1. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающий:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первый сайт встраивания первой гетерологичной кодирующей последовательности и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a) R (d) в ориентации 5' R 3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

2. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающий:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первую гетерологичную последовательность, кодирующую указанный нужный белок; и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a) R (d) в ориентации 5' R 3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 100 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

3. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

4. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

5. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности и указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

6. Генетический вектор по любому из пп.1-5, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

7. Генетический вектор по любому из пп.1-6, который дополнительно содержит дистальные 3'-фланкирующие последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

8. Генетический вектор по любому из пп.1 и 3-7, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности включает по меньшей мере один рестриктционный сайт эндонуклеазы.

9. Генетический вектор по п.8, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности представляет собой полилинкерный сайт, включающий по меньшей мере два рестриктционных сайта эндонуклеазы.

10. Генетический вектор по любому из пп.1-9, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают эукариотическую интронную последовательность.

11. Генетический вектор по п.10, где указанная эукариотическая интронная последовательность происходит от интрона 1 гена тяжелой цепи ферритина.

12. Генетический вектор по любому из пп.1-11, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают нетранслируемые экзонные последовательности.

13. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности и указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.

14. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности и любые дистальные 3'-фланкирующие последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.

15. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

16. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

17. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет 100% идентичность указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

18. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

19. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

20. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

21. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

22. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

23. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

24. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

25. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 0, 1, 2 или 3 нуклеотида.

26. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 4 нуклеотида.

27. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 1000 нуклеотидов.

28. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 5000 нуклеотидов.

29. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

30. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

31. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

32. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

33. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 10 нуклеотидов.

34. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 1000 нуклеотидов.

35. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат сигнал полиаденилирования.

36. Генетический вектор по любому из пп.1-2, дополнительно содержащий дистальную 3'-фланкирующую последовательность эукариотического локуса, включающую последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

37. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

38. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

39. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

40. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

41. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

42. Генетический вектор pFerX8.

43. Генетический вектор pFerX11.

44. Эукариотическая клетка, трансфицированная вектором по любому из пп.1-43.

45. Эукариотическая клетка по п.44, где указанный вектор устойчиво интегрирован в хромосому указанной клетки.

46. Эукариотическая клетка по любому из пп.44-45, где указанная первая кодирующая последовательность экспрессируется в указанной клетке.

47. Эукариотическая клетка, содержащая:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первую кодирующую последовательность; и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a) R (d) в ориентации 5' R 3' посредством необязательных линкерных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

48. Эукариотическая клетка, содержащая экзогенную дистальную 5'-фланкирующую последовательность, происходящую от локуса тяжелой цепи ферритина и функционально присоединенную к кодирующей последовательности.

49. Способ продуцирования нужного белка в эукариотической клетке, предусматривающий:

(a) продуцирование по меньшей мере одной клетки по любому из пп.44-48 или ее потомства;

(b) поддержание указанной клетки в культуре в условиях, обеспечивающих высокий уровень экспрессии нужного белка; и

(c) выделение указанного нужного белка из указанной культуры.

 

(57) Реферат / Формула:
Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающий:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первый сайт встраивания первой гетерологичной кодирующей последовательности и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a) R (d) в ориентации 5' R 3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

2. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающий:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первую гетерологичную последовательность, кодирующую указанный нужный белок; и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a) R (d) в ориентации 5' R 3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 100 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

3. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

4. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

5. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности и указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

6. Генетический вектор по любому из пп.1-5, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

7. Генетический вектор по любому из пп.1-6, который дополнительно содержит дистальные 3'-фланкирующие последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

8. Генетический вектор по любому из пп.1 и 3-7, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности включает по меньшей мере один рестриктционный сайт эндонуклеазы.

9. Генетический вектор по п.8, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности представляет собой полилинкерный сайт, включающий по меньшей мере два рестриктционных сайта эндонуклеазы.

10. Генетический вектор по любому из пп.1-9, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают эукариотическую интронную последовательность.

11. Генетический вектор по п.10, где указанная эукариотическая интронная последовательность происходит от интрона 1 гена тяжелой цепи ферритина.

12. Генетический вектор по любому из пп.1-11, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают нетранслируемые экзонные последовательности.

13. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности и указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.

14. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности и любые дистальные 3'-фланкирующие последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.

15. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

16. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

17. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет 100% идентичность указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

18. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

19. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

20. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

21. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

22. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

23. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

24. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

25. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 0, 1, 2 или 3 нуклеотида.

26. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 4 нуклеотида.

27. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 1000 нуклеотидов.

28. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 5000 нуклеотидов.

29. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

30. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

31. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

32. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

33. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 10 нуклеотидов.

34. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 1000 нуклеотидов.

35. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат сигнал полиаденилирования.

36. Генетический вектор по любому из пп.1-2, дополнительно содержащий дистальную 3'-фланкирующую последовательность эукариотического локуса, включающую последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

37. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

38. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

39. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

40. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

41. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

42. Генетический вектор pFerX8.

43. Генетический вектор pFerX11.

44. Эукариотическая клетка, трансфицированная вектором по любому из пп.1-43.

45. Эукариотическая клетка по п.44, где указанный вектор устойчиво интегрирован в хромосому указанной клетки.

46. Эукариотическая клетка по любому из пп.44-45, где указанная первая кодирующая последовательность экспрессируется в указанной клетке.

47. Эукариотическая клетка, содержащая:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первую кодирующую последовательность; и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a) R (d) в ориентации 5' R 3' посредством необязательных линкерных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

48. Эукариотическая клетка, содержащая экзогенную дистальную 5'-фланкирующую последовательность, происходящую от локуса тяжелой цепи ферритина и функционально присоединенную к кодирующей последовательности.

49. Способ продуцирования нужного белка в эукариотической клетке, предусматривающий:

(a) продуцирование по меньшей мере одной клетки по любому из пп.44-48 или ее потомства;

(b) поддержание указанной клетки в культуре в условиях, обеспечивающих высокий уровень экспрессии нужного белка; и

(c) выделение указанного нужного белка из указанной культуры.

 

