EA 008105B1 20070427 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2007\TIT_PDF/008105 Титульный лист описания [PDF] EAPO2007/PDF/008105 Полный текст описания EA200200499 19960913 Регистрационный номер и дата заявки US08/528,858 19950915 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EAB1 Код вида документа [eab] EAB20702 Номер бюллетеня [RU] СЕМЕНА КРЕСТОЦВЕТНЫХ, ПОРОШОК, ЭКСТРАКТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПИЛЮЛЯ ИЛИ ТАБЛЕТКА, ДИЕТИЧЕСКИЙ И ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ, ПОВЫШАЮЩИЕ ХЕМОПРОТЕКТИВНОЕ КОЛИЧЕСТВО ФЕРМЕНТОВ ФАЗЫ 2 ИЛИ СНИЖАЮЩИЕ УРОВЕНЬ КАНЦЕРОГЕНОВ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИЕТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА Название документа A23L 1/30, A23L 1/212, A61P 35/00, A61P 5/14, A61P 39/06, A61K 36/00 Индексы МПК [US] Тэйлэли Пол, Фэйхи Джед У. Сведения об авторах [US] ДЖОНС ХОПКИНС СКУЛ ОФ МЕДСИН Сведения о патентообладателях [US] ДЖОНС ХОПКИНС СКУЛ ОФ МЕДСИН Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000008105b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

1. Семена крестоцветных, за исключением Brassica oleracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 200000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян, при этом указанные семена не содержат или содержат только нетоксичные уровни индолглюкозинолатов, продуктов их расщепления или гидроксибутенил глюкозинолатов.

2. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 300000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.

3. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 400000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.

4. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 500000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.

5. Порошок, состоящий из растительного материала, отличающийся тем, что он получен из семян по любому из пп.1-4.

6. Экстракт в нетоксичном растворителе из семян крестоцветных по любому из пп.1-4 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в указанных пунктах и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа.

7. Диетический продукт, отличающийся тем, что он содержит семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов.

8. Применение диетического продукта по п.7 для снижения уровня канцерогенов у млекопитающего.

9. Применение диетического продукта по п.7 для повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего.

10. Пилюля или таблетка, отличающаяся тем, что она содержит семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов.

11. Пилюля или таблетка по п.10, отличающаяся тем, что она предназначена для использования в способе снижения уровня канцерогенов у млекопитающего при введении млекопитающему указанной пилюли или таблетки.

12. Пилюля или таблетка по п.10, отличающаяся тем, что она предназначена для использования в способе повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего при введении млекопитающему указанной пилюли или таблетки.

13. Способ получения диетического продукта по п.7, отличающийся тем, что смешивают семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов с каким-либо съедобным ингредиентом.

14. Способ получения экстракта по п.6, заключающийся в том, что семена крестоцветных или проростки крестоцветных по любому из пп.1-4 гомогенизируют в избытке смеси диметилсульфоксида, ацетонитрила и диметилформамида при температуре, достаточной для подавления активности мирозиназы.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что соотношение диметилсульфоксид:ацетонитрил:диметилформамид составляет 1:1:1.

16. Применение семян крестоцветных по любому из пп.1-4, порошка по п.5, экстракта по п.6 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в пп.1-4 и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любой комбинации указанных компонентов для получения пищевого продукта, используемого для повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 в организме млекопитающего.

17. Применение семян крестоцветных по любому из пп.1-4, порошка по п.5, экстракта по п.6 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в пп.1-4 и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любой комбинации указанных компонентов для получения пищевого продукта, используемого для снижения уровня канцерогенов в организме млекопитающего.

 


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:
Семена крестоцветных, за исключением Brassica oleracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 200000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян, при этом указанные семена не содержат или содержат только нетоксичные уровни индолглюкозинолатов, продуктов их расщепления или гидроксибутенил глюкозинолатов.

2. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 300000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.

3. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 400000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.

4. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 500000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.

5. Порошок, состоящий из растительного материала, отличающийся тем, что он получен из семян по любому из пп.1-4.

6. Экстракт в нетоксичном растворителе из семян крестоцветных по любому из пп.1-4 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в указанных пунктах и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа.

7. Диетический продукт, отличающийся тем, что он содержит семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов.

8. Применение диетического продукта по п.7 для снижения уровня канцерогенов у млекопитающего.

9. Применение диетического продукта по п.7 для повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего.

10. Пилюля или таблетка, отличающаяся тем, что она содержит семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов.

11. Пилюля или таблетка по п.10, отличающаяся тем, что она предназначена для использования в способе снижения уровня канцерогенов у млекопитающего при введении млекопитающему указанной пилюли или таблетки.

12. Пилюля или таблетка по п.10, отличающаяся тем, что она предназначена для использования в способе повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего при введении млекопитающему указанной пилюли или таблетки.

13. Способ получения диетического продукта по п.7, отличающийся тем, что смешивают семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов с каким-либо съедобным ингредиентом.

14. Способ получения экстракта по п.6, заключающийся в том, что семена крестоцветных или проростки крестоцветных по любому из пп.1-4 гомогенизируют в избытке смеси диметилсульфоксида, ацетонитрила и диметилформамида при температуре, достаточной для подавления активности мирозиназы.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что соотношение диметилсульфоксид:ацетонитрил:диметилформамид составляет 1:1:1.

16. Применение семян крестоцветных по любому из пп.1-4, порошка по п.5, экстракта по п.6 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в пп.1-4 и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любой комбинации указанных компонентов для получения пищевого продукта, используемого для повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 в организме млекопитающего.

17. Применение семян крестоцветных по любому из пп.1-4, порошка по п.5, экстракта по п.6 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в пп.1-4 и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любой комбинации указанных компонентов для получения пищевого продукта, используемого для снижения уровня канцерогенов в организме млекопитающего.

