EA 008147B1 20070427 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2007\TIT_PDF/008147 Титульный лист описания [PDF] EAPO2007/PDF/008147 Полный текст описания EA200500224 20030724 Регистрационный номер и дата заявки DE102 33 723.3 20020724 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2003/008111 Номер международной заявки (PCT) WO2004/011663 20040205 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [eab] EAB20702 Номер бюллетеня [RU] МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ 7a-ЗАМЕЩЁННЫХ 11a-ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ Название документа C12P 33/10, C12P 33/16, C07J 1/00, C07J 3/00, C07J 5/00, C07J 7/00, C07J 9/00, C07J 11/00, C07J 31/00, C07J 41/00, A61K 31/56 Индексы МПК [DE] Цорн Людвиг, Больманн Рольф, Галлус Норберт, Кюнцер Германн, Мун Ханс-Петер, Нуббемейер Райнхард Сведения об авторах [DE] ШЕРИНГ АКЦИЕНГЕЗЕЛЬШАФТ Сведения о патентообладателях [DE] ШЕРИНГ АКЦИЕНГЕЗЕЛЬШАФТ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000008147b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

1. Микробиологический способ получения 7 a -замещенных 11 a -гидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой

R 7 представляет собой группировку P-Q, где

Р обозначает C 1 -C 4 алкилен, a Q обозначает водород, C 1 -C 4 алкил или C 1 -C 4 фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,

R 10 может находиться в a - либо b -положении и представляет собой Н, CH 3 или CF 3 и

R 13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7 a -замещенный стероид общей формулы 3,А

в которой R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, гидроксилируют и окисляют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. и Rhizopus sp.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana, Glomerella cingulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica и Rhizopus stolonifer.

3. Микробиологический способ получения 7 a -замещенных 11 a -гидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой R 7 представляет собой группировку P-Q, где

Р обозначает C 1 -C 4 алкилен, a Q обозначает водород, C 1 -C 4 алкил или C 1 -C 4 фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,

R 10 может находиться в a - либо b -положении и представляет собой Н, CH 3 или CF 3 и

R 13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7 a -замещенный стероид общей формулы 3,А

в которой R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, на первой стадии микробиологического способа с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Gibber-ella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhizium sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. и Verticillium sp., гидроксилируют в положении 11 a с образованием 7 a -замещенного 11 a -гидроксистероида общей формулы С

в которой

R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, затем образованный 7 a -замещенный 11 a -гидроксистероид общей формулы С на второй стадии микробиологического способа с использованием другого микроорганизма, выбранного из группы, включающей Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. и Pseudomonas sp., окисляют с образованием 7 a -замещенного стероида общей формулы 4,В.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используемый на первой стадии микроорганизм выбран из группы, включающей Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerellafusaroid.es, Gnomonia cingulata, Metarrhizium anisopliae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer и Verticillium dahliae.

5. Способ по пп.3 и 4, отличающийся тем, что используемый на второй стадии микроорганизм выбран из группы, включающей Bacillus lactimorbus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor и Pseudomonas testosteroni.

6. Микробиологический способ получения 7 a -замещенных 11 a -гидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой

R 7 представляет собой группировку P-Q, где

Р обозначает C 1 -C 4 алкилен, a Q обозначает водород, C 1 -C 4 алкил или C 1 -C 4 фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,

R 10 представляет собой Н, CH 3 или CF 3 и

R 13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7 a -замещенные стероиды общей формулы D

в которой

R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, гидроксилируют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp. и Syncephalastrum sp.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica и Syncephalastrum racemosum.

8. Микробиологический способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что R 7 представляет собой CH 3 .

9. Микробиологический способ по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что R 10 представляет собой Н.

10. Микробиологический способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что R 13 представляет собой CH 3 .

 


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:
Микробиологический способ получения 7 a -замещенных 11 a -гидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой

R 7 представляет собой группировку P-Q, где

Р обозначает C 1 -C 4 алкилен, a Q обозначает водород, C 1 -C 4 алкил или C 1 -C 4 фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,

R 10 может находиться в a - либо b -положении и представляет собой Н, CH 3 или CF 3 и

R 13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7 a -замещенный стероид общей формулы 3,А

в которой R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, гидроксилируют и окисляют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. и Rhizopus sp.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana, Glomerella cingulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica и Rhizopus stolonifer.

3. Микробиологический способ получения 7 a -замещенных 11 a -гидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой R 7 представляет собой группировку P-Q, где

Р обозначает C 1 -C 4 алкилен, a Q обозначает водород, C 1 -C 4 алкил или C 1 -C 4 фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,

R 10 может находиться в a - либо b -положении и представляет собой Н, CH 3 или CF 3 и

R 13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7 a -замещенный стероид общей формулы 3,А

в которой R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, на первой стадии микробиологического способа с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Gibber-ella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhizium sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. и Verticillium sp., гидроксилируют в положении 11 a с образованием 7 a -замещенного 11 a -гидроксистероида общей формулы С

в которой

R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, затем образованный 7 a -замещенный 11 a -гидроксистероид общей формулы С на второй стадии микробиологического способа с использованием другого микроорганизма, выбранного из группы, включающей Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. и Pseudomonas sp., окисляют с образованием 7 a -замещенного стероида общей формулы 4,В.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используемый на первой стадии микроорганизм выбран из группы, включающей Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerellafusaroid.es, Gnomonia cingulata, Metarrhizium anisopliae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer и Verticillium dahliae.

5. Способ по пп.3 и 4, отличающийся тем, что используемый на второй стадии микроорганизм выбран из группы, включающей Bacillus lactimorbus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor и Pseudomonas testosteroni.

6. Микробиологический способ получения 7 a -замещенных 11 a -гидроксистероидов общей формулы 4,В

в которой

R 7 представляет собой группировку P-Q, где

Р обозначает C 1 -C 4 алкилен, a Q обозначает водород, C 1 -C 4 алкил или C 1 -C 4 фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,

R 10 представляет собой Н, CH 3 или CF 3 и

R 13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7 a -замещенные стероиды общей формулы D

в которой

R 7 , R 10 и R 13 имеют указанные выше значения, гидроксилируют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp. и Syncephalastrum sp.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica и Syncephalastrum racemosum.

8. Микробиологический способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что R 7 представляет собой CH 3 .

9. Микробиологический способ по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что R 10 представляет собой Н.

10. Микробиологический способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что R 13 представляет собой CH 3 .

 


008147
Настоящее изобретение относится к микробиологическим способам получения 7а-замещенных 11а-гидроксистероидов, к получаемым из них 7а,17а-замещенным 11р-галогенстероидам, к способам получения последних соединений, а также к их применению и к фармацевтическим препаратам, содержащим эти соединения. Кроме того, изобретение относится к другим 7а-замещенным 110-галогенстероидам, конкретно к 7а-замещенным эстра-1,3,5(10)-триенам, получаемым из 7а-замещенных 11 а-гидроксистероидов.
Для терапии климактерических расстройств у мужчин (Climacterium virile) и для развития мужских половых органов, равно как и для контроля репродуктивной способности (фертильности) мужчин применяют андрогены, прежде всего тестостерон. Кроме того, эти гормоны содержат также обладающие частично анаболическим действием активные компоненты, которые среди прочего способствуют росту мышц.
Климактерический период у мужчин характеризуется естественным, обусловленным возрастными изменениями организма снижением выработки андрогенов, для восполнения недостатка которых проводят гормонзаместительную терапию (ГЗТ).
Введение в организм ЛГ (лютеинизирующего гормона) и РГ (рилизинг-гормона) с целью контроля фертильности мужчин наряду с уменьшением сперматогенеза приводит также к избыточной активизации ("высыпанию") ЛГ и к снижению уровня тестостерона и угасанию либидо, для повышения которых используют лекарственные средства, содержащие тестостерон (D.E. Cummings и др., "Prostate-Sparing Effects of the Potent Androgen 7а-Methyl-19-Nortestosterone: A Potential Alternative to Testosterone for Androgen Replacement and Male Contraception", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, т. 83, № 12, 1998, cc. 4212-4219).
Для контроля мужской фертильности может применяться комбинированная терапия с использованием андрогенов и обладающего гестагенным действием компонента (см., например, заявку WO 01/60376 А, а также источники, приведенные в этой публикации в качестве ссылки).
При лечении с использованием тестостерона было установлено появление побочных эффектов, таких прежде всего, как увеличение предстательной железы, обусловленное ростом числа клеток и желез стромы (доброкачественная гиперплазия простаты, ДГП). При метаболизме тестостерона, опосредованном 5а-редуктазой, образуется дигидротестостерон (ДГТ), который среди прочего может привести к ДГП (Cummings и др., см. выше; заявка WO 99/13883 А1). Поэтому в клинической практике подавление 5а-редуктазы используют для лечения ДГП (применение финастеридов).
Быстрый метаболизм андрогенного стероида, коим является тестостерон, в организме человека приводит далее не только к образованию нежелательного ДГТ, но и обусловливает необходимость перо-рального введения высоких доз для достижения требуемого эффективного уровня тестостерона. Поэтому возникает необходимость в использовании альтернативных лекарственных форм, таких как внутримышечные инъекции или большие пластыри.
Для замены тестостерона, применяемого при вышеназванных показаниях, был предложен 7а-метил-19-нортестостерон (МеНТ), биологическая эффективность которого, во-первых, выше по сравнению с тестостероном, поскольку он обладает более высокой аффинностью к андрогенным рецепторам, и который, во-вторых, образуя благодаря 7а-метильной группе своеобразный стерический барьер, препятствует, как предполагают, процессу метаболизма под действием 5а-редуктазы (Cummings и др., см. выше; WO 99/13883 А1; WO 99/13812 A1; US 5342834).
При метаболизме тестостерона, кроме того, некоторая часть этого соединения в результате ароматизации кольца А стероидной системы превращается в эстрадиол, прежде всего подобное происходит в головном мозге, в печени и в жировой ткани. Эстрадиол касательно общего действия тестостерона и его метаболитов в решающей степени ответствен за обусловленные спецификой пола свойства и регуляцию, осуществляемую гонадотропинами. Поэтому действие эстрадиола, равно как и действие тестостерона в организме взрослого мужчины следует рассматривать как положительный фактор (Cummings и др., см. выше).
Вместе с тем было установлено, что фармакокинетика тестостерона является неудовлетворительной. Прежде всего при пероральном введении тестостерон быстро снова выводится из организма, вследствие чего эффективность и продолжительность действия лекарственных средств на основе тестостерона также не дает удовлетворительных результатов. Поэтому был синтезирован целый ряд производных тестостерона. Подобные производные описаны, в частности, в патенте US 5952319. Прежде всего речь идет о 7а,110-диметильных производных 19-нортестостерона, таких конкретно, как 7а,11Р-диметил-170-гидроксиэстр-4-ен-3-он, 7а,11Р-диметил-170-гептаноилоксиэстр-4-ен-3-он, 7а,11Р-диметил-170-[[(2-циклопентилэтил)карбонил]окси]эстр-4-ен-3-он, 7а,11Р-диметил-17р-(фенилацетилокси]эстр-4-ен-3-он и 7а,11Р-диметил-170-[[(транс-4-[н-бутил]циклогексил)карбонил]окси]эстр-4-ен-3-он.
Названные 7а,110-диметильные производные обладают аналогично МеНТ такими же преимуществами, включая улучшенную фармакокинетику, иными словами, их эффективность и продолжительность действия подняты на более высокий уровень по сравнению с тестостероном. Однако существенным недостатком этих производных является их требующий значительных материально-технических затрат
- 1 -
008147
синтез.
Одна из возможностей синтеза стероидов микробиологическим путем описана в ЕР 0900283 В1. В этой публикации указывается, что эстр-4-ен-3,17-дион и канренон с использованием определенного микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus nigricans, Rhizopus arrhizus и штаммы Pestelotia, можно трансформировать в соответствующий 11 а-гидроксианалог. Вместе с тем во вступительной части описания названной публикации дается ссылка на работу Shibahara и др. авторов в Bio-chim. Biophys. Acta 202, 1970, сс. 172-179, где говорится, что осуществляемая микробиологическим путем реакция 11 а-гидроксилирования стероидов относится к реакциям, не поддающимся точному расчету.
Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача получить производные тестостерона, которые отличались бы невосприимчивостью к восстановлению под действием 5а-редуктазы, обладали бы улучшенной фармакокинетикой и прежде всего характеризовались бы простотой и легкостью их получения. Один из крайне важных аспектов настоящего изобретения состоит в соответствии с этим в разработке с целью упростить получение форпродуктов такого способа, который без проблем позволял бы получать эти форпродукты.
Положенная в основу настоящего изобретения задача решается с помощью микробиологических способов получения 7а-замещенных стероидов согласно пп.1, 3 и 6 формулы изобретения, с помощью 7а,17а-замещенных 110-галогенстероидов согласно п.11 формулы изобретения, способов получения 7а,17а-замещенных 110-галогенстероидов согласно пп.23, 24 и 25 формулы изобретения, благодаря применению этих 7а,17а-замещенных 110-галогенстероидов согласно п.26 формулы изобретения, благодаря фармацевтическим препаратам, содержащим эти 7а,17а-замещенные 110-галогенстероиды, согласно п.27 формулы изобретения, а также с помощью 7а-замещенных 110-галогенэстра-1,3,5(10)-триенов согласно п.21 формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления изобретения представлены в зависимых пунктах формулы изобретения.
Пояснения
Нижеследующие пояснения относятся ко всем разделам описания и к пунктам формулы изобретения, а также к прилагаемой схеме I.
Все группировки, остатки и иные структурные единицы могут соответственно независимо друг от друга варьироваться в указанных диапазонах значений.
Все алкильные, алкиленовые, алкенильные, алкениленовые, алкинильные и алкиниленовые группы могут иметь либо прямую, либо разветвленную цепь. Так, например, пропенильную группу можно представить в виде следующих химических структур: -СН=С-СН3, -СН2-С=СН2 и -С(СН3)=СН2. Тем самым под понятие "C^^ram" подпадают, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, и-пентил, изопентил, трет-пентил, неопентил, н-гексил, 1-метил-н-пентил, 2-метил-н-пентил, 3-метил-н-пентил, 4-метил-н-пентил, 1-этил-н-бутил, 2-этил-н-бутил и т. д.
Алициклический алкил представляет собой либо циклоалкил, либо замещенный одной алкильной группой или несколькими алкильными группами циклоалкил, который присоединен непосредственно через циклоалкильное кольцо или через одну из алкильных групп.
Аналогично этому алициклический алкенил представляет собой либо циклоалкенил, либо замещенный одной или несколькими алкенильными группами или одной либо несколькими алкенильными и ал-кильными группами, или одной либо несколькими алкильными группами циклоалкенил или циклоалкил, который присоединен непосредственно через циклоалкенильное кольцо или через одну из алкенильных либо соответственно через одну из алкильных групп, при этом в алициклическом алкениле содержится по меньшей мере одна двойная связь.
Арил может представлять собой фенил, а также 1-нафтил или 2-нафтил. Понятие "арил" включает в принципе также гетероарил, прежде всего 2-, 3- и 4-пиридинил, 2- и 3-фурил, 2- и 3-тиенил, 2- и 3-пирролил, 2-, 4- и 5-имидазолил, пиридазинил, 2-, 4- и 5-пиримидинил, а также 3- и 4-пиридазинил.
Галоген представляет собой фтор, хлор, бром или йод.
Фармацевтически приемлемыми аддитивными солями служат соли соответствующих соединений с неорганическими и органическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная кислота, бро-мисто-водородная кислота, иодисто-водородная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, винная кислота и метансульфоновая кислота. Эфиры можно образовывать прежде всего с янтарной кислотой.
Числа, напечатанные в виде верхнего индекса при соответствующем символе R, например R13, обозначают его положение в стероидном каркасе, при этом С-атомы в этом каркасе имеют нумерацию согласно номенклатуре ИЮПАК. Числа, напечатанные в виде верхнего индекса при соответствующем символе С, например С10, обозначают положение соответствующего атома углерода в стероидном каркасе.
- 2 -
008147
Описание изобретения
Микробиологические способы нового типа предназначены для получения 7а-замещенных 11а-гидроксистероидов общей формулы 4,В
4,В
в которой
R7 представляет собой группировку P-Q, где
Р обозначает С1-С4алкилен, a Q обозначает водород, С1-С4алкил или С1-С4фторалкил (алкил частично либо полностью фторирован), и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом, R10 представляет собой Н, СН3 или CF3 и R13 представляет собой метил или этил.
В одном из первых вариантов способа получения данных соединений соответствующий 7а-замещенный стероид общей формулы 3,А
3,А
в которой R7, R10 и R13 имеют те же значения, что и указанные для соединении общей формулы 4,В, с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. и Rhizopus sp., на соответствующей стадии способа гидроксилируют и окисляют. Особенно предпочтительны Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana, Glomerella cingulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica и Rhizopus stolonifer, при этом целесообразно использовать в первую очередь Aspergillus awamori (CBS), Aspergillus fischeri (ATCC 1020), Aspergillus malignus (IMI 16061), Aspergillus niger (ATCC 9142), Beauveria bassiana (ATCC 7159), Glomerella cingulata (CBS 15226, CBS 23849, CBS 98069, ATCC 56596, ATCC 64682, IFO 6425), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Haplosporella hesperedica (CBS 20837) и Rhizopus stolonifer (ATCC 15441).
Этот микробиологический способ можно осуществлять также по двухстадийному механизму, проводя последовательно реакцию гидроксилирования и реакцию окисления. Протекание реакции можно регулировать за счет ее продолжительности. Так, например, прекратив реакцию по истечении определенного промежутка времени, можно выделять гидроксилированные, но еще не окисленные продукты. Обе указанные стадии можно проводить поэтому раздельно или же по смешанной ферментативной реакции.
С этой целью соединение общей формулы 3,А на первой стадии микробиологического способа с использованием одного из микроорганизмов, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beau-veria sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhizium sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. и Verti-cillium sp., гидроксилируют в положении 11 с образованием в результате 7а-замещенного стероида с гид-роксигруппой в положении 11. Такое соединение соответствует общей формуле С
- 3 -
008147
в которой R7, R10 и R13 имеют те же значения, что и указанные выше для соединений общей формулы 4,В. Прежде всего используют следующие микроорганизмы: Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingu-lata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Metarrhizium anisopliae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer и Verticillium dahliae. Наиболее предпочтительно использовать для гидрокси-лирования Aspergillus malignus (IMI 16061), Aspergillus melleus (CBS), Aspergillus niger (ATCC 11394), Aspergillus ochraceus (NRRL 405, CBS 13252, ATCC 46504), Beauveria bassiana (ATCC 7159, IFO 5838, ATCC 13144, IFO 4848, CBS 11025, CBS 12736), Gibberella fujikuroi (ATCC 14842), Gibberella zeae (CBS 4474), Glomerella cingulata (ATCC 10534, CBS 23849, CBS 23749, ATCC 16646, ATCC 16052, IFO 6459, IFO 6425, IFO 6470, CBS 98069, IFO 7478, IFO 5257, ATCC 64682, ATCC 15470), Glomerella fusaroides (ATCC 9552), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Metarrhizium anisopliae (IFO 5940), Nigrospora sphaerica (ATCC 12772), Rhizopus oryzae (ATCC 4858, ATCC 34102, ATCC 34102), Rhizopus stolonifer (ATCC 6227b, ATCC 15441) и Verticillium dahliae (ATCC 11405).
По завершении гидроксилирования промежуточный продукт формулы С на второй стадии микробиологического способа с использованием другого микроорганизма, выбранного из группы, включающей Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. и Pseudomonas sp., окисляют с образованием в результате 7а-замещенных 11-а-гидроксистероидов общей формулы 4,В. В этих целях используют прежде всего следующие микроорганизмы: Bacillus lactimorbus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobac-terium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor и Pseudomonas testosteroni, наиболее предпочтительно при этом использовать Bacillus lactimorbus (ATCC 245), Bacillus sphaericus (ATCC 7055), Mycobacterium neoaurum (ATCC 9626, NRRL B-3683, NRRL B-3805), Mycobacterium smegmatis (ATCC 14468), Nocardia corallina (ATCC 31338), Nocardia globerula (ATCC 9356), Nocardia minima (ATCC 19150), Nocardia restrictus (NCIB 10027), Nocardia rubropertincta (ATCC 14352), Nocardia salmonicolor (ATCC 19149) и Pseudomonas testos-teroni (ATCC 11996).
Согласно еще одному варианту способа соединения общей формулы 4,В можно получать с помощью микробиологической реакции из 7а-замещенных стероидов общей формулы D
в которой R7, R10 и R13 имеют те же значения, что и указанные для соединений общей формулы 4,В. Данную реакцию проводят с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Hap-losporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. и Syncephalastrum sp., при этом стероидный каркас гидроксилируют в положении 11а, и в результате образуется 7а-замещенный 11а-гидроксистероид общей формулы 4,В. Предпочтительны для этой цели следующие микроорганизмы: Aspergillus alliaceus, Aspergillus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus nidualans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus variecolor, Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Hap-losporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae и Syncephalastrum racemosum, прежде всего при этом используют Aspergillus alliaceus (ATCC 10060), Aspergillus awamori (CBS), Aspergillus fischeri (ATCC 1020), Aspergillus malignus (IMI 16061), Aspergillus melleus (CBS), Aspergillus nidualans (ATCC 11267), Aspergillus niger (ATCC 9142, ATCC 11394), Aspergillus ochraceus
- 4 -
008147
(NRRL 405, ATCC 13252, ATCC 46504), Aspergillus vanecolor (ATCC 10067), Beauveria bassiana (IFO 5838, ATCC 13144, IFO 4848, CBS 11025, CBS 12736, ATCC 7159), Curvularia lunata (1X3), Gibberella zeae (CBS 4474), Glomerella cingulata (ATCC 10534, CBS 23849, CBS 23749, ATCC 16646, IFO 6459, IFO 6425, IFO, 6470, ATCC 15093, ATCC 10529, IFO 5257, ATCC 56596, ATCC 64682), Glomerella fusaroides (ATCC 9552), Gnomonia cingulata (CBS 15226), Haplosporella hesperedica (CBS 20837), Helicostylum piriformae (ATCC 8992), Nigrospora sphaenca (ATCC 12772), Rhizopus oryzae (ATCC 4858) и Syncephalastrum ra-
cemosum (IFO 4827).
Наиболее пригодными являются способы, с помощью которых получают 7а-замещенные 11а-гидроксистероиды общей формулы 4,В, где независимо друг от друга R7 представляет собой СН3 и/или R10 представляет собой Н, и/или R13 представляет собой CH3.
Способ осуществляют по обычной методике. Обычно сначала приготавливают стерилизованный питательный раствор для штамма и затем для культивирования штамма в этот питательный раствор вносят содержащий его культуральный раствор. Далее полученную таким путем предварительную культуру переносят в ферментер, в который загружен также соответствующий питательный раствор. Предпочтительно после начальной стадии выращивания культуры штамма в ферментер добавляют затем исходное вещество, в рассматриваемом случае либо соединение общей формулы 3,А, либо соединение общей формулы D, инициируя таким образом предлагаемую в изобретении реакцию. По завершении реакции смесь веществ для выделения требуемого 7а-замещенного 11 а-гидроксистероида очищают по обычной технологии.
Из полученных таким путем соединений общей формулы 4,В можно синтезировать другие предлагаемые в изобретении соединения с помощью также предлагаемых в изобретении способов. Прежде всего 7а,17а-замещенные 11(3-галогенстероиды общей формулы 8,10,12
8,10,12
в которой
U-V-W-X-Y-Z представляет собой одну из циклических структур С1-С2-С3-C4=С5-С10, С1-С2-С3-С4-С5=С10 или С1-С2-С3-С4-С5-С10, при этом в данном случае оксогруппа (=O) связана с W^G3) или представляет собой циклическую структуру С1=С2-С3=С4-С5=С6, при этом в данном случае остаток OR3 связан с W3 (=С3),
R3 представляет собой Н, ^-^алкал, ^-^алканою! или простой циклический С3-С7эфир с О-атомом остатка OR3,
R7 представляет собой группировку P-Q, где
Р обозначает ^-^алки^н, a Q обозначает водород, ^-^алки! или C1-C4фторалкил (алкил частично либо полностью фторирован), и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,
R может находиться в а- либо ^-положении и представляет собой Н, CH3 или CF3, однако он присутствует лишь при условии, что X-Y-Z не обозначает C4-C5=C10,
R11 представляет собой галоген,
R13 представляет собой метил или этил,
R17 представляет собой Н, ^^^алкал, алициклический ^^^алкал, ^-^^кенил, алицикличе-ский ^-^^кенил, Cp^^ramm!,
^-^^китарют, ^-^алки^нт-рил или группировку P-Q, где эта группировка P-Q имеет указанное выше значение,
R17 представляет собой Н, C1-C18алкил, алициклический ^^^алки!, ^^^ал^нил, алициклический ^-^^кенил, C1-C18алкинил или ^^^ал^^арил, при этом R17 может быть также через кетогруп-пу связан с 17^-оксигруппой и, кроме того, R17 дополнительно может быть замещен одной или несколь-
18 19 20 18
кими группами NR18R19 либо одной или несколькими группами SOxR20, где х обозначает 0, 1 или 2, a R18,
19 20 17
R19 и R20 каждый независимо друг от друга может иметь те же значения, что и R17, равно как и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли, сложные эфиры и амиды представляют собой действующие вещества, которые обладают целым рядом важных преимуществ. Эти получаемые в результате проведения других стадий способа из 7а-замещенного 11 а-гидроксистероида общей формулы 4,В соединения являются ценными активными веществами с ярко выраженным андрогенным действием, не проявляя при их применении упомянутых выше побочных эффектов. Данные соединения пригодны для получения
- 5 -
008147
соответствующих лекарственных средств, и прежде всего эффективных контрацептивов и действующих веществ для гормонзаместительной терапии (ГЗТ).
В случае дополнительного замещения R17 группой NR18R19 речь может идти о метиламино-, диме-тиламино-, этиламино-, диэтиламино-, циклогексиламино-, дициклогексиламино-, фениламино-, дифе-ниламино-, бензиламино- или дибензиламиногруппе.
К особенно пригодным для использования в указанных целях 7а,17а-замещенным 11Р-галоген стероидам общей формулы 8,10,12 относятся соединения, в которых U-V-W-X-Y-Z представляет собой циклическую структуру C1-C2-C3-C4=C5-C10, C1-C2-C3-C4-C5=C:10 или C1^C2-C3=C4-C5=C10.
В первом случае (U-V-W-X-Y-Z обозначает С1-С2-С3-С4=С5-С10) речь идет о стероидах общей формулы 10
R17
13 = OR17'
Во втором случае (U-V-W-X-Y-Z обозначает С1-С2-С3-С4-С5=С10) речь идет о стероидах общей формулы 12
R17
13 = .OR17
Соединения общих формул 10 и 12 представляют собой соединения с андрогенным действием. В третьем случае (U-V-W-X-Y-Z обозначает С1=С2-С3=С4-С5=С10) речь идет о стероидах общей формулы 8
R17
13 = JDRW
Эти соединения представляют собой эстрогены (соединения с аффинностью к эстрогенным рецепторам).
Во всех трех случаях остатки R3, R7, R10, R11, R13, R17 и R17 имеют те же значения, что и соответствующие остатки в общей формуле 8, 10, 12.
Предпочтительно независимо друг от друга R1 представляет собой Н и/или R7 представляет собой CH3, и/или R11 представляет собой фтор, и/или R13 представляет собой CH3, и/или R17 представляет собой Н, CH3, C1-C18алкинил, прежде всего этинил, CH2CN или CF3, и/или R17 представляет собой Н.
К особенно пригодным для использования предлагаемым в изобретении 7а,17а-замещенным 11Р-галогенстероидам общей формулы 8,10,12 относятся следующие соединения:
17а-этинил-11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он (формула 10),
17а-этинил-11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-5(10)-ен-3-он (формула 12),
17а-этинил-11р-фтор-7а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол (формула 8).
Эти соединения можно синтезировать следующим путем:
Для получения 7а,17а-замещенных 11Р-галогенстероидов общей формулы 10, где U-V-W-X-Y-Z
- 6 -
008147
представляет собой циклическую структуру С1-С2-С3-С4=С5-С10, в качестве исходных веществ используют получаемые с помощью микробиологического способа по изобретению 7а-замещенные 11а-гидроксистероиды общей формулы 4,В.
На первой стадии синтеза полученные таким образом 7а-замещенные 11 а-гидроксистероиды посредством нуклеофильного замещения галодегидроксилирующим реагентом превращают в соответствующие 7а-замещенные 11 р-галогенстероиды формулы 5
4,В 5
В качестве галодегидроксилирующих реагентов могут рассматриваться все обычно используемые для подобных целей соединения, например фтористо-, хлористо-, бромисто- или иодисто-водородная кислота, тионилхлорид либо тионилбромид, пентахлорид фосфора, оксихлорид фосфора, N-хлорсукцинимид, трифенилфосфин/тетрахлорметан, HF/пиридин или трифторид диэтиламиносеры или предпочтительно нонафлилфторид/1,5-диазабицикло[5.4.0]ундецен.
Из соединения формулы 5 можно затем путем селективного алкилирования у атома С17 каркаса получать соединение формулы 10 (см. схему I). Для селективного алкилирования могут использоваться обычные алкилирующие реагенты, например соединения Гриньяра и металлоорганические соединения, прежде всего алкиллитиевые соединения. Так, например, для получения соответствующего 17а-этинил-17р-гидроксиэстр-4-ен-3-она из эстр-4-ен-3,17-диона в качестве алкилирующего реагента можно использовать этинилмагнийбромид.
Для получения 7а,17а-замещенных 11 р-галогенстероидов, в которых U-V-W-X-Y-Z представляет собой циклическую структуру С1-С2-С3-С4-С5=С10 и которые соответствуют общей формуле 12, используют и изомеризуют соединения общей формулы 10, в результате чего двойная связь А4 изомеризуется в двойную связь А5(10). Для защиты 3-кетогруппы сначала образуют простой циклический эфир в положении 3. Затем двойную связь А4 изомеризуют в двойную связь А5(10) с образованием при этом 7а,17а-замещенного 11 р-галогенстероида общей формулы 12, после чего защитную группу снова отщепляют.
При получении других 7а,17а-замещенных 11 р-галогенстероидов общей формулы 8, где U-V-W-X-Y-Z представляет собой циклическую структуру С1=С2-С3=С4-С5=С10, работают следующим образом:
Сначала, как уже описывалось выше, из полученного в результате микробиологического гидрокси-лирования и окисления 7а-замещенного 11 а-гидроксистероида общей формулы 4,В путем галодегидрок-силирования по реакции нуклеофильного замещения образуют соответствующий 11 р-галогенстероид общей формулы 5.
Затем из этого 11 р-галогенстероида путем окисления, например солью меди(П), образуют 7 а-замещенный эстра-1,3,5(10)-триен общей формулы 6
в которой R3, R7, R11 и R13 имеют указанные выше значения. Если R3 представляет собой Н, то эти соединения можно синтезировать непосредственно.
Если же R3 имеет значение, отличное от Н, то после образования путем окисления 1,3,5(10)-триенового кольца необходимо по обычной методике образовывать соответствующие простые и сложные эфиры.
7а-замещенные 11р-галогенэстра-1,3,5(10)-триены общей формулы 6, равно как и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли, сложные эфиры и амиды являются новыми и включены поэтому в объем настоящего изобретения в качестве промежуточных продуктов, используемых при синтезе также предлагаемых в изобретении 7а,17а-замещенных 11 р-галогенстероидов общей формулы 8.
Одним из особенно предпочтительных 7а-замещенных 11р-галогенэстра-1,3,5(10)-триенов общей
- 7 -
008147
формулы 6 является 11Р-фтор-3-гидрокси-7а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-17-он.
Из 7а-замещенного 11Р-галогенэстра-1,3,5(10)-триена общей формулы 6 аналогично описанному выше синтезу соединения общей формулы 10 путем селективного алкилирования у атома С17 каркаса можно образовывать предлагаемый в изобретении 7а,17а-замещенный 11Р-галогенстероид общей формулы 8.
Кроме того, из полученных в результате микробиологического гидроксилирования и окисления из 7а-замещенных стероидов общей формулы 3,А или D веществ общей формулы 4,В могут быть получены также обладающие андрогенным действием 7а-замещенные 11 Р-галогенстероиды общей формулы 9:
в которой R7, R11 и R13 имеют указанные выше значения. Одним из особенно предпочтительных соединений является 11Р-фтор-17Р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он. Соединения общей формулы 9, равно как и их фармацевтически приемлемые аддитивные соли, сложные эфиры и амиды также обладают анд-рогенным действием.
Для получения соединений общей формулы 9 эстр-4-ен-3,17-дион формулы 5 восстанавливают до 17Р-гидроксиэстр-4-ен-3-она формулы 9, например с помощью соответствующего борогидрида.
Соединения общей формулы 9 можно превращать, кроме того, в соответствующие 7а-замещенные 11р-галогенэстра-5(10)-ены формулы
в которой R7, R10, R11 и R13 имеют те же значения, что и указанные в общей формуле 8,10,12. С этой целью соединения общей формулы 9 изомеризуют за счет смещения двойной связи А4 в двойную связь А5(10). Для защиты 3-кетогруппы сначала образуют простой циклический эфир в положении 3. Затем двойную связь А4 изомеризуют в двойную связь А5(10) с образованием при этом вышеуказанного 7а-замещенного 11 Р-галогенстероида, после чего защитную группу снова отщепляют.
Еще одна возможность получения соответствующих 7а-замещенных 11Р-галогенэстра-5(10)-енов формулы
в которой R7, R10, R11 и R13 имеют те же значения, что и указанные в общей формуле 8,10,12, заключается в том, что их образуют из соединений общей формулы 5 за счет изомеризации двойной связи А4 в двойную связь А5(10). С этой целью соединения общей формулы 5 изомеризуют за счет смещения двойной связи А4 в двойную связь А5(10). Для защиты 3-кетогруппы сначала образуют простой циклический эфир в положении 3. Затем двойную связь А4 изомеризуют в двойную связь А5(10) с образованием при этом вышеуказанного 7а-замещенного 11 Р-галогенстероида, после чего защитную группу снова отщепляют.
Все названные соединения можно также этерифицировать далее с образованием сложных или простых эфиров, но только при наличии соответствующих гидроксигрупп в положении 3 или 17р. Так, например, соединение формулы 9 можно превращать в соответствующий простой 17Р-эфир или сложный
- 8 -
008147
17р-эфир. Одним из предпочтительных соединений данной группы является 11Р-фтор-17Р-(4-сульфамоилбензокси)-7а-метилэстр-4-ен-3-он. В качестве заместителей у атома кислорода оксигруппы при С17 пригодны в принципе такие же остатки, которые указаны для R17.
Прежде всего 7а,17а-замещенные 11 Р-галогенстероиды общей формулы 8,10,12 пригодны для получения соответствующих лекарственных средств. С учетом этого настоящее изобретение относится также к применению названных соединений общей формулы 8,10,12 для получения соответствующих лекарственных средств, равно как и к фармацевтическим препаратам, содержащим по меньшей мере одно из указанных соединений общей формулы 8,10,12 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
Предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 Р-галогенстероиды общей формулы 10,12 представляют собой соединения с ярко выраженным андрогенным действием, не проявляя при их применении указанных выше побочных эффектов, таких, например, как стимуляция предстательной железы (прежде всего никакой доброкачественной гиперплазии простаты). К преимуществам соединений следует отнести и их простой в осуществлении синтез. Как было установлено, предлагаемые в изобретении соединения общей формулы 10 или 12 могут применяться не только для ГЗТ мужчин - они пригодны также без дополнительного введения в организм каких-либо иных действующих веществ в качестве эффективных мужских контрацептивов при соответственно подобранной дозировке с целью требуемого снижения уровня содержания в крови ЛГ, вырабатываемого в организме тестостерона и ФСГ (фоллику-лостимулирующего гормона). Это объясняется способностью предлагаемых в изобретении 11Р-галогенстероидов ингибировать избыточную активацию ("высыпание") ЛГ и ФСГ. ЛГ стимулирует клетки Лейдига таким образом, что они секретируют тестостерон. Если содержание ЛГ в крови поддерживать на низком уровне, то при этом снижается также выделение в организме тестостерона. Тестостерон используется для сперматогенеза, тогда как ФСГ стимулирует зародышевые клетки. Поэтому для эффективного сперматогенеза требуется достаточно высокий уровень содержания ФСГ и ЛГ в крови, при этом достаточно высокий уровень содержания ЛГ в крови обусловливает необходимую для сперматогенеза избыточную активацию тестостерона.
Поскольку использование для стерилизации только одних 7а,17а-замещенных 11Р-галогенстероидов без добавления каких-либо дополнительных действующих веществ уже может привести к эффективной мужской контрацепции, это позволит не только существенно упростить введение соответствующего лекарственного средства, предназначенного для этих целей, но и значительно снизить расходы, связанные с его применением.
Для контроля мужской фертильности предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11Р-галогенстероиды могут применяться также в комбинации с гестагеном.
Помимо этого предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 Р-галогенстероиды эффективно ингибируют 5а-редуктазу и стероид-11-гидроксилазу [CYP11B (P450c11) G. Zhang, W.L. Miller, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, т. 81, 1996, cc. 3254-3256], благодаря чему удается, например, избирательным путем избежать стимулирующего воздействия на предстательную железу, и соединения проявляют улучшенную фармакокинетику. Ингибирование 11-гидроксилазы приводит к уменьшению степени дезактивации обладающих андрогенным действием соединений и к снижению их выделения из организма человека. Благодаря этому повышаются эффективность и продолжительность действия данных соединений по сравнению с известными соединениями, прежде всего при пероральном применении.
Вышеназванные свойства позволяют применять предлагаемые в изобретении соединения прежде всего для контроля репродуктивной способности мужчин, равно как и для андрогензаместительной терапии со сниженной склонностью к восстановлению 5а-редуктазы при одновременно сохраняемой ароматизации с образованием эстрогенных стероидов и положительном влиянии на сывороточные липиды и центральную нервную систему.
Андрогенное действие и отсутствие, как было предварительно установлено, вышеназванных побочных эффектов исследовали в опытах на семенных пузырьках с использованием предлагаемых в изобретении соединений общих формул 10 и 12. Эффективность же предлагаемых в изобретении соединений общей формулы 8 тестировали в опыте на эстрогенное действие, которое эти соединения оказывают на рост матки.
Предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 Р-галогенстероиды общей формулы 10 или 12, равно как и предлагаемые в изобретении фармацевтические препараты, содержащие эти соединения, пригодны для исключительно успешного лечения не страдающих бесплодием мужчин, а также в принципе мужских особей животных-млекопитающих. Применение в целях мужской контрацепции приводит лишь к временной утрате мужчинами репродуктивной способности. По завершении приема действующих веществ по изобретению, соответственно фармацевтических препаратов первоначальное состояние восстанавливается, т.е. к мужчине возвращается репродуктивная способность и сперматогенез протекает в том же объеме, что и ранее. Для достижения временной стерильности и поддержания ее на постоянном уровне в течение требуемого промежутка времени действующее веществ, соответственно препарат необходимо вводить в организм постоянно, без перерывов, причем в зависимости от формы применения их
- 9 -
008147
следует назначать ежедневно, а в иных случаях предусмотреть периодическое повторение через определенные короткие или же длительные промежутки времени. После однократного или многократного введения действующего вещества либо препарата восстановление первоначального "не стерильного" состояния мужчины не обязательно происходит сразу, оно может восстанавливаться постепенно, для чего потребуется определенный период времени, зависящий от различных факторов, таких, например, как дозировка, особенности конституции человека и одновременный прием других лекарственных средств.
Если целью применения является контрацепция, то дозировку 7а,17а-замещенных 11Р-галогенстероидов следует выбирать настолько высокой, чтобы содержание ЛГ и ФСГ в крови составляло соответственно максимум 2,5 МЕ/мл, прежде всего максимум 1,0 МЕ/мл, а содержание тестостерона составляло максимум 10 нмолей/л, прежде всего максимум 3 нмоля/л.
Если предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11 Р-галогенстероиды предусматривается применять для ГЗТ без достижения при этом контрацепции, то дозировку следует выбирать более низкой. В этом случае стремятся достичь такого уровня действующих веществ, который обеспечивает содержание ЛГ и ФСГ в крови соответственно выше 2,5 МЕ/мл, а содержание тестостерона выше 10 нмо-лей/л.
Дозировка предлагаемых в изобретении 7а,17а-замещенных 11 Р-галогенстероидов общей формулы 10 или 12, требуемая для регуляции уровня содержания в крови ЛГ, ФСГ и тестостерона, зависит от многих факторов и должна определяться поэтому, исходя из специфики применения. В первую очередь дозировка зависит, как очевидно, от вида терапии. Если соединения предполагается применять для мужской контрацепции, то их необходимо назначать в существенно более высоких дозах, чем при использовании для ГЗТ. Дозировка определяется далее типом 7а,17а-замещенного 11Р-галогенстероида и его биодоступностью. Специфика применения крайне важна также для выбора вводимого количества соединения. Кроме того, дозировка зависит от конституции человека и от иных факторов, таких, например, как необходимость учитывать возможный параллельный прием других лекарственных средств.
Соединения могут назначаться для перорального и парентерального введения, например интрапе-ритонеального, внутривенного, внутримышечного или чрескожного. Соединения можно также имплантировать в ткань. Назначаемое для введения в организм количество соединений может варьироваться в широких пределах с учетом эффективности этого количества. Оно может варьироваться в широких пределах также в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и от методики введения. Суточная доза для человека составляет от 0,1 до 100 мг. Предпочтительная суточная доза для человека составляет от 0,1 до 10 мг. Продолжительность применения соответствующего соединения определяется конечной целью.
Для практического применения могут предназначаться капсулы, пилюли, таблетки, драже, кремы, мази, примочки, жидкости, например сиропы, гели, инъецируемые жидкости, например для интрапери-тонеальной, внутривенной, внутримышечной или чрескожной инъекции, и т.п., при этом отдельные лекарственные формы высвобождают соединения по изобретению в зависимости от их типа постепенно или высвобождают все количество через короткий промежуток времени.
Для перорального введения применяют капсулы, пилюли, таблетки, драже и жидкости или какие-либо другие пероральные лекарственные формы в качестве фармацевтических препаратов. В этих случаях подобные лекарственные средства можно изготавливать таким образом, чтобы обеспечить высвобождение ими действующих веществ либо через короткий промежуток времени, либо обеспечить эффект депо, что позволит действующему веществу поступать в организм постепенно, с замедлением (пролонгированное действие). Унифицированные дозы наряду с 7а,17а-замещенным 11Р-галогенстероидом могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, например вещества для регуляции реологических свойств лекарственного средства, поверхностно-активные вещества, гидротроп-ные солюбилизаторы, микрокапсулы, микрочастицы, грануляты, разбавители, связующие, такие как крахмал, сахар, сорбит и желатин, а также наполнители, такие как кремниевая кислота и таль, смазки, красители, ароматизаторы и другие вещества.
Предлагаемые в изобретении 7а,17а-замещенные 11Р-галогенстероиды могут быть представлены также в виде раствора, предназначенного для перорального применения и содержащего наряду с активным 11 Р-галогенстероидом в качестве других компонентов фармацевтически приемлемое масло и/или фармацевтически приемлемое липофильное, поверхностно-активное вещество, и/или фармацевтически приемлемое гидрофильное, поверхностно-активное вещество, и/или фармацевтически приемлемый смешивающийся с водой растворитель. В этом отношении можно сослаться, кроме того, на заявку WO
97/21440.
Для достижения лучшей биодоступности стероида соединения можно использовать для получения циклодекстриновых клатратов. С этой целью соединения подвергают взаимодействию с а-, Р- или у-циклодекстрином либо с их производными.
Если предусматривается использовать кремы, мази, примочки и другие предназначенные для наружного применения жидкости, то данные лекарственные средства следует формировать таким образом, чтобы обеспечить для соединений по изобретению возможность поступления в организм в достаточном количестве. В состав таких лекарственных форм входят определенные вспомогательные вещества, на
- 10 -
008147
пример вещества для регуляции реологических свойств, поверхностно-активные вещества, консерванты, гидротропные солюбилизаторы, разбавители, вещества для повышения способности предлагаемых в изобретении стероидов проникать через кожу, красители, ароматизаторы и средства защиты кожи, такие как кондиционеры и регуляторы влажности. В состав лекарственного средства наряду со стероидами по изобретению могут входить и другие действующие вещества.
Для парентерального введения действующие вещества можно растворять или суспендировать в соответствующем физиологически совместимом разбавителе. В качестве разбавителей во многих случаях используют масла с добавлением или без добавления гидротропного солюбилизатора, поверхностно-активного вещества, суспендирующего или эмульгирующего агента. В качестве примера используемых в указанных целях масел можно назвать оливковое масло, арахисовое масло, хлопковое масло, соевое масло, касторовое масло и кунжутное масло. Для приготовления инъецируемого препарата может использоваться любой жидкий носитель, в котором предлагаемые в изобретении соединения находятся в растворенном либо эмульгированном виде. Подобные жидкости содержат часто также вещества для регулирования вязкости, поверхностно-активные вещества, консерванты, гидротропные солюбилизаторы, разбавители и другие добавки, с помощью которых раствору придают изотоничность. Вместе с 7а,17а-замещенными 11Р-галогенстероидами в организм могут вводиться также другие действующие вещества.
Предлагаемые в изобретении 11 Р-галогенстероиды могут применяться в виде депо-инъекции или имплантируемого препарата, например подкожно, которые можно формировать таким образом, чтобы обеспечить постепенное, замедленное высвобождение действующего вещества. В этих целях могут использоваться известные технологии, например растворяющиеся или снабженные мембраной депо-формы. Имплантаты могут содержать в качестве инертных материалов, например, биологически разлагаемые полимеры или синтетические силиконы, например силиконовый каучук. При чрескожном введении предлагаемые в изобретении 11 Р-галогенстероиды можно заделывать, например, в пластырь.
Ниже изобретение более подробно поясняется на примерах.
А. Микробиологический синтез
11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-дион (соединение 4,В) Пример 1.
А В
В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 1000 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121°С в автоклаве питательного раствора, содержащего 3 мас.% глюкозы, 1 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, 0,2 мас.% NaNO3, 0,1 мас.% КН2РО4, 0,2 мас.% К2НР04, 0,05 мас.% KCl, 0,05 мас.% MgSO4-7H2O и 0,002 мас.% FeSO4-7H2O (pH 6,0), вносили инокулят культуры штамма Gnomonia cingulata, выращенного на скошенном агаре (CBS 15226), и в течение 72 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в 20-литровый ферментер, содержавший 19 л стерильной среды такого же конечного состава, что и описанный выше для предварительной культуры. Кроме того, перед стерилизацией для подавления ценообразования добавляли еще 1,0 мл силиконового масла и 1,0 мл Synperonic (этоксилат кетоспирта). По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 12 ч при повышенном давлении 0,7 бара, температуре 28°С, аэрации с расходом 20 л/мин и скорости перемешивания 250 об./мин, добавляли раствор 4,0 г 17Р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 40 мл ДМФ. Далее продолжали перемешивание и аэрацию. Через 135 ч культуральный бульон собирали и в течение 12 ч экстрагировали 10 л метилизобу-тилкетона и в течение 5 ч 5 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы концентрировали досуха. Силиконовое масло удаляли путем промывки гексаном. После хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей гексан/этилацетат выделили 1,64 г (39%) 11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона.
- 11 -
008147
Пример 2.
Микробиологическое окисление
В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 1000 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121 °С в автоклаве питательного раствора, содержащего 3 мас.% глюкозы, 1 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, 0,2 мас.% NaNO3, 0,1 мас.% КН2РО4, 0,2 мас.% К2НРО4, 0,05 мас.% KCl, 0,05 мас.% MgSO4'7^O и 0,002 мас.% FeSO4'7^O (pH 6,0), вносили инокулят культуры штамма Glomerella cingulata (IFO 6425), выращенной на скошенном агаре, и в течение 72 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в 20-литровый ферментер, содержавший 19 л стерильной среды такого же конечного состава, что и описанный выше для предварительной культуры. Кроме того, перед стерилизацией для подавления ценообразования добавляли еще 1,0 мл силиконового масла и 1,0 мл Synperonic (этоксилат кетоспирта). По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 12 ч при повышенном давлении 0,7 бара, температуре 28°С, аэрации с расходом 20 л/мин и скорости перемешивания 350 об./мин, добавляли раствор 2,0 г 17^-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 30 мл ДМФ. Далее продолжали перемешивание и аэрацию. Через 19 ч культуральный бульон собирали и в течение 16 ч экстрагировали 20 л метилизобу-тилкетона и в течение 23 ч 20 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы концентрировали досуха. Остаток практически полностью растворяли в метаноле. Силиконовое масло отфильтровывали. Затем концентрировали и после хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей дихлорметан/ацетон выделили 1,55 г (73%) 11а,17^-дигидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она. После перекристаллизации из ацетона/диизопропилового эфира выделили 827 мг (39%) белых кристаллов с температурой плавления 163°С и [a]D= -16° (СНС13, с=0,501).
В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121°С в автоклаве питательного раствора, содержащего 0,5 мас.% глюкозы, 0,5 мас.% бактодрожже-вого экстракта, 0,1 мас.% пептона и 0,2 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания (рН 7,5), вносили четыре полученных криогенным путем шарика культуры штамма Bacillus sphaericus (ATCC 7055) и в течение 24 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в четыре 2-литровые колбы Эрленмейера, содержавших 500 мл стерильной среды такого же состава, что и описанный выше для предварительной культуры, при этом в каждую колбу инокулировали по 10% культурального бульона. По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 4 ч при температуре 28°С с использованием ротационного шейкера при 165 об./мин, в каждую из четырех колб добавляли 50 мг 11а,17^-дигидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 2,5 мл ДМФ. Встряхивание продолжали еще в течение 48 ч. Объединенные культуральные бульоны дважды экстрагировали 2 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха. При этом получили 630 мг маслянисто-кристаллического остатка. После перекристаллизации из ацетона/диизопропилового эфира выделили 103 мг (49,2%) желтоватых кристаллов с температурой плавления 189°С и [a]D=+40,4° (CHCl3, с=0,529) (непосредственная кристаллизация, без предварительной хроматографической очистки).
Пример 3.
D В
В 2-литровую колбу Эрленмейера после загрузки в нее 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 121°С в автоклаве питательного раствора, содержащего 3 мас.% глюкозы, 1 мас.% жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, 0,2 мас.% NaNO3, 0,1 мас.% КН2РО4, 0,2 мас.%
- 12 -
008147
KOTO.,, 0,05 мас.% KCl, 0,05 мас.% MgSO4-7H2O и 0,002 мас.% FeSO4-7H2O (pH 6,0), вносили половину ино-кулята культуры штамма Aspergillus ochraceus (CBS 13252), выращенного на скошенном агаре, и в течение 72 ч при 28°С встряхивали на ротационном шейкере при 165 об./мин. Затем эту предварительную культуру вносили в 10-литровый ферментер, содержавший 9,5 л стерильной среды такого же конечного состава, что и описанный выше для предварительной культуры. Кроме того, перед стерилизацией для подавления ценообразования добавляли еще 0,5 мл силиконового масла и 0,5 мл Synperonic (этоксилат кетоспирта). По завершении начальной фазы роста, продолжавшейся в течение 6 ч при повышенном давлении 0,7 бара, температуре 28°С, аэрации с расходом 5 л/мин и скорости перемешивания 350 об/мин, добавляли раствор 1,0 г 7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 15 мл ДМФ. Далее продолжали перемешивание и аэрацию. Через 22 ч культуральный бульон собирали и дважды в течение 4 ч экстрагировали 7 л метилизобутилкетона. Объединенные органические фазы концентрировали досуха. Остаток практически полностью растворяли в метаноле. Силиконовое масло отфильтровывали. Затем концентрировали и после хроматографии на силикагеле с использованием градиента растворителей дихлорметан/ацетон выделили 0,78 г (74%) 11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона. После перекристаллизации из ацетона/диизопропилового эфира выделили 311 мг (29,6%) белых кристаллов с температурой плавления 200°С и [a]D =+52° (CHCl3, с=0,5905). Б. Химический способ получения
Пример 4. Получение 11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она
а) 11в-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-дион
К раствору 13,08 г 11а-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона (полученного предлагаемым в изобретении микробиологическим синтезом [раздел А]) в 250 мл толуола и 18,2 мл 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ена при 0°С добавляли по каплям 11,5 мл фторангидрида перфторбутан-1-сульфоновой кислоты. Через 1 ч нейтрализовали 2-молярной соляной кислотой, сливали на воду, четырежды экстрагировали этилацетатом, промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили и концентрировали в вакууме. После хроматографии сырого продукта на силикагеле с использованием градиента растворителей гексан/этилацетат получили 8,7 г 11р-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона. Температура плавления 101,4°С, [аЬ=+135,8° (СНСЬ).
б) 11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он
Раствор 8,7 г 11р-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 148 мл тетрагидрофурана по каплям смешивали при 0°С с 29,5 мл 1-молярного алюмотритретбутоксигидрида лития и в течение 5,5 ч перемешивали при 0°С. Затем при 0°С добавляли разбавленную серную кислоту, после чего реакционный раствор сливали на смесь льда и воды, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 5,8 г 11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она с температурой плавления 143-144°С, [аЬ=+89,9° (CHCl3).
Пример 5. Получение 11р-фтор-17р-(4-сульфамоилбензокси)-7а-метилэстр-4-ен-3-она
Раствор 500 мг 11 р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 7,5 мл пиридина смешивали при комнатной температуре с 750 мг 4-сульфамоилбензойной кислоты, 800 мг N,N-дициклогексилкарбодиимида и 125 мг n-толуолсульфоновой кислоты и перемешивали в течение 8,5 ч. Затем смесь сливали в раствор гидрокарбоната натрия, четырежды экстрагировали дихлорметаном, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хрома-тографировали на силикагеле с использованием дихлорметана/ацетона. В результате получили 302 мг 11р-фтор-17р-(4-сульфамоилбензокси)-7а-метилэстр-4-ен-3-она с температурой плавления 232°С, [аЬ=+100,5° (CHCI3).
Пример 6. Получение 17а-этинил-11 р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она
а) 11р-фтор-3-метокси-7а-метилэстр-3,5-диен-17-он
Раствор 2 г 11р-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 20 мл 2,2-диметоксипропана перемешивали совместно с 200 мг тозилата пиридиния в течение 6,5 ч при 80°С. Затем разбавляли этилацетатом, промывали раствором гидрокарбоната натрия и хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Таким путем получили 2 г сырого 11р-фтор-3-метокси-7а-метилэстра-3,5-диен-17-она.
б) 17а-этинил-11 р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-он
Раствор 9,17 г хлорида церия(Ш) в 60 мл тетрагидрофурана по каплям смешивали при 0°С с 74,2 мл раствора этинилмагнийбромида (0,5-молярный раствор в тетрагидрофуране) и в течение 1 ч перемешивали при 0°С. Затем по каплям добавляли раствор 2 г сырого 11 р-фтор-3-метокси-7а-метилэстр-3,5-диен-17-она в 40 мл тетрагидрофурана и перемешивание продолжали еще в течение 3,5 ч при 0°С. Для последующей переработки добавляли насыщенный раствор хлорида аммония, сливали на воду, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали полуконцентрированной соляной кислотой, раствором гидрокарбоната натрия и хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хромато-графировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 1,15 г чистого 17а-этинил-11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она с температурой плавления 218-220°С, [аЬ=+19,2° (СНСЬ).
- 13 -
008147
Пример 7. Получение 17а-этинил-11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-5(10)-ен-3-она
а) 3,3-этандиилдиокси-17а-этинил-11 р-фтор-7а-метилэстр-5(10)-ен-17р-ол
Раствор 700 мг 17а-этинил-11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-4-ен-3-она в 7 мл дихлорметана и 4,7 мл этиленгликоля перемешивали совместно с 2,3 мл триметилортоформиата и 30 мг гидрата n-толуолсульфоновой кислоты в течение 6,5 ч при комнатной температуре. Затем смесь сливали в раствор гидрокарбоната натрия, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. Таким путем получили 205 мг 3,3-этандиилдиокси-17а-этинил-11р-фтор-7а-метилэстр-5(10)-ен-17р-ола.
б) 17а-этинил-11р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-5(10)-ен-3-он
Раствор 205 мг 3,3-этандиилдиокси-17а-этинил-11р-фтор-7а-метилэстр-5(10)-ен-17р-ола в 27 мл метанола и 3,6 мл воды перемешивали совместно с 361 мг щавелевой кислоты в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем смесь сливали в раствор гидрокарбоната натрия, трижды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/этилацетата. В результате получили 95 мг 17а-этинил-11 р-фтор-17р-гидрокси-7а-метилэстр-5(10)-ен-3-она с температурой плавления 112-114°С.
Пример 8. Получение 17а-этинил-11 р-фтор-7а-метилэстр-1,3,5(10)-триен-3,17р-диола
а) 11 р-фтор-3-гидрокси-7а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-17-он
Раствор 500 мг 11 р-фтор-7а-метилэстр-4-ен-3,17-диона в 16,5 мл ацетонитрила перемешивали совместно с 400 мг бромида меди (II) в течение 6,5 ч при 25°С. Затем разбавляли этилацетатом, промывали раствором гидрокарбоната натрия и хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гексана/ацетона. Таким путем получили 280 мг чистого 11 р-фтор-3-гидрокси-7а-метилэстр-1,3,5(10)-триен-17-она с температурой плавления 185-186°С.
б) 17а-этинил-11 р-фтор-7а-метилэстра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол
Суспензию 2,03 г хлорида церия(Ш) в 7,5 мл тетрагидрофурана по каплям смешивали при 0°С с 16,5 мл раствора этинилмагнийбромида (0,5-молярного в тетрагидрофуране) и в течение 0,5 ч перемешивали при 0°С. Затем по каплям добавляли раствор 280 мг 11р-фтор-3-гидрокси-7а-метилэстр-1,3,5(10)-триен-17-она в 2,8 мл тетрагидрофурана и перемешивание продолжали еще в течение 3,5 ч при 0°С. Для последующей переработки добавляли насыщенный раствор хлорида аммония, затем сливали на воду, четырежды экстрагировали этилацетатом, промывали до нейтрального состояния, сушили над сульфатом натрия, концентрировали в вакууме и хроматографировали на силикагеле с использованием гекса-на/этилацетата. В результате получили 220 мг 17а-этинил-11р-фтор-7а-метилэстр-1,3,5(10)-триен-3,17р-диола с температурой плавления 115-117°С.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Микробиологический способ получения 7а-замещенных 11 а-гидроксистероидов общей формулы
4,В
4,В
в которой
R7 представляет собой группировку P-Q, где
Р обозначает ^^^килен, a Q обозначает водород, ^-^алкал или ^^^оралки, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,
R10 может находиться в а- либо р-положении и представляет собой Н, CH3 или CF3 и R13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7а-замещенный стероид общей формулы 3,А
- 14 -
008147
3,А
в которой R7, R10 и R13 имеют указанные выше значения, гидроксилируют и окисляют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp. и Rhizopus sp.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Aspergil-lus awamori, Aspergillus fischeri, Aspergillus malignus, Aspergillus niger, Beauveria bassiana, Glomerella cin-gulata, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica и Rhizopus stolonifer.
3. Микробиологический способ получения 7а-замещенных 11а-гидроксистероидов общей формулы
4,В
4,В
в которой R7 представляет собой группировку P-Q, где
Р обозначает ^^^килен, a Q обозначает водород, ^-^алкил или ^^^оралюш, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом,
R10 может находиться в а- либо р-положении и представляет собой Н, CH3 или CF3 и R13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7а-замещенный стероид общей формулы 3,А
3,А
в которой R7, R10 и R13 имеют указанные выше значения, на первой стадии микробиологического способа с использованием соответствующего микроорганизма, выбранного из группы, включающей Aspergillus sp., Beauveria sp., Gibber-ella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Metarrhizium sp., Nigrospora sp., Rhizopus sp. и Verticillium sp., гидроксилируют в положении 11а с образованием 7а-замещенного 11а-гидроксистероида общей формулы С
в которой
R7, R10 и R13 имеют указанные выше значения, затем образованный 7а-замещенный 11а
- 15 -
008147
гидроксистероид общей формулы С на второй стадии микробиологического способа с использованием другого микроорганизма, выбранного из группы, включающей Bacillus sp., Mycobacterium sp., Nocardia sp. и Pseudomonas sp., окисляют с образованием 7а-замещенного стероида общей формулы 4,В.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используемый на первой стадии микроорганизм выбран из группы, включающей Aspergillus malignus, Aspergillus melleus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Beauveria bassiana, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerellafusaroid.es, Gnomo-nia cingulata, Metarrhizium anisopliae, Nigrospora sphaerica, Rhizopus oryzae, Rhizopus stolonifer и Verticil-lium dahliae.
5. Способ по пп.3 и 4, отличающийся тем, что используемый на второй стадии микроорганизм выбран из группы, включающей Bacillus lactimorbus, Bacillus sphaericus, Mycobacterium neoaurum, Mycobac-terium smegmatis, Nocardia corallina, Nocardia globerula, Nocardia minima, Nocardia restrictus, Nocardia rubropertincta, Nocardia salmonicolor и Pseudomonas testosteroni.
6. Микробиологический способ получения 7а-замещенных 11 а-гидроксистероидов общей формулы
4,В
4,В
в которой
R7 представляет собой группировку P-Q, где
Р обозначает 01-04алкилен, a Q обозначает водород, 01-04алкил или 01-04фторалкил, и эта группировка P-Q через Р связана со стероидным каркасом, R10 представляет собой Н, CH3 или CF3 и
R13 представляет собой метил или этил, заключающийся в том, что 7а-замещенные стероиды общей формулы D
в которой
R7, R10 и R13 имеют указанные выше значения, гидроксилируют с использованием микроорганизма, выбранного из группы, включающей Beauveria sp., Curvularia sp., Gibberella sp., Glomerella sp., Gnomonia sp., Haplosporella sp., Helicostylum sp., Nigrospora sp. и Syncephalastrum sp.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что микроорганизм выбран из группы, включающей Beauveria bassiana, Curvularia lunata, Gibberella zeae, Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, Gnomonia cingulata, Haplosporella hesperedica, Helicostylum piriformae, Nigrospora sphaerica и Syncephalastrum racemosum.
8. Микробиологический способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что R7 представляет собой
CH3. 10
9. Микробиологический способ по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что R10 представляет собой Н.
10. Микробиологический способ по одному из пп.1-9, отличающийся тем, что R13 представляет собой CH3.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 16 -