
tctctttttg
aggaaattgc
tgttaattta
tcaagtctcc
taataggctc
aggaggcaga
gtctgttttt
aatttcatcc
taatgaaatg
atcgaaattg
tttaaaagtt
ttttattaga
gggatacctc
ctacagtcag
atcctttata
attatccacc
tctttcctat
aactagacac
tactgcaaag
gtgcccacag
ctttgcaaat
aaaaaccgta
atttgagaat
aaaactatat
atatatatag
tctctcaagg
gattttagac
tgatccatct
tattaacctc
aaggtctctc
tatatatatt
gatagaaaga
catgatcata
ctcccaaagt
aatgaagggt
cactttcatg
actgctcacc
ttgaagatct
tgtcttactg
ataattaaat
aaattttaat
ctgtgtatgt
tttcgattct
tgggttgttg
ataccctaat
agagctgaaa
caactaagta
acattcttct
aatttagcat
catattatat
attgttatca
accataaagt
ttaaagtcag
atattttatt
ttgtctccta
tactctctta
gtacagaggc
tggtatggga
ccaacagctg
ggtctgagtg
cttacagaaa
ccgtttttaa
catctttctt
agagaaaaag
cttggaggca
tctcccaagg
agggcacagg
aacaaagcgt
gccacaatag
gttggcaata
gtttgcttat
ttgatcttgt
atagctgctt
cttatggaaa
cacatgtgat
agatagcagc
cagtcctatg
tcaagttgat
taaaggattc
gggatacctt
cttccaacac
aaaatgattt
tgagacaaga
ctgtagaaaa
atggtgatag
gtttaatatg
tcagatacac
agagagagag
tctcatatat
agacacgtca
tcgcttcagt
atcaacaatg
aaggtctctc
ctctttgctg
gcaaaggtct
gttcactgca
gcaacgatta
aattacatta
tgttgttcac
agagctagaa
gggacttagc
gtaaaatacg
aattgatact
tctatgccta
atatgggcag
caataacrgc
actcaaagat
aggcaaggta
agtgctcctt
ataaatgtat
tggcttgcct
ctgccattta
tattaaagca
gagtaatttt
tacagctttt
ttttgcaaat
tcaagcatta
tttcacaaaa
aacttatcca
atcatgaatt
ggcgagatgt
ggcatgacta
tatccatgtc
ataacctcca
tgcaacaatt
cactctgact
tctccttgta
gtcgccccct
atttaagctc
gctatgcctg
atgtcttttt
agaatttagt
ttcattattc
ttttcccaaa
accataacca
cctgatatta
caaaagacaa
catctcttca
tatttggggt ttatctatac atccaaccta ttatattcct gagttccttc tcagaaggac tcatcatgca attttgtgaa attccttcct tattcttata
LOCI U I. CI- - у t-
atacacaatt
agagagagag
atattaccaa
cgtatatctc
cttaactgac
cttgtcatca
tttctctctc
tactcttaga
ctcaaggtct
acctcgaacc
caggcatgag
ttcattgtaa
aggaatgtaa
gaaggctacc
aggcaagagc
ttttaagttt
aatattttga
ttttataata
cagtgtttgt
atttaagcat
aaacaaaatt
agtcttaaaa
gattagaata
gggaaatgct
tattaagtcc
gttgatatca
aaaaatgtat
ttaaactaaa
atatagaata
aacatctcag
tagttagatg
atccagaagc
actttgtaat
ataccaataa
atataggctg
gaatgcatgc
ttctatggag
attttttaaa
gtacccaaat
tacaatggct
ctgtgctgac
actaaagcaa
cttgaaaaca
gctcacaggg
aattcattgg
tgttttcttg
ctcatgactc
ttcatcatca
aaacattttt
tgtatctctg
ttttttgccc
tgcatgcatt
- 116 -
008252
tgaatttaaa tatgtaagta accattcaaa ctcattaaga cagagtcatg catctttgcc atgaaatttt gggcatctaa agcaggatag ttgagtcagg tcacaaggca acaactgctt gttttcatgg caagcaccat ttttaaaggc aagaaataca atccattttg ttatttctca cctggtgaag gtagaagcag tgggctccac ccatgggggt cactatccta taacaaaaat aatgtacttt ttagtaggaa aacatagaac gaaaacattc agagaggcct aaattcttta atagagacta tatcatgagc atttacaaaa accgggggag aagtaacatt atgagaatgc taatattatc caattctttc taacctctga gactcctttg tagatcatga cctcaatttc aaagagcaac ctagaaattg ggtgtaataa atgattccct gaggcattgg tctcggtctg cctcctgggt ccatcaccat agccaggagg tgggattaca tgcctatgtt aaggcaagtt aatgtcctga gtcattgaat catatacatt caggtgctcc agccatgctg aattccctga tgcacctttc actgactcat ttgcaagctt
acataattag
attatggtta
acatgaattt
tttaacactg
gagtagaaaa
tctttgtgtc
catgtttaag
cagaaaactt
caatattcta
gaatcagagc
gaggccctca
tgttgctgct
ccactataac
cctcatgtca
tctccaggtg
cacatagaca
gttgttgtaa
cagttctaga
gctcacttcc
taagggttct
cttcatgatc
tagaaattca
gaacattacc
ttatttcaaa
gaggtacttt
acagagcact
agtcaacact
attaggcatc
gaaacttcat
gggaaagaat
tattttgcat
tagtctctag
tacaatgtaa
atagtgtgat
tatacaatat
atgataaact
tatgaccacg
taaatcttga
atagagttat
tggtaaagtt
ctccacttta
cccatctagg
tgagaaacta
ggatgcacgg
taagggaggg
ttgtttacag
ggcaggggca
tcgcccaagc
tcaagcagtt
gcctggctaa
gtctcgatct
ggcgtgagcc
aactcatatc
tttggtgatg
cttctgtgct
tttctagttt
cgaatctgtg
ttccacagag
tgatgtgcag
gccacgtgac
catctttatt
ccctgctaag
cctgagtagt
gtgcctaatt
gttaaaaagg
caattcactt
atgatgttga
aattacaagg
cccaaaatca
aactctgaaa
cctgagaaga
agataatgca
aaaggctgat
tttctgcagg
gatctgggtt
ttaggatgac
attaaatcac
attaatttat
cacacacacc
caaaatgtca
gtctgggaag
tggttcatag
ctcttgaacc
taatcacacc
acaaatgaat
ctgttcctcc
gatgagtcat
taaaactgaa
gaattacaga
gagacacatc
cagaaaaaat
gtcaatatgg
gggtcaagct
gaaatcttcn
tatctatttg
atattataaa
tatgttgata
atgaaatgta
cagnaaatta
tcccaaaaaa
taatagttct
gctatttgct
tgcttgaagc
tattagtgtg
aaatggggta
cacttagagt
gcaaaatatg
caggacatag
acattaacta
cggtgttttt
tggagtgcag
ctcctgcctc
tttttttgta
cctgacctcg
actgcacccg
tcccatttca
tttggtcttt
tgtaccaatc
gatgaagcat
acccctggat
cctaagtaaa
gggctccagc
aactgagata
tctggatagc
acattagccc
agacataatc
atgcatatga
agcccatttc
ataaaatttc
aaaattcaaa
aacccctgtt
tccaaatatc
agctgtaact
ttctgcctac
tgttcctgga
tgtggaggct
cagttggtgg
ggctagaatg
ctggggaacc
aaccttagag
gtgcatgcag
tgtattataa
cagaatcagt
tccaagagca
aatggcacct
tccttcataa
caaaggtcct
ttgggggaaa
ccaaagtgaa
aattgaaaga
aaaaaatcat
ttcgaaggat
ttagtaaaat
aaggtcaagt
aactctagaa
ctttctgaat
ttgaaaacat
ttttaagaac
ttatgaatat
ttcttaacat
taatagagat
ctttctttag
tcatttcaat
caaaagaaaa
gtagcatgtt
acagttgttc
acagccttag
agtgatagac
acgtgtagcg
aatgtatctc
atattttcac
tgcaggtttt
tgtttgtttg
tggcacaatt
tgcctcccag
tttttagtag
tgatccaccc
ccggggcacg
ttttattcca
attcatcaat
tctctagaat
catgcatatg
tggagcctct
gcaccagctg
actaagtgat
ctagttattt
tttcctgtgg
gtgcactcaa
taaaggacat
atttggctaa
cttttcttac
tggcagaagt
ttttaaaata
gtaagattga
aagaagattg
ataaaccaca
tgtggatctc
ggaacacaac
tactaggacc
ggagatagag
ggataaaagc
ttttaaaaca
tgatccaagg
agttatgaac
aaaccttcaa
gtctcataac
agacagcagc
tttcactgtg
ggttactaat
accttctggt
catcagcatt
acagtgacag
atgaggacca
gatatataac
gcagcttttc
tgttggaaat
tagctataag
tgtaatggca
atttttgaag
tcagttaatc
aaagctaata
ctagaagaga
tcacatttta
atgtgcatac
aaataactca
atgagtaata
gtaacaaaca
taaaattatt
aaaagaatgg
gaaagtaatt
ctaccttata
tagaacaaac
tgtgttattt
actcacacac
ccagtatctt
tttgtttgtt
ttggctcact
ttagctggga
agacggagtt
gcctcggcct
gtgttcttaa
atcaatgact
tattcccctc
ctgatcaaca
tttaatttta
ccctttcagc
gggcattgag
ttattttccg
ctgtctcttt
ctccttccta
gatatcacac
cttgcaaaat
tatacttgaa taatcaaatt agctttatgt tattaaaagc agagtaaaga agaaacagaa tcacaggact agacagcacc tgtctcatat ccatgcagca tggaggggac taaacggaag aacagattct aatagatggc cattggacta ttccatcttg caagagaaat agatttcatg tcctcacgta accattaatg agcatcaccc ctgtccattg acatctggtc catctataaa tcataaaagc tcagtaagtg caaagctaaa gaggtacatc caatgcttac aggcaggaac aagaatttct taactgtagg taagatgaaa gcagttaaaa ttgtcatgag aaaatccaaa atattggaat gtatattttt aggggcacat ccctggggtt aactctcttg cagttaatgt gcagaatgaa gagggaaaat tgcatctgat attcaaggga tgagatggag gcaaactttg ctacaggcgc tcaccgtgtt ccaaaagtgc ccttgcatct agcattctag ccctctcaca tttagcccgt tttatttatc gcctttcaan cagaaggcac nacctcctct cttccattta aggaccccca actccccatg cgcaaaattt
- 117 -
008252
atttagcaga
acagtggtaa
aatcacagca
ctttcagttc
gagacataaa
agtttagagc
gagtcagagt
cttctccaga
caaaatagtg
ttttctagtg
atccaaacag
gaaataaatc
aagaaagtaa
cccttcattc
ttaatgaatg
tatcatgcat
aaaaaaatcc
gcaagataaa
atgcccttaa
aaagtcgaag
atcagacagt
ttatcgattg
taatcctcaa
agataagcaa
tgctgccccg
agagtagcca
taaagtctca
gcatatcctg
aaaagaataa
gctgaggcag
aatcctgtct
cage i. а с u eg
aagecgagat
aataaataaa
aaggaatgtg
gtctagtccc
ttgaatgaaa
tactgagctg
ctacttttga
tagcaagcaa
ctaaattcaa
attaatttct
ttctaaatta
aattaatttc
gaaaaaatta
caagtegtea
atgatgactt
agaaaatgea
actcacttct
aagaaatata
gtattgacta
tattgattta
acccctgtat
cattgagatt ggtttgggga acttacccta ctacttccgc agaggegaca tggaacagat gagtgggatt tttgcagatg tttaagaaga gaatgttagc aggtgatgtg acagcaaaaa aacatttggt attgtacagt tcattggatg tttttattag agaataaatg ctatgaatca cactacacga gtaaagccag cgttactttt catattatgt aatcagccca gaatgaactc tgtgctgagg gecatgagta ttatgatgat caacatggtg atgtgggctg gcagatcacc ctacagaaat
ccgtgattgc ttgacaacat tttagaaaat tgnttcccac ctgtgatttt aatgeagtea agaattacag tccaccatac aaattcaaaa attatttccc ccagttagaa aacaccatcg acaagagatg caggtaaaaa ataaaactca tctttagaat aaattcaact agacattctg gctgtatatr gaaataataa gtaattactg gcctggcacc tggggtatca tcccagagcc ctgaagcctg accttcattc ggaagaaaca acctccctct ggcgtggtgg tgaggtcagg acaaaaatta
agtatgggtg
cctaaaagcc
gtgtcttccc
ttgctcataa
ctgtaataac
tacattttac
agaactcegg
ttgctgtttc
acaatttgea
tttagtgaaa
agaaagcaac
aactggtgat
agaacaaaac
ataaaaaatg
tcctgaaaag
catcagaata
gaaacagctt
aaaataacta
gtggatcact
acactgtatt
tcattactta
agtgaaaagg
ttatccctca
tcttaccagc
tgctcttgat
ctgtggcttg
catcttccaa
tgtcctgaag
ctcaagcctg
aattcaagac
gctgggcatg
gcaaggtggg
acactgtcga
ttttctgaat
acatatgaga
actggaaatg
ccacacaggt
gcagaggcag
caccaaaccg
aagcttagtt
tgctgatggg
acaaaatata
tccttgtcat
tattcaggtg
ttcagtttgg
tcacttagga
aatgacaaaa
atagcagagg
atagaaaaga
ttgcctgttc
cttatggtga
ggacaactgt
ttttgeatec
gctgatgagt
cgcatttgga
ctacaaacta
tcaggacacc
aagagtgacc
tctttagaca
taatccaagc
cagcctgggc
atggcgggtg
tgggaggcag
agcaagactc
aataataaag
gggttggtct
tggtgcataa
ggcaatgcag
ccagaaaaaa
tagagatgtg
aagttttgtg
tgtaatgtat
tatgaatatt
tgattttgga
ccttattagt
aatattagat
atgctaagaa
taaattaatt
ccagatttcc
ggactggtat
ttcttctttg
cataaatcag
ggagttctgt
taggaatcat
agtgacacaa
acttacccca
cataaaagct
aaattacaga
ggggatctga
gctgaactca
tcttacaact
ttattcctaa
gaagaccgtt
ecatatatge
gaccttttaa
gttatttgaa
actaaacaac
agtaaatege
gcccattttc
aagcccacaa
catacaacat
tatatattca
ctaattgtcc
tggntatcat
attgtgtttt
ggggagaatg
agecatgtet
ctacgttacc
tggtccatta
tgccatagtg
agtcttagaa
actttgggag
aacatagtga
ccagtaatcc
agg \_acagu
tgtctcaaaa
agtaaatgtg
ctggctttaa
tatatgttag
ttttataagc
ttagtaaata
ggagagaact
tgtatttgaa
agetacatge
taaatttget
aatccacatt
ttntctttac
aagaaaacta
caaatttaag
gggectttea
tatattccca
tttttacaag
aatttgggta
ttttattaaa
getteggact
ууаууи> -,уау
tgagccactg taaataaata acgtccactg ttgtattctg gaatataaat taaacatctg tgtaaaatta aagaaaatat aatgccgtga gttgtgtatt tcacaaatta tttattagaa taaangcttt gctccacagg gtaatcttca gaaaactaag gaagaacgta ctgtagctgt taagctatgg gaaatatcag ettgetgaaa
aactccagcc aataaataaa caaactgatg tattctgtga attaaacaat ggcaaggatt ggtggtagac gctatttggt taaggcatgt tgaatttact accaacaaat tgtgacataa tctatatata agttaacatg tgaattgett gtaaagggtg attatgagta tatttacttt actcagctcc ttattatttt taggattgac
tgggcaacag taaataaata gccccttaag gacagagagt gtacctggga agagataatg acatcatggc atattttagt gtttgetata ttctttgaga ttatacaagg acagtattta tcctccttaa tggattttgg ttggcaacaa attgagtctt ttgaaatttg tgtggtattt ctgtgtgggt cntcactggt aat
<210> 2
<211> 237961
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> экзон <222> 43726..43868 <223> экзон 8
- 118 -
008252
<220>
<221> экзон <222> 43998..44102 <223> экзон 9
<220>
<221> экзон
<222> 52093..52179
<223> экзон 10
<220>
<221> экзон <222> 77568..77699 <223> зкзон 11
<220>
<221> экзон
<222> 98226..98393
<223> экзон 12
<220>
<221> экзон
<222> 106567..106758
<223> экзон 13
<220>
<221> экзон
<222> 144109..144246
<223> экзон 14
<220>
<221> экзон
<222> 159794..159868
<223> экзон 15
<220>
<221> экзон
<222> 191292..191428
<223> экзон 16
<220>
<221> экзон
<222> 192967..193108
<223> экзон 17
<220>
<221> экзон
<222> 211540..211613
<223> экзон 18
<220>
<221> экзон
<222> 225006..225107
<223> экзон 19
<220>
<221> экзон
<222> 225544..225613
<223> экзон 20
<220>
<221> экзон
- 119 -
008252
- 120 -
008252
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223> аллель 166087
99-79322-224 : полиморфное основание G или Т
аллель 166336
99-79322-473 : полиморфное основание А или G
аллель 235894
99-79306-182 : полиморфное основание С или Т
связанный праймер 51031..51051 99-79335.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 51539..51559
<223> 99-79335.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 60925..60945 <223> 99-79336.ри
<220>
<222> 61354..61374
<223> 99-79336.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 80271..80290 <223> 99-79338.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 80700..80720
<223> 99-79338.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 91037..91056 <223> 99-79339.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 91466..91486
<223> 99-79339.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 100285..100305 <223> 99-79314.ри
<220>
<221> связанный праймер <222> 100764..100784
- 121 -
008252
<223> 99-79314. гр комплемент <220>
<221> связанный праймер <222> 106568..106585 <223> 99-79316.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 107000..107020
<223> 99-79316.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 165864..165884 <223> 99-79322.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 166381..166401
<223> 99-79322.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 235713..235732 <223> 99-79306.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 236190..236210
<223> 99-79306.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 51071..51089 <223> 99-79335-60.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 51091..51109
<223> 99-79335-60.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 61274..61292 <223> 99-79336-369.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 61294..61312
<223> 99-79336-369.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 80583..80601 <223> 99-79338-332.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 80603..80621
<223> 99-79338-332 .mis комплемент
<220>
- 122 -
008252
<221> связанный праймер <222> 100466..100484 <223> 99-79314-201.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 100486..100504
<223> 99-79314-201.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 100490..100508 <223> 99-79314-225.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 100510..100528
<223> 99-79314-225.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 106706..106724 <223> 99-79316-158.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 106726..106744
<223> 99-79316-158 .mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 166068..166086 <223> 99-79322-224.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 166088..166106
<223> 99-79322-224 .mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 166317..166335 <223> 99-79322-473.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 166337..166355
<223> 99-79322-473.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 235875..235893 <223> 99-79306-182.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 235895..235913
<223> 99-79306-182.mis комплемент
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 51078..51102 <223> 99-79335-60.зонд
- 123 -
008252
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 61281..61305 <223> 99-79336-369.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 80590..80614 <223> 99-79338-332.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 100473..100497 <223> 99-79314-201.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание
<222> 100497..100521
<223> 99-79314-225.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 106713..106737 <223> 99-79316-158.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 166075..166099 <223> 99-79322-224.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 166324..166348 <223> 99-79322-473.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 235882..235906 <223> 99-79306-182.зонд
<220>
<221> признак ошибки копирования
<222> 6485,14 24 6,14248,14250,14252..14254,14256..14262,14 969..14 980 17712,18786,19477,194 96,21043..21064,21547,24 607,2494 6,24974 25072,25124,25136,25142,28843,31239,31372,37750..37751,4 0488 46542..46557,49309,49326,49357,49395..49398,49400..49402 4 9408..4 9409,56275..56280, 6104 8, 61050, 61059, 61856..61857 618 60..61861,64842,66307,66326..66327,69835..69840,70893,70905 73279,76154,76354..76355,76371..76372,76407..76408,77095 78933..78934,79363,89491..89492,95836,95838..95839,95841..95842 95958,96966, 9704 9,97067,97078, 97292, 98642,98712..98713,98716 98740..98741,101368,101373..101374,10137 6,101378,101401..101403 101406,110014, 129061, 129066,129973..129974,135336,135345,135359 139924,147368..147369,147469,147507..147510,147767,151694,151729 163111, 164480, 1697 64, 17334 0, 173390..173391,173398..173401,173407 173414,173419,173426,174800,1748 94,175041,175486,176256,17724 0 178864, 181149,181154, 181230,181287, 183433, 186606, 186648, 191065 191267,193117,193203,193223,193380,194051,194053,194057,196577 198388,198655, 198828, 19884 9,198862,199667, 199693, 199701, 199704 199747..199748,201117,201224,201226,201314,201410,202524,203887 204 396,204 939,205891,205930,205998,206908,207363..207364,210938 212018,214253..214254,217022,217333,219027,219909.-219912,220924
- 124 -
008252
222620,222882,223870,224 902..224 903,224911,224 914,226899,226915 227232.-227233,227415,228441,228446,229373,229471,233305,233405 233512,233601,233629,236096,237468,237471..237472,237478..237482 237486,237488..237490,237492,237495..237496,237498..237499 237504.-237507,237509 <223> n=a, g, сили-
<400> 2
gatgttaaat aaggcgataa aatatgagga agaaaaatac ttttattcaa attataatgg 60
gatgtaaatt gaattttgtt gatgctgctg ctaaaaattg attcatcaga gttaaatgat 120
attaaagcat atttcatgct accatatgtg atatcagatg agaactttac aaataaatag 180
aaaacagaaa gttatatatc tacaaccatg atttattaca gaacgtatat ttttactgca 240
gtcataaaag aaaaagccca gtaaagacta atttgtaaaa tatgtaattg agatttataa 300
tgctttcaaa aaaaaaaaag caccaagggg tttttctgat gcatttatct tgatgtttac 360
tgttgccata ggaattactt attgattttt atgaaaacac atatggaaga gagaactaag 420
gcaatagaat tcaactaaaa gggcttcatc tatgataatt ctgtttgctc tgataaaaat 480
tcctttatca tggaacaagg aaaacctgac atatttttgt tgagtcgagg acaagatcaa 540
gaaacatcct atgaggaata tttgtgaaaa ctcttagcca aatgcaagga gttttatcct 600
tgtatcttga atcataagtg cccctaggtt acatgaaatg tgtgcttgag gatttttaaa 660
gggactgtct ttaggtttct caggttctca aatagggcca cagacttact taaactgaaa 720
ttaggtgtcc agatattctt cagaatgtta ggaagaaagg agtttaaagg cagaaattgc 780
aggcatgact ttttaaaaat aaggttgtcc attgtctgct gaaagatgtt taggagttct 840
tgttgaatgg atgagaaaag atagtgacta gaggagtttt tcatcagaca gtgaaaggaa 900
attttaaaag taaattttgg agagcataaa gtgatgattt atttcatgtt atatgtagaa 960
gacagtgttc attggaaata tctagtggat tccaagaaat tagcattttt atggttgtat 1020
tttaaacatt tataagttaa aaaagtaata cttcaaataa tgtaagagat ttaatgattt 1080
aagaaagtaa taaattctgc catatataat tccctccctc cttccctctc ttcctttctt 1140
ttctcatttc ttctcccctc tctgtaagtt tcatggtatg ttataacatg tttttcattc 1200
ttcccttact gatagacatt taagtggttt tcagtctttc cctgcaataa gtaatgctgt 1260
gttgaataca ggcatatata cattctgtgc tcatgtgtga ttatgcttta gaacagattc 1320
ctagaaacaa tttctgggtg aaatgatatg cacattttta atatgagata gctggcggtt 1380
4--,^4-4-*-+-> -+--* ^> ~ _, 4- 4- ~4- ~.t- ^--. *- I--.4- 4. -.-,,-,4- 4. -, 4- 4- 4- 4- 4- 4- Л А Л Pt
" w i_ ъ" ъ. h. u ua сшауа.аауу a. - .atay La w UVJ \_-\_- U, L. ua fc. k.y -.y .yoy \-y aa i" w ь. u, v. а i_ а -л v
aatacaaggt attctttttc aatatgcata aatattgaag aaaaaaaata atgtaggcat 1500
ttcgtattcc gtactctgta ctcttctgaa cactggcagt ccattctctt cttgaatgta 1560
tgtattcatc ccattcttcc tggaatgcct ctctccattc tcttcttgaa tgtatgtgtt 1620
catcccattc ttcctggatt gcctctctcc taccgctccc cctaccccca tctcctgtga 1680
ctcacctgtc aggacctact caggtaagtt tcccctaatc tgccagcagc actcatctcc 1740
cttctgtctg aactgtgata gcaaggtttg.tgcatcaaag tggacacttc gttacttcgt 1800
tctacatgtg tcccaccgtc tgggagtgtg tgtgtgtgtg tgcacacgtg cgtgcctgtg 1860
tgtgttttac ccttatgttc tggattcgtt cattagaccc agttgtctca ggtgggagca 1920
gagcctcagg cacttctttt gatgtctttt ctcgctctca ttgaactcgg tatatacttg 1980
aggactggct gatcacattt atgagaattt tatatttgat agattgcctt ttgaaaatca 2040
tcattctgca gaaatttagt aattgaaaat ttaaatcaaa ttcaaataca actctaggct 2100
ctaatttcac tgttcgtttg aatgtatgac ttctctgtta agccagatac tcacgtgaaa 2160
caaatgtgaa tagaatagca tggaaatcgt gtatggacag tcaaggaaac tttctctgct 2220
ggcgacagca gcctgcagaa cataattccc tggacactct atgaaatcaa atccgtttta 2280
tcaactaatc agttggagca aaaaataata atagtgttat ttaggaaagc cgtaacacag 2340
ctcttacctc aaggctaatg aagacctgac ccttgaactc taggggcttc catgttccag 2400
cttgtgagcc ctgctttgcc aaaaccctgc tgaagaggta agagcctcct tctctggaga 24 60
gaaagccccc agcctttgac aaagtgcttc tagcctgagc catgtgggct atgaaaaaga 2520
agttggtcat cccgaggagt cactggacag tggagagagc ccatccattt ttctccttta 2580
ttcttcccta cccctcagct ctcactccct taggacttgg gattctggaa tcataaaagc 2640
a a a a+-a 4-+-r-4* a a a +- a 4- a -.4- a a a a r* a 4- /-/-4- a a a 4- a a y-> +- +• a a a 4- a 4- -i/-"4- a a a 4-a a a a 4-4-a a a "Jl ПП
-"-•-(-.-.UP-.-> w> h, U-BaUt-wUvV.-I -* -l"wt*V_ywbU Ы-*\-_ftU.WU-* -I-IW-fw-b-b-U Ub-ULwl-awWb. t- u _. г v v
actaaaataa acgtattaga ataaatcatg aatggctaat aaatataagc tgccaccatt 2760
aaaacaaaaa taacaaccac taccacaatt gctactataa agattattat tgatcagctt 2820
tatttttagg taagtagaaa agtgagatgt atttctattt ttctgagaat gtaaccattc 2880
tgaaagaata ggagatactt tctcacagta agcagaagaa tgagatgtac tcataaataa 2940
tatattcaac aaacagttat tttgcactta ctctatatag gtactgaaaa tagaatgatg 3000
ttaataaata tgaacagccc tcaaacagag atattaaaat aaaacaagaa atgaaggtga 3060
aataaattta gaagaaacga tggatcatta acttgtagta gttcttacag ccatgtgctg 3120
gatgcaggca tccctgtctg agtgtgtgcg tgtgtacaga cattgtttcc aaactttttt 3180
actataactt tgttaaagtg aagcgtgagc actccacatt tgctgcaagt ctcacttccc 3240
ctatttcctt tatttctcac atttacgtaa cttgtctaac ctctgaaaca aatgttttta 3300
- 125 -
008252
ttagttctgg aataagatct tttctgcttc gcttcaatta cgttgtattc ctttcctttt tcgtttttct tatcctgtgc tgagactcat tctcttctcc catatttttt cttgacttct atgaccacaa acactgggga gggggctgct ttcatgcttc ggcatttagt ggatgcctgg tagaacactt cagtgtgtac caaggaatct attctttgct ttttcaattc cctgcctgtt atctcaccaa tctaactctc catttccact ttgtgtttgc tggcttaaag gtaatttata caatcatggc
taatgcaaaa acagtagcat ctgtgtactt gtgcagaatt tggaatctat tttttttttt ctggtagttt ctaggcatgg gcctttcttc attctctcta attctatcct cttgttacca ccaaggagga tagttcccaa tagctgagtc ttcatatgtt atggtaaggt gaccagtttt ttaaacaacg ccaaaaaccc tctatcattc gaactcttaa caacatctat cttttatctt acattttaaa ctttacaata ggctatgagc tgcagtttca aatatattaa aagaaaaaga acaaggtgaa
w -i .ywjyyy.a
cgtgaggctt tacctcccac atgacatttg ttgcattatg ctgatttctc tctgcttttt cctttgtaac tgcctcccaa agtacatctg caaactctct aacttactct gaaaaaggtg gctgctaata ctctctctgt ctcccgggtt agccaccacg caggctggtt gagattacag gtaatgatgc atttttatac
t-att-т- rr-t-i-n '------- --1
ttttngctgc gtcaatttgt tcagcaatga taagcttctt ttcagcaaat caagtaaatt ttgtgcatac aaattgaagt tgtaaggaaa ctaatggtac
у у <-aay ay ay
attcaccatc tgaatccctc ggtggaaaca ggggcactgt tgaggagact tctgagctgg acccagcttt ctcctctctc tgaaccattt gaccgctgga cttttatcta tctaaataag acattatata cacccaggct caagcaattc cccggctaat tagaactcct gtgtgagcca aattttcctt ttatatataa
taatctttag aagttaagtg ttctgaaaat ctcctttggt tactgccaat tttttttttt ttaagattta atttttattt aattctggaa ttctttgttt ccatgtcttt cacaatgggc tttaaccaag agcagtgcct actgtgtgca gcccatacag gaagaggtct ttgtgtttgt gaaactcaag agggaccctg tccgtccctc ttttctctca aatttttata agattcctgt catgcttatt gttcattttc tcatttttca tggatatcaa tgtgttctca tttaatagat gaagtaaagg cctgtgcagg atgagaacag ccaggacaca cagctaaacc aaaattagac cttttgcccc aggccagggt gtagagacac tattgggacc ggcttcagct tagtttgctc tttccttgtg catagtccaa tatgtatata ggagtgcagt tcatgcctca ttttatattt gacctcaggt ctgtgtccag tctttgatat aatgcatttt
tgaatagtta gtaaagacaa taattattga aatattaatt aagcaaaata gtcctaggca agatatatta tgaactgaaa gtcacctagt agatgttgag
tgccaacctc aataatatta gtactgagaa gcagcaaata tgaaataaaa attcttacca tctcatttaa gaggctttcc cctcacatca atgcagagaa agaattacgt
tgccaccttc
ggctttaatt
attgattgga
aacaagccta
tggctttgtg
ccctttgtct
tttatctact
ggtttttagg
tctggaatac
aaatcgtgct
gggttcagtt
ggatttcatt
ccccagacac
gaggtggagt
aaaatggcac
ccaaagttca
tctttgtttt
gtgcaacagt
ggttacactc
caagagttgt
gtgtgtctag
cctaatattt
tcttgctgtt
ttagaatttg
ttgtgtggtt
ggggtactct
ccgttcttac
tgctgctaat
tcacagttcc
tatgtcttac
gaaad.gccc
cacaggaaag
tggggattat
atatcaggga
tacacacttc
gcatggatct
tcttccagtc
ctcagctcca
cagaagccct
gctgctcaca
atgtagcttt
ttgatttggc
cacattgacc
tatattatat
ggcatgatct
gcctcccaag
ttagtagaga
gatctgccca
cctatgtttt
gatgcatcta
attaattaag
ttCCatt ?C€f
tgtgcagcct gagagcaaga caattccagt ttcaaatgct accctaattc tcttatgtcc aaactagcgg tgtaaagata accccaggtg cagaagcagc ttttattttt attttgtagc tgtcttattt cataaaacct ccgtgagtcg aatttgggtt ttgctgtctt gtgaactcat tattatcttc tgattaatat ttctaacttc gcttggcagg actggcaaca aggtggaaac gcaggcaggc ataagctctt tctccagctc gcaggggctc taaaagtgga ttgatccttg ttacgtattt actgctattt ctatctaatt ttctttctaa tttctaatgc tataatattg ggcctgaact tgatactcgt aaagacatac acatggctgg ttggtggcag
иииаиаааач-
actcgccccc tatgggagct aggagaggtc agttggccca ggacagaagt cagataaaat acttactgtc gaagatttat gctctgattt gagataattt atagggtgag taaagcccat ataatttttt cagctcactg tagctgggac cagggtttca cctcagcctc tatattttta tgattttata cattagttct
gggaagacaa gaatgagaca ggattaagat ttcactttcc agaattacct agtaaaacaa tgattgtaaa cttaggatcc tgacatgtta tcttagggga
gcttttgtta
3360
: tggctaaata
3420
ttgataatta
3480
gagatatgtt
3540
aattttaagg
3600
ttttttaaca
3660
atggtcttag
3720
tctctgcata
3780
tcaaaacagc
3840
ttgtttttat
3900
cctctatttt
3960
tgggagtcca
4020
agtaagtaga
4080
agggctttgt
4140
acagctgttg
4200
ccctgggcag
4260
aggcatcccc
4320
ggcttcttcc
4380
tagttcttca
4 440
attagttgca
4500
tcaagctcaa
4360
atttatcgaa
4620
ctgtttcaaa
4680
tcttttcttc
4740
ttccatattt
4800
gctatgagct
4860
gtgactgggg
4920
gttacttttg
4980
ttgagactgg
5040
ggaggcctca
5100
gcacatctta
5160
w укиауаu w _
J-.-, V
atgattcaat
5280
acaattcaag
- 5340
cttgaactat
54O0
ggtctggatt
54 60
caagcaacat
5520
gcagaacaat
5580
ttatattagg
5640
attgactcca
5700
tatattctcc
5760
atacattcaa
5820
gagggtaagg
5880
atatatatat
5940
ttgaaacagt
6000
cagcctcctc
6060
tacaggcgtg
6120
ccatttcggc
6180
ccaaagtgca
6240
ggattcccat
6300
ttctaaatgt
6360
taaaagttgg
6420
<- <-+¦ ? an+-a*--t-
6480
cacatcagca
6540
agactgcaaa
6600
ttgggatgct
6660
atataagtac
6720
aaatataaaa
6780
taacctatat
6840
tcttgacacc
6900
ttacattgta
6960
ttaacttatt
7020
cagagacagg
7080
- 126 -
008252
gctcagtgat gattatattc acctgtcatg gggtagagct acaatagtga gtattctgtg 714 0
gatggtccta tccagataaa agaaggaatt ggtttcagga catagtctgc atcttactag 7200
gtggggaatg ttggacaagt tacttaacct cttctgccct gtaaaatagg gataaaaatg 7260
gtacatatca cagagtgtca taggaagact aaagtagact attctcatcc tcacacctaa 7320
tgagttctca atatttaact gattataatt atctttacta gatacataat taattaaata 7380
aattaaggaa ttatagagca aatagtcata gggtcacaca gatagaaagt gggaaaaata 7 440
ggagacaaac ctatgtctat attcattcca tggcattaga tttagattac ctccttttag 7S00
tctggcaaaa cactcatgat tatacaatgt aatttaaaaa tatacagtac tttgctgggt 7560
gtggtggtgc atgcctgtgg tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gatggcttaa 7620
gcctgggaag cagaggttgc aatgagccga gatcacgcca ccgcactcta gcctgggctg 7 680
tagaacgaga tactgtctca aaaaagaaaa aaaaatacag tactcacatt ttactttgct 774 0
agtatatgct gtattcactg gtgtatgctc tcttgcatgg agactttcat tgggaataaa 7800
atgtttgaaa ctattttact atttcttgca ctgctttgag atactaccag caaagctatt 7860
tctaagctaa gacgctatgt cctggcagga cttctaaaga cttaaagcaa tgctgtagct 7920
gtgtatttac aactgactag agcagggatc agcaaaccat ggccagtggg tcaaatcctg 7980
cttactgcca gtttttgtaa acaaagtttt atcgcaactc cctgcccatt tgtttagaca 8040
tggtctgtgg ctgcttttct ccaacagcag aaaagttcag tagtttcaac agaaaccctg 8100
aggcccataa agcctaaaat gtttaccatc tggccattta cggaaagtta gccaaccccc 8160
agactagaat aaaggtagga aaaaccactc agcccaagct tcttttttga ttctatcttc 8220
ccacagctgc ctagaatcct ttgcagtctt tatcctagga ggctcagagg ctataacaca 8280
tctctaattt tgtctagatt tgtgagaatc catttctcac aaatccagtt ctggccctct 8340
ttccctgact cgatgttcct tgaactctaa acatgaattt ttaaaagaag gattacctgg 8400
gatgggtata tccctgaaag tcacctcctt tctgctgcct ctcacaaata cacaggctat 8460
gtgccttaaa cctgtcattc actttaagga atttttgaaa agtggataat aggttagaca 8520
taaaattcac tgaatctggg ttaaatttaa tcagtgagta ttctttagaa tggaagcatg 8580
agcctgaatg attaaagaaa ttgcttaaaa aattagaatc aaaatactaa atatcatccc 8640
ccccccaatg ttttagctag aaaaattact tgaaaatgag ccagagaagg agaaaaataa 8700
ttatcttaca gaaaactaat aaaaatacaa taaactatca tttatttaaa tacaataaac 8760
tatcatttgt taaaatacaa taaacatgca aaagcgctat cattgatagc acttttaatg 8820
tttaaataac ccactgatta ctttctctag tggattattt gcaagggtag agtaagaatc 8880
gttgcttctc tggacacata acccatttgc catgtgacat tgcctccctt ccaccaagaa 8940
gtggaatgta tttttcctcc ccttaaatct gatgcctata actttctttc cccttgagat 9000
aatggcagag tggcattgtg caagttttgg aactaaggtc ccacgaggcc ctgcggctct 9060
ctctcttgtt tatctgagta ctgccctaag atgaccatgg agagaagccc agtctagcct 9120
agaaaaggag aagaggccac atggagaact gaggtcagcc agccccagct gcttgacttc 9180
tgaacaaagc cttctccgac tatttggccc tgttagaccc agctgagatc agcagaagaa 9240
tcacccatct gaccctagcc caaattgcct tctgcagaac cacgggccaa taaatagcag 9300
atgctttaac ccaccatatt ttgcagtgat ttgttatatg gcaacatatc attgaaaaac 9360
cctcatttta ccaaagaagg ggggtcatga cattaagcaa ctacctaaac ccacaatgta 9420
aatggcaagt cagggattta gatgcaaatc attccaacta aaaatgtata ctctaaatca 9480
atgccctgta ctatactctg tattttccaa aaactaatta gattgtgtca tcagcatttc 954 0
tgaagacaga ggtagtcgtc tgggaagtag agttttctca accagtattt tgcacttgtt 9600
gggatttttg agatcaggaa tgttttggaa aacctgagat gtgcagtcac atctctgagc 9660
agtgttttaa gtttattcat tcactcattc attcattcag caaatattta ttgagatcta 9720
ctatatgtta ggcactatgt ttaccactgg aaggcaggca ccaggtaagt acaaacacag 9780
aaactgagat ggatggcatt gcattttcat ttgattacaa atttattctt gcttataagt 984 0
tgattaccta ccttattaag agctgatttg tttcaagttt tagaactcca attgtgtcct 9900
taaatttttg tctagcttaa aacatagtgc tagatttcaa gaagtaaatt gtcaaacagg 9960
tttgctgttt agtttttgta aaaaaggaaa cttgtaggca gaaacaaaaa ccaaaataaa 10020
taaaatctaa attatggtaa taactaaaga tagttgaggc attaacagag tttgactgaa 10080
ctctcaagtc tcaagcaaat ttctaaacta aactgttttc ttctgttaat cagtttaaaa 10140
gggaatacct tgtgctaatt tttcttggtg ttggtaacat taataaagct ctgtgaaatg 10200
aggccagaag gaacagaaat tgagtcaaaa taatgataac acctcttaca tattcttacc 10260
atcttgtctc ctagccacac acaccatgtt taaacctaaa aggagagaca cctggagggg 10320
ttaattagct tgcagctgtc tgtgactagt ctgcagagga taaaacggat atcagccgta 10380
agaaagcagc tagcactagc ctggatgatg aacaaagaaa agaagcagct gctgaggaaa 10440
agcacatttt gctgaccttt gaggagggct taagaggccc tttgccccct gaaaatggga 10500
cctgggaaga aagtcttgat ggcagacagt acaaaatcaa gggacagcag ctggctgttt 10560
tgtgtaaggg gcaaaattca agaggatttg tgaatcattg tgatttacag tgaccattaa 10620
ctattgtaat aaggagagaa aaatcaacat ccattcagtg cccacattgc aaattgccaa 10680
gcactggagg ggtactttca cctaggccaa caaacttaat aagcagagaa acccttcagt 10740
gttttggctc ctacagctca agtgtactag gttggcaagt ggaagttcct ttggtcatct 10800
ctgtttatac acttgtttga gatatttcat aaagtcagcc catttgttac tttatctgta 10860
- 127 -
008252
gtatgtgctg
ctgtacggat
ggaaccagct
agcccttcat
taagagctat
cattcgcttt
tagtgttgga
taggaagaga
accccatcgt
gatacaaaat
ccaaatcatg
ctaacttaca
ttgttaaaaa
ctgataaaat
caaaacagaa
gttaaatact
gttgagacgt
ttatgaagta
acttaaatag
ctactaagtt
tcagtgcctc
atggcagaag
gacaggcagt
atgttagtac
tatttttttc
taaccaataa
gactttatgt
taatcatgca
aggggacctg
gcattgtgtc
gccgtaaaat
aatacaaatg
attattcatc
attaatagta
gattataaga
aatttttaaa
ccaggcgcag
cacctgaggt
aaaatacaaa
tgaggtagga
actaaatttc
aacaacgctt
agtggtttct
catcaagtcc
accagatgat
taaaaattgc
atactgatta
attgtacatt
cgtactttgt
tcacacagtt
atacccacac
aggagaaatt
agaatggata
gtgtctgcct
cattaattct
tccggtcctc
aaaactttga
tgttgtttac
actatcacgt
ttactaatac
tctgtatttg
aaattgttcc
caatatttga
tttcatgtgg
ttaagccact
tgtccagaag
gctaaaaact
ttgtgacaaa
gaaaactggc
agttctggcc
ggaagtcaaa
ctcagcccaa
caatgtgcaa
agtgaactcc
agggatgtga
ctaaagttgt
attttaaatt
acccactaaa
tgttgcacag
gttacgagga
tacaagccat
aattatacta
aaacgttgct
tctacataga
aaaagttacc
gcacaatatt
atgtgactgt
ttcctactgg
ttgagcttac
tctgctcttt
ctgaggaaat
tggaaataga
gttcacatag
ttgtaatttg
gctaaggtct
agtctctacc
aactttttat
tgttaataat
ggtttattca
tggctcacac
cacaagtttg
attagccggg
gaattgtttg
aacctgggcg
agagattttt
atttaaatca
aaccttctgc
ttctttgata
tgttcttttg
agttatacac
gtcaaataat
gtcatatata
atagatctgt
aaatacaccc
cattagaaaa
ttttattttt
tacagttcat
tttctttaaa
tctccggtat
aactcacttt
atattattta
attttatttg
tggagtatta
aaaatagaat
tgcatactcc
tataatgaaa aagatgcttg
gagaagctat
tttaatcctt
ctcaataaat
accacagcca
acaagacagg
agggcagtca
ttgtccctgt
aatctcctta
aaatcacaag
cattcacaat
aggagctctt
tggggaacaa
ctggtgttac
atgttaactg
tagtatgagt
ctcaaaatat
tctaaccttc
ataatgcata
tcccatggtt
ggaacctatc
catttgaaaa
tgccttccag
ttccctgtct
attccattat
tatgttgagg
ggattaggct
acaatattaa
atctaagaac
caaattcagt
tttggcaaat
gtaattatga
tactattcca
attaagtata
ggtaagtcat
acaaaataga
ctgtaatccc
agaccagcct
catggtggtg
aacccgggag
acagagtgag
aaattaaatt
caaatgatag
tacgatatta
gtctgtttaa
gaattaatat
tgcttagcct
ttgcacacga
tttgtgcatt
gtgaattccc
catgaaatga
aaatcctata
tccatgtttg
atatttcttg
ctattaagac
ctccaagata
catatngntn
tatgaataaa
gtcattctac
atatacttgc
tactgggtat
caccagtact
cttgtaaatt
ccttttgata
gaacagacag
taaggaaaag
taagtattga
atatcatact
gatggcctct
ggcaggagaa
ttgcagatga
agctgatagg
cattcctata
tgcttcaaag
caaggagaac
attgtactta
aaagatttag
attgacatta
tgtttctatc
tctaattggc
acagtaaatt
ttttctgagt
ttctgggtga
tcagtaactc
aataccttat
aaaaggagat
tatcctgaat
aaaacctcta
ctgtaggcag
aattttcaaa
aataaatttt
atattgtaca
acagattgtt
cttgacaatg
gttatttaag
aattaattga
catatgtgaa
gactgttatt
gttatcttac
agcactttgg
ggccaacatg
ggcacctgta
gcggaggttg
actctgtctc
agtttcaata
aggttagaga
gacttcaaat
aaatattgaa
aaaaacatat
agcatgtgta
tcatttacac
atcagttgat
tatattccac
tatccagtta
agcctctagt
acttgtaaag
aatttaaaaa
agcaaagtct
acatgattat
tnnncnnnnn
tatacaccta
aattgattga
atgagtctcc
gcacattttt
aagaatgtat
ttagccaact
gtattccaaa gtgaagtttt gatagcaagc tgggacgtat gaatgggcaa ctcaccactc agaaataaag catgattgta caacttcagc caccaataac agagtaaaat tacaaaccac aaatatattt tgtttctttt tattttttgc atttactctt ggtgaccaaa tttttaccct gttaatgtca tgggtgttta ctatactact tttccaaaca tgcataaatg gcatggaaag tttgtatagg aggataagat agttattgac gaagaagatg tatgctgaat tgttaatgtc ctgagacatt ctaagaaatt ctgttttata ataaaatcat ttgttgaagt ttaaaaatgg gaggccaagg gtgaaaccct attccagcta cagtgagccg aaaaaaataa cttctataat tgaaactaaa ggaaagcaca ttaataaact actttaaagt tgttatactt atctgtattg ttgcacattg atgcatggac atgaatacaa tttcccaatg taaaacttta actcaattac tttttatgat gagtttaatg nntacataga ctccaggtaa tgccttttgt ttgtgtacca aatttttaat ctgttttcct aaatgagtgt ctgaccaacc
ggtattgcca
ccaatgcaac
ctcaaaataa
aaactggaag
ctattcaaca
ggtattcagt
tatctagaaa
aaagtctcag
agacagagag
acctaggaat
tgctagacaa
attgtgtaat
gttcttttta
tttcgtcagt
ctacaagcca
tgtcatacaa
ctggttgcat
tgtgaaattg
ttctgcttat
ctacaacaaa
gaagtcttca
cataacttac
tcatgagact
ttataaattc
ttacatgtca
tgtaaaataa
gaattatagc
taatagagtt
aacagattat
tattctagtt
tggcaagttc
tactgataca
attattattg
gattttttag
atgcttaggg
cgggcagtat
gtctctacta
cttgggaggc
agatcatgcc
aaaataaaaa
agttaaaaca
catatgagat
tcaaacgtta
ggaaacattt
aaggaatttt
aaaaatgtgc
ttcacattga
cacaccagag
atgttcatat
aggtttttaa
aattaatcta
gtaataaaga
ataagaaata
tatctacaat
tatgacattt
atatatggag
tttagtggtg
gtgtgtgtga
tgggaatagt
atatacttcc
cttagcatgt
gatttctatt
- 128 -
008252
cctttatagt
cactcaggtt
gacttgtgtg
attttaaggt
cagaatcgta
gacaaaagaa
atcaagaatg
atcaagaaat
cctgggaaag
gttagaatca
ccattccaag
aacaaggaag
catattccaa
ggcagtaaac
attctcctat
ctgtactttg
aatgacttca
aggggaagca
tagcttatat
agttgtaatt
atacgtgtaa
agtacactaa
aacttactgg
aaagaacaag
tgtgtttgag
gaatagaata
aattatcaac
cattttcaga
ttcttctatg
ttaccttttt
gaacgtatgt
taatcaaata
ttcagaaggt
agaagtgtca
cagtaggttt
tgggagaggc
gttaggacta
ctggctgtac
agattctgca
caggtatttt
acatccagca
ggtttattga
taatgaagtc
attctaaaaa
ttttgagttt
agttccctgg
ataaaaggga
aagtcatttt
cttcacatag
ttccaaatgc
acttgcagta
ctgaccaccc
actcactcat
aggctggtag
ggtgagaaaa
caccctaagg
aatttaaaac
ccacaaagaa
tcaatacgtt
atgcatatat
cattataata
ctgaggcttt
agagggcgtc
aactgatgag
tttttcttct
tgtgtctttt
tataggattt
cataggattc
aaatgtggaa
actttgtcat
taacggtgtt
tattattaca
aataaaagga
aataaaaaac
gatagagctc
gaacctgaaa
tgtctaatgg
tttaaaaacc
cagtattatt
gaatggaaaa
aaaacaacct
tttatttcag
tgaggaaact
gacttgcttt
ataatcatga
gatgccagga
attagttaac
attgattttt
gctatttttt
tttatataaa
gccatctaaa
caacaaatgg
ttctcatcat
accaaaaaaa
taacaaagta
attgtgtttt
ctccagcctg
ggcacaggat
tgcaggagga
gacaagccct
cttgggggac
aaatatactg
ccctccagtg
gcactttacc
gtttgaagag
ttcttcacta
tacatcatgc
tagggctttc
ggtggatttc
catgaagtac
cagaaattga
ttaagatttc
agcagcttca
tgcctggtct
cnaccgcagc
gcaccccgca
tgaaagtcaa
acttgggcaa
attctgtgac
ccagttgagc
aggatctccc
aaaaaataag
aaagaataaa
aagcaaacac
cagagtggct
catgtttgag
gttataatca
acgaattgct
tcttacatat
tagagttaat
taaacagaag
tttcacagnn
aacatcggca
gctctgcaga
atggaaaaag
gggatagatg
aaaaaaataa
tgaaagctga
aactggtaat
gatataaaaa
ttctttatat
gagcatctca
tgtcccagaa
taatctaaaa
aatgcttagc
catggttttc
gttattgttg
tgttcattct
agtgctctga
tatcatggga
aaaagaaaaa
taattcataa
agtaaaatga
ttcagccttg
ctgtatataa
aaaggtaaaa
tcacttcaaa
tatttaggcc
ctgagtattt
ggtgtcctgt
gaagcaagaa
gcagagaggt
gtgaccaaca
ttcctccatt
cagttctcat
gtacccagtt
cacaggtggg
taggcaggga
aaaaaaagat
ttaattgtat
ttattggtga
cttagttgca
acatatctgg
tgtcaaatag
cccctattca
ctgtgttcta
agccacagca
cagcgtgtct
ctgctcccca
atgctgcctg
acgtgccact
aatgggaaaa
aagtatatct
tcctctatta
tagataatgt
tgcacataac
tgatgagcca
cttggcccat
aaaccacaaa
agttaagcat
ggttcacatg
attggtatat
gaaaggataa
ccatgttcta
nnrmnrmnnn
tcattgaatg
ctggcaaatc
atatgcgaca
tagtaagaga
taggcgagtt
ctgcagtcac
ggacccttcc
tagagtcttt
ggcactgcaa
agtgtctgaa
tttttaattt
tccagcttaa
aaatttcttg
taagatcctt
ttgtaaattg
gtgctaatag
tcacccagga
aacataagaa
gacctattta
attttatatt
taatttgata
tttgttcatt
aatatacatg
cacatgcatt
atcatggttt
aatattttga
cattatttaa
gtggttgagt
catcaaacta
cctgataatg
gaggaaagag
.ttgtctgggc
tcatgtgccc
tattatttct
tgtttattag
tttctgtttt
gtgaggacaa
ccacaaaggt
attatcaata
tataattcta
gaattaatta
gtcttccata
gaaatattag
ataatgttca
gggagccggc
ggctgtgcac
cctggctcaa
ccaggccggg
ggctacagag
ggggtaatga
gtaaataatg
tcacagggtc
ttttagcttt
atttatgtgg
ctggtgagga
gtagaggtaa
atcacaggag
ttttttatat
cttcgcccat
ttgacttttg
aatgctggag
aataaggatt
acatttatgg
gtattgtcac
tcattgccct
agatattgta
agcagatttt
cattgtgggc
taacaaaaac
ttatactcgg
ttttcctccc
ataatagcac
aggtacaaag
tccttctaaa
aatgacaacc
actttgtatt
tatacctgaa
aatacctgaa
gcaggaaaga
gtgagacatg
gaatttggct
aaaatccaca
ggttagtttt
tatttcctga
atacatatat
acttgttgat
tcataaatgt
acgtatcttc
ctatgataaa
agcagaaggt
caaatcagtg
aaggggccaa
aggttccctg
tttctgagca
tcatccacag
cttgagatgc
agtccattca
gtttttattt
tatgagtcac
tcttgcgcag
tttaaaaatt
attgtagtgc
gcctcttcag
catttttctg
gctgaaagtg
tttctgatga
tgcttaggga
gcccatgcca
catggccaga
ccttggtggg
tgggcagaac
gtttccggct
agggatagag
tacttttgta
atcccggaag
aaaaaaaagt
gttatgtaag
aacataacct
gggtgtgaaa
tcgctaaagg
gtttattggc
tttccttctg
tctattattt
gcctagaatt
tggcttgtgg
gcaatagaga
ctataccatg
ttcttctaac
ttaatagggt
atagctatcc
atctgtcagg
ccttttgaga
tgtcttgaaa
ccactctaat
acagcaagaa
ctaacaacca
acagaaatat
agaggttttc
aattttagtg
aagttgtcgc
ggtagatttt
tggacaatag
agatgggcag
ttagggattg
gatgcttagg
cacagcagtg
tatgagtcca
aagaaaatcc
ttaaaatctt
ttgaaaatgg
taaaaacatg
atcgctttga
ttcatctttc
cttccactat
gaacaatagg
actatagcag
ctttctatat
tcctgctaag
atttgagctg
actcataaca
cttttgtcca
ttgtcagctg
tgtcataatt
taaacatcag
tttcttgaaa
cctactaagg
ctcaagagcc
ctaggtgtct
caatggaaaa
tcctgaaacc
gttcccagag
ctccatgctc
catgggatcc
gagcccagcg
ggtgaagtga
cagattaagg
tactacaaaa
aactgacatt
ggaataatct
cagaggtaag
tcctaaatct
gaacaggaag
agtagtttaa
- 129 -
008252
ttggttatat
atcacagagg
cataccttat
tgtccttggt
cagatcaaaa
aaatgtcttg
tatcanaaca
gtaaaataag
caatttcagg
agaaaatcct
ataaagaatt
tatttttaaa
gcatcatgaa
ctgttctatg
ggtcacctgg
aattttctcc
aaaagggtat
agaaaaattt
tattttcagt
acatgaaata
gaataaatct
ataaaatgtc
ggctgatcga
aattagacca
tgatgagaag
atctaagtat
acaactgtca
acatggaaag
ggagattttg
ttggtagctt
tgtttcattt
gtgtttgtgt
gatattaatc
tttcttgaga
gctgtttata
atagataagc
cctctaaaga
ctagtgatcc
aagaaatctg
cgctctcttc
tcgttttgac
tatttctcat
aataatgatt
attccttaaa
nnnnaagccc
tcgccagcat
gaacttaagt
aagctttgct
aaggctgaat
tataatttgc
aatagagaac
gtggtatgta
gtgactngaa
aggaaaatgc
catatgtttg
tttaatcatt
atgtgcacaa
ccattaactc
caccccacaa
ttcaattccc
tgctgagaat
tttttatggc
tcgttgttgg
ggaggaaatc
ccatcctgag
gggtttaaac
gtgcactttt
ttcttccttg
ccttcatctc
ttattattta
tggaagcaaa
aaatagccat
aagatgagga
tacagaatag
atgaaaaggc
actacttaat
ataatctaca
tcccaacctt
ttgcaatgta
attcttgaca
gatgtttgaa
aatgacagaa
aataggtaat
ggaatcctag
tgggtactta
actgagaggg
ttgtcatctg
gacatttatt
cttagtctat
cttgagtatt
aaggcaagga
gcactgaaga
aaaaggagga
ttaccctctt
ttactatatt
attatgatta
gattatatat
tcttaaatta
ttgtgcagtc
ataaaatatg
tgtaatatca
gttggaactg
tttaagggtg
aatttttctt
tttgaccaat
aaacatatta
gcctctctcc
ttccttagca
tgtcctcttc
acaggcaagt
cacctgcctt
caaagcctta
attttgtatt
tgagtgattc
cagctagtcc
ctattcaggc
cacctattcc
ttttccgtgt
ccctatatac
tgtgcaggtt
gtcatttagc
cagtccccag
acctatgagt
gatggtttcc
tgcatagtat
acatttgggt
tggagtgatg
cagtacaata
caatgatgct
cagatggaga
actttcatag
ataaaattat
tacaaataat
cttaaatgat
ttaatccctc
gatgaagcta
ctggaaaatt
atttaacaat
tatctgcacc
ggaagacata
tggaacattt
tacaagaaat
gggaatcaga
cttaagaaaa
agtcaggaaa
ttagatacag
gaggtcgccc
ggactcctct
attagtacat
ttgctgtgtg
gaatagcatt
agactaagtt
gggtgacttg
agaggagaat
cagatcagga
gtcaagtctt
agggtaaaag
taagaaacac
gacactagtt
taaatgggtg
atgtagaatt
agctgtgaat
aactatcttg
atacatgcat
atgccttccc
ttcagattat
tctaagttaa
ttttccctag
attaaacaaa
atcgttaacc
tctcactgga
ccgccagtgg
caacagattt
tgtacaggag
ttagtgggag
catttgaaaa
ctgggtttat
ccaaatatga
tgtaaaatat
tacattagtc
ctctgattga
atttttttat
tgttacatat
attaggccta
tgtgtgatgt
gagaacatgc
agcttcatcc
tccatggtgt
tggttccaag
ttagaagatg
ggaaattaat
tacgagggag
ttggcaagcc
catttccaga
ctctatgtcc
tatattttct
tcagaacaac
gaaaacaaaa
aaaaaaatat
aaggttaagt
ctaaaaacta
tatcagtgaa
attttaaaat
gaaaagcaag
ttaaaaaaga
gtgctgacag
tggaaanttt
gatgaatgtg
tgggtggtgc
taaccagtga
aggcaataaa
aatttaatct
ggagaggaag
gtacacttta
tgattctttc
acttctcttc
atatcttgtc
gcatatcaga
accaactctg
agtctggtat
cattagatca
taaaagcata
gtgtacacat
tctcccttaa
tcatctaggc
ttgaaattaa
gcatacatac
agtgagcctt
ctagactttc
aaccacattg
cattacagtt
taatgattat
cttttccttt
ggtacgttca
gaaccaacta
catatgcatc
tctgctgctg
gatctttgac
attgtcctgt
gtgggtgata
ttgtatttta
aggaaccatc
tggcccttgc
tgcagctagc
tttattatta
gtatacatgt
tctccaaatg
tcgccttcct
ggtgtttgat
atgtccctac
atatgtgcca
tctttgctat
caattgacca cagggatccc aagttagctt aatggctaag ggatgtctag tcacctgtaa taaaaagact tttctaaata tttggcttcg attgaacact
gatcaggtgg ctatggttac ttctggacaa gagggtgaat tttatgagta agatgttcta tttttgtaca tttgactaaa gttaattttt gtgcatttca
aiauaayyi-
catcaaatac
gcattttttt
ttgtaaggat
gaacatataa
attttccaga
atggctaaga
ctttgctgga
gaaacaaaat
cagtatgctc
ggtctctctc
tgaccttcag
atttgctaat
aggacaaggc
agagtggatt
ctttcattag
caagtcgaac
ccatcactgg
taggaacaaa
aacactcacc
ttctaagtat
attcttatta
gattagtttc
tcttactaag
tttctacata
ctactaccat
gtgctactag
ataaatattt
tgctggctct
tagaattaat
gcattttgtg
cgttaattta
ttatttttgt
gtnnnnnnnn
ggcagcatca
acaagtacac
caaatgacac
ctgggtttta
atgaaattct
gcatttgttc
ttgtggaaat
ctagagatag
tgccatagaa
tccaaaattt
taatgcctaa
tactttaagt
gccatgttag
ctatccctcc
gtgtccatgt
tttttgtcct
aaaggacatg
cattttccta
tgtgaatagt
а L Laia Lac L.
attatattta
tctcataaat
tagagtggat
actgaacatt
gtacaggtat
tttccatcca
cctcanataa
gttcttgaac
tgtaggtgaa
acttatgaac
ttagattgag
tagcatgatg
atttaagttt
ctcatatatg
tgacagagct
acactgcata
tcatttcagg
aaaaacaggc
tcagtagtga
atgctttcta
atgattactt
attaaagact
aaagttttct
gaaacttagt
ttcttcatct
atctatactg
taagaaggaa
tgacagtttt
gattatttta
aatatgatca
ctggtaatta
attacgtttt
nnnnnnnnnn
ctttagtatc
tctcaggtat
gttaaataca
atgaaactta
ttttgttcag
gaatatcgag
aagaggtgct
agaattcaca
taagcatatt
cacatgtact
tgacagtttt
tttagggtac
tgtgctgcac
cccctccccc
gttctcattg
tgcgatagtt
aactcttcat
atccagtctc
gccacaataa
- 130 -
008252
acatacatgt gtaatgggat ccaacttcca tttctccaca ggtatctcat tcatgtgttt cccacttttt ttctggatat cactctgatg gtcaattttg
~-/--. <"- 4- --4-
aacacgtaag cagtttcagc atcctttccc tggcattatt gtaccatgct gcctgcagct ccatatgaac cacatagttg tgtctctcag cgctcaacta atgaaggcag aatctctggg aagagaaagc aagcaagagc gaactgaagg ttttttgaaa gagaagaatc gaaatgcaaa ctagaagaaa gttgaatctc
gcatgtgtct ggctgggtca caagggttga tcctctccag tgtggttttg tttggctgca gatggggttg tagccgtttg acggtttctt gcttttgttg
4- -t -* 4- -*-.4> 4-tyaa .yy La u
tctttaatcc tttctacata catttcttgt tctgagggct gttttggtta ttgctctttt tttaaagtag gaagtaaagc accacagtgc catggaaact aaataaagat acacattcaa aggaaagatc aaacacattc aaatagagac agatcaacaa aaatagacgc ctaccatcag tggataaatt tgaatagacc
gaggaactgg cctaactcat aaaaaagaga atactggcaa ttcatccctg ataaacagaa gacaaaattc tatctcaaaa caaaaantgg ctcctattca aagggtattc atatatctag agcaaagtct aacagacaaa ataaaatacc aaaccactgc tgggtaggaa antgccatcc attcagttct gtttccttcc
t-arrt-l-t-.-it-t-rf --="------J
aaaatccttg taagtaagta agacaaagag gtgtcccttc agagtgtgca tgctctcctc agggaatacg aatgaccttg gcgagacaaa caatgacaga
taccattcct tttatgaggc attttagacc accgaatcca ggatgcaagg ccaaagacaa aacagccctt taataagagc aagcattccc acataatgtt aattaggaaa aaaaccccat caggatacaa cagagagcca tagnaatcca tcaatgaaat gaatcaatat ccatcaagag gactttattt tggtcaattg
annarnra r> f--ээ-------
ctttcatgga aaataaatag aggggaaggt aaggaaaatg gggcatcggg ctcatatgag attggaaagg gctattcctt actgatcagg agagactgtc ttatagcagc aatggtattt actagtttat cacctgttct atttgcagtt taaatgtctt tttgtttttt tcagatgaaa ttgctgtgca ccattgcttt
4- ~ ,-.+- -.-.-,4.4. L.LjvvLCiyVJLL
atcttgaatt tggctagcca ttttgtcagg ctgttctgtt ctgtagcctt ggcttaggat ttttttccag actcctcagc aatcaaacta gaacaacctg gttctttgaa agcagtgtgt caaaattgac aaaagctagc acaaaaaacc aattgataga aataaaaaat agaatattac cctcgacacg aataacaggc
- > --.-чи-
tctgaaacta cagcatcatc aatatctttg gcagcacatc ctggttcaac aaaccacatg. catgctaaaa tatctatgac tttgaaaact ggaagtcctg agaggaagtc tgtctcagcc aatcaatgtg aatcatgagt acttacgagg aaaagaggat cgtgaaaatg atttttttac ccattatatg actatatggg
a? n? rtfb ancr
--~Э " ~D---
gtttacaaat catgctacat gtgagcagga tagtagttgg agcagccctt gaggccaaca taacaaggaa ttaaatgaga acaactctgc ctaagagtcc
atgatttata ctagttctag agtcctacca ttcctgacat ctctgatggc cttttgagaa tcttgtaaat aattttctcc gaagctcttt tggtgtttta
atcctttggg atccctgagg acagtgtaaa tttaatgatt cagtgatgat gtgtctgttc ttgtttgagt cattttatag agtttaatta gacatgaagt
aatttttgta gttttcccag tttgtcaaag ccattgatct gtagtatagt tgacttggtg ttctgtgaag aaatgtaaaa gaactcagga ctcctgaatg accaacgaga agagggaaat accctaacat agaaggcaag tttcaaaaaa cctctaacaa gataaagggg aaacacctct tacaccctcc tctgaaattg
ttccaatcaa ctgataccaa atgaacattg aaaaagctta atacgcaaat attatctcaa actctcaata aaacccacag ggcacaagac gccagggcaa aaattgtccc caaaatctcc caaaaatcac gaactcccat gatgtgaagg acaaacaaat gccacactgc acattccata tgaatgtgtt aaaatatttt cstttgstcs tctaccaaag agtaataagt attgcagttt gaaggggcaa gcaaaggcct ggtcttgaat tggatcacgt tggaaagccc ttgctgggca aggcgagaga
yy yV> LLLLOLLJkJ
taaggtgtaa caccatttat aacagatggt atatctctgt ttgaagtcag atgcgggctc aaagtcattg gaacagaaat ttaagaaact aatactgggt acaaagacac ttatagcact cacaattaaa aaatagctaa ttaatgaatc gactaataaa atatcaccac acgcaaataa caagactaaa tggcaataat
331 Ct"CC3
tagaaaaaga agccgggcag atgcaaaaat tccaccatga caataaatgt tacatgcaga aattaggtat ccaatatcat agggatgccc ttaggcagga tgtttgcaga ttaagctgat aagcattctt tcacanttgc acctcttcaa ggaagaacat ccanggtaat tgtgaatatc tctttactat atccattcaa
tatataccca aatcgccaca agtgttcctg ggtgtgagat gagcattttt atatccttca tcattgtaga gttccctatt aatcccattt ctttgcccat
4- 4- 4- 4- -i fr~-4- <-"+¦
ggaagggatc taaataggga tgtagatatg tttggtacca gtagcttgat ttttttggtt gtagcttgac tataacaaac cactcaaaac acataatgaa aacataccag aaatgcccac agaactagaa aatcagagca caggagctgg gaagaaaaga cgatcccaca actagaaaat ccaggaagaa caatagctta
nai/-irf4" araart
gggaatcctc agacacaacc cctcaataaa tcaggtgggc aatccagcat aaaggccttt tgatgggacg actgaatggg tctctcacca gaaggaaata tgacatgatt aagcaacttc atacaccaat ttcaaagaga ggagaactac tncatgctca ttacanattc ctattttctg ttttctatca tattcaaaaa
raanant-iraa дддг-апаАаэ
gaaacaggaa gtcaaggaga cagataaggt gtcacatggc tgagaaggaa gaagctatgg agagccttcc gtggagcatt gagaatagaa tggcagtggc
ataatgaaaa aaaggaaagc ggccatgaag tctctgggga gcatgcccca agaaagagaa agggcaacgt ttgagtagag tcaagggaag ttggacaaag
- 131 -
008252
gtggtagcag tggaggtcac agaagatgct gaatatagtg ttcatgttta ctttatggga 26040 tttactaaga gattggctgt gtgttaaaag gaaaagatca ttctaaagct tctggcctca 26100 gtgattagat agacttgcca ttaacttcca gaagagcatg tttgagggga aatatgagga 26160 tctcggtttc attacatgtt aagttccagt aatgtgatta gattgaaaat gctatagctg 26220 gtagaatttt ttcacttttt atgtcaaaac agaaaacatg attgaataat gaaaactaca 26280 catgctcaat ttttttaaaa ttgttttctt tgacacagta aaggatcaat gagacttgct 26340 taattcttgt caagaataca aagtcaacaa tggctgagat gaaaatattt tccataaagt 26400 aaaatgatca aatttgcaaa agcttggtta catgatgtga atttcactca aaccacaagg 26460 cattacacta gagtcttgct gaaatttaag acagactgtc ttaggaatta tttgccaata 26520 gacaaaatga atatggggtg gttgatgtgc tgaagtggcc aatgagcatg ctttgattga 26580 cagatgagga aatgtatccc tacattttat caaactatgt ggtgtctgat ttatatcact 26640 gaggtggcca ttcattatgg tcatgaactg tgaggtcaaa gcacttgcaa aaacttgcca 26700 aaatacttcc tattccagta ctaaatattt ctcatatttg tttgcctaga ataacaagat 26760 gcaggcttgg tagtcctttc aagaatgtga atttctttgg tatgtctgag tttagtaatg 26820 ttgaattgtg tgtgtgtgtg tattattctt aagactttgc ctgtatttta acattttatt 26880 tggtaaaaat agcattattt tggcaagatt tttaaagcct tgaaatggga caaattaaag 26940 tataatgctt tttcttgaga aataatttat tgctccatgt tgttgaatca taccattagt 27000 catgaaacca aaaccctata tttaaaaagt aacaatctca tattcaaagt atctcctttg 27060 aacatttcaa agaatcttaa gcaaatcttt atgtgacatt aaattgtaca ttttaccttg 27120 ttattttaga tctatgggtg gagttcattc ttcgggctaa gtgtaggtat gaagtgtgaa 27180 tttctgtgtc ttggtatgcc agtaacttag ggcaaggtta gtagagtggc ttttgtgaga 27240 aaaaaagagc tgttttatca gacatcagtt ggaactttgc cttgttttgt ttccctgaac 27300 cgtccaatct gcttcatata cttgtgtgaa atcctaaaat gtctgtatgt caataatttt 27360 tagttagcat attttttcca aacagacatc cttgtgaaca tcagccgttt ctgagaactg 27420 ggcccacgga ccatagctac tttgagtctc agtctatgta atagttgggg taaagtaagc 27480 tttaaagaga gaactcacaa cacaatggct caagcaagac acaagttgat ttctttctga 27540 agctgccatc ctgggtatgt gggtatttgg atgagctggg ccccatgaag tcatcccaaa 27600 gtgcaggcct ctgtggcatc tctgccaaac tcaacactta ctctccaagt ctgtccttgg 27660 cttctctatt tctagctggt ggaagggaag ggaaaaatga gtccagggaa ggagtttttg 27720 tagatggctt gggagttgca tacatcagga agaactttgt cacaaggcca caactccttg 27780 caggaaattc taggaaacat attccctcac tgagcagcca tgcgcccagg aagaagagaa 2784 0 gaatgagtct agagtcgcaa gcagcaatat ctactacagg cttaaataac caaaggacaa 27900 aatgcccagt ccattataaa tatattccaa aaatgaagcc atgaaatttg acttcattta 27960 ttgaagtcaa aacaaattta ttgttatgaa ctaatttctc tattttatat ttctcaaatg 28020 attacatttt taacacagaa caaagccata gttagaattt cagtaatcgt atggaatatc 28080 caaaaggtac acccaataca cccaaaagct aaaccagagt cactgctaaa ttttatattg 28140 ttctgattta cctaacagat tagtgaaaat aattaaaatc ttgctgcttt ttaaatttta 28200 aatatcggat tttggttaga actctaagaa .tatttaaaac tatctttacc tactcttgtt 28260 ggacaatcat ttgaggagct aagagtgcag agaaggcaga gaaatgttct cctcaaccca 28320 agcaaaagca cagaagaact attgctaatc caaaatgcag gaaggaaatt tcacccctcc 28380 tcccttccct tttcttgggc tagtctgttt aactttaaaa gcagaatttt tgctctcaca 28440 aagtatacca gacaggaatt tgttcaaatt cctcaaaacc aagccaagaa aagtttcaga 28500 aagttcagac atgcatggca gagtggaaag aacatagtct gtggaggcga gcacggattc 28560 attggaatgc cgctccagac atccactctg ggtgaactca gggatgtgtt tagtctcatt 28620 aagccacagt cttttcattt ttaatgtaag agtgataaga acgacttgcc agtgtgttgg 28680 tggagaactg aaatagagaa aggcctggtg tgtaacagga tgtttctctc catctgtgta 28740 atctgtgaca gtcctaggaa gttcaaagtt atgactgttc tgggtttgtg gccaacagtt 28800 gtctgtggct tccatgggtt ggagctgtct aatggggccc agnccaccat cgctctgctc 28860 agaagctaat cataccaaaa catgaggttt ttctccaagc gacaaagagg ggctaagcac 28920 ccaaggatct ccataatagt agcaggaaaa tgaagctgag accttaccct gacttagaag 28 980 ttcataacaa taatggcccc aaacaagatg ctcatgtcta ttggttgtgg ttaataatca 29040 tgcaacaaca tgaacttcaa acccagccta tgcttggctc ttccagggac tgaaggcatc 29100 tcagagcccc accccttacc tcagaaaccg caggaaggag cctgggttct cagagtccaa 29160 gaaaatgcac ctgataatag cacctgaact tcctccacac aaagaaagcc tgatagggac 29220 aggggattaa gcttgcatgg agggcaggat ccaacccaca gtagcacttc cttgccatgc 29280 gaccttagca aatggcttaa ctcgctttct gtatcagtaa aatggtgttt gtagtactaa 29340 ggtgtcagtg aggattaaat gagccaagcc tgacccacag caattcatga caagtctcag 29400 ccactttaat gaatgtgatg atattctaac gtttgggatg ctgaggtgga ggacgatggt 294 60 gtcccacctc ctgcaaatgc catgtgaaca ctgaagctac acaagcaatg gctctaaagt 29520 caaagccagc atcaggactg gtataaaaga atcaccagga caagggcagg gcagagggga 29580 ggccaaagca gctttgtcag tgcctgcacg gctggaccta gaggaatttc tcgacataga 29640 gggtaaaaca acccattggc ccacatttct gaggaccgac gtgggagaag ggtcacatga 29700 ggccatgaaa tgggcatctg cagaggaaat ggaagccagt gtctggagac aagtggagcc 29760
- 132 -
008252
attgagctag caagggaggt tctgcagcct catggaaatt ctggccggct actcttccct tctctctgct taacatacct caacacagag aactttaaac caatgcgtga ggctgagtct cgggagctct aatctggata ttcaaagtct tttacatgtg ttgttacttt gtgtttcatc tggctgcttt tttaaaattt tagatactgt ggcaatgagg ggcagctggt gtcccctcct gctgacctct tttcctcttt cctttgccca tgccaggcac catggagttt ggacaaactt gggaagggat gcctggggca gtgggtcacc ggagaccctc ataattgtgg gaatatttcc tttaatctac tggcccaggc acaatctaca ttataaatac gtggggaatg tccttagtca aactggcctc caggatggca ctcttcacat accagcccct attttatgtt cctaggaata aagggacaaa tgcatttttc cagcacctct gcaaagcagg gggcaccatt gatgagcaga ggtccaacac ctccctgacc ttgtccagat tggtggtgac aaggataaac caataaaatg
aya t_a.aai_aa
tgagataaaa
aaccttgaat
tctaggtcaa
tgtcttgcta
atttgtgctg
agaattacga
accagtgatg
ttcaactcca
aatcttgttg
attttgtcaa
gtgcggtggc
ggtcaggaga
caaaaatcag
caggagaatc
accctagcct
aaattattcc
aggtgggtgg
tggtctctac
ctcctcatcc
ttccatcctg
cctgtcaggg
ggggcttaaa
cctatgtaac
ataaaaataa
aaaattaaaa
tcagatttaa
gaacacctac
agtgagttat
gccaattgct
ttctgtattc
atgtctgatt
ggccaaatga
aagacatttt
tgattaagtt
ttttccttcc
gttagttgtt
agttgttggt
ccaggagaat
ctgtgctgtt
agagaaccac
atctgtacta
ctgtttctgc
ctgagcacac
aattttctca
aaagtaggaa
tttttaattt
aaaccagttg
aatgtggata
gaagttataa
acattttcta
catctttgct
ggtatttatc
Lyyuaitiai..