---

008222
Предпосылки создания изобретения Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, и в частности к созданию и применению векторов для экспрессии гетерологичных генных последовательностей в трансформированных клетках.
Описание уровня техники
Типичные экспрессирующие векторы содержат промоторы, обеспечивающие регуляцию нужного гена, а также сигналы полиаденилирования, обеспечивающие образование зрелого транскрипта. Промо-торные последовательности имеют длину только в несколько сотен пар нуклеотидов и, в большинстве случаев, если не всегда, содержат регуляторные области для оптимальной экспрессии, определяемой путем транзиентной трансфекции. Однако экспрессионные конструкции, содержащие эти последовательности, хотя они и являются высокофункциональными при транзиентных трансфекциях, не всегда способны обеспечивать аналогичный уровень экспрессии при интеграции в хроматин в качестве стабильного трансфектанта. Это обусловлено экспрессией, зависимой от положения, то есть феномена, при котором сайт интеграции оказывает доминирующее воздействие, обычно негативное, на уровень экспрессии (Wilson (1990), Ann. Rev. Cell Biol. 6:679-714). Результат экспрессии, зависимой от положения, очевиден при трансфекционном скрининге, при котором большинство клеточных линий продуцирует незначительное количество продукта либо вообще не продуцирует такого продукта. Поэтому обычно для идентификации одного высокоэкспрессирующего клона необходимо проводить скрининг большого числа трансфектантов. Но даже после проведения широкомасштабного скрининга трансфектанты, полученные с использованием стандартных экспрессирующих векторов, обычно обнаруживают уровни экспрессии, которые являются недостаточными для их применения в промышленных целях.
Для увеличения уровней экспрессии в стабильных трансфектантах часто применяется способ DHFR-амплификации, который требует много времени и является в высокой степени трудоемким. Так, например, для достижения уровня экспрессии эндогенных генов от промоторов с аналогичной активностью (только от двух аллелей) обычно требуется амплификация более чем 100 интегрированных копий стандартных экспрессионных конструкций. Различие между стандартными экспрессирующими векторами и эндогенными генами, по всей вероятности, обусловлено присутствием последовательностей, расположенных со стороны 5'-конца по отношению к промотору и/или со стороны 3'-конца по отношению к сигналу полиаденилирования эндогенных генов, способных сообщать хроматину конфигурацию, более благоприятную для экспрессии. Экспрессионная конструкция, содержащая последовательности, которые могут придавать хроматину желательные и независимые от положения конфигурации, независимо от сайта(ов) интеграции, должна быть благоприятной для генерирования клеточных линий с высокой степенью экспрессии гетерологичных генов.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение основано, отчасти, на получении высокоэкспрессирующих "локусных векторов", происходящих от гена тяжелой цепи ферритина. Понятие "локусный вектор" основано на обнаружении того факта, что области, расположенные со стороны 5'- и 3'-концов по отношению к высокоэкс-прессируемым генам в их природном хроматиновом окружении, могут обеспечивать более высокие уровни экспрессии гетерологичного гена. Поэтому настоящее изобретение относится к векторам, полученным на основе локуса гена тяжелой цепи ферритина и включающим 5'- и 3'-последовательности, которые могут обеспечивать высокие уровни экспрессии гетерологичных генов в стабильных трансфектан-тах. Таким образом, настоящее изобретение относится к генетическим векторам для обеспечения стабильной трансфекции и высоких уровней экспрессии нужного белка в эукариотических клетках.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к генетическим векторам для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающим: (а) дис-тальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса; (b) проксимальные 5'-регуля-торные последовательности эукариотического локуса; (с) по меньшей мере, первый сайт встраивания гетерологичной последовательности; и (d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса; где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)--(d) в ориентации 5'-3' посредством необязательных лин-керных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями; и где (1) дис-тальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 100 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; и/или (2) проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
В другом своем аспекте указанный вектор включает, по меньшей мере, первую гетерологичную кодирующую последовательность, кодирующую нужный белок. Таким образом, настоящее изобретение относится к генетическим векторам для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукарио
- 1 -
008222
тических клетках, включающим: (а) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса; (b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса; (с) по меньшей мере, первую гетерологичную кодирующую последовательность, кодирующую указанный нужный белок; и (d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса, где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)- (d) в ориентации 5'- 3' посредством необязательных линкерных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями, и где (1) дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 100 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; и/или (2) проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина. В других вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина. В других вариантах осуществления изобретения как проксимальные 5'-регуляторные последовательности, так и дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина, а в некоторых вариантах изобретения указанный вектор, кроме того, включает дистальные 3'-фланкирующие последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения сайт встраивания гетерологичной последовательности включает, по меньшей мере, один рестриктционный сайт эндонуклеазы, а в других вариантах изобретения сайт встраивания гетерологичной последовательности представляет собой полилинкерный сайт, включающий, по меньшей мере, два рестриктционных сайта эндонуклеазы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают эукариотическую интронную последовательность. В некоторых из этих вариантов изобретения указанная эукариотическая интронная последовательность происходит от интрона 1 гена тяжелой цепи ферритина. В некоторых вариантах изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают нетранслируемые экзонные последовательности.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 5'-фланкирующие последовательности и проксимальные 5'-регуляторные последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нук-леотидов. Аналогичным образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности и любые дистальные 3'-фланкирующие последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к эукариотическим клеткам, трансфици-рованным любыми векторами настоящего изобретения. В некоторых вариантах изобретения указанный вектор устойчиво интегрирован в хромосому указанной клетки, а в некоторых вариантах изобретения указанная первая гетерологичная кодирующая последовательность экспрессируется в указанной клетке.
В некоторых вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к эукариотическим клеткам, включающим: (а) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса; (b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса; (с) по меньшей мере, первую кодирующую последовательность; и (d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса; где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)- (d) в ориентации 5'- 3' посредством необязательных линкерных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями; и где (1) дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 100 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; и/или (2) проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 20 нуклеоти-дов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к эукариотической клетке, включающей экзогенную дистальную 5'-фланкирующую последовательность, происходящую от локуса тяжелой цепи ферритина, функционально присоединенного к кодирующей последовательности.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования нужного белка в эукариотической клетке, включающему стадии (а) продуцирования, по меньшей мере, одной клетки на
- 2 -
008222
стоящего изобретения или ее потомства; (b) поддержания указанной клетки в культуре в условиях, обеспечивающих высокий уровень экспрессии нужного белка; и (с) выделения нужного белка из культуры.
Эти и другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам из подробного описания изобретения и примеров, приведенных ниже.
Краткое описание фигур
Нижеследующий графический материал приводится лишь в целях иллюстрации вариантов осуществления изобретения и не должен рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения.
На фиг. 1 представлены экзонные последовательности для тяжелой цепи крысиного ферритина.
На фиг. 2 проиллюстрирован один пример субклонирования области, содержащей экзоны тяжелой цепи ферритина, в плазмиду Litmus 38.
На фиг. 3 проиллюстрирована делеция экзонов 2, 3 и 4 из pFerX1 и инсерция полилинкера для генерирования плазмиды pFerX2.
На фиг. 4 проиллюстрирована делеция кодирующей области экзона 1 из pFerX2 для генерирования плазмиды pFerX3 и делеция IRE для генерирования плазмиды pFerX4.
На фиг. 5 А-В проиллюстрировано удаление экзонов 2-4 гена тяжелой цепи ферритина из космиды 15А с помощью ПЦР-слияния.
На фиг. 6 проиллюстрирована инсерция продукта ПЦР-слияния, представленного на фиг. 5, в HpaI-и AatII-сайты pFerX4 для генерирования плазмиды pFerX5.
На фиг. 7 проиллюстрировано удаление SwaI-сайта из pFerX5 для генерирования плазмиды pFerX5.1.
На фиг. 8 проиллюстрировано присоединение дистальных 3'-фланкирующих последовательностей к pFerX6 для генерирования pFerX7.
На фиг. 9 проиллюстрировано присоединение дистальных 5'-фланкирующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина к pFerX7 для генерирования плазмиды pFerX8.
На фиг. 10 проиллюстрирована генетическая карта плазмиды pFerX8, включая источники происхождения последовательностей.
На фиг. 11 проиллюстрирована генетическая карта плазмиды pFerX9, включая источники происхождения последовательностей.
На фиг. 12 проиллюстрирована последовательность транскрибируемой области плазмид pFerX8 и
pFerX9.
На фиг. 13 проиллюстрирована генетическая карта pSIDHFR.2, то есть DHFR-экспрессирующей плазмиды.
На фиг. 14 представлены результаты экспериментов по измерению уровня экспрессии репортерного гена в пулах трансфектантов.
На фиг. 15 представлены результаты экспериментов по измерению уровней экспрессии репортерно-го гена в трансфецированных изолятах.
Подробное описание изобретения Используемые в описании изобретения ссылки на патентные, научные и медицинские публикации следует рассматривать как известные сведения, которые доступны любому специалисту на момент подачи настоящей заявки. Полное описание выданных патентов США, опубликованных и рассматриваемых патентных заявок и другие цитируемые здесь ссылочные материалы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Определения
Все используемые здесь технические и научные термины, если они как-либо иначе не определены ниже, имеют общепринятые значения, известные любому специалисту; а при ссылках на применяемые здесь методы подразумевается, что эти методы являются общеизвестными и включают их варианты или замены эквивалентными методами, очевидными для каждого специалиста. Для более ясного и точного описания рассматриваемого объекта изобретения ниже приводятся определения конкретных терминов, используемых в описании и в прилагаемой формуле изобретения.
Эукариотический локус.
Используемый здесь термин "эукариотический локус" означает любые хромосомные генные локусы в эукариотических клетках, кодирующие полипептид или РНК-продукт, который может быть экспресси-рован в данной клетке в соответствующих условиях. Из объема используемого здесь термина "эукарио-тический локус" намеренно исключены митохондриальные локусы.
Дистальные 5'-фланкирующие последовательности.
Используемый здесь термин "дистальные 5'-фланкирующие последовательности" означает фланкирующие нуклеотидные последовательности, которые находятся со стороны 5'-конца от проксимальных 5'-регуляторных последовательностей гена. Хотя эти последовательности могут оказывать воздействие на уровни транскрипции, обусловленное их влиянием на структуру хроматина, однако, эти последовательности, в основном, находятся со стороны 5'-конца от основных 5'-регуляторных последовательностей (например, операторов, промоторов, сайтов связывания с рибосомой) и более удалены от сайта инициации транскрипции, чем проксимальные 5'-регуляторные последовательности. Размер дистальных 5'
- 3 -
008222
фланкирующих последовательностей может варьироваться в пределах 100-100000 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 5'-фланкирующие последовательности могут включать 500-50000, 750-25000 или 1000-10000 нуклеотидов. Дистальные 5'-фланкирующие последовательности могут начинаться где-либо со стороны 5'-конца от проксимальных 5'-регуляторных последовательностей, а обычно они начинаются за 20, 50, 75, 100, 500, 1000, 5000 или 10000 нуклеотидов от 5'-сайта инициации транскрипции. Дистальные 5'-фланкирующие последовательности могут простираться на значительное расстояние от 5'-промотора и от последовательностей инициации транскрипции гена, а обычно они заканчиваются на расстоянии 100000, 50000, 25000 или 10000 нуклеотидов от 5'-сайта инициации транскрипции.
Проксимальные 5'-регуляторные последовательности.