 


008105
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к профилактической медицине, а именно к диетическому способу снижения уровня канцерогенов в организме животных и в отдельных клетках, чем достигается снижение риска развития рака. В частности, данное изобретение относится к производству и потреблению пищи, богатой хемопротективными в отношении рака соединениями. Более конкретно, данное изобретение относится к хемопротективным соединениям, которые модулируют ферменты млекопитающих, участвующие в метаболизме канцерогенов. Данное изобретение относится к пищевым источникам, которые чрезвычайно богаты соединениями, индуцирующими ферменты фазы 2 и не индуцирующими биологически значимую активность ферментов фазы 1, активирующих канцерогены.
Уровень техники
Широко известно, что диета играет важную роль в снижении риска развития рака и что увеличенное потребление фруктов и овощей снижает частоту заболеваний раком у людей. Считается, что главный защитный механизм обусловлен наличием в растениях таких химических компонентов, которые, попадая в клетки млекопитающих, повышают уровень ферментов фазы 2, участвующих в детоксикации канцерогенов.
Ранние исследования механизма хемопротекции отдельных соединений показали, что данные хе-мопротекторы индуцируют активность монооксигеназ, известных также как ферменты фазы 1 или цито-хромы Р-450. Однако Talalay и соавт. [см. "Химическая защита против рака индукцией электрофильной детоксикации" В:кн. CELLULAR AND MOLECULAR TARGETS OF CHEMOPREVENTION, L. Watten-berg и соавт., CRC Press, Boca Raton, FL, с.469-478 (1992)] показали, что введение известного хемопро-тектора - бутилированного гидоксианизола (ВНА) - грызунам приводит к незначительному изменению активности цитохромов Р-450 (ферменты фазы 1), но существенно увеличивает активность ферментов фазы 2. Ферменты фазы 2, такие как глутатионтрансферазы, НАД(Ф)Н:хинонредуктаза (QR) и глюкуро-нозилтрансферазы, детоксицируют ДНК-повреждающие электрофильные формы основных канцерогенов. Избирательные индукторы ферментов фазы 2 были обозначены как монофункциональные индукторы. См. Prochaska & Talalay, Cancer Res., 48:4776-4782 (1988). Почти все монофункциональные индукторы являются электрофилами и принадлежат к 8 различным химическим классам, включающим: 1) дифе-нолы, фенилендиамины и хиноны; 2) акцепторы реакции Михаэля, содержащие олефины или ацетилены, конъюгированные с электронсвязывающими группами; 3) изотиоцианаты; 4) 1,2-дитио-3-тионы; 5) гид-ропероксиды; 6) трехвалентные органические и неорганические производные мышьяка; 7) тяжелые металлы, обладающие аффинностью к тиоловым группам, включая Hg2+ и Cd2+; и 8) димеркаптаны. См. Prestera и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2963-2969 (1993). Единственным общим свойством всех перечисленных индукторов является их способность реагировать с тиоловыми группами.
Хемопротективные агенты могут быть использованы для снижения чувствительности млекопитающих к токсическому и неопластическому воздействию канцерогенов. Указанные хемопротекторы могут быть растительного происхождения или представлять собой синтетические соединения. Были получены синтетические аналоги встречающихся в природе индукторов и показана их способность подавлять химический канцерогенез у животных. См. Posner и соавт., J. Med. Chem., 37:170-176 (1994); Zhang и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3147-3150 (1994); Zhang и соавт., Cancer Res. (Suppl.), 54:19761981 (1994).
Разработаны высокоэффективные методы для измерения способности растительных экстрактов индуцировать и повышать активность ферментов фазы 2. См. Prochaska & Santamaria, Anal. Biochem., 169:328-336 (1988) и Prochaska и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2394-2398 (1992). Кроме того, данные методы были применены для выделения соединений, ответственных за индуцирующую активность в растениях, и для оценки антиканцерогенной активности указанных соединений и их синтетических аналогов. См. Zhang и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2399-2403 (1992); Posner и соавт., J. Med. Chem., 37:170-176 (1994).
При том, что индуцирующая активность может быть обнаружена в съедобных растениях многих различных семейств, ее величина сильно варьирует в зависимости от семейства, рода, вида, разновидности или сорта данного растения, а также в зависимости от условий произрастания и сбора.
Таким образом, существует потребность идентификации конкретных съедобных растений, а также методов их выращивания и подготовки с целью получения высоких уровней индуцирующей ферменты фазы 2 активности для хемопротекции. Кроме того, необходимо разрабатывать способы выращивания и подготовки съедобных растений, продуцирующих известный спектр специфических индукторов ферментов фазы 2 с целью повышения эффективности инактивации специфических канцерогенов или классов канцерогенов. Кроме того, существует потребность в методах скрещивания и селекции растений для повышения указанной индуцирующей активности, а также в методах выделения и анализа индукторов, продуцируемых отдельными сортами растений.
Сущность изобретения
Одним из объектов настоящего изобретения являются пищевые продукты и добавки, обогащенные хемопротективными в отношении рака соединениями.
Другим объектом изобретения являются пищевые продукты, которые содержат значительные коли
- 1 -
008105
чества индукторов ферментов фазы 2 и практически свободны от индукторов ферментов фазы 1.
Еще одним объектом настоящего изобретения являются пищевые продукты, содержащие значительные количества индукторов ферментов фазы 2 и нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления, а также вызывающих образование зоба (струмогенных) гидроксибутенил глюко-зинолатов.
Следующим объектом изобретения являются семена крестоцветных, за исключением Brassica ol-eracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, или порошок, полученный из указанных семян, которые содержат высокий индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал.
Получение указанных и других продуктов достигается использованием семян, порошка из семян или проростков крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранных перед стадией второго листа. Под проростками крестоцветных подразумеваются проростки Brassica oleracea разновидностей acephala, alboglabra, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, almifolia, ramosa, sabauda, sabellica и selensia.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения получают проростки крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранные перед стадией второго листа, при том, что проростки практически свободны от потенциала, индуцирующего ферменты фазы 1.