ggagacaaga
attagccttt
aacataaggg
aaatgtctat
gatattttat
aacacaacta
agaaggcaga
tttcttcatg
aatgaatcta
caaacaataa
tcatgcctgt
tcaagaccag
ctgggcgtgg
actttaacac
ggcaacagag
aggccaggtg
accgcttgag
aagaaataca
gcctgtaatc
ggtgacagag
ggtgggaggg
acctagatga
aaacctgcac
taacataata
ataaaattaa
atggaggtca
actctacaaa
accttctgaa
ccatatttct
ctcccagtca
gctctcttga
gctctggcct
attccaggca
tgttgtgcta
tctttcgcca
aaaatcaagc
ggggaaaatg
cgccccatca
agtgatgcat
gtctttgtag
tttttgatct
ttgtaaagag
tgaaagtcag
tattcttctc
tatacagtac
tagtttaacc
aacaaatttc
gcaaatacag
gacagaacaa
ttcagtttta
tttagtgctg
gtaatacaaa ggtattgttg
tgattgttgt
ttaaaaggct
gtagatgata
aagcgtccat
tcataggaga
aagtgacaag
tcccaataag
gtacagaggt
caataatttt
aatcccagca
tctggccaac
tggcagggac
gggaggcgga
caagattccg
tggtggctca
ctcaggactt
aaaattaacc
ccaggcggag
ccaaaccctg
aaggggaggg
tgggtcaata
attctgcaca
aaataacaaa
agtacaaaaa
ttgaagctca
aagacttatg
tagtgaatta
ctgcatgtta
ggaatagcca
ggtcgttagc
ggtgcagccg
taagcaggcc
ttatgtaatg
ctattctaag
agaaaagaaa
acttataatg
caattcagcc
aagccaaatt
acattaattt
atatcttaaa
cttggaagtt
taactggaaa
tcacctctgt
agagctttct
tttaaactgg
aattttaaac
gaaaaattct
tttccccatg
accattaagt
tattataaat
taagaacttt dyetelLwtgi-y
gacttgaatt
ctctttttgc
ggaaaaatta
aaatgtcctt
taggcaatag
tacttatttc
attaaccaag
agacaacgtt
tcataaaaac
ttctttaaaa
ctttgggagg
atggtgaaac
ctgtagtcgc
gattgcagng
tctcaaaaaa
cacctgtaat
caaggccagc
aggcgtggta
attgaagtga
tctcaaaaaa
agagcatgag
ggtgcagcaa
tgtatcccag
aaagtcttta
cttaaaataa
aacacctggc
aataccctgc
aataaaatac
gagtttagct
gtcagtatta
ccagatactt
tcttgccaat
agatcacagc
ggtacttgaa
tatgttgtct
acaggcaaat
cattattctg
tctctctgtg
gtgaccaggc
aaaactcgtt
tcaaaacgaa
atcaatcctg
tcaacagtgt
agagttctgg
tggcagcata
aatctgtagc
atgttttcag
gtgaatattt
tacaagcttc
tgtaatatta
atttaaatta
atttttagtt
LL'l-.ULddd
tgtcgtgcaa
agtatgaggt
aataggccaa
gtgcctcttt
caaatttatt
cttccaacca
taagagagtt
tgacctgccc
cgtcaggtat
attattccag
ctgaggcggg
ccccatctct
agctactcgg
agctgagatc
aaaaaaaaaa
cccaacactt
ctgagcaaca
gtgagtgcct
gccgagatgg
taacaaaata
gacaaatacc
accatcatgc
aacttaaatt
catctgaaat
aaatcatttt
tgcaaagtga
attggttgat
tattaaagtt
agtgtttcca
ctccatcagc
gctagaaagg
gtgcctaatg
tgcccaaagc
ccatattccg
gtatctaatg
attaaaacgt
acataatgtc
ctaatgacgg
agactagacc
ctaatcaaat
gcttttttga
tcttcataac
tttaaaagtt
tctacattgg
acttaataca
acattggaaa
gctttggaag
ttattcacat
aaatttttag
ttacaaatga
atgacattca
aattccatgt a L. LdddlJUL L.
ataagattaa
agttgtgaat
atgaaagaat
aacttcaatg
caactataag
ataagtaacc
ggatacaaca
tctcattcct
ataatgccgg
gccaggccgg
cggatcacga
actaaaaata
gaggctgagg
cagccaccgc
gaaaagaaaa
tnggtggcca
tggcgaaacc
gtagtcccag
caccactgca
cacaccaggg
tagtgcatgt
cacatgcata
taaaaataaa
aagtgtactt
agatatttcc
tttgtaagac
gaacaagaac
ttaaataatt
gggatgattt
cacagcacaa
tatgattgct
agagcgcgga
tctctggctt
tgaatgaccg
ttgccttgca
aaatagaaaa
ttggggtcca
ccttttcatc
acatgtaagc
atgttcattt
cttctggttt
aagaaaaatg
aattggttac
aaatgctgga
tgaaaaatga
aaaaaaacct
cttactgaag
atgtaaacgt
cagttagtta
tattagaaca
gtgtaaattt
gttatttgta
- 133 -
008252
tttcttatct ccctcccacg aaacgtcaat ttcattcagc ctgaggtaga tatgtatgat tagtactttt aactattatc atttccttcc catatttctg
cacatttatt
tagacctaat
tatttatttc
cttcctatta
ctgaccaggt
gatgcagata
gccaaatgct
ttaacattat
aataaatctt
gtatgacata
agcgccttag
tccagggtgt
taggaactgt
gtcttgtctt
tgtgatctcg
ctcccaagta
agtagagaca
cacctgcctt
tcttttcttc
ctcactgctc
ctttgctacc
gctgtagttg
tcctgccaat
gaaagccttc
attttctaca
acttagaaga
tggcaagttg
aattaaagta
aaaagtcctt
tttattttgt
cacatgactt
cagcacagtc
ttatgcctgt
gtgaaggctg
actccatctc
aaagaaagga
gaaggaagga
aggaagaaga
agaggtttta
tcgtttagta
ccacatgatc
ttgagtccag
tatgtcacac
ccacagaacc
agaaaaacat
ttaatatgtg
gatgagagaa
catcaaaagt
ttaatctggt
tgtattatct
gtctgttttc
aaaacctgaa
tgtgtgtggt
tttgcactat
tttgtaatgg
catgtataca
cagtgcctag
gtctactgtg
ccttcaaaaa
gtgaagagat
taggcactgc
tcaattggca
gggttgcagg
taaaattaca cggatttttt caatcttggt aaaataaata ctaccttatt tgaaccatgt tggttctaat gcgaacttct taaaatatgg ttttgtgtac
tttggtccct aaaattggat tgatcttttt aataaataaa gttaattttt gcatatctca ttttggacta agcccttttg gtgacaaaac tctttaggac
atcactcagg tttaatctgc attccgagat taattgctct gcattttcat gaataggagg ttatgaattt cttcaatttc taaaagaccc aattgaaaag
tatgtttctt ctttataaac tatttactag tgtagctctt ttttattgaa aaaaatatct tttatgtcat ctttgaaaag tcagaggaaa cttctaatta
dUdULLLL. L, L
gaagttgagg
actggaatgt
tttttttctt
agtgcggtgg
ctgcctcagc
ttgtattttt
cctcatgatc
gcccggcctt
ttgacctgac
gaccaggttt
cgcagggagt
acctacactt
atactatagt
aactttagaa
taaaaaatta
tttaccaata
ccaaaatcaa
ataattttaa
tggtttttgc
gtgtgtggag
cacaatgtta
gcgtggtggc
aacccaggag
acagggcgag
aaaaaaagag
aggaaggaag
ggaaaagaag
catggtttac
agctgcttta
gtctgctgat
gttcattatg
tttttttaat
tttactctta
aatttggtga
aaaatttttt
attattagag
tagattttgc
cactttgttc
tttgcaagtt
ttaagaatta
attcagaaga
aaaaaaaccc
ttgggaacat
ttaatgtact
ctaagatatg
cttttctttc
ctattgagct
aggcttttag
ttgatctcaa
gaccctgtgc
aaagtgtttc
ttttggttgg
LyyLydLwdy
actgactcac
aaatgacagc
ttttttttga
gctcactgca
gctgggatta
aggtttcacc
ggcctcccga
ttaagacaac
ctcaaaggca
cttactctca
gcgtgtggac
gtcagcatcc
acctctcctt
tttaaggaaa
tatatgtaaa
tgccaaaaga
gctcaaaaac
ttatgtttgt
tttattgcct
gagtgtgtgg
tatcagggaa
aatcccagct
cagtgagcca
agaaaaagaa
aggaaggagg
aggaaagaaa
agaaggaggg
ttcactagga
aatctctgca
ttatttcatg
atgtccacct
taaatacatt
agctctcagt
tatagtaagt
gctaaaatct
actgagagtt
gacctcaaat
ggctgctgct
gtctcatgat
ttctgtgttt
agcttaccca
ttgtcttggg
ttatttcatt
cttattccgc
gtcatcttac
ttgttaaaac
tggcaaatac
tctttaaaga
tcaattcatt
agggcaaaag
atttttccaa
gactgttgga
_dy LdL.dl.-
acaggttacc
taactgtggc
gacagagtct
ccctctgcct
caggtacatg
atgttggcca
agtgctggaa
taatggaaaa
gaatgctgat
gcctacctgg
tgagcgtcct
ggcttgtcaa
tctttgaagt
catatttcaa
catgtgtatg
gtgcttaagt
ataaagttta
cccatgttct
tgatatgcca
acaagttgtg
aaatacttaa
ccttgggagg
agactgtacc
aaaaaggaaa
gaaggaagga
gaaagaagaa
aaggaaggaa
tggtaacatc
attcaggatg
tatgtggatc
taagagtaca
tactttatga
taagaagaaa
tacagtcaat
gcataacaga
caccaaaaat
gcaagtttgt
taggtttcat
ccagacagaa
ttctatgaat
aaaacaaaca
acagttcaga
caaaatatgt
aagcagagat
tacatagcag
agcaaaatga
tttatacaaa
agaatgaaat
tcaaaaatac
ctgaagaatc
caagggccac
atttagtggg
taggtaagaa
aaagcgtagg
tgctctgtcc
cccaggttca
ccaccaggcc
ggttggtctc
ttacaggcat
taaacttcca
tcacaggctg
aaattgccga
gggaactgtt
cacttctttt
attctctgtt
ctatgattct
gtttaaggta
gtaaaaaaca
taaatatttt
ggaatagcaa
cgtggcaagc
ttgaagatta
gtttattttt
ctgaggcaga
actgcactcc
ggaagaaaga
aggaaggaag
aaagaaaaag
ggaggatcgg
ctcccaagta
cacctttctt
atccagccac
cacccctcgc
taactactgt
gtgctgagat
ctcactactg
tggtatatct
aaaaactaat
agctgaattg
tgtagaggct
ccagagtcta
atactgaatg
aacaaacaaa
aggcagtcat
taatttattt
agcctccctt
gaattttaaa
taaaaattta
taagcaatgt
gtcattttta
ttaatataaa
agagaggctg
tggtgaatgt
tagaggtcag
Lyt_d LLLd Ly
gtaatggatg
gttttgtttt
ccgaggctgg
agcaattctc
tggataattt
aagctcctga
gagccactgc
agaagctctt
aggggtatct
gcgcaggggg
ctgctgtagt
ccatttgtga
cagaacttgg
ttattactta
acaaagtgag
aacaaagaaa
taaggcattt
ataaaaaatg
ctcaggctgg
ttattacagg
ttgaggctga
aaattggttg
agcctgggtg
aagagagaga
gaaggaagga
aaggaaggaa
agggagaaaa
atttagttct
gctgttgctg
cgtgacaaat
tgctgctttt
tggggtacaa
ggtgtgggga
acctttggct
gagtgaagag
aattgcaata
aagaggtggc
actgagctgt
ccaacgtgga
tctcatcttg
caaacaaaca
ttaatttcgt
tcgattttaa
cccccaaatt
aagaaataag
tgtaatggta
cttaggatct
agtcttgtat
ttatatgcta
tcaagttaga
ctacaagtat
gggtgtggct
- 134 -
008252
acacatcttg caatgcatag gacagacctt cccattaaag catcatccac ctgcagatgt 37380 cactagtacc aaacttacat tttgtgtagc ttcagcaagt tctctcttaa actattcatc 37440 gctctctttt ttcattagtt ctgcagttta ataagaatat tgccctatgg agcagttcta 37500 gcactttggg aggccgaggt gagtggatca cctgaggtca ggagttcgag gccagcctgg 37560 ccaacatgac gaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaac ttagccaggc gtggtggcat 37620 gtgcctgtag tcccagctac ttggggaggc tgaggcagga gaatcacttg aatctggagg 37680 cagaggttgc agtgcgttga gatcaagcca ctgcactcca gcctgggtga cagagcaaga 37740 caccgtctcn naaaaaaaaa aaatagctgg agattaggca agttgtatat atgtaaacat 37800 aaaaagacag aaacaaataa aaaccaatat agcacaaccc accccatctt gaacaagttg 37860 tacttctaat catgcacatg tgaaaacatc aagctcttat ttgaccacca ttcaggattg 37920 aatatttagt cattgcaaat gtagttgagc aaataagtat ctatttggag tttaggatta 37980 ggatcataca cttccacagt taaatctact gactgacagt agacagttca ttgagacaca 38040 gatacagcat agtcatccat gtatagtggt tgagtaacgt gtaagtttct tttcccttcc 38100 aactgaaggg gatgctcaaa ctgagattta accaggacaa agtcaatcag cttctctctg 38160 aaaagggtga tgtctgatca gagtcagctg gaggatcaga aagagtcatt tagaaaagtc 38220 tgagggaaac tgatgatctt gagtaacaag aaagttgcca ttttgttcac cacagatgaa 38280 agtctattcc cagacagtaa atgaagccgg ataatcaggc caatttcata aacagtagat 3834 0 cagattggaa gagttaaagg accagataag aaaacaagca cctgtagcag gatgacccga 38400 gtaacacaaa ggatgattca cgcaaagggg gtgcaaggac taattctgca gactcctata 384 60 gcttgttgtg ccttgcaagc ccaagagagg ttcccaaagg gactgaagcc tggcagcatc 38520 cagtgaatgg gctctagcat acctggtaag gagctgtctc agaagatggg gtgttccata 38580 tccctggagg ggttaaagtt caagaacatt gctgaggatc caaacactgg gagagagaaa 38640 gaaatggatg gtcataaaat aaatcctctt tgttctttta aaaattctga gtgtgggagt 38700 gaaggtgatt tttcagacca agcccttggg tactgactca ttcttattcc actgtctcgg 38760 gcttacatct ccaattctaa cttcccaact tctgtcatgg cagatcaggt attaccattg 38820
ttagaatagt actataggta ttttgtgttt ggagagaggt ttagtggtag gaccccaggt 38880 ttgtagtgtg ttgctagtta tcatcacaat tttatgaccc tctcacttga gagtggaatg 38940
acaatgtggt tatgtaacct aagactagaa gaaacaaatg ggagtactcc caaaacacaa 39000 atatctcacc tcttttttca tgggaaaaga gtcagcagaa gagggcaaag cggtaaataa 39060
aatcctaaag gtaatcaaaa cagatgggaa tataattttg ttcagagcta taaaaaatat 39120
cctctactat tctcaataca ggcagtgtgt agaaagtttc aaggttagta tttatcttct 39180
aaacatagac ttgtggtctt cttatttaat caattcaaac caccagtgga agaggtcaga 3924 0
aagaatgaat gaaatcagga gaactgatta tcatgagtat cattgttgtg attgcatttc 39300
ttgcacagct ttaatttgtg ccttgagagt ttggggtctg agaaagtagt gctattccaa 39360
gagctctcca gggatatttt tggaacaggc cttattgttc tctaaaaaat taatgcgtta 39420
tattcccagg tgctgttgta gcatcatttt tcatttaaca aaaatatggt cgtttagcca 39480
gaaattttag ttctataatt aaaatggact aaaaatattc tgtagcacat ctagaaaaaa 39540
tattttaaat gtatcaatgt tcttcctaga aattttccat gttggatcaa acagtagatg 39600
aagacttttc tgtgtgtata gcatgggttt ttatgtttat atatgagtgt gcaggtgttt 39660
taagagaatt ttgaaaatca gcaaagcaaa gtcaattcac tacaaaatag tttccaaatt 39720
atctgtgcag tattaatatt gaggaagaat taatcaaaaa gcaaatattt gagaaatgct 39780
ttcctatgtc tgtaggctac aaaatcattg tttaatttat caacaatctt tgagtgctcc 39840
tcagtgtctg gtacagaaat gaaagataca gttttaactt tagagtgctc acacctactg 39900
agggaaacaa acaaggtaga gaattcagta tgacgagtga catgagacag ttgaatggga 39960
ggctctctgg gagtactaag ggccattgcc tagtgtagct gagggcacag aggagctgag 40020
ctgggcagcc caggagtctg tcaagagggc cagagggaag cagtgcaggg ccagcagcga 40080
gagcgggact gtgcaaaaga agtttcagta gctacagttt ctttctcagg gtcctccact 40140
tcccaaagaa aatgaaagga acatacattt gatttttgtc agtttaaata ttggtcgacc 40200
attggaaaac catttttgaa aagtgatttc ttttgctatg tttggcaaag ccaggagtag 40260
taaagagatg aggaaggacc atcttcgtcc attgcctttg cctttgtaac tgttacttct 40320
tcacagcctt tctacccagt gtagttcacg tatgggaaac atttctttcc atcgtcagcg 40380
tcttcctggg gagtgttttg gttatacttt cacgaatgtc tcacctcttt gtgtcaacaa 404 4 0
acccttctct ttgagctgta ctgtgggttt ctgtttcttt cctttttntc ctttgtccaa 40500
ttagaaaaaa aaatggagta gaagtttcaa ggctactagt tcaatgtgct cttttttact 40560
tgactccaaa tgacatcttg cttgcagatg tgattaagaa agatctggac agggagaggg 40620
aggataattt tcaatgttcc tctcaaattt aatcttatag tgacaagctc catattctac 40680
atgaaaatgc tcagttaata cagctattaa acttgaatgg tagataatag tggatttctg 40740
tagccactgt ttggtttcat tcaaaaacct agaggaaaat aagggatata cattataaat 40800
tgtttgttta atgttaaaaa tatgtttcat attcagtgca cataaagcaa aggtattgtc 40860
cagtgttagt acctatgaat catcaataaa aacagttgct tctgtttgct gttgacattt 40920
tatgtatgtg ttgttcctct ctgaaccttt ttcttaaaag tcaactttta agaaacttat 40980
aagtttactg tggagagcct atgaacagat gcatgagggg gcgcctgttc atatggataa 41040
gatagggcta taaatgccct tatcttgcca gggctcttct aggcctcttt agggttaagg 41100
- 135 -
008252
catactccct
tggattgttt
ataggttatg
aatattgtaa
attacttcat
aaactacccc
gcatcacagg
aaaaaaaaaa
tttaaggata
tacatattta
tcaagatatt
ttcaaggcct
ccctcgtctg
attaataatt
aaaaaaattt
ttggagacct
tatctgccct
atgttgtgtt
gagttacagt
gttatattct
ctttgcttct
gcggctggac
ttctcatgca
tgtttggata
atgagtggag
attgaggtac
cttcaatggt
tttatagtca
taagtcatta
gaaactaact
gctttgtacc
agacaagtca
ttgttaggat
aaaaaatcta
tgaggtaatt
gtgttcggta
gatactttac
tcattttggt
tggcaagctt
tgtttatttc
tattttattg
ttttaagaga
tcattgagaa
tcaaaagtca
ccgtctatga
gctttccccg
ttgtgaaggt
atcttttgtt
tttgtgattt
gagtacagtt
aggtacgcta
accatcagtg tctgagaatt
gtaaccagct
gaaagactgt
attcttatct
ccccatgtga
caccctcact
accagaaggc
agaaacaata
ataagagaaa
tggggtacct
taggatatcc
ctctgctagc
ccatggaaca
tctttttaaa
tttttgacct
tcattaacca
catccccact
aaagaggcta
accaatgtac
atagaaagta
ttctcttagc
ttgccttctg
caggctcaaa
cttggtcata
attggtttta
aaatgtttac
atatgtgtgt
taaatgatac
aatccttaca
acagaaagac
agaatgactg
ctttatcttt
taaacacatc
tccacatatt
ctcccagaaa
acaccatgga
tctccctgtg
taaaactata
aaatggtaca
cttttccaca
ttagatgttg
acagtaaaat
aataagtatg
gctgtgactc
ggccgcctca
ttggcgttcc
actgcgaaga
tggttttggt
ttttcagaac
tcaacaaatg
tcagcaagag
gaccttgggg tgtgttgtaa
tttgctgcaa
tttctgtttt
ctgtatactg
ccatctcact
aaacttaaca
agtgatcccc
aacttagcca
ataatctctt
gtgatatttt
ataacctcaa
tattttgaaa
ttacaactta
gccccagtct
gatgatatgg
gtgaccttca
tcgccatttg
gaaactcaac
aaaatatgat
tattagcaca
ttttctttcc
ttctgcatgc
gaaacagtga
tgcacattct
tattctgtaa
cagttttatg
gtgttttctc
ctgaaatatc
acacagtaaa
tattaaagag
agttaattcc
atatgcttta
ttttccctac
tttagctttc
atacaaagtc
atccaaagac
agaaagtgat
gcaggtgctt
tatccttttt
ttattatttg
aaattaccct
gtgttgcatg
gataaatatt
agtctgtcct
caggaaggct
tacttctatt
attgtactaa
tgccctctgc
gtgtttattg
tggggatcga
gatgttataa
aagctcttgc ccggttgtct
ctgttactgc
aaggctctgt
tacttctgca
tcataatcaa
ataaatgctg
ctggacccag
ttataatccc
tttaacatac
gttttatgga
gcatttatca
tacacaatac
ttccttctat
caatcaagag
gttcaatttc
cttttctttt
cctagctaat
atgctttaca
ttttaaaatg
cattaatgca
agcctctttt
cttggtgttt
ggctgcccca
agtttaaatt
taataaaact
aataacaact
acaaaagcat
ttaagaacct
gtctgtgtta
gcaagatatc
agttccctta
gtttccctgt
atggcatttt
ctttctttcc
ctatttggtg
aagctccatc
ttcaaatgaa
ttcagcttat
ttaattatac
catttaacag
ggcttgaagt
tgattctaat
gattgttttt
cctctgtcat
gggtgttcct
tcatcactct
gaaagtctat
tttgtcattc
ctgttatcat
gaagcagcac
cccattcgag
atgatgggct agcttcacgt
tgattaatac
tagaaattgc
tacagatatt
atgactctaa
gtatatccag
ctttcactaa
tcagaaaaac
ttattgatac
taaaatgtgt
tttctatgtg
attgttgtta
ctaactctat
aaatataaat
tggttctacc
ctgtaagatg
aagacagaga
aataccagct
aaaggcagga
taataggcga
tctcccttgt
gctgttgctc
acctgtgcaa
tctgtgtaac
tatttataga
tatatttatt
attgagcaat
accctgtgat
tttcccattt
atcacagttg
attattatct
ctgtaaaaca
aggttctctt
attactagaa
attcactgcc
atatcaattg
actcagttct
tgaatgtgtt
atatatatac
ctaaaggtat
cagaaacaac
caatttttga
ctggaaaatg
gacaggaact
catgtacaga
cattttcttc
gttctgtgat
ttagactttg
tgaaacattt
tacctcaaca
catgcacatg
tctatagtct cctgtttcta
cttgctaatc
tgatgcacac
atgttaaaga
atccctcact
tacgttggcg
aaaaaaaaaa
attaactata
ataataattg
aattatcaaa
ttgggaacat
actataatca
gtttgtaccc
agcatggtaa
actttccacc
gtattgataa
tttccttagc
gtatgacaag
catttatgaa
taggactgca
catcaagtct
tgattctgct
ctctcctctt
taaaacatgt
agtagaattt
ttataaacaa
tattttcaat
ttacaggaat
tacagatgga
gatgtgtggg
ttgcatcctc
tcttatagtg
aaccaatgtt
gtactttcta
ttacattctg
tggagcctga
cccatttatt
aggctccaag
ttggtttgac
aatatcaaat
tttattaaaa
agcacttttg
ctttcttatt
agtatattca
gcaattgaca
ctcgcctggc
agttctgcag
gtaaatgtgg
gcagaaatca
gccaccaccc
tctcaccctc
gactcaggaa
nr-t- n't- t-1- a a a aat-a,
ttgggaggct gtagcaagac cttgtagtcc aaggtacagt tatccccaaa caatcaaatc tgggtggttt gacatcacaa tttatgggta ttttgtaatg gagggagagg cctgtctcta cagctactca gagctgcaat aaacataaaa agagcttcca tgatacaaaa atcctcaaat tttattcatg gaaaatatat gattgcttga caaaaaaatt gtaggctgag cacaacactg gaaaataaaa ggcagtgagg ccaagatcgt ggcttgtgga tacttgcaag ttcattcaga gcccaggagt ttaaaaatta atgggaggat caccccagcc taaaacaggt taatgacacc caaccacatt taaaatgcaa cctatgtaat acaaaccaca ttgagatcag gccaagagta cacttgagct tgggtgacag tcaaaggccc tatattttgt tattacatac ccactatgga gtctatgtgt gtacaataaa cctaggtaat gtggcatgag caggaggtca agcaagatcc aaacacagaa aacagctccg ctttgattct atttcttact aggattagaa ctatgaaaaa
- 136 -
008252
gatccctcaa gattcccata gaaggtgggc agatccaatg aaaaaaagga gaaaatataa ttaaattcta gtatctatca ttaataatta tgaggcatct
- 4- -"+. -, _
at.akjLijLk'aij
tgaatatgct
catagcaagt
tcccggtcca
acctaaatgg
atgacctaag
cacagctgga
agggaaatgt
cttaatcaag
taatcataca
gttgctaagc
tagcaacgag
gcttttatgt
tatgaccaaa
gttactaatt
catggaagta
gctattctca
tgcagacttc
atatatatat
taggcagctc
ctgtgatgag
accaaatgcc
tttaggagac
tcaaattact
tcttagacgt
attcatacac
acaacttttt
aagtcctgag
cttcagatac
gagcttatcc
caaggctact
atatctaact
aattaaatat
ttgagcactc
tgataaaggt
tccatcaaca
tcagtgctgg
aagaatttct
gcaaaaatgt
aatatgtgag
aataatgagt
accataaatg
aatcaagcca
aaaaaccata
tttctctgca
ttcagctgct
acctgttatt
gcatttttag
gacaggcctg
agaggagagt
tcttcttaca
tcttatttaa
tgtaaaaaat ccccaaatgc agttccatag tacagatttg cctttgtttt agggcagatt attccagaat aaggatattt aggagccgag tttgttaaaa ttatgatgct
tCutattCoCj
atccaggtta
tctcatctcc
ttccgaggtg
aatatggaac
attcctttaa
aaaaatagtg
gaagagactt
aggaataaat
gagaattgtg
aaccaaagct
cttcaggccc
gtagagaagg
ttccgtgaac
tgaaggaaat
cattcttgcc
tcaaaggact
ccataacagc
atatatatat
actaggaact
aactgtttct
tccaagacac
cataatataa
aaatattgac
gggtaactat
ccatgatata
agtgatgtcc
taccgtatct
ctgttatgag
caactttgcc
tttctgttaa
tttataaatg
tctgattgca
ttgctgacat
agaactggtg
ttcttagaat
gttaaaaagt
cctccaaaaa
gtttactgtg
aaaacaattc
gccttctaat
agaattaaat
ggtatccact
aattttcaaa
ttactgtgta
agtgattctc
catgttgttg
ctactttaca
agagaattct
gccatggaaa
gtcactccca
ttttcataat
gacaatgatt atgtttgtga caatattgtt ctaaaagcag tatttttggt tgtgtatctt caggaataaa aacaactttg gtgtacaaat tgcaattaaa gtaaaagtct
LULLuauaaa
tatcagaaat
tctctcctct
gcagcctcta
tatgatctca
aaccatagta
tttggaagca
ggaacaaagt
tggtaattca
aaaaaccttc
cctgctgtca
cgcccaccct
gagagacata
agggacttct
aaaataaaga
tttctctagc
aaagggtcct
catgtgtata
atgcacattt
ggctctgaca
ttaaaataac
agcataggaa
catgtaactg
tctggcctct
tgccttgtgc
ataccctgct
catgactgga
cactaaccca
ccccatggtc
ttgagtagaa
aatggtagga
aatcataatc
caaagacagc
gtgttttctg
tgggaagaat
atgggttata
agagaaaaaa
gaaagctaca
ttccaagacc
aattaatgca
aagaaaccat
tttgtgaggt
ttcactattt
gaatccaaag
tgtggatgtg
cattaccaag
atgatgatga
aaccaaccga
caaagttgaa
ttcatttgtg
tatattgaga
aatactgtga
ggaaagttaa ttttttaaag
tccataaaac
cagggcagtt
tttgtttcac
cttctagcgt
atgatataat
taaacactta
tttacttttg
cacactaatt
gaattgtcca
caac i"g t.ca
gccatgtaga
ctttttgcaa
gaaggacatg
gcccttaact
tgtttatgga
ccaccaagtc
tgtacagaat
gaggtaatgc
attaagaaaa
gcctctgggt
ggctagccac
atttgccatg
cattcagtgg
tgattattat
atatggaaaa
gggcttgttg
gaaaatatgt
tcagaacaaa
gggaccattt
gaagcaatat
caaattacag
gaaaacagaa
gagagccttg
tcagttgtgg
ttgttaatcc
tgttgggatg
gacctttact
ctctgatcta
ctcaaagaac
gacagaaagc
caataggatc
aatcatttct
aattaatatc
gggcactttt
caatgcctaa
tggatgaaaa
tataacttaa
atttatttcc
tttcagggaa
aataatagaa
tgcatcattg
tctgtcatag
agcatgcaaa
tgtgtgcctg
attctttctc
tattatgcct
ccagttataa
atctccatgc
ttattggtga
tctgcactag
agtgggcact
ttatctaacc
aatccctata
cataaggctc
attacaaaag
gtgtgtgttt
gaatctttat
gccttgtaat
caaatactgt
aaaaccctca
tgggaaaagc
gtcaattcat
аасиисса_.д
aaagccttca
actatgagag
ttttcagtta
cacatgcagt
gtaactctca
aggcaatggt
cattttgatg
gtctagatat
atgctatagc
gaaacaccac
ttgcgagtgg
atgctattat
tttaaaacac
aatgcacaca
tttgcagttg
gacttgttga
gnnnnnnnnn
gaaggggctt
caagggaggc
ttttcaattg
agacattaat
ggaaaatgat
tgatttcata
attgggttga
actatagggt
tgcaggtgag
cccattattt
gactagctca
tgctaaattt
aggcttctga
atattgaagg
gggtctgtta
ccctaattaa
gagtttttct
agcaacttgt
gacacatgat
tgctcaaaga
tcatgaatat
gggtgcttct
tagtacaatc
aatatattat
tgactattag
ttgcaaagta
tcttgagttt
ttaccactat
ataatggaac
aactgtagca
gcttccaaat
gattctacta
tctaatggct
attaatgtct
caatgttata
tattcagaag ctgagaattt agggcaattc ttgtggtgtt aaaagagaga tattataata taagacaaag agttgagctt ctggtggtgt tatagatgaa
aaayvjLL.UL
agaaatcaac
ataagaaagt
tgactttgag
gttcctggag
cgtataaaat
tctaatagaa
caaaattgta
tcagcagtgg
tgaggacctg
tcaggcagcc
gccctctgat
gtttgtaaaa
tagatcacaa
gcttttcaaa
ttaaatatag
tgtctaagtc
nnnnnnntat
tctgttatat
gaaaggaaat
aatggtcacc
gccaagggtc
gtagaaaatt
cctgcctgat
aggataagtg
tacccaggcc
ctgaaagacg
agatgcttta
tgatggagat
tagagccaca
cagtcaatac
tttggtaaat
ttatctctga
cagagaagac
cctttgggtt
gcataaatgt
ccaaaatgga
aaatacttta
acatcattaa
agcatggtgt
atcataggaa
ttcgtaatga
ctattttttg
aattttagat
ggaattctaa
ccattagata
aatcccagaa
gttgcaaatg
gattgtgcta
attcagaaca
ttacaaactg
ccactttgca
taactggcta
- 137 -
008252
gtggtaaaac
gagatgctac
ttctggcctc
gggacattcg
tttggcaata
tagaaatgta
tatgaggcat
atcgattata
attgatgtga
gggatgcagg
aactgtaaaa
ctcatncctc
aaaattacat
atactagtta
tgacgtatgc
atggtatggt
cagcccccat
catccatatc
catcctatag
ctggcctttt
aagagataca
tgaggattct
taaccaatct
tcctttactt
ttgattcttt
ctgatcaaag
gtatcaacag
ccttaaaatg
catctccact
ccccaaaaag
tgagatgagc
taattttgtc
gagttcaaaa
aaaaattagt
aggaaaattg
ctccagcctg
atacatatag
aggcaagttt
attacaaatc
accccttcga
atttatttct
tatcattatt
cacacacact
gtgggaaatg
aggagataat
ttagtgggcc
ttgttccctt
aaaataatta
agttctttcc
taggtcagtg
tggaagactg
cacaatgctt
taatggggat
gcaaagcata
ttatcattgt
gacttcattc
aagctggaga
tttgtcttga
gtcaacaagc
aaaaatcgcc
aagctctaga
tctattccca
ctgatggctg
tgggactcaa
cacctttcaa
atgttaactt
catacattgt
tgtatccaaa
tcctaagaaa
tatggcaatt
aattatgaaa
agatatgctg
tgtgtgtgtg
tgttagtggt
attttctaag
cagtnnnntn
agttacattc
gatgaggaat
tgtctgtgtt
taccacagtc
ccagagagca
tcctgtatgt
ttcttggtag
aaggaaagac
tggcttctgc
aaatgttgta
atttcataca
tgattttggt
tcaatatatg
agggttttta
aggcttccag
gatgtctata
agtttttgca
aatttgcagt
atttaaaaat
ccaccctgga
tgggcattgt
cttgaacccg
ggcgacagag
ggactgtgat
attttccaca
ctaggtaatg
atacagggtc
gtaaaacagc
tagaaaaaca
cgctcctaag
tcttccagct
aggtacctag
tgtagcatct
cataatacgt
cacaaagtgt
ctatgccaca
ctcctgttca
tccactaaat
ttaaattctg
aaaatactaa
tgcaagacag
tcttttttca
caaatataaa
catagagttc
agatgtttca
cccagggacg
cagcaaaggt
tttgtccaaa
ggacctagct
caggcatgta
aaccaggttg
tttagccatt
ttcttttctt
tgccaagagt
agtaaaacat
aattgggggc
ttttaaaaat
ttggaataaa
atgacatatt
tgtgtgtgtg
ggtgtctctg
cctttaatag
nnaaaaanna
agttgcaagg
cccattctct
gccacggatc
accttgtaga
ggaagaagaa
agttacatgg
cctagtggcc
tggcagtccc
tagctagccc
taattcaggg
aataagtgac
ctattgaaaa
ccccagggat
ttaataactg
aattttgaca
ttctcagaat
gtttattcta
tggcatcttt
acatatagga
caacaagctg
ggcgggtgcc
ggaggtggag
caggactcta
ttttggcaac
aaggatctac•
ggatctttgc
agactaacag
gacctcaggy
aaaatgttta
aactagaaag
gggtgtaata
gagataataa
tgaatttcat
acataaaatt
attaagcaat
cgcacacttc
gccttgaggg
aaaaataaaa
attttcattt
agtatttctc
aaagtgcctg
ttcatttaag
tccataagaa
tcaatgttcc
tgaagatgct
cgccccagcc
ctttgaattt
tttaaaatcc
tttttttttt
agagcatttc
ctcagctgca
acaagccctg
aaaaaagaca
atgaattaaa
acatactatc
agtagccaag
ggaaacaatc
tgcaaaccat
agtacaaaaa
tgtgtgtgtg
gggaatgggt
taaaatnatt
aattaatgga
gacaaaaaag
ctcatataaa
cagacacctt
ctagcatggc
ggaaatacag
tcaagctcag
ccatacagat
tgccacgctc
agcttctgtc
gattaaagag
cttgggagaa
aaaaatttaa
cctttatgcc
gtgactggca
gaaactttac
gagctattca
aagaaaatca
gtcaaaggag
ggcagaagct
aaaccctctg
tgtagtccca
gttggagtga
tctcccccca
tgtctctcac
caccactact
atcatctcat
gaggacataa
aggaatgaaa
attttgccct
aaaaatatgt
ttgacacata
cctaggtatc
cacttgggtc
tctgctgagc
gtggcaatct
ttattttatg
taagatacca
atttgcaacc
tctcccagat
ttgtggagaa
acatagcaag
ctttcaatgt
gacaaatttt
atattaaatg
gctggaggtt
tgcctccagg
tatttcatcc
tgaagttaga
taacatacac
agtggtattg
agagcctttt
ctgtcaacat
gtatttattg
acatcttttc
tgaccaagaa
ggcatatgtt
ttagtctcta
taaaataaga
aagatcctat
tgtataatac
ttaagctgnt
taattataga
cattctaaca
cccaaaataa
gttggaggtg
ccttcctgtt
tgctgtagct
gaaaagaggg
cttcaaaaaa
tctctttgta
cccgcaagga
tcaaagatct
aaattgaacg
cacttttact
gagagaaaat
acaattagag
atgctggttt
aaggtcctat
ggaagaatat
gaatcctgta
ctttatgtaa
gggggattgc
tctagtaaaa
gctactcggg
gtggagatca
aaaataaata
cacctcactc
accagggatt
tcgtatttcc
ataagggtga
cagtgagcac
attcctacca
tagtgggaaa
ggtaatatgt
taattcaatg
tttaatccaa
aggttaattg
tctaccatta
gatcctgaga
tggtagtcca
tatagtaaaa
ctaatagata
gaatatttga
tagtcaataa
taaagaacta
tgataacata
tctctgactc
ggcagctggt
tgcagtacaa
aagaaaatcc
gatggtattt
aatagggatt
aatcaatgaa
tattcagcat
gctgtctttg
ctggctgaaa
cagaaaaccg
agtccgcttt
tgaggatgtt
gcaataagtt
attgaacttt
gtttgtctgt
ctggaatgtt
tcttttgcaa
atgagaaagg
gaaaccacgt
gttgcttagg
ctcattcagc
ccactttgca
ctaaccctca
tttctgcttg
agggcaagaa
aaacagggaa
tttgagtctc
actgtaatat
tttttgcatt
gaaaattaaa
tagtctgcta
agtataggat
tgtcttttat
aacaggtttg
gcttgattca
aatggacagc
atgtgcacct
ctgagctcag
aaaaaaatac
aggctgagac
cgcccctaca
aataataaaa
attttataga
tgaaactcta
atcagcagtt
caaaggaaac
ttgtagttag
tacacacata
atacgtgaaa
gatgatacct
gatttcagat
aagaaactac
ctgcctagtt
aaataacacc
atatttttat
agccagggag
acacaccaga
tttatcaata
gcaattatat
actcaagtta
taattgaaat
aaaatataca
atctcccttc
agctgtggat
tgacattttt
acagctcttt
cactccttcc
tgataagttt
gaattttgtt
- 138 -
008252
gacatgtgaa
aaattcattg
ctgtttttct
agtgcactga
ttctcacagt
catcttctcc
taaactcctt
ctccttgccc
acccctaact
accggagaat
gtgacaaatc
atttggagaa
gtctttctcc
tgtactctga
acttcttttt
aggtatacaa
ctaattaaca
gggtaacact
ccattaatga
ctaatatctc
tgcttcaatg
ctttctgtgt
tcaatggcag
acattttttt
tgtgaataac
ttcctttggg
ttttttggga
acagtgtaaa
tgatggtgac
ccctgataat
ctttggaaaa
atcttataaa tttcatacct gcatttggaa tagcaaacat gattagaaga aagctgccat tatctcttct cctaaatatc ttccataata tgattcttcc ctcttctcgc gtgttcacat agatagggac gccattactg gtttctattt tgtgatgatt cacccatcac taagatctaa atcactttgt cccatttcta aatttgactt ctagttcatt gatttttttc tatccattca gctgcagtaa catatatcca aacctccata agggttatct cattgtaaca tagggatcgt aaatctactc aatattcttt
ccccgagtaa
gctttcagag
aaggattgca
tggagtctca
tgacaacaat
tcagggggcc
agtaactcat
ttttcacttt
acctggagaa
aaggggtggt
ctgccgtggg
ttcttatgca
tgggctatgt
gtattgaggt
tgatatatgt
cgcatatatt
tctcctagca
ttattagatc
ccccctgtcc
tttgagattc
tcacttagca
tttattatgg
tccatcagta
acacggggct
gaagtgggat
ctgcgtttca
tttctttatg
gatatgaggt
atgcactttt
agaatttgct
accgaaggac
ctgggaaaaa
gaacataatg
ggtggggcct
cgtccctgcc
atggataaca
atactgacat
tcaaaataat
cattttccct
ttttattttc
ttccatagtt
atgagactgt
actcaaggat
ttatatggcc
gtgattaaca
acacagtgta
cagtagttac
aatctcatgt
ctgagaactt
ccagcccctg
catatataaa
taacgtcctc
ctgagtaata
gacacttagg
gcagatgtct
tgtgggatca
gaatggctct
cctttgccaa
gatatctcaa
tcatatacct
catttataat
tgagttatgt
tatgttaata
tagaggtgtt
gagagtcctc
tgtgaacttt
ataataacaa
cttctcttcc
gtcaccttac
ccaagcagcc
tttagccttt
gtttatatcc
atctcttttc
gggtacatga
attttaccat
aataaaattg
aaacgattgt
ctctgtgtgt
atacaataca
ggccatcttt
gtaaccacaa
tgagattatg
caggcttatc
tttcattgta
ttgttccctg
ctttgagata
tatggtagtt
accaatttaa
atagttatct
tgtggtttaa
attggccatt
cagattattt
ggcagtgggc
catagtctct
tctttagcaa
atgagataga
ctggaaaaac
taaggcccaa
ttggtttccc
caagagcagc
cactcgtagg
ttggttttca
tgccctcata
tttcttttgg
aaaataaaat
agagttattt
taaatactta
tgcaaccaag
gtggggtggg
gtattattaa
tgactgataa
tcctactctc
cggtgtttgt
catatagttg
tgtctatacc
tcttgaccat
ctgatttcat
ctatttttaa
atccccacca
tttgtctttt
atttgtattt
catatgtctt
gcattttgtg
cttttgaata
ctgccttttc
gcaataagta
atcctatatt
tactatcact
taaaaagcac
actatgtgct
agcttacagt
agtgatgtgg
cgctttgaga
tccagcattt
ctggccaaca
gtgcacgcct
gaggtggagg
gagactctgt
ggatgaggtt
taggagaaag
acccaggact
aatatgcaag
ccaaatcaga
gcctcaaggt
gaataacaag
aaaataaaga
tctcagagac
atgaatgtga
acaagtttca
caatgaagag
aggagctgtg
ttaaaagaaa
ggctttcact
cttccactcc
ttatctcctt
attttgttta
gaaaagctta
tgatgttgac
actaatagta
ttttattgac
agacactaag
atgcttgaga
gttttgaaag
ggtcagggaa
tgggaggctg
tggtgaaacc
gtaatcccag
ttgcagtgag
ctcaaaaaaa
tactacaacc
tgctgattca
aatggctggg
taatcataag
gtcgtatggt
ggccatctga
ggattaatga
ttggaatggt
ccctatatga
ctcatatgct
ttccactcaa
tgcatggaag
attagagaga
agaattaagt
aatgattaat
ctggcttgga ttcagaaata
ttgttagtta
caatgaatat
tatgctgcta
ataacaataa
attatttttt
atagtcttga
gtgggaggga
aagtaatgca
ggttttagtg
aggcaggcag
ccatctctac
ctacttggga
ctgagattgt
aaaaaaaaga
ctgtgatgta
gagaacatag
tcttatggct
ttcgtgatag
atccagagct
aattaggagg
cagggtgaag
gtggggatag
gatatgtgtt
tagaaactgg
cttcatgtgt
aaaagtggga
gaatacattt
aaaaatatat
gccatctaaa
ctaccatggt
tggtgttcca
tttatttctg
tgataagtat
atataaaact
tgacaaagat
aatccatcaa
aagaaacatg
aaaaggcagc
agatgcaatg
cataatctta
atcacctgag
taaaaatcca
ggctaaggca
gccactgcaa
gagagagaga
gaaagaccta
ggatgtgaat
cctagcccca
agaaataaac
ttaaaatcta
caagtcagcc
tgtgatgaca
atgttgggct
atgaatatag
ggggaaaggg
ttggccctga
tggccaagaa
ctatgtctca
tgaagataaa
actgggtaac
atcttaccct
attttcccct
tcagtttaaa
tattttgtgg
actacaacta
tatagtacta
ctgatattta
cacagtctcc
attgagctag
agaatatata
aaatcaaaac
gtcatgagtt
aatattaccc
caagaatcac
tgtagcctgg
atgaggaaaa
catgcctggt
tacattcaac
tgctttatcc
tatcagggct
ttaaatcctt
tccttatcac
aaatcgagca
tgaagtgtat
cagcatgctt
gtcaggtaat
ataaagcttt
gttatctgtt
gcaagaaaat
atggtcctga
aggaaaactt
caaggctgaa
gttccataga
aaaatggagg
tcctccttcc
cctttactcc
gcttcttacc
ctgagtacca
acactcatag
caatcacaag
aattggggtc
cttgagtaat
tgagaccagc
aggtgttgtg
ttgaacccgg
gcaacagagt
gaatgactaa
cagccattta
cagagggaga
agctgaaaaa
actctgagtg
gttaatagat
aaagatttga
aggagatagt
agatgtggca
atgacatctt
tcagtgtgac
ccagaggcag
tgtaccgggc
aattaattaa
aatacttgat
tcatctcagt
caggagcata
- 139 -
008252
taccacttct
tttatttatt
cgggatctcg
ctcccaagta
ttagtagaga
tccgcccgcc
ctttttattt
taaaattaaa
ttccaatgag
gcattttatc
atgtttcctc
cactttctta
acacttttct
ttgatgtctg
gtcacttctg
acagtccagt
ctcgcttaga
tagactgtgg
ggagtctaaa
taggactttg
gagccttggc
catcttgtaa
catcattgaa
gtctcactct
gcctcccagg
tgcgccacca
gtcaggctgg
gggattacag
aaaacagagt
tgaaataaat
gagttcccat
atttgaccca
cttgtaaaag
cagagctgag
tcccaactct
tcatacattt
tggaaataaa
gcatggatga
aaaacaatga
gtaaccctaa
gggtgactca
caattagtcc
acattttaaa
taaatgaaat
accatatttt
aacaagattg
aaccaatgct
tctctctcta
catatataag
gctggcataa
tagcaactaa
tatatcaaat
gatagtcaat
tctattgagc
aatttatttt
gaataggaac
ctttctgttt
agtttggagc
gctctttaac
aggacatttc
agtttaataa
ttaaaacgag
gcctgcaatg
ttttatttat
tattttttga
gctcactgca
gctgggacta
cggggtttca
tcggcctccc
ttaaaacaag
aggaagagtt
taacttggag
tcacatgaaa
ttcctacacc
tcctcaaaaa
tttatgtctg
cttctccaac
caactgtgct
gaaagaagga
agctgctctg
caataacacc
gcaagcagta
gatatctctg
aggacataac
gcatataaga
aagaacccaa
cctgcccagg
ttcaagtgat
cgcctggctg
tcttgaactc
gtgtgagcca
ttattggaat
tagaaaaaat
ttaactactg
aagtttaaaa
agaatgatct
tggtggctgc
ccatattgtc
atttttctaa
taaacaagta
atgaataaag
gaaatgaacc
gcctagtttt
cggaataaat
acacatttca
atgttaaaat
gtactaaaaa
ctactctgta
attaaggtgg
tctgtgatgc
tgtgtgtgta
tgcatatgtg
aactattagg
ttttaaattg
atttccatta
gaattagggc
catttgtgga
gtgttctgaa
catatgcagg
ttataataaa
aggaggacta
gccacttgtt
tcatgtttat
gatactgagc
taagcgaatg
tctttctggc
ttatttattt
gacggagtct
agctccgcct
caggcgcccg
ccgttttagc
aaagtgctgg
caaaatgtga
tacttgaaat
gttaatgttg
aagcatttct
acttccttct
ataagccagg
tcataatttt
caggggaaat
ttagacatga
ggcagtacct
tttgtcctcc
cttttccata
cacttggagt
gatagttttg
cctgacttct
taaatttgtc
actcattctt
ctggaatcca
tctcctgcct
atttttgtat
ctgacctcat
ctgtgcccag
gaaacatttg
gaggtatcaa
ggaactgttg
accagagtat
ggcaataaag
cacatgagca
tccacagcac
gagtagagaa
ataaattcat
aataaataca
tagtatttta
ctcattatgt
gaaaataatg
gtgattccaa
cataactcag
atcaaaactg
tcctcatcca
cttaattttc
tgagtttttt
tatatacaca
tgtatatgta
attttatata
ttttcctaca
ttatggtatt
acataaaaga
ggagaatata
acacaaatta
catgcaagga
tgaaaatgca
gcagaaaggt
aaaatttttt
ccagttatta
atggtaaatg
tcctagaacc
tctttctcat
atttatttat
cgctctgtcg
cccgggttca
ccactacgcc
cgggatggtc
gattacaggc
acatgttctc
cttctttcaa
agtcgattct
gcctccagga
cactcatcct
tacctctgtt
aataaaataa
tccattactt
gagatgatca
tcttggctta
tggtcttgtc
cagaacactt
ttgcttccag
ccaggatgtc
gttatgtttc
ttatgtttag
tttttttttt
gtggcacaat
cagcctccag
ttttagtaga
gatccgccca
ctgaacccaa
aacggctgta
taatatctga
attttgttca
tttacataaa
agctctcatt
gaggcagaga
tggaggtgag
agatttctct
aaatatataa
aggcatttta
agaaaaaagt
tacttgctag
taactttaga
aatagtattt
cataattgga
tctccattgg
gttactataa
ctcaccatta
acgagtaata
aacatatata
tatgtgtata
tttcaatggg
ttcccacatg
tgtttcctct
tcttcttact
ggcatctttt
caattacaat
aacgattcaa
catacttgta
attgttagct
gttaatcaac
atgaaattta
tgtgcaattc
cctgaaaaac
ctctgtgcat
ttatttattt
cccaggctgg
cgccattctc
cggctaattt
tcgatctcct
gtgagccacc
ataaaaaatt
tgtatccttc
tctcagactc
agcactgaca
tcagaactca
acatgttttc
attaaggata
tagagaccat
attatgttta
tgaaagtact
tgtaagaact
atttctatat
aaagtgcctc
tcctctaata
acctctttca
aaatatagtg
tttttttttt
cttggctcat
agtagctggg
aaccgggttt
cctcggcctc
actaattgta
ctttgtaatt
gagacagcaa
aagtgggact
aacccacacg
tccacctggc
ggctttattg
tgttttacct
ttgtccgtga
atgtataaag
aaagcaccct
tattccgatg
gtctcaggag
tcacaaagat
tcatatattt
agctggctca
tattatgtat
gtaattaggt
ttaaattaaa
atttattctc
tacacacgtt
tacatatata
cagtgattct
tgcacataca
tttcaaatat
cttctacaga
gtctgcagtt
catagctata
tctggtgccc
aatttaactg
tggtaagtta
ttaattatat
taccatgctt
ctaataaatt
cccctcccat
tgctgatgtg
atttnnnnnn
agtgcagtgg
ctgcctcagc
ttttgtattt
gacctcgtga
gcgcccggcc
aatatggaaa
ctcattcttc
ctgcatttat
ttttcacaga
gctcaaacat
atatcatcct
taattagttg
accagtcatg
ttaaccgaga
tatttgacct
agaaattgaa
gcatgtcgtt
gcagaggttg
tgtggtggca
gaactctttt
ttaggaatag
ttgagacaga
tgcaacctcc
actacaggca
caccatgttg
ccaaagtgct
tgttaatgag
ttgaaactgt
actgatgttt
ttgtttttaa
tcctacccat
tagagttggc
tgcctcagtt
acccaagaat
ctctatcgtg
atacacaaat
gtgattacag
tgttaaatat
gcacttggtt
tatataataa
tatgttttta
agttctctta
tatacttttc
aatttaataa
tacatgaagt
tctttctccc
tttatatata
tagaaacatt
gatcacacat
tattttacct
tgcttatgga
aaaaataggc
tgaaaccaca
attataatta
ttgaagtgat
caagaccaca
tatgtggtga
taatttgtct
aataaggctg
tatcctcacg
cctctgtcat
cttgtcactt
- 140 -
008252
aggggcccct cgtgcctgtt cctttttttt tttttttttt tttttttttt ttgagaagga 60060
gtctcgctct gtcatcaggc tggagtgcat tggtgcgatc tcggctcact gcaacctcta 60120
cctcccaggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcctga gtagctgaga ctacaggcgc 60180
ccgccaccat gcccagctaa ttttttgtat tttagtagag acggggtttc accacgttgg 60240
ccaggatgat ctcgatcttc tgacctcgtg atctgcctgc cttttcctgt ttttggtcca 60300
tactgtgggg acaagatgac tcgtggtgaa aaagaaaagc ctaggaacat agataagcca 60360
agccccatac ctggtttctt ttcctttttg tgctacaact gcctaaatgc gcatctccca 60420
acatgacctc ctcacctctc ccttcttcct ccccagctac agatctcctt atcttcacct 60480
gatgcataga cacccaacac aacatcttgt tttgagacta cacgctattg tggtctgtta 60540
gagataagac tctggaaaca tatttcagct acactaccta ccagtggtac gcgacaggac 60600
acgtttatgg aaaatgggga tgagaatgca gttttcctgg gtttgagaga attattgagt 60660
atttatgact tagtaaagaa ttatttggaa ggaacagacc atctgctcaa agggaacatt 60720
gattgcaagt gtcattcggc ctttctctgc ctgtctctca ctctccgttt gagccacatg 60780
atttctgtct gtgagcctgc ctctgttttc tcaccttgaa cactggcttt attctgtttt 60840
gttttggttt gtttctctcc ttgcatatta cccaagtatg gctgattgtg actgggtgta 60900
atgacctccc aatcaaaagc cctaacgaga ctccccagaa aacacccaaa ggtgaaggtg 60960
cactgggaaa aaatgaagtt gcgtgggggc atcagaaaca ggaggcgtgg ccgggagcag 61020
caggtcagga gagtgcaaat ggaagganan gagcaggtnc tgctgaagcc aagtattgga 61080
tttccctgca gagcaaaccc aaagtcgttt gaaaccgccc tttttaatcc tctctgaaag 61140
ccttgcccca tctctgctgg aaccactact caaccaccct ccttagcttc atggaatggg 61200
aggagagagg acacaactct ttggccatac taagtggtga gacttgactg cagtacttac 61260
aactcaggga tcatttttcc tgtcaaactt ctraatctta taggacttga gaagtttatt 61320
aagagctaaa aaaataggct attacagtct cacctgaagc tcaaatcatg ctgtataaga 61380
tagtttcttt agagaaacac cacgtagtta ctataaactt acaaatggac aatttgtaaa 61440
ttggtgctat tttacaacat aatattaagt cgatttcctt gcatttaaaa aatacatatt 61500
ctgaaataat ttagaaacac agataaaaaa tacctatgtg tctgtcagaa ataataatag 61560
ctaatattta tggaccactc actgtgtgtt ttattaggta ttaaattatt taatgctcac 61620
agcaccataa aggtaggtac taatacgatc tgttttacaa aagaggaggt tgaggcacag 61680
acagcataag gaatttgatg aaggtcacat agttactgaa tggggatttc atctcaggca 61740
gtccacgtta tacttttaac tacttcattt tcacccctgt gtattaccct actgtgaaaa 61800
taacccagtt tcttcattca tttattcatt ccactatcga tggacattga gcttgnnttn 61860
nattgttttg ctattgcaga ccttctaaga cctttcttat ccgtgccttt gtatgcacac 61920
gtgagagagg tgttctaaca tatatagcta ggacagcaat ttctgggtta aaggatatga 61980
gcacctttga ctctctgaga tatggcagat ggctctccgg atgatagggc tattttgtat 62040
gccttctaga aacgtgtaag ggtgctcgtt gtctacatct tcatctgcac ttgatgttat 62100
caggctttta caccagatga cacgaaatgg tgtcctgtaa tgtaaatttg catctccctg 62160
atctccctga ttaatggatg ttgaacattt ttaggttcaa gggccacaca ttttcttttt 62220
tttttttttt ttttttttga gatggagtct tgctctgtcg cccaggctgg agtgcggtgg 62280
cgtgatcttg gctcactgaa agctccgcct cctgggttca cgccattctc ctgccccagc 62340
ctcccgagtt gctgggtcta caggtgcctg ccaccacgcc cggctaattt tttgtatttt 62400
tagaagagac ggggtttcac tgtgttagcc aggatggtct cgatctcctg actgtagatt 624 60
gcttgtttat ctcatttgcc catttatctg ttgatttttc taagtgatgt tcaggaattc 62520
tgagtgtttc taaagggtat attgtttctt tctaaataaa aatttaagat attagatata 62580
aagacaaatc taaaatatta aatgcttgac acatgtgcct ttttcatctc tcccatgttt 62640
agtcaataag gcaattcttt tatgtggtat taaagaaacc gattagaaag ttgcttcgtt 62700
gtgtgcttaa gtgtgagtct tagaaaggtg aaaagttata attgactctt ttagcaccaa 62760
accaagcagg tatatagctg tttaaatact attttagcat aagccatagc tgtgggaagg 62820
gtcactccag tgcttgataa atagaagtct attcaattgg accctcattc ctcagcggct 62880
gctgtgacaa gccgttttcc cgctgctgct caggtaggag ttttcatctc ttgacacttt 62940
gacagatgtg gctgcacact tttgaaccat cttccaacac acccccgtgc tctattacca 63000
tgaggaaagt ctctgacaag agaatgaaag tacatatgca tgagacgtgg tacaatggat 63060
gtcagtttcc ctctggtagc atattccacc gcgtgcctcc tgtgaggaac agagggaggt 63120
aacaggtgct tgctgaaagt aggtcaaacg gtggcgaaat tattccttca gtgttttaat 63180
gctctttgaa aacatttcca ttgaaggcta agattgaggg gaggtggcct gtgtgatgtg 63240
agcatttcaa gtgacaaagt gacatcctag gcactcctga aactgtcttc ttcgtgaacc 63300
ttcccacaaa ctggcagatc atttcaagaa ttgatggagc ccatgagaat gtaggttccc 63360
tccagaacgc agctctctcc ccagcccatt cccacaaaga aactaggttt tccctgcatt 63420
tccagaaacc tccaaaccaa cccattatgc ttctcctttt gtcctctcca aattcaatct 63480
gatccttctt caattctgtc attacttcag tattttgata ttttttgact cattctctcc 63540
actccatctt catattcctg ccctcaaaat caggtcagtg cttcctcaac agagtgatct 63600
ctgattcctt gattatattt ggtcattttc ttttttgttt ctctttcttc tctattgctt 63660
cattcacgat aggcatttgc caaaaatttt ctgaattata cgtgattgta catatccagc 63720
tgcgttcacg tgcagaaaac atagcctcac acacagcaga cccaaattct tactctcccc 63780
- 141 -
008252
ttaggcaggt cacagtcaaa atgcatgcag caggctcaca acatgcacac acaactcaca ggcacacaca acagtgacac gcatgctcac acatgcatgc cagtgacaca caaacacact acacatacac aacaactgct attacctgga gctaaaatgc aacagagagg tatatattca gaatagacac atttttattt ttaaacctca tcaaactaaa ctcttgaatg ttaaaatgtc gcaaaaatga ctccaggtta attttctcag tatgcactct atcaggcagt caaaatgagt tttattaaat
gtcaaacgat aacacagcat agacacacag catgctcaca tcgtgcacat tgtacataca catatctaca acaatcacac acacacctca acacagacat gtgacacaca tgtacataat tcacacacag tggaggaaaa ataaatatta tacttgaaaa ccaattgtat atatgtatct cagatgacca atttgtttat ctggaagaaa ttcctgtctc tttacaatta cattggagac aggatgagtt aatacacagc tgttcaacac aaagctgctg tcagtccttc ctttccttaa atcacaagtg
acttccccca gcatgtgtac tcaaaaacac cgcacacaca acacatgcct cacacagtga cgcacatgct gcacacacat caatgcacac gcatacacac gacatttaca catgcatgct gcgcacacac gtttgtagga aaaccaggaa aggcctattg aaatcctcag aatatatcct ggcataggat ctgtcttact tatgcagaac ctattatatt tattaattag aaatttccat tttctgtttg cttctttaag aatctgcagt acaggtttag gcatttgttt agattctaca aggtcctgca
aatgctcacg
acacacatac
agcatgcatg
cctcaaacac
acacacttat
cacacaatcg
catgcacaca
atgcacacat
tcacaaacgg
gcttatacac
tgcttatgca
cacacataca
attcattttc
aaaagtgaat
aaataaaata
taattttgaa
ttctaaatat
gattatattt
aataaaaaat
ggcaattaaa
attttaaaat
ttcatcctcc
gagacatgtg
caccaaagat
ttcgtttggt
acttaaaccc
agaagggttt
acataatcta
taatgttttt
tagctcaaaa
ttgcattaga
catgcacgca acactcatac tgtacacaca acacagtgac acatgctcat cagacacaca cacttcacac gcatatggct tgacacactg acacacacct cacatgcaca cacgcacata aatttctcag ataaaaatgg gctacatgta gtcagtggcc cccatatata cnaaataata aagattaaaa cagttttgct tatttgcatg agtttgaatc ctaacttatg ttgttgcatt ttggttttgc agggtttgaa ggagcagcaa aaatgtaagt cctaaatact ttattttatt aatgcagtgt
aacagagaca
63840
: aggctcacac
63900
cacactcata
63960
acagacacac
64020
gcacgctcac
64080
catgcacaca
64140
gtacatacac
64200
acacacacgt
64260
acacacacac
64320
cacgcatact
64380
cacacatgca
64440
cctcacacac
64500
gggaatataa
64560
ttatgcagta
64620
gaaaggggta
64680
aaataaacta
64740
tttatttaaa
64800
attatattta
64860
tatcagtgtt
64 920
tctttgattt
64980
ccacattatc
65040
agtcctataa
65100
ccaagcattt
65160
gtcacctttg
65220
aagtcttgat
65280
agtgctgtgt
65340
tatgatgcct
65400
cactttgtgt
65460
ctaaatattt
65520
tatgtatgca
65580
attagaaagg
65640
=. a _> /ff+- +• +• rr"-
uuuu w w w <-) "-
65700
caatttgaag
65760
caaaaccatc
65820
ctcactaact
65880
agaaagcacc
65940
actagtgaga
66000
ccttttagga
66060
tttttctact
66120
attcttattt
66180
gaaaagccaa
66240
tgagtgtatg
66300
ggctgagact
66360
gtcttcttgt
66420
aagcaacaag
66480
taatacatgc
66540
agcatccctc
66600
ctggctcatg
66660
agatagagaa
66720
atggccaatt
66780
atgaatccag
66840
atatatatat
66900
gaaagaaaag
66960
gtaagcaaag
67020
ttttcttcca
67080
taggttagtt
67140
aatccataaa
67200
aagatagttt
67260
ctaaattgaa
67320
ttttattggg
67380
atttgtatct
67440
tcctagtgct
67500
agtctctaaa
67560
gttcaactgc
tgattctaga
atggcgtcgt
tacccatgaa
ttttgtcaaa
aaaatataaa
actcagtact
ctttctagac
ttattattac
gattttagca
tcagaantca
tactgetgga
gcccaaagca
attgtattgc
caaagatagg
ttttaggagt
gtccagttaa
atgtttcacc
gagtacatgg
ecttgeagga
atatatatat
tgttgcggaa
tgaacacttc
agtcaataat
aattgaaagg
tgtaggecac
aaattgtgaa
gctttcataa
caggatatag ctgtagtctt tagtaaggca
ccaccgttta
tgtaggaatt
gtcacctgtc
gacaaagata
gtctgttgag
acatcatgta
gaagtctagg
accagggaac
ctatgtccag
ttttcattct
gagggtcatg
acatgtatag
gaatggtgtg
ttgaactcta
gaaggggatg
ecttgetaag
ctatgtcaac
cccgaggcta
aggaaattaa
actgagtact
atatgagctt
taactaatat
attgttgaaa
gaagtcatgc
tttttgtaca
aaagtgtgag
tatccattat
agaaaatttc
gaaaagttct
agtggcagta
tcatagctat
atactaaaaa
taattagctg
tagcagccct
aagaaaaact
attattcagt
tattcaaatt
aacatcaggc
atgagagaaa
ccaagtaagc
taatttttac
aagaanngga
tgaggcctcc
gcttcctgga
gtgtcctaat
aaagggtctt
acacctcagg
agtaccaaca
ctttcctcag
gttatatcaa
gaagcttagg
tttctactct
tttttatttt
agecaagatt
aggggtattg
tgtcatcatt
gaaaccagga
ggcattgtac
ccatgtttta
gttttaaata
tcccaatgcc
gtgactgeca
taaaagatga tgggaatgtc attgtagtcc cacaacaata aactatgtgg .gtttaatcta taaaaaaaat attattgtgg aaggtcaaca tctagtattt cagccctggt tttgttgacc ataggagatc ttgttttact gggaccacca ggaaactgee ttactttcat aaggaggcag aaattattgt aacaccaggc ttctggacac tcttacccat ttagcatgtt agttcttaat tacttttcct gattttaagt tctaggaaat aatcaattca
tttcttactt cagaaatggc tggcattatg
acataaaagt aatgacatct ttcctgactt caggtaacta ttggcggagt atgegtccat aatggttgga aaggactaat cttcaccgtt cactgacact gactgccaca atcaccctgg atattacttg cactttgtat tctaggttac tttctgaagc ttaatacagg aagatgetec tgaatctact taaaatatat caaggaacat gtccagccaa tattcttaat ccataaatta ttctcctact agtgttctat acatgttgtc agacagatga
taactgatat ttttgtgtgc attgataagg
- 142 -
008252
cagcagaaaa ggactatatg taatatatat gacccagact agagtaacaa agctaaacac 67620
cttagaaaag cccagaaaat agtctcccct tcccacaagg gttattattt atgatcaatg 67680