Используемый здесь термин "проксимальные 5'-регуляторные последовательности" означает нук-леотидные последовательности, которые расположены возле 5'-конца гена и которые включают основные регуляторные элементы (то есть промотор и, если они присутствуют, оператор и последовательности, связывающиеся с рибосомой), необходимые для транскрипции и трансляции. Размер проксимальных 5'-регуляторных последовательностей может варьироваться в пределах 20-10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают 50-5000, 75-1000 или 100-500 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения 3'-конец проксимальных 5'-регуляторных последовательностей может быть определен как непосредственно примыкающий к 5'-кодону инициации трансляции или "старт"-кодону кодирующей области. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности могут включать последовательности, находящиеся внутри гена, включая интронные последовательности, а поэтому 3'-конец проксимальных 5'-регуляторных последовательностей может простираться в интронные последовательности. Кроме того, в некоторых вариантах изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности могут включать некоторые 5'-кодирующие последовательности (например, старт-кодон и/или короткую N-концевую последовательность). Проксимальные 5'-регулятор-ные последовательности простираются от 5'-сайта инициации транскрипции и могут заканчиваться на расстоянии 10000, 5000, 1000, 500, 100, 75, 50 или 20 нуклеотидов от 5'-сайта инициации транскрипции.
Проксимальные 3'-регуляторные последовательности.
Используемый здесь термин "проксимальные 3'-регуляторные последовательности" означает нук-леотидные последовательности, которые расположены возле 3'-конца гена и которые включают основные регуляторные элементы (то есть кодон терминации трансляции, сигнал полнаденилирования и терминатор транскрипции), необходимые для правильного процессинга мРНК и терминации трансляции. Размер проксимальных 3'-регуляторных последовательностей может варьироваться в пределах 10-2000 нуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности включают 25-1000, 50-750 или 75-500 нуклеотидов. 5'-Конец проксимальных 3'-регуляторных последовательностей может быть определен как кодон терминации трансляции или "стоп"-кодон (то есть TAG, ТТА или TGA). Проксимальные 3'-регуляторные последовательности простираются от 3'-кодона терми-нации трансляции и могут заканчиваться на расстоянии 2000, 1000, 750 или 500 нуклеотидов от 3'-кодона терминации трансляции.
Дистальные 3'-фланкирующие последовательности.
Используемый здесь термин "дистальные 3'-фланкирующие последовательности" означает фланкирующие нуклеотидные последовательности, которые находятся со стороны 3'-конца от проксимальных 3'-регуляторных последовательностей гена. Таким образом, эти последовательности находятся со стороны 3'-конца от основных 3'-регуляторных последовательностей (например, стоп-кодона и сигнала поли-аденилирования), необходимых для правильного процессинга мРНК и терминации трансляции, и являются более удаленными от сайта терминации транскрипции, чем проксимальные 3'-регуляторные последовательности. Размер дистальных 3'-фланкирующих последовательностей может варьироваться в пределах 100-100000 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут включать 500-50000, 750-25000 или 1000-10000 нуклеотидов. Дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут начинаться где-либо со стороны 3'-конца от проксимальных 3'-регуляторных последовательностей, а обычно они начинаются через 500 нуклеотидов, 750, 1000 или 2000 нуклеотидов от 3'-кодона терминации трансляции. Дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут простираться на значительное расстояние от 3'-кодона терминации транскрипции и последовательностей полиаденилирования гена, а обычно они заканчиваются на расстоянии 100000, 50000, 25000 или 10000 нуклеотидов от 3'-кодона терминации транскрипции.
Вектор.
Используемый здесь термин "вектор" означает любую генетическую конструкцию, такую как плаз-мида, фаг, транспозон, космида, хромосома, вирус, вирион и т. п., обладающую способностью переносить нуклеиновые кислоты от клетки к клетке. Векторы могут обладать одной или несколькими функциями, такими как репликация, экспрессия, рекомбинация, инсерция или интеграция, но они необязательно должны обладать каждой из этих функций. Таким образом, этот термин включает клонирующие и экс-прессирующие векторы.
- 4 -
008222
Трансфекция.
Используемый здесь термин "трансфекция" означает введение в клетку или организм вектора, который реплицируется внутри этой клетки или организма или который экспрессирует полипептидную последовательность в такой клетке или организме с его интеграцией или без интеграции в геном этой клетки или организма. Используемый здесь термин "трансфекция" охватывает все различные методы введения таких векторов, включая, но не ограничиваясь ими, методы, известные специалистам, такие как трансфекция, трансформация, трансдукция или перенос генов, а также включая такие методы, как мик-роинжекция, опосредованный DEAE-декстраном эндоцитолиз, копреципитация фосфатом кальция, элек-тропорация, опосредуемая липосомами трансфекция, инжекция биобаллистическими методами, вирус-опосредованная трансфекция и т. п. Клетки или организмы, которые подвергаются трансфекции, называются здесь "трансфектантами".
Стабильная трансфекция.
Используемый здесь термин "стабильная трансфекция" означает трансфекцию, определенную выше, которая приводит к интеграции всего вектора или его части в геном трансфецированной клетки или трансфецированного организма. Клетки или организмы, которые подвергаются стабильной трансфекции, называются здесь "стабильными трансфектантами".
Функционально присоединенный.
Используемый здесь термин "функционально присоединенный" относится к ковалентной и функциональной связи генетических регуляторных элементов и генетической кодирующей области, которая может приводить к образованию кодирующей области, транскрибируемой в мРНК под действием РНК-полимеразы, способной связываться с одним или несколькими регуляторными элементами. Таким образом, регуляторная область, включая регуляторные элементы, функционально присоединяется к кодирующей области в том случае, если РНК-полимераза способна, в пермиссивных условиях, связываться с промотором внутри регуляторной области и обеспечивать транскрипцию кодирующей области в мРНК. В этом контексте пермиссивные условия должны включать стандартные внутриклеточные условия для конститутивных промоторов, стандартные условия и отсутствие репрессора или присутствие индуктора для репрессируемых/индуцибельных промоторов и соответствующие in vitro условия для in vitro-систем транскрипции.
Гетерологичный.
Используемый здесь термин "гетерологичный" относится к двум или нескольким генным последовательностям, где указанные генные последовательности в природе не являются функционально связанными, либо они обычно не присутствуют в природе в одном и том же геноме. Так, например, если вектор включает кодирующую последовательность, функционально присоединенную к одному или нескольким регуляторным элементам, то такие последовательности считаются гетерологичными по отношению друг к другу, если они в природе не являются функционально связанными или не присутствуют в одном и том же геноме.
Положения нуклеотидов.
Используемый здесь термин "все положения нуклеотидов" относится к цепи ДНК, включающей элементы области гена тяжелой цепи ферритина в "смысловой" ориентации. Как будет очевидно из контекста, нумерация положений нуклеотидов начинается либо с положений старт-кодона гена тяжелой цепи ферритина, либо с положений в одной из последовательностей, включенных в список последовательностей. В первом случае аденозин или "А" старт-кодона (ATG) обозначают как положение 1, при этом предшествующие положения обозначаются со знаком минус. В последнем случае всегда конкретно указывают соответствующую SEQ ID NO. Относительные положения нуклеотидов будут далее обозначаться в соответствии с общепринятым 5'- и 3'-направлениями смысловой цепи.
Проценты идентичности нуклеотидной последовательности.
Упоминаемый в настоящем изобретении процент идентичности последовательностей между двумя нуклеотидными последовательности вычисляют, исходя из числа идентичных остатков последовательностей, сопоставляемых путем их выравнивания, деленного на число нуклеотидов, присутствующих в меньшей из двух последовательностей. Перед вычислением процента идентичности последовательности выравнивают с использованием алгоритма (или эквивалентного алгоритма) программы ClustalW с параметрами по умолчанию, которая имеется в Европейской лаборатории микробиологии (EMBL) при Европейском институте биоинформатики (European Bioinformatics Institute of the European Molecular Biology Laboratory (http://www.ebi.ac.uk/clustalw)) и описана в работе Higgins et al. (1994) "CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 22:4673-4680.
Происходящий от.
Используемый здесь термин "происходящий от", указывающий на происхождение нуклеотидной последовательности, относится к последовательности, которая была или может быть получена, прямо или опосредованно, из известной последовательности путем введения в эту последовательность ограниченного числа инсерций, делеций или замен. Так, например, последовательность, которая представляет собой субпоследовательность известной последовательности, может быть получена из этой известной
- 5 -
008222
последовательности путем делеций фланкирующих последовательностей. Аналогичным образом, данная последовательность может быть получена из известной последовательности путем введения в эту последовательность комбинации инсерций, делеций и/или замен одного или нескольких нуклеотидов. Число инсерций, делеций и замен может быть ограничено в соответствии с требуемым процентом идентичности между известной последовательностью и производной последовательностью. Область числовых значений.
Используемые здесь указания областей числовых значений означают, что настоящее изобретение может быть осуществлено с использованием параметра, величина которого равна любой величине, находящейся в пределах определенного интервала значений. Таким образом, если данный параметр по своей природе является дискретным, то такой параметр может быть равен целому числу в пределах числовых значений, включая конечные значения данного интервала. Аналогичным образом, если данный параметр по своей природе является непрерывным, то такой параметр может быть равен любой действительной величине, находящейся в пределах числовых значений, включая конечные значения данного интервала. Так, например, данный параметр, который определен как параметр, имеющий величины от 0 до 2, может составлять 0, 1 или 2, если он является дискретным по своей природе, или он может составлять 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 или любую другую действительную величину < 2, если он является непрерывным по своей природе.
Или.
Если это не оговорено особо, то используемый здесь союз "или" употребляется в смысле "включительно", как в сочетании "и/или", но не "исключительно", как в сочетании "либо.. , либо..".
Общее обсуждение
Настоящее изобретение основано, отчасти, на получении высокоэкспрессирующих "локусных векторов", происходящих от гена тяжелой цепи ферритина. Понятие "локусный вектор" основано на обнаружении того факта, что области, расположенные со стороны 5'- и 3'-концов по отношению к высокоэкс-прессируемым генам в их природном хроматиновом окружении, могут обеспечивать более высокие уровни экспрессии гетерологичного гена. Поэтому настоящее изобретение относится к векторам, полученным на основе локуса гена тяжелой цепи ферритина и включающим 5'- и 3'-последовательности, которые могут обеспечивать высокие уровни экспрессии гетерологичных генов в стабильных трансфектан-тах. Таким образом, настоящее изобретение относится к генетическим векторам, обеспечивающим стабильную трансфекцию и высокие уровни экспрессии нужного белка в эукариотических клетках.
Ген тяжелой цепи ферритина
Крысиный и человеческий геномы содержат множество процессированных псевдогенов тяжелой цепи ферритина (Hentze et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7226-72307). Крысиный ген ферритина состоит из четырех экзонов (то есть экзонов 1-4), разделенных тремя интронами (например, интронами 1-3). В банке генов Genbank per. №№ М18051, М18052 и М18053 имеются три генных сегмента, которые на фиг. 1 обозначены как части А, В и С. Все эти три сегмента охватывают четыре экзона геномной последовательности тяжелой цепи ферритина. На фиг. 1(А) показана 5'-нетранслируемая последовательность длиной 168 п.н., включающая сайт инициации транскрипции в положении -168, за которым следуют экзон 1 и первые 104 п.н. 5'-конца интрона 1. Экзон 1 включает старт-кодон и кодирует 38 аминокислот. На фиг. 1(В) показаны последние 50 п.н. 3'-конца интрона 1, за которыми следуют экзон 2 и первые 35 п.н. 5'-конца интрона 2. На фиг. 1(C) показаны последние 33 п.н. 3'-конца интрона 2, за которыми следуют экзон 3, интрон 3, экзон 4 и 3'-нетранслируемая последовательность, включая стоп-кодон, а после этого стоп-кодона следует сигнал полиаденилирования длиной 132 п.н.
Поскольку вставки космидных библиотек имеют довольно большие размеры, то их выбирают так, чтобы получить 5'- и 3'-фланкирующие области достаточной длины. В частности, была выбрана крысиная космидная библиотека Catalog #RL1032m (BD Biosciences/Clontech, Palo Alto, CA). Однако могут быть также использованы и другие библиотеки, либо эти последовательности могут быть получены путем синтеза.
Во избежание клонирования процессированных псевдогенов при скрининге космидной библиотеки, интронные последовательности выбирают так, чтобы они служили в качестве зондов-матриц. Эти интро-ны были клонированы с помощью ПЦР с использованием крысиной геномной ДНК (Catalog #6750-1, Clontech, Palo Alto, CA) в качестве матрицы и праймеров, полученных на основе родственной кДНК и геномных последовательностей, взятых из Genbank. Биотинилированные зонды получали с использованием интронов в качестве матриц и с помощью этих матриц скринировали космидную библиотеку. Затем выделяли одну космиду, содержащую ген тяжелой цепи ферритина (15А), и картировали ее с помощью рестриктирующих ферментов. Три сегмента крысиной геномной последовательности, взятой из Genbank, служили в качестве "гида" для определения локализации кодирующих областей и для составления плана создания высокоэкспрессирующего локусного вектора.
Продуцирование высокоэкспрессирующего вектора на основе локуса гена тяжелой цепи ферритина
Продуцирование высокоэкспрессирующего локусного вектора настоящего изобретения может быть осуществлено различными методами. Так, например, последовательности, образующие данный вектор, могут быть получены из одного клона или из множества клонов. Эти последовательности могут быть получены только на основе гена тяжелой цепи ферритина крысы, только на основе другой тяжелой цепи
- 6 -
008222
ферритина млекопитающего или на основе множества генов тяжелой цепи ферритина млекопитающего. Такие последовательности могут быть получены на основе только природных последовательностей или смеси природных и синтезированных последовательностей. Кроме того, локусный вектор может быть создан сначала путем получения одного или нескольких крупных геномных фрагментов, включающих всю область гена тяжелой цепи ферритина или ее часть, а затем путем удаления или инактивации нежелательных последовательностей со встраиванием нужных последовательностей, либо он может быть создан путем клонирования или субклонирования только нужных фрагментов области гена тяжелой цепи ферритина с последующим их объединением с другими нужными последовательностями.
Аналогичным образом, путем комбинирования этих методов с применением клонирования, субклонирования, делеции, инактивации и инсерции могут быть получены нужные конструкции. Используемый здесь способ и порядок проведения различных стадий не имеют важного значения для осуществления настоящего изобретения и могут быть выбраны самим специалистом.
Высокоэкспрессирующий локусный вектор настоящего изобретения включает в направлении 5'-3': (а) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса; (b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса; (с) по меньшей мере, первый сайт встраивания гетерологичной последовательности; и (d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса. Линкерные последовательности могут, но необязательно, находиться между сегментами (a)-(d). Кроме того, по меньшей мере, одна из дистальных 5'-фланкирующих последовательностей и проксимальных 5'-регуляторных последовательностей, в основном, идентична соответствующим последовательностям гена тяжелой цепи ферритина. В некоторых вариантах осуществления изобретения в этот вектор также включены дистальные 3'-фланки-рующие последовательности.
Один из вариантов высокоэкспрессирующего локусного вектора настоящего изобретения, вектор pFerX8, описанный ниже, имеется в Genbank рег. № AY147930.
А. Дистальные 5'-фланкирующие последовательности и проксимальные 5'-регуляторные последовательности.
В некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 5'-фланкирующие последовательности локусного вектора включают последовательность из 100-100000 нуклеотидов, которая, по меньшей мере, на 70-100% идентична нуклеотидной последовательности, имеющейся в дистальных 5'-флан-кирующих последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 5'-фланкирующие последовательности могут включать, по меньшей мере, 100, 500, 750, 1000, 10000, 25000, 50000 или 100000 нуклеотидов, которые, по меньшей мере, на 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальных 5'-фланкирующих последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина. Как показано в ни-жепривиденных примерах, дистальные 5'-последовательности могут включать 1000-10000, 2000-9000, 3000-8000 или 4000-7000 п. н. фланкирующих последовательностей.
В других вариантах осуществления изобретения дистальные 5'-фланкирующие последовательности локусного вектора имеют более низкий процент идентичности с соответствующими последовательностями гена тяжелой цепи ферритина, а в некоторых вариантах дистальные 5'-фланкирующие последовательности могут не иметь сходства ни с одной из соответствующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина.
В высокоэкспрессирующем локусном векторе настоящего изобретения за дистальными 5'-фланки-рующими последовательностями в положении "даунстрим" находятся проксимальные 5'-регуляторные последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регулятор-ные последовательности локусного вектора включают последовательность, которая состоит, по меньшей мере, из 20-10000 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70-100% идентична нуклеотидной последовательности, расположенной в проксимальных 5'-регуляторных последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности могут включать, по меньшей мере, 20, 50, 75, 100, 500, 1000, 5000 или 10000 нуклеотидов, которые, по меньшей мере, на 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны нуклеотид-ной последовательности, имеющейся в проксимальных 5'-регуляторных последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина.
В других вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности локусного вектора имеют более низкий процент идентичности с соответствующими последовательностями гена тяжелой цепи ферритина, а в некоторых вариантах проксимальные 5'-регуляторные последовательности могут не иметь сходства ни с одной из соответствующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина.
Во всех вариантах осуществления изобретения проксимальные 5'-регуляторные последовательности должны быть эффективными для инициации транскрипции гетерологичной кодирующей области, встраиваемой в вектор. Так, например, в тех вариантах изобретения, в которых проксимальные 5'-регуляторные последовательности получены на основе соответствующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина, эти последовательности не должны варьироваться настолько, чтобы они становились не эффективными для инициации и стимуляции транскрипции. Таким образом, для сохранения
- 7 -
008222
функциональности экспрессирующего вектора необходимо сохранение таких отличительных признаков, как "ТАТА-бокс" или сайт связывания с рибосомой, или замена этих последовательностей эквивалентными последовательностями. С другой стороны, допустима также полная замена этих последовательностей функциональными эквивалентами от других генов, включая любые из многих известных проксимальных 5'-регуляторных областей от других генов. Аналогичным образом, допустима также замена этих последовательностей химерными последовательностями, полученными на основе проксимальных 5'-ре-гуляторных областей двух или более генов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения как дистальные 5'-фланкирующие последовательности, так и проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают последовательность, которая состоит, по меньшей мере, из 100-1000 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70-100% идентична нуклеотидной последовательности, имеющейся, соответственно, в дистальных 5'-фланкирую-щих последовательностях и проксимальных 5'-регуляторных последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина. В некоторых из этих вариантов изобретения дистальные 5'-фланкирующие последовательности и проксимальные 5'-регуляторные последовательности на 70-100% идентичны непрерывным последовательностям, имеющимся в локусе тяжелой цепи ферритина.
Поскольку интрон 1 гена тяжелой цепи ферритина может содержать позитивные регуляторные элементы и может способствовать процессингу и транспорту РНК, то может оказаться предпочтительным создание локусного вектора, который сохранял бы весь интрон 1 или его фрагмент как часть проксимальных 5'-регуляторных последовательностей. Это может быть осуществлено путем сохранения кодона ATG и, необязательно, дополнительных кодонов, расположенных со стороны 5'-конца от начала последовательностей интрона 1. Если, помимо кодона ATG, сохраняются другие кодоны, то они могут происходить от кодирующих последовательностей экзона 1 гена тяжелой цепи ферритина или от любых других кодирующих последовательностей (включая синтезированные или искусственные последовательности) и могут кодировать N-конец гибридного белка с гетерологичными кодирующими последовательностями. Такой N-конец может функционировать как лидерная или сигнальная последовательность, стимулирующая экспрессию гетерологичных последовательностей. Альтернативно, в других вариантах осуществления изобретения сайт встраивания дополнительных гетерологичных последовательностей (например, один рестрикционный сайт или полилинкер) может быть встроен со стороны 5'-конца от начала ин-трона 1 так, чтобы при необходимости могли встраиваться последовательности, кодирующие различные N-концевые последовательности (например, лидерную или сигнальную последовательности). Кодон ATG может присутствовать как часть вектора, либо он может быть частью встроенных гетерологичных последовательностей.
Однако обычно в сохранении кодона ATG или каких-либо других кодонов перед интроном 1 нет никакой необходимости. Наоборот, в некоторых вариантах изобретения кодон ATG может присутствовать в экзоне 2 либо он может обеспечиваться гетерологичной кодирующей последовательностью. В таких вариантах изобретения сайт встраивания гетерологичной последовательности может присутствовать в экзоне 2 либо на стыке интрон 1/экзон 2, а кодон ATG может присутствовать либо как часть вектора, либо как часть встроенных гетерологичных последовательностей. Однако во всех случаях, где интрон 1 включен в вектор, донорные и акцепторные последовательности сплайсинга интрона 1 или эквивалентные донорные и акцепторные последовательности сплайсинга должны быть сохранены для того, чтобы интронные последовательности могли быть подвергнуты посттранскрипционному удалению. Другие последовательности, присутствующие в интроне, могут быть делетированы или заменены, либо могут быть встроены дополнительные последовательности, описанные в настоящей заявке. Однако в тех конструкциях, где сохранен интрон 1, вставка гетерологичной кодирующей области, независимо от того, встроена она в 5'- или в 3'-конец интрона 1, не должна разрушать донорный и акцепторный сайты сплайсинга, а должна восстанавливать донорный и акцепторный сайты сплайсинга или обеспечивать присутствие эквивалентных донорных и акцепторных сайтов сплайсинга.
И, наконец, поскольку экзон 1 гена тяжелой цепи ферритина также содержит железорегулирующий элемент (IRE) (т.е. регулирующий элемент железосодержащего белка, ферритина), который расположен со стороны 3'-конца от ATG (приблизительно от положения -138 до положения -111), и который негативно регулирует (ингибирует) трансляцию в зависимости от уровня железа (как описано Klausner et al. (1993), Cell 72:19-26), то при конструировании локусного вектора IRE может быть, но необязательно, делетирован из проксимальных 5'-регуляторных последовательностей.
В. Кодирующие области тяжелой цепи ферритина.
Обычно локусный вектор не включает какие-либо кодирующие области гена тяжелой цепи ферри-тина. Однако, в зависимости от способа конструирования вектора, кодирующие области гена тяжелой цепи ферритина могут быть включены специально или они могут присутствовать в качестве артефактов. Так, например, если вся область гена тяжелой цепи ферритина клонирована в вектор с использованием только дистальных 5'-фланкирующих последовательностей и/или проксимальных 5'-регуляторных последовательностей (вместе с "5'-последовательностями ферритина"), то кодирующие области могут быть намеренно полностью делетированы. Альтернативно, сайт встраивания гетерологичной последовательности (например, уникальный рестрикционный сайт или полилинкер) и проксимальные 3'-регуляторные
- 8 -
008222
последовательности (и необязательно дистальные 3'-фланкирующие последовательности) могут быть встроены непосредственно со стороны 3'-конца от 5'-последовательностей ферритина без делеции кодирующих областей. Из-за встраивания промежуточных последовательностей кодирующие области должны быть инактивированы. Аналогичным образом, все кодирующие области, за исключением старт-кодона, могут быть делетированы, либо, альтернативно, сайт встраивания гетерологичной последовательности и проксимальные 3'-регуляторные последовательности (и необязательно дистальные 3'-фланкирующие последовательности) могут быть встроены непосредственно у старт-кодона со стороны 3'-конца. Кроме того, большая часть кодирующей области, расположенная до сайта встраивания гетеро-логичной последовательности и проксимальных 3'-регуляторных последовательностей (и необязательно дистальных 3'-фланкирующих последовательностей), может быть сохранена, в результате чего может быть продуцирован гибридный белок. И, наконец, могут быть использованы такие комбинации вышеупомянутых методов, с помощью которых кодирующие области тяжелой цепи ферритина могут быть частично делетированы и частично инактивированы путем встраивания промежуточных последовательностей. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения для уменьшения размера вектора инактивированные и нетранслируемые последовательности делетируют.
C. Сайт встраивания гетерологичной последовательности.
В высокоэкспрессирующем локусном векторе настоящего изобретения, ниже от проксимальных 5'-регуляторных последовательностей (в положении "даунстрим") находятся сайт встраивания гетероло-гичной последовательности, такой как полилинкерный сайт. Сайт встраивания гетерологичной последовательности может представлять собой любую последовательность, в которую может быть встроена ге-терологичная последовательность на достаточно регулируемом и предсказуемом уровне, необходимом для реально ожидаемого успешного продуцирования функциональных высокоэкспрессирующих локус-ных векторов. Сайты встраивания гетерологичной последовательности могут включать сайты для гомологичной рекомбинации, сайт-направленной интеграции (например, посредством транспозонов или вирусных конструкций) или опосредуемой эндонуклеазой рестрикции. Длина сайта встраивания может варьироваться от 4 п. н. (для использования рестриктирующих эндонуклеаз, разрезающих последовательность в четырех сайтах) до 1000 или 5000 п.н. (для использования в методах гомологичной рекомбинации). Однако в некоторых случаях 3'-конец проксимальных 5'-регуляторных последовательностей и 5'-конец проксимальных 3'-регуляторных последовательностей могут образовывать сайт встраивания, что позволяет избежать необходимости введения между ними дополнительных нуклеотидов. Так, например, по меньшей мере, последние два нуклеотида проксимальных 5'-регуляторных последовательностей и первые два нуклеотида проксимальных 3'-регуляторных последовательностей могут образовывать рест-рикционный сайт длиной 4 п.н., который может служить сайтом встраивания гетерологичных последовательностей. Альтернативно, для создания инсерционного сайта между этими последовательностями может потребоваться только один или несколько нуклеотидов. Так, например, длина инсерционного сайта может составлять 0, 1, 2 или 3 п.н., а также от 4 до 5000 п.н., как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления изобретения сайт встраивания гетерологичной последовательности будет включать одну или несколько нуклеотидных последовательностей либо на смысловой цепи, либо на антисмысловой цепи, которая(ые) служит(ат) в качестве рестрикционных сайтов для природных или искусственных эндонуклеаз. Эти рестрикционные сайты могут быть уникальными в данном векторе, а инсерционный сайт может представлять собой полилинкер, который включает множество таких рестрикционных сайтов, что расширяет возможности использования различных рестриктирующих эндонуклеаз. Пример такого полилинкера проиллюстрирован в примере 1 и на фиг. 3.
D. Проксимальные 3'-регуляторные последовательности.
В высокоэкспрессирующем локусном векторе настоящего изобретения, ниже от сайта встраивания гетерологичных последовательностей (в положении "даунстрим") находятся проксимальные 3'-регуля-торные последовательности. Эти последовательности, как минимум, включают сигнал полиаденилиро-вания. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности также включают кодон терминации транскрипции. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие последовательности могут включать кодон терминации трансляции или стоп-кодон, а в других вариантах изобретения стоп-кодон может быть включен во встроенную гетерологич-ную последовательность.
Проксимальные 3'-регуляторные последовательности могут происходить от гена тяжелой цепи фер-ритина, но это необязательно. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности локусного вектора могут включать последовательность, которая состоит, по меньшей мере, из 10-2000 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70100% идентична нуклеотидной последовательности, расположенной внутри проксимальных 3'-регуля-торных последовательностей локуса тяжелой цепи ферритина. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности могут включать, по меньшей мере, 10, 25, 50, 100, 500, 750, 1000 или 2000 нуклеотидов, которые, по меньшей мере, на 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны нуклеотидной последовательности, имеющейся в проксимальных 3'-регуляторных последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина. В других вариантах осуществления
- 9 -
008222
изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности будут состоять, в основном, из сигнала полиаденилирования, который может происходить от гена тяжелой цепи ферритина, гетерологичной последовательности или синтезированной или искусственной последовательности.
В других вариантах осуществления изобретения проксимальные 3'-регуляторные последовательности локусного вектора имеют более низкий процент идентичности с соответствующими последовательностями гена тяжелой цепи ферритина, а в некоторых вариантах проксимальные 3'-регуляторные последовательности могут не иметь сходства ни с одной из соответствующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина.
Е. Дистальные 3'-фланкирующие последовательности.
В высокоэкспрессирующем локусном векторе настоящего изобретения, за проксимальными 3'-регу-ляторными последовательностями в положении "даунстрим" находятся, но необязательно, дистальные 3'-фланкирующие последовательности. Эти дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут происходить от гена тяжелой цепи ферритина, но это необязательно. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 3'-фланкирующие последовательности локусного вектора могут включать последовательность, которая состоит, по меньшей мере, из 100-100000 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70-100% идентична нуклеотидной последовательности, расположенной внутри дис-тальных 3'-фланкирующих последовательностей локуса тяжелой цепи ферритина. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут включать, по меньшей мере, 100, 500, 750, 1000, 10000, 25000, 50000 или 100000 нуклеотидов, которые, по меньшей мере, на 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% идентичны нуклеотидной последовательности, имеющейся в дистальных 3'-фланкирующих последовательностях локуса тяжелой цепи ферритина. Как показано ниже в примерах, дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут включать 1000-10000, 2000-9000, 3000-8000 или 4000-7000 п.н. фланкирующих последовательностей.
В других вариантах осуществления изобретения дистальные 3'-фланкирующие последовательности локусного вектора имеют более низкий процент идентичности с соответствующими последовательностями гена тяжелой цепи ферритина, а в некоторых вариантах дистальные 3'-фланкирующие последовательности могут не иметь сходства ни с одной из соответствующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина.
Нижеследующие примеры иллюстрируют некоторые конкретные способы осуществления настоящего изобретения, которые не должны рассматриваться как ограничение объема заявленного изобретения. Аналогичные результаты могут быть также получены с применением альтернативных материалов и методов.
Пример 1. Создание вектора на основе локуса тяжелой цепи ферритина.
Для получения высокоэкспрессирующего вектора на основе локуса гена тяжелой цепи ферритина проводили три стадии конструирования: (1) клонирование гена тяжелой цепи ферритина с крупными 5'-и 3'-областями; (2) продуцирование экспрессирующего вектора на основе, по меньшей мере, одной из этих областей гена; и (3) оптимизацию вектора. Как указывалось выше, для продуцирования таких же или эквивалентных локусных векторов могут быть применены и многие другие способы.
Сначала область, содержащую экзоны тяжелой цепи ферритина от космиды 15А, субклонировали в вектор Litmus 38 (New England Biolabs) с получением плазмиды pFerX1 (фиг. 2). BamHI-XhoI-фрагмент выделяли из космиды 15А и лигировали в плазмиду Litmus 38, гидролизованную ферментами BamHI и SalI, с получением плазмиды pFerX1. Следует отметить, что космида 15А была лишь частично секвени-рована и что локализация некоторых из рестрикционных сайтов была определена путем рестрикционно-го картирования. Поэтому положения некоторых из этих рестрикционных сайтов могут быть неточными.
На фиг. 3 проиллюстрирована делеция фрагмента, содержащего экзоны 2, 3 и 4 от pFerX1, и инсер-ция полилинкера, содержащего рестрикционные AatII- и SalI-сайты с получением плазмиды pFerX2. Де-летированный HpaI-фрагмент простирается от HpaI-сайта в этой вставке до HpaI-сайта в векторе pFerX1. 5'-Конец полилинкера восстанавливает HpaI-сайт, а 3'-конец не восстанавливает этот сайт. Скрининг на ориентацию данного линкера проводили с помощью ПЦР.
Область, кодирующую экзон 1, делетировали из pFerX2, оставляя при этом инициирующий кодон ATG и следующую за ним интактную донорную последовательность сплайсинга, в результате чего получали плазмиду pFerX3. На фиг. 4 показано, что делеция области, кодирующей экзон 1, была осуществлена путем удаления BamHI-BspHI-фрагмента (2515-2719) и NcoI-BamHI-фрагмента (2830-2515) из pFerX2. BspHI и NcoI образуют совместимые выступающие концы, которые позволяют лигировать все полученные фрагменты вместе с получением pFerX3. В результате такой манипуляции в данном векторе экзон 1
BspHI
CCAGCCCCCATC ATG АСС АСС GCG ТСТ ССС TCG САА GTG CGC CAG AAC ТАС САС CAG GAC TCG GAG GCT
GGTCGGCGGTAG ТАС TGG TGG CGC AGA GGG AG С GTT САС GCG GTC TTG ATG GTG GTC CTG AGC CTC CGA
> Met Thr Thr Ala Ser Pro Ser Gin Val Arg Gin Asn Tyr His Gin Asp Ser Gl u Ala
Ncoi Донор сплайсинга
GCC АТС AAC CGC CAG АТС AAC CTG GAG TTG TAT GCC ТСС TAC GTC TAT CTG TCC ATG GTGAGTGCGGCCT CGG TAG TTG GCG GTC TAG TTG GAC CTC AAC ATA CGG AGG ATG CAG ATA GAC AGG TAC CACTCACGCCGGA > Ala He Asn Arg Gin lie Asn Leu Gl и Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met
- 10 -
008222
был заменен на экзон
Донор сплайсинга CCAGCCGCCATC ATG GTGAGTGCGGCCT GGTCGGCGGTAG ТАС CACTCACGCCGGA > Met
Делецию IRE экзона 1 осуществляли путем замены SacII-EagI-фрагмента (2575-2639) в pFerX3 на линкер, не содержащий IRE (но создающий 5' KpnI-сайт для скрининга), в результате чего получали плазмиду pFerX4. В результате такой манипуляции в данном векторе экзон 1 (IRE подчеркнут) Sacll (2575) Eagl (2639)
CAGAGTCGCaSCGGTTTCCTGCTTCAACAGTgCTTG
GTCTCAGCGGCGCCAAAGGACGAAGTTGTCACGAACTTGCCTTGGGCCACGAQCTGGGGAGGCTGGGGGCAQQCCGGCGAAACTCGG
был заменен на экзон (линкер обозначен жирным шрифтом)
Kpnl (2579)
Sacll (2575) Eagl (2611)
CAGAGTCGCCGCGGTACCGGTGCTCGACCCCTCCGACCCCCGTCCGGCCGCTTTGAGCC GTCTCAGCGGCGCCATGGCC ACGAGCTGGGG AGGCTGGGGGC AGGCCGGCGAAACTCGG
Продукт ПЦР-лигирования получали путем проведения трехстадийной процедуры с заменой экзо-нов 2-4 полилинкером, содержащим SwaI- и NotI-сайты, сохраняя при этом проксимальные 5'-регулятор-ные последовательности и проксимальные 3'-регуляторные последовательности гена тяжелой цепи фер-ритина. Как показано на фиг. 5(А), в первой ПЦР использовали космиду 15А (фиг. 2) в качестве матрицы. Положения для праймеров Fer1 и Fer4 показаны стрелками. Область "праймирования" для праймеров FN1 и FN2 также показана полосками. Во второй стадии, проиллюстрированной на фиг. 5(В), был продуцирован ПЦР-продукт Fer1-FN2. На этой фигуре показана локализация "праймирующей" области праймера Swa-2. В третьей стадии, проиллюстрированной на фиг. 5(С), был продуцирован ПЦР-продукт FN1-Fer4. На этой фигуре показана локализация "праймирующей" области праймера Swa-1. В четвертой, и конечной, стадии, проиллюстрированной на фиг. 5(D), был продуцирован конечный ПЦР-продукт ли-гирования с использованием продуктов Fer1-Swa-2 и Swa-1-Fer4 в качестве матриц, и праймеров Fer1 и Fer4. Из этого продукта был выделен HpaI-AatII-фрагмент для встраивания в HpaI- и AatII-сайты pFerX4 с получением плазмиды pFerX5 (см. фиг. 6). Реакции ПЦР-лигирования, используемые в первых трех стадиях генерирования SwaI-NotI-полилинкера, показаны в табл. 1.
Таблица 1
Матрица(ы)
5'-праймер
З'-праймер
Первая ПЦР
Космида 15А
Ferl
FN2
Космида 15А
FN1
Fer4
Вторая ПЦР
Fer 1 /ТШ-продукт
Ferl
Swa-2
FN 1 /Рег4-продукт
Swa-1
Fer4
Третья ПЦР
Ferl /Swa-2- и Swa-1/Рег4-продукты
Ferl или Fer3
Fer4
Ниже приводятся ПЦР-праймеры, где полилинкерная последовательность показана жирным шрифтом, а комплементарные последовательности между FN1 и FN2 или между Swa-1 и Swa-2 подчеркнуты.
Nhel Noll Aatll
PNl ACTTTCAGC T6CTACCGGCCGC6 С TGACGTCCCCAAGOCCAT
Notl Nhel
FN2 ACGTCAG CGCGGCCGCTAGCAG CTG A AAGTGGAAAGGGTAT
Swal Notl Aatll
Swa-1 CTTTCCATTTAAATCTGC TAGCGGCCGC TGACGTC
Swal
Swa-2 ТА G С A G ATTTAAATGGAAAGGGTATTTGTTATTGATC
- 11 -
008222
SwaI-сайт удаляли из векторного остова pFerX4 путем разрезания плазмиды ферментом SwaI с образованием тупых концов и встраиванием двухцепочечного олигонуклеотида
GGC6C6CC
CCGCGCGG
который содержит AscI-сайт, в результате чего получали плазмиду pFerX4.1. SwaI-сайт был удален из векторного остова для создания уникального SwaI-сайта в вышеуказанном полилинкере.
Векторные остовы плазмиды pFerX4.1 (в которой встраивание AscI-олигонуклеотида, показанного на фиг. 15, приводило к разрушению SwaI-сайта в вектором остове) и плазмиды pFerX5 (которая включала SwaI-сайт в указанном остове и полилинкер) заменяли с использованием SacII-AatII-фрагментов, в результате чего получали плазмиду pFerX5.1 (фиг. 7). pFerX5.1 содержала полилинкер, но не содержала SwaI-сайт в остове, что делало этот SwaI-сайт в полилинкере уникальным.
Полилинкер
Bglll BstBI CTGTGAGATCTGTTCGAATGG TGCAGACACTCTAGACAAGCTTACCAGCT
Aatlf Sail совместимый совместимый
встраивали в SalI-AatII-сайты pFerX5.1 с получением плазмиды pFerX6. Этот полилинкер включал BglII-и BstBI-сайты и был сконструировал для получения дистальных 3'-фланкирующих последовательностей гена тяжелой цепи ферритина.
Дистальные 3'-фланкирующие последовательности гена тяжелой цепи ферритина (AatII-BamHI-фрагмент от космиды 15 А) встраивали в AatII-BglII-сайты pFerX6 с получением плазмиды pFerX7 (фиг. 8).
Дистальные 5'-фланкирующие последовательности гена тяжелой цепи ферритина (BamHI-фрагмент от pFerH1, субклон космиды 15А, фиг. 2: BamHI 10269-15176) встраивали в BamHI-сайт pFerX7 с получением плазмиды pFerX8 (фиг. 9).
Ориджины репликации различных последовательностей, образующих pFerX8, показаны на фиг. 10. Остов Litmus 38 обозначен сплошным блоком. Эта плазмида содержит > 6 т.п.н. дистальных 5'-фланкиру-ющих последовательностей перед инициирующим кодоном ATG и ~7 т.п.н. дистальных 3'-фланкирую-щих последовательностей после стоп-кодона. Клонирующие SwaI- и NotI-сайты локализованы в положениях 10240 и 10254, соответственно. Кодирующие области, встроенные в SwaI- и NotI-сайты, должны быть затуплены по 5'-концу (SwaI-конец) и должны начинаться с нуклеотидов CAG, для регенерации акцептора сплайсинга, за которыми следует вторая аминокислота. NotI-сайт должен присутствовать у 3'-конца после стоп-кодона.
Дополнительный сегмент дистальных 5'-фланкирующих последовательностей (BspEI-фрагмент от космиды 15А) встраивали в BspEI-сайт (6037) плазмиды pFerX8 с получением плазмиды pFerX9 (фиг. 11; BspEI-фрагмент 6034-14211). Эта вставка присоединяет уникальный сегмент дистальной 5'-фланкирую-щей последовательности, а также создает копию сегмента дистальной 5'-фланкирующей последовательности, уже присутствующей в pFerX8 (область 10697-13990 аналогична области 2520-5813). Эта плазми-да не была полностью секвенирована, и локализацию некоторых рестрикционных сайтов определяли по размерам рестрикционных фрагментов.
