EA 008220B1 20070427 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2007\TIT_PDF/008220 Титульный лист описания [PDF] EAPO2007/PDF/008220 Полный текст описания EA200400605 20021029 Регистрационный номер и дата заявки NLPCT/NL01/00792 20011029 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок NL2002/000686 Номер международной заявки (PCT) WO2003/038100 20030508 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [eab] EAB20702 Номер бюллетеня [RU] КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ЭРИТРОПОЭТИНПОДОБНЫЕ МОЛЕКУЛЫ, И СПОСОБЫ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа C12N 15/65, C12N 15/86, G01N 33/68, G01N 33/74, C07K 14/505, A61P 9/00, A61P 25/00 Индексы МПК [NL] Опстелтен Дирк Ян Элбертус, Каптейн Йохан Кристиан, Пассир Петрус Кристианус Йоханнес Йосефус, Брюс Роланд Хендрик Петер, Баут Абрахам Сведения об авторах [NL] КРУСЕЛЛ ХОЛЛАНД Б.В. Сведения о патентообладателях [NL] КРУСЕЛЛ ХОЛЛАНД Б.В. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000008220b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

1. Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, характеризующаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

7. Композиция по любому из пп.1-6, где N-связанные гликаны в эритропоэтинподобных молекулах представляют собой преимущественно биантенные структуры.

8. Фармацевтический препарат, включающий композицию по п.1.

9. Применение композиции по п.1 в качестве лекарственного средства для лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы.

10. Способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы, предусматривающий стадию введения человеку или животному композиции по п.1.

11. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

12. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

13. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

14. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

15. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

16. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

17. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

18. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

19. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

20. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

21. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

22. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

23. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

24. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

25. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

 


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:
Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, характеризующаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

7. Композиция по любому из пп.1-6, где N-связанные гликаны в эритропоэтинподобных молекулах представляют собой преимущественно биантенные структуры.

8. Фармацевтический препарат, включающий композицию по п.1.

9. Применение композиции по п.1 в качестве лекарственного средства для лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы.

10. Способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы, предусматривающий стадию введения человеку или животному композиции по п.1.

11. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

12. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

13. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.

14. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

15. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

16. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.

17. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

18. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

19. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.

20. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

21. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

22. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.

23. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

24. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

25. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.

 