tatgagtttt caaataccct acagcagact cagagatgcc ataagagctg ggggagctgg 67740
gtggtgaaca atcaagttga agtccaggag tcctgactgt tagcattttc tgctttccat 67800
aatgtaaatg ctcccaccat ggccaatttc aagtcaccaa catgacatca gtaaacatga 67860
aggtggagag agatgtgatt gcagctccag cacaccacag ctggggcaag ctgcactccc 67920
actgcagtca gagatggcat atacatacat acatgtcata catgtctatg taaacacgtt 67980
gcaaaatttt gtttgcagaa agtggaattt ttgatgcctc catccaaagt acctagtttc 68040
caacatcact gtagagggaa agagagaggg agactttcga gaaggcacac cctttctcaa 68100
agtgacacat ccaaagtgat gcatcacttc catttctgtt ctggttgtga gaaccaatca 68160
cattgctcca cttcagtaat agtaagctga gtgatgtaga tgagctatat gccaggaaga 68220
ggaaaccagc ttggtaggta taatagcttt tgctaaacca caaggcatcc taaaacttaa 68280
tggcctggac agacactaac tcttgctcat gaatttgcgg atcagttgaa cagccctgct 68340
agtctgagcc aatctcagct gactacagct gagctcaccc ctgcctctgc ggtcagccac 68400
tcgtcagctg gcatctctga ttttgggtgt ggctcgccat taattggaat gaagagaatg 684 60
gcagggccca tggccacctg gccaccatgc aacaggctag gctgcagggt tgatgtggtc 68520
gctcggggtt ccaagagcag caagagtaat ttctaataca caagtatttt ccaagtctct 68580
gcttacttca cctttgctac catctcactg accaaaataa gtcacatggc tgagtctgga 68640
gttggtgtgg aggatactgc caaggatgtg tggatacagg gaggtgaatt caattggagg 68700
ccactgggtt ttttcacaca ggctaagagg aatttgaaaa tcactggctt ggcatcataa 68760
tcaatcctgc ttagaggtga tttctttcac accagccatt actggtgctt tttccttctt 68820
gttaaaatct agtttgtgtt gtaaagtcaa gaggagctgg tgattgaaaa aaataacatc 68880
cacatgtgtt tgttgatttg tgatttcaca tctaacctta ctcttacaga gtagagtgaa 68940
agctatactc acatggccta gagataaagg gtctgtccag gattccctta ctcggctctc 69000
cattccaata aagagagcca gccactgata gggcgtggca gctggcaggg tgtccactga 69060
aatcataggc tcttggtacc tttgtggaga tggacatgtg gattcccttc tgtcctgact 69120
ctctaaggac gcatcaggaa cagacagatg ggaaaggcag tctctaagga tatccactgg 69180
ttatgttttc agtgttgata taagtgttac ctttttcata taaattcttt gtattggaca 69240
gaataattgt gtacattgat agtagaagta atgaatatcc agatgtcttc taaataaggg 69300
aagcaaaaga tgtcccactt gcaaatggga gatttatttt aggttttatg catttggtct 69360
tttacattgt gtccttgttc ttatgttcat ggctcatatg caagatggtt tctgagaatt 69420
tcatcatgta attgcattgt tctccaaata agtttatttc aaaatccaat taaaacacaa 69480
gttttagtac atggctgatg cagtattcag tggaggagac tttgttttac taagttgagt 69540
tgttttactc actcaagcag caatttaaag acagatttca tttctgagct gtactattca 69600
ttatcctaat ttatatttat tgcaacctct gagaccacta ttttgtctct ttgcctacag 69660
tcttcagaat ctttaagtta ctgtttcata ggaaaaatta ttggagaaat ttaatagaaa 69720
gagcttttat gaagtactta agcatttata ccacaaaaaa agataagata gctttagatc 69780
attttgaaag tttataaatg ttcacggtcc atttcaagat tactaatctc ttccnnnnnn 69840
acctgatttc ttatgttaca ccttcaggcc ttccctgtaa gcaactgact gcatctctac 69900
tttcaaatcc ttagagtgct ttccaagact gaaataatga gagttacaga gcacacggtg 69960
tccactgcag gctagactct acactgaagt ctcatttatt ttcgttttac agccaaaaga 70020
tgtagatgtc atcatactca tttcctctgt gagaaaactg agtcacagaa aggtgaaatc 70080
cagcacagag acaagattta aactcagttc atcctgtctt caaaattgat attccattaa 70140
accatggcaa tcttaaatct ttctgtgaaa aacagattgt cttcagcttt cagatttagg 70200
gttcatgtac ttataccttc tatccaacca caaatacttg gtgaggaagc tgctgtcact 70260
cttttttaat atatagagca atgttgactg atgaattttg actgtctgat acaaggcaag 70320
agactacctg gtttgggctc acaatgtcta agatgtttct atctctgtgg gcctagaaat 70380
ctacttagac tttctgagcc tgtttctcca tatgtaaaag gggatgcaaa agtatctacc 70440
tcacagagtt gttgaggatt aaagatgtta ttacatgagc aagcaacatc tttggaatga 70500
atcttggcac aaaccaagca ctccagaaaa cagtagctct tatttcaata atccatcctg 70560
ttggtgtcca ttttaattgc gtgagaagcc ctccccgtgt ttggcttaga cttccacagt 70620
ctcctgggag gtttgctttc atggcaggac tcagaatcaa tgcgggaaaa agtgaccttt 70680
cttgttgttc tgcttgaggt tggactcagt cccattgttc cagactcatt gtctcattac 70740
acttttggac acaaagcaag atgaaagcgt tggttgctgt tatgagtttt atatctgtag 70800
ttgtcaaagt tacagagacc ccacgttggc aagtcacctt gtgtggaacc ctatggtcag 70860
gtaccatttt gtagccctgg gcacttttat acnaatcatg tttcnataga aggtgatttg 70920
agctggtata caagacagtt tgagctggtg tctgtcaaaa tcgttgacaa tgctgtgtta 70980
gtttcctgtt gctgctgtaa caaataacca caaattcagt gacttaaaac cacacacatg 71040
tattctctta gaactctgca gttagaagtc caaaatggac ttccttaggc taaacacaag 71100
gtatcaacaa ggctgcattg ctttgggaga ctctggagaa gaaatggctt ccttgctttt 71160
ttcacatcct ggaggccacc tgcatttgca tttcttaact ttatgagagt ctgtaatgat 71220
gtctttataa tgcctccaaa tggttgcaaa actaacacat gcttttgttt ttatgaagcc 71280
aaacagattt agttgatttt tgaccatgga gttggggtat ggggacaagg ttggcagcca 71340
- 143 -
008252
tttttatgtt tagtcattat cccagtgcag gctcacgaat tggggcctga acactttgag atagactctt tcaaagccaa tgacattgca ttatattaaa atgtactcac gagggataga tattttgtgg aaaaaattga atgtcatcag gaattgagtt taatatttaa agttactgct gtaagtgatt caacctaatt agtttcctga taagacataa cagatgaaat gaaaaggaat aaaaatttta agtcatttct tgatttttgt ggtgacagga ttagatcctt taattaattc tcacaaaatt
K.^ w -.W-.-.UVfW
gtactatttt acagtgccag aggataagga gaagaggcag atccacagct ccagacagta tgtgtggtgg tcctttccat tctctccatt atagactagg caccatatag ggattatgac aatgaatgtg tcatgctaaa aactggggat ctagtatcat caaggatgcc ataggacaag tgtttgcaga aagaactgat tagcatttct ttacggtagc cataatgaac atattccata cagtctacag aaaaaaattc acaaagctgg aaacgccgtg cagaaggaaa actggggaaa aactaacccc agtgtagtcc agacttttag cctgctatta cacctgggaa gatcctgcat taacaatgct tgtattttga actaaaaaca attaaaggaa atatataaat atacacatat tcatgcatcc tactgactca aaagtataaa cctttttaca gaagtgggcc atgtaggtac ttggagaaag attttaataa ataatgacag cagccatggc atccacagct ggaaatcagc aatagtaatg atgagcatag gcaagtaaat attacctgta agccttaata atcaatgtta ttcaacctcg gcattccttt
aacatattac aatcatgaaa aggagtatcc ccgtgttaaa tcttaataat cattcctgac aaattccagc tatccaaaac actttaaaaa aaaaaagaat actagagatg atattaaata gctttaacat tttggacttt ttaaagaaac atgccactag tgcacatatt tcagctaagc ctctgaacca caccaaagtg taaaagcttt aaggaaaata agaaatattt gaatttaact aaatgtgcca tgatgtgcat aaataaagtc aaagtctact cttacctcac ggtaattaat tttctgtaaa
attccagcca gcatctgtgg tattctattc ctgtgaagtt gcaaataatc ttataggtca cctacaacag tgcttctcaa aattcaacat gatacagatt ctgattcagt aggcctggga tgcttccagg ttgctgctgg tccagggacc agataatgct gccttgggga ttaatctagt tgtcatatac acagataagt aatttttgga tcctctgctt ttaaaaaatg taaaccaaaa atcaaatgtg tatgtggagt ctgaaggacc atgcacacac atatgtgaat ccacatatgt tatgtgttca tctgtctaca tagataggta atgcaattgt gaagacctca agtcatataa tttcctttat attaattttt attagaaaat cctgtagata caaggatgaa tctaaatgta tgatagccag tttcaagcac tggctgaagt ctctaacttt aaagctggag ttactgattt tatcacctta attcttattt aatatttgaa aatggtgatt atagtgtatc aaaatccatt acagggacat gtagacattc agacaaaaaa aagctgtgac agttacaaaa ccaatttaaa gtttggatct ttcagtaata acagtttact gaaaaagaaa gttgtggctt ttctgccatg ctaatagaac attatgctga aaggagtata ctcacaatgc aagaaagact aaataacaat gatgatttgc ctatctgtgt tatgaaggtc ataaacatgt tgattggcag ctctggaatt aaagggaaac ggatatgcat caatagccac ttcccgatgt cactggcatg tctcaaatta tagactatgg gctgagtctg atatgcaaca ttctcattcc cgaacagaaa aatgcttgat cctttgtaga atatttgtaa gtgtaatcac
fff aaanff a a ?• а а г+л a rr +¦ r* t-1- +¦ rr /та a rr
ctccacttna
taagtggtgg
agaccccatg
ttcttgttct
aaggaaaata
agggcatgtg
cgctagtccc
aggtctgctt
taagtattct
gtaaaatgac
agctatggtg
caagtcggat
atacatccta
aaagcatttg
agaaggaaca
actgaatggg
cactatcacc
agaaagatta
tgatatgatc
gaacaaacct
ataagccaac
tacaaataaa
actatcaaac
ttcatggatt
atgcaattga
taaaattata
gggaatcaca
gtactgccat
tccacacacc
agagagttcc
tatctctgta
tcaatgagaa
agttacggct
aaacacatac
cttaccccat
gctctttgag
ttaataaata
tgggcagatg
ctctctcctc
ctaccccaca
ttagtctctc
gatattaaag
ttatccctgg
tcaacagaat
gcaaaattca
tacatcaaca
gaaaatctga
tctgttattc
aagggcatcc
ttatatttgg
agtaatgttg
agcaaacagt
ataaaattcc
agtgatgaaa
ggaagaatca
atccttatca
tgaaaccaca
ttacctgact
aaaaacagac
tacagtgaac
ttcaataaat
aggtacaaaa aacagaggtt
ccaggcagtt
atagagtcat
tttagtaata
ctgcaaggac
cccagaagaa
tggctcagtg
tttctgctgc
gtgggcagcg
tgaactgtgt
tagataaaac
gatacaagga
gaaggataaa
acatctcttc
taataaaagc
aaagcctttc
aacatagtac
aaattggaac
aaaaacctaa
caggatacaa
gtgaaaaaga
ttgcaattaa
gaaatcgaag
atattgttaa
aaataccaat
gaagagccaa
tcaatttata
acatagacca
tcatttttaa
ggtcctggac
atcacatcaa taagtaactc
tggcccagag
ggagacattg
acagtttgct
taaaggattc
atgaaacctc
gtgtgttgtt
ccagggcctt
ggccccagaa
gaaatgtgag
aaataacatt
tgattcaaca
agctatatga
atggtaaaac
tatatatgac
ctctaatacc
tggaagtccc
ggaagaagtc
agactccaca
aatcaacata
aatcaagaaa
ccaaaaaatt
aggacaccaa
aatgttcata
gatattcttc
atctatccta
attcaaagct
acgaaacaga
caaaggtgcc
atccatatgc
aatggattaa
ccctggggcc
cacctgatgt
gcagtgctca
taagacataa
tcaggtcaga
agaaagagga
tgtgctcagt
cagcctccac
tggactttaa
taatatatct
tgaataatgt
tatgcaaata
tcatttcaat
ccctcagcaa
agacccacag
tgcaacatga
agctagaaaa
aaattatcct
aggaaactat
caaaaattag
gtaatcccat
gaaggatctc
aaatggaaaa
ctacccaaag
acagaaatag
aacaaattga
acagtaatca
atagagaacc
aagaacatac
agaagaatga
agacttaaag
- 144 -
008252
ctatgacctc ggactgggca ggacaaatgg agtgaagaga attaataacc atcaaaaaat caaacaggca ctacaatgag ataaatgctg aattagtaca tgctgtaatt ctaagagaaa aacctaagtg agcactattc tggagatcat cacttatttg ttggttgcca ggaacaaaaa ctgcagtcaa ttgtaactca tcaaaacatc tgtgtgtata tgaataatat tcattatggc gggcggatca ctactaaaaa tcgggaggct gatcacgcca aataataata cagtagactt agtgggaaag
~--.4-r-.4-4--. 4- n ->
yw-yLLOLVja
atgtacatgt ataagtaaaa aaaatatttt ttactagctt accaaccaat agtcaaaagt ccttgcctgc tgcatagcag atgaggttta catccgtttt gcaactacta taagcagctc tcttagagat tcattgtctg accgcgggcc ctgggtctta tcagcgtaca aataagctgg taatgataaa aggtaggttt aaactatgaa aagattttat gattacatca caacacacag agaatatata gggcaaaaga tatgaaaagg acatcatatc gtgaggatgc atcactatgg tagcaatccc tcttcactcc tccatcaaca aaccatagta tatgttaagc tgggatcaca gaggctgaga aaantagaaa taataataac aaggataccc ttgtgtactc tatatatata ggcctggaac caggcatggt tgaggtcaga tacaaaaaaa gaagccggag ctgcactcta aataatactc ggaccagact ttacttaacc
r- 4- 4- - -.---.-- - 4-
cacttactag aataaatctc catctgcagt tttaaaagcc taaaaattaa ctctgaaacc ccagttcagc cacatcacaa tttctttgtt ccacatgttc caaaggagaa tccaccgtgc gcaaaagtga cttcttaagt tgagtcatct ctctagaatc ttagtttgtt tcagctcagc ttactcctct catgattaaa attactacaa
gagcaatacc
agttacaaag
aattagagaa
aggacctgaa
tttgaataga
tgttcaacat
accccagtta
gaagaaaagg
agaacagttt
actgctgggc
catgtttgct
gacgaataga
aagaacaaga
gaaataagcc
aaatcaagat
tgggtactgg
gaatagataa
tgtacatttt
cattctccat
cataaatata
tatatannca
atagtaaccg
ggctcatgcc
agatcgagac
ttagccagac
aatgacgtga
gcctgggcga
attatttttt
tgggttccag
tctttgagcc
gtaaagcacc
aagttgtagt
aggtttctct
attctcccta
atttatccat
gatgcaagcc
atcttcctag
agtgtgggac
aggtgctgtc
aagagtctgt
atcctgagca
aacttcagga
agatcgctgg
agtgtagcct
ggttcctctg
tcctcacagt
ttgctgtttt
tcctactaag
aatacgtaga
agaaacgggt
taagcatctc gaaaacactg
cccataagca
cttctgcaca
aatatttgca
acaactctat
catttctcaa
cattgatcat
aaatggttta
gaacccttct
gaacattcct
atatacccaa
gcagcactgt
taaagaaaat
tccagtcatt
aggcacagaa
aatcaaactc
ggggacgggg
gacctactat
aaaataactt
gatatgctta
tatnngtgta
cttactatgt
tttaatacat
tgtaatccca
catcctggct
gtggtggcgg
atccaggaag
gagagcgaga
aatgtttaat
tattgagtcc
tcagtttcct
tagaaaaact
aaaattttca
tacttttcca
aacacagaat
acagtcagaa
atacacaaat
tcactgttta
atggatggct
agccaaggac
ctgtttcgcc
tggtgaccgt
ggcagtacga
gcaaggagca
gttcattact
gtcacagtgt
atgtcacgtt
cctatccacc
tacaagcagg
agagggctgg
gttacaacct
cctagcactc gggaaaatct
ccggcaacca
gcaaaagata
aactacccct
aggaaaaatc
aagaagacat
cagagaaatg
tattcaaaag
acactgttgg
caaaaaacta
aagaaaggaa
ttgcaataag
acagtacata
tgtaacaaca
agacaaacat
atggacatag
ggaggcaggg
ttgctagcat
aaagagtgta
ttccccattg
tatatatata
acccacaaat
gataaccttt
acactttggg
aacgtggtga
gcgcctgtag
cagagcttgc
ctctttctca
tatctttatc
atcttcaatc
tattagaata
ccaggtagag
acaaatattt
gttgtataat
aaagaaatac
ttaaggataa
gatatatgtt
gctgcctgaa
ttatcttgga
taagtcaatt
ccctcagaaa
ggacgtgatc
cgagttctac
ggtgaaccgc
tgactttcac
ggcctgattc
gccagggtaa
tcttattatc
cacagattca
aaggacatat
acattaaaga
tacatatcat ccaggacatt aagcaaaaat caattaacaa ctgacaaagg taataatctg acaaatgaca caaatgaaaa tcaggcaata tgggaaggta aaaattgagc ataagtatat atttggaagc tgcgtaatgg tggatggaac cacatgttct agagtagaga atggttaatg aatacagtga acataatcat catgcctgta nntttatgtg atttttaatg ataataatac aggccgaggc aaccctgtct tcccagctac agtgagccaa aaataataat ttaatgtagg cctgtttgac ggttcctagg
-. ~-. - -.4- -.4- -"
ay u> aay ua uy
atggnaagta aatcatctct ttgttttgtg atactaccca ttccattttt agaaaggttc agccctgttt acacttaatc atgatgcggt gtggcggcta ctggcggagg ggacagtgcc caaagctgaa atttcctgtc cccttttccc tctccctttc gaagatcata agagagatgg caccaattaa attacagttt
aatttttatt aagatctttg acatatttac tacatacaca acagaaaaaa atttgccata gatttggtta gcatgtacct tctgaattct ttttactggg tctttcaata tttttttaat aaaaaaattg gttgtacaac gtcacaattt taattaagtg ataaaaattt aacgagcata cctcttcatg ctacagtctc agcattttgc gtaaaaactt attgacaacg gcttcaataa tattattttt ttattacatt agtctaccca gacatctacg gaagtatgtc tgtgatgcaa atttatatta acctaaaata tagaaaccca atccaaccta accaaagcat cctagaattc cgcacaagct tggatatcaa tcctgaaaca catttgccca aagcatttta tatctcagaa ttcattgtgt tgaaaaagta ttttcacata tctcagtaca tttctgaaaa gaaactttta aaataccgtt atggccacct
statttt ataattttcc ttcaatggtt gagtgaggta aactgaaaag aaaaaaatca tttaaaaatt agaattgatt agtagtcgct aatacaaaac ggtatatgga
- 145 -
008252
gcttacaatc tagcaaaaaa aaaaaaaaaa aanncaataa acaataagag tggagaacta atgacagggg ctgatgaaga aattatatcc agcccagcct ggtataattt tgctgaaaat ccagcacacg atgaatggat tgtcaataaa aggtcgggta tggtggctta cgcccgtaat cccagaactt tgggaggcca atcacgaggt caggagttcg agacaagcct ggccaacatg gtgaaacccc aaaatacaaa aaattagctg ggtgtagtgt cgggcacctg taatcccagc gctgaggcag gagaatcact tgaacctggg aggcggaggt tgcagtgagc ccactgaatt ccagccaggg tgacagagtg agactccatc tcnaaaaaaa cagaaagaag cctagactga tactaatatt tgcaggtaaa tttctaacac caatgaagga agcctcatca agttatttct gtttttccca ggaagtagga gcatccagcc agatgatgag acagtgaagt gggaagttgg caaagaaagg gaggtgcctg gggttaggca aaaaattaac aatacagcaa atgcaacatt ttaggactat ggatttacag tgataccaat tcagatagct ctgcgacttt ataagaagag ggaaaagcaa catttaaatc aatccacctt tagggatttt ggggaactga gaaacaaggg gaaaagatgg attgctggca aaggagttga ctgtggtttc tgttggatgt ggaaatggga ggagaatgga ggagtgaagg atggtctcta tatggttaaa ggacgggtac caccaaagtg atggaataat gaggttatga tcagagagtg gagtccagga ttttacaatt ccagggtaat gaaatataaa atctagggtg tcacgtgaat gtgggtggct taaacatatt aggcagaaat ggaaacgact gttgaagcta aggcgctggc tgagtcttca gaagtcactc agagtgaggc cagttcttgg agagaagagt ggagtcaggg cggggaatga gcgagtgact gatgaacaga ttgacagaag gacagaagac agagtgggtg acagcatggt ttaacctcat ggaatacgtt gcaaaggagt aatggatggg cacctcttcc tcgtctacat gttctactag aaagggctgg aggggtaact catgtatttg agagagaatc agttgaggca cagacagaaa ggaacagaga ttgataatgt agaggacatt atttaacgta ggagagactc tcaaggctct gaggagggag aagtgggaag atcgatgaga cagaagaatg aatagcatca gtaggtaaag atttgctggc aaaaatgcca ggaaacaaaa ccacaagaga ttacagttat gyttatctct ctgggaggag gaatctgcat gggaatcttg acattagaga ttacagtaac attgcttttg tgatctagca aggtggtcac actaaatcag tcctggagca taagtgaata ggccctccac
пгаппггз -а л/ч
i+-+-+-+-a -.-+- •" -.-"+¦ 4- +¦ +• f/".*•-(¦
ttcctaatgt gtttatgtat ggtagatgat ttatcctcat accttaagaa aatgtcaaat aattgaatgt tgtagagttg actggttact atttaagtgt ccaggggtag ttggtaaatc cttgtctttt ttctttttta tataatatta caacctcaac aacagacaga caggattgga tggtggaatt cagtatatat ataattgttg tcccctgaca ataataataa gaaagggtgt gggaggaaac ggtggatatg tcaatggcat tgatggtaat .ggtttcacag gggtacactt tcatcacatt ggtacattac atgaatgcag cttttaacat gtcattcatt tttttttttt ttttgagaca gagtctcgct ctgtcgccca ggctggagtg atctcggctc actgcaagct ccgcctcccg ggttcacgcc attctcctgc caagtagctg ggactacagg cgcccgccac tacgcccggc taattttttg agagacgggg tttcaccgtt ttagccggga tggtctcgat ctcctgacct ccgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccaccgcgcc tcattcattc ttaacaaagc ggcaaatcag ttaaccagct aaaaactaac ggaaaaataa ataaataaat aaactaggta gtggtgattt tgttgactta tagaccccat cagtgtactc ttgaactact taagcattct gaatttgttc tttggggttt ttttgttgtt gtttttgtct cctttttttt tttttttttt gtcccactct gttgctcagg ctagagtgca gtggcaccat ctcggctccc gcctcccaag ttccagtggt tctcttgcct tagcatccca agaagctggg cacccagcta atttttgtat ttctagtaga gatggggttt cgccatgtta tctcaaactc ctgggctcga gcgatccatc catcttgacc tcccagagtg
астПГУпЬпапг* rahr-rf r"r-t" rrnr^rrii- t- r"r"a" r*t- r ccccaagtat gtttcgtttt tattcagatt acattgccat ttctctttgt tatacatgag acaaagtgat ttgtttcaaa tgaatgtgaa aaagtcactt tactttttca taatatattc tatttttata aagtttataa agatgtcttg agggtttggc aaactctttc ttgcagaccc agatagtaaa cattttgcct accctctctc tgtctcaact actcaactct gaaattgtac aaaagtgagt atggttgttt tccaataaaa ctttatttac aaaaatggat cttggtttaa cagagagcaa tgtcaaataa ttgaatattg gattatattc aattatttaa aataataaca ttttgtgtta aagtcaaata ttttaatact gacaacaata ttttgggggg cccattatgt tctaagtgct ttaaaagaat tcattgtctc caaaatagtt ataataacag caattcaagt ttatagacta taatgatgca
; ttttgtgcta
78960
: ctgaaaaata
79020
, agcagagaga
79080
. aggcgggtgg
79140
atctatacta
79200
: tactctggag
79260
caagagcgca
79320
aaaaaaaaag
79380
agggaaagaa
79440
agcaaggtct
79500
ggagagggaa
7 9560
aaagatccat
79620
ttagccctgt
79680
tttcaggtta
79740
aatgatgacc
79800
tgaaggatca
79860
agaaccagaa
79920
tctaagtaat
79980
gatggagtca
80040
catggacatt
80100
agcaaagtca
80160
agctacaggg
80220
atcaaggagt
80280
aaagggctgc
80340
gtagattctg
80400
aaagattagt
80460
atacaagagt
80520
gcagaaatga
80580
ctgctcctga
80640
cagggtgggc
80700
actggcaaca
80760
aatfnatrrf
80820
attccaacaa
80880
attgtagagt
80940
aaaataaaaa
81000
tatgtgtcca
81060
tttgagaggt
81120
attcccaagt
81180
cttttttttt
81240
cagtggcggg
81300
ctcagcctcc
81360
tatttttagt
81420
cgtgatccgc
81480
cggccacatg
81540
ttgaaatcct
81600
aacaaccaga
81660
cactctaggt
81720
ttttgagaca
81780
tgcaacctct
81840
ataacaggca
81900
gccaggctgg
81960
ctggaattac
82020
rrt-1- t-rrar-l-t-t-
82080
atcagaaact
82140
taattaaact
82200
agtttaggcc
82260
tttgtagacc
82320
gtgtctcaga
82380
gctatagaaa
82440
aatacaaata
82500
aagctatgat
82560
atttaattct
82620
gtatgtaagg
82680
- 146 -
008252
caatagcatt
agcttttaaa
tctaaaataa
gaataaatta
ttaattaacc
ctatgcataa
tgtgatctaa
tacattttaa
tattatatga
cacaggagat
acagatggga
ctgtgtcacc
aatggggagc
tttccaatga
taaattaact
ccatatctcc
aattccactc
ctctgctatt
ctcttagtcc
ttcacatgga
agaagggcct
aaataaagta
agaagctata
ttgtggcaat
acaatttcca
taaatccgtg
ttaagttgtc
aagttacagc
gagactaaat
tacctatgat
ttctttttct
ctttntttts
attataacca
gtttgggtca
gtaccacttc
atgcatgctt
tgggaaattg
gggtatttca
attagaattt
ttgtgaattt
aaagtgcttg
cttttttttg
tatacatttt
atttcctctt
agtagtatgc
tcttttcttc
tgattcagtg
aaaggctaga
gataaggact
ttcattcttt
acaattgtgt
tgttgtcata
fnbrnatat t-- -э - - -i- - - - w
attatgaaaa ttcagttatt tcttccacat ataatttcaa ttcatagcca atttctatgt tcatatctct aatagaggca tgatttcatc gctcacttct atgtaatatt gaagttattt agcactttac agatacttag tacatttaga acagaaaaag gagaatatat aatatatatt atgtatttgt taaaagcttt gagatacaac ccctagcatt tcaatcctct agccagaggg agaactcctc ccaacttgtc cacccccaga aagaggatct cccacaggaa tataaaattt agtatccttt aataagatat gttctgtgag aacatgattt agtcagtgtt tttccaatag ttgtcggagg ttgagagaat taattttaca gtcagaagca atggttattt
ttgaaaagtt tttaagttcc ccattaagag cttctgttgt attagttaag gtaaagttta tattattgca attttcttaa atccattaga atcttctttt aaggaaggca atccccagct tccacctcct gagaaagaag ttaccctcaa atcagccagg cttgcatctt agattcctca atatttattt ttcatctcat cttacatggc ggccatcgat attatctggt atcaaagaaa tgtctcaaca atctaaaaat gaatgagtca gttgtttcta caaataagat accattagcc ttccttcttt
tattttaaaa cacatattcc ccaactcaca gaagctgggg aaacaggaaa ttttcctctg cattaaatca gaaataaaat ctgtacattt atctcaattc acggacctac atgttctctg ggtgttaagt tcctaggact ctctgtctat caggctcttc cacttgcttt gaaaagaaag taaatacatt ttcaattata agttgtgctt gtgtgactct gtaatcttga ttttagtgac catcatatcc cattctctat taaactgcca aaacagatta ttgggcagga tttgtgtatt ttgaaatttc
atggatcaca
agaataaatt
gtctaaaaat
acttgttttg
cagtttacct
taagaatttt
tatgttataa
ataagcaata
aacaaaattt
ttcttttgag
agagaggccc
atttcctcta
attaatgagg
ctgtgctaca
ccctcctacc
ccctgctact
ttgttcagca
tatcatctat
cagagtttct
aagtcagaga
ggtgatgggg
aaggacctct
gtgaggtgta
tctacaagaa
atatgagcag
tgtggtagac
aggtgctagt
ttgatgaagc
ttagacttat
aatatgatta
tatcctttga
<- V- С l"V_- "_ W- \-¦ V_
atatttgtgt ggtttttcaa ttgatctcct tataatagta attcatgtcg attgcttcca ctgtgccaca gtcagatatg tgtcaattta ttcaggattt cttggttacc ctataatttt agtgcagaca aatagaagtt ctttttgtgt gttttcaagt tgattttttc cctcactcct ttctggacac agtgctatcc
r"t-1- r*t- i-пяпл
tttaattcat ctaaccttcc tttttgttac ttacattttt gcaactttac agataattgt gatttttttc gtgatagtgg attaatgtca atttctaggt
aat ua^c-aat-j
gtccgtcacc
tcagaaataa
ccttctccct
tgaagtatta
attgaagcat
actttttgct
tttgggagag
ctcactttca
cattcctacc
ttaagtttct
atagagattt
gcctgtttaa
tctcccagcc
attaatttta
cttatctata
tgtgcttttt
cccatatata
gtagtgcaat
ctcagtctgt
tttataataa
tttgttttat
tttagtaatg
ttagtgtttt
attcatgcct
attgatgtag
tacaattggt
atcttctgaa
ttcttttatt
acatgctggg
tttgtaggtt
tgccaagagc
cagattttta aacatcatta aatccacaga aggtgccact gaatttattt gttgaaaaca ctctttctaa actttgctaa aggatatatg tacaatctca gacctttttt tctgtaccct ttcagcttgt acactgtaag ccagagtcat caattttaga aacaattgtc ttctgtcata gtctatacat accttgagat
aaaaattaat gtagagtaga gaactatatt ttttcaatcc gttctgcatg atacttcagt atatatacct atattgttaa agcagctcta tataatcatt tcgtattctg aattgatttt cttttaactt atatagtcat taaagacatt ctccaataca cttcgaagat tatcaggttt caaagcttta ctattagggc
1- <-1-t-rfi~-r- = 1-t-
agattttaat ccaacaatgc acatatccta gaataatatt tgtttgtgat attaaggttt atccgggtgt tgtttttcta tttatagatg atttctcatt
tgatgttaag tttataattt cagtttcttt aattttttat catccataga tgtctttcca gggtctctaa tattttgata cctttcatca atgagttgag
acaggtcatg
82740
atttagaaaa
82800
caccctttaa
82860
ttactttgga
82920
cttttgtagc
82980
aacttttcat
83040
tgaacatgat
83100
tttttcttat
83160
atcagcacag
83220
aaactcacaa
83280
aaagttagct
83340
gacctatctg
83400
acagtcatgt
83460
taccccacag
83520
cagcctactc
83580
catgcacagc
83640
aaacaaaaag
83700
tacttaagcc
83760
ctgcaaagat
83820
acagagagga
83880
aatcagaggt
83940
ttctactctt
84000
tacctaaaat
84060
gaaattaaga
84120
ttttagttat
84180
taaatatgta
84240
tcgctgagag
84300
aaaacgtgct
84360
ttatgtcaga
84420
ttttgcagga
84480
aaatctgtga
84540
v-aijavjaHcia с
8 4600
agtttttcat
84660
agatccctgt
84720
catcatatca
84780
tcattatatt
84840
taagggcaat
84900
aaacattgtc
84960
agacttaaaa
85020
attgaacttc
85080
cttcatacta
85140
atagtcttaa
85200
tcagccctga
85260
tcagttatct
85320
ttatttgctg
85380
ctttaatttt
85440
ctcttatagt
85500
tttggaatga
85560
tcattgaaaa
85620
acacatgtgc
85680
gttgataaca
85740
aagctactga
85800
85860
aacatctcta
85920
tctccaaagg
85980
tgtgaatgaa
86040
attgacctaa
86100
cttgattgga
86160
cgtctaatta
86220
taaaatgttg
86280
cgaatgctta
86340
tgttaataaa
86400
tattcaatct
86460
- 147 -
008252
tcttctacct
attagaataa
atagcattac
ataaggatag
gaagttacac
aagaatgaat
ggtggagaaa
ggtttgtcag
tctcacattt
aatccttttt
ttctgatgct
acaagattac
acatatgaca
atcaacaggc
aatgactcac
aggttgcaaa
acatgtgaaa
atggatgtga
tgaggcttct
cacaaggttg
ccagggtcac
ctacttccca
cagcttttag
ccaatatttt
tttattattt
tactggggtt
gttcatcgca
gatagactgg
aaggaacgag
caaactaaca
gataatgaga
gcctatcagg
taatacctag
taacaaacct
taaaaaaata
attttactga
tttatttaaa
ccctccctct
ctggacccta
atatgggtga
tttttcagat
gtcttagcct
ctgtcttttc
ccctatagga
tgcatttctg
tcctgttttt
ctcattttgc
gaagacattt
aaatctgaca
tcaatcttgc
aaacttcaag
ctggacatta
catccatctc
tgatttacag
aatctgaatt
ctgtaatctt
tgaaattaga
cactcatggg
gttaaactct
cgttttgaat
aagcagagat
agctcaaggg
ttggccacct
atactgagct
tagatatttt
ttttaataaa
tagttctgtg
ttcctttcac
aaagtccctc
gggagaagag
tttcatggtt
ccacagtttt
gctgccaata
aactacctgg
ccttactcga
tatcatatgg
taaaaactcg
agaaatcagg
tcagagccag
cttgctgttt
aacaatattc
gattgggatt
gagtttctga
cataaataac
ggaacttgag
tttggttgac
gaactattaa
tctctttttc
ctctgggtgg
gcactgttca
ataaagaaaa
atcacatcct
caggaacaga
acactgaata
aggtgggggg
gtcatgggtt
gcatatcctg
aaataatgaa
gagtaaattc
atctttgcat
atgatcactt
ccatccagag
tatcacagtt
aagctgataa
tgggtagttg
actatgaagg
agcaattgag
gtcaacaaag
tcctttgatc
cgtcttgcag
ggttttatga
cccacgtttg
catagcagca
taaataggtt
tcttgttagg
aaaatttgct
acagctccag
tcatgtaaga
cctttgtgat
aaacagagac
caatgtccat
gctgttgtta
aaagaactgg
ttattgaaag
ccccagatac
acttggtgtt
gactacacag
gatactgaaa
caaatccaat
attttatttt
aaatggaata
tggaacacca
agatcttgat
tattgcttgc
ctctcaggat
ttgtttattt
attttagacc
gatactaact
ctaatatggt
ggggtttcca
aaagtgctat
ccaaaagaag
cctcttttca
agagcgctga
tccttaggta
catggccagt
aaagatacct
gcaaaagcca
actaacagtt
gtccctttat
atttatctct
aatataaatc
caatagcaaa
tgtggtacgt
ttgcagggac
aaaccgaaca
gctgaacatg
aggggtagca
tataggtgca
cacatatatc
aacaactaaa
atagtttgaa
gctgcctcat
ctactttctt
ccaggttttt
cttgtcacta
tttctcctcc
gtctctgtcc
ttctcatctt
tccaacattg
aggttaacct
acagtatgtt
ggagtcctct
tatttgttaa
agttcattaa
gtctttgaca
tcttctgaca
taaaaatata
ctttataaca
actgatacag
gaatgggatt
aaatatgcat
tgcaacacaa
ctctaccatt
ctggtagagg
acaaaacgca
tgaaagtaca
agaatcttct
caccccatgt
actttccttt
ctattttaga
aagctgacat
cttttacatt
gacatatttt
tctagggcta
taatgactta
tatttataga
ttttataatc
ataactttct
aaacttcaca
gtaagctcag
tgatatgaca
ctagccttct
acttctgatt
agatgcagag
tggagtgagg
gaaccaggga
ggcatgatcg
gctcatgaat
atcaattggc
gtaaaattct
tctaatgtac
ttctttgttt
ttggtcatct
attctattat
gacatggaat
atacactatg
atggatagat
ctgcatgttc
gacacaggga
tcaggataaa
gcaaaccgcc
ctggaacttt
tgatggtgaa
ttttagaatt
ttggcttggg
agggatattg
aagtgtcatt
gtctatattc
tgcctctgga
tttccttagc
taccttatct
cctgattctt
cgtttagaat
tgaaacagaa
tttctagaaa
aatgaagagt
tcataaaaat
ttattggtga
nntacttttt
atacaataat
tactgatata
gtaatcagta
gcctgaactg
ttttttctca
atattagata
ttatctcata
gtctcgactg
cagcaaagca
cttcacagtg
caggtccaaa
aaatgaagtg
ttaatttctt
ttcctgaaac
tatattagga
gctagtctga
tctctttttc
ttgtttgcag
ttttatggtt
gtcattaatt
tctattgaaa
tttttataga
gcacagaggc
ggggttccag
tatgacatat
caagtttgat
acatttttat
agaaaggtct
acatatcacc
agctcacctg
ctggaatcac
gatctcattg
aaattccaag
ttatttttca
ctgaaattat
tttaaatttc
taaacttctt
aaagatacat
caacccaaat
gaatactagg
cgggaagcca
tcacttataa
gaacaacaac
tagctaatgc
atggcacaca
aaatttaatt
aaaaaagttt
ttgttttctt
agattttctt
cagttgcctt
tggagaatgc
cataaaatat
ggcctgcagc
agagaaaccc
aaggtgcctt
gacctagcat
tccttcctgc
ggggtttcat
agtgatttct
catttatttt
tggccaaatg
gtttaatttc
ggggggtgtt
gacaatctgg
cactataagc
atcacttttt
attttcttgt
tgatatccat
acacatttca
ggcctgtgtt
caagttgtcc
aggaaagaaa
tgggagtgag
taccccctag
gttgcccgca
agtgcagtat acttgatttt attttcaatc ttttgttagg tcttctgtga tgggatccct tgattattat ttaactaatg ctgaatgtat agtaaatgac acagtcctct ggcctccctg catatgacat aatttgctag taaagcaaaa ggagagtcct ctctcagcac agctttgtgc tggccatgca ccataaacta gatgtagagg ttcaaagaac tggttcgttc tcctctcacc tgaaaattct gcatgcatat gtccatcagg cagcgataaa tcatcctcag gtgggagctg acacactggg atgtggggct tttacttatg gaatttaatt gacaaaatta tctcattaga atttctctct aaccttgacc tagccccttg cttgttctga tgcctataag attctagtcc agtctcctca atgtttctgt ctctttggtt aaatcatgaa gcattcctct ggccccaaca aagaaaataa attttctggg tctaaaagat acttctcaac taagagtagg gttgttattg gagctttgtc catgattctt aatatctttc tacgagatta aggttcttga gaagcaagga cccaagcagc aggtttccca atcagaggct
- 148 -
008252
gaggtgaagt tacgaagtta cattcctagg caagtgtctg gttgggaaaa gcaaccgatc agaggtactt tcaattatcc atctgccgca cagaaaaggt gggggtttgc aaagggagta gcccctggtc cttttgctac tcaggcatgg aaagttaggg tttttctttc aatttagttc taagaagtca gtgtgaaatg gacttaggtt ccctgcctcc agaccctatt ctcctgcctc attatggcga catcaaacca ggtatatcgg ttgagcatgc attctcaaca gggagtaaaa tcacctccaa aggggtgaaa atatgttctt agttgggggg tagaaaattc tctcttttat aatgcagatt gccttgtaga ccaaataacc aaagtagagt atgtaaaaag atatataata tggtagaggt atcaaaactc catgaggtgg tgattaagaa caaaatctct aaaagacttc ttagaagagg tgatttaaaa aaagattggg aaacactgct ttggggtatt tgtaagaaga aataaatatt tctcttcttt tctatgcatt gtttctaagt tttcttaaag taatgcaaaa aaaaagaaaa gtttattata ctcttacaaa ttttgtctta actcttaaaa agttaagttt taacttgtag gtactcacaa aggtggaatg cactgcagaa tatgaaacag aagaagggtc ccaatgagcc cttcttggtg caggggctgc agactgagga gggccaaagc agtggagggc tgccaggcta agagtgacaa atggaagcca ccgttccact tttccacagg ctgcctgctg aatgcctggg atttgcagaa agccttgaga ttggacacct gcacaggtga ctttggtggg agccctccag gcaactaggt tctgcagaga ccccagttgc cttctccctt ttagatggct cccagcatgc ccctggcaaa ttccaccctg tccagctacc atcaaggttg agttcactgc aataatctgg agctgcacat tgagaagtgg ttactagagc ttgcctccac tgcttctatt ttggttcttc tgaactatta tagtcctctg aatttaagtc ctgtaccaaa ccccataacc tacactgaaa tacttagtga tcatttaaac taatttgatt ttcctaatca ccttctttaa atcctgacac agttcttctc tatggcagga taacccatac cttcaagtta agttaggcat atttttatgt gcattgattt tccataaaat gttatcactt tggcatgaat atttcagaga gctagagtgt tggcttgtaa aagttaacaa attatgttca aagcaagcca tttgattcca agagaatctg gaatcaggaa ttctagggga aaatcagtga gactatagat atttaaatat aatcacataa caatttgcta aatcttttag tgccttttag tgtctttcaa aagaatatca ttttcccaca gagaaaattg taatgcaaac agatccagct gcatatttta ctataaatta tgctcattta aacagttcat tccatctgtc cttttgataa tatatgcagt tagtaaggtg attaattgta tgtatacata attagacaat ctattggaat atctttcagg cattcattag tagttttctt ttaaaaaaac actttaaaat ggatcaccac tctttttttt tggaatgaaa atctcagtct gaaaatacag gtgaagggag agatgatgta atgaatgcct attactgctt cctctgctaa tacagcaacc aggtcaggca tgtggatggg accttcatga cacatcaatt tcagtttctc ctgagattcc ctagtatcca taggagagaa aacaggttca agtcttcccc atatcattgc aaggccagaa ctaagaagcc tgtgctagag aggaagtacc tgtcgcagga cttgcagcaa agtctgagtc ctctggtccc ctgaggccac tgctcagggc agagagcctt tcatttcccg cagaggagct ggacctgcct gtatgctgct tgtggtccag gagcagtcca cagagtcctg tgggtctcag tgggccagga agggaagctc actagagact gaattactcc aggtggagaa gggggtcaat aaatgactcc actcatttct gggaaatcct gtcaccaaaa agccttcttc agatgttcag caaaggagct atggcttttc aggtctttcg cctccgtaaa ctatggtgcc ctctactacc cctcatttgc cactgcttaa gatagcataa aagacaaacg acaattacat caaaaacatg tatccatggt gaaggaaaga aaagttaact cacacacaaa gggagactca gaaactgagg atgaaactca gagaatcaag acaaatgtct agtctagaga tttcccaagc aagtagaatt gatgggcgag agaatccgtt gttgttgttg ttgttgttgt ctcaagaaaa agtaagcagg gcacaaaata caatttctgt aacttcaact aaaaatgtcc aaaaaatgag ttaaaaaagg gcatagtcct tgagagctag tttttaatat gggagatgaa gcaggaaaaa ataactcaaa aagtggtaga gatataataa taagggcaaa gtaaaatagc ctatccacac agctatgaat aataggagtc cctgaaggaa aaagcgaaca gatagaagaa aagttgtcat aaacaacgga agaaagctta cataaatgaa aaaaaaaaaa aaacataaat ctgcaaactg aaagagctca ctaaatttta gtgagattaa atgaaaatag atgcttactc atgtcctggt gaccttccta ggttgcaagc ataaagaagt aaccttgttc agcccctaaa caggctgaac ctaaacctga aaaagtaaaa taaatgtatt gtgcaatgga tgactcatct acaatactgg aaagtggaag gtaatgaatc aatatacata gactactgag agaatagaac tgcaactaca gaatctgaac acagacaaca tgttcatctg tcagtgttaa aaatgcattt tatatacaaa aggactaaga gagcataaaa ccctttgtat ttatttgaga aaactacttt aaagtgtgct aatcacaaga taagtaaatt gcaatctcaa tgactagaca aaagaagaga gaattgatgg gcattggatc tcaatagata ataataaata tgtcaaatag ggatctttga aaaaagagaa atgataacat taaagaaact agtaataaat ttgtaaatga tttcagcaaa accaggactt aggaaagggt gtgatatcaa aggagagtgg gatggtagaa gtgtactatg aagtttgcag atgtgtgggg tggagggatg agtgagccag caatttagtt gtgaagcaat aagaaaaaag cattggtttg atgtctaacc attgagaatt aagccaggag attagaaaaa ccaagtcgag cgtccaaatt aatgaatagg gaaagaaatt agcaaatagt tgaccaagtt aaaaaaagac aagataaggt taaaaatgaa acagcaatga cataaaatac acaggaagcg taagaccaag tataactttg gcacattttg tttgagcagg ttgaattttc ttatcaaaaa ccctagaaaa tctgagtatg tttaaacaca aaataaaaat tgtacactgc ttataggaag
- 149 -
008252
cacatacaaa
taagacgttt
aaattaaatg
ggacatttgc
agtgactaga
aggaaaaatc
ggcagatcaa
tttgggaggc
catggtgaaa
ctgtaattcc
ggtcccagtg
ctctgtctca
cagcctgccc
agcagccaaa
agaaccaatt
aatcaatgat
atctgaacag
tttcctggtg
tttcatacaa
aaacctgata
gaaaattata
agtttttttc
gcctcagtga
aaacatgata
aactttcatt
caaccattat
atcttaaaaa
aatcgtgaga
gaaggtcaat
agtaaaaaag
atttaggata
aggaaaagag
atatgtaaaa
ttatgtttgt
tgtttgcagt
aaggaacaca
ctttaaaaag
attacactga
aatgatttct
ctaatctgtc
tcaataaata
gtgcttaacc
aaatgttgag
ataggaccta
agttgcagag
taactttagg
aaatacctgt
taagtgtata
tgctttcata
ctgttnctgt
tgacattaac
ggacttaaga
atggcaatta
gctaatttcc
aaaacactat
cccttctgat
ttcaataaat
cctcatagtc
tcctttacaa
tatgtgtgtg
gattaaaaga
taaagtaaca
ctcaatttct
gtggccctgc
taaatgttca
tgacgtgagt
aaatccttgt
ggcctgtgca
ccatccctca
aaatgttatc
cgaggtgggt
ccccatctct
agctactcgg
agctaagact
gaaaaagaaa
actcgtgggg
agttgattta
ctttctggaa
ttcctggcaa
cactggacag
ctttctgtct
aagataaaaa
atgatataca
aataaaatat
caaaaataaa
attaaaggtt
aaaattaatc
gaaaacaagg
ataactgtac
tgaaataatc
ctttatgaaa
atagagaaat
aaaaaataca
tttatntnna
tgcattcctg
ggtaaagnaa
agcactaaca
atatatagca
acataacacc
aaattaaagt
tactggcatg
tataatattt
tttgccccag
ctggtattga
accttcctga
ttacataaac
tatcccttaa
tgatatataa
taataccaag
cacattattt
gaaagtatga
aattgtaaca
gattgcatat
atgaaatacc
tcatttcaaa
aaattaaaaa
tcttcacatc
tattaaaact
actccacatt
catgtagtgt
tttaattaga
aatgaaaatt
ttttataata
tcaaataaat
tattgattta
cttttgccat
aaggtaacta
gcagagtgtg
ccagaatacc
gaccagaact
aagtgaagag
gagggaaagg
tctggccggg
ggatcacttg
actaaacata
gaggctgagg
gatcatgcca
aaaaaaggtt
ttggagctca
agggggaccc
aaatatgtac
aatacaaact
ctttgctcca
acttttaaag
ctgtacagaa
agtaaaacta
attacccaat
taaatggtta
aaatcctttg
accaagactc
agcaagttat
ctttataact
ttattttatt
aatattagaa
caatagcttt
tagatagata
nnaaacttat
gatatgaaga
aaaaatcata
atatcaaagt
aagattattg
atataatagt
gattaataaa
gatttgagac
tgaaagtaat
caataccaac
gggaggatgc
tgattcctgc
attgaacact
tctggaggga
tattcctgca
aatgcctatt
ttaacaactt
acttgacaga
attgttttta
gtgtggatga
tgagaaacnt
tttaaaatat
gcaactagaa
taaattaact
gcattttccc
agtctagaag
cttctcagag
agttaatctt
cttgttcata
ttgttatttg
gtgttaatat
tttgcataag
gtggcctaaa
aaaatcattt ctaccaaaca caaaaaatta aggaaaattc aggtgggccc caaggcagtg tgcagttttc aggagtgtgt gcagaagaga ggccccacat atgggatcat cattctggac catggtggct cacgcctgta aggtcaggag ttcgagacca caaaaattag ccaggcatgg caggagaatc acttgaacct
cttaaaatat
ttgaggccaa
gctgccctga
ccaggatgga
aacatcagga
cttgacccct
atcccagcac
acctggccaa
tggcatgtgc
gggaggcaga
cagagtaaga
ttgtgtaaga
tctgagaaac
gttccctgga
atctagagac
aagaaacctg
cccatgtggg
tttcagaaat
atcttagcca
cagtaactgt
tatcatctag
atatttcatt
gaaagtcttt
acgctgaaga
ttgtatttag
tccaaaataa
tttctataaa
agtgggtaca
gggtagaaat
aagataggat
tcaaataaat
gttctatttt
catgtaaatt
agggaaaaaa
caaaacgcat
catttaatta
aataagtttg
ctgaagggca
ttaaaacaca
tatgaaagcc
aagtagcaat
ttagtagaga
taaataaaac
tcagaaaaca
acagttcacg
tttccagagt
ttatacataa
ttagaaatag
aattgcaagc
agaatataca
cgtgtttngt
aaggagggaa
gagaagtgat
ttcatttctt
ggaagaaaat
tattcctatc
cagtagtcac
agctgcaatc
atgctgtctt
gcatgtgaga
ttattaatat
ggtatgaaat
ttttaacttt
ctgcactcua gcictggg-gci atcatgttat ctgtactgaa aaatcccatt acgtccagaa aaatttctaa gatgacccag cctaaatgca ggtcttgaaa gccaaattga tggatgagat ccatcaccaa aaggcctgtg gtgtgctaat tcttatttta tgaatgataa agctagcata taggccaatt tcacataaaa aaaatccaac atgttagcat acatcaggag cttttgtgtt aaggagaata ggaagaaaag atttcaacca ctatatatga ggattcctat tattaccatt aatgcattca tatgattaac tccttatgaa attgtgcaca ttaatagaag aatctagtaa tcttcccact ggaactaact gagagagaga gagagaaaga taaagaacgt aaaatccagt ctagtattaa tcttcttaaa aagttgtaga catatgtgaa tagaaaccag actgttggct tcctcaatac caacaactcc gtcaaggtta cggacagtaa catataaaca gatgagcaac aagataactt tcctgtattg cactttaata ttttctaaat tttggaaatc tatttataga ttagtgcagc ctttttattg aaataccacc catcaatgaa atgggaaatt atgcagctga tatccacgat tgttagtgac tacccaaatc tttatcattc tgtctttaga attttttttc catagaactg tatgtaatat ggacaatgac atctttaaaa catctcatgt aaaaacatgt agaagcagat gatcaaggaa gggcaaagga gttcatncca attaccttgt tatgtttttt tctgcagaaa tggtagattt atctgcagtg cctttaatgt cncatgttcc atatatgagt aagagaagca aggtctgcta ggacatatta tgactaatcc ctattgcaaa ttttaattcc ggacatgtaa aggaaataac gaatagtaaa ttcatagaat actaatattg atcattaatt cacacataga tcaattgctt gcataaagga ataaatgata
- 150 -
008252
taaattttag tttaattagg ttaataatat gtaagttgtt attttataat atgccatgta 97860
cattaaataa attttatctt aaaaaataca acatacaaaa aaattcagcc ttttgtgtac 97920
atagaaagtc tttaaataat aatggtttta aaataatatc aaatatagat aataaagaaa 97980
taatgccact cacaaacatt caaaatcata acatgttttt ataattgttt aagattgctt 98040
tggtctactg tgttctagtt ggtatgtttc aaatgcattc ttaaagtaaa atgtcattct 98100
tgaccttatg gggcacctta gtgtatatga tagtggcaaa aattcataca ctgacaaata 98160
tgtgaaataa tttagaataa attatagttc tgaatttcaa tttcaatgtt tctttgtttc 98220
tctaggtggc ttttacagta ctttttgatt tggaagcact tctgaagata tggtgtttgg 98280
gatttactgg atatattagc tcatctctcc acaaattcga actactactc gtaattggaa 98340
ctactcttca tgtataccca gatctttatc attcacaatt cacgtacttt caggtaataa 98400
aaataatgcc tatttgtctt tagaaattta tttatttcca gagtaaatac ctgtcacatt 7o4g.
attttaacaa ccacatagaa ttatatataa tatttatata taataactat tatggtaaat 98520
atgaacttga gaaaggcaca atgacatctt acaaattaga aaagtgcatt cacaaattgt 98580
aacaatcgct ttttaaaact cctgaaaatt cacagaaaca atgtagatgt tttacttact 98640
tnttcctaaa ttagcagtat atagatacac atatttttat atatggataa catatatcca 98700
tacatgcgta tnnaantttt aaactacata agatgttggn ncaaacttta aagactagga 98760
aacattaatt taatcccaag tgtttctctt ccttgtcgat aaggctaagt gtttgctcaa 98820
caacggttta taatgaaaat attaaaggtt tataaaactt acctttacag attgtaatta 98880
ctcatacagt attatttata aatgcctgtt acttcatgat ggcacttata attcttattt 98940
aacttgtaat aattggatat ctttttttaa atgtgatata ttggatcaca ttgctttcta 99000
attatgcaat aaacagtaat tattagttac attctttgtt attattgaat atagcaacac 99060
gctcactgtc ctggtaaata cttagtcaaa atgataaaat atgtctacat ggtattctag 99120
tcaaaaacac ctcaaatgta gtcattttcc tgattcaaac ttggtcattt attttttatt 99180
ttattttatt ttattttata ttattttatt ttttatttta ttttatttta ttattattat 99240
actttaagtt ttagggtaca tgtgcacaat gtgcaggtta gttacatatg tatacatgtg 99300
ccatgctggt gtgctgcacc cactaactcg tcatctagca ttaggtatat ctcctaaagc 99360
tatccctgcc ccctcccccc accccacaac aggccccaga gtgtgatgtt ccccttcctg 99420
tgtccatgtg ttctcattgt tcaattccca cctatgagtg agaatatgcg gtgtttggtt 99480
ttttgttctt gcgatagttt actgagaatg atgatttcca atttcatcca cgtcccctac 99540
aaaggacatg aactcatcat tttttatggc tgcatagtat tccatggtgt atatgcgcca 99600
cattttctta atccagtcta tcattgttgg acatttgggt tggttccaag tctttcctat 99660
f* rrt" /та а ста /"+• глг*г*гтг*л з+- a a a г* а *л а *-"п+- /ч+* rrra (-/Tt/rr* rth t-t-afarf-anp at*rra+"h+'at*a Q Q ~7 9 П
- WWW^w -.-WWW. W.W.W. WW. WW _y w WWwV.y WW W W w WWWwW.WW-.WW -.www. WW WW, w_> --.WW
gtcctttggg tatataccca gtaatgggat ggctgggtca aatggtattt ctagttctag 99780 atccctgagg aatcgccaca ctgacttcca caagagttga actagtttac agtcccacca 99840 acagtgtaaa agtgttccta tttctccaca tcctctccag cacctgttgt ttcctgactt 99900 tttaatgatt gccattctaa ctggtgtgag atggtatctc attgtggttt tcatttgcgt 99960 ttctctgatg gccagtgatg gtgagcattt ttccatgtgt tttttggctg cataaatgtc 100020 ttcttttgag aagtgtctgt tcatgtcctt cgcatttata taatttatca tggaaacact 100080 agaatgtgca ttgattgttt tctaaataga tattgttaaa tatttgggaa ataaaatgac 100140 agtagaattt taaagaagta attttgagaa acaggactct aaccccttag gaaaaagaac 100200 atgcattgca actttattga ttttatttat tagtaatacc aaaatattat tttcagaaca 100260 atattcactt taactgccag atcacaggta actagacact tttagtacct gggggaaagg 100320 acatgcaaat ataattcaca aaaagtaaaa agcaaaaccc cctacaaacc caggcaaaaa 100380 gctgagccct tgtaatcaca gctaagcata ttgaaaccac agagggtttt catagttcaa 100440 gcgctcactt ccctcagcat ccgtggatgt aaatctctcc tcatktgttg agttatatcc 100500 tgaagcttrg ctatcataag tgacatggct ggggcaagag atatacatgt ttaaaactct 100560 tgatacaaaa tgtgctttcc aaacattcct gtgattataa gctcttgtgc actgctctct 100620 agattcacaa agttatcatg gccattgagt acctacctta gggcatcatt gcacataatt 100680 atagagaata tcctttatat caaaacaaca gcataccttt tttacaaagc tattaaagta 100740 gccaaattaa gaaaattggt gttgcctatt tcagcaaagg tacagtataa aatatattca 100800 gggccttaaa attgctatag tctctgacat gccatttttc agtaaaaagt tagaaaataa 100860 catttgtgtg caaaatattt attatagaat taatgagaga aaaaagaaaa ctgtttaaat 100920 gacaaacatt tgaggaatag cttaataagt cataacgcga atttaaccat aaaattataa 100980 ttgtgatgag ttttttataa cttagaaata tgactgtttt atttaaacga taaacagcat 101040 aaattatatt atatacataa ctacatatat gtatgtatat atttattata tacatatgta 101100 aaatacctat aaaatggaaa aaaatgacta gaaagaaacc aatttattac aaattattaa 101160 tcatctctag tttcctactc ttgtcatcat gtctgatttt cctactagtc tgttttttta 101220 caaaatatct aatattagcc tgcaaggctg taaccatttt atagatagac agatgataga 101280 tagatagata ggtagatgat agatagatag atagtagata gatagatagt agatagatag 101340 tcaaatcaca gtgaagtttg caatttcnag ttnngncntt gattttggat tattctgtaa 101400 nnngtnctgt ttaatttatg ttaatgatta ggtgattttc atttgtatct ctctatacat 101460 ggccatgctt ctctttttct aatgtattaa taatgaataa aaatgatctc agttaatttg 101520 tggctagaaa gtaaatctct tgagaaactt aggtgtcaca agggtttttg caaatttgca 1015B0
- 151 -
008252
tgtggagaat ccctattggt tctttcctta ggcttccttt ttcaagtgat gagcagtgga agttcacaaa gaagtgtgca tcatagaagc aaactgtaag ctgaggtggg tgcaaccaat gttcttacat gggtcgggca aggactgtat ctagcagatg cccagcactt ggctaacatg tgggcgcctg aggtggagct agactccgtc catattctta agagaaggac gcttatcttt tctttatagg ttagactcac ctgatcaaat cagttaggta tttccagatt aaagctgttt tgtatgttaa ccactgtacc cctcacactt gacaatttca aaaatattag atttctgagc caaagcagag gaagtacaca gggtaaaaag cctctctgaa gaggtctgag tgcatgattg gcagggcagc atcggtatca tcttgctgag gtgtaaattg atggagctaa tgggaggccg gtgaaacccc tagtcccagc tgcagtgagc tcacaaaaaa actatgcaat tcagaaatgt gagagtatgg gtagatagag tgacagggat caccaatgtg ctgaattatt attattctgg gcttgttctt gaattacagc agacagagcg ctcatttcaa tatttctcac ttatctgtta ttctactatg aggattccca aaggaatgtg catagagatt gaggtgaggt gggaagcatt
a v_y Lyt i.aa
atggcctgtg tcctgatgat tgcattgtct aggtctcaag atcttcttcc aggcgggtgg gtctctacta tacttgggag tgagattgcg aaaaaaaaaa ttctacagca gaccaggaaa tttacttcat tgaaaaacct ttttcctttc gaagtggtat tatgtccgaa aaattaatac tgtaaagatt aggatggccg gctctttgta tcaacctttc atttaaatga gactaactac tgtcagccac ttttatgaag aagtacaagt gtgtagtagg ttgagcagag ccaggtggag ggaatagcac ggaaatcatc attgactggt catttgtttc aaatctgttg cggctgggcg atcacgaggt aaaatacaaa gctgaggcag ccactgctct attcttccca tctcactaca atgtgtttca gttgtatctg gctgatccct taggaatgca taaatagttc aatagacaaa gaatgttaat atctgagagt ggtgcagtgg taaaggccta tttactgtgt agtaatgttt tgaagttatt tgttccagat ctgaaattct actggaaatg ggctatttta actgaatgaa agaatcacac aaaggccagc aggtcttgca gcgtcttgtg tcataacaag acttgcccaa cagtggctca caggagatca aaattagcca gagaatggtg ccagcctggg agaacatgaa aatcaacaga gagacaaaat taggaacaca gaataaatga ggtttaaccc catttttttc tctgataaaa actttaatag aatatgtcct ctcacacctg cattggtctt
tggcaacaag
agtgcaaagt
catgtattta
actgaagatg
aaaggcaaac
tcttaaggaa
gattagttgt
gtgaaggagc
tgagcatgtc
gtggctgggc
aaacgctgtg
aatttcctgt
ccctaagata
gaccgcatac
cacctgtaat
agactatccc
ggcgtggtgg
tgaacccggg
ccacagaggg
tttcagagtt
gtgaccttta
gttctgaagt
aaatcaaaaa
aaaggcacaa
tttgaaaatg
aagctgttta
atgtgaaatc
ttcttatgat
gatttgggaa
taatcccagc
catggtgaaa gcctgtagtc gagcttgcag ccgtcacaaa ccatgtggta aattagcatg taaaccatat gttaaatcaa atggtgtcag cattcttaag gtttgtgtga aacatttctt actctggcca ctggggtagg ggaaagccaa aaaatgaatt tcaatctctt atgccaagaa tggtgtgtta gtgacatctt
^ \_# ". ^ у \-> -х у
ccccgtctct ccagctactc tgagccgaga aaaaaaaaaa tgatgcttaa aaggaaacat catttgcatt agtaaatgca gggctcagtg ctggttttct ctcttacagc attaaaggca gatctggatc aatgatttgc aaagaaacaa ttctgtttct attgacatca tgcaattttc tactttaatt agacttaatg
ftt-t-ai-.f 9.