Последовательность транскрибируемой области плазмид pFerX8 и pFerX9 показана на фиг. 12. На этой фигуре показан предполагаемый сайт инициации транскрипции. Интрон обозначен строчными буквами. Предполагаемый ТАТА-бокс и сигналы полиаденилирования подчеркнуты. Инициирующий кодон присутствует в первом экзоне, а введенный ген, начинающийся со второй аминокислоты, встроен в SwaI-и NotI-сайты.
Пример 2. Экспрессия гетерологичных последовательностей. А. Репортерный ген.
Репортерный ген встраивали в SwaI-NotI-сайты в полилинкер обеих плазмид pFerX8 и pFerX9. В качестве репортерного гена был выбран ген секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP), поскольку имеется коммерчески доступный набор для простого и быстрого анализа (Clontech, Palo Alto, CA) на данный продукт. Экспрессирующие векторы обозначали pFerX8SEAP и pFerX9SEAP.
Последовательность векторного полилинкера и исходная последовательность у 5'-конца экзона 2, которые необходимо восстановить для регенерирования донора сплайсинга, показаны на фиг. 5. Таким образом, для восстановления природного донора сплайсинга 5'-праймер должен включать CAG у 5'-кон-ца, за которым следует кодирующая область, начинающаяся со второй аминокислоты (ATG уже включен в экзон 1). 5'-Конец ПЦР-продукта должен оставаться затупленным для лигирования с SwaI-сайтом. Например:
Общий 5'-праймер:
CAG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN АА2 ААЗ АА4 АА5 АА6 АА7 АА8
- 12 -
008222
Пример праймера для SEAP:
CAG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG GGC
3'-Праймер должен включать NotI-сайт, за которым следует 3'-конец гена, включая стоп-кодон (противоположная нить). ПЦР-продукт должен быть гидролизован ферментом NotI для создания конца, совместимого с NotI-сайтом в полилинкере. Например: Общий 5'-праймер:
NNNN GCGGCCGC NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN Notl 3'-конец гена
сайт
Пример праймера для SEAP (стоп-кодон обозначен жирным шрифтом):
ТТТТ GCGGCCGC AGC ТСА TGT CTG CTC GAA GCG GCC
Лигирование ПЦР-продукта с вектором (гидролизованным ферментами SwaI и NotI) не приводило к восстановлению SwaI-сайта у 5'-конца вставки. Вместо этого, лигированный продукт содержит соответствующий акцептор сплайсинга у "SwaI-конца". Встроенная область также содержит кодирующую последовательность, начиная со второй аминокислоты до стоп-кодона, за которым следует NotI-сайт у 3'-конца. Например:
Общая последовательность после лигирования:
ССАТТТ CAG NNN NNN NNN // NNN NNN NNN GCGGCCGC TGACGT
Пример для SEAP:
ССАТТТ CAG CTG CTG CTG // CAG АСА TGA GCGGCCGC TGACGT
В. Трансфекция.
В качестве хозяина для трансфекции использовали клеточную линию СНО DG44(E) (Urlaub et al. (1986), Somatic Cell Mol. Gen. 12:555-566), которая была выбрана для культивирования и была способна выживать в бессывороточной среде. Эта клеточная линия поддерживалась в центрифужной колбе в бессывороточной среде с добавленными нуклеозидами. Клетки, используемые для трансфекции, обнаруживали экспоненциальный рост. Для каждой трансфекции использовали либо 2х106, либо 5х106 клеток.
Репортерные плазмиды котрансфицировали плазмидой, обозначенной pSI-DHFR.2 и кодирующей дигидрофолат-редуктазу (DHFR), для отбора стабильных трансфектантов в DHFR-хозяине.
Плазмида pSI-DHFR.2 включала селективный маркер и ген dhfr, регулируемый промотором SV40 с делетированным энхансером SV40 (фиг. 13).
Все ДНК поставлялась в наборе Megaprep (Qiagen, Valencia СА). Перед трансфекцией ДНК осаждали EtOH, промывали 70%-ным EtOH, сушили, ресуспендировали в HEBS (20 мМ Hepes, pH 7,05, 137 мМ NaCl, 5 мМ KQ, 0,7 мМ Na2HPO4, 6 мМ декстрозы) и количественно оценивали. В качестве позитивного контроля использовали плазмиду, экспрессирующую SEAP с ранним промотором/энхансером SV40 (pSEAP2, Clontech, Palo Alto, CA). Негативный контроль включал "пустой" вектор pUC18 (ATCC #37253, Американская коллекция типовых культур, Manassas, VA), используемый в качестве репортерного контроля, а трансфекционный контроль не был трансфицирован ДНК.
Каждая смесь для трансфекции содержала 50 мкг репортерной плазмиды и 5 мкг pSI-DHFR.2. Были отобраны плазмиды, имеющие равную массу, а не эквимолярное количество. Если принять во внимание молярность, то контрольные репортеры отличались от тест-репортеров примерно в 3-5 раз (табл. 3). В каждом случае тест-репортер имел меньшее количество, чем контроль.
Таблица 3
Репортерная плазмида (50 мкг каждой)
Размер плазмиды (т.п.н.)
Молярное отношение к контролю
DHFR (5 мкг каждой)
Репортерный ген
pSEAP2
5,1
pSIDHFR.2
SEAP
pFerX8SEAP
18,9
0,27
pSIDHFR.2
SEAP
pFerX9SEAP
26,6
0,19
pSIDHFR.2
SEAP
pUC18
2,7
pSIDHFR.2
нет
ДНК отсутствует
ДНК отсутствует
нет
Клетки и ДНК трансфицировали путем электропорации в 0,8 мл HEBS с использованием кюветы по 0,4 см (BioRad, Hercules, CA) при 0,28 кВ и 950 мкФ. После подачи импульса путем электропорации
- 13 -
008222
клетки оставляли в кювете на 5-10 мин при комнатной температуре для инкубирования. Затем клетки переносили в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл среды альфа-MEM с добавленными нуклео-зидами (GIBCO, Gaithersburg, MD) и 10% dFBS (HyClone, Logan, UT), и осаждали центрифугированием при 1000 (1 тыс.) об/мин в течение 5 мин. Ресуспендированный осадок высевали в Т-колбы в среде альфа-MEM, содержащей 10% dFBS, но не содержащей нуклеозидов, и инкубировали при 36°С с 5% СО2 в инкубаторе с повышенной влажностью до образования колоний.
В табл. 4 систематизированы результаты семи экспериментов. Каждую из трансфекций 1-3 проводили 3 раза, а каждую из трансфекций 4-7 проводили 1 раз.
Таблица 4
Эксперимент №
Репортерная плазмида (50 мкг каждой)
DHFR (5 мкг каждой)
Репортерный ген
pSEAP2
pSIDHFR.2
SEAP
pFerX8SEAP
pSIDHFR.2
SEAP
pFerX9SEAP
pSIDHFR.2
SEAP
pFerX8
pSIDHFR.2
нет
pFerX9
pSIDHFR.2
нет
pUC18
pSIDHFR.2
нет
ДНК отсутствует
ДНК отсутствует
нет
C. Эффективность трансфекции.
Примерно через 2 недели после трансфекции образовывались колонии. Стабильные трансфектанты анализировали либо в виде пулов, либо в виде изолятов. Хотя все pSI-DHFR.2-содержащие трансфектан-ты продуцировали колонии, однако, трансфектанты, содержащие векторы на основе локуса тяжелой цепи ферритина, продуцировали меньшее число колоний, чем контроль. Полученные результаты не зависели от экспрессии продукта локусным вектором. Эти результаты были неожиданными, поскольку при каждой трансфекции использовали одинаковое количество ДНК. Из-за такого различия в эффективности трансфекции множество процедур по трансфекции рекомендуется проводить с учетом снижения числа трансфектантов.
D. Анализ на SEAP.
Репортерные конструкции, содержащие ген SEAP, анализировали с использованием репортерной системы Great EscAPe(tm) SEAP Reporter System 3 (Clontech, Palo Alto, CA). В этом анализе использовали флуоресцентнный субстрат для детекции активности SEAP в кондиционированных средах. При этом использовали набор в 96-луночном формате в соответствии с инструкциями производителей за некоторыми исключениями, указанными ниже. Все стандарты и образцы разводили в свежей среде, а не в буфере для разведения, имеющемся в наборе. Вместо проведения одного считывания через 60 мин, проводили множество процедур считывания через интервалы в 10-20 мин, а активность SEAP выражали в относительных флуоресцентных единицах в минуту (ОФЕ/мин). Эмиссионный фильтр, подходящий для считывания на планшет-ридере Cytofluor II, был установлен на длину волны 449 нм, вместо рекомендованной длины волны 460 нм.
Все данные для пулов и изолятов, описанных ниже, были получены на основе репортерных конструкций, экспрессирующих SEAP. Зарегистрированные титры были получены, исходя из позитивного контроля, имеющегося в наборе. Хотя абсолютные величины не были определены, однако, могут быть также использованы и относительные величины титров.
Удельную продуктивность оценивали в анализах, где среду заменяли свежей средой, а затем через 24 ч брали образцы среды и подсчитывали клетки. По окончании 24-часового анализа титр продукта нормализовали по числу клеток. Поскольку титры были относительными, то удельную продуктивность выражали в относительных величинах.
Удельная _ титр продукта (/мл) х объем (мл) продуктивность время (дни) х # клеток
E. Пулы трансфектантов.
После появления колоний клетки от каждой трансфекции собирали и объединяли в пул. Пулы высевали в 6-луночные планшеты или Т-колбы и выдерживали при субконфлюентности в течение всего 24-часового анализа. Результаты анализов этих пулов представлены на фиг. 14. Для каждой конструкции
- 14 -
008222
анализировали пять пулов, из которых два были получены в эксперименте 1 (1 А и 1 В), а три - в эксперименте 2 (2А, 2В и 2С). Все анализы проводили через 3-4 недели после трансфекции. При этом следует отметить, что эксперимент 2С с pFerX8SEAP давал очень низкую эффективность трансфекции по сравнению с другими трансфектантами.
Удельная продуктивность явно соответствовала контролю (pSEAP2), но сильно отличалась для векторов pFerX8SEAP и pFerX9SEAP. Следует отметить, что ферритинсодержащие векторы были способны продуцировать пулы с более высокой удельной продуктивностью, чем контроль.
F. Изоляты трансфектантов.
Изоляты получали путем "сбора" колоний от трансфектантов эксперимента № 2. "Сбор" осуществляли путем аспирации пипетками по 50 мкл Р200 Pipetman, помещенными непосредственно над колонией. Собранные путем аспирации колонии сначала переносили в 48-луночный планшет, а затем в 6-луночный планшет с достаточным количеством клеток. Удельную продуктивность оценивали в 6-луночных планшетах при клеточной плотности от почти сливающихся клеток до полностью сливающихся клеток с использованием 24-часового анализа, описанного выше. Для каждой конструкции анализировали 40-50 изолятов. Результаты проиллюстрированы на фиг. 15, где эти изоляты представлены в порядке их специфической продуктивности для каждой SEAP-экспрессирующей конструкции. Для всех панелей, представленных для сравнения, использовали одну и ту же шкалу оценок удельной продуктивности.
Большинство изолятов (63%) от трансфектантов pSEAP2 не экспрессировали продукт на уровне, превышающем предел детекции. В этом эксперименте самая высокая продуктивность, которую давала pSEAP2, составляла 46 единиц на клетку в день (относительная величина для сравнения). В отличие от этого, лишь 28% изолятов от трансфектантов pFerX8SEAP экспрессировали продукт на уровне ниже предела детекции, а 44% изолятов имели продуктивность, превышающую самую высокую продуктивность трансфектантов pSEAP2. В этом эксперименте самая высокая продуктивность, которую давала pFerX8SEAP, составляла 259 единиц на клетку в день, и эта продуктивность более чем в 5 раз превышала самую высокую продуктивность pSEAP2. Хотя конструкция pFerX9SEAP по сравнению с pSEAP2 была усовершенствована, однако, она не давала такого же результата, как pFerX8SEAP.
Пример 3. Уменьшение размера вектора.
Для уменьшения размера вектора, то есть для удобства его использования, 5'- и/или 3'-области этого вектора были делетированы (табл. 5). Тест на эти делеции проводили так же, как и тест перед использованием SEAP в качестве репортера. Было протестировано приблизительно 30 изолятов, взятых от каждой из плазмид, указанных в табл. 5, а также от контроля, pSEAP2 и pUC18 (10 изолятов).
Таблица5
Плазмида
Делегированная область
5'-конец делеции*
3'-конец делеции*
Размер плазмиды (п.н.)**
pFerX8SEAP
отсутствует
19340
pFerXlOSEAP
2513
7414
14439
pFerXHSEAP
13727
17636
15431
pFerX12SEAP
2513
7414
8042
12704
19101
* Делеции в конечных точках были сделаны, исходя из нумерации последовательности pFerX8. ** Ген SEAP состоял из 1557 п.н. плазмиды.
Вектор pFerX11SEAP давал такой же результат, как и вектор pFerX8SEAP, что указывало на то, что делеция ~3,9 т.п.н. в 3'-области, указанная в табл. 5, не давала какого-либо негативного эффекта. Векторы pFerX10SEAP и pFerX12SEAP не давали такого же результата, как pFerX8SEAP, что указывало на то, что делеция ~4,9 т.п.н. в 5'-области, указанная в табл. 5, оказывала негативное влияние на функцию векторов.
Эквиваленты
Хотя настоящее изобретение было конкретно проиллюстрировано и описано со ссылками на некоторые конкретные варианты его осуществления, однако, для каждого специалиста очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения, касающиеся формы и деталей его осуществления, но не выходящие за рамки существа и объема изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения. Многие варианты настоящего изобретения, эквивалентные конкретным описанным здесь вариантам, могут быть очевидны для каждого специалиста, либо они могут быть установлены всего лишь рутинным экспериментированием. При этом подразумевается, что такие эквиваленты входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
- 15 -
008222
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотиче-ских клетках, включающий:
(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;
(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;
(c) по меньшей мере, первый сайт встраивания первой гетерологичной кодирующей последовательности и
(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;
где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)--(d) в ориентации 5'-3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательно -стями; и
где
(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклео-тидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или
(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклео-тидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
2. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотиче-ских клетках, включающий:
(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;
(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;
(c) по меньшей мере, первую гетерологичную последовательность, кодирующую указанный нужный белок; и
