1. Соединение формулы (I)

где n равен 0 или 1 и, когда n равен 0, тогда имеется в виду непосредственная связь;

каждый Q представляет собой азот или ;

каждый X представляет собой азот или ;

каждый Y представляет собой азот или ;

каждый Z представляет собой азот или ;

R ¹ представляет собой -C(O)NHOH, -NHC(О)С _1-6 -алкандиил-SH;

R ² представляет собой водород или нитро;

R ³ представляет собой водород, C _1-6 -алкил, арил-С _2-6 -алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, С _1-6 -алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ди(С _1-6 -алкил)аминосульфониламино-С _1-6 -алкил, ди(С _1-6 -алкил)амино-С _1-6 -алкил, C _1-12 -алкилсульфонил, ди(C _1-6 -алкил)аминосульфонил, ди(С _1-6 -алкил)аминосуль-фониламиноС _1-6 -алкил, тригалоген-С _1-6 -алкилсульфонил, ди(арил)-С _1-6 -алкилкарбонил, тиофенил-С _1-6 -алкилкарбонил;

R ⁴ представляет собой водород;

когда R ³ и R ⁴ находятся у одного и того же атома углерода, R ³ и R ⁴ вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы

-С(О)-NH-CH ₂ -NR ¹⁰ - (а-1),

где R ¹⁰ представляет собой водород или арил;

когда R ³ и R ⁴ находятся у соседних атомов углерода, R ³ и R ⁴ вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы

=СН-СН=СН-СН= (b-1);

его N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые соли присоединения и стереохимически изомерные формы.

2. Соединение по п.1, где n равен 1; каждый Q представляет собой ; каждый Z представляет собой азот; R ¹ представляет собой -С(O)NH(ОН); R ² представляет собой водород; R ³ представляет собой нафталинкарбонил, C _1-12 -алкилсульфонил или ди(арил)-C _1-6 -алкилкарбонил; и R ⁴ представляет собой водород.

3. Соединение по пп.1 и 2, выбранное из числа соединений ь 18, ь 5 и ь 24.

4. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемые носители и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество соединения по пп.1-3.

5. Способ получения фармацевтической композиции по п.4, где тщательно смешивают фармацевтически приемлемые носители и соединение по пп.1-3.

6. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве лекарственного средства.

7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лечебного средства для лечения пролиферативных заболеваний.

8. Способ получения соединения по п.1, отличающийся тем, что промежуточное соединение формулы (II) вводят во взаимодействие с соответствующей кислотой, такой как, например, трифторуксусная кислота, и получают гидроксамовую кислоту формулы (I-а), где R ¹ представляет собой -C(O)NH(OH)

9. Способ детекции или идентификации HDAC в биологическом образце, включающий детекцию или определение образования комплекса между меченым соединением по п.1 и HDAC.

10. Сочетание противоракового средства и ингибитора HDAC по любому из пп.1-3.

 

(57) Реферат / Формула:
Соединение формулы (I)

где n равен 0 или 1 и, когда n равен 0, тогда имеется в виду непосредственная связь;

каждый Q представляет собой азот или ;

каждый X представляет собой азот или ;

каждый Y представляет собой азот или ;

каждый Z представляет собой азот или ;

R ¹ представляет собой -C(O)NHOH, -NHC(О)С _1-6 -алкандиил-SH;

R ² представляет собой водород или нитро;

R ³ представляет собой водород, C _1-6 -алкил, арил-С _2-6 -алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, С _1-6 -алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ди(С _1-6 -алкил)аминосульфониламино-С _1-6 -алкил, ди(С _1-6 -алкил)амино-С _1-6 -алкил, C _1-12 -алкилсульфонил, ди(C _1-6 -алкил)аминосульфонил, ди(С _1-6 -алкил)аминосуль-фониламиноС _1-6 -алкил, тригалоген-С _1-6 -алкилсульфонил, ди(арил)-С _1-6 -алкилкарбонил, тиофенил-С _1-6 -алкилкарбонил;

R ⁴ представляет собой водород;

когда R ³ и R ⁴ находятся у одного и того же атома углерода, R ³ и R ⁴ вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы

-С(О)-NH-CH ₂ -NR ¹⁰ - (а-1),

где R ¹⁰ представляет собой водород или арил;

когда R ³ и R ⁴ находятся у соседних атомов углерода, R ³ и R ⁴ вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы

=СН-СН=СН-СН= (b-1);

его N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые соли присоединения и стереохимически изомерные формы.

2. Соединение по п.1, где n равен 1; каждый Q представляет собой ; каждый Z представляет собой азот; R ¹ представляет собой -С(O)NH(ОН); R ² представляет собой водород; R ³ представляет собой нафталинкарбонил, C _1-12 -алкилсульфонил или ди(арил)-C _1-6 -алкилкарбонил; и R ⁴ представляет собой водород.

3. Соединение по пп.1 и 2, выбранное из числа соединений ь 18, ь 5 и ь 24.

4. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемые носители и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество соединения по пп.1-3.

5. Способ получения фармацевтической композиции по п.4, где тщательно смешивают фармацевтически приемлемые носители и соединение по пп.1-3.

6. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве лекарственного средства.

7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лечебного средства для лечения пролиферативных заболеваний.

8. Способ получения соединения по п.1, отличающийся тем, что промежуточное соединение формулы (II) вводят во взаимодействие с соответствующей кислотой, такой как, например, трифторуксусная кислота, и получают гидроксамовую кислоту формулы (I-а), где R ¹ представляет собой -C(O)NH(OH)

9. Способ детекции или идентификации HDAC в биологическом образце, включающий детекцию или определение образования комплекса между меченым соединением по п.1 и HDAC.

10. Сочетание противоракового средства и ингибитора HDAC по любому из пп.1-3.

 