yV-yyaUWC-vy QVJVJLwQ^yoy ULVJ^U^ULLU
actaaaatta caaaaaaatt agctgggtgt gggaggctga ggcaggagaa tggtgtgaac tcgctccact acactccagc ctgggcgaca gaaaagaaaa gaattacagc aggaaaaatt tttgaacaac ataatttctt acatatgttt gctttagtca ttttttttca attggtttac ctgcagacaa taggaataag actgaccact gtaaacgtgg tttcaggtat ggcaaaattc tatgtcttca cctacctttc ttctgttggt ctatgtgaag gcaaagatgg ctcccaggag agtacccgtt ggggattaaa aaaaaaaaaa tccagcaaaa gccctgagga tgactcagat atgacgggtg gggagtcctt cttgcacctt taaaggaaaa ccaggcagag ttgaagaagc atgttatttt agacatgtaa aaattaaaat tactgtgttc taaatacact attcatcttt aaaaatcttg gatgatcatt gtataaacta ctatgttaat atctctgaat ttgggagctg ggcagcattt ttttatttct tagagctaca aaaagttgta tttttcacac tatatacttc
r-faafr-lfaf a aaf af> /rf ^r < +-+-а а а а n
ggtggtgggc
ccgggaggtg
gagtgagact
ggtagctgca
aaaaattgca
ttacatgctg
gatacttcct
agaggccgat
gtgtcggtgt
ctctgtaaga
aaagaaatag
gactgtgaat
tgtactaagg
cagaggcact
ctaattttta
aacagacaac
tatttcattt
ttataatcag
tacaaaattg
agcttttaat
t^tcttt^t"
agtttggcac
ttaattactt
tatttagatg
attttgagaa
caaacctaga
ggctacaaac
gtaagtattt
catcctatac
taaatatata
atataacaaa
ttatactcgc atagtaatca attttttttt tgtgtgtgtg atgcattgtt tgtatagccc ctgtacagtg gtatatctaa gtggcccata cacacacaca
tttgtaatag ataaaggttt gcaaatgtga tgtgtataca aggcaatttt actatatacc tatgactaca acatagctaa cttgactcaa tatacatgcg
tagccattga gttaaacaaa gtatgcaaaa cagtcatgca gttgtcgtgt taggctatat ttgaatactg atatagaaaa aagttatgcg tgtatatata
atcctatttg tgagtgaata catctaaata tcatttaaca gatcatagag ggtatggcct taggcaattg ggtaagtctt atgcatgact gagagagaat
tccaacacaa aatttgtcaa tatctgtata gcagagatac tttacttaca attgctccta tcacacaaag ataggaccac aaaatatatg agttgagtac
- 152 -
008252
gatccaaaaa tacaaaactt acataagaca gaagtttatt tatgcaggga aagcaggtgg ctgtgccccc catggtcacc gacctgtcgt attctatgca agccttctat ttctggtcca tccatttcca ggcaagagaa aggtatttta aaaaggattc caccaaaact tgtacaaatc atttcctctc acattccgta gagacagcta gctgcaaggg agactggaat gtgtaggcta ctaggttaga attcggaaag ttctgttttt taaaggagga ctgataatct caataagaag taaagattct tggcaaaagt ttgtgatttt ctaataatac ctaggaaaat attttatgag aggttgagta tctgtatccc aaatgcttgg gaacagaagt tcagattttg gaatatttgt atgtatgtgc ataatgagat gtctaaacac aaaaattgtt tatgttttat ttgtatgcaa tattcttaat agttttttta catcataaag caaaggtgtc aggtgtagaa aaaaacttta aatttttgag cattttatgt attaaaggtt tccttgcata tttgaacgtt gtactagtga atatcatttt gtataatcat tcatttggga tttattgagc tagaccaatg tattcaaata gagaggtatg attttcataa atatttaaga ttcagtgtaa ataaatgatc tgataggttc tccgagtagt tcggctgatt tacaagatat ttggtcctgg aaaaaagctt ttgattgtta tgtcagcaat tagtttgcag tttactacgt ttccgagggt aagagtttta attttagtaa taatgattaa catcaaagta ctatttttga taacttggga taattagatt tgcaggtgtt tgagaccatt ttcagcattg aaataatcta atagagttag atgctgaaac ttaaaataca gcagaatttt aaaataaagc atttttaatg ttttataatt tatatattgt tgattttcaa taaaataaaa ttcataggct
tctctgcagc agttggtaag cagcctgtcg ggttggacag
aaggggctac agagaaagtt ggtctgaacc tagccccagg aagagaaaat ttgcttctct acagtgaata
actatttgtt taacttaatg cagtccactg caaccacttg ggatactggg ttccatttcc taactaatac
gttttggctt tcgatgtttg atcctgggaa tgggacccaa
catgtaagag gtacagctct taaccagaag gaaacataaa aaaatacaat gaccagacaa atagtaaggc ctattatatg gtgtattagt cgatgaaact gggtaattta taaagaaaaa ctggagaggc ctcacagtca tggtggaagg agagagaatg agagccaagc taaaggggga gacttattca ctaccacaag agcagcaggg acacctggtc ccttccacaa cacatgggaa gggtggggac acagccaaac catatcatat tatattttta aaagttaagc tttgacagca
aaacacctca aatacattcc ctgaaggtag tgcatgaaac aaagtgtgta tacattgaac tttttcactt atggcctcat atcagcactc tttaaattag gaatgttcaa cctgtattga agaaaaatat taattttatt tcaacaatac ataatatgtt aaaacactta gttcatccat gttattctat tgttaatttt agtcactaga agcactataa aataatattt tagtatgaat atatgtgtaa ataaatgttt ctctctccct aagatttcac ctgcattaga agactttgtg gggagtttgg ttgtatttac tgccagcctc ttgtygaaga actggacaga aagttaaatt cattgttctt agtcattcag aagtattatc aaattgtctc ttctgcaggg tatcaattct aaaattctgg gggttcttag cacctataaa gtgttcaaga gagttaacat agaatctaga aggaagcttt taaatgtctc tcagctttct
-"*"."¦¦".""-• +• /-" /-Ч +-
au^^Q-v^uaL aaov^Baaavji.
gaccttgaaa tttaactcta tgtggactta ataatgtata tatttttacc ctaagttgaa ccattcttac actgatgata aagacatact gaggtttaat ggactcacag ttccacgtgg tgaaaggcac atcttacatg gtggcaggca aacctcttat aaaaccatca gatctcgtga gggaaaccgc ccccatgatt caattatctc ttatgggagc tacaattcaa gatgacattt gggaagaata atattggggt aaaaacaaca aaagggtctg tacttctaat ggatagctta
atgttctgct aaaatgcagt atttcacttt ttaatattta tcagattata ctgaatgcta ttgcattttt tatgttagtc cttcagattt
+- 4- -4 -
gctttatttt agggattttt ttaaaaatcc tatgctaaat ttattatttt agctaccagt
gttggaattc atccttttat aatgcagatt agtgccttta aagcatctgg tcatttaggt cttcattcat gtgccgccaa ggatttgtcg aatcatgggg acataagtcc tcaagaaatt
ctcagttgag gggaggaacc agtaggtaag cacagggcac cacaggcctt gatgaaggca
gacaccaggt gctctgggga cacagaggca aggccgattc ccaggcatgg aaaagtccag
aaaggcttat gggaacaggt gactccaatg gctggatgta gccaaaggaa gtgcaaggga
acggattccc atcacaggaa cagcatgtac taaatgtctg aggtgagcaa atccttcttc
cagaacttag caagaaccat caatggtaag aggaggacaa aaggccaagg aactctgaag
tcggttgaaa gtgtgatcgt atctgtcatg ccaaactcct atcaactcta gtagggaagg
caccaggttc aagaggctga agaagagacc cagagccagc agatgagaca tggggtttca
ttgagggctt acatacaggg gagggagtcc
cctgcttgca aaatgcatgc aatttacata cctccacatg gaaatcttaa ttcaccccag
agtgttccac gggaggagat ggggactcag
gggttggcca ctcctagatt ccctagctca
gggtcattct cggggtatgc ttgagttatt
agtgctgatg agagagggca agtagctagt
gatggcaaag gttcctgcag aggtgggaga
tggccttaga caggtgttga gctgacaggt
gctgaaagtt acaatcaaga ctttgttccc
gtaggcaccg ctctccagct ctccagcgtc aatgctggct ggctggtcag gagaacaaga gcatttttac ttagcacact cccccagcaa acttggggcc tcaattccct gtgtatagcc atgttcctca tcaacaagga gtcagtctct gaacacacat tcaggtgtgt ctggcaagaa gctttcaggt gcacttacat acgatgttta gaggttgcag atgggtgaga taaggaggat aggcagtatc cacagcaaga ggacaaagat gtcgaggtga tcctcaggac agcaagccaa tcactgcaac agtacaggca ggaggcaaag cggaggtgtt ggttaagggt caggtggatc
- 153 -
008252
agcaggcatg ggggagggag ggctcttttc cttgctaagc agtcctgaac aaaaggttcc 109200 agccattcct gcacctaggg aggggaagca taaggaagga agggatagga gaagaaagga 109260 acggagccag catggaggaa agtgcctcat ctgggccctg atcaggaggc ctctgcacag 109320 aggcacctgg tctgggactg cagctatggc catgatccca gctggcctgg cagggcagag 109380 ctgagtcata aattgcaagt ccctccagaa atggcagtgc cctggtcatg caccatgtct 109440 agggtgggga tggcagtggt ccccgggagg tctcccaggc aaggccttgc catcaggtct 109500 gaatggatca cacataggat tttggccagg agcaggactc ctggaacgga ggctggaggg 109560 aggcaagcca aaatgatagc cacatcatta ggcccacctt ctctgggtct gccccttcac 109620 tgggtaaata aaaagatcag ctggccatct tttccatggg aacatgggga tggttattgt 109680 aagagttaaa gaggtaagaa acacaaaaag cagctcaaca gtaaaagaca gatttatttt 109740 ggagaataaa ctttagaggg gcttctggcc aattttgctc aggagcattc tctcttacag 109800 actaagggta tttaagggtg taggaagtgg ggagcttatc gcaggttcgg aatgtttcta 109860 tgtgagggaa agtttattgt ggggttggga ttgggatgtc tggttggagg ggaggctgtc 109920 tcagggttgg cgtgtttctg gtcagagggg gtttatctta gggttggaat gtttctggtg 109980 atgctgacat taggcattag gctgatgttt gggngcttga tttgggtgtt tttttaatca 110040 aagggaactt aaaatggtgg tgtttctcca agacgacgat ctcctgctct gtcaatccag 110100 tccctacagt tatagaaagg aagaggggtg gtatattctt tctggctact tcctgctgag 110160 tggagggtca gagggttctt tggtcttggg ttgattgtgg gagtaatgcc atctgtagat 110220 gtttttaggt aattgtgaga tgtccatgat cctgtcagtt aaaaaatctt tgaaaaaggt 110280 gaattaagcc aggtaagcac attagtccta ggcatattat taggagaggg cccaagaatg 110340 ggatggtcca tgttaggatt ttgtttctaa accaagaatg tatttggttg ttttggtatt 110400 cctttcacgt tttagccctt tcttcaagtt tttcagcagc atctcttact aggcctgatt 1104 60 ggttgagata gaagcaacat tcctcactca gtgagaggca gagaccccct ttttcagcca 110520 ttgtaagatc taatcccagt ctattttgga ggactgctcc aggcaaggag tctaattggt 110580 cttcgactct tataaggctt tgggctatat cttttaataa atcctgtagt tctgttgaaa 110640 gaactttaaa gtatgttaag gagttggcca gtctgcctgc tcccaatcca agcccggagg 110700 ttatacataa ggcagccatt aaaggaatga cttggatgct cctccttttt ctaacatact 110760 ggatgaatgg aacaggtgaa gattgattag gaggaactag tccaacggag ggagaaagat 110820 aaactagggt acaggttctg gtctagttgg tggggagaaa aagatatgtg ttggtaccgc 110880 ataaaaagaa cgagcctttg tcataatgca ggcggagata gggaaagaag ataagcaaat 110940 taaagatggg gtgttttttc tttcctgcgg ttttttactc caggtggaca aggaggaggc 111000 cagggagaca cccactatag tagagatata ggaagagtta ttttttacac atttaatgca 111060 atcggatgtt gcaccattga tattgagcca tggaaaaagt tgggcaccag gggcagcgca 111120 agttaggcag gaggcattgg ttgacggaga ggctgtaaac tagctggttg cagaaatgct 111180 ccatttgttt caggtgatac ttggtagtca acgtggctac tttgatggtc agaggggtgt 111240 ttaacaatga tagtgtgatt gcattggtta gatgttaagg accctacagg gaaatttccc 111300 tccgaggctg aaaagcaaag tgaggcttgt tgtaaaaggg gggtgtgtgt agttatgggc 111360 ccttcaatgg gagggtcttg gtgcttaagg .cattgtagag agttgtaata ggtttgaaat 111420 attttgttgg cccgattggc cctggaagtg aaataatctc tgaacagggt gtcggctctc 111480 tcaaaaaagg aagctccttt tgggagttta taagttaggg ttatatttcc tgttcaaagg 111540 tcatgaagag gtgtaggaag ggctgtgtaa gctgaggaag acagcgataa gcatatccag 111600 cactctggag caaaggaaga gttagctttg cagcaagagg gattgtgtaa ggtttataga 111660 gcattctagt ttgagagcag tgaggagtgg ttttattggt gaggttgata tgattaggga 111720 atttatattg aaagaaacaa tcaaaaagag aaaaaagtta tttgggtagt agtaaagtcc 111780 tggaaagttc cttgaagcca taggtaccat agaacagtca gaaactgatt agcatgtata 111840 atgggagctt tgtaagggta ccactgaagg tctgtagcaa ggttggttag gaagcagtga 111900 aagtttggga gagaaagaga cataagcagc ttatgtggat ttctcttcct tttcctccag 111960 gatttaggtg aggcgaaggg aagtaggtcc tgtggagaca caagagaagg ctgaaggggt 112020 tttagatttg gttgtttgtg tatgtggtga agggaagtct gttttcttga gagaggtata 112080 atgaaaccag ttggggagtc cctggagttt tgctgccatg ggtgtagtaa ggatgatctg 112140 gtaaggtcct ttccatttag gtgtaaggag ggaattgggg ctaggactgg gatcttttat 112200 cagaacccag tctcctggct gtaggaaggg attagaggag ttggtgacaa gttgtggcag 1122 60 gtgtttgtca gcatattccc aaatgaaatg gcagatggta tgtacaagag gggaaatgag 112320 aggggttggc agaggtgggg cttgaccctg aggtggacca aaaggggcaa gtggtctccc 112380 atatgtgagt tcaaaggggc tgagcattaa aggtttatgt gagagcacct gaatttttag 112440 aagggctaaa ggcaaaagtg taaccgagtc tttatgtgtc tggagtgagt acctggtgag 112500 ggtgtttttt agaatgccat tcattttttc aaccttttct gaagattgag gtcgataggg 112560 gatgtgtagc ttccaggtaa tttgtagggc ttgtgaaagt gtttgagtaa tctgagaaat 112620 gaattcaggg ccattatcag attgaaaaga aagaggcacc ccaaacctgg ggatgatttc 112680 tgttattaat ttggaggtga cattagaggc tcgtttgttg gttgtgggaa aagcctcaag 112740 ccattccaaa aaggtatcaa ccagaactaa aagaaatcaa acccttttta ctgggggtat 112800 atgggtaaaa tcaatttgcc aatcctgtcc tggaaggtgt cccctggctt gatggattgg 1128 60 gaaagaagag tgtctagtgt tggaatgggg tgaagctttc tggcaaatag agcattgatg 112920
- 154 -
008252
ggaaatggct tttaactgtt cctttatatc tggggttatg tgtttatggg aatttaagaa 112980 gtgttgtaga ggtgaatggc tagcatggaa gaggttgtga atgtcccgta aaagagttgt 113040 ttttttcagg gtcaggtagg actaatttgt tttgtatgaa tcagtttggg gggtttgaat 113100 tgtgcccctg ccatgattag ttgttgtgtt tggtgttctg gataaaagaa ggggatatgt 113160 tgtatgaagg gaaataagta ttggggaatt gggtgattgg ttgagacatg ttttgcccag 113220 tagtcagcct catggttccc taaagaaatg tggcttttgt ctgatgttct ttgccatgaa 113280 taactgcaac cttttctgga agtagaagtg cctttaatag aggatgaatg agctttccat 113340 taatgatagg ggttcctata actgtgagat agccccgctc cctccaaatt taggcattgg 113400 aatggatgat gttataagca tatttagaat tggtgtatta ttaacttgtg tgttttttgg 1134 60 tagggttagt gctcttatta gggcaactaa ttctgcttgt tgggcggatg tgcccaaagg 113520 caagggggca gcctctatca ctcttctaga tgggagagag tgggtatcat aacgctatcc 113580 ctcaatgatg gcatatcctg cttggagagg agggtttttt gatgcactgc catctataaa 113640 ccagtctggg gctcccttta tgtgagtgga agtaagatgg tgaaacatgg taggaggact 113700 ttcaattaga tcagagcatg agtattggtc aggatctaaa atcggtattg agggtaaaag 113760 agaggcggga ttaggtgggg agcatctatg aagagagata gcgggttgaa ggagggttaa 113820 atgtaaggct tgcatatgag aggatgagat gggggtgagc gcctatggct gaccatatct 113880 tgtagactgt gagaagaaaa tacctgaagg ggtttgtaga acatgagttt ttgtgtctca 113940 gagataatta gagaggctgt ggccaaaatt tttaagaaaa gggaccagat tttataaatg 114000 gggtctagtt gttttgaaaa atatgccact gttgagaagg agtctcccat aagttgggct 114060 aatagtccaa gggcctgatt atgagaactg tgtaaatata gatgaaaagg tcttaggagg 114120 tttggaatgt ctaaagcatg ggcctgcaat aaggcacgtt ttagatgaga aaaagcatga 114180 taaaggtctg gggtgggagt gagtggttgg tcaagatttc cttttgtgtg ttcataaagg 114240 ggtttagcaa taatggcaaa atttgctacc cataatcgga aatatcccac taatccaagg 114300 aaggaaagta agtccctttt cgttttagga aatgggattt gttgaacacc ttgctttcat 114360 gccaacagca tttctcgggt atttggagtt atgatcagtc ctaggtatga aactttcggt 114 420 gaggttaatt gggccttcct tttggacacc aggtacccac attcagccaa aacatttaaa 1144 80 atcttggtgg tgtgttgaat acaatggtca agaaaggggc tgcaaaggag taaactgtcc 114 540 acatattgca gcaaaatcct gggttgtaga ggtagttggg agaggtctaa ttgaagtgac 114 600 tgaaatagtg atggctgtct ctaaaccccc aggggaggac agtccagatg agttgttggg 114660 agtagcctgt gtcagggttg gtccaagtga aagcataaag gttttgagag gagggatgta 114720 gagggatagt aaaaaaggtg tctttggcca ggtgcagggc tcatgcctgt aatcccagca 114780 ctttgagagg ctgaggtggg cggatcatga ggtcaggaga tggagaccat cctggccaac 114840 atggtggaac cctgtctcta ctaaaaacac aaaaattagc tgggtgtggt ggcgtgtgcc 114 900 tgtaatccca gctactcagg aggctgaggc aggagaatca tttgaaccag ggagtcagag 114 960 gttgcagtag attttgctac taaatgtact ataagaaaaa aaaaaaattc aaaaggacct 115020 tcaagtattt tcagaaattt ttaaattttg gagttgtgaa taaggactgt gggcctctat 115080 ttttaaaaaa tgcatttaag agtctgtact tctgtcccta caagtccgat tgtgcatcaa 115140 tgccccattg ctttttagct atgtgatact .gggcaaatca ttctttacat ttttattctt 115200 cacaaccaag atgtaagccg aaatgtgttt ttttttcttc tgcattttgt gtattaaata 115260 atatacaaag atgacacaac tgggcttaga aagtatttct taaaagacta gattacagcc 115320 tatgtaatat atttgaaatt gataatatta tctgtataaa tggcaaggct gctttttaga 115380 tccattcctg acttagcccc tctatacttg ctctattttc cagctataat agtaatcaag 115440 tagtattaca ttttcagatc tccaattact caattgcacc attttgcctg attattttga 115500 ccatcataat gaaagcagct cggcctctcc caggccccct aatcagttat tcagcagctg 115560 acaatggtga cagcctgaac gtgtgaagtg actagaagga gtatattttt cctttcacat 115620 aaatgttact aaaggtgaaa tccatgaaga gtaataaaat tttacaagga aatgttaaaa 115680 aatattacaa ttacaaaagg ggtcattatc atccctaatc aaataaagca tcaccaattg 115740 gtcttacttg ccagatagaa aatcattcag gagagatgat taaaaacata ttttactcaa 115800 ggctagattt gtcgtcagac gcacatccct gggtttcttt tccctccctt ctctagacat 1158 60 tatccagtgg ttgagtgctt aaggtaggtt ggttaattac agtattagcc aaggcacagg 115920 acatgaccag aacaaatttt ctgcaagaaa aatcacatga tgtatcgcaa agtgaaatac 115980 agactttaaa aatcagcaat tgtctatgtt atcttgactt gggtccaggc cgtcttggag 116040 gctgcctccc agcaatgttt atagggctgc agaatggtgt gggaaaataa agtgtggaag 116100 cacatgggag gcttggggag ggcactcacc ctgaatctgc ttcagcacta tttaccaggt 116160 gtgtagtctt aggtgacact taatttgtct gagcttcatt catttttaaa atggtaatga 116220 tgtctatcaa acaggcatga taactaagag ccctacttac acatagtaag actttgaagc 116280 ttggagagct tgcataaccc acacaaagtt acacagctgg acagctggat ttgaagttgt 116340 ctactgctcc taccaactat tatccattag gtcacttcta gccaagcaaa cacactagaa 116400 agtgttcagt taggaaatac ttattgagtg ccaagaatat aaatattttg tcaatctgta 1164 60 cctggaagga aaggcctctg gaatagttca tcacaaactt cccagaggac ttcaggaaat 116520 caagaaaggt atagaggtat taacattttg gggcacagcc tgtgagtgtt aggaatgatc 116580 atgtcaggat cccaaaccag cacctgatag tctctgtgcc acagcagaaa cagcatttgt 116640 ctaagaagat cccacacatg agacaggtga aaggatgttc caagtgacag cttgtgaaga 116700
- 155 -
008252
ggtgtttgaa atactgggtg tcctcattac gttgcaaaca ggaaatttat tttcactgaa tgatatccca taaaatgaag aaagaacaga gttctcacat attgctcccg aaaccacaag ggctggagca ttcatgatga ctgagaaacc ttacaattga tggccatggg ccagaagccg gctaacacct ttttaagcca ccttctccat gatgacatct aaccttttct tgagtaacag agtagatgtt agctctgtct ggtagaaaga cccaagatgc tagatcagtt taccattgac gagagcatgt
П /"• г^> Гж/-"-Ь -4
agagatggag tagaatttaa caaacagcta aacagttcct attctggaac ctttctgtat cagcttcagt aaattactga tattccttct aatggggata ttttagtatg ttgctctatt aacaaatgct gactagtcgt ctccttaatt ttcaaggttt tttttgttct atatgaataa tagacctgaa atcacttttc atatggacat ctcattctgt gttacctaaa actacatatt ttcattttcc gtccataccc ctgtcattcc tgtcatgtgt aagggtcttc tgcagcacac taccctagaa tggagaatga aggctcagca cctccatcat ctttggctgc tccataaaat attctcttaa actcccagaa taatcagggt cacaaatatg tgctataaag gttctgcagg aaacttacaa ggaggaaaag ctcactcagt acccctataa acatgagatt actggaatgg taagatacaa taattttaga ccaggtttgt gggttgtctt agaggaatat atcatccctt ggtcattcct gtgaagacaa ccaaagctgc aagctggtgt ccaaataggt atggattcct attacacatg gcattcctta ag uagagtica aagggatgct taaaacaact cactgctaaa gttttgttgg agcctgtaca caaaaacaaa aagattttac aataaatgca gatttcccac gtttttattt atttatttga gagttttcac ataaaacaca gcagttagtt ttttaaatta attttaatat gtctttcatg taataaaaca gtccctgggt tgattttgat caactgaaaa actatttctc tgagtacatg atattgcata tgtgcagtag tgcatcatcc tgtgaatagg gggcctgtcc tgttggcttg caacgtggca cttaaagtat gcaacaatgc tgccggattc tccccttacc aagtaacaga tcaagagatc ttgttgtttg cctcaaaata ggaccctaat cataagagga aaatacctga ttgtatagga tcacagcaga aaagagagag gtcatgagaa tctaatcact tgggtgggga catctacaag gggaagattt cttctggcct ggagcttttt cctatgttag gtgggtcctc tccttccagc agaattaaaa ctacttgggt tcctatattc ttaattcctt aggtacctgc gctctccctg ggtcttactg cacctccaag gaaaggaaga cgaattctac ttgtcatctc tagaaataac gatgaatata ggtcctaaga ttgcatgttt . tcagtttttc gtaaacattc taaaataata ctaagtaata tataggtttt ttataaaata taattaaaaa gtattaaagg tttgtcagat ttaaaactat tatttttaat tactcctctg gcctcttcct gtgtgttttg tcatatatct ctgctaattg gagctgtatt tataatacat gcagattcta cctacccttc ttgctaagca taatcagagg cattaggaga catgtataca aataaattaa
tgaaccaaca cttttcccag ctatccaatc aaacttgatt aggtagcttt aattgtcagt taactatatt ccagtatgcc agatgatata gactgggtaa agcatggcag aggcaaaggg gaggtgctac cagcactgag cccatcaggc cacagatcta ccaaggaatg ttttccctag ccatacctgt taccacagcc caaaatggat tgttcccagg aaacttgctg ttactggctt cagacccaaa cccatgcaaa tcaccagaaa aaagtagcta tttttatggt cctttgctag agcacttaac
caaacatctg tattgttcat agaagcgtct ccagttgact caggaagtca gttcccccaa tgaaatacag tgatgctttt gacccacagt ttacaaagaa catctgcttg gaagcaggca acacttttaa aagatggtgc cccacctcca aactgtatga tcaaagaatg agctgtcaga gagacaatac ctagcaaact gtgacatttc cctcctcctt tcatctctca tggttaatca acctggacaa caaggtttgt catctggacc gcatagggct actggtcagt tctacaggta actgtgcagt
tcatccttac tcctccagga gcataattcc ttaagaataa ggactggatc aaatgtatgt gtaatcaagt atgaaaaggg atattagcct gagaggttta gctcctgggg agtcttatat gcaacctgat tcaaccattc atattgggga cacggggata ctggcaaaca gcacagccct atttctgttg catacagtga caggcttcct aggaccagga ttggcaggat catgggaagg gatttctctc aaatagacgt ccagatcctt ggacacagag ttctatcaca ccttgaggtt gggatctgta
40V> Ц-wb
tcgatggaaa aagccaataa aagatgaaat ttgtatgagt cagattgcca .ttccataatt ctccatttat actgtccatc aacagacctc tattatcctc cttaattttc tgtccaaaac ttaactttcc aattaccaaa gtagtgagag tagttcaatt tttatcatga tggccatact gatctctgtc ttaataaatt tttgtgtaat cttttattgc ttatttattg tctttataca agctgtcccc gatactggta tttaatgttg tactggcctt tatacctaat tatgtaacaa taaataaatt
aacaaagaat
ctttctgttc
cctgatgtaa
acaatttaga
taagcaagaa
gcctaacaaa
tatagaaagc
tttaaccagc
atatgtttag
tataacacaa
attctctaaa
agttattgca
tttcctcttg
aaatttgaag
tgtgtgacat
aatattgctg
aatatttgat
taacaaacac
ctctcactct
tctttatact
ttaaacttgc
tcaatattat
tcattactgt
gacagaacac
catgatatct
ggatttgtga
agtcagtcat
ttcttagatt
gtaaatgatg
acctgcacgt
aataaatagg
gctatattga
tagtttggac
ggcaatatgc
tgaactattc
caaccacagt
agctcataag
aactgcctct
tctgtatctt
cggttgtata
agtacttaaa
tgttaattac
cgatagaagc
ccaccaaaat
aaacaatttg
ttttaataga
aaatctttaa
gtgcaaaaag
taaattgcaa
cccatggaga
tttaatgcat
cttatatggt
gtttatgaga
ataaaaagca
aatttatttt
ccgcacgagt
atatgatggg
aaatagagat
taaagcaaga
agttaacggg
tgtgcacatg
aaaaaaaaag
- 156 -
008252
taagcctcca
gcaggactct
tagaagaaga
ttttgagact
aaaactgtga
caatagaaaa
actgctctga
atgtatctgg
attgataaac
tgagagtatt
tcjaaacactt
acaattttat
catgccccct
gcccaagtca
tggatctgga
gtatctcagc
cattaaaaac
ttcaagctac
cctttaaaag
tttccataca
ctccatggac
atgtgcataa
ccattaactc
accccatgac
tcaattccca
gctcagaatg
ttttatggct
atcattgttg
aacatacgtg
agtaatggga
actgtcttcc
atttctctat
ctggtgtgag
atgagcattt
tcatatcctt
tttgtagatt
ttctgtaggt
cttaattaga
catgaagtcc
ttttatggtt
aggtgtaagg
ccatttatta
cagatggttg
atctctgttt
gaagtcaggt
gcgggctctt
agtcattggt
cattttcatg
taaaatgagc
acagtctttt
agctttaccc
atacccattt
caacattctt
cctctttaac
tagaacacat
tcagttctaa
tgtgtgccta
gaaggaggtg
gtagagattt
aaattagaga
caatgggaaa
tgaagatttt
ttttgaggaa
tgttgtgaag cagtcctgca ccgcaagctc ctgagctgag agtaacaaat gtaatgcatc acatttttgt gaatagagtt tttcattcca ctctacttta
tgctgtgtgg
accctaagga
cagatgagac
agcacagtta
gagtgttaag
caggtgttgg
acattgattt
gctgggtctt
aagtagtttt
ccactcagga
itagectgaa
ataaacaatt
catatgccag
gctcccttgt
ctctgaggtt
tttcaaaggt
cagagatcgg
ttggtccctg
gcattttatc
ctgaggttca
atagactttt
tgttacatat
ttaggtatat
gtgtgatatt
agaacatgca
gcttcatcca
ccatggtgta
ttggttccaa
tttatagcag
aaatggtatt
aactagttta
cacctgttgt
attgtggttt
cttttggctg
ttgaaggagt
gccctttgtc
ctctgatggt
ctattttggc
ctatatcctg
catttaagtt
gtttcagctt
cctttcccca
gtattatttc
accatgctgt
ctccagcttt
atatgaactt
cgatggcatt
ttcctatcag
gcaggccatc
gcattgagga
tgccacacca
taaataaatc
agctaggaag
tcaagaaccc
tcaagtaagc
aagacatttg
atatcagctc
tataaagatt
attagatgaa
cacaggcatg
agggtcttca
tttttaattt
gaagaaatgt
ccaagaccct acaaccctct caaagcccag tattacacca ctgcttcgtt atgtttctaa gtgcacatgt agaataaaca accaatttat acacttggtc ttgatttttg gccacagtac ctgtgtcata catccccttt taaaaccaat tcatgacttt aaattctcta gagtttttaa cagaatttcc ctaataaatt ttaaaaatta gtatacatgt ctcctaatgc ccccaccctg gtgtttggtt tgtccctaca tacatgtgcc gtctttgcta catgatttat tctagttcta cagtcccacc ttcctgactt tgatttgcat cataaatgtc tgtttgattt agatgggtag agtttctttt .tcctgttgcc aatggtattg tttaatccat tctacatatg tttcttgttt tgagggctct tttggttact gttcttttgg taaagtagtt gaatctataa atggataaga ccagtgtttg tattgtgtcc ctgaaaatca atgttcttgg catactgaca aaggaaggac caaaggtgac ggagagtatt atttaatgag tgtctttagg ggcattccat gagggacata gtggttggaa tttttttctt tatttctatg gggcaacagc
gataataacc
ccagcatctt
tgcccacatt
tgtggtaatt
atattgtaaa
gaaataattc
tatcctcatt
cctaagctat
tggtcaggct
tggctgctgt
catttattga
acgtggttcc
tgccattgaa
aactatatag
gtaccttatc
gagaaactga
ttattttctt
tggggttttt
tttgagaaga
tactttaagt
gccatgttgg
tatccctccc
tgtccaaatg
ttctgtcctt
aaggacatga
acattttctt
ttgtgaatag
aatcctttgg
gatccttgag
aacagtgtaa
tttaatgatc
ttctctgatg
ttcttttgag
tttcttgtaa
attgtaaaaa
gctgtgcaga
attgcgttgg
cctagatttt
cttgaattaa
gctagccagt
ttgtcaggtt
gttctattcc
gtagccttat
cttaggattg
ttttccaatt
attaccttgg
cttcagatgg
cctttactgt
tctttgaatg
tctttcacaa
tttttcattc
tgaacaaatg
tgaaacaact
atatgctaca
ttaaaattct
agaaaaatat
ggtgaatata
ataagaaaaa
tgaccaaagg
ctgtgacaca
ggagaatagc
aggaggtatt
catcaagaaa caaatgaagt gatttccacc ctgaccttca tgttacacat tccaaacagt tttttagggt tctcattggt cagcagtata ttattttgct
c_g__c_tcat
ttccatttgg
agttctgcat
agaggcacag
tcaacctcct
agtctcctcc
caaagtctag
ttcttagctt
gatgcttttt
ggatgagaaa
tctcagatgg
cgtgcaggtt
atcatttaca
aggccctgga
cctatcagtg
atggtttcca
gcatagtatt
gacacttggg
tgcatgtgtc
gggctgggtc
acaatgattg
atgcctccag
atggcatctc
tttcatgtgt
cgcccacttt
ctggatatta
tgcctgttca
tcccatttgt
ttgcccatgc
ttaggtctaa
aagggatcca
aatagggaat
tagatgtgtg
tggtaccagt
agcgtgatgc
ttttggttcc
agcttgatgg
gtattgatcc
atgatctagg
gcctttgttt
tccctcagtc
atgatgaaga
tatgcaacac
tatagcattg
aagaaagatc
agtaatagca
gcacttccaa
tgcagagctt
gggtcatggc
catggagaat
ccagacatgg
tactttattt
agttacactg
у ciyciyciyy yet
ccaatctatt
atatgtgagt
ttttttttac
ctttgctcaa
tctgacacaa
cttttcttga
ggactattca
gaatcatttt
agaaacagta
tctagggtac
tgtgctgcac
acctcccccc
ttctcattgt
gcgatagttt
actcatccat
aatccagtct
tgccacaata
gtatataccc
gaatcgccac
aagtgttcct
gccattctaa
gccagtgatg
aagtgtctgt
atttaagttc
ttttctctca
ggctctttag
gtgttttact
cttctagggt
tttttgtata
tttcccagca
tgtcaaagat
attggtctat
agtatagttt
tcttggcaat
ctgtgaagaa
gcagtatggc
atagactttt
ccgcagcctc
tcatagcctc
aatatctgat
ataattctat
tactcactgc
catcccatag
atagatgtac
gggaatttac
tgcttccaga
atttcaacag
ccaaatgagt
atggcagtag
agggagcttt
agaagagcta
ttcattgaac
- 157 -
008252
aaaattcatt
ctttggagat
ttcataaaat
actctgcaat
tatatatata
tcattatttc
atttttgtgg
ttccttttag
atcattggtc
gtttcctacc
tcttattttg
catcttacat
aatgaaagtc
gttttcagtg
aagaggacag
cggtggaatt
acagtctgta
aaaacaggat
tgcaaagtag
gtccttctta
actgaggtag
cagttttctg
ggagattatt
atcatattac
tcattaacta
cattctttct
agactaaaat
tgaaatctta
catgcatctg
ccctaagcaa
ggaaaagcag
ggtctgcagt
tcagaattcc
aaatgtactt
aatatgaacc
ctcttgggat
tgcaaaggta
tcctgtatta
caataaataa
cggcaataat
aacaaattaa
cactcatgtt
ttgatagaca
agagaagcat
ttaatggtta
aaatggagag
acatatatct
aaagaagcag
ctacaataac
ttgctataaa
accattctgc
caagcttcca
gaaacaaaag
agcttagagc
gccccgtgac
acatgggatt
atgtaacaaa
actaaagccc
aatgaagccg
ttgttccttc
cgctggcctc
gcacatctgg
tggtcttgct
tttattgatg
attttatatt
tgagtctcat
agaaactaac
tagtttattg
ctttctacta
tgactcatct
aggatgattc
cactgaactg
cctaacccta
gtagtttttc
taatattatt
attaatgaaa
atgaaaacat
ttcatacatt
ttgaacaaca
atgagactct
aataatacat
ttagcactgc
aatgcatgga
cccagcatcc
tgttgtatag
tttaatcagt
agaaaaataa
ttacatatac
cttgggtata
gcctacttct
atttccagga
gctgagcaca
atggaagcta
agcaggtggg
attgctgctg
ggagaaaaag
gctaaattcc
accaaaaagt
aaaccaagtc
cagcaaatga
ctcactagac
aaagaaatgt
tatatccagg
gatggaaaca
tcccagaatc
aacatgttta
aattattcct
ctatatgtga
atggatgggt
aatataattc
tgaggaacag
tagaagtgca
gaaatacctg
aggctgtaca
gtcatggcag
agagaggagg
gagagctcac
ctaaacacct
tggaaaggac
gtgtcacaat
tctcatactg
cagacccttg
tgatatttgg
aggagtgaag
agttgtttgt
ggcttcagga
aaagacaaga tttttctgtg ctgaagcttt aatttggctt tcattgtctc taacattagg gtggcataat acataaaatt caatgatcag gaagagtact
atttatgatc
aggctgttac
aggccagatt
attttaaagt
cccccccaaa
gttttttttt
gatgaaatga
ggccatcttt
aattatgact
ctttcaggga
ttatttgcaa
gactgttcca
cattccatta
ttaaatattt
tgccttttag
atgatttatg
tctcatggct
attggtagga
taaacaggca
cttagcatgg
gactggagaa
actttaaaaa
tttccagaca
caagttattt
agagaccatt
atgtaacacc
gtctctaaca
gataaagcat
gatgggggtg
tcctataatc
gaaagaacet
tgttgcttct
aaagataaaa
ctgcaaagtt
aacattctag
gagtaaaatg
aacactctct
atcttcatct
tggccttgtt
ttaatcaaaa
ctccaaaacc
cgtgactaat
acagtgatta
agaaagacat
tgtgtgagag
agagagaggt
ttcattaagg
tgatgagaac
ttcgcagaca
atttctaaag
caccagcgtc
gggagcaagc
ttcaaacaac
agacagcacc
cccacctcca
accatatcac
aagacatatt
tgttgggttc
tacagttctt
agtttctgcc
ctgtgatgag
gggagttctt
agaccttcgt
agttgataaa tgtgtcaaat gttatccatg gataccatga aaaaactgta ccttgctcct taaaataata tcctgctgtt ttccttgaat gaacctattt
tttcaggcat
ctttcacagt
gttgagcatg
gatatatata
aaattaattt
gttggaattt
tcctgtgtac
gtatattaat
aaagcatcct
ttgcagctca
atttaattgt
tttaaaaata
cctcaagtat
tgcctacaaa
taaagaatgt
tacaaaaaat
tcctatcaat
aagtaacagg
agtagcagtt
tcctagcagc
ggtgggcact
ttccagttta
gtaaaaaaaa
aaatagctta
tatgtatatt
gtgtgccaga
gaatcaatgt
cgtgtgtgag
gagggacccc
caatacaaaa
tttagatgga
attttagttt
aatccaacag
aatgcatatt
catttgctgt
agtgggatta
gggagaactt
gccaattcaa
ataatgtgtc
ttaaaaataa
atcatgagga
aatatacact
actagttcct
gttattaatc
ccttgaagaa
atagatatcc ;
acgttataaa
acatataagg
caaacacgca
taattggctc
gaggcctcag
ggcgagaaca
gtgaatttag
tgagacagct
tcacatttca
ctcaaacaac
agttgggaat
tgacttcaag
tgtctagagt
ttcctggtct
cataaaggtg
ggtgggttcg
acagttcata
dUUd-LLdLL
ttaataatca
agtattgtct
gaccgtgtta
tgtgtctgta
aaacaggcac
attgtcagtc
aacttagagg
gcctgccatg
aagcccatgt
aagggtaaat
aaagtttaaa
cttttgcgac
gacaaaccga
ggaactaaac
cccttcttgg
gcagaggact
agcatgatgg
tgtgcatgca
atgggctgca
accagatgca
tggcttttgc
gcaacaggca
tgtgagaact
gaattctgtt
atttcaagtt
aaggaaaggc
aaagattatt
ttattatatt
tcaaataaat
aaaaatggca
ccggaccaag
tacaagttct
gatcaagtcc
ttgcttttta
atacacagag
tcaaaacgac
caccagaaat
tgacttaggg
agactgagca
ggaagtgtag
aaggtgaaag
cgccaactct
tcgttatcat
cccagcaggc
acacatgcaa
gaatgattaa
tgtccggaat
cggtgagtgt
acgtgtccgg
ctgcagacct
tcctcccgtc
gtgaagctgc
L> L. ULULddU L.
ttgttcaaat
taatgagctt
tgtggattct
ctctactgca
tagtcttgcc
acccacaatt
agattaaagg
cttaacaagt
catgctgaat
ttaatggaat
tagtccccaa
aatgcaaaag
ccagacgcgg
cacccaatga
cagagtctta
ttttttctag
aatgtgtgta
gggaaggaga
ttaaattgtg
tagtagctag
ttgtgttgtt
atcctgcctc
ggcaataaag
acaaatgtca
aagtaaagcc
tgaagagcga
tatagttgct
ctaacagaat
tttaaagtaa
taaaaggctc
ttttctagca
tgaggtacca
ttttctggat
tttacaagag
gcacacacac
aaaattatgg
caacaagaaa
gatgaatggg
caaagaggtt
tgctccttgt
ggtttcacat
cagatctcct
aagccatttg
acactgggga
catatattca
aaacaagtta
ttggtcttgc
aaagatggtg
ttctggtggg
tgttacagtt
tgtccctcct
ggtgagtgtt
- 158 -
008252
aaggtggcgc atctggagtt gttcgttcct cctgttggga gttgtttgtc cctcctggtg 128100 ggttcgttgt cttgctggct tcaggagtga cgctgcagac cttcgtggtg agtgttacag 128160 ttcataaagg cagcgcctct ggagttgttc attccttccg gtgggttcgt ggtctcgctg 128220 gcttcaggag tgaagccgca gacctttgcg gtgagtgttg cagctcataa agacagtgcg 128280 gacccaaaga gtgagcagca gcaagatgta ttgcaaagag caaaagaaca aagcttccac 128340 agcacggaag gggacccaag caggttgctg ctgctggctt gggtggtctg cttttattcc 128400 cttatctggc cccacccaca tcctgctgat tggtccattt tacagagcgc tgattggtcc 128460 attttacaga gtgctgattg gtgtgtttac aaatctttag ctagacacag agtgctgatt 128520 ggtgcattta caatcctttg gctagacaga aaagttctcc aagtccccac tcaacccaga 128580 agcccagcca gcttcatgtc tcaatactat gtatcaaaac attttcttga tgaattagag 128640 caaggatatt taaagaatga aaaatgtaga gaacaaaaag aaaataaaat cttaatcttg 128700 gatagtcaaa ggccacctaa gcctaacaga ataaaatcaa ttacaaagaa gaatgaattt 128760 gaatttttaa acaagtcaaa aataaccacc aaaaatattt tctaaacaaa atatgaaata 128820 caaccttaac ttaccatttc agtaagaaaa tgtcaaatgg acaagattta tttgctatat 128880 ttggtttttg ttatcaacaa tgcacactgc tggcaaggaa gcacagatac tgtgatatat 128940 tgcatgtggc agtgaaaatt tgtgtaactt ttctgagaat tggtttttta ttatataaaa 129000 tgacactaaa aagcatctta tcctttgatc ttctaattgc atttataaaa atctctccta 129060 nagaanagta acctgagatg catacaaaga ttgatcttca aaaaatgttt tttgttgcat 129120 tatttactgt tttgaaaatt ttgaaacagt ttttctgtcc aaccatagta gaatgactaa 129180 gtaaattttg aaatatagtg gtttatcatg caattatcaa aactatattt ttatagacta 129240 attagtgatg taagtcatga gtgagagaaa tggtgatgat aaaatatttt taaaaatttt 129300 accaaactat atttgcagct gaattcaatt ttgattcaag tacatttgta tgcctagaaa 129360 caaactgata gaatgtttaa attacaaaac aaaatatata cattttttgt tatatgtgta 129420 tatatatata tatatattta aaaaacctgt tgtttgaatt attttatgct tcatatattt 129480 tggtattttg agatttttta ctatgaaaat cttcaaaaat ggaaacaggt ggactgataa 129540 acaaatagat ataaaacctt actttatagt taaacatcag tgagaaaaaa actgtttttt 12 9600 aaatggcaag tacatgaaca ggtaaagttc taaaagaaag aaaatacaca cacacacgga 129660 catgctagtt atatttacaa taaaactaat ttaggttttt gacttgtaaa atattttatt 129720 aaagtaaaat aatttcaatt aagtgtttat tcataaacag ctatcaagtt tatttttaag 129780 gtattaaagt actaaataag cactattaga agtgtggctt tgaaatttat atctgcaaaa 129840 gaccacatca tttttgataa agctctttat ttgtgagctt agtgaagaga aatgagaaat 129900 caaagttgat tacacaggtt actttttcac atgataagag aaagatacag ggagggagga 129960 aggcaggaat tgnntgagat tttagaaaat ctcagattta aaacttttaa aaattaagta 130020 ttgggcatga ggaaatgagc agagaaaata gtagtcatat ttccacattt gtaaagagaa 130080 gaacaatagc caggcaaact ccatgtctga agtgtggttt attttaatat gcaaaacata 130140 agcatttctc tgaccaaagc tgctttctat ttaaagctaa atataaaaat attatttttg 130200 agcatagtat tgcgagaaca tagtgaaatt tcctatgtag attctgtgct gttttagtta 130260 cggaaatatt tttaattaat cctccattta .acaatggggc atacatctgt gtttttcgaa 130320 gcactgtttt gtatatatta gtaattatca ttgcactgaa atgaaaatat caatttcatg 130380 tacaatttta tagcacatat ttgattgaca atgaaatgca tttaacttat aaaaatgtaa 130440 tatggctgac attagcaaaa tctcttatta agaaataggt cataagtact ccaagaaact 130500 tgacagtctg ttctatgaag agcattaatt caaaagtccc ctatttgcat aaatctccag 130560 gtctcatttt cacagctgtt tgttgtcagc tagacggttg cagttcaaca ttattttaac 130620 ataatcggtg ggaagtatac ctttcaacta aaaataccat gctctgcaag aaagattgtc 130680 aggggtaaaa tataagttca ttcagttgat cttgatattt ttccttaaaa taaatatttc 130740 taatacagga actttaagtc tcaaattact gaaatatttt tattattaaa atatattttg 130800 taattttata ttttcataaa aataaaaagg ttatgtgttc atacataaaa atgttaatca 130860 gtagagctta ttttagcaaa gagtaaaaaa tactgaggat atctattttt cattaatcag 130920 ccaagcatta tatggagtgc aatataggtg tgctggaaaa aagaggatta aaatttttag 130980 atattgctga gaatatgcat gtatgttctt tgttttatta attttaataa tggaaaggga 131040 tcagcaatta ttagatctta aatgtctttt acctgtaaca cccaagagca cagaaggaat 131100 caaagtcaag agatctcagc ctggatactg agcaacacca tttgctacct gtaagctgga 131160 gttcttgatt taaaccctat gtacttcagc tctccatctg cagtaggggc cattatatct 131220 acagtaatca cttcacaggg tcattgctaa gattatatta aataatggac aattaactac 131280 tgtgggaatt gcaaagcacc atacaaatgc tagtcctggt tcagtgcctg ttctcatatc 131340 atttcatctt agctgcaatg aaatcctagt acaaattcat gaccttgtcc agctgtcatt 131400 tatggtataa tacataaaag ttaacccaag catagccaag gaaagagaca attggacata 1314 60 cctacatata ttttcataac tagcaaaaag attcgctggt ttttgccaat gtgcttctgt 131520 tacttttttt ttcttttact cttgaaatta tatttaagtg tagactccac ttaaagtaat 131580 ttgctgctgg aataggcata atgttctgat gtctgctttg cttctaatta tgttcaagct 131640 cattttgaca tttaaggcca attacaaaag tctagattca gaagactttt ccttagtcat 131700 ctaaaatttg aacaataaac agtttttttc tcctctctct ttattcattt aagtggtatg 131760 cttggcaaca agcatatttt gggaattgta aaagcaaaat aaataatgtg ggttcatttt 131820
- 159 -
008252
gaaaaaagaa ctacttggtc tttcttgcca acataaaagg cagtcacaga attaactgaa 131880 accaccagtt tcaactttat ttcctcctaa atcacaagga ataaggaatt attttacaga 131940 tacagtgata ttttaaacgc ctaagttcta ttaacataaa ggtaattgac ttcaacagat 132000 ctctaattcc aaaagagttc atacatagag agatatgtat aaaaatagct acaaaatctt 132060 tatcatttaa aagtcactca taattaaact ccccagacta ggaccctaca ccaaaattca 132120 gttagtgttc cattgcgttt taacatccag tcatgtgatg acttacgaca tagagcaaag 132180 cacttaattt acctgcctcc ttattttcag tcaatttgcc aactgcaatt tttactgttg 132240 attcagtaga agaccctgat gagttgacag caccaaaagg caattcatag catctattag 132300 taagaagtca ctgtagcttc tttgtttaac ttttataggt aagatctggc ttggaaaaat 132360 agactggaaa gtatattgta aaaaaaacaa aattttccaa ttgactgtca ttatcagtta 132420 atagattata gaatagtaga cctttatagc tggaagatat gtatcgtgta cttcaaagat 132480 gaaaggaaat aatgtctttg aaaacactgt caaattttca aaattatgta tctaaaagaa 132540 attccttaaa aaatagttta tcctttataa tttttgaact ttataaaaat ggaatcacac 132600 catatatgac caaacatttt aagtcataaa gaatacacag gaattctggg ccgggcacag 132660 tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg gaagctgagg tgggtggatc acctgaggtc 132720 aggagttcaa gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa aaaatacaaa 132780 agtcagccag gtgtggtggt aggcacctgt aatcccagct acttaggaga ctgaggcagg 132840 agaatcgttt gaacctggaa ggtggaggtt gcagtgagcc aagatcgtgc cattgcactc 132900 cagcctgggc gacaagagcg aaactctgtc tcaaaaaaaa gaaaacatag gaattccgga 132960 atttaaccac tgtgatagaa gttgcttttc cttgggacaa tatttttaag gcagatttca 133020 aaattattat ttcaactatt ctttatataa tgctttatta tttttaaagt attcacatat 133080 atgttatttt gattttcaaa acaatcttcg agtgacaatg ggattgcata tttgagaaag 133140 gctggtctca ggacggctga atgtttttcc caaagccgtt aagtaagtcg gtgacttaga 133200 ctcagacgct gtgaaagcag aggctgagta cttggttctt gacctcactg atctgctggc 133260 ttacagagca tcctggtctg catactcagc gattcaatct ctatcttaaa cgcagtccct 133320 cagccattcc ttctagaaag gtgatctctt tagagtgaga gcagtgatgg aggtggctga 133380 agttacacca gggggagcag ctttgaaaag ctcctggctg ataggcatgt actaatggga 133440 gcaggagctt tgttggcagt gtcgaagtcc ctttggaggc tgtgtgagga gggaacccat 133500 ttccctggga tatagctctc tccacagggc agctggatgg ctaggggcag ccatggagta 133560 tcagattcac ctaggaatcg atatttttcc tgagggtttc acaaaaaaag acagagagat 133620 ggaatttgaa gaactgggaa gagtgtgatt gaattggagg gatctgaaat aaagaaatag 133680 ctatggtcaa tggctctaac caacagtact atatttatac tccaaattcc aaatccacac 133740 tatgtgtatt taggtacaat ttagtttagc catagtaagt tgtggcttct ggagctttta 133800 tttaccatag gattttaaat acatttcatg tcatcttcat tggttttcct taacccctaa 133860 ttctccacaa gatcttcatc ccgtcagtta tgactttgcc aaccaatata ctttttagaa 133920 atgtaacccc aacattaggt acgaccagca tttactgtat atcaatatta tcctaaatat 133980 tgctgtagct ttgaatagct gaattaagtt ttaaataaaa gcaaaggaat tataaaacaa 134040 aatattaacg gattatgagg tcagtgggtt .tttctgaaga taaaactatt ctactaatta 134100 ttgctgtttg ggaaaaatag aaacaaggag actgagtaaa tgaatcatta aggcaattaa 134160 aaacagaaga gaagtcactt ttgcactcag tgaataccat caaggcaagt cttctatttt 134220 agggctgtct tatagtaaga tataacaggg actctctcaa taaaaaggtt gagctactat 134280 ataaatcatc aagtagattt tattttgaaa gcaacttttt ttgtagagaa agagttcttg 134340 aaaccagtta aagatttaaa aagttgatac aagttatgtt gtaaaatcaa agttatatgt 134400 ggatgatacg agttgtattc cccaccacat tttaacattt ttagtgtata tatttttaaa 134460 tgaaaaaatg tacattttac acgtatttta gtacaaacag taaaaaaaaa gtcagaagta 134520 atttatcaaa acatatgttt acacaaaaac ttgtatataa atgttcataa cagcattatt 134580 cataatagcc aaaaggtgga aacaacccaa atatcaactg ataaataggt aaaatgtggt 134640 atatccatta ataaaatatt atttggcaac aaaagggaat gaagttccga tgcatactac 134700 aacatggatg acccctggcc acatattggg tgattccatt tatagaaaat atccagagta 134760 caaaaagcca tagagacaga aagtagatgt ctttgatttc caaaggctga gggagggagg 134820 aatggagaat gacagctaac aagtatgtag cttcttttgg ggataaagag aatgttctta 134880 aattagatag tggtaatggc tgcacaacca tgtgaataaa ctaaaaccca cttaatcgta 134940 cactttaaaa ggtgaacttt atggtatgca aattgtatct caaaaaccta tttcttttaa 135000 aagtcaaaaa aaatagtata gaccccttcc atagttcctt agtcctttcc attctagtcc 135060 ttagagttac aggtttattg tatacacttt caagcattta tatgcacaca aaagcatatc 135120 tatgtgcttg ggatatagca aagggatggt actatatatt ctacttactc tactttgacc 135180 aaaacccaag atgtttaacc attctacttt ttcttaatat ttgactatgt ttgaacttaa 135240 attgatatcc acacatacta aaataccaaa atatgcattg agtcatcaaa tttcaaaggt 135300 catccatgat attttttaag ggcttaaaac tccttngcat gatcnttcag cctgtttant 135360 tcagcatagg aaaataccct tgctttgcct tcacctaact ctaaggaagt ctattagaga 135420 tatttagggt cagaaatggg ttcttggggc ttgagagaga aaaggatctt ctgctattga 135480 tgatctggct ctgccatgac cctatggcat gggtcctcag tggccctgtg ggaagcctag 135540 tgtaggcaac atggcctagc ccacctatgt tgatgtttaa ggggtgctag gaacaaaaga 135600
- 160 -
008252
gaagctgtgg aaacttttgc ttatccccct ttcttccctc tttggtggtc ttatttttat 135660 ccgacgctct taatctcaac ttataaccgg aaaatacagc accaaagcgt gagggcattt 135720 aggggaaaaa tgttatctgt tttggaagta atatcaagga agatcaggga caaatgcaga 135780 actggaagca aggactaagg ttggatttag caggatttcc tgaaagattg gatgtaggat 135840 gtgaggaaat gagatgaacc aaagatgtct tcagggtcat tggcctgaat aacttgaaga 135900 atagatttgc cattttcttg gctgggaagg agtgcagaaa gaacaggttt gaaagtgggg 135960 catgaggagt ttcatatgac acatcaaata cttgagattc ctgttatcta acatctgtcc 136020 aagtaaaaat gtggagttga ttctggaggt ggggctggaa atataactgt ggaagtcatc 136080 agaacataca agggatgtga aggcattaca atggatgaga tcaagcaggt agtgagtatt 136140 gagatataag aaaagatctg aggtcaagta ctggagctct gtaacattta gacattagga 136200 aattgaagag aaaccagcaa aggagcatgc aaagggctgg cattggattt tgtggctctg 1362 60 tagtgcagtg ctctggctct tttggtgact gaaagatgct tgttcactgc ttttctctgt 136320 gttttcaccc ggagcatccc tgtgacattt ctatatatat atatttattt atactctaag 136380 ttctagggta catgtgcaca acgtgcaggt ttgtacatat gtatacatgt gccatgttag 136440 tgtgctgcac ccattaactc gtcatttaca ttagctatat ctcctaatgc tatccctccc 136500 ccctcccccc accccacaac aggccccagt gtgtgatgtt ccccttcctg tgtccaagtg 136560 ttctcattgt tcaattccca cctatgagtg agaacatgcg gtgtttggtt ttttgtcctt 136620 gcgatagttt gctgagaatg atggtttcca gcttcatcca tgtccctaca aaggacatga 136680 actcatcatt ttttatggct gcatagtatt ccattgtgta tatgtgccac attttcttaa 136740 tccagtctat aattgttgga catttgggtt ggttccaagt ctttgctatt gtgaatagtg 136800 ccacagtaaa catatgtgtg catgtgtctt tatagcagca tgatttattt atttattttt 136860 tccaactctt ttttttatta tactttaaat tttagggtac atgtgcacaa tgtgcaggtt 136920 tgttacatat gtatatatat gccatgttgg tgtgctgtac ccattaactt gtcatttaca 136980 ttagctatat ctcctaatgc tatacctccc acctcccccc accccacaac aggccccagt 137040 gtgtgatgtt ccccttcctg tgtccatgtg ttctcattat tcagttccca cctatgagtg 137100 agaaagtgca gtgtttgact tttgtccttg tgatagtttg ctgagaatga tagtttccag 137160 cttcatccat gtccctacaa gggacatgaa ctcatcaatt ttatggctgc atagtattct 137220 atggtgtata tgtgccacat tttcttaatc cagtctatca ttgttggaca tttgggttgg 137280 ttccaagtct ttgctattgt gaatagtgcc acaataaaca tacatatgca tgtgtcttta 137340 tagcagaatg atttataatc ctgtgagtat atacccagta atgggatggc tgggtcaaat 137400 ggtaattcta gttctagatc cctgaggaat tgccacactg acttccacaa tggttgaact 137460 agtttgcagt cccaccaaca gtgtaaaagt gttcgtattt ctccacatcc tctccagcac 137520 ctgttgtttc ctgacttttt aatgatcgcc attctaactg gtgtgagata gtatctcatt 137580 atggttttga tttgcatttc tctgatggcc agtgatgatg agcatttttt catgtgtctg 137640 ttggctgcat aaatgtcttc ttttgaaaag tgtctgttca aatcctttgc ccactttttg 137700 atggggttgt ttgttttctt cttataattt gtttgagttc attgtagatt ctggatatta 137760 gccctttgtc agatgagtag attgcaaaaa ttttctccca ttctgtaagt tgcctgttca 137820 ctctgatggt agtttctttt gctgtgcaga agctctttag tttaattaga tcccatttgt 137880 caattttggg ttttgttgcc attccttttg gtgttttaga catgaagtct ttgcccatgc 137940 ctatgtcctg aatggtattg cctaggtttt cttctagggt tttcatggtt ttatgtctga 138000 catttaagtc tttattccat cttgaattaa tttttgcata agattcctca tacattcctg 138060 ttgtgctttc accctctact ctctggttct caccctgttc tcatatatcc aaggaagatg 138120 atacactcta attagaaaca acaactgaac tcagctcatt attttcaaaa tctttcttct 138180 ccattaggta aaaatcattg cagtctgttt attcaatatg ttttcttttc cacttaaatt 138240 ctgttcatgc agagactgat tcctgggaac atcaatgtgc tggcaacttt gactttgtaa 138300 tttccctttt gttgtcccac tcaactgcat ggctgatctc cattcatttg ttcacttcca 138360 gagcctactg ttggcaatct gatttttctt catagtttcc cattaaaatt cactagagat 138420 gcttttgatt tacttatttc ttccctggca gggtagagtt gcttgttcca gatcacctca 138480 tagcaaactg gaccattctc aagtaaactg ctcatccctg gtgcagttat cagcagggag 138540 gcatctgcag cattaacagt gattgacccg tatagtgatg tttaatatgt gataatgtta 138600 ctagcagcaa acaaaatagc acttgtaaac acagttgttt actcatactt acatgtatag 138660 gtttggactt gaggggtaaa atagcaaaat tacccaactc ccctgctaat aaaacctaag 138720 gaaatgaata aaatgacctg agaaaattat accagcataa ctacagtaag gaagagctac 138780 aatttcatgc cattttctcc gaatagcagc taggaggaaa gaaaagaaga gaaagatgaa 138840 ggaggaggaa aaggaaaggg tcgcggagga ggagaagaga atgagagaga acatgaatat 138900 tctaggctca tcccttaaga ctgtcttctg gaagaagtta agaagaaata aacttggaaa 138960 aacaacgaaa ccgtatactc aaattcccca atctgtgaag tctgtggcca aagggctatg 139020 cagagccctg gaaagtgata agaaccactc atgtatagaa gccacttgtt ccagaggcaa 139080 aataatccac tagatctcac catttttatt tttttcagct gaggaggctt gagagtgaag 139140 gcaaaatgtc ataccttctg aaaatgaatc atctcccatt ctgctacaaa aatgtagcat 139200 aatgaaaata tgaagagaca aaaacagaag cttcaagagt acaggaagct caggataaag 139260 aggggtgtcg aaagccccag gagttgtcct attcgcccat acagagaacc aaaaccaaca 139320 ggaggacatt gacttctccc tcacctggag tcagtggagt gggaatgatg gctggagaga 139380
- 161 -
008252
ggccagtgaa tttggggaag tgaacactta ggactgatta gttctggctg caataaagat ttcctgaacc tacctgaatt gaagaaatat ctgaagcctg atatttcaag cataattgcc catacacagc ctcagctaat acttctctcc ctgtacccct ctcctcatac tgaaacagta aaacacagag aagaaaacct cgttgataaa ttgaaaaagg atgctaatga gtgggatgag atatctggaa taattctctg cccctgtatt agaaagaatg aaagatctag ataataatgt taaaagtgga aattttggca actgtggaac cagtctagaa agaaattagt tcaaattaaa acaggtagtg agaggacccc aagaataata tctatgagag taagaatcaa atggtttctg ggcaattgat ggtttaaaga aagaacatct gcaggatagt aagaagggtt tattctaaat gataagtgta atgtgtgaga atctggaagc tacttgagat agaagaaaga aagaatatat ttanttttcc caatgagaca tgtgagaaat agtcagaaaa tctcagcaaa aacaaaacca aaccaaagat tgtattaaaa aaaaatggct caaataacgt gagttaaatt ggcccagatt ctgagcaatt aatggaaagt aaggaaggtt ccatttaacc ttgaccattt actgtctaat agagtcttgg agggggaagt ataattttag aacattacct ggcccaagag tgagcaatgt tttcatagga aacattgact atcaacatat tgattatcaa cctgctgaga agcacggatg acccaattat gatagaaaaa caaaatgtaa atattgtcaa acttgaggat ataaatgtat acatgacacg agatggaaaa tgaaagcaga gagaagaggt gacctgacaa gtggcaatgg taataccttc atctcacact ggaaggggtc aagtctttct agtttgatgg aaaaagaaat cgagatttac atacaaattt gggagtggtt aagggaagtg gggagtgatg ttgtgcctga atgaaatctt cacatatcat agcagaagtc tatgtctaaa gtggataaat caagaaatcc taaataggga taggcataac gccatcagaa gtgaaaacaa aaaattcctg tctcattact tataccaaaa taaatttcag atttaaactg atttaaacag ccaattcagg ttcaacatgt ttaaaataat aaagcaagga aagtgtcaaa ctactgcata aaaccatggg taaatttatg tctaatcatg cagtgagaga agtcttttta agcaaaataa aaacacttaa aaggaatgac aaattagacc acactgaaat ttaaaactga tctttgcaaa aatataagaa atgtataggg gaaaatgcac tgaacataca tggcagataa aagatgggtt ttcttatttg taaagagttg gtggaaacca ataaagaaaa taaaatggtc aacagggcag aaaaatggaa taacatgcga ataggtagtt cagagaaaca acttcctctc tgccttcttt ccactgaaac tctactcctg tgcattactg aggtcagttg cttcattttc ccaaaactgt tcttgattca cccaagagga ctaaattggc tcttctctgt tgcccctcag tactttaacc atattttgct tacacaccaa agttactatt cttccctttc tttttatttt cttttttctt ttgagacagg atctcgctct gttgtccagg ctggagtgca gtggcacaat ctcagctcac tgaaacctcc gcctcccagg ttcaagcaat tcttcttcct cagcctcccg agtagctggg attacaggtg accatcacca caactggcta atttttgtat ttttagtaga gacggggttt caccatgttg gccaggctgg tctggaactc ctgacctcaa gtgatctgcc cgccttggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcgtgagc catcatgccc agccagtatt cttccttttt gagaattgat cctgttcatc tttttcttcc cctctcaatt atacaattct taagggaaga aactatgtct tactccactc aatccccaat gcatcaaacc tttagtaacc actaataatc cttgtttgaa taaataaaga gcacaggccc tacggacaat gtaagtcagt aagtgcactt gagtcactat ctcaagcaca ctaccatttg aatttaaatt tctggataaa aatctccaca aaactgataa ggcacccttc aagcaagaca caagttaatt ttcagcctct aatagaagta tttgttggca ctacctttca ttggtttatt catttcagca gccataaaca cacagatccc attgtcacag aaagccttgt tcgcaaatat aatttagtgc atctcacaat atgagctttc aggtggttga gctgtgtgga aattcgattt ttttttctcc cgagactctg aaatgaaaag aggataaccc cagtgctctt gcccacatcg cttatctcac aacaacagat tacaatccca taactccacg ttcccaagca gctactgtgt tgatcaaatg taatgcaaca gatgagaaaa catcagctgg ttcatgccca agacagctga aaggtgcact tacattttta gtctccagat accaaaataa atctgttggg cttaatcatg agttgtcctg ctacttttgg ggaaagaaag ccatgtccag tgaaatttct tttatactgg caggcatttt gactcttcac ctattgctgt tgaatctcca ggatatgtac atgttttcac accgatacct tcattgaaga aaatacagca atctgatatt tttatgtgaa tcatctttgg aattcgtgtt cctcaccttt ggatacaata aatattcaag agaaaaaaaa tacaggaaaa aaataattgc cctcaatgat gagttctgaa atacttataa ggataagtga tgtgttgaaa aattctcaaa agcaatttta gaaggaataa tttttgcaga gagtggctgt ctcttgggca ccataacaag aaaaatagta tattgccctt ggtgatggtg cggtcaagta tcaataacaa cacgcttcat attttcatga acaaaacact tcttcataag gtaatgagat tatagaaaaa tcaactcaag gtaaaaataa ttactttgca catggacaaa ggataagtgg aagaacttat cttctagttc gtggttcatt taacaattaa ttgctccttt ttcaaatagg tccactgtgt tctgggcctt gaacagtgta cctctaagaa agtttgttat ccttactgaa ggaaattaca gttaggtcgc ttctcagcct tttggctaag atcaagtgtg aaaattatac ttagattact atgtaattag gcctggtaga tcctgggtag acttcactga atgcaggatg caatatttgg aaaagtactt actttggagt cctaatgcct gggtgctact tctattagtg ccagaaatta atagtgtgac tttgggataa tcacttaaca tctttgagcc tcattttcct tatcttcaaa aaaaaaaaaa aaagaaggaa tcagatgaaa tcatctttac cagattaggt ctatctttag gtcccccagt gtaactgggt ttctgtcttg gtctcagtcc atccttgcat