008220
Область техники
Настоящее изобретение относится к области технологии рекомбинантных ДНК. Изобретение также относится к получению белков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению рекомбинантных белков для использования их в качестве терапевтически активных компонентов фармацевтического препарата. Настоящее изобретение также относится к линиям клеток млекопитающих, идентифицированным, выбранным и/или созданным для получения рекомбинантных белков. Настоящее изобретение относится также к использованию получаемых таким образом белков.
Предпосылки создания изобретения
Системы рекомбинантной клеточной экспрессии для получения белков известны. Указанные системы включают широкий диапазон от бактерий, дрожжей и грибов до клеток растений, и от клеток насекомых до клеток млекопитающих. Выбор организма-хозяина для целей получения желаемого продукта и системы экспрессии зависит в основном от таких факторов, как легкость их применения, стоимость культивирования, параметры роста клеток, уровень продуцирования и способность расти в бессывороточной среде. Известно, что указанные выше системы клеточной экспрессии различаются также по их способности подвергаться модификациям в ходе трансляции и после трансляции, таким как укладка, фосфорилирование, у-карбоксилирование и у-гидроксилирование. Несмотря на признание того факта, что выбор системы рекомбинантной экспрессии может оказывать решающее воздействие на окончательную структуру экспрессированных белков, посттрансляционные модификации в целом не играют определяющей роли в выборе соответствующей системы экспрессии для каждого конкретного белка.
В проведенных ранее исследованиях было выявлено множество фактов, свидетельствующих о сложности процесса дифференциальной посттрансляционной модификации белков человека и их потенциальном участии в функциях человеческого организма. Так, например, результаты проведенных относительно недавно исследований позволяют предположить, что характер дифференциального гликозили-рования белков человека, имеющего место в крови (так называемые модификации "сывороточного типа"), отличается от характера указанного гликозилирования, имеющего место в цереброспинальной жидкости в мозге (модификации "мозгового типа"). Указанное различие может быть ключевым моментом, имеющим огромное значение для разработки эффективных терапевтических препаратов.
В целом, гликопротеины нервных клеток человека характеризуются наличием гликозилирования, которое в литературе получило название гликозилирование "мозгового типа" (Margolis and Margolis 1989; Hoffman et al. 1994). В отличие от гликозилированных белков "сывороточного типа" (т.е. глико-протеинов, циркулирующих в крови), гликозилированные белки мозгового типа содержат характерные N-связанные сахара комплексного типа, которые модифицированы а1,3-связанной фукозой, присоединенной к N-ацетилглюкозамину в антенне лактозаминового типа, за счет чего образуются структуры Lewis-x или сиалил-Lewis-X-структуры (фиг. 5). Имеются два типа структур Lewis-X: один - с концевым галактозным остатком и один - с концевым N-ацетилгалактозаминовым остатком (GalNac). Если указанные концевые группы присоединены к сиаловой кислоте, образуемая структура Lewis-x называется сиа-лил-Lewis-X-структурой. Другое различие между олигосахаридами сывороточного типа и мозгового типа заключается в том, что последний часто содержит концевой N-ацетилглюкозамин и/или концевую галактозу и может включать модификацию концевого N-ацетилгалактозамина, тогда как олигосахариды сывороточного типа обычно содержат только небольшие количества таких структур.
Олигосахариды, которые обычно встречаются в белках, циркулирующих в сыворотке, часто содержат высоко галактозилированные структуры. Это означает, что галактоза присоединяется к периферическому N-ацетилглюкозамину, образуя лактозаминовую структуру. Гликопротеин при этом защищается от эндоцитоза с помощью N-ацетилглюкозаминовых рецепторов (т.е. рецепторов, которые распознают концевой N-ацетилглюкозамин), присутствующих в ретикулоэндотелиальных клетках печени и макрофагах (Anchord et al. 1978; Stahl et al. 1978). Олигосахариды сывороточного типа обычно также содержат концевые сиаловые кислоты (часто называемые также нейраминовой кислотой), которые защищают гли-копротеин от клиренса через асиалогликопротеиновый рецептор. Механизмы указанного клиренса специфически работают с гликопротеинами, циркулирующими в крови, и, вероятно, отсутствуют в центральной нервной системе человека (ЦНС) (Hoffman et al. 1994).
Системы рекомбинатной экспрессии для продуцирования белков, включающих модификации "сывороточного типа", доступны в технике, примерами которых являются клетки яичников китайского хомячка (СНО клетки) и клетки почки детенышей хомячков (ВНК клетки). Однако для продуцирования белков с другими модификациями, такими как модификации "мозгового типа", не описано соответствующих удобных систем. В этой связи, имеется потребность в системах экспрессии, которые принимали бы во внимание различия в посттрансляционных модификациях терапевтических белков. В частности, имеется потребность в эффективной системе экспрессии белков, включающих посттрансляционные модификации "мозгового типа".
Белки, которые удовлетворяют таким специфическим требованиям, могут быть полезными при лечении всех видов расстройств, в число которых входят заболевания, связанные с ЦНС, периферической нервной системой и сердечной тканью. Расстройства, поражающие ЦНС, включают различные виды на
- 1 -
008220
рушений, таких как острое церебральное нарушение, нейродегенеративные заболевания и другие дисфункции, такие как эпилепсия, шизофрения и расстройства настроения. Другие патологические расстройства, которые могут поражать нервные клетки и ткани, связаны с повреждениями, которые могут возникнуть в результате гипоксии, судорожных расстройств, отравления нейротоксинами, рассеянного склероза, гипотензии, остановки сердца, облучения или гипогликемии. Повреждения нервных клеток также могут возникать при проведении хирургических процедур, таких как устранение аневризмы или резекция опухоли.
Примером белка, играющего разные роли, которые, по меньшей мере частично, связаны с различными посттрансляционными модификациями, является гормон, известный как эритропоэтин (ЭП). ЭП, белок, известный своей ролью в дифференциации гемопоэтических стволовых клеток в эритроциты, имеет несколько иных функций, включая функции в нервной ткани. Было высказано предположение о роли ЭП в развитии ЦНС (Dame et al. 2001). Белок ЭП был также обнаружен в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) новорожденных и взрослых людей (Juul et al. 1997; Buemi et al. 2000). ЭП, присутствующий в ЦСЖ, образуется, скорее всего, локально в головном мозге, поскольку он не проходит через интактный гематоэнцефалический барьер (Marti et al. 1997; Buemi et al. 2000). Регуляция экспрессии ЭП является тканеспецифичной, что еще больше поддерживает гипотезу о том, что ЭП обладает тканеспецифичными функциями, различающимися в головном мозге и костном мозге (Masuda et al. 1999; Chikuma et al. 2000; Sasaki et al. 2001). В этой связи, было сделано предположение, согласно которому ЭП, кроме гемопоэти-ческой функции, может играть нейротропную роль. Нейротропные факторы определяются как гуморальные молекулы, действующие на нейроны, влияя на их развитие, дифференциацию, поддержание и регенерацию (Konishi et al. 1993). Результаты ряда исследований показали, что ЭП может действовать как нейротропный фактор (см., например, Sadamoto et al. 1998; Brines et al. 2000). Дополнительно к указанным выше эффектам ЭП на эритропоэз и нейропротекцию описаны другие роли ЭРО, например, в эндо-телиальных клетках и мышечных клетках. Установлено в данной области, что эффект (рекомбинантного) ЭП зависит в значительной мере от характера олигосахаридных фрагментов, используемых для гликози-лирования белка. N-связанные олигосахариды ЭП человека чрезвычайно важны для его известной биологической активности по стимуляции эритропоэза (Takeuchi and Kobata 1991; Wasley et al. 1991; Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996; Takeuchi et al. 1989; Misaizi et al. 1995).
В случае ЭП можно выделить ЭП сывороточного типа (или ЭП "почечного типа" или "мочевого типа"), который образуется в почке и циркулирует в крови, и ЭП, который образуется в других видах тканей, таких как головной мозг (ЭП мозгового типа). Системы продукции и очистки ЭП сывороточного типа хорошо известны в данной области техники, и рекомбинантный сывороточный тип ЭП получают рутинными методами и успешно используют, например, в случае пациентов, страдающих в связи с низким уровнем эритроцитов в крови. Установлено в данной области техники, что указанный рекомбинант-ный ЭП удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к стабильности того белка, который может циркулировать в крови в течение периода времени, достаточного для индукции эритропоэза. Обычно для получения ЭП с указанными характеристиками используют системы на основе клеток СНО или ВНК. Однако сывороточный тип ЭП, получаемый на основе такой системы продукции и очистки, относительно бесполезен при лечении заболеваний, связанных с центральной или периферической нервной системой, а также при лечении нарушений, связанных с расстройствами, вызванными ишемией/реперфузией. Это связано с характером его гликозилирования, который не подходит для лечения указанных расстройств, а также из-за того, что он приводит к повышению числа эритроцитов (эритропоэзу) благодаря своей высокой гемопоэтической активности, которая рассматривается как нежелательный побочный эффект в случае таких не гемопоэтических заболеваний (Wiessner et al., 2001). В этой связи, существует потребность в новых системах продуцирования белков, таких как ЭП, которые имели бы характерные особенности молекулы ЭП, активной в головном мозге или в тканях, участвующих в основанных на се-лектине нацеливании или транспорте. Кроме того, существует потребность в фармацевтически приемлемых препаратах белков, таких как ЭП, с посттрансляционными модификациями, отличными от гликози-лирования сывороточного типа, предпочтительно имеющими гликозирование мозгового типа, и в эффективных системах продукции и очистки для них.
Другой пример белка, который имеет разный характер гликозилирования в разных тканях, позволяющий предположить разную роль различных видов гликозилирования, является трансферрин, который встречается в значительных количествах в виде асиалотрансферрина в ЦСЖ, но не в виде сывороточного варианта (Van Eijk et al. 1983; Hoffman et al. 1995).
Определенное семейство гликопротеинов, известное как селектины, играет важную роль на начальных стадиях адгезии лейкоцитов к эндотелию при повреждении ишемией/реперфузией. Известны три представителя семейства селектинов: Р-селектин, Е-селектин и L-селектин. Селектины содержат лекти-новый домен, который распознает сахарные структуры связывающихся с ними гликопротеиновых лиган-дов. Предполагается определенная роль сиалил-Lewis-K-модификаций олигосахаридов при их связывании с селектинами (Foxall et al. 1992). Ряд исследований выявили важность селектинов и структур сиа-лил-Lewis-X в адгезии лейкоцитов на моделях ишемии/реперфузии. Было, например, показано, что сиа-лил-Lewis-Х-олигосахарид Slex-OS является кардиопротектором на модели ишемии/реперфузии кошки за
- 2 -
008220
счет снижения некроза сердечной ткани на 83% (Buerke et al. 1994) . Кроме того, в заявке на патент WO 02/38168 описывается использование селектинсвязьтающих белков, включающих сиалил-Lewis-X-структуры для использования в качестве противовоспалительных средств при лечении различных заболеваний. Однако подходящие системы экспрессии для получения белков, включающих (сиалил)-Lewis-X-гликаны, еще не описаны. В этой связи, имеется потребность в рекомбинантных системах экспрессии белков с заданными структурами гликозилирования, такими как cиaлил-Lewis-X-cтpyктypы. В более общем виде, имеется потребность в системах экспрессии для рекомбинантной продукции белков с заданными посттрансляционными модификациями.
Краткое описание таблиц и чертежей Таблица I. Сводные данные по маркерным белкам, которые могут использоваться для характеристики клеток.
Таблица II. Ткани, взятые в качестве положительного контроля, которые могут использоваться для некоторых из маркерных белков, приведенных в табл. I.
Таблица III. Подробная информация (с указанием поставщика и каталожного номера) об антителах против маркерных белков, которые могут использоваться для характеристики клеточной линии
Таблица IV. Результаты оценки наличия маркерных белков в PER.С6(tm).
Таблица V. Моносахаридный состав N-связанных Сахаров в PER.C6(tm)-ЭП и Eprex.
Таблица VI. Распределение MS-пиков, наблюдаемых для молекулярных ионов десиалилированных N-гликанов, высвобождаемых N-гликаназой F из ЭП, образуемого в DMEM ЭП-продуцирующим клоном Р7 линии PER.C6(tm). Пики со значениями массы (m/z), которые также найдены в Eprex, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом.
Таблица VII. Распределение MS-пиков, наблюдаемых для молекулярных ионов десиалилированных N-гликанов, высвобождаемых N-гликаназой F из ЭП, образуемого в DMEM ЭП-продуцирующим клоном Р8 линии PER.C6(tm). Пики со значениями массы (m/z), которые также найдены в Eprex, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом.
Таблица VIII. FUT-активности в клетках СНО и PER.C6(tm).
Таблица IX. Распределение MS-пиков, наблюдаемых для молекулярных ионов десиалилированных N-гликанов, высвобождаемых N-гликаназой F из ЭП, фракционированного на AAL-колонке для отбора вариантов с высоким и низким содержанием фукозы.
Таблица X. Относительный уровень экспресии Е1А и морфология продуцирующих ЭП клонов E1A^O и Е1А.Е1В.ЕРO НТ1080. Уровень экспрессии Е1А оценивали методом Вестерн-блоттинга. Клоны, помеченные знаком "+", отбирали для анализа продукции ЭП.
Таблица XI. Относительный уровень наличия масс-профилей N-связанных Сахаров в ЭП, полученном из НТ1080/Еро-клона 033, НТ1080/Е1А-ЕРО клона 008 и НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО клона 072. Для прогнозирования состава сахаров использовали компьютерную программу ExPAsy. В таблице указано количество гексозаминов, гексоз и дезоксигексоз, присутствующих в антенне гликанов, и прогнозируемые для них структуры.
Фиг. 1. Масс-спектры N-связанных сахаров в Эпрекс, Р7-ЭП (пулы А, В и С) и Р8-ЭП (пулы А, В и
С). (А): Эпрекс; (В): Р7, пул А; (С): Р7, пул В; (D): Р7, пул С; (Е) : P8, пул A; (F) : P8, пул В; и (G) : P8,
пул С.
Фиг. 2. Содержание сиаловой кислоты в PER.C6(tm)-ЭП и СНО-ЭП. Фиг. 3. Гликановые структуры Lewis-X, имеющиеся в PER^(tm)^^ Фиг. 4. Экспрессия структур Lewis-X на поверхности клеток PER.C6(tm). Фиг. 5. Схематическое изображение структур Lewis-X и сиалил-Lewis-X. Фиг. 6. Влияние PER.C6(tm)-ЭП и эпрекса на эритропоэз in vivo.
Фиг. 7. Объемы некротизированных при инфаркте зон у неподвергшихся лечению крыс (контроль) и крыс, подвергшихся лечению эпрекс и PER.C6(tm)-ЭП, вычисленные на основе карт, полученных путем преобразования аналоговых данных в цифровые (фиг. 7А), и карт Т2, полученных через 24 ч (фиг. 7В) с использованием ЯМР-томографии.
Фиг. 8. Концентрация эпрекса в указанные временные точки после однократной в/в инъекции 150 eU Эпрекса у трех животных.
Фиг. 9. Хроматограмма PER.C6(tm)OII, подвергнутого фракционированию на колонке AAL для разделения форм с высоким и низким содержанием фукозы.
Фиг. 10А. Масс-спектр N-связанных сахаров из фракций 1-4, полученных с колонки AAL. В. Масс-спектр N-связанных сахаров из фракции 4, полученной с колонки AAL в независимом эксперименте.
Фиг. 11. Изображения клона 033 НТ1080/ЕРО (А) и клонов 058 (В) и 026 (С) НТ1080/Е1А.Е1В.ЕРО. Показана их экспрессия Е1 А при анализе методом Вестерн-блоттинга (D). Клоны, экспрессирующие Е1 А, имеют плоскую морфологию.
Фиг. 12. ВЭАОХ-ПАД профиль N-гликанов, высвобождаемых из ЭП, продуцируемого клоном 033 НТ1080/ЕРО и клоном 072 HT1080/E1A.E1B. Линии внизу указывают элюцию незаряженных (0), моно
- 3 -
008220
заряженных, с двойным, тройным и четверным зарядом гликанов (1-4, соответственно). Отмечается сдвиг менее заряженных N-связанных гликанов из клона 072.
Фиг. 13. Maldi-MS анализ ЭП, продуцируемых 3 разными клонами. Клон 033 НТ1080/ЕРО, клон 008 НТ1080/Е1А-ЕРО и клон 072 НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО. Последние 2 клона демонстрируют более сложный профиль.
Фиг. 14. Профили, полученные при моносахаридном анализе N-связанных гликанов из клона 033 НТ1080/ЕРО, клона 008 НТ1080/Е1А-ЕРО и клона 072 НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО. Соотношение указанных моносахаридов (Fuc = фукоза, GalN = N-ацетилгалактозамин, GlcNac = N-ацетилглюкозамин, Gal = галактоза, Man = манноза) нормализовано по маннозе.
Фиг. 15. Maldi-MS-анализ ЭП, продуцируемых клоном 033 НТ1080/ЕРО (А, В) и клоном 072 НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО (С, D) при обработке (В, D) или без обработки (А, С) а-фукозидазой. Наблюдались различия только в гликановых профилях ЭП, полученного из клона 072. Выявлено четкое различие между пиками со значениями m/z, равными примерно 2039, примерно 2185 и примерно 1892 (С и D), что, скорее всего, отражает снижение уровня предполагаемых структур, содержащих антенные дезоксигексо-зы.
Фиг. 16. Различные изоформы разных препаратов ЭП, разделенных методом ИЭФ. Изоформы ЭП содержат 0-14 сиаловых кислот на молекулу. Вносили указанные ниже образцы (200 eU на полосу): Эп-рекс (А); эпрекс после обработки нейраминидазой (В); СНО-ЭП, общий уровень продукции (С); PER.C6TM-ai (D), клон 022; frCHO-ЭП (Е).
Фиг. 17. Гематокрит (ГКР (HCR) объемный процент) у крыс, которым инъецировали 5000 eU/кг Эпрекса, frCHO-ЭП, PER.C6(tm)-ЭП или разбавленный буфер (контроль). У крыс, которым вводили Эпрекс, обнаруживались более высокие значения ГКР, чем в контроле, frCHO-ЭП и PER.C6(tm)-ЭП (p <
0,001).
Фиг. 18. Процентное содержание ретикулоцитов в крови крыс, которым инъецировали 5000 eU/кг Эпрекса, frCHO-ЭП, PER.C6(tm)-ЭП или разбавленный буфер (контроль). У крыс, которым вводили ЭП, обнаруживался более высокий процент ретикулоцитов, чем в контроле (р < 0,001). Процент ретикулоцитов у крыс, которым вводили эпрекс и frCHO-ЭП, был значительно выше, чем в случае введения PER^(tm)^.
Фиг. 19. Процентное содержание незрелых ретикулоцитов (НЗР) в общей популяции ретикулоцитов через четыре дня после инъекции 5000 eU/кг Эпрекса, frCHO-EPO, PER.C6(tm)-EPO или разбавленного буфера (контроль). У крыс, которым вводили Эпрекс, обнаруживался значительно более высокий процент незрелых ретикулоцитов, чем в контроле, в случае введения frCHO-EPO или PER.C6(tm)-EPO (р <
0,001).
Фиг. 20. Сайт расщепления PNG-азой F (отмеченный F) и эндогликозидазой F2 (отмеченный F2).
Фиг. 21. MALDI-спектр гликанов из PER^(tm)^^ высвобождаемых PNG-азой F (А) и эндоглико-зидазой F2 (В). Ось х на нижнем спектре ориентирована таким образом, что соответствующие пики на обоих спектрах находятся непосредственно друг над другом (различие в 349 Да, см. текст).
Фиг. 22. Некоторые моносахаридные связи N-концевых гликанов.
Фиг. 23. На верхней части схемы приведены десиалилированные гликаны, высвобождаемые из PER.C6(tm)-ЭП; значения в нижней части соответствуют спектру, получаемому после обработки галакто-зидазой. В скобках указан процент спектров, отражающий соответствующие структуры. Спектры приведены на фиг. 26.
Фиг. 24. В верхней части схемы приведены десиалилированные гликаны, высвобождаемые из PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с галактозидазой; значения в средней части соответствуют спектру, получаемому после обработки фукозидазой из почки быка, и значения в нижней части получают после инкубации с GlcNac-азой. В скобках указан процент спектров, отражающий соответствующие структуры. Спектры приведены на фиг. 26.
Фиг. 25. В верхней части схемы приведены десиалилированные гликаны, высвобождаемые из PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с галактозидазой; значения в средней части соответствуют спектру, получаемому после обработки фукозидазой из миндальной муки, и значения в нижней части получают после инкубации с GlcNac-азой. В скобках указан процент спектров, отражающий соответствующие структуры. Спектры приведены на фиг. 27.
Фиг. 26. MALDI-спектры N-связанных гликанов из PER.C6(tm)-ЭП после экзогликозидазной обработки.
A) PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с PNG-азой F и нейраминидазой.
B) PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с PNG-азой F, нейраминидазой и галактозидазой.
C) PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с PNG-азой F и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой и фукозидазой из почки быка.
D) PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с PNG-азой F и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой, фукозидазой из почки быка и GlcNAc-азой.
- 4 -
008220
E) PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с PNG-азой F и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой и фукозидазой из миндальной муки.
F) PER.C6(tm)-ЭП после инкубирования с PNG-азой F и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой, фукозидазой из миндальной муки и GlcNAc-азой.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам идентификации, отбора и получения клеток млекопитающих, которые способны продуцировать белковые молекулы, такие как пептиды и белки, включающие посттрансляционные модификации, где указанные посттрансляционные модификации заданы заранее и осуществляются в клетке млекопитающего, в которой указанные белковые молекулы экспрессиру-ются. Настоящее изобретение также относится к способам получения и продуцирования белковых молекул, таких как эритропоэтин (ЭП), с использованием клеток млекопитающих, получаемых по способам настоящего изобретения, и в клетках млекопитающих, которые были получены на основе их способности продуцировать белки и/или посттрансляционные модификации, которые являются показательными для заранее заданной посттрансляционной модификации, которая является желательной.
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, который включает стадии: обеспечения наличия в клетке млекопитающего, полученной по способу согласно настоящему изобретению, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу, таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; и культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, который включает стадии: идентификации клетки млекопитающего, обладающей способностью продуцировать указанную белковую молекулу с указанной заранее заданной посттрансляционной модификацией; обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; и культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, включающему стадии: идентификации клетки млекопитающего, обладающей способностью продуцировать указанную белковую молекулу с указанной заранее заданной посттрансляционной модификацией, обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу, таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы; анализа указанных посттрансляционных модификаций в указанной продуцированной таким образом белковой молекуле; и определения того, включает ли указанная посттрансляционная модификация, имеющаяся в данной белковой молекуле, указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клеткам млекопитающих, которые имеют характеристики и свойства нервных клеток, так что может быть получено значительное количество рекомбинантных белков, которые обладают свойствами "невронального или мозгового типа". Продуцирование рекомбинантных белков, таких как ЭП мозгового типа, несущих специфические заранее заданные посттрансляционные модификации, теперь становится возможным при использовании способов и средств по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится, кроме того, к способам получения белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, включающим стадии: обеспечения наличия в клетке млекопитающего, полученной по способу настоящего изобретения, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы, и очистки указанной белковой молекулы из культуры клеток млекопитающих.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способам получения белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанные способы включают стадии: обеспечения наличия в клетке млекопитающего, полученной по способу настоящего изобретения, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы; анализа указанных посттрансляционных модификаций в указанной продуцированной белковой молекуле; и определения того, включает ли указанная посттрансляционная моди
- 5 -
008220
фикация, имеющаяся в указанной белковой молекуле, указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
Предпочтительно, указанные способы получения белковых молекул включают дополнительную стадию очистки указанной белковой молекулы из культуры клеток млекопитающего. Более предпочтительными являются способы получения белковой молекулы в клетке млекопитающего по настоящему изобретению, в рамках которых указанная клетка млекопитающего иммортализуется и/или экспрессиру-ет последовательности аденовируса Е1 А.
Иммортализация или включение последовательностей аденовируса Е1 А может иметь место до стадии идентификации полученной клетки млекопитающего, но может также иметь место и после идентификации, отбора и/или получения клетки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам очистки белковых молекул, где указанные белковые молекулы очищают из культуры клеток на основе заранее заданной посттрансляционной модификации, имеющейся в молекуле, причем указанная заранее заданная посттрансляционная модификация осуществляется в клетке млекопитающего, в которой образуется данная молекула.
Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию композиции на основе эритропо-этинподобных молекул, выбранных из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или более мутеинов эритропоэтина, одного или более производных эритропоэтина или объединения одной или более фракций эритропоэтиновых молекул, содержащих разное количество сиаловых остатков, для получения лекарственного средства, используемого для лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого нарушения центральной или периферической нервной системы; причем указанная композиция на основе эритропоэтинподобных молекул имеет в расчете на содержание белка меньшую эритропоэтическую активность in vivo, чем эритропоэтинподобные молекулы, используемые в настоящее время для лечения анемии, такие как эпоэтин альфа и эпоэтин бета. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим такие эритро-поэтинподобные молекулы. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или профилактики указанных расстройств, включающим введение указанных композиций.
В других аспектах настоящее изобретение относится к способу продуцирования в клетке млекопитающего белковых молекул, требующих наличия гликозилированной структуры, выбранной из группы, состоящей из структур, (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNAc, содержащих в N-связанных гликанах, который характеризуется тем, что указанная клетка экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1 А из аденовируса, при условии, что когда указанная белковая молекула представляет собой эритропоэтин, такая клетка млекопитающего не является клеткой PER.C6(tm), когда указанная белковая молекула представляет собой гликоделин или протеин С или метаболический ингибитор тканевого фактора, указанная клетка млекопитающего не представляет собой клетку НЕК293, и когда указанная белковая молекула представляет собой матриксную металлопротеазу 1, указанная клетка млекопитающего не является клеткой НТ1080.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения фракции, обогащенной белковой молекулой, имеющей N-связанные гликаны, включающие структуры (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNAc, включающему стадии: (а) рекомбинантной экспрессии указанной белковой молекулы в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1 А из аденовируса; и (b) фракционирования продуцированных таким образом белковых молекул с получением в результате фракции, которая обогащена молекулами, имеющими указанные N-связанные гликаны, включающие структуры (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNAc.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу фракционирования смеси, включающей белковые молекулы, которые содержат структуры Lewis-X, при этом в указанном способе используется связывание указанных молекул с AAL-лектином. В других вариантах осуществления изобретение относится к полученным таким образом фракциям.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям, включающим эритропоэтин-подобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или более мутеинов эритропоэтина и одного или более производных эритропоэтина, отличающихся тем, что среднее число структур Lewis-X на N-связанных гликанах в расчете на одну эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2. В других вариантах осуществления изобретения указанное среднее число составляет по меньшей мере примерно 2,6; 2,7; 3,6; 4,1 или 5,7. В другом аспекте композиции или их фракции по настоящему изобретению используют для получения лекарственного средства.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию эритропоэтина, полученного рекомбинантным способом в клетке млекопитающего, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1 А из аденовируса, для получения лекарственного средства, применяемого для лечения расстройства, выбранного из группы, включающей ишемию, реперфузионное повреждение, расстройство, вызванное гипоксией, воспалительное заболевание, нейродегенеративное нарушение и острое нарушение центральной или периферической нервной системы. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или терапевтического лечения расстройства, выбранного из группы, со
- 6 -
008220
стоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративных нарушений и острого нарушения центральной или периферической нервной системы; при этом указанный способ включает стадию введения человеку или животному композиции на основе эритропоэтин-подобных молекул, выбранных из группы, состоящей из эритропо-этина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропо-этина, где указанная композиция на основе эритропоэтин-подобных молекул характеризуется тем, что ее получают рекомбинантным способом в клетке млекопитающего, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1 А из аденовируса. В ряде предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанная клетка представляет собой клетку PER.C6(tm).
Подробное описание изобретения
Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно предлагает системы рекомби-нантной продукции, подходящие для получения белков с необходимой заранее заданной посттрансляционной модификацией. В первом аспекте такие рекомбинантные системы могут быть получены с использованием способов по настоящему изобретению с целью идентификации систем экспрессии, способных осуществлять посттрансляционную модификацию, требуемую для рассматриваемого белка, или желаемое использование рассматриваемого белка. Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу создания систем экспрессии, обладающих способностью осуществлять желательную посттрансляционную модификацию, требуемого белка. Другие аспекты изобретения включают выделенные белки, содержащие введенные таким образом заранее заданные посттрансляционные модификации, способы их использования и фармацевтические композиции, включающие их. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации клетки млекопитающего, способной продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: (а) анализа посттрансляционной модификации в белке, продуцированном указанной клеткой млекопитающего; и (b) определение того, включает ли указанный белок указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу отбора клетки млекопитающего, способной продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: (а) анализа наличия или отсутствия ткане-специфического маркера или комбинации тканеспецифических маркеров в указанной клетке млекопитающего или на клеточной поверхности указанной клетки млекопитающего, при том что маркер или комбинация указанных маркеров является показателем способности указанной клетки осуществлять соответствующую необходимую заранее заданную посттрансляционную модификацию в белковой молекуле при продуцировании в указанной клетке, с использованием метода рекомбинантной ДНК и клеточной культуры, хорошо известных специалистам в данной области; и (b) отбора указанной клетки млекопитающего на основе наличия или отсутствия указанных тканеспецифических маркеров.
В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения клетки млекопитающего из гетерогенной клеточной популяции, причем указанная клетка млекопитающего способна продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, при этом указанный способ включает стадии: (а) сортировки клеток на основании наличия посттрансляционных модификаций в белках, продуцируемых указанными клетками, в указанной гетерогенной клеточной популяции; и (b) отбора клеток, способных продуцировать белки, включающие указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию. Такая сортировка может быть осуществлена с использованием известных в данной области способов, включающих, но не ограничивающих, сортировку клеток с использованием флуоресцентно меченых антител, распознающих заранее заданную посттрансляционную модификацию.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу идентификации клетки млекопитающего, способной продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей нужный белок, способной включать указанные посттрансляционные модификации таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанного белка; анализа посттрансляционной модификации в указанном белке, продуцированном указанной клеткой млекопитающего; и подтверждения наличия указанной посттрансляционной модификации в указанном белке. В соответствии с другим вариантом, настоящее изобретение относится к способу идентификации клетки млекопитающего, способной к продуцированию белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу, способную включать посттрансляционные модификации таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы; анализа посттрансляционной модификации в указанной белковой молекуле, продуцированной указанной клеткой
- 7 -
008220
млекопитающего; и определения того, включает ли посттрансляционная модификация, имеющаяся в указанной белковой молекуле, указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
Белковые молекулы в контексте настоящего описания относятся, не ограничиваясь приведенным списком, к молекулам, таким как пептиды, полипептиды и белки, а также к мутантам пептидов, полипептидов и белков (молекулам, включающим делеции, точечные мутации, замены и/или химически индуцированные изменения), при условии, что они дают возможность получения заранее заданной посттрансляционной модификации, то есть имеют требуемое количество аминокислотных остатков в правильном сочетании, обеспечивающем возможность указанной модификации (например, они должны включать последовательность Asn-X-Ser/Thr в случае добавления желательной структуры N-связанного гликана, которая в таком случае может быть присоединена к остатку Asn). Указанный термин относится также к пептидам, полипептидам и белкам, содержащим маркеры и/или другие протеиновые и непротеиновые метки (например, радиоактивные соединения). Примером такого белка является ЭП человека, который включает, помимо почечного или сывороточного типов, формы других фенотипов, такие как форма мозгового типа. Другие не ограничивающие примеры классов белков, которые обладают определенными характеристиками, которые способны играть важную роль в функционировании белков в некоторых тканях и которые должны (в случае рекомбинантной экспрессии) содержать заранее заданные посттрансляционные модификации для соответствующей функции, включают моноклональные антитела, нейротро-фины, цитокины, инсулиноподобные факторы роста, P-TGF-подобные факторы роста, факторы роста фибробластов, эпидермальные факторы роста, гепарин-связывающие факторы роста, лиганды рецептора тирозинкиназы и другие трофические факторы. Большинство указанных факторов ассоциируются с болезненными синдромами и, в этой связи, большая часть белков может использоваться в рекомбинантной форме для лечения людей, при условии что указанные белки содержат посттрансляционные модификации, необходимые для активности in vivo. Указанные белки должны, в этой связи, продуцироваться системами экспрессии, которые способны обеспечить желательные посттрансляционные модификации. Примерами таких белков служат, не ограничиваясь приведенным списком, трансферрин, гликоделин, фактор роста нервных клеток (NGF), нейротропный фактор из головного мозга, нейротропин-3, -4/5 и -6, цилиарный нейротропный фактор, фактор ингибирования лейкоза, кардиотрофин-1, онкостатин-М, некоторые интерлейкины, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 и -2, TGF-0, глиальный нейротропный фактор, нейртурин, персефин, миостатин, фактор роста фибробластов-1, -2 и -5, амфирегулин, фактор, индуцирующий активность рецептора ацетилхолина, нетрин-1 и -2, нейрегулин-2 и -3, плейотрофин, мидкин, фактор стволовых клеток (SCF), агрин, CSF-1, PDGF и сапозин С. Моноклональные антитела, используемые в настоящем изобретении, относятся к человеческим и гуманизированным антителам, к их частям и к их эквивалентам, таким как одноцепочечные фрагменты Fv (scFv), фрагменты Fab, участки CDR, вариабельные участки, легкие цепи и тяжелые цепи или любой другой формат, пригодный для использовании в качестве специфического лиганда.
В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления предлагаются системы продуцирования, которые способны создавать структуры Lewis-X и/или LacdiNAc в белках, способных включать структуры N-связанных гликанов. Согласно настоящему изобретению, такие системы экспрессии могут быть идентифицированы, отобраны или специальным образом сконструированы. Примером такого целевого конструирования является введение в клетку млекопитающего нуклеиновой кислоты, включающей последовательность Е1А аденовируса, так, что указанная последовательность Е1А экспрессируется в указанной клетке млекопитающего. Примерами уже существующих подобных клеток являются НЕК293, PER.C6(tm), 911. Хотя указанные клеточные линии сами по себе известны и уже использовались для получения белка (Van den Nieuwenhof et al., 2000; WO 00/63403; Grinnell et al., 1994), решающее воздействие ElA на способность вводить структуры Lewis-X и/или LacdiNAc в продуцируемые белки до сих пор еще не было признано.
Посттрансляционная модификация в контексте настоящего описания относится к любой модификации, которая присутствует в указанной белковой молекуле. Она также относится к модификациям, которые вводятся во время или после трансляции указанной молекулы с РНК in vivo или in vitro. Такие модификации включают, не ограничиваясь приведенным списком, гликозилирование, образование складчатой структуры, фосфорилирование, у-карбоксилирование, у-гидроксилирование, мультимеризацию, образование сульфидных мостиков и, например, такие формы процессинга, как вырезание или добавление одной или более аминокислот. Заранее заданная посттрансляционная модификация в контексте настоящего изобретения относится к любой посттрансляционной модификации, которая полезна для целей выбранного лечения. Согласно предпочтительному варианту осуществления, заранее заданная посттрансляционная модификация относится к форме модификации, которая делает модифицированный белок особенно полезным для лечения заболеваний специфических тканей, органов, компартментов и/или клеток организма человека или животного. Белковая молекула, содержащая такие заранее заданные посттрансляционные модификации, может в результате не оказывать заметного эффекта (такого как вредные или нежелательные побочные эффекты) на ткань, орган, компартмент и/или клетку, которые отличны от таковых, подлежащих лечению. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобрете
- 8 -
008220
ния, заранее заданная посттрансляционная модификация дает белок, включающий заранее заданную посттрансляционную модификацию, который более быстро выводится из крови, то есть снижаются нежелательные побочные эффекты. Заранее заданная посттрансляционная модификация будет более полно описана далее, но в целом может быть охарактеризована как желательное состояние, которое требуется для соответствующей и желательной активности белковой молекулы, включающей такую заранее заданную посттрансляционную модификацию, означая, что детальные модификации, присутствующие в интересующей белковой молекуле, необязательно должны быть полностью понятными и/или определенными, главное, чтобы достигалась желаемая активность. Примерами желательных модификаций по типу гликозилирования в O-и/или N-гликанах, в зависимости от целей использования, могут служить такие структуры как Lewis-X, сиалил-Lewis-X, GalNac, GlcNac, LacdiNAc, а-1,3-связанная фукоза, присоединенная к N-ацетилглюкозамину, концевому N-ацетилглюкозамину, концевой галактозе, находящемуся посередине N-ацетилглюкозамину, сульфатной группе и сиаловой кислоте.
Клетки млекопитающих по настоящему изобретению представляют собой предпочтительно клетки человека или человеческого происхождения для целей продукции белков человека с целью получения белков, которые с наибольшей вероятностью обладают характеристиками клеток организма млекопитающего и предпочтительно человека. Для получения белковых молекул, которые должны обладать посттрансляционными модификациями нервных клеток, предпочтительно использовать клетки, которые обладают невральными характеристиками, такими как белковые маркеры, являющиеся показательными для нервных клеток. Это не исключает того, что не нервные клетки могут быть чрезвычайно полезными для продукции белков, включающих посттрансляционные модификации невронального типа. Это зависит от активности белка, которая, в свою очередь, требует выбрать, идентифицировать или получить клетку, которая способна продуцировать такие посттрансляционные модификации.
Поскольку требуется производить большие количества белков в том случае, когда они применяются для терапевтических целей, предпочтительно, чтобы клетки млекопитающих по настоящему изобретению были иммортализованы. Иммортализация может быть осуществлена многими способами. Примеры способов получения иммортализованных клеток включают активную трансформацию покоящейся клетки в делящуюся клетку путем добавления нуклеиновых кислот, кодирующих трансформирующий и/или иммортализующий белки, или путем химической обработки, посредством которой эндогенные белки становятся трансформирующими, или путем отбора клеток из опухолевого материала. Один предпочтительный способ иммортализации неопухолевых клеток заключается в добавлении участка Е1 аденовируса, как было показано для клеточных линий, таких как 911 и PER.C6(tm). Известны другие способы иммор-тализации клеток, такие как трансформация с использованием последовательностей, кодирующих некоторые белки папилломавируса человека (HPV) (например, из клеток HeLa). Добавление некоторых вирусных белков, таких как Е1 из аденовируса, также может быть полезно для целей продуцирования ре-комбинантных белков, поскольку многие такие белки обладают способностью к активации транскрипции, а также антиапоптозным эффектом. В настоящее время было неожиданно показано, что экспрессия Е1 А аденовируса в клетке-хозяине, используемой в качестве экспрессирующей системы по настоящему изобретению, изменяет характеристики системы экспрессии так, что она приобретает способность вносить N-связанные структуры гликозилирования, которые включают Lewis-X и/или LacdiNAc.
Подходящей клеточной линией для использования в способах получения требуемых белковых молекул, включающих N-связанные гликаны, содержащие Lewis-X и/или LacdiNAc, является PER.C6(tm), депонированная под № 96022940 в Европейской коллекции культур животных клеток (European Collection of Animal Cell Cultures) Центра прикладной микробиологии и исследований (Center for Applied Microbiology and Research). Другие подходящие клеточные линии, относящиеся к данному аспекту настоящего изобретения, включают НЕК293, 911 и другие клетки млекопитающих, которые могут быть модифицированы путем введения в одну или несколько указанных клеток или их предшественников нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательности аденовирусной Е1 А в экспрессируемом формате. Необязательно включаются последовательности Е1 В экспрессируемого формата, которые могут быть полезными в связи с антиапоптозным эффектом, свойственным Е1 В, который противодействует потенциальным апоптозным эффектам, возникающим при экспрессии Е1 А.
Способы продуцирования белковых молекул по настоящему изобретению могут также включать дополнительную стадию очистки указанных белковых молекул из культуры клеток млекопитающих. Очистка в контексте настоящего описания может быть проведена путем использования традиционных способов, которые известны в данной области техники, однако предпочтительно использование способов очистки, которые включают стадию, на которой используются посттрансляционные модификации, имеющиеся внутри и/или на указанных белковых молекулах. Еще более предпочтительными являются способы очистки, которые включают стадию, на которой используются заранее заданные посттрансляционные модификации, имеющиеся внутри и/или на указанных белковых молекулах. В случае использования способов аффинной очистки, предпочтительно использовать антитела или другие связующие вещества, такие как лектины, специфичные для определенных углеводных фрагментов, и которые направлены против определенных типов посттрансляционных модификаций. Примерами таких антител служат антитела, направленные против структур (сиалил)-Lewis-Х, структур lacdiNAc или структур GalNac-
- 9 -
008220
Lewis-X. Неограничивающими примерами лектинов, используемых согласно указанному аспекту настоящего изобретения, являются AAL и селектины, такие как Е-селектин, Р-селектин и L-селектин.
Использование таких связующих соединений позволяет очищать (рекомбинантные) белки так, что при этом высокий процент очищенного белка содержит желательную заранее заданную посттрансляционную модификацию. Еще более предпочтительными являются способы, в рамках которых белковую молекулу очищают до гомогенности. Примеры способов очистки белков из культуры клеток млекопитающих приведены в настоящем изобретении, и они охватывают случаи применения способов аффинной хроматографии для очистки ЭП, гликозилированого по мозговому типу, с использованием антител или лектинов, распознающих структуры Lewis-X, имеющиеся в N-гликанах рекомбинантно полученного продукта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемой композиции, включающей белковую молекулу, имеющую заранее заданную посттрансляционную модификацию, которую получают по способу настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители известны специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления указанная белковая молекула в указанной фармацевтически приемлемой композиции представляет собой эритропоэтин. Согласно настоящему изобретению, эритропоэтин, продуцируемый в клетках с маркерами неврального белка требует посттрансляционной модификации, которая будет активна в нервной ткани или в нервных клетках. Однако, эти посттрансляционные модификации несравнимы с посттрансляционными модификациями, наблюдаемыми в ЭП, который циркулирует в крови.
Эритропоэтический эффект ЭП, продуцируемого в клетках с маркерами неврального белка, проявляется значительно слабее. В соответствии с настоящим изобретением, в настоящее время имеется достаточно обоснованное предположение о том, что это связано с отсутствием высокого процента сиаловых кислот и/или с наличием характерных особенностей структур мозгового типа, таких как структуры Lewis-X или концевые галактозиды. Указанное свойство является полезным, поскольку такой ЭП мозгового типа может использоваться в относительно высоких дозировках при лечении расстройств, связанных с нервной тканью, или при лечении повреждений ткани, вызванных ишемией (таких как ишемиче-ская болезнь сердца), и в то же время имеет значительно сниженное воздействие на эритропоэз по сравнению с препаратами ЭП, доступными в настоящее время. Настоящее изобретение относится к рекомби-нантному эритропоэтину, включающему по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из: структуры сиалил-Lewis-X, структуры Lewis-X, а-1,3-связанной фукозы, присоединенной к N-ацетилглюкозамину, структуры LacdiNAc, концевой N-ацетилглюкозаминовой группы и концевой галактозной группы. Указанный рекомбинантный эритропо-этин может продуцироваться в клетке млекопитающего, получаемой по настоящему изобретению, а также в клетках млекопитающих, известных ранее, но которые ранее не признавались как пригодные для данной цели. Одним из примеров являются клетки PER.C6(tm). Настоящее изобретение, в соответствии с еще одним вариантом его осуществления, также относится к использованию клеток PER.C6(tm) для продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, и предпочтительно, чтобы указанная белковая молекула быстро выводилась из кровотока и/или могла использоваться в высокой дозировке. В случае ЭП, образуемого PER.C6(tm), могут использоваться высокие дозировки для лечения или профилактики острых нарушений, связанных с гипоксией, при этом ограничиваются нежелательные побочные воздействия на эритропоэз.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения белковые молекулы по настоящему изобретению пригодны для лечения человека или организма человека путем хирургии, терапии или для диагностики. Предпочтительно ЭП-подобные молекулы по настоящему изобретению используют при производстве лекарственного средства для лечения расстройства, вызванного гипоксией, нейродегенератив-ных поражений или острого нарушения центральной или периферической нервной системы. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные белковые молекулы, такие как ЭП, используют при производстве лекарственного средства для лечения ишемии и/или реперфу-зионных повреждений. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные белковые молекулы, такие как ЭП, используют при производстве лекарственного средства для лечения иммунного расстройства и/или воспалительного заболевания.
В настоящем описании раскрываются способы и композиции для продуцирования и производства рекомбинантных белков. Настоящее изобретение особенно полезно для целей получения белков, которые должны подвергаться модификации в процессе трансляции и/или посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование и соответствующая складчатость, и относится также к использованию клеток человека, способных продуцировать модификации мозгового типа на белковых молекулах в процессе трансляции и/или после трансляции. Указанные клетки могут, например, использоваться для получения гликопротеинов человека, имеющих особенности, свойственные нервным клеткам, которые могут быть терапевтически полезны в связи с их неврональными особенностями.
Настоящее изобретение также относится к использованию линии клеток человека, имеющих характеристики нервных клеток, которые модифицируют рекомбинантно экспрессируемые белки с получением неврональных свойств, таких как посттрансляционные модификации "мозгового типа" или "невро
- 10 -
008220
нального типа", такие как гликозилирование, фосфорилирование или образование складчатой структуры. Пример такой клеточной линии, названной PER.C6(tm) (Патент США № 6033908), был создан путем им-мортализации эмбриональных клеток сетчатки человека с использованием конструкции, содержащей гены Е1 аденовируса. Ранее было доказано, что клетки PER.C6(tm) особенно подходят для получения ре-комбинантных белков человека в связи с высоким выходом белков, таких как ЭП человека, причем при этом могут быть получены полностью сформированные человеческие моноклональные антитела (описано в WO 00/63403). Настоящее изобретение указывает, что рекомбинантные белки, продуцируемые клетками РЕК. С6(tm), могут приобретать определенные тканеспецифические свойства, такие как характеристики нервных клеток (например, посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование). Такой пример иллюстрируется образованием белка, который содержит олигосахариды так называемого мозгового типа. Показано, что ЭП человека, продуцируемый клетками PER.C6(tm), модифицируется с помощью N-связанных Сахаров, которые существенно отличаются от N-связанных Сахаров, обнаруженных в мочевом ЭП человека или в рекомбинантном ЭП человека, продуцируемом клетками яичника китайского хомячка (СНО) или клетками почек детенышей хомячка (ВНК). Мочевой ЭП человека и рекомбинант-ный ЭП человека, продуцируемый в клетках СНО и ВНК, содержит структуры гликозилирования, которые могут быть обозначены как олигосахариды "почечного типа" или "сывороточного типа". В типичном случае, N-связанные сахара указанных препаратов ЭП, продуцируемых в клетках СНО и ВНК, очень сильно разветвлены, в высокой степени галактозилированы и в высокой степени сиалилированы, при том, что они не содержат периферической а-1,3-связанной фукозы (Tsuda et al., 1988; Takeuchi et al., 1988; Nimtz et al., 1993; Watson et al., 1994; Rahbek-Nielsen et al., 1997).
В настоящем изобретении была определена природа олигосахаридов, связанных с ЭП человека, продуцируемым PER.C6(tm), и было показано, что она существенно отличается от природы олигосахари-дов, присутствующих в мочевом ЭП человека и в рекомбинантном ЭП человека, продуцируемом в клетках СНО и ВНК. Во-первых, среднее содержание сиаловой кислоты в олигосахаридах в продуцируемом PER.C6(tm) ЭП человека значительно ниже, чем среднее содержание сиаловой кислоты в мочевом ЭП человека или в рекомбинантном ЭП человека (из клеток СНО или ВНК). Очень низкое содержание сиало-вой кислоты в ЭП человека, продуцируемом PER.C6(tm), является показательным для наличия N-связанных олигосахаридов, которые содержат концевую галактозу, и/или N-ацетилгалактозамин, и/или N-ацетилглюкозамин. Во-вторых, N-ацетилгалактозамин был обнаружен в значительных количествах в N-связанных сахарах в ЭП человека, продуцируемого PER.C6(tm), тогда как N-ацетилгалактозамин не был обнаружен в N-связанных сахарах мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО. Было сообщение о наличии лишь следовых количеств N-ацетилгалактозамина в N-связанных сахарах в нескольких партиях рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого в клетках ВНК (Nimtz et al., 1993). В-третьих, N-связанные сахара в ЭП человека, продуцируемого в PER.C6(tm), содержат, как было показано, очень большое количество фукозы. Фракция фукоз соединяется а-1,3-связью с периферическим N-ацетилглюкозамином, образуя таким образом так называемую структуру Lewis-X (фиг. 5). Никогда ранее не сообщалось о наличии структур Lewis-X в мочевом ЭП человека или в рекомбинант-ном ЭП человека, продуцируемом в клетках СНО и ВНК. Структуры (сиалил)-Lewis-X, присутствующие на ЭП по настоящему изобретению, делают такой ЭП пригодным для связывания с селектинами, и предполагается дальнейшее его применение в кардиопротекции.
В связи с тем, что связанные с белком олигосахариды оказывают громадное воздействие на физико-химические свойства полипептида, такие как третичная структура, растворимость, вязкость и заряд, продуцируемый PER.C6(tm) ЭП человека имеет физико-химические свойства, которые существенно отличаются от таковых у мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО и ВНК (Toyoda et al., 2000). Так, ЭП человека, продуцируемый PER.C6(tm), явно отличается заметно более низким зарядом, чем у мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО и ВНК, в связи с более низким содержанием сиаловой кислоты, и он может быть более гидрофобным в связи с очень высоким содержанием фукозы. В результате, среднее значение ИЭТ для ЭП человека, продуцируемого РЕК.С6(tm), значительно выше, чем среднее значение ИЭТ для мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО и ВНК. Поскольку имеющиеся в ЭП гликаны, в частности сиаловые кислоты, также оказывают воздействие на связывание с рецептором ЭП, ожидается, что ЭП человека, продуцируемый PER.C6(tm), имеет иную аффинность для рецептора ЭП, чем мочевой ЭП человека и рекомбинантный ЭП человека, продуцируемый клетками СНО и ВНК. Несмотря на то, что получение ЭП с использованием клеток PER.C6(tm) было описано ранее (WO 00/63403), в указанном документе не раскрывается никаких структурных особенностей продуцируемого ЭП. В этой связи полученные в настоящем изобретении данные подтверждают вывод о том, что возможность получения ЭП с использованием клеток PER.C6(tm) делает его пригодным для совершенно нового применения, в особенности там, где эритропоэз рассматривается как (нежелательный) побочный эффект. Разумеется, для других белков также можно получить определенную пользу на основании представленных в настоящем изобретении результатов. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается способ получения требуемого белка, включающего N-гликаны, содержащие Lewis-X и/или LacdiNAc, с
- 11 -
008220
использованием PER.C6(tm) или любых клеток млекопитающих, экспрессирующих Е1А. Примерами белков, которые могут приобрести полезные свойства благодаря наличию таких структур и, в этой связи, могут быть получены с использованием названных клеток, являются эритропоэтин, трансферрин, глико-делин, такой как гликоделин А (РР14), фактор роста нервных клеток (NGF), нейротропный фактор из головного мозга, нейротрофин-3, -4/5 и -6, цилиарный нейротропный фактор, фактор ингибирования лейкоза, кардиотропин-1, онкостатин-М, интерлейкин, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 и -2, TGF-Р, глиальный нейротропный фактор, нейртурин, персефин, миостатин, фактор-1, -2 и -5 роста фибробластов, амфире-гулин, фактор, индуцирующий активность рецептора ацетилхолина, нетрин-1 и -2, нейрегулин-2 и -3, плейотропин, мидкин, фактор стволовых клеток (CSF), агрин, CSF-1, PDGF, сапозин С, рецептор-1 растворимого комплемента, альфа-1 кислый гликопротеин, протеины острой фазы, лиганд-1 Е-селектина, LAM-1, карциноэмбриональные антигеноподобные антигены CD66, аддресин периферического лимфатического узла, CD75, CD76, CD45RO, CD21, гликопротеиновый лиганд-1 Р-селектина, GlyCAM-1, гли-копротеины муцинового типа, CD34, подокаликсин, а1-антихимотрипсин, ингибитор al-протеазы, а-амилаза, гликопротеины слюнной железы, обогащенные пролином, SERP-1, интерферон-Р, Р-следовый протеин, протеин С, урокиназа, гликопротеин из Schistosome, гликоделин А, ингибитор метаболизма тканевого фактора, а-фетопротеин, белки беременности человека, такие как гонадотропные гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), человеческий хориого-надотропин (чХГ) или фрагменты, или варианты любого из указанных веществ, которые способны включать указанные структуры гликозилирования. Используемые в настоящем изобретении фрагменты представляют собой части белка и могут быть пептидами из нескольких аминокислот, простирающимися до почти целых белков. Варианты могут представлять собой мутеины, белки слияния, белки или пептиды, сопряженные с другими небелковыми фрагментами, и т.п. Такие фрагменты или варианты по настоящему изобретению должны обладать способностью подвергаться посттрансляционным модификациям.
В других аспектах настоящего изобретения, предлагаются способы получения фракции, обогащенной белковой молекулой, содержащей N-связанные гликаны, включающие (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNac-структуры, включающие стадии: (а) рекомбинантной экспрессии указанной белковой молекулы в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1 А из аденовируса; и (b) фракционирования продуцированных таким образом белковых молекул с получением фракции, которая обогащена молекулами, содержащими указанные N-связанные гликаны, включающие структуры (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNac. Указанные выше белковые молекулы могут приобретать полезные свойства при реализации указанного аспекта настоящего изобретения. Было описано, что белок С, продуцированный клетками НЕК293 и впоследствии очищенный из них, содержит определенную структуру гликозилиро-вания, включающую структуры GalNAc-Lewis-X (Grinnell et al. , 1994), но выделенные и очищенные белки не были, как предполагалось, обогащены сахарами указанного типа, в результате чего данные клетки не были выбраны в качестве клеток-продуцентов, которые экспрессируют Е1А. Достоинством настоящего изобретения является раскрытие того факта, что клетки млекопитающих, экспрессирующие аденовирусный Е1А, могут использоваться для продукции белков с N-связанными гликанами, включающими планируемые структуры (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNAc, и далее для обогащения указанными структурами определенных фракций. Предпочтительно указанные фракции обогащаются по способу, включающему стадию аффинной очистки, на которой используются желательные гликановые структуры, такие как использование связывания с лектином или с моноклональным антителом, которые взаимодействуют с указанными N-связанными гликанами, содержащими структуры (сиалил)-Lewis-X и/или LacdiNAc. В настоящем изобретении показано, что использование указанных способов создания ЭП делает возможным получение фракций ЭП с определенными профилями гликозилирования. В этой связи, одним из аспектов настоящего изобретения является предложение композиций, включающих эритропо-этинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, отличающихся тем, что среднее число структур Lewis-X на N-связанных гликанах в расчете на одну эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2. В других вариантах осуществления указанное среднее число структур Lewis-X на N-связанных гликанах в расчете на одну эритропоэтин-подобную молекулу составляет, по меньшей мере, примерно 2,6; 2,7; 3,6; 4,1 или 5,7. Такие композиции могут быть ценным инструментом для медицинских применений, раскрытых в настоящем описании.
Кроме того, настоящее изобретение раскрывает использование белков мозгового типа, продуцируемых в нервных клетках человека, для лечения ишемии/реперфузионного повреждения у млекопитающих, особенно у людей. Ишемия/реперфузионное повреждение в контексте настоящего описания определяется как повреждение клеток, которое происходит после реперфузии ранее жизнеспособных ишемических тканей. Ишемическое/реперфузионное повреждение связано, например, но не ограничивается приведенным списком, с тромболитической терапией, коронарной ангиопластикой, перекрестным шунтированием аорты, сердечно-легочным шунтированием, трансплантацией органов или тканей, травмами и шоком.
- 12 -
008220
Настоящее изобретение относится к использованию продуцируемых в клетках млекопитающих терапевтических белков с олигосахаридами мозгового типа. Указанные олигосахариды мозгового типа включают, в частности, Lewis-X-структуры, сиалил-Lewis-X-структуры или их производные, содержащие структуру (сиалил)-Lewis-X, применяемые для лечения ишемии/реперфузионного повреждения у млекопитающих, таких как люди. Присутствие сиалил-Lewis-X-стpyктyp на рекомбинантных белках нацеливает данные белки на поврежденный сайт, содержащий ишемию/реперфузию, и в этой связи, их протекторное воздействие в отношении ишемии/реперфузии оказывается более эффективным, чем у белков, не содержащих (сиалил)-Lewis-X-структур. Присутствие олигосахаридов мозгового типа на реком-бинантно экспрессированных белках проиллюстрировано в настоящем изобретении эритропоэтином (ЭП), который продуцируется клетками PER.C6(tm). Указанный конкретный тип ЭП содержит Lewis-X-, а также сиалил-Lewis-X-структуры. В настоящем изобретении описаны эксперименты, которые показывают улучшенные свойства ЭП мозгового типа (или невронального типа) из клеток PER.C6(tm) по сравнению с ЭП сывороточного типа (или почечного типа) в отношении кардиопротекторной функции на моделях in vivo ишемии/реперфузионного повреждения сердечной ткани и кровоизлияния.
Другим достоинством настоящего изобретения является то, что продуцируемый клетками PER.C6(tm) ЭП человека имеет нейротропную активность. Продуцируемый PER.C6(tm) ЭП придает белку ЭП физико-химические, и/или фармакокинетические, и/или фармакодинамические преимущества при функционировании в качестве нейротропного и/или нейропротекторного средства. Продуцируемый клетками PER.C6(tm) ЭП имеет большую аффинность в отношении нервных клеток и для рецепторов ЭП на нервных клетках, чем гликозилированный рекомбинантный ЭП человека сывороточного типа с высоким уровнем сиалилирования, продуцируемый клетками СНО и ВНК. Рекомбинантный ЭП человека, продуцируемый в клетках, отличных от нервных (Goto et al., 1998), имеет более низкую аффинность в отношении рецепторов ЭП на нервных клетках, чем в отношении рецепторов ЭП на эритроидных клетках-предшественниках (Musada et al., 1993 и 1994).
Нейропротекторная роль ЭП четко открывает новые возможности использования рекомбинантного ЭП человека в нейропротекторной терапии в ответ на воздействие токсичных химических соединений, которые могут быть индуцированы воспалением или гипоксией и/или ишемией, или в случае нейродеге-неративных нарушений. И еще важным недостатком является тот факт, что при использовании в качестве нейропротекторного средства рекомбинантный ЭП, присутствующий в кровотоке, может также приводить к повышению массы эритроцитов или гематокрита. А это, в свою очередь, ведет к повышению вязкости крови, что может оказывать пагубное действие, приводя к ишемии мозга (Wiessner et al., 2001).
Настоящее изобретение относится к решению проблемы, связанной с тем, что применявшийся в качестве нейропротекторного средства рекомбинантный ЭП человека оказывал нежелательный гемато-тропный побочный эффект (Wiessner et al., 2001). Так, было показано, что продуцируемый клетками PER.C6(tm) гликозилированный рекомбинантный ЭП человека мозгового типа имеет высокий потенциал в качестве средства для нейрогенеза и/или нейропротекторного средства, поскольку он имеет низкий потенциал по стимуляции эритропоэза.
В соответствии с настоящим изобретением ЭП, продуцируемый в клетке млекопитающего, которая экспрессирует Е1А, такой как продуцируемый клетками PER.C6(tm) ЭП, может вводиться системно (внутривенно, внутрибрюшинно, внутрикожно) для ингибирования, предупреждения и/или восстановления повреждения нервной ткани, которое, в свою очередь, вызывается, например, острым повреждением головы и мозга или нейродегенеративными расстройствами. Настоящее изобретение также относится к продуктам, которые могут использоваться для модулирования функции тканей, которые могут получить тяжелые повреждения при гипоксии, таких как центральная и периферическая нервная система, ткань сетчатки и сердечная ткань млекопитающих. Такие ткани могут быть поражены заболеванием, но могут также быть нормальными и здоровыми. Расстройства, которые можно лечить с использованием продуктов, предлагаемых по настоящему изобретению, могут возникать в результате повреждений головы, мозга и/или сердца, нейродегенеративных заболеваний, судорожных расстройств, отравления нейротокси-нами, гипотензии, остановки сердца, облучения, рассеянного склероза и/или от повреждений, связанных с гипоксией. Гипоксия может быть результатом пренатального или постнатального недостатка кислорода, удушения, эмфиземы, септического шока, остановки сердца, асфикции, утопления, кризиса при серповидно-клеточной анемии, респираторного дистресс-синдрома взрослых, аритмии, азотного наркоза, постхирургической дисфункции распознавания, отравления окисью углерода, вдыхания табачного дыма, хронического обструктивного заболевания легких, анафилактического шока или инсулинового шока. Судорожные расстройства включают, не ограничиваясь приведенным списком, эпилепсию, хроническое судорожное расстройство или конвульсии. В том случае, когда указанные патологии являются результатом нейродегенеративных заболеваний, указанное расстройство может быть связано со слабоумием при СПИДе, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Крейтцфельда-Якоба, кровоизлиянием, церебральным параличом, травмой спинного мозга, травмой головного мозга, связанной с возрастом утратой познавательной функции, амиотрофным латеральным склерозом, алкоголизмом, ишемией сетчатки, глаукомой, общим снижением уровня нейронов, потерей памяти или старением. Другие примеры заболеваний, которые можно лечить продуктами по настоящему изобретению, включают аутизм, депрес
- 13 -
008220
сию, тревожные расстройства, расстройства настроения, гиперактивность со снижением внимания (ADHD) и расстройство познавательной способности.
ЭП из клеток PER.C6(tm) может пассивно проходить через гематоэнцефалический барьер в случае дисфункции гематоэнцефалического барьера. В том случае, когда гематоэнцефалический барьер является неповрежденным, ЭП из клеток PER.C6(tm), как полагают, активно транспортируется через гематоэнце-фалический барьер посредством рецептора ЭП. Ряд исследований позволяет предположить, что ЭП сам по себе способен проходить через гематоэнцефалический барьер при введении высоких доз рекомби-нантного ЭП (WO 00/61164). Другой предполагаемый путь, посредством которого рекомбинантный ЭП из клеток PER.C6(tm) может пересечь гематоэнцефалический барьер, связан с взаимодействием гликано-вых структур (сиалил)-Lewis-X, имеющихся на ЭП, продуцируемом PER.C6(tm), с молекулами Е-селектина, имеющимися на эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга человека (Lou et al., 1996). Взаимодействие между Е-селектином и ЭП может облегчать перенос ЭП через эндотелиальный барьер головного мозга, поскольку Е-селектин также участвует в миграции Т-лимфоцитов в ЦНС (Wong et al., 1999). Если это необходимо для оптимальной нейропротекции, продуцируемый клетками PER.C6(tm) ЭП может вводиться в значительно более высокой дозе, чем ЭП сывороточного типа, поскольку продуцируемый PER.C6(tm) ЭП будет индуцировать эритропоэз значительно менее эффективно, так что пагубный эффект повышения гематокрита будет понижен или даже будет совсем отсутствовать.
В другом аспекте настоящего изобретения ЭП, продуцируемый в клетке млекопитающего, которая экспрессирует Е1 А, такой как ЭП из PER.C6(tm), может вводиться внутриоболочечно инфузией или с помощью введенного желудочкового катетера или посредством поясничной инъекции с целью ингибиро-вания или предотвращения повреждения нервной ткани. И вновь преимущество использования ЭП мозгового типа над ЭП сывороточного типа заключается в том, что не будет наблюдаться нежелательных побочных эффектов в отношении эритропоэза в случае просачивания в кровоток при дисфункции гема-тоэнцефалического барьера, связанной, например, с кровоизлиянием.
В настоящем изобретении установлено, что неопределенно долго растущие трансформированные клетки, которые вырастают до очень высокой плотности в бессывороточных условиях и которые обладают характеристиками нервных клеток, такие как PER.C6(tm), чрезвычайно полезны для целей продуцирования факторов, функционирование которых зависит от указанных характеристик. Это, в свою очередь, также создает возможность продуцировать факторы, которые не обладают неврональными характеристиками или связанными с нервными клетками функциями, но которые, тем не менее, имеют преимущества, связанные с посттрансляционными модификациями, производимыми в таких клетках. Можно показать, что некоторые факторы также играют роль в отношении ткани, не являющейся нервной, но которая также требует участия структур гликозилирования, включающих, например, структуры Lewis-X или фукозные остатки, описанные для ЭП в настоящем изобретении, и наличие которых может быть обеспечено средствами и способами по настоящему изобретению. Примеры факторов, которые могут продуцироваться с помощью PER.C6(tm) и которые имеют преимущества, определяемые наличием невро-нальных характеристик у клеток PER.C6(tm), включают, не ограничиваясь приведенным списком, эритро-поэтин мозгового типа, трансферрин и различные факторы из числа указанных выше. В настоящем изобретении показано, что весьма вероятно, что продукция других рекомбинантных нейротропных глико-протеинов будет также улучшена за счет модификаций мозгового типа, которые имеют место в таких клетках.
В соответствии с настоящим изобретением, неожиданно было обнаружено, что эритропоэтин-подобные молекулы, имеющие в среднем сниженное число остатков сиаловой кислоты в расчете на белковый скелет, все еще эффективны при лечении и/или профилактике различных заболеваний. Это открывает совершено новые пути использования ЭП и ЭП-подобных молекул, которые, как считалось ранее, менее полезны или вообще не могут использоваться, и которые включают, не ограничиваясь приведенным списком, фракции ЭП с низким содержанием сиалиловых остатков партий ЭП, получаемых в системах рекомбинантных клеток млекопитающих, которые отбрасывают при фракционировании из-за низкого уровня сиалилирования и/или связанной с ним низкой эритропоэтической активности. Таким образом, в настоящем изобретении показано, что ЭП с низким содержанием сиаловой кислоты примерно также полезен для снижения размера некротической зоны на модели экспериментально индуцированного кровоизлияния у крыс, как и ЭП с более высоким содержанием сиаловой кислоты. В данной области техники хорошо установлено, что высокое содержание сиаловой кислоты в ЭП коррелирует с более длительным периодом полувыведения данного соединения из кровотока и с повышенным эритропоэтическим потенциалом in vivo (Tsuda et al., 1990; Morimoto et al., 1996).
В этой связи, настоящее изобретение в целом относится к использованию композиции эритропо-этин-подобных молекул, выбранных из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина, одного или нескольких производных эритропоэтина и композиции из одной или нескольких фракций эритропоэтиновых молекул с различной степенью сиалилирования, при получении лекарственного средства для лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного поражения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейро-дегенеративного расстройства и острого поражения центральной или периферической нервной системы,
- 14 -
008220
где указанная композиция эритропоэтинподобных молекул имеет в расчете на содержание белка более низкую эритропоэтическую активность in vivo, чем у альфа-эпоэтина и у бета-эпоэтина. Варианты осуществления настоящего изобретения включают композиции и их использование, где указанная эритро-поэтическая активность in vivo у них по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% ниже, чем у альфа-эпоэтина (Эпрекс (Eprex)) или бета-эпоэтина. Эритропоэтин-подобные молекулы в контексте настоящего описания включают молекулы, которые имеют белковый скелет, идентичный известным в настоящее время формам ЭП, например мутеины ЭП, производные ЭП или молекулы ЭП, различающиеся по гликозилированию белкового скелета в качественном и/или количественном отношении. Мутеины в контексте настоящего описания означают эритропоэтин-подобные молекулы, которые имеют одну или несколько мутаций в белковом скелете, полученных путем делеции, добавки, замещения и/или транслокации аминокислот, связанных с белковым скелетом альфа-эпоэтина, и включают природные аллельные варианты, а также генетически, и/или химически, и/или энзиматически полученные варианты. Такие молекулы должны быть способны проявлять функциональную активность ЭП. Их получают с использованием стандартных методик молекулярной биологии, хорошо известных специалистам в данной области техники. Производные в контексте настоящего описания означают эритропоэтинподобную молекулу, которую получают из эритропоэтина или альфа-эпоэтина или из любого другого функционального му-теина альфа-эпоэтина посредством его химической или энзиматической модификации. Эритропоэтиче-ская активность в контексте настоящего описания означает стимулирующий эффект ЭП на продукцию эритроцитов у человека или животного, которая измеряется по повышению величины гематокрита в определенной временной точке после введения человеку или животному эритропоэтин-подобных молекул (см., например, пример 9) или путем измерения концентрации гемоглобина. Указанные методы хорошо известны специалистам в данной области техники. Альфа-эпоэтин представляет собой рекомбинантную форму ЭП человека, имеющуюся в настоящее время на рынке в виде препарата Эпрекс-(tm), и является близким или идентичным (с точки зрения аминокислотного и углеводного состава) эритропоэтину человека, выделенному из мочи пациентов с анемией. Режим лечения, проводимого с целью увеличения эри-тропоэза, хорошо установлен. В основном, дозировки ЭП даются в ME (международные единицы), которые относятся к активности ЭП в эритропоэзе. Такие значения ME коррелируют с содержанием белка ЭП, но не определяются функционально, и в этой связи, уровень корреляции может варьировать между различными партиями. По определению, 1 ME соответствует 8-10 нг. альфа-эпоэтина. Для целей пояснения настоящего изобретения эритропоэтическая активность эритропоэтин-подобных молекул указывается на основе содержания белка с тем, чтобы избавиться от различных переменных, которые применяются при определении ME. Специалисту в данной области техники понятно, что, хотя значения ME обычно приводят для коммерческих препаратов ЭП, концентрация молекул ЭП в таких препаратах может быть легко определена стандартными методами. Это позволяет определить относительную удельную активность, например величину МЕ/г (см., например, ЕР 0428267). Несколько тестов in vivo и in vitro, полезных для данной цели, описаны также в работе Storring et al., 1992. Примеры других форм ЭП, имеющихся в настоящее время на рынке, включают Прокрит (Procrit) или Эпоген (Epogen) (оба являются альфа-эпоэтином) и Аранесп (Aranesp) (альфа-дарбэпоэтин, ЭП с дополнительными сайтами N-гликозилирования, служащими для повышения периода полувыведения и эритропоэтической активности). Хотя эритропоэтическая активность может в некоторой степени варьировать между различными коммерческими препаратами альфа-эпоэтина и бета-эпоэтина, имеющимися на рынке, они в целом оптимизированы с целью достижения высокой эритропоэтической активности. Настоящее изобретение описывает использование ЭП-подобных молекул или ЭП-форм, которые имеют пониженную гемопоэтиче-скую или эритропоэтическую активность, снижая или элиминируя за счет этого побочные эффекты, связанные с повышенным эритропоэзом, когда они нежелательны.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения композиция эритропо-этин-подобных молекул отличается средним числом остатков сиаловой кислоты на эритропоэтин-подобную молекулу, которое по меньшей мере на 10% ниже, чем среднее число остатков сиаловой кислоты на эритропоэтиновую молекулу в альфа-эпоэтине. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения, указанное среднее число остатков сиаловой кислоты может быть выбрано на уровне по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% ниже, чем среднее число остатков сиаловой кислоты на белковый скелет ЭП в альфа-эпоэтине. Указанное среднее число остатков сиаловой кислоты в эритропоэтинподобной молекуле предпочтительно лежит в интервале от 0 до 90% от среднего числа остатков сиаловой кислоты на молекулу ЭП в альфа-эпоэтине, хотя точное процентное соотношение может варьировать от расстройства к расстройству, и иногда - от пациента к пациенту, так как некоторые сочетания пациент - расстройство в меньшей степени чувствительны к высоким величинам гема-токрита, чем другие. Альтернативно, число остатков сиаловой кислоты может быть описано, например, значением 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобную молекулу. Поскольку приведенные значения представляют собой среднюю величину, вычисленную для композиции, которая состоит из ЭП-подобных молекул с различной степенью сиалилирования, возможны варианты нецелых значений указанных выше величин, которые определяют молекулы по настоящему изобретению. Оптимальный диапазон может быть определен эмпирически, что не слишком обременяет
- 15 -
008220
специалистов в данной области техники. Среднее число остатков сиаловой кислоты на молекулу или среднее содержание сиаловой кислоты в ЭП может быть определено по известным процедурам, такие методики хорошо известны специалистам в данной области техники. Одна возможная процедура описана в ЕР 0428267. Вкратце методика состоит в том, что остатки сиаловой кислоты отщепляют от ЭП-подобных молекул путем гидролиза с использованием 0,35М серной кислоты при 80°С в течение 30 мин, после чего полученный раствор перед анализом нейтрализуют гидроксидом натрия. Альтернативно, сиа-ловые кислоты удаляют энзиматическим расщеплением по стандартным методикам. Количество ЭП оценивают с использованием хорошо известных процедур, например, с помощью коммерчески доступных наборов для анализа белка (например, по методу Брэдфорда, Biorad) и с использованием стандартных кривых, построенных на основе рекомбинантного ЭП человека в качестве стандарта, при длине волны 280 нм, методом ИФТФА, РИА и им подобных. Содержание сиаловых кислот может быть определено по методике Jourdian et al., (1971). Альтернативно, содержание сиаловых кислот может быть проанализировано с помощью анионообменной хроматографии высокого разрешения по известным специалистам методикам (например, Анализ сиаловых кислот с использованием анионообменной хроматографии высокого разрешения. Заявка № TN41, Dionex). Содержание сиаловых кислот может быть выражено в виде молей сиаловой кислоты на моль ЭП или в виде среднего числа остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобной молекуле. Показание среднего числа остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобной молекуле может быть получено при изоэлектрическом фокусировании (см. пример 4), которое измеряет ИЭТ (pI).
Можно рассмотреть несколько путей получения эритропоэтин-подобных молекул со сниженным средним числом остатков сиаловой кислоты на эритропоэтин-подобную молекулу. Указанные пути включают, не ограничиваясь приведенным списком, обработку ЭП-подобных молекул, например, полученных рекомбинантно в любой подходящей линии клеток-хозяев, с использованием ферментов, которые отщепляют сиаловую кислоту, в частности таких как нейраминидазы, или ферментов, которые отщепляют большее количество заместителей (включая сиаловую кислоту) из гликозилированных структур, таких как, например, N-гликаназа F (удаляет целиком N-гликан), эндогликозидаза F2 (удаляет би-антенные структуры), эндогликозидаза F3 (удаляет би- и три-антенные структуры) и т. п., или обработку ЭП-подобных молекул химическими соединениями, которые включают, не ограничиваясь ими, кислоты, что приводит к снижению среднего числа остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобную молекулу. В частности, высокосиалилированная фракция ЭП может быть таким образом десиалилирована и использована по настоящему изобретению. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения ЭП-подобные молекулы со сниженным средним содержанием молекул сиаловой кислоты получают путем очистки или отделения таких форм из смеси, содержащей и ЭП с повышенным, и ЭП со сниженным содержанием сиаловой кислоты. Используемые в настоящее время системы продукции приводят, в целом, к получению таких смесей, и ЭП, предназначенный для целей эритропоэза, получают путем очистки форм с высоким средним числом остатков сиаловой кислоты. Настоящее изобретение описывает использование других фракций, получаемых в ходе указанного процесса, то есть форм ЭП со сниженным числом остатков сиаловой кислоты. Очистка или отделение таких фракций могут быть проведены с использованием установленных методик, известных специалистам в данной области техники, таких как ионообменная, аффинная очистка и т. п. Эритропоэтин-подобные молекулы по настоящему изобретению предпочтительно получают рекомбинантно. Такое получение может быть осуществлено в любой подходящей системе экспрессии, которые включают, не ограничиваясь указанным, клетки яичника китайского хомячка, клетки почки детенышей хомячка, клетки человека, такие как HeLa, HEK293 или PER.C6(tm). Возможно также осуществлять экспрессию в клетках низших эукариот, таких как клетки насекомых или дрожжей. Продуцирование ЭП-подобных молекул со сниженным содержанием сиаловой кислоты может быть осуществлено в системе клеток, дефицитных по сиалилированию, у которых в естественном состоянии отсутствуют ферменты сиалилирования, такие как некоторые прокариотические клетки-хозяева, или могут быть получены путем мутагенеза или генетической модификации клеток-хозяев, способных продуцировать сиалилированные белки. Способы и средства продукции рекомбинантных белков хорошо описаны и известны специалистам в данной области техники, и для специалиста в данной области техники очевидно, что можно использовать разные источники ЭП-подобного белка, не отходя от объема настоящего изобретения. В одном аспекте настоящего изобретения ЭП-подобные молекулы получают по способам настоящего изобретения, что приводит к получение молекул с заранее заданной посттрансляционной модификацией. В другом аспекте настоящего изобретения композиции, включающие эритропо-этин-подобные молекулы, характеризуются наличием эритропоэтинподобных молекул, которые при парентеральном введении человеку или животному выводятся из кровотока быстрее, чем альфа-эпоэтин и бета-эпоэтин. Клиренс из кровотока может быть измерен с использованием хорошо известных методик, например, путем измерения периода полувыведения белка из крови по методике, такой как описана в примере 18. У здоровых волонтеров период полувыведения альфа-эпоэтина из кровотока после повторных внутривенных инъекций составляет примерно 4 ч. Период полувыведения составляет примерно 5 ч у пациентов с хронической почечной недостаточностью и примерно 6 ч у детей, как следует из литературных данных. С использованием методики примера 8 авторы настоящего изобретения измеряли период полувыведения, равный 180 мин, для альфа-эпоэтина (Эпрекса). Для специалиста в данной области оче
- 16 -
008220
видно, что указанный способ может использоваться для определения периода полувыведения композиции по настоящему изобретению, и указанный период полувыведения может быть выражен в часах или в процентах от периода полувыведения стандартного ЭП (Эпрекса). Аналогичные эксперименты могут быть осуществлены на людях с целью определения периода полувыведения у людей.
Эритропоэтинподобные молекулы со сниженным уровнем содержания тетра-антенных структур относительно би-антенных структур будут также иметь укороченный период полувыведения из плазмы (Misaizu et al., 1995; Takeuchi et al., 1989). Возможно получать ЭП в клеточных линиях, которые позволяют получать такие сниженные соотношения, или, альтернативно, указанные формы очищают из форм, содержащих большее число тетра-антенных структур. Такие композиции, содержащие относительно больше би-антенных структур, также являются полезными согласно настоящему изобретению. Очевидно, также, что одним из достоинств настоящего изобретения является, то, что можно достичь более высоких максимальных концентраций эритропоэтинподобных молекул в кровотоке по сравнению с используемыми в настоящее время ЭП формами, такими как Эпрекс, Прокрит, (Eprex, Procrit), NESP. Если для упомянутого лечения желательны высокие концентрации ЭП-подобных молекул, этого можно достичь введением высоких доз композиций по настоящему изобретению, например, в виде фармацевтических препаратов, содержащих такие высокие дозы. Введение аналогичных по содержанию белка доз используемых в настоящее время ЭП-подобных молекул привело бы к повышенному эритропоэзу, который является нежелательным побочным эффектом при данных видах лечения.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные эритропоэтинподобные молекулы, и к способам лечения или профилактики расстройств, выбранных из указанных групп, а также к композициям эритропоэтинподобных молекул для профилактического и/или терапевтического лечения человека или животного.
Примеры
Пример 1. Изучение экспрессии маркерных белков в клетках PER.С6(tm)
Клетки, которые были трансформированы Е1-участком человеческого аденовируса типа 5, что дало клеточную линию PER.C6(tm) (депонированную в ЕСАСС под № 96022940), получали из сетчатки человека. Сетчатка в целом включает множество различных типов клеток (по меньшей мере 55 различных подтипов нервных клеток), включая нервные и фибробластоподобные клетки (Masland 2001). Для того, чтобы отследить клеточное происхождение PER.C6(tm), проводили исследование для определения экспрессии маркерных белков внутри или на клетках. Указанные маркеры известны в данной области техники и являются характерными для определенных типов клеток и/или тканей. Маркерные белки приведены в табл. I.
Экспрессию маркерного белка анализировали с использованием антител, направленных против маркерных белков. В каждом эксперименте отрицательный контроль (клетки PER.С6(tm), не инкубированные с антителом) и положительный контроль брали параллельно. Указанные позитивные контроли представляют собой срезы тканей человека, в отношении которых известно, что они экспрессируют маркерный белок (табл. II).
Клетки PER.C6(tm) культивировали на стеклянных пластинках в камере для среды (Life Technologies, Nunc Lab-Tek, Chamber Slide, стерилизация облучением, 2 камеры для среды, номер по каталогу 154464А). Клетки PER.C6(tm) высевали до 65-70% слияния (по 2 ячейки на камеру для культивирования) и культивировали в течение 24 ч при 37°С (10% CO2, влажность 95%). Затем среду отсасывали и стеклянные пластинки с клетками промывали стерильным ФСБ, удаляли из камеры для среды и высушивали на воздухе. Клетки фиксировали на стеклянных пластинках путем инкубирования в ацетоне в течение 2 мин. После высушивания на воздухе слайды заворачивали в алюминиевую фольгу и замораживали при температуре ниже -18°С до использования.
Ткани положительного контроля получали из банков тканевых слайдов, приготовленных для обычного использования в отделении патологии Academic Hospital Erasmus University (Роттердам, Нидерланды). Готовили замороженные срезы (5 мкм) и фиксировали их в ацетоне по обычным методикам.
Первичные антитела, их соответствующие маркерные белки, поставщики антител и каталожные номера приведены в табл. III. Разведения, также подробно описанные в табл. III, готовили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина. Инкубирование слайдов с первичными антителами проводили в течение 30 мин при комнатной температуре, промывали их ФСБ и инкубировали со вторичными антителами. Указанные вторичные антитела представляли собой либо козьи антитела против иммуноглобулинов кролика (DAKO Е0432; разведение 1:50) либо козьи антитела против иммуноглобулинов мыши (DAKO E0433; разведение 1:50), в зависимости от природы используемого первичного антитела. Вторичные антитела конъюгировали с биотином. После промывания ФСБ полученные слайды инкубировали с комплексом стрептавидин-авидин/биотин, конъюгированным со щелочной фосфатазой (DAKO, К0376). После инкубации в течение 30 мин образцы промывали раствором Трис/HCl с рН 8,0 и обрабатывали фуксин-хромогенным субстратом (DAKO K0624) в темной комнате в течение 30 мин. Затем слайды промывали в течение 2 мин водопроводной водой и проводили контрокрашивание гематоксилином в соответствии с обычными методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Затем слайды просматривали под микроскопом и анализировали на наличие экспрессии маркерного белка (отрицательный или положительный результат). Результаты представлены в табл. IV. В случае окрашивания нейрофиламентов (положительное), не все клетки PER.C6(tm) окрашива
- 17 -
008220
лись положительно в результате того, что они находились на различных стадиях клеточного цикла или фазы созревания клеточной популяции. Это является нормальным результатом при окрашивании нейро-филаментов.
Из полученных данных был сделан вывод, что клетки PER.C6(tm) имеют неврональное происхождение, поскольку клетки положительно окрашивались виментином, синаптофизином, нейрофиламентом,
GFAP и N-CAM.
Пример 2. Моносахаридный состав N-гликанов ЭП из клеток PER.C6(tm) по сравнению с N-гликанами Эпрекса (Eprex)
Первым этапом характеристики N-гликановых структур, продуцируемых PER.C6(tm), является измерение молярного соотношения различных моносахаридов. Анализ моносахаридов проводили с использованием высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD). Для данного анализа были выбраны образцы ЭП, образованного в процессе роста PER.С6(tm)-клонов Р7, Р8 и С25 на среде DMEM и/или JRH (клоны Р7 и Р8 описаны в WO 00/63403, а С25 получен непосредственно в соответствии с указанными методами, использующими ген устойчивости к неомицину в качестве селективного маркера [плазмида pEPO2001/Neo]). Параллельно проводили анализ препарата Эпрекс (Eprex; Jansen Cilag), который представляет собой коммерчески доступный ре-комбинантный эритропоэтин, продуцируемый клетками СНО, и в данном случае использовался в качестве эталона.
Образцы ЭП из PER. С6(tm) очищали аффинной хроматографией на колонке, заполненной шариками С4 Сефарозы (заполненный объем 4 мл, (Amersham Pharmacia Biotech)), связанной с моноклональными мышиными антителами против ЭП (IgGl). Связанные молекулы ЭП элюировали 0,1М глицин-HCl, рН 2,7 и полученные в результате фракции сразу же нейтрализовали добавлением натрий/калий фосфатного буфера с рН 8,0. После этого объединяли фракции, содержащие ЭП, и буфер заменяли на 20 мМ Трис-HCl, содержащий 0,1% (об./об.) Твин 20, с использованием колонок для обессоливания Hiprep 26/10 (Amersham Pharmacia Biotech).
Для анализа гликанов очищенные образцы ЭП диализовали в течение ночи против деионизирован-ной воды качества Milli-Q и высушивали в вакуумном испарителе Speedvac. Высушенные образцы ЭП (в количестве от 39 до 105 мкг) растворяли в буфере для инкубации (в разбавлении 1:1 С3 профилирующим буфером, Glyko). После добавления додецилсульфата натрия (ДСН) и бета-меркаптоэтанола до конечной концентрации 0,1% (вес./об.) и 0,3% (об./об.) соответственно, образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. Затем добавляли Nonidet P-40 (BDH) до конечной концентрации 0,75% (об./об.) и ЭП подвергали дегликозилированию в течение ночи при 37°С с использованием N-гликаназы F (мЕ, Glyko). После дегликозилирования высвободившиеся N-гликаны отделяли от белков, солей и детергентов с использованием SPE-колонок (Alltech) с графитным черным углем (Carbograph) в соответствии с методикой Packer et al., (1998).
Очищенные N-гликановые цепи подвергали гидролизу в 2М трифторуксусной кислоте (ТФУ) при 100°С в течение 4 ч. После гидролиза моносахариды сушили в вакуумном испарителе Speedvac, промывали водой и снова высушивали в вакуумном испарителе Speedvac. Высушенные моносахариды растворяли в 26 мкл деионизированной воды качества Milli-Q. После добавления 6 мкл раствора дезоксиглюко-зы (100 нмоль/мл), которую использовали в качестве внутреннего стандарта, образцы (24,5 мкл) помещали в систему HPAEC-PAD BioLC с колонками CarboPac PA1 (Dionex) диаметром 2 мм. Изократическую элюцию с колонки вели в 16 мМ NaOH (Baker) со скоростью потока 0,25 мл/мин. Состав моносахаридов рассчитывали путем сравнения профиля с профилем, полученным со смесью стандартных моносахаридов, которая состоит из фукозы, дезоксиглюкозы, галактозамина, глюкозамина, галактозы и маннозы.
Данные анализа моносахаридов показали, что состояние гликозилирования ЭП из PER.C6(tm) значительно отличается от такового в препарате Эпрекс (Eprex) (табл. V). Соотношение указанных моносахаридов (Man = манноза; Fuc = фукоза; GalNAc = N-ацетилгалактозамин; GlcNAc = N-ацетилглюкозамин; Gal = галактоза) нормализовали до 3 Man. В скобках приведены удвоенные значения. Образцы ЭП из PER.C6(tm) содержат значительное количество GalNAc, тогда как N-связанные сахара в Эпрекс не содержат указанного остатка. Это свидетельствует, что ЭП из PER.C6(tm) содержит так называемые LacdiNAc-структуры (например, GalNAcP1-4GlcNAc). Другой особенностью ЭП из PER.C6(tm), как видно из табл. V, является относительно большое количество остатков фукозы. Это в значительной степени свидетельствует о наличии Lewis-структур в N-гликанах ЭП из PER.C6(tm). В противоположность этому, известно, что эпрекс не содержит Lewis-структур. Следовательно, количество фукозы, найденной в эпрекс, может быть полностью связано с фукозилированием N-гликанового ядра. Следует отметить, что данные анализа моносахаридов также показывают, что условия культивирования влияют на состояние гликозилирования ЭП в PER.C6(tm). Из этого не следует вывода о том, что только условия культивирования определяют заранее заданные посттрансляционные модификации, имеющиеся на продуцированных белках. Разумеется, клеточные линии должны быть способны модифицировать посттрансляционные модификации белков, продуцируемых такими клеточными линиями, благодаря наличию определенных специфических глико-зилирующих ферментов, таких как трансферазы. Условия культивирования могут лишь выявлять дополнительные активности. Так, например, когда ЭП-продуцирующие клоны культивировались (в суспензии)
- 18 -
008220
в среде JRH Excell 525, N-связанные гликаны ЭП, как было показано, содержат более высокие уровни GlcNAc, GalNAc Gal и Fuc по сравнению с N-связанными сахарами в ЭП, полученном из клеток, культивируемых (в прикрепленном слое) в среде DMEM (табл. V). Этот эффект особенно очевиден в случае клона Р8. Повышенный уровень GlcNAc позволяет предположить, что разветвление N-связанных Сахаров повышается и/или что N-связанные сахара содержат больше лактозаминовых повторов, когда клетки культивируют в среде JRH. Увеличение N-ацетилглюкозаминилирования и (N-ацетил)-галактозилирования, в свою очередь, приводит к увеличению числа акцепторных сайтов для фукозы, что позволяет объяснить повышение содержания фукозы.
Пример 3. Масс-спектрометрический анализ, выявляющий структурные различия между N-гликанами из ЭП PER.C6(tm) и Эпрекс (Eprex)
Для получения более детальной информации о структуре N-гликанов, продуцируемых PER.C6(tm), было решено проанализировать полные сахарные цепи ЭП из PER^(tm) методом MALDI-MS. Для данного анализа использовали очищенные методом аффинной хроматографии образцы ЭП, образованного полученными из PER.C6(tm) клонами Р7 и Р8 на среде DMEM, которые затем фракционировали методом анионообменной хроматографии (как описано ниже). Образцы ЭП PER.C6(tm), очищенные методом аффинной хроматографии, как описано в примере 2, в которых буфер был впоследствии заменен на ФСБ, подвергали анионообменной хроматографии с использованием колонки HiTrap с сефарозой Q HP (Amer-sham Pharmacia Biotech). Три подфракции ЭП были получены при использовании ступенчатого градиента в 20 мМ Трис-HCl/20 мкМ CuSO4, начиная с 45 мМ NaCl (фракция 1), продолжая при 75 мМ NaCl (фракция 2) и заканчивая 135 мМ NaCl (фракция 3). Каждая ступень градиента длилась 10 мин при скорости потока 1 мл/мин. Фракции 1 из четырех протоков объединяли в пул А, фракции 2 - в пул В и фракции 3 -в пул С. Полученные в результате пулы А, В и С затем обессоливали с использованием колонок для обессоливания HiPrep 2 6/10 (Amersham Pharmacia Biotech). N-связанные гликаны высвобождали из пулов ЭП путем обработки N-гликаназой F и подвергали десиалилированию путем обработки нейрамини-дазой. Параллельно в качестве стандарта анализировали эпрекс. На фиг. 1A-G приведены репрезентативные масс-спектры различных образцов ЭП: Эпрекс и очищенные и фракционированные пулы А, В и С, собранные с колонок для анионообменной хроматографии. Образцы ЭП из PER.C6(tm), полученные из культур указанных клонов на среде DMEM, обрабатывали гликаназой F и нейраминидазой и затем анализировали методом MALDI-MS. Символы (приведенные на спектре Эпрекс) обозначают: закрашенные квадратики обозначают GlcNAc; незакрашенные кружки обозначают Man; закрашенные кружки обозначают Gal; незакрашенные треугольники обозначают Fuc. Масс-профиль N-связанных сахаров из Эпрекс (фиг. 1 А) соответствует опубликованным ранее данным и указывает на то, что тетра-антенные сахара, содержащие и не содержащие лактозаминовых повторов, преобладают в данном препарате ЭП. Хотя Эпрекс и ЭП из PER^(tm) содержат сахарные структуры аналогичной массы (фиг. Ш-G), профиль сахарных структур в последнем является значительно более сложным, и это позволяет предполагать, что данные сахара проявляют более высокий уровень гетерогенности.
Для прогнозирования состава сахаров на основе наблюдаемой массы была использована компьютерная программа ExPAsy (таблица VI и VII). В каждом пуле было также показано относительно большое содержание различных олигосахаридов. Приведенные данные показывают, что большая часть N-связанных олигосахаридов, полученных из ЭП PER.C6(tm), содержит множественные остатки фукозы (таблица VI и VII, см. уровень dHex-остатков). Некоторые гликаны были даже четырежды фукозилирован-ными. Следовательно, полученные данные соответствуют результатам проведенного авторами анализа моносахаридов и дают серьезные основания полагать, что ЭП из PER.C6(tm) является гиперфукозилиро-ванным и, в этой связи, наиболее вероятно в значительной мере снабжен N-гликанами, имеющими так называемые Lewis-структуры.
Олигосахариды с (сиалилированными) Lewis-X эпитопами известны как основные последовательности, распознаваемые селектинами, опосредующими адгезии по типу клетка-клетка при воспалительных и иммунных реакциях (Varki et al., 1999), и являются характерным признаком для мозговых глико-протеинов (Margolis and Margolis, 1989). В этой связи, было показано, что различные гликопротеины, несущие указанные Lewis-X-структуры, обладают терапевтическим потенциалом, связанным с их противовоспалительной и иммуносупрессорной активностью. Авторами настоящего изобретения было показано, что сигнал в масс-спектре не всегда может быть однозначно присвоен определенной сахарной структуре: например, остатки типа GlcNAc и GalNAc имеют одинаковую массу. Поскольку анализ моносахаридов ЭП из. PER.C6(tm) выявил наличие GalNAc в N-связанных сахарах, можно предполагать, что некоторые из пиков соответствуют N-гликанам с так называемыми LacdiNAc (например, GalNAcPl-4GlcNAc)-структурами. Так например, пики со значениями m/z, равными -2038 и -2185 (табл. VI и VII), наиболее вероятно представляют N-гликаны с LacdiNAc-мотивами. В ином случае, указанные пики могли бы представлять тетра-антенные структуры, которые заканчиваются GlcNAc в связи с отсутствием Gal или GalNAc. Хотя такие структуры могут существовать в связи с неполным гликозилированием, наличие остатка фукозы на проксимальном конце означает, что сахар содержит остаток Gal или GalNAc,
- 19 -
008220
который является необходимым для формирования мотива, который распознается фукозилтрансферазой (FUT), которая катализирует формирование Lewis-структуры.
Относительная встречаемость различных Сахаров варьирует между препаратами ЭП, полученными из двух независимых клонов PER.C6(tm), что следует из различий в относительной высоте соответствующих пиков. В частности, предполагаемые би-антенные сахара с LacdiNAc-мотивами (фиг. 1; табл. VI и VII, сигналы со значениями m/z, равными -2038 и -2185) представляют собой основные сахара в образцах ЭП, полученных из Р8, в то время как в образцах из Р7 указанные структуры представлены значительно менее обильно. У последнего клона пик со значением m/z, равным -2541, предположительно соответствующий полностью галактозилированному тетра-антенному гликану, был наиболее обильно представленной структурой. Указанные данные соответствуют результатам авторского анализа моносахаридов, которые показали, что при росте на среде DMEM клон Р8 продуцирует ЭП, несущий гликан с меньшей степенью ветвления, чем у гликанов, полученных из Р7-ЭП (табл. V).
Пример 4. Сравнение содержания сиаловой кислоты в PER^-ЭП и СНО-ЭП
Содержание сиаловой кислоты в PER. С6(tm)-ЭП анализировали и сравнивали с эритропоэтином, выделенным из клеток яичника китайского хомячка (СНО-ЕРО), с помощью изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) с использованием полосок IPG (Amersham Pharmacia Biotech), которые имеют линейный градиент рН в диапазоне 3-10. После фокусирования изоформы ЭП подвергали пассивному блоттингу на нитроцеллюлозу и проявляли с использованием ЭП-специфичных антител и ECL (фиг. 2). ЭП, образованный четырьмя различными клонами PER.C6(tm) (линии С, D, Е и F) и тремя различными клонами СНО, стабильно экспрессирующими ЭП (линии G, Н и I), анализировали методом изоэлектрического фокусирования для определения содержания сиаловой кислоты. Продуцирующие ЭП клеточные линии СНО и PER.C6(tm) получали в основном по методикам, описанным в WO 00/63403, с использованием гена устойчивости к неомицину в качестве селективного маркера. На каждую полоску наносили тысячу eU (единица ELISA) PER.C6(tm)-ЭП и 500 eU СНО-ЭП. Для идентификации различных изоформ ЭП использовали пятьсот ME препарата Эпрекс (линия А) и Эпрекса, обработанного нейраминидазой (частично десиали-лированного) (линия В). После фокусирования ЭП подвергали блоттингу на нитроцеллюлозный фильтр и проявляли с использованием моноклонального антитела против ЭП и ECL. Образец Эпрекса, представляющего собой коммерчески доступный ЭП, является препаратом, содержащим высоко сиалилирован-ные изоформы, и использовался в качестве маркера.
Полученные результаты показали, что клетки СНО способны продуцировать изоформы ЭП, содержащие по меньшей мере до 12 остатков сиаловой кислоты на молекулу (линии G-I), подтверждая данные, полученные Morimoto et al., (1996). В противоположность этому, несмотря на то, что некоторые изоформы с содержанием 8-10 сиаловых кислот также продуцировались PER.C6(tm), такие формы были представлены в небольшом количестве и обнаруживались лишь после длительной экспозиции на пленке (линии C-F) . Следовательно, может быть сделан вывод о том, что PER.C6(tm)-ЭП сиалилирован в значительно меньшей степени, чем СНО-ЭП.
Пример 5. а-1,3-, а-1,6- и а-1,2-фукозилтрансферазная активность в клетках PER.C6(tm)
Потенциал гликозилирования клетки в значительной мере определяется обширностью набора гли-козилтрансфераз, участвующих в ступенчатом биосинтезе N- и О-связанных сахаров. Активность указанных гликозилтрансфераз варьирует между клеточными линиями, и в этой связи, гликопротеины, продуцируемые различными клеточными линиями, имеют различные гликаны. В свете приведенных в настоящем описании данных, которые демонстрируют, что гликаны PER.C6(tm)-ЭП высоко фукозилированы, активность различных фукозилтрансфераз (FUT), участвующих в синтезе N-связаных сахаров, анализировали с использованием методик, в основном известных специалистам в данной области техники (Van den Nieuwenhof et al., 2000). В настоящем исследовании авторы изучали активности a-l,6-FUT, которая участвует в фукозилировании ядра N-гликанов, a-l,2-FUT, которая опосредует кэппинг концевыми остатками галактозы, что приводит к получению так называемых Lewis-X-эпитопов и a-l,3-FUT, что приводит к образованию Lewis-X-структур. Для сравнения авторы также проанализировали соответствующие активности FUT, присутствующие в клетках СНО.
Активности указанных FUT в клеточных экстрактах PER.C6(tm) и СНО измеряли с использованием теста на активность гликозилтрансферазы. Указанный тест позволяет оценить реакцию, катализируемую гликозилтрансферазой, между сахаридом (в данном случае фукозой) и сахарным субстратом. Измеряли также активность GalT, рассматривая ее в качестве внутреннего контроля. Приведенные величины отражают среднее значение результатов двух экспериментов. Все величины, и в частности величины, полученные для PER.C6(tm), были в 2-3 раза ниже во втором эксперименте. Следует отметить, что активности выражали в расчете на мг белка (присутствующего в клеточном экстракте). Поскольку клетки PER.C6(tm) значительно крупнее, чем клетки СНО, различия между активностями FUT и GalT в клетках СНО и PER. С6(tm) могут быть больше или меньше, чем это кажется. Результаты тестов по определению активности гликозилтрансфераз приведены в табл. VIII, и они указывают на то, что PER.C6(tm), так же, как и СНО, обладают значительной активностью a-l,6-FUT, что позволяет полагать, что обе клеточных линии могут продуцировать гликановые цепочки, фукозилированные по ядру. Активность a-1,3-FUT была, однако,
- 20 -
008220
значительной лишь в клетках PER.С6(tm), в то время как она с трудом обнаруживалась в клетках СНО. Ни одна из клеточных линий не демонстрировала активности a-l,2-FUT. Взятые вместе указанные данные демонстрируют разницу, имеющуюся между гликозилирующим потенциалом СНО и PER.C6(tm), и объясняют, почему PER.C6(tm)-ЭП содержит больше фукоз, чем ЭП, полученный из СНО (Эпрекс). Пример 6. Гликаны с Lewis-X эпитопами, присутствующие в PER.C6(tm)-ЭП
В связи с тем, что PER.C6(tm) обладают a-1,3-, но не a-1,2-фукозилтрансферазной активностью, очень вероятно, что PER.C6(tm) продуцируют N-гликановые цепочки, которые содержат Lewis-X-эпитопы вместо эпитопов Lewis Y. Авторы подтвердили это предположение путем проведения эксперимента с мечением PER.C6(tm)-ЭП мышиными моноклональными антителами (против Lewis-Х-структур IgM человека; Calbiochem), которые специфически распознают Lewis-X-структуры, с использованием Вестерн-блоттинга. Равные количества PER.C6(tm)-ЭП (полученного из клона Р7, который в данном случае указан как Р7.100) и препарата Эпрекс, необработанных (-) и обработанных (+) HCl, разгоняли в ДСН-полиакриламидном геле и подвергали блоттингу на нитроцеллюлозную мембрану с использованием методик, известных специалистам в данной области техники. Для обнаружения эпитопов Lewis-X использовали моноклональные антитела (против мышиного IgM; Calbiochem) и ECL (Amersham Pharmacia Biotech) . Как можно видеть на фиг. 3, лишь PER.C6(tm)-ЭП мог быть помечен антителами, специфичными для эпитопа Lewis-X. Указана локализация маркера молекулярной массы (52, 35 и 29 кДа). Поскольку a-1,3-фукозная связь является кислотолабильной, сигнал был потерян после обработки HCl.
Пример 7. Экспрессия Lewis-Х-структур на клеточной поверхности клеток PER.C6(tm) Для выяснения вопроса о том, присутствуют ли обычно структуры Lewis-X в клетках PER.C6(tm), авторы метили поверхность клеток СНО и нормальных (то есть, не продуцирующих ЭП) клеток PER.C6(tm) антителами, специфичными для Lewis-X (Calbiochem). Клетки инкубировали с первичными антителами (мАТ a Lewis-X в рабочей концентрации 0,16 мкг/мл и мАТ a сиалил-Lewis-X в рабочей концентрации 5 мкг/мл). В качестве вторичных антител использовали FITC-конъюгированные анти-IgM. Меченые клетки анализировали методом флуоресцентной сортировки (FACS). Пунктирная линия обозначает сигнал от клеток, инкубированных только со вторичными антителами (отрицательный контроль). Результаты, приведенные на фиг. 4, показывают, что клетки PER.C6(tm) сильно метятся антителами, в отличие от клеток СНО, которые не способны образовывать указанные структуры. Следует отметить, что авторы неоднократно наблюдали, что клетки PER.C6(tm) демонстрируют гетерогенную картину окрашивания с использованием антител к структурам Lewis-X. Мечение антителами, специфичными для структур сиалил-Lewis-X (Calbiochem), давало умеренно положительный сигнал только при использовании очень высокой концентрации антител.
Пример 8. Ингибирование апоптоза с помощью PER.C6(tm)-ЭП (мозгового типа) in vitro в клетках NT2 и в клетках hNT, культивируемых в условиях гипоксии
ЭП, продуцируемый PER.C6(tm) (мозгового типа), и ЭП сывороточного типа сравнивали по их активности in vitro в отношении защиты кортикальных нервных клеток крысы, мыши и человека от гибели клеток в условиях гипоксии и недостатка глюкозы. Для этого культуры нервных клеток получают из эмбрионов крысы, как описано другими авторами (Koretz et al., 1994; Nagayama et al., 1999; White et al., 1996). Для оценки эффектов ЭП мозгового типа, продуцируемого PER.C6(tm), и ЭП сывороточного типа клетки поддерживают в модульных инкубационных камерах в инкубаторах с водяной рубашкой в течение 48 ч при температуре 37°С на бессывороточной среде с 30 мМ глюкозы в увлажненной газовой смеси 95% воздуха/5% CO2 (нормоксия) или на бессывороточной среде без глюкозы в увлажненной газовой смеси 95% N2/5% CO2 (гипоксия и недостаток по глюкозе), в отсутствие или в присутствии 30 пМ очищенного ЭП мозгового типа, продуцируемого PER.C6(tm), или 30 пМ препарата Эпрекс. Клеточные культуры подвергают гипоксии и голоданию по глюкозе в течение по меньшей мере 24 ч и затем возвращают в условия нормоксии на 24 ч. Цитотоксичность оценивают по флуоресценции Аламарового синего, которая позволяет оценить жизнеспособность клеток как функцию метаболической активности.
По другому способу культуры нервных клеток в течение 24 ч подвергают воздействию 1 мМ L-глютамата или a-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМПК) в условиях нор-моксии, в отсутствие или в присутствии различных концентраций очищенного ЭП, продуцируемого PER.C6(tm), или препарата Эпрекс. Цитотоксичность анализируют по флуоресценции Аламарового синего, которая позволяет оценить жизнеспособность клеток как функцию метаболической активности. Ожидается, что жизнеспособность клеток, обработанных PER.C6(tm)-ЭП, будет аналогична жизнеспособности клеток, обработанных препаратом Эпрекс.
Пример 9. Активность PER.C6(tm)-ЭП (мозгового типа) по стимуляции эритропоэза у крыс по сравнению с ЭП сывороточного типа
Способность рекомбинантного ЭП человека стимулировать продукцию эритроцитов может быть оценена на модели грызунов, описанной Barbone et al., (1994). В соответствии с указанной моделью, повышение числа ретикулоцитов используют как меру биологической активности препарата рекомбинант-ного ЭП человека. Ретикулоциты являются предшественниками эритроцитов, и их продукция в ответ на
- 21 -
008220
ЭП может использоваться как мера потенциала ЭП в плане стимуляции образования эритроцитов. Повышенная продукция эритроцитов, в свою очередь, ведет к более высокой величине гематокрита.
Активности PER.C6(tm)-ЭП и препарата Эпрекс сравнивали в шести группах по три крысы линии Wag/Rij. Различные дозы PER.C6(tm)-ЭП (Р7-ЭП), Эпрекса и буфера для разведения в качестве отрицательного контроля инъецировали внутривенно в вену полового члена в день 0, 1 и 2. PER.C6(tm)-ЭП вводили в дозе 5, 25 или 125 eU (единица ELISA=ИФТФА) , определяемой с помощью коммерчески доступного ЭП-специфичного набора R &D Elisa Kit, a препарат Эпрекс вводили в дозе 1 или 5 eU. Все препараты ЭП разводили до соответствующей концентрации с использованием ФСБ с 0,05% Твин 80 в общем объеме 500 мкл. На день 3 посредством пункции языка отбирали образец крови с ЭДТА объемом 250 мкл. В тот же день определяли процент ретикулоцитов в общей популяции эритроцитов.
Как видно на фиг. 6 (стрелки указывают процент ретикулоцитов, присутствующих в общей популяции эритроцитов), ежедневное введение 1 eU препарата Эпрекс крысам в течение трехдневного периода вызывало значительное повышение числа ретикулоцитов на четвертый день по сравнению с числом ре-тикулоцитов у крыс, получавших только буфер для разведения. Число ретикулоцитов еще больше повышалось при пятикратном увеличении дозы Эпрекс. Число ретикулоцитов возрастало явно в меньшей степени при использовании эквивалентных количеств РЕК.С6(tm)-ЭП. Аналогичное повышение числа ретикулоцитов наблюдалось при введении 1 eU Эпрекс и 25 eU PER.C6(tm)-ЭП, что является показателем того, что PER.C6(tm)-ЭП по меньшей мере в 25 раз менее активен в плане стимуляции продукции эритроцитов, чем Эпрекс. Различие между потенциалом Эпрекс и PER.C6(tm)-ЭП в плане стимуляции продукции эритроцитов было еще сильнее выражено при более высоких дозах (то есть, 5eU Эпрекс и 125 eU PER.C6(tm)-
ЭП).
Пример 10. Эффект PER.C6(tm)-ЭП на церебральную ишемию после экспериментальной субарахнои-дальной геморрагии
Для того, чтобы продемонстрировать, что PER.C6(tm)-ЭП более эффективен как нейропротектор в отношении церебральной ишемии, чем сывороточный тип ЭП, авторы сравнили эффекты системного введения ЭП мозгового типа, продуцируемого PER.C6(tm), и ЭП сывороточного типа на модели кроликов с острой церебральной ишемией, индуцированной субарахноидальной геморрагией. Для этого провели исследования на 32 животных, которых разделили на 4 группы (n=8).
Группа 1 - субарахноидальная геморрагия;
Группа 2 - субарахноидальная геморрагия плюс плацебо;
Группа 3 - субарахноидальная геморрагия плюс рекомбинантный ЭП человека сывороточного типа;
Группа 4 - субарахноидальная геморрагия плюс рекомбинантный ЭП, продуцируемый PER.C6(tm).
Экспериментальную субарахноидальную геморрагию воспроизводят посредством чрескожной инъекции аутологичной крови в cisterna magna (мозжечково-мозговую цистерну) после анестезии животного. После инъекции кроликов выдерживают в течение 15 мин в лежачем положении на брюхе для образования брюшных сгустков крови. Животным в группах 2, 3 и 4 инъецируют, соответственно, буфер для разведений, Эпрекс и очищенный ЭП мозгового типа, продуцируемый PER.C6(tm), через 5 мин после индукции субарахноидальной геморрагии, и затем повторяют их введение через 8, 16 и 24 ч. Все инъекции проводят внутрибрюшинно. Буфер для разведений состоит из водного раствора сывороточного альбумина (2,5 мг/мл), хлорида натрия (5,84 мг/мл) и безводной лимонной кислоты (0,057 мг/мл). Опытных животных подвергают эвтаназии через 24 ч после индукции субарахноидальной геморрагии и удаляют у них мозг. После этого из мозга с использованием микротома с замораживанием готовят корональные срезы толщиной 10-25 мкм, начиная от теменной части и, продолжая двигаться назад, до мозжечка включительно (Ireland and MacLeod, 1993). Для визуализации и оценки числа поврежденных ишемией нейронов срезы окрашивают гематоксилином и эозином. Количество эозинофильных нейрональных профилей, содержащих пикнотические ядра, в поле микроскопа с высоким разрешением (100х) определяют в пяти выбранных случайным образом областях боковой коры, полученных с нескольких уровней корональных срезов, расположенных позади темени. Ожидается, что животные, которым вводили PER.C6(tm)-ЭП, будут иметь меньшее число поврежденных нейронов, чем животные, которым ничего не вводили или вводили плацебо.
Пример 11. Экспрессия рецептора эритропоэтина в неонатальных кардиомиоцитах крыс после ги-поксии/реоксигенации
Из желудочков однодневных крыс линии Sprague-Dawley получали первичные культуры неонаталь-ных крысиных кардиомиоцитов, как было описано ранее (Simpson and Savion, 1982). Гипоксию создали путем инкубации кардиомиоцитов в воздухонепроницаемой камере из плексигласа с газовой смесью 5% СО2/95% N2 и с содержанием О2 <1% при температуре 37°С в течение 2 ч с использованием установки Gas Pak Plus (BBL). Посредством замены среды на среду, насыщенную газовой смесью из 95% воздуха и 5% СО2, клетки переводили в условия нормотоксической атмосферы (реоксигенация).
Кардиомиоциты дважды промывали охлажденным на льду ФСБ и выделяли суммарную РНК с использованием Тризола (Trizol, GIBCO), экстрагировали ее хлороформом и осаждали изопропиловым спиртом. Для проведения Нозерн-анализа 15 мкг препарата суммарной РНК разделяли в 1,5% формаль-дегид/MOPS-агарозном геле, подвергали блоттингу на нитроцеллюлозу и гибридизовали с 32Р-меченым
- 22 -
008220
зондом для рецептора ЭП (фрагмент кДНК размером ±400 пн (пар нуклеотидов)). Гибридизацию проводили в течение ночи при 65°С в фосфатном буфере с рН 7,2 и завершали двумя промывками в 2xSSC при комнатной температуре, 2 промывками в 0,2xSSC/0,l% ДСН при 65°С и 2 промывками в 2xSSC при комнатной температуре. Сигналы гибридизации визуализировали путем экспозиции обработанной мембраны с рентгеновской пленкой (Кодак). Уровни экспрессии корректировали по уровням GAPDH-мРНК.
Пример 12. Эффект PER.C6(tm)-ЭП мозгового типа и ЭП сывороточного типа (Эпрекс) на апоптоз не-онатальных кардиомиоцитов крыс, культивируемых в условиях гипоксии
Первичные культуры неонатальных кардиомиоцитов крыс получали из желудочков однодневных крыс линии Sprague-Dawley, как было описано ранее (Simpson and Savion, 1982). Гипоксию создавали путем инкубации кардиомиоцитов в воздухонепроницаемой камере из плексигласа с газовой смесью 5% СО2/95% N2 и с содержанием О2 <1% при температуре 37°С в течение 2 ч с использованием установки Gas Pak Plus (BBL). Посредством замены среды на среду, насыщенную газовой смесью из 95% воздуха и 5% СО2, клетки переводили в условия нормотоксической атмосферы (реоксигенация). Результаты эксперимента оценивали в четырех группах:
A) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях нормоксии (95% воздуха/5% С02);
B) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации в присутствии 30 пМ очищенного ЭП, продуцируемого PER.C6(tm);
C) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации в присутствии 30 пМ очищенного препарата Эпрекс; и
D) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации в отсутствие ЭП.
Все эксперименты проводили в тройной повторности. Апоптоз оценивали с помощью морфологического анализа, лэддеринга ДНК и по наличию терминальных концевых меток в виде разрывов фосфо-диэфирной связи в dUTP, опосредованных дезоксирибонуклеотидтрансферазой (TUNEL). Для проведения морфологического анализа монослойные культуры миоцитов фиксировали и окрашивали красителем
Hoechst 33324.
Морфологические особенности апоптоза (сморщивание клеток, конденсация и фрагментация хроматина) отслеживали с помощью флуоресцентной микроскопии. Просматривали по крайней мере 400 клеток в 12 случайным образом выбранных полях на каждой чашке.
Для выявления лэддеринга ДНК (характерного для апоптоза) кардиомиоциты лизировали в лизи-рующем буфере и подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле. Полученный гель окрашивали этидий-бромидом и фрагменты ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете. Выявление апоптозных кар-диомиоцитов in situ проводили с использование метода TUNEL с использованием набора для выявления гибели клеток in situ (Boehringer Mannheim).
Пример 13. Эффект PER.C6(tm)-ЭП и сывороточного ЭП на размеры инфарктной зоны на крысиной модели ишемии/реперфузии миокарда
Взрослых самцов крыс линии Sprague-Dawley (весом от 300 до 400 г) анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (20 мг/кг, в/б) и кетамина-HCl (60 мг/кг, в/б). К яремной вене и трахее присоединяли канюли и проводили вентилирование, поддерживая 100% уровень кислорода, с помощью вентилятора для грызунов, приспособленного для поддержания уровня выдыхаемого СО2 в пределах от 3,5 до 5%. Проводили левую торакотомию и шов располагали на расстоянии 3-4 мм от начала левой венечной артерии. За 5 мин до ишемии животные случайным образом получали различные концентрации PER.C6(tm)-ЭП, ЭП сывороточного типа или физиологический раствор (n=6 для каждой группы). Ишемию (30 мин) инициировали путем затягивания шва вокруг венечной артерии и завершали последующей ре-перфузией в течение 4 ч. Крыс с симулированной операцией готовили идентично, за исключением того, что шов не затягивали (n=6).
После реперфузии определяли размеры инфарктной зоны с помощью дифференциального окрашивания запатентованным сине-фиолетовым красителем (5%) и хлоридом трифенилтетразолия (ТТС). Затем вновь перетягивали венечную лигатуру и делали внутривенную инъекцию запатентованного сине-фиолетового красителя для окрашивания нормально перфузированных участков сердца. Затем сердце удаляли, и промывали его в ванночке с охлажденным на льду физраствором перед удалением предсердия, крупных сосудов и правого желудочка. Левый желудочек разрезали на тонкие секции и неокрашенные зоны риска (AAR) отделяли от нормально перфузированных синих секций, разрезали на кусочки по 1-2 мм3 и инкубировали с ТТС. С помощью препаровальной лупы некротические зоны (AN, бледно окрашенные) отделяли от ТТС-положительных (окрашенных в кирпично-красный цвет) зон. Затем все зоны миокарда взвешивали по отдельности и подсчитывали размеры инфарктных зон.
Пример 14. Выделение и фракционирование гликоформ PER^(tm)^^ содержащих большое количество a-1,3-связанной фукозы
Использовали специфичный для фукозы лектин из Aleuria aurantia (AAL) для предпочтительной очистки гликоформ PER.C6(tm)-ЭП с высоким содержанием Lewis-X и/или сйалил-Lewis-X. ЭП, который секретируется в культуральную среду ЭП-продуцирующими клетками PER.C6(tm), вначале отделяли от клеточных обломков и других контаминирующих веществ аффинной хроматографией на колонке с ис
- 23 -
008220
пользованием моноклональных антител, специфичных для ЭП человека (см. пример 2). После этого примерно 270 мкг (или 27000 eU) очищенного ЭП подвергали второй хроматографической процедуре, при которой молекулы ЭП связывали на колонке, содержащей иммобилизированный AAL, при скорости потока 0,1 мл/мин (AAL-колонка Hitrap на 1 мл, Bio Med Labs). Гликоформы ЭП, несущие фукозу, элюиро-вали с колонки с использованием L-фукозы (Sigma) в качестве конкурента за связывание с AAL. Получали четыре субфракции ЭП при применении ступенчатого градиента фукозы в ФСБ (Gibco, содержащем 154 мМ NaCl; 1,05 мМ КН2РO4 и 3,0 мМ Na2HPO4; pH 7,4), начиная с 60 мкМ фукозы (фракция 1), затем при 200 мкМ фукозы (фракция 2), затем при 400 мкМ фукозы (фракция 3) и в заключение при 1000 мкМ фукозы (фракция 4). Первая стадия градиента длилась 10 мин, а другие стадии градиента длились 5 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. Сигнал УФ при 214 нМ на хроматограмме показывает, что материал элюируется с колонки в каждой фракции (см. фиг. 9). Собирали порции по 0,5 мл и объединяли фракции из двух или трех пиков (см. фиг. 9).
Буфер в указанных фракциях заменяли с использованием микроконденсатора 10 кДа-микрокон (Millipore) на 20 мМ фосфат, и фракции концентрировали на таком же микроконденсаторе до объема 2030 мкл. N-связанные гликаны высвобождали из пулов ЭП обработкой N-гликаназой F и подвергали де-сиалилированию при обработке нейраминидазой. Репрезентативные спектры MALDI-TOF MS различных образцов ЭП показаны на фиг. 10А. Относительное обогащение каждого пула различными олигосахари-дами также приведено (см. табл. IX) . Полученные результаты показывают, что фракции, элюируемые с AAL-колонки позже, содержат относительно больше фукозных остатков. Так, например, фракции, элюи-руемые с колонки позже, обогащены гликанами, дающими пики при 2507,9 и 2978,1 Да, которые содержат 3 или 4 фукозных остатка, тогда как гликаны с массой 1891,7 и 2215,8, которые содержат всего лишь 1 фукозный остаток, относительно мало представлены в указанных фракциях. Исходя из этого видно, что указанные фракции обогащены N-гликанами, содержащими так называемые Lewis-X-структуры. Среднее число Lewis-Х-структур на молекулу ЭП в N-связанных гликанах, которые высвобождали с использованием PNG-азы F и обнаруживали методом MALDI-TOF MS, составляло в данным эксперименте: 2,2 для фракции 1; 2,7 для фракции 2; 3,6 для фракции 3; 4,1 для фракции 4. Исходный материал содержал 2,6 структур Lewis-X на молекулу ЭП. В независимом эксперименте с клоном С25 была получена фракция 4 (спектр показан на фиг. 10В), которая еще больше обогащена структурами Lewis-X, имея в N-связанных гликанах 5,7 структур Lewis-X на молекулу ЭП. Указанный метод позволяет очищать эритро-поэтин из культуральной среды с использованием специфических характеристик посттрансляционных модификаций, таких как наличие структур Lewis-X, произведенных клетками, в которых продуцируется данный белок. Это, однако, не говорит о том, что не могут использоваться другие способы для соответствующей очистки белка с (заданными) посттрансляционными модификациями.
Материал, элюируемый во фракции 4, представляет собой новую форму ЭП; он содержит преимущественно N-связанные гликаны с массой примерно 2185 кДа, что, в свою очередь, соответствует комплексному би-антенному N-связанному сахару с наличием GalNAc-Lewis-X-структур в обеих антеннах. Фракция 4 содержала примерно 8% от общего количество ЭП, который был элюирован во фракциях 1-4. Это указывает на то, что новая форма ЭП с преимущественным содержанием биантенных GalNAc-Lewis-X-структур отражает низкое содержание такой формы ЭП, которая может быть обогащена с использованием описанного выше способа.
Пример 15. Выделение и фракционирование гликоформ PER.C6(tm)-ЭП с высоким содержанием LacdiNAc
Гликоформы PER^(tm)^^ несущие так называемые олигосахаридные структуры LacdiNAc, специфически выделяли с использованием моноклональных антител против указанных LacdiNAc-структур. Мышиные моноклональные антитела, такие как 99-2А5-В, 100-2Н5-А, 114-2Н12-С, 259-2А1 и 273-3F2 (Van Remoortere et al., 2000), специфически распознающие структуры LacdiNAc, очищают и связывают с гранулами CNBr-активированной сефарозы 4В в соответствии с процедурой, известной специалистам в данной области техники. PER.C6(tm)-ЭП, который секретируется в культуральную среду продуцирующими ЭП человека клетками PER.C6(tm), вначале предварительно отделяют от клеточных остатков и других кон-таминирующих веществ посредством аффинной хроматографии на колонке с использованием монокло-нальных антител, специфичных для ЭП человека. После этого предварительно очищенный ЭП подвергают повторной хроматографической процедуре, при которой молекулы ЭП, несущие LacdiNAc-структуры, связываются на колонке, содержащей иммобилизованные LacdiNAc-специфичные моноклональные антитела. Гликоформы ЭП, которые лишены LacdiNAc-структур, не связываются на данной колонке и собираются в проходящем объеме. Гликоформы ЭП, несущие LacdiNAc-структуры, элюируются с колонки при низком рН или с использованием GalNAc или синтетических LacdiNAc-олигосахаридов в качестве конкурентов за связывание с LacdiNac-специфичными антителами. Гликоформы ЭП, несущие относительно высокий процент LacdiNAc-структур, отдельно элюируют с колонки ступенчато или постепенно повышающейся концентрацией GalNAc или LacdiNAc. Гликоформы ЭП с относительно высоким процентом содержания LacdiNAc-структур элюируются при более высокой концентрации GalNAc или LacdiNAc, чем гликоформы ЭП, обладающие относительно низким процентом содержания Lacdi-NAc-структур. Согласно описанному выше способу, указанный способ позволяет также очищать эритро
- 24 -
008220
поэтин из культуральной среды с использованием специфических характеристик посттрансляционных модификаций, таких как наличие структур Lewis-X и LacdiNAc, произведенных клетками, в которых продуцируется данный белок.
Пример 16. Выделение и фракционирование гликоформ PER.C6(tm)-ЭП с высоким содержанием Gal-NAc-Lewis-X
Гликоформы PER^(tm)^^ несущие так называемые GalNAc-Lewis-X олигосахаридные структуры, специфически выделяли с использованием моноклональных антител против указанных GalNAc-Lewis-X-структур. Мышиные моноклональные антитела, такие как 114-5В1-А, 176-3 А7, 290-2D9-A и 290-4А8 (Van Remoortere et al., 2000), специфически распознающие структуры GalNAc-Lewis-X, очищают и связывают с гранулами CNBr-активированной сефарозы 4В в соответствии с процедурой, известной специалистам в данной области техники. PER.C6(tm)-ЭП, который секретируется в культуральную среду продуцирующими ЭП человека клетками PER.C6(tm), вначале предварительно отделяют от клеточных остатков и других контаминанирующих веществ посредством аффинной хроматографии на колонке с использованием моноклональных антител, специфичных для ЭП человека. После этого предварительно очищенный ЭП подвергают повторной хроматографической процедуре, при которой молекулы ЭП, несущие GalNAc-Lewis-X-структуры, связываются на колонке, содержащей иммобилизованные GalNAc-Lewis-X-специфичные моноклональные антитела. Гликоформы ЭП, которые лишены GalNAc-Lewis-X-структур, не связываются антителами, закрепленными на данной колонке, и собираются в проходящем объеме. Связавшиеся гликоформы ЭП, несущие GalNAc-Lewis-X-структуры, элюируются с колонки при низком рН или с использованием синтетического GalNAc-Lewis-X в качестве конкурента за связывание с Gal-NAc-Lewis-X-специфичными антителами. Гликоформы ЭП, несущие относительно высокий процент GalNAc-Lewis-X-структур, могут быть отдельно элюированы с колонки ступенчато или постепенно повышающейся концентрацией конкурента GalNAc-Lewis-X.
Гликоформы ЭП с относительно высоким процентом содержания GalNAc-Lewis-X-структур элюи-руются при более высокой концентрации GalNAc-Lewis-X, чем гликоформы ЭП, обладающие относительно низким процентом содержания GalNAc-Lewis-X-структур. И вновь, в соответствии с описанными выше способами, данный метод позволяет также очищать ЭП из культуральной среды с использованием специфических характеристик посттрансляционных модификаций, таких как структуры Lewis-X, Lacdi-NAc или GalNAc-Lewis-X, произведенных клетками, в которых продуцируется данный белок. Это, однако, не означает, что другие модификации с (заранее заданными) посттрансляционными модификациями не могут использоваться для соответствующей очистки указанного белка.
Специалистам в данной области очевидно, что несмотря на то, что данное описание проиллюстрировано подробными примерами, относящимися к ЭП, настоящее изобретение не ограничивается продукцией и/или очисткой ЭП с характеристиками мозгового типа. Различные другие терапевтические и/или диагностические пептиды и белки (человека), которые могут найти применение при лечении заболеваний мозга и других частей центральной и периферической нервной системы и/или ишемиче-ских/реперфузионных повреждений тканей, могут быть получены с использованием средств и способов по настоящему изобретению.
Пример 17. ЭП с низким содержанием сиаловой кислоты имеет такую же активность, как ЭП с высоким содержанием сиаловой кислоты в плане снижения размера зоны инфаркта после окклюзии средней церебральной артерии у крыс
Эффект PER.C6(tm)-ЭП и препарата Эпрекс на размер инфаркта мозга, который экспериментально индуцируется окклюзией средней церебральной артерии (СЦА), исследовали на самцах крыс линии F344/Ico весом 200-250 г с использованием способа, аналогичному способу, описанному Siren et al., (2001). Правую сонную артерию животных подвергали постоянной окклюзии, тогда как СЦА подвергали обратимой окклюзии в течение 60 мин с использованием металлического зажима. Очищенный PER.C6(tm)-ЭП со средним содержанием сиаловой кислоты <6 сиаловых кислот на молекулу или Эпрекс (Jansen-Cilag; коммерчески доступный ЭП) со средним содержанием сиаловой кислоты > 9 сиаловых кислот на молекулу вводили внутривенно за 5 мин до начала окклюзии СЦА в дозе 5000 eU (ELISA units; единицы ИФТФА) на кг веса тела. Следует отметить, что содержание сиаловой кислоты в препарате PER.C6(tm)-ЭП варьировало в диапазоне 0-9 сиаловых кислот на молекулу, в то время как Эпрекс содержал более 8 сиа-ловых кислот на молекулу. По истечении 60-минутного периода окклюзию завершали удалением металлического зажима, опоясывающего СЦА. Реперфузию наблюдали под микроскопом после удаления зажима. Через 24 ч осматривали мозг живых крыс с использованием ЯМР-томографии для выявления вероятного коэффициента диффузии (ADC) и Т2-картирования. Указанные карты использовали для количественной оценки объемов инфаркта (фиг. 7А и 7В).
Результаты, представленные на фиг. 7А и 7В, показывают, что крысы, которым вводили препараты PER.C6(tm)-ЭП и Эпрекс, демонстрировали сходное снижение зоны инфаркта по сравнению с животными, которым препараты не вводились. Так как препарат PER.C6(tm)-ЭП имеет значительно более низкое содержание сиаловой кислоты, чем препарат Эпрекс, данный результат показывает, что высокое содержание сиаловой кислоты не является обязательным для нейропротекторной активности ЭП in vivo.
- 25 -
008220
Пример 18. Определение периода полувыведения ЭП у крыс
Для определения периода полувыведения препарата Эпрекс in vivo самцам крыс линии Wag/Rij вводили внутривенной инъекцией 150 eU препарата Эпрекс, разведенного в ФСБ/0,05% Твин-80 до конечного объема 500 мкл. Непосредственно перед введением указанного субстрата отбирали 200 мкл ЭД-ТА-образца крови в качестве отрицательного контроля, используя методику, описанную в Lab. Animals 34, 372. В моменты времени t=5, 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480 и 540 мин после инъекции отбирали ЭДТА-образцы крови животных объемом 200 мкл с использованием той же методики. После отбора последнего образца крови животных забивали. Полученные образцы центрифугировали при 760 g в течение 15 мин при комнатной температуре в пределах 30 мин с момента отбора образца. Образцы полученной плазмы исследовали методом ЭП-специфичного ИФТФА (R &D) для определения концентрации ЭП в каждом образце.
Как показано на фиг. 8, снижение концентрации препарата Эпрекс в плазме описывается двухфазной кривой, соответствующей фазе распределения и фазе клиренса. На основании таких результатов можно считать установленным, что Эпрекс имеет период полувыведения примерно 180 мин в фазе клиренса. Период полувыведения PER.C6(tm)-ЭП измеряют с использованием такой же процедуры.
Пример 19. Эффект экспрессии Е1А на гликозилирование ЭП в клетках НТ1080
Клетки НТ1080 стабильно трансфицировали векторами экспрессии, кодирующими гены аденовирусного Е1А типа 5 (plg.ElA.neo) или Е1А+Е1В (plg.ElA.ElB; обе плазмиды описаны в патенте США 5994128), для определения влияния экспрессии генов аденовирусного Е1 А типа 5 и/или Е1 А+Е1 В на гликозилирование. Для осуществления гликозилирования маркерного белка клетки совместно трансфи-цировали вектором экспрессии, кодирующим ЭП (pEPO2001/neo). Контрольные клетки НТ1080 транс-фицировали только вектором экспрессии ЭП.
Трансфекцию проводили с помощью липофектамина (Gibco), когда клетки достигали состояния 7090% слияния, используя 1,0 мкг pElA.neo или рЕ1А.Е1В и 1,0 мкг рЕРО2001.шо на чашку площадью 7,85 см2. Среду заменяли на 2, 3, 7, 10 и 13 день селективной средой, содержащей DMEM, 1% НОАК (необязательные аминокислоты, Invitrogen), 250 мкг/мл генетицина (Gibco) и 10% ФСБ. Предварительные эксперименты со стабильно Е1 А-трансфицированными клетками НТ1080 выявили, что экспрессия Е1 А приводит к изменению морфологии клеток. В соответствии с наблюдениями, описанными Frisch et al., (1991), авторы настоящего изобретения показали, что стабильная экспрессия гена E1A индуцирует гладкую морфологию. На основе этой информации авторы провели грубый отбор ElA-экспрессирующих клонов путем выбора гладких клонов. Указанные клоны отбирали на 14 день и культивировали на 24-луночных планшетах с селективной средой в условиях 37°С/10% СO2.
ЭП-продуцирующие клетки отбирали на основании присутствия ЭП в среде, когда клетки достигали состояния, близкого к слиянию. ЭП измеряли с использованием ЭП-специфичного ИФТФА (Quanti-kine(r) IVD human EPO-ELISA, R &D systems). ЭП-продуцирующие культуры увеличивали в масштабе и анализировали на экспрессию Е1 А. Для этого клетки лизировали в лизисном буфере (1% NP40, 0,5% де-зоксихолевой кислоты, 0,5% ДСН, 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5), с добавкой одной таблетки полного мининабора ингибиторов протеиназ (Roche Diagnostics) на 10 мл. Лизаты осветляли центрифугированием в течение 10 мин при 14000 g. Равные количества (по содержанию белка) осветленного лиза-та клеток подвергали электрофорезу в восстанавливающих условиях с использованием 10% БисТрис геля (NuPAGE, Invitrogen). Затем белки переносили на PDVF-мембрану (P-Immobilon) с использованием системы NuPAGE (Invitrogen) для транс-блоттинга. Блотты блокировали в течение 1 ч или в течение ночи при комнатной температуре с добавлением 5% Протифара (Protifar (Nutricia)) в TBST, после чего проводили инкубацию с моноклональными мышиными IgG2 против человеческого Е1 А (клон М73, Santa Cruz), разведенными 1:400 в 5% Протифар/TBST, в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4°С. Блотты промывали TBST и инкубировали с конъюгированными с перок-сидазой козьими антителами к мышиному IgG (Biorad), разведенными 1:1000 в 5% Протифар/TBST, в течение 45 мин при комнатной температуре. После промывания с использованием TBST блотты окрашивали с использованием системы ECL-плюс (Amersham Pharmacia Biotech). 55% ЭП-положительных клонов Е1А и 68% ЭП-положительных клонов Е1А.Е1В демонстрировали явную экспрессию Е1А (таблица X). Клоны НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП, которые в высокой степени экспрессировали Е1А, демонстрировали гладкую морфологию (см., например, фиг. 11).
ЭП для анализа гликанов получали с помощью клонов НТ1080/ЭП, НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП. Для этого клон 008 НТ1080/Е1А.ЭП, клон 072 НТ1080/Е1А.Е1В.ЭП и клон 033 НТ1080/ЭП (табл. X) высевали в матрасы на 175 см2 на стадии пассажа номер (пн) 7. Через 24 ч, когда клетки достигали уровня слияния 60-80%, селективную среду заменяли на среду для продуцирования (DMEM, 1% НОАК). Указанную среду отбирали через 3 дня, а клетки лизировали лизирующим буфером. ЭП очищали из среды по методике примера 2.
N-связанные гликаны из различных препаратов ЭП высвобождали обработкой N-гликаназой F и затем анализировали высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометри-ческим детектированием (ВЭАОХ-ИАД; Дионекс (НРАЕС-PAD; Dionex)). В этой хроматографической системе полученные из ЭП гликановые цепочки разделяют в щелочных условиях на основании их заря
- 26 -
008220
да. Как показано на фиг. 12, гликаны, полученные из ЭП, продуцируемого клетками НТ1080/Е1 А-ЭП, менее заряжены, чем гликаны из ЭП, продуцируемого контрольными клетками НТ1080/ЭП, что указывает на то, что ЭП, продуцируемый последними клетками, является значительно более сиалилированным, чем ЭП, продуцируемый Е1 А-экспрессирующими клетками. Более детальная информация по структуре указанных N-гликанов была получена при анализе методом MALDI-MS сахарных цепей из препаратов ЭП. N-связанные гликаны высвобождали из препаратов ЭП посредством обработки N-гликаназой F и подвергали десиалилированию посредством обработки нейраминидазой. Масс-спектры различных репрезентативных препаратов ЭП представлены на фиг. 13. Для прогнозирования состава сахаров на основании полученных масс-спектров (табл. XI) использовали программное обеспечение GlycoMod (www.expasy.ch/tools/glycomod).
Приведенные данные показывают, что масс-спектры гликанов из ЭП, продуцируемого контрольными клетками НТ1080/ЭП, отличается от таковых из ЭП, продуцируемого клетками НТ1080/Е1 А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП. Указанные масс-спектры показали, что ЭП, продуцируемый последними клетками, обладает относительно меньшим количеством гексоз и относительно большим количеством дезокси-гексоз по сравнению с ЭП, продуцируемым контрольными клетками. Кроме того, гликановые структуры с относительно низкой массой, содержащие относительно большое количество гексозаминов и дезокси-гексоз, были обнаружены в ЭП, продуцируемом клетками НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП. Некоторые из них отсутствовали в ЭП, продуцируемом контрольными клетками. Масс-профили гликанов из ЭП, продуцируемого клетками НТ1080, экспрессирующими Е1 А и Е1 А+Е1 В, аналогичны таковым для гликанов из ЭП, продуцируемого клетками PER.C6(tm) (см. пример 3), что позволяет предположить, что гликаны из ЭП, продуцируемого первыми клетками, содержат структуры Lewis-X и LacdiNAc, и что эти структуры лишены концевых галактоз.
Для подтверждения того, что ЭП, продуцируемый клетками НТ1080, экспрессирующими Е1 А и Е1 А+Е1 В, содержит больше фукоз и GalNAc, чем ЭП, продуцируемый контрольными клетками НТ1080, был проведен анализ моносахаридов. Для этого N-связанные гликаны высвобождали из препаратов ЭП посредством обработки N-гликаназой F и нейраминидазой и затем проводили их гидролиз и анализ методом ВЭАОХ-ИАД. На фиг. 14 показаны профили моносахаридов из гликанов ЭП, нормализованные по содержанию маннозы. Приведенные данные показывают, что N-связанные гликаны из ЭП, продуцируемого клетками, экспрессирующими Е1 А и Е1 А+Е1 В, действительно обладают относительно высокими количествами фукозы и GalNAc.
Масс-спектры и данные по моносахаридам являются сильным основанием для заключения, что ЭП, продуцируемый клетками, экспрессирующими Е1 А и Е1 А+Е1 В, содержит множественные остатки фуко-зы. Для подтверждения этих данных препараты ЭП обрабатывали альфа-фукозидазой (миндальная мука), расщепляющей концевые альфа-1,3- и альфа-1-4 остатки фукозы. После этого образцы анализировали методом MALDI-MS и результаты сравнивали с результатами, полученными для препаратов ЭП, которые не подвергались обработке альфа-фукозидазой. На фиг. 15 показано, что после обработки альфа-фукозидазой пики, которые отражают N-гликаны с антенными фукозами, уменьшаются, а пики, которые получены из указанных структур, возрастают. Например, пики со значениями m/z ~ 2038 и -2184 уменьшаются, в то время как пик -1892 возрастает.
В целом, приведенные данные показывают, что экспрессия аденовирусного Е1 А, одного или в сочетании с Е1 В, может менять профиль гликозилирования клеток. Данные о том, что экспрессия одного Е1 А достаточна для такого изменения, указывают на то, что именно Е1 А ответственен за такое изменение. Изменения в гликозилировании в типичном случае включают образование структур Lewis-X, LacdiNAc и GalNAc-Lewis-X. Многие клетки НТ1080, экспрессирующие Е1А и Е1А+Е1В, были охарактеризованы, при этом большая часть указанных клеток продуцировала гликаны, которые обладают указанными характерными гликановыми структурами. Показано также, что насыщенность указанными структурами варьировала по сравнению с гликановыми структурами, которые продуцируются родительскими клетками НТ1080 (данные не приведены). Насыщенность указанными гликановыми структурами в значительной мере коррелировала с уровнем экспрессии Е1 А. Это указывает на то, что степень, в которой профиль гликозилирования подвержен влиянию Е1 А, находится в большой зависимости от уровня экспрессии гена Е1 А.
Пример 20. Сравнение гемопоэтической активности PER.C6(tm)-ЭП и СНО-ЭП в высокой дозе Гемопоэтическую активность PER.C6(tm)-ЭП определяли у крыс и сравнивали с таковой у ЭП, полученного из клеток яичника китайского хомячка (СНО-ЭП). Были выбраны два препарата СНО-ЭП: (1) Эпрекс (Jansen Cilag), который представляет собой коммерчески доступный рекомбинантный СНО-ЭП с высоким содержанием сиаловой кислоты и (2) frCHO-ЭП, препарат СНО-ЭП с более низким (аналогичным таковому у PER. С6(tm)-ЭП) содержанием сиаловой кислоты (см. фиг. 16), который получали путем продуцирования ЭП клетками СНО с последующей очисткой указанных слабо сиалилированных изо-форм методами хроматографии, описанными в примерах 2 и 3 и в документе ЕР 0428267.
Исследование проводили с четырьмя группами из шести крыс линии WAG/Rij. Однократную дозу в 5000 eU (ELISA units; единицы ИФТФА, определяемые с помощью коммерчески доступного ЭП
- 27 -
008220
специфичного набора для ИФТФА (ЭП-specific R &D Elisa Kit)) на кг веса тела препаратов Эпрекс, frCHO-ЭП и PER.C6(tm)-ЭП или буфер для разведений (в качестве контроля) вводили внутривенно в вену полового члена. Все препараты ЭП разводили до требуемой концентрации буфером для разведений (ФСБ; 0,03% Твин-80; 0,5% глицин) до общего объема 500 мкл. Через четыре дня методом пункции языка отбирали по 250 мкл ЭДТА-образцов крови. В тот же день проводили анализ отобранных образцов крови на величину гематокрита и процентное содержание ретикулоцитов в общей популяции эритроцитов с использованием автоматического гематоцитометра.
Определяли уровень гематокрита и выражали его в виде объемного процента осадка эритроцитов, получаемого после центрифугирования крови (фиг. 17). Приведенные результаты показывают, что PER.C6(tm)-ЭП и frCHO-ЭП не индуцировали гематокрит, тогда как Эпрекс делал это.
Как показано на фиг. 18, ЭП индуцировал значительное увеличение количества ретикулоцитов по сравнению с крысами, которые получали только буфер для разведений. Эпрекс и frCHO-ЭП демонстрировали похожую стимуляцию; указанная стимуляция значительно выше (р <0,001), чем у животных, которым инъецировали PER^(tm)^^
Оценка содержания РНК в ретикулоцитах позволила определить степень их зрелости. На фиг. 19 показана незрелая фракция ретикулоцитов (НРФ). Крысы, получавшие Эпрекс, демонстрировали значительно более высокий процент незрелых ретикулоцитов по сравнению с контрольными крысами. Это указывает на то, что образование ретикулоцитов, стимулированное препаратом Эпрекс, все еще имеет место после четырех дней с момента его инъекции. Этот эффект менее выражен или совсем отсутствует у крыс, которым вводили frCHO-ЭП и PER^(tm)^^ соответственно (фиг. 19).
В целом, приведенные данные показывают, что все три препарата ЭП индуцируют образование ре-тикулоцитов; кроме того, продолжительность такого эффекта была наиболее длительной у препарата Эпрекс и наиболее короткой у PER^(tm)^^ тогда как frCHO-ЭП демонстрировал промежуточный эффект. Это свидетельствует о том, что низкий гемопоэтический эффект PER.C6(tm)-ЭП связан не только с низким содержанием сиаловой кислоты, но также и с другими особенностями структуры гликанов.
Пример 21. Детальный анализ структуры N-гликанов из PER.C6(tm)-ЭП
Масс-сигналы, полученные при масс-спектрометрии, не всегда можно однозначно присвоить определенной сахарной структуре в связи с тем фактом, что могут существовать различные изомерные структуры. Для получения дополнительной информации о структуре N-связанных гликанов в PER.C6(tm)-ЭП была осуществлена эндо- и экзогликозидазная обработка препаратов PER.C6(tm)-ЭП.
Вначале использовали обработку эндогликозидазой F2. Этот фермент осуществляет расщепление между остатками GlcNAc в триманнозильном ядре N-связанных гликанов с высоким содержанием маннозы или би-антенных комплексов (фиг. 20). В отличие от PNG-азы F, эндогликозидаза F2 не расщепляет три- и тетра-антенные гликаны и может, в этой связи, быть использована для выявления различий между би- и три-/тетра-антенными гликановыми структурами. На фиг. 21 представлены MALDI-спектры PER^(tm)^^ обработанного PNG-азой F или эндопротеиназой F2. При сравнении полученных спектров следует иметь в виду, что гликаны, высвобождаемые эндогликозидазой F2, имеют меньший размер, чем гликаны, высвобождаемые PNG-азой F. Это определяется различием в остатках GlcNAc и фукозы (349 Да) и связано с различием сайтов расщепления указанных ферментов (см. фиг. 20).
Все структуры, наблюдаемые при расщеплении PNG-азой F, при значении m/z > 2185 представляют собой три- или тетра-антенные структуры, поскольку ни один из указанных гликанов не наблюдается при расщеплении эндогликозидазой F2. Большинство структур с меньшими массами, то есть со значениями m/z 1485, 1648, 1689, 1835, 1851, 1997, 2038 и 2185, имеют соответствующие пики при расщеплении эндогликозидазой F2 и являются би-антенными. Возможно, что присутствуют также и некоторые изомерные три- и тетра-антенные структуры, но их не так много, поскольку соотношение пиков в обоих спектрах, как видно на фиг. 21, в значительной мере сопоставимо. Спектр после расщепления эндоглико-зидазой F2 не содержит пиков, соответствующих величине m/z 1892 и 2054, присутствующих в спектре после расщепления PNG-азой F. Это доказывает, что указанные пики отражают гликаны, которые не являются би-антенными, а являются тетра-антенными без или с одним галактозным остатком, соответственно. Указанные данные подтверждают, что PER. С6(tm)-ЭП содержит гликаны с концевым GlcNAc.
Далее, были использованы экзогликозидазы для дальнейшего исследования N-гликановых структур. Гликаны высвобождали из PER.С6(tm)-ЭП с помощью PNG-азы F и подвергали десиалилированию с использованием нейраминидазы.
В дальнейшем образцы обрабатывали различными сочетаниями приведенных ниже экзогликозидаз:
1) в-галактозидаза, которая расщепляет невосстановленный, концевой Galpl-4GlcNAc (и Galp1-4GalNAc и при более высоких соотношениях фермента Galp1-3 связки).
2) . а-Фукозидаза из почки быка, которая расщепляет al-2,3,4 и 6-связанную фукозу из N- и О-гликанов. Она расщепляет al-6 связанную фукозу в триманнозильном ядре N-связанных гликанов более эффективно, чем другие а-фукозные связки.
3) a-Фукозидаза из миндальной муки, которая расщепляет невосстановленные, концевые al-3 или al-4 фукозидазные остатки.
- 28 -
008220
4) P-N-ацетилглюкозаминидаза (GlcNAc-аза), которая расщепляет невосстановленный, концевой в 1-2, 3, 4, 6-связанный N-ацетилглюкозамин из сложных углеводов. Она не расщепляет N-ацетилгалактозаминовые остатки.
Типы химических связей, ожидаемые в гликанах PER-С6(tm)-ЭП, показаны на фиг. 22. Одновременно проводили инкубацию с галактозидазой и фукозидазой, то есть во время обработки фукозидазой присутствовала также активная галактозидаза. Далее проводили обработку GlcNAc-азой, когда галактозидаза и фукозидаза теряли свою активность.
На фиг. 23 представлены результаты обработки галактозидазой. На данной фигуре показаны значения m/z и относительные интенсивности всех пиков в спектре, которые имеют относительную интенсивность (то есть высоту пика, деленную на суммарную высоту всех пиков) 5% или выше. Показаны также предполагаемые гликановые структуры. Пики, которые соответствуют галактозилированным структурам, сдвинуты после галактозидазной обработки, хотя и не полностью. Было обнаружено, что галактози-даза не высвобождает галактозу, когда фукоза присутствует на соседнем остатке GlcNAc. Некоторые три-антенные гликаны, по всей видимости, появляются после галактозидазной обработки (m/z 1689) . Это вызвано загрязнением GlcNAc-азы, которое, как было показано с использованием стандартных гли-канов, присутствует в препарате галактозидазы (данные не приведены).
Гликаны, обработанные гликозидазой, подвергали затем обработке фукозидазой (фиг. 24 и 26). В случае фукозидазы из почки быка это приводит к сдвигу на 146 Да всех пиков в спектре. Это связано с массой фукозного остатка. Поскольку указанная фукозидаза предпочтительно расщепляет al-6-связанные фукозные остатки и, в этой связи, все пики теряют только одну единицу в 146 Да, это указывает на то, что все гликаны содержат в ядре фукозу.
Пул гликанов, обработанных галактозидазой, который затем инкубировали с фукозидазой из миндальной муки, дал относительно простой спектр (фиг. 25 и 26). Все фукозные остатки удалялись из антенн, оставляя только простые (ядерные) фукозилированные гликаны. Оставшиеся концевые галактоз-ные остатки также удалялись, поскольку галактозидаза все еще была активна во время инкубирования с фукозидазой. После обработки дефукозилированных гликанов GlcNAc-азой оставалось только четыре пика. Основной пик наблюдался при значении m/z 1079 и соответствует фукозилированному триманно-зильному ядру. Пики со значениями m/z 1485 и m/z 1891 подтверждают наличие остатка GalNAc в антенне, поскольку указанный остаток не удаляется GlcNAc-азой. Пик со значением m/z 1444 подтверждает присутствие лактозаминовых повторов: галактоза должна быть защищена GlcNAc во время обработки галактозидазой.
Список литературы
Anchord DT, Brot FE, Bell CE and Sly WS (1978) Human beta-glucuronidase: in vivo clearance and in vivo uptake by a glycoprotein recognition system on reticuloendothelial cells. Cell 15:269
Barbone AG, Aparicio B, Anderson DW, Natarajan J and Ritchie DM (1994) Reticulocyte measurements as a bioassay for erythropoietin. J Pharm Biomed Anal 12:515-522
Brines ML, Ghezzi P, Keenan S, Agnello D, De Lanerolle NC, Cerami C, Itri LM and Cerami A (2000) Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury. Proc Matl Acad Sci USA 97:10526-10531
Buemi M, Allegra A, Corica F, Floccari F, D'Avella D, Aloisi C, Calapai G, Iacopino G and Frisina N (2000) Intravenous recombinant erythropoietin does not lead to an increase in cerebrospinal fluid erythropoietin concentration. Nephrol Dial Transplant 15:422-423
Buerke N, Weyrich AS, Zheng Z, Gaeta FCA, Forrest MJ and Lefer AM (1994) Sialyl Lewisx-containing oligosaccharide attenuates myocardial reperfusion injury in cats. J Clin Invest 93:1140-1148
Chikuma M, Masuda S, Kobayashi T, Nagao M and Sasaki R (2000) Tissue-specific regulation of erythropoietin production in the murine kidney, brain, and uterus. Am J Physiol Endocrinol Metabol 279:E1242-E1248
Dame C, Juul SE and Christensen RD (2001) The biology of erythropoietin in the central nervous system and its neurotrophic and neuroprotective potential. Biol Neonate 79:228-235
Foxall CS, Watson SR, Dowbenko D, Fennie C, Lasky LA et al. (1992) The three members of the selectin receptor family recognize a common carbohydrate epitope: the sialyl Lewisx oligosaccharide. J Cell Biol
117:895-902
Goto M, Akai K, Murakami A, Hashimoto C, Tsuda E, Ueda M, Kawanishi G, Takahashi N, Ishimoto A, Chiba H and Sasaki R (1988) Production of recombinant erythropoietin in mammalian cells: host-cell dependency of the biological activity of the cloned glycoprotein. Bio/Technology 6:67-71
Grinnell BW, Hermann RB, Yan SB (1994) Human Protein С inhibits selectin-mediated cell adhesion: role of unique fucosylated oligosaccharide. Glycobiol 4: 221-225.
Hoffmann A, Nimtz M, Wurster U and Conradt HS (1994) Carbohydrate structures of в-trace protein from human cerebrospinal fluid: evidence for "brain-type" N-glycosylation. J Neurochem 63:2185-2196
Hoffmann A, Nimtz M, Getzlaff R and Conradt HS (1995) brain-type N-glycosylation of asialo-transferrin from human cerebrospinal fluid. FEBS Lett 359:164-168
- 29 -
008220
Ireland WP and MacLeod WS (1993) A method for finding stereotaxic coordinates from brain sections. J Neurosci Methods 49:93-96
Jourdian GW, Dean L and Roseman S (1971) . The sialic acids. XI. A periodate-resorcinol method for the quantitative estimation of free sialic acids and their glycosides.
Juul SE, Harcum J, Li Y and Christensen RD (1997) Erythropoietin is present in the cerebrospinal fluid of neonates. J Pedriatr 130:428-430
Konishi Y, Chui D-H, Hirose H, Kunishita T and Tabari T (1993) Trophic effect of erythropoietin and other hematopoietic factors on central cholinergic neurons in vitro and in vivo. Brain Res 609:29-35
Koretz B, Von В Ahern K, Wang N, Lustig HS and Greenberg DA (1994) Pre- and postsynaptic modulators of excitatory neurotransmission: comparative effects on hypoxia/hypoglycemia in cortical cultures. Brain
Res 643:334-337
Lou J, Dayer J-M, Grau GE and Burger D (1996) Direct cell/cell contact with stimulated T lymphocytes induces the expression of cell adhesion molecules and cytokines by human brain microvascular endothelial cells. Eur J Immunol 26:3107-3113
Margolis RU and Margolis RK (1989) Neurobiology of glycoconjugates. Plenum Press, New York Marti HH, Gassmann M, Wenger RH, Kvietikova I, Morganti-Kossmann C, Kossmann T, Trentz O and Bauer С (1997) Detection of erythropoietin in human liquor: intrinsic erythropoietin in the brain. Kidney Int
51:416-418
Masland RH (2001) The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci 4:877-886
Masuda S, Nagao M and Sasaki R (1999) Erythropoietic, neurotrophic, and angiogenic functions of erythropoietin and regulation of erythropoietin production. Int J Hematol 70:1-6
Misaizu T, Matsuki S, Strickland TW, Takeuchi M, Kobata A and Takasaki S (1995) Role of antennary structure of N-linked sugar chains in renal handling of recombinant human erythropoietin. Blood 86:4097-4104
Morimoto K, Tsuda E, Said AA, Uchida E, Hatakeyama S, Ueda M and Hayakawa T (1996) Biological and physicochemical characterization of recombinant human erythropoietins fractionated by Mono Q column chromatography and their modification with sialyltransferase. Glycoconjugate J 13:1013-1020
Nagayama T, Sinor AD, Simon RP, Chen J, Graham S, Jin К and. Greenberg DA (1999) Cannabinoids and neuroprotection from global and focal cerebral ischemia and in vitro. J Neurosci 19:2987-2995
Nimtz M, Martin W, Wray V, Kloppel K-D, Augustin J and Conradt HS (1993) Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant BHK-21 cells. Eur J Biochem 213:39-56
Rahbek-Nielsen H, Roepstorff P, Reischl H, Wozny M, Koll H and Haselbeck A (1997) Glycopeptide profiling of human urinary erythropoietin by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass
Spectrom 32:948-958
Sadamoto Y, Igase K, Sakanaka M, Sato K, Otsuka H, Sakaki S, Masuda S and Sasaki R (1998) Erythro-poietin prevents place navigation disability and cortical infarction in rats with permanent occlusion of the middle cerebral artery. Biochem Biophys Res Commun 253:26-32
Sasaki R, Masuda S and Nagao M (2001) Pleiotropic functions and tissue-specific expression of eryhtro-poietin. News Physiol Sci 16:110-113
Simpson P and Savion S (1982) Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells Circ Res 50:101-116
Siren A-L, Fratelli M, Brines M, Goemans C, Casagrande S, Lewczuk P, Keenan S, Gleiter C, Pasquali C, Capobianco A, Mennini T, Heumann R, Cerami A, Ehrenreich H and Ghezzi P (2001) Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress. Proc Natl Acad Sci USA 98:4044-4049
Stahl PD, Rodman JS, Miller MJ and Schlesinger PH (1978) Evidence for receptor-mediated binding of glycoproteins, glycoconjugates, and lysosomal glycosidases by alveolar macrophages. Proc Natl Acad Sci USA
75:1399
Starring PL and Gaines Das RE (1992) The international standard for recombinant DNA-derived erythro-poietin: collaborative study of four recombinant DNA-derived erythropoietins and two highly purified human urinary erythropoietins. J. Endocrinol. 134: 459-484
Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N and Kobata A (1988) Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem 263:3657-3663
Takeuchi M, Inoue N, Strickland TW, Kubota M, Wada M, Shimizu R, Hoshi S, Kozutsumi H, Takasaki S, and Kobata A (1989) Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proc Natl Acad Sci USA 86:7819-7822
Takeuchi M and Kobota A (1991) Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoi-etins. Glycobiol 1:337-346
Toyoda T, Itai T, Arakawa T, Aoki KH and Yamaguchi H (2000) Stabilization of human recombinant erythropoietin through interactions with the highly branched N-glycans. Japan Biochem Soc 128:731-737
Tsuda E, Goto M, Murakami A, Akai K, Ueda M, Kawanishi G, Takahashi N, Sasaki R, Chiba H, Ishihara H, Mori M, Tejima S, Endo S and Arata Y (1968) Comparative structural study of N-linked oligosaccharides of urinary and recombinant erythropoietins. Biochemistry 7:5646-5654
- 30 -
008220
Tsuda E, Kawanishi G, Ueda M, Masuda S and Sasaki R (1990) The role of carbohydrate in recombinant human erythropoietin. Eur J Biochem 188:405-411
Van den Nieuwenhof IM, Koistinen H, Easton RL, Koistinen R, Kamarainen M, Morris HR, Van Die I, Seppala M, Dell A and Van den Eijnden DH (2000) Recombinant glycodelin carrying the same type of glycan structures as contraceptive glycodelin-A can be produced in human kidney 293 cells but not in Chinese hamster ovary cells. Eur J Biochem 267:4753-62
Van Eijk HG, Van Noort WL, Dubelaar M-L and Van der Heul С (1983) The microheterogeneity of human serum transferrins in biological fluids. Clin Chim Acta 132:167-172
Van Reemoortere A, Hokke CH, Van Dam GJ, Van Die I, Deelder AM and Van den Eijnden DH (2000) Various stages of Schistosoma express Lewis X, LacdiNAc, GalNAce1-4 (Fucal-2Fucal-3)GlcNAc carbohydrate epitopes: detection with monoclonal antibodies that are characterized by enzymatically synthesized neoglycoproteins. Glycobiol 10:601-609
Wasley LC, Timony G, Murtha P, Stoudemire J, Dorner AJ, Caro J, Krieger M and Kaufman RJ (1991) The importance of Nand O-linked oligosaccharides for the biosynthesis and in vitro and in vivo biological activities of erythropoietin. Blood 77:2624-2632
Watson E, Bhide A and Van Halbeek H (1994) Structure determination of the intact major sialylated oligo-saccharide chains of recombinant human erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells. Glycobiol
4:227-237
White MJ, DiCaprio MJ and Greenberg DA (1996) Assessment of neuronal viability with Alamar blue in cortical and granule cell cultures. J Neurosci Meth 70:195-200
Wiessner C, Allegrini PR, Ekatodramis D, Jewell UR, Stallmach T and Gassmann M (2001) Increased cerebral infarct volumes in polyglobulic mice overexpressing erythropoietin. J Cereb Blood Flow Metab 21:857864
Wong D, Prameya R and Dorovini-Zis К (1999) In vitro adhesion and migration of T lymphocytes across monolayers of human brain microvessel endothelial cells: regulation by ICAM-1, VCAM-1, E-selection and PECAM-1. J Neuropath Exp Neurology 58:138-152
- 31 -
008220
Таблица I
Маркерный белок
Описание
Пан-кератин
Обнаружение почти всех цитокератинов. Метит кератинизированный и роговичный эпидермис, многослойный плоский эпителий внутренних органов, многослойный эпителий, гиперпролиферативные кератиноциты и простой эпителий.
ЕМА
Антиген эпителиальной мембраны.
Метит нормальный и опухолевый эпителий.
S100
EF-полоса типа Са2+ -связывающих белков. Экспрессируется в нейрональных тканях и других тканях.
Виментин
Цитоскелетные промежуточные филаменты (= структурный белок).
Это основной маркёр клеток, происходящих из мезенхимы.
Экспрессируется при развитии скелетной мышцы.
Десмин
Цитоскелетные промежуточные филаменты (= структурный белок). Экспрессируются при развитии скелетной мышцы.
г.м.-актин.
Актин гладкомышечной клетки. Окрашивает гладкомышечные клетки и мио-эпителиальные клетки.
Синаптофизин
Реагирует с нейроэндокринными клетками.
Хромогранин
Кислые гликопротеины, которые широко экспрессируются в секреторных гранулах эндокринной, нейроэндокринной и нервной ткани.
NSE
Нейрон-специфичная энолаза. Метит клетки невронального и нейроэндокринного происхождения
Нейрофиламент
Реагирует с фосфорилированным нейрофиламентным белком и метит неврональные процессы и периферические нервы, а также симпатические ганглиозные клетки и мозговой слой надпочечников.
(GFAP) (поликон)
Глиальный фибриальный кислый белок. GFAP специфически обнаружен в астроглиях, которые отличаются высокой реактивностью на неврологические инсульты. Астроглиоз обнаруживается как результат механической травмы, СПИД-связанной деменции и перед инфекцией и сопровождается повышением экспрессии GFAP. Иммуногистохимический маркер локализации доброкачественного астроцита и опухолевых клеток глиального происхождения в центральной нервной системе.
CD-31
Реагирует с РЕСАМ-1.
Имеется в тромбоцитах, моноцитах,
гранулоцитах, лимфоцитах, эндотелиальных
клетках.
CD-34
Распознает О-гликозилированный трансмембранный гликопротеин. Экспрессируется в гемопоэтических стволовых клетках, васкулярных ЭК, эмбриональных фибробластах, некоторых клетках фетальной нервной ткани у взрослых.
N-CAM
Молекулы адгезии нервных клеток. N-CAM участвует во взаимодействии клетка-клетка в процессе роста.
- 32 -
008220
Таблица II
Маркерный белок
• Контрольная ткань
Пан-кератин
Карцинома толстого кишечника
ЕМА
Карцинома толстого кишечника
S100
Поджелудочная железа
Виментин
Миндалина
Десмин
Толстый кишечник
Г.м.-актин
Миндалина
Синаптофизин
Поджелудочная железа
Хромогранин
Поджелудочная железа
NSE
Поджелудочная железа
Нейрофиламент
Толстый кишечник
GFAP (поликон)
Мозг
CD-31
Толстый кишечник
CD-34
Миндалина
N-CAM (CD56)
Толстый кишечник
Таблица III
Маркерный белок
Поставщик
Антитело
Номер по каталогу
Разбавление антитела
Пан-кератин
Biogenex
IgGl мыши
MU071-UC
1:200
ЕМА
Da ко
IgG2a мыши
М0613
1:50
СТАЛ
d ли
Г7 Л ГЗ 1 1 ilU J1 1
1 .
Виментин
Biogenex
IgGl мыши
MU074-UC
1:3200
Десмин
Sanbio
IgG мыши
M0N 3001
1:50
Г.м.-актин
Biogenex
IgG2a мыши
MU128-UC
1:150
Синаптофизин
Da ко
IgGl мыши
М0776
1:50
Хромогранин
Biogenex
IgGl мыши
MU126-UC
1:150
NSE
Da ко
IgGl мыши
М0873
1:250
Нейрофиламент
Sanbio
IgG мыши
MON3004
1:300
GFAP (поликон)
Dako
IgGl мыши
М0761
1:200
CD-31
Da ко
IgGl мыши
М0823
1:60
CD-34
Biogenex
IgGl мыши
MU236-UC
1:20
N-CAM (CD56)
Neomarkers
IgGl мыши
MS.204.Р
1:10
- 33 -
008220
Таблица IV
Маркерный белок
Оценка реакции
Пан-кератин
Отрицательная
ЕМА
Отрицательная
S100
Отрицательная
Виментин
Положительная
Десмин
Отрицательная
Г.м.-актин
Отрицательная
Синаптофизин
Пол ожи те л ь на я
Хромогранин
Отрицательная
NSE
Отрицательная
Нейрофиламент
Положительная
GFAP (поликон)
Положительная
CD-31
Отрицательная
CD-34
Отрицательная
N-CAM (CD56)
Положительная
Таблица V
Клон и условия культивирования
Молярное соотношение нейтральных моносахаридов, нормализованное по трем маннозным остаткам
Man
Fuc
GalNAc
GlcNAc
Gal
P8-DMEM
0,5 (0,9)
0,4 (0,4)
2,2 (2,7)
1,7 (1,3)
P8-JRH
1,5 (1,4)
0,7 (0,8)
6,1 (6,4)
3,5 (3,9)
P7-DMEM
1,5 (1,4)
0,4 (0,3)
5,5 (6,1)
2,3 (3,3)
P7-JRH
1,8 (1,7)
0,4 (0,4)
6,1 (6,8)
3,6 (4,2)
C25-DMEM
2,0
1,0
6,0
2,2
Эпрекс
0,7
5,4
4,1
- 34 -
008220
Таблица VI
Масса (m/z)
Процентное содержание от общего количества
Соотношение Hex:HexNAc:dHex
Пул А
Пул В
Пул С
1809,64
2,34
2, 99
2,44
5:4:1
1850,67
2,57
5,31
2,49
4:5:1
1891,69
5, 06
10,39
1, 31
3:6:1
1955,70
1, 95
2,16
5:4:2
1996,72
6,37
7, 96
6,38
4:5:2
2037,75
6,33
5,16
5,39
3:6:2
2053,74
3,70
4,11
1, 98
5:5:1
2142,78
2,19
3, 68
2,45
4:5:3
2174,77
6,53
3, 63
8,04
6:5:1
ОТ О О О 1 ^lOJ, О J.
С СП и , VIZ)
с м
¦J 1 \J ?.
1 СП 1 г U 1
о . с . о
2199,80
3,78
4, 65
1, 58
4:6:2
2215,80
4,13
4, 95
4,15
5:6:1
2256,82
1,30
4:7:1
2320,83
2,34
2,04
3,29
6:5:2
2361,86
4,35
3,30
3,23
5:6:2
2377,85
3,77
3,79
2,86
6:6:1
2507,91
1, 62
2,32
1,32
5:6:3
2523,91
2,09
2, 60
1, 61
6:6:2
2539,90
11,89
4,81
19,32
7:6:1
2580,93
3,32
1,53
1, 69
6:7:1
2612,94
1,78
6:5:3
2669,97
1, 95
2, 34
6:6:3
2685,96
6,21
3,11
5,81
7:6:2
2726,99
1, 62
1,38
1,36
6:7:2
2832,02
3, 64
1,55
3,08
7:6:3
2905,04
1,79
2,45
8:7:1
2978,08
2,23
1, 65
7:6:4
- 35 -
008220
Таблица VII
Масса (m/z)
Процентное содержание от общего количества
Соотношение Hex:HexNAc:dHex
Пул А
Пул В
Пул С
1809,64
1,03
5:4:1
1850,67
3,36
2,05
4:5:1
1891,69
5,11
2,11
3,04
3:6:1
1955,70
1,46
1,22
1,08
5:4:2
1996,72
5,05
4,61
6,54
4:5:2
2012,72
1,34
1,38
1,35
5:5:1
2037,75
14,62
14,34
12,48
3:6:2
2053,74
3, 73
2,76
4,29
4:6:1
2142,78
2,57
1,97
2,06
4:5:3
2158,78
1,43
1, 91
5:5:2
2174,77
2, 40
2, 53
5, 58
6:5:1
2183,81
16,91
15,79
14, 90
3:6:3
2199,80
1,74
3,18
4, 90
4:6:2
2215,80
4,23
4,20
3,08
5:6:1
2256,82
2,08
3,04
2,17
4:7:1
2320,83
1, 67
1,88
2,23
6:5:2
2361,86
3,25
2,25
3,02
5:6:2
2377,85
1,50
1,84
2,73
6:6:1
2402,88
2, 05
2,20
4,26
4:7:2
2418,88
0,97
1,54
5:7:1
2466,89
1,03
6:5:3
2507,91
2,04
2,48
5:6:3
2523,91
1,58
1, 73
1,47
6:6:2
2539,90
2, 48
4,79
9, 56
7:6:1
2548,94
1,26
1,14
0, 66
4:7:3
2580,93
1,87
2,07
2,48
6:7:1
2685,96
2,74
3,39
4,30
7:6:2
2726,99
2,55
3,12
6:7:2
2768,01
1,35
5:8:2
2832,02
2,14
3,06
1,91
7:6:3
2873,05
1,70
1, 81
1, 63
6:7:3
2889,04
1,14
0,67
7:7:2
2978,08
0,89
0,99
2,39
7:6:4
3019,10
1,09
1,26
6:7:4
Таблица VIII Активности FT (нмоль/час/мг белка)
al,3 FT
al,6 FT
GalT
СНО
< 0,01
0, 03
4,31
12,5
PER.C6
< 0,01
0, 65
3, 62
3,41
- 36 -
008220
Таблица IX
Масса (m/z)
Hex
HexNAc
dHex
Фракция 1
Фракция 2
Фракция 3
Фракция 4
1631,6
1,16
1688,6
3,22
3,09
2,22
2,82
1793,7
1,29
1,15
0,83
1809,6
1,50
2,10
2,82
1834,7
1,71
1,77
1,73
1,41
1891,7
10,98
7,96
5,19
4,31
1955,7
0,86
3,36
0,87
1,33
1996,7
2,40
2,65
2, 47
2,32
2037,8
4,03
4,86
4,82
3,65
2053,7
6,43 .
5,39
3,89
2,65
2101,8
1,29
1,55
2142,8
1,71
2,03
1,36
2,98
2174,8
1,29
1, 95
1,36
0,00
2183,8
8,57
11,05
16,44
22,54
2199,8
4,54
5,04
4, 94
3,81
2215,8
5,66
4,60
2, 84
2,32
2256,8
1, 97
1,77
0,87
1,33
2320,8
1,03
1,27
0, 87
1,49
2361,9
4,46
4,86
4,39
3,31
2377,9
5,23
2,21
2,10
1,66
2507,9
1,65
1, 68
3,71
5,47
2523,9
3,43
2,21
2,22
1,82
2539,9
10,72
6,19
4, 94
4, 47
2580,9
2,14
2,21
1,85
1,16
2670,0
0,86
1, 68
2,47
2, 82
2686,0
6,69
6, 90
5, 93
3,81
2727,0
2,70
3,36
2,72
1,82
2832,0
2,83
4,60
6,43
3,81
2873,1
1,29
1,55
4,57
2, 98
2978,1
1,03
1,55
3,58
3,73
3019,1
2,47
2, 90
3124,1
0, 62
2,49
- 37 -
008220
Таблица X
Клон
Морфология
Экспрессия Е1А
Клоны Е1А.ЕРО
004
Гладкая
008*
Гладкая
025
Гладкая
+++
028
Мя тт^ньтст/ге" тлт.тты
034
Гладкая
056
Гладкая+исходная родительская морфология
062
Гладкая
+++
066
Гладкая
076
Исходная родительская морфология
1 Клоны EIA.EIB.EPO
002
Гладкая
003
Гладкая+исходная родительская морфология
005
Гладкая
023
Гладкая
+++
025
Гладкая+исходная родительская морфология
026
Гладкая
+++
028
Гладкая+исходная родительская морфология
031
Гладкая
033
Гладкая
+++
035
Исходная родительская морфология
049
Гладкая
051
Гладкая+исходная родительская морфология
057
Гладкая, неровная морфология
058
Гладкая
062
Гладкая
067
Гладкая
072*
Гладкая, неровная морфология
076
Гладкая
+++
077
Гладкая
+++
Таблица XI
[M+Nal +
1647,6
1909,6
1891,7
1996,7
2037,8
2174,8
2183,8
2215,8
2361,9
HexNAc
Hex
dHex
2 1
2 2
1 1
4 1
3 3
2 1
Предполагаемая структура
•> *
±~*
Клон 033
11%
Клон 008
Клон 072
Другая
возможная
структура
- 38 -
008220
[M+Na] +
2377,9
2402,3
2539,9
,2580,9
2686,0
2727;р
2832,0
2873,1
2905,0
HexNAc
Hex
dHex
Предполагаемая
структура
Клон 033
78%
Клон 008
28%
14%
Клон 072
26%
11%
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, характеризующаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гли-канах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гли-канах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гли-канах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
7. Композиция по любому из пп.1-6, где N-связанные гликаны в эритропоэтинподобных молекулах представляют собой преимущественно биантенные структуры.
8. Фармацевтический препарат, включающий композицию по п.1.
9. Применение композиции по п.1 в качестве лекарственного средства для лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы.
10. Способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы, предусматривающий стадию введения человеку или животному композиции по п.1.
11. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных глика-нах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
12. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропо-этинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
13. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
14. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных глика-нах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
15. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропо-этинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
16. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
17. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных глика-нах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
18. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропо-этинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
19. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
20. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных глика-нах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
21. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропо-этинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
- 39 -
008220
22. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
23. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных глика-нах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
24. Применение по п.9, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропо-этинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
25. Способ по п.10, где среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтин-подобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
254Ш
1809.7$
2906.10 V
| жетш
Фиг. 1А
"О I
Фиг. 1В
1650
Масса (m/z)
Фиг. 1 С
- 40 -
008220
и Т -I ( 1 ,-i-,-,--.-г---.
1650 2020 2390 2760 3130 3500
Масса (m/z)
Фиг. 1F
Фиг. 1G
- 41 -
008220
PER.C6 СНО
¦А- _К.
Низкий рН
Высокий рН
ABCDE F G Н I
Фиг. 2
р7.100 Эпрекс - + - +
52 35
Фиг. 3
- 42 -
008220
Сиаловая кислота ф Галактоза Н N-ацетилглюкозамин [> Фукоза
R Структура N-связанного сахара
Фиг. 5
Биологическая активность PER.C6-EPO
рЯКИи EprexSeU P7EP05eU P7EPO""U P7EP01MeU РВв/ОЛШ Тмил
Обработка
Фиг. 6
ADC карты через 24 часа после инсульта
Обработка ¦ Контроль ¦Эпрекс
? ЕРО-КЛОН022
Прямоугольники указывают средние
День
Фиг. 7А
- 43 -
008220
Т2 карты через 24 часа после инсульта
День
Обработка
¦ Контроль
¦ Эпрекс
? ЕРО-КЛОН022
Прямоугольники указывают среднее > /-1,0 CKO
Прямоугольники указывают средние
Фиг. 7В
16000 -,
14000 -
12000 -
10000 -
8000 -
ffl
6000 -
4000 -
2000 -
Уро
0 -
Период полувыведения Эпрекса у крыс
вотное 1 -•-Животное 2 -Животное 3
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 Время (мин)
Фиг. 8
Фракция 2
25.0 30.0
Фиг. 9 35.0
- 44 -
008220
1200 ""
Фракция 1 2120 ""°
Масса (m/z)
" 40
1200 "•"
Фракция 2
!833.4
2720.'
2120
Масса (m/z)
Фиг. 10А
МВ7.4 2833.4
"УГо"1 Г ' fl" 8 Г'74'6 В7В 5
Фракция 3 2120 2080
Масса (m/z)
'185.2
Фракция 4
2120 2SI0
Масса (m/z)
Фиг. 10А (продолжение)
- 45 -
008220
2185.08
r260
1700
2100 2500
Масса (m/z)
Фиг. 10В
3300
E1A
CI026
CI058
Фиг. 11
-* 1 •
Клон 072
КлонО^^
Фиг. 12
- 46 -
008220
НТ1080.ЕРО
Vbyagw-Spec"p> -B"42"U!
2977.14
Um,,m.","i,L Х**.л
жнш setae
LbJuU......1
Масса (m/z)
Фиг. 13
E1A.EPO cl 008
r_________"______________ ^kwUl*^
s -
Ё 40 X
35 so
Масса (m/z)
Voyager Spec M"BCIBP в 2540.9.3740]
2640.64
E1A.E1B.EP0 клон 072
; 1380.04
I'UM
о4--r
2728.04 2BZ Я j
Масса (m/z)
Фиг. 13(продолжение)
- 47 -
008220
GlcN
Фукоза
GalN
Человеческий
Клон 008
Клон 072
Клон 033
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 П.О 18.0 19.0 20.0 МИНУТЫ
Фиг. 14
.81 JTAA.T4,
Масса (m/z)
Фиг. 15А
-да
ei7S.3r
2200.33
шю мио 5B"
Масса (m/z)
Фиг. 15В
- 48 -
008220
Масса (m/z)
Фиг. 15D
1413l2111°9 8 7 6 5
I M Mil I I I I ___i ________I
...E_r-E
Фиг. 16
- 49 -
008220
56 54 -52 -s 50
5C О
со 48 S
46 i 44 42 40
Контроль
Эпрекс
Фиг. 17
Я . Г.
СНО-ЕРО PER.C6-EPO
S? 5
& 3
КОНТРОЛЬ ЭпреКС frCHO-EPO PER.C6 ЕРО
Фиг. 18
60 55 50 45 g 40 4 S 35 30 25 -J 20 •Hit
Контроль Эпрекс f ГСНО-ЕЕО PER.C6-EPO Фиг. 19
- 50 -
008220
F2 F
Фиг. 20
s100 1 80
i во 140
* 20
s100 g 80
0 60
1 40 s
55 20 л
1689.0
189 1851
2.1 2055
2185.2
254b
UluL
687.4 2833.5
200
38.5
660 |
I I |
1341.5
212
1691.
0 2580 3040 3500
Масса (m/z) 1837.4
°851 1311 1771 2231 2691 3151
Масса (m/z)
Фиг. 21
PNG-аза и сиалидаза
Галактозидаза nj/z 1688.6
' 6%
±* ф-4 I*-*
m/z 1996.7 5%
m/z 2183.8 m/z 2539.9 m/z 2686.0 9% 20% 15%
m/z 2832.0 10%
m/z 1891.7 23%
m/z 2053.7 5%
m/z 2183.8 6%
m/z 2199.8 13%
m/z 2978.1
5% [64%]
m/z 2507.9
7% [60%]
Фиг. 23
- 51 -
008220
Галактозидаза
^0R^ "Ъ* ?н -ku -кл
Z 1688.6 m/z 1891 7 mivoruco, _^..... i
m/z 1688, 6%
Фукозидаза
m/z 1542.6 7%
GlcN Ас-аза
Галактозидаза
(nfe 1688.6 8%
Фукозидаза
m/z 1891.7 23%
mfc 2053.7 m/z218a8 mfe 21998 5% 6% 13%
m/z 2507.9
7% [60%]
ъ~ l> "w^ -ъ-
Z 1542.6 m/*17"fi _^..... ._____ S
m/z 1745.6 27%
m &1907.7 m/z2037.8 m/z 2053.7 mfe2361.9 5% 8% 17%
6% 170%]
*> •
•*>
lb1"
m/z 933 40%
m/z 1298 6%
m/z 1339 6%
mfe 1444 18%
m/Zl8D9 7%
m/z 1955 7%
m/z 2037 6%
[92%]
Фиг. 24
^ OR ^
mfe 1891.7 23%
mfe 2053.7 m/z 2183.8 m/z 2199.8 mfc 2507.9
5% 6% 13% 7% [60%]
mfe 1485.5 m/z 1688.6 m/z 1891.7 m/z 2053.7 mfe 2094.7 mfe 2256.8
8% 12% 48% 9% 10% 10% [95%]
GlcNAc-аза
> i > > i ¦> ! ?> i
mfe 1079 69%
mfe 1444 12%
mfe 1485 13%
mfe 1891 6%
1100%]
Фиг. 25
- 52 -
008220
Vqyegw Spec#1-"BC*> eqBP - 2540Д 2027]
Voy"B.r Sp": #1-> Ш"ВС[Ш" - 1ШЛ, 176"j
"ИЛ
Фиг. 26
voy"ner SPK #"-> BC-> BCIW "i74".e. sosq
Масса (m/z)
Уоушдаг SpK #1-> ВСдаР " 93U. ""71
! *
X "¦ s
5? "
Масса (m/z)
- 53 -
008220
W <4Wr8p":#1-"BCIBP-11И.7. M14J 1M1.7
Масса (m/z)
Масса (m/z)
Фиг. 26(продолжение)
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 54 -