(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;
где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)- (d) в ориентации 5'- 3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и
где
(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 100 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклео-тидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или
(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и которая, по меньшей мере, на 70% идентична нуклео-тидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
3. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.
4. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.
5. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности и указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.
6. Генетический вектор по любому из пп.1-5, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.
7. Генетический вектор по любому из пп.1-6, который дополнительно содержит дистальные 3'-фланкирующие последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
8. Генетический вектор по любому из пп.1 и 3-7, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности включает по меньшей мере один рестриктционный сайт эндонуклеазы.
9. Генетический вектор по п.8, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности представляет собой полилинкерный сайт, включающий по меньшей мере два рестриктционных сайта эндонуклеазы.
10. Генетический вектор по любому из пп.1-9, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают эукариотическую интронную последовательность.
11. Генетический вектор по п.10, где указанная эукариотическая интронная последовательность происходит от интрона 1 гена тяжелой цепи ферритина.
- 16 -
008222
12. Генетический вектор по любому из пп.1-11, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают нетранслируемые экзонные последовательности.
13. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности и указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.
14. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности и любые дистальные 3'-фланкирующие последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.
15. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.
16. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.
17. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет 100% идентичность указанной нуклеотид-ной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.
18. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.
19. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.
20. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
21. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
22. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
23. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи феррити-на.
24. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферри-тина.
25. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 0, 1, 2 или 3 нуклеотида.
26. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 4 нук-леотида.
27. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 1000 нуклеотидов.
28. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 5000 нуклеотидов.
29. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотид
- 17 -
008222
ной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.
30. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотид-ной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.
31. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотид-ной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.
32. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.
33. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 10 нуклеотидов.
34. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 1000 нуклеотидов.
35. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат сигнал полиаденилирования.
36. Генетический вектор по любому из пп.1-2, дополнительно содержащий дистальную 3'-фланкирующую последовательность эукариотического локуса, включающую последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотид-ной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
37. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
38. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
39. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
40. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
41. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.
42. Генетический вектор pFerX8.
43. Генетический вектор pFerX11.
44. Эукариотическая клетка, трансфицированная вектором по любому из пп.1-43.
45. Эукариотическая клетка по п.44, где указанный вектор устойчиво интегрирован в хромосому указанной клетки.
46. Эукариотическая клетка по любому из пп.44-45, где указанная первая кодирующая последовательность экспрессируется в указанной клетке.
47. Эукариотическая клетка, содержащая:
(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;
(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;
(c) по меньшей мере, первую кодирующую последовательность; и
(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;
где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)- (d) в ориентации 5'- 3' посредством необязательных линкерных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями; и
где
(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% иден
- 18 -
008222
тична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или
(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п. н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.
48. Эукариотическая клетка, содержащая экзогенную дистальную 5'-фланкирующую последовательность, происходящую от локуса тяжелой цепи ферритина и функционально присоединенную к кодирующей последовательности.
49. Способ продуцирования нужного белка в эукариотической клетке, предусматривающий:
(a) продуцирование по меньшей мере одной клетки по любому из пп.44-48 или ее потомства;
(b) поддержание указанной клетки в культуре в условиях, обеспечивающих высокий уровень экспрессии нужного белка; и
(c) выделение указанного нужного белка из указанной культуры.
А. Экзон 1
Beat BseRI Std E*ri
ксстсхшдоссскяеАвссосстсхсалтскхсхспясстсссод
EMI BSSMECOM BamM Sad САттосссссАссасссстеАсаСАасАтссстстАТАААСтоаюсссестоотсс^ iccioc 11 CAACAUTUCIIUA
ст1идса8ССтсосссс8"ягесотсстАОо(1ССАт"тттс*ссссо^
Baal Ban. BsMKAl PahAI Eaot BpulOI ВмЯ
лсое^ссоехтастсадемстесвАСссссстссавасо^^
TeCCITG9G?CACSA?CT;"CHiAS3CTaSSttH:j^sXGGCGAAACT^
On*
BspHl DmCt Bpml Mod
ATCATCACCACCGC6rrCTCCCTCCCAA0TCC"CCAGAACTACCACCAGCAC^ TAGTACTeGTGGCGCAGAGeeAGCGTTCACCCCCTCTTCATCGTGCTCCTCAGCCTCra
* we 1 Ti*i Tin A i яде Г Pi uGct Gt itVi J Ai yQ? iiAiijTy i rii aGi iiA> p5ci Qi uA i *A i я i i KA &IIAI yGi ii i i CAANUEUG* ut-ciiTy i Al "3wi Ту i Ve i Ту I UCUOC!
S^ < Add
ATGCTOAeTGCSeCCTaSCCTTTGCGeeGGCaaAAASAGCSTGCGCCCTTOCCT^ TACCACTCACGCCeGACCGGAAACeCCCCCGCCTTTCTCCCACeCeeSACCGGAGCaAACCC^
"Mtl
В. Экзон 2
Eco571 Bspf
GCATCTGCCTTGCTGTeeGOATCAATAAOUUWACCCTTTCCACTTTraCT^^
COTACACCGRACOACACCCCTAGTTATTCTTTATCCCAAAgCTGAAAGTCACAACAATAAAACTCCCCCTACTACACCCGCALI 1С1ТЦАААСССТТТАТСАААСАССТА6ТТАСА
r Sar CysTyr RieAspAl aAspAtpVal Al alMlLysAsnPtwAf aLysTyr PhaUaHl S <9 nSaf Ml
ем Nsft Ps* Bsea SM team Acd
CATGAACAGAGGGAACATCCTGAQAAACTaATeAACCTeCASAACCAOCGAGGTCGACCM eTACTTCTCTCCCTTGTACGACTCTTTCACTAmCGACGTCTTGGTCOCTC^ > HsGlueiuAr jOiuHlsAI"GI ulysLauMttLysLauGI ПА.ЫЭnAr gGI yGI yAr g11 "PheL"uO)nAapl I aLys
С Экзоны 3 и 4-
Ps" AM Bmft BsfH BmlBaa ApaU
CTCTCAGATCAATTCACATCSTTTCTTTCATTCIiCAAAICTakCICTGATGACTG^
GACGTCTACTTAACTCTACAAftQAAACTAAGTCTTTGGACrGOCACTACTtSACCCTCTCQCCCOACTTACOTTACTCCACACCT
> LyiPr oAipAr gAapAapTr pGluSer <3I yLauAsnAlaMMAr gCysAI aLcuHl a LeuGI vlytSer ValAsnGI nSer PmB Опт
CTACTeGAACTTCACAAACTGGCTACTeACAAGAATeATCCCCACOTGAGTATCAG
бАТбАССТтаматетпоасссАтшстаттсттАСТАаеаатосАСТСАТлетстттотассс^ > LtuL.uGI uLcuHi aLyalewAt iThr AtplysAsnAspPr oHI s
BsaO 8> pM Xcna Bnal BsCI Pm"
СТОТСССАТОТТ1ГГСТТТССТ*ОТТАТвТвАСТТСАТТОА"С6САТТАССТ6ААТСЛ^ GAO6e6TACaAaAGAAAGSATCAATACACTa"A6TAACTCT0COTAAT6GACTTACT^
> lauO/aAapPiia 11 eGl "Т1м MsTyr UuAsnGI uGl aVaIlysSar 11 alysO oLetKayAspHU Val Thr AaalatiAr gLyaafe IG Ban* Mat ЩЛ Aaa) Sajal Bat
GAGCCCCTCAATCTCGCATGeCAGAATATCTCTTTGACAAGCACAOCCTCGGACAOMTeA
CTCCGeeACTTAGACCGTACCeTCTTATAGAGAAACTGTTCQT6TGGGACCCTGTecCACTACTCTCGATTCGACTGCACCC3TTCCG^
M yAl aPf ов MS"" Gl уМе 1ЛI a6l "Tyr leoFlMAaplysM a Thr LauGI у HI ad yAapGI uSar • • ¦ PpulOl
Ma* Xapi EcoT22f АрЫ Kpnl
SpM Actl Banl
САвТССДТбСАТеТСАбеСТСССМТДТСТТТТСТАТААСТТОСАеСААА*"^ СТСАССТАССТАСА0ТССв*СаалААТАе)ААААбАТАТТСА"ССТ6вИ"вТ^^
Sspl
CrraTTGTa*TTGASCATGACCeCACCAGCTTCCCTTGCCTCBOCTATA7AACCACACTOCAA <^ С^СААСАСТААСТССТАСТагеСТССТСОААСОШШЯСАаССОАТАТАТТССТСТ^
DseDI Slyl
Dual BspMI Ncoi Xmnl Snt
C &GGTGTeTTCAGACAeeACTAAGCAGTCCTGGTTCTGAGTTACCTGCCAGACTOCCATGGeAACATATTCTTGAeTGTC GTCCACACAAGTCTCTCCTGATTCGTCAGGACCAAGACTCAATeCACeCTCTGACGGTACCCTTGTATAAOAACTCACAG
Фиг. 1
- 19 -
008222
НраЦЗЮ6)
Фиг. 2
Aatll (4702)
Фиг. 3
- 20 -
008222
¦ Делеции IRE путем
I замены Saell/Eagl-фрагмента
I линкером
Фиг. 4
- 21 -
008222
Ferl
АТС ТОТ CCA ТС GTOAGTgCaCCCTGGCIT TTCQCGOGGCCGAAAG -*~
CJTGGGTTGG CrGCCGTGGCAAeTCTOAGCACCTAGCGCTTIOTGGCTCCT^^
reTCAOCCTCTCCAATCAACCCTGCAGTTAGCTGCATTTTCCrrGC^
СЛ TCCAQCTCCAUTTCCTCTGACTATGOC6CCTCTGCTT"rrCATGGTGTGGAA^
AAC^ACTCTAACCACrrTCTGAAGCAGCGGCCTCTACATCTCrTGCTTATCAC^
CrGTAATCACCCTGACCTTGCCAAGGCATCTAGAGTACTGTACGl' I'T'f'l'AATTTTTATTTTGCACCAGl i Q11Ш- T1ACTAACAGAAGTAGTAGGT AACATACiTbTlGGAAAAAGCCCaCCGTrCOGAAAAAACCATTATCGTGGAATA
Hpat
CAATGTATTTGTGCTAAAATACAATGCCCTCAGTTCTTAACCAGCTAATCAGCAGTTGGCTGTCT Г "TTTTTTATTTAAC^TGATTGTTGAAGGAGAGAATTGACCTCCCAATGTAGGGCACTTT
Экзон 2
TAGGGTOACAAACAQO-H lACCACCATTGCATCTGCCrrTGCTGTGGGGATCAATAACAAATACCC'l'l i'CCACTHCAG TCT TGT TAT TTT
•I > Car Cy" Tyr Phe
GAC Свв GAT GAT GTG GCC CTG AAG AAC TTT GCC AAA TAC TTT CTC CAT CAA TCT CAT GAA GAG AGO GAA CAT
> Asp Aig Asp Asp Vat Ala Leu Ly" Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gin Ser His 61 и Glu Arg Glu His
CCT GAG AAA CTG ATG AAG CTG CAG AAC CAG CGA GOT GGA CGA АТС TTC CTG CAG GAT АТС AAG GTAAGTAGACTA
Mia Glu Lys Leu Met Lys Leu Gin Asn Gin Arg Gly Gly Arg lie Pne Leu an Asp lie Lys
мтшымттянкюппгмюгтшнт Экзон 3
TTTCTTTGATTCAG AAA CCT GAC CGT GAT GAC TGG GAG AGC GGG CTG AAT OCA ATG AGG TGT GCA CTG CAC TTG
> Lys Pro Asp Arg Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Arg Cy" Ala Leu His Leu
GAA AAG ACT GTG AAT CAG TCA СТА CTG GAA CTT CAC AAA CTG GCT ACT GAC AAG AAT GAT CCC САС вТвАОТАТ
Xllg Lys Ser val Asn Gin Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His
Экзон4
CAGAAACACGGGGTGAGTGGACATGATTTGCCACAGGGCTTGGGAOAGCTGACCAGTAACCCTGTCCCATGT TCI СITICC TAG ТТЛ TGT GAC
> Leu Oys Asp
TTC ATT GAG ACG CAT TAC CTG AAT GAG CAG GTG AAA TCC ATT AAA GAA СТО GOT GAC CAC GTG ACC AAC TTA
> Phe lie Glu Thr His Tyr Leu Asn Gtu Gin Val Lys Ser Me Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu
CGC AAG ATG GGA GCC CCT GAA TCT GGC ATG GCA GAA TAT CTC TTT GAC AAG CAC ACC CTG GGA CAC OGT GAT
"Arg Lys Mel Gly Ala Pro Glu Ser Gly Met Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu ay His ay Asp АКЯ(541в)
GAG AGC TAA CCTGACGTCCCCAAGGeCATGTCACTTTACTGGTCACTGAGGCAGTOCATG "Glu Ser ••• ---"-•
Pert
CCACCAAAACATCTGCTTAAAAOr ГС11 lAATTTGTACCATTTCTTCAAATAAAGAATTTTOGTACCCAQCTCTXGTTUTGATTQ
Fori
АТС TOT CCA TO OTOACaGCGWCTGOCCTTT00C00CCC(WAAA6AGG0TOC004CTGGCCT
TGGGTTGGGXXCTGOCCTGCTGCGGGCTTCCCCGCCTTC^
GCCGTGGCAAGTCTGAGCACCTAGCOCTTTGTGGCTCCnrcCATAGACCAGGCACGTCATAACACCC CAGCTCCAGTTCCTCTGACTATG43CGOGTCTGCTTGGTCATGGTOT
ACTCTAACCACTTCTGAAGCAGCGGCCTCTACATCTCTGCTTATCACAGAGCCTCA(!TTGCATTGAAA
TCACCCTGACCTTGCCAAGG <^TCTAGAGTACTGTACGTTTTTAAT^
TTGTTGGAAAAAGCCCACGGTTGX^AAAAAACCATTATCCTGGAA(tm)
Hpei
TTCTGCTAAAATACAATGreCTCACTTCTTAACCAGOTAATCAGCAG III IT 1'IA
TTTAACATQATTGTTGAJVGGUMSAGAATTGACCTCCCAATGTAGG^CACTTTA
TTTTCTCTGCACTAATGTGGAGCCATAGAACCCTTGATAAAGCCAAGTCCCAAG1 Tl'^T'ITTCCCATCCTTACTTTAAAGGCCAAGTAGGGTGACAA
Swe-2 Notl FN2
ACAGCCTTTACCACCATTGCATCTGCCTTGCTGTGGGGATCAATAACAAATACCCTTTCCACTTTCAGC^
^-,-
Фиг. 5А
- 22 -
008222
FNl Swa-1 No" Aatll
ACTTTCAGCTGCTAGXXX^CacGCTOACGTCCCCAAGGCCATGTr^
-ft*.
Fert
TCTATAAGTTGCACCAAAACATCTGCTTAAAAGriCTTTAAT^
Feci
АТС ТвТ CCA TO eTGAGTeCGCCCTGeCCTTTeGCGGGGCC^AAAGAG^GTGCGGCC^
TGGGTTGGreCQTQQCCTG4rrGCGGGCTTCCCCQCCTTCCA GCCt7TGGCJU\GTCTeftG?ACCTAGCGCTTTGTGeCTCCTGC^
CAGCCTCTCCAATCaACCCrTGCAGlTAGOTGCATTTTCCTGCACTCTCGTCCCCTC
CAGCTCXAGTTCCTCTGACTATGGCGGGTCTaCTTGCTCATCQTr3TGGA^
ACTCTAACCACTTCTGAAeCAGCGGCCTCTACATCTCTOOT
TCACCCTGACCTTGCCAAGGCATCTAGACTACTGTAOnTTTTA^
TTGTTGXHUUUUkGCCCACGGTTGXKAAAAAACCATTATCCTGGAATA
Hpal
TTGTOCTAAAATACAATGCCCTCAOl 1CT IAACCAGOTAATCAGCJU3TTaiCTGTCTAGMrTGAAAACCTT <5AGACCTTG^GTTAACCAT 111 Tl I1A
TTTAACATGATTGTT6AAGGjuAGAArrGACCTCX:C^
TTTTCTCTgCACTAATCTCGAGCCATAGAACCC^
Swa-1 Swal Swa-2 Noa АаМ
ACAGCCTTnCUCCATTGCATCTGTCTTGCTG14"GGATCAATAACAU
CATGTGACTTTTACTGCTCACTGAGGCAGTG^TGaATGTCAGGCTGCCTTTAT^
Pert
ATTTGTACCATTTCTTCAAATAAAGAATTTTGCTACCCAGCTCTTGTTGTOATTG
~+-
Фиг. 5В
- 23 -
008222
Фиг. 7
хмекэц
Фиг. 8
- 24 -
008222
- 25 -
008222
SaH(13990)
Фиг. 11
Sacll
BamHI (9469) CAP (9521) Kpni(9533)
GGATCCCGCTATAAAGTGCGGCCCGCTGGTCCCT^^
ACCCCTTCCGACCCCCGTCCGGCCGCTTT^
CeCGCCTCGCCCAGCCGCCATC ATG gtgagtgcggcctggcctttggcggggcggaaagagggtgcggcctggcct > Met
cccttgggccacttggtgagctggcggagggtgggttggggcgtggcctgctgcgggcttccccgccttccagcgccc ttctggaaaatggagtttgtccggggttctttccaaaggcaggcagccctgccgtggcaagtctgagcacctagcgct ttgtggctcctgcatagaccaggcacgtcataacacccgtgttttgaagccttagggctgtacaactgtcagcctctc caatcaaccctgcagttaggtgcattttcctgcactctcgtcccctccggtcacatggcctgcaggcttctctgtttg ggtgtacatccagctccagttcctctgactatggcgggtctgcttggtcatggtgtggaatggcagccctggggcttg gtacaaagaggcttatctcttgtgaacttactctaaccacttctgaagcagcggcctctacatctctgcttatcacag agcctcacttgcattgaaacttatcgctaggaatctccccttctgtaatcaccctgaccttgccaaggcatctagagt actgtacgtttttaattttcattttgcaccagttgttgcttactaacagaagtagtaggtaacatacttgttggaaaa agcccacggttgggaaaaaaccattatcgtggaatacaaatacactgagtgcctaaaactgaaaatcaaagcttctcc caatgtatttgtgctaaaatacaatgccctcagttcttaaccaggtaatcagcagttggctgtctagctgaaaacctt gagaccttgtgttaaccattttttttatttaacatgattgttgaaggagagaattgacctcccaatgtagggcacttt agcaccccccctctcagacaaatagatatggccttggcttaaagttttttctctgcaccaatgtggagccatagaacc cttgataaagccaagtcccaagtttgttttcccatccttactttaaaggccaagtagggtgacaaacagcctctacca
Aatll (10785)
Swal <10762) Notl (10776) ccattgcatctgocttgctgtggggatcaataacaaataccctttccatttAAATCTGCTAGCGGCCGCTGACGTCCC
CAAGGCCATGTGACTTTACTGGTCACTGAGGGAGTGCATGC
КрЫ (10927)
AAAACATCTGCTTTAAAAGTT'CTTTAATTTGTACQATTTCTTCAAATAAAGAATT TGAGGATGAGCGCACCAGCTTCCCTTGCeTCGGCTATACTAACCACACTGCA
Фиг. 12
Фиг. 13
- 26 -
008222
? Относительная специфическая продуктивность о пулов трансфектантов
эдукти
л S
кая inpi
5 I
ричес!
5 г
1ьная специс
¦ 1
эсител э г
¦ ¦--¦ 1 _
1 . ¦!¦
н < ? Я 8 8 < ? S Я 8 " ? S 8 8 DSEAP2 pFerXBSEAP pFerX9SEAP
Фиг. 14
pSEAP2
300-
ОСП
200 -
Iflfi
^ ^° ? !? ? SI S S 5 П 5 § !?
Ранговый порядок
pFerXDSEAP
Ранговый порядок
1 300
pFerX9SEAP
Относительная специфи1 продуктивность
о 8 8 8 I i
---
Ранговый порядок
Фиг. 15
- 27 -
008222
Список последовательностей
- 28 -
008222
- 29 -
008222
- 30 -
008222
Asp Glu Ser * 95
aggcagtgca tgcatgtcag gctgccttta tcttttctat aagttgcacc aaaacatctg cttaaaagtt ctttaatttg taccatttct tcaaataaag aattttggta cccagctctt gttgtgattg aggatgagcg caccagcttc ccttgcgtcg gctatataac cacactgcaa cgcctgaaag aatatttatt aaactcgtag ttggggaaag atagtgaaag acaggtgtgt tcagacagga ctaagcagtc ctggttctga gttacctgcc agactgccat gggaacatat tcttgagtgt с
<210> 8 <211> 42 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 8
Lys Pro Asp Arg Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Arg Cys 15 10 15
Ala Leu His Leu Glu Lys Ser Val Asn Gin Ser Leu Leu Glu Leu His 20 25 30
Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 35 40
<210> 9 <211> 53 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 9
Leu Cys Asp Phe lie Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gin Val Lys Ser 15 10 15
lie Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 20 25 30
Pro Glu Ser Gly Met Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly 35 40 45
His Gly Asp Glu Ser 50
<210> 10 <211> 764 <212> ДНК
<213> Rattus norvegicus
<400> 10
gacactcaag
gtcctgtctg
tctttcaggc
tcaatcacaa
gaacttttaa
atgcactgcc
atcaccgtgt
tcccatcttg
attcaggtaa
actggtcagc
ctcacgtggg
acactctttt
aatatgttcc aacacacctg gttgcagtgt caagagctgg gcagatgttt tcagtgagcc cccagggtgt cgtaagttgg tgcgtctcaa tctcccaagc gatcattctt ccaagtgcag catggcagtc tctttcacta ggttatatag gtaccaaaat tggtgcaact agtaaagtca gcttgtcaaa tcacgtggtc tgaagtcaca cctgtggcaa gtcagtagcc tgcacacctc tggcaggtaa tctttcccca ccgacgcaag tctttatttg tatagaaaag catggccttg gagatattct acccagttct taactaggaa atcatctcca agtttgtgaa attgcattca ctcagaacca actacgagtt ggaagctggt aagaaatggt ataaaggcag gggacgtcag gccatgccag ttaatggatt agagaacatg ctcaccccgt gttccagtag gcccgctctc ggactgctta taataaatat gcgctcatcc acaaattaaa cctgacatgc cttagctctc attcaggggc tcacctgctc ggacagggtt gtttctgata tgactgattc ccagtcatca
- 31 -
008222
cggtcaggtt tctgaatcaa agaaacatgt caattcatct gcag 764
<210> 11 <211> 2045 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность <221> CDS
<222> (1132)...(1279) <221> CDS
<222> (1495)...(1622) <221> CDS
<222> (1715)...(1873)
<221> misc_feature <222> (1)...(2045) <223> n = A, T, С или G
<400> 11
atctgtccat ggtgagtgcg gcctggcctt tggcggggcg gaaagagggt gcggcctggc 60
ctcccttggg ccacttggtg agctggcgga gggtgggttg gggcgtggcc tgctgcgggc 120
ttccccgcct tccagcgccc ttctggaaaa tggagtttgt ccggggttct ttccaaaggc 180
aggcagccct gccgtggcaa gtctgagcac ctagcgcttt gtggctcctg catagaccag 240
gcacgtcata acacccgtgt tttgaagcct tagggctgta caactgtcag cctctccaat 300
caaccctgca gttaggtgca ttttcctgca ctctcgtccc ctccggtcac atggcctgca 360
ggcttctctg tttgggtgta catccagctc cagttcctct gactatggcg ggtctgcttg 420
gtcatggtgt ggaatggcag ccctggggct tggtacaaag aggcttatct cttgtgaact 480
tactctaacc acttctgaag cagcggcctc tacatctctg cttatcacag agcctcactt 540
gcattgaaac ttatcgctag gaatctcccc ttctgtaatc accctgacct tgccaaggca 600
tctagagtac tgtacgtttt taatttttat tttgcaccag ttgttgctta ctaacagaag 660
tagtaggtaa catacttgtt ggaaaaagcc cacggttggg aaaaaaccat tatcgtggaa 720
tacaaataca ctgagtgcct aaaactgaaa atcaaagctt ctcccaatgt atttgtgcta 780
aaatacaatg ccctcagttc ttaaccaggt aatcagcagt tggctgtcta gctgaaaacc 840
ttgagacctt gtgttaacca ttttttttat ttaacatgat tgttgaagga gagaattgac 900
ctcccaatgt agggcacttt agcacccccc ctctcagaca aatagatatg gccttggctt 960
aaagtttttt ctctgcacta atgtggagcc atagaaccct tgataaagcc aagtcccaag 1020
tttgttttcc catccttact ttaaaggcca agtagggtga caaacagcct ttaccaccat 1080
tgcatctgcc ttgctgtggg gatcaataac aaataccctt tccactttca g tct tgt 1137
Ser Cys
tat ttt gac egg gat gat gtg gec ctg aag aac ttt gec aaa tac ttt 1185 Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe 5 10 15
etc cat caa tct cat gaa gag agg gaa cat get gag aaa ctg atg aag 1233 Leu His Gin Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys 20 25 30
ctg cag aac cag cga ggt gga cga ate ttc ctg cag gat ate aag g 127 9 Leu Gin Asn Gin Arg Gly Gly Arg lie Phe Leu Gin Asp lie Lys 35 40 45
taagtagact atgggactgc gttaaatgag cagtnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1339
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1399
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1459
nnnnctgcag atgaattgac atgtttcttt gattc ag aaa cct gac cgt gat gac 1514
Lys Pro Asp Arg Asp Asp
- 32 -
008222
50 55
tgg gag age ggg ctg aat gca atg agg tgt gca ctg cac ttg gaa aag Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Arg Cys Ala Leu His Leu Glu Lys 60 65 70
agt gtg aat cag tea eta ctg gaa ctt cac aaa ctg get act gac aag Ser Val Asn Gin Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys 75 80 85
aat gat ccc cac gtgagtatca gaaacacggg gtgagtggag atgatttgee Asn Asp Pro His 90
acagggcttg ggagagctga ccagtaaccc tgtcccatgt tctctttcct ag tta tgt
Leu Cys
gac ttc att gag acg cat tac ctg aat gag cag gtg aaa tec att aaa Asp Phe lie Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gin Val Lys Ser lie Lys 95 100 105
gaa ctg ggt gac cac gtg ace aac tta cgc aag atg gga gee cct gaa Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu 110 115 120 125
tct ggc atg gca gaa tat etc ttt gac aag cac ace ctg gga cac ggt Ser Gly Met Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly His Gly 130 135 140
gat gag age taagctgacg tccccaaggc catgtgactt tactggtcac Asp Glu Ser
tgaggcagtg catgcatgtc aggctgeett tatcttttct ataagttgea ccaaaacatc tgcttaaaag ttctttaatt tgtaccattt cttcaaataa agaattttgg tacccagctc ttgttgtgat tg
<210> 12 <211> 49 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный пептид <400> 12
Ser Cys Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys 15 10 15
Tyr Phe Leu His Gin Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu
20 25 30
Met Lys Leu Gin Asn Gin Arg Gly Gly Arg lie Phe Leu Gin Asp lie 35 40 45
Lys
<210> 13 <211> 42 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
- 33 -
008222
<223> Синтезированный пептид <400> 13
Lys Pro Asp Arg Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Arg Cys 15 10 15
Ala Leu His Leu Glu Lys Ser Val Asn Gin Ser Leu Leu Glu Leu His 20 25 30
Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 35 40
<210> 15 <211> 1153 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность
<400> 15
atctgtccat ggtgagtgcg gcctggcctt tggcggggcg gaaagagggt gcggcctggc 60
ctcccttggg ccacttggtg agctggcgga gggtgggttg gggcgtggcc tgctgcgggc 120
ttccccgcct tccagcgccc ttctggaaaa tggagtttgt ccggggttct ttccaaaggc 180
aggcagccct gccgtggcaa gtctgagcac ctagcgcttt gtggctcctg catagaccag 240
gcacgtcata acacccgtgt tttgaagcct tagggctgta caactgtcag cctctccaat 300
caaccctgca gttaggtgca ttttcctgca ctctcgtccc ctccggtcac atggcctgca 360
ggcttctctg tttgggtgta catccagctc cagttcctct gactatggcg ggtctgcttg 420
gtcatggtgt ggaatggcag ccctggggct tggtacaaag aggcttatct cttgtgaact 480
tactctaacc acttctgaag cagcggcctc tacatctctg cttatcacag agcctcactt 540
gcattgaaac ttatcgctag gaatctcccc ttctgtaatc accctgacct tgccaaggca 600
tctagagtac tgtacgtttt taatttttat tttgcaccag ttgttgctta ctaacagaag 660
tagtaggtaa catacttgtt ggaaaaagcc cacggttggg aaaaaaccat tatcgtggaa 720
tacaaataca ctgagtgcct aaaactgaaa atcaaagctt ctcccaatgt atttgtgcta 780
aaatacaatg ccctcagttc ttaaccaggt aatcagcagt tggctgtcta gctgaaaacc 840
ttgagacctt gtgttaacca ttttttttat ttaacatgat tgttgaagga gagaattgac 900
ctcccaatgt agggcacttt agcacccccc ctctcagaca aatagatatg gccttggctt 960
aaagtttttt ctctgcacta atgtggagcc atagaaccct tgataaagcc aagtcccaag 1020
tttgttttcc catccttact ttaaaggcca agtagggtga caaacagcct ttaccaccat 1080
tgcatctgcc ttgctgtggg gatcaataac aaataccctt tccactttca gctgctagcg 1140
gccgcgctga cgt 1153
- 34 -
008222
<210> 16 <211> 191 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность <400> 16
actttcagct gctagcggcc gcgctgacgt ccccaaggcc atgtgacttt actggtcact 60 gaggcagtgc atgcatgtca ggctgccttt atcttttcta taagttgcac caaaacatct 120 gcttaaaagt tctttaattt gtaccatttc ttcaaataaa gaattttggt acccagctct 180 tgttgtgatt g 191
<210> 17 <211> 1312 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность
<400> 17
atctgtccat ggtgagtgcg gcctggcctt tggcggggcg gaaagagggt gcggcctggc 60
ctcccttggg ccacttggtg agctggcgga gggtgggttg gggcgtggcc tgctgcgggc 120
ttccccgcct tccagcgccc ttctggaaaa tggagtttgt ccggggttct ttccaaaggc 180
aggcagccct gccgtggcaa gtctgagcac ctagcgcttt gtggctcctg catagaccag 240
gcacgtcata acacccgtgt tttgaagcct tagggctgta caactgtcag cctctccaat 300
caaccctgca gttaggtgca ttttcctgca ctctcgtccc ctccggtcac atggcctgca 360
ggcttctctg tttgggtgta catccagctc cagttcctct gactatggcg ggtctgcttg 420
gtcatggtgt ggaatggcag ccctggggct tggtacaaag aggcttatct cttgtgaact 480
tactctaacc acttctgaag cagcggcctc tacatctctg cttatcacag agcctcactt 540
gcattgaaac ttatcgctag gaatctcccc ttctgtaatc accctgacct tgccaaggca 600
tctagagtac tgtacgtttt taatttttat tttgcaccag ttgttgctta ctaacagaag 660
tagtaggtaa catacttgtt ggaaaaagcc cacggttggg aaaaaaccat tatcgtggaa 720
tacaaataca ctgagtgcct aaaactgaaa atcaaagctt ctcccaatgt atttgtgcta 780
aaatacaatg ccctcagttc ttaaccaggt aatcagcagt tggctgtcta gctgaaaacc 840
ttgagacctt gtgttaacca ttttttttat ttaacatgat tgttgaagga gagaattgac 900
ctcccaatgt agggcacttt agcacccccc ctctcagaca aatagatatg gccttggctt 960
aaagtttttt ctctgcacta atgtggagcc atagaaccct tgataaagcc aagtcccaag 1020
tttgttttcc catccttact ttaaaggcca agtagggtga caaacagcct ttaccaccat 1080
tgcatctgcc ttgctgtggg gatcaataac aaataccctt tccatttaaa tctgctagcg 1140
gccgctgacg tccccaaggc catgtgactt tactggtcac tgaggcagtg catgcatgtc 1200
aggctgeett tatcttttct ataagttgea ccaaaacatc tgcttaaaag ttctttaatt 1260
tgtaccattt cttcaaataa agaattttgg tacccagctc ttgttgtgat tg 1312
<210> 18 <211> 1532 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность <400> 18
ggatcccgct ataaagtgcg gcccgctggt ccctacgcca gaegttcteg cccagagtcg 60 ccgcggtacc ggtgctcgac ccctccgacc cccgtccggc egctttgage ctgagccctt 120 tgeaactteg tcgctccgcc gctccagcgt cgcctccgcg cctcgcccag ccgccatcat 180 ggtgagtgcg gcctggcctt tggcggggcg gaaagagggt gcggcctggc ctcccttggg 240 ccacttggtg agctggcgga gggtgggttg gggcgtggcc tgctgcgggc ttccccgcct 300
- 35 -
008222
tccagcgccc ttctggaaaa tggagtttgt ccggggttct ttccaaaggc aggcagccct 360
gccgtggcaa gtctgagcac ctagcgcttt gtggctcctg catagaccag gcacgtcata 420
acacccgtgt tttgaagcct tagggctgta caactgtcag cctctccaat caaccctgca 480
gttaggtgca ttttcctgca ctctcgtccc ctccggtcac atggcctgca ggcttctctg 540
tttgggtgta catccagctc cagttcctct gactatggcg ggtctgcttg gtcatggtgt 600
ggaatggcag ccctggggct tggtacaaag aggcttatct cttgtgaact tactctaacc 660
acttctgaag cagcggcctc tacatctctg cttatcacag agcctcactt gcattgaaac 720
ttatcgctag gaatctcccc ttctgtaatc accctgacct tgccaaggca tctagagtac 780
tgtacgtttt taatttttat tttgcaccag ttgttgctta ctaacagaag tagtaggtaa 840
catacttgtt ggaaaaagcc cacggttggg aaaaaaccat tatcgtggaa tacaaataca 900
ctgagtgcct aaaactgaaa atcaaagctt ctcccaatgt atttgtgcta aaatacaatg 960
ccctcagttc ttaaccaggt aatcagcagt tggctgtcta gctgaaaacc ttgagacctt 1020
gtgttaacca ttttttttat ttaacatgat tgttgaagga gagaattgac ctcccaatgt 1080
agggcacttt agcacccccc ctctcagaca aatagatatg gccttggctt aaagtttttt 1140
ctctgcacta atgtggagcc atagaaccct tgataaagcc aagtcccaag tttgttttcc 1200
catccttact ttaaaggcca agtagggtga caaacagcct ttaccaccat tgcatctgcc 1260
ttgctgtggg gatcaataac aaataccctt tccatttaaa tctgctagcg gccgctgacg 1320
tccccaaggc catgtgactt tactggtcac tgaggcagtg catgcatgtc aggctgeett 1380
tatcttttct ataagttgea ccaaaacatc tgcttaaaag ttctttaatt tgtaccattt 1440
cttcaaataa agaattttgg tacccagctc ttgttgtgat tgaggatgag cgcaccagct 1500
tcccttgcgt eggctatact aaccacactg ca 1532
<210> 19 <211> 139 <212> ДНК
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (13) . . . (126)
<400> 19
ccagccgcca tc atg асе acc gcg tct ccc teg caa gtg cgc cag aac tac 51
Met Thr Thr Ala Ser Pro Ser Gin Val Arg Gin Asn Tyr 15 10
cac cag gac teg gag get gec ate aac cgc cag ate aac ctg gag ttg 99 His Gin Asp Ser Glu Ala Ala lie Asn Arg Gin lie Asn Leu Glu Leu 15 20 25
tat gec tec tac gtc tat ctg tec atg gtgagtgcgg cct 139 Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met 30 35
<210> 20 <211> 38 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus <400> 20
Met Thr Thr Ala Ser Pro Ser Gin Val Arg Gin Asn Tyr His Gin Asp 15 10 15
Ser Glu Ala Ala lie Asn Arg Gin lie Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met
<210> 21 <211> 139
- 36 -
008222
<212> ДНК
<213> Rattus norvegicus <400> 21
aggccgcact caccatggac agatagacgt aggaggcata caactccagg ttgatctggc 60 ggttgatggc agcctccgag tcctggtggt agttctggcg cacttgcgag ggagacgcgg 120 tggtcatgat ggcggctgg 139
<210> 24 <211> 87 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность <400> 24
cagagtcgcc gcggtttcct gcttcaacag tgcttgaacg gaacccggtg ctcgacccct 60 ccgacccccg tccggccgct ttgagcc 87
<210> 25 <211> 87 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Векторная последовательность <400> 25
ggctcaaagc ggccggacgg gggtcggagg ggtcgagcac cgggttccgt tcaagcactg 60 ttgaagcagg aaaccgcggc gactctg 87
<210> 26 <211> 59 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 37 -
008222
- 38 -
008222
- 39 -
008222
- 40 -
008222
<220>
<223> Полилинкерная последовательность <400> 41
gtcgaccaca gacgtcaacc gtt 23
^ffj) Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 41 -