- 162 -
008252
tatcctggac tactgaagtc cagatatcat tgagttggag agccaaagat gctctatttt tcttgaccct gtccagtgtg atgatagcta tgccttagac aaaagtaatc accaaagatc ttttaattca agatctttat ataaaaatca atgcaagcct atgttccaga gtgggacata actctggtga atcaacagat taatctggtt tgatttgtta gacagaacaa acctagatga cactgtcttc atagacctca gactggaaaa aagaaaactg tcttcaatat actaaggaat gcaaacctaa
v. wu.ba^^ae
agttacaaaa cccagttaac atggaatgta tcttgcagct gtctttgtca ctctaaggtc tataacttag caccaaaaag gaactacata gaaagatagg gtgctggtgt taagcctgtg agtttattaa attgtgggtt taattatttt ttcctcactg aaaatgaaag caagtgaaaa agccttcttg acttaaagtt caagatgaaa aaacatctgt aaattgaaat ttcagaagtc aaattggagg ttctgaagac ataattcaca tctgaggatg gcatttaaag tatgcaagta tcttctttct tttatttatt tataaagatg catagtctca actcacagat attggcagaa ttattttttt gtgccttgaa gcaatatcac aaataatatg aagtgtaatt tgttgaaaat ttgaatttgt gggtaattat tcttatatct ataatattga aaagctagtg tcctcaccca tgtgggcacc gttcagcatt atttggccta ggatgagatc agttagatat aatgaaaatc tctcaggatc agtttcactg gggtgcagtc aaacacatgg aataccaaag acttccatta gtaataccaa gttctaacat
+- i r> т" /т _"-_> "¦
tatcttacaa agatgataaa aatatgacca aattattatt aatcaaactt agttttaatt aagttgtgtt ttaatgagaa gacatagttt aacattgtgc ttgcacaaca ccatttattc gctacttgtg aaatgcagga atagtaatca aaaatgtttc ctggaagaaa ttctactggg ggcaatctaa catccaagga accaatctct tctaactttt aacttgttct tacatgttaa gcaaaaatcc tcacataact atacacccag ttttagagca ccatatatta tcatttatta ctccttccct ggaatcccaa tttttaaaga ttaaaaagta acacatatat agtgtgtgaa gtttgtttgt acttttttta ttagaaatat atagaaaggt cactataaaa gttagatagc ttctaatttg tttcttattc ttcctatgtg gatcaaagtc tgtaatacct ggaaggatgg cgtggttgcc tttttttcaa ttgtcaattt cctccttcca tttctccatc tcacatttac aaaccggaac catcctcttc agttaattag aaaaaaataa tccagtaaga aaaacaaaga atgctcatct cacgttagaa aaatacaact tattattgct actgatactc gagtgttccc gcttccctgg ctgccaaaga ctaaatatct tgctatagac ttcattgtta tggccttttt aataggaatg cttagccctg attcatccat tttaagttac tagatttcat acctaatcat acactcagat aaactagcct gtcactaata atcttcttta ctcctggggt aattctactc ttattgcaat tttattcaca cgagaacagt agattcaggt tccctgatct tttccaaggt ccagcactga ataaatgtta gggtatcatt atacctcttc tatctgagaa gtcactagac tttattgact ttaattagaa atttttagct ttgttttttt aatcatgaaa ttctttttta accataaaaa ataagtttct ttgctgaaag ctcaacagca cacatcaaat ttgaatcaag ttcaaacatc ttgttctttt gtggacgtaa atctatttca ttatatcttg caaaatggga ttctaagttt aggtaccagt ataccaattt tccattatta acagctgtaa aaatcagcac aacacattgc accgacttct aaaaatgtta ctatgtaata gttccaagtt
-"^-(--l Г-*--
aatctttgga agaagagttt aggtctgtct ataatgaagt atcactcaca atgaatgaaa agacagaggc catggtgtga atacatggag gaagcctggc gggtctttgc tcatttacac tctaaaacta tgaaatcatc tttcctaata atatgtttga attacattat taataaaata tgggctaaaa tcacctgagg tttccactta tttcaaacaa ctttttaaaa ttggtaaatg tctagctctg ctctgttgtt tgtcatgtat gcccctttaa aatttatatt tatgcccctt tcccaggcaa ttcaatttat tccagtgggg actaatgtgt aaatatgtaa tggctggcct ggtcttggct aatgtgtttg aagagtccca taaaattata cttagcagca gaaaaaaatt tttactgcga agttaaatat actgttcttg acatgctaat cctcttaggc tggaccaaac ttctctatca gaatttataa gccaaaggac ctacacatca gtttgtaaga aagtatcccc ttttttttct ttaaactgaa agtggttttg tgcaagtatt gtcacacaag tgaaatgcag aatttgttca gaggactcaa
+¦¦-+¦+• 4- nnr* -i -i
acacccgatt agtaatttat gatctagatt ttaaagttgt tcaaacaaat taagtccttg tttcaaaact agtcatgggc ttgactttta ttgcaaagct atcttccctt atcatttatg tggaattgct tatgtcaggg aagcaacaaa ttcttaaatc ttagtaaagt aaatattaaa tatggcattg ctttaggaat ctgatttaag cagttataag gtctgtaagg tggtgtcgta ctggtcactc tgtatcggaa ctgcgagtta atgtagataa atgttcagat cctgaattaa tgactctgat gtctttatcg
caacttgctc
ataggataca
gaatgaaact
ttgttggaat
tcttccatga
tcttcaagct
tgtttttaat
tgcctttata
ggaacaaaga
aacggcaaaa
acaaaactaa
cacattttta
ccctgatcag
ttgaagttgt
atttatgtcc
tctaaatgct
tctttttgcc
tgggatgaac
taatgcagac
aagaactgct
gggaaaacaa
aagcattcac
catgtagaga
gacagaagct
tgctatgtgc
gtaaaagcac
cagatttttc
cctgtgactt
tatttaagaa
atgtttccct
agatagtatt ctgatgtcac tggtccttag ctgaaaaaat tacatataat ataaactaga aagacatgtc tcaaacagta aaagttacgc gaatctggct ccaggacctt cgttcaacta cagactgttg aatatcaatc atggtttact agggacacaa aacatttttt actggtatat gttatagaac ccacagagca tatctaccca ttaaaactga caattgagaa caagactacg gatatctgat agtgaggata accctgtatt gacggtttgt atttttaatt tttccattct aattttaata
- 163 -
008252
taaattcatt ttccaatttt tagaacatat ttcactaaat ttaacattct gtcattcagt 14 7000 agaagactca gtttgtgtaa cactaaggag aaaaacaatt aaactataca catagaggat 147060 aaggtgcatc cctacttcag agtttttaaa aggtgaaagt aaatgtgcat cttaaaatca 147120 atgaaatgca gaggtttccc acacatatat gcatccatta aaaatatagt atttagggcc 147180 agcacggtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggag gctgaggcag gtggatcacc 147240 tgaggtcagg agttaaagat cagcctggcc aacatggtga aaccctatct ctactaaaaa 147300 tacaaaatat tagccaggca tggtggtgag cacctgtaag cccagctact caggatactg 14 7360 aggcaggnna gaatcacttg aatctgggag gtgggggttg cagtgagccg agatcatgct 147420 gttgtacccc agcctgggca acaacagtga aactccatct caaaaaaant atatatatat 147480 acacacacac agacacacac acacacnnnn gtgtgtgtgt atatatgtgt atatatgtat 147540 atatgtgtgt atatatgtat atatatgtgt gtgtatatat gtatatatat gtgtgtgtat 147600 atatatgtat acatatagta ttttaaactt aaggttacca tctaaataca ttttatgccc 147660 aaaattctga agattaatat taagttttct tagtttgcaa agcactgctc cagtcaactg 147720 atggccatcc ctaggggagt ggtctggtaa tacatacttc tctcccntat aagtccacgc 147780 tggggccaag ttatacatgg tcatgtgttt ccctccttat caattatttg tagcagcaat 147840 ttttagaaca aatggtatca aactcaacat atattctgca gttaaatttt tcactggcta 147900 tttttttctg agatcttttt atcttactcc acatgaagct aatttggtca ttgttataga 147960 gagccgtgtg gtactccgcg gactgtgaat atgccatatt tgtttatcag ttccctttct 148020 gatggctatt taggctgttt tccaaagttg tacttttata atgctgcaat acatttatgt 148080 atcgtgccca cttatgtgaa tttctctagg atatatgtcc aaaagtagaa tgcttagatc 148140 ttaggtactt cccaaattgc tctataccag ggacctgcaa gcccagatac caaatccagc 148200 ccaccacctg tattatacaa cctgtgagct aaaaatggtt tctataattt agtggttata 148260 caggtaccca cagaatatcc tcagtattgc ctcatgaccc tcaacgtcta aaatgtttac 148320 tgtctggacc tttaagaaaa cactgtggac tcctgctcta tagataaatt gtgctaattt 148380 accctcccaa gtgcaatagt tgagaattcc tgtgttctta cactctcact tagacgtcac 148440 attgtttgac atgtgaggtt ttggcaatct tatgagtgaa cactggtatc aattgggctt 148500 gcatttttgc atttccataa ttattaataa gggagcacct cttactatgt ttattgacca 148560 tcttttttgt gactcaattg tttgctttac ctattttcct aaaaacaaat ttgtcttaac 148620 tcatttattg gatatttgtt ggatattaat ctcttgacta ttacatgtgt tgcgaatatc 148680 ctctcttagg cagtattttg tcttccagtt tgtctgtgat gtcttttgac attctatata 148740 tttttatttc atttttagtt aacaaataat aattgtatat atagtagtcc tcctttgtcc 148800 ccaagggaaa ctttccaaga ttcccagtag atacctgaaa ccatggatag tacagaaccc 148860 tatatatact atgtgtttta ttatacatac ataactttga-taaagtttaa tttgtaaatg 148920 aggcatagta agaaattaac aacaataata acaaaataga acagttatga caatatactg 148980 taataaaagt tatgtgaata cgcattctct ctctgtctcc atctctcctt ttcaaaatgt 149040 cttaatattt tcaggctgtg gctgaccaca gggaactgaa actacagaaa gtgagacagt 14 9100 ggataagggg ggggcctact gtatttatgg ggtacaacgt gatgttttga tacatgcata 149160 cattgtggaa tgatcaaatt aggtcaaaac .tatcggtttt tcactgatgg tctgtattta 149220 ttttgacctc atgcttaagg aattctttcc cacctgaggt aatacaaata ttctcctata 14 9280 tcttcttcta attgtttaca atttttgctt ttcaccttta agtctttagc tcatctctac 149340 ttactagtta gatatagcat aagctagatg aaatatactg tttaaataaa actcaaatca 14 9400 atttttctca gatttatatg agaaactgca aggtttagaa tatttatttg atttatctga 149460 ttatgaagtc taacacaaaa aaggtaaact gttcaaactt ttaaatttct aaattatttt 149520 ttaaatgata tataatttaa taaaaggaaa cactatataa ctaaattaaa acaaagatta 14 9580 tcacttctat actacccaaa aaaagtctaa tactgaagtc acttccccag ttcacaaaaa 149640 attttgctta aaacatggtc agcagttgtt tctcttttcc tttgtaccct tagactaaca 14 9700 gttactgtaa tgggctttat gaagtgagtt caatttgatt tgatacagtt ttactgaacc 149760 tctactacca cgtgcaggta ctaacctacg tcctggccaa agtgggaaag agcttaattc 14 9820 atgtcctctt aggggctaca aataattgga aattagcaat aacgaacaca gacaggctaa 149880 ccaacaaaca aataaaacca gtggttccaa ggcctaaaga tgcaaatggt aagagaggca 149940 tgtgtacatt gctacttgct atgtgatcaa taaacatctg cttcccagtt gttcccaatc 150000 tgccttatga gaaatatcaa aagtagtggc agtgaaacag ctggagatag tctgtgggct 150060
ааС-а + яУяая r*=ir"af" rtf-nt* n япппт-пягягт nt-r*t-rfr-rr*-+- д няга^а^яИ1 rrpa f rrrrrrt 1 ЦП"! 70
---------------U — Z7 - ZJ - -э ~Э TJ ~----"Э -)-----~ ~ - -----. - ~ ~j-----^ ~ ~ ~ '--
aaaaactaaa cttcacaagt taaaatattc cataagcctg tcttcagagc tgaacttacc 150180 ttaaaatgag catttttgtt taattgtatg tttcctttta caaaatgcta caacgcattt 150240 taacccaaat gggtgagaag ggaaaaaaaa agtagtctgt gtaaacatac aagctctgat 150300 gtgtcttttg ttcacaccga acagtggtgc catacaactt gatgagttcc tgatttagtc 150360 ttcccaggga caggcatgtg ccaagcagcg aaaaataaaa tgtgtggttg cagcttgttc 150420 tggaataaag aacagcaggc tatttcatca cccctggggg caccaatttt cagcccacaa 1504 80 tgaaaatcaa gctgaagtat atagcaaatg catattcata acctccatgt attgtccctt 150540 tcaaacatct ctctcttccg ccaggtatgt attctgtatt tctgtcctga ctgattgcag 150600 tttattgaat gcttgttaaa ttcatctttt tccccatctt tgccaatgat ttggggatag 150660 ggactatgga agacctaaca agttgaaaga ctccattttt cctgcaatgt ttttctgtct 150720
- 164 -
008252
attactgttt agcgttcatt tcttgatttt tgggcattcc ctgtgttgaa tataaaaagt taaatggtaa ctagtgtata acgaaaataa gaaaaaaatc tagggtaagg cagggagaga aaataaatca aatgagaact attatacttg gttaaataga ataactacca gaggaggtat agaccctggt tgaaaggtca cagcaggcct ttagcaatgg attctccact aaaaagtgga ttaatatgat tagatatttg atacatgtac ctgaaattat aaatatcggg gggtggatca gtctactaaa
caaaggaaag gtgggtagtc gcctcggtag aaagtgtaaa cgtatcccat gaaattgttt acaggaaaag tttcaaaata gattaaaggt ataaaattaa tcatggctat aattttcaac tacttttcag acattatgtt caaatgcaac aaaaaaataa cagncattaa tagagaaaga ccaggtacca aaatcctatt gataatgtgg gcattataat ttttcattga tacatacatc caaacgctat gctttctttt ttagcagggt atcattaaaa ccaggcgtgg cctgaggtcg cacacaaaaa
gatcgcacca
caatcactca
aattagttgc
tgacactcct
gttttaatat
acatgtggta
ttctgattac
cagagaactg
tttccatacc
atccacattg
gatggacacc
accttattag
tacagactca
cttgggtcag
cctacatgcc
tcagcggaaa
agtttgtgct
atttgctgaa
atttttaaat
gttgtgaagt
cttctcctat
tgccgtggct
agtatatacc
tttttttttt
tctcggctca
gagtaactgg
agaaacgggg
cggccttggc
acattatata
agtgagccag
ctgccatcca
yaavjuavj^avj
ctgcactcca
atagaaatat
ataatttaga
gtgatttaat
gaacctgtaa
gtgtaggtaa
taatgagcat
aaaaatggtt
atgtgttggc
cactgggttt
aagctgccat
agtctgtgag
ccctgcacct
acttcagtca
agggacagtt
cccaagcccc
tttgtcatgc
taaaattagg
ttgttgcctc
cacgcagcgt
ccacagcaaa
ctctctgtcc
agtttcttgt
tttgagatgg
ctgcaagctc
gactacaggc
tttcaccatg
ctcccaaagt
tctaataaca
tttatttttt
ggcctagagt ccctgtgatg
tttttgttac
tggcagcttg
ttaaataact
tttacactgc
cataccacag
aaaaacacaa
atttaaagat
gaaatttcag
acttcataaa
ctgcagagtc
cagaaaatcc
ctgtttgaat
ggacaaaatg
tatttcagta
atatatctgt
ctgaggtgaa
ggagcgtcat
gtttgaacct
atatcattca
cattttccac
ctgagggaaa
catcactgat
agctgtatat
agacctgtta
ttacagcatt
tcaagaggag
aaaaataggg
tggctccccc
ggaattccag
ttagcctggt
aaccacw ~ga
gcctggggga
cacataaatc
acagtcaaag
gtggcaagtc
atcacattta
acattagctg
tacctcagct
cttcctttca
aagtgtctga
gtaggaaaat
tcttccttca
aaaagaaccg
cctgaatctt
tctctcaccc
tgatgaggat
ctaccacaca
cactgtcaaa
tttatgctac
cccaagagtt
tttcccagag
tatcaaatgc
tgctctgagg
ttaaccaatg
agtctcgctc
cgcctcccgg
acccgccacc
ttagccagga
gctgggatta
ttttgtcaaa
tgttttgttt
gcagtggcac
tgaatactga ctttgaagtg ctgagaatag tgattgtata gctgattaca gcggcaagac gagtgtggga aagaaattat ctaaagggac aagaaagaaa agagagaatg attgtgaatg catgctaatc atctgcatca atttattgaa ggtcacatgt tctgggctgt aaagaatatt ggaaaattac taaatattct actgaatgca taaagaatta tcataatgta tacacagtag aaagtgccaa gtacaaacta atgaaaggtg acatagtata tataatccca accagcctga gtggtggcag
aaagaaagaa ctgaaattaa tcatattttg gaattcattt tttgactttt agcttaggat cattgattcc taataaagtt atctttaagc aatgaaaagg taaaatagga acaaggctgc caaaagtctt caacaaaatt tttgactgaa ataaaactta ttcagaggna agagaaatca gcttttgaaa gagagagact ttgtcaatgc gatatctgaa tcaatatcgg gacaaatgct atagtaaatg aacaccactg gtgtcattag tcctgctgca gcactttggg tcaacatggt gcacctaaaa
aatgtaatta cacagcaatc ctgacacaaa aaaagtgcat tgttgaccca agggtgatta tgctgtgttt cacagcaaag tatataaaag gaaagctata tatgttgctg cctcttgcaa attccgaggg ggaagaaata atttattgta aacagagcaa gaaaaaggaa aacgcctgtg tccactaagc tcccagactt taaacatacc atacattgtt tcataaaatt gtgttgcata catgaaaaaa tgttgaaagc cctttttccc gtataaattg aggccgaggc aaaaccctgt tcccagctac
LUUUL
cagagagaga
taaatattaa
cacaaaggta
cctgtaaaat
gtggctatag
aaggtaatat
ttctgtaaaa
gaatgagggc
cacccaggtc
actgtatcat
cttctaccct
caaagtcatt
ctgtttccat
ggagtgccag
caatctgaaa
catacatctt
ttaattgaaa
tttcaagcaa
tgttctaatt
aagccaaagc
atctgccttg
gtggcttttc
taagaaaaca
tgttgcccag
gttcacgcca
acgcccggct
tggtctcgat
caggcgtgag
ctgcacttaa
gtttttagtt
attcacagct
ctctgcctca
gaaataaata
aaagtgtttt
tcctttatta
aaaaaccttt
gcagacatcg
acagaataaa
ttgtcaccca
gacctgctct
tgataacata
ttatcgcagt
ctcacctcct
tgcaaagaca
ttgccacctt
gtccacattc
gaaccagttt
aatgatgcct
acttcaaact
ctttaagttt
tcttccttta
aggagtcagt
tctgtttatc
ttacatatct
gctggagtgc
ttctcctgcc
aatttttttg
ctcctgacct
ccactgcacc
ccttgtctag
tttggagaca
cactgcagcc
atcaatcaat
atgcaaagca
atacatatga
catcaatacc
tggcacagca
ctgtaatggg
tgagaacact
ctcccatgac
ttcagtccaa
aattaaatat
gcttattgtc
ggcaatcagc
cagccaaagc
atcacagtgc
aaatagggct
ctgttttgta
aaacaaagat
ttattatatt
gggccttcct
ggagtcttgc
gcagctggca
ccaaggaaaa
tttttttttt
agtggcacga
tcagcctcct
tacttttagt
cgtgatctgc
cggctagaaa
ttactatttc
gggacttgct
tcgacctccc
- 165 -
008252
aggctcaaga aatcctccca cctcagcctc ctcccaagta gctggggcca caggcatgcg 154560 ccaccatgcc tgactaattt ttgttttttt ttttttttga gagacagggt tgcccaggct 154620 ggtctcaaat tcctggggtc aagcaatcct gcctcagctt cccaaactgc taggattaca 154 680 cgcatgagtc accatgccca gctgagccag tttaaacttg ctgcattaca tgcattaaaa 154740 acaaaaacac acacacaaaa agccccagaa cttttaaaag gaaaaattta gcagaaagaa 154800 actgatgtca tcactttgtg attattccag cctccctctc ttatccgtga cctctgtggc 154860 actcaagacg cctgtccatc ctgccttcct ctccagcctc caaaccctct gcctggaagc 154 920 cagactctgg ccagacttac tcaccaggcc ctcaccacac cacctggaat gcgttcctca 154 980 cagctctttt ccaaaatcag tcttctcctt ggcatctgcg tggcttggga gagcatcctt 155040 ggctctctgt cattgtctca caatcttcga taagtagtgt tcggaaagtg cccccctggc 155100 ccatgtgccc agatgggctc tccaagtcta aatgcttcaa aatggtacag aactaaatgt 155160 gtgaatttat gatggggctt catttctggt cctccttctt cacacttgcg tggccgccct 155220 tcccatccgc tctccaattt tctttcacgt ttctgctttc tgagaagaaa taagactgat 155280 ttctgggatg gagcatgaga gagacagatg cagagagaga gagagacaaa gcgtgtttcc 155340 gtgggagatg cccacacacc tcacttggga gcatcggcag tgttggtacc cacacaggtg 155400 tgttttgaca tccaagactt gaccctaatt cttcttggaa cctgatgggg agagaacctt 1554 60 gctgggggcc ccacatgggc caggggcagc cagggcagag ttgggcagct gcctgagagt 155520 tctcggtgga gaggcccaga atatcccaca agaacaagtc tccgttagtt ccaagtggaa 155580 tgacagccct ttctgagttt ccctgagttg agagctaata catgtgttgt gggaacaaca 155640 gcccaagcca aaggccacgc ggaggccagg cgtggtgact cacacctgta atcctagcac 155700 tttgggaggc caagatccac ggatctcatg agctcaggag ttcaagacca gcctggtcaa 155760 ccttgtctct acaaaaaata caaaaaaaaa aaaaagtagc caggcatggt ggtaggtgcc 155820 tgtagtccca gctacttggg aggctgaggt gggaggatcg cttgagccca tgaggtggag 155880 gctgcatgag ttgagatcac accactgcac tccagcctgg gtgacaatgt gaggccctgt 155940 ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagaccagg tggagagtat agtggattaa atgggcccct 156000 acaaaagata ggaccatggc ttaacccaca gaacctatga acacgacctt attggaaaaa 156060 gagtctttgc agatgtaatt aaattaagga tcttgtgatg agatcatcct ggattatctg 156120 ggtgggccct aagtccaatg acaagcgtcc ttgtaagaca caaaagagca caagacacag 156180 agagaaagcc ttgtgactgg tgttagataa aggccaagtg actggtgtta acaaagccac 156240 aagccgaggg acagaggagg ccaccagcag ctggaagaga caagggagta ttctcccccg 156300 tggcctttgg agagagtgtg gtcttgccga caactcaatt ttggactctg gcctccagaa 156360 ttgtgatcaa ataaatgtct gttgtttgaa gctaccaact ccgtgcacgg tgttacagta 156420 ctctaggaag cgcatatgga ggacatcact gggaatcaga gctcttagct ttgggagctg 156480 agatggtggt caagtcagca gaaagaaagc cccaaacccc ctgtacagcc tcatcagttc 156540 ccctgatggg ggatggagga catattaccc agcttgtagt gggtaacctt gaccttaaac 156600 taccctaaaa agaaaaggag catttattca aatgtaactg agcttgaaag gactgaatgg 156660 aactgatgta gcaagataat gtttccagcc cccaacagaa atggagggat tgtgcaccaa 156720 attcaattca tttgtagaaa aaccaagaaa tttattttag ctttgcataa ctaattttat 156780 gtctgtatat tttcagacat tgtatagcta tactacatgt cagggttgct cggggagaat 156840 taaatgaaaa aaaagctgca atttgttgag ctattattac atttgtaata ttttacaaac 156900 gagagcacca aaactcactg tgggctggca gttgccacgt ggctcatagc tggcacagcc 156960 tgtttgctac ctgagctctc tgactccaag cacagtgctc tcttctatgt ctgcttaatt 157020 cagtgataaa catcactgca gtgagtgcaa tattgtattt atgtatcaga ccaggcagtg 157080 cctcacacat ccatggagtc cagtcaactg tttgtcaaat ttaatagaat aacatagcct 157140 tgctgtcctt aagtagcctg ccctctgtcc agtttggggg atataattaa gaataaaatc 157200 tcctgccaac ccacgaaacc tctccttaaa ggtagaggag agagagccca gttttattat 157260 tgaaaaagct ctaacgcagg ctgcaatgca catcactggc aatctgctaa agagatcacg 157320 gaggcagaaa atacctccct cttttatatc accgctttcc atacgtgttc tcaagataga 157380 aataactagt cctcaagtaa gaaggcttga cagcaccact tgttaaatat agtttatcct 157440 aaattcacct ggtaagtggg gtggccatct gtgggagctg attgccttta tccaaaggaa 157500 aattaaaact tctcatattt ccgtgacaag taggtaggtt tacaacttgg agccagatgt 157560 ctaaactccc accctctacg gagaagggga gacggaggct cttgtcttcc ttgatgttta 157620 cattacttca aggagacagc cctcaaggaa aacattcttt taggttgtag aactggtgag 157680 aagcttattt ggctcttaaa agtatttata tacatctcaa acagaaaggg aaagaattta 157740 caattccaag tcttataaag gaaatgctct aagaaaaggg aggcgaacag gatcccttcc 157800 gacccccctt tttttagatt catgtttgta ctttcactag agagagagga aacatgatta 157860 aattaggaca cagaacaatg cctgctccag tgcccaggtg tgagagaagg ggtataagat 157920 atcccctcct gcagaaggaa accagcaggt gaacatctca gaattcgggg tgagaaatca 157980 agacagggga aggtagactc tgcctctgat attactttct gtcgtcgagg tattgggaaa 158040 tgggctgaac atggagcaaa ctttaaaatg tccagtttgg aatgatgtct ggttcagaat 158100 aagcctgatg cccagttacc agtggtgtac cagtcatggt gatgttaata aaaaccctct 158160 ggtctagatc attctgtatc ttcttcaagt tatggtaaga ctccaaaggg catggctgtt 158220 gaaaagaagg gtgctggcat ttgtcccaag ccaagcatat cccatcataa tttaatcatg 158280
- 166 -
008252
ttgatatact tagcactggc aatgggaata gatgatcaag aatattttta acatttttta ccaatacaca tattactccg cgtatttact tgttgctgtg tctcaattag aaagtgtcat ctagggctgg cagttcctca ctgcttccac tgcctagcct catattcagt gaggccatct acataaatct tccttattac tcagatcact tttcttaatt tgaacgtatg attcatcact gctatattat caccatttta tgatgaagac ggacaaaaaa agtaaaeata tatctaatat ttatttttga
aattatatgt
ctagacacta
tgatcaaatg
ataccccaga
acagctatcg
ttggctctat
tgggtggaac
accaaactct
gttaacagaa
cagaatttcc
ttaatttttt
ttaaagccta
acaaaaaaaa
tttaccatcc
tcttccccgt
attcctttat
taataggtga
tctgctgctg
ttccttcatg
aatgtgtatt
aggttccata
ctgctggaaa
acctaaggat
gtatatgcat
tttcatatct
gacattcttc
gtcattattt
tggaaattct
tactctgggt
gtacttttta
tctattaatt cattaaaatt tgaattatct attcattaag tgaatatggg aaaattatac aaaactgaga aaagcaagta ttatatgcat gttataatgt taataaatta
gaaaaagagc caactttctg aagaaaactg acttaaaaaa tattttgttt aaatcataac ccattaatat agttgagctt gttttcaaca cccacacatt ttgggaatct ttgagatgtt tccaagatgg ctctccagag atctaggaga acacaattat actacacaaa ctaccacatg attgactatt ctaataagca attatcacac gtaagttggt catgtatttg tttgcattta ttttgatact tgagtttgtt ttaaacaagt accatttgct aggctatcga aactttctat aatgggcaga
/-r+- f nf f f пла
atcatcatca
tagtctgggt
tatgtatgaa
agaaataggt
ctatagcttc
agaccctttg
caccctcccc
tagaatgtta
gaaactttcc
tatttttaac
tcatgatcag
agagggtatc
agattcctac
caggcaaatg
tgtggcagca
aaaatacttt
gaaagtgacc
ttagtccatg
tatgcacaga
aatttaaaat
taaccatata
aaacttgtat
gttcattttt
aattttttgt
gaagaagcaa
aagttttaat
ttttaatcac
actggttatc
tgaaaactcc
tattcatggt
aactcgttga tagccattaa accttcatgc aaaagaaaaa attcaaagtt tattttattt attttttaaa ttctaaagta ctaccatata ccataaaaat agaagcctac gagacaggct gtctacagct gtcactccag ggctgcttga gaccaagggt ttctgcaacc ggcatgaacc ggaatttgta catgcaaagt cctgtgtata aagtgggatt ttcataaagc tgataaatac atgaattata tatggcatgt tgttgctgtt aagtagtgtg tataggcaat aggtggtaaa tactctataa gtatagttaa
taaaaatact
gcccatagtg
aacagacggg
gaatgctgtg
tgttgcatgg
agaagaagag
aaaactgaga
taatgttgac
atttggaatt
aaagcaaaaa
gttaggcatt
aacaaggaaa
ttggagcata
ggcatcttcc
gtgatagatt
gtgtggcttc
agccatataa
ctttacaaat
tatgtactat
atccaatttt
attccagccc
gtagcaattt
ttcaacattt
catctttata
caataaaaag
aaactatatg
ttgctagata
caattgcact
aatcataacg
tggactgaaa
acctgaaatt cttctgcata ttaaccacct tatgagttag gaagagggac acctgttcta agaggaaaaa cctccttcaa tatatatata tcaccagtgt caggaaatag tagctgagtg gcagtcacct tggctgttgg gcatcctcac aaagacacag tgctgatgac aggagtctag atggctgcat tggatgttat ttaagctttt gttgagttca aagttaacat cttgaaatgc tactcaatat gggttttttc attttggaca tgggggattt attaaaaatt atggtgttaa atatcctagg ttggatttgg
CtCuuCfCjCCu
acaatcaacc
agtataagaa
atgtcatcat
ttcttaatgg
aggatatttg
ctcgcaagag
gaatagttga
agaaccacac
ataagcaggc
gtataaccta
tcattttatt
aaaaaaaaca
ccaagaaagg
cggctctgct
cttcaaatga
tagttgcaga
ttagacatga
ctggtattga
cctctgagac
ttttagctag
tcatttgtaa
tttcaggatt
taacttattt
tctagtggtc
tcaggacttt
gcccttcact
ttagtgaagc
agcctacaat
cagcaattcc
ctatgtatct
cattatagca ataacttctc aatattaaca aaatgaaaaa tacagcgtaa aaagaagcat ttgtattact gcattttctc tatatatact attaggtatc atgtttatta tttctagttc tgaagtttta caggaggcct aacatagcac tgtattttat acaggccaga aacaacgctg gtatcttatc ttctaatatt catcaatagt aaaaaacctt attatttcaa ctatgcaatg attttaggta attgttattt acttagaact tttttaaaaa tgagcttcaa gtttaacttt aatagtttta agactgttct
"-" W l_ _> V.vjwWv.
tgcctggtct acagaataaa ggtgaaagtt caggaggatt gcttgaatat agtgggacaa gatgttaact ctgttataat cctccatatt tttaaatttt actcttacct gaacaaacaa ttttgagttc agagatgatt gagttgggac aaaaaatatc tcaataaaaa gctgtcactt agtatgttac tgctaccgcc aataattttt gtgaattcaa atatatacac acaataggca aattggcatt ttgggtaaat tttgtgtttc ttggaccata atttttgtta attaaattct aatattatta
LLi.wLwwwyy
gaggttgcag agtgcctctt ccacatggac agagcaggtg cataagtcac gtggaaggga tgaagagtag ctataactgt aaacaaccct tttttagaat tcctttttaa cattttattt gcatgtttat acatataata tagatcctcc ctaaagaagc ccaggggcaa aaatgtaata taacaaggga ataaaagtaa
4- "- a a = +¦ r"-i гыч i- LaaaLvjoovj
aatagtcttt
aaggacaatt
tggacccagt
gaatgaaact
tcaatcattc
caaagagtac
gttcttgtat
acccaactgt
ccatggctct
caaagctctc
ttaatctatc
tgcttttaac
attgttatga
tacagctacc
cttttcactc
gccatcaatg
attcaagatt
tagaaccact
ccatggttat
ctatagataa
tgcttttaaa
gcaacaaaat
actttgcagt
agcctactta
gacccaaagt
ctgggctata
ataaaatggc
gtatatcaga
atttgggcat
cactattctt
tcatacttga
- 167 -
008252
aactaagtta aagtgttcct ggttaacttt ctctcatttt tgtatgatta tgttttgttt 162120 tcagtagttt ttaacaacgg tgtcattttt tatgcccctg atttttctta ttttcagtga 162180 tcttggcctt taaggtaggg ctcatttgca tatttttaaa aacacacaca ttctcatgca 162240 ttcactttca tatacacatg tggtcatgtg gatacctgaa actttagact gtcttttaca 162300 gattctttta aaaaacaatg aaattggtac cctaaatatt tgtttcaatt gtccatgtac 162360 aaatccagtc cttaagattt aaacttatgt actctatttt tactactccc agatagagag 162420 tagagtggag gaaatgttca aaaaaagtat ttgattttct taatgtttca agtttcagaa 162480 agcgctatgc attccaaatt ccatctttgc tccgttcaaa ctttttgctt cttttaccac 162540 atctgcttgt atgtagattc tcatagctat ggtgacattg gttgaattct tgctcagtat 162600 caagtgtttt atgttttcac ttatttttca caacgaccca ttcaatgcag gtgttattat 162660 tatgtccatc ttacagatga ggaaactaag acatagagag gttaagtaac ttgctcaagg 162720 ttacacagcc aacaaatgtc ggagctagaa tttgaaccta ggcaatttgg accgaaagcc 162780 cacactctta acctctaaac tgtattgatt caaactaaag ctatataaag gccaaacatg 162840 agtcatgcat actggggagg gcactcatag gactatgaat tatttgttta taaataatga 162900 tgttgtagat aacaaaggca tcctcatatt caagtaactg ttagaatgaa ggacagtttc 162960 tgagaatagc ggtgaatgca gcaacccaat cgttaaaact attcacatta gttctttgtt 163020 tcctctcaaa actcagagga tctaatcaga gccactggag ttacagtctt gctgcgcgat 163080 ggcaaacgcc actcaaggtg ccactttgca natgatcttc ttggagtgat gatcctcctc 163140 agacgcctac ataacaggct tgcagcatag cagcatttta gtgactttaa tgtcttttat 163200 tatcgatatg tttttaactg tgttaatatg taaaagttgg ttcatagatt tttttcaaga 163260 gtaataaaaa ccagggcctg ttcgctctaa aatgggggtg ttggccaggc gcggtggctc 163320 acacctgtaa tcccagcact tggggaggct gaggtgggcg gatcacgagg tcaggagatc 163380 gagaccatcc tggctaacac ggtgaaatcc cgtctctact aaaaatacga aaaacaaaaa 163440 aattagctgc gcgtggtggc gggcacctgt agtcccagct acttgggagg ctgaggcagg 163500 agaatggcgt aaacccggga ggcggagctt gcagtgagcc aagatggcgc cactgtactc 163560 cagcctgggt gacagagcga gactccgtct caaataataa taacaataaa tgggggtgtt 163620 aacatgcaac actcagtagg gctcaacaga ggaagaggaa gcagccctca tacaggggag 163680 aggagaggcc gcccttaagc taagggtgtg agatggtggt agaaagtgaa aaggtactag 163740 tgaagaaatt ataatggaaa agaaggaaga agtgaagtag gaaaacacca gatatgaaat 163800 aaagagtatg actataactc agggataaag gtgcaggaat gtggccaaat ccagagttag 163860 gaatgtgagc aagtcagtgg ccaaaagtca aagcccacca gggcgttccc ctcagaagct 163920
-.-.-,4-__-,____4-____4--__4-__4--_ .1...41.-Ы.. -.4-4- "4- -,-.4- 1 CWOn
Ч"1_-1~ L.y CIVjyy V- CIVJVJwCl tyyyU UVJVyOV.Vjai.VjVj Ct V- L,y L.V~VJVJ L.VJ UVJUV.UVJLVJLU V~ V, V~.V~ L.Vjy СД CLVJ J.VIJ3UU
agaagcatgg cgctgtatgt cttttcccat tatttttcta tgcaacctcc gtgtgcatca 164040 gaggtggttt ctagccaagg actgctgagc tctaggcgtc ctcatgagaa gctatggtgt 164100 catttttaat acttcaggaa gctggaagag aattgtgcat tcacttaata taagcccgca 164160 cctgctaaat aaaatgtcaa gtttaatact tttagctgga aacctgaaaa ttctaagtgg 164220 cagcactgtt tccttaatac tatagttctg aagtgttttc atatatagtt tcctttaagc 164280 aaatttgttt aaagctacaa tgaatttctt attgcttaat cgaggcattt tggcaggaaa 164 340 gaagtttggg ttttagaatc cagaggagaa agtaaaagga ctttttgcac agaaattttg 164400 agaggctctg gtgtgtttat tcccatcacc gcctctccaa gacatcacca gtgtgtgccg 164 4 60 tgatggtcac ctctatggcn ttttcctttg tcacttccca caatcatgtt ccaaaaactc 164520 acctcaatca tataaccata tgaaattcct ctattgcctt ccctgtgtgt tatatatatg 164580 acacagctga ttgctaatag caatagggca gcgtaatctt ttcatagctg ccatcattta 164640 catgaccccc atattgaagt acgtagaaac catatttctc ttttcagcat ccccaaaagc 164700 caatacagag acctcggaaa aaaatatata tgtgtgtgtg tgtatatcta ttattacata 164 760 tatgtaatat atgtaacata tatgtatatg tcatacatta aatacaaaaa tatattataa 164820 ttttgtatta catatatgta atatctatac atatatgtat atattaaata taaagattat 164880 atttataaat atatgtaata catgacataa attatacata atgtgtgtaa tatatgtaac 164 940 agtatataaa aattatattt tttatattta gtatttatac acacatatat ataaaacatt 165000 gtttctgcat gacatttaaa aattggctaa aaatgagatt gtggtgagct gaggagattc 165060 ctgataaatc agttggtata gaggctacaa caaaaccctt gacctaaaac ttctctgaac 165120 agaagagttg atgactgtga agctcaagtg atgcaggaat gacactgggg aatgtacaca 165180 gagttttgca aggtttgaat atgaagagaa ttcttgcagc tttaatgatt tttgcaaatt 165240 tggtgaaaga cagatataaa gggttttctt ttaagtggta taaaattcat taagctttga 165300 gggaagaaaa aacccacaga aaagcctgag gggaggaatc atcgaaaagg gaagtatagg 165360 tagtctgttt agattaaatt cagagctgtg aaattgaaaa ctgtttaccc agccctgtat 1654 20 ccagtctcac ttgaatcctg gttccaattt aatgatgttt ggtctttgct agagtccact 165480 gcatagtgtt ggatagatat tatatattaa gaagctttcc tttcttattg actgtgactt 165540 ttttaaacaa aaaccataaa tatcttatat tctcttttgt taaagtatga gctctaggtg 165600 aatgtttttc tttagcctta agctgcatga tagttgattt tatgtgtcaa cttgactggg 165660 ctaagggatg cccagatagc tggtaaaaca ttgtttctgg gtgcatctgt cgggtggttc 165720 tggaaagatt tgcatttgaa ttggtagcct gagtaaagca gacctccttc cccaatgtcg 165780 ttaaaccact tccaaagctt tgaggtccca gatagaacaa aaaggtggag gaaagctgaa 165840
- 168 -
008252
tttgctgtct gtctcattgc ctgcaccatg taaacaacct tctcctgccc tgaggaatcc 165900 tggttcttag gccttcaaaa tgttgccctg gcttccaaag gtctccagct tgaagagagc 165960 agatagtggg acttatcatc agcctccata attacatgag ccaatacctt aaaataaata 166020 ctgatgtata ttttattggt cctgtttctc tggagaatct tgcctaacac acctgaagct 166080 ctcattkgca tgtccatttt gtcgcctata ttgagttcat tccagattga gggcggtagc 166140 aaggtggcag ggatactgct ggaagatgcc attcggctga gcactggttg catctcctga 166200 tgttagttga atcttcaatc ttctcagcat tttgtcagtc tctcatgaat gaactcaaac 166260 taatgtaatt ttaaaagact gatataactg ctgcaggagc aaatgctatc tattgagaac 166320 taccttgtgt aggctrcttt atattaaatt atcacattta atcctaaata ttaaagacgt 166380 ggcaactaac attcagggga gtgaatttct cacccaagtc cacacaattc atatgtgcct 166440 gggtcagagc cacaaaggct gtctgaccct aaaccaatgt ecttgctgaa aaaggccatg 166500 ctgcctgcag agaaccagct ccttcattta taatgaaaag catatctagg tgtggattgg 166560 atgagatgct tatccatttt ttagatcagc atattttctc cctgtgggta ttcaaagaag 166620 aagccaaatt ataatcagac tatagcttag tgagccagga atcaggatgg agagggaggc 166680 gagaaaggtt gtgtgattta aatacataga tgatggtttg atagatgcag caaaccacca 166740 tggcacatgt aagcctgtgt aacaaacctg cacattctgc acatgtatcc cagtatttaa 166800 agtaaaatct aaaaataaat aaaaatattt ttaaaaatac ataatggcat aggctaagat 166860 aggctgagat caactgagtt atctctttta cagttgagat attagtgacc tagaaactaa 166920 atctactcat tctgtgaaac tggggtctgg acactcatct actatgctat agatattgtg 166980 ttggggctag ggacatgtga tggtcaggac actgtttcta ccctcaaaaa taactcctga 167040 gccagtggga gaaaaagaca agtaaacagg cagtttgggt tcagtggtga tgattataag 167100 gataatgttt cggaagcaca cagaaaacat ctaaagcaga ctgtgaaatc agggacgttt 167160 tctcacaagc aggtgcagac tgaaatctgg aggttgagta gtgctaatcc aggtgaagag 167220 ggttggagga agatggcatg aaggagggta gtgaagacca agggaactgc agagtctttt 167280 ttaggtggga aaaaaacaga gtggctttct cgacactaag agtttgctgt ggctaatgtg 167340 tagagcaaga gagaaaattg ttaactggaa aaataaggag ataccagcac aggaaatgct 167400 tgagcagcac taagcatttt gatattattc tgatggtatt gatgccacag ggtgtcataa 167460 tcatacctac attttggtgt cagtgtgaaa tgcactggag ggcacccaga ctggagatgg 167520 aagaatccgt tcttgaggca agtggtgatg gcagcctgaa ccaaaggaaa taggaatgag 167580 agaatatcga aagcggtgga gtacagagaa gaggatttag tgacaaattg gatgtaggaa 167 640 gtgagaaaaa ccaggacaca gggatgtcac ccagatttct agatttcttt aagtgcgctg 167700 atgcagaaga aatacaagag aaagaagaaa tgagagtttt gtttatttgg gttttttttc 167760 gggggaagaa gtttggtcat attttccctg agatgcctgg gaaatatcta tgagacaatg 167820 tctatggaga gatacaaagt ttaaagctta ggtggaatat ctaggctgaa atagatactg 167880 aaaaagagca aaatcaacat gcagatggta atttaagcct ttagagagca ggaacttacc 167940 aagggaagga tggttcccta aggggtaata aataaatggt atgaaccagt gaggaggagc 168000 caaaatgtgt atgagaagtc acagcacaag aggtaagagg aaagcctaga atgtgtttgt 168060 caccaagatc aaaaggtgaa agagtttcaa gagagatcct tgttcaacga tctcaaagac 168120 ttcagagagg tcaaaaaaat agtcaccatg gaaagcaatc ccatttacag tagcaccaaa 168180 aagaataaaa tacttggaat aaacttagcc aaggaggcaa agacacatac cctgaaaact 168240 ataaaatact gaggaaagaa cttaagccac aaataaagat gaattctgac ttacgatgat 168300 tcgacttaac agtttttgtt tttgtttttt tttgacagag tctcaacctt ttccttaggc 168360 tggagtgcag tagcatgatc tttggctcac tgcaacctct gcctcccagg ttcaagtgat 168420 tctcctgcct cagtctacca agtagctggg attacaggca tgcaccacca aatccaacta 168480 atttttgtat tttcagtaga gacagggttt caccatgttg gccagggctg gtctcgaact 168540 cctgacctca agtgactcac ctgcctcagc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgaa 168600 ccacctaacc tggcaactta caattttctg attttatgat ggtgcaaaac agatacacgc 168660 tcagtatgct cctcaactta tgatggaatt atatccagaa acactcatag taacttgaaa 168720 atatcataag ttaaaaaatg cacttttaca gtattttcaa cttataatga atttataaac 168780 cctattgtaa gttgaggaac atctgcaagt gaaaagacat tctgtgttga agaactggaa 168840 ggcttaatat tgttaaaatg ttcataccat ccaaagcaat ctacagattc aatgcaatct 168900 ttcgtaaaat tccaatgacg ctttttgcag atatagaaaa gaaatcttaa aattcatacg 168960 aaatcttaag ggataccaaa tagccaaaac aattctgaaa aagaacaaac ttgaagatgt 169020 catacttcct gatttcaaaa catattacaa agataaaata atcaaaacag tgtgatactg 169080 gcataaaggc acacatatag accagtggaa cagaatagag aggccacaag taaaccctca 169140 catatatagt cacatgatct tcaacagtgg tgtcaagacc acactatggg gaaaggacag 169200 tctcttcaac aaatgatgtt gaaaaattgg ataccacaca caaaagaatg aagtttggcc 169260 cttaccttat atcatatata aaaattagct caaaatggat taaggacctt aacaaaagac 169320 ctaaaaccat aaagctccta gaagaaaaca aggcaaaagc ttcatgacat tggaattgtc 169380 aatgatttat tggatatggc acagacagca aaagcaaaaa taggagactg cattaaactt 169440 aaaaacactt gcacgtcaaa ggaaacaatc aatagagtga aaagccaacc tatgggattg 169500 tagaaaatat ttgcaaatcg tgtgtctgat gaggagttaa tattgagaat atgaaagagc 169560 tcctatagtc aacaagaaaa atacaaataa tctgttttaa aaataggcaa aatacttaag 169620
- 169 -
008252
ctgacattta actaatcatt aatggccact tactttgttg tcaaaaaatt aaagaaatga ttcacaataa aaatgtggta cacatgctac aaaagacaaa gaaacagaag tcaatgggta caatgtgagt gcgtggtggc gagcccagga acaaaaaatt gccaaggtga ccattacatt aaaatgatca tttaaaactg agggccttcg agtgaaggtg acctggttgc tacccaacct tcaataggta agggaacagc gctgagagtt gaagccattc ccataacttt ttctgaaata tttataataa tctaaaaaag agagaaatgc atcaaaaaaa atgagaatgt aaaagtagca aaatagaatc cagaaggtgg tctacacgca acatggatga ttctgtatgg acagaatgag cagagtttcc atgtttaaca tcacgcctgt atttgagatc agcctagccg aaggattgct tcggcctggg agatggcaaa atcatattaa atgatacaga gatcaccaac tggctgattc tttgccattg ggaagcaaaa tgcccaggag gaaaaactct tttcaatctt ccatgatgta gctacttact attctctgtc gtatacaaat aaatagaaac aaancagttt aaaatggtgc tgatcatatg tcaaagacat aagcaaccct aggaaatatc accttgagga tttctcttat agttgccagg actttgaaag ctgctgaact aatcccaaaa agcctgcgca gacatggtgg tgagcccaag caagagtgag atttatgttg caataaggag gctgggttgc cttttcctca ttaattttgt tggtatgcat gcagctggaa cgagaggacc gcatttcact ttggtcagag aatctcaaaa tttataataa acactaagac ggccaagtag cacaatgaga ggcaagaatg tgctgctgcg ataaaatata atttgcacac agtgtccacc attcagcctt catcatgcta gtgagtttat ggctagggag atgaaaaagt gtacacttaa ctttaggagg acgtggcaac cgcatgcctg agatcaaggc accctgtctc tatgtttttt gtggttagtg agaggatagg aacgcctcat tagatatgtt agagaatgat atatcagata gtaccctgaa caaatctgtt atgactcttt gatcagctta attcttactt ataaacagca atgaaaagat taccacttta tgaaaaaatt gaaaacagta cttctggata tcatgtteat agtggatgaa aaacatgaat agtgaaataa ctaaagtagt gggagtaaac tctggagatc aatggttaag ccgaggtaag accctgtctc tagtcacagc ttcagtgagc aaataacaac accacaatta aaggcaataa gaatcaatga actctgtttc aacaccattt atttgtacaa tcaaggattc gaacctataa gatgetaect tgaggtcagt tagagcattt ttataataaa ataaaattgg gttcaacatc tacctattag gcaacatttg tggcagttcc tgtatatcca tgcagtattt tagataaaca aaaactctga gccagtcaca caaattcaga ccattgttgt tgttgtacaa atggggctag cacattgttt tactaaaaat tacgtaggtg tgtgatcatg aacaacgaca atttctttta gagcaagctc egggtaagga cagatagacc gctacagtgc caegctgaag ctgatgctcc atcattagtg aactccactt ttattattgc gatctgetat tgttagactt tttgaagaaa
ctcagaattt attcaaaaag agaccaacct tgtggtggtc agectgggag acagagaaag ggatttttac tacctgttag tggaagcect atgcaatcag aaagagaaga gaccagagtg aaagtcccat ttgatctcag cagttttttg tctctggact tggggcagca gagcagcttt aaccccatca gcccttccaa gaccttttct accatggaac gttgtcggtt acagcactct gactcacacc ggagtttgag attagecagg gaatcacttg catctcaaca ttggagggaa cacccactgc gggaatatca tagaaatatg gggcaatata catacctgtg gtcaaggctg accctgtccc agtcaaataa aattgatgtt acgcctcagt gttaagatga gacacagaca atgtggtcca ggagtagacc acttccagcc gaactttgtg caagaagaaa gggaacaatg ctcagcagtt tagtaaaatt aatttcatgt ttgcctcatc aaacatgaaa gtatcattct gcaaggtaac tgtaatccca actagectgg cgtagtggcg aacccaggag agagtgaaac gatgtgccca ttaactgtaa attatcaaca
ggaggccaag
gtgagaccct
gtcccagctg
cagtgagctg
cccaaccccc
gtataggtgg
ctcctgatat
ccctgtgaat
ggtcattagg
cagacacaca
caaggaacac
cccctcagaa
cccagaaata
gcagcggccc
cgatcccttc
gacgtaccct
ggagttattt
ttatagactt
catgtgtgat
catgggtact
ctacacacct
ttaattgtgc
ccttcaatta
gcactttggg
ccaatatggt
ggcgcctgta
gcagaggttg
tccatctcaa
aacaggagag
ggatgetatt taaaaacaac
gtgggaggat
catctctaca
cttgtgaggc
tgattgtgcc
caagaaagat
gagattcaaa
gagtggaatt
gtaacttgat
gtggactcaa
gagagagcac
ecaggattge
cctccagaag
tgagacaata
tagacaacta
taaagctggc
tggaatccta
tcttctgcct
gagactttct
taactcaaac
cgggactgtt
aagattgtcc
taattcagaa
aaatatatat
aagecgagge
gaaaccctat
gtcctagcta
cagtgagctg
aaaaataaat
aagctcacac
ttattttgtt agectaggaa
cgcttgagcc
aaaaataaaa
tgaggtagga
actgeattet
aaagatagaa
aagtcagttc
ctgtccctca
tggaaatagg
tatgactgtt
tgtgtgttga
tggcatcaca
gagcttgect
catttctgtt
acacacctcc
aagtagcctg
cgccagcctg
ttctttgatt
tagaggaaag
cagaaggaca
ttgttagcat
actcgagtct
ttattttcat
atatataggc
aggtggatca
ctctactaaa
cttgggagac
agatcgegtc
aaaataaaat
ttcaactcca
tcctttaatn tctagaagtc
cagtagttgg
attategcag
gaatcacttg
agectgggea
acagccaact
aaaacagaag
aataggtacg
gtctttgtag
gtcctcataa
tgaagecaca
agcagctgga
tgetgacate
ttcagccacc
agagecttgt
gctgagagca
cgccaccctg
ataggaatca
gtttctgtaa
ttgttttaga
gatctctctt
acaatggtgg
tctagtttcc
caggcatggt
cctgtggtca
aatacaaaaa
tgagacagga
tgegaatetc
atagtgggat
actgaacacn
ncaagagnnn
- 170 -
008252
nacaaanatt gttnaagana gcatgnagct tactgcactg taccattgaa aacagcaagg 1734 60 atgataagga agagcaacct cgcagcactt tttctttcag atcctgtcac aggcagtggg 173520 aaactagatt gcaatggttc taagagaaaa gcatgacagt tttcagtttt atgcggtgcc 173580 tggcagttgt tgaattacaa aaaggcactc ttatagttgt gttaagattt gttgtgagga 173640 gttagaatag tgaggtttac cctgtgtgga cctacacatt aaataggaac atgctggagc 173700 tggagtcatt gccctgattc cttttggact caactttcac acagtccgtt tggatctttt 173760 ttcaagtaat tcatgtactt ttccgttctt ctggaagcat cctcacaatc tgctttatca 173820 tccattcttc aaatatttga gtacctacca tgtgtacaac gctaggccag gtacaataat 173880 aagtaagttc tttgctccca tggagccttc tggtctaata ggggagttgg atgtaaatca 173940 agtaattaaa ataattccta actgtgtaaa gattgagatg agctttcttc agaaaataac 174000 atcatttaag gagagacact cgtagaagac cccgacacaa atggtggtca ggggtgagga 174060 tgaagaaagt tacaggagag ctaagttttg caagatgagc cttgtggact tcacggaggt 174120 gtggtgggtc aggggagggg agcacaactc cagggagaag ggaaagcctc tgtgcaccca 174180 gaatgcagga agaccagggt ggagtggtat agagtaagtg tggaaaagtc agcagggcat 174240 gaaccatgca gtgccttgag aaacacggta aggtcattta ccatttgttt tttgtttgtt 174300 tgtttgtttt gagacagtct cactctgtca cccaggctgg agtgcagtgg tacagtcttg 174360 gctcactgca acctctacct ccaaggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagta 174420 gctgggatta caggcgtgcg ccaccactcc tggctaattt ttatattttt agaagagacg 174480 gggtttcacc atgttggcca ggctggtctt gaactcctga cctcaggtga tccgcctgcc 174540 ttggcctccc aaagtgctgg gattacaggc atgagccacc ataccagcca gaacatttac 1746O0 ctttaatgtt tacctttaac ctgagccact gaaagcttat aagatgggag gcagtggtga 174660 accagagagc tgtttggaaa ataaaatcaa gagggacttg gtgataggtt ggatttaaag 174720 acatgagtga gagagtctca aagatgattc ctggtttcag gtttctacag ttgcatgaat 174780 gaaatgtcat taactgagtn aagaaacact agcatacaac cgtatttggg ggaaacgttc 174840 atcaactcag ccttgggcat gttgagttgg tgaatctttc aagatgtctg aacngagatg 174900 cctaatagtt gtgtataggt ctggagttca ggggagaagg atggctgcct agagatataa 174960 atgtggacat tcaatgtaat tctcaattat ttattcaggt gctgttctag acatgtggcg 175020 taggtcaatg aacagaacag ncaaaaatga ctgcctcctt tgagcttcag tcctagtaaa 175080 gttctccatg ttttcataat actggaaggt gtaaatctgg atgagattgt atagggtggg 175140 aagaaaaaat atgctggagc cttgaggaag agcaacattt aataactgct ggtgtttgcc 175200 tttatggtaa ctcaacctgt ctctgttttc ctccttgtgt attttcactt tcagttccat 175260 tgcaaatagt caacattttc tgtatctcag gttcaaaact tgatcaataa gaacagattt 175320 ggtcgatcca gctaatcaat atgattcctt ttaggcagga atttcatctc tgattgcctc 175380 gcaatgctgg ccagtcttat agaaagtccc tgtctttggc ccggtttctg gctcaaccag 175440 ctttgacaag ggtgatgagt tactttgtac cataaggcaa tttatnagga agaaacacct 175500 tcataaaaaa aaacaaaaac aaaacaaaac aaaaaacaga acaggcagac atttggagaa 175560 ctcacctgca tattacagag agatttaata tgtttatcta ttgcatgcca ctgtaattta 175620 acagtctagg caaaggtaac agaaaagagg agctgagata atccagctcc tccccaacca 175680 ctcattcagg aggaagcaga tgtgagtgcc attgtagggt cctgagggag tattggttcc 175740 catttcctag cctgcccctc ctccccacgc ttggtcagtt acaccttcat atggctcctg 175800 ttctcacttt acctctctgc tttatgataa gcgcagataa aaggcaagag acacagacaa 175860 agcgaaaaag aaggaagagg gaaggaaatt tagaagggac cttgcaaaca ttttccttcc 175920 actgagtggt ccacaggagg aaacaatgaa aacttctctc tcctttggga ggccaaggcg 175980 ggcagatcac aaggtcagga gatcgagacc atcctggcta acatggtgaa accctgtctc 176040 tactaaaaat acaaaaaatt agtcaggcat ggtggtgtgt acctgtagtc ccagctactc 176100 aggaggctga ggcagtagaa tcgcttgaac ccaggaggca gaggttgcag tgagccgaga 176160 tcgcaccgct gcacttcagc ctgggcgaca gaatgagact ccgtctcaaa ataaaataaa 176220 ataaaaataa caaaaaataa caaaaaacaa aaaaanacct tctctctcac taacaaagag 176280 atgtgatttt ggagaaatgt cttccctctc tttcagtttt accaaatcta acttgggtat 176340 ctttagatcc ggtgtgccct cttttctttg atgacacgag tcctaactcc tatatattgt 176400 cttatatgat tgttttatgt catccaagct ggcacttata tcatctccct ggtctcatag 1764 60 gcatttaaat ctgggcccct gcactagacc ctgacaagat ctcttctaga tctaaaattc 176520 tcatccggga aagagtcgag agctgtcatt actgggacac ctgtagctgt atacttcatt 176580 atgacagatc tgttgtttat gtccagtgtc tcttctgatt ttggggtgtt catgctgcat 176640 ggttttctaa tatacgtagt tctaatatgt tctctgttca ttactgcgaa tttctgctcc 176700 gacccctggc cacctacaca aaccgcaatc cccagcatag gcaacatgtt agtaaccacc 176760 cggagggggc gactgcaagc catgatgaag agctgggtct accatgtacc tgacctgtgc 17 6820 tgcaagctct ggcactagag ctggggtcac agggccctag ataagtaatc tcctctgaga 176880 atagtcagat tttgtcaata catacaattt tctcttagca gaaatcttgg ttgtattaat 176940 aaatgctgtc attgacagca ttgctttgta tttgtacatg gatcaaatga aagaataaaa 177000 gtcaggaaag tgatgatatt cattccttgc catttactta atatgccatc aaactttccc 177060 actttcctat tattttttca ctctgggagt ttaggaaagg gaattatatg actacctgga 177120 ttctcatatg ccttcaacat atttttaact ggatcatttc atcttactct ggatttgtgc 177180
- 171 -
008252
ctaaaatctc agtgctaagt gctctatctt actggtggtc ctcttattcc tgattatctt gagagtgctg tgggaggaaa gttgtggtag attattcctc ctttgccaaa gcgcaagaga ggagtaccag tcaaacagaa agagactggc ctctactcag ttcagccact agattacagc atcttccttc tgaagaatgg tgcagatggg gacagttctg aaagtcagag gccagccaga actgtcaaga agaatatttt ctaagattaa ccttctctgc cacctcagac agtgcagagg gaggaaggtt ggggaggcag agggctgcac caggagagga ttaaaggaag gacctaagga ttggctgcgg aagaccagag taaaactctc atgttaaccc tatcaacaaa ggacataagt gaagggaggt cagtggtttc ctaagataat ccaactttgg aggagctaca cccaaaagaa ttggttgctc accctgtaat ctcagcactt caagagtttg agaccagcct ggccaacgtg aattagctgg gtgtggtggc gcctgcctat agaattgctt gaacccagga ggcagaggtc cagctctggg caacagagca agactccatc ccctccctag ctcaaaacca tatgtcatac gtttgaatca gatatgagac tagactgcac caaaaagtta gggaattaac tagggataac actttcctat aattgaggat gactgatttc agcattactc agtgagaggt agggcatccc cattctgtca ccgtgaaatt tccagtcctc gccagccatt tcttcaaaga gtgctgattt aaancctagc actaggtttc tcattgtttc caagaagagc agggaaatac atgtatgtgt agctagtttt gtatatattt acctatctat
+* /"?/"•/••+- ¦¦-(-# fi 4~ __ -i /"•¦• "-"^ "-.¦¦- #-> ^" гчгч'
\, v-J V. V. t-j U " C-\-.U> U^i-CIV-> -.(->
gacatgagtg cagtatatac atgttatttt ttaataaaat atgtggatta atgtgaattt acataggaga catttaaaaa ctattcattt gaaatgcatg attgtggcca gaaaagaaat caagacccca atgttaagac tgcattccaa gtgtcatatt tatttgatag taaataccat gcaacaaata agggaatttt ctatagaaaa gaagttataa atgagcagag gggagatgcc tatcagtaag aactcagctt attttaagag tatatatata cctgcataca tatggttgga atatacaaaa ctaggtaaat gtgagagagt atttccccgc tctttctgct gagggagcct aacctagtgc tgggattttg gtccctaaat tgaagaaatg gctggcttta gagctgaatt ttgtggtgcc agaaaataaa gaagacctaa acaaacaaaa tagatagaag tatgtctgaa gtggccaaag caggaagact ttgagcaatg ccaaagaata caataaatag tcacaaatac aaataaagga ggagggacaa ctgattctct aatagaaata atagaataat aaatgaagta
+* rrt- a at* *¦ n r*r* алапалаагга rrr"+- ла rra at +¦
ctaaattgag cccagctcac aatcatcagt ggacttccag tcttctatct aagctgagtt ggtagagtga gtacagctag tgctgggctg ggagctcagc
attccacctt actcccccag agcagtgttt agaatcactt ggaagcttgg ggttgtgaaa acctgccctt cagtagcttg ggggaacccc ggtgcccatg
oyywtayciyyv-
agacaagatt cttatacaaa gctgaatggg accttctgct gaagatgtgg tgggaggctg gtgaaaccct aatcccagct gtagtgagct tcaggaaaaa tgtcatgtaa tgaagtaaat aaccagtctt actgttggcc caggcacagt atcttgtgtt gttttattgg cagtatatca actaactcaa gcatgtgtct
ctttaatgtt tcatagtgta gaccacagac tacttaaggg agtacgtatt .tactgataca tgagagccag acaggagaac agaggatagg gggttatgta gtgtgtacat agaagtaagg aacattctcc aaagagaaca aaaggaaaaa gactagagaa aaatgaataa atatttatac cagaataatt aacagaaaat
ar"r"aaaa+*4-a
waayL,4.aaya
ctctttctct aaagaaatca tgtagatcca cctaactctc agcaatgaaa aggtgggtgg gtctctacta actcaggaag gagatcacgc aaaaaaaaaa tggggtgagg ttttaataac ttatcctcat ttcccttaca gagaggtgag ttctgtaatt agaatggtat gtgtttctag gtacacacat tacataacca
*- 4- +- 4- -"4- 4-
atccctattt tctaataagc atacacaaaa aataggacac ttccatgcct acgttacatg agttcatacc ctgtggggct taggtagtta agatacatac gagttagtat atatactaga aataaaacaa caagatgagg acaaacaagc gccgactgaa ggaaagtact agatacatga ccaagtaaga tgccattagg ccaaagatgn atgaaataag acggagagag gtaggagtga aaacccgtag ggaagctggc gcgtgacata tcaagaaagg acccctttct acagatgtta catgctcatt taggacgtct cacaaattat aaccaaacta cactctgacc gaaaagacag atcacaaggt aaaatacaaa ctgaggcagg cattgcactc agaccatgtc aagaagggag caaagttgac ttataatcca ttccacttgg acattcctgg cagctctaaa ttagggacca gctctctcag acatgtattt tagaaccatc
V 4- -.+¦ 4- -" -.4-vV> yW> k."wwyy
ccacttgttt
ccttttatca
atgataattg
tgctggggtc
ctaatttaaa
cacactaagt
atcagagaaa
agattaggag
catgcatata
gtaggtaaat
acatacatgt
aacaatgaga
gtcggcactc
ataggacatt
aaacaaacaa
agtgccccca
gggttataac
ttgaataaat
aatgtagaga
aaactattgt
rrtr at +" rr +" rra a a r*? +- а а гтпа^т
aaataaaaca cagctttaac aattcttcta agaaacactg aggacagtta atggtatttg caaaattggg ttaacaacaa gaaatgcaat acctgggaat tttgcatggc atccacccac agtgtcagtt aatgtaactt acctcaatgt tcccaaaaat ggacactctg gaagaattag gtggtttcca tcccaataac ctcaaagtgt aaattctttg ggagtcagtg tataatgcag catatacaca gtataagctc caaattacct aggaattgtc ggatgagctc ttctttagtt cctctccaag atactcctcc acttgcttca aaacctggca ctgatatgac agtctaatca gactgatact acagccaaga ctggatcaga aaaagtattt tcttttttta ttcctaagag agccaatgga gacatcacct gagaagggcg tgagaaaaga cctcgaaacc gaaacttcag cgaaagtcat gaccaaggtt attattgtag ataaagcttt gtaggaaaag tacccaagta tatcatctcc tcagacaacc atcaaagtca atgtgacaat tcgtgcaaaa aattttgtag
- 172 -
008252
ttttgataaa actatctttg ggatgagaat ccttgttcna tttatacttt gccaaatgct cctctttcat ataatataga atattacaaa ctcatctcat
tgttctatgg caactctcat tttctatggt aagnatatgt attattcttt ttttgtgatt ctttgccagt tgattccata tgatcctctt caccattgga
tatataacat gtgagtttta aagctgtaat acatctgtgt tttgatcttn ttgtttncta aatataactc ttgtaaaggc ctgcctgttg ttatcattgt
gctgggtcaa aattacttca aatgcaacat agctttctgc aaaaagctgg atagaaaatc atctgaaatc tctaagaaaa atgggactcc attgtgtgca a-ca ugc uag aggtgcaaca tggtttagag aaacgagaga gtaccaattg agctctggaa ttcaggcagc ggagctaatt aaagtgttca tgagaaatat tgcaggcatg caggttagag agaatttctt aaggtatttc aagccagtta attggattca ggggggacac taagcatctc tttaactgcc caacatagca ccagagggaa
ggtatacagg aaatagtgtt agaaattagc catgaatacg gaacacacac tgatgtaact ggcagacttg caataataga gttagtgttg caatttgagg
aactctctgt tttgtaaaca tcctgtgttg ttgtatcaag tttatcaaga tgtcattact cttgtgctgg atgaagagaa ccttcttgtt ccacagggcc gcacacguaa tgactaaatg gaagatgtgt tataagagga ttgttttggt tgttgtcaaa tccatggacc catcagggag cagcacgcgt gatggttttg tcttcatgtg aaagcactgg ttgatagtct gttctaaaag aggagtctca aaatacgctg agaggctgga caaccttaaa ttcattttta aattggggaa cacacatatg
Я Г""!" rrt- П rtn Я t----1 - - - ---.