---

008245
Данное изобретение относится к соединениям, обладающим ферментативной активностью ингиби-рования гистондеацетилазы (HDAC). Оно также относится к способам их получения, к композициям, содержащим их, а также к их применению, как in vitro, так и in vivo, для ингибирования HDAC и в качестве лечебного средства, например в качестве лекарственного средства для подавления пролифератив-ных состояний, таких как рак и псориаз.
Во всех эукариотических клетках геномная ДНК в хроматине ассоциирует с гистонами с образованием нуклеосом. Каждая нуклеосома состоит из октамера белка, состоящего из двух копий каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4. ДНК обвивает такую белковую сердцевину с помощью основных аминокислот гистонов, взаимодействующих с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК. Самой обычной посттрансляционной модификацией таких коровых гистонов является обратимое ацетилирова-ние е-аминогрупп консервативных высокоосновных N-концевых лизиновых остатков. Устойчивое состояние ацетилирования гистонов устанавливается за счет динамического равновесия между конкурирующими гистонацетилтрансферазой(ами) и гистондеацетилазой(ами), называемыми в данном описании "HDAC". Ацетилирование и деацетилирование гистонов долгое время связывали с транскрипционным контролем. Современное клонирование генов, кодирующих различные гистонацетилтрансферазы и гис-тондеацетилазы, дает возможное объяснение соотношения между ацетилированием гистонов и транскрипционным контролем. Обратимое ацетилирование гистонов может привести к реконструкции хроматина и, как таковое, действует как контрольный механизм транскрипции генов. Вообще, гиперацетили-рование гистонов облегчает экспрессию генов, в то время как деацетилирование гистонов коррелирует с транскрипционной репрессией. Показано, что гистонацетилтрансферазы действуют как коактиваторы транскрипции, в то время как гистондеацетилазы, как было обнаружено, принадлежат к каскаду реакций транскрипционной репрессии.
Динамическое равновесие между ацетилированием и деацетилированием гистонов существенно для нормального роста клеток. Ингибирование гистондеацетилазы приводит к задержке клеточного цикла, клеточной дифференцировке, апоптозу и реверсированию трансформированного фенотипа. Поэтому ингибиторы HDAC могут иметь большой терапевтический потенциал при лечении клеточно-пролифератив-ных заболеваний или состояний (Marks et al., Nature Reviews: Cancer, 1:194-202, 2001).
Исследование ингибиторов гистондеацетилаз (HDAC) показывает, что, действительно, эти ферменты играют важную роль в пролиферации и дифференцировке клеток. Ингибитор трихостатин А (TSA) вызывает задержку клеточного цикла в обеих фазах G1 и G2, возвращает в исходное состояние трансформированный фенотип различных клеточных линий и индуцирует дифференцировку клеток лейкоза Френда и других. Сообщалось, что TSA (и субероиланилидгидроксамовая кислота - SAHA) ингибирует рост клеток, индуцирует терминальную дифференцировку и предотвращает образование опухолей у мышей (Finnin et al., Nature, 401:188-193, 1999).
Также сообщалось, что трихостатин А пригоден при лечении фиброза, например фиброза печени, и цирроза печени (Geerts et al., заявка на европейский патент ЕР 0827742, опубликована 11 марта 1998).
В международной заявке WO01/38322, опубликованной 31 мая 2001, описываются, среди прочих, ингибиторы гистондеацетилазы общей формулы Cy-L-Ar-Y-C^-NH-Z, а также композиции и способы лечения клеточно-пролиферативных заболеваний и состояний.
В международной заявке WO01/70675, опубликованной 27 сентября 2001, описываются ингибиторы гистондеацетилазы формулы Cy-X-Y1-W и Cy-S^^-NH-Y^W, а также композиции и способы лечения клеточно-пролиферативных заболеваний и состояний.
Проблема, которую следует решить, состоит в получении ингибиторов гистондеацетилазы с высокой ферментативной активностью, показывающих также такие выгодные свойства, как клеточная активность и повышенная биологическая доступность, предпочтительно оральная биологическая доступность, и имеющих слабые побочные действия или не имеющих их.
Новые соединения настоящего изобретения решают описанные выше проблемы. Соединения отличаются от соединений известного уровня техники по строению.
Соединения настоящего изобретения показывают in vitro превосходную ферментативную активность ингибирования гистондеацетилазы. Соединения настоящего изобретения обладают выгодными свойствами в отношении клеточной активности и специфическими свойствами в отношении ингибиро-вания развития клеточного цикла в обеих контрольных точках G1 и G2 (способность индуцировать р21). Соединения настоящего изобретения показывают хорошую метаболическую устойчивость и высокую биологическую доступность, и, конкретнее, они показывают оральную биологическую доступность.
Данное изобретение относится к соединениям формулы (I)
008245
где п равен 0 или 1 и, когда п равен 0, тогда имеется в виду непосредственная связь;
каждый Q представляет собой азот или
каждый X представляет собой азот или каждый Y представляет собой азот или ;
каждый Z представляет собой азот или \ ;
R1 представляет собой -C(O)NHOH, -NHC(О)C1-6-алкандиил-SH;
R2 представляет собой водород или нитро;
представляет собой водород, С1-6-алкил, арил-С2-6-алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, C1-6-алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфониламино-С1-6-алкил, ди^^-ал-кил)амино-С1-6-алкил, C1-12-алкилсульфонил, ди(C1-6-алкил)аминосульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфо-ниламиноС1-6-алкил, тригалоген-С1-6-алкилсульфонил, ди(арил)-C1-6-алкилкарбонил, тиофенил-С1-6-алкил-карбонил;
R4 представляет собой водород;
когда R3 и R4 находятся у одного и того же атома углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы
-C(O)-NH-CH2-NR10- (а-1), где R10 представляет собой водород или арил;
когда R3 и R4 находятся у соседних атомов углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы
=СН-СН=СН-СН= (b-1);
его N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые соли присоединения и стереохимически изомерные формы.
Предпочтительным воплощением изобретения является соединение формулы (I), где п равен 1; каждый
Q представляет собой ; каждый Z представляет собой азот; R представляет собой -С^^ЩОН);
R2 представляет собой водород; R3 представляет собой нафталинкарбонил, C1-12-алкилсульфонил или ди(арил)-C1-6-алкилкарбонил; и R4 представляет собой водород.
Другим предпочтительным воплощением изобретения является соединение, выбранное из числа соединений, приведенных ниже.
__А> \_/ \_/ HN-OH
сто
Соед.№ 18
Соед.№ 5
A J Н
Qi N
Соед.№ 24
Другим воплощением настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемые носители и, в качестве активного ингредиента, терапевтически эффективное количество соединения формулы (I).
Еще одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции тщательным смешиванием фармацевтически приемлемых носителей и соединения формулы (I).
Другим воплощением настоящего изобретения является применение соединения формулы (I) в качестве лекарственного средства.
Еще одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения является применение соединения формулы (I) для получения лечебного средства для лечения пролиферативных заболеваний.
Другим воплощением настоящего изобретения является способ получения соединения формулы (I), отличающийся тем, что промежуточное соединение формулы (II) вводят во взаимодействие с соответствующей кислотой, такой как, например, трифторуксусная кислота, и получают гидроксамовую кислоту
- 2 -
008245
формулы (I-а), где R1 представляет собой -C(0)NH(OH)
Другим воплощением настоящего изобретения является способ детекции или идентификации HDAC в биологическом образце, включающий детекцию или определение образования комплекса между меченым соединением формулы (I) и HDAC.
Другим воплощением настоящего изобретения является применение сочетания противоракового средства и ингибитора HDAC.
Термин "ингибитор гистондеацетилазы" используется для обозначения соединения, способного взаимодействовать с гистондеацетилазой и ингибировать ее активность, конкретнее - ее ферментативную активность. Ингибирование ферментативной активности гистондеацетилазы означает ослабление способности гистондеацетилазы удалять ацетильную группу из гистона. Предпочтительно такое ингибирование является специфическим, т.е. ингибитор гистондеацетилазы ослабляет способность гистондеаце-тилазы удалять ацетильную группу из гистона в концентрации, которая ниже, чем концентрация ингибитора, которая требуется для получения некоторого другого эффекта, неродственного биологическому.
Используемый в приведенных выше определениях и далее термин "галоген" является общим для фтора, хлора, брома и иода; C^-алкил определяет линейные и разветвленные насыщенные углеводородные радикалы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода, такие как, например, метил, этил, пропил, бутил, 1-метил-этил, 2-метилпропил и т.п.; C1-6-алкил включает C^-алкил и его более высокие гомологи с 5-6 атомами углерода, такие как, например, пентил, 2-метилбутил, гексил, 2-метилпентил и т.п.; C1-6-алкандиил определяет двухвалентные линейные и разветвленные насыщенные углеводородные радикалы с 1-6 атомами углерода, такие как, например, метилен, 1,2-этандиил, 1,3-пропандиил, 1,4-бутандиил, 1,5-пентандиил, 1,6-гександиил, и их разветвленные изомеры, такие как 2-метилпентандиил, 3-метилпентандиил, 2,2-диметилбутандиил, 2,3-диметилбутандиил и т.п.; тригалоген-С1-6-алкил определяет C1-6-алкил, содержащий три идентичных или разных галогенозаместителя, например трифторметил; С2-6-алкендиил определяет двухвалентные линейные и разветвленные углеводородные радикалы, содержащие одну двойную связь и 2-6 атомов углерода, такие как, например, этендиил, 2-пропендиил, 3-бутендиил, 2-пентендиил, 3-пентендиил, 3-метил-2-бутендиил и т.д.; и аминоарил определяет арил, замещенный амино.
Термин "другая Zn-хелатообразующая группа" относится к группе, способной взаимодействовать с Zn-ионом, который может присутствовать в сайте связывания фермента.
Фармацевтически приемлемые соли присоединения охватывают фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований. Подразумевается, что упомянутые выше фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот включают терапевтически активные нетоксичные формы солей присоединения кислот, которые способны образовывать соединения формулы (I). Соединения формулы (I), имеющие свойства оснований, можно превратить в их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот обработкой указанной формы основания подходящей кислотой. Подходящими кислотами являются, например, неорганические кислоты, такие как галогеноводородные кислоты, например хлороводородная или бромоводородная кислота; серная, азотная, фосфорная и подобные кислоты; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, трифто-руксусная, пропановая, гликолевая, молочная, пировиноградная, щавелевая, малоновая, янтарная (т.е. бутандиовая кислота), малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, метансульфоновая, этан-сульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая, памовая кислота и подобные кислоты.
Соединения формулы (I), имеющие кислотные свойства, можно превратить в их фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований обработкой указанной формы кислоты подходящим органическим или неорганическим основанием. Соответствующие формы солей присоединения оснований включают, например, соли аммония, соли щелочных и щелочно-земельных металлов, например литиевые, натриевые, калиевые, магниевые, кальциевые соли, и т.п., соли с органическими основаниями, например соли бензатина, ^метил^-глюкамина, гидрабамина, и соли с аминокислотами, такими как, например, аргинин, лизин и т.п.
Термин "соли присоединения кислот или оснований" также включает гидраты и формы присоединения растворителей, которые способны образовывать соединения формулы (I). Примерами таких форм являются, например, гидраты, алкоголяты и т. п.
Термин "стереохимически изомерные формы соединений формулы (I)", используемый в данном описании, определяет все возможные соединения, состоящие из одних и тех же атомов, связанных в одной и той же последовательности связей, но имеющие разные трехмерные структуры, не являющиеся взаимозаменяемыми, которыми могут обладать соединения формулы (I). Если не упоминается или не указано иное, химическое название соединения охватывает смесь всех возможных стереохимически изо
- 3 -
008245
мерных форм, которыми указанное соединение может обладать. Указанная смесь может содержать все диастереомеры и/или энантиомеры основной молекулярной структуры указанного соединения. Подразумевается, что все стереохимически изомерные формы соединений формулы (I) как в чистой форме, так и в форме смесей друг с другом входят в объем настоящего изобретения.
Подразумевается, что N-оксидные формы соединений формулы (I) включают такие соединения формулы (I), где один или несколько атомов азота окислены до так называемого N-оксида, в частности такие N-оксиды, где N-окисленными являются один или несколько атомов азота пиперидина, пиперазина или пиридазинила.
Некоторые соединения формулы (I) также могут существовать в их таутомерных формах. Подразумевается, что такие формы, хотя и не указываются ясно в приведенной выше формуле, включены в объем настоящего изобретения.
Когда бы ни использовался далее в настоящем описании термин "соединения формулы (I)", подразумевается, что он также включает фармацевтически приемлемые соли присоединения и все стереоизо-мерные формы.
Подразумевается, что используемые в данном описании термины "гистондеацетилаза" и "HDAC" относятся к любому ферменту из семейства ферментов, удаляющих ацетильную группу из е-аминогрупп лизиновых остатков в N-конце гистона. Если в контексте не указано иное, подразумевается, что термин "гистон" относится к любому белку-гистону, включая H1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 и Н5, от любого вида. Человеческие белки HDAC или генные продукты включают HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9 и HDAC-10 и другие белки. Гистондеацетилаза также может происходить от источника, принадлежащего к простейшим или грибам.
Первая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимы одно или несколько из следующих ограничений:
a) правей0 или 1;
b) каждый Q представляет собой ;
c) R1 представляет собой -C(O)NH(OH) или -NHC(О)-C1-6-алкандиил-SH;
d) R2 представляет собой водород или нитро;
e) R3 представляет собой C1-6-алкил, арил-С2-6-алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, C1-6-алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ди^^-алкш^аминосульфониламино-С^-алкил, ди^^-алкил) амино-С1-6-алкил, Cb^-алкилсульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфонил, тригалоген-С1-6-алкилсульфо-нил, ди(арил)-C1-6-алкилкарбонил, тиофенил-С1-6-алкилкарбонил, пиридинилкарбонил или арил-С1-6-ал-килкарбонил;
f) R4 представляет собой водород;
g) когда R3 и R4 находятся у одного и того же атома углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы (а-1), где R10 представляет собой арил;
h) когда R3 и R4 находятся у соседних атомов углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы (b-1).
Вторая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимы одно или несколько из следующих ограничений:
a) правей 1;
b) каждый Q представляет собой ;
c) каждый Z представляет собой азот;
d) R1 представляет собой -C(O)NH(OH);
e) R2 представляет собой водород;
f) R3 представляет собой нафталинкарбонил, C1-12-алкилсульфонил или ди(арил)-C1-6-алкилкарбонил;
g) R4 представляет собой водород.
Третья группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), где
представляет собой водород.
Четвертая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), где R1 представляет собой -C(O)NH(OH).
Пятая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), где R2 представляет собой водород и R1 представляет собой -C(O)NH(OH).
Шестая группа соединений, представляющих интерес, состоит из таких соединений формулы (I), к которым применимо одно или несколько следующих ограничений:
a) R1 представляет собой -C(O)NR5R6, -С(О)-C1-6-алкандиил-SR7, -NR8C(O)N(OH)R7, -NR8C(0)-C1-6-aлкaндиил-SR7, -NR8C(0)C=N(0Н)R7 или другую Zn-хелатообразующую группу, где R5 и R6 выбирают, каждый независимо, из числа водорода, гидрокси, гидрокси-С1-6-алкила или амино-С1-6-алкила;
b) R2 представляет собой водород, галоген, гидрокси, амино, нитро, C1-6^COUI, С1-6-алкилокси, три-фторметил или ди(C1-6-алкил)амино;
c) R3 представляет собой водород, C1-6^COUI, арил-С2-6-алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, -С(0)-фенил^9, C1-6-алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ариламиносульфонил, аминосульфо
- 4 -
008245
ниламино, ди(C1-6-алкил)аминосульфониламино, ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкил, C1-12-алкилсульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфонил или пиридинилкарбонил, где каждый R9 выбирают, независимо, из числа фенила; фенила, замещенного одним, двумя или тремя заместителями, выбранными, независимо, из числа галогена, C^-алкила, C^-алкилокси; или тиофенила;
d) R4 представляет собой водород, гидрокси, амино, гидрокси-С1-6-алкил, С1-6-алкил, C^-алкилокси, арил-С1-6-алкил, аминокарбонил, амино-С1-6-алкил, С1-6-алкиламино-С1-6-алкил или ди(C1-6-алкил)амино-С1-6-алкил.
Группа предпочтительных соединений состоит из таких соединений формулы (I), где
R1 представляет собой -C(O)NR5R6, -С(O)-Cl-6-aлкaндиил-SR7, -NR8C(O)N(OH)R7, -NR8C(O)-Q-6-aлкaндиил-SR7, -NR8C(O)C=N(0Н)R7 или другую Zn-хелатообразующую группу, где R5 и R6 выбирают, каждый независимо, из числа водорода, гидрокси, гидрокси-С1-6-алкила или амино-С1-6-алкила;
R2 представляет собой водород, галоген, гидрокси, амино, нитро, C^-алкил, C1-6-алкилокси, три-фторметил или ди(С1-6-алкил)амино;
R3 представляет собой водород, C^-алкил, арил-С2-6-алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, -С(0)-фенил^9, C1-6-алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ариламиносульфонил, аминосульфо-ниламино, ди(C1-6-алкил)аминосульфониламино, ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкил, C1-12-алкилсульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфонил или пиридинилкарбонил, где каждый R9 выбирают, независимо, из числа фенила; фенила, замещенного одним, двумя или тремя заместителями, выбранными, независимо, из числа галогена, C1-6-алкила, C^-алкилокси; или тиофенила; и
R4 представляет собой водород, гидрокси, амино, гидрокси-C1-6-алкил, C^-алкил, C1-6-алкилокси, арил-С1-6-алкил, аминокарбонил, амино-С1-6-алкил, С1-6-алкиламино-С1-6-алкил или ди(C1-6-алкил)амино-С1-6-алкил.
Другая группа предпочтительных соединений состоит из таких соединений формулы (I),
где n равен 0 или 1; каждый Q представляет собой ; R1 представляет собой -C(O)NH(OH) или
-NHC(0)-С1-6-алкандиил-SН; R2 представляет собой водород или нитро; R3 представляет собой C^-ал-кил, арил-С2-6-алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, C^-алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ди^^-алкиОаминосульфониламино-С^-алкил, ди(C1-6-алкил)амино-C1-6-алкил, Cbn-алкилсуль-фонил, ди(C1-6-алкил)аминосульфонил, тригалоген-С1-6-алкилсульфонил, ди(арил)-C1-6-алкилкарбонил, тиофенил-С1-6-алкилкарбонил, пиридинилкарбонил или арил-С1-6-алкилкарбонил; R4 представляет собой водород; когда R3 и R4 находятся у одного и того же атома углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы (а-1), где R10 представляет собой арил; или, когда R3 и R4 находятся у соседних атомов углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы (b-1).
Группа более предпочтительных соединений состоит из таких соединений формулы (I),
где п равен 1; каждый Q представляет собой ^""^; каждый Z представляет собой азот; R1 представляет собой -C(O)NH(OH); R2 представляет собой водород; R3 представляет собой нафталинкарбонил, Cbn-алкилсульфонил или ди(арил)-C1-6-алкилкарбонил; и R4 представляет собой водород.
Наиболее предпочтительными соединениями являются соединения № 18, № 5 и № 24.
7^Э\_У \_/ HN-OH
(ТО
Соед.№ 18
Соед.№ 5
Соед.№ 24
Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли и их N-оксиды и стереохимиче-ски изомерные формы можно получить обычными способами. 0бщий путь синтеза включает, например, этапы, перечисленные далее.
а) Гидроксамовые кислоты формулы (I), где R1 представляет собой -C(O)NH(OH), причем указанные соединения относят к соединениям формулы (I-а), можно получить взаимодействием промежуточного соединения формулы (II) с подходящей кислотой, такой как, например, трифторуксусная кислота. Указанное взаимодействие осуществляют в подходящем растворителе, таком как, например, метанол.
- 5 -
008245
b) Промежуточные соединения формулы (II) можно получить взаимодействием промежуточного соединения формулы (III) с промежуточным соединением формулы (IV) в присутствии соответствующих реагентов, таких как моногидрохлорид №-(этилкарбонимидоил)-^№диметил-1,3-пропандиамина (EDC) и 1-гидрокси-1Н-бензотриазол (НОВТ). Взаимодействие можно осуществлять в подходящем растворителе, таком как смесь DCM и ТГФ.
с) Промежуточные соединения формулы (III) можно получить взаимодействием промежуточного соединения формулы (V) с подходящим основанием, таким как NaOH, в присутствии подходящего растворителя, такого как этанол.
Соединения формулы (I) также можно удобно получать с использованием метода твердофазного синтеза. Вообще, твердофазный синтез включает взаимодействие промежуточного соединения при синтезе с полимерным носителем. Такое промежуточное соединение на носителе затем может проходить через ряд стадий синтеза. После каждой стадии отфильтровыванием смолы и промывкой ее несколько раз различными растворителями удаляют примеси. На каждой стадии смолу можно разделять для взаимодействия с разными промежуточными соединениями на следующей стадии, причем таким образом создается возможность синтеза большого числа соединений. После последней стадии в процедуре смолу обрабатывают реагентом или способом, отщепляющим смолу от образца. Более подробное пояснение методов, используемых в твердофазной химии, дается, например, в работах "The Combinatorial Index" (B.Bunin, Academic Press) и Novabiochem's 1999 Catalogue & Peptide Synthesis Handbook (Novabiochem AG, Switzerland), которые обе включены в данное описание в качестве ссылок.
Соединения формулы (I) и некоторые промежуточные соединения могут содержать в своей структуре по меньшей мере один стереогенный центр. Такой стереогенный центр может присутствовать в R-или S-конфигурации.
Соединения формулы (I), полученные описанными выше способами, как правило, представляют собой рацемические смеси энантиомеров, которые можно отделить друг от друга последующими процедурами разделения, известными в технике. Рацемические соединения формулы (I) можно превратить в соответствующие диастереомерные формы солей взаимодействием с подходящей хиральной кислотой. Затем указанные диастереомерные формы солей разделяют, например, селективной или фракционной кристаллизацией и энантиомеры высвобождают из них под действием щелочи. Другой способ разделения энантио-мерных форм соединений формулы (I) включает жидкостную хроматографию с использованием хиральной неподвижной фазы. Указанные стереохимически чистые изомерные формы также можно получить из соответствующих стереохимически чистых изомерных форм подходящих исходных веществ, при условии, что взаимодействие происходит стереоспецифически. Предпочтительно, если нужен определенный стереоизомер, следует синтезировать указанное соединение стереоспецифическими способами получения. В таких способах преимущественно будут использоваться энантиомерно чистые исходные вещества.
Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и их сте-реоизомерные формы имеют ценные фармакологические свойства, проявляющиеся в том, что они обладают ингибирующим действием в отношении гистондеацетилазы (HDAC).
Данное изобретение относится к способу ингибирования аномального роста клеток, в том числе трансформированных клеток, путем введения эффективного количества соединения изобретения. Ано
- 6 -
008245
мальным является рост клеток, не зависимый от нормальных регуляторных механизмов (например, утрата контактного ингибирования). Сюда относятся ингибирование роста опухоли как непосредственно, за счет задержки роста, терминальной дифференцировки и/или апоптоза раковых клеток, так и косвенно, путем ингибирования неоваскуляризации опухолей.
Данное изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолей путем введения субъекту, например млекопитающему (в более частном случае, человеку), нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения настоящего изобретения. В частности, данное изобретение относится к способу ингибирования роста опухолей путем введения эффективного количества соединений настоящего изобретения. Примерами опухолевых заболеваний, которые можно подавлять, являются, но не ограничиваются указанным, рак легких (например, аденокарцинома, и в том числе немелкоклеточ-ный рак легких), раковые заболевания поджелудочной железы (например, панкреатическая карцинома, такая как, например, экзокринная панкреатическая карцинома), раковые заболевания ободочной кишки (например, колоректальные карциномы, такие как, например, аденокарцинома ободочной кишки и аденома ободочной кишки), рак предстательной железы, в том числе прогрессирующее заболевание, гемо-поэтические опухоли лимфоидного ряда (например, острый лимфоцитарный лейкоз, В-клеточная лим-фома, лимфома Беркитта), миелоидные лейкозы (например, острый миелоидный лейкоз (AML)), фолликулярный рак щитовидной железы, миелодиспластический синдром (MDS), опухоли мезенхимного происхождения (например, фибросаркомы и рабдомиосаркомы), меланомы, тератокарциномы, нейробласто-мы, глиомы, доброкачественная опухоль кожи (например, кератоакантомы), карцинома молочной железы (например, прогрессирующий рак молочной железы), карцинома почек, карцинома яичников, карцинома мочевого пузыря и эпидермальная карцинома.