В еще одном варианте осуществления изобретения получают экстракт в нетоксичном растворителе из семян или проростков крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранных перед стадией второго листа. Нетоксичный экстракт может быть водным экстрактом. Кроме того, водный экстракт может содержать соединение крестоцветных, например, рода Raphanus, включающее активный фермент мирозиназу.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения получают пищевой продукт, содержащий семена, порошок из семян или проростки крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранных до стадии второго листа; экстракты проростков или семян крестоцветных; или любые комбинации семян, порошка из семян, проростков или экстрактов в нетоксичном растворителе.
Кроме того, изобретение обеспечивает способ повышения хемопротективной активности ферментов фазы 2 у млекопитающих, включающий применение эффективного количества проростков крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранных перед стадией второго листа.
Изобретение также обеспечивает способ повышения хемопротективной активности ферментов фазы 2 у млекопитающих, включающий применение эффективного количества пищевого продукта, содержащего проростки крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранных перед стадией второго листа.
В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ получения проростков крестоцветных, за исключением Brassica oleracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Rapha-nus sativus, включающий проращивание соответствующих семян и сбор проростков до стадии второго листа или на этой стадии с получением проростков, обогащенных соединениями, индуцирующими активность ферментов фазы 2 при измерении через три дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащих нетоксичные уровни индолглюкозинолатов, продуктов их расщепления и гидроксибутенил глюкозинолатов, вызывающих образование зоба. Проростки крестоцветных представляют собой проростки Brassica oleracea разновидностей acephala, alboglarba, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, palmifolia, ramosa, sabauda, sabellica и selensia.
В другом варианте осуществления изобретения получают пищевой продукт, содержащий проростки крестоцветных, собранные перед стадией второго листа, содержащие по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через 3 дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащие нетоксичные уровни индолглю-козинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов, а также любые комбинации проростков или экстрактов.
Изобретение также относится к проросткам крестоцветных, за исключением Brassica oleracea capi-tata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, собранным перед стадией второго листа, обогащенным соединениями, индуцирующими активность ферментов фазы 2, например, содержащим по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащим нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов и практически свободным от индуцирующего ферменты фазы 1 потенциала.
Изобретение также относится к полученному с помощью нетоксичного растворителя экстракту из семян крестоцветных или проростков крестоцветных, за исключением проростков Brassica oleracea capi-tata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, собранных между стадией начала прорастания и стадией второго листа или на этой стадии. Композицию глюкозинолатов и изотиоциана-тов получают из данного экстракта в нетоксичном растворителе семян или проростков крестоцветных, собранных перед стадией второго листа, содержащих по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания се
- 2 -
008105
мян, которые образуют указанные проростки, и содержащих нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов. Экстракт в нетоксичном растворителе может быть водным экстрактом. Кроме того, водный экстракт может содержать соединение крестоцветных, например, рода Raphanus, представляющее собой активный фермент мирозиназу.
Изобретение также относится к способу увеличения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающих, включающему введение эффективного количества проростков, собранных перед стадией второго листа, содержащих по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащих нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов.
Изобретение также относится к способу увеличения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающих, включающему введение эффективного количества пищевого продукта, который содержит проростки, собранные перед стадией второго листа, содержащие по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащие нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривает разработку способа получения пищевого продукта, обогащенного глюкозинолатами и содержащего семена крестоцветных, полученный из этих семян порошок, нетоксичный экстракт, полученный с помощью растворителя, проростки крестоцветных, собранные перед стадией второго листа, причем способ предусматривает введение указанных семян крестоцветных, порошка из этих семян, экстракта в нетоксичном растворителе, проростков или любой их комбинации в другой съедобный ингредиент, причем указанные семена, порошок, экстракт в нетоксичном растворителе или проростки богаты глюкозинолатами. Под проростками крестоцветных подразумеваются проростки Brassica oleracea разновидностей acephala, alboglabra, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, palmifolia, ramosa, sabauda, sabellica и selensia, содержащие нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидрокси-бутенил глюкозинолатов.
Изобретение также относится к пищевому диетическому продукту, обогащенному глюкозинолата-ми, используемому для увеличения хемопротективного количества ферментов фазы 2 или снижения уровня канцерогенов в организме млекопитающего при потреблении данного продукта и полученному с помощью указанного способа. Данный пищевой продукт согласно изобретению содержит семена крестоцветных, порошок, полученный из этих семян, экстракт в нетоксичном растворителе, проростки крестоцветных, за исключением проростков Brassica oleracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, собранные между стадией начала прорастания и стадией второго листа или на этой стадии, или любую комбинацию указанных семян, указанного порошка, полученного из указанных семян, указанных экстрактов в нетоксичных растворителях или указанных проростков.
Изобретение также относится к пилюле или таблетке, содержащей семена крестоцветных, порошок, полученный из этих семян, экстракт в нетоксичном растворителе, проростки крестоцветных, за исключением проростков Brassica oleracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, собранные между стадией начала прорастания и стадией второго листа или на этой стадии, или любую комбинацию указанных семян, порошка, полученного из указанных семян, экстрактов в нетоксичных растворителях или проростков. Пилюли или таблетки могут быть использованы в способе снижения уровня канцерогенов у млекопитающего при введении млекопитающему указанных пилюль или таблеток. Пилюли или таблетки могут быть использованы в способе повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего при введении млекопитающему указанных пилюль или таблеток.