caggcatatt ttttttattt tttaaatcca tttataaatt gtaagtgtgt acgaagaatc ttcctctgaa atgactcagt tataatataa attcatcacc aatatgagca ttttctttta atgttgttgc gtgataacag aatgcaacag cacttaattg agggacatgc gctaatgtta ataggctaac aataattgaa
ttagaaagtt caaggtgcac ctaaaaatga ataacaggca gtggcagtat ttccagttct tgtttcctca ctaattttta gtttactgct gaaggattta acatccctgt aagacccgct ttgcattact attggtttaa acgagatgaa actttgccaa agaggggtgg tagcaaagga caaccaagag agagggagag
* п*г*япг*г*пя --,-------
ggtgatagct
gctatctcac
gagaacactg
tgtcttctta
aaaaaaaaga
gtgtgtgtat
atctcacaat
gtggagcaaa
aaattctctg
aatagagatg
actgtctcta
aaatgtgctc
ctaattcatt
acaaagtaac
catgaaagta
tctgttataa
cccagtgcat
tgcttggacg
tgaacatttt
caagaaatga
aaccccactt
attagtgact
tctatgcact
acctgaagaa
tattaaggtt
ccagatgccc
gcaagagaaa
ttgctatgtc
agagacttca
aagataatgt
actcacaaat
atagtgcaaa agaggaagat tgcataaaat caagattcac acaacagttt gccacttcta tcgatgacat gggttaaata tcacctacca taagagttaa gtgagggggg tatgccatgc ttaaggacca agggaaaaaa atttggatga gagcagcccc gaagcgatat ggcatgatca tcttgagaaa gttgagttgt
cccctgagca gtgcctaatt tttcttagga aagtaaaagt tagaagctca gctatgtgac tgcataatat atattagcat gttgttattc ataagtgtat cacagaccta taagaagatt gagggacata ctaagacaga ccaattgacc actgaggcag aatggtgctg ggagaaatgg acaatccaat ctcagattag
L avjyyyaaaa
gagggagatg gcaggtcctg aaatatccca cttgaaagtg tcaggaaaat taattgaagc atggtaccga gcatcatatc tcctggagaa gggagcagta catagagggc ctgtacataa ttttctagat ggaaggtttc gcaaaatggg ctgagacagg tttgaagaag tattttcgtt aacgagaaga gggactcaag
ttggtttgta ttacacgtct aaatccaaag ctttgttttt gaaaaattac cctgaattcc aagaaccaag aaagatatat atggaaacaa ttntgggacc agaaattatt attcaacata agagttgttg cttctgaagg aacattttat gtgctctgct ccgcccctcc aatgagtaac ggatgtcagc gccctccaat
t* rra r-r-t-t-rrrra
taaacatgtt aatttgactt attctgtatt ttataattac catctgtttt ctcccttgaa atatatatag gccttaattt ggttattttt ctatgcacag
tagcacattt ggcatttata gggtgaagag tactgttttt atgggagtgt ctttggtgtg tatctagttg actttttttt ctgtgtctca tagaagaata aattacatta attaggtatt gttagcttag acatttaaag gcacacttca gagctcccaa gaaaacagag cagccaggat tatcacataa ttctatctgt
tatarfrinnf
_.M- - - w
ttttgatgaa ggttgccttt ggatttcaca acagaggtat gactgtgcga aaataatagt atacagaaaa attcacataa cctatattga ttttcaaact
cccttgagta tgaaagacta attataaaac acttatgcta atgtgcgtgt acatttttcc acatgaaact atcacactga gtggagtaac aacctacaaa atgggatatt ctggatttga ccttgctgca cttgtaagat gggatatcat accaacaaac cttctcttca acagcacatg aaatgtagct ggcttcagtc
attcaaatta aagatcctca tgaacaaaag tctctgatgt ttgtgtgtgt ctagcactta ctaatataat gcatatttct aaaggacaga atcaatcttt aaaggacaat atagtttttt aatattatct cttaagggtt aagtggcagg acaaaacagc tacttactta cagttaatca tttatggccc gatgcgtcca
ni-attaaat-a t-r t--г t-rrt* я a a
acgtttgaaa tgtccacagc ggccagtgag tattaaaaac tttgggttgt ttacgcctta aatagctaaa caaagaggag acaaccaaaa aacacggact
actgtacagt agaaaagaca ggatattctt caacatgtgt aaaatcacat gcaagactct gccactgtgt ggactccttt aatattctac agatttcaaa
atcgctgtct gtgcccaccc tgtatttgca gatcattatt atacaaatta atgttctgaa aaagaagcaa cttctgattg agttacatca atgagaatct
- 173 -
008252
cccaagtctg aaatttttat tgaaactgaa tttaagcgat tgagaagtca gcagatgctg gtttgaagtt gtgaatgtgt tgaggccatt taaaatccta
aatgtttttt
ttaatgtaat
taatgtttga
gaggcagaac
gggaaagcag
agccgtagaa
tgtttctttg
gacaaagcta
ataaacttcc
ggattctcta
tggacattta
atgatcttaa
agtaaattta
aaaggtagaa
tgtaatactt
tcccatctta
gaaagacgtc
aactgcatca
aggtatagta
ctgtgcctta
gaccactctg
acgtggaatg
caatgttatg
tttaaataaa
attttgggac
tgtgcacgca
cctgtgctca
actgctgtcc
gagattcaaa
taatgcacaa
ctccaaaaag
tgagttctaa
gaagtaaatt
tatctctaat
actgttggta
tgccatttct
tgtgtccccc
gggttcacgc
ccacgcccag
atggtctcga
acaggcgtga
ttcattagtt
attctcttct
caatagatat
atttcccagt
ccattattcc
ctgcccgtgg
tcagggaaaa
agtagggggt
catctttgga
cagtgtttgg
cgcaggccca
agggaactcc
cgcctggagc
tccagaatgc
tgacaggagt
atgttcaact
tgagcttgta
tgaaatctag
aacccagcag
cagagggtgc
gagctagctg
aagattgaga
aaattgtttt tcttcaattc atattttaac acagtatgtg aggatttcag tagcactgag attctaattt tcatttgatc tttgtactgt cactgtgttc
cttttgggaa atcataccaa agttattcct cacagcaatc agaagaaagc acaggctgaa tcgtgcagag caattacacc ccgcccgatg tgtaatgata cttagacgac ttctagtttt cattcttgca aatgtgcttt tctcggttgc agccagactt tctttacatt agatttttca ttttccttca agaatcatga tactttatgt taaaagatct ccacttctta taatatatat atctttgctt aaatgcaaaa ttacatttta aagaaactta ggtcacctca tcccccacca ctttttctgt gtctgtagct tggctgatag tgccgaagta tgaaaaactt ttaactgaac taaactgaac acacccagca tccatactcc ctcccgctcc gcagcacacg tcagtgccac aacagtatgt actctgttgt cacatttctt acactgagat ttttcccact caactgctag tgacactgct gtggccaagg gcacgcacct aggagaggat atgctgcttc tctcttaata gtccttgctt ttaggaggtt ttcaagcagc cgctcatcct atgatgccag gtttgcacaa ctgttctttg tagtttcaca tacaaagagt tctatttnct tcttgttcct aaggagcgta atgcgggtga aacccatttt gttaaacaat atattcaagg cctttataat tttttttttt gcagtggcac aatcttggct cctcagcctc cctagtagct gtatttttag cagagacggg tcgtgatccg cccacctcgg ccagcctaca aaatttttat agacatcagt tcaggttaaa ggacacgcat actccacact tctctctacc cttcaggata agagtttagc ttagagttga atttgctcag ctcaccttgt agagccctgc atggttcctg gtgcaagggg tcacacaata cccccaaaat ttttgtccag ttgcagaggt aaccagttaa gaaaaggaga gggggattca tggtgacaga agcagggatg gagaatcatg agaaacaaga agcatggccc tgctggcgcc aatttctatt gtgttaagct taatgtattg tggattcaat acacaaacag caatattata tttgtcagag aaagcttctg gaatttgatg gagttcaaga gagggccggc agaggtgggg aagcaactga aggatgtgac ggcagggagg ggccaaaaaa gcatggcagc tcgcacctgt aaaattacaa agaaaggaac atagggaaga cgaagtctct tctcagccag aaagctcaag tctttaccat catgctcagc atatgagaaa tcttaaaaac
a <_u ll. L. Laaa
gtatagtata
tttgcatcaa
aatttggata
caaaataaca
ccctgtctac
catgggttgg
aattttgctt
atatagaaag
gaaatattga
cacccaggac
aacttcctcc
tcccttcact
cattcaaata
gacagttcac
gccttgtggg
gctggattta
gtgcatggga
cctcagccat
aactggccct
ccttctgagt
caagtngtgc
atgtactata
ggagtgtaaa
aaacaaggtg
aaatataact
acagtctcgc
tccacctccc
gcgcctgcca
gttagccagg
tactgggatt
tgtctaaaca
gtctaatttt
ttcaatcaat
cttttctttt
ctgatcaata
atgccagcca
gtttacagtc
cgacagtacg
agaatgagac
ctggatggtc
cacagaaaca
gctacaagcc
gaaggactct
acttctagcc
tggtaatgtg
gaaattgcag
taccatgtta
ctagtggaac
aagaaagggg
ggttctgagg
tgtggggata
gcctagattg
LciaL LclUclau
aaattcataa
atcttgcaaa
taccatttca
tgtgtatcat
ctctttcttc
aaagttttgg
tcttcccttt
tacatttttg
gaagctcctt
cagacacccg
gagtacatac
ttgtgaaatc
cccaaatgta
ttttaacaac
gttcttgcag
tttttagttg
agaagaacaa
atactcaccc
ctgtagggca
agcttcccgt
ttcatttatt
taaaatggta
accaattaga
tcctacatat
ccaacatgtc
aggctggagt
cattctcctg
ctaatttttt
tctccttacc
gccactgcgc
tgtcaacgac
gtgaatctaa
tttatgctta
tgtctgctgg
ttcactgaat
aataatgagc
gagaactgtt
ttaaggcatt
aattgggtct
catctataag
gaaggccatg
gagcatggct
cttcagagag
tgagagagta
cctaggaaac
gctttgagcc
agaggaaaac
aaaacaagta
agggccagca
agatgtttcc
aggctggaca
ttttgaccag
L.wL.L.Uwwl.L.U'
tattcattca aaggggaaag atagtggctt ccaacacaca tggtcaaaat agaatggaat tctaatatac ccctgctcag ccgccacccc ctgctggttt tgcgtctggc gtagttcact tgggcatttg gagggcttgt ccacagggct acagcaaaga tgattcagtg tctctgtgtt tcgtgaagaa gcgcaatgac actccctaga caagctttgg taaaatgtgt atattcgata tttttttgag cactgtaagc gggactacag gtttcaccgt cctcccaaag atctgtactt cgacacagga aacaaattta tatctaaaat gttccgccac gtccagtgcc tcctcaccaa tagtgtcaaa ctggatcctc gttaattgtt gattcagaga gggtgttaca gaaaggcaag ttggtttttg aatgatctag tgacccgtaa ggattcatcc tgaggaattt gaaaaagagg gaggcacaga tggaacccgg aggcctctga agtcccggct
- 174 -
008252
actcaggagg ctgaggcaag aggatccctt gagcccagga gtttgaggcc agcctgggca 188580 acattgcaag atcccatatc tttaaaaaag aaaagtttat atttttgttt ttgtttgtta 188640 aaacaaaagt ttttttgttt gtttgttaaa agcagtgggt agccaggtgt ggtggtgcat 188700 gcttataatt ccagcgactc aggaaactga ggcttgaacc agaaggcaga ggttgcggtg 188760 agccaagatc gcaccactgc actccagcct gggagacaga gcaagactcc atctcaaaaa 188820 aaaaaaaaaa aaagagagag agaggaagaa aaaggcagtg gaatgccatt gaaaagtttt 188880 aagacagagc gtgagaaatg gcaataaccg cagaatgaag agcagattag aaagagctga 188940 agcagatgga gaaagcactg caggaaatgc aggaacccag tggtgcattg gccagggagg 189000 cactggtggg gatgcaggca gtgggcaggc ctagaggctt ttaggaaaga actctgtgtt 189060 ctcatttcaa tgatatgtcc caattaatat accatttgcc cttgtgtctg tttgaagaca 189120 ttgaattctc ataaaatatg cataccagtc ctgatacatc tagagccccc aagtcaactc 189180 ttctgaccac gtgtgtctat tctgctgccc gtgaagtctc gtggagtaga agtagtgcct 189240 tcattttttt tcttatttct ctctttgctc tataccttgt gtttccgagc actctgttcc 189300 tatatctgcc agagtggcca ttctatttta ttatcattgt ctctttatag aactatctac 189360 ccagttatac tgtgggctcc gtgagggcga gtgcagtgac ttatttcttt ttatatcccc 189420 tgagcttagc acagaacctg acctgtaaga tttgatttat aagtgacagt atcaatgtat 189480 aaataaatga gtcagcaaat gcatgaatta acaatacttt atttctgctc tgtcttatca 189540 cctttggcct gatatacctg ccttacactc tgatctgatc taatagatta actgcttttt 189600 ctacttctgc tctatttacc actgacaagt atttttctac tagttgtatc aacttttaga 189660 aaacaagact cttcctggta aatctcttta ctcgtgtgtg gaatcatttt tctaactgtg 189720 tacctctcac agagatgcta ctactttttg ttttgtgtct ttgggagcta attccttacc 189780 attgtcatca tcataaccat ggaactgttg agaacgtgcc attttgcaca cattactgcg 189840 ttgagcactc cagttaggaa gggaggaagg caacgaacag cagtgactcc ttctccaaat 189900 aagattacca tctaagacag aaaaaccaaa ggctacccac aaaatcaaat cagacttaca 189960 aatggctaag gtaaatgttt atgttacaca aaacaaaaac ataagagcga tttctgcagc 190020 ctaataagaa aaccagaaat caggatgtat aatctcatca tgagctcaca accaatagga 190080 tagttgagtc atccatcata ttgaaatggg aatgtttccc caaaaagaag ccctcctgtt 190140 ctccttagcc aatttgtatt tccacatata ggagggatgc attgccatct ctcttcctgt 190200 tttaaaagct ctcttggcct ctaattctta tctttccata attcctaaaa caaattatag 190260 agtaaaacca tacccaacaa ggaggtaaat gagtggatga tttttgaaac ccacccccca 190320 aatccctcca aaaaggcagc ctgaattaca tgtactcttt gaaaggcatc agtgttaaaa 190380 gatgcagttt gggaagccgg gacagaagac agggcagacg tggggaaggg tgttccactc 19044 0 tgcagaaggt cctggagaag gggagaggta aacagaagta aagagggact ccaagagacg 190500 tcggcactgg gagagaaaaa gagagcatag gaaagtatag catgaattct ggaagccaca 190560 gtccaccttt gtagtatctt agttcagcct tgttccagtt tatgatgtta aacctgagct 190620 tccctgaaac tcaatttgta gaaatataaa tatacactct taaataaatc catttgattg 190680 tcattcctca caaagatatc atatggcatt taagttcgtc gtgtccaagc atgtttgcag 190740 ccaaatggaa aactcgctgc atggaccaaa .tgtggtattt gtgttttgag cttttctgtt 190800 ttaatctgct aggcgacata accaattttc ctgccattgt ctctctttac aaatgctact 190860 acttagtatg attctgtagt taattttttt taaatttttc atggttttta aaaattttta 190920 attctagcgt taggcatgtg taaacaaatt ttattgttta aatatgcaag taatagtaaa 190980 ccattaaaaa tgtctgagat gaaaagagac ttgtctttgg gaataaaatg acataaagtt 191040 ttccttgaat ttttttctgg tttanttttt ttgttgttaa gttttgtttt tgttttttct 191100 gttaactcaa aagttttagc tcatagagca atttatggcg ggcaagagag gtatacttgg 191160 taggcctttg ctgccatcta ctggcatttc atgtaattac ttattgcttc cattctaaaa 191220 ctaattttgt gtaacgtata taatagtatt ataggttccc ccttttnttc ttctttccaa 191280 tttttcttta gttaaagcaa agtgaagcaa atgcggacac caaagaaaag ctccctttac 191340 gcctgcgaat ctttgaaaaa tttccaaaca gacctcaaat ggtgaaaatc tcaaagcttc 191400 cttcagattt tacagttcct aaaatcaggt accaaaatac ttctttaatt gcatatttca 191460 catatattgt aaaagattca tcatcttaaa tctgatttaa cccttctttt aagtatatgt 191520 gggttgggtt tctttctatt ttattgtcat ctttctacta cctctacctc tatttaaaat 191580 aaataaataa ataaacaact ttgactcttt taagcaatgt attcacagaa gagtcacttt 191640
д 13 д гтттгэ n tartr-haanr a a ~a з ~rrr*f n rhfrpz-af-rrt ft* ¦-/*•¦* r-t" r"t*rr ггпл +¦ /Т ap f" r*r" IQITDH
-------~> --w, WW.- - - w--.-- - - ----- WW- - WW---- W-- - W.W - -- -- - - ---- - - - W-- -.-.WW
tcgggaatgg gacatcccag gaaactggag aagctgctca gtgttgcagg gatggcaggt 191760 agacatcaat ctcagacccc aaccgtatga gactaaaatt gcctctgtgg cccttttatt 191820 ttcaagcaaa cagggaaacc acagctggcc cagtttgtgt actactacag tgtttatgga 191880 gcctaccatg tcaggttacc atatataatt tgccttccac tttttaaaag aagaaccgtg 191940 gcgtttttcc actcatactg atttgatttt ctaccacgtt tgccctccag ttaagcaaat 192000 gcataaaaga tgctttaaac acctattttt aataataaaa ggaaattctt ctagttatag 192060 ctcaagaaat tacaaacaga attacagtaa tatgttacta gctttaaaaa taattctgtg 192120 gggggttata aaagtatgag actatatatg gtgccataat atttaaaatt cgggtagaaa 192180 tatatttgca tttctaattt taaaaaacaa aattaattga atttggtaat ttgaagagac 192240 gttacttgaa ttttcgttat gctttgaaga tcagatgaac gcacttgctt ttgagtctta 192300
- 175 -
008252
aaatgtaaaa ttctctctta gtcattctta tgataaatgg acatttagag agagcaacta 192360 attcttccaa gtcttagagg gggaaaaaaa gtgttttatt accacaataa gattcaaaaa 192420 actgggctgg gtgcggtggc tcacacctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaaccggg 192480 cagatcacct gaggtcggga gttcgagacc agcctgacca acatggagaa atcccatctc 192540 tagtaaaaat acaaaattag ctgggcgtgg tggcgcatgc ctgtaatccc agctactctg 192600 gaggctgagg caggagaatt gcttaaactc gggaggcgga ggttgtggtg agctgagatt 192660 gcaccattgc actccagcct gggcaacaag agtgaaactc cgtctcaaaa aaaaaaaaga 192720 ttcaaaaaac taccatcggt tactgagtaa tattgcttga aagttatttc aaggatattg 192780 ctttttaagc aggagtcact gagtttcagg aagctgttgc taatgaaata ttttagtcat 192840 gatctagttt tctatgatct tttatcactg ctttatcttt gctcaagcaa actcatcatt 192900 gcaaaatgct gtcacttgct cccttccact aataatgcct gatgcacata tacttcattt 192960 gcaaagggag agttttatga agcagtttat tgaccgccag caacaggaca catgttgcct 193020 cctgagaagc ctcccgacca cctcttcctc ctcctgcgac cactccaaac gctcagcaat 193080 tgaggacaac aaatacatcg accaaaaagt aagatcngct gtttcgaata accaggcttc 193140 taaaaagcat ctatgtttga gaaaagaacc gcagagttct ttagggtcct ggaatccaat 193200 ttnctcaaga gaataatgaa aanaaaatga tttcatttgt aaaagatatc atgaaaccta 193260 acatttttta ctctatgcat tgaaattttg catttgcccg tgtaagcttt tgagctgcgc 193320 cacgtggcag ccatgcgact ttgtaaacat caagagcctc ccaaatctgc attttctcan 193380 gtgcggaata aagggctggg atctccaagg ctcagtccag gtgtaatgac ctgccatctc 193440 ctgcaagtac aactgcttat gtctacttat tacatcagag aggatacgag agcatgtttc 193500 tctaaaatcg gtcgaaagaa ttgccattta ttcaatgctt agtatgtggc aggaacttag 193560 gtgcaagagc ttattcatgt tctagtttac ctatttcttt atcatttgaa aagtagaagg 193620 gaaaattttt ttcagattcc acagcaaagt atcagtaggg aaccacatat aaataaagca 193680 aatttaggta ataattttaa agaaatgtac tttttcattt attcactttt aaaaaaaata 193740 atataagggc tgtgtgccgt ggctcacccc tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc 193800 gggtggatca cttgaggtca gaagttcgag accagcttgg ccaacatggt gtaaccccat 193860 ctctactaaa aatacaaaag tcagccgggc gtggtggtgg atgcctgtaa tcccagctac 193920 tcgggaggct gaggcaggag aatcactcga acctaggagg cagaggttgc agtgagctga 193980 gattgtgcca ctgtactcca gcctgggcaa cagagtgaga ctccatctca aaaaaaaaaa 194040 aaaaaaaaaa nangacntag aatgtattat ctaggtataa taagtaaaca tatttatata 194100 tacacacata gacatataaa tgtatatgtg tgtatatatg tatgcatagt atcaaactat 194160 atatatcagc ttggtcacat aatcaatgtc agttcagtta gaaaatgaaa gattaataat 194220 tgtcctttaa tattaaagag attaaacagt agagtttgca aaaacatcta gttcacttgc 194280 aagtattcca ctttggcatt cctagagtgt tttttattcc tttacattgt tactgccctt 194340 tttcttttgc ttatagtgaa atccatattt ctctatgatc atgtgacaat aaaatgccaa 194400 ctgtttcatc ctccaggatc ttctttctct ccgctttctt tcccttccca cagggatgaa 194460 ccctttggaa ttccctcacc tttctcttta tctcgcctcc cctttttctc ctctttcttg 194520 cctccccttt ttcctccttt ttcacctccc .ccttttctcc tcctctttct cacctcccct 194580 cccctaatgt gatactactc ccgtttacct ctcccccagc tcccaggttc tctgctgtag 194640 ttcagtcatg ttgctcttgc tgaaaatgat gatgattttc tttgcaggat gtctcttctt 194700 tttcaaggat ttccatgtgt tgattttcct tcagccatct agagatgcta ttctactatc 194760 tttgcagaat ccaagattgt aaatgacaag tctgatgcca atgtcatttt ttttttaagt 194820 aattagcctt ttggttggta gacttggttt gcttgtttct tcaggaaaac ttgtaagatt 194880 ttctgtgtat ccttggagtt cagaagcttt cttagaatat accttatatg tcttttttca 194 940 tcagaactgc tccaactaga gtcttttcag cttgccaact aagatatttg ctcagggaaa 195000 tttccattta ttttgcgttc aattgttact cttccatctg cttctctctc ccctgggatt 195060 gccatctctc tatttttgtt ctgtgcttgg tcttccagga cactaattag atttcaactg 195120 aggtcatcct ttgcttctaa atttctcgtg aaaaattatg atatggacat atgaccctta 195180 actatcctta aaggcttgca tattaccctt agctgtcctt agaggcttta cttttatctt 195240 ttatttttat ttttttagag atgagatctt gctgtgttgc ccaggctggg gtgcagtggc 195300 tattcacagg cacggccata gtgcactata gccttgaact cctgagctca agtgatcctc 195360 ctgcctcagc ctcccgagta gccgggacta taggcatggc caccatgcct ggcttttttg 195420 atttttttaa attaaactta tcacctctct tcttcacagt tataatccac tcaacactgt 195480 gcatggggca tggaagcaga aggtcatatg tcagtggata aacaagtggg aagatagtgc 195540 cttggcttca gccagtcagt ctgaaattgc agtttgcgtg gactagaaag caggttgttt 195600 tgttttgttt tgtttccaaa gcagattgta agccagaagt ctgggctgtc cttgtgacca 195660 cttatctcca ggaagaggat agagagctga tttccattat ggccaaagtc acaaaaccat 195720 gacatgcttt taaaaatcac tggtaacact accccactgg aaacacaaaa ttgaaatatg 195780 agtttatttt ctctctaaaa ggaaatgtga ttgtttctca catttcctga acacagtatt 195840 ttgatttggt gaggacaaag ataaaaagag tcttgagagg catgtgccgg gctgaggagg 195900 agtctaaaga gaatgtggcc cgcccctctg tgcgcccgcc cgaagcgaac cctccccagg 195960 tacagttgga ataacacgtt ttatcccata caacatgtct tattgctccc acttggaaag 196020 tggaatgtca aaaacatact ttttcttcat cagaggaccc tattatggga gtggcaagac 196080
- 176 -
008252
aactgctcct
aagtagactt
gtgttcctca
tctaaagcag
attgcggaga
ttaagaaacc
tcacagaccc
tttccattaa
ttcttcactc
gctgtgtttc
gattctcata
gtaccaggag
aaaatagtga
gacagcaacc
attaggcaag
tggcaacctc
tatacagttt
aatcttgggg
tcgtttgaga
gctacctacc
ttgacagggg
tttttcctcc
aagtgagatc
ccgaagtgag
actgccctgt
tgtcagaacc
agggctgtcc
acataataat
gtcagcctcc
ctaacttatg
tttgatttta
gttattcatc
accctttaga
gtattactgg
attgataaag
catcaggtgc
caaccctcat
taatgtaata
caaaccagac
agatttctat
cagtctagtt
atttttttag
gtcttcgaat
ttattgccat
cttgtaactc
tgtttgttca
acagcctgnt
ggcttagctt
atgatgctac
caaatatgaa
tcccaattta
ggccatcaga
gttactatcc
aattcttttc
taagacctta
aaaatccctc
cagcattctg
cgaaagccac
taccaccatt
aatcccaatt
tacgtgnaaa
ctcagtgact
acatgaacaa
aaacttctga
agccccaggt
ccagaagggg
attttctccc
actttgcaga
aaaatacctg
ctgacccaga
ctccatagaa
gttcctgtga
cttttccagt
atattattga
tgaacttgac
acatccagtc
ggcctgagga
tgcaatagcc
cagcacctcc
gaacagtgaa
tttctgctga
tacagtaaag
taactcatta
tgctattctc
agctcatagt
aaccatgaga
gaagaaagca
tcgatgtttg
cagtaaagtg
atgttaaata
aagaaaggtt
tcatcagtta
gagtgcaata
agtttgattt
ctgaagaagt
acagcatttt
ctcacatagc
ccttaaaaga
ttcattttta
ctctgcagta
catgtaacca
aactctgtac
gtcacaataa
gaaatgcaaa
acgctttctt
aggatccacc
ggatttgtca
ttcaaaggat
gcatttgtat
ttaaaaacaa
agttcccctt
gcctttggaa
aaaaaaacca
ggtatgaaag
aggaacaata
cttcactatg
gcctgaagac
gctggggttt
agtaattacc
aaccatgttt
tccttctccc
tcctaaaagg
acgaccttcc
gcaattgtga
ttccaagcag
aattaaactc
tttccagtaa
aaggtcaagg
tggttctgtg
tgggaagcat
acctcgtgcc
tattttctct
agcatatgat
aggaaaatga
acattcattc
tgggctgtgg
ccaatgggag
cagaaccccc
ccccaggcag
agagaaattg
gagataattc
cctagcattg
actgttanta
ggacaaaaga
tattaattac
ttgttgatat
aaattaggtc
ataatgttct
aagttactca
gagagagaga
gngcttttgg
ccattcaaga
tgggttgtat
acttctctct
tggaaagaaa
tcaaagccac
acttttacac ttcctcaagg gcccaaagga cactgttcac ttaagaaaat tcatgtcctt aaggacaaaa acacttggac ggggggnnag gcacacaaac
tgttggtggg atctagaact ttataaatca aatagcaaag gtggcacata tgtagggacg aaccaaatac acnaggaagg ggatagtatt atggcacatg
4^UV-*V-" 4-F U U V-J
accgtaaact agaaatacat tgctgctata acctggaacc tacaccatgg tggatgaagc tgcatgttct nggnacatca aggagatata catacctatg aaagctttga attttcagca accttgttga ttcagtgata tatgaatacg gagcgcataa ataaagtatt atcctagtca cccagccctc aaaaaggaca aaataaaact ctagagggaa tgcaagttca gatgaagcat caagctttga ttaaaaatag agaaaacaac aaaagacagg caagtggtca gaggttcctt aaagaaatca tagtttcctt ccctgtaata tctcacctgt ctgctgtctt gagtgaacct cctgtacttc gacagtaggg agttctttaa tcattggaat agtcattcaa gaattcaaca gaaatgcaca taagttcccc agggggacat ggtagaagag tcattttcaa .cacctgggct aactgtacca cttttacata tgatcaattt tttagttgct attctggtaa atatgattat gcctgatcta gagagagaat tcttttgaaa tgtatctcca ctcaaaggga agcttaaaaa taaaaagatg aatgagatac
agttcaacca ttgacccagc aagacacatg aacccaaatg aatactatgc tggaaaccat cactcatagg cacactggga cctaatgtaa taacaaacct ttcgatctag atagttccca gtgcccctgg aggatttaat gcaagccttt acacagaaca tttcagcgag cagtaaagtg tgcaaattgt ttagaggctg gttctcttaa tcacctttct gggagaaaaa tgcagaaaac acagggatga ccctggtgga cagcaaacaa aaagagtgtt tttccccatc ttcttcctga agcaacaatt aagcagagtg aaagcagccc ggttgagtct ggctgatgca cctggagcca ccagcataga caatatctgc taagccttca gactatgttt caagcactta gtgagcaaga tacatgcatg ttacagaaga atatgcaaag tgattaagtg ggtttgttgt agcatatgtt tgaagtcaga aatttaacct ccttatggta atccctattg gatttactct agagtgcttg taatttccag gaacaaanga gaattttttt ggaaaagagt agaattggtg tgctttagta cgtaagattt catctcacac
gttgtcagaa
ccagttcttg
gccagggaaa
ggaagcacaa
ttcattttta
aaaatccccg
cacttagaaa
acaggcaggg
gcaaattgag
gtttatcggt ".-¦> -_•--.".-.- <. *"
uy у L. i_a L. w l. u
ctttccaggg
aacaacaact
acaaaagcac
gtaattccca
tcacctttat
aaatctttaa
ttcctgcctg
cctttatcct
ttcaaggatt
tctacttgta
gtgattaata
gctctgttct
acagcgtctc
ccatttctta
tgctaggatg
atcagagccc
ccaccctctt
caatgaacag
tgtttaccca
tagagcaccc
tgcgaactgt
aaagtaaaaa
agtgtgattg
gtatgcaaag
gtgcaggttc
gagaatcaaa
ctgtgcctct
ctcagcaaac
tcagatgtaa
cctaagtctg
tctacacggt
tccgnttttt
ataatttgtt
gatgaatgaa
acgaacgaac
tttaaataat
gacagatgac
ttcctcatgt
gataatggat
catcatcact
cagttagaat
yy_-.y _yy_.y
ttgtggaaga catcccatta cacatgtatg tccatcaatg agtcataaaa cattctcagc tgggaanctg cctgtcatgg atgatgagtt gcacgttgtg
cagcgtgcta ctgggtacat tttattgcag atagactgga aaggatgagt aaactatcac aacaatgaga ggcaggggga aatgggtgca cacatgcacc
- 177 -
008252
ctagaaccta aagtataata taaataaata aataaataaa taaataaata aataaataaa 199920 taaaacgatg cgtactataa aatcaaacca ttttttcttc ttactggtct ttgcagtaaa 199980 ttctcaagct aaaaccaaat atctgtgtgt gtgagcactc accctttcat ccaacaatca 200040 tttttgagga ccattatatg caaacagttt gctgggccct gagtaaacaa acacatcttt 200100 ctatattcaa ctaacattag agtaggaatt ccctctcaat gattattttt gcagaatatt 200160 taattgtgta accattttta ggttggaact atgtatcagc tgtttgtatt ccttagtaaa 200220 tgcgcattga gagtcaaaag taaatcagtc taggattaag aattttttat aggtaattta 200280 aaagattttt aatcgcattt tctgtatcat gcacaaaaga ggtatcaagg agttaaggcc 200340 gctgctaaat ctatcttgga aatttacatt ttgctcttct ttttaaactt tttcctcttc 200400 tgactacagt tttacttata aattgtctct tctatcaagt gtcatgctag tctcagtgtg 200460 ttgtatttgt tgctgatgat ggtgttgagt ccaagtcctg cttccttgtg ttgccacaga 200520 ccttaaattt cgaatttcta cacccataat cccagcactt tgggaggcca aggctggcgg 200580 atcacctgag ctcaggagtt cgagaccatc ctgggcaaca tggtgaaacc ccatctctac 200640 taaaaaaaag tagctgagca tggtggcaca caactatagt cccagctact cgggaggctg 200700 aggcatgaga attgcttgag cccagggggc ggaggttgca gtgagccaag atcatgccac 200760 tgcactccag cttgggcgat acagcgagac tccgtctcaa aacaaaaaaa aattttggaa 200820 tttctaaatt cacaaacagg ttaaaagcat ctgacattta ctctagaatc acaagcccac 200880 tcaccttctt ttgtctctgc agatttccaa tctttgcctt cctgtttata ttagatataa 200940 tcataaagtc attttgtatt ttacttttgt aattaaaatc tatctagcgt atatttatag 201000 ttttgtttgt ttgtttgttt gagacggagt ctcgctctgt cacccagcct ggggtgcagc 201060 ggcacgatct cggctcactg caagctccgc ctcccgggtt cacgccattc tcctgcntca 201120 gcctcctgag tagctgggac tacaggcgcc cgcaaccacg cccggctaat ttttttgtat 201180 ttttagtaga gacagggttt caccgtgtta gccaggatgg tctncnattt cctgacctcg 201240 tgatccaccc gcctcggcct cccaaagtgc tgggactaca ggcgtgagtc tccgcacccg 201300 ggcatttata gttncttatc attaagtact gtatattaaa cctatctaaa tttgtttcag 201360 tactcgaaga tattgctttt ccctcgattt ttgcacagtt tcattatttn atgtgtaaga 201420 tgttggagat ttgaccaagt gaccccaggc tactgtgtta gtggccgaaa cattgtcata 2014 80 acattcacgt gcaaaaaaaa atcagatcca ttaagtttta aattgtttag tttctaatat 201540 tacaagctgt tcctatatat caagttagtt gattcatttc aaaataagca gtccctcttt 201600 gtaattttta cgtcattcat atttcttatt ttcaaggact aactacatta aaatatataa 201660 gatagaaaaa gtaatacttt aatattatga aattaattca attttcaaat atatttcaag 201720 caccaacaat gcacagtgct agacaatgaa agaaaatgta ataaacaaag aatacattat 201780 acatatccta aggagtttac aatctattgg aatttacaga aagataaaaa gatgtttcac 201840 acagggcagg gatcaacttg tgctgggtgc ctaggagtcc aaaggaagag cgaagatttg 201900 gtgtatgcat ggcatgcaca cacgtgcaca tgcatgttta tatgaatatt ttaactccta 201960 cacatagtgt ttttacaggg ttcagaacac atgatattga aataagttac aataggaaat 202020 cttttttttt gtttgtttgt ttttttgaga cagagtctcg ctctgtggcc catgctggag 202080 tgcagtggca cgatctcagc tcactgcaag .ctctgcctcc caggttcacg ccattctcct 202140 gcctcagcct cccgagcagc tgggactaca ggcgcccgcc accatgcccg gcttattttt 202200 tctatttttt agtagagacg gggtttcacc atgttagcca ggatggtctc gatctcctga 202260 cctcgtgatc cacccacctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccgc 202320 acctggccta caataagaaa tcttgaccca tcatctaaaa ttctcttcac aaaattcaca 202380 ttttaagata ctgttcaaag cttcataaca tgatattata atggtattca cctttatata 202440 catccataat caacatttta atcttgctga tgctcacatt aatcaccttt taaaattttt 202500 tttctaagca taatgtcaat tccnagagaa agtttatttt atagaaacat cttgccacac 202560 acatgatctg tcgtatgcac tttgggatta attatgaatt cacgggtgca tgaaaattca 202620 aatacagtca aatgagatac caccttcgac ccatgcaatt ttaagtaatt gcttattccc 202680 aattactata ttttatttgg gagacttatt caataaagtg gctcgttaca ataattacac 202740 tacaactttc tagcagaaat gacattcatc aagccatatt cattggaccg tggttttgtg 202800 tcttatggtc atatgttttt ataaccactt tcccatttat tattaacctg ttaatatttg 202860 taaagtgaga aaagaaaaat ggagccactc aaactttttc ccagttagaa acagaaatgt 202920 attgttaaca ttgtaaatca aaaaagctat tgaatattta taatacttgt ggtgtgcttt 202980 gtcaaataaa tattgatggc ttcattctga aggtggtttc tagggtcaag ctatggttct 203040 ttaggtctaa gcattgccgc atcctaaagg aatctatatt caagataggt ctgtggttac 203100 ttctgggtga ttgaattaat caaattaata ttctgattga ttgagagttt tgatggatcc 203160 cagattttaa ggaatcagta agtgtaaaat ataaaaacta tgatcatact agctttaatg 203220 agttaggaaa tgtattgatc tctttcagtg cttcagagtc attattctga aaatcaatta 203280 tgcatatgta gaacaaacaa aaagttggtt agtttcgatt ttgcattagg atgtgagaat 203340 agcaagagtt tataatatgt gtaaacaaaa tatttcaagt caagcagata atattttgtt 203400 atgatatagt ttagaaaatg cttttttata ctaagcctag tgacatttta catagacata 2034 60 atgcagtgaa aagatttgaa cactgaagct gcatgatcca gagttctagt aataattttg 203520 caatttatta tctgagtgaa cttagacaac ttaattttta tgagccttag atctttaatc 203580 tggaaaaaag agataataat accttaccta cctatgagga ttagtttgaa gattaagttt 203640
- 178 -
008252
aaaatatgta tatatcacct cagcacagat caaggagcca agaaatacag atgtagaagt 203700 tataaaatgt acatttttaa atgtgcaatg ggcatctata aaattcttca ttcaatgact 203760 agagaataac attctaattc aagaacacat gtatgatttt aaatgtaacc atttaccaca 203820 gacttctaaa tatatacaca tcagtgtcct agaaaagata ttatttgacc aaaatgtaac 203880 aaaatcngaa acctaataag aagaaaataa ccacaaaaaa acctacacat tcagaaattt 203940 aaaactattt tcaaataagc acagaagaaa caccaatgaa aataagaaaa tatctacaat 204000 taaaaaataa tgaacaaaag atgcatcaaa cttgtgggaa gtagctaatg gcatttttag 204060 aggaaaaaat ttagccctga atgaatatct agtaaagaaa taaaggctta aattaatcct 204120 ccaagcattc atttcaagaa tttagaaaaa ttatcaacca aggaaacact aagatagcag 204180 aaagaaagaa ataataaaga gaaaagcagt tattaatcaa atggggggaa agaggtgata 204240 aataatatca acataattga aattttgttc tttggaagca gtaataaaat tgataaatct 204300 actttaaaat tcaacaagaa aaaattaagg agccttcttc tataaagatg acagaggcat 204360 tgacattgtt ttttaacctt gaattcccac atgaanaaca aaaagaatac caagatatca 204420 aaaccccaaa tccatagtta atatttacca taaaactcgg taatccacaa accctaaata 204480 aaagcaagtg ttgacaaaca gccacatgat ttgcatgata ttagtgtctg tgggaggaaa 204540 ccaagcttag ttacagagcg tccaatgttc atggaatggt agaacatctt ctttgctcca 204600 ttctgaaata aaaagtccag gagtggaatc aaaattgaac aggccaggaa caagagtgat 204660 aaggataaaa gcagatccag acaaaatttg tggggggagg aggattggga aacagagctt 204720 ggaaattcca gaaagaaagc taccatattt gatcgatata ttaaaacaac agaagaggaa 2047BO actctgaagt tagaagagaa atactaaact gtttgggaaa actaattttg tataaaaatg 204840 agtaaggaaa attatcaaag ccaaattccc tgcaaacgtt attataagaa aaaaacagca 204 900 gaatactgtc tctcactgta gacaaggaaa gcaacctana aaaacgtgct ctaaccagct 204 960 caaactgtag catactattg aaaaattagt taaaagacat taaaaattac ataaggatga 205020 aatagcaaca taaataaaag ttagaaaaac tcagaaatga ggtgccagaa ctgagaaaag 205080 ttataaatta aagcaatgaa aactaaacga gaaggaacat aaagagacct cagatgattc 205140 aaaagtgaga aatagaaaat ggagaagagg gcatttttta aaatcaaaga gaaatgaaga 205200 aagagatgaa aatgatttgc aagaaaaatg acaaattgaa gaaagtcaaa aatccgacat 205260 ctgcattata ggtgtcccta aggaagaaaa accacagcaa gagaataaaa cgtatactaa 205320 acttttctga aacataaaaa gatatgaaac tatatattga cagcacacac ctaaaaatat 205380 tggagtaaat gattaaaaac aatacataca ccagacaaat gacaggtctt taaatttttt 205440 aaaaatatat tatctagccc aaataagaac aagtgattta taaaggaaag aacgttagat 205500 tatcatgaga tttttcagca gcaatgcttt atgtcagaag aaaatagagt aacatatata 205560 ggatgcccag gcaaagaata tctgagccag atttttttcc atcctgaaaa ctgactttca 205620 actttcaagg tcagagaaac tgctttcaag atctaagaat atgagtaatg taagatacaa 205680 gtaatcttgt ttcaatgaac ctgtaatcta ctaaaaaaca tgcctcagat aacctaaatg 205740 aactccaaaa gggactctta aaccatttgg cataaaaatt cacattcata tgtaacaact 205800 aactacataa ggacaacatg aagagtgaaa tatgtaataa ttatttgttc taatatggat 205860 agagtacaga tatacaaatg aggaggtgaa ngggaagaag atatgcaaac ccttaagata 205920 ttcagtagtn ttcttggttg tgtattttca ttctgagact attgtctatg aaatgtgaaa 205980 taaaactgag tcactgtnga gacaatctaa ttctggcatc cctggtgctc ttgataatca 206040 agagtgctct ttgtggagaa aaaaggagat atagatatca tatagaaaag cttaggtaaa 206100 aataaaaatc ctaaagaaaa cgtggcatgt atacaccatg gaatactatg cagccatata 206160 aaagaatgag ctcatgtcct ttgcagggac acggatgaag ctggaaacca tcattctcag 206220 caaactaaca caggaacaga aaaccaaaca cagcatgttc tcagtcataa gtaggaattg 206280 aacaatgaga acatatgggc acagggaggg gaacatcaca cactgggtgc tatcggggtg 206340 gggggcaagg ggagggatag cattaggaga aatacctaat gtagatgacg ggttgatggg 206400 tgcagccaac cactgtggga catgcatacc tacgtaacaa acctgcacgt tctgctcatg 206460 taccccagaa cttaaagtat aactaaaaaa aaaaaaaaaa aatcctgggt catgaattta 206520 aattgaaaac atcagaataa acccaggcaa aatatttgaa acagtgacca actccatagc 206580 agtgagcatc tatgggctct agatatgttc ttgaaacacc atttttccaa ttttccaata 206640 agtaaaccag ggcttcttga agaaaatggt tgattttgaa taggaagtgt acaagctgac 206700 cttggagcat cttgtcatac taggaacaag gaagctttgt caaagactac gagggtcata 206760 taaaaagaac ctacagactg accaacttga aaaactccca atgagcacag tagagataat 206820 ttgactaaca gtaagaaatg gtaattgaca tggactgaaa tccattaaac attaaataag 206880 tttaaatctt gagttcataa tgacattntt ttaaatagta attggttacc ttgagcgatg 206940 atagaaaatc aaccatgtaa aattaataag taaaagtcga taatcaagca tttatcttgg 207000 cttttccata ccagttttgc tactgggtaa ccaaataata caggagggaa agcacctcat 207060 tataaaacta tcccaactaa taaatgaaaa agaaatgaca gttttgcaaa cggaatgaag 207120 tcaagggatc taagaaatga acatcaagac ccgtaacatc acaaaaagaa acacacacac 207180 tctgttcctt tcgatggaag aatctgacac cacctatggc cttgccaaag ggatgaaacc 207240 agagtctgta tgatgaaacc tctggatcca gctgccgatt ttcagaaaat agaagacaga 207300 agaacgtgtt gaactgtacc aagagtgtgc tttcagcaaa atccagactc tctcttggct 207360 ggnngtgcgg tggcttactc ctacaatccc agcatattgg gaggccacgg caggaggatc 207420
- 179 -
008252
acttgagccc aggcatttca agaccagcct gtgcaacatg aagaaacccc atctcttaaa 207480 aaaaaaaaaa tgttacttag ctatatgtga tggcacacgc ctgtagtccc agctactcag 207540 aaggctgaga caggaggatc gattcagccc aggaggtcaa gactgcagtg agtcatgata 207600 attccactgc atgcactcca gcctgggtga cagaacgaaa ccctgtcaaa aaaagaaaaa 207660 aaaaaatcca gactcaaaaa ctataggtca aatggcccag gtttctctat tttaagggga 207720 aaaaagggta acatgtagat taattagaag acatcgccaa aaaatcagca agattcatac 207780 attggaatgt ctttcaggtc caaattattc aatcacaaat aactctatgg gaattgagtt 207840 gaagcttttg aattatgtgt taaagtatgt aattctggaa acgtgtttta acttagaagt 207 900 tcaagactta aaatatctct atattgttga taatttaaat ttaatttact tgttttgagt 207960 tattaattct gtcaaagaat tgttatctga ggcagttgga tgttttcagt ttccaaacaa 208020 aaccgaagaa aatcttcttc aacgaatctt tgactttttt caaagtaaac tccttgtaat 208080 tccatcattc atccccttcc tttttattcc cacatctctg atatgtttac atccagaatg 208140 agcaattact ggctcctttc atagctgtaa tttacaattt cagatctgaa attactcatc 208200 atgaaatgga tctctgtatt ctttgttttg ctaattattt caggtgattg tcagtatctt 208260 ctagagccag aagagggcac tgcagagcag tgtagctctg agctctttat gtttagcaca 208320 gtctaggaat gccctttgcc aaaaaaaatt cgcaaagctt tactatagaa gtaagaaaaa 208380 agaagggaat aactagataa tcactatagg ccttctttat ttagtagaaa aaagaaagta 208440 tataacgatc taaatacata tctaggacat caaatgtaat atcatatata tatgtataag 208500 tagatgaaag aagacatata tatgtgtgtg tgagtccttt ccttctttta agaacatccc 208560 aaaggccagg tgtggaggct cacacctgta atcccagcac tttgggaggc caaggtcggt 208620 ggatcacttg aggtcaggag tttgaggcca gcctggccaa catggtgaaa cctcgtctct 208680 actaaaaata caaaaattag ccggtgtggt agtgcatgcc tgtaatccca gctactaggg 208740 aggctgaggc aggagtattg cttgaaccca gggggcggag gttgcagtga gccgggatca 208800 caccactgcc ctccaacctg ggcaacagag tgagactctt tctcaaaaaa caaaacaaaa 208860 caaaagaaca tcccaaagct aaatctgatg tttttctatt ataatattga ttctcctgct 208920 acctctggca ttagttataa aaacagttct caagtactct cctgtatgaa ttaatactgt 208980 attttgtctt agttcaaatt caggacaaag gccattcagt agccttttag caatcttgtg 209040 cagggcagaa atcatttagg caatagtgta ccagatatta tcccaaaagt ttttcctaac 209100 gtgaaattgc aggggcagta gataagtgat tggattcaga ctctcatctt ccactgaagg 209160 aaagacaact aacacatgtc attgtccttt caagatgaaa taagagttgt ggaatctgga 209220 gtcctctctt aaaactcact gtcacaggac ctctgtgcct gggtctgtct caggactatg 209280 tgtgttctta ggtgtctaaa gagcagatgc tccacgatga tggggccacc agctgagtct 209340 tccatctcca aaagcggctc caagcagctt tccttaggag ctgagctgtc aactcaagag 209400 aggttaaatc catgtcaaaa gtcaactttt ggccgggtgt ggtggctcat gcctgtaatc 2094 60 tcagcacttt gggaggctga ggcaggtgga tcacaaggtc aggagttcaa gaccagcctg 209520 gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaatacaaaa atcagtcggg catggtggcg 209580 ggcacctgta gtcccagcta ctcgggtggc tgaggcagga gaatcgcttg aacccaggag 209640 gtggaagttg cggtgagctg agattacgcc actgcactcc agcctggatg gcagagcaag 209700 actatcttaa aaaaaaaaaa aaaattatgc caaaagtcaa ctctttcagg aggggagaag 209760 taggaaagtt tcaagattta tcattggaaa tagcatgtat gtgctaccaa gaaaatggaa 209820 gttccaaata gttggtatcc actcttgtct ccttgtccat acattaattt ttctcctaag 209880 agttctagtg aataatgaaa ccaattccgg tttttcattt ttgagcagaa aaatgaacaa 209940 accacctttc ctcatgaggg ggaaatcacc agtatgttca gtgatgctga tctttactac 210000 atatctgctg taaaatatga aaagtggatt gctagttttg atgttatcta ggttatcatt 210060 tgtgactaaa aagacctgtt tgttactctg gttcttctcc actatggctt tatggacaca 210120 ctgactgaca ttatagcatt tgttcatagc tttgtttgta gaatggggtg ctgtgagttt 210180 gtacctcaac atacctaacc cttgttgaaa agaaactaac taggtgatct atttttactg 210240 aatacagagt tttctgtctt ctgagggttt tctttccccc ctcaactttg tttgacacac 210300 agtatgccct gtagggcttc ttgcctggtt tcaagatctg gctagcacag cacttataca 210360 ggtagtttgt accaaattaa cttgccctgt gcacacatgt ccacttcagt ccttcaccca 210420 gtaccgcctt tgcctctagg aatcttagcc ttccttcaag gcccagtata acctccactt 210480 tttcattgaa gcctttgccg actagtccag acttgctgtt ccaccgcaga gagctccagc 210540 ccctctgatc ttgtgttttc tcctttacgt atcatctagc actgtgccat ctactgcact 210600 gtacttgtca ctgatgatct catgtgtcct acccttgtct tcctatctag gctattcact 210660 tctagaaacc aagaactcca aattctattt accctaaatc tcctatggtc actaatatca 210720 tgctaagtgc tcagtaaatc taatctattg atcaaaatga acaggtctca attactatct 210780 tcagtctgac tactggagtt acactttcct gttatttatt atttattcta gttatttatt 210840 attgtgaatc tagttattta tttattatta tgagaacata gtggcccatt tgcctgtttt 210900 ctctttgccc ttcttctgcc tgctttaact ccttgtanac cttccaccaa tctaaaatct 210960 gcaactagca agccacacag aactgagctt ggggagtata tctttgaatt tacagtcagc 211020 atccaggatg gttttctcct tagttctctt ctctggagta attttatcat cgccaactag 211080 gaagagatct tgaatgccca tttcattcat tccccacacc tgcaagcaaa acaactccta 211140 aactcattgt tcagattagt gttaggttac aggccaagaa cctgcagcag acataatgtg 211200
- 180 -
008252
gattagagaa cattgcgcta atcaaagaca aataaggagt ccagtatgag ggtcaacgtt 211260 aaagtctttg gaaactgaaa attttattca gacgaaggcc attatcagag tgaggcacag 211320 ccaatgcacc atccgtggct gggacgtggg gccccacaag tttgttcatg gtgctgccca 211380 aataaaagta aaaatagaca agaattgtca attgtacgat gatgctttag cgaaacatat 211440 tcatgtttca tgttttaaca atgtcatcta ttgaatgatt tgacagtata ttatttctta 211500 acattccaaa actaaaagtc atactcttat cattttcagc ttcgcaagtc tgttttcagc 211560 atcagggcaa ggaaccttct ggaaaaggag accgcagtca ctaaaatctt aaggtaacac 211620 caattaatgt tgacacatat ttaaacacaa gtgggattat attaatcgaa aaatagcttt 211680 ttgaaaaatg aattaatgtt ctgggcatca gcatatactt tctgccagaa agtagctttg 211740 agtatctatg tacttataaa caatgtaaaa gacatattga tgtcatttct aaaaaaaaat 211800 tttagtagct cagtaggcct ttctttcaag tatttaaaca taaatgataa gtataaacat 211860 tgaccaaaag gtgaaaataa cttactgtta tttttaacag ttttatatct tttgtgatat 211920 gtaaaggaga aattgcaatc taaaggataa atggtaaaag ggtaaacttt ttcattatag 211980 ttcattacac tattaagagc acatttatta aaaatccnga aataataaaa agtataccaa 212040 tcttagaatg cctatgaaaa catatgcttt taatgctact ttctagaaga tgcgctgaaa 212100 tgaagtatca aggaggaaaa ctaagcaacc gacttgagtg ttttataaga ctatatgtta 212160 tattatggag taacatgatg agtataaaaa cacataggca tttagaatat catttattgg 212220 tacatatatt acatagacat atgtagatga cacaactcaa gattgggagc tggaggtagg 212280 atcgctcgca aggcgagtgg acagattcat gccaggaagc cccctgcaaa cctgcggtga 212340 gtgataagga gttctagctc ccttctacta gatttattac taggaataga cattaatgca 212400 ttctctccag aatgcatatt actataactt ggaagactgt gtgagaaaat aaagcttagt 2124 60 atatatgatc tttaaaacta ttcttacttt ataatactac ctaaaatttg tgtgcaaaaa 212520 aaatttccta actcatcaag acagtatttc tctcaatatt ggctgacgtt catgcataga 212580 gttaagtatg tgttggagta gctgtcatag gatgaaaata agcatttcta gggcttgtat 212640 attatcacca caaaatgtga tgagataaac agacaaggtc tcattgaaat agacaacctg 212700 cgccccaact taggcttact cccgactggc tggtaactcc atcctggtat taccatcaga 212760 tcatgcagtg aggctggcct tgaaccacac atgttacatc aggatcatga ttccagctgc 212820 acctacatca gacaggttca tggtagggtc ctacagcaag gctgatccac tcactaaaaa 212880 gagaaattca ccctcaagcc agaaactacc tacaaggaca tcataattct cagtctgcat 212940 cgagtatctg cctgccaagt caggaactac agggacctta ctcacctgtc cagagccact 213000 gccttgcagt gtgaatgggc cctctgtgtg aatgggttcc cagagacttt ccaaggcaga 213060 tgcagaaaca gatactggca aggaagagat ttccagacct cacttctcta ggaactcttc 213120 cttaaaactg atctatcact ttaccttttt caccctcctg tccttattta cccctctctc 213180 agtttacaaa agaaaggtga aactctcact catccggaaa ctatggcgtg tattaatctg 213240 ggatgtaaaa tcctctgggt tgccaagcaa aaggaccgtt cccacctgga tttctccaaa 213300 aagagggtcc catggggccg tgccttatta tttatccagg tgacagtttt atggataact 213360 tccttcccaa agctatccac cttagattag gccttagaaa taacatgatt gtcacaaggg 213420 catgtggtta catgttattt gaattgaaaa .ataaagccag actttttctg acagattcag 213480 ctgattggtt caacaatgaa aactgattta ataagtgccc aatgtcataa aattgaatag 213540 attggatggc gaagagtctc caatattttc ttaaaattat tttcaagcac aaacacaata 213600 atgctagaaa ttacattctt ctatttaacg tggtgcaaga gggatatagt tgctgatttt 213660 taaatataca gaagtgtttt tgttttttca attatataat gtacatgagc aatattttta 213720 agactatcag ggaatataga cacctctaac ttgcctaaca atggtgtagt ttaggggata 213780 cccacagcca ataaataata ttttactgca gcccagcata ctacagaatg agaggcagca 213840 ccttaaaact acctgagcta tatcaccttt tgaaactcag gaaataaaaa gccataattt 213900 gaaaaaataa aaaaccttag aattttttaa aatacaaatt tgatcttaga aagccatttt 213960 gttttttctt ctgtgcgaat ggtttcttca ttgcttctat gctagtttct gcatgaatta 214020 agggcaagtg caaaaaatca aactgatatt ttgggaatac ttatcttttc accactaatc 214 080 gtagtaatag taatggcaat gataccatac ctgcattata atgtgatcca tcagttaaaa 214140 agtcaagaat agattgggtc catgtcaatg agtgtttgta ttgttttata ctgtttttca 214200 aggaacaata acagctaaaa ggaaaaaaag agggagaaaa agaatttttt ttnnaaaaaa 214260 aaaaaaggaa aacatttgca gtaacctcag gacaattgat tcgaataacc ttccacaaaa 214320 ttgggaagga gaaaaagctc tccaccactt tttcagtgtc tttttactgc ctctagggac 214380 tccgctctcc taggctccaa ccttgctgtc gattaaactc tgccaaggtt cctggataac 214440 ttagcagtgg ggtctcccag gaccatttgc attttgaaag aaggctttta aaaaatgaaa 214500 gggcttttaa gacaaagagg atgcagattc tgtcttttaa tagatgggtc tatcttgata 214560 taaataaaag aaatctggaa gagactgccg ttttagtgtt ctattcctct taactttcta 214620 ggtgttctta atttcataga attattgttt ttagtcttat ccaagaggtt cctcgccagg 214 680 gaggtaagta acagcagtat agggaggctt gaaaaagaga cctgagctgg atcattccgg 214740 caaatatcac aggttggcat tcgtcctaat ttgtgtgcag atagagataa atcacaaaaa 214800 ccttaaatcc agagtgatat aagaatagga agtttttatg aaatattagc gtcttgagat 214860 aactttccaa aaaataacaa gtatttggga aaaaataaag caaccccttg acttaaggtt 214 920 tctggaggcc tggctgtgta aacagacaat taatttcaat tctcagctct cttgtctatt 214 980
- 181 -
008252
ccatgggagc taggaggagg cgatcttcag ggcccctgaa gatctaatgt aggatactgg 215040 acttggtgtt aaatcccccc tggctgggat caggctctgc ttctctgtaa cattgaacac 215100 ctcactaatc tgaccctcag ttttcttatc taccttaaaa agattgtctg aataatctat 215160 tgaccaagca aaatttaata cttattccag taagggaaac tgccactttg ttttcataat 215220 gtctcagaag ggataagtga gaggtggata tatgtaaggt tttgggtttg ggtttcagtg 215280 tttgtaggat ggaggtctgt ttagactggg cagaattctt gatatgagtt gaggagtatt 215340 gaagatgcct ggtatggaca agtaatagtt actgttctga agacggcagt gctgtggttg 215400 aggaccagaa agagaaagcg acctgcctgg tgcctctcca ctgctttcca tgttctttcc 215460 cccggctttg gttcaacatt tgagtaatcc attctttaca gcgagtttgc ccttctattt 215520 tcattctcct tcttgacttg ggtgatctaa gagaagaaaa ataaatggtg accttatgtt 215580 gtcctcttca cacatgaaat ttattttttc ttttgtgcct ttcagatttt taaccagaca 215640 catgtattac ctttaacaaa caaatacaac tgacttttat agtggttttt tttttttttt 215700 aagtttggca ttgatcccca ttgggtagag tcttcacaaa aaatcctaat gaataccaac 215760 tatttgtagg tgactagctt gaccagttga gtgacctact gtctggagaa aggggttggc 215820 ccagcagtct atagttcaga taaatgaatt tgtgggaagt gcctgaaatc aacggtgaag 215880 ttgctgactg tttaacagct ttaccttcct ggacaagtca agtcatattg acgcagaggc 215940 tcagctctca gccctggaaa ttaagctgga gagctgccag gggtcttagt tctcaggggg 216000 gacccacatt tccaaatatc catcttccat ttgaaacagg atccacatta ttctagcaga 216060 aagtatgtta tatacattac tatgaacagg aaattccagc ccacagagga agaagtcttt 216120 cagagaggaa gggccctaga gcctgaggta tgtaactcac aggtagaatc acccatttct 216180 atgtataatc atctttaatt catgttcttg tacttttgaa aattaattga tgttttgaga 216240 aatataaatg aattttttga tatatttgag aactctttga tgagaaaaaa aaaagtgggc 216300 catttttaca gaacttgagg ctactggccc atgctaaaat gcagatgatt cacttggcac 216360 aaacaggcat ctgagttgtt gttttttaag agttatccga agaggatgtt ccactacctg 216420 aattataaaa tccaggattg ctattaaatt tattgttgtt ctgacttaga ctgtatcgtt 216480 cagctccact aaataaagct tcttttcaaa aggcagtgac cttttctctc atcaggcgaa 216540 ataaaaaaca aatagcaatg tactttcaaa agcatcacta cctttgttga gatttcctct 216600 aattcaaagc cctgaaatcg agcaaaaaat gcattatcgt tcctgcaagg ctgaatgaat 216660 agagaaatgt taaaataaaa caattaaaca ttttacatta gtttagaaag ttccatcctt 216720 gtgtggtttg ccatgagtac ctccttagtg aggacaatat atttataacc tttcgaatgc 216780 tcagtctcgt atgatgtttg cattctgaca tttggtttta taacgtaact ttctttgcca 216840 tgcacttata ttaataactg tttaagtctt aaggaatagt ctttagttta gtgctactta 216900 ctacagaaaa aaattaaacg gatttaataa aatacataga gatagttttt ctcttatcat 216960 tttaaaagaa tcatttaatg actataaata caacttatat actacttaca tatatatata 217020 ancactatgt atttattaat ctgcaattat gtaaatgaca ttagctggat tttttttcct 217080 gaaagaaagt gcccctaaga attcacgcat tcattcgaga aatatctctg tagtgtctca 217140 catgccaggc atttcacacc atttgctttt tcccatttgg aaagttctcc ttttataatt 217200 attgttccat aggttagcca gctattcagc .aactttggat aaggtcatat tatttctctg 217260 cagctccgca ttctgggcag aactagcaag acaccctgta cactgctggg agggcctgag 217320 taccttacag cgntcccctg gacctttgag ctcagctcct cagtggaaag ggaaggtgct 217380 ggactgaccc tacagatgag agaaagaaac gacagagacc cttgcagcct agggtttgtg 217440 ccaacccctg agatagcagc aatttttttc ttagcatttg gtatgaataa ccccaagttt 217500 taagaaaata gagtatgaga atgaatgtca taaatattta tctttgcaat tctatgaagt 217560 ctgcctggtt attgttggct ttttcttaag attttcctga cacttaaaaa ctctgataag 217620 ttagttgaaa gactatttgg aaataagcta agtagataga tgaaaattaa ctgtattcag 217680 acaaccataa actaaggaga caagatgtgt agatatatgt ttttgcataa aacataaaat 217740 agtaaagatt taaaagtggc aaaatataac taaaacaaaa ataatatatt ctaatcacat 217800 ttttagatag tacctgattt gcggtaatca aaatatgtta tattttattg agatagcata 217860 tgatttatag attgttttta gttaagccca aaagtgatta taatagtgtt atggattaga 217920 agggctacta ttgagtttta ccaaacagat gtgggaagtt ttttttaata gactattttt 217980 tgagcagttt taggtttgcg gcaaaatgga gcaaaggtac agagatttcc catgtacctt 218040 ctgcccccac acaggcacag tctccccaac tatcaacatc cccatcagag tggtacattt 218100 gttacaattg atgaacctac actgacacat cactatcacg ccaagtctgt agctgacact 218160 agggttcact cctagagtac tatagtctat gggtttgaac aaatatgtga tgatgtgtat 218220 ctatcattat aacatcatac agagtaattt gagtgctcta aaaatcctct gtgctccacc 218280 tattcattcc tccctcccca caaaccctgg caaccaatga tctttttact gtttccacag 218340 acatagaaat gcacatagaa atacatagat atgtgtctcc atagacatgc attgatgttg 218400 atggcagctt tattcctaat tgccaaaact tggaagcaac caagatgtcc ttcagtagga 2184 60 gaatggataa gcaaactgtg gtacatccag acagtggaat aattattcag catggaaagg 218520 aaattagata tcatcatgga aagacatggt gtaaacataa atgcctgtta ctgagtaaaa 218580 gaagtcagtc tgaaaagtct acatactgta tgattctaac tatatggcat tctgggaaag 218640 atagaaccat ggagatggaa agatatctta acaaggtctt tcttttgtta ttttgtcact 218700 ggagagtaaa gtagtaaaga aaaatggaat acatatctgt tgaaaattgg ccaatgcagt 218760
- 182 -
008252
tcctgcagca tttacaaaat ttcactttta ttgtagtaaa aagttcagcc tttgcattgt 218820 aatttgcatg tttcggagtc agtagttggg ttactaaatt tgaagcccag tgaatgatgc 218880 ggggttgcag acatttttta tgctgaaatt taatagatgc acgaaaggca tggatttctc 218940 atgagttaat ttttcttttt tgtttatagt atgggtataa gtgcgtaaga taaagacatt 219000 caaggtttat tttattttct gcctacnatg aagttctggt cgcccatgta tttacatgcc 219060 tttctatgaa aacattttta tgaataacac aagattggga agaactaact ggcagttgct 219120 atgaaagagc cagatccatt tactcaggat agggctgact cacaaaggag tggggtatcc 219180 actaggataa aaatgcagct ttttcctcat ctcagcaaga ggccattacc gacgagctca 219240 cccattagca tccgctgttg tctctacttg ggaagatcac attgtcactc tagtggagtc 219300 aggtaagagc catttccagg aaatactcat tatctattct cttagttata cagtcatagt 219360 tttacataat taccactgaa agactat Cut ectgttgtet gctaatgtga ttacat.aca _ 1 .-4 2u ttaaccaacc ttggataata cttttaaatg tattacttgt ggagttcaag atttgagcaa 219480 aatccctcaa atgtaatgct ctgcaaagtt atactgcagt tcctttagat ggtaattacg 219540 tttaatacca gacggtattg tgtaatctaa cttttctata atgagtgaaa ataatttgaa 219600 gactcatagg cctctccctt tcattacaga atgtataggc tttttccaca cccttgttct 219660 gggacattaa gaaagaagac atggagacaa agaagaaaag aaccggggac cccctgctac 219720 tgtgtctata aacaactagt ggtgtttaaa ggctaataaa gctccaaaga tctctcttat 219780 aaccataatc tttgggccaa ttttaaaata ttttagatgg agaaatgtca agaaaaatag 219840 agacaatttc aagacatgat tctctttccc caacgtccat aaaagattat atatatatat 219900 atatatatnn nnggctgtca tataaggagc aattgaaatt ccacagcaca aaggcaatgc 219960 agggggaaaa aaaaggatca atctttcata ttattttttc tcaaaggctt ggcaagaaac 220020 caggggtaat atttttgcaa ctgggaatgt gtgtttgctg aagaatattc ccacatttga 220080 atcatcctca ggggtcctca tcttgtttta ctttcaaagg tagacagggc ataacattaa 220140 ccccaactgg gaaaaggaaa atgcctcact gtaattctcc tccagggaac aggaataaag 220200 ggattacata tgcctgcata atgaagaatt tcctcaccca gacaagacaa aagacttcat 220260 tatttttcac cagacacttg aagtcttgtg cctcccagtt gcagaagctg aggaggcagg 220320 ccagtttttt atatgaagcc actagatgga gttcctaaga aactggcctt ctagtacttg 220380 ccattgtgaa aagatctagg gaagatgtta aaaaccttgg tacctgacac tacccagtct 220440 ttcctctaag aaaagtgaga ctgtccctga agatcacagt attcttccag taaaattagc 220500 cttgccttta ctctgggaag caaataaatg agcattttct ttctgaaaat gcacctcctt 220560 tgtccttaca tgagaccaaa aggcatctca atactaatga aaaatgtaaa gtggcaaaat 220620 ataacaaaat ggaatattca agttcttctc cttctgggta ggtctgttac ttcgtaactt 220680 taaggatgta tgcatctcat ttcttatata aaatattgga agtctcaaat tttgtagtta 220740 ctcactattt cggcttgcaa gtattagatt cctgtaagag gaggtatatg gagactatgt 220800 tcccagcaac agatctgatc tccagttaaa gaaattgaac taagttcacc tgctacagcc 220860 tgctctgctc cctcttggct ttcaggcttc cctaatagct ttcacataca acatagagaa 220920 agangtatga agtttttagt cgtaagaagc aatgtctttt ttttttcatt actgtctctt 220980 ctagtgtagg tatgcagccc attattcttg agtggcatca tattctaact tgagataaaa 221040 ttaagattat ttaacttgcc cctttaaaag tatattttaa acacatgctg ttttgtccgt 221100 gattattttc atgcttcaaa agcagggagt gatcagaaaa gaaaatattt gatcttcacg 221160 gaatttcaag gttcattcat tccacaaata tttattgagc acctactgtg gataagagct 221220 gagaaataat catgaccaat tttaaagaaa accctactct cttagagctc tttggagcat 221280 ggcatatgtg acgaactaaa agaacaaaga aaatggcatg gagagaacga ggttcctcct 221340 ggtaaagatg agaccagaaa gggaggttag agggacacta aacggggctg tgcaagccat 221400 gctgctcgtt aggcttagtc tttttaaggc agtgataata accgcattcg tgatctattg 2214 60 ctgcaggaca aattactcca aaacttaagt gatttaaaca acacgttttt catctcacag 221520 ttttagtcag gaatctgggc atcccttagt catgtctctc tccaagctgc atgcatttgg 221580 acttgaatgg gaagagcccc actcaatcgc atggttgtta gtggattcag ttcctcgtga 221640 gctgtgatat gaaggcctca gttccatccg gtttgctgga ttcctcccca agtggaactc 221700 tccgtagagc acctcacaat atgcagcttg cttcaccagg gcaagcaagc aagatgggaa 221760 gagcaagtca gcgagagaga gagagagaga gagagagaga atgaatatgc tatgtagagt 221820 gttataacat ccaccatgac gcgggaaaag atacaacagg aaataatagc aactaaaatt 221880 caaagaaagc gttgatgttt ccaaagcact gtcacattca taatcatctt tacttcttcc 221940 agctccctgt gaagtcagaa ggaaaggcat tattgttctc tgcattttac atatgggaaa 222000 tggaggctta gagaaagcac atcacctgtc taaggtccca cagcttataa aagctgaagt 222060 cagaagtgtg tgcttttaaa gcttatgttt tctcaactca tcttctccat taggcttcca 222120 gacaaaggca gaactttcca tcagcagctg cactgcaggg tgcacttctt tgaaccatga 222180 gaggctagca agttagggat ggggtcacac agtccccacg cacctgccgc taccctccct 22224 0 actcacccct ccccaccttt tcacttactc attctgttca tcaggcagca tgagggccag 222300 aaactgaact tcctaggaat gggaggctga gtgataaagt ggtccctaat caactcacag 222360 cctagtaagg ggaataacta atgataacaa aatgccatga gcgttaaaca agcttggtta 222420 ataacatact gtaggaacat ggagtataaa acaagtcttt ttttgtgctt tcacataggt 222480 gaaatattca tttctcattt catgttactt ttcagagccc atttatatca gtctgtcatt 222540
- 183 -
008252
atactgtgca tgttaaaaca ctatttggta tttatttcat ggtttgcctt actgtatatg 222600 cttatctata gtaacattgn tattcccttt aaaaaataat aaagcaaact tttaccatgc 222660 ttttgtatga acctgggcac attggattag agtatatgta acctcttagc aggtctgatt 222720 gtgtccaact gaagttcata gctttctgcc aacactgtta ttttccaaaa tagcaaaatt 222780 tcttacatga ccaacaaatg tgacaatggc ttaggctgta caaggctgtt tcattatgca 222840 gaaacgtcct atcatgggaa tctttctata cctgtctcaa tntccaggtg agctctaggc 222900 caaagggtca taaaacttcc ttcccattgc cttgctcctg catccaccgt ccaacctcag 222960 gtttataact tccatctgcg gtccttccct cattcaccag gaacctgtgt gtggccagtg 223020 gtctccttgt ataatggaat aagatttttc agaatgttct cgttagacat atttatatat 223080 ctgtagaaaa gttgcttcat gctgtttagt aaatgaaaaa tagtgattat ttagggtttg 223140 tttccaagaa tacatttaca ttcagtgaat ttgtatgatt tttcatagat attcaccata 223200 attatcttca tccacattaa aagcattttt aaggacttaa atatgacata tttagtaagt 223260 tcttatataa tgtattacta tataataagt tcttatatga tgtattatat aagttcttct 223320 gtaatatatg tgttatattt aaatacttaa aaatgcttct attatacatg tatcataaga 223380 gctgctattt taagtgcgct aagcacatac aaatcttttt ctcaaagatc ttaattctca 223440 gacagatggt aatcatattc aaagccattc aagaaatgca ttttaagaaa cataaatgtg 223500 aaaataatat gtaaaaaatg gcagaattgt gtgttcaggt gttgagcaaa tagagtatca 223560 ttagatttgc atatcataaa atcattgcat tttcaacctg tgagctatct ttcagagcaa 223620 ggctttctct tcattttacc aatgaggaag ttaggcccaa agatcactca actacttcat 223680 aacagtgtaa cttctggcac acaggtcttt taatcccttg tgttattttc ttgccactta 223740 tcaactatct caagggaatt cctgtcattc ccagttggag aaaattttct ggagaataat 223800 ttttttttct caccaaaatc attcacacca caggtgttag gccacccaat tgtcttcact 223860 cattagcaan atcagaaatt aacacaagtc cagttattgt ccaaaaagaa catgttttta 223920 aaagtcttcg tggtttaaac aagtggtaac tggttaccag taagctgcaa gcttcagatt 223980 gaggtttctg taggtaataa ttccaaaaac tgtgtgcttt tttttttttt ttgaactgtg 224040 gttttaaaaa caacacataa catttaccat ctaaaccatt tctaagtgta cagttcagtc 224100 gtgttaagta tgtttacatt gttgtgcata attccagctt tagttacttc tctttatgac 224160 tcatttttgc ttgtaagctt atgttttcct atcttcctaa agttctacaa aatctccttg 224220 gaacatatat ttaatcattc caggagcctg agtggacaaa tccttcccaa agggggttta 224280 ttagaaacct tgtttaaatt caaaaccgac atcatgattg cctgtgtgta ttaatctgtt 224340 ttcatgctgc tagtaaagac atacctgaga ctgggcaatt tacgaaagaa agaggtttag 224400
*.____---I.*.-.____J_______________л________---_4-__------. Ш Л Л СГ\
LyaaL-i. Laua yLL-uauyuy yu-uyyciyc-yy uuivduocii.. didyuayauyj у иус-ас-у y\~c- --ччиу
cgtcttatat ggcagcagac aagagaagag agcttgtaca gggaaactcc cctttttaaa 224520 accatcagat cttatgagac taattcacaa tcacgagaaa agcacaagaa agacctgccc 224580 ccatgattca attacctccc accgggtccc tcccacgaca catgggaatt caagatgaga 224640 tttgggtggg gacaaagcca aaccatatca ctgtgggtag gctggccttc tgcttatggt 224 700 gtcctgatag aagctctacc attatttttg gaaaggaggg aggaggcaga aggaggaggg 224760 gcaagagggg agctttctgt ttattttcca .gcccttcttc atagctgtga tacttctgct 224820 ttgtaagtgt tcttgacgca gagcgtaaag ttcattttcc tttataatta tacgttattt 224880 gctgtatttt gtgttttcat tnnggtgttg nccntttaaa ataataaaag taatgagcac 224 940 ttatgtgtta ttcatctcaa gtgtacaaac catgcattta tcttgggctc cttttttttt 225000 cctagagctt gcacccgaca gcgcatgctg agcggatcat ttgaggggca gcccgcaaag 225060 gagaggtcaa tcctcagcgt gcagcatcat atccgccaag agcgcaggta aatacttggg 225120 aagacagggc ttcagagact ctaaaaaagg ggggttttac aggaaatggt cgctgtacac 225180 agtcacggct gtcagccctg gctgccagac aggcatggct gaggaatcgc gttctatttg 225240 ctgtttgtta caataatgaa acacctaatc agatccaaag attcaaaaaa atctctactt 225300 cacaatcctt ttccttagag atggccaaat tctcaccttt aagatcagaa ggaaaaattc 225360 tgaattttgt tagatgggat caaagacatt tggagagagt ataagcttct gctatgaaaa 225420 gaaatcatag gcatttgtgg cgttgtagca gaaaaagtgt tttattttga ttttatcatg 2254 80 gtcactgctt gaaaggccag tttgatcttg agatgtatta accagtgcct gtggttgttt 225540 taggtcacta agacatggat caaacagcca gaggatcagc aggggaaaat ctcttgaaac 225600 tttgactcaa gatgtaagtt ttaagcaatg ctttggattt cagaaacgtg attatgaaaa 225660 tgtatttaaa tgactgctta gacaatgccc agtgtctttc tgctgcattc ccatgtctcc 225720 ttaagacttc ataccagagg gaatcaggaa actcaggata tgaattatgt agccaagtat 225780 cagaagtaac tgttaacagc agaaaactcc agtcatccca cacaaagcac atgtcttagt 225840 taaaatagta acacaaaagt gtcattatca gttggatttg acttgaaatt aaagacattt 225900 taagcattgt atataggatt gatttgcatc attgactttg aatattcact gagaatcgaa 225960 tattctagaa tctagatcaa gggtctataa tttcagggct ttatatatta ggaagtgaaa 226020 ttttatttct agaagaattt tcctgtcaag gactacctag tatttcccag gaaagctttt 226080 tgcttttaga ctctaagtca tggatttatt tactggctct ataaatagtt atcaagtgtt 226140 tgctctgtgc tgggttctgt tttaaggaac gaggagcagt ggggtaataa gatagactca 226200 gtgccctcct ggagcttaaa ttttagaata ggagacagat aataagttca taaaaatata 226260 atggaatttc tggagtgatt tctttttatt ttccatcatc tcttcattac tgtgacagat 226320
- 184 -
008252
ttgctttata atgtaaagta aaatgaagtc atgtaaataa atcaaaggtg gggatttggg 226380 ggcagggaat tttagatacg atggttatcg tagacccatc tgcattatcc cggagaccca 226440 aatgaaatga aggagacatg aaaaaaatgc agagaagcca agcgttatat ggcccagcag 226500 ctataccatg caaagattac aatgaaaggt ttgggaaatg catattaaat aaccgtaatt 226560 atgaagccct ggtaaaaaga caggcgttag gttgaatctg gatgaactgg cttaaaaagt 226620 aatcttgaat gttcagagcc aaggatggca cttgagaaag gagggctagc aagagaaagt 226680 tagcaaagcc ttggggttat ttcgtttttc tctttttcac cacttatctc ttatttcttg 226740 agcttttgga gtgcttgcat actacatctg ctttcattct gtagaaactg ctgttttagt 226800 ccaagtacat ggtttttatt aagtgttccg ggcaaaatca agagcgagaa gttggcaatg 226860 agaacacctg atatcaccaa taccctatag acatggttnc tagttggcac agagnctctg 226920 tttaccacca tgatttttaa tatccatagc tctatctgat tggctaccat attgttgaca 226980 tagaattgcc atcaaatcca acatatggcc tgcgcaactt agaactgcag agtcagccat 227040 attgcacgga gaacattttc aggtgaaaag tcaaagaggc aaccctcatt caaagcgcct 227100 tcaatatgtt tcaaccgaaa tgtacaacct acttaagaat caaatcagaa catgtctttg 227160 aaaataatgt gtttaaacat agacagcaaa ggccctattt gaatagtctc agtgccggag 227220 cttacttctt cnnagagact tcctacccta tttttcatgt agaagtatag taaaatccat 227280 ctcccacctt ctccatagca aaatgccatg gggttctgat catttccaat aaattcttat 227340 aatgtctttt ctcccacaaa ggggagattt aaattagaga attttaactt tttcacttat 227400 tcggaatgat agcangacac agataattaa gtctaaggag tgctttctgt aaaatctact 227460 gagttactgg aactctggcc ttgcaccttc catggggtcc atctaaaggg ctgtgaaggg 227520 cctgcatggc ctgctcacct ctcttagctt tacccacact ggcatcctgg ctattccaca 227580 tgtagacacg ccaggcctgc tcctagctct ggaagaacac atttctgtag tcctaccaca 227640 gcctgcaccc tcacctcctt ctagtctttc ctcaaatagc accttcatat tgaggtctac 227700 cctgacctgt tcatttaaaa tcataatctt ctagcctgtc tgtgtctctc tatgcctttc 227760 acccattgtg attttttaaa aaatcggatc actaagcatc ctcttacata cttattttga 227820 attatttttt atctgtctcc cactgactag aacatcctat gagaataagg atgttttgtt 227880 tccacttgcc atatcctgca cactagaata gtgcctggca cataatagga tttcaatcaa 227940 tatgtgctga atgaattact ttttagagga acaaatactc ttgctatgaa gactgtggcc 228000 attaaatatg tgcatttaat cgtatacata ttttatatac tgtaaattta tatatttaat 228060 gtaagtatat acatttactt taaattacat atttaatgta aatatatacc tttagtataa 228120 atatacataa ttataaatat atacatttca tatagatata tatttattgt aaatatatac 228180 ttagtataaa tatacatatt taatgtaaat atatacattt agtgtaaata tacatatttg 228240 ttgtaaatat atacatttag tataaatata cattgtaaaa tatacattta atataaatat 228300 ataaatatat gtttaacagt aaatatatgt aattaatatt tatactttat attgagggag 228360 atattagttt taagtttttt aactgataat atattttgca ttcaaaaccc tcctgtttta 228420 acacaccccc tgttaattta ntttcntagc attccaatac agtgagatat agaaatgcac 228480 aaagagaaga cagtgaaata aagatgattc aggaaaaaaa ggagcaagca gagatgaaaa 228540 ggtacaggtt gctgcagtgt cccatggctc tcattcggga atggcaaaat ttcccttagc 228600 ctcattctcc catgaatttc tccttcaagg aaagtgcaag aagaggaact cagagagaac 228660 cacccatact tcgataagcc actgttcatt gtcgggcgag aacacaggtt cagaaacttt 228720 tgccgggtgg tggtccgagc acgcttcaac gcgtaagtac acttcatttc agccaggtgt 228780 ttggcctgag ccatgcaaac agcaggggtg ttgtcatatg aagaagaagg aacgtgtaat 228840 cctaatgggg tcacaaaata aactgcggac taattaatca tgctgctcct ctttgctgaa 228900 cacccgacca ggtggaaaac aaaggtcgca agtagttaac atttatagaa aactcgcatt 228960 gataaaacac aaaacagcca ttttcgtttg tgcattttaa cagtttcctg atacacttat 229020 atcggcatta ttaactccat attttatttt ggaagtactg agacaaaagg agactaaagg 229080 acatggtgaa aggaaggtca ttgtccatgt cttccatgag gcttgtagtt cctttgtggt 229140 aaaaatacct caatttgttt tttggagaat aacgtaaagt tgattagtgc tttcattacc 229200 aactgttata agaaggaaac ccactgttca ctgtctctac cctaccaaca tggaagaaat 229260 gtgtaagaag ccgtaagtag agtggacatt gaagacacta gttgtggaca cctaagccaa 229320 gtttgacagg caacaaatgg atgaaatgga tttttgtcaa gcatacctgt atnagtccat 229380 tttcatgcca ctgataaaga catacctgag actgggtaat ttataaagaa aaagagattt 229440 attggattca cagttccaag tggctgggga ngcctttcaa tcatggtgga aggcaaaagg 229500 cacatcttac atggcagcag acaagagagg gaagtgaaag cagaaacccc tcataaaatc 229560 atcagatctc atgagactta ttcaccacca caagaacagt atgggggaac cgcccccatg 229620 attcaattat ctctgactgg gtccctccta caacatgtgg gaattatggg agctaccatt 229680 caagatgaga tttgggtagg gacgcagagc caaaccctat cagtaccttt aagtaaatat 229740 tctgaagaca ttaagagtca tggaggaaat gagaaaactt tccatgttcc cattatgtag 229800 ttggagtgtc cctgatgcca tcgtttaagt aaattgattt ctttgttatt aattagtagc 229860 atatgataat cactatctgt tatggactga attgttcccc ctccacaaaa tccatacggt 229920 agagtccaaa ccctcagaac ctcagaatgt gactgtattt ggaaatagga attttaaaca 229980 ggttaattaa aatgagatca ttagggtggg ccctaatcta atatgattgg tttccttaag 230040 agaacatttg gacacagaca tatacagaga gaagaccttg cgaagacacg tagggagaag 230100
- 185 -
008252
acggctctcc acaagtcaag gagacagccc tggaacaggg ttttccctca cagccctcag 230160 aaagaaccaa ctcagctggc atcttgatct tggatttcca gcctccaaaa ctatgagaaa 230220 ataaacttat gttgcttgag ccatccagtc ttaagcacca gtggtacttt gttacagcag 230280 ctcgaggaaa ctaatacaca ctattataac atttcaggga tggaagagac ctcagggacc 230340 actcggtgtc atttgtgtgc cccctccttc aacagaggag gacatttaag cgtgcagaag 230400 ttgagggctt tgctcaggga cccagctact acctggctct ctcttgattg ccagactatt 2304 60 gttctttctg ctgttctata aagactttca caatttaaag caactgagtc acaattatta 230520 aaatcttcca tgagttttca aagtaaagga agaaaatgcc attttggaga ttgatttgat 230580 cagttcttga agtacgtttt ttttatcttg aattatcctg ttggctgcct gtaccttaac 230640 atctcatggt taattctcca cttcacttag tgtgatgtaa tttccctttt atcagcaagg 230700 cagctgatgt tgaatacaat tgatgaagac tctgttgtaa ttggggacac atacacaaag 230760 actgtaagca atctcattga cagtgctcac aggcttcctg aaagtagaaa caacgactct 230820 cccttccaag aaattctaaa taaatcattc taccacatca cagttaaatg cagggggaag 230880 aagtctattt aaattatgga gtatttaatt aaataatctt gaataactaa cattcttgaa 230940 ctattaaggc aaagatttca aatgagtgtt tttaaatgaa agtcaaaact taattttgta 231000 ctacccatgt cagaaaattc tgaacaaagt cacaaagtct aaaatcaagt attttgagaa 231060 atataaaact ttattttcat aagcatcaac tgcaaattct ttggattttt tctttcatca 231120 atgttctctg acctccagag ttacctacag ttaacatatt ttataatgga cattgtagag 231180 aggctgtaaa agagatttta ggtagatgag atgtttgcaa atatgatttt tagcaagtta 231240 aaacatgctt gctttgttgc agaattttat atatgtgttc tcttacagat ctaaaacaga 231300 ccctgtcaca ggagctgtga aaaatacaaa gtaccatcaa ctttagtaag catcaccaac 231360 ttcattttcc atgcacattt aaagttttca tgtactattt tatgctgcat acaacgatta 231420 aaattctctt ttattttctt gctatatagt gctatgaaat agatgattgg ggaatgatgt 231480 ttttaaaata ccagtcatgt tgatagagcc acagaagcca tcatctctaa ctcttagaag 231540 cctttcctgg aacctttatg tttctcaatt ttgtttggtc tttggcagtg atttgctggg 231600 attggtcact tacctggact gggtcatgat catcgtaacc atctgctctt gcatttccat 231660 gatgtttgag tccccgtttc gaagagtcat gcatgcacct actttgcagg taccgcttac 231720 cgctgcaaaa tctcagctta caactaggag gtaaaatact gacctgctgt ttttccgttc 231780 attgtaacca aactgccttt tgcccgtttc agattgctga gtatgtgttt gtgatattca 231840 tgagcattga gcttaatctg aagattatgg cagatggctt atttttcact ccaactgctg 231900 tcatcaggga cttcggtgga gtaatggaca tatttatata tcttgtaagt ctttgcttat 231960 tgcctaaatg aaaaatgtaa tggttttgta aaatctcctg catttcttgg tataagcgca 232020 agaggtatga gttacagagg cttagattcc ctaaccgaat tcttaaatgg actctagagt 232080 agttcattat atgcaaataa gggccatgca tgtaaaatct aaattaagag catcataaat 232140 atctatggat agttatattg ttcaaataca ctaatcacaa ttttatgtat gaatgagaca 232200 tacattaata aggtctaaca tggcaaatct agtttgcatc ccacaaacct tatggcttct 232260 atactaaaaa aaaaaagttt gcctcatata aaccatgtta ttgattatga gccccttatt 232320 gctgaaagca aactaaagtg attgtgattg .tatctctctc ctgattccat tgcataaaat 232380 acctggctat agcagttgcc cattcaactg tctagtaaaa ctcgctggaa aaccatagaa 232440 atgggctcag agaatttttt atttttcctg tatgtccaag gaggcatgaa atcaatgtct 232500 ttgcagagac aacaaggaga attgtgatca ttaacaagta gcatgttgca ggtcattaat 232560 aaaatagcag taaccttgat aaaaggaatt ccagccagat cgacatcagt ggagcctcca 232620 gagtagtaag ttaaaagaag aggcagaacg cactggtgta cacacacaca cacacacggt 232680 gtggacaccc ccatttcttt cctgcataca catgatgact ttcctttgag gtacctagca 232740 agtctagatg aggtttgttg tttaaagtta acagatggca cgtacaacca gtgagtggaa 232800 tctctgctaa atgaaaagtt gtggccagtc ggctgtcaga aaatgtaaat agtaggggat 232860 gaattgtata aattccagag atcatttgtt cccctttagg tgagcttgat atttctttgt 232920 tggatgcctc aaaatgtacc tgctgaatcg ggagctcagc ttctaatggt ccttcggtgc 232980 ctgagacctc tgcgcatatt caaactggtg ccccagatga ggaaagttgt tcgagaactt 233040 ttcagcggct tcaaggaaat ttttttggta tgtgagaatt atcctttgat tccagttcac 233100 agtagtccac ctctaatgca gctaatgagg gaaaagtgag tcttgcttat tgaggtcaat 233160 tcaatagttt tggttattgc cagagggtaa tggaggcact aacaaaacac aatgcacctt 233220
гяяягя PT'T't' ar-*- -•=¦ t- лп/т i-" a -*t- *¦-"¦• rtrtr*(tm) f- a f- frarth t- +" a *-¦*+¦ a =_¦•¦* pa г" р|*ааалапая 9 ~ < 4 9 Я П
-----------.- -.-.-.WW---. _w_ WW-- - W 4. v.--.-. ---¦- - "
gcactctgag atttgaaaga gttcntatct gctgactctt tcggtactaa cctcttgact 233340 ctaattccta ctctgggttt tagtttcctc ccatctgaaa atgaaggata agaagattca 233400 acacngtgta ctccacaaat gggattagga attcatgctt ttgggctcct aatctcattc 2334 60 tgtgtgttcc tgaaataata tagcacagaa tttgtcttta gatctcagga gntgttaaca 233520 taaaacaact ttaaaaatgc aacatatagg tataacccac ttcaattaac ttcagcatta 233580 cagtaatgag tgattacaaa ngatgattga gggggcaaaa cgtactttnt agctgggcaa 233640 acattgattt agggtcttct gaaaacaagg tcagagataa aacaacaaga aagaggctca 233700 ttgttcacaa tctgttacag aaagatcttt gccttacaaa acagtgatca aaagtttttt 233760 ttattattga tgaggtctgc ttgtgcatga gaagcatgaa ttaatttaca taggcttgtt 233820 ttgtatcttg ctttctagag acttacctgt gatgagaaaa cagctgtagt tgtagttgac 233880
- 186 -
008252
acaaatgtat tttaaagata gattgtgatg ttactagagg tatatatatc attactgact 233940 ttttttttct ttttttttga gacagaatct tgctctgtcg cccaggctgg agtgcaatgg 234000 cgcaatctca gctcactgca acttccacct actgggttca agagattctc atgcctcagc 234060 ctcccaagta gctgagacta cacgcatgtg ccaccactcc cagttaattt tttgtatttt 234120 agtagacacg gggctgcacc atgttaccca tgctgccctt gaactcctga cctcaggaga 234180 tccacccacc tcagcctccc agttgctgaa tttctttttt aagatgggtt taaaaattct 234240 tgttttcttt atgcaaagcc ataaaacagt gactcttcac acagctggaa ttaaaagaaa 234 300 atatcacctg actgctaatg tatatgaatc ttttgatcaa taataaattt tagaggagaa 234360 tttgtgcctt tccctaatgg tggtcagtgt gattttagta cacttaggta tatgtttagg 234420 ttattcaacc agtgcagttc acttgttcca tattttgccc tctgccactc gtctctgctg 234480 agaccaaaga agtcagccag cagagggagc atgagttaat taacagattt gctcttcagg 234540 actgaattct ctcctctcct ctatgcatag aacattctcc taacgcacac cttcacagtt 234 600 acaagacagc taagccactg tcccgctcat ttgtgctctg ctaataaaaa tatgaatcca 234660 ggccgggcac agtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gagaggccca ggcgggtgga 234720 ttgcctgagg tcaggagttc aagaccagcc tgaccaatat gatgaaaccc tgtctctact 234780 aaaaatacaa aaattagctg ggcttggtgg cgtgtgcctg tagtcccagc tactcgggag 234840 gctgaggcag tagaattgct tgaacccagg aggtggaggt tgcagtgagc tgagattgca 234 900 ccattgcact ccaccctggg ggacagagtg gcactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 234960 agaaaaaaaa ataaatatat atatgtccat ttgggaaaaa atagacaaaa tataattact 235020 taaacatttt tttcctttgt tccattaaat aaaaaagatc aaggtgttga ttttaaagtc 235080 agaaaagttc aagccatatc aaaaatacct tattccattt tcttacatga aattcatgtt 235140 tccatttaaa aaattcaaag cttgttaatt ttctcctttt gaccttccag taaggctaat 235200 tgtgtgacct atggtggaga agttaaaata tatcatcaaa aacccatgat ttttatacaa 235260 tgttatctta gaagtcctat ttatgtcact gtttaaacca aacctaatat ttagtcttta 235320 acaagagatt taacatttca tcaatttctt tcaggtctcc attcttttgc tgacattaat 235380 gctcgttttt gcaagctttg gagttcagct ttttgctgga aaactggcca agtgcaatga 235440 tcccaacatt attagaaggg taagatgtat ctttctgtct tttgaaataa aaattaaggg 235500 ccaagtgtgg tggcatgtgc ctacaatcct agcactttgg aatgccaagg agggaagatt 235560 acttgaactc aggaggtcaa ggttgcagtg agctatgatc tcaccactgt actccaacct 235620 gggcaacaga gcgagagccc tgtccctaaa aagaaaacaa aataataata aggtgtttac 235680 actcccttgg caagcatgtg gtaccagtgg ctgacaagcc tagtttaaga actccctata 235740
а а a r*r*r*+ a a n -i-,*-*--.*--.*-*-^-. а. а -"/ч-* -v -i-.-.-.*-.-**----* +• a *¦ -r+- -•+¦ ОТНЯЛА
______ __._.y __v-.v-i.____ __________ v.b.v-.-.-.yv.-- __y--.-.у-у- ---у-_-_-¦- -_--__
ctggctagaa aggttaataa gatgaaaagc acacctcaga gaatgtcact cttccctcct 235860 attccagtgt caacccactg ttgacaactt gagygtggtc acccaagatt ccagctgttt 235920 acagctgtaa gctttggata ctttcccttg aggtcttagc taacttgatc cttcctttgt 235980 tgtcacataa gactcatatc agcaaacagc cccatgcaaa aatgtccaag aagcagcgtt 236040 tggttctcac cactttttat tgcttcccca ctctcagctt tctccccatt agaaangcca 236100 gtgcctttac attagctcta gctgcccaga .atctccctct ttatgacaac caacaaggac 236160 ctccacaaag acccaaactt gaatacttgc actacggcgt ttctttctct ttcttcagtc 236220 attggttata agggaaggct agctgctgta acaagcccaa tatttcggta gcttcacata 236280 atgaaatgta tatattgcat cttggatcag ttgcaatata tacatttgca atatatacac 236340 tatatacagc tctcctccaa atgaccactc agggactcac atgccttcta tcctatgccg 236400 ccaccctttg ccatgtcttc agagccttct tcaatgagct ggagataaca gtggagagcc 236460 atctccaact gagtgggctg tgggagaatc tgctccaccc acattcctct gtaaagagca 236520 gagatactgc aaggggggct ggaatttagt tgtgtgctcc agaaaaataa aagggggaca 236580 cagtttggtt aataattaga caatttttgt aatatcataa agtgtcccat tctcttagga 236640 ttcttatgtt acaagtaaat tcataaagta aaccaaccac tgctgatgta taaactagaa 236700 aagcattttc tctttgatcc caataaaatg atgcctcagt tcctaaatgt atatcttcaa 236760 aaggcctact agacctgaac tacattattt atttctagca aatatggcta tctagtatag 236820 attttaaatg atacaaattg ttctctaatt gtgacaaaat acaggtaaca tctttgttca 236880 gccaaaatac attataaatt atattaataa tgagaatttg aaacaaaggc cagactggga 236940 gagacattcc aagagctttg atacacctga gaagacagaa caaggaatgt ggcctgacgg 237000 tcatgccgta tcaaattagc tgataaagaa agtgacagag acctgacgca ttcatccaca 237060 agcttgtgtg tggaaagaag agtgattttt gatccacact gaacagaggc cagaaagata 237120 ataacacttc aggatgaagc ctgctaggaa tcttggatga ctcagtatat taacagtggc 237180 ctggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggcg 237240 gatcacgagg tcaggagatc gagaccatcc tggctaacaa ggtgaaaccc cgtctctact 237300 aaaaatacaa aaaaaaatta gccgggcgta gtggcgggcg cctgtagtcc cagctacttg 237360 ggaggctgag gcaagagaat ggcgtgaacc cgggaggcgg agcttgcagt gagccgagat 237420 cccgccactg cactccagcc tgggcgacag agcgagactc cgtctcanaa nnaaaaannn 237480 nnaaanannn anaannanna aaannrmana aaaccggggg ccctaaaaac gggggggttt 237540 tactttttcc ccttatcccc ccccaaagtt aaaaattggg ggggaccgcc ccccccaaaa 237600 aaccctaacc cccattttta ggggcctttt ttcctttttc caaaaacagg ggggttttgc 237 660
- 187 -
008252
caaggtttaa atggaaaccc taagggaacc tccccttttt aaaagccccc ccccccaacc 237720 aaaaccttta aaaaaaattt ggcccgggaa aacggggttt aaattttttt gtttttcaaa 237780 aaccaaaaaa aaaaggccgg ggccggggcc aaaaacccct taaagaaagg ggacccccgt 237840 taaatttttt ttgaaaaact tccccccttt tttctaaaaa aaaaaataat tccaaaaaag 237900 gggggaaagg taatcccccc acttttaaaa cccccccctt tcctttaaaa aaaaaaaaaa 237960 t 237961
<210> 3
<211> 47841
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> экзон <222> 3895..4001 <223> экзон 28
<220>
<221> экзон <222> 9611..9731 <223> экзон 29
<220>
<221> экзон <222> 9816..9914 <223> экзон 30
<220>
<221> экзон <222> 15776..15869 <223> экзон 31
<220>
<221> экзон
<222> 16382..16488
<223> экзон 32
<220>
<221> экзон
<222> 16697..16771
<223> экзон 33
<220>
<221> экзон
<222> 17934..18053
<223> экзон 34
<220>
<221> экзон <222> 23644..23712 <223> экзон 35
<220>
<221> экзон
<222> 24928..25076
<223> экзон 36
<220>
<221> экзон <222> 25913..26006 <223> экзон 37
<220>
- 188 -
008252
<221> экзон <222> 30767..30899 <223> экзон 38
<220>
<221> экзон <222> 31561..31676 <223> экзон 39
<220>
<221> экзон <222> 34044..34201 <223> экзон 40
<220>
<221> экзон <222> 37493..37643 <223> экзон 41
<220>
<221> экзон <222> 39652..39801 <223> экзон 42
<220>
<221> экзон <222> 41563..41680 <223> экзон 43
<220>
<221> экзон
ylllv Л Л 1 -1 1 1 J.JJ.
<223> экзон <220>
<221> признак ошибки копирования
<222> 45842..47841
<223> 3'регуляторная область
<220>
<221> аллель <222> 31646
<223> 99-79310-29 : полиморфное основание А или С
<220>
<221> аллель <222> 42373
<223> 99-79311-50 : полиморфное основание G или С
<220>
<221> связанный праймер <222> 31618..31635 <223> 99-79310.ри
<220>
<221> связанный праймер
<222> 32080..32100
<223> 99-79310.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 42324..42344 <223> 99-79311.ри
- 189 -
008252
<220>
<221> связанный праймер
<222> 42704..42723
<223> 99-79311.гр комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 31627..31645 <223> 99-79310-29.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 31647..31665
<223> 99-79310-29.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 42354..42372 <223> 99-79311-50.mis
<220>
<221> связанный праймер
<222> 42374..42392
<223> 99-79311-50.mis комплемент
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 31634..31658 <223> 99-79310-29.зонд
<220>
<221> ошибочное связывание <222> 42361..42385 <223> 99-79311-50.зонд
<220>
<221> признак ошибки копирования
<222> 26,350..351,353,356.-357,366..367,371,383,389,392,396,399..400 404,411..412,416,421..422,435..438,440,442,44 6..447,450,455 457..459,461,463..4 65,1805,2175,2328,24 02,2561,4048,4 661,6659 6799,7509, 7534, 828 9..8290,8294,10663,10789,11052,12083,12904 13017,13916,14116..14117,14680,14 971..14974,17093,18448,18669 18767,18808..18811, 18838,18971,18985, 20714,20903,21355..21367 22901,24093,24112..24115,24171..24173,24868..24869,25356,25797 25879,26062,26234,26824,27130,27254,27437,28745,28781,29278,29475 29526..29528,29617,31152,31790..31791, 31796,32011,32262..32273 32296,32415,33656,33719,39140,39142,39343, 3994 4,4094 5.-40947 41948,42166..42169,43371..43372,46709..46720
<223> n-a, д, с или-
<400> 3
gtttaaaaaa aaggtgaagg cctctnggct agattttttt ttcccccctc cacaagggcc gcttgggaat tttggggggc tccgggaatt ccccccttta ttcccccccc ttttgggggc taaacccttt ttggttaaaa aggggaaacc aacccggggg gtgggggggg gccccttttt aagggnntaa ncccgggggg ggnggtttnc nncggggggg aaaannnnan ancccnntcn aaaaaaaaaa aaaaaaaaac agtggcctaa acccagccaa agctgaagat tgatggtgac ttcatgatgc atttatcctg tttcctagag
ttttttcccc aaattttttt gggaaaaaaa 60
caaaaaataa aaacccttcg ggagaaaccc 120
taccaagggc ccggcccggg ggggggggtt 180
caaggggggg ggtttccagg gttgggggat 240
cccttttttt ttaaaaaaca aaaaaaaaat 300
cccccttcct tgggggggtn ngncannaaa 360
antaanccnn aatncccccc nngccnccca 420
cccanannna nannnaaaaa aaaaaaaaaa 480
gagcatggtg attttacatt atccactcat 540
agcagccagc agatgagcat agacacagat 600
cagtgaggtc tgtgcgaggc tcagatggaa 660
- 190 -
008252
agcctaagga aattggcacg ccgaggccga aacttcagcc accaacattt catagtttcc ctcctttgtt tggagcctag aatagtcatt gggaaacatt tttcatgttc aaataacatg actgggaggg agagcaagca gaccgaacaa acttcaggag ttgaatgctt ctaacctgat gaacaaggcc ggggntttgg atcagacaca cccatatcct aatttgtcca ctggcttttc caggaagaca cactacaaca taatcgcaat ctcagataca gtctgtggca gnatgtgtta gaagtaacgt
алаллпа at sirt
gggacagaaa gattaaaatg ccttgaaccc aataaccaaa aaccttttta gtgttcaatt agaacatttg ttagcctcca ctgttctgga aattagcata tcctatggct caaaaatgga cattttatac agtggagttg ttttccaaag gattgcgatt tttctcagtg agatggcaca tggagaagtg aactgcctgt ttagataaag tctgagttca tgcaatggca cctggagaga atattctgaa taactaaaag ctagattata ttctgtatag aatatgtatc taaaactaaa aaccctaaat gactcagcca gtgagacggg ggccaaaaac catcttacta agatcacaca agttgggaag tgttgtctta gactttgtca aaatgtcagt aggaggtcct aagcaacagt taatctatga cttcagggag gtgaagaagg ggaggaagga aggtgatggc ctcacacaat ctcaacagtg agaaatgtaa aatttcgttg tcctagtgcc aatgaggata aggtcaccca accaagatac aattggaaaa cagcnctttc gtagttttag tataggaaaa attgtgggta tttgcattaa tggcattact
__ гчгчп •_"¦_-/*¦>
ggaggaggcc
gaatttttgt
agaaaagaga
gggagaatag
acagctttat
caatggtttt
tatctccttg
cctcaagacc
cttctatatg
atattttcaa
gaataatatt
catctggatt
aagtttctat
ctggctcata
tggttgcacc
cctccacatc
ggtgtgaggt
tgatactgag
tctactcagg
ctccaaagtc
ggcttttggg
ttttctgacc
tattcagaat
aaaaacctgg
gaatggtgtg
tagttttgct
ttggaagata
cttcatgaaa
tggattcaaa
cttatcctga
cataaagcta tcatagagag gcttgagtct gccatgagtg aaagaagaga cagttcctgt atgtgttttc aaactcaaca ccaaaaccct tgtgtccaag tgcttctgtt aatataaagt tgtcagcatg gaggtgggat acacggagca gcatgggctt ctggtctggt gatattatga agtgttagtt gttagggaga atgagaagtg cacaaagtac tccattccta cctaataagt cagactgctt ggcagtgagg caaataatgt ctgaaaaaag aagactggaa agttttcttc aatattctta aaactcatcg
aagaggagac
tgaaatattc
tttaggttca
gaaatgagtc
tgagatgtaa
ttagcgtatt
aaaagaaacc
taaacaacaa
aataaaatca
ggatcctcca
cacttgtatg
gtttccacct
agggacatat
tggtaactct
attctacatc
ctcgccaatg
gatatatcat
catcttgtcg
tcctttgctc
tttgttacta
attccgtgaa
aggtttcccc
taatgtcagt
attttgggtg
tttgtcanta
agagatgtta
gaaataaggt
ctagagaaat
tgccttaaaa
gtttatatct
tttccatttt aagcagaacg attgaaaaga tcaaatccaa acataagagg cggctgaagt tctgttggag gaaaggggga aagtagatac gaagcttcag ttgctgcgcc ctgagcactt cctccctctg gatcaatata gatatagata gctgaggata ccttttgaca aggtgaaatg aaatgtggaa ttctgtccaa tcagaacgtg caaaagccta tgagaagcag cttccaactg ggagtactgt caggaaagga ccttccaagg ggtcacagtg tagaggcagg gcttctgaga ttggaatcct ttctggaacc tatttctgcc accttgttta tgcgaagtac ccatgtagga aaaaactgaa tgcctgaaat gcctggctaa aaaggttggt aagaagagga tcctagtgca gtttttgtta caggtgtaga aagattaaat ggaactagtg tccaggcacc aaggtgggct caggtgggtt caagggacct ttatacaata aaggtatggt tatggaaaga aagaatataa actttatgag caaaacgntt cattgtgttt tccaggcttt ataaattaaa tcatgctggt aatccagaaa ggagacttgg gccaagaagg
т*ч rtr> i- firm a +* rrfr- /-"/"-"¦-r* r^r-a
Ji\v CVJ W - <-)l-|--lU W Y-J > -) l_ "_••_.v*
gtcaaagagg acgtgaagca caagaatttt accatctaca atcatagcca aagaaacaaa tatagatgtt taatttttaa tccacatacc acacaataca cccacttcaa catagagttg tatacacgac agccactttt ctatgtctct taactattac ccccatccct ctaatattct ttttgtctct atagagttca taacatatgg tcttttgtga cttttttctc tgttgtagca cgtatcagga cttcatccct gttggaccac attttgttta tctgtttgtt tttggctatt gtgaataatg cttatataaa attttcatct ctcttgggta gatacctagg gtgttagtgg tttgaggacc tgctagaatg cccaccagta tgtaagggtt ccagtatgag cttgttgtta tctgactttt tggttatggc tatggttttg atttgcattt tccggatggc tgtgcttttt ggccatttgc atatcttcct atttaagtaa tattctcagc atcgattttt tttgctgggt agctgtccac atcactgttg agaagaaaga gtttcctatc ctttatcttt tctcctcttg tttttctact ttaggaagat gtgtcaaaga acttaaattt aaaattgagg ccccgtgttt ggtaagtata tcataaaaaa taaggcttta aataagtatc atatggcatg aaatgatctt aagtcataca gggcgaagcg aaaaaataag agagcaagta gtgcaatgag attatctcag tatttttcta atacttcaga aattaggctt aacaggattt tctgtcaaat ttaaaggagg atctgatgtc ctcataatag aaaacccatt tacactgaag gacttccatt
caccagcacc
ttttgtcttc
aaggtgacgt
taaatccaaa
taaagacaac
ttgtatgagg
gatgtcatga
gtaaacaaac
gcactgtgat
ttgtggcatt
cagcagtttt
ggaaattgtg
ttgagatgag
tacaaagaag
cgaaatcaca
cacttaatcc
agattagatt
tcattcccgc
gatcctcaag
agaaaccaca
aaagcaccat
atgaggaaaa
ggagaagcag
catgcaatca
ccaaatatgt
tctacataaa
tgggcgatgg
ggatatactc
cttttatttg
ttttaaagaa
tagtaagaat
-..Vj <_ L_. \_> V-) Х-} v.
atggcttagg aaacagtgat aaatatgacc aaaaacttcc
- 191 -
008252
attgaaacac tagagaggaa taatcagtga cacagttgat tgcttctaac tttcccttta atattccttt ttctttaaat tgagttttca aagcacttag atcaaagcta gaaataccta gtaccttctt tcttatttta ttaatgacca tgagtgaatc tctcagtctg tgtcattggt gaactgagtg ttctgtcacc ttcatttgtc ctttaaaatt nttatctgtt ttttaagttt tcttttagaa aatgtgtaag aataacaact gagtcacagc acctctgctt ttgtcacaat tgatgttctt ttctaaatgt caaaactctt taaaaggaac agcatttcac ccagctgtac cctagcactc actgttacct ctctttggca tttttctcat atgaaattcg cttttatacg taatccaata gaatgcatat tgggttttta ttttttaaaa tatccaagaa ctgagaaaaa ggattcattt ggggtatgtg gcttcagctt ggagagagag gaatgtgaga catgagaata tcctggcccc actgctgact agaaaagccg tccaatttcc attgaaataa aaattaaagg agcataaaaa ttttcttcca tgagataaaa attaattata gcataaagtt atttatgtta taatttatta atttttatta attcaaagat aatatcatgg aagtaaatgt agtcaggaat agagaacact ggggcatttc atttccttca ctatagagaa aggtagaggg tgcctcccac ctctgccaag tgaggtaccc cagggggatc acttaacgtc agagatgggc agggcaagaa gagagactct tgtggccagg ctgctcatca ccatctggag agcagggtta tctggtgttc ctggagagcc cagtagtcac tgcctagggc cacatcatct gagtcctctt gagccttgcg gcaaagggct ttgtgctggg aaagggtaac cccctccaaa gggtccgtag gtgtgtttcc aggagccaga cttgagaatc acccagagac tgcacactta caggagaaaa ggtgcaatga ggcactcctg ggctggagag ggggttcaaa ctcttgaaca cctatggcca gaatccaatt gtatcagatg cacaagactt aaactccatt cctccattcc tttcaacgac atcccacctc agtcatgtga gaatctcgtg gtggcctgaa gaggatgagt ggaagtgaag aaagtggcca acttttcttc ctttcctcaa accggggtcc ttgagctgct aaggatggga ttgttatatg agttatagga tcagttggat gtaaaactga attactgaaa ataaccaaaa agctctggga cctccccaag aattcagaca gggagctgga acacacttga aggtagtgtt tggagaaaag taaacctgcc agttgtgccc tatagcactc aacctagtcc ataaaaccag ctacatggga tttttaaaat caaagttaat ttaaatgcaa tattttatgg aaggtattat taggggtttc aaaggcaatg ccattctaga agcataagca aatagccagg cattccttga acatcatcac aagtgctctt gtccatttct ccaggataat gtgacttgga ttgtagtgaa atagacacct tcgatctaat aaatgtcatc tgtaaccatg ataacttttt acactttcct tcttaagtaa gctaatcaag agttggaagc tgaaattttg taattttata ttggctaaat tatgattaag aaaataacat atctaggaat acactagagg aatgctttgg taattataat taggacataa
a -I- a +• rm a /¦"•¦• a aff^a гчгч -"/-"•-. _¦¦"" <-"¦• -J, *- +-/-•-
actttcttct gaatcactca gacttgatga gtcacctcag taaaaaggat taaacatatc atggattata aatacagtgt gatttatttt aagaggaggt ctggaatata ggaaaatggc atgcatggga gaaaaactaa caaagtattc aggcttataa taaatgtatt tattgagtgc ttgctcttca ccagctagta tgcttgtcac tgtggtaagg ccctgaataa gcgatggccc ctacccctta ggagcttaaa gtctagtggg aaacagaaaa taaaattaca aataatttna tataatatgc taagggcttt aatgctgcac agagaagccc ctaagcttac ctctggctca cccgaaactc atctccatgt aatgttaagc tacactgtga tatgttctag gaagaaggtg atcaggtttt atagggtcna aggcccaaac aatttggggt accaacatct cagaagggcc tgtacaaaag aggggtccta ccccttaggt ttctttggct tcatcatata cctgcctctg attcctacag aaaggctaag ggtacaatgg acacacagga gaagcaccta accccaacta tgcagggcca aagagaagga ccagatgaga agacacactg gttacctttt gaaggacaac caataggaac tagccaggtg aagggggcag ggtcagaggc aggtgaggag gaaagtctag gcataggttt ggtattacaa gttaaggcaa ctctatgccc aaagctcaag gcaaaaagcg ttggggtgct gtaggaagta cgacgtttct gatttctttt aggagagatg gttgtgtaag atacagcatg ccgtttttgg acaaagtctt tttctgcatt tccacatcca agggcagacg ctcagtcacg tcttcagggt gcccccatgt tccccaaggg aagagcagct ctccctacct tgatcttggg gggccttgga gcacctcctc tgggaggtaa aaaactgaca aaattatgtg gtcagatcta atgtcttagt tttctgaatt ggacaggcaa gattacaata tttcacaaat taaccagaaa aaatgacaac cttttcaatt caaggaaggg tagcaggtaa aaatgacaat aatagatgnc atttgggatt tattgaagga ctcngtagtt acaggtaaag tttcaaactt tgcaactttg ctagcatgaa gaaagcataa gaaaacactt tacatgatta aaactgaaaa agacttattt ttttaatgtg ataaattctt ccaactattg aagtctttga tgctacattt tgttttactt ggtttagtta gaatattttt cacatattct aacttctaga agatctagaa cataacagta gtttcagtgg ctgcaaattc agctaagaaa gcacttctac aaaagaaaat gagcaggtaa ggaagtccaa caccggctct gagaaccggt tcacttgctt gtaaaaaatc cttattcaag caaactgtgg catctgtaga atccttataa cttctgtcta ctgtaaaata tatgaaattt agtggaaaca tcccaaagga aagattgttg gaagcatcca aaagaatata tttgtacttt catacataaa aaaatataaa gcagaattcc aaaatatgca tttctgagtg gggcttttgc actatattaa agaccgtctc cactaatcag ccctaagccc ttaagaacaa atcagtttca gtttaatgtt ttcttcttat atcctcatct atttaatatt caaaaaactt atgaaggcac atcttgtgat tgtctctata gtttaaaaaa cataaaagat ggtagaaaag
- 192 -
008252
tacagaacca gattttccct agagcgttgc ctgtcctgag ggttaaattt tgagaaatga gctagcagnn gggnaaaaaa tgatcaaaat ataatttaaa taggctccaa ggggcctact ctagtcagtg gtccggagct cagttcttca ttaaattcaa gaaatatagt ccatgatttt ccagtgtttg gttatcaaaa tcttaattat ttaaaattag cctctaataa gaaggaaaga gggggaaaag ccactgaaag cttcttctat taacaacaaa aatgttagct aagaaccata acaattaaag aagatgcaat ctagtaaaaa ggatcacttt tataattggg aagagaaaag tataaccatg ttaaaagaac aagaaatgag acatccctgg cccccacaga agtgggagct aaacagtggg tacacctcga cataaagttg gaaactctgg acagcgggga cttcaaatgg gaggaggaag gaaggaggtc ataggttgga aaaattacct gttggattct gcgtgcacta tctgagtaat gggttcatta gaagctcaaa ccccagcatt atgcaataca cccatgtaac aagcctgcac gtgtaccccc caaatctata agaaaacaga aaatgaataa gccaatgagt ttcaggaatc aggaatcagc ggtggaggta gaaagcatac cacccataaa ggggaccaga ctaagagtcc actgagaaga ctcagagtta ataagaaaaa atccaactgg aagagagtaa tttggaaaaa tacatactac aagcaaacac ctcttgccgt ctcagtgacc tctaaatgca tcactacttt ccagccctgt gttcaccatg atgacacaaa gtgaaataaa gtgactaaat tctactctac actttctata ctaacacagg caattgtaat ttatgccttt cgaaagattt tcagttacaa aactatttca aaatccacat ccaaaatcca atgcttcttt gtgcaaatcg ataaaatcat ctgtccagtc ctcagggtaa tcaggacaag gtagaaatgt tgcagaacct ctcaagctag aactagagct gttttacatt gagatcaccc catcattacc taatgaacac aatcaattat aacacattga tgcattgtta tgatttagca aacgaatgcc atatagcgta aaaatgtgtg tgtatacata tacacacata tgtatgtgtg tgtgcacgca cacgtgtgtg tgtatatatg tgtgtgtata tacacacaca cacacatatc ccacactcat gactggaaag ggctacagat atttgccttc gggtgctgct tattggaatt tcacagaaca ttcctgtatt ggaatcgcag ggcgaatcct cggaacttta atttcgacaa tgtgggaaac gctatgctgg cgttgtttga agttctctcc ttgaaaggct gggtggaagt gagagatgtt attattcatc gtgtggggcc ggtaagcgag cacatcgaat cctttgaaca cttcaagagc agctttcatt tgttttgatg aataaccata ttttccttta tgcagatcca tggaatctat attcatgttt ttgtattcct gggttgcatg attggactga ccctttttgt tggagtagtt attgctaatt tcaatgaaaa caaggtaagg atttttggtt tggataccac agggtttagc cttttctagc cactcacttt gagctatttg tttcttttca cacgcggcgt gaagccgctt taaactgtaa tgtgactggt gtaaataatc tctataactg ttttacaagc tccctcattg ctgcttttca gacacattat ttaagagtac agttctcttg ctaaatttac ccttttggta acagtgtcat taattcaccg acaactgaga ggcgcgtctc ctattgttca aattgaaaag aaagatgggc agcaagttat taaaatacaa tagatgaaag tgattcgcta attacaggta atattacttt cactaaatgt aaattgtatg cttctgtgta actcagtagg tgaactcagg attttgatgg gggtgagggg agtctggtag aaatttcaaa atcctaattc acagaaaaaa agattttgtg gcagggcatg gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gcgggtggat cacttgaggt caggagttca agaccagcct .ggccaacata gtgaaaccct gtctctacta aaaatacaaa aattagccgg gcgtggtggc gcatgcctgt aatcccagct actgggttgg ctgaggcatg agaatcgttt gaacctagaa ggcagaggtt gcagtgagcc gagatcacac cactgcatcc agcctgagca acagagcgag actcaaaaaa aanaaagaaa aaaaagaaaa aaagattttc taatttcata tgaacttgac atactttgtg aactcgggaa gcctgttgag tttgtaacag ctctaatgat tagaacaaag gctcacaaat gggaaaatna caatgtagtt tcctatcaaa gtgtgagttt ggggaagaac attctattag cactccttgg agaggggctt gctcatctag gcacttgagc tatgccctct attgtttgag acgcagtctt tggaatcata gtaagggaag tgcatgcagt ttttgagcac acactgtgta ctaagatttt acatattcaa tcaattctca caactctcaa atgcacggtt gcagaaaaag caatgactag tctggggctt ataaggtgtg anaaacaggg ccagaattca gaattggtgc ctattaccgc aggctctgtg attcttcgaa ggcatgagta gaataaagtc aaccttcact ctgcattaag ttgaagctag atctgcctgt aaagcaccgt gctgctcgat gttattcatg gctaggactg attcccatgc gttcacatca gagctcttca gtttgtgttg ctacacatgg gactgtatct gtcattcact gtcctcaggc tcaacgtgag tggtaccagt tagccagtca attgacacct ttgatgtgtg gctaatgagc atgtcatttc attcaggctt tcaaagggtg agatttaaaa attcctcttt tgggccccga ctctacttgg accctcagaa acatgggatg ttagagacag aaagaacagt agtgatcatg tcacccagcc ccttatttta ctcctatcac attcattaac gagatgcttt gagccctaca gtgttgagtt taataccaag cagaaagagg aagaaggatc tttttagatg cctttgagcc atgtaatgca gcagacactg agaattctag aatataagca gaagctaatc agtcaattaa caggagagtt taggcactgc ttgcccagaa caccgttaag aagccgtctg agcagacacc tgatttcagg aagattagaa tgtatcacag ctcacaattc agcaacatac atagaacaac ataaaatgtt cagtaactgg aaataaatgt ataattaatt gcaacacttg agcttagaga agtggctgag gttagcagaa taaccaggga ggtctccatc cagcactgta tttatgttct gcaggtagga aagagtaacg tggcctgttt gggggatctg gggcgtatgt tctatcagct caaatgggca cttaaagaaa ggagaaattg acaagaaatt atattaccaa
- 193 -
008252
gctttacaaa
gaaaagtttc
atctaacagc
tgccagaggc
aaagttattt
aatttccaaa
gaatcatgca
tatattagta
tattaaccta
atatctccat
ttatgtataa
ataattagtg
acactattat
tagaacttcc
agaaaatcca
gagnagaata
ggaaaactct
cccagaaggc
aaacaaaaac
atgagttgaa
cgtcatatac
tttaagtgta
tcaataaatt
aggacacaaa
aataacaaaa
gaacaaaaat
ttgttatagg
atgtatgtag
ggagtggtgt
cactgcatac
ttaaaccatt
cttgatttgt tttctctgca atttatacat tgctcttgac gccctcatgg tgtagagaca aaaatatgtc atatagattt acttgataat gcctattatt caaagtaatt agaaaagtgg tgggaataaa aaatcccaaa aaatcatagt aaaggaaata aattacaaca cataattacc aaaaaaaact gaaattataa aaaaactaat tatattaaag ataataaagt ttaatgatac gctgggtttt aaaaacatga tatagaaaat aaaacagaag tgggagtatt tcaaaaatga tttaaagcat
taattggaga agnttttttt tattcaatca actgaggacc agcacacatc acagagatag ttcttttgaa ttttctgatt aataaacttt cttttagatc acattagtgt tttagcaatg tgatgtacta atgtacaaag gaaagatatt tgagatttga atttgagaat caagaattga ctacaatttg tagaaaatca gaggtatagg aagaatcaca aaaatcaaat agaaagtaag ggtttttttt aacaagaaag tagacttaca cagctcaaca gattgtattg attccagatg gtcagcattt
tatcaattgc ttttttttag ttcaacagat tagtgaacta ttaatagtca aaaatgaggg aatggaaacc tctctactat cagaggtttt ctttcagagt ctatggtggc tgattatcag aagaatgaca caaaaattaa aacatatatc tacaataaac gtgcattatt taatgtaaga gaaatattaa caaaatattt taaatcagta agttaaatat aaagtagggg gaaacttgta aaatcaagtc taagctacaa gaaaaaacta aattagtgca atgtaaagag aattaaagac attttttatt
taaattatgt aaagcagctc gtatttgagc acctaaacac tacccaaagg aatctttagg tctttaaaga gtaagacaat tatatattaa tcaactttcc cagagaacaa aaaagaacaa aaataatcac acaagttgta tcaaaaaatc acaatcaagt ttcaagcaca atgttttctg gacaatacta acagacaaaa attacaaata taatatgtca ggaagaaagt tagcttctat aataaacctc tcattaaaag gaaagaccca gagggtggtg ctatgctgag ttcaatatga tgaatttcag
4- ~. 4- ---. 4- 4-
Luyuaua.aL
tcaaatcagg aacattcata attcaccata catatccatt gcatttgttt ctataaagga aagacactct cataattgat gtaaatatca acaagcatca agatacattt gcaagaatat ttgctctttg accccatcaa gagacagtac acttcggata atctagttgt acatgttgga ttcatgcgta tggttagctc
L L vayu.u v L L
tcatatgcat atcacagcac ttgcaattgc acagcattga tgagtatcct tgaatattac tggtcatcat tcaccaccac cggcacccca cttttgtctg gagcctttta
atgagctgcc
atctactagg
taaacacaga
cacataggta
gtacaattca
gttccaagtc
gtgtttgatt
tgatcagatg
aaaatttttt
gtgtttgctt
ttttaaacaa
cagaaagata
aaaagaagct
tcataattca
gaatgtataa
aaatgtntct
accataatga
taaataattt
cattttatag
aatgtatcat
aatatccaaa
aacaaagatt
aatattcaag
taggaaggtt
agtgtcagta
gcagggaccc
agaccaacaa
atctctacct
aaagcaaaat
ataagcagca
u. La иСпд <-р -.а
ataattagca
atcctctctt
tattaccatg
aatcaacatt
tttgccctgg
aaaaaattat
aagcaaaata
aaaagattag
aaatacaaaa
ccatttacac
tcacacctat
taggatatgg
gaaagcaagt
ttcttctcct
atggatgctt
ttcgtacagt
atggaaagta
gtccatttct
agcacaaaag
tgggtaagga
". L^o out-
tttaatcaag tactttctta acatattaga caagctataa tttttgaaaa acatctccaa tttgggaact ggttggaaga tctgccatgt ttaaggggac
aBtaai.yuLL
cagtgtgata tatctatcac ctaggtattt gaacactaaa tgactatccc agtagttatg aaactcgatt aaaatacaag tatccagcat atgagcaaag acatgcaaat caaaatggtc taacacctgt tggcaacatc agagatcaac attgcagcat ggatggtgtt tactgttcaa ataaatatta tctgaaaaca
a actnfrtartfarft -"--_-¦-"•-*•-> -
ataatgcagt tactctatta aaatgcaaac cattttttaa ttttgctgct tgtaattatg agatacaagt cctcccaaga acatggtcag tcttggtgca
-yLwLLLQU LCI L L L L L CICI L
tttcaattca
ctcaaacatt
aaaaataaac
atttannttc
tattctagtt
gatttcatcc
atatttaaat
ccaagactaa
gtataaagaa
gatatgaatg
gtttcatctc
agattacaat
gtattgctgg
tggtaaatgt
aatggagaaa
tggttatagt
tgtgagcagt
tgcagatata
aaaaattcag
tagtaaggag -#-•-"--+• *- +¦ *- +-
¦-".'-( У LL.LLLL-
gcagtgcaat tacagaatat tctatgactt agaaagacaa atgaaatgaa tagaaactcc cgaaggctgc ccaactttga tgcaagccct agcacatgac
tgtattataa tatcactgtt aattaattgt ctccattcta cccctcccca cattagccac taaaattttc gagaaaatat tctctacaaa ggcaattcac gttaatatta gtctggcaat taggaaattt aaagatgctt ccctcataga ccataaatca taaacaaatt aagaaacagc aacaaattct gatgcacgcc
+- -" -"-4- +- 4- +•
L acaatataat ggaattccat tgtatctctc cataccctta aggaaactaa tctttacatt tgaattctct gcattctgac cacatcagtc aaaaggcctt
tgtgtaatga ttgtgttggg tgtcaattag gctgtatttt cccctagtaa .caagtgaaat tgaatgacaa gtacaactta ccattaaaaa ataggaagat aaacaacatt atcaagtatt gttttggttn aaattcctag tatttactgt aaaatgaata agatttagta nnnnataatc tacgtattga tgaagggtag
aaaatlt-v-CciC
ataattttaa ttaggcagtt aaaaacagtt actggaagcc ctactattag ttcccaaacc ctgaaacacc catgtttctc ctgtttgtct ttcctgcttt
- 194 -
008252
ggctttgctg
acagcctctt
gggcactagt
ggccgctggg
cataaggcta
taatgaaaaa
gaaatgtatt
catgcactgt
acggaactgt
cgacaagaaa
gataatgatg
acaatcgcat
accctaagac
gctatatgca
aagtgggcag
gctgtttctg
agttgttttc
gaatctgtgc
tctgtgttcc
ttaactcgaa
gtcgattgtt
aatggtgcaa
gcccagacaa
ctgaaataca
gccttttgct
aagagtgtag
tggtaataaa
ataaccgagc
gatcacctga
ctaaaaatac
aggctgaggc
tgccactgca
taaatagaca
ggcattaaag
taaaattttc
aaatatgtac
tgaagatcat
tcctggtgac
tagaagtcaa
ttccagtctc
gcccagcttt
cactcttcac
gaaggacctt
gagagaggaa
aagactatag
ttataatcag
acatttagcc
tattttacct
ctatgggtnt
acagatatca
aactattaaa
aatatatttt accgtcgatc
catcttccgc
gtgcacgatt
aggttgtgca
ttaaaatcaa
atgaattttt
aaactgacag
cgttttgaat
ttggggagaa
gtaaatgtga
gttttagagc
tactcgtcct
tccgggaatg
ttcacggtta
aagaggggca
ttgcagtggg
accttcatct
acagttttaa
attgcctttg
caaagacatc
gtgtctgaac
gccactataa
ggttatttta
agcagattct
taaggaagaa
agaacacaga
ctcttatttt
atgctggctc
ggccaggagt
aaaaattagc
aggagaattg
ctccagcctg
gacagacaga
tgtttgtctc
ttcatttgaa
taaacactct
agcaatgtcg
gtcgcttggc
gttgatttca
attttactcc
gactgtgatg
acaggcaaaa
caagatcttc
gactgcaaca
tcctgttttc
tatttcacaa
tccacttctc
aaagtgcctt
actgaactgt
cttaacattt
ttgttaataa
attatttaaa agagaagatg
ctcgcccggg
ccccaggagt
taaggtaata
ccacccaaag
aaataaaata
aaattgaatg
attcagagcc
aaatgtaatg
cctgtgtcta
taaaatgtat
ggcccagtcg
aattttgtat
tgttcttggg
agcctgtatg
acgtcgagga
ttgttctgga
agtaaatcag
aagtttgccc
actttatcca
attggcctgt
ttcattgact
acatgtgatt
tattttgccc
aaatgtccca
tttgtaagct
tagttactac
actcctgtaa
ttgagaccag
caggagtggt
cttgaacccg
ggtgacagag
tagatagtgt
attttcaatg
aaaaatacat
ctctgtttat
cctgctggct
gttgtatggg
gctgattatt
acatcaacct
ggctctcaga
cctggcccct
tggtttagcc
gagactgaga
ctgttttnct
tgtgattctc
taaagcatat
caccctccat
aatctagggc
tctagaagcc
ttattaannn
atatgtatta ggaagacctg
tacccaaaat
ctcagattta
cagaaacagg
gctgtgcttc
tatttgctct
atgcacttct
agccattgct
ggttttaaga
aaatgccctt
gacataaccc
gtgttgctct
tcactgctac
tgtaaaaatt
tgtccgatgg
cccggtgacc
ggtactgtaa
cctccctctt
ttaggatatt
tcagattttt
ctagttatgc
caaattgcaa
ctcataatat
tacactggtt
tgatcagaac
acttagcttc
atgtttacaa
tcccagaact
cctggccaac
tgcacgtgcc
ggaggcagag
cgagactcag
aggcacgtgg
gaaaagatac
acacataatg
tttcttcttt
tctggcaaag
.tggtgcttca
tcagtttggt
gctctgaggt
catgcttgtg
caaagaccta
cctcatttta
actgtccaaa
cagctgaaat
aagtgcttcc
gattctccat
tcagtctgag
catattgtcc
acaataaaaa
nataaataat
attaaaagat aagagccgac
gctctgattt
aattaaaata
ctccaaacca
agtgctctca
tgccttttaa
ccttccaata
gcaaaaacac
taagcattta
gcccaaacct
agcatccatt
ctgtcaaggt
atccgagagt
aagattcact
acgtgggcaa
gtacctttgg
tgagtcagct
tgatgccact
tcctacttaa
ctaactacag
gagttctgat
tagagacgca
tgctttccag
gatgtttccc
tagtcataaa
aaaaataaaa
ttattcttta
ttgggaagcc
gtggtgaaac
tataatctca
gctacagtga
tctcaaaaaa
cctaaaagga
tgtgtccaca
catctcaagt
gctttttctc
cagaagaaac
ctttgccctc
tcagttctgc
gttagatgga
tctacatgta
gacgatgcaa
ccaaagggga
ttcacacaag
atagcatttg
actgtttcat
ctctatatct
atcccactca
aatgaaaata
agtagtngtt
aattaattat
gcattatgtg tgaagatcgc
tattcatgtt
ataatcgtga
cagatctctc
gactaagcct
aaatataagt
tagacggcat
ctcacaatag
agaaaataaa
ttcttttcta
ttttaagagg
acttcgtttc
atcacaagct
gtcaatggca
cgactcgtgt
caacaatgtc
agctctgggg
tactctcctc
gcggttctgc
aaatgctgct
atttagaggg
aancaagttg
ggcagtcttc
aaaatctatg
acgaagagga
tcatatatct
aatagatagt
gacgtgggtg
cccatctcta
gctactcggg
gccaagatca
taataataaa
aacctcaaag
tcaaataatt
taatacattt
caggttacca
cgatacgatc
ctggtaagca
tcagtcctgt
cctccctaaa
cacaccccca
gctagaaaga
aaacaagaaa
ctagtatcag
ttccactttg
tttctataag
gtgttctcac
aaatctgcag
aaatgtggcc
tagaaaatat
ttaattangt
tatgtgtatg
t- a +¦ a t- a t-t- t-t- f.H-aftfat af-a-ihtatat a ft- a *- a f a-t-f aatat-aH-fa a(-faaahaat
taatttaatt aattatttat atgtaattat actatatcca gtatccttgt tcttcattta ctggttacca attttccagc gccaatataa tatatttgag nattatataa gtataattat aattatttat aagtattatt atctgtgtgt aattgccaca tgttggatag cttgactaat cttcataatc gctttcttga ttaanttaat tatttatata ataatttaat attttcatgt gaagtctttg ttttaagtgc cacagctctg ttatttgcct cacctattcc actagaaaga aattatttaa cttataacta tattaacaat gtaagcaata gctgagtatg tcagtaacca gaagatatgg tcaatgatcc ctctggcatt ttatacaagc ttatataatt ttatgtatgt ttaataatta taaaattatt tatcttacat catgtggttc gtcctagtct tttgtttcct atgaagatca ctgtaggcat atttggttat aattatactt tattttctaa gagataagta ttacagcata catgtggctg aggttccacc gctctgaatg agtgagataa tattataatt
- 195 -
008252
accttctttt tgttagtcat acttgatctc atcccaagga atattatcgg tttttccctg tttccttcta tccattctcc catcccctta gtgttagaga catgctggga aagactcatt tacacatcct aaagggcttg ccttaatacg agacgctgtg ctcatgaaca tagtgagcgt ccttcttaaa ccagtggtta ccttcagcat caggggctgt atgaagccta ggtgagctct cagtcatcct gaagtatttt ctcagcaata aatggttctc aattcctagt acaagacaca gtactagtaa ctgagaagaa tgtaataagc aaaacaaata tagttgctgc tcttgtgaac cttatatcct agaaaagtag atagatagtc atcaattgct cacaaatcta tgagtataat gactatgatg agggagatga aggagagcct gtgttcctgt gacaacatag ataatagtgg gagatggctt catcagagag gtcttggaag acatccccaa gggagtgatg gctccatctg taggataagg ggagggcatt tcaggtagtt gtccctgtga tggaaagatg acagagctgg aagaaggata gatacatagt actagcatag tacaagattt ggatgggtaa gaaggtatca gacctcttag gaccttgcag tccaggtgaa gaattcagat tctcatccta aaaactattg gttgtcatta cttccaaaac ataaagaggg aaggtatctg caatagatct ttagctaaca tgggaagaaa aggcagcaag gcccatgttt ttcctttctc cagataaaat ttgtattagt cccttctcac actgttatga agaaataccc aaaactgggt aatttataaa ggaaagatat ttaattgact caaagttcca catggctggg aaggccccag gcaacttaca atcatggtgg aaagggaagc aaacacatcc ttcttcacaa gggaacagga gagagaagaa tgagtgccca gcaaaggggg aagtccctta taaaaccatc agatcttgtg agaactaact caatatcatg agaacaggat gggggaaact gcctccctta attcaattat ctccacctgg tccctcccac aacatgtgga gatnatggga actacaattc aagatgagat ttgggtgggg acacagttaa accatatcat tctgcctgga cccctcccaa atctcatgtc ttcacaattc aaaatacaat cataccctcc caacagtccc cgaaagtctt aattcattcc agcattaact taaaagtcca agcccaaagt cttatctgag aanaggaaag tttctgctgc ctatgagcct gtaaaatcaa aagcaagtta gttacttcct agatacaatg ggggtacagg cattgggtaa atatacccat tccaaatggg agaaattggc caaaacaaag gggctatagg caccatgcaa gtccaaaatc caatagggca gtcattaaac attaaagttc caaaataatc tcctttgact ctgtcttata tatatccagg gcacactgat gcaagaggtg ggctcccatg gccttgggca gctccaccat tgtggctttg cagggtacag accccctcct ggactggtat tgagtgtctg tggcttttcc aggcacacag tgcaagctgt cagtggatct accattctgg agtctggagg atggtggccc tcttctcaca gctccactag gcagtgctcc agtggggact ctgtgtgtgg actcnnnnnn nnnrmnncaa ccacacattt tccttccgca ctgccccagc agaggttctc catgagggct ctacccccac agcaaacttc tgcctggaca tccagttgtt tctatacatc ctgtgaaatc taggcagagg ttcccaaacc tcagttcttg acttctgttc acccacaggc ccaaaaccat gtgtaagcca ccaagtcgtg gggcttgcac tctttgaagc atcagcctga gctgtatatt ggcacctttt agccatggct ggagcagaag ctgctggaag gcagggcacc atgtcccaaa gctgcataga gcagagggag cctggggccc acccacaaaa ccattgttcc cttctaggct tccaggcctg tgatggaagg ggctgctgtg aaggtctctg gcatgccctt ggggacattt tccccattgt cctggtgatt agcattcagt ccctcgttac ttatgtaaat ttctgcaact ggcttcaatt tctccctagt aaataaggtt ttcttttcta taaaaatcat cagactgcac attttccaaa tatttatact ctgcttcctc ttgaacactg tgtcacttag aaatttattc taccagatac cctaaatcat ctctcttaaa ttcaaagttc cacagatctc tagggcaggg gcaaaatgct gccagtctct ttgctaaagc ataacaagag tcacctttgc cctagttccc aataagttcc tcatctccac ctgagaccac ctcagcctgg acttcactgt ccatatcact atcagtattt tggtcaaagc tatccaacaa gtaggaagtt ccaaactttc ccatatcttc ctgtcttctt ctgagtcctc caaattgttc caacctctgc ctgttaccca gttccaaagt cgcttccaca ttttcaggta tccttatagt agccccccac tctaagtacg aatttactgt gttagtcctt tttcatgctg ctatgaagaa atacccaaaa ctgggtaatt tataaaggaa cgaggtttaa ttgactcaca gttctgcatg gctgggaagg cctcagaaaa cttatgatca tggtggaagg ggaagcaaac acatctttct ccacatggtg gcaggaagaa gtatgagtga ccagtgaaag gggaagcccc ttataaaact atcagacctg gtgagactta atcatcacaa gaacaggatg agggaaacca ccccagtgat tcaattatct ccacctggtc cctcccagga tacatgggga ttatgggaac tacaatccaa aataaggttt gggtgggaac atagccaaac catatcgaaa tgcaacctaa agctactgag tccaagcaaa agtcaagtag actctctaat cccagataac ctcagagagg aaatcttaaa cccaaagacc aacttccctt ttctgcctaa ttgcctttgt tcttctccaa gaacctcttt ggtcttggaa ggatgctcat tctccaccgt attttgcagt ggactattgg gaaggaaagt tccccatcca nggatgctat gtgcacacat tcatgtgctt ggacctcacc aaggatctca ctggaccccc ttcgcggggc ccatctgtga ctgtcatcat ttggctaggc aagcctcctt gagagtaatc acactctggc atcggctgaa tgtcaaggtt gttattgcag ttatagctgg tgggatcttt gtttctcaaa tgaagctttc ttattcataa agtgcagtca tctcttcctg ctaatcacac ccttgaaaaa agagctggat gtgttcctga gcagggagga cctctctgaa atcagcttag aggaatgagt gtatgtttgt tcttcagtgg tgtctagaat ctgacttctg gcaatctttt ccaccatcag ccctttctct ttgccaggat tcctttacct cctatgtcag ttgaccttcc tatgttgcac tgttaccctg
- 196 -
008252
tgtttttcac accctgtatg caaaagagct ggtcaccatt ttatgtaaaa taaatttcaa
aatacagaat ttagctgagc aaaacagaac ccgaagtttc atttgagact gaattttaaa
tctaatattt attcatgagt ttttgcagtg accttttcag cacctttttt agatcacttt
cttataataa tttacacata ttaagctaat tattcagtat acttcacaga aggcttaaaa
aatggaactg taacaagatc ttttgtgcaa attatgagaa gctgtcttct gtttaaattt
cagaatgcat atacttacat gatgggcgct tgtgtgattg tatttaggtt tttctccatc
tgtggaaaac atgtaagtac attgttaaga atcttatctt aaaggtcata tatgtgttaa
tgaaagaatg gtgattaatt gattacagcc ttacctcggt tatttaggga tgtaatcaca
aattactaga catcataagt caagattaac aaatattaaa cattgttaaa tgaatcagta
gcttagttat cattcgatgt gtttcctgcc atttatgttg cttattcttt atattcaata
+¦ +--•.••-¦*-+¦ -> ¦-. i- ¦.- v-aa u i. l. aacuaouLaa
j eta. a. av.
aaaaaccaat attctttctt aatgcatttt tatttttatt ttcaataaag ttaagtaact tcaaagaaaa ataatcttta atgaattttt atngtttcca tgattccaga tnnnnttttt tttttttttt tttgagatgg agtcttgctc tgtcaccagg ctggagtgca nnngtggcag gatctcggct cactgttttc tccacctccc aggttcaagt gattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gagattacag gcatgtgcca ccacacccag ctaatttttg tatttttagt agagacaggg tttcaccacg ttagccagga tgagattcca gattttttaa tattatttgt taatgtccat gggtatattc cacatatatt tttcattttt tacaatgctg tttccttttt tattacaaac gttatttcat atatacattc catatataca cataaccaat atacttaata tttgatagtt atttagtatt ataccattgc ttaggtttgt ttttgtgaaa gtctgtttgt ggaagaaacc tgagtttact tgctgtcagt caaaaatgtg tagcccttat catagagaat tgaggagcag aagagaaaat ggaaggtgaa aatgcttagt gttactctta ttaatttgtg tgaagaggct gaaatgtttg aagtaaaaat aaaattcgcc caacgcctgg tgggttttga agaatatttt gatgtaatac cttatagaaa gcaactttca aatgatacac ctaagagtga ttttgagcca atctgcttaa agattagttg ctacccaggt cttccatagc ttaatagatt gaatattctc tctctctctc tctctctnng tctctgtctc tctctctctc tctctctgtc tccccgcttc ccacccctgg tccccaggta acgctaaaga tgctcctctt gacagtggtc gtcagcatgt acaagagctt ctttatcata gtaggcatgt ttctcttgct gctgtgttac gcttttgctg gagttgtttt atttggtact gtgaaatatg gggagaatat taacaggttg gtatatactt atctttctat tcatttatca agcaaaccct ttggtaataa aattttaaat aaacaaatgt tttttgtcta ttaaagtcta ggagagggga aagggaagta atcagttgga aattaaaata aaatagccaa gttttaaatg atatttttcc agttgaaaaa ggttattcaa ctgaaaaggt ctactttcaa aaccttagaa aaattagaaa taaaagaaaa caaaaagaat ctataattcc accaacattc agtaatcatc actccnaatt ccagcacttt ttctatctac atattgccaa aaaatgatat attattttta gatggaacaa ttttaagata actctgggtt tctttctcag caaaatatgg gaatttagag ccccccaaat ggttgtaata tatgaaaagc agttttcaac gatttgccta agttttatag atgcatcatt ttttttcaag tcctgataca acaaagtata taccgatatg tcaagttgta .ggaattagat acatggctgc cccacctttt atagcatcgt ccaagtgaaa gaaggaatca cttagttgcc aaagcctgcc tacttagtca ttcaagatga atggtaataa attagtggcc atgctagagt tgggtgttca gacggctata cttggaggca agtataaatg acaaattaat aaaaaggtat aacctttgga aaaggtnact tagcaaccaa atttgctaca acctccactt gttttggtgt tggcaaacca tgctatttca tgacaaaccc ttctataant cacattctgt taattttttt ttcttaaatt aggcatgcaa atttttcttc ggctggaaaa gctattaccg tactgttccg aattgtcaca ggtgaagact ggaacaagat tatgcatgac tgtatggtaa atatctctca tcatgaacaa ggcttagact tagaatcagc atgaaactct tncaacacaa tgttggcagg atcatccttg ttagcgttaa gactttatgt atgaaatata aatcctgaca cttcagtcca taaaattgca ttattataca ttccaatgtg tgaatattta gggcaaaata ctcaattaac ccaacttgag ctattgtagt tccattcaac aaantatgca ttttgtgagt gttgttcttt ccctcccatc tttaatattt tggtaatgaa agtcaaacag gaagcccttt aatttaatgt gttcagtgga tagttcactg cccctcagct atatgctagg ccctaggtct tcaacaactc caaggcacac tcaaggagct tacctcaagg gctctgagtt actcttcctt tatactataa agtatacttt atacttcctt cttactatat cctgtcttcc ccaagcatca tccttctggt ctcagtttaa acaggtcttt tgccttaagc taagacagcc agctacatgt tcttatgctg ctctatagtt ctcctttgta ataaggagct gtagtgaatt actggcttac attcatttat tttatctctt tctcaccgta ggacagacca atgctgtgtt aaaaaatgtc tgcagtgatg gaaatctgca ctgtccaatt cgggagccac tagccatatg tggttatgga gcatttaaaa tgtggctaac acaactgagg aactgaattt tagttttaat tttatattat tacattttaa ttaacataaa tttaaattta catngctgca tggagctagt ggtcaccata ttggactgca cagcactcaa ctgtcagtag gaagaagaga tagggccgcc tatgtctttc ttaccagtct ctccccaaac ttggcacaaa cctagcacac agtaggagtg ctgggacttc atgcatgaat taacaaggag aatttgccaa atcaaataga atacaaggca aaatttaatg aatcttaaat aaaaatacaa gcagaatgct gggattatag aagagagagc tagtttatct ggctgagaaa aaccagaaag ttctctcaga
- 197 -
008252
ggtgtcggcn
tgctattcca
tgaatgtgaa
ttgcagacat
atcagggcca
taattctcac
tcttttgatg
tggagaattt
tccaactctt
taggccgatt
atcagtcact
agctgagtta
aaaggaaaag
aatagcctta
gccacaacat
ttatgaaggg
tggttcatta
gctgatataa
acactaaaca
ctagaacttt
gacttactct
tttaccattc
catcttgaat
ttgaatcatg
tagccgtcat
cttgctgcca
tcctgaggcc
ttacncagtc
agaattatgc
cagaatagct
ctcagaaaaa
cacaacatcc
cagaaataga
ggcaaagtat
ttcatggcca
gtggatcacg
actaaagata
ggaggctgag
tgcaccactg
aaaaannnaa
tttggaagaa
aggaggtcgc
cctgaagacg
tccttatgga
gaacatagtc
agcagcaggg
gctagcaaac
atgataaact
agccaccacc
agaagattac
ctttttatta
gtatggtata
tgcaatattc
ctgtagagtc
tgtcttttta
tggtggtggc
tggcaataac
atttctgcta
attatatgct
attctctact
ttgtactcca
tatgtatttc
ttttatagag
tagcatccca
tttnctatgt
tgcattttta
tttttccaat
tatttcngac
tttcttttgt
aattgataaa
ctctcttttc
cacaacccta
tcaaatcaaa
gcccaaaagc
ttcttgaagg
tggctgatat
gcccttaagc
tgagagaggt
tgtttaagga
aagctgtggc
atggattttc
catagctaga
gttgttaggg
caaaaatcct
tgtagttccc
ggggtggttt
gagatctgat
ccatgtgaag
tcccaatccc
tcaggtatgt
taaatctacc
gtttgcagca
aaagattgct
cctgtaaaca taacagtgtt gcaggcacat caagttgaag agcatgtttg tttttcatta agtttttttt tgtcatatgt ttgggcctcc caatggccta agctagaaat taggtccctt gaattaaaat ggagaaaaaa taaagccaaa gaggacgctg aagaaagaag aagttatcta aatgtagaca aaggagaagt actaatgcag aggaccctgc ttaatctcca cttccatcct ggttttataa aagaacatat tgctgaactg ctttattagc ctgcctgtgc tggtttgctg ttcaaagtag
atgagagagt
ccaagaatgg
cttgttttac
gtttatggca
ctcactttct
ttatctgttt
gaggggtgcc
cttctgattg
ctatgtcctg
taagtgttca
gattaagctt
gcaccaaata
gctactccag
ttttaccggt
tgcagaagaa
tagaaaaaaa
ccatctccat
gaagatctag
aaacagcctt
caatgcctgg
ctggtgactt
aatggtttga
tgtgtcgtgg
gttcttgtga
gaggtttttc
ttgcttcccc
tgagtcaatt
agtgtgagaa
tctataaatg
gatatttaag
tactgctcat
ttttgatgac ggcttactcc tgtgcttccc atcttgtgtg ggttctgtat tggtgatctg atgaaccatg ctgcaccgaa agacacaaca agtgaataga atggaggaag gttactcaag tgaacacatg ctcagtagaa ggcccttact tgtttgacgc aatatgaaag ctcaaataat ctattggaag attcaaagct tcagtggaag ctgtgtcccc gagggaccag tactgagtga cccccatttt ttccgccgtg aaatctcttt nggactaata gaacaacaaa cccactcttg taacaatgca
iyy aLjaLyuai.aa LjyjaLjaLLaBL aLLyLLLLL."
attctgtcca tttcataagg attgaaaacc ggcgcagtgg aggtcaggag caaaaaatta gcaggagaat cactncagcc cattcatgat gttgattcca tgcacatgtg cgactgaatt tgatcagagt ataatgacaa tttgagaggg agcatcacat tccatgttga ctgctcagtc aactcactga aggtctgtac aacatgagtt actttatcac tatattccca tttgattttc agaaagaata cttgggattc cagatgatgt atatgtttag cttatcctct gatgaattta tgttcatttt
tggatcaaga
ctaatagctg
ttctggaaag
ctcacgcctg
atcgagacca
gccgggcatg
ggcgtaagcc
tgggcgacag
tcatggaagg
gccattatgg
gttggtagaa
gctgcagtct
ggtttcttga
caaaggattt
ttgactccaa
gctgcagaaa
cttgttttaa
agcagctgtc
aggctcacat
ctttttggac
gcatgtgcac
agcagtctgg
aatcttaacc
tgcagtttga
tctagtggag
tacaagataa
acccaatgta
gaatctattc
ccttcttcca
catactgggc
atgtcatcat
agtcatttca ccatagatag gattcactat taatcctagc tcctggctaa .gtggtgggcg caggaggcgg agtgagactc aggtcaaaat atgactntga atagcaagag cctgatcaaa aatggaatct ataatgttac attcgaaaga aatctttcat gaaatcgcca aacattgagg gattgttagc ataatgccat tgggaaacca aactgaaact cattacttca tcacagtggc atcagttcat cagcatagca tgtggctttt attaactata ccccaatgcc aacagactgt tgcctacatc
actttcaagt
tgattgctct
tctacatgcc
actttgggag
catggtgaaa
cctgtagact
agcttgcagt
cgtctcaaaa
atcatcaaca
ggggttcaag
aactagaatt
cttgaaggaa
actcttgcag
ataaaattac
agttctattg
gaaaggaaga
cagccacccc
caagaccctc
ttttcttagc
tgtgcactta
aaacatgcat
gcaatgtctc
gtcagagaaa
tacttatcac
tttcattgtg
taagtgaaat
gaaagcttac
gtcagctaaa
ccaaaggttc
ggaaattatg
atgctaaatc ttaagtcttg tcacacaatt ttattgcctt gagcaggtct cacattttgg tgatcagtga ctcaataaga catctgtttc atattgacat agattcacac gcatgtcaaa ttgtaaattc actgataaga gatcagacta ctcttcaaat tagcaaaggt tgtaagtgct taaggtggct aagatgccct tcaaataaca ccaatgctca acccaaatct gcagagataa gttctcacta cttggcactt attgtaaatc cctttataaa cagtctctta gcctggatga agacctactg tctacctggt
+--"-.-.+- ГЧ a LVJL-L.Lywl.Cia
cttattattt
gatggatctg
attaagaaca
gtcaaggngg
ccttgtctgt
cagctactcg
gagcggagat
aaaaaaaaaa
ttaacaggaa
acttcagtga
agaaatggaa
tgaagattgc
aagatgctat
tcgataaacc
tgggtaaaat
gtcaattgat
aaccttcagc
caccaccagc
aataaaagta
ataagccaca
aggactttat
cgaggtatac
aacttgcaaa
ttggggctgg
cttttaaaaa
attcttcttt
tttgaagtta
agaaatttgt
agcctccgtt
ctggggcact•
tgcttgtagg
- 198 -
008252
taagtgatgt ttattttcaa attgttgtct actgcaattt atggattgag tatgtttttg acctttaaaa tctatacaca gagaaatagc aaaaatttgg
tagttgaata gcaattaccc ctcaatccag taagagttgt tngaacaaat aaaggtacac atggccctgg gaatgtgtgt ttagtccaag cttatgatat
ctttttactc
tggatttctt
aagctgaaaa
agcatttatt
atcagagagg
cttatttacc
aactctcaac
ttgtgcttac
tgtaaacatg
aggtgataga
gca L,aa -.gg t
tccttgtttt
caaatmatat
tgcctcacct
caaatgacac
tcagcagaat
gaacatcctc
gtaggaatca
cagtatatta
aaaggagtta
gaatgtttta
ctgctcttcc
tcctcctcct
tccccctcct
cctcctcctc
cctcctgttc
agttctaggc
cttacagtct
atttccagaa
ccatgaagga
gccagggtat
gaccaagaag
ttgctccctc
aaggtagtga
cctgtctctc
cccactgccc
cgcccagcac
ggaaggtagc
gcagagctga
aaggagttag
aggctggaat
cctcccaaat
tagtagagac
atccacccgc
cttttaatgg
gaagaggagg
actcagtgca
gagagcaaga
ctgcaatgtg
tatcctctgc
cttcacatct
tgagaaaccc
cagggggtga
gaggtggacc
ctccacaatg
agggctgaat
aacaagtgtg
gtcccaggcg
tcgcagggga
gtgcaccccg
tgatgcggga
agctgggact
tgctctgtga
tttaaactca ggggtgggtg gacctttgaa atgatcatta actatctttc cagatgtggg taagagttaa gaccctcatg ccaatttgga atccattatt
ggtacttaga tttcatggca aggcacgtaa atttcaaaag tagccttgaa cccacccaga agccagctgg ttttggaaag aaccatacta aataatagat
taattatgta ttaattataa atgacagttg ggctcttctc atatcacatt actcaatttg catgactatc gcaggagctg aaagcacttt gttttactct
L L L.wa.ciaa - a
ccataattgt
acaatgatct
gggagtgggt
ttaaatggtt
agaaagccat
cttacatgat
aaggaagcca
cactgaaact
gcaatcccaa
ttatttttga
ttagccaaag
cctccttccc
cctcctcttc
ccacctcatc
cacctcctcc
cctagcaaac
cagctcctgt
ataataataa
ggctgcgccg
tgaacaacaa
gagttgatga
ggcagtgcac
gtcttgaggg
tctcagctcc
atgcaataca
agtcatggtc
catggtggtt
agttctgacc
aatcctgaag
tggagtccca
aagtgattcc
ccgggtaatt
cgaactcctg
catgatccaa
tcctagcatc
gtgtgagtac
tatgcaagca
cccatgcctc
aaatttatca
ccaaggaggt
gcaccttttt
acttcttgtg
ggctactgcg
tgtgctacga
ggtacaaggc
aaggcctctg
gtcgtgaagt
aacatttcca
agggacccct
acagtcccac
cggttacagg
tgatgagaat
.ya-avja u La
ggagaatttc tcgccacttt tgttgtttca ttcaggttgg catttacagt cttcaaccat aagggactct accaaaggga ttaaaagtac gttactactt tagctgcagt ttcctcctac cccctnctct ttccccccta ttctncactt actcaggcac actcacagag atagtgcagt gcaggaatga ggaaagttct agggcacaaa tcaccccaat ctttcctttc tcaggatcca cacatgaaga gccagtgttc tgtgttgcat ccagaagagg aagacatgaa ctctgtcccc ccagcctcag tttttatttt acctcaggtg cacgagttat ccgattgagt attatggccc tcagcctggt actccaaatg ctcagttttc gaccagcttt ttttttcttt ctctgccccg tgggaggctg aatggagagg aggctttcgc cagtacaatt ggggtcacat agtaggtgcc gcccactgag cccttccctg gctctggcaa ttgcctggcc
LltOaLL ULLVJ
attccactga
ggaacatggt
caaagagact
agattgaatt
cctctaggaa
ttcttcagac
gccttgggct
ncaaattcat
tttaagtggc
accataaagt
tcttcttgtc
ctaccccctc
cttccccctc
ctctacccct
ttcctccctc
actgaggata
aataggtgga
gttaaaacta
ggcctgaggg
ttggggcgag
ccagcctggg
ttcttggtac
gagccctgcg
tgtaactgtc
tgcacaccga
tttcattcaa
aacacatctt
aggcctaatt
ttagctcttt
gcagtggtgc
agctgggact
tgggcttcat
ctcggcctcc
tagaaaaaca
attacacgtg
tgtgttggag
gtagggtcct
gtgacatccc
tcttcttagt
ggtgctaatt
aagtgaatca
tccccacgtt
tggacaagga
gcggcgacgt
gggggccaga
tttccaaccc
ctaagtgccc
gggctgggcg
aggggagagg
actgcccaga
aacatgcaga
tggttgcccc
aa LLLLLLLL
ggaggaccag
ggatgataaa
tatcaacatg
tttaaatggn
gggagacagc
tttccgaagg
caggccagaa
gatcacctca
atctgaaggt
ttacccaacg
attgtcgtca
tnnnnnnnnn
ctcctcgtcc
tcctctacct
tcctcttctc
tagcagtgaa
gacaaataat
tagacagtag
gtgctgtggg
atctggaaat
catcataaat
ccctgcccgc
tgcagggcat
acccacggga
gatgtcagta
agaaagatac
agattctcag
ctcttgtata
tttttttttt
aacctctgct
acaggcatgt
catgctggcc
caaagtgctg
tgtaataaac
tgtgtcttgt
gtggcgtctg
ggggggctga
agaaagagaa gcacttaatt atgctagctt tcgaggcctg ccgcgtcaag caagctcctg caccttccat aaccacagct aaaatgccac tttcctgccg gctgtgccct tggaagggat agagctgagt gcacctcact gttggctaaa
LLLLuaaaay
cttttaagtt
agagaggtat
tctcaaacac
ntgaanttgc
atcgttcctc
ccagcaggga
aaagaggtga
aactcaagta
gtgtattgga
tttcttaaaa
tcaacctcca
nnntcttccc
acctcctctt
tctcctcccc
tcttcctcat
caagatggaa
aaaaagtgaa
ttggggttgg
acctcatgtc
agttcaagaa
gaggggctcc
ccaggcttca
ctgagctcac
acctgctttc
actggcaggc
agccaggggg
tgtctggatc
tagtttttct
ttttttgaga
tcctgggttc
accactatgt
aggctggtct
agattacagg
attgagacgt
ccattncctt
tgggacagnc
aggggagctt
gcaccagcag
ctaccaggct
ttgagaaata
atgatttgct
ttcctgctgc
tttaagcaca
gatgtcctga
gtcagccttc
atctgctgtg
tcctccagtg
gatgtcccgt
ctgggagagc
gacttgcttg
tgcatgggtc
acaccagatt
- 199 -
008252
ttccagacat
cttcttcctg
ctgagggatt
atggaggtat
ctcccctggc
cagcttggtc
tgtgtgtgtg
aggagtccat
tgttctattt
tttttttggg
acagaggccc
tttgaaatgt
aatatccatg
gccttgactg
catttgagct
ttactttatc
cctttgtaat
ataagctcca
gtagctattt
tcaaatttca
aaaaggatca
cctcccacta
aatgcatgtg
agtggcaaat
atattcagcc
gtgatggggc
aacagtgaag
gaagagaaaa
aatgtaccag
ctcacagaag
aatcctgtgg
gg~ggac-gc
tgtgttggct
gatattcaac
tggctcacac
aggagtttaa
ctagctgggc
aaatgcttga
gcctggtcaa
atacagaagg
tgacgcacag
gaggtgcggt
ctttacaggc
agtcattaaa
gggagacaca
aaaacactag
gtaaatctca
cataccggtc
agctggagta
agtgcctgaa
ccgccccgcc ttcatgagcg ggagacttct taaacaacag tgcggggctg tgctggaggt tcccttcatc tatctatgtt tctactccac ccaaataacc aggaaacatt atggacttgc gtcattctct tctttgttac acatcttaaa ctgctagatg actgccgttt acggtgtatt ctgccacagg taatcacata ggagaactca gatcagcaca tccagttctt aatcacaaag ttttttggtt tctttggaac tgtctctccc ataaaagcaa ttcatttttt tgctctcaag tgggtagctc ctacacctgg
•b "*-* -a /*r+* у*"/-" пыт i_ w"_-i^ h. v- we* у у
ttacctacaa cctgggtttg ctgtaatccc gaccagtttg atggtggcac acccaggagg caagagtgaa atgaatgaga ccgagcatat cttccttctg acttagatgg taaaggagtt gagaggtgac acttattaga ggtgaatcag cgtggacatc caccatagag gcgcatcaga ctgccccgca cccagacagg gtatttgttt aaaggtatgg attccttctg gcgctgccaa ttcacatggc caaattcctc tgtgatctca ttacgttctg taacccataa aagggggaaa tccatgatga caggagaaat atatcattta gtattattta taaagtaaat tcattccgtg ggtccatgcc gcagtaccta ggtgtacaga ggaagaatct ccaccaacaa gaggtcatct gacatgaggc acaccgatgt cttcctattt tgaagctttg ttccctctgt agcctccagg acaggtgcac gtgcatcaca
Г* f_ -t" <^ /-"¦¦" *_ I-• -- t- > _- I", ^ Ы
ctgcatgggc tttggtagcc agctctttgg accaacatgg acacctgtaa cggaggttgc gctccatctc gaaacagaga taaccatcac cagagaaagt cacttactac accaggacta aggaccagcc ctgagtgatg agctgcgatt cggaagagct gaggaggtgg gctgtgagtg ggaggatgaa acagagggtc ccttgggcta tctcgaagtc aggcctgtga tgttggtcat attctgtttg cttttataag ttttaactta aggtactaga cagcttctta caattacatc acgtaggcaa catagatatt tgctcaccag atggaataat ttgagaattg catttaaagc acagaaaaaa caaggagtgt aatatgcttg gggaaaagtt gctaaaaagc ctgtcagaat agataggcat atctaataaa attcccctag atgggattct ggtgggaaga ctgtgatttg cagggtgcat ctgccaagag
/"--Г/-"+-/-"Гл-"/-"+* +• -5 +-
-•^W-.^WWWt-.C-.'.-.
ctgctgtgtg tctgaaatta gaggctgagg tgaaaactcg tcccagctac agtgagctga aaaaaaagaa gggaagtggg ctcggggggc cgcgagcctt tataagagcc tctatcatct caagacatgc tcctctctgg gcaggtgtgt tgcagctgga ccaagcagac aactgcacac agaaaagagc aaatggagtc ctgtaactta ctggatgctg gggagaatct tccttggctt tgtgtgtgtg aacatctgtc attactaatt ggttaggact agcaggagtc tttattttca caaaccacag ttcagatgac tgcttctgag aaaggaagca tattttaata attatttcaa ataagagcga gtgggatatt tggccagaag ctctcaagtt agaaaaacat gtttctgagt actgttgtca aatagaccca cccagtatat tgatgagtca gatttagcaa ggctctagga gggtctgagc gggctgtctt
<- у wwww" v у fc*
tcaagggtta ataaggaaga caggtggatc tctctactaa ttgggaggct cagcgcgcca aaaattaatt atgcagggag taagtgtgaa ttcctagcct tcacagatat ttgttttaca gggtggcgag attttgacgt ttctcccacc ggaactcctg catccgcatg atgcaggttg ttcgtgaaca tctgcctttt gcaccttaag gaagcccgag agcctagcct gtagaagcat tgtgtgtgtg gtattacatt acatctgcaa ccaacatatc catggataaa ctaatcactc tcgcattagc ataactgact ttatggtagt cttacttatg taattggttt gaaatgtccc ctgactagca gtgttgtgtc ctgaaaaaaa atcaatttca gggacggaga ctttcctcct ttaataatta ggcaaaatct gataaaaaca gggaagagag agagaagccc tggaactgag cataacctgg ctcctctggt
/-¦•> гтч- a a rt r* caw *¦" w *"*b*--jw
aatgggagtg ccaggcatgg atttgaggtt aaatacaaaa gaggcagaag ttacactcca aataaggaag tagggatgtg gaaagtatgg ggatcttttg taactcactt gacgagggaa gggtggcgtc atctaagggt agcatgcttt gcgagggagc tggctcaaga ggtccccgcc tgggattagc
tccttctgtg atcagccttc tatcccttta aactatgtcc actacctcca cctacagtgg
+¦ r*a rra t" ra t" rr **it-rrr"arTar--t"t- trart--tanr* nr*a na rrl- r-э rr r-r"r-t- nnrr-t r-
tccattagga gtttattggc gggagctcaa catctctact actcaggagg gagatcatgc aaaaaagttt ctagaatttt caaactgtga tgcttcctga gtttccatgg caggtgtggt ctcacttgag aaaaatacaa ctgaggcatg cactgcactc attgatatta ccacatattg taatgtcatt cttataagcc aatcccattt ggctcatgcc gccaggagtt aaattaacca agaatcactt cagcctgggt aaatatgatg aatttgcaaa tattctgaaa tataagattc ttataatatg tgtaatccca ggagaccagc ggcgtggcac gaacctggga gacacagtga tccatttatt actactttaa agaccacctc tctaactcat acatgaagac gcactatgag ctgccaacat acatgcctgt ggtagaagtt gaatctgtct aaactcaact attgctgcta tcaagattaa aaattaatga ttaaaaagca aggtcaaggg ggcaaaaccc agtcccagct gcagtgagct caaaaaaaaa gttcaaaatt aaaatttcaa tgatgtttcc atgtatactg
- 200 -
008252
cattgacata
ttttggcatg
acagagattg
tctattggag
cagctgccca
aatctgtcct
acagactggt
ctcatccacc
attgtattgg
tagtaatttt
ttgggaaact
agagtgagac
agtcatgcac
ctaggagttt
acatagtgag
aaaaagaaaa
cacaaatgaa
cctaccttaa
cacccgtcat
caggcaggat
cagtcgtgca
ctgaacccgc
gacaacagca
gggcttcttt
gtgacaatat
tgatccagat
gtctgactca
tatttttgtc
catggagtat
tagaaatttg
atcagactca
tctatgtatg gctgtgagaa aggttaacaa catggtgtgc cccagcaggg gttttgggct ttagtcaacc gatggttggc gacagggcta aagcctaaga gaccaaggct tgtgggaagt cctccaccag gtgtggatct accttccttc aaacaatgac tgtcccagga gtgacccttt cttcccactt gggttaaaaa ctcctgagcc aaaccccaga ctccagcgat ttcaaaatgc tcttgtcaaa attttccggg gattcagnaa atgggcaaaa cgaagttctc ggtcactggc acttacgtag tactgtattt tttcacagac tttcaatcct gagaaaaggt gtgatgtccc cctctggctc ctcctggatt caaggctctt cttaatgagc aaataagaca gaggcgggag ctcctctctn acttttagtc aaggttacag atcctatcta acaaataaat aatggactgg ttgaacattg gcaggtctta gctgggctta gtatcatcca ccagcatcga tgcaacctga cttttaataa ttctaatagg tatgtctatg tatgaatgcc taaagagtta ggtttacagg cagtaaaatc ttgaagatat
**•/¦-+• *• гч^гчгч^г*
tgtctatata gcagctggct cgtggagctg agcaacgcag tgctccagga ccccagcctt aaggggcaag aatgtctcgc atgaggttgg aagaaagagg tttgttagga cttggcatct ggcccatcat ccaggctggt ctgcagttcc attctcaggc agagtggtgt atacccattt gtcctcctgc gacggtaact ccacgctgtc ggaaatttgg cgaggcattt aagtctgcat aacattgtcc tacatttcag gagggagaaa gtattcaact aaaaaaggga tttaggcaag tactcactgt acagtgaatg agggaaaaaa cttcctcaga tcccagagaa atcactgctg tgagagggca gacctgaaaa tgcctcttac ctagaataaa taagctgggc gatcgcttaa gnaaaaaaaa tcagcttctc tgagctataa aaaaaaaaaa aaaatacaag gaagtcaatg aaattagttc ggagagggga ttttactgaa cagcctgaga gaccacccag ggtatgggca aaataaataa aatattttca tctttgccat aaaaaaagtg acatcagctc aagctctgcc agtgaaaatg
atcctttcct -.+¦ -> +-¦*-¦•
aaaaagtaca gggaggacct atcccgtgct ccaggggcca ggcccactgg tagaaatcat gggaggcatc atgggagagg agaaagtgat tgacnnnaaa aagggagagg ctctttcttt acagctttgc gacagtagac ccttccttac atggagggga ctccttcagc tcacttttcc catgtgtttt gtgtgcttct ggatcgagga gcagtggcgt taaaggtatt ctacagttgt cccaaaataa gctatcatgg tttccaaggg gaagagggag caggcccccg ctgctttacc atgccagtca tttctatgag cccaaagcaa gcaacaacgt aagatacaac gccactgtag caaggagtcc cttcagaacc aacttgcagg ataagaggag acagtgtctc gaccagaagt aaaaaaaaaa aggaggctga taatcgcacc aaaaaaaaaa catcaatgac catacctctc aggatcctta gaagaaaata caaacaatcg gagagtcagc cccagtgagg cgaggcgtcc aatgggtgct ttaaaaaaaa cttggatgca aatgccctga taagggctgc ctaaatattt tttgtaatta ggttgggtat
+¦ n •_" /-T-b r* _"
•" 4, V-" V-W_A
aggagttatc gcccctttat ctgtgcagag gagtaccttt tgccatagct ctgccaccga tgcagtggcc gaggcaggct gatttcagag aaaaaaaaaa tgacaggtga cactgtagct ctgcagagaa tgcccccgcc cccctggttt acgaagcagt agggcgtgca ccattgtgga cctttcttat cctcccatgc ggaagtcggc ctgccctcag tactctgttt ttacagacag cttctctaaa ttgagaagcc ctttctgtgt tgggcagatg atttctctca tccatacaat ctcttctaag ataattactt tcactaaaca caattgcaga tcaacctcct ctatgttagc tggctttagt aagacaagca aaagtgggaa aaaaaataga atgcctgtaa ttgaaactag aaaattaatt ggcaggagca actgaactct aancagaaaa cgtcactatt taagcccacc cttggaaatt agatttgtgt catttccata agcaagagct acacgaatgc tctgtcccag ggtcagatca aaanggcaac gttgaggtta acttcataat atttgaatct tcctcccttc gctttcaacc cagaagaaca goat at- tti t с agcgtcctgg gaggcagcaa cccccagcag ggaagcctaa cagttttcag ctgcagggac ttgccactgg gaagtcagga ccctctgttt ggatactaaa acctgagaac tagattgtta ctctttccct cagccggtcc gccagcgaag gggggttacc gtggtggctc cactctgagt agtaaaagga agacaagcag aagatgcagc gtaggtccat gtgtgttttg caacataatg tatgacttac agcacctatg gcctcaaggc caatcattca gcacactttg aacaannnnc tgcattactt ttatgaatgc tttatatata aacatgtatt atagcaaggc tccagggatc atatgccgag caaaggtttt aggggttggg atagccacat tcccagcaca cttgggcaac agccagccac tagcttgagc agtctacggg caccaacaac ctgattgtta tttgcatcag cctaagaggt ggcggtgggg gaaacagcag gagccggttt caacagtcag gacactctgt ttcaaacaag ggaaatccat tttaaaaaga tctgtagttt gggtatatta tctaaagtca tccttaaata tatggaattc
SttttC233C
agagtcctgt
ttacgatttg
caccaggctc
ggctccacgg
tagatctcat
ttctgcggag
tcaccctgaa
cagacagtga
ttagatgaaa
gagatgtgaa
aggtgaaatg
tcagctccat
gaagctctaa
ccactgcccc
atatgaaggg
caggacaaga
tttttcttct
ccatgttgtt
ggagagcgca
ccagcagcag
cgacgcaggg
ccaggcattt
ggtcttgcct
aaaaatgtag
attagccccc
aaaaagacaa
atgctcaaac
gaaaatgcca
cagctgagcc
aacaacaaac
gtgttctctc
- 201 -
008252
attcaatcct ttttcttcta gcactcagga tttctataga cccaacttca gacagcacag ccaaggaaag aggttcctcc tgccaggtca tagcaaagat gcagcaaagg ttaccgtggt agggacagat gacaaaagaa tgtaatccca accagcctgg ggtagtggtg agcctgggaa agagagtgag actggtccat ggggtcaggc aacaatgtca atcctgacaa tgggttcaga caacaccatg cccctcgcct taatgaatgc ttttctagtt atgacatcat atcaagtcct atcactgatg
ciy t CJCJQ uCat
cagtcaactt ccatgactga ctgtggagag atgaatttct ctgtaattga tcctgccaca aaaatttttg atcacttaaa ctaatgcagt gggtacaggg tgagagaatt gatagtagtt tatattttta ttatgttaat gaaatggact catagttgcg aagaataaaa ttggcttcat ttctgggtga gaatcttcta
ttaataaaca tgagcttctt atsgagggag taactaagtt gcccaattga cttacatttt tatccccttt tgattcaaac taaattacaa ttctgagcag agggaattgt gtgagcacaa aggagaggtg atgatgctgt gcactttggg tcaacatggt tgcacctgta gcagaggttg aacctgtctc gcctaggtgg tgagtttgag caggtgtcat tagtctaatt gacgtgaagt actgtgaggc ttactgtggg acaggtttct tttttaatta tagttgtcca gaaaaggatg ggaatatcat
-.-.4-+-UVJLJU V L.U L L
acggtttgga cgcggcttcc cgacgaaagt agtggtggaa tctataactg gaaaggcata tataatgaca aatgtcatat attatcaccg gttatagctt tattatttat ttacaaacta aatatacaca gaaactgttg caggatgctt caaagatgtt ctatatagct ttcttaccca tcctaacaca tggaaataat
4" +- =1 Г-*Г 4- a --+¦ ->
gtcccattat ctctataggg agcaatgctc catgctaaag aaggagaaga gaggctgacg catatccagg acagcagaga gctgagtcgg tatgtgactt ctatgacaga ggcaacaaag acctggggag caaaagtact aggccgaggc gaaaccctgt atcccagctg tggtgaacca ccaaaaaaaa tccccaccaa gaggcagagg gctatgcact aggacatttt tgcccatagc cccagaacca tcacactctc gtgacactta tttcaaaatg tgagcacaat tttacttagc gggtttttag
tttccatatt ttttggaaag cccacagccc caggagcttt tgtgtagcat atgttcagtg aacttatttt atgacagcat ttcaatttta ttggaatctg gcctggaggc gcatggacag aatgcacagt tccattgggc aggtggatca ctctactaaa cttgggaggc agattgtgcc aaaaaaaaaa aaacggtgat agaagaaaaa ttcctaagtc cattgtcttc tacatatcca cacctttcct cttccttttt atagttcccg aaaggggtga taaaaaaaaa atctgtggct gagtgattac
aaui> 4._a-avj wwwwaaczG-ww
ggaaggacaa tgcggttctg ggggatgacc accgttttct aattccagct agctgcatgt gtactgataa attctgtctg ccccgcaaaa tagttcacat gattgatctg cagattctga agacatttgg cctccttcta agcggtttaa aagtttctta caatttattt aggtatgtct ccattgctat ggtgccctgc
rtl- ccatgaaatc aagttaagaa ttctggatat aataatgtcc tgtcacaaga .atgatgggtt tattagaaat cgtaaactaa gagtgctaag ctttcccatt aaaaggtcag attttaaaaa tgaccagaac agaaaattgt aacaaacctg agaaaccttt aaaaaaatct gttttgccat gttagatttg aaaatcttcc
4- -H--T*- +• <-+¦ -n-
ttactgattc ccaggataat agtgtccttg ataatgctct atgtgttcca ggtcttcact tcagagatca caagacaacg tcctgtaggc tgctttagga aggttacaag agctgggggc ccttggtatt caggcgcagt tttgaggcct aatacaaaaa tgaggcagga gctgcactcc aaaaaaaaaa cgtgaaatag tagtattttg atctcatgta atcttacaat caggttgcag cccataccct gtttttttta aattggaatt gcagcacgtt atctatcgtg aggacacgtt aatagggtga
autuuCjCCut
tgtcgtgtgc gtggtggacc ttaggtggat ttgattgtcc tgtttataaa actatcaatc gataccgcaa ggtatatatt cccaaagtgg tccactagaa cactgaactt gtatcttctt aagttgattt gtgtgcaagc tagataaatc taataactga ttgcatgtgt aaatcagcag aaatgacatc tctgaactca
tr-t- i~i~? *-=¦*- 31 4-
agtaagagaa cccattaaga tacatgtttt ttaactgtgc caaagcagat gggactacca gagaagatct tagatggtgg aattaggagc agttgacttg ctggaggaag cagatactgc catttaaatg ggctcacccc ggagttcaag ttagctgacc gaatcacttg tgtctgggtg nngtacttcc acatgctctt agggggcagc acctgtttta ggaggaaact aggtgggtcc cactgcatcc ttgcatatgc tttttagtga tttttcccaa aacataaaga agccaaaagt agcaatacca
L-V-U'wj t- \j WWW..
aaaatgaacc
cggcagctga
gtcaatgtag
agtgagcaat
ttgattttca
attgctcaaa
gcaaatgtat
catatgtgct
ctgatattta
atatttctct
atgctaaaat
tttctcgtgt
ctgtcctcag
accaggcaaa
acttgagtga
gtttagcaaa
gatgttatca
agtcatttca
tctgttaaaa
caggttaggg
r,tc3atrir*cc
gatttcttgt
attacagatt
tgtgacctcc
ggcaaatagg
atatgattca
tttgatttga
atttgtaaaa
cactcggtag
aagctgtgtc
cttgtgctga
catgtcctcc gctgggccag ggacatttgc aggttgtttt acattccttc ttgtaactat tgttcacttg taatttactc cagcacattg cctgatactc
gggaaaatta ccaagtagaa tgttcagatg ataatctatt tgtgtcacag gagataaaga gagtttactt tgagttgacc caaacctgga atttcaactc
gaaaagcaaa gtggacttga ttttttaaca tttctctatt aagtatcgtg acaaccagtc tttgtacata atttttaaac ttgaatattc aattctctga
atgattacaa cttggacctt gagggattat taacattcct gtagtggcag atgtggccaa caagataaaa ccttttcttg agtccataat gccagaatgt
agtgctgtta taactatttt ctcagaatcc cagatagata tctacagttt aaggattaga taaatattgg gtggggcagg tagttggcaa tcctttcaca
- 202 -
008252
taaggctgag
ggtccagggc
acttgagtaa
ttgatgttca
aatgtattta
tgtaggactc
taagcgccac
acacagatgg
tactaatcct
ggcaccagaa
ccacaca ug.
aatggaaggg
cggagtcttg
ctccacctcc
ggtgcccgcc
atgttagcca
agtgctggga
ccagaccaac
aagggtacat
gtggaatgat
tcagtatatc
accagccaaa
gtggtctctt
gtcctaaccc
aattacttat
tcctctgaag
ggagctatgc
aaggcgcctc
cttctagcca
ctgctttttt
ccctttccaa tgaataccct atgggtctgt tacagcttca gcagaacatc aagccatagc ctctctacga ccccatttag gaaaacttgg gtcatcacgc agcatatggg
gtgccctcta actagtgctg ttctcacgaa attgttgttc accctatatt ttttcctgaa attttacccc gtcacagtgt cacccactgc gtggaatact
agcctacaat cataaaaaca actgctgagc attctgcagt ttcaatgaag acaggtagag tagatatgta tccctggtcc ctttaattag tacttgactc aggagactca nnnnnnnnnn tgcagtggca gcctcagcct ttgtattttt cctcgtgatc gcccggccca tggctgtgcc aaagccttac aggaagtggc ctaaggcctt agttgaggtg gaagtgtgac cttattagga gggtaatccc tggccatgag ctgggctacc atggccccct atttctgttg ttttagttta gaacagaaaa agatgttttt cctttctaaa gaagccaggg cgaaacagtc catatgcaag aacatatgaa gtagggaagc agggtgctgt agagcccctg aagggaacaa tttttttttt cgatctcggc cccaattagc agtagagacg cacccgcctc ctctattctt ttggccaagc aggaaagcag attctataca caacagatcc aagatgaaaa ccccagaagg aatagggtct ttactccaac acggtgaagg agaagctgca gtcaacacct ttttaagctg gtctctgtct ggcacttaca ggctcattac acgtctggaa gcagaatacc acacacttcc ccagagaaat aaatcccatt cagacactga cagttccaaa agagagcagg ggatggacag ttttttgaga tcactgcaag tgggactaca gggtttcacc ggcctcccaa aatggtactt tgaatgagat ctttaagcca tgggtggttt caaaatttta cggcactcat ataggttgaa tcgcagatat atacctggta cagaggcatc agaggcaagg tgattctgga cccagtttgt tctactaact
ccaatgctat ctctgtcacc cgggttcaca accatgccca ggatggtctc ttacaggcgt atacatcagc agaagaaaaa gtgtttgcct agtaagcagt agccaggcag ctcacccact ttagtacctg gaggaggtca acacaggcat tgcccagagc ccagaggctt gaagaactgt atcattttat ttctacttta
tcactctann caggctggag ccattctcct gctaattttt gatctcctga gagccaccgt agtgtctggc ccagtgttat gtttccttgt ggaactgttt ccctcgttga attatgggtt tgaatatgac tactagagga gtggggagga caagggacac ctaagggaga gagaacatac cattttagtt
<210> 4
<211> 6799
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> 5'UTR <222> 1..65
<220> <221> CDS <222> 66..5282
<220>
<221> 3'UTR <222> 5283..6799
<220>
<221> полиА-сигнал <222> 6081..6086
<220>
<221> полиА-сигнал <222> 6777..6782
<220>
<221> аллель <222> 1658
<223> 99-79316-158 ¦ <220> полиморфное основание С или Т
- 203 -
008252
- 204 -
008252
- 205 -
008252
aga cct саа Arg Pro Gin 640
cct aaa ate Pro Lys lie
сад дас аса Gin Asp Thr
tec tgc gac Ser Cys Asp 690
gac caa aaa Asp Gin Lys
705 ctg gaa aag Leu Glu Lys 720
сад cgc atg Gin Arg Met
tea ate etc Ser lie Leu
aga Arg
act Thr
aga Arg 800 gag Glu
cat gga His Gly 770 ttg act Leu Thr 785
gaa gac agt gaa
atg gtg Met Val
agg gag Arg Glu 660 tgt tgc Cys Cys 675
cac tec
His Ser
ctt cgc Leu Arg
gag acc Glu Thr
ctg age Leu Ser 740 age gtg Ser Val 755
tea aac Ser Asn
caa gat Gin Asp
atg aaa Met Lys
tac ttc gat Tyr Phe Asp
aac ttt tgc Asn Phe Cys 850
gac cct gtc Asp Pro Val
865 gat ttg ctg Asp Leu Leu 880
acc ate tgc lie Cys
Thr
agg aaa Arg Lys 820 aag cca Lys Pro 835
egg gtg Arg Val
аса gga Thr Gly
gga ttg Gly Leu
tct tgc Ser Cys 900
aaa ate Lys lie 645
agt ttt Ser Phe
etc ctg Leu Leu
aaa cgc
Lys Arg
aag tct Lys Ser 710 gca gtc Ala Val 725
gga tea Gly Ser
сад cat Gin His
age сад Ser Gin
cat tec His Ser 790 ata aag
т i _ т___
805
gtg caa Val Gin
ctg ttc Leu Phe
gtg gtc Val Val
get gtg Ala Val 870 gtc act Val Thr 885
att tec lie Ser
tea aag Ser Lys
atg aag Met Lys
aga Arg
tea Ser 695 gtt Val
age Ser 680 gca
ttc Phe
act aaa Thr Lys
ttt gag Phe Glu
cat ate His He 760 agg ate Arg He 775
aat аса Asn Thr
ctt cct Leu Pro 650 сад ttt Gin Phe 665
etc ccg Leu Pro
att gag
age ate Ser He
ate tta He Leu 730 ggg сад Gly Gin 745
cgc caa Arg Gin
age agg Ser Arg
gtg aga Val Arg
tea gat ttt Ser Asp Phe
att gac cgc He Asp Arg
acc Thr
gac
Asp
agg Arg 715 aga Arg
acc Thr
aac Asn 700 gca Ala
tct Ser 685 aaa
Lys
agg Arg
get tgc Ala Cys
ccc gca aag Pro Ala Lys
atg att сад gaa
gag cgc Glu Arg
gga aaa Gly Lys 780 tat aga Tyr Arg 795
aaa aag
Lys Lys
agg Arg 765 tct Ser
aat Asn
аса gtt Thr Val 655 сад caa Gin Gin 670
tec tec Ser Ser
tac ate
aac ctt Asn Leu
acc cga Thr Arg 735 gag agg Glu Arg 750
tea eta Ser Leu
ctt gaa Leu Glu
gca caa Ala Gin
gag caa gca
gaa gag Glu Glu
att gtc He Val 840 cga gca Arg Ala 855
aaa aat Lys Asn
tac ctg Tyr Leu
atg atg Met Met
gaa Glu 825
ggg
Gly
810 etc Leu
cga Arg
aga gag aac Arg Glu Asn
gaa cac Glu His
cgc ttc Arg Phe
аса aag Thr Lys
gtc atg cat gca cct act ttg сад
ttc atg age Phe Met Ser 930
ttc act cca Phe Thr Pro
945 ttt ata tat Phe He Tyr 960
915
att gag He Glu
act get Thr Ala
ctt gtg Leu Val
ctt aat Leu Asn
gtc ate Val He 950 age ttg Ser Leu 965
ctg Leu 935 agg Arg
att
T 1 -. 4 1C
920 aag Lys
gac Asp
gac Asp
ttt Phe 905 get
tgg Trp 890 gag Glu
aac Asn
tac Tyr 875 gtc Val
gca Ala 860 cat His
atg Met
agg Arg 845 tct Ser
caa Gin
ate He
cac His 830 ttc Phe
815 cca Pro
aga Arg
tec ccg ttt Ser Pro Phe
gag tat gtg ttt
ata ttt He Phe
att atg He Met
ttc ggt Phe Gly
ctt tgt Leu Cys 970
925
gca gat ggc Ala Asp Gly 940
gga gta atg Gly Val Met 955
tgg atg cct Trp Met Pro
aaa аса Lys Thr
ctt tat Leu Tyr
ate gta He Val 895 cga aga Arg Arg 910
gtg ata
tta ttt Leu Phe
gac ata Asp He
caa aat Gin Asn 975
- 206 -
008252
- 207 -
008252
ttc tec ate tgt gga aaa cat gta acg eta Phe Ser He Cys Gly Ьуз His Val Thr Leu
1315 1320 gtg gtc gtc age atg tac aag age ttc ttt Val Val Val Ser Met Tyr Lys Ser Phe Phe
1330 1335 etc ttg ctg ctg tgt tac get ttt get gga Leu Leu Leu Leu Cys Tyr Ala Phe Ala Gly
1345 1350 gtg aaa tat ggg gag aat att aac agg cat Val Lys Tyr Gly Glu Asn He Asn Arg His 1360 1365 gga aaa get att acc gta ctg ttc cga att Gly Lys Ala He Thr Val Leu Phe Arg He
1380 1385 aac aag att atg cat gac tgt atg gtt cag Asn Lys He Met His Asp Cys Met Val Gin
1395 1400 gat gaa ttt аса tac tgg gca аса gac tgt Asp Glu Phe Thr Tyr Trp Ala Thr Asp Cys
1410 1415 ctt atg tat ttc tgt tea ttt tat gtc ate Leu Met Tyr Phe Cys Ser Phe Tyr Val He
1425 1430 aat ctg ctt gta gec ata att gtg gag aat Asn Leu Leu Val Ala He He Val Glu Asn 1440 1445 act gag gag gac cag ctt tta agt tac aat Thr Glu Glu Asp Gin Leu Leu Ser Tyr Asn 1460 1465 atm ata tgg aac atg gtg gat gat aaa aga
aag atg etc etc ttg аса Lys Met Leu Leu Leu Thr 1325
ate ata gta ggc atg ttt He He Val Gly Met Phe 1340
gtt gtt tta ttt ggt act Val Val Leu Phe Gly Thr 1355
gca aat ttt tct teg get Ala Asn Phe Ser Ser Ala 1370 1375 gtc аса ggt gaa gac tgg Val Thr Gly Glu Asp Trp 1390
cct ccg ttt tgt act cca Pro Pro Phe Cys Thr Pro 1405
gga aat tat get ggg gca Gly Asn Tyr Ala Gly Ala 1420
att gec tac ate atg eta He Ala Tyr He Met Leu 1435
ttc tec ttg ttt tat tec Phe Ser Leu Phe Tyr Ser 1450 1455 gat ctt cgc cac ttt caa Asp Leu Arg His Phe Gin 1470
gag ggg gtg ate ccc acg
1475 1480 1485
ttc cgc gtc aag ttc ctg ctg egg eta ctg cgt ggg agg ctg gag gtg Phe Arg Val Lys Phe Leu Leu Arg Leu Leu Arg Gly Arg Leu Glu Val
1490 1495 1500
gac ctg gac aag gac aag etc ctg ttt aag cac atg tgc tac gaa atg Asp Leu Asp Lys Asp Lys Leu Leu Phe Lys His Met Cys Tyr Glu Met
1505 1510 1515
gag agg etc cac aat ggc ggc gac gtc acc ttc cat gat gtc ctg age Glu Arg Leu His Asn Gly Gly Asp Val Thr Phe His Asp Val Leu Ser 1520 1525 1530 1535
atg ctt tea tac egg tec gtg gac ate egg aag age ttg cag ctg gag Met Leu Ser Tyr Arg Ser Val Asp He Arg Lys Ser Leu Gin Leu Glu
1540 1545 1550
gaa etc ctg gcg agg gag cag ctg gag tac acc ata gag gag gag gtg Glu Leu Leu Ala Arg Glu Gin Leu Glu Tyr Thr He Glu Glu Glu Val
1555 1560 1565
gec aag cag acc ate cgc atg tgg etc aag aag tgc ctg aag cgc ate Ala Lys Gin Thr He Arg Met Trp Leu Lys Lys Cys Leu Lys Arg He
1570 1575 1580
aga get aaa cag cag cag teg tgc agt ate ate cac age ctg aga gag Arg Ala Lys Gin Gin Gin Ser Cys Ser He He His Ser Leu Arg Glu
1585 1590 1595
agt cag cag caa gag ctg age egg ttt ctg aac ccg ccc age ate gag Ser Gin Gin Gin Glu Leu Ser Arg Phe Leu Asn Pro Pro Ser He Glu 1600 1605 1610 1615
acc acc cag ccc agt gag gac acg aat gee aac agt cag gac aac age Thr Thr Gin Pro Ser Glu Asp Thr Asn Ala Asn Ser Gin Asp Asn Ser
1620 1625 1630
atg caa cct gag аса age age cag cag cag etc ctg age ccc acg ctg Met Gin Pro Glu Thr Ser Ser Gin Gin Gin Leu Leu Ser Pro Thr Leu 1635 1640 1645
- 208 -
008252
cga gga gga Arg Gly Gly 1650
aaa ttt ggg Lys Phe Gly
cag agg Gin Arg
1665 age cat Ser His 1680
atg aaa tct gtc gtg
tea gtg tec Ser Val Ser
agt egg Ser Arg
cag tgg Gin Trp 167( tea gtc Ser Val 1685 tgc aaa
caa gat Gin Asp 1655 cgt ctg Arg Leu
gca gee gac Ala Ala Asp
gca ggg Ala Gly 1660 cca aaa Pro Lys
ccc tea gee
Pro Ser Ala I 1675
aac tta egg ttt gga gga agg
Asn Leu Arg Phe Gly Gly Arg 1690
atg aac ccc atg act gac gcg
aaa ccc Lys Pro
cca ata Pro He
аса acc Thr Thr
1695 get tec
ncu uya oci voiJ. vetJ. i_.ys J-iys hkl паи r.u net
1700
1705
tgc ggt tct gaa gtt aag aag tgg tgg acc egg Cys Gly Ser Glu Val Lys Lys Trp Trp Thr Arg
1715
1720
age gac gaa agt ggg gat gac ctt ctg gat att Ser Asp Glu Ser Gly Asp Asp Leu Leu Asp He nil. i-u.a rtj-a _> -=x
1710
cag ctg act gtg gag Gin Leu Thr Val Glu
1725 tag gtggatgtca
1730 1735
atgtagatga atttctagtg gtggaaaccg ttttctaata agcaatctgt aattgatcta taactgaatt ccagcttgtc ttttcatcct gecacagaaa ggcataagct gcatgtatga ctcaaaaaaa tttttgtata atgacagtac tgataatatt atgtatatca cttaaaaatg tcatatattc tgtctgcgta tgtgctctaa tgcagtatta tcaccgcccc gcaaaagagt tatttagggt acaggggtta tagctttagt tcacatcttt ttctcttgag agaatttatt atttatgatt gatctgaaaa taaaatgata gtagttttac aaactacaga ttctgaattt tcgtgttata tttttaaata tacacaagac atttggtgac cctcagttat gttaatgaaa ctgttgcctc cttctaagaa ggcaaagaaa tggactcagg atgcttagcg gtttaaaaca gagtgacata gttgcgcaaa gatgttaagt ttcttaagaa agcaaaaaga ataaaactat atagctcaat ttatttaaaa ttatcattgg cttcatttct tacccaaggt atgtctgttt atttcattct gggtgatcct aacacaccat tgctatgtta ttaaaagaat cttctatgga aataatggtg ccctgcaaaa ttagggatca cacaacttac ttaatcgttt tttgtttttg atggcccatg tcctccggga aaattagaaa agcaaaatga tcttgtgctg ggccagccaa gtagaagtgg .acttgacttg cagattggac atttgctgtt cagatgtttt ttaacagagg acctccaggt tgttttataa tctatttttc tctatttaac aataggacat tccttctgtg tcacagaagt atcgtggtag gattcattgt aactatgaga taaagaacaa ccagtcatgt atttgatgtt cacttggagt ttactttttg tacatacaag gtaaaat
<210> 5
<211> 1738
<212> PRT
<213> Homo sapiens atgtccttga acaagatgtt tgggttacta agaaatgata aactaaggta gctaagccca cccatttcca ggtcagcact taaaaagtat cagaacaagt aattgtgtgt aacctgtaga accttttaat aaatctttgc tgccataaat gatttgaaat tcttcctctg ttttttttcc ttacaaagtg gacctttaac gattatctca attcctcaga tggcagtcta ggecaaaagg ataaaataaa ttgtccagtg tataaattga tcaatcattg ccgcaagcaa tatattcata aagtggctga ctagaaatat gaacttatgc cttctttttc tgatttctgt gcaagcacca taaatcactt aactgagttt atgtgtgatg cagcagagtc gacatctctg aactcacagg ttatatgtca ctgttagatt tattttatta gaatcctgtg tagataggca cagtttatat attagatttg tattggattt
<400> 5
Met Leu Lys Arg Lys Gin Ser Ser Arg Val Glu Ala Gin Pro Val Thr
15 10 15
Asp Phe Gly Pro Asp Glu Ser Leu Ser Asp Asn Ala Asp He Leu Trp
20 25 30
He Asn Lys Pro Trp Val His Ser Leu Leu Arg He Cys Ala He He
35 40 45
Ser Val He Ser Val Cys Met Asn Thr Pro Met Thr Phe Glu His Tyr
50 55 60
Pro Pro Leu Gin Tyr Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Leu Leu Met Phe 65 70 75 80
Leu Tyr Thr Ala Glu Met He Ala Lys Met His He Arg Gly He Val 85 90 95
- 209 -
008252
- 210 -
008252
- 211 -
008252
Met Leu Ala Leu Phe Glu Val Leu Ser Leu Lys Gly Trp Val Glu Val 1105 1110 1115 1120
Arg Asp Val He He His Arg Val Gly Pro He His Gly He Tyr He
1125 1130 1135
His Val Phe Val Phe Leu Gly Cys Met He Gly Leu Thr Leu Phe Val
1140 1145 1150
Gly Val Val He Ala Asn Phe Asn Glu Asn Lys Gly Thr Ala Leu Leu
1155 1160 1165
Thr Val Asp Gin Arg Arg Trp Glu Asp Leu Lys Ser Arg Leu Lys He
1170 1175 1180
Ala Gin Pro Leu His Leu Pro Pro Arg Pro Asp Asn Asp Gly Phe Arg 1185 1190 1195 1200
Ala Lys Met Tyr Asp He Thr Gin His Pro Phe Phe Lys Arg Thr He
1205 1210 1215
Ala Leu Leu Val Leu Ala Gin Ser Val Leu Leu Ser Val Lys Trp Asp
1220 1225 1230
Val Glu Asp Pro Val Thr Val Pro Leu Ala Thr Met Ser Val Val Phe
1235 1240 1245
Thr Phe He Phe Val Leu Glu Val Thr Met Lys He He Ala Met Ser
1250 1255 1260
Pro Ala Gly Phe Trp Gin Ser Arg Arg Asn Arg Tyr Asp Leu Leu Val 1265 1270 1275 1280
Thr Ser Leu Gly Val Val Trp Val Val Leu His Phe Ala Leu Leu Asn
1285 1290 1295
Ala Tyr Thr Tyr Met Met Gly Ala Cys Val He Val Phe Arg Phe Phe
1300 1305 1310
Ser He Cys Gly Lys His Val Thr Leu Lys Met Leu Leu Leu Thr Val
1315 1320 1325
Val Val Ser Met Tyr Lys Ser Phe Phe He He Val Gly Met Phe Leu
1330 1335 1340
Leu Leu Leu Cys Tyr Ala Phe Ala Gly Val Val Leu Phe Gly Thr Val 1345 1350 1355 1360
Lys Tyr Gly Glu Asn He Asn Arg His Ala Asn Phe Ser Ser Ala Gly
1365 1370 1375
Lys Ala He Thr Val Leu Phe Arg He Val Thr Gly Glu Asp Trp Asn
1380 1385 1390
Lys He Met His Asp Cys Met Val Gin Pro Pro Phe Cys Thr Pro Asp
1395 1400 . 1405
Glu Phe Thr Tyr Trp Ala Thr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Ala Leu
1410 1415 1420
Met Tyr Phe Cys Ser Phe Tyr Val He He Ala Tyr He Met Leu Asn 1425 1430 1435 1440
Leu Leu Val Ala He He Val Glu Asn Phe Ser Leu Phe Tyr Ser Thr
1445 1450 1455
Glu Glu Asp Gin Leu Leu Ser Tyr Asn Asp Leu Arg His Phe Gin He
1460 1465 1470
He Trp Asn Met Val Asp Asp Lys Arg Glu Gly Val He Pro Thr Phe
1475 1480 1485
Arg Val Lys Phe Leu Leu Arg Leu Leu Arg Gly Arg Leu Glu Val Asp 1490 1495 1500
T л.- 7V л*-. T • ¦ л 7\ T ¦> ¦ n T . ч T л i •" ПкЛ 7 *.~ U-i e. U"f ,r- T1 ¦ r-r- ПЛ ii Мгъ.+- Г1 n
JuiwU ПО^ ±jy ГЛ О Jj-1 JjyO -UCU UCU C1IC Jul у _> _-__.-> UCL V^-> J. у J. \_> J- -- IJC v, v_> Jv _Л
1505 1510 1515 1520
Arg Leu His Asn Gly Gly Asp Val Thr Phe His Asp Val Leu Ser Met
1525 1530 1535
Leu Ser Tyr Arg Ser Val Asp He Arg Lys Ser Leu Gin Leu Glu Glu
1540 1545 1550
Leu Leu Ala Arg Glu Gin Leu Glu Tyr Thr He Glu Glu Glu Val Ala
1555 1560 1565
Lys Gin Thr He Arg Met Trp Leu Lys Lys Cys Leu Lys Arg He Arg
1570 1575 1580
Ala Lys Gin Gin Gin Ser Cys Ser He He His Ser Leu Arg Glu Ser 1585 1590 1595 1600
Gin Gin Gin Glu Leu Ser Arg Phe Leu Asn Pro Pro Ser He Glu Thr
- 212 -
008252
1605 1610 1615
Thr Gin Pro Ser Glu Asp Thr Asn Ala Asn Ser Gin Asp Asn Ser Met
1620 1625 1630
Gin Pro Glu Thr Ser Ser Gin Gin Gin Leu Leu Ser Pro Thr Leu Ser
1635 1640 1645
Asp Arg Gly Gly Ser Arg Gin Asp Ala Ala Asp Ala Gly Lys Pro Gin
1650 1655 1660
Arg Lys Phe Gly Gin Trp Arg Leu Pro Ser Ala Pro Lys Pro He Ser 1665 1670 1675 1680
His Ser Val Ser Ser Val Asn Leu Arg Phe Gly Gly Arg Thr Thr Met
1685 1690 1695
Lys Ser Val Val Cys Lys Met Asn Pro Met Thr Asp Ala Ala Ser Cys
1700 1705 1710
Gly Ser Glu Val Lys Lys Trp Trp Thr Arg Gin Leu Thr Val Glu Ser
1715 1720 1725
Asp Glu Ser Gly Asp Asp Leu Leu Asp He 1730 1735
<210> 6
<211> 453
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> аллель <222> 105
<223> 99-62617-105 : полиморфное основание G или С
<220>
<221> ошибочное связывание
<222> 93..117
<223> 99-62617-105.зонд
<220>
<221> связанный праймер
<222> 86..104
<223> 99-62617-105.mis
<220>
<221> связанный праймер <222> 106..124
<223> 99-62617-105.mis комплемент
<220>
<221> связанный праймер <222> 1..20 <223> 99-62617.pu
<220>
<221> связанный праймер <222> 435..453
<223> 99-62617.гр комплемент
<400> 6
tgaggatgag gggcaaacac agaggaagaa tctgggcccc atgaggtcaa cagtgagctg 60 ctaaaattaa cctgaaattt ccctgctggg agacattgtg ttgtsaaata gttttatacc 120 atcttttact aggttttcaa ttaccagcag ttggatgcac cctgtgatcc aatggataca 180 aatgagattt agaagtgcac tttaacttaa ataaaataaa tagccttgtc taatgtatta 240 acgagaaaga catttttgtc ttatttatat gtcttatgtt ctttgaaatg aaataaatga 300 ccatatatgc ttgtaaagag agggagtcta cagatatttg gagaaaggac attctgggtg 360 gagagaacac agagtgcaaa ggacttgaag ttaaagtgca tccagcagtc tcaaggaaga 420 gtaaaggggt ccatgtgagt ggaataaggt gag 4 53
<210> 7 <211> 18 <212> ДНК
<213> синтетическая последовательность <220>
<223> секвенирующий олигонуклеотидный праймер PU <400> 7
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 8 <211> 18 <212> ДНК
<213> синтетическая последовательность <220>
<223> секвенирутощий олигонуклеотидный праймер RP <400> 8
caggaaacag ctatgacc 18
- 213 -
008252
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело или антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO: 5.
2. Антитело или антигенсвязывающий домен по п.1, который является химерным, гуманизированным антителом, или антигенсвязывающим доменом, или моноклональным или поликлональным антителом, или антигенсвязывающим доменом человека.
3. Антитело или антигенсвязывающий домен по п.1 или 2, которое является антителом или анти-генсвязывающим доменом с одной цепью.
4. Антитело или антигенсвязывающий домен по любому из пп.1-3, который является моноспецифичным, биспецифичным, триспецифичным или мультиспецифичным антителом или антигенсвязываю-щим доменом.
5. Применение антитела или антигенсвязывающего домена по любому из пп.1-3 для диагностики шизофрении или биполярного расстройства.
6. Набор антисмысловых последовательностей, ингибирующих экспрессию полипептида ионного канала, кодируемого полинуклеотидом, показанным в виде SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащий фрагмент полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.
7. Набор антисмысловых последовательностей по п.6, которые являются рибозимами.
8. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по пп.1-4 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.
9. Применение набора антисмысловых последовательностей по п.6 или 7 для получения лекарственного средства для лечения шизофрении или биполярного расстройства.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-4.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая набор антисмысловых последовательностей по п.6 или 7.
12. Применение по крайней мере одного двухаллельного маркера (ДМ), связанного с ионным каналом, выбранного из группы двуаллельных маркеров, показанных ниже, для определения подвержен ли индивидуум риску или страдает ли больной шизофренией или биполярным расстройством.
Название маркер
Полиморфизм
Положение ДМ в SEQ ID
Аллель 1
Аллель 2
N0:1
NO : 2
NO : 3
N0:4
NO:06
99-62626-168
12642
99-62632-275
14088
99-62633-409
24981
99-62611-51
69248
99-62605-56
73428
99-62635-443
80250
99-79335-60
51090
99-79336-369
61293
99-79338-332
80602
А10
99-79314-201
100485
99-79314-225
100509
А12
99-79316-158
106725
1658
А13
99-79322-224
166087
А14
99-79322-473
166336
А15
99-79306-182
235894
А16
99-79310-29
31646
4481
А17
99-79311-50
42373
А18
99-62617-105
105
- 214 -
008252
13. Способ генотипирования, включающий стадии:
a) выделения нуклеиновой кислоты из биологического образца;
b) обнаружения наличия нуклеотида в одном или нескольких зависимых двухаллельных маркерах, связанных с ионным каналом, А1-А18, перечисленных в п.12.
14. Способ по п.13, где способ осуществляют с использованием анализа микросеквенирования.
15. Диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащий полинуклеотид, который является фрагментом полинуклеотида с последовательностью SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4, содержащего один или несколько биаллельных маркеров А1-А18, как описано в п.12.
16. Диагностический набор для диагностики шизофрении или биполярного расстройства, содержащий:
a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом ионного канала, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID No 5, или с фрагментом пептида или его вариантом, необязательно меченным;
b) реагент, с помощью которого осуществляется определение образовавшегося комплекса антиген-антитела, указанный реагент либо необязательно содержит метку, либо который может быть распознан меченным реагентом.
область LE
8000000 85О0ОО0 9000000 9500000 10000000 10500000 110О0ООО 115ОООО0 120О0ООО 125СКХ
С0001А06 О0001А10
Фиг. 1
данные
поискового
устройства
120
Фиг. 2
- 215 -
008252
200
Q запуск ^)-201
сохранить новую послед
овательность в память
открыть базу данных последовательностей
прочтение первой последовательности в базе
осуществление сравнения новой послед, и сохраненной последовательности
202
204 206
210
212
224
перейти к след последовател-Ti/ в базе данных
одинаковые
2.14
дисплей сохраняет название последовательности J для пользователя '
218
•да
нет 220
(^окончание
Фиг. 3
250 С за"Уск
252
сохранение первой последовательности в память 254
256
сохранение второй последовательности в память
прочтение первого символа в первой последовател-ти
260
прочтение первого символа во второй последов-ти
262
264
одинаковые?
268
прочтение следующего символа в первой и второй последовательностях_
270
одинаковые?
274
1несколькТ
символов дляда-ючтен!
нет
276
уровень дисплейной гомологии между первой и второй последовательностями
у окончание у/
Фиг. 4
278
- 216 -
008252
300
( запуск J-302
сохранение первой последовательности в память
открытие базы данных элементов последовательное,-!
304
308
прочтение первого элемента в базе данных
310
сравнение определяющих элементов с первой J последовательностью У
316
нахождение?
318
дисплейное обнаружение элемента для
пользователя
[ 320
прочтение следующего элемента в
fiaag ПЯЫЫЫУ
324
Гокочание
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 217 -