Соединения по изобретению можно использовать для других лечебных целей, например для
a) сенсибилизации опухолей к радиотерапии путем введения соединения по изобретению перед, во время или после облучения опухоли для лечения рака;
b) лечения артропатий и остеопаталогических состояний, таких как ревматоидный артрит, остео-артрит, ювенильный артрит, подагра, полиартрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит и системная красная волчанка;
c) ингибирования пролиферации клеток гладких мышц, в том числе васкулярных пролиферативных расстройств, атеросклероза и рестеноза;
d) лечения воспалительных состояний и состояний кожи, таких как неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, аллергический ринит, болезнь "трансплантат против хозяина", конъюнктивит, астма, ARDS, болезнь Бехчета, отторжение трасплантата, крапивница, аллергический дерматит, гнездная алопеция, склеродерма, экзантема, экзема, дерматомиозит, акне, диабет, системная красная волчанка, болезнь Кавасаки, рассеянный склероз, эмфизема, кистозный фиброз и хронический бронхит;
e) лечения эндометриоза, маточного фиброза, дисфункционального маточного кровотечения и эн-дометриальной гиперплазии;
f) лечения глазной васкуляризации, включая васкулопатию, поражающую ретинальные и хориои-дальные сосуды;
g) лечения сердечной дисфункции;
h) ингибирования иммуносупрессорных состояний, например, лечения ВИЧ-инфекций;
i) лечения ренальной дисфункции;
j) подавления эндокринных расстройств;
k) ингибирования дисфункции глюконеогенеза;
l) лечения невропатологии, например болезни Паркинсона, или невропатологии, которая приводит к расстройству познавательной способности, например болезни Альцгеймера, или нейронных болезней, связанных с полиглутамином;
m) ингибирования нервно-мышечной патологии, например амиотрофического бокового склероза;
n) лечения спинально-мышечной атрофии;
о) лечения других патологических состояний, поддающихся лечению путем потенциирования экспрессии гена;
р) усиления генной терапии.
Итак, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I) для применения в качестве лекарственного средства, а также к применению указанных соединений формулы (I) для получения лечебного средства для лечения одного или нескольких из вышеуказанных состояний.
Соединения формулы (I), их фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и стерео-изомерные формы могут иметь ценные диагностические свойства в том отношении, что их можно использовать для детекции или идентификации HDAC в биологическом образце, включая детекцию или определение образования комплекса между меченым соединением и HDAC.
В способах детекции или идентификации можно использовать соединения, помеченные веществами-метками, такими как радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и т.д. Примерами радиоизотопов являются 125I, 131I, 3Н и 14С. Ферменты, как правило, делают детектируемыми путем соединения с соответствующим субстратом, который, в свою очередь, катализирует реак
- 7 -
008245
цию детекции. Их примерами являются, например, бета-галактозидаза, бета-глюкозидаза, щелочная фосфатаза, пероксидаза и малатдегидрогеназа, и предпочтительна пероксидаза из хрена. Люминесцентные вещества включают, например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люцифе-
разу.
Биологические образцы можно определить как ткань организма или жидкости организма. Примерами жидкостей организма являются цереброспинальная жидкость, кровь, плазма, сыворотка, моча, мокрота, слюна и т.п.
С учетом их полезных фармакологических свойств, обсуждаемые соединения можно ввести в состав разных фармацевтических форм для целей введения.
Для того чтобы получить фармацевтические композиции данного изобретения, эффективное количество определенного соединения, в форме соли присоединения основания или кислоты, в качестве активного ингредиента объединяют при тщательном перемешивании с фармацевтически приемлемым носителем, который может иметь самые разные формы, в зависимости от формы препарата, нужного для введения. Такие фармацевтические композиции представляют, желательно, единичную дозированную форму, подходящую предпочтительно для введения перорально, ректально, чрескожно или путем парентеральной инъекции. Например, при получении композиций в оральной дозированной форме можно использовать любую из обычно используемых фармацевтических сред, такую как, например, вода, глико-ли, масла, спирты и т.п., в случае оральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазывающие вещества, связующие вещества, дезинтегрирующие вещества и т.п., в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток.
Из-за легкости их введения таблетки и капсулы представляют наиболее благоприятную оральную единичную дозированную форму, и в таком случае, очевидно, используют твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель, как правило, будет содержать стерильную воду, по меньшей мере, в большей части, хотя можно включать и другие ингредиенты, например, способствующие растворению. Можно получить, например, растворы для инъекций, в которых носитель содержит физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и раствора глюкозы. Также можно получить суспензии для инъекций, и в таком случае можно использовать соответствующие жидкие носители, суспендирующие вещества и т.п. В композициях, подходящих для чрескожного введения, носитель необязательно содержит вещество, усиливающие проникание, и/или подходящее смачивающее вещество, необязательно, в сочетании с небольшими количествами подходящих добавок любой природы, которые не оказывают существенного раздражающего действия на кожу. Указанные добавки могут облегчить нанесение на кожу и/или могут быть полезными при получении нужных композиций. Такие композиции можно вводить разными способами, например в виде трансдермального пластыря, в виде капли или в виде мази.
Особенно выгодно получать указанные выше фармацевтические композиции в единичной дозированной форме для облегчения введения и равномерности дозировки. Используемый в данном описании и в формуле изобретения термин "единичная дозированная форма" относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок, причем каждая единица содержит предварительно установленное количество активного ингредиента, рассчитанное на получение нужного лечебного действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных дозированных форм являются таблетки (в том числе таблетки с насечками или с покрытием), капсулы, пилюли, порошки в пакетиках, облатки, растворы или суспензии для инъекций, чайные ложки, столовые ложки и т.п. и множество таких разделенных дозированных форм.
Специалисты в данной области техники легко могут определить эффективное количество из результатов испытаний, представленных далее. Вообще, предполагается, что терапевтически эффективное количество будет составлять от 0,05 до 100 мг на кг веса тела, и в частности от 0,05 до 10 мг на кг веса тела. Может оказаться подходящим введение требуемой дозы в виде двух, трех, четырех или большего числа субдоз через соответствующие интервалы в течение суток. Указанная субдоза может быть составлена в виде единичных дозированных форм, например, содержащих 5-500 мг, и в частности 10-500 мг, активного ингредиента на единичную дозированную форму.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к сочетанию ингибитора HDAC с другим противораковым средством, в особенности для применения в качестве лекарственного средства, конкретнее, при лечении рака или родственных заболеваний.
Для лечения вышеуказанных состояний соединения изобретения можно выгодно использовать в сочетании с одним или несколькими другими лекарственными средствами, в частности с другими противораковыми средствами. Примерами противораковых средств являются
координационные соединения платины, например цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин;
таксановые соединения, например паклитаксел или доцетаксел;
ингибиторы топоизомеразы I, такие как соединения камптотецина, например иринотекан или топотекан; ингибиторы топоизомеразы II, такие как противоопухолевые производные подофиллотоксина, например этопозид или тенипозид;
противоопухолевые алкалоиды растения барвинок, например винбластин, винкристин или винорелбин;
- 8 -
008245
противоопухолевые производные нуклеозидов, например 5-флуороурацил, гемцитабин или капецитабин;
алкилирующие агенты, такие как горчичный газ или нитрозомочевина, например циклофосфамид, хлорамбуцил, кармустин или ломустин;
противоопухолевые производные антрациклинов, например даунорубицин, доксорубицин, идару-бицин или митоксантрон;
антитела к HER 2, например Trastuzumab;
антагонисты эстрогеновых рецепторов или селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, например тамоксифен, торемифен, дролоксифен, фаслодекс или ралоксифен;
ингибиторы ароматазы, такие как экземестан, анастрозол, летразол и ворозол;
дифференцирующие агенты, такие как ретиноиды, витамин D и блокаторы метаболизма ретиноевой кислоты (RAMBA), например аккутан;
ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, например азацитидин;
ингибиторы киназ, например флавоперидол, иматинибмезилат или гефитиниб;
ингибиторы фарнезилтрансферазы или
другие ингибиторы HDAC.
Термин "координационное соединение платины", используемый в данном описании, обозначает любое координационное соединение платины, ингибирующее рост опухолевых клеток, в котором платина предоставлена в форме иона.
Термин "таксановые соединения" обозначает класс соединений с таксановой циклической системой, родственные или полученные из экстрактов некоторых видов деревьев тиса (Taxus).
Термин "ингибиторы топоизомеразы" используется для обозначения ферментов, способных изменять топологию ДНК в эукариотических клетках. Они являются критическим фактором для важных клеточных функций и клеточной пролиферации. Существует два класса топоизомераз в эукариотических клетках, а именно типа I и типа II. Топоизомераза I представляет собой мономерный фермент с молекулярной массой приблизительно 100000. Фермент связывается с ДНК и вводит временный однонитевой разрыв, раскручивает двойную спираль (или создает возможность для ее раскручивания) и затем закрывает разрыв перед диссоциацией от цепи ДНК. Топоизомераза II имеет подобный механизм действия, который включает индукцию разрывов в цепи ДНК или образование свободных радикалов.
Термин "соединения камптотецина" используется для обозначения соединений, родственных или образованных от исходного камптотецина, представляющего собой нерастворимый в воде алкалоид, полученный из дерева Chinese Camptothecin acuminata и дерева Indian Nothapodytes foetida.
Термин "подофиллотоксины" используется для обозначения соединений, родственных или полученных из исходного подофиллотоксина, экстрагированного из растения мандрагоры.
Термин "противоопухолевые алкалоиды растения барвинок" используется для обозначения соединений, родственных или полученных из экстрактов растения барвинок (Vinca rosea).
Термин "алкилирующие агенты" охватывает группу разных химических веществ, общим свойством которых является способность, в физиологических условиях, отдавать алкильные группы биологически жизнеспособным макромолекулам, таким как ДНК. С помощью большинства более важных агентов, таких как горчичные газы и нитрозомочевины, активные алкилирующие группы генерируются in vivo после сложных реакций деградации, из которых некоторые являются ферментативными. Наиболее важными фармакологическими действиями алкилирующих агентов являются действия, которые нарушают фундаментальные механизмы, касающиеся пролиферации клеток, в частности синтез ДНК и деление клеток. Способность алкилирующих агентов влиять на функцию и целостность ДНК в быстро пролифирирующих тканях создает основу для их терапевтических применений и, во многих случаях, для их токсических свойств.
Термин "противоопухолевые производные антрациклинов" включает антибиотики, полученные из гриба Strep. peuticus var. caesius, и их производные, характеризующиеся наличием тетрациклиновой циклической структуры с необычным сахаром даунозамином, присоединенным гликозидной связью.
Показано, что амплификация белка рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER 2) при первичных карциномах молочной железы коррелирует с плохим клиническим прогнозом для некоторых пациентов. Trastuzumab представляет собой полученное методом рекомбинантных ДНК гуманизированное моноклональное антитело IgG1-каппа высокой степени чистоты, которые с высокой аффинностью и специфичностью связываются с внеклеточным доменом рецептора HER 2.
Многие злокачественные опухоли молочной железы имеют эстрогенные рецепторы, и рост таких опухолей можно стимулировать эстрогеном. Термины "антагонисты эстрогеновых рецепторов" и "селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов" используются для обозначения конкурентных ингибиторов связывания эстрадиола с эстрогеновым рецептором (ER). Селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, когда связываются с ER, индуцируют изменение в трехмерной структуре рецептора, инги-бируя его связывание с реагирующим на эстроген элементом (ERE) в ДНК.
У женщин в период после менопаузы основным источником циркулирующего эстрогена является конверсия андрогенов надпочечников и яичников (андростендиона и тестостерона) в эстрогены (эстрон и эстрадиол) ферментом ароматазой в периферических тканях. Депривация эстрогена через ингибирование или инактивацию ароматазы является эффективным и избирательным лечением для некоторых пациен
- 9 -
008245
ток с гормонзависимым раком молочной железы в период после менопаузы.
Термин "антиэстроген" используется в данном описании не только для антагонистов эстрогеновых рецепторов и селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов, но также для ингибиторов ароматазы, описанных выше.
Термин "дифференцирующие агенты" охватывает соединения, которые могут, различными путями, ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать дифференцировку. Известно, что витамин D и ре-тиноиды играют главную роль в регуляции роста и дифференцировке широкого ряда типов здоровых и злокачественных клеток. Блокаторы метаболизма ретиноевой кислоты (RAMBA) повышают уровни эндогенных ретиноевых кислот путем ингибирования опосредуемого цитохромом Р450 катаболизма рети-ноевых кислот.
Изменения метилирования ДНК находятся в числе наиболее обычных аномалий при неоплазии человека. Гиперметилирование в промоторах селективных генов, как правило, ассоциируется с инактивацией вовлеченных генов. Термин "ингибиторы ДНК-метилтрансферазы" используется для обозначения соединений, которые действуют через фармакологическое ингибирование ДНК-метилтрансферазы и реактивацию экспрессии гена супрессора опухоли.
Термин "ингибиторы киназ" включает сильные ингибиторы киназ, вовлеченных в развитие клеточного цикла и запрограммированную гибель клеток (апоптоз).
Термин "ингибиторы фарнезилтрансферазы" используется для обозначения соединений, сконструированных для предупреждения фарнезилирования Ras и других внутриклеточных белков. Показано, что они действуют на пролиферацию и выживаемость злокачественных клеток.
Термин "другие ингибиторы HDAC" включает
короткоцепные жирные кислоты, например бутират, 4-фенилбутират или вальпроевую кислоту;
гидроксамовые кислоты, например субероиланилидгидроксамовую кислоту (SAHA), биарилгидрок-самат А-161906, бициклические арил^-гидроксикарбоксамиды, пироксамид, CG-1521, PXD-101, суль-фонамидгидроксамовую кислоту LAQ-824, трихостатин A (TSA), оксамфлатин, скриптаид, м-карбокси-циннамовую кислоту, бисгидроксамовую кислоту или аналог трапоксингидроксамовой кислоты;
циклические тетрапептиды, например трапоксин, апидицин или депсипептид;
бензамиды, например MS-275 или CI-994; или
депудицен;
и другие вещества.
Для лечения рака соединения по настоящему изобретению можно вводить пациенту так, как описано выше, в сочетании с облучением. Облучение означает обработку ионизирующим излучением, и в частности гамма-излучением, в особенности испускаемым линейными ускорителями или радионуклеида-ми, которые обычно применяют в настоящее время. Облучение опухоли радионуклеидами может быть наружным или внутренним.
Настоящее изобретение также относится к сочетанию по изобретению противоракового средства и ингибитора HDAC по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к сочетанию по изобретению для применения в лекарственной терапии, например для ингибирования роста опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к сочетаниям по изобретению для ингибирования роста опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток у человека, включающему введение субъекту эффективного количества сочетания по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования аномального роста клеток, в том числе трансформированных клеток, путем введения эффективного количества сочетания по изобретению.
Другое лекарственное средство и ингибитор HDAC можно вводить одновременно (например, в отдельных или в единых композициях) или последовательно в любом порядке. В последнем случае два соединения будут вводиться в течение периода - в количестве и способом, которые достаточны для того, чтобы иметь уверенность, что достигается благоприятный или синергический эффект. Следует иметь в виду, что предпочтительный способ и порядок введения и соответствующие дозировочные количества и режимы для каждого компонента сочетания будут зависеть от конкретных вводимых другого лекарственного средства и ингибитора HDAC, способа их введения, конкретной опухоли, которую лечат, и конкретного хозяина, которого лечат. Оптимальный способ и порядок введения и соответствующие дозировочные количества и режим могут легко определить специалисты в данной области техники с использованием обычных методов и с учетом изложенной в данном описании информации.
Координационное соединение платины выгодно вводить в дозировке 1-500 мг на кв.м (мг/м2) площади поверхности тела, например 50-400 мг/м2, в частности в случае цисплатина в дозировке примерно 75 мг/м2 и в случае карбоплатина примерно 300 мг/м2, на курс лечения.
Таксановое соединение выгодно вводить в дозировке 50-400 мг/м2 площади поверхности тела, например 75-250 мг/м2, в частности в случае паклитаксела в дозировке примерно 175-250 мг/м2 и в случае доцетаксела примерно 75-150 мг/м2, на курс лечения.
Камптотециновое соединение выгодно вводить в дозировке 0,1-400 мг/м2 площади поверхности те
- 10 -
008245
ла, например 1-300 мг/м2, в частности в случае иринотекана в дозировке примерно 100-350 мг/м2 и в случае топотекана примерно 1-2 мг/м2, на курс лечения.
Противоопухолевое производное подофиллотоксина выгодно вводить в дозировке 30-300 мг/м2 площади поверхности тела, например 50-250 мг/м2, в частности в случае этопозида в дозировке примерно 35-100 мг/м2 и в случае тенипозида примерно 50-250 мг/м2, на курс лечения.
Противоопухолевый алкалоид растения барвинок выгодно вводить в дозировке 2-30 мг/м2 площади поверхности тела, в частности в случае винбластина в дозировке примерно 3-12 мг/м2, в случае винкри-стина в дозировке примерно 1-2 мг/м2 и в случае винорелбина в дозировке примерно 10-30 мг/м2, на курс лечения.
Противоопухолевое нуклеозидное производное выгодно вводить в дозе 200-2500 мг/м2 площади поверхности тела, например 700-1500 мг/м2, в частности в случае 5-FU в дозировке 200-500 мг/м2, в случае гемцитабина в дозировке примерно 800-1200 мг/м2 и в случае капецитабина примерно 1000-2500 мг/м2, на курс лечения.
Алкилирующие вещества, такие как горчичный газ или нитрозомочевина, выгодно вводить в дозировке 100-500 мг/м2 площади поверхности тела, например 120-200 мг/м2, в частности в случае циклофос-фамида в дозировке примерно 100-500 мг/м2, в случае хлорамбуцила в дозировке примерно 0,1-0,2 мг/кг, в случае кармустина в дозировке примерно 150-200 мг/м2 и в случае ломустина в дозировке примерно 100-150 мг/м2, на курс лечения.
Противоопухолевое производное антрациклина выгодно вводить в дозировке 10-75 мг/м2 площади поверхности тела, например 15-60 мг/м2, в частности в случае доксорубицина в дозировке примерно 4075 мг/м2, в случае даунорубицина в дозировке примерно 25-45 мг/м2 и в случае идарубицина в дозировке примерно 10-15 мг/м2, на курс лечения.
Trastuzumab выгодно вводить в дозировке 1-5 мг/м2 площади поверхности тела, в частности 2-4 мг/м2, на курс лечения.
Антиэстрогенное средство выгодно вводить в дозировке примерно 1-100 мг ежесуточно, в зависимости от конкретного средства и состояния, которое лечат. Тамоксифен выгодно вводить перорально в дозировке 5-50 мг, предпочтительно 10-20 мг, дважды в сутки, при продолжении терапии в течение времени, достаточного для достижения и поддержания лечебного эффекта. Торемифен выгодно вводить перорально в дозировке примерно 60 мг 1 раз в сутки при продолжении терапии в течение времени, достаточного для достижения и поддержания лечебного эффекта. Анастрозол выгодно вводить перорально в дозировке примерно 1 мг 1 раз в сутки. Дролоксифен выгодно вводить перорально в дозировке примерно 20-100 мг 1 раз в сутки. Ралоксифен выгодно вводить перорально в дозировке примерно 60 мг 1 раз в сутки. Экземестан выгодно вводить перорально в дозировке примерно 25 мг 1 раз в сутки.
Указанные дозировки можно вводить, например, 1 раз, дважды или большее число раз на курс лечения, который может повторяться примерно каждые 7, 14, 21 или 28 дней.
С учетом их полезных фармакологических свойств, компоненты сочетаний по изобретению, т.е. другое лекарственное средство и ингибитор HDAC, можно ввести в разные фармацевтические формы для целей введения. Компоненты можно включить по отдельности в отдельные фармацевтические композиции или в единую фармацевтическую композицию, содержащую оба компонента.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей другое лекарственное средство и ингибитор HDAC вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями.
Настоящее изобретение также относится к сочетанию по изобретению в форме фармацевтической композиции, содержащей противораковое средство и ингибитор HDAC по изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями.
Настоящее изобретение также относится к применению сочетания по изобретению для получения фармацевтической композиции для ингибирования роста опухолевых клеток.
Настоящее изобретение также относится к продукту, содержащему в качестве первого активного ингредиента ингибитор HDAC по изобретению и в качестве второго активного ингредиента противораковое средство, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении пациентов, страдающих от рака.
Экспериментальная часть
Далее приводятся примеры в целях иллюстрации.
"BSA" означает бычий сывороточный альбумин, "DCM" означает дихлорметан, "DIEA" означает диизо-пропилэтиламин, "ДМФА" означает диметилформамид, "ДМСО" означает диметилсульфоксид, "EtOAc" означает этилацетат, "Fmoc" означает флуоренилметоксикарбонил, "Hepes" означает 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота, "НОВТ" означает 1-гидрокси-1Н-бензотриазол, "МеОН" означает метанол, "РуВор" означает гесафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидинофосфония, "РуВгОР" означает гесафторфосфат бром-трис-пирролидинофосфония, "TEA" означает триэтиламин, "ТФК" означает трифторуксусная кислота, "ТГФ" означает тетрагидрофуран, Extrelut(tm) представляет собой продукт Merck KgaA, Darmstadt, Германия, и представляет собой короткую колонку, содержащую диатомовую землю.
- 11 -
008245
А. Получение промежуточных соединений. Пример А1. а) Получение
промежуточное соединение 1
Раствор 1-(фенилметил)пиперазина (0,068 моль) в ацетонитриле, чда (135 мл), постепенно добавляли к раствору карбоната калия (0,18 моль) и этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидин-карбоновой кислоты (0,082 моль) в ацетонитриле, чда (135 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь оставляли на ночь. Добавляли DCM (400 мл). Добавляли воду (300 мл), и органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали, и выпаривали растворитель. Остаток (28 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент DCM/MeOH, 95/5). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Остаток кристаллизовали из ацетонитрила, отфильтровывали и сушили в вакууме и получали 15,1 г промежуточного соединения 1.
Ь) Получение
промежуточное соединение 2
Смесь промежуточного соединения 1 (0,03 моль) и EtOH (250 мл) гидрировали при 50°С с Pd/C, 10% (2 г), в качестве катализатора. После поглощения Н2 (1 экв.) катализатор отфильтровывали и фильтрат упаривали. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент DCM/(MeOH/NH3), 90/10). Фракции продукта собирали, выпаривали растворитель и получали 6,8 г (> 96%) промежуточного соединения 2.
с) Получение
"Л0"|
^---N^jpN^
промежуточное соединение 3
Раствор диметилсульфамоилхлорида (0,0015 моль) в DCM (1 мл) при 5°С в токе N2 добавляли к смеси промежуточного соединения 2 (0,0012 моль) и TEA (0,0017 моль) в DCM (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Добавляли 10% раствор карбоната калия. Смесь экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель досуха. Остаток (0,69 г) растворяли в диэтиловом эфире. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,64 г (73%) промежуточного соединения 3, температура плавления 193°С.
Пример А2. Получение
промежуточное соединение 4
Раствор этилового эфира 2-(метилсульфонил)-5-пиримидинкарбоновой кислоты (0,0434 моль) в ацетонитриле (100 мл) добавляли по каплям при 10°С в токе N2 к раствору 4-пиперидинметанамина (0,0868 моль) и карбоната калия (0,0434 моль) в ацетонитриле (200 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток (14,18 г) очищали колоночной хроматографией на силикагеле (20-45 мкм) (элюент DCM/MeOH/NH4OH, от 90/10/1 до 80/20/2). Чистые фракции собирали, выпаривали растворитель и получали 3,7 г (32%) промежуточного соединения 4.
- 12 -
008245
Пример A3. а) Получение
промежуточное соединение 5
Смесь промежуточного соединения 2 (0,0002 моль), а-фенилбензолацетилхлорида (0,0003 моль) и поглотителя морфолинометил-PS (поставщик Novabiochem, кат. № 01-64-0171: морфолинометилполи-стирол HL (200-400 меш), 2% дивинилбензола) (0,150 г) в DCM (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч, затем добавляли поглотитель трис-^-аминоэтш^амин^^ (поставщик Novabiochem, кат. № 01-64-0170: трис-(2-аминометил)аминополистирол HL (200-400 меш), 1% дивинил-бензола) (0,150 г) и реакционную смесь перемешивали еще в течение 4 ч. Поглотители отфильтровывали, промывали DCM, и выпаривали растворитель, и получали промежуточное соединение 5.
Ь) Получение
промежуточное соединение 6
Смесь промежуточного соединения 5 (0,0003 моль) с 1 н. раствором гидроксида натрия (1,5 мл), ТГФ (4 мл) и МеОН (1 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 суток и затем реакционную смесь нейтрализовали НО (1,5 мл, 1 н.). Смесь фильтровали через Extrelut(tm) NT (поставщик Merck) и сушили в токе N2 и получали промежуточное соединение 6.
с) Получение
промежуточное соединение 7
Смесь промежуточного соединения 6 (0,0003 моль), поглотителя НОВТ-6-карбоксамидометил-PS (0,200 г; Novabiochem, кат. № 01-64-0425) и ^№диметил-4-пиридинамина (0,00015 моль) в DCM/ДМФА (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем добавляли ^№-метан-тетраилбис-2-пропанамин (0,070 мл) и реакционную смесь встряхивали в течение 4 ч. Смолу промывали
3 раза DCM, 3 раза ДМФА, и снова 3 раза DCM и 3 раза ДМФА, и окончательно 6 раз DCM. Добавляли раствор О-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)гидроксиламина (0,00026 моль) в DCM (5 мл) и реакционную смесь встряхивали в течение 20 ч, затем добавляли присоединенный к PS метилизоцианат (поставщик Novabiochem, кат. № 01-64-0289: метилизотиоцианатполистирол HL (200-400 меш), 2% дивинилбензола) (0,150 г) и смесь встряхивали в течение 4 ч. Поглотители отфильтровывали, промывали 2 раза DCM, и использовали фильтрат, и получали промежуточное соединение 7.
В. Получение конечных соединений. Пример В1.
Из N-Fmoc-гидpoкcилaмин-2-xлopтpитилoвoй смолы (Novabiochem, кат. № 01-64-0165) удаляли защитную группу 50% раствором пиперидина в ДМФА (RT, 24 ч). Смолу промывали несколько раз DCM и ДМФА и замачивали в ДМФА. Добавляли в один прием 2 экв. кислоты1 РуВгОР и 4 экв. DIEA. Смесь встряхивали в течение 24 ч, жидкость сливали и смолу промывали несколько раз DCM и ДМФА. Смолу замачивали в ДМФА, содержащем 2 экв. амина, встряхивали в течение 24 ч при комнатной температуре (RT), жидкость сливали и смолу промывали DCM и ДМФА. К смоле, разбухшей в ДМФА с добавлением
4 экв. TEA, добавляли в один прием арилсульфонилхлорид (2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в
- 13 -
008245
течение ночи, сливали жидкость и смолу промывали DCM и ДМФА. Конечный продукт отщепляли 5% ТФК в DCM, анализировали методом ВЭЖХ и МС и упаривали в предварительно взвешенных пробирках. 1В расчете на загрузку смолы.
В целях пояснения далее приводится схема.
Пример В2.
Из К-Ршос-гидроксиламин-2-хлортритиловой смолы (Novabiochem, кат. № 01-64-0165) удаляли защитную группу 50% раствором пиперидина в ДМФА (RT, 24 ч)1. Смолу промывали2 несколько раз DCM и ДМФА и замачивали в ДМФА. Добавляли в один прием 2 экв. кислоты3 РуВЮР4 и 4 экв. DIEA. Смесь встряхивали в течение 24 ч, жидкость сливали и смолу промывали несколько раз DCM и ДМФА. Смолу замачивали в ДМФА, содержащем 2 экв. амина, встряхивали в течение 24 ч при RT, жидкость сливали и смолу промывали DCM и ДМФА. Конечный продукт отщепляли 5% ТФК в DCM, анализировали методом ВЭЖХ и МС и упаривали в предварительно взвешенных пробирках.
Пример В3.
Из N-Fmос-гидроксиламин-2-хлортритиловой смолы (Novabiochem, кат. № 01-64-0165) удаляли защитную группу 50% раствором пиперидина в ДМФА (RT, 24 ч)1. Смолу промывали2 несколько раз DCM и ДМФА и замачивали в ДМФА. Добавляли в один прием 2 экв. кислоты3 РуВЮР4 и 4 экв. DIEA. Смесь встряхивали в течение 24 ч, жидкость сливали и смолу промывали несколько раз DCM и ДМФА. Смолу замачивали в ДМФА, содержащем 2 экв. амина, встряхивали в течение 24 ч при RT, жидкость сливали и смолу промывали DCM и ДМФА. 3 экв. кислоты, DIC и DIEA встряхивали со смолой в течение ночи при RT. Жидкость сливали и смолу промывали DCM и ДМФА. Конечный продукт отщепляли 5% ТФК в DCM, анализировали методом ВЭЖХ и МС и упаривали в предварительно взвешенных пробирках.
1B одном примере использовали соединение 1-карбоксиметантиол-4-метокситритиловую смолу (Novabiochem, кат. № 01-64-0238).
2В одном случае в разных процедурах промывки соединения 1 также использовали МеОН.
3В расчете на загрузку смолы.
4В одном случае РуВЮР заменяли РуВОР - соединением 1.
Пример В4. а) Получение
натриевая соль, промежуточное соединение 8
Смесь промежуточного соединения 3 (0,0016 моль) и гидроксида натрия (0,0033 моль) в EtOH (6 мл) перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч и затем охлаждали до комнатной температуры. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, промывали EtOH и сушили и получали
- 14 -
008245
0,59 г (> 100%) промежуточного соединения 8.Na. b) Получение
промежуточное соединение 9
В токе N2 к смеси промежуточного соединения 8.Na (0,0016 моль), О-(тетрагидро-2Н-пиран-2-ил) гидроксиламина (0,0021 моль) и 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (0,0021 моль) в DCM/ТГФ (10 мл) добавляли порциями моногидрохлорид N'-(этилкарбонимидоил)-N,N-диметил-1,3-пропандиамина (0,0021 моль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение уикенда. Добавляли 10% раствор карбоната калия. Смесь экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSO4), фильтровали и выпаривали растворитель досуха. Остаток (0,94 г) очищали колоночной хроматографией на кромасиле (элю-ент DCM/MeOH/NH4OH, 97/3/0,1; 15-40 мкм). Чистые фракции собирали и выпаривали растворитель. Остаток (0,45 г, 65%) растворяли в диэтиловом эфире. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,422 г (61%) промежуточного соединения 9, температура плавления 183°С.
с) Получение
соединение 2
К смеси промежуточного соединения 9 (0,0009 моль) и МеОН (10 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали, промывали DCM и сушили и получали 0,176 г (59%) соединения 2, температура плавления > 260°С.
Пример В5. Получение
промежуточное соединение 10
Смесь промежуточного соединения 2 (0,0019 моль) и сульфамида (0,0021 моль) в 1,2-диметокси-этане (5 мл) перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение 4 суток. Добавляли воду. Смесь фильтровали, вещество на фильтре сушили и получали 0,51 г (83%) промежуточного соединения 10, температура плавления 192°С.
Промежуточное соединение 10 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В4], и получали 0,034 г (13%) соединения 3, температура плавления 212°С.
соединение 3
Пример В6. Получение
- 15 -
008245
промежуточное соединение 11
Раствор диметилсульфамоилхлорида (0,007 моль) в DCM (5 мл) при 10°С в токе N2 добавляли к раствору промежуточного соединения 4 (0,0057 моль) и TEA (0,0085 моль) в DCM (5 мл). Смесь перемешивали в течение ночи, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSC^), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток кристаллизовали из смеси СНзСМдиэтиловый эфир. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,492 г (24%) промежуточного соединения 11, температура плавления 142°С.
Промежуточное соединение 11 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В4], и получали 0,7 г (85%) соединения 4, температура плавления 182°С.
соединение 4
Пример В7. Получение
[ N N
соединение 5
Смесь промежуточного соединения 7 (0,0003 моль) с уксусной кислотой и трифторуксусной кислотой (5 мл, 5% в МеОН) перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч, затем реакционную смесь продували до сухого состояния и получали соединение 5.
Пример В8. Получение
ONNJJOO
промежуточное соединение 12
Смесь промежуточного соединения 2 (0,0025 моль), 2-нафталинкарбонилхлорида (0,003 моль) и карбоната калия (0,005 моль) в ацетонитриле (20 мл) перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение ночи, затем охлаждали до комнатной температуры, выливали в смесь воды со льдом и экстрагировали DCM. Органический слой отделяли, сушили (MgSC4), фильтровали и выпаривали растворитель. Остаток кристаллизовали из диэтилового эфира. Выпавшее в осадок вещество отфильтровывали и сушили и получали 0,97 г (100%) промежуточного соединения 12, температура плавления 140°С.
Промежуточное соединение 12 обрабатывали аналогично способу, описанному в примере [В4], и получали 0,338 г (86%) соединения 6, температура плавления 130°С.
- 16 -
008245
соединение 6
В табл. F-1 приводится перечень соединений, полученных согласно одному из примеров, приведенных выше. В таблицах используются следующие аббревиатуры: соед. № означает № соединения, пр. [В №] относится к такому же способу, какой описан в примерах В №, C2HF3O2 указывается в случае соли трифторуксусной кислоты. Некоторые соединения характеризуются температурой плавления (т.пл.), другие соединения характеризуются масс-спектральными данными [МН] (мс).
Таблица F-1
"r"*VNY^SH
"о '
C2HF302'(1:1), Соед.№ 1; Пр.[В2]
Соед.№ 2: По.ГВ41: т.пл > 260 °С
Соед.№ 3; Пр.[В51; т.пл212 °С
Соед.№ 4; Пр.[В61; т.пл. 182 °С
v • О
v _Р
.C2HF3O2 (1г2), Соед.№ 7; Пр.[В2]; Мс 412
.C2HF302 (1:2), Соед.№ 8; Пр.[В2]; мс 383
- 17 -
008245
.C2HF3O2 (1:2), Соед.№ 9; Пр.[В2]; мс. 383
.C2HF3O2 (1:1), Соед.№ 10; Пр.[В2]; мс. 361
xfcp
но-ж ^-^~ ^-/ ~Сн
.C2HF302 (1:1), Соед.№ 11; Пр.[В2]"; мс. 314
.C2HF302 (1:1), Соед.№ 12; Пр.[ВЗ]; мс. 366
Н°> 1Н
.C2HF302 (1:1), Соед.№ 13; Пр.[В2]; мс. 314
.C2HF302 (1:1), Соед.№ 14; Пр.[В2]; мс. 412
C2HF302 (1:2). Соед.№ 15; Пр.[В2]; мс. 281
C2HF302 (1:2), Соед.№ 16; Пр.[В2]; мс. 365
C2HF3O2 (1:2),Соед.№ 17; Пр.[В2]; мс. 295
Соед.№18;Пр.[В1];мс. 398
Соед.№ 19; Пр TBI]; мс. 328
Соед.№20;Пр.ГВ1];мс. 300
Соед.№ 21; Пр.[В1]; мс.329
Соед.№22; Пр.[В1]; мс. 354
- 18 -
008245
CyN^J
СТО
Соед.№ 5; Пр. [В7]; мс. 418
Соед.№ 6; Пр.ГВ8];т.пл. 130 °С
Соед.№ 23, Пр.|Б71. мс 348
Соед.№ 24; Пр.[В7]; мс. 378
Os^N---J
Соед.№ 25; Пр.[В7]; мс. 329
Соед.№ 26; Пр,[В7]; мс. 402
Соед.№ 27; Пр.[В7]; мс. 329
С. Фармакологический пример.
С помощью анализа in vitro на ингибирование гистондеацетилазы (см. пример С.1) измеряют инги-бирование ферментативной активности HDAC, полученное с соединениями формулы (I).
Клеточную активность соединений формулы (I) определяли на клетках опухоли А2780 с использованием колориметрического анализа на клеточную токсичность или выживание (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods, 65:55-63, 1983) (см. пример С.2).
Кинетическая растворимость в водных средах определяет способность соединения оставаться в водном растворе после разведения (см. пример С.3).
Исходные растворы в ДМСО разводят одним водным растворителем-буфером в 3 последовательные стадии. Для каждого разведения измеряют мутность нефелометром.
Проникающая способность лекарственного средства выражает его способность перемещаться из одной среды в другую или через нее. Конкретно, это его способность перемещаться через кишечную оболочку в кровоток и/или из кровотока в мишень. Проникающую способность (см. пример С.4) можно измерить через образование фосфолипидного бислоя искусственной мембраны, иммобилизованной на фильтре. В анализе с искусственной мембраной, иммобилизованной на фильтре, формируют "сэндвич" из 96-луночного титрационного микропланшета и 96-луночного фильтра-планшета, так что каждая составная лунка разделяется на две камеры с донорским раствором на дне и акцепторным раствором сверху, разделенными диском микрофильтра в 125 мкм (размер пор 0,45 мкм), с покрытием из 2% (мае/об.) раствора диолеоилфосфатидилхолина в додекане, в условиях, в которых внутри каналов фильтра образуются многослойные бислои, когда система контактирует с водным буферным раствором. Проникающая способность соединений через такую искусственную мембрану измеряют в см/с. Целью является проверка проникания лекарственных средств через параллельную искусственную мембрану при 2 разных рН: 4,0 и 7,4. Детекцию соединения осуществляют методом УФ-спектрометрии при оптимальной длине волны от 250 до 500 нм.
Метаболизм лекарственных средств означает, что жирорастворимое соединение - ксенобиотик или эндобиотик - ферментативно трансформируется в (а) полярный(е) водорастворимый(е) и экскретируе-мый(е) метаболит(ы). Основным органом для метаболизма лекарственных средств является печень. Продукты метаболизма часто менее активны, чем исходное лекарственное средство, или неактивны. Однако некоторые метаболиты могут обладать усиленной активностью или токсическим действием. Таким образом, метаболизм лекарственных средств может включать процессы как "детоксикации", так и "токсика-ции". Одну из главных ферментативных систем, определяющих способность организма обращаться с лекарственными средствами или химикатами, представляют цитохром-Р450-монооксигеназы, которые являются NADPH-зависимыми ферментами. Метаболическую устойчивость соединений можно опреде
- 19 -
008245
лить in vitro с использованием субклеточной ткани человека (см. пример С.5). В данном описании метаболическая устойчивость соединений выражается в % лекарственного средства, претерпевшего метаболизм после 15-минутной инкубации указанных соединений с микросомами. Количественно соединения определяют анализом методом ЖХ-МС.
Супрессор опухолей р53 транскрипционно активирует ряд генов, в том числе ген WAF1/CIP1, в ответ на повреждение ДНК. Продукт гена WAF1 в 21 кДа обнаружен в комплексе, включающем циклины, циклинзависимые киназы (CDK) и ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), в нормальных клетках, но не в трансформированных клетках, и, как оказалось, является универсальным ингибитором активности CDK. Одним из следствий связывания p21WAF1 с CDK и ингибирования CDK является предотвращение CDK-зависимого фосфорилирования и последующей инактивации белка Rb, который важен для развития клеточного цикла. Следовательно, индукция p21WAF1 в ответ на контакт клеток с ингибитором HDAC является сильным и специфическим индикатором ингибирования развития клеточного цикла в обеих контрольных точках G1 и G2.
Способность соединений индуцировать p21WAF1 измеряли с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа на p21WAF1 (WAF1 ELISA of Oncogene). Анализ на p21WAF1 является "сэндвич"-иммуноферментным анализом с использованием как мышиных моноклональных, так и кроличьих поли-клональных антител. Кроличьи поликлональные антитела, специфические для человеческого белка WAF1, иммобилизовали на поверхности пластиковых лунок, имеющихся в наборе. Любое количество p21WAF1, имеющееся в анализируемом образце, будет связываться с иммобилизованными антителами. Биотинилированные идентифицирующие моноклональные антитела также узнают человеческий белок p21WAF1 и будут связываться с любым p21WAF1, который удерживается иммобилизованными антителами.
Идентифицирующие антитела, в свою очередь, связываются стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой из хрена. Пероксидаза из хрена катализирует конверсию хромогенного субстрата тетраме-тилбензидина от бесцветного раствора до раствора синего цвета (или желтого после добавления стоп-реагента), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству белка p21WAF1, связанного с планшетом. Продукт цветной реакции определяют количественно с использованием спектрофотометра. Количество определяют, строя стандартную кривую с использованием известных концентраций p21WAF1 (предоставляемого в лиофилизованном виде) (см. пример С.6).
Пример С.1. Анализ in vitro на ингибирование гистондеацетилазы.
Экстракты ядер HeLa (поставщик Biomol) инкубировали при 60 мкг/мл с 2х10-8 М меченного радиоактивными изотопами пептидного субстрата. В качестве субстрата для измерения активности HDAC использовали синтетический пептид, т.е. аминокислоты 14-21 гистона Н4. Субстрат биотинилируют в №г[2-концевой части со спейсером - 6-аминогексановой кислотой, защищают в СООН-концевой части амидогруппой и специфически [3Н]-ацетилируют в лизине 16. Субстрат биотин-(6-аминогексановая)Огу-Ala-([3Н]-ацетил-Lуs-Аrg-Нis-Аrg-Lуs-Vаl-NH2) добавляли в буфер, содержащий 25 мМ Hepes, 1 М сахарозы, 0,1 мг/мл BSA и 0,01% Тритона Х-100, при рН 7,4. Через 30 мин реакцию деацетилирования обрывали, добавляя НС1 и уксусную кислоту (конечные концентрации 0,035 мМ и 3,8 мМ, соответственно). После остановки реакции свободный 3Н-ацетат экстрагировали этилацетатом. После перемешивания и центрифугирования определяли радиоактивность в аликвоте верхней (органической) фазы в счетчике 0-частиц.
Для каждого эксперимента проводили параллельно инкубацию контролей (содержащих экстракт ядер HeLa и ДМСО без соединения), "пустышек" (содержащих ДМСО, но без экстракта ядер HeLa и соединения) и образцов (содержащих соединение, растворенное в ДМСО, и экстракт ядер HeLa). В первом случае соединения испытывали в концентрации 10-5 М. Когда соединения демонстрируют активность при 10-5 М, строили кривую зависимости ответа от концентрации, где соединения испытывали в концентрациях от 10-5 до 10-12 М. В каждом испытании величину для пустышки вычитали из величин как для контроля, так и для образца. Контрольный образец представлял 100% деацетилирование субстрата. Для каждого образца радиоактивность выражали как процент от средней величины для контроля. В соответствующих случаях величины IC50 (концентрация лекарственного средства, необходимая для снижения количества метаболитов на 50% от контроля) вычисляли с использованием пробит-анализа для сортируемых данных. В данном случае действие испытываемых соединений выражают в виде рЮ50 (значение кологарифма величины ГС50). Все испытываемые соединения продемонстрировали ферментативную активность при испытываемой концентрации 10-5 М, и 21 соединение имели pIC50 > 5 (см. табл. F-2).
Пример С.2. Определение антипролиферативной активности на клетках А2780.
Все испытываемые соединения растворяли в ДМСО и затем получали разведения в культуральной среде. Конечные концентрации ДМСО в анализах на пролиферацию клеток никогда не превышали 0,1% (об./об.). Контрольные образцы содержали клетки А2780 и ДМСО без соединения, и пустышки содержали ДМСО, но без клеток. МТТ растворяли в PBS в концентрации 5 мг/мл. Получали глициновый буфер, содержащий 0,1 М глицина и 0,1 М NaCl, забуференный до рН 10,5 NaOH (1 н.) (все реагенты от Merck).
Клетки карциномы яичников человека А2780 (получены в дар от Dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cancer Centre, Pensilvania, USA]) культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл
- 20 -
008245
гентамицина и 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки обычным способом поддерживали в моно-слойных культурах при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2. Клетки пересевали 1 раз в неделю с использованием раствора трипсин/ЭДТК при отношении разделения 1:40. Все среды и добавки получали от Life Technologies. Клетки были свободны от загрязнения микоплазмами при определении с использованием набора Gen-Probe Mycoplasma Tissue Culture kit (поставщик BioMerieux).
Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты NUNC(tm) (поставщик Life Technologies) и оставляли прилипать к пластику на ночь. Используемая при высевании плотность клеток составляла 1500 клеток на лунку при общем объеме среды 200 мкл. После того как клетки прилипли к планшетам, среду заменили и добавляли лекарственные средства и/или растворители до конечного объема 200 мкл. После четырехсуточной инкубации среду заменяли 200 мкл свежей среды и анализировали плотность и жизнеспособность клеток с использованием анализа на основе МТТ. В каждую лунку добавляли 25 мкл раствора МТТ и затем клетки инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Затем среду осторожно отсасывали и синий продукт МТТ-формазан растворяли, добавляя 25 мкл глицинового буфера и затем 100 мкл ДМСО. Тестируемые микропланшеты встряхивали в течение 10 мин на планшетном шейкере и измеряли поглощение при 540 нм с использованием спектрофотометра для чтения 96-луночных планшетов Emax (поставщик Sopachem).
В рамках эксперимента результаты для каждого условия эксперимента являются средними результатами повторения в 3 лунках. Для целей начального скрининга соединения испытывали в одной установленной концентрации 10-6 М. В случае активных соединений эксперименты повторяли для построения полных кривых зависимости ответа от концентрации. Для каждого эксперимента параллельно проводили инкубацию контрольных образцов (не содержащих лекарственного средства) и пустышек (не содержащих ни клеток, ни лекарственного средства). Величину для пустышки вычитали из величин для всех контролей и образцов. Для каждого образца среднюю величину роста клеток (в единицах поглощения) выражали в виде процента от средней величины роста клеток для контроля. В соответствующем случае величины Ю50 (концентрация лекарственного средства, необходимая для снижения роста клеток на 50% от контроля) вычисляли с использованием пробит-анализа для сортируемых данных (Finnely D.J., Probit Analyses, 2nd Ed., Chapter 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge, 1962). В данном случае действие испытываемых соединений выражают в виде рЮ50 (значение кологарифма величины IC50). Большинство испытываемых соединений показывали клеточную активность при испытываемой концентрации 10-6 М, и 9 соединений имеют рЮ50 > 5 (см. табл. F-2).
Пример С.3. Кинетическая растворимость в водных средах.
На первой стадии разведения 10 мкл концентрированного исходного раствора активного соединения в ДМСО (5 мМ) добавляли к 100 мкл фосфатцитратного буфера, рН 7,4, и перемешивали. На второй стадии разведения аликвоту (20 мкл) раствора с первой стадии разведения также распределяли в 100 мкл фос-фатцитратного буфера, рН 7,4, и перемешивали. Наконец, на третьей стадии разведения образец (20 мкл) раствора со второй стадии разведения также разводили в 100 мкл фосфатцитратного буфера, рН 7,4, и перемешивали. Все разведения осуществляли в 96-луночных планшетах. Сразу же после последней стадии разведения с помощью нефелометра измеряли мутность трех полученных растворов с последовательных стадий разведения. Разведение повторяли трижды для каждого соединения для того, чтобы исключить случайные ошибки. На основании измерений мутности осуществляли разделение на 3 класса. Соединениям с высокой растворимостью ставили оценку 3, и для таких соединений раствор после первого разведения прозрачный. Соединения со средней растворимостью получали оценку 2. В случае таких соединений раствор после первого разведения непрозрачный, а после второго разведения прозрачный. Соединения с низкой растворимостью получали оценку 1, и в случае таких соединений раствор как после первого, так и после второго разведения непрозрачный. Измеряли растворимость 9 соединений. Из указанных соединений 7 продемонстрировали оценку 3, и 2 продемонстрировали оценку 1 (см. табл. F-2).
Пример С.4. Параллельный анализ проницаемости искусственной мембраны.
Исходные образцы (аликвоты в 10 мкл исходного 5 мМ раствора в 100% ДМСО) разводили в планшете с глубокими лунками или Pre-mix, содержащем 2 мл водной буферной системы, рН 4 или 7,4 (RSR4 System Solution Concentrate (pION)).
Перед добавлением образцов в планшет для сравнения в лунки добавляли по 150 мкл буфера и осуществляли контрольные измерения в УФ-свете. Затем буфер отбрасывали и использовали планшет как планшет для сравнения. Все измерения осуществляли в планшетах, устойчивых к УФ-излучению (поставщик Costar или Greiner).
После контрольного измерения планшета для сравнения в его лунки добавляли по 150 мкл разведенных образцов и по 200 мкл разведенных образцов добавляли в лунки донорского планшета 1. На акцепторный фильтр-планшет 1 (поставщик Millipore, тип MAIP N45) наносили 4 мкл раствора, образующего искусственную мембрану (1,2-диолеил-sn-глицер-3-фосфохолин в додекане, содержащем 0,1% 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола), и помещали поверх донорского планшета 1 для формирования "сэндвича". Сверху в лунки акцепторного планшета вносили буфер (200 мкл). Сэндвич накрывали крышкой и хранили в течение 18 ч при комнатной температуре в темноте.
Контрольные измерения акцепторного планшета 2 осуществляли, добавляя в лунки по 150 мкл бу
- 21 -
008245
фера, и затем проводили УФ-измерения. После контрольного измерения акцепторного планшета 2 буфер отбрасывали и 150 мкл акцепторного раствора переносили из акцепторного фильтр-планшета 1 в акцепторный планшет 2. Затем акцепторный фильтр-планшет 1 удаляли из "сэндвича". После контрольного измерения донорского планшета 2 (см. выше) 150 мкл донорского раствора переносили из донорского планшета 1 в донорский планшет 2. Снимали УФ-спектры донорского планшета 2, акцепторного планшета 2 и планшета для сравнения (с помощью SpectraMAX 190). Все спектры обрабатывали для вычисления проникающей способности с помощью программного обеспечения PSR4p Command Software. Измерения для всех соединений повторяли трижды. В качестве эталонов в каждом эксперименте использовали кар-бамазепин, гризеофулвин, ациклогуанизин, атенолол, фуросемид и хлоротиазид. Соединения распределяли на 3 категории как имеющие низкую проникающую способность (средний эффект <0,5х10-6 см/с; оценка 1), среднюю проникающую способность (1х10-6 см/с > средний эффект > 0,5х10-6 см/с; оценка 2) или высокую проникающую способность (> 0,5х10-6 см/с; оценка 3). Два соединения показывали оценку 1 при измерении при одном из рН.
Пример С.5. Метаболическая устойчивость.
Субклеточные препараты получали согласно Gorrod et al. (Xenobiotica, 5:453-462, 1975) путем разделения на центрифуге после механической гомогенизации ткани.
Ткань печени ополаскивали в охлажденном на льду буфере 0,1 М Трис-HCl (рН 7,4) для отмывания избытка крови. Затем ткань сушили, промокая, взвешивали и нарезали на крупные куски хирургическими ножницами. Куски ткани гомогенизировали в 3 объемах охлажденного на льду 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) с использованием или Potter-S (Braun, Италия), снабженного тефлоновым пестиком, или гомогенизатора Sorvall Omni-Max, в течение 7х10 с. В обоих случаях во время процесса гомогенизации сосуд держали во/на льду.
Гомогенаты ткани центрифугировали при 9000 х g в течение 20 мин при 4°С с использованием центрифуги Sorvall или ультрацентрифуги Beckman. Полученный супернатант хранили при -80°С и обозначали "S9".
Затем фракцию S9 можно центрифугировать далее при 100000 х g в течение 60 мин (4°С) с использованием ультрацентрифуги Beckman. Полученный супернатант осторожно отсасывали, делили на алик-воты и обозначали "цитозоль". Осадок ресуспендировали в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в конечном объеме 1 мл на 0,5 г массы исходной ткани и обозначали "микросомы".
Все субклеточные фракции делили на аликвоты, сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до применения.
Для испытываемых образцов смесь для инкубации содержала PBS (0,1 М), соединение (5 мкМ), микросомы (1 мг/мл) и NADPH-генерирующую систему (0,8 мМ глюкозо-6-фосфата, 0,8 мМ хлорида магния и 0,8 единиц глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы).
Контрольные образцы содержали те же вещества, но микросомы заменяли микросомами, инактиви-рованными нагреванием (10 мин при 95°С). Извлечение соединений в контрольных образцах всегда составляло 100%.
Смеси предварительно инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Реакцию начинали в момент времени ноль (t=0), добавляя 0,8 мМ NADP, и образцы инкубировали в течение 15 мин (t=15). Реакцию обрывали, добавляя 2 объема ДМСО. Затем образцы центрифугировали в течение 10 мин при 900 х g, и супернатанты хранили до анализа при комнатной температуре не более 24 ч. Все инкубации повторяли дважды. Анализ супернатантов осуществляли методом ЖХ-МС. Элюирование осуществляли на Xterra MS C18 (50х4,6 мм, 5 мкм, Waters, США). Использовали систему ВЭЖХ Alliance 2790 (поставщик Waters, США). Элюировали буфером А (25 мМ ацетата аммония (рН 5,2) в смеси Н20/ацетонитрил (95/5)), причем растворителем В являлся ацетонитрил и растворителем С метанол, при скорости потока 2,4 мл/мин. Использовали градиент - возрастание концентрации органической фазы от 0% через 50% В и 50% С за 5 мин до 100% В за 1 мин при линейном изменении - и концентрацию органической фазы поддерживали постоянной еще в течение 1,5 мин. Общий объем загрузки образцов составлял 25 мкл.
В качестве детектора использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр Quattro (поставщик Micromass, Manchester, UK), снабженный источником ESI. Температуру источника и десольватации устанавливали в 120 и 350°С, соответственно, и использовали азот в качестве распыляющего и осушающего газа. Данные получали в положительном режиме (реакция одного иона). Пик напряжения устанавливали в 10 В, и время пребывания составляло 1 с.
Метаболическую устойчивость выражали в % метаболизма соединения после 15-минутной инкубации в присутствии активных микросом (Е(акт)) (% метаболизма = 100% -
Полный ионный ток (TIC) Е(акт) при t=15
((------------------------------------------------} х 100)
TIC Е(акт) при t=0
Соединения, имеющие процент метаболизма менее 20%, определяли как высокоустойчивые к метаболизму. Соединения, претерпевающие метаболизм на уровне от 20 до 70%, определяли как промежу
- 22 -
008245
точно устойчивые и соединения, демонстрирующие процент метаболизма свыше 70, определяли как слабоустойчивые к метаболизму. Когда бы ни осуществлялась проверка на метаболическую устойчивость, всегда включали три эталонных соединения. Верапамил включали в качестве соединения с низкой метаболической устойчивостью (% метаболизма 73%). Цизаприд включали как соединение со средней метаболической устойчивостью (% метаболизма 45%) и пропанол включали как соединение с метаболической устойчивостью от промежуточной до высокой (25% метаболизма). Указанные эталонные соединения использовали для проверки достоверности анализа на метаболическую устойчивость.
Испытывали одно соединение, и оно показывало процент метаболизма менее 20%.
Пример С.6. Индуцирующая способность в отношении р21.
Для определения уровня экспрессии белка р21 в клетках карциномы яичников человека А2780 применяли следующий протокол. Клетки А2780 (20000 клеток/180 мкл) высевали в 96-луночные планшеты в среде RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10% фетальной телячьей сыворотки. За 24 ч до лизиса клеток добавляли соединения в конечных концентрациях 10-5, 10-6, 10-7 и 10-8 М. Все испытываемые соединения растворяли в ДМСО и затем осуществляли разведения в культуральной среде. Через 24 ч после добавления соединений супернатанты удаляли из клеток. Клетки промывали 200 мкл охлажденного на льду PBS. Содержимое лунок отсасывали и добавляли 30 мкл буфера для лизиса (50 мМ Трис.НС1 (рН 7,6), 150 мМ NaCl, 1% Nonidet p40 и 10% глицерина). Планшеты инкубировали в течение ночи при -70°С.
Соответствующее число титрационных микролунок извлекали из мешочка из фольги и помещали в свободный держатель для лунок. Получали рабочий раствор (1 х) буфера для промывки (20х концентрат для промывки планшетов: 100 мл 20-кратного концентрированного раствора PBS и поверхностно-активного вещества, содержит 2% хлорацетамида). Лиофилизованный эталонный p21WAF1 восстанавливали дистиллированной Н2О и затем разводили разбавителем для образцов (имеющимся в наборе).
Образцы получали разведением их 1:4 в разбавителе для образцов. Образцы (100 мкл) и эталоны p21WAF1 (100 мкл) переносили пипеткой в соответствующие лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки промывали 3 раза 1 х буфером для промывки и затем в каждую лунку добавляли пипеткой 100 мкл реагента идентифицирующих антител (раствор биотинилированных моно-клональных антител к p21WAF1). Лунки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем 3 раза промывали 1х буфером для промывки. Разводили 400х конъюгат (конъюгат стрептавидина и пе-роксидазы: 400-кратный концентрированный раствор) и в лунки добавляли по 100 мкл 1 х раствора. Лунки инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин и затем промывали 3 раза 1х буфером для промывки и 1 раз дистиллированной Н20. Добавляли в лунки раствор субстрата (хромогенного субстрата) (100 мкл) и лунки инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли стоп-раствор в том же порядке, в каком ранее добавляли раствор субстрата. Измеряли поглощение в каждой лунке при двух длинах волн 450/595 нм с использованием спектрофотометра для прочтения планшетов.
Для каждого эксперимента параллельно проводили инкубацию контрольных образцов (не содержащих лекарственного средства) и пустышек (не содержащих ни клеток, ни лекарственных средств). Величину для пустышки вычитали из величин для всех контролей и образцов. Для каждого образца величину индукции p21WAF1 (в единицах поглощения) выражали в виде процента от величины для p21WAF1, присутствующего в контрольных образцах. Индукцию в процентах свыше 130% определяли как существенную индукцию. В данном анализе проверяли три соединения. Два показывали существенную индукцию.
В табл. F-2 приводятся результаты для соединений, которые испытывали согласно примерам С.1, С.2 и С.3.
Таблица F-2
Соед. №
Ферментативная активность, р1С50
Клеточная активность, р1С50
Оценка растворимости
- 23 -
008245
<5
<5
б, 173
6,166
7, 096
6,181
6, 932
5,796
7, 073
6,084
6,-29
<5
6, 984
5, 378
6, 433
<5
7,104
5, 828
5, 536
<5
5, 451
<5
5, 679
<5
5, 599
5,297
6, 615
5,534
6,881
<5
7,27
5,528
D. Пример композиции: таблетки с пленочным покрытием. Получение сердцевины таблеток.
Смесь 100 г соединения формулы (I), 570 г лактозы и 200 г крахмала тщательно перемешивали и затем увлажняли раствором 5 г додецилсульфата натрия и 10 г поливинилпирролидона в примерно 200 мл воды. Влажную порошкообразную смесь просеивали, сушили и снова просеивали. Затем добавляли 100 г микрокристаллической целлюлозы и 15 г гидрированного растительного масла. Все тщательно перемешивали и прессовали в таблетки и получали 10000 таблеток, причем каждая содержала 10 мг соединения формулы (I).
Покрытие.
К раствору 10 г метилцеллюлозы в 75 мл денатурированного этанола добавляли раствор 5 г этил-целлюлозы в 150 мл дихлорметана. Затем добавляли 75 мл дихлорметана и 2,5 мл 1,2,3-пропантриола и 10 г полиэтиленгликоля расплавляли и растворяли в 75 мл дихлорметана. Последний раствор добавляли к первому раствору, и затем к этой смеси добавляли 2,5 г октадеканоата магния, 5 г поливинилпирроли-дона и 30 мл концентрированной суспензии красителя, и все гомогенизировали. Полученную таким образом смесь наносили на сердцевины таблеток в аппарате для нанесения покрытия.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение формулы (I)
где п равен 0 или 1 и, когда п равен 0, тогда имеется в виду непосредственная связь; каждый Q представляет собой азот или каждый X представляет собой азот или каждый Y представляет собой азот или каждый Z представляет собой азот или ^;
- 24 -
008245
R1 представляет собой -C(O)NHOH, -№НС(О)С1-6-алкандиил-8Н; R2 представляет собой водород или нитро;
R3 представляет собой водород, С1-6-алкил, арил-С2-6-алкендиил, фуранилкарбонил, нафталинкарбонил, С1-6-алкиламинокарбонил, аминосульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфониламино-С1-6-алкил, ди(С1-6-алкил)амино-С1-6-алкил, С1-12-алкилсульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосульфонил, ди(С1-6-алкил)аминосуль-фониламиноС1-6-алкил, тригалоген-С1-6-алкилсульфонил, ди(арил)-С1-6-алкилкарбонил, тиофенил-С1-6-алкилкарбонил;
R4 представляет собой водород;
когда R3 и R4 находятся у одного и того же атома углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы
-С(О)-МН-СН2-№110- (а-1), где R10 представляет собой водород или арил;
когда R3 и R4 находятся у соседних атомов углерода, R3 и R4 вместе могут образовывать двухвалентный радикал формулы
=СН-СН=СН-СН= (b-1);
его N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые соли присоединения и стереохимически изомерные формы.
2. Соединение по п.1, где n равен 1; каждый Q представляет собой каждый Z представляет собой азот; R1 представляет собой -С(0)МН(ОН); R2 представляет собой водород; R3 представляет собой нафталинкарбонил, С1-12-алкилсульфонил или ди(арил)-С1-6-алкилкарбонил; и R4 представляет собой водород.
3. Соединение по пп.1 и 2, выбранное из числа соединений № 18, № 5 и № 24.
J\> \W \_/HN-OH
СТО
Соед.№ 18
Соед.№ 5
Соед.№ 24
4. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемые носители и в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество соединения по пп.1-3.
5. Способ получения фармацевтической композиции по п.4, где тщательно смешивают фармацевтически приемлемые носители и соединение по пп.1-3.
6. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве лекарственного средства.
7. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лечебного средства для лечения пролиферативных заболеваний.
8. Способ получения соединения по п.1, отличающийся тем, что промежуточное соединение формулы (II) вводят во взаимодействие с соответствующей кислотой, такой как, например, трифторуксусная кислота, и получают гидроксамовую кислоту формулы (I-а), где R1 представляет собой -C(0)NH(OH)
9. Способ детекции или идентификации ЬГОАС в биологическом образце, включающий детекцию или определение образования комплекса между меченым соединением по п.1 и HDAC
10. Сочетание противоракового средства и ингибитора ЬГОАС по любому из пп.1-3.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 25 -