Изобретение также относится к способу получения композиции глюкозинолатов и изотиоцианатов, включающему экстрагирование глюкозинолатов и изотиоцианатов из проростков крестоцветных, за исключением капусты, кресса, горчицы и редьки, собранных перед стадией второго листа, с помощью нетоксичного растворителя и выделение экстрагированных глюкозинолатов и изотиоцианатов из экстракта. Фермент мирозиназу или содержащее данный фермент соединение крестоцветных, например, вида Rap-hanus смешивают с проростками крестоцветных, экстрактом или с проростками и экстрактом.
Кроме того, изобретение относится к способу получения пищевых продуктов, обогащенных глюко-зинолатами, включающему проращивание семян крестоцветных, содержащих по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащих нетоксичные уровни индолглюкозинатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов, и сбор проростков перед стадией второго листа с приготовлением пищевых продуктов, содержащих многочисленные проростки. Семена могут принадлежать Brassica oleracea, включая разновидности acephala, alboglabra, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, palmifolia, ramosa, sabauda, sabellica и selensia.
Изобретение также относится к пищевому продукту, обогащенному глюкозинолатами, полученно
- 3 -
008105
му путем проращивания семян крестоцветных, содержащих по крайней мере 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащих нетоксичные уровни индолглюко-зинолатов и продуктов их расщепления и струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов, и сбором проростков перед стадией второго листа с приготовлением пищевого продукта, содержащего многочисленные проростки. Пищевой продукт содержит нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления, а также струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов.
Изобретение также относится к способу получения пищевого продукта, включающему экстрагирование глюкозинолатов и изотиоцианатов с помощью растворителя из семян, проростков, растений или частей растений крестоцветных, при том, что семена, используемые для получения проростков, растений или частей растений, содержат не менее 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении через три дня после проращивания семян, и данные семена, проростки, растения или части растений содержат нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления, а также струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов, и выделение экстрагированных глюкозинолатов и изотиоцианатов. Нетоксичным экстрагирующим растворителем может быть вода. Фермент мирозиназу или соединение крестоцветных, содержащее данный фермент, например, вида Rap-hanus, смешивают с проростками крестоцветных, семенами, растениями или частями растений, или с экстрактами, или с любой их комбинацией.
Изобретение также относится к способу снижения уровня канцерогенов у млекопитающих, включающему применение проростков крестоцветных, за исключением проростков капусты, кресса, горчицы и редьки.
Изобретение также относится к способу снижения уровня канцерогенов у млекопитающих, включающему применение проростков крестоцветных, содержащих не менее 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении на третий день после проращивания семян, которые образуют указанные проростки, и содержащих нетоксичные уровни индолглюкозинола-тов и продуктов их расщепления, а также струмогенных гидроксибутенил глюкозинолатов.
Кроме того, изобретение относится к способу получения пищевого продукта путем введения в съедобный ингредиент семян крестоцветных, содержащих не менее 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении на третий день после проращивания и нетоксичные уровни индолглюкозинолатов и продуктов их расщепления, а также струмогенных гидроксибу-тенил глюкозинолатов.
Изобретение также относится к способу экстрагирования глюкозинолатов и изотиоцианатов из растительной ткани, включающему в себя гомогенизирование растительной ткани в избытке смеси диме-тилсульфоксида, ацетонитрила и диметилформамида (DMF/ACN/DMSO) при температуре, достаточной для подавления активности мирозиназы.
Изобретение также относится к проросткам крестоцветных, собранных перед стадией 2-го листа, при том, что соотношение монофункциональных и бифункциональных индукторов в них составляет не менее 20 к 1.
Другим объектом настоящего изобретения является пищевой продукт, дополнительно содержащий очищенный или частично очищенный глюкозинолат.
Другие объекты, особенности и преимущества настоящего изобретения станут более ясными из дальнейшего подробного описания. Однако необходимо понимать, что подробное описание и конкретные примеры, относящиеся к предпочтительным вариантам осуществления изобретения, приведены здесь только в иллюстративных целях, поскольку различные изменения и модификации, которые не выходят за рамки изобретения, будут очевидны для специалиста из последующего описания.
Перечень фигур чертежей и иных материалов
На фиг. 1 показан общий индуцирующий потенциал органических экстрактов (полученных с помощью растворителя) культивируемых растений брокколи и дайкона как функция возраста растения.
На фиг. 2 приведены ЯМР-спектры высокого разрешения выделенных глюкозинолатов, полученных из 3-дневных проростков брокколи сорта Сага путем горячей водной экстракции.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
I. Определения
В описании многие термины используются в расширенном значении. Последующие определения приведены для облегчения понимания изобретения.
Бифункциональный индуктор - это молекула, которая повышает активность как ферментов фазы 1 (цитохромы Р-450), так и ферментов фазы 2, и для проявления действия которой необходимо участие арилгидрокарбонового (Ah) рецептора и родственного ему ксенобиотик-отвечающего элемента (XRE). Примерами таких индукторов служат плоские пленарные ароматические соединения, такие как полициклические гидрокарбоны, азокрасители или 2,3,7,8-тетрахлородибензо-п-диоксин (TCDD).
Хемопротектор или хемопротектант представляет собой синтетический или природный химический агент, который уменьшает чувствительность млекопитающих к токсическому и неопластическому действию канцерогенов.
- 4 -
008105
Под пищевым продуктом понимается любая съедобная субстанция, содержащая заявленные в настоящем изобретении проростки, или экстракты или препараты, приготовленные из указанных проростков, которая способна доставлять индукторы фазы 2 млекопитающим, съедающим данный пищевой продукт. Пищевой продукт может быть свежеприготовленным, и представлять собой, например, салаты, напитки или сэндвичи, содержащие заявленные проростки. Альтернативно, продукт, содержащий заявленные в настоящем изобретении проростки, может быть высушен, зажарен, сварен, лиофилизирован или запечен. Среди огромного многообразия предлагаемых продуктов находятся хлеб, чаи, супы, смеси злаков, пилюли и таблетки.
Индуцирующая активность или индуцирующая активность по отношению к ферментам фазы 2 служит мерой способности соединения (соединений) индуцировать активность ферментов фазы 2. В настоящем изобретении индуцирующую активность измеряют посредством определения QR-активности в биологическом тесте на клетках мышиной гепатомы in vitro. Соответственно, индуцирующую активность определяют как индуцирующую QR-активность в клетках Нера 1с1с7 (клетки мышиной гепатомы), инкубированных с экстрактами проростков, семян или других частей растений, не обработанных миро-зиназой. Индуцирующую активность измеряют в клетках мышиной гепатомы Нера 1с1 с7, выращиваемых в 96-луночных планшетах. Обычно в каждую ячейку планшета вводят 10000 клеток Нера 1с1с7. Клетки гепатомы выращивают в течение 24 ч, а затем в каждую ячейку вносят последовательные разведения растительного экстракта, содержащего микрограммовые количества свежей растительной ткани. Разведения готовят на свежей среде, содержащей 0,15 мл культуральной среды альфа-MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также пенициллина и стрептомицина. Клетки инкубируют еще 48 ч. QR-активность (на основании образования восстановленого сине-коричневого красителя тетра-золия) измеряют при помощи оптического сканера микротитровальных планшетов в клеточных лизатах, приготовленных в одном планшете, и соотносят с концентрацией белка. Количественную информацию о специфической QR-активности получают при компьютерном анализе величин поглощения. Одна единица индуцирующей активности соответствует такому количеству, которое при добавлении в одну ячейку планшета приводит к удвоению QR-активности (см. Prochaska & Santamaria, Anal. Biochem., 169:328-336 (1988). Prochaska и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2394-2398 (1992)).
Индуцирующий потенциал или индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал служит мерой комбинированных количеств индуцирующей активности в растительной ткани, обусловленной изотиоцианата-ми и глюкозинолатами, которые могут быть конвертированы мирозиназой в изотиоцианаты. Глюкозино-латы сами по себе не являются индукторами ферментов фазы 2 у млекопитающих, при том что изотио-цианаты являются такими индукторами. Таким образом, индуцирующий потенциал определяют как QR-активность в клетках мышиной гепатомы Нера 1с1 с7, инкубированных с обработанными мирозиназой экстрактами проростков, семян или других частей растений. В настоящем изобретении индуцирующий потенциал измеряют при биологическом тестировании QR-активности в клетках мышиной гепатомы in vitro, как описано выше. Индуцирующий потенциал измеряют с использованием клеток мышиной гепа-томы Нера 1 с1 с7, выращиваемых в 96-луночных планшетах. Обычно в каждую ячейку планшета вводят 10000 клеток Нера 1 с1 с7. Клетки гепатомы выращивают в течение 24 ч, а затем в каждую ячейку вносят последовательные разведения растительного экстракта, содержащего микрограммовые количества свежей растительной ткани. Разведения готовят на свежей культуральной среде, содержащей 0,15 мл куль-туральной среды альфа-MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также пенициллина и стрептомицина. К растительному экстракту добавляют мирозиназу (6 единиц на 1 мл растительного экстракта). Мирозиназу очищают согласно модифицированному методу Palmieri и соавт. (Anal. Bio-chem., 35:320-324 (1982)) из 7-дневньгх проростков дайкона, выращенных на агаровой подложке, не содержащей дополнительных питательных веществ. После 234-кратной очистки мирозиназа имеет специфическую активность 64 единицы/мг белка [единица = количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкмоля синигрина в минуту]. Растительный экстракт первоначально разводят в 200 раз в лунках планшета, а затем осуществляют 7 последовательных разведений. Клетки инкубируют еще 48 ч. QR-активность (на основании образования восстановленого сине-коричневого красителя тетразолия) измеряют при помощи оптического сканера микротитровальных планшетов в клеточных лизатах, приготовленных в одном планшете, и соотносят с концентрацией белка. Количественную информацию о специфической QR-активности получают при компьютерном анализе величин поглощения. Одна единица индуцирующего потенциала соответствует такому количеству, которое при добавлении в одну ячейку планшета приводит к удвоению QR-активности (см. Prochaska & Santamaria, Anal. Biochem., 169:328-336 (1988). Prochaska и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2394-2398 (1992)).
Монофункциональный индуктор селективно повышает активность ферментов фазы 2 без существенного изменения активности ферментов фазы 1. Монофункциональные индукторы не зависят от функционального Ah-рецептора, но усиливают транскрипцию ферментов фазы 2 посредством элемента, отвечающего на антиоксиданты (ARE).
Под проростками крестоцветных понимают растение или рассаду на ранних стадиях развития, непосредственно следующими за прорастанием семян. Семена крестоцветных помещают в такие условия, в которых они успешно прорастают и развиваются. Заявленные в настоящем изобретении проростки кре
- 5 -
008105
стоцветных собирают вскоре после прорастания семян до стадии второго листа или на этой стадии. Заявленные в настоящем изобретении проростки крестоцветных содержат индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал в количестве не менее 200000 единиц на 1 г свежей массы при измерении на третий день после выращивания в условиях, обеспечивающих прорастание и развитие семян. II. Описание
Основной механизм защитного действия фруктов и овощей, заключающийся в снижении частоты опухолей у людей, зависит от минорных химических компонентов, которые при поступлении в клетки млекопитающих повышают уровни ферментов фазы 2, детоксифицирующих канцерогены. Показано, что антиканцерогенная активность отдельных съедобных растений может быть повышена. Такие растения, как Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) обычно не собирают до тех пор, пока они не образуют головки. Путем культивирования данных растений только до стадии проростка, т.е. с начала герми-нации до стадии 2-го листа, удается повысить количество индукторов ферментов, которые детоксифици-руют канцерогены и защищают от по меньшей мере в пять раз по сравнению с овощами того же сорта, собранными на товарной стадии. Может наблюдаться и 10-1000-кратное повышение.
Сбор растений на стадиях ранних проростков или остановка их роста любым другим способом приводит к повышению индуцирующего потенциала и к получению пищевого продукта, к которому потребители уже привыкли. Индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал подобных проростков может быть в несколько сот раз выше в сравнении с таковым у взрослых растений товарной стадии, полученных из тех же семян. Таким образом, появляется возможность получения людьми того же количества индуцирующего потенциала при потреблении относительно небольшого количества проростков, а не значительных количеств овощей обычной товарной стадии.
Показано, что в значительной мере индуцирующий потенциал крестоцветных обусловлен наличием в них изотиоцианатов и их биологических предшественников глюкозинолатов. Глюкозинолаты превращаются в изотиоцианаты под действием фермента мирозиназы, которая является тиоглюкозидазой. Обычно мирозиназа и глюкозинолаты в клетке разделены, но при повреждении клетки, с утратой ком-партментализации, мирозиназа входит в контакт с глюкозинолатами, которые затем превращаются в изо-тиоцианаты.
Для проверки большого количества съедобных растений и оценки воздействия изменений окружающей среды на индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал данных растений было необходимо усовершенствовать ранее описанные методы гомогенизации и экстракции. Ранее описанные методы экстракции индукторов фазы 2 из овощей включали гомогенизацию овощей в холодной воде, лиофилиза-цию, экстракцию полученного порошка ацетонитрилом, фильтрацию и концентрацию упариванием. Pro-
chaska и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2394-2398 (1992).
После идентификации сульфорафана из брокколи в качестве главного индуктора ферментов фазы 2, были проведены сравнительные экстракции горячим 80% метанолом, в которых была обнаружена аналогичная индуцирующая активность, как и в упомянутых выше ацетонитрильных экстрактах. Когда к этим метанольным экстрактам, в которых растворены глюкозинолаты, добавляют мирозиназу, наблюдается резкое усиление индуцирующией активности, присущей данным экстрактам (данные суммированы в табл. 1). Таким образом, намеренное превращение глюкозинолатов в изотиоцианаты с использованием экзогенной мирозиназы может служить хорошим указанием на присутствие в тестируемых растениях индукторов ферментов фазы 2. Стало понятным, что большая часть потенциальных индукторов в крестоцветных обычно присутствует в растениях в виде глюкозинолатных предшественников изотиоциана-тов.
Преобладание глюкозинолатов и та быстрота, с которой они переходят в изотиоцианаты при повреждении тканей крестоцветного растения, привели к разработке усовершенствованного метода экстракции. Путем подбора смесей растворителей и оценки активности водных гомогенатов и гомогенатов в растворителях, полученных из свежих растений, была разработана процедура, позволяющая проводить количественное определение глюкозинолата и изотиоцианата в одном и том же неконцентрированном образце. Помимо того, что концентрация выпариванием является лимитирующим по скорости этапом всей процедуры экстракции, она еще дает возможность летучим индукторам избежать обнаружения. Усовершенствованный метод более прост и эффективен и требует лишь полной гомогенизации растительного образца в растворителе. Использование данного метода позволило авторам настоящего изобретения продемонстрировать резкое увеличение выхода индуцирующей активности и индуцирующего потенциала из крестоцветных растений по сравнению с ранее описанными методами.
Свежесобранные овощи быстро и осторожно помещают непосредственно в органические растворители, представляющие собой смесь DMF/ACN/DMSO, при температуре, подавляющей активность миро-зиназы.
Глюкозинолаты и изотиоцианаты эффективно экстрагируются смесью органических растворителей. Предпочтительно смешивать DMF, ACN и DMSO в равных объемах. Однако пропорции трех растворителей в смеси могут варьировать для оптимизации экстракции специфических глюкозинолатов и изотио-цианатов из любой растительной ткани. Предпочтительно, чтобы температура экстракционной смеси была ниже 0°С, а наиболее предпочтительно - ниже -50°С. Температура экстрагирующего растворителя
- 6 -
008105
должна оставаться выше точки замерзания. В то же время фермент мирозиназа, который неизбежно сопутствует данным растительным компонентам и быстро превращает глюкозинолаты в изотиоцианаты, неактивен. Подобные экстракты обычно содержат большие количества глюкозинолатов и пренебрежимо малые количества изотиоцианатов. Активность мирозиназы in planta варьирует в зависимости от различных видов растений.
Глюкозинолаты сами по себе не являются индукторами ферментов фазы 2 у млекопитающих, при том, что изотиоцианаты являются монофункциональными индукторами при биологическом определении QR-активности в клетках мышиной гепатомы. Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, в отличие от индуцирующей активности, может быть количественно определен добавлением в тест-систему очищенной мирозиназы, полученной из того же или другого растительного источника.
У человека глюкозинолаты по меньшей мере частично конвертируются в изотиоцианаты. Однако, если желательно усилить эту конверсию, проростки брокколи или других растений могут быть смешаны с мирозиназой. Смесь может быть приготовлена в воде или другом нетоксичном растворителе, не инак-тивирующем мирозиназу. Мирозиназа может быть в виде частично или полностью очищенного препарата. Альтернативно, мирозиназа может присутствовать в растительной ткани, например в богатых миро-зиназой проростках крестоцветных, включая Raphanus sativus или дайкон. Подобный препарат можно использовать для приготовления "супа" для потребления человеком, богатого изотиоцианатами, но почти лишенного глюкозинолатов. Индуцирующий потенциал может быть определен путем измерения специфической QR-активности in vitro в многолуночных планшетах с клетками мышиной гепатомы, как описано выше.
Отношение монофункциональной и бифункциональной индуцирующих активностей в растительной ткани определяют путем биологического тестирования растительных экстрактов, как описано выше, не только с использованием клеток Нера 1 с1 с7 дикого типа, но также и мутантных клеток, обозначенных с1 и ВРс1, которые имеют соответственно дефектные рецепторы Ah или дефектные гены цитохрома Р-450. Prochaska & Talalay, Cancer Res., 48:4776-4782 (1988).
Согласно настоящему изобретению, собранные проростки могут быть включены непосредственно в пищевые продукты, такие как свежие салаты, сэндвичи или напитки. Развитие проростка может быть остановлено активным вмешательством человека, например, путем охлаждения перед стадией 2-го листа, обычно между 1-м и 14-м днями роста. Остановка роста может быть достигнута путем лишения проростка субстрата и/или источника воды. Замораживание, высушивание, запекание, жарка, лиофилизация и кипячение - вот те обработки, которые наряду с другими можно использовать для остановки роста. Они могут быть полезны как для сохранения активности мирозиназы в проростке (например, лиофилизация), так и для инактивации мирозиназы (например, кипячение), в зависимости от конкретного применения.
До введения в пищевой продукт проростки могут быть подвергнуты созреванию в различных ростовых условиях. Например, проросток может быть собран на очень ранней стадии развития, всего лишь на первый или второй день после прорастания семени. Затем проростку можно дать созреть в различных условиях, таких как пониженная или повышенная интенсивность освещения, температура или влажность, обработка ультрафиолетовым облучением или другими стрессовыми воздействиями, добавление экзогенных питательных веществ или регуляторов роста растений (гормонов). Затем проростки немедленно включают в пищу, например в салаты. Напротив, развитие проростков может быть остановлено и сами они подвергнуты различным обработкам, например лиофилизации, высушиванию, экстрагированию водой и другими растворителями, замораживанию, запеканию, жарке, кипячению и т. д.
Проросток пригоден для потребления человеком, если к нему не прилипло или не прикрепилось несъедобного субстрата, такого как земля. Обычно проростки выращивают на плотной непищевой подложке, такой как агар, бумажные полотенца, промокательная бумага, Вермикулит, Перлит и т. д. при достаточной освещенности и достаточном количестве воды. Таким образом, если проростки выращивают не в земле, а на плотной подложке, нет необходимости отмывать несъедобную землю. Если проростки выращивают на особенно плотной подложке, такой как земля, Вермикулит или Перлит, может потребоваться отмывка, чтобы проростки стали пригодными для потребления человеком.
Проростки могут быть выращены в удобных для транспортировки и продажи контейнерах. Обычно подобные контейнеры представляют собой пластиковые коробки или банки с влажной подушечкой на дне. Контейнеры позволяют проникать свету, являясь вместе с тем механическим защитным барьером. Известны многочисленные методы культивирования проростков; примеры их приведены в патентах США No. 3,733,745; 3,643,376; 3,945,148; 4,130,964; 4,292,760 или 4,086,725. Пищевые продукты, содержащие заявленные в настоящем изобретении проростки, наряду с другими продуктами можно хранить и транспортировать в различных контейнерах, таких как банки, пакеты и коробки.
Проростки, служащие источником хемипротектантов против рака, обычно являются проростками крестоцветных, за исключением проростков капусты (Brassica oleracea capitata), кресса (Lepidium sativum), горчицы (Sinapis alba и S. niger) и редьки (Raphanus sativus). Обычно для получения проростков используют представителей семейства Criciferae, вида Brassiceae подвида Brassicinae. Предпочтительно используют проростки Brassica oleracea, выбранные из следующих разновидностей: acephala (капуста, коллардс, дикая капуста, курчавая капуста), medullosa (кормовая мозговая капуста), ramosa (тысячеголо
- 7 -
008105
вая капуста), alboglabra (китайская капуста), botrytis (цветная капуста, проростковая брокколи), costata (португальская капуста), gemmifera (брюссельская капуста), gongylodes (кольраби), italica (брокколи), palmifolia (Джерсейская или кормовая капуста), sabauda (савойская капуста), sabellica (коллардс) и selen-sia (листовая капуста). Возможно использование и других разновидностей.
Наиболее полезными сортами брокколи для использования в целях настоящего изобретения являются сорта Сага, ДеСикко, Эверест, Эмералд Сити, Пэкман, Корвет, Денди ранний, Император, Меринер, Грин Комет, Грин Вэлиант, Аркадия, Калабрезе Каравел, Ченселлор, Ситейшн, Крузер, Красная стрела проростковый, Эврика, Эксцельсиор, Галеон, Гинга, Голиаф, Грин Дьюк, Гринбелт, Интальянский про-ростковый, Поздний пурпурный проростковый, Поздний зимний проростковый Белая Звезда, Легенда, Лепрешо, Марафон, Минарет (Романеско), Парагон, Патриот, Премиум Кроп, Рэпайн (Спринг Рааб), Ро-залинд, Сэлад (Фолл Рааб), Самурай, Шогун, Спринтер, Султан, Тайко и Трикси. Однако пригодны и многие другие сорта брокколи.
Наиболее полезными сортами цветной капусты являются сорта Аотверда, Эмейзинг, Анды, Бургундская Королева, Кэндид Шарм, Кашмир, Белый Рождественский, Доминант, Элби, Суперранний Сно-убол, Фримонт, Инклайн, Милуоки Миньютмен, Рашмор, S-207, Серрано, Сьерра Невада, Сирия, Снежная Корона, Снежные Хлопья, Сноу Грейс, Сноубред, Солид, Тайпан, Вайолет Куин, Уайт Бэрон, Уайт Бишоп, Уайт Контесса, Уайт Корона, Уайт Дав, Уайт Флэш, Уайт Фокс, Уайт Найт, Уайт Лайт, Уайт Ку-ин, Уайт Рок, Уайт Сэйлс, Уайт Саммер, Уайт Топ, Юкон. Однако пригодны и многие другие сорта цветной капусты.
Подходящие проростки должны содержать индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал в количестве не менее 200000 единиц на грамм свежей массы при измерении на 3-й день инкубации в условиях, в которых семена прорастают и развиваются. Предпочтительно, проростки должны содержать индуцирующий потенциал в количестве не менее 250000 единиц на 1 г свежей массы, или даже 300000 единиц, 350000 единиц, 400000 единиц или 450000 единиц. В отдельных образцах было обнаружено более 500000 единиц на 1 г свежей массы на 3-й день после проращивания семян.
Уровень индуцирующей активности и индуцирующего потенциала варьирует среди крестоцветных и даже среди их сортов. Наиболее предпочтительны проростки, практически свободные от индолглюко-зинолатов и продуктов их расщепления, которые в клетках млекопитающих обладают индуцирующим ферменты фазы 1 потенциалом, и практически свободные от токсичных количеств струмогенных нитрилов и таких глюкозинолатов, как гидроксибутенил глюкозинолаты, которые при гидролизе образуют струмогенные оксазолидонетионы. Зрелые проростки брюссельской капусты и рапса богаты подобными нежелательными глюкозинолатами.
Нетоксичные экстракты в растворителях, полученные согласно настоящему изобретению, могут быть использованы для приготовления полезных настоев и супов. В число нетоксичных или легко удаляемых растворителей, используемых для экстракции согласно настоящему изобретению, входят вода, жидкая двуокись углерода, этанол и другие растворители. Экстракцию проростков можно проводить холодной, теплой или, предпочтительно, горячей или кипящей водой, которая денатурирует мирозиназу. После экстракции ростки могут быть удалены из экстракта или оставлены в нем. Процедура экстракции может быть использована для инактивации мирозиназы, присутствующей в проростках. Подобная инактивация может способствовать сохранению индуцирующего потенциала. Экстракт можно употреблять в пищу сам по себе или подвергать дальнейшей обработке. Например, экстракт можно выпарить с получением сухого экстрагированного продукта. Он может быть охлажден, заморожен или лиофилизирован. Он может быть смешан с соединениями растений семейства крестоцветных, содержащими активный фермент мирозиназу. Это облегчит конверсию глюкозинолатов в изотиоцианаты до употребления продукта в пищу. Растения, содержащие активную мирозиназу, принадлежат к роду Raphanus. Это, в частности, дайкон, разновидность редьки.
Наряду с проростками семена весьма богаты индуцирующим потенциалом. Поэтому в объем настоящего изобретения включено использование семян крестоцветных в качестве пищевых продуктов. Подходящие семена крестоцветных можно смолоть в муку (порошок) и использовать в качестве добавок к пище или напиткам. Подобная мука может добавляться при выпечке хлеба и других хлебобулочных изделий, добавляться в напитки и коктейли. Альтернативно, семена можно экстрагировать нетоксичным растворителем, таким как вода, жидкая двуокись углерода или спирт, для приготовления супов, чаев и других напитков и настоев. Семена можно также использовать в пищу и без размола. Семена можно использовать в различных блюдах и продуктах, таких как салаты, мюсли, хлеб и другая выпечка и т. д.
Согласно настоящему изобретению, в состав пищевых продуктов могут вводиться проростки, семена или экстракты проростков или семян, полученные или приготовленные от одного или нескольких различных крестоцветных растений различных родов, видов, разновидностей или сортов. Показано, что генетически различные крестоцветные продуцируют химически различные индукторы ферментов фазы 2. Различные индукторы ферментов фазы 2 детоксицируют различные канцерогены с различной скоростью. Поэтому пищевые продукты, включающие генетически различные проростки или семена, или экстракты, или препараты, приготовленные из этих проростков или семян, будут детоксицировать более широкий ряд канцерогенов.
- 8 -
008105
Глюкозинолаты и/или изотиоцианаты можно выделять из семян или растительных экстрактов при помощи методов, хорошо известных из уровня техники. См. Fenwick и coaвт., CRC Crit. Rez. Food Sci. Nutr., 18:123-201 (1983) Zhang и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2399-2403 (1992). Очищенные или частично очищенные глюкозинолаты или изотиоцианаты можно вводить в пищевые продукты в качестве добавки. Доза глюкозинолата и/или изотиоцианата, вводимого в пищевые продукты, находится в интервале от 1 до 1000 мкмоль. Однако величина добавок глюкозинолата и/или изотиоцианата к пищевым продуктам может быть и выше.
Отбор растений, чьи проростки, семена или другие части обладают высоким потенциалом индукции ферментов фазы 2, может стать частью программ по селекции Cruciferae. Кроме того, целью тех же программ может стать идентификация и отбор сортов, продуцирующих специфические индукторы ферментов фазы 2, или определенного спектра индукторов. Стратегия скрещивания, селекции выведения новых сортов Cruciferae хорошо известна специалистам в данной области исследований. Brassica Crops and Wild Allies: Biology & Breeding; S. Tsunoda и соавт., (eds), Japan Scientific Societies Press, Tokyo, с. 354 (1980). Полученные растения проверяют на активность индукторов фазы 2 или на химическую идентичность специфических индукторов ферментов фазы 2, продуцируемых конкретным растением на различных фазах роста. Определяют растения, представляющие интерес, и усиливают нужные признаки или сочетают их с другими агрономическими характеристиками с использованием методов, хорошо известных из уровня техники.
Пример 1. Сравнение индуцирующего потенциала побегов крестоцветных.
Первоначально проводили поверхностную стерилизацию семян различных видов семейства крестоцветных обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором гипохлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на 1 см2 на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 1-9 дней. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры. Семена и проростки инкубировали при следующем дневном цикле: 16 ч освещения при 25°С и 8 ч темноты при 20°С.
После 3-х дней инкубации проростки собирали и немедленно помещали в 10 объемов смеси DMF/ACN/DMSO (равное сотношение компонентов) при -50°С. Данная смесь растворителей имеет точку замерзания около -33°С, но при добавлении около 10% воды, а именно столько ее содержится в растительном материале, точка замерзания опускается ниже -64°С. При смешивании с растительным материалом действительная точка замерзания опускается еще ниже.
Гомогенизацию проводили или вручную, растирая образцы в стеклянном гомогенизаторе в небольшом количестве растворителя с постепенным добавлением большего количества растворителя, или же образцы гомогенизировали в 10 объемах растворителя в гомогенизаторе Бринкман Политрон в течение 1 мин при половинной мощности. Гомогенат центрифугировали для удаления плотного материала и хранили при -20°С до тестирования.
Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, приготовленных как описанно выше, определяли биологическим методом в микротитровальных планшетах, как описано в разделе "Определения".
Проростки брокколи и цветной капусты, собранные и протестированные после трех дней проращивания семян, содержат более 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала. С другой стороны, капуста, редька, горчица и кресс содержат менее 200000 единиц на 1 г свежей массы индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала при измерении в те же временные сроки.
Пример 2. Вариации в индуцирующем потенциале среди различных сортов брокколи.
Имеются вариации в индуцирующем потенциале в зависимости от сорта брокколи. Кроме того, значительная доля индуцирующего потенциала в крестоцветных присутствует в виде предшественников глюкозинолатов. Индуцирующую активность и индуцирующий потенциал головок брокколи товарной стадии определяли после соответствующей экстракции DMF/ACN/DMSO и исследовали QR-активность, как описано выше.
Биологическое тестирование гомогенатов головок брокколи товарной стадии с добавлением или без добавления очищенной растительной мирозиназы показало, что величина QR-активности в отсутствие мирозиназы была на 5% ниже, чем при ее добавлении. Данные наблюдения подтверждают ранние предположения (см. Matile и соавт., Biochem. Physiol. Pflanzen, 179:5-12 (1984)) о том, что неповрежденные растения практически не содержат свободных изотиоцианатов.
- 9 -
008105
Таблица 1
Воздействие мирозиназы на индуцирующую активность головок брокколи товарной стадии
Сорт
Единицы на грамм растения (влажный вес) брокколи
- мирозиназа
+ мирозиназа
ДеСикко
5882
37037
Калабрезе Корвет
1250
41666
Эверест
8333
Денди Ранний
20000
Император
13333
Эмералд Сити
5000
13333
12500
* Ниже предела обнаружения (833 ед./г).
Как видно из табл. 1, значительная доля растительного индуцирующего потенциала обусловлена гидролизом глