1. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту вирусного генома, которая представляет собой нуклеиновую кислоту генома вируса герпеса или последовательность, по меньшей мере на 80% ей гомологичную, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый из которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса и оперативно связаны с кодирующими последовательностями, и где

(a) более 10% и вплоть до 95% вирусных последовательностей, которые находятся в области вирусного генома, которая соответствует области, расположенной между 5'- и 3'-концами нуклеиновой кислоты вирусного генома в данной конструкции, отсутствуют в указанной конструкции, и

(b) нуклеиновая кислота вирусного генома составляет от 1 до 50 т.п.н. в длину.

2. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где конструкция представляет собой космиду или плазмиду.

3. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где в конструкции отсутствуют последовательности упаковки вируса и/или сайт инициации репликации вируса.

4. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где более 20% и вплоть до 85% последовательностей вирусного генома удалено.

5. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где более 30% и вплоть до 75% последовательностей вирусного генома удалено.

6. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где эндогенные регуляторные элементы экспрессии гена оперативно связаны с их природными кодирующими последовательностями.

7. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где последовательность более чем в 500 п.н., расположенная выше и/или ниже промотора эндогенных элементов экспрессии гена, идентична или по меньшей мере на 90% гомологична эндогенным последовательностям генома вируса герпеса.

8. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где два или более эндогенных элемента регуляции гена происходят из последовательных генов генома вируса герпеса.

9. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где три или более эндогенных элемента регуляции гена происходят из последовательных генов в геноме вируса герпеса.

10. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два эндогенных промотора индуцируются в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса.

11. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два этих эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена или же все элементы происходят либо от предранних вирусных генов, либо от ранних вирусных генов.

12. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена являются различными.

13. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где вирус герпеса выбран из вируса простого герпеса (HSV), цитомегаловируса (CMV) и вируса Эпштейна-Барр (EBV).

14. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.13, где вирусом является HSV, который выбран из HSV-1 и HSV-2.

15. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из вируса простого герпеса и по меньшей мере каждый из двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена содержит эндогенный промотор, выбранный из группы, состоящей из промоторов генов ICP0, ICP4, ICP22 и IСР27.

16. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из HSV-2 и вирусные последовательности удалены из указанной конструкции одним или несколькими из следующих способов:

(a) путем частичного гидролиза под действием EcoRI, с последующим повторным лигированием;

(b) путем гидролиза под действием Bst 11071 и ScaI, с повторным лигированием;

(c) путем гидролиза под действием Nsi, с последующим повторным лигированием;

(d) путем частичного гидролиза под действием фермента BstXI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей между ICP27 и ICP0;

(e) путем полного гидролиза под действием фермента BspHI, с последующим частичным гидролизом под действием фермента BsiWI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей, смежных с ICP22;

(f) путем гидролиза под действием фермента SrfI, с последующим повторным лигированием для удаления последовательностей между ICP4 и ICP0; и

(g) путем полного гидролиза под действием фермента BstXI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей между ICP27 и ICP0.

17. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из HSV-1 и вирусные последовательности удалены из конструкции в целях исключения, по существу, всех последовательностей HSV-1, не относящихся к кодирующим последовательностям ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27.

18. Конструкция нуклеиновой кислоты по пп.14-17, где указанная конструкция содержит промоторы ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27, оперативно связанные с их природными кодирующими последовательностями.

19. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где две или более кодирующих последовательности оперативно связаны с эндогенными регуляторными элементами экспрессии гена, кодирующими антигены.

20. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где указанная отсутствующая область содержит все промежуточные последовательности или их часть, расположенные между двумя смежными эндогенными регуляторными элементами экспрессии гена и их кодирующими последовательностями.

21. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где отсутствующая область соответствует одному или нескольким генам, присутствующим в области вирусного генома, кроме по меньшей мере двух эндогенных регуляторных элементов экспрессии гена, активных в одной и той же фазе жизненного цикла вируса.

22. Способ создания конструкции нуклеиновой кислоты для ее непосредственного введения субъекту в целях выработки у этого субъекта иммунного ответа, где указанный способ предусматривает

(a) встраивание нуклеиновой кислоты генома вируса герпеса или последовательности, по меньшей мере на 80% ей гомологичной, в остов вектора, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома составляет от 1 до 50 т.п.н. в длину и содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый их которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетке млекопитающего, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса, и

(b) делецию некоторых или всех вирусных последовательностей из указанной нуклеиновой кислоты вирусного генома, за исключением по меньшей мере двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, которые присутствуют в области вирусного генома, которая соответствует области, расположенной между 5'- и 3'-концами нуклеиновой кислоты вирусного генома указанной конструкции, где указанную делецию осуществляют либо до, либо во время, либо после встраивания нуклеиновой кислоты вирусного генома в остов вектора,

где созданная конструкция соответствует тому, как определено в любом из предшествующих пунктов.

23. Способ по п.22, дополнительно предусматривающий покрытие конструкцией частиц, подходящих для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки.

24. Частицы с покрытием, подходящие для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, где указанные частицы включают в себя частицы-носители, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 или полученной способом, как определено в п.22 или 23.

25. Дозировочный сосуд, используемый в устройстве для опосредуемой частицами доставки и содержащий частицы с покрытием по п.24.

26. Устройство для опосредуемой частицами доставки, загруженное частицами с покрытием по п.24.

27. Вакцина, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.

28. Способ in vitro осуществления экспрессии требуемого полипептида в клетке млекопитающего, где указанный способ предусматривает перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 или полученной способом по п.22 или 23.

29. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.

30. Применение конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.22 или 23, в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.

31. Применение частиц с покрытием по п.24 в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.

32. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, как определено в любом из пп.1-21.

33. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.22 или 23.

34. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение частиц с покрытием по п.24.

 

(57) Реферат / Формула:
Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту вирусного генома, которая представляет собой нуклеиновую кислоту генома вируса герпеса или последовательность, по меньшей мере на 80% ей гомологичную, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый из которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса и оперативно связаны с кодирующими последовательностями, и где

(a) более 10% и вплоть до 95% вирусных последовательностей, которые находятся в области вирусного генома, которая соответствует области, расположенной между 5'- и 3'-концами нуклеиновой кислоты вирусного генома в данной конструкции, отсутствуют в указанной конструкции, и

(b) нуклеиновая кислота вирусного генома составляет от 1 до 50 т.п.н. в длину.

2. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где конструкция представляет собой космиду или плазмиду.

3. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где в конструкции отсутствуют последовательности упаковки вируса и/или сайт инициации репликации вируса.

4. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где более 20% и вплоть до 85% последовательностей вирусного генома удалено.

5. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где более 30% и вплоть до 75% последовательностей вирусного генома удалено.

6. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где эндогенные регуляторные элементы экспрессии гена оперативно связаны с их природными кодирующими последовательностями.

7. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где последовательность более чем в 500 п.н., расположенная выше и/или ниже промотора эндогенных элементов экспрессии гена, идентична или по меньшей мере на 90% гомологична эндогенным последовательностям генома вируса герпеса.

8. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где два или более эндогенных элемента регуляции гена происходят из последовательных генов генома вируса герпеса.

9. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где три или более эндогенных элемента регуляции гена происходят из последовательных генов в геноме вируса герпеса.

10. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два эндогенных промотора индуцируются в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса.

11. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два этих эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена или же все элементы происходят либо от предранних вирусных генов, либо от ранних вирусных генов.

12. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена являются различными.

13. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где вирус герпеса выбран из вируса простого герпеса (HSV), цитомегаловируса (CMV) и вируса Эпштейна-Барр (EBV).

14. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.13, где вирусом является HSV, который выбран из HSV-1 и HSV-2.

15. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из вируса простого герпеса и по меньшей мере каждый из двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена содержит эндогенный промотор, выбранный из группы, состоящей из промоторов генов ICP0, ICP4, ICP22 и IСР27.

16. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из HSV-2 и вирусные последовательности удалены из указанной конструкции одним или несколькими из следующих способов:

(a) путем частичного гидролиза под действием EcoRI, с последующим повторным лигированием;

(b) путем гидролиза под действием Bst 11071 и ScaI, с повторным лигированием;

(c) путем гидролиза под действием Nsi, с последующим повторным лигированием;

(d) путем частичного гидролиза под действием фермента BstXI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей между ICP27 и ICP0;

(e) путем полного гидролиза под действием фермента BspHI, с последующим частичным гидролизом под действием фермента BsiWI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей, смежных с ICP22;

(f) путем гидролиза под действием фермента SrfI, с последующим повторным лигированием для удаления последовательностей между ICP4 и ICP0; и

(g) путем полного гидролиза под действием фермента BstXI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей между ICP27 и ICP0.

17. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из HSV-1 и вирусные последовательности удалены из конструкции в целях исключения, по существу, всех последовательностей HSV-1, не относящихся к кодирующим последовательностям ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27.

18. Конструкция нуклеиновой кислоты по пп.14-17, где указанная конструкция содержит промоторы ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27, оперативно связанные с их природными кодирующими последовательностями.

19. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где две или более кодирующих последовательности оперативно связаны с эндогенными регуляторными элементами экспрессии гена, кодирующими антигены.

20. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где указанная отсутствующая область содержит все промежуточные последовательности или их часть, расположенные между двумя смежными эндогенными регуляторными элементами экспрессии гена и их кодирующими последовательностями.

21. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где отсутствующая область соответствует одному или нескольким генам, присутствующим в области вирусного генома, кроме по меньшей мере двух эндогенных регуляторных элементов экспрессии гена, активных в одной и той же фазе жизненного цикла вируса.

22. Способ создания конструкции нуклеиновой кислоты для ее непосредственного введения субъекту в целях выработки у этого субъекта иммунного ответа, где указанный способ предусматривает

(a) встраивание нуклеиновой кислоты генома вируса герпеса или последовательности, по меньшей мере на 80% ей гомологичной, в остов вектора, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома составляет от 1 до 50 т.п.н. в длину и содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый их которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетке млекопитающего, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса, и

(b) делецию некоторых или всех вирусных последовательностей из указанной нуклеиновой кислоты вирусного генома, за исключением по меньшей мере двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, которые присутствуют в области вирусного генома, которая соответствует области, расположенной между 5'- и 3'-концами нуклеиновой кислоты вирусного генома указанной конструкции, где указанную делецию осуществляют либо до, либо во время, либо после встраивания нуклеиновой кислоты вирусного генома в остов вектора,

где созданная конструкция соответствует тому, как определено в любом из предшествующих пунктов.

23. Способ по п.22, дополнительно предусматривающий покрытие конструкцией частиц, подходящих для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки.

24. Частицы с покрытием, подходящие для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, где указанные частицы включают в себя частицы-носители, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 или полученной способом, как определено в п.22 или 23.

25. Дозировочный сосуд, используемый в устройстве для опосредуемой частицами доставки и содержащий частицы с покрытием по п.24.

26. Устройство для опосредуемой частицами доставки, загруженное частицами с покрытием по п.24.

27. Вакцина, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.

28. Способ in vitro осуществления экспрессии требуемого полипептида в клетке млекопитающего, где указанный способ предусматривает перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 или полученной способом по п.22 или 23.

29. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.

30. Применение конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.22 или 23, в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.

31. Применение частиц с покрытием по п.24 в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.

32. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, как определено в любом из пп.1-21.

33. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.22 или 23.

34. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение частиц с покрытием по п.24.

 

---

008247
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и иммунологии, а в общих чертах, к способам экспрессии генов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот для экспрессии полипептидов и к их применению для продуцирования иммунного ответа у индивида путем иммунизации, а в частности иммунизации нуклеиновой кислотой.
Предшествующий уровень техники
Стандартные стратегии вакцинации обычно предусматривают введение либо "живой", либо "убитой" вакцины (Ertl et al. (1996) J. Immunol. 156:3579-3582). Так называемыми "живыми" вакцинами являются аттенюированные микробы и рекомбинантные молекулы, полученные на основе "живого" вектора. "Убитыми" вакцинами являются вакцины, созданные на основе инактивированных целых патогенов и субъединичных вакцин, например растворимых субъединиц патогена или субъединиц белка.
Вообще говоря, "живые" вакцины могут быть с успехом использованы для достижения эффективного иммунного ответа у иммунизированных индивидов, однако, такие вакцины могут представлять определенную опасность для индивидов с нарушенным иммунитетом или для беременных женщин и могут превращаться в патогенные микроорганизмы, либо они могут быть контаминированы другими патогенами (Hassett et al. (1996) Trends in Microbiol. 8:307-312). "Убитые" вакцины, такие как субъединичные вакцины, являются безопасными, в отличие от живых вакцин. Поскольку субъединичные вакцины не содержат целого патогена, они также позволяют решить проблему, связанную с иммуномодулирующими вирусными белками, которые могут экспрессироваться из аттенюированных вирусных вакцин и которые могут снижать эффективность вакцинации. Однако "убитые" вакцины, а в частности субъединичные вакцины, часто не продуцируют соответствующего и/или эффективного иммунного ответа у иммунизо-ванных индивидов.
Одним из возможных способов повышения эффективности субъединичных вакцин является создание вакцины, содержащей множество субъединиц. Иммунизация множеством антигенов является желательной потому, что такая иммунизация обычно индуцирует иммунный ответ более широкого спектра, который может обеспечивать лучшую защиту, чем иммунизация отдельно взятым антигеном. Использование вакцин, содержащих множество субъединиц, также позволяет избежать необходимости в идентификации одного конкретного антигена, способного индуцировать протективный ответ. Это может оказаться особенно важным для индуцирования клеточных иммунных ответов у аутбредных популяций, в которых индивиды могут широко варьировать по их способности индуцировать ответ на отдельный генный продукт, а поэтому не существует какого-либо антигена, способного индуцировать протективный иммунный ответ у всей популяции в целом.
Вакцины могут быть введены индивиду, подвергаемому иммунизации, различными способами. Совсем недавно был описан метод прямого введения плазмидной ДНК путем внутримышечной инъекции (Wolff et al. (1990) Science 247:1465:1468) или чрескожной инъекции шприцем с иглой (Raz et al. (1994) PNAS USA 91:9519-9523). Таким образом, индивиду была введена конструкция, кодирующая антиген, а не сам антиген. Такие вакцины, содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, называются ДНК-вакцинами.
Другими методами доставки ДНК-вакцин является биобаллистическая доставка ДНК или опосредованная частицами доставка ДНК, а также использование безыгольного устройства для опосредованной частицами доставки, а именно для введения микроскопических золотых сфер, покрытых ДНК, непосредственно в клетки эпидермиса (Yang et al. (1990) PNAS USA 87:9568-9572). Так, например, для доставки нуклеиновых кислот в целях иммунизации могут применяться различные методы доставки, включая методы с использованием частиц, которые позволяют доставлять покрытые нуклеиновой кислотой микрочастицы в ткань-мишень (см., например, патент США № 5865796, с правом совместного владения, выданный 2 февраля 1999).
Уровень эффективной защиты, достигаемый с помощью ДНК-вакцин, аналогичен уровню, наблюдаемому при использовании стандартных белковых субъединичных вакцин и инактивированных или ат-тенюированных вирусных вакцин, хотя этот уровень традиционно ниже уровня, наблюдаемого у выздоравливающих животных после излечения от природной инфекции (Manickan et al. (1997) Critical Review Immunol. 17:139-154). Было показано, что методы опосредованной частицами иммунизации нуклеиновыми кислотами позволяют продуцировать как гуморальный, так и цитотоксический Т-лимфоцитарный иммунный ответы после доставки в эпидермис нанограммовых количеств ДНК (Pertmer et al. (1995) Vaccine 13:1427-1430). Такие методы опосредованной частицами доставки сравнивали с методами инокуляции нуклеиновыми кислотами других типов, и было обнаружено их заметное преимущество. Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83, Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482 и Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на том факте, что совместная эволюция группы генов в вирусных геномах приводит к минимизации взаимного влияния экспрессии этих генов и к максимизации стабильности области, содержащей эти гены. Такая координированная эволюция вирусных генов может быть использована в целях создания экспрессионных конструкций для коэкспрессии гетерологичных коди
- 1 -
008247
рующих последовательностей. Для этого берут область геномной нуклеиновой кислоты, содержащей два или более таких вирусных генов, и природные кодирующие последовательности вирусных генов заменяют гетерологичными кодирующими последовательностями для их последующей экспрессии. Поэтому такие конструкции имеют преимущества с точки зрения совместимости вирусных промоторов и других используемых регуляторных элементов, а следовательно, такие конструкции обладают повышенной стабильностью и минимальной интерференцией.
Затем для оптимизации конструкции в геномную нуклеиновую кислоту могут быть введены другие модификации.
Следовательно, настоящее изобретение относится к конструкциям, из которых может быть экспрес-сировано множество гетерологичных кодирующих последовательностей. Использование одной конструкции для экспрессии нескольких гетерологичных полипептидов, вместо экспрессии каждого полипептида из отдельной конструкции, облегчает изготовление конструкции и контроль за ее качеством. По всей вероятности, это также позволит минимизировать трудности, связанные с получением разрешения регуляторных органов на создание такой конструкции. Повышение стабильности конструкции и снижение интерференции благодаря использованию эндогенных элементов регуляции экспрессии генов вирусной геномной нуклеиновой кислоты отличается по сравнению с конструкциями, собранными путем встраивания множества генов с их собственными промоторами или с другими промоторами, обычно используемыми в векторах для достижения высокого уровня экспрессии, поскольку такие конструкции часто обнаруживают нестабильность и нежелательное взаимодействие между промоторами.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей вирусную геномную нуклеиновую кислоту, где указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых включает в себя эндогенный промотор, где эти эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, где
(a) по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов содержат промоторы, которые являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса и каждый из которых функционально присоединен к отдельной гетерологичной кодирующей последовательности, встроенной в вирусную геномную нуклеиновую кислоту; и
(b) вирусная геномная нуклеиновая кислота имеет длину от 1 до 50 т.п.н., за исключением гетеро-логичных последовательностей, встроенных в эту нуклеиновую кислоту.
Настоящее изобретение также относится к способу генерирования конструкции нуклеиновой кислоты для ее непосредственного введения индивиду в целях продуцирования у него иммунного ответа, где указанный способ предусматривает
(a) встраивание вирусной геномной нуклеиновой кислоты в остов вектора, где указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых содержит эндогенный промотор, где эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, и
(b) функциональное присоединение эндогенных промоторов по меньшей мере двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена в вирусной геномной нуклеиновой кислоте к гетерологичным кодирующим последовательностям, которое осуществляют до, во время или после встраивания вирусной геномной нуклеиновой кислоты в остов вектора,
где указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота имеет длину от 1 до 50 т.п.н., за исключением гетерологичных последовательностей, встроенных в эту нуклеиновую кислоту.
Кроме того, настоящее изобретение относится к частицам, имеющим покрытия и подходящим для их доставки с помощью устройства для такой доставки, где указанные частицы включают частицы-носители, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты, где указанная конструкция содержит вирусную геномную нуклеиновую кислоту, которая содержит по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых содержит эндогенный промотор, где эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, где
(a) по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов содержат промоторы, каждый из которых функционально присоединен к отдельной гетерологичной кодирующей последовательности, встроенной в вирусную геномную нуклеиновую кислоту; и
(b) указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота имеет длину от 1 до 50 т.п.н., за исключением гетерологичных последовательностей, встроенных в эту нуклеиновую кислоту.
Настоящее изобретение также относится
к дозировочному сосуду для опосредованной частицами доставки, содержащему частицы с покрытием, полученные в соответствии с настоящим изобретением; и
к устройству для опосредуемой частицами доставки, нагруженному частицами с покрытием, полученными в соответствии с настоящим изобретением.
- 2 -
008247
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу осуществления экспрессии нужного полипептида в клетке млекопитающего, где указанный способ предусматривает перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей вирусную геномную нуклеиновую кислоту, которая содержит по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых включает в себя эндогенный промотор, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, где
по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов содержат промоторы, каждый из которых функционально присоединен к гетерологичной кодирующей последовательности, встроенной в вирусную геномную нуклеиновую кислоту; и
указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота имеет длину от 1 до 50 т.п.н., за исключением гетерологичных последовательностей, встроенных в эту нуклеиновую кислоту.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу иммунизации индивида нуклеиновой кислотой, предусматривающему введение этому индивиду эффективного количества частиц с покрытием, где указанные частицы являются подходящими для введения с помощью устройства для опосредованной частицами доставки, где указанные частицы включают частицы-носители, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей вирусную геномную нуклеиновую кислоту, которая включает по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых содержит эндогенный промотор, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, где
по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов содержат промоторы, каждый из которых функционально присоединен к гетерологичной кодирующей последовательности, встроенной в вирусную геномную нуклеиновую кислоту; и
указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота имеет длину от 1 до 50 т.п.н., за исключением гетерологичных последовательностей, встроенных в эту нуклеиновую кислоту.
Настоящее изобретение также относится к способу создания конструкции нуклеиновой кислоты для ее прямого введения индивиду в целях выработки у этого индивида иммунного ответа, где указанный способ предусматривает
(a) встраивание вирусной геномной нуклеиновой кислоты в остов вектора, где указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых содержит эндогенный промотор, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, и
(b) удаление из указанной вирусной геномной нуклеиновой кислоты некоторых или всех вирусных последовательностей, за исключением по меньшей мере двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, которые присутствуют в области вирусного генома, соответствующей области, расположенной между 5'- и 3'-концами вирусной геномной нуклеиновой кислоты указанной конструкции, где указанное удаление осуществляют до, во время или после встраивания вирусной геномной нуклеиновой кислоты в остов вектора,
и где длина указанной вирусной геномной нуклеиновый кислоты, встроенной в указанный остов вектора, составляет от 1 до 50 т.п.н.
Настоящее изобретение также относится к способу осуществления экспрессии нужного полипептида в клетке млекопитающего, где указанный способ предусматривает перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом согласно изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу иммунизации индивида нуклеиновой кислотой, предусматривающему введение этому индивиду эффективного количества частиц с покрытием, где указанные частицы являются подходящими для введения с помощью устройства для опосредованной частицами доставки, где указанные частицы включают частицы-носители, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты, полученной способом согласно изобретению.
Эти и другие цели, аспекты, варианты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны для каждого специалиста из нижеследующего описания.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1 представлены плазмидные карты космиды 23 и конструкции ОР23-6 и различных промежуточных конструкций, расположенных между ними.
На фиг. 2 представлены плазмидные карты конструкций OPhsv1-1 и OPhsv1-6 и различных промежуточных конструкций, расположенных между ними.
Подробное описание изобретения
Перед подробным описанием настоящего изобретения следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно проиллюстрированными параметрами молекул или способов, и само собой разумеется, что эти молекулы и способы могут варьировать. Поэтому настоящее изобретение не ограничивается конкретными антигенами или нуклеотидными последовательностями, кодирующими
- 3 -
008247
антиген.
Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не должна рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение может быть осуществлено, если это не оговорено особо, стандартными методами вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, техники реком-бинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) and Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields & D.M. Knipe, eds.). Следует также отметить, что описанные методы могут быть адаптированы для применения в различных целях.
Все цитируемые выше или ниже публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Следует отметить, что используемые в настоящем описании и в формуле изобретения существительные в единственном числе могут означать и существительные множественного числа, если это не оговорено особо.
Определения
Если это не оговорено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятые значения, известные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Определение этих терминов приводится ниже. Хотя для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы различные методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь методам и материалам, однако, предпочтительными являются материалы и методы, описанные в настоящем изобретении.
Термин "вакцинная композиция" означает любую фармацевтическую композицию, содержащую антиген (например, полинуклеотид, кодирующий антиген), где указанная композиция может быть использована для предупреждения или лечения заболевания или состояния у индивида. Этот термин также охватывает субъединичные вакцины, то есть вакцинные композиции, содержащие антигены, которые представляют собой отдельные и дискретные антигены, не присутствующие в организме, с которым они ассоциируются в природе, а также композиции, содержащие целые "убитые", аттенюированные или инактивированные бактерии, вирусы, паразиты или другие микробы.
Используемый здесь термин "иммунизация нуклеиновой кислотой" означает введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей один или несколько выбранных антигенов, в клетку-хозяина для in vivo экспрессии такого антигена или антигенов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть непосредственно введена индивиду-реципиенту, например, путем стандартной внутримышечной или чрескожной инъекции; чрескожной доставки частиц; ингаляции; местного применения, или путем перорального введения, интраназального введения или введения через слизистую. Альтернативно, эта молекула может быть введена ex vivo в клетки, взятые у индивида. В последнем случае клетки, содержащие нужную молекулу нуклеиновой кислоты, снова вводят индивиду для того, чтобы у этого индивида мог вырабатываться иммунный ответ против антигена, кодируемого данной молекулой нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для такой иммунизации, обычно именуются здесь "конструкциями нуклеиновой кислоты".
Термин "чрескожная" доставка означает интрадермальное (например, в дерму или эпидермис), трансдермальное (например, "чрескожное") и трансмукозальное введение, то есть доставку агента в кожу или через кожу либо в ткань или через ткань слизистой (см., например, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft & Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson & Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); and Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus & Berner (eds.), CRC Press (1987)). Таким образом, этот термин также означает доставку с помощью устройства для введения частиц (например, безыгольным шприцем), как описано в патенте США № 5630796, а также опосредуемую частицами доставку, как описано в патенте США № 5865796.
Термин "коровый носитель" означает частицу-носитель, на которую нанесена нуклеиновая кислота (например, ДНК) в целях придания определенной частице нужного размера, а также достаточно высокой плотности для сообщения ей импульса, необходимого для прохождения через клеточную мембрану, так, чтобы данная нуклеиновая кислота могла быть доставлена методами опосредуемой частицами доставки, описанными, например, в патенте США № 5100792. Подходящими коровыми носителями обычно являются такие материалы, как вольфрам, золото, платина, феррит, полистирол и латекс. См., например, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer (1994), Yang N. ed., Oxford University Press, New York, NY, pages 10-11.
Термин "безыгольный шприц" означает инструмент, обеспечивающий чрескожную доставку композиции, состоящей из частиц, где такую доставку осуществляют без традиционного прокола кожи иглой. Безыгольный шприц, используемый в настоящем изобретении, обсуждается ниже.
Термин "антиген" означает любой агент, обычно макромолекулу, которая может вырабатывать им
- 4 -
008247
мунный ответ у индивида. Этот термин может быть использован для обозначения отдельной макромолекулы или гомогенной или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. Используемый здесь термин "антиген" в общих чертах означает молекулу белка или ее часть, содержащую один или несколько эпитопов. В соответствии с настоящим изобретением антигены могут быть получены из какого-либо подходящего источника либо они могут происходить от этого источника. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением термин "антиген" включает в себя белок, который в своей нативной последовательности имеет модификации, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по своей природе), при условии, что такой белок будет сохранять достаточный уровень иммуногенности. Такие модификации могут быть созданы искусственно, например путем сайт-направленного мутагенеза, либо они могут возникать спонтанно, например вследствие хозяйских мутаций, продуцирующих антигены.
Иммунологическим ответом, вырабатываемым данным антигеном, может быть клеточный антиген-специфический иммунный ответ, или гуморальный ответ в виде продуцирования антитела, либо тот и другой. Такой антиген может, например, происходить от любых известных вирусов, бактерий, паразитов, растений, простейших или грибов. Термин "антиген" также включает в себя опухолевые антигены. Этот термин также включает в себя аутоантигены и антигены, происходящие от аллергенов. Аналогичным образом, в определение антигена также входит олигонуклеотид или полинуклеотид, экспрессирующий антиген, например, применяемый при ДНК-иммунизации. Синтетическими антигенами также являются, например, полиэпитопы; фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетические антигены (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier A. (1997) Immunol., and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference,
Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998).
Термин "иммунный ответ" на нужный антиген означает выработку у индивида гуморального и/или клеточного иммунного ответа на данный антиген. В соответствии с настоящим изобретением термин " гуморальный иммунный ответ" означает иммунный ответ, опосредованный молекулами антитела, а термин "клеточный иммунный ответ" означает иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами.
