EA 008213B1 20070427 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2007\TIT_PDF/008213 Титульный лист описания [PDF] EAPO2007/PDF/008213 Полный текст описания EA200401448 20030602 Регистрационный номер и дата заявки US60/384,114 20020531 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2003/005753 Номер международной заявки (PCT) WO2003/101468 20031211 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [eab] EAB20702 Номер бюллетеня [RU] СПОСОБ ЗАЩИТЫ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВО ВРЕМЯ ХИМИОТЕРАПИИ Название документа A61K 31/7088, A61K 31/522, A61K 31/675, A61P 35/00 Индексы МПК [DE] Айсснер Гюнтер, Холлер Эрнст Сведения об авторах [DE] КЛИНИКУМ ДЕР УНИФЕРСИТЕТ РЕГЕНСБУРГ Сведения о патентообладателях [DE] КЛИНИКУМ ДЕР УНИФЕРСИТЕТ РЕГЕНСБУРГ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000008213b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

1. Применение защитного олигодезоксирибонуклеотида для производства лекарственного средства для защиты эпителиальных и/или эндотелиальных клеток от апоптоза и/или активации, индуцированных введением иммунодепрессанта, где указанный защитный олигодезоксирибонуклеотид выбран из

полидезоксирибонуклеотида, соответствующего следующей формуле случайной последовательности:

Р 1-5 , (dAp) 12-24 , (dGp) 10-20 , (dTp) 13-26 , (dCp) 10-20 ,

где Р=фосфорный радикал, dAp=дезоксиадениловый мономер, dGp=дезоксигуаниловый мономер, dTp=дезокситимидиловый мономер, dCp=дезоксицитидиловый мономер; или

олигодезоксирибонуклеотида, имеющего следующие физико-химические и химические характеристики: молекулярная масса: 4000-10000 Да, параметр гиперхромизма: менее 10, А + Т/С + G: 1,100 - 1,455, А + G/C + Т: 0,800 - 1,160, удельное вращение: +30 + 48.

2. Применение по п.1, где иммунодепрессант представляет собой нуклеозид.

3. Применение по п.1, где иммунодепрессант выбран из групп, включающих в себя флударабин, циклофосфамид, бисхлорэтилнитрозомочевину, мелфалан.

4. Применение по п.1, где иммунодепрессант представляет собой флударабин.

5. Применение по п.1, где защитный олигодезоксирибонуклеотид представляет собой дефибротид.

6. Применение по п.1, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят совместно, одновременно, после или перед введением пациенту иммунодепрессанта.

7. Применение по п.6, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят после стадии введения пациенту иммунодепрессанта.

8. Применение по п.7, где задержка по времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и стадией введения пациенту иммунодепрессанта составляет от 1 ч до двух недель, предпочтительно от двух суток до семи суток.

9. Применение по п.6, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят перед стадией введения пациенту иммунодепрессанта.

10. Применение по п.9, где разница во времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и стадией введения пациенту иммунодепрессанта составляет от одного часа до двух недель, предпочтительно от двух часов до двух суток.

11. Применение по пп.1-10, где вводимую дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил от 100 до 0,1 мкг/мл, предпочтительно от 10 до 100 мкг/мл.

12. Применение по п.11, где вводимую дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил 10 мкг/мл.

13. Применение по пп.1-12, где вводимая доза дефибротида составляет от 100 мг/кг массы тела пациента до 0,01 мг/кг массы тела, предпочтительно от 20 мг/кг массы тела пациента до 0,1 мг/кг массы тела.

14. Применение по п.13, где вводимая доза дефибротида составляет от 15 мг/кг массы тела пациента до 1 мг/кг массы тела, предпочтительно 12 мг/кг массы тела пациента.

15. Применение по любому из пп.1-14, где активация включает в себя усиленную экспрессию фактора межклеточной адгезии 1 (IСАМ-1).

16. Применение по любому из пп.1-15, где лечение иммунодепрессантом проводят во время трансплантации стволовых клеток.

17. Применение по п.16, где трансплантация стволовых клеток представляет собой трансплантацию аллогенных стволовых клеток.

18. Применение по п.1, где указанный полидезоксирибонуклеотид формулы P 1-5 , (dAp) 12-24 , (dGp) 10-20 , (dTp) 13-26 , (dCp) 10-20 имеет следующие физико-химические свойства: электрофоретическая = равномерная анодная подвижность; коэффициент экстинкции, Е 1см 1% при 260 + 1нм=220 + 10; отношение экстинкции, Е 230 260 =0,45 + 0,04; коэффициент молярной экстинкции (относительно фосфора), e (Р)=7,750 + 500; удельное вращение [ a ] D 20ш =53ш + 6; обратимый гиперхромизм, выраженный в % в нативной ДНК, h=15 + 5.

 

 


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:
Применение защитного олигодезоксирибонуклеотида для производства лекарственного средства для защиты эпителиальных и/или эндотелиальных клеток от апоптоза и/или активации, индуцированных введением иммунодепрессанта, где указанный защитный олигодезоксирибонуклеотид выбран из

полидезоксирибонуклеотида, соответствующего следующей формуле случайной последовательности:

Р 1-5 , (dAp) 12-24 , (dGp) 10-20 , (dTp) 13-26 , (dCp) 10-20 ,

где Р=фосфорный радикал, dAp=дезоксиадениловый мономер, dGp=дезоксигуаниловый мономер, dTp=дезокситимидиловый мономер, dCp=дезоксицитидиловый мономер; или

олигодезоксирибонуклеотида, имеющего следующие физико-химические и химические характеристики: молекулярная масса: 4000-10000 Да, параметр гиперхромизма: менее 10, А + Т/С + G: 1,100 - 1,455, А + G/C + Т: 0,800 - 1,160, удельное вращение: +30 + 48.

2. Применение по п.1, где иммунодепрессант представляет собой нуклеозид.

3. Применение по п.1, где иммунодепрессант выбран из групп, включающих в себя флударабин, циклофосфамид, бисхлорэтилнитрозомочевину, мелфалан.

4. Применение по п.1, где иммунодепрессант представляет собой флударабин.

5. Применение по п.1, где защитный олигодезоксирибонуклеотид представляет собой дефибротид.

6. Применение по п.1, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят совместно, одновременно, после или перед введением пациенту иммунодепрессанта.

7. Применение по п.6, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят после стадии введения пациенту иммунодепрессанта.

8. Применение по п.7, где задержка по времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и стадией введения пациенту иммунодепрессанта составляет от 1 ч до двух недель, предпочтительно от двух суток до семи суток.

9. Применение по п.6, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят перед стадией введения пациенту иммунодепрессанта.

10. Применение по п.9, где разница во времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и стадией введения пациенту иммунодепрессанта составляет от одного часа до двух недель, предпочтительно от двух часов до двух суток.

11. Применение по пп.1-10, где вводимую дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил от 100 до 0,1 мкг/мл, предпочтительно от 10 до 100 мкг/мл.

12. Применение по п.11, где вводимую дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил 10 мкг/мл.

13. Применение по пп.1-12, где вводимая доза дефибротида составляет от 100 мг/кг массы тела пациента до 0,01 мг/кг массы тела, предпочтительно от 20 мг/кг массы тела пациента до 0,1 мг/кг массы тела.

14. Применение по п.13, где вводимая доза дефибротида составляет от 15 мг/кг массы тела пациента до 1 мг/кг массы тела, предпочтительно 12 мг/кг массы тела пациента.

15. Применение по любому из пп.1-14, где активация включает в себя усиленную экспрессию фактора межклеточной адгезии 1 (IСАМ-1).

16. Применение по любому из пп.1-15, где лечение иммунодепрессантом проводят во время трансплантации стволовых клеток.

17. Применение по п.16, где трансплантация стволовых клеток представляет собой трансплантацию аллогенных стволовых клеток.

18. Применение по п.1, где указанный полидезоксирибонуклеотид формулы P 1-5 , (dAp) 12-24 , (dGp) 10-20 , (dTp) 13-26 , (dCp) 10-20 имеет следующие физико-химические свойства: электрофоретическая = равномерная анодная подвижность; коэффициент экстинкции, Е 1см 1% при 260 + 1нм=220 + 10; отношение экстинкции, Е 230 260 =0,45 + 0,04; коэффициент молярной экстинкции (относительно фосфора), e (Р)=7,750 + 500; удельное вращение [ a ] D 20ш =53ш + 6; обратимый гиперхромизм, выраженный в % в нативной ДНК, h=15 + 5.

 

 


008213
Область изобретения
Изобретение относится к области применения лучевой терапии и/или химиотерапии. Более конкретно, изобретение касается способа смягчения побочных эффектов, ассоциированных с таким лечением.
Предшествующий уровень техники
Трансплантация аллогенных стволовых клеток (ТСК) является хорошо разработанным методом лечения гематологических неоплазий и возрастающего числа других злокачественных расстройств. ТСК состоит в основном из двух последовательных стадий: предтрансплантационного кондиционирования (pretransplant conditioning), в классическом случае состоящего из тотального облучения организма (ТОО) и химиотерапии, которые приводят к минимальной резидуальной болезни и иммуносупрессии реципиента, в качестве первой стадии, и пересадки аллогенных стволовых клеток, которая, наконец, должна обеспечить лечебный эффект, в качестве второй стадии. Однако, вследствие несоответствия антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС) и минорных (mHAg) Н-антигенов гистосовместимости, на разных этапах после трансплантации могут начаться сильные воспалительные реакции, включая острую реакцию "трансплантат против хозяина" (РТПХ). Широко распространено основанное на исследованиях авторов изобретения1 и ряда других исследователей2,3 мнение, что кондиционирование через неспецифическое воспаление способствует появлению этих связанных с трансплантатом осложнений (СТО). Кроме того, была продемонстрирована прямая токсичность, особенно в случае ТОО4,5. Это привело к появлению большого числа альтернативных режимов кондиционирования, исследование которых идет в настоящее время. Помимо прочего, новые методы предтрансплантационной терапии позволяют расширить протоколы лечения и увеличить круг пациентов. Одним из соединений этих новых концепций кондиционирования является флударабин, немиелоаблативный иммунодепрессант, изначально использовавшийся для лечения хронических лимфолейкозов6. Флударабин в сочетании, например, с бис-хлор-этилнитрозомочевиной (БХНМ) и мелфаланом, циклофосфамидом или другими агентами может заменять ТОО или используется совместно с низкодозными режимами ТОО7,8. Полученные к настоящему моменту клинические данные свидетельствуют в пользу сравнительно низких побочных эффектов флу-дарабина и его специфичности в отношении гемопоэтических и иммунокомпетентньгх клеток9. Однако влияние этого соединения на клетки, не являющиеся гемопоэтическими, такие как эндотелиальные и эпителиальные клетки, до настоящего времени не было исследовано.
Фактически все СТО связаны с дисфункцией и повреждением эндотелия10. Авторы изобретения и другие исследователи показали, что эндотелий является мишенью предтрансплантационного кондиционирования in vitro и in vivo. Ионизирующее излучение индуцирует программированную гибель (апоптоз) эндотелиальных клеток11-14. В то же время происходит активация эндотелия, выражающаяся в экспрессии молекул адгезии, которая ведет к увеличению лейкоцит-эндотелиальных взаимодействий, что является предпосылкой для развития воспалительных процессов15,16. Эти эффекты значительно усиливаются под влиянием бактериального эндотоксина (липополисахарид, ЛПС), который может проникать из желудочно-кишечного тракта через поврежденные барьеры слизистой оболочки17. Кроме того, как было показано, ЛПС увеличивает антигенность эндотелиальных клеток в отношении аллогенных CD8+ цитотокси-ческих Т-лимфоцитов18.
Имеющиеся к настоящему времени результаты клинических испытаний с использованием флудара-бина, включавших режимы кондиционирования пониженной интенсивности (РКПИ), ясно показывают снижение токсичности, связанной с кондиционированием, при отсутствии воздействия на иммуновос-становительную терапию25. Частота встречаемости острой РТПХ у пациентов, проходивших РКПИ, сравнима или даже меньше таковой у пациентов, подвергавшихся стандартному режиму кондиционирования. Однако есть сообщения о случаях появления таких же или даже более тяжелых поздних последствий, подобных остеонекрозу27, легочным осложнениям28, и других хронических РТПХ, что отчетливо демонстрирует возможность возникновения серьезных побочных эффектов, связанных с лечением флу-дарабином.
Краткое изложение сущности изобретения
В основе данного изобретения лежит открытие способности флударабина активировать и повреждать эндотелиальные и эпителиальные клетки. В случаях лечения с использованием флударабина, например лечения злокачественных опухолей при помощи ТГСК, активация клеток приводит к их повреждению. Эпителиальные и эндотелиальные клетки можно защитить от такой активации и повреждения при помощи лечения дефибротидом. Это лечение можно проводить совместно или дефибротид можно вводить перед лечением флударабином или после него.
Сокращения и определения
ТГСК: трансплантация гемопоэтических стволовых клеток.
Иммунодепрессант: вещество, снижающее иммунный ответ субъекта при введении. Иммуноде-прессанты используют для супрессии иммунной системы пациентов, подвергающихся терапии стволовыми клетками. Примеры иммунодепрессантов включают в себя флударабин, циклофосфамид, БХНМ, циклоспорин, сиролимус, такролимус и мелфалан. В контексте данного изобретения предпочтительным является флударабин (также известный как 2-фтор-9-Р^-арабинофуранозиладенин).
- 1 -
008213
Защитный олигодезоксирибонуклеотид: в контексте данного изобретения означает как олигодезокси-рибонуклеотиды, как определено в патенте США 5,646,268, так и полидезоксирибонуклеотиды, как определено в патенте США 5,223,609, включенных посредством ссылки в данное описание во всей своей полноте.
В патенте США 5,646,268 представлен способ получения олигодезоксирибонуклеотида, обладающего следующими физико-химическими и химическими характеристиками:
Молекулярная масса: 4000-10000
h: <10
A+T/C+G* 1,100-1,455
A+G/C+T* 0,800-1,160
Удельное вращение: +30° - +48°
*молярное отношение оснований h= параметр гиперхромизма
Способ получения такого олигодезоксирибонуклеотида включает в себя осаждение 0,8М водных натрий-ацетатных растворов натриевых солей полидезоксирибонуклеотидов при 20°С путем добавления алкилового спирта, выбранного из группы, состоящей из этилового, пропилового и изопропилового спирта.
В патенте США 5,223,609 раскрыт дефибротид, который обладает определенными фармакологическими и терапевтическими свойствами и поэтому является особенно подходящим при условии, что формирующие его фракции нуклеотидов находятся в стехиометрическом соответствии со следующей поли-дезоксирибонуклеотидной формулой случайной последовательности:
Pl5, (dAp)i2 24, (dGp)i0-20, (dTp)i326, (dCp)i0-20,
где Р=фосфорный радикал,
dAp=дезоксиадениловый мономер,
dGp=дезоксигуаниловый мономер,
dTp=дезокситимидиловый мономер,
dCp=дезоксицитидиловый мономер. Более того, дефибротид, соответствующий этой формуле, обладает следующими физико-химическими свойствами: электрофоретическая = равномерная анодная подвижность; коэффициент экстинкции, Е1 см1% при 260±1нм=220±10; отношение экстинкции, Е23О/Е26О=0,45±0,04; коэффициент молярной экстинкции (относительно фосфора), е(Р)=7,750±500; удельное вращение [ Предпочтительным защитным олигодезоксирибонуклеотидом является дефибротид (регистрационный номер СА8: 83712-60-1), полинуклеотид, хорошо известный специалистам в данной области, который обычно идентифицирует полидезоксирибонуклеотид, полученный путем экстракции (US 3,770,720 и US 3,899,481) из животной или растительной ткани; этот полидезоксирибонуклеотид обычно используют в форме соли щелочного металла, как правило, натрия, и обычно его молекулярная масса составляет приблизительно 45-50 кДа. В основном дефибротид используют как вещество, обладающее антитромботиче-ской активностью (US 3,829,567), хотя его можно использовать для различных целей, например для лечения острой почечной недостаточности (US 4,694,134) и лечения острой ишемии миокарда (US 4,693,995). В патентах США 4,985,552 и 5,223,609 описан способ получения дефибротида, позволяющий получить продукт, имеющий постоянные и хорошо определяемые физико-химические характеристики, а также свободный от любых нежелательных побочных эффектов.
Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, подвергающегося лечению имму-нодепрессантом, включающему в себя стадию введения этому пациенту эффективной дозы защитного олигодезоксирибонуклеотида. Лечение иммунодепрессантом предпочтительно происходит во время ТГСК. Иммунодепрессант предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя антиметаболиты (например, 5-фторурацил (5-ФУ), метотрексат (МТХ) флударабин), антимикротрубочковые агенты (например, винкристин, винбластин, таксаны (такие, как паклитаксел и доцетаксел)), алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, мелфалан, бисхлорэтилнитрозомочевина (БХНМ)), платиновые агенты (например, цисплатин (также называемый cDDP), карбоплатин, оксалиплатин, JM-216, CI-973), антрацикли-ны (например, доксорубицин, даунорубицин), антибиотические агенты, включая митомицин-С, ингибиторы топоизомеразы (например, этопозид, камптотецин), циклоспорин, такролимус, сиролимус и другие цитотоксические агенты, механизм действия которых основан на супрессии иммунной системы. Обзор таких агентов, часто используемых в терапии злокачественных опухолей, можно найти в статье Gonzales et al., Alergol. Immunol. Clin. 15, 161-181, 2000, включенной в данное описание посредством ссылки. Предпочтительными иммунодепрессантами являются нуклеозиды (т.е. гликозиды, получаемые из нуклеотида путем удаления фосфатной группы), такие как, например, флударабин, который, кстати, является предпочтительным иммунодепрессантом для целей данного изобретения.
- 2 -
008213
Защитные олигодезоксирибонуклеотиды можно вводить совместно, одновременно или вместе с иммунодепрессантом. Предпочтительной комбинацией является одновременное введение дефибротида и флударабина.
Стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида предпочтительно проводят совместно, вместе, одновременно, перед или после введения пациенту иммунодепрессанта.
В предпочтительном воплощении изобретения стадию введения защитного олигодезоксирибонук-леотида проводят после введения пациенту иммунодепрессанта. В следующем предпочтительном воплощении задержка по времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и введением пациенту иммунодепрессанта составляет от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 недель. Предпочтительно задержка по времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и введением пациенту иммунодепрессанта составляет от приблизительно 2 до приблизительно 7 суток.
В следующем предпочтительном воплощении изобретения стадию введения защитного олигодезок-сирибонуклеотида проводят перед введением пациенту иммунодепрессанта. Предпочтительно разница во времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и введением пациенту им-мунодепрессанта составляет от приблизительно 1 ч до приблизительно 2 недель. Более предпочтительно разница во времени между стадией введения защитного олигодезоксирибонуклеотида и введением пациенту иммунодепрессанта составляет от приблизительно 2 ч до приблизительно 2 суток.
Предпочтительным защитным олигодезоксирибонуклеотидом является дефибротид, однако в качестве защитных олигонуклеотидов могут быть использованы и другие вещества, упомянутые выше. В последующих воплощениях для дефибротида определены предпочтительные дозы; однако сходные дозы можно использовать при использовании защитного олигодезоксирибонуклеотида, не являющегося де-фибротидом. Оптимальную дозу для любого защитного олигодезоксирибонуклеотида будет определять лечащий врач. Эксперименты, описание которых приведено ниже, демонстрируют защитные эффекты дефибротида. Эффективная доза, определенная в таких экспериментах, может быть использована в качестве основы для определения дозы, эффективной для лечения.
Дефибротид предпочтительно вводят перорально или внутривенно.
Предпочтительную дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил приблизительно от 100 до 0,1 мкг/мл. Более предпочтительно дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил от приблизительно 10 до приблизительно 100 мкг/мл. Наиболее предпочтительно дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил приблизительно 100 мкг/мл.
В предпочтительном воплощении изобретения вводимая доза дефибротида составляет от приблизительно 100 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 0,01 мг/кг массы тела. Предпочтительно вводимая доза дефибротида составляет от приблизительно 20 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 0,1 мг/кг массы тела. Более предпочтительно вводимая доза дефибротида составляет от приблизительно 15 мг/кг массы тела пациента до приблизительно 1 мг/кг массы тела. Более предпочтительно вводят суточную дозу от приблизительно 12 до приблизительно 14 мг на 1 кг массы тела пациента. Наиболее предпочтительно вводимая доза дефибротида составляет приблизительно 12 мг/кг массы тела пациента.
Предпочтительно введение защитного олигодезоксирибонуклеотида по изобретению способно защитить эндотелиальные клетки и эпителиальные клетки от воздействий иммунодепрессанта. Иммуноде-прессант предпочтительно активирует эпителиальные клетки и эндотелиальные клетки и индуцирует их апоптоз. Таким образом, в предпочтительном воплощении защитный олигодезоксирибонуклеотид защищает эпителиальные и/или эндотелиальные клетки от апоптоза и/или активации иммунодепрессантом. Предпочтительным иммунодепрессантом является флударабин. Предпочтительным защитным олигоде-зоксирибонуклеотидом является дефибротид.
Активация включает в себя усиленную экспрессию фактора межклеточной адгезии 1 (1САМ-1) и молекул МНС I класса. Предпочтительно значительное усиление экспрессии. Кроме того, предпочтительно иммунодепрессант индуцирует провоспалительную активацию эндотелиальных и/или эпителиальных клеток у пациента. Предпочтительно клетки представляют собой клетки эндотелия капилляров человека (human microvascular endothelial cells - НМЕС) и/или кожные и/или альвеолярные эпителиальные клетки. Повреждение предпочтительно происходит, когда эндотелиальные и/или эпителиальные клетки пациента подвергают воздействию иммунодепрессанта в течение от приблизительного 1 ч до приблизительно 1 недели или больше. Более предпочтительно указанное повреждение происходит, когда указанные клетки подвергают воздействию в течение от приблизительного 5 до приблизительно 72 ч. Еще более предпочтительно продолжительность такого воздействия составляет приблизительно от 20 до 72 ч. Наиболее предпочтительно продолжительность такого воздействия составляет более 48 ч.
Лечение иммунодепрессантом предпочтительно происходит в ходе трансплантации гемопоэтиче-ских стволовых клеток. Предпочтительно трансплантация гемопоэтических стволовых клеток представляет собой трансплантацию аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.
Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей в себя, по меньшей мере, защитный олигодезоксирибонуклеотид, для лечения нуждающегося в этом пациента, подвергающегося лечению иммунодепрессантом. Введение указанной фармацевтической композиции смягчает или защищает от побочных эффектов, являющихся результатом воздействия иммунодепрессанта
- 3 -
008213
или иммунодепрессанта и трансплантата. Предпочтительным трансплантатом является костный мозг или гемопоэтические стволовые клетки. Более предпочтительно трансплантат представляет собой аллоген-ный костный мозг или аллогенные гемопоэтические стволовые клетки.
Побочные эффекты предпочтительно касаются эндотелиальных и/или эпителиальных клеток и/или тканей пациента. Предпочтительно эти побочные эффекты включают апоптоз и/или активацию указанных клеток. Активация предпочтительно включает в себя усиленную экспрессию молекул МНС I класса и/или фактора межклеточной адгезии 1 (1САМ-1). Побочные эффекты повреждают клетки эндотелия капилляров человека (НМЕС), а также, предпочтительно, кожные и альвеолярные эпителиальные клеточные линии после 48 ч культивирования при условии использования в фармакологически релевантных концентрациях (диапазон: от 10 до 1 мкг/мл).
Побочные эффекты в большинстве случаев включают в себя повреждение тканей, являющихся мишенями связанных с трансплантатом осложнений и вызванного аллогенного иммунного ответа.
Эти побочные эффекты предпочтительно включают в себя значительное усиление экспрессии фактора межклеточной адгезии 1 (1САМ-1) и молекул МНС I класса в эндотелиальных и/или эпителиальных клетках пациента, особенно в альвеолярных эндотелиальных клетках. Побочные эффекты также включают в себя провоспалительную активацию клеток эндотелия капилляров. Побочные эффекты также предпочтительно включают в себя усиление лизиса таких клеток аллогенными цитотоксическими Т-лим-фоцитами, рестриктированными по МНС I класса, имеющими происхождение от трансплантата.
Введение защитного олигодезоксирибонуклеотида предпочтительно защищает от вызванных имму-нодепрессантом побочных эффектов, включая апоптоз и аллоактивацию.
Фармацевтические композиции, включающие в себя иммунодепрессант по изобретению, могут быть приготовлены с использованием традиционных и хорошо известных методов, эксципиентов и наполнителей для перорального и инъекционного, особенно внутривенного введения. Дозы активного ингредиента в композициях по изобретению могут варьировать от 50 до 1500 мг на однократную дозу, но для достижения желаемых результатов предложено введение от 10 до 40 мг/кг в сутки. Способы получения дефибротида можно найти в патентах США 4,985,552 и 5,223,609, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу иммунодепрессанта и защитного олигодезоксирибонуклеотида. Предпочтительным иммунодепрессантом является флударабин. Предпочтительным защитным олигодезоксирибонукле-отидом является дефибротид.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: флударабин индуцирует программированную гибель клеток эндотелия капилляров человека (НМЕС). НМЕС или оставляли необработанными, или инкубировали с убывающими концентрациями 2-фтор-9-в-арабинофуранозиладенина (метаболизированной формы флударабина, в дальнейшем обозначаемой F-Ara) в течение 48 ч и анализировали при помощи проточной цитометрии (А) или DAPI-окраши-вания с микроскопией. А: контурные графики зависимости изображения бокового светорассеяния (side scatter - SSC) (по оси х) пропидийиодид (РЦ-негативных клеток от изображения прямого светорассеяния (forward scatter - FSC) (по оси у) в качестве параметра зависимости клеточной гранулярности от размера клеток. В: количественный анализ DAPI-окрашенных эндотелиальных клеток с использованием флуоресцентной микроскопии. Результаты представлены в % апоптотических НМЕС (% апоптотических кле-ток)±стандартное отклонение (из n=10 полей зрения со средним количеством клеток на поле, равном 70). Приведены показательные результаты по меньшей мере пяти независимых экспериментов. *: р <0,001 необработанного контроля относительно клеток, обработанных F-Ara (10 мкг/мл).
Фиг. 2: дефибротид (D) ингибирует индуцированный F-Ara апоптоз в НМЕС, доказательство внутриклеточного антагонизма. F-Ara: 10 мкг/мл. D: 100 мкг/мл. Анализ посредством проточной цитометрии SSC-изображения PI-негативных клеток. А: воспроизводимая индукция апоптоза с использованием F-Ara. В: дозозависимое ингибирование индуцированного F-Ara апоптоза посредством D. С: левый график: инкубация НМЕС с F-Ara в течение 1 ч, после промывки последующая инкубация с D в течение 48 ч. Правый график: инкубация НМЕС с D в течение 1 ч, после промывки последующая инкубация с F-Ara в течение 48 ч. Подробности эксперимента изложены в комментариях к фиг. 1 и в разделе "Материалы и методы". Приведен один показательный эксперимент из трех независимых экспериментов.
Фиг. 3: F-Ara индуцирует апоптоз в кератиноцитах и альвеолярных эпителиальных клетках, но не в клетках кишечного и бронхиального эпителия; защитный эффект дефибротида. F-Ara: 10 мкг/мл. D: 100 мкг/мл. Анализ посредством проточной цитометрии SSC-изображения PI-негативных клеток (фиг. 3А) и анализ посредством DAPI-окрашивания апоптотических клеток (фиг. 3В). Результаты представлены как среднее значение % апоптотических клеток±стандартное отклонение в трех разных экспериментах. НаСаТ: клеточная линия кератиноцитов человека. SW 480: клеточная линия кишечного эпителия. А 549: клеточная линия карциномы легкого из альвеолярного эпителия. BEAS-2B: клеточная линия бронхиального эпителия. Первичные клетки бронхиального эпителия были получены в результате бронхоскопии с щеточной биопсией. Фиг. 3А: *: р=0,005 клеток НаСаТ, обработанных F-Ara, относительно клеток НаСаТ, обработанных F-Ara+D; **: р=0,116 клеток А 549, обработанных F-Ara, относительно клеток А 549, обработан
- 4 -
008213
ных F-Ara+D; -: нет индукции апоптоза. Фиг. 3В: +: р=0,026 клеток НаСаТ, обработанных F-Ara, относительно клеток НаСаТ, обработанных F-Ara+D; ++: р=0,001 клеток А 549, обработанных F-Ara, относительно клеток А 549, обработанных F-Ara+D. Подробности эксперимента изложены в комментариях к фиг. 1 и в разделе "Материалы и методы". Для каждой клеточной линии суммированы результаты трех показательных экспериментов.
Фиг. 4: дефибротид (D) не препятствует проявлению антилейкемического и антиРВМС эффектов F-Ara. F-Ara: 10 мкг/мл. D: 100 мкг/мл. А: Окрашивание пропидийиодидом зародышевых клеток пациента с острым миелоидным лейкозом (AML), полученных на стадии бластного криза (70% бластов из всех подсчитанных РВМС). Результаты трех независимых экспериментов представлены в виде среднего значения % жизнеспособности клеток. *: р=0,008 контрольных клеток AML относительно обработанных F-Ara клеток AML. В: анализ посредством проточной цитометрии SSC-изображения PI-негативных РВМС. Приведены результаты одного показательного эксперимента из пяти независимых экспериментов с разными донорами крови.
Фиг. 5: F-Ara индуцирует экспрессию ГСАМ-1 в клетках НМЕС, защитный эффект дефибротида (D). Анализ посредством проточной цитометрии ГСАМ-1 позитивных клеток. НМЕС или оставляли необработанными, или инкубировали с F-Ara (10 мкг/мл, или убывающие концентрации в В) в присутствии или в отсутствие убывающих концентраций D. А: гистограмма экспрессии ГСАМ-1 по результатам показательного эксперимента. Пунктирная линия: фоновое окрашивание (нулевой контроль); тонкая линия: экспрессия ГСАМ-1 необработанных контрольных клеток; толстая линия: экспрессия ГСАМ-1 клеток, обработанных F-Ara. В: дозозависимая индукция экспрессии ГСАМ-1 посредством F-Ara. Объединенные результаты трех независимых экспериментов. Результаты представлены как среднее значение % ГСАМ-1 позитивных клеток±стандартное отклонение. *: р=0,075 обработанных F-Ara клеток относительно необработанных контрольных клеток. С: дозозависимое ингибирование индуцированной F-Ara экспрессии ГСАМ-1 дефибротидом (D). Результаты представлены как среднее значение % ГСАМ-1 позитивных кле-ток±стандартное отклонение. **: р=0,004 обработанных F-Ara клеток НМЕС относительно клеток НМЕС, обработанных F-Ara+D.
Фиг. 6: F-Ara увеличивает аллогенность НМЕС к CD8-позитивным цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL), защитный эффект дефибротида. А: РВМС стимулировали облученными НМЕС в присутствии интерлейкина 2 (50 единиц/мл) в течение 7 дней и подвергали анализу высвобождения 51СГ с необработанными (контроль) и обработанными F-Ara (10 мкг/мл) НМЕС (24 ч инкубации) в качестве клеток-мишеней. Аутолог. B-LCL: аутологичные (эффекторные) трансформированные вирусом Эпштейна-Барр В-лимфобластоидные клетки. K 562: клетки-мишени для естественных киллеров (NK-клеток). Результаты представлены в виде % специфического лизиса, как описано в разделе "Материалы и методы". *_: % специфического лизиса обработанных F-Ara НМЕС в присутствии антител w6/32 против МНС I класса. Соотношение Э/М: соотношение эффектор/мишень. В: снижение индуцированной F-Ara аллогенности НМЕС в отношении СD8-позитивных CTL дефибротидом (D). СD8-позитивные РВМС отбирали путем негативной селекции (очищены от не-О08+ клеток) с помощью разделения с использованием магнитных шариков (magnetic bead separation). Детали эксперимента изложены в комментариях к фиг. 6 А.
Фиг. 7: F-Ara уменьшает аллогенность НМЕС по отношению к NK-клеткам, усиление лизиса блокированием МНС I класса. NK-клетки отбирали путем негативной селекции (очищали от не-МК-клеток) с помощью разделения с использованием магнитных шариков и стимулировали облученными НМЕС в присутствии IL-2 (50 единиц/мл) в течение 4 дней, после чего подвергали анализу высвобождения 51СГ, как описано для фиг. 6. Таблица под графиком: Анализ посредством проточной цитометрии популяции клеток-эффекторов до и после стимуляции с использованием НМЕС. NK-клетки были охарактеризованы как CD3-/CD16+CD56+. *_: % специфического лизиса клеток K 562 при соотношении Э/М 20:1.
Антиэндотелиальные CTL проявляют Тс 1-подобный фенотип
Эффектор
IFN-Y
IL-4
РВМС
319[±176]
CD8+
524 [± 174]
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для выявления продукции интерферона гамма (IFN-y) и интерлейкина 4 (IL-4) в супернатантах стимулированных клеток-эффекторов (7 дней, облученные НМЕС, 50 единиц/мл IL-2). РВМС или оставляли неразделенными, или отбирали путем негативной селекции на CD8+ Т-клетки, как изложено в экспериментах, показанных на фиг. 6. Результаты представлены в виде среднего значения в пг/мл цитокина±стандартное отклонение для трех независимых экспериментов.
Примеры Методы
Клеточная культура и реагенты.
Линия клеток эндотелия капилляров кожи человека CDC/EU.-HMEC-1 (в дальнейшем обозначаемая НМЕС) была любезно предоставлена центром контроля и предотвращения заболеваний (Atlanta, Georgia,
- 5 -
008213
USA) и была стабилизирована описанным ранее образом19. НМЕС культивировали в среде MCDB131 с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1 мкг/мл гидрокортизона (Sigma, Deisenhofen, Germany), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (Collaborative Biochemical Products, Bedford, MA, USA) и антибиотиков. Все реагенты для культивирования клеток были закуплены у Gibco BRL (Karlsruhe, Germany), если не указано иначе. 2-Фтораденин-9-бета-Э-арабинофуранозид (F-Ara) был получен от Sigma, Deisenhofen, Germany, флаконы с дефибротидом были получены от Prociclide(tm), Crinos, Como, Italy.
Изучение апоптоза.
Общепринятый метод выявления апоптоза в эндотелиальных клетках человека осуществляли так, как было описано ранее20, с использованием проточной цитометрии (компьютерные программы FACScan(tm) и CellQuest(tm), Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Эндотелиальные и эпителиальные клетки оставляли необработанными или инкубировали с убывающими концентрациями (варьирующими от 10 до 0,1 мкг/мл) F-Ara в присутствии дефибротида или без него в течение 48 ч. После этого клетки промывали PBS/10% FCS (PBS - фосфатно-солевой буферный раствор) и окрашивали детектирующим некроз красителем пропидийиодидом (PI, 0,2 мкг/мл, Sigma, Deisenhofen, Germany). Апоптотические клетки идентифицировали по PI-негативному окрашиванию и характерному изображению бокового светорассеяния, отличному от такового для неапоптотических клеток. Для каждого типа клеток проводили по меньшей мере три эксперимента.
В качестве альтернативного метода для детекции апоптоза использовали микроскопический анализ клеток, ДНК которых была помечена флуоресцентным красителем. Производили посев эндотелиальных клеток на чашки Петри 35 мм (Nunc, Wiesbaden, Germany) в количестве 1х 105 на чашку. Эти клетки обрабатывали описанным выше способом, после чего фиксировали смесью метанол/ацетон (1:1) в течение 2 мин, однократно промывали PBS, окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (0,5 мкг/мл, Sigma, Deisenhofen, Germany) и растворяли в 20% глицерине/PBS. Образцы заключали под стекла и подвергали микроскопии. Конденсацию ядра, выявляемую красителем DAPI при отсутствии поглощения трипанового синего, рассматривали как характеристику апоптоза, в отличие от некроза21. Количественный анализ включал подсчет числа апоптотических клеток по отношению к общему числу идентифицируемых клеток по меньшей мере из 10 полей зрения со средним числом клеток на поле, равным 70.
Для большей четкости изложения здесь представлены только результаты окрашивания DAPI для экспериментов с эндотелиальными клетками и клетками линий НаСаТ, а также А 549.
Анализы клеточной поверхности.
Экспрессию ICAM-1 (Becton Dickinson/Pharmingen, Heidelberg, Germany) и молекул МНС I класса (w6/32, супернатант гибридомы, Американская коллекция типовых культур (АТСС), Manassas, VA, USA) на поверхности НМЕС оценивали при помощи метода непрямой иммунофлуоресценции с последующей проточной цитометрией с использованием проточного цитометра FACScan(tm) и программы анализа CellQuest(tm) (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Эндотелиальные клетки обрабатывали согласно методике и после инкубации снимали с использованием трипсина/ЭДТА (ЭДТА - этилендиаминтетраук-сусная кислота) (Gibco), однократно промывали смесью холодный PBS/10% FCS и инкубировали 1 ч на льду с добавлением антител против молекул адгезии (МОАЬ) в концентрации 5 мкг/мл. Клетки снова промывали и инкубировали с фрагментом F(ab)2 антимышиных козьих антител, меченных IgG-FITC (IgG-FITC - иммуноглобулин G - флуоресцин) (Dako, Hamburg, Germany), в течение 45 мин на льду. Затем клетки промывали в смеси PBS/10% FCS и анализировали. Жизнеспособность клеток определяли при помощи совместного окрашивания пропидийиодидом (0,2 мкг/мл, Sigma, Deisenhofen, Germany). Исключение первых антител являлось негативным контролем для выявления неспецифической флуоресценции. Этот подход был использован вместо контрольных изотипических антител, основываясь на предыдущем наблюдении, что на поверхности эндотелиальных клеток отсутствуют Fc-рецепторы22. Поэтому можно было исключить возможность неспецифического связывания антител через их Fc-участок.
Аллостимуляция клеток периферической крови при помощи НМЕС.
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были получены из гепаринизированной (Novo Nordisk, Mainz, Germany) крови здоровых добровольцев или из светлых слоев кровяных сгустков, полученных специалистами Красного Креста Баварии согласно стандартному протоколу с использованием центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-hypaque (Pharmacia, Freiburg, Germany). Затем клетки стимулировали облученными (20 Гр) НМЕС в соотношении 1:1 и 2:1 в течение 7 дней в присутствии интерлейкина 2 (50 единиц/мл) и 10% человеческой АВ сыворотки (Sigma, Deisenhofen, Germany). В качестве альтернативы РВМС подвергали селекции на CD8+ Т-клетки и естественные киллеры (NK) с использованием наборов для выделения клеток согласно инструкциям производителя (MACS(tm), Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany), основанным на устранении клеток, не являющихся CD8+ и NK соответственно. Стимуляцию отобранных клеток проводили тем же способом, что и стимуляцию цельных культур РВМС, за исключением NK-клеток, которые стимулировали только 3 дня.
Анализ цитотоксичности.
Цитотоксичность, опосредованную Т- или NK-клетками, определяли согласно хорошо разработанному протоколу23, с использованием 4-часового 51 СГ радиоизотопного исследования. НМЕС, которые оставля
- 6 -
008213
ли необработанными или инкубировали с F-Ara (10 мкг/мл) в течение ночи, использовали в качестве клеток-мишеней, которые метили при помощи 0,4 мКи Na251CrO4 в течение 2 ч. После трех стадий промывки клетки-мишени доводили до концентрации 104 клеток/мл и совместно инкубировали с эффекторными клетками РВМС, CD8+ или NK, используя убывающие соотношения эффектора и мишени, в течение дополнительных 4 ч. Супернатанты переносили на сухие сцинтилляционные планшеты и подсчитывали при помощи у-счетчика (все от Canberra Packard, Darmstadt, Germany). В качестве дополнительных контрольных мишеней были взяты аутологичные (эффекторные) В-лимфобластоидные клеточные линии (B-LCL) и K 562, как чувствительные к NK-клеткам. Процент специфического лизиса подсчитывали как: [(экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение)/(максимальное высвобождение -спонтанное высвобождение)]х100. Спонтанное высвобождение во всех экспериментах всегда составляло менее 20%.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
ELISA для детекции интерлейкина 4 (IL-4, ответ Тс2) и интерферона у (IFN-у, ответ Тс1), IL-1 и IL-10 в супернатантах аллогенных эффекторных Т-клеток (см. ниже) проводили в строгом соответствии с инструкциями производителя, прилагаемыми к набору реагентов (R &D Systems, Minneapolis, MN, USA).
Статистический анализ.
Значимость различий между экспериментальными значениями проверяли при помощи t-критерия Стьюдента.
Пример 1. F-Ara индуцирует апоптоз (программированную клеточную гибель) в клетках эндотелия капилляров человека (НМЕС).
Для того чтобы оценить влияние F-Ara на жизнеспособность культивируемых клеток эндотелия человека, НМЕС инкубировали с убывающими фармакологически релевантными концентрациями (от 10 до 0,1 мкг/мл) 2-фтораденин-9-Р^-арабинофуранозида как метаболизированной формы флударабина. Средний внутриклеточный уровень активного (цитотоксического) флударабинтрифосфата в клетках-мишенях составляет 20 мкМ, что соответствует концентрации 5,8 мкг/мл (medac SCHERING, инструкции производителя). После 48 ч инкубации проводили исследование апоптоза НМЕС, используя метод детекции клеточной гранулярности пропидийиодид-негативных клеток (изображение бокового светорассеяния (SSC) в проточной цитометрии) и микроскопический анализ DAPI-окрашенных клеток соответственно. Независимо от системы анализа фиг. 1 А и В отчетливо демонстрируют, что F-Ara в концентрации 10 и 5 мкг/мл вызывает в НМЕС апоптоз, тогда как концентрация 1 мкг/мл перестает быть эффективной. Критический порог цитотоксичности F-Ara находился между 2 и 3 мкг/мл. Апоптоз, вызываемый F-Ara, хотя и в меньшей степени, можно было выявить уже через 24 ч (данные не представлены).
Пример 2. Дефибротид защищает НМЕС от апоптоза, индуцированного F-Ara.
НМЕС оставляли необработанными либо обрабатывали F-Ara в присутствии или в отсутствие различных концентраций дефибротида (от 100 до 0,1 мкг/мл) и оценивали программированную клеточную гибель через 48 ч методом проточной цитометрии, анализируя SSC-изображение, как описано для фиг. 1 А. На фиг. 2А (средний контурный график) показано, что дефибротид сам по себе, взятый в качестве второго контроля, не влияет на жизнеспособность эндотелиальных клеток. Апоптотический эффект F-Ara показан на фиг. 2А (правый контурный график), тогда как фиг. 2В демонстрирует дозозависимый защитный эффект дефибротида, предотвращающего клеточную гибель, индуцированную F-Ara. Для того чтобы исключить неспецифическое искусственное внеклеточное взаимодействие F-Ara и дефибротида in vitro, НМЕС предварительно обрабатывали дефибротидом в течение 1 ч и затем, после трех стадий промывки, инкубировали с F-Ara в течение дополнительных 48 ч, и наоборот. Фиг. 2С (правый контурный график) демонстрирует, что предварительная обработка НМЕС в течение 1 ч оказалась достаточной для защиты клеток от апоптоза, индуцированного F-Ara. Сходным образом, предварительная обработка НМЕС F-Ara в течение 1 ч (фиг. 2С, левый контурный график) и последующая инкубация с дефиброти-дом не привели к программированной гибели клеток эндотелия.
Пример 3. Влияние F-Ara на различные линии эпителиальных клеток, защитный эффект дефибротида.
К основным мишеням РТПХ относятся кожа, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и, вероятно, легкие. Поэтому было рационально протестировать влияние F-Ara на клеточные линии, имеющие происхождение от этих органов. Клетки из клеточных линий кератиноцитов (НаСаТ), ЖЮ" (SW 480), альвеолярного (А 549) и бронхиального эпителия (BEAS-2B), а также зародышевые клетки бронхиального эпителия инкубировали с F-Ara (10 мкг/мл), как представлено на фиг. 1 и 2, и исследовали апоптоз при помощи проточной цитометрии через 48 ч после обработки. Данные, суммированные на фиг. 3А, показывают, что клетки кишечного и бронхиального эпителия, вероятно, устойчивы к индуцирующему апоптоз действию F-Ara, тогда как кератиноциты (НаСаТ) и клетки альвеолярного эпителия (А 549) демонстрировали признаки апоптоза, что было выявлено посредством проточной цитометрии SSC-изображения (34,0 [±1,0]% апоптотических клеток в случае НаСаТ и 42,9 [±26,7]% в случае А 549 соответственно). Вновь оценивали защитный потенциал дефибротида (100 мкг/мл). Клетки НаСаТ (4,3 [±3,0]%) и клетки А 549 (5,4 [±2,9]%) были полностью защищены от программированной клеточной гибели после совместной обработки F-Ara и дефибротида (фиг. 3А, вложенные гистограммы). Для подтверждения этих результа
- 7 -
008213
тов для клеток НаСаТ (фиг. 3В, левая группа столбцов) и клеток А 549 (фиг. 3В, правая группа столбцов) было проведено исследование апоптоза с использованием DAPI-окрашивания. Как было показано для эндотелиальных клеток, дефибротид сам по себе не влиял на количество апоптотических клеток ни в одной из клеточных линий (данные не представлены).
Пример 4. Дефибротид не влияет на проявление антилейкемического и антиРВМС эффекта F-Ara.
После выявления желательной защитной способности дефибротида для эндотелиальных и эпителиальных клеток от апоптоза, индуцируемого F-Ara, необходимо было исследовать, будет ли дефибротид препятствовать проявлению антилейкемических свойств F-Ara. Для ответа на этот вопрос зародышевые клетки из периферической крови пациента с острым миелоидным лейкозом (AML) с содержанием бла-стов 70% размораживали и культивировали в течение 24 ч, после чего обрабатывали F-Ara в присутствии или в отсутствие дефибротида в течение дополнительных 48 ч. На фиг. 4А показано, что к этому моменту почти 50% клеток погибло спонтанно в результате некроза. Однако F-Ara индуцировал гибель до 80% клеток. В отличие от эффекта, демонстрируемого в отношении эндотелиальных и эпителиальных клеток, дефибротид не был способен защищать AML-клетки от опосредованной F-Ara токсичности. Следует отметить, что на фиг. 4А показан процент жизнеспособности клеток, а не процент апоптотических клеток, поскольку в AML-клетках F-Ara непосредственно вызывал некроз, а не апоптоз. Эффект можно наблюдать уже всего лишь через 24 ч инкубации. Таким образом, фиг. 4А ясно демонстрирует, что дефибротид не препятствует проявлению желаемого токсического эффекта F-Ara в отношении лейкемических клеток. Далее авторы изобретения задались вопросом, может ли дефибротид модулировать действие F-Ara против нормальных гемопоэтических клеток, и провели исследование апоптоза (SSC-изображения) РВМС нормальных людей-доноров крови. Как можно видеть по результатам показательного эксперимента, отраженным на фиг. 4В, F-Ara индуцировал апоптоз в 40,1% клеток по сравнению с 5,1% апопто-тических клеток в необработанном контроле. И в этом случае дефибротид не влиял на апоптотическую активность F-Ara против РВМС (43,1% апоптотических клеток), что свидетельствует о том, что совместная обработка дефибротидом не мешает проявлению иммунодепрессивных свойств F-Ara.
Пример 5. F-Ara увеличивает экспрессию фактора межклеточной адгезии 1 (ЮАМ-1) на НМЕС, антагонистические эффекты дефибротида.
Основываясь на предшествующих наблюдениях, что предтрансплантационное кондиционирование не только повреждает эндотелиальные клетки, но и ведет к их провоспалительной активации путем индукции молекул адгезии15, далее авторы изобретения исследовали экспрессию ЮАМ-1 под влиянием F-Ara. Как изображено на фиг. 5А и В, анализ методом проточной цитометрии показал, что F-Ara после 24 ч инкубации значительно усиливает экспрессию на НМЕС дозозависимым образом, подобным наблюдаемому при индукции апоптоза. Концентрации F-Ara вплоть до 1 мкг/мл были эффективными в индукции экспрессии ЮАМ-1. Далее авторы изобретения задались вопросом, будет ли дефибротид также выступать в роли антагониста F-Ara в этом эксперименте. НМЕС обрабатывали F-Ara согласно методике и инкубировали в присутствии или в отсутствие убывающих концентраций дефибротида. На фиг. 5С суммированы результаты 3 независимых экспериментов, показывающие, что дефибротид на самом деле выступал в роли антагониста индуцированной F-Ara экспрессии ЮАМ-1 в концентрациях 100 и 10 мкг/мл. Следует отметить, что дефибротид сам по себе не активировал эндотелиальные клетки, экспрессия ЮАМ-1 оставалась неизменной в случае каждой из протестированных концентраций (данные не приведены).
Поскольку провоспалительная активация клеток-мишеней часто связана с увеличением экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС) I и II классов, далее, при помощи проточной цитометрии, авторы изобретения провели анализ этих антигенов после инкубации с различными концентрациями F-Ara в течение 24 ч. Несмотря на свои хорошо охарактеризованные иммунодепрессивные свойства, неожиданно оказалось, что F-Ara индуцирует появление молекул МНС I класса на НМЕС дозо-зависимым образом (индукция средней интенсивности флуоресценции в 1,5 раза сильнее при концентрации 10 мкг/мл, индукция в 1,3 раза сильнее при 5 мкг/мл), тогда как для МНС II класса изменений не наблюдали (данные не приведены).
Пример 6. F-Ara увеличивает антигенность эндотелиальных клеток в отношении аллогенных клеток периферической крови, защита при помощи дефибротида.
Обнаружение того, что F-Ara индуцирует появление молекул МНС I класса на НМЕС, побудило авторов изобретения проверить, будет ли F-Ara также усиливать способность НМЕС стимулировать алло-цитотоксические ответы. Используемые в качестве эффекторов мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), которые получали или из гепаринизированной крови здоровых людей-добровольцев, или из препаратов светлых слоев кровяных сгустков, стимулировали облученными (20 Гр) НМЕС в присутствии 50 единиц/мл интерлейкина 2 (IL-2) в течение 7 дней, после чего подвергали стандартному анализу высвобождения 51 СГ (подробнее см. "Материалы и методы"). В день 1 свежие НМЕС, используемые в качестве мишеней, оставляли нестимулированными или инкубировали с F-Ara (10 мкг/мл) в присутствии или в отсутствие нейтрализующих антител против МНС I класса (w6/32). Контролями служили аутологичные эффекторные В-лимфобластоидные клеточные линии (B-LCL), трансформированные вирусом Эпштей-на-Барра, и клетки K 562 как классические мишени для естественных клеток-киллеров (NK). Фиг. 6А демонстрирует, что F-Ara действительно увеличивал антигенность НМЕС в отношении аллогенных
- 8 -
008213
РВМС при всех протестированных соотношениях Э/М. Отсутствие специфического лизиса K 562 и ауто-логичных эффекторных B-LCL подтвердило участие рестриктированных по МНС цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Кроме того, лизис или необработанных НМЕС, или обработанных F-Ara НМЕС мог быть почти целиком заблокирован после совместной инкубации этих клеток с антителами w6/32 против
МНС I класса (фиг. 6А, *_). Для дополнительного подтверждения того, что CD8+ CTL ответственны за
антиэндотелиальную цитотоксическую активность, РВМС подвергали селекции на CD8+ и CD4+ Т-клет-ки (РВМС очищали от re-CD8 и не-СD4-клеток соответственно), используя разделение с использованием магнитных шариков при помощи набора магнитных шариков MACSIM. Чистота препаратов во всех случаях была > 93% при полном отсутствии другой клеточной популяции (не показано). Отобранные Т-клетки стимулировали при помощи НМЕС и IL-2 точно так же, как описано для РВМС, которые не подвергали селекции (см. выше). Как показано на фиг. 6В, количество обработанных F-Ara НМЕС, лизиро-ванных CD8+ CTL, и в этом случае значительно превышало количество лизированных НМЕС в контроле. Более того, предварительная обработка НМЕС, используемых в качестве мишеней, с помощью F-Ara и дефибротида (F-Ara + D) уменьшала специфический лизис до значений, находившихся даже ниже контрольных уровней, что говорило о том, что дефибротид также защищает эндотелиальные клетки от лизиса аллогенными эффекторными лимфоцитами. CD4+ Т-клетки, стимулированные НМЕС, не проявляли никаких признаков цитотоксической активности в этих экспериментах (данные не представлены). Анализы посредством проточной цитометрии НМЕС, обработанных F-Ara, по сравнению с НМЕС, обработанными F-Ara + D, показали значительное уменьшение числа молекул МНС I класса под воздействием дефибротида, что свидетельствовало о том, что экспрессия МНС I класса является критическим этапом регуляции цитотоксического ответа, индуцированного F-Ara (данные не представлены). Пример 7. Антиэндотелиальные CTL проявляют Tc1-подобный фенотип.
Чтобы получить информацию о природе антиэндотелиальных CTL, НМЕС и CD8+ Т-клетки стимулировали, как описано выше, и собирали супернатанты для определения интерферона гамма (IFN-у) и интерлейкина 4 (IL-4) с использованием анализа ELISA. Как описано в таблице выше, стимуляция при помощи НМЕС и IL-2 явно привела к росту Tc1-подобных Т-клеток, что можно было заключить из уникальной экспрессии IFN-у, тогда как IL-4 не вырабатывался.
Пример 8. F-Ara снижает лизис НМЕС аллогенными NK-клетками.
Интересно было получить ответ на вопрос о том, как индуцированная F-Ara модуляция экспрессии МНС I класса влияет на цитолитический ответ естественных киллеров (NK-клеток) против эндотелиальных клеток. РВМС от здоровых индивидуумов подвергали негативной селекции на NK-клетки (очищали от не-№С-клеток) и стимулировали в течение 4 дней при помощи облученных НМЕС в присутствии IL-2, как было описано для эксперимента на фиг. 6В. На 4 день НМЕС, выступающие в роли клеток-мишеней, или оставляли необработанными, или инкубировали с F-Ara (10 мкг/мл) в течение 24 ч и подвергали стандартному анализу высвобождения 51 СГ со стимулированными NK-клетками в роли эффекторов. Фиг. 7 демонстрирует, что F-Ara значительно снижает аллогенность НМЕС в отношении NK-клеток. В качестве позитивного контроля активности NK-клеток можно отметить лизис МНС I класса-негативных клеток K 562 (фиг. 7, *_). Предварительная обработка стимулированных F-Ara НМЕС антителами w6/32
против МНС I класса полностью устраняла эффект F-Ara и вела почти к 100% специфическому лизису НМЕС (фиг. 7), что позволило заключить, что МНС I класса на поверхности НМЕС и в этом случае являются решающим переключателем регуляции цитотоксического ответа NK-клеток. Причиной ослабленного цитолитического ответа NK-клеток может быть роль киллер-ингибирующих рецепторов (KIR), которые, как было обнаружено, подвержены негативной регуляции высокими уровнями экспрессии молекул МНС I класса24.
Обсуждение
Имеющиеся к настоящему времени результаты клинических испытаний с использованием флудара-бина, включавших режимы кондиционирования пониженной интенсивности (РКПИ), ясно показывают снижение токсичности, связанной с кондиционированием, при отсутствии воздействия на иммуновос-становительную терапию25. Частота встречаемости острой РТПХ у пациентов, проходивших РКПИ, сравнима или даже меньше таковой у пациентов, подвергавшихся стандартному режиму кондициониро-вания26. Однако есть сообщения о случаях появления таких же или даже более тяжелых поздних последствий, подобных остеонекрозу27, легочным осложнениям28, и других хронических РТПХ29. В ходе исследования авторов изобретения оказалось, что флударабин, помимо своих хорошо подтвержденных имму-нодепрессивных свойств, активирует и повреждает эндотелиальные и эпителиальные клетки. Это наблюдение может, по меньшей мере, отчасти объяснить описанные выше нежелательные клинические побочные эффекты, поскольку остеонекроз является проявлением дисфункции эндотелия, и флударабин, видимо, токсичен для клеток альвеолярного эпителия. Интересно отметить, что повреждающие эффекты флударабина на клетки легких, видимо, являются компартмент-специфичными, поскольку клетки бронхиального эпителия в ответ на этот иммунодепрессант не подвергались апоптозу. Тот факт, что клеточная линия кератиноцитов (НаСаТ) также была чувствительна к флударабину, говорит о том, что он также может быть вовлечен в кожные расстройства после ТГСК. Поскольку в патогенез поздних осложнений
- 9 -
008213
вовлечено множество факторов и на него также может влиять увеличение возраста пациентов, проходящих ТГСК и использование периферических стволовых клеток, необходима дальнейшая оценка клинических анализов легочных и дерматологических осложнений.
В связи с тем, что во многих предтрансплантационных протоколах флударабин используют в сочетании с ионизирующим излучением, было важно выяснить, будут ли эти две составляющие взаимодействовать, воздействуя на эндотелиальные клетки. Интересно, что авторы изобретения не смогли обнаружить какого-либо усиления индуцированной излучением гибели клеток под действием флударабина или наоборот (данные не представлены). Это указывает на то, что механизмы, посредством которых происходит передача сигнала клеточной гибели к эндотелиальным клеткам, различны.
Точный механизм, посредством которого флударабин индуцирует апоптоз эндотелиальных и эпителиальных клеток, остается невыясненным. Видимо, флударабин, как аналог пурина, интегрируется в ДНК, тем самым вызывая мутации, которые ведут к делеции генов, как сообщалось ранее30. Также можно предположить, что флударабин может взаимодействовать с цитохромом С и активирующим белок апоп-тоза фактором 1 (apoptosis protein-activating factor-1 - APAF-1), запуская каскад апоптотических каспаз31.
Флударабин увеличивает аллогенность эндотелиальных клеток-мишеней для CD8+ Т-клеток. В отличие от этого, флударабин значительно снижает лизис эндотелия аллогенными NK-клетками. Экспрессия МНС I класса, видимо, необходима для регуляции любого из этих типов иммунного ответа, поскольку блокада I класса полностью прекращала лизис CTL и сильно увеличивала лизис, осуществляемый NK-клетками. Эти противоположные эффекты флударабина в совокупности с клиническим наблюдением того, что флударабин показывает сниженную острую и такую же или даже повышенную хроническую токсичность, чем стандартный режим кондиционирования, позволили предположить, что NK-клетки и CTL могут быть активными в разных фазах патофизиологии РТПХ, т.е. NK-клетки преимущественно будут действовать на более ранней фазе (супрессируемой флударабином), а CTL - на более поздней фазе (усиливаемой флударабином) после трансплантации.
Относительно природы антиэндотелиальных CTL интересен вопрос, являются ли они специфичными в отношении эндотелия или просто аллоспецифичными. Существование эффекторных лимфоцитов, специфичных в отношении эндотелия, было описано ранее32. В противоположность CTL, которые были охарактеризованы авторами изобретения как проявляющие Td-подобный фенотип, многие из клонов CTL, о которых сообщают в литературе, демонстрируют малое количество IFN-у, если он имеется, и, что необычно, экспрессируют лиганд CD40 в состоянии покоя, что, возможно, усиливает цитолитическую активность33. Однако эти данные не исключают возможности существования дополнительных аллоген-ных CTL, обладающих специфичностью к негемопоэтическим мишеням.
Дефибротид является хорошо переносимым лекарством, который успешно используют для лечения первичного тромбоза печеночных вен, одного из основных затрагивающих печень осложнений после ТГСК34. Кроме того, возрастает количество предклинических и клинических сообщений о его эффективности в лечении ишемических/реперфузионных повреждений и атеросклероза, а также возвратной тром-ботической пурпуры35-37. Как известно, дефибротид оказывает прямое воздействие на эндотелиальные клетки, не требуя дополнительных метаболических преобразований38, и поэтому его можно было использовать для исследований авторов изобретения in vitro. Дефибротид полностью защищал эндотели-альные и эпителиальные клетки от опосредованного флударабином апоптоза. Требуются дополнительные эксперименты для выявления точного механизма защиты, посредством которого дефибротид анта-гонизирует флударабин, однако можно предположить, что роль дефибротида состоит в ингибировании интеграции флударабина в ДНК или в вышеупомянутой активации каспаз. Помимо антиапоптотических эффектов дефибротид был способен снижать антиэндотелиальные CTL-ответы, регулируя экспрессию МНС I класса. Однако, как показало отсутствие защиты клеток AML, дефибротид не влиял на желаемый антилейкемический эффект флударабина. Другим важным наблюдением явилась неспособность дефиб-ротида блокировать опосредованный флударабином апоптоз РВМС. Это позволяет заключить, что совместное лечение дефибротидом не влияет на иммунодепрессивный эффект флударабина, обязательный для кондиционирования.
Стоит отметить, что дефибротид не обладал защитным действием в отношении индуцированного облучением повреждения эндотелиальных клеток, что свидетельствовало о том, что его эффект специфичен для клеточных изменений, опосредованных флударабином (данные не представлены).
Основываясь на этих результатах и принимая во внимание незначительные побочные эффекты39 дефибротида, если таковые имеются, по результатам исследования авторов изобретения можно заключить, что дефибротид является хорошим претендентом для использования в сочетании с с флударабином во время кондиционирования, предшествующего ТГСК, особенно для пациентов с риском первичного тромбоза печеночных вен (VOD). Исследования, направленные на изучение защиты эндотелия от дополнительных агентов, используемых во время кондиционирования, помогут выяснить, можно ли использовать дефибротид в качестве защитного агента с широким спектром действия.
Ссылки
1. Holler E., Kolb H.J., Moller A. et al. Increased serum levels of tumor necrosis factor a precede major complications of bone marrow transplantation. Blood. 1990; 75:1011-1016.
- 10 -
008213
2. Antin J.H., Ferrara J.L.M. Cytokine dysregulation and acute graft-versus-host disease. Blood. 1992; 80:2064-2968.
3. Ferrara J.L., Levy R., Chao N.J. Pathophysiological mechanisms of acute graft-vs.-host disease. Biol. Blood Marrow Transplant. 1999; 5:347-356.
4. Xun C.Q., Brown B.A., Jennings C.D., Henslee-Downey P.J., Thompson J.S. Acute graft-versus-host-like diseases induced by transplantation of human activated natural killer cells into SCID mice. Transplantation. 1993; 56:409-417.
5. Weiner R.S., Bortin M.M., Gale R.P. et al. Interstitial pneumonitis after bone marrow transplantation. Assessment of risk factors. Ann. Intern. Med. 1986; 104:168-175.
6. Weiss M.A. Novel treatment strategies in chronic lymphocytic leukemia. Curr. Oncol. Rep. 2001; 3:217222.
7. Wasch R., Reisser S., Hahn J. et al. Rapid achievement of complete donor chimerism and low regimen-related toxicity after reduced conditioning with fludarabine, carmustine, melphalan and allogeneic transplantation. Bone Marrow Transplant. 2000; 26:243-250.
8. Carella A.M., Champlin R., Slavin S., McSweeney P., Storb R. Mini-allografts: ongoing trials in humans. Bone Marrow Transplant. 2000; 25:345-350.
9. Slavin S., Nagler A., Naparstek E. et al. Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood. 1998; 91:756-763.
10. Holler E., Kolb H.J., Hiller E. et al. Microangiopathy in patients on cyclosporine prophylaxis who developed acute graft-versus-host disease after HLA-identical bone marrow transplantation. Blood. 1989; 73:2018-2024.
11. Eissner G., Kohlhuber F., Grell M. et al. Critical involvement of transmembrane TNF-a in endothelial programmed cell death mediated by ionizing radiation and bacterial endotoxin. Blood. 1995; 86:4184-4193.
12. Lindner H., Holler E., Ertl B. et al. Peripheral blood mononuclear cells induce programmed cell death in human endothelial cells and may prevent repair role of cytokines. Blood. 1997; 89:1931-1938.
13. Haimovitz-Friedman A., Balaban N., Mcloughlin M. et al. Protein kinase C mediates basic fibroblast growth factor protection of endothelial cells against radiation-induced apoptosic. Cancer Res. 1994; 54:25912597.
14. Fuks Z., Persaud R.S., Alfieri A. et al. Basic fibroblast growth factor protects endothelial cells against radiation-induced programmed cell death in vitro and in vivo. Cancer Res. 1994; 54:2582-2590.
15. Eissner G., Lindner H., Behrends U. et al. Influence of bacterial endotoxin on radiation-induced activation of human endothelial cells in vitro and in vivo, protective role of IL-10. Transplantation. 1996; 62:819-827.
16. Lindner H., Holler E., Gerbitz A., Johnson J.P., Bornkamm G.W., Eissner G. Influence of bacterial endotoxin on radiation-induced activation of human endothelial cells in vitro and in vivo: 2. IL-10 protects against transendothelial migration. Transplantation. 1997; 64:1370-1973.
17. Beelen D.W., Haralambie E., Brandt H. et al. Evidence that sustained growth suppression of intestinal anaerobic bacteria reduces the risk of acute graft-versus-host disease after sibling marrow transplantation. Blood.
1992; 80:2668-2676.
18. Eissner G., Multhoff G., Holler E. Influence of bacterial endotoxin on the allogenicity of human endothelial cells. Bone Marrow Transplant. 1998; 21:1286-1287.
19. Ades E.W., Candal F.J., Swerlick R.A. et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J. Invest. Dermatol. 1992; 99:683-690.
20. Cotter T.G., Lennon S.V., Glynn J.M., Green D.R. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Res. 1992; 52:997-1005.
21. Lee A., Whyte M.K., Haslett C. Inhibition of apoptosis and prolongation of neutrophil functional longevity by inflammatory mediators. J. Leukoc. Biol. 1993; 54:283-288.
22. Westphal J.R., Tax W.J., Willems H.W., Koene R.A., Ruiter D.J., De-Waal R.M. Accessory function of endothelial cells in anti-CD3-induced T-cell proliferation: synergism with monocytes. Scand. J. Immunol.
1992; 35:449-457.
23. MacDonald H.R., Engers H.D., Cerrottini J.C., Brunner K.T. Generation of cytotoxic T lymphocytes in vitro. J. Exp. Med. 1974; 140:718-722.
24. Long E. Regulation of immune responses through inhibitory receptors. Annu. Rev. Immunol. 1999;
17:875-904.
25. Nagler A., Aker M., Or R. et al. Low-intensity conditioning is sufficient to ensure engraftment in matched unrelated bone morrow transplantation. Exp. Hematol. 2001; 29:362-370.
26. Michallet M., Bilger K., Garban F. et al. Allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation after non-myeloablative preparative regimens: impact of pretransplantation and posttransplantation factors on outcome. J.
Clin. Oncol. 2001; 19:3340-3349.
27. Holler E., личное сообщение.
28. Hildebrandt G., Bertz H., Mestan A. et al. Analysis of pulmonary function after allogeneic bone marrow transplantation (BMT) or blood stem cell transplantation (PBSCT) using conditioning regimens with total body
- 11 -
008213
irradiation (TBI) and conventional intensity compared to regimens without TBI with reduced intensity [abstract]. Bone Marrow Transplant. 2001; 27 (Suppl. 1):S216.
29. Bornhauser M., Thiede C., Schuler U. et al. Dose-reduced conditioning for allogeneic blood stem cell transplantation: durable engraftment without antithymocyte globulin. Bone Marrow Transplant. 2000; 26:119125.
30. Huang P., Siciliano M.J., Plunkett W. Gene deletion, a mechanism of induced mutation byarabinosyl nucleosides. Mutat. Res. 1989; 210:291-301.
31. Genini D., Budihardjo I., Plunkett W. et al. Nucleotide requirements for the in vitro activation of the apoptosis protein-activating factor-1-mediated caspase pathway. J. Biol. Chem. 2000; 275:29-34.
32. Biederman B.C., Pober J.S. Human vascular endothelial cells favor clonal expansion of unusual alloreactive
CTL. J. Immunol. 1999; 162:7022-7030.
33. Briscoe D.M., Alexander A.I., Lichtman A.H. Interactions between T lymphocytes and endothelial cells in allograft rejection. Curr. Op. Immunol. 1998; 10:525-531.
34. Pegram A.A., Kennedy L.D. Prevention and treatment of veno-occlusive disease. Ann. Pharmacother.
2001; 35:935-942.
35. Rossini G., Pompilio G., Biglioli P. et al. Protectant activity of defibrotide in cardioplegia followed by ischemia/reperfusion injury in the isolated rat heart. J. Card. Surg. 1999; 14:334-341.
36. Rossini G., Berti F., Trento F. et al. Defibrotide normalizes cardiovascular function hampered by established atherosclerosis in the rabbit. Thromb. Res. 2000; 97:29-38.
37. Pogiiani E.M., Perseghin P., Panna M., Pioltelli P., Corneo G. Defibrotide in recurrent thrombotic thrombocytopenic purpura. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2000; 6:69-70.
38. San T., Moini H., Emerk K., Bilsel S. Protective effect of defibrotide on perfusion induced endothelial
damage. Throm. Res. 2000; 99:335-341.
39. Chopra R., Eaton J.D., Grassi A. et al. Defibrotide for the treatment of hepatic veno-occlusive disease: results of the European compassionate-use study. Br. J. Haematol. 2000; 111:1122-1129.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение защитного олигодезоксирибонуклеотида для производства лекарственного средства для защиты эпителиальных и/или эндотелиальных клеток от апоптоза и/или активации, индуцированных введением иммунодепрессанта, где указанный защитный олигодезоксирибонуклеотид выбран из
полидезоксирибонуклеотида, соответствующего следующей формуле случайной последовательности:
Р1-5, (dAp)12-24, (dGp)10-20, (dTp)13-26, (dCp)10-20,
где Р=фосфорный радикал, dAp=дезоксиадениловый мономер, dGp=дезоксигуаниловый мономер, dTp=дезокситимидиловый мономер, dCp=дезоксицитидиловый мономер; или
олигодезоксирибонуклеотида, имеющего следующие физико-химические и химические характеристики: молекулярная масса: 4000-10000 Да, параметр гиперхромизма: менее 10, А + Т/С + G: 1,100 -1,455, А + G/C + Т: 0,800 - 1,160, удельное вращение: +30±48.
2. Применение по п.1, где иммунодепрессант представляет собой нуклеозид.
3. Применение по п.1, где иммунодепрессант выбран из групп, включающих в себя флударабин, циклофосфамид, бисхлорэтилнитрозомочевину, мелфалан.
4. Применение по п.1, где иммунодепрессант представляет собой флударабин.
5. Применение по п.1, где защитный олигодезоксирибонуклеотид представляет собой дефибротид.
6. Применение по п.1, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят совместно, одновременно, после или перед введением пациенту иммунодепрессанта.
7. Применение по п.6, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят после стадии введения пациенту иммунодепрессанта.
8. Применение по п.7, где задержка по времени между стадией введения защитного олигодезокси-рибонуклеотида и стадией введения пациенту иммунодепрессанта составляет от 1 ч до двух недель, предпочтительно от двух суток до семи суток.
9. Применение по п.6, где стадию введения защитного олигодезоксирибонуклеотида проводят перед стадией введения пациенту иммунодепрессанта.
10. Применение по п.9, где разница во времени между стадией введения защитного олигодезокси-рибонуклеотида и стадией введения пациенту иммунодепрессанта составляет от одного часа до двух недель, предпочтительно от двух часов до двух суток.
11. Применение по пп.1-10, где вводимую дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил от 100 до 0,1 мкг/мл, предпочтительно от 10 до 100 мкг/мл.
12. Применение по п.11, где вводимую дозу дефибротида выбирают так, чтобы уровень в крови составил 10 мкг/мл.
- 12 -
008213
13. Применение по пп.1-12, где вводимая доза дефибротида составляет от 100 мг/кг массы тела пациента до 0,01 мг/кг массы тела, предпочтительно от 20 мг/кг массы тела пациента до 0,1 мг/кг массы тела.
14. Применение по п.13, где вводимая доза дефибротида составляет от 15 мг/кг массы тела пациента до 1 мг/кг массы тела, предпочтительно 12 мг/кг массы тела пациента.
15. Применение по любому из пп.1-14, где активация включает в себя усиленную экспрессию фактора межклеточной адгезии 1 (1САМ-1).
16. Применение по любому из пп.1-15, где лечение иммунодепрессантом проводят во время трансплантации стволовых клеток.
17. Применение по п.16, где трансплантация стволовых клеток представляет собой трансплантацию аллогенных стволовых клеток.
18. Применение по п.1, где указанный полидезоксирибонуклеотид формулы P1-5, (dAp)12-24, (dGp)10-20, (dTp)13-26, (dCp)10-20 имеет следующие физико-химические свойства: электрофоретическая = равномерная анодная подвижность; коэффициент экстинкции, Е1см1% при 260±1нм=220±10; отношение экстинкции, Е230/Е260=0,45±0,04; коэффициент молярной экстинкции (относительно фосфора), е(Р)=7,750±500; удельное вращение [ос]о2° =53°±6; обратимый гиперхромизм, выраженный в % в нативной ДНК, h=15+5.
Апоптоз: SSC-изображение
О SO tM ISO 200 250
Фиг. 1А
- 13 -
008213
Апоптоз - окрашивание DAPI
Фиг. 1В
13,6%
.................'
в 50 100 ISO 200 КО 0 50 100 ISO 200 350 О JO 100 ISO 200 250
F-Ara
[мкг/мл]
[мкг/мл]
100
Si-г
3,2%
О 30 100 150 200 2S0
О SO 100 ISO 200 250
F-Ara
[мкг/мл]
[мкг/мл]
100
0,1
F-Ara
[мкг/мл]
14"> D
48 ч
' 100
100
[мкг/мл]
48 ч
, 1 ч "> F-Ara
Фиг. 2
- 14 -
008213
АПОПТОЗ: SSC-изображение
Клеточная линия
Апоптоз под действ. F-Ara
Защита Дефибротидом
НаСаТ
(Кожа)
SW 480
(кишечник)
AS49
(альв. эпит.)
с 1:
BEAS-2B
(бронх.эпит.)
Зарод, бронх, эпит.
Фиг. 3А
Апоптоз - окрашивание DAPI
? Контроль ¦ F-Ara a F-Ara+D
НаСаТ
А549
Фиг. 3В
Фиг. 4А
- 15 -
008213
5,1%
О 50 100 150 200 ?50
Контроль
40,1%
0 50 100 150 200 250
F-Ara
43,1%
0 50 100 150 200 250
F-Ara +- D
Фиг. 4В
нулевой контроль
ICAM-1 НМЕС контроля L ICAM-1 F Ara ! Юмиг/ил)
10 5 1 0,5 0,1
Фиг. 5
- 16 -
008213
100
с. 2 о
s -8
40:1 20:1 10:1 Sri соотношение э/м
со s С
2 о
о 30
50 40
о Ю
10:1 5:1 2,5:1 соотношение Э/М
Фиг. 6
100
S о
о 20
Мишени <М)
20rt 10:1 "П
соотношение Э/М
% позитивных клеток
CD4+ Т-клетки
CD8+ Т-клетки
NK-клетки
До стимуляции
После стимуляции
Фиг. 7
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 17 -