Термин "полипептид", используемый здесь в самом широком смысле, означает соединение, состоящее из двух или более субъединичных аминокислот, аминокислотных аналогов или других пептидомимети-ков. Такие субъединицы могут быть связаны пептидными связями или другими связями, например слож-ноэфирными связями, эфирными связями и т.п. Используемый здесь термин "аминокислота" означает природные и/или неприродные или синтетические аминокислоты, включая глицин и оптические D- или L-изомеры, а также аминокислотные аналоги и пептидомиметики. Если пептидная цепь является короткой, то такой пептид, состоящий из трех или более аминокислот, обычно называется олигопептидом. Если пептидная цепь является длинной, то такой пептид обычно называется полипептидом или белком.
Термин "патоген", используемый в широком смысле, означает источник любой молекулы, которая вырабатывает иммунный ответ. Такими патогенами являются, но не ограничиваются ими, вирулентные или аттенюированные вирусы, бактерии, грибы, простейшие, паразиты, раковые клетки и т. п. Обычно иммунный ответ вырабатывается одним или несколькими пептидами, продуцируемыми этими патогенами. Как подробно описано ниже, нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенные пептиды, происходящие от этих и других патогенов, используют для генерирования иммунного ответа, имитирующего ответ на природную инфекцию. Как будет очевидно из описания настоящего изобретения, эти методы предусматривают использование нуклеиновых кислот, кодирующих антигены, полученные от более чем одного патогена.
Используемые здесь термины "молекула нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" являются взаимозаменяемыми и означают полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеоти-ды, либо рибонуклеотиды, либо их аналоги. Полинуклеотиды могут иметь трехмерную структуру и могут осуществлять любую функцию, как известную, так и неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются ген, генный фрагмент, экзоны, интроны, открытая рамка считывания, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинук-леотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, космиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, нуклеиновокислотные зонды и праймеры.
Полинуклеотид обычно состоит из специфической последовательности из четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (С), гуанина (G) и тимина (Т) (а в случае, если указанным полинуклео-тидом является РНК, то вместо тимина (Т) присутствует урацил (U)). Таким образом, термин "полинук-леотидная последовательность" означает буквенное представление полинуклеотидной молекулы. Это буквенное представление может быть введено в базу данных компьютера, имеющего центральный процессор, и используется в биоинформатике, например в функциональной геномике и в поиске гомологии.
Термин "конструкция" означает любую молекулу, способную переносить последовательности нуклеиновой кислоты (например, невирусные векторы, частицы-носители, липосомы и вирусные векторы) в клетки-мишени. Термин "плазмидная конструкция" означает внехромосомный генетический элемент, способный к саморепликации в клетке-хозяине. "Космида" представляет собой плазмидную конструк
- 5 -
008247
цию специфического типа, в которой используются космидные (cos) последовательности бактериофага лямбда (К). Термины "cos-концы" или "cos-сайты" означают одноцепочечные комплементарные удлинения КДНК, состоящие из 12 пар оснований. Космиды могут содержать крупные вставки, например размером приблизительно 50 т.п.н., тогда как обычные плазмиды могут содержать вставки размером примерно ниже 10 т.п.н. Благодаря своей способности нести крупные фрагменты космиды могут быть использованы для конструирования геномных библиотек, и они могут быть также использованы в тех случаях, когда необходимо введение крупных вставок. Обычно термины "вектор", "конструкция", "экспрес-сирующий вектор" и "вектор для переноса генов" означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную регулировать экспрессию нужного гена и переносить генные последовательности в клетки-мишени. Таким образом, этот термин включает в себя клонирующие и экспрессирующие носители, а также вирусные векторы.
Термин "геномная библиотека" означает набор рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, которые, взятые вместе, представляют собой целый или почти целый геном организма. В том случае, когда данная библиотека представляет почти, но не весь геном, она может, например, содержать более чем 95, 98, 99 или даже 99,9% последовательностей данного генома.
Термин "кодирующая последовательность" или последовательность, которая "кодирует" выбранный полипептид, означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo при ее нахождении под контролем соответствующих регуляторных последовательностей (или "регуляторных элементов"). Границы кодирующей последовательности определены старт-кодоном у 5' (амино)-конца и кодоном терминации трансляции у 3' (карбокси)-конца. Кодирующей последовательностью может быть, не ограничиваясь ими, кДНК, происходящая от вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные ДНК-последовательности, происходящие от вирусной или прокариотической ДНК, и даже синтезированные ДНК-последовательности. Последовательность терминации транскрипции может быть локализована со стороны 3'-конца по отношению к кодирующей последовательности. Транскрипция и трансляция кодирующих последовательностей обычно регулируются "регуляторными элементами", включая, но не ограничиваясь ими, промоторы транскрипции, энхансерные элементы транскрипции, последовательности Шайна-Дальгарно, сигналы терминации транскрипции, последовательности полиаденилирования (локализованные со стороны 3'-конца по отношению к кодону терминации трансляции), последовательности для оптимизации инициации трансляции (локализованные со стороны 5'-конца по отношению к кодирующей последовательности) и последовательности терминации трансляции. Термин "элемент регуляции экспрессии генов" означает нуклеотидную последовательность, содержащую, как минимум, промотор. Такой элемент может, кроме того, содержать другие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующих последовательностей, функционально присоединенных к промотору, или влияющие на такую экспрессию. Компоненты этих элементов необязательно должны быть смежными, то есть они могут быть разделены промежуточными последовательностями. Компоненты этих элементов могут влиять на экспрессию кодирующих последовательностей на уровне транскрипции, стабильности РНК, процессинга и/или трансляции РНК. Обычно такой элемент не содержит кодирующих последовательностей, с которыми они функционально связаны. В некоторых случаях, элемент регуляции экспрессии гена может содержать природный ген либо, в основном, состоять из такого гена, кроме кодирующей последовательности данного гена.
Термин "промотор" означает нуклеотидную последовательность, которая регулирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего полипептид. Такими промоторами могут быть индуцибельные промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально присоединенной к промотору, индуцируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т.п.), репрессируемые промоторы (где экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально присоединенной к промотору, инги-бируется аналитом, кофактором, регуляторным белком и т. п.) и конститутивные промоторы. При этом подразумевается, что термин "промотор" или "регуляторный элемент" включает полноразмерные области промотора и функциональные сегменты (например, регулирующие транскрипцию или трансляцию) этих областей.
Термин "эндогенный элемент регуляции экспрессии гена" означает элемент, регулирующий экспрессию гена, который происходит от того же самого организма, от которого происходят некоторые или все последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующие в этом организме. Таким образом, эндогенный элемент регуляции экспрессии гена обычно имеет последовательности, расположенные выше, или ниже, либо выше и ниже от этого гена, которые происходят от того же самого организма, что и сам элемент, регулирующий экспрессию гена, и которые предпочтительно соответствуют некоторым или всем последовательностям, фланкирующим элемент регуляции экспрессии гена в геноме данного организма. Обычно некоторые или все фланкирующие последовательности, происходящие от того же самого организма, что и элемент, регулирующий экспрессию гена, могут быть локализованы в том же самом положении по отношению к элементу регуляции экспрессии гена, которое они занимали в геноме данного организма, и могут быть расположены непосредственно выше и/или ниже данного элемента регуляции
- 6 -
008247
экспрессии гена. Таким образом, в случае конструкций нуклеиновых кислот согласно изобретению эндогенный элемент регуляции экспрессии гена будет обычно происходить или частично происходить от вирусных геномных последовательностей нуклеиновой кислоты, присутствующих в данной конструкции.
Термин "гетерологичная кодирующая последовательность" означает кодирующую последовательность, функционально присоединенную к элементу регуляции экспрессии гена, а в частности к промотору, с которым она обычно не ассоциируется в природе. В основном, две этих последовательности могут быть функционально присоединены методами рекомбинантных ДНК. Такая гетерологичная кодирующая последовательность и функционально связанный с ней эндогенный элемент регуляции экспрессии гена могут происходить от одного и того же организма, или, альтернативно, они могут происходить от разных организмов. Гетерологичная кодирующая последовательность может, например, представлять собой любые кодирующие последовательности, упомянутые выше, а в частности она может кодировать гетероло-гичный антиген.
Термин "выделенная полинуклеотидная молекула" означает дискретную или отдельную от целого организма молекулу нуклеиновой кислоты, с которым данная молекула ассоциирована в природе; или молекулу нуклеиновой кислоты, не содержащую всех тех последовательностей или части тех последовательностей, с которыми она обычно ассоциирована в природе; или последовательность, которая существует в природе, но которая имеет ассоциированные с ней гетерологичные последовательности (определяемые ниже). Говорят, что последовательность "выделена или получена из данной молекулы", если она имеет такую же или в основном такую же последовательность пар оснований, как и область молекулы-источника, ее кДНК или ее комплементы, либо если она обладает идентичностью последовательности, как описано ниже.
Термин "функционально присоединенный" относится к такому расположению элементов, при котором конфигурация описанных выше компонентов обеспечивает осуществление их обычных функций. Таким образом, данный элемент регуляции экспрессии гена, а в частности промотор, который функционально присоединен к кодирующей последовательности (например, кодирующей нужный антиген), обладает способностью осуществлять экспрессию кодирующей последовательности в том случае, если присутствуют соответствующие ферменты. Промотор или другие регуляторные элементы необязательно должны быть смежными с кодирующей последовательностью, при условии, что их функция будет направлена на регуляцию ее экспрессии. Так, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут присутствовать промежуточные нетранслированные, но уже транскрибированные последовательности, но, при этом промоторная последовательность все еще может рассматриваться как последовательность, "функционально присоединенная" к кодирующей последовательности.
Термин "рекомбинантный", используемый для описания молекулы нуклеиновой кислоты, относится к полинуклеотиду геномной последовательности, кДНК, полусинтетической или синтетической последовательности, которые благодаря своему происхождению или модификации: (1) не ассоциируются с целым полинуклеотидом или с его частью, с которыми они ассоциируются в природе; и/или (2) связаны с полинуклеотидом, который не ассоциирован с ними в природе. Термин "рекомбинантный" относится как к ДНК, так и к РНК-молекулам, подпадающим под это определение. Термин "рекомбинантный", используемый по отношению к белку или полипептиду, относится к полипептиду, продуцируемому путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида.
Гомологи полинуклеотидов описаны ниже. Обычно полинуклеотид считается гомологичным другому полинуклеотиду, если их последовательности являются гомологичными по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 90%, а более предпочтительно по меньшей мере на 95, 97 или 99%. Способы определения гомологии хорошо известны специалистам и будут понятны из нижеследующего описания, в котором приводится вычисление гомологии, исходя из идентичности нуклеиновых кислот. Такая гомология может охватывать область, состоящую по меньшей мере из 15, предпочтительно по меньшей мере из 30, например по меньшей мере из 40, 60, или 100, или более смежных нуклеотидов.
Методы измерения гомологии или идентичности полинуклеотидов, а также гомологии или идентичности полипептидов известны специалистам. Так, например, блок UWGCG представлен в программе BESTFIT, которая может быть использована для вычисления гомологии (например, с использованием параметров по умолчанию) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p. 387-395).
Алгоритмы PILEUP и BLAST также могут быть использованы для вычисления гомологии или для выравнивания последовательностей (обычно по их параметрам по умолчанию), например, как описано Altschul S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
Программное обеспечение для осуществления BLAST-анализа является общедоступным и имеется в Национальном центре информации по биотехнологии (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм предусматривает сначала идентификацию пары последовательностей с высокими положительным весом (HSP) путем идентификации коротких слов W в запрашиваемой последовательности, которая либо соответствует, либо удовлетворяет определенной пороговой положительной оценке Т при выравнивании со словом той же самой длины в последовательности базы данных. Т означает пороговую оценку соседнего слова (Altschul et al., см. выше). Эти начальные совпадения соседних слов играют роль затравки для инициации поиска в целях обнаружения HSP, содержащих эти совпадения. Поиск совпадения слов продол
- 7 -
008247
жают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен суммарный вес выравнивания. Расширение поиска наилучших совпадений слов в каждом направлении прекращают, если суммарный вес выравнивания становится равным 0 или ниже, что обусловлено накоплением одного или нескольких выравниваний с отрицательным весовым вычетом; либо если достигнут конец любой последовательности. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLAST длина слова (W), используемая по умолчанию, равна 11; число выравниваний, проводимых с помощью оценочной матрицы BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) (В) составляет 50; математическое ожидание (Е) составляет 10; M=5; N=4; при этом осуществляют сравнение обеих нитей.
Алгоритм BLAST позволяет проводить статистический анализ сходства между двумя последовательностями; см., например, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Одним из критериев сходства, определяемого с помощью алгоритма BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая указывает на вероятность случайного соответствия между двумя нуклеотид-ными последовательностями или аминокислотными последовательностями. Так, например, последовательность считается аналогичной другой последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности со второй последовательностью составляет менее чем примерно 1, предпочтительно менее чем примерно 0,1, а более предпочтительно менее чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно менее чем примерно 0,001.
Гомологи обычно гибридизируются с релевантным полинуклеотидом на уровне, значительно превышающем фоновый уровень. По своей интенсивности уровень сигнала, генерируемого при взаимодействии гомолога и полинуклеотида, обычно отличается от "фоновой гибридизации" по меньшей мере в 10 раз, а предпочтительно по меньшей мере в 100 раз. Интенсивность взаимодействия может быть измерена, например, путем радиоактивного мечения зонда, например 32Р. Селективная гибридизация обычно достигается с использованием среды, создающей условия высокой жесткости (например, в присутствии 0,03М хлорида натрия и 0,003М цитрата натрия при температуре примерно от 50 до 60°С).
Гибридизация в жестких условиях может быть осуществлена с использованием 50% формамида, в 5х раствора Денхардта, 5х SSC, 0,1% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, а условия отмывки могут быть созданы с использованием 2х SSC, 0,1% ДСН при 37°С, а затем 1x SSC, 0,1% ДСН при 68°С. Соответствующие условия гибридизации могут быть определены любым специалистом. См., например, Sambrook et al., см. выше.
Гомолог может отличаться от последовательности в релевантном полинуклеотиде менее чем на 3, 5, 10, 15, 20 или более мутаций (где каждая мутация может представлять собой замену, делецию или ин-серцию). Эти мутации могут присутствовать в области длиной по меньшей мере 30, например по меньшей мере 40, 60 или 100 или более смежных нуклеотидов данного гомолога. Если полинуклеотид кодирует полипептид, то предпочтительными заменами являются "консервативные" замены кодируемых аминокислот. Эти замены указаны в нижеследующей таблице. Консервативными заменами аминокислот является замены аминокислот, находящихся в одном и том же блоке во втором столбце таблицы, а предпочтительно в той же самой строке в третьем столбце.
Алифатические
Неполярные
GAP
ILV
Полярные незаряженные
CSTM
Полярные заряженные
Ароматические
HFWY
Используемый здесь термин "адъювант" относится к любому материалу, который усиливает действие лекарственного средства, антигена, полинуклеотида, вектора или т.п. При этом подразумевается, хотя и не всегда может быть точно установлено, что данные молекулы обладают биологической активностью, аналогичной активности молекул дикого типа или очищенных пептидных адъювантов (например, рекомбинантно продуцированных молекул или их мутеинов), а из этого следует, что нуклеиновые кислоты, кодирующие эти молекулы, также входят в рамки объема и существа изобретения.
Используемый здесь термин "лечение" имеет следующий смысл: предупреждение инфекции или повторной инфекции; ослабление или устранение симптомов; уменьшение числа или полное уничтожение патогенов; и ослабление, предупреждение, облегчение или устранение заболевания или расстройства. Лечение может быть осуществлено профилактически (то есть до инфицирования) или терапевтически (например, после инфицирования).
Используемые здесь термины "индивид" и "субъект" являются взаимозаменяемыми и обозначают
- 8 -
008247
любой член семейства хордовых Subphylum chordata, включая, но не ограничиваясь ими, человека и других приматов, не относящихся к человеку, таких как шимпанзе и другие виды обезьян и мартышек; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних питомцев, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашнюю птицу, диких птиц и дичь, таких как куры, индейки и другие птицы семейства куриных, утки, гуси и т.п. Этот термин не определяет конкретный возраст животного. Таким образом, подразумевается, что этот термин охватывает как взрослых, так новорожденных особей. При этом предусматривается, что описанные здесь способы могут быть применены к вышеуказанным видам позвоночных, поскольку иммунная система всех этих позвоночных функционирует аналогичным образом.
Общее описание изобретения
Перед подробным описанием настоящего изобретения следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными параметрами композиций или способов и, само собой разумеется, что такие параметры могут варьироваться. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не должна рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают экспрессию множества антигенов из одной и той же конструкции, и к использованию этих конструкций для иммунизации нуклеиновой кислотой. Настоящее изобретение также относится к способам конструирования таких конструкций. Эти конструкции включают вирусную геномную нуклеиновую кислоту и два или более эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, присутствующих в вирусной геномной нуклеиновой кислоте и используемых для экспрессии нужных гетерологичных полипептидов. Экспрес-сируемые гетерологичные кодирующие последовательности встраивают в указанные конструкции так, чтобы они были функционально присоединены к выбранным эндогенным элементам регуляции экспрессии гена, а в частности к эндогенным промоторам этих элементов. Указанные конструкции обеспечивают эффективную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей, а в частности антиген-кодирующих генов в клетках-хозяевах.
Конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению обычно включают, а в некоторых вариантах осуществления изобретения, в основном, состоят из них, вирусную геномную нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии гена, каждый из которых содержит эндогенный промотор, где эти эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, где
(a) по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии гена содержат промоторы, которые являются активными в одной и той же фазе и каждый из которых функционально присоединен к отдельной гетерологичной кодирующей последовательности, встроенной в вирусную геномную нуклеиновую кислоту; и
(b) вирусная геномная нуклеиновая кислота имеет длину от 1 до 50 т.п.н., за исключением гетеро-логичных последовательностей, встроенных в эту нуклеиновую кислоту.
Преимуществами настоящего изобретения являются, но не ограничиваются ими, (i) высокая стабильность конструкции и низкий уровень взаимодействия между генами; (ii) использование массива антигенов (например, эпитопов), а не отдельного антигена, что позволяет получить конструкцию, которая наиболее точно имитирует природную инфекцию; (iii) осуществление совместной доставки антигенов в одну и ту же клетку для достижения координированной экспрессии множественных антигенов; (iv) вырабатывание иммунного ответа, аналогичного иммунному ответу, продуцируемому природной инфекцией, что обусловлено экспрессией множества антигенов; (v) вырабатывание иммунного ответа, который обладает более сильным протективным действием, чем иммунный ответ, продуцируемый природной инфекцией, например, благодаря тому, что выбранные антигены не являются иммунодоминантными антигенами или полипептидами, которые ингибируют иммунные ответы и которые могут присутствовать в интактных вирусных вакцинах; и (vi) стимуляция путей процессинга и презентации антигена, которая обычно приводит к выведению внутриклеточных инфекций.
Эндогенные элементы регуляции экспрессии гена
Вирусная геномная нуклеиновая кислота в конструкции согласно изобретению содержит по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии гена. Каждый эндогенный элемент регуляции экспрессии гена содержит эндогенный промотор. Однако, как правило, в случае необходимости, такой элемент может содержать другие нуклеотидные последовательности. В частности, такой элемент будет включать в себя нуклеотидные последовательности, необходимые для транскрипции и/или трансляции кодирующих последовательностей, к которым функционально присоединен эндогенный элемент регуляции экспрессии гена, или влияющие на такую транскрипцию и/или трансляцию. Во многих вариантах осуществления изобретения один или несколько таких элементов будет содержать, или, в основном, состоять из них, эндогенный ген, в котором кодирующие последовательности, обычно ассоциируемые с данным геном, заменены на гетерологичную кодирующую последовательность.
- 9 -
008247
Каждый эндогенный элемент регуляции экспрессии гена может содержать компоненты, которые необходимы для осуществления транскрипции кодирующих последовательностей, функционально присоединенных к этому элементу, либо которые влияют на эту транскрипцию. Эти компоненты могут включать в себя энхансерную последовательность или другую последовательность, которая модулирует экспрессию функционально присоединенных кодирующих последовательностей. В данном элементе могут присутствовать последовательности, которые модулируют конформацию и/или доступность кодирующих последовательностей и/или других последовательностей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения может также присутствовать эндогенная последовательность терминации транскрипции.
Эндогенный элемент регуляции экспрессии гена, как минимум, должен содержать эндогенный промотор. Таким промотором обычно является полноразмерный эндогенный промотор, то есть эндогенные последовательности, необходимые для обеспечения нормальной экспрессии кодирующих последовательностей, с которыми обычно связан этот эндогенный промотор в природе, и/или для обеспечения такой же специфичности и такого же уровня экспрессии гетерологичных кодирующих последовательностей, с которыми данный элемент функционально связан в конструкции согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения этот промотор может иметь в своей последовательности несколько модификаций. Так, например, могут быть введены замены, инсерции или делеции оснований, такие, например, как ни одной, две, пять, десять или более замен, инсерций и/или делеций. В других вариантах изобретения может быть введено большее число модификаций. Так, например, может быть введено от двух до пяти, от пяти до десяти, от десяти до двадцати или более делеций оснований. В некоторых случаях промотор может быть укорочен до минимальных последовательностей, необходимых для достижения экспрессии функционально присоединенных к нему кодирующих последовательностей, хотя обычно необходимости в этом не возникает. В некоторых вариантах изобретения эндогенные последовательности, расположенные между промотором и сайтом инициации транскрипции, могут быть сохранены.
Эндогенные элементы регуляции экспрессии гена могут также содержать последовательности, которые участвуют в трансляции или оказывают влияние на такую трансляцию. В указанном элементе могут присутствовать транскрибированные нетранслированные последовательности, ассоциированные с эндогенным геном, от которого происходит данный элемент. Так, например, некоторые или все транслированные 5'- и/или 3'-области указанного элемента могут быть сохранены. Могут быть также сохранены конкретные области, которые влияют на процессинг и/или стабильность транскрипта. Кроме того, могут быть сохранены последовательность Шайна-Дальгарно, старт-кодон и/или стоп-кодон. В указанном элементе могут быть сохранены последовательности, которые влияют на конформацию транскрипта, а особенно, если они влияют на уровень экспрессии кодирующих последовательностей, функционально присоединенных к указанному элементу.
Эндогенный элемент регуляции экспрессии гена не содержит ни одну из некодирующих последовательностей, от которых происходит эндогенный ген, хотя обратный вариант также возможен. Этот элемент может содержать эндогенный промотор и, необязательно, любую другую область, происходящую от эндогенного гена, кроме кодирующих последовательностей. Такой элемент может содержать эндогенный промотор в комбинации с одним или несколькими вышеупомянутыми элементами эндогенного гена. Эндогенный элемент регуляции экспрессии гена может содержать последовательности, которые в эндогенном гене могут быть расположены на некотором расстоянии друг от друга.
В указанном элементе могут отсутствовать некоторые из последовательностей в некодирующих областях эндогенного гена, например такие последовательности, которые не играют важной роли в транскрипции и/или трансляции либо не оказывают на них какого-либо влияния. В некоторых случаях могут быть использованы регуляторные элементы, обычно ассоциированные с гетерологичной кодирующей последовательностью, а не их аналоги от эндогенного гена, от которого происходит указанный элемент регуляции экспрессии гена. Так, например, 5'- или 3'-нетранслируемыми областями транскрипта могут быть области, обычно ассоциированные с гетерологичными кодирующими последовательностями. Ин-троны могут происходить от того же источника, что и гетерологичные кодирующие последовательности. В некоторых случаях могут быть использованы регуляторные области, происходящие от гетерологичных источников, отличающихся от источников гетерологичных кодирующих последовательностей.
Эндогенные элементы регуляции экспрессии гена могут происходить от любого подходящего вирусного гена, а в частности от любого вышеупомянутого вирусного гена.
Вирусная геномная нуклеиновая кислота в конструкции согласно изобретению содержит по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии гена и может, например, содержать два, три, четыре, пять или более эндогенных элементов регуляции экспрессии гена. Эти по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии гена содержат эндогенный промотор, экспрессируемый в той же самой фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит вирусная геномная нуклеиновая кислота, а предпочтительно, чтобы три, четыре, пять или более эндогенных элементов регуляции экспрессии гена содержали такие промоторы, которые экспрессируются в одной и той же фазе жизненного цикла вируса. В некоторых вариантах осуществления изобретения все эндогенные промоторы указанных элементов могут быть экспрессированы в одной и той же фазе. По меньшей мере два эндогенных промотора, экспрессируемых в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, могут быть по отдельности функ
- 10 -
008247
ционально присоединены к гетерологичной кодирующей последовательности, а предпочтительно к гете-рологичным кодирующим последовательностям могут быть функционально присоединены три, четыре, пять или более промоторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения все указанные эндогенные промоторы данных элементов могут быть по отдельности функционально присоединены к гетероло-гичным кодирующим последовательностям.
Эндогенные элементы регуляции экспрессии гена обычно имеют такое же происхождение и могут быть частью вирусной геномной нуклеиновой кислоты, в которой они присутствуют. Таким образом, предпочтительно вирусную геномную нуклеиновую кислоту получают из вирусного генома в виде отдельного фрагмента, а затем ее модифицируют путем введения гетерологичных кодирующих последовательностей и внесения каких-либо других нужных модификаций. Хотя такой способ генерирования конструкций согласно изобретению является предпочтительным, однако, такой же результат может быть достигнут и другими способами, например путем получения вирусной геномной нуклеиновой кислоты в виде нескольких фрагментов и их постадийной сборки вместе с дополнительной последовательностью, встраиваемой одновременно или позже в соответствующий вектор, и эти способы также входят в объем настоящего изобретения.
Во многих вариантах осуществления изобретения эндогенные элементы регуляции экспрессии гена, а в частности эндогенный промотор указанного элемента, могут содержать те же самые последовательности, расположенные выше и/или ниже последовательности данного элемента, присутствующего в вирусном геноме. В частности, эндогенные элементы регуляции экспрессии гена могут иметь некоторые или все одинаковые вышерасположенные последовательности, которые присутствуют в вирусном геноме, в пределах вирусной геномной нуклеиновой кислоты в данной конструкции. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые или все последовательности, расположенные ниже гетерологич-ной кодирующей последовательности, с которой функционально связан данный элемент, а в частности эндогенный промотор, могут быть эквивалентны некоторым или всем последовательностям, расположенным ниже кодирующей последовательности, с которой обычно ассоциирован данный элемент, а в частности эндогенный промотор. Нижерасположенными эндогенными компонентами, присутствующими в данном элементе, могут быть компоненты, которые содержатся в транскрипте от эндогенного промотора, такие, например, как компоненты, определяющие стабильность транскрипта. Нижерасположенные эндогенные последовательности согласно изобретению могут содержать элемент терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования. Последовательностями, расположенными выше и/или ниже гетерологичных кодирующих последовательностей или присутствующими в интронных последовательностях, входящих в состав кодирующих последовательностей, могут быть эндогенные энхансерные элементы. Вышерасположенной последовательностью может быть эндогенная последовательность Шайна-Дальгарно. В некоторых вариантах осуществления изобретения в данной конструкции сохраняется полноразмерный эндогенный ген, от которого происходит эндогенный элемент регуляции экспрессии эндогенного гена, кроме кодирующих последовательностей. Кроме того, могут быть также сохранены любые последовательности, которые влияют на экспрессию от эндогенного промотора данного элемента, такие как энхансер.
В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности, состоящие из более чем 100 пар нуклеотидов, предпочтительно более чем 500 п.н., а более предпочтительно более чем 1 т.п.н., а еще более предпочтительно более чем 2 т. п.н., расположенные выше указанного элемента, в частности промотора, и/или ниже гетерологичной кодирующей последовательности, могут быть гомологичны или идентичны последовательностям, расположенным выше и/или ниже указанного элемента, в частности эндогенного промотора и его кодирующей последовательности в вирусном геноме. Область, расположенная выше и/или ниже последовательности, идентичной последовательности, расположенной в вирусном геноме, может простираться до следующего эндогенного элемента регуляции экспрессии гена, функционально присоединенного к гетерологичным кодирующим последовательностям, и/или до следующих гетерологичных кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения в вирусной геномной нуклеиновой кислоте в конструкции, расположенной выше и/или ниже эндогенного элемента регуляции экспрессии гена и гетерологичной кодирующей последовательности, могут присутствовать делеции, что означает, что указанные последовательности, которые расположены выше и/или ниже и которые эквивалентны некоторым последовательностям, расположенным выше и/или ниже в вирусном геноме, могут быть фактически передвинуты ближе к эндогенному элементу регуляции экспрессии гена в данной конструкции.
Эндогенные промоторы, к которым функционально присоединены гетерологичные кодирующие последовательности, будут предпочтительно экспрессироваться в одной и той же фазе, а обычно в то же самое время или почти в то же самое время жизненного цикла вируса, от которого происходит данная вирусная геномная нуклеиновая кислота. Жизненные циклы вируса обычно подразделяются на фазы, каждая из которых может участвовать в экспрессии конкретной субпопуляции генов, где указанные гены классифицируются по той фазе, в которой они экспрессируются. Так, например, жизненный цикл вируса может включать предраннюю, раннюю и позднюю экспрессию гена или экспрессию гена в латентной фазе. Таким образом, во многих вариантах осуществления изобретения эндогенными промоторами эле
- 11 -
008247
ментов регуляции экспрессии гена могут быть промоторы вирусных генов, экспрессируемых в одной и той же фазе или в смежных фазах жизненного цикла вируса, а предпочтительно в одной и той же фазе. Такими промоторами могут быть, например, предранний, ранний или поздний промотор либо промотор, ассоциированный с латентной фазой жизненного цикла вируса.
Обычно в некоторых стадиях жизненного цикла вируса оба/все эндогенные промоторы будут экс-прессироваться, что будет приводить к их перекрыванию, либо эти промоторы будут индуцировать транскрипцию. При этом предпочтительно, чтобы инициация и/или прекращение транскрипции от эндогенных промоторов, присоединенных к гетерологичным кодирующим последовательностям, происходили примерно в то же самое время или точно в один и тот же момент времени.
В некоторых случаях оба выбранных промотора могут экспрессиироваться в одной и той же фазе экспрессии вирусного гена, например в предранней фазе, но при этом эти экспрессируемые промоторы, фактически, не будут перекрываться в этой фазе, а, скорее всего, они будут последовательно экспресси-роваться в одной и той же фазе.
В некоторых вариантах осуществления изобретения для экспрессии гетерологичных кодирующих последовательностей могут быть выбраны предранние промоторы. Это может быть, в частности, сделано в том случае, если необходимо, чтобы вирусные белки экспрессировались от промоторов более поздней стадии жизненного цикла вируса. Поэтому предпочтительно, чтобы выбранные промоторы не требовали вирусных белков для экспрессии.
В других вариантах осуществления изобретения промоторы могут быть выбраны так, чтобы они имитировали конкретную стадию жизненного цикла вируса. Так, например, путем использования промоторов раннего гена можно имитировать ситуацию, когда вирус, такой как, например, HSV, выходит из латентной фазы.
Примерами предпочтительных наборов эндогенных промоторов являются:
(i) по меньшей мере два из ICP 0, 4, 22 и 27 генов HSV, а в частности ICP 0 и 4; ICP 4 и 22; ICP 22 и
27; ICP 0, 4 и 22; ICP 4, 22 и 27; или ICP 0, 4, 22 и 27;
(ii) по меньшей мере два промотора оболочки HSV, а в частности два из промоторов UL48, 49 и 50,
такие как UL48 и UL49; UL49 и 50; или UL48, 49 и 50;
(iii) по меньшей мере два из промоторов UL83 и UL84; UL122 и UL123; или UL36, 37 и 38 гена ци-томегаловируса, а в частности цитомегаловируса человека, такие как UL36 и 37; или UL37 и 38.
Во многих случаях вирусные гены, которые экспрессируются в аналогичной стадии вирусного жизненного цикла, являются смежными и между ними не имеется промежуточных генов. Во многих вариантах осуществления изобретения выбранные эндогенные элементы регуляции экспрессии гена происходят от смежных или тесно сцепленных генов в вирусном геноме, от которого они происходят. Таким образом, эндогенные элементы регуляции экспрессии гена, выбранные для индуцирования экспрессии гете-рологичных кодирующих последовательностей, могут происходить от двух, трех, четырех или более непрерывных генов в вирусном геноме, хотя в некоторых вариантах осуществления изобретения между двумя выбранными эндогенными элементами регуляции экспрессии гена могут присутствовать, например, один, два, три или более промежуточных генов.
Некоторые вирусы содержат в своем геноме повторяющиеся последовательности. Так, например, HSV имеет два набора таких повторов. Во многих вариантах осуществления изобретения вирусная геномная нуклеиновая кислота, присутствующая в данной конструкции, не содержит повторяющейся последовательности, в частности она не содержит множества копий одного и того же гена, элемента или промотора. Предпочтительно, чтобы такая конструкция не содержала инвертированных повторов в вирусной геномной нуклеиновой кислоте, в частности инвертированных повторов генов, промоторов и/или элементов, или инвертированных повторов двух гомологичных промоторов, генов или элементов.
Предпочтительно, чтобы гетерологичные кодирующие последовательности, функционально присоединенные к эндогенным промоторам, не имели каких-либо промоторных элементов, с которыми они обычно функционально связаны в природе. Таким образом, промотор, ответственный за их экспрессию, будет эндогенным вирусным промотором эндогенного элемента регуляции экспрессии гена и не будет встроен, например, с гетерологичной кодирующей последовательностью. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые или все промоторные элементы, обычно присоединенные к гете-рологичными кодирующим последовательностям, могут быть введены выше или ниже эндогенного промотора, но выше сайта инициации транскрипции. В таких вариантах гетерологичный промотор обычно расположен ниже эндогенного промотора.
Обычно гетерологичные кодирующие последовательности встраивают вместо кодирующих последовательностей, с которыми обычно ассоциирован этот промотор. Таким образом, кодирующие последовательности, которые в природе связаны с данным эндогенным промотором, обычно удаляют и заменяют гетерологичной кодирующей последовательностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения первые несколько кодонов природных кодирующих последовательностей могут быть сохранены и могут быть присоединены к гетерологичным кодирующим последовательностям. При этом допускается любое расположение, которое обеспечивает экспрессию полипептида, кодируемого гетерологичными последовательностями. В одном из вариантов осуществления изобретения кодирующие последовательности,
- 12 -
008247
ассоциированные в природе с указанным промотором, могут присутствовать вместе с гетерологичными кодирующими последовательностями, расположенными ниже этих последовательностей, а также вместе с внутренним сайтом связывания с рибосомой (IRES) для гарантии осуществления трансляции.
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные конструкции могут содержать два или более наборов эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, функционально присоединенных к гетерологичным кодирующим последовательностям. Каждый набор функциональных элементов регуляции экспрессии гена будет содержать по меньшей мере два промотора, осуществляющих экспрессию в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит вирусная геномная нуклеиновая кислота данной конструкции. Различные наборы элементов будут индуцировать экспрессию в различные периоды времени. Это позволит осуществлять экспрессию конкретных антигенов в различное время.
Антигены
Гетерологичные кодирующие последовательности, присутствующие в конструкциях согласно изобретению, обычно кодируют антигены. Описанные здесь способы и конструкции могут быть использованы для выработки иммунного ответа против широкого ряда клеток, тканей и патогенов человека или животного. Эти патогены содержат один или несколько антигенов. Гетерологичные полипептиды, экс-прессируемые конструкцией согласно изобретению, могут представлять собой любые один или несколько из этих антигенов. Неограничивающими примерами источников антигенов, экспрессируемых конструкциями согласно изобретению, являются вирусы, бактериальные клетки, грибковые клетки, паразиты и другие патогенные организмы. Во многих вариантах осуществления изобретения антигены могут происходить от инфекционного агента, вызывающего заболевание.
Антигены, кодируемые гетерологичными кодирующими последовательностями в конструкциях согласно изобретению, могут происходить от того же самого организма, что и вирусная геномная нуклеиновая кислота данной конструкции, или от другого организма. Все они могут происходить от одного и того же организма, либо два или несколько из них или все они могут происходить от разных организмов. Эти антигены могут происходить от нескольких близкородственных организмов. Так, например, они могут происходить от нескольких штаммов одного и того же патогена, что позволит проводить иммунизацию индивида в целях выработки у него протективного ответа против каждого из штаммов, от которых происходят данные антигены. Гетерологичные кодирующие последовательности могут кодировать эквивалентный антиген от каждого штамма.
Обычно гетерологичные кодирующие последовательности будут кодировать различные антигены, хотя в некоторых вариантах осуществления изобретения два, или более, или даже все гетерологичные кодирующие последовательности могут кодировать один и тот же антиген, в результате чего достигается более высокий уровень экспрессии антигена.
Антигены, экспрессируемые данной конструкцией, могут присутствовать в аналогичных положениях в патогене и/или иметь аналогичные функции. Так, например, все они могут экспрессироваться на поверхности патогена либо, альтернативно, они могут представлять собой антигены, которые не отображаются на поверхности патогена, например такие, как внутриклеточные антигены. Все антигены могут представлять собой белки вирусной оболочки, гликопротеины или другие белки, экспрессируемые на поверхности вируса. В некоторых вариантах конструкция согласно изобретению может экспрессировать-ся как поверхностный антиген и как неповерхностный антиген.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигеном может быть часть гибридного белка, экспрессируемого от эндогенного промотора. Таким образом, антигенные последовательности могут быть присоединены к последовательностям, которые обычно экспрессируются эндогенным промотором элемента регуляции экспрессии гена. Альтернативно, эндогенный промотор может инициировать экспрессию гибридного белка, содержащего несколько различных антигенов или эпитопов или, в некоторых вариантах изобретения, в основном, состоящего из них. Гибридный белок может содержать любую комбинацию из двух или более антигенов, обсуждаемых ниже. Помимо последовательностей, кодирующих данный антиген, встроенные гетерологичные кодирующие последовательности могут также включать последовательности, обеспечивающие направление антигенов в соответствующий сайт. Они могут также включать сайты расщепления для специфических протеаз, что позволяет специфическим антигенам или последовательностям отделяться от гибрида.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предусматривается, что большинство антигенов или все эти антигены будут вырабатывать, главным образом, клеточный или гуморальный ответ, то есть ответ, который является преимущественно или почти целиком клеточным или гуморальным. Таким образом, эти антигены могут и не присутствовать на поверхности патогена; то есть для того, чтобы генерировался, главным образом, клеточно-опосредованный ответ, а не гуморальный ответ, они необязательно должны быть гликопротеинами. В некоторых вариантах осуществления изобретения может иметь место и обратная ситуация. В некоторых вариантах осуществления изобретения эти антигены могут быть выбраны так, чтобы они специфически вырабатывали как клеточный, так и гуморальный ответы.
Подходящими вирусными антигенами являются, но не ограничиваются ими, антигены, полученные или происходящие от вирусов, принадлежащих к семейству вирусов гепатита, включая вирус гепатита A (HAV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита дельта (HDV), вирус гепатита Е
- 13 -
008247
(HEV) и вирус гепатита G (HGV). См., например, WO 89/04669; WO 90/11089 и WO 90/14436. Геном HCV кодирует несколько вирусных белков, включая Е1 и Е2. См., например, Houghton et al. (1991) Hepa-tology 14:381-388. Аналогичным образом, кодирующая последовательность 8-антигена HDV известна специалистам (см., например, патент США № 5378814).
Аналогичным образом, в качестве антигенов согласно изобретению может быть использован широкий ряд белков вирусов, принадлежащих к семейству герпесвирусов, включая белки, происходящие от вируса простого герпеса (HSV) типов 1 и 2, такие как гликопротеины gB, gD и gH HSV-1 и HSV-2; антигены вируса ветряной оспы (VZV), вируса Эпштейна-Барр (EBV) и цитомегаловируса (CMV), включая gВ и gH CMV; и антигены других человеческих герпесвирусов, таких как HHV6 и HHV7 ^м., например, Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses, J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag, pp. 125-169; McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; патент США № 5171568; Baer et al. (1984) Nature 310:207-211; и Davison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816).
Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такие как молекулы gр120 для множества изо-лятов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, включая члены различных генетических подтипов ВИЧ, известны и описаны в литературе (см., например, Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992) и Modrow et al. (1987) J. Virol. 61:570-578); а антигенкодирующие последовательности, происходящие или полученные от любого из этих изолятов, описаны в настоящем изобретении. Кроме того, другими иммуногенными белками, происходящими или полученными от любых различных изолятов ВИЧ, могут быть антигены, экспрессируемые конструкцией согласно изобретению, включая один или несколько различных оболочечных белков или фрагментов, таких как gр160 и gр41, антигены gag, такие как р24gаg и р55gаg, а также белки, происходящие от pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu и LTR-области ВИЧ.
В настоящем изобретении также могут быть использованы антигены, происходящие или полученные от других вирусов, такие как, но не ограничивающиеся ими, антигены, происходящие от членов семейства пикорнавирусов (например, полиовирусов, риновирусов и т. п.); калицивирусов; тогавирусов (например, вируса краснухи, вируса денге и т.п.); флавивирусов; коронавирусов; реовирусов (например, ротавируса и т.п.); бирнавирусов; рабдовирусов (например, рабивируса и т.п.); ортомиксовирусов (например, вирусов гриппа типа А, В и С и т.п.); филовирусов; парамиксовирусов (например, вируса паротита, вируса кори, респираторно-синцитиального вируса, вируса парагриппа и т.п.); буньявирусов; аре-навирусов; ретровирусов (например, HTLV-I, HTLV-II, ВИЧ-1 (также известных как HTLV-III, LAV, ARV, hTLR и т.п.)), включая, но не ограничиваясь ими, антигены, происходящие от изолятов ВИЧШЬ, ВИЧа?2, ВИРЧ^, ВИЧ^, ВИЧ^); ВИЧ-1СМ235, ВИЫи^, ВИЧ-2 и т.п.; вируса обезьяньего иммунодефицита (SIV); папилломавируса, вирусов клещевого энцефалита и т.п. Описание этих и других вирусов можно найти, например, в Virology, 3rd Edition (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B.N. Fields & D.M. Knipe, eds. 1991).
В некоторых случаях может оказаться предпочтительным, чтобы выбранными антигенами были вирусные антигены, полученные или происходящие от вирусного патогена, который обычно проникает в организм через поверхность слизистой и который, как известно, вызывает заболевание или ассоциируется с этим заболеванием у человека, где такими патогенами могут быть, но не ограничиваются ими, ВИЧ (СПИД), вирусы гриппа (грипп), вирусы простого герпеса (генитальная инфекция, герпетическая лихорадка, STD), ротавирусы (диарея), вирусы парагриппа (респираторные инфекции), полиовирус (полиомиелит), респираторно-синцитиальный вирус (респираторные инфекции), вирусы кори и паротита (корь, свинка), вирус краснухи (краснуха) и риновирусы (насморк).
Бактериальными и паразитарными антигенами, которые могут кодироваться гетерологичными кодирующими последовательностями конструкций согласно изобретению, являются антигены, полученные или происходящие от известных возбудителей, ответственных за развитие заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, дифтерию, коклюш, столбняк, туберкулез, бактериальную или грибковую пневмонию, средний отит, гонорею, холеру, тиф, менингит, мононуклеоз, чуму, шигеллез или сальмонеллез, болезнь легионеров, болезнь Лайма, проказу, малярию, анкилостомоз, онхоцеркоз, шистосомоз, трипаносомоз, лейшманиоз, лямблиоз, амебиоз, филяриатоз, бореллиоз и трихинеллез.
Другие антигены могут быть получены или могут происходить от аномальных форм вирусов, таких как прионы, включая патогенные агенты, вызывающие такие заболевания, как куру, болезнь Крейтц-фельда-Якоба (БКЯ), скрепи, трансмиссивная энцефалопатия норок и хроническая кахексия, либо от прионов, которые ассоциируются с болезнью коровьего бешенства. Такими антигенами могут быть также прионы, либо эти антигены могут происходить от прионов, ответственных за врожденную патологическую бессонницу. В случае заболеваний, вызываемых прионами, при которых может образовываться конкретная конформационная форма прионового белка, ассоциированного с данным заболеванием, а также нормальная конформационная форма, предпочтительным антигеном, экспрессируемым данной конструкцией, является антиген, который вырабатывает ответ лишь против ассоциированной с этим заболеванием конформационной формы прионового белка, но не против нормальной формы такого белка.
Конкретными патогенами, от которых могут происходить данные антигены, являются М. tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella
- 14 -
008247
pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogaus, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (типа А и В), Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (типа b), Toxoplasma gondic, Complylobacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis и Actinomycosis; грибковые патогены, включая патогены, вызывающие кандидоз и аспергиллез; паразитарные патогены, включая цепни, трематоды, круглые черви, амебы, лямблии (Giardia lamblia) криптоспоридии, шистосомы, Pneumocystis carinii, трихомониды и трихины. Так, например, настоящее изобретение может быть также использовано для продуцирования подходящего иммунного ответа против множества болезней животных, таких как ящур, болезни, вызываемые коронавирусами, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, вирусом коровьей диареи (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E.coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis и brochiseptica.
В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько, предпочтительно все антигены, экспрессируемые конструкцией согласно изобретению, могут представлять собой опухолевые антигены. Такими антигенами предпочтительно являются опухолеспецифические антигены и антигены, не экспрессируемые клетками других типов или по крайней мере клетками индивида других типов. Такие антигены могут происходить от злокачественных опухолей, в частности от метастатических опухолей. В некоторых случаях антигены могут быть специфически выделены у индивида, подвергаемого лечению, либо у индивида, у которого вырабатываются соответствующие специфические опухолевые антигены, экспрессируемые опухолью этого индивида.
В других вариантах осуществления изобретения указанным антигеном может быть аутоантиген, в частности аутоантиген, участвующий в индуцировании аутоиммунного заболевания или расстройства или ответственный за развитие такого аутоиммунного заболевания или расстройства. Альтернативно, указанным антигеном может быть аллерген или антиген, происходящий от такого аллергена.
Адъюванты
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение может быть эффективно осуществлено с использованием любого подходящего адъюванта или комбинации адъювантов. Так, например, подходящими адъювантами являются, но не ограничиваются ими, адъюванты, образованные солями алюминия (квасцами), такими как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.; эмульсионные препараты типа масло в воде или вода в масле, такие как полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); адъюванты, образованные компонентами бактериальной клеточной стенки, такие как адъюванты, включающие липополисахариды (например, липид А или монофосфорил-липид А (MPL), Imoto et al. (1985) Tet. Lett. 26:1545-1548), димиколат трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS); белок теплового шока или его производное; адъюванты, происходящие от ADP-рибозилирующих бактериальных токсинов, включая дифтерийный токсин (DT), токсин коклюша (РТ), холерный токсин (СТ), термолабильные токсины E. coli (LT1 и LT2), эндотоксин А Pseudomonas, эндотоксин S. Pseudoraonas, экзофермент В. cereus, токсин В. sphaericus, токсины С2 и С3 C. botulinum, экзофермент C. limosum, а также токсины, происходящие от C. perfringens, C. spiriforma и С. difficile, и EDIN Staphylococcus aureus, и мутанты ADP-рибозилирующего бактериального токсина, такие как CRM197, нетоксичный мутант дифтерийного токсина (см., например, Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:175, и Constantino et al. (1992) Vaccine); сапониновые адъюванты, такие как Quil А (патент США № 5057540), или частицы, генерированные из сапонинов, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); хемокины и цитоки-ны, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 и т.п.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF), дефензины 1 или 2, RANTES, MIP1-a и MIP-2 и т.п.; мурамил-пептиды, такие как ^ацетил-муршил^-треонил^-изоглутамин (thr-MDP), ^ацетил-нормурамил^-аланил^-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т. п.; адъюванты, происходящие от молекул семейства CpG, динуклеотидов CpG и синтетических олигонуклеотидов, содержащих мотивы CpG (см., например, Krieg et al., Nature (1995) 374:546, Medzhhitov et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:4-9, и Davis et al. J. Immunol. (1998) 160:870-876), такие как ТСС ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEQ ID NO: 1) и АТС GAC TCT CGA GCG TTC TC (SEQ ID NO: 2); и синтетические адъюванты, такие как РСРР (поли[ди(карбоксилатофе-нокси)фосфазен) (Payne et al., Vaccines (1998) 16:92-98). Такие адъюванты являются коммерчески доступными и поставляются различными фирмами-дистрибьюторами, такими как Accurate Chemicals; Ribi Immunochemicals, Hamilton, MT; GIBCO; Sigma, St. Louis, MO.
Предпочтительным адъювантом, используемым в настоящем изобретении, является имихимод. Имихимод представляет собой 1-(2-метилпропил)-1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин. Он имеет молекулярную формулу C14H16N4 и молекулярную массу 240,3.
Имихимод имеет следующую структуру:
- 15 -
008247
Другим предпочтительным адъювантом является резихимод.
NH2
,СНя
Резихимод представляет собой 4-амино-2-этоксиметил-альфа,альфа-диметил-1Н-имидазо[4,5-с]хи-нолин-1-этанол (R-848, S-28463). Могут быть также использованы подходящие производные имихимода и резихимода.
Адъювант может быть доставлен отдельно или в комбинации с двумя или более адъювантами. В соответствии с этим комбинации адъютантов могут обладать аддитивным или синергическим эффектом стимулирования иммунного ответа. Синергическим эффектом является эффект, при котором результат, достигаемый путем объединения двух или более адъювантов, превышает аддитивный эффект, являющийся результатом введения каждого адъюванта по отдельности.
Этот адъювант может экспрессироваться из конструкции нуклеиновой кислоты, вводимой индивиду. Такой адъювант может кодироваться конструкцией согласно изобретению или отдельной конструкцией. Поэтому конструкции согласно изобретению могут включать область, кодирующую адъювант, функционально присоединенный к регуляторным элементам, обеспечивающим экспрессию адъюванта у данного индивида.
В тех вариантах осуществления изобретения, где адъювант кодируется нуклеиновой кислотой, для экспрессии адъюванта может быть использован любой подходящий элемент регуляции экспрессии гена. Могут быть также использованы промоторы, стимулирующие высокие уровни конститутивной экспрессии адъюванта.
Альтернативно, могут быть использованы элементы регуляции экспрессии гена, аналогичные или идентичные элементам, которые используются для экспрессии антигена.
В тех вариантах осуществления изобретения, где адъювант кодируется отдельной конструкцией, происходящей от конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению, такая кодирующая адъю-вант конструкция может быть предпочтительно введена в сочетании, одновременно или последовательно, с конструкцией согласно изобретению. Обычно две такие конструкции могут быть введены в виде одной композиции. Так, например, две конструкции могут быть нанесены на те же самые частицы или, альтернативно, на отдельные частицы, а затем смешаны. Композиции, содержащие такие частицы или смеси частиц, входят в объем настоящего изобретения.
В тех вариантах изобретения, где адъювант кодируется нуклеиновой кислотой, предназначенной для введения индивиду, примерами предпочтительных адъювантов являются любые полипептидные адъюванты, упомянутые выше, а в частности РТ, СТ, LT и DT.
Получение вирусной геномной нуклеиновой кислоты
Обычно вирусная геномная нуклеиновая кислота, используемая в настоящем изобретении, может быть получена из геномной библиотеки конкретно выбранного вируса. Могут быть также применены и другие способы, такие как ПЦР-амплификация выбранной области вирусного генома, либо в виде нескольких фрагментов, либо в виде одного фрагмента; или выделение этой области из имеющихся клонов субобласти вирусного генома.
Вирусные геномные библиотеки могут быть продуцированы любым известным методом. Во многих вариантах осуществления изобретения вирусной геномной нуклеиновой кислотой в конструкции согласно изобретению может быть фрагмент, выделенный из геномной библиотеки, либо фрагмент, происходящий от указанного фрагмента. Для получения геномной ДНК могут быть использованы различные источники. Геномная ДНК может быть коммерчески доступной, например она может поставляться фирмой Advanced Biotechnologies Inc. (ABI) и Clonetech, Inc. Другим стандартным источником является геномная ДНК, выделенная непосредственно из выбранного вируса.
Вирусная геномная нуклеиновая кислота, используемая в конструкции согласно изобретению, а также сама эта конструкция могут представлять собой двухцепочечную или одноцепочечную нуклеиновую кислоту, и такой нуклеиновой кислотой может быть РНК или ДНК. В тех вариантах осуществления изобретения, где используется вирусная РНК, эта РНК может быть сначала превращена в ДНК, а затем, перед генерированием РНК-конструкции из ДНК, она может быть модифицирована.
Геномная ДНК, полученная от выбранного источника, может быть выбрана стандартными методами, которые обычно предусматривают последовательную экстракцию фенолом и фенолом/хлороформом, а затем осаждение этанолом. После осаждения ДНК, происходящая от нужного вируса, может быть об
- 16 -
008247
работана рестриктирующей эндонуклеазой. При этом может быть проведен частичный гидролиз рест-риктирующей эндонуклеазой для того, чтобы получить более длинные фрагменты. Альтернативно, геномная ДНК может быть полностью гидролизована. Используемый рестриктирующий фермент может быть выбран, исходя из средней частоты рестрикции ДНК так, чтобы большая часть фрагментов в полученном гидролизате имела нужный размер в определенных пределах. ДНК-фрагменты выбранного размера могут быть разделены различными методами, включая электрофорез в агарозном или полиакрила-мидном геле или гель-электрофорез в пульсирующем поле (Carle et al. (1984) Nuc. Acid. Res. 12:56475664; Chu et al. (1986) Science 234:1582; Smith et al. (1987) Methods in Enzymology 151:461), в результате чего может быть получен исходный материал соответствующего размера для клонирования.
Геномные фрагменты могут быть затуплены по концам и клонированы в аналогично затупленный по концам вектор, либо они могут иметь определенные одноцепочечные выступающие концы, образовавшиеся в результате расщепления рестриктирующим ферментом, а поэтому они могут быть клонированы в вектор, который имеет совместимые выступающие концы. Фрагменты, расщепленные рестрикти-рующими ферментами, могут быть затуплены по концам, если это необходимо, путем обработки крупным фрагментом ДНК-полимеразы I (Кленова) E.coli в присутствии четырех дозоксинуклеотид-трифос-фатов (dNTP) в соответствии со стандартной технологией. 5'-одноцепочечные выступающие концы достраивают фрагментом Кленова, а выступающий 3'-одноцепочечный конец гидролизуют, даже когда присутствуют четыре dNTP. Если это необходимо, то может быть осуществлена селективная репарация путем введения только одного или нескольких выбранных dNTP в пределах ограничений, зависящих от природы выступающего конца. После обработки фрагментом Кленова смесь может быть подвергнута экстракции, например, фенолом/хлороформом и осаждению этанолом. Обработка нуклеазой S1 или BAL-31 в соответствующих условиях приводит к гидролизу любой однонитевой части в рестрикционных фрагментах, в результате чего также получают затупленные по концам фрагменты.
После получения подходящих геномных фрагментов они могут быть клонированы в любую подходящую векторную конструкцию или репликон. Примерами подходящих векторов являются векторы, хорошо известные специалистам. Указанным вектором может быть, например, плазмида, или, в некоторых вариантах изобретения, им может быть космида. При использовании космидных клонирующих векторов клонированные в них фрагменты геномной нуклеиновой кислоты имеют обычно большой размер, предпочтительно составляющий примерно от 20000 п.н. (20 т.п.н.) до 50000 пар нуклеотидов (50 т.п.н.) (либо любое целое число в этом промежутке), более предпочтительно примерно от 25 до 50 т.п.н., даже более предпочтительно примерно от 30-35 до 50 т.п.н., а еще более предпочтительно примерно от 35 до 50 т.п.н. Подходящие космидные векторы являются коммерчески доступными, например они выпускаются в виде набора космидньгх векторов (SuperCos 1 Cosmid Vector Kit, Stratagene, La Jolla, California). Лигирование ДНК в космиду осуществляют в соответствии с инструкциями производителей, либо такое лигирование может быть определено эмпирически методами, известными специалистам и описанными в настоящей заявке.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусные геномные фрагменты клонируют в плазмиду с получением плазмидных библиотек. При использовании плазмидных клонирующих векторов эти фрагменты имеют обычно большой размер, предпочтительно составляющий примерно от 5000 п.н. (5 т.п.н.) и до 25000 пар нуклеотидов (25 т.п.н.) (либо любое целое число в этом промежутке), более предпочтительно примерно от 10 до 25 т. п.н., даже более предпочтительно примерно от 10-15 до 25 т.п.н., а еще более предпочтительно примерно от 15 до 20 т.п.н. Подходящие плазмидные векторы являются коммерчески доступными. Лигирование ДНК в космиду осуществляют методами, известными специалистам и описанными в настоящей заявке.
В тех вариантах осуществления изобретения, где желательно удалить некоторые последовательности из вирусной геномной нуклеиновой кислоты, присутствующей в данной конструкции, количество вирусной геномной нуклеиновой кислоты, присутствующей в данной конструкции, за исключением встроенных гетерологичных последовательностей, может быть уменьшено. Так, например, общий размер вирусной геномной нуклеиновой кислоты, присутствующей в векторе, может составлять от 1 до 20 т. п.н., предпочтительно от 1 до 15 т.п.н., более предпочтительно от 3 до 12 т.п.н., а еще более предпочтительно от 5 до 10 т.п.н., за исключением длины встроенных гетерологичных последовательностей.
Во многих вариантах осуществления изобретения эндогенные кодирующие последовательности, которые обычно ассоциируются с выбранными эндогенными элементами регуляции экспрессии гена, могут быть удалены. Это может быть осуществлено любыми подходящими способами, но во многих вариантах это может быть осуществлено с помощью ПЦР.
Для делеции кодирующих последовательностей могут быть проведены две стадии ПЦР-стратегии. При этом могут быть выбраны уникальные сайты рестрикционных ферментов; а именно один внутренний сайт кодирующих последовательностей, один сайт, расположенный за пределами гена в 5'-области, то есть выше этого гена, и третий сайт, расположенный за пределами гена в 3'-области, то есть ниже этого гена. Затем осуществляют ПЦ3-реакцию с использованием праймеров, с помощью которых осуществляют амплификацию от уникального 5'-рестрикционного сайта, расположенного непосредственно выше от кодирующих последовательностей. Нижерасположенные праймеры включают в себя последователь
- 17 -
008247
ность уникального рестрикционного сайта в данных кодирующих последовательностях. В результате получают ПЦР-продукт, содержащий 5'-область гена, включая эндогенный промотор и любой другой нужный регуляторный элемент, но не содержащий кодирующих последовательностей, которые включают 5'-рестрикционный сайт и сайт, являющийся внутренним по отношению к этим кодирующим последовательностям. Затем вектор, содержащий вирусную геномную нуклеиновую кислоту дикого типа, гид-ролизуют рестриктирующими ферментами, специфичными для уникальных 5'-сайта и внутреннего сайта, и 5'-область гена вырезают, после чего ее заменяют ПЦР-продуктом. После повторения тех же самых процедур для 3'-конца гена получают конструкцию, которая имеет исходные 5'- и 3'-концы гена, но в которой отсутствуют кодирующие области. Все, что остается от кодирующих последовательностей, это уникальный рестрикционный сайт, в который могут быть встроены гетерологичные кодирующие последовательности.
При создании конструкций, которые имеют уникальные рестрикционные сайты там, где ранее находились эндогенные кодирующие последовательности, предусматривается, что в данный вектор могут быть затем встроены любые выбранные гетерологичные кодирующие последовательности. В одном из вариантов осуществления изобретения выбранные гетерологичные кодирующие последовательности амплифицируют посредством ПЦР с использованием праймеров, включающих уникальный рестрикци-онный сайт, что позволяет легко осуществлять клонирование в нужный сайт. В некоторых вариантах осуществления изобретения множество уникальных сайтов может быть сконструировано ниже выбранного промотора, что обеспечивает максимальную гибкость в стратегии клонировании.
Хотя конструкции согласно изобретению предпочтительно генерируют, начиная с одного фрагмента геномной вирусной нуклеиновой кислоты с последующей ее модификацией, однако, тот же самый конечный результат может быть достигнут и с применением других стратегий. Так, например, области геномной нуклеиновой кислоты могут быть собраны по частям. Такая стратегия может облегчать введение необходимых гетерологичных кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах изобретения эта стратегия дает возможность эффективно вносить делеции в геномную нуклеиновую кислоту, например удалять ненужные последовательности из вирусной геномной нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения для получения одного геномного фрагмента нуклеиновой кислоты для последующей модификации или для амплификации конкретных субобластей геномной нуклеиновой кислоты данной конструкции может быть использована ПЦР. ПЦР может быть также использована для введения в последовательность нужных модификаций, таких как мутации, и/или для введения конкретного рестрикционного сайта.
Конструкции согласно изобретению обычно не содержат полноразмерного вирусного генома, а чаще всего они содержат одну или несколько субобластей вирусного генома. Поэтому обычно эти конструкции, по своей сути, не обладают способностью продуцировать инфекционные вирусные частицы. В этой конструкции может отсутствовать вирусный сайт инициации репликации и/или один или несколько генов, необходимых для репликации вируса, от которого происходит вирусная геномная нуклеиновая кислота данной конструкции. В вирусных геномных последовательностях нуклеиновой кислоты данной конструкции могут отсутствовать сигналы упаковки. В этих последовательностях может отсутствовать конкретный ген, кодирующий белок, включенный в вирусную частицу вируса дикого типа, или белок, участвующий в репликации вируса, однако, данная конструкция может и не содержать таких генов. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные кодирующие последовательности, функционально присоединенные к эндогенным элементам регуляции экспрессии гена, представляют собой лишь последовательности, экспрессируемые от вирусных последовательностей нуклеиновой кислоты в данной конструкции.
В одном из вариантов осуществления изобретения вирусные геномные последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующие в данной конструкции, могут быть укорочены путем удаления некоторых ненужных последовательностей, расположенных между выбранными эндогенными элементами регуляции экспрессии гена. Так, например, могут быть делетированы некоторые или все промежуточные последовательности, начиная с конца элемента терминации транскрипции, ассоциированного с гетероло-гичными кодирующими последовательностями, и следующий эндогенный элемент регуляции экспрессии гена, функционально присоединенный к гетерологичным кодирующим последовательностям. Кроме того, или альтернативно, могут быть делетированы некоторые или все эндогенные последовательности, расположенные между 5'- и 3'-концами элемента регуляции экспрессии гена, который не образует часть самого элемента. Это позволяет облегчить модификацию и амплификацию данных конструкций. Это может также уменьшить вероятность рекомбинации между вирусами дикого типа и конструкциями согласно изобретению.
Что касается всего количества делетированных лишних последовательностей по сравнению с размером области в вирусном геноме, соответствующей области между 5'- и 3'-концами вирусной геномной нуклеиновой кислоты в данной конструкции, то может быть удалено более 10%, предпочтительно более 20%, более предпочтительно более 30%, а еще более предпочтительно более 50% последовательностей. В некоторых вариантах изобретения может быть делетировано до 75%, предпочтительно до 85%, а еще более предпочтительно до 95% последовательностей вирусной геномной нуклеиновой кислоты. В неко
- 18 -
008247
торых случаях длина эндогенных последовательностей, расположенных выше одного или нескольких эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, функционально присоединенных к гетерологичной кодирующей последовательности, может составлять менее 5 т.п.н., предпочтительно менее 2,5 т.п.н., более предпочтительно менее 1 т.п.н. и наиболее предпочтительно менее 500 п.н. Это количество эндогенных последовательностей может относиться к последовательностям, расположенным выше эндогенного промотора. Количество эндогенных последовательностей, расположенных непосредственно ниже эндогенного элемента регуляции экспрессии гена, в частности ниже гетерологичных кодирующих последовательностей, может иметь аналогичное значение.
Последовательности могут быть удалены между всеми эндогенными элементами регуляции экспрессии гена или только между некоторыми из них. В некоторых случаях могут быть делетированы все эндогенные последовательности, кроме тех, которые участвуют в экспрессии гетерологичных кодирующих последовательностей. Такая делеция может составлять, например, по меньшей мере 250 п.н., предпочтительно по меньшей мере 1 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 2,5 т.п.н., а наиболее предпочтительно по меньшей мере 5 т.п.н. Вводимыми делециями могут быть одиночные делеции между парами смежных эндогенных элементов регуляции экспрессии гена или множественные делеции. Эти делеции могут быть ограничены некодирующими последовательностями. Обычно делеции вводят для уменьшения размера конструкции, а не в целях аттенюации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения эндогенный элемент регуляции экспрессии гена будет состоять из эндогенного промотора. В таких вариантах могут быть делетированы некоторые или все промежуточные последовательности, находящиеся между эндогенными промоторами, функционально присоединенными к гетерологичным кодирующим последовательностям. Такая делетированная область может иметь любой размер, определенный в данном описании. Другие компоненты эндогенного гена, такие как транскрибированные некодирующие последовательности и/или энхансерные элементы, могут быть вырезаны, либо они могут быть заменены гетерологичными последовательностями.
Делеции могут быть внесены любым подходящим методом. Так, например, конструкция может быть разрезана рестриктирующими ферментами, которые гидролизуют делетируемую область по обеим сторонам. Полученный вектор может быть очищен от нежелательного фрагмента и снова лигирован с получением вектора, содержащего нужную делецию. Для введения выбранных делеций могут быть использованы и другие методы, такие как ПЦР. Для подтверждения осуществления нужных делеций могут быть проведены секвенирование и гидролиз рестриктирующим ферментом. Для отбора конструкций с нужной делецией в процессе клонирования связи, образующиеся при лигировании, могут быть гидроли-зованы рестриктирующими ферментами, которые разрезают внутреннюю область, делетируемую перед трансформацией.
Удаление некоторых или всех ненужных последовательностей в целях уменьшения размера векторов может быть также с успехом применено к конструкциям, содержащим вирусную геномную нуклеиновую кислоту, и к аналогичным другим обсуждаемым здесь конструкциям, которые отличаются лишь тем, что эндогенные промоторы, экспрессируемые в одной и той же фазе, функционально присоединены к кодирующим последовательностям, с которым они ассоциированы в природе, а не к гетерологичным кодирующим последовательностям. Так, например, вирусная геномная нуклеиновая кислота может происходить от HSV и содержащая ее конструкция может быть использована для выработки иммунного ответа против предранних белков, таких как ICP 0, 4, 22 и 27, которые экспрессируются от вирусной геномной нуклеиновой кислоты, находящейся под контролем их обычных эндогенных промоторов. Удаление лишних последовательностей из последовательностей, кодирующих экспрессируемые антигены, и эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, с которыми они функционально связаны, может быть с таким же успехом осуществлено в конструкции геномной нуклеиновой кислоты этого типа. И в этом случае лишние последовательности, расположенные между концами элемента регуляции экспрессии гена, могут быть удалены для дополнительного уменьшения размера конструкции.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу генерирования конструкции нуклеиновой кислоты в целях ее непосредственного введения индивиду для продуцирования у него иммунного ответа, где указанный способ предусматривает:
(a) встраивание вирусной геномной нуклеиновой кислоты в остов вектора, где указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере два эндогенных элемента регуляции экспрессии генов, каждый из которых включает эндогенный промотор, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса, от которого происходит указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, и
(b) делетирование из вирусной геномной нуклеиновой кислоты некоторых или всех вирусных последовательностей, кроме по меньшей мере двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, присутствующих в области вирусного генома, соответствующей области, расположенной между 5'- и 3'-кон-цами вирусной геномной нуклеиновой кислоты в данной конструкции, где такое делетирование осуществляют до, во время или после встраивания вирусной геномной нуклеиновой кислоты в остов вектора,
где указанная вирусная геномная нуклеиновая кислота, встроенная в остов вектора, имеет длину от 1 до 50 т. п. н.
- 19 -
008247
Введенная делеция может иметь природу, аналогичную природе любой обсуждаемой здесь деле-ции, и полученные конструкции могут иметь такие же характеристики и применения, как и любые другие конструкции согласно изобретению, за исключением того случая, когда эндогенные элементы регуляции экспрессии гена присоединены к их природным кодирующим последовательностям, а не к гетеро-логичным кодирующим последовательностям. Таким образом, частицы с покрытиями, дозировочный сосуд, устройства для опосредуемой частицами доставки и т.п. могут быть получены с использованием указанных конструкций и такие конструкции могут применяться в методах иммунизации и экспрессии гена, обсуждаемых в настоящей заявке.
Введение конструкции
Описанные здесь конструкции нуклеиновой кислоты и вспомогательные вещества могут быть введены любым подходящим методом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, описанном ниже, введение конструкции осуществляют путем нанесения подходящей конструкции (например, космид или плазмид) на коровые частицы-носители, а затем эти частицы с покрытием вводят индивиду или в клетки. Однако геномные фрагменты могут быть также доставлены с использованием других невирусных систем, например путем доставки "оголенной" нуклеиновой кислоты.
Хотя конструкции могут быть доставлены с помощью вирусов, однако, такая доставка не является предпочтительной. Поэтому такие конструкции обычно вводят непосредственно индивиду без использования вируса. Таким образом, в такой конструкции могут отсутствовать последовательности сигнала упаковки вируса и/или сайт инициации репликации вируса. Обычно в такой конструкции отсутствуют последовательности упаковки вируса и/или сайт инициации репликации нативного вируса, от которого происходит вирусная геномная нуклеиновая кислота. Предпочтительно, чтобы для применения этой конструкции не требовалось использования хелперного вируса и/или вирусных белков поставляемых, in trans для репликации, а в частности, чтобы для репликации не требовалось использования хелперного вируса и/или белков вируса, от которого происходит геномная нуклеиновая кислота. Однако в случае конструкций, полученных на основе космид, белки лямбда могут поставляться in trans, а вирус может иметь космидные последовательности, необходимые для репликации.
В тех вариантах изобретения, где отдельная конструкция нуклеиновой кислоты используется для экспрессии адъюванта, эта конструкция может быть получена вместе с конструкцией согласно изобретению или отдельно. Если данная конструкции получена отдельно, то способ ее получения может быть таким же, как и способ получения конструкции согласно изобретению, и/или эти композиции могут быть такими же, как любые другие, кроме конструкции согласно изобретению. Две конструкции могут быть введены в любом подходящем соотношении, например в эквимолярных количествах либо в молярном отношении 1:2, предпочтительно 1:5 или более предпочтительно 1:10, где любая одна конструкция присутствует в избыточном количестве. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, содержащим конструкцию согласно изобретению и конструкцию, кодирующую адъювант.
Стандартные фармацевтические препараты
Приготовление препарата, содержащего конструкцию согласно изобретению, с добавлением или без добавления адъювантной композиции, может быть осуществлено с применением стандартных химических методов и технологий приготовления фармацевтических композиций, которые известны специалистам. Так, например, композиции, содержащие одну или несколько конструкций, могут быть объединены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями с получением жидкого препарата.
В указанном наполнителе или носителе могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т.п. Указанными наполнителями, носителями и вспомогательными веществами обычно являются фармацевтические средства, которые не индуцируют иммунный ответ у индивида при введении ему указанной композиции и введение которых не вызывает нежелательной токсичности. Фармацевтически приемлемыми наполнителями являются, но не ограничиваются ими, жидкости, такие как вода, физиологический раствор, полиэтиленгли-коль, гиалуроновая кислота, глицерин и этанол. Могут быть также использованы фармацевтически приемлемые соли, включая, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бен-зоаты и т.п.
Также предпочтительно, хотя и необязательно, чтобы данный препарат содержал фармацевтически приемлемый наполнитель, который служит в качестве стабилизатора, в частности, для пептида, белка или других подобных молекул, если они включены в состав вакцинной композиции. Примерами подходящих носителей, которые также действуют как стабилизаторы для пептидов, являются, но не ограничиваются ими, декстроза, сахароза, лактоза, трегалоза, маннит, сорбит, инозит и декстран фармацевтической чистоты и т. п. Другими подходящими носителями также являются, но не ограничиваются ими, крахмал, целлюлоза, фосфаты натрия или кальция, лимонная кислота, винная кислота, глицин, высокомолекулярные полиэтиленгликоли (ПЭГ) и их комбинации. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей, носителей и добавок можно найти в руководстве REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J., 1991), которое вводится в настоящее описание посредством ссылки.
- 20 -
008247
В данные композиции могут быть также включены некоторые стимуляторы поглощения и/или экспрессии нуклеиновых кислот ("агенты, стимулирующие трансфекцию"), например такие стимуляторы, как бупивакаин, кардиотоксин и сахароза, и носители, стимулирующие трансфекцию, такие как липо-сомные или липидные препараты, которые обычно используются для доставки молекул нуклеиновой кислоты. Широкое применение находят также анионогенные и нейтральные липосомы, и такие липосо-мы хорошо известны специалистам в области доставки молекул нуклеиновой кислоты (см., например, Liposomes: A practical Approach, (1990) RPC New Ed., IRL Press). Хорошо известными носителями, используемыми для доставки молекул нуклеиновой кислоты, также являются катионогенные липидные препараты. Подходящими липидными препаратами являются DOTMA (хлорид №[1-(2,3-диолеилокси) пропил]-^^^триметиламмония), выпускаемый под торговым наименованием Lipofectin(tm), и DOTAP (1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмоний)пропан), см., например, Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081; патенты США №№ 5283185 и 5527928 и публикации международных заявок №№ WO 90/11092, WO 91/15501 и WO 95/26356. Эти катионогенные липиды могут быть предпочтительно использованы в комбинации с нейтральным липи-дом, например DOPE (диолеилфосфатидилэтаноламин). Другими композициями, стимулирующими трансфекцию, которые могут быть добавлены в вышеуказанные липидные или липосомные препараты, являются производные спермина (см., например, публикацию международной заявки № WO 93/18759) и соединения, стимулирующие прохождение через мембрану, такие как GALA, грамицидин S и катионо-генные соли желчных кислот (см., например, публикацию международной заявки № WO 93/19768).
Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть инкапсулированы в носителях, состоящих из частиц, или они могут быть абсорбированы на этих частицах или ассоциированы с ними. Подходящими носителями, состоящими из частиц, являются носители, происходящие от полиметилметакрилатных полимеров, а также микрочастицы PLG, происходящие от лактидных полимеров и сополимеров лактида и гликолида. См., например, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. Могут быть также использованы другие системы, состоящие из частиц, и полимеры, например такие полимеры, как полилизин, полиаргинин, полиорнитин, спермин, спермидин, а также конъюгаты этих молекул.
Полученные вакцинные композиции содержат конструкцию согласно изобретению. Соответствующее эффективное количество этой конструкции может быть легко определено специалистом. Такое количество может варьироваться в относительно широких пределах, которые могут быть определены путем рутинного экспериментирования. Так, например, иммунные ответы были продуцированы с использованием по меньшей мере 1 мкг ДНК, а в других случаях было использовано до 2 мг ДНК. В основном, предполагается, что эффективная доза конструкции будет составлять в пределах примерно от 100 до 1000 мкг, однако, эффективными могут также оказаться дозы выше и ниже пределов указанного интервала. Такие композиции могут содержать примерно от 0,1 до 99,9% данной конструкции.
Введение стандартных фармацевтических препаратов
Введение вышеописанных фармацевтических препаратов может быть осуществлено в виде разовой дозы, непрерывно или периодически в период всего проведения курса лечения. В большинстве случаев доставку жидких композиций и жидких суспензий, содержащих композиции из частиц, осуществляют стандартным шприцем с иглой. Кроме того, для введения композиций согласно изобретению могут быть использованы различные известные специалистам безыгольные шприцы для инъекции жидкостей. Методы определения наиболее эффективных средств и доз введения хорошо известны специалистам и могут варьироваться в зависимости от носителя, используемого для доставки, от конкретной композиции, применяемой в терапии, от клеток-мишеней и от конкретного индивида, подвергаемого лечению. Одноразовое и многократное введение может быть осуществлено с использованием определенного уровня доз и определенной схемы введения, выбранной лечащим врачом.
Кроме того, способы доставки конструкций согласно изобретению предусматривают объединение этих конструкции с другими подходящими композициями и схемами лечения. Так, например, для усиления иммунного ответа у индивида описанные здесь композиции и способы могут также включать вспомогательные вещества (например, адъюванты), такие как фармакологические агенты, цитокины и т. п. Такими вспомогательными веществами могут быть, например, белки или другие макромолекулы, которые могут быть введены одновременно, до или после введения обсуждаемых здесь ДНК-вакцин (например, космид или плазмид). Такие композиции могут быть также введены непосредственно индивиду либо, альтернативно, ex vivo в клетки, взятые от индивида, методами, известными специалистам.
Частицы с покрытиями
В одном из вариантов осуществления изобретения конструкции согласно изобретению и другие вспомогательные компоненты, такие как адъюванты, доставляют с использованием частиц-носителей. Методы опосредуемой частицами доставки для введения таких препаратов нуклеиновых кислот известны специалистам. Так, например, после получения и подходящей очистки вышеописанные конструкции могут быть нанесены на частицы-носители (например, коровые носители) различными известными методами. Частицы-носители выбирают из материалов, имеющих подходящую плотность в пределах размеров частиц, обычно используемых для внутриклеточной доставки с помощью соответствующего устройства для доставки частиц. Очевидно, что оптимальный размер частицы-носителя зависит от диаметра
- 21 -
008247
клеток-мишеней.
В соответствии с настоящим изобретением коровыми частицами, которые могут быть использованы, являются вольфрамовые, золотые, платиновые и иридиевые коровые частицы-носители. Предпочтительными являются вольфрамовые и золотые частицы. Вольфрамовые частицы со средним диаметром 0,5-2,0 мкм являются коммерчески доступными. Хотя такие частицы имеют оптимальную плотность, подходящую для их использования в методах доставки частиц, и позволяют высокоэффективно наносить покрытие нуклеиновой кислотой, однако, вольфрам может оказаться токсичным для некоторых типов клеток. В соответствии с этим в способах настоящего изобретения могут быть также использованы золотые частицы или микрокристаллическое золото (например, золотой порошок А1570, поставляемый фирмой Engelhard Corp., East Newark, NJ). Золотые частицы являются однородными по размеру (поставляются Alpha Chemicals с размером частиц 1-3 мкм или поставляются Degussa, South Plainfield, NJ со средним размером частиц 0,95 мкм) и не являются токсичными.
Различные методы покрытия или осаждения ДНК или РНК на золотые или вольфрамовые частицы являются известными и описаны в литературе. Большинство таких методов, в основном, предусматривают объединение предварительно определенного количества золота или вольфрама с плазмидной ДНК, СаСЬ и спермидином. Полученный раствор непрерывно встряхивают во время процедуры нанесения покрытия для обеспечения однородности реакционной смеси. После осаждения нуклеиновой кислоты частицы с покрытием могут быть перенесены на соответствующие мембраны для их осушки перед использованием, а затем нанесены на поверхности модуля или кластера для образца либо загружены в кластер для доставки, который используется в соответствующем устройстве для доставки частиц.
Пептидные адъюванты (например, цитокины и бактериальные токсины) также могут быть нанесены на те же самые или аналогичные коровые частицы-носители. Так, например, пептиды могут быть присоединены к частице-носителю путем простого смешивания двух компонентов в эмпирически определенном соотношении, путем преципитации сульфатом аммония или другими методами преципитации, известными специалистам, либо методами химического связывания пептида с частицей-носителем. Связывание L-цистеиновых остатков с золотом было ранее описано в литературе (Brown et al., Chemical Society Reviews 9:271-311 (1980)). Другие методы могут предусматривать, например, растворение пептидного адъюванта в абсолютном этаноле, в воде или в смеси спирта/воды, добавление полученного раствора к определенному количеству частиц-носителей, а затем сушку смеси в потоке воздуха или газообразного азота при перемешивании. Альтернативно, адъювант может быть осушен на частицах-носителях путем центрифугирования в вакууме. После сушки частицы с покрытием могут быть ресуспендированы в подходящем растворителе (например, в этилацетате или в ацетоне) и подвергнуты растиранию (например, путем обработки ультразвуком) с получением, в основном, однородной суспензии. Коровые частицы-носители, покрытые адъювантом, могут быть затем объединены с коровыми частицами-носителями, несущими конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и введены путем одностадийной инъекции частицы, либо они могут быть введены отдельно от композиций, содержащих конструкцию нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, конструкции, кодирующие адъювант, и конструкции согласно изобретению могут быть нанесены на те же самые частицы либо эти конструкции могут быть нанесены на отдельные частицы, а затем смешаны с частицами, покрытыми конструкцией согласно изобретению.
Введение частиц с покрытием
После получения коровых частиц-носителей, покрытых конструкциями согласно изобретению, эти частицы-носители, взятые отдельно или в комбинации, например, с адъювантными препаратами, вводят индивиду методами опосредованной частицами доставки.
Различные устройства, подходящие для использования в методах опосредованной частицами доставки, известны специалистам, и все они являются подходящими для осуществления настоящего изобретения. Современные устройства сконструированы на основе взрывного, электрического или газового разряда для нацеливания покрытых композицией коровых частиц-носителей на клетки-мишени. Эти частицы с покрытием могут сами прилипать к подвижной пластине-носителю и отделяться от нее либо прилипать к поверхностям и отделяться от них, вдоль которых пропускается газовый поток, поднимающий эти частицы с поверхности и ускоряющий их движение по направлению к мишени. Пример газоразрядного аппарата описан в патенте США № 5204253. Устройство взрывного типа описано в патенте США № 4945050. Один из примеров прибора для ускорения частиц электроразрядного типа описан в патенте США № 5120657. Другие электроразрядные аппараты, подходящие для использования в настоящем изобретении, описаны в патенте США № 514 9655. Описание всех этих патентов во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Частицы с покрытием вводят индивиду, подвергаемому лечению, способом, подходящим для данной лекарственной композиции, и в количестве, эффективном для выработки нужного иммунного ответа. Количество вводимой композиции в случае молекул нуклеиновой кислоты, в основном, составляет в пределах от 0,001 до 100,0 мкг, обычно от 0,01 до 10,0 мкг, предпочтительно от 0,1 до 5,0 мкг молекул нуклеиновой кислоты на дозу, а в случае пептидных или белковых молекул такое количество составляет
- 22 -
008247
от 1 мкг до 5 мг, обычно от 1 до 50 мкг, предпочтительно от 5 до 25 мкг пептида, в зависимости от индивида, подвергаемого лечению.
В тех вариантах изобретения, где предусматривается введение конструкции, кодирующей антиген, эту конструкцию вводят в аналогичном количестве. Альтернативно, общее количество конструкции согласно изобретению и конструкции, кодирующей адъювант, может варьироваться в вышеуказанных пределах.
Точное количество вводимой конструкции варьируется в зависимости от возраста и общего состояния индивида, подвергаемого иммунизации, а в частности от выбранной нуклеотидной последовательности или пептида, а также от других факторов. Соответствующее эффективное количество может быть легко определено специалистом, исходя из описания настоящего изобретения.
Так, например, эффективное количество описанных здесь конструкций должно быть достаточным для индуцирования соответствующего иммунного ответа у иммунизованного индивида и может варьироваться в относительно широких пределах, которые могут быть определены путем рутинного экспериментирования. Предпочтительно, чтобы коровые частицы с покрытием могли быть доставлены в нужные клетки реципиента для продуцирования у него иммунного ответа (например, активации Т-клеток).
Композиции, состоящие из частиц
Альтернативно, конструкции согласно изобретению, а также один или несколько выбранных адъю-вантов могут быть приготовлены в виде состоящей из частиц композиции. Более конкретно, приготовление частиц, содержащих нужную конструкцию, может быть осуществлено с использованием стандартных химических методов и технологий приготовления фармацевтических композиций, которые доступны специалистам. Так, например, одна или несколько конструкций и/или адъювантов могут быть объединены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями с получением вакцинной композиции. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения в данную композицию включена нуклеиновая кислота, кодирующая адъювант, но не сам адъювант. В наполнителе или в носителе могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т.п. Такими наполнителями, носителями и добавками обычно являются фармацевтические средства, которые не индуцируют иммунный ответ у индивида при введении ему указанной композиции и введение которых не вызывает нежелательной токсичности. Фармацевтически приемлемыми наполнителями являются, но не ограничиваются ими, жидкости, такие как вода, физиологический раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, глицерин и этанол. Могут быть также использованы фармацевтически приемлемые соли, включая, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п.
Также предпочтительно, хотя и необязательно, чтобы данная композиция нуклеиновой кислоты содержала фармацевтически приемлемый носитель, который служит в качестве стабилизатора, в частности, для пептида, белка или других подобных адъювантов или вспомогательных материалов. Примерами подходящих носителей, которые также действуют как стабилизаторы для пептидов, являются, но не ограничиваются ими, фармацевтически чистые декстроза, сахароза, лактоза, трегалоза, маннит, сорбит, инозит и декстран и т. п. Другими подходящими носителями также являются, но не ограничиваются ими, крахмал, целлюлоза, фосфаты натрия или кальция, лимонная кислота, винная кислота, глицин, высокомолекулярные полиэтиленгликоли (ПЭГ) и их комбинации. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей, носителей, стабилизаторов и других добавок можно найти в руководстве REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J., 1991), которое вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Полученные композиции должны быть доставлены в количестве, достаточном для выработки иммунного ответа, как описано выше. Соответствующее эффективное количество может быть легко определено любым специалистом. Количество нужной конструкции нуклеиновой кислоты может варьироваться в относительно широких пределах, в основном, примерно от 0,1 мкг до 25 мг или более, а конкретное подходящее количество может быть определено путем рутинного экспериментирования.
Эти композиции могут содержать примерно от 0,1 до 99,9%, предпочтительно от 1 до 80%, более предпочтительно от 10 до 50%, а еще более предпочтительно от 20 до 40% молекул нуклеиновой кислоты. Если адъювант включен в данную композицию или если для введения этого адъюванта применяются методы с использованием состоящей из частиц адъювантной композиции, то такой адъювант присутствует в подходящем количестве, определенном выше. Затем получают композиции в виде частиц стандартными методами, такими как простое выпаривание (сушка воздухом), вакуумная сушка, сушка распылением, сушка вымораживанием (лиофилизация), распылительная сушка вымораживанием, покрытие распылением, преципитацией, получением жидкости в надкритическом состоянии, состоящей из частиц, и т. п. Если это необходимо, то полученные частицы могут быть уплотнены методами, описанными в публикации международной заявки с правом совместного владения № WO 97/48485, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Разовые лекарственные формы или емкости для многоразового применения, в которые данные частицы могут быть упакованы до их использования, могут представлять собой герметически закрытый контейнер, включающий подходящее количество частиц, содержащих подходящую конструкцию нук
- 23 -
008247
леиновой кислоты и/или выбранный адъювант (например, для получения вакцинной композиции). Состоящие из частиц композиции могут быть упакованы в виде стерильных препаратов, а герметически закрытый контейнер может быть изготовлен так, чтобы он сохранял стерильность данного препарата до его использования в способах настоящего изобретения. Если необходимо, то такие контейнеры могут быть адаптированы для их непосредственного использования в устройстве для доставки частиц. Такие контейнеры могут иметь форму капсул, пакетов из фольги, саше, кассет и т.п. Соответствующие устройства для доставки частиц (например, безыгольные шприцы), описанные в настоящей заявке, могут также содержать упакованные в них частицы, предназначенные для доставки.
Контейнер, в который упакованы частицы, может быть дополнительно помечен для идентификации композиции и для указания информации о соответствующей дозе. Кроме того, этот контейнер может быть снабжен памяткой в форме, рекомендованной правительственной организацией, например Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств, где в данной памятке сообщается о разрешении, выданном данной организацией в соответствии с федеральным законом о производстве, применении и продаже содержащихся в данной композиции антигенов, адъювантов (или вакцинной композиции), для введения человеку.
Состоящие из частиц композиции (содержащие одну или несколько нужных конструкций отдельно или в комбинации с выбранным адъювантом) могут быть затем введены чрескожно. Состоящие из частиц композиции предпочтительно вводят методом инъекции порошкообразного препарата, например, с помощью системы безыгольного шприца, такой как система, описанная в публикациях международных заявок с правом совместного владения №№ WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12512 и WO 96/20022, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Для доставки частиц с помощью такой системы безыгольных шприцев обычно подходящими являются частицы, имеющие размер примерно от 0,1 до 250 мкм, а предпочтительно примерно 10-70 мкм. С помощью таких устройств могут быть также доставлены частицы, имеющие размер более чем примерно 250 мкм, при этом частицы, имеющие размер выше этого верхнего предела, могут приводить к нежелательному повреждению клеток кожи. Фактическое расстояние, на которое доставляемые частицы могут проходить через поверхность-мишень, зависит от конкретного размера (например, от номинального диаметра частицы, которая, в первом приближении, имеет сферическую форму), от плотности частицы, от начальной скорости, при которой частицы соударяются с поверхностью, и от плотности и кинематической вязкости кожной ткани-мишени. В соответствии с этим оптимальные плотности частиц, используемых для безыгольной инъекции, обычно составляют в пределах примерно от 0,1 до 25 г/см3, предпочтительно примерно от 0,9 до 1,5 г/см3, и более предпочтительно примерно от 1,2 до 1,4 г/см3, а скорости частиц при инъекции обычно составляют в пределах примерно от 100 до 3000 м/с или более. При соответствующем давлении газа прохождение частиц, имеющих средний диаметр 10-70 мкм, через сопло может быть ускорено до скорости, приближающейся к ультразвуковой скорости подаваемого газового потока.
Если необходимо, эти системы безыгольных шприцев могут быть приготовлены в предварительно загруженном состоянии, где они содержат подходящие дозы частиц, включающих данную конструкцию и/или выбранный адъювант. Такой нагруженный шприц может быть упакован в герметически закрытый контейнер, который может быть затем маркирован, как описано выше.
Таким образом, указанный способ может быть применен для получения частиц нуклеиновой кислоты, имеющих размер в пределах примерно от 10 до 250 мкм, предпочтительно примерно от 10 до 150 мкм, а наиболее предпочтительно примерно от 20 до 60 мкм; где плотность частиц составляет в пределах примерно от 0,1 до 25 г/см3, а объемная плотность составляет примерно от 0,5 до 3,0 г/см3 или выше.
Аналогичным образом, могут быть получены частицы выбранных адъювантов, имеющих размер в пределах примерно от 0,1 до 250 мкм, предпочтительно примерно от 0,1 до 150 мкм, а наиболее предпочтительно примерно от 20 до 60 мкм; где плотность частиц составляет в пределах примерно от 0,1 до 25 г/см3, а объемная плотность составляет примерно от 0,5 до 3,0 г/см3, а наиболее предпочтительно примерно от 0,8 до 1,5 г/см3.
Введение композиции, состоящей из частиц
После получения состоящих из частиц композиций эти композиции (например, порошок) могут быть чрескожно введены в ткань позвоночного индивида методом, подходящим для чрескожной доставки. Различные устройства для доставки частиц, подходящие для введения нужного вещества, известны специалистам и могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. В особенно предпочтительной системе для чрескожной доставки частиц используется безыгольный шприц для выстреливания твердых частиц в контролируемых дозах в интактную и через интактную кожу и ткань. См., например, патент США № 5630796, Bellhouse et al., в котором описан безыгольный шприц (также известный как "устройство для доставки частиц PowderJect(r)"). Другие системы безыгольных шприцев известны специалистам и описаны в настоящем изобретении.
Композиции, содержащие терапевтически эффективное количество описанных здесь порошкообразных молекул, могут быть введены в любую подходящую ткань-мишень с помощью вышеописанных устройств для доставки частиц. Так, например, указанные композиции могут быть доставлены в мышцу, кожу, головной мозг, легкие, печень, селезенку, костный мозг, тимус, сердце, лимфу, кровь, костный
- 24 -
008247
хрящ, поджелудочную железу, почки, желчный пузырь, желудок, тонкую кишку, яички, яичник, матку, прямую кишку, нервную систему, глаз, железы и соединительные ткани. Для доставки конструкций нуклеиновой кислоты и экспрессируемых в них молекул предпочтительно, чтобы они были введены в терминально дифференцированные клетки; однако, эти молекулы могут быть также введены в недифференцированные или частично дифференцированные клетки, такие как стволовые клетки крови или фибро-бласты кожи.
Порошковые композиции вводят индивиду, подвергаемому лечению, способом, совместимым с данным лекарственным препаратом, в профилактически и/или терапевтически эффективном количестве. Количество вводимой композиции обычно составляет в пределах от 0,5 до 100 мкг/кг конструкции нуклеиновой кислоты на дозу в зависимости от индивида, подвергаемого лечению. Дозы для других фармацевтических препаратов, таких как физиологически активные пептиды и белки, обычно составляют в пределах примерно от 0,1 мкг до 20 мг, а предпочтительно примерно от 10 мкг до 3 мг. Точная доза может варьироваться в зависимости от возраста и общего состояния индивида, подвергаемого лечению, тяжести состояния, подвергаемого лечению, конкретного препарата для доставки, участка введения, а также от других факторов. Соответствующее эффективное количество может быть легко определено любым специалистом.
Таким образом, "терапевтически эффективное количество" состоящих из частиц композиций согласно изобретению должно быть достаточным для лечения или предупреждения симптомов заболевания или состояния и может варьироваться в относительно широких пределах, которые могут быть определены путем рутинного экспериментирования.
Ниже приводятся примеры конкретных вариантов осуществления изобретения. Эти примеры представлены лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Примеры
Были предприняты попытки получения точных значений используемых величин (например, количеств, температур и т.п.), однако, при этом допускаются некоторые экспериментальные погрешности и отклонения.
Пример 1. Создание конструкции ОР23-6.
Была создана HSV-2-конструкция, содержащая все четыре предранних гена, но не содержащая ненужных вирусных геномных последовательностей. Исходным материалом для конструирования вектора служила космида, которая включала в себя три EcoRI-фрагмента, происходящих от штамма MS HSV-2 и простирающихся от нуклеотида 110931 до нуклеотида 147530 генома HSV-2, полученного на основе опубликованной последовательности (штамма HG52). Порядок расположения генов также указан в этой опубликованной последовательности.
Эту космиду частично гидролизовали ферментом EcoRI, снова лигировали и отбирали конструкцию, которая имела только фрагмент из 28000 нуклеотидов (110931-139697). Эту молекулу обозначали ОР-23. В эту молекулу было внесено шесть модификаций для удаления большинства нежелательных последовательностей из вирусной геномной нуклеиновой кислоты. Для введения таких модификаций были проведены следующие процедуры:
1. Bst1107I и ScaI-гидролиз и повторное лигирование космиды (удаление гена резистентности к ампициллину) с получением ОР23-1;
2. NsiI-гидролиз и повторное лигирование для удаления сайта инициации репликации SV40 с получением OР23-2;
3. частичный BstXI-гидролиз и повторное лигирование для удаления областей между ICP27 и ICP0 с получением ОР23-3;
4. полный гидролиз ферментом BspHI с последующим частичным гидролизом ферментом BsiWI и повторным лигированием для удаления последовательностей, расположенных после гена ICP22 и некоторых каркасных последовательностей. В результате получали ОР23-4;
5. SrfI-гидролиз и повторное лигирование с получением ОР23-5 (удаление последовательностей
между ICP4 и ICP0);
6. полный BstXI-гидролиз и повторное лигирование с получением ОР23-6 (для удаления небольшого фрагмента между ICP27 и ICP0).
Секвенирование конструкции ОР23-6 проводили для подтверждения структуры вектора и его последовательности.
Структура конструкций ОР23 и ОР23-1 - ОР23-6 показана на фиг. 1.
Пример 2. Генерирование мультиантигенной HSV1-вакцины, в которой отсутствуют ненужные последовательности.
Вакцина аналогичного типа для HSV-1 может быть получена, как описано в примере 1 для HSV-2.
Частичный EcoRI-гидролиз может быть осуществлен на HSV-1 для генерирования геномных фрагментов, а затем могут быть генерированы космиды, содержащие эти фрагменты, с использованием набора superCos от Stratagene. Затем отбирали космиду, содержащую последовательности, простирающиеся от нуклеотида 110095 до нуклеотида 146694 генома HSV-1. После этого может быть проведено несколько стадий гидролиза и повторного лигирования в целях продуцирования конечного компактного вектора,
- 25 -
008247
экспрессирующего четыре предранних гена, происходящих от HSV-1, но не содержащего большинства ненужных промежуточных последовательностей.
Для создания нужной конструкции проводили следующие стадии.
1. Космиду HSV1 (43392 п.н.) гидролизовали ферментами ScaI и NdeI и снова лигировали с получением OPhsv1-1.
2. OPhsv1-1 (39694 п.н.) гидролизовали ферментами AflII и ClaI и снова лигировали с получением
OPhsv1-2.
3. OPhsv1-2 (31365 п.н.) гидролизовали ферментами EcoRV и Swa I и снова лигировали с получением OPhsv1-3.
4. Ophsv1-3 (30727 п.н.) гидролизовали ферментом BbvCI и снова лигировали с получением OPhsv1-4.
5. OPhsv1-4 (27668 п.н.) гидролизовали ферментами Врu11021 и BbvCI и снова лигировали с получением OPhsv1-5.
6. OPhsv1-5 (26121 п.н.) гидролизовали и частично гидролизовали ферментом Psp1406I, а затем снова лигировали с получением OPhsv1-6, т.е. конечной конструкции, которая имела все четыре пред-ранних гена, но из которой было удалено большинство других нежелательных последовательностей.
Пример 3. Встраивание гетерологичной кодирующей последовательности.
(i) Общая стратегия.
Конструкцию ОР23-6, полученную, как описано в примере 1, использовали для создания конструкции, в которой кодирующие последовательности ICP 0, 4, 22 и 27 были заменены гетерологичными кодирующими последовательностями. Такая основная стратегия предусматривает сначала удаление исходных кодирующих последовательностей, а затем введение в эти сайты гетерологичных кодирующих последовательностей. В основе замены каждой кодирующей последовательности лежит обнаружение трех уникальных рестрикционных сайтов; одного - внутри гена; одного - выше этого гена, то есть в 5'-области, и одного - ниже этого гена, то есть в 3'-области. Затем кодирующую последовательность заменяли в две стадии.
Затем выбирали ПЦР-праймеры для амплификации области, начиная, включительно, от расположенного выше уникального рестрикционного 5'-сайта и вплоть до вышерасположенного старт-сайта кодирующих последовательностей. 3'-праймер включает в себя последовательность уникального рестрик-ционного сайта в кодирующих последовательностях. ПЦР продуцирует ДНК-фрагмент, который содержит 5'-область гена и не содержит кодирующих последовательностей и который фланкирован уникальным рестрикционным сайтом, присутствующим в кодирующих последовательностях. Затем исходный вектор гидролизовали уникальным ферментом, специфичным в отношении рестрикционного 5'-сайта, и этот рестрикционный сайт, являющийся внутренним по отношению к кодирующей последовательности, использовали для вырезания 5'-половины гена. Затем эту половину заменяли ПЦР-продуктом, гидроли-зованным теми же самыми ферментами. Эту серию стадий повторяли для 3'-конца кодирующих последовательностей и получали конструкцию, которая имела исходные 5'- и 3'-концы гена, но из которой были удалены кодирующие области. Все, что оставалось в этой конструкции, это присутствующий внутри нее уникальный сайт рестриктирующего фермента. Затем в этот сайт встраивали новый ген. Если необходимо, эта процедура может быть затем повторена столько раз, сколько генов ICP присутствует в ОР23-6.
(ii) Молекулярная биология.
Стандартные методы молекулярной биологии, применяемые для манипуляции с ДНК-последовательностями, были использованы для превращения ОР23-6 в нужную мультигенную конструкцию, экс-прессирующую гетерологичные антигены. В целях генерирования соответствующих ДНК-фрагментов проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для замены сегментов исходной ОР23-6 и фрагменты клонировали в вектор pTARGET (Promega). Затем положительные клоны идентифицировали путем гидролиза рестриктирующими ферментами и ДНК, выделенную из бактериальной культуры положительных клонов, использовали для выделения чистых препаратов нужных фрагментов. Фрагменты, очищенные из агарозных гелей, лигировали в вектор ОР23-6, который предварительно разрезали соответствующими рестриктирующими ферментами и очищали из агарозных гелей. Затем проводили скрининг на положительные клоны путем рестрикционного гидролиза.
Гетерологичные гены, встраиваемые в вектор, получали с помощью ПЦР-реакций, где в 5'- и 3'-концы ПЦР-фрагментов вводили соответствующие рестрикционные сайты. Затем с помощью рестрикци-онного гидролиза проводили скрининг на положительные клоны, содержащие нужную вставку, а также подтверждали правильную ориентацию. Для подтверждения наличия нужных последовательностей в полученных клонах проводили ДНК-секвенирование.
(iii) Получение ДНК-вакцин.
Осаждение ДНК на золотые частицы осуществляли с помощью стандартных процедур для получения ДНК-вакцин с использованием кальция/спермидина. ДНК смешивали с 2-микронными золотыми частицами в небольшой центрифужной пробирке, содержащей 300 мл 50 мМ спермидина. Затем добавляли ДНК в количестве 2 мкг на мг золотых частиц, в результате чего обычно получали 26 мг-партии золотых частиц (52 мкг ДНК). ДНК осаждали на золото путем добавления 10% Са02 в объеме 1/10, с непрерывным перемешиванием содержимого этой пробирки в ротационном смесителе. Комплексы
- 26 -
008247
"ДНК-золото" 3 раза промывали абсолютным этанолом, а затем загружали в пробирки Tefzel, сушили и разрезали на 0,5-дюймовые сегменты для их использования в устройстве XR-1.
Для иммунизации ДНК-вакцины доставляли с помощью устройства XR-1 в брюшную полость мышей Balb/C. Для каждой иммунизации вводили одну инъекцию, а затем животных сенсибилизировали и через 4 недели вводили бустер-инъекцию. Образцы брали у животных через 2 недели после последней иммунизации.
(iv) Антитело ELISA.
Образцы сыворотки анализировали на антитела против гетерологичных антигенов, экспрессируе-мых вектором, с использованием ELISA-анализа. Микротитрационные планшеты Falcon Pro Bind сенсибилизировали в течение ночи при 4°С антигеном в PBS (забуференном фосфатом физиологическом растворе, BioWhittaker). Планшеты блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре 5% сухим моло-ком/PBS, а затем 3 раза промывали промывочным буфером (10 мМ забуференным трисом физиологическим раствором, 0,1% Brij-35). После этого в планшет добавляли пробы сыворотки, разведенные в буфере для разведения (2% сухое молоко/PBS/0,05% Твин 20), а затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты 3 раза промывали и в эти планшеты добавляли биотинилированное козье антимышиное антитело (Southern Biotechnology), разведенное 1:8000 в буфере для разведения, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования планшеты 3 раза промывали, а затем добавляли конъюгат "стрептавидин-пероксидаза хрена" (Southern Biotechnology), разведенный 1:8000 в PBS, и планшеты инкубировали еще 1 ч при комнатной температуре. Планшеты 3 раза промывали, а затем добавляли субстратный раствор (BioRad) и реакцию останавливали добавлением 1 н. H2SO4. Оптическую плотность считывали при 450 нм.
(v) Культивирование клеток.
Моноклеточные суспензии получали из мышиной селезенки. Селезенки пропускали через сито путем прессования, с получением моноклеточной суспензии, после чего клетки осаждали и обрабатывали буфером АСК (Bio Whittaker, Walkersville MD) для лизиса эритроцитов. Затем клетки 2 раза промывали в среде RPMI 1640, в которую были добавлены HEPES, 1% глутамин (Bio Whittaker) и 5% термоинактиви-рованная фетальная телячья сыворотка (FCS, Harlan, Indianapolis IN). Клетки подсчитывали и ресуспен-дировали до нужной концентрации в "полной" среде, содержащей RPMI 1640 с HEPES и 1% глутамином, в которую были добавлены 5% термоинактивированная FCS, 50 мМ меркаптоэтанол (Gibco-BRL, Long Island NY), гентамицин (Gibco BRL), 1 мМ MEM с пируватом натрия (Gibco BRL) и MEM с заменимыми аминокислотами (Sigma, St. Louis, МО). Затем клеточные суспензии использовали в различных имму-ноанализах. Для проведения CD8-специфических анализов клетки культивировали in vitro в присутствии пептида, соответствующего известным СD8-эпитопам. Пептиды растворяли в ДМСО (10 мг/мл) и разводили до 10 мкг/мл в культуральной среде.
(vi) ELISPOT.
Для проведения ELISPOT-анализов на IFN-y планшеты для мембранной фильтрации Millipore Multiscreen сенсибилизировали 50 мкл 15 мкг/мл антисыворотки против IFN-y (Pharmingen) в стерильном 0,1М карбонатном буфере, рН 9,6, в течение ночи при 4°С. Планшеты 6 раз промывали стерильным PBS, а затем блокировали средой для культивирования ткани, содержащей 10%-ную фетальную бычью сыворотку (FBS), в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Затем среду удаляли и клетки селезенки распределяли по лункам до общей концентрации 1х106 клеток на лунку. Если в лунки было добавлено менее чем 1х106 клеток от иммунизованных животных, то для доведения их концентрации до 1 х106 брали клетки от животных, которые ранее не участвовали в экспериментах. Клетки инкубировали в течение ночи в инкубаторе для культивирования ткани в присутствии пептида, как описано выше. После этого планшеты 2 раза промывали PBS и 1 раз промывали дистиллированной водой. Затем планшеты 3 раза промывали PBS. В планшеты добавляли биотинилированное моноклональное антитело против IFN-y (Pharmingen) (50 мкл 1 мкг/мл раствора в PBS) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты 6 раз промывали PBS, a затем добавляли 50 мкл конъюгата "стрептавидин-щелочная фосфатаза" (1:1000 в PBS, Pharmingen) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты 6 раз промывали PBS, добавляли субстрат, дающий цветную реакцию (BioRad), и реакционную смесь оставляли для осуществления реакции, вплоть до появления темных пятен. Реакцию завершали путем трехкратной промывки водой. Планшеты сушили воздухом и пятна подсчитывали под микроскопом.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту вирусного генома, которая представляет собой нуклеиновую кислоту генома вируса герпеса или последовательность, по меньшей мере на 80% ей гомологичную, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый из которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетках млекопитающего, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса и оперативно связаны с кодирующими последовательностями, и где
- 27 -
008247
(a) более 10% и вплоть до 95% вирусных последовательностей, которые находятся в области вирусного генома, которая соответствует области, расположенной между 5'- и 3'-концами нуклеиновой кислоты вирусного генома в данной конструкции, отсутствуют в указанной конструкции, и
(b) нуклеиновая кислота вирусного генома составляет от 1 до 50 т.п.н. в длину.
2. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где конструкция представляет собой космиду или плазмиду.
3. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, где в конструкции отсутствуют последовательности упаковки вируса и/или сайт инициации репликации вируса.
4. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где более 20% и вплоть до 85% последовательностей вирусного генома удалено.
5. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где более 30% и вплоть до 75% последовательностей вирусного генома удалено.
6. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где эндогенные ре-гуляторные элементы экспрессии гена оперативно связаны с их природными кодирующими последовательностями.
7. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где последовательность более чем в 500 п.н., расположенная выше и/или ниже промотора эндогенных элементов экспрессии гена, идентична или по меньшей мере на 90% гомологична эндогенным последовательностям генома вируса герпеса.
8. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где два или более эндогенных элемента регуляции гена происходят из последовательных генов генома вируса герпеса.
9. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где три или более эндогенных элемента регуляции гена происходят из последовательных генов в геноме вируса герпеса.
10. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два эндогенных промотора индуцируются в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса.
11. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два этих эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена или же все элементы происходят либо от предранних вирусных генов, либо от ранних вирусных генов.
12. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена являются различными.
13. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где вирус герпеса выбран из вируса простого герпеса (HSV), цитомегаловируса (CMV) и вируса Эпштейна-Барр (EBV).
14. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.13, где вирусом является HSV, который выбран из
HSV-1 и HSV-2.
15. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из вируса простого герпеса и по меньшей мере каждый из двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена содержит эндогенный промотор, выбранный из группы, состоящей из промоторов генов ICP0, ICP4, ICP22 и ЮР27.
16. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из HSV-2 и вирусные последовательности удалены из указанной конструкции одним или несколькими из следующих способов:
(a) путем частичного гидролиза под действием EcoRI, с последующим повторным лигированием;
(b) путем гидролиза под действием Bst 11071 и ScaI, с повторным лигированием;
(c) путем гидролиза под действием Nsi, с последующим повторным лигированием;
(d) путем частичного гидролиза под действием фермента BstXI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей между ICP27 и ICP0;
(e) путем полного гидролиза под действием фермента BspHI, с последующим частичным гидролизом под действием фермента BsiWI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей, смежных с ICP22;
(f) путем гидролиза под действием фермента SrfI, с последующим повторным лигированием для удаления последовательностей между ICP4 и ICP0; и
(g) путем полного гидролиза под действием фермента BstXI, а затем повторного лигирования для удаления последовательностей между ICP27 и ICP0.
17. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где нуклеиновая кислота вирусного генома происходит из HSV-1 и вирусные последовательности удалены из конструкции в целях исключения, по существу, всех последовательностей HSV-1, не относящихся к кодирующим последовательностям ICP0,
ICP4, ICP22 и ICP27.
18. Конструкция нуклеиновой кислоты по пп.14-17, где указанная конструкция содержит промоторы ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27, оперативно связанные с их природными кодирующими последовательностями.
19. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где две или более кодирующих последовательности оперативно связаны с эндогенными регуляторными элементами экс
- 28 -
008247
прессии гена, кодирующими антигены.
20. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где указанная отсутствующая область содержит все промежуточные последовательности или их часть, расположенные между двумя смежными эндогенными регуляторными элементами экспрессии гена и их кодирующими последовательностями.
21. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, где отсутствующая область соответствует одному или нескольким генам, присутствующим в области вирусного генома, кроме по меньшей мере двух эндогенных регуляторных элементов экспрессии гена, активных в одной и той же фазе жизненного цикла вируса.
22. Способ создания конструкции нуклеиновой кислоты для ее непосредственного введения субъекту в целях выработки у этого субъекта иммунного ответа, где указанный способ предусматривает
(a) встраивание нуклеиновой кислоты генома вируса герпеса или последовательности, по меньшей мере на 80% ей гомологичной, в остов вектора, где указанная нуклеиновая кислота вирусного генома составляет от 1 до 50 т.п.н. в длину и содержит по меньшей мере два эндогенных регуляторных элемента экспрессии гена, каждый их которых содержит эндогенный промотор, способный экспрессироваться в клетке млекопитающего, где указанные эндогенные промоторы указанных элементов являются активными в одной и той же фазе жизненного цикла вируса герпеса, и
(b) делецию некоторых или всех вирусных последовательностей из указанной нуклеиновой кислоты вирусного генома, за исключением по меньшей мере двух эндогенных элементов регуляции экспрессии гена, которые присутствуют в области вирусного генома, которая соответствует области, расположенной между 5'- и 3'-концами нуклеиновой кислоты вирусного генома указанной конструкции, где указанную делецию осуществляют либо до, либо во время, либо после встраивания нуклеиновой кислоты вирусного генома в остов вектора,
где созданная конструкция соответствует тому, как определено в любом из предшествующих пунктов.
23. Способ по п.22, дополнительно предусматривающий покрытие конструкцией частиц, подходящих для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки.
24. Частицы с покрытием, подходящие для доставки из устройства для опосредуемой частицами доставки, где указанные частицы включают в себя частицы-носители, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 или полученной способом, как определено в п.22 или 23.
25. Дозировочный сосуд, используемый в устройстве для опосредуемой частицами доставки и содержащий частицы с покрытием по п.24.
26. Устройство для опосредуемой частицами доставки, загруженное частицами с покрытием по
п.24.
27. Вакцина, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.
28. Способ in vitro осуществления экспрессии требуемого полипептида в клетке млекопитающего, где указанный способ предусматривает перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 или полученной способом по п.22 или 23.
29. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-21 в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.
30. Применение конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.22 или 23, в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.
31. Применение частиц с покрытием по п.24 в производстве лекарственного средства для использования при иммунизации нуклеиновой кислотой.
32. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, как определено в любом из пп.1-21.
33. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение конструкции нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.22 или 23.
34. Способ иммунизации нуклеиновой кислотой, предусматривающий введение частиц с покрытием по п.24.
- 29 -
008247
НрЦ EcoRI sspl; Sspl! Tsspl '
~ <# sspl X щ amp EcoRI^X neo i XbaI-.# 40000 Фрагмент 10
ECOFT ;
Космида 23 Ю000-(Фрагмент 9 43294 п.н.
-30000 ICPOi
Xbal-EcoRI'
BgUT
Фиг. 1(a)
Psp1406I BbvCI / _ OT BstBI / EcoRI
" 5 11 1 1 / ,Bpu1102I
Psp1406I Hp' Scal^\ Psp1406I-EcoRI-Psp1406I-
EcoRV
¦EcoNI ¦Hpal
EcoRV
¦BbvCI
Bcir
Bpu1102I
Фиг. 1(b)
win
4Psp1406I
Psp1406IBstBj// /Sgfl EcoNI
BstBI-Hpal-
..Bpu1102I Blnl
Psp1406I-
EcoR'
•EcoNI ,HpaI .EcoRV
BbvCI
Bell'
Bpu1102I
kflE > sp1406I
Фиг. 1(c)
- 30 -
008247
- 31 -
008247
Фиг. 2(a)
- 32 -
008247
BstBI BglE BInl- *
BspHI Pcil I
BsrGI -BInl
BstBI.. BspHI-
neo
30000
jSwal -EcoRI
5000'
Kpnl-Асс65Г Bpu1102I
-25000
20000
0Phsv1-2 31365 п.н.
10000^
22 15000
,SnaBI -Acc65I •Kpnl
RL1.
Pcil'
EcoF
BsrC
Фиг. 2(b)
BspHI Pcil I
BstBI Bgm.
Blnl27
BsrGI ' -BInl
BstBI BbvCI-.' BspHI-
BbvCI-
BbvCI-
Kpnl-Асс65Г Bpu1102I neo
•25000
30000
5000'
QPhsvl-3 30727 п.н.
20000 122
10000,
15000 RL1.
,SnaBI > Acc65I 4KpnI
Рей
EcoRI'
BsrGI
Фиг. 2(c)
BspHI
BstBI BglE HinrM
BstBI B,nL Xmni: BbvCI. BstHOft Kpnl,. Acc65P Bpu1102T
Hincffll-
Pcil
Bst1107I BsrGI BInl
5000-
0Phsv1-4 -20000 27688 п.н.
SnaBI \-Acc65I Kpnl
EcoRI
BsrGI' / Xmni
Фиг. 2(d)
- 33 -
008247
Pspl 4061.. Есо47Ш PshAI-BstBI Xmni XhoI/1 HincfflT" A
Psp1408I PcjI BspHI
Есо47Ш\
Bg.I.BstBI Hindi. BlrA
Bst1107I BsrGI BInl
BsrGI Xmni
Фиг. 2(e)
Psp1406I
¦•SnaBI ¦АссбЯ Kpnl •Xhol PshAI 4PshAI
Psp1408I
Есс47Ш Bsu36I VsP[
Bgl Hindi BInl Psp1406I Есо47Ш PshAI BstBI Xmni ХпоГ7 HindHT Pcil
Alw44I / Bsu36I
Bstnon
BsrGI BInl
SnaBI
BsrGI Xmni
Фиг. 2(f)
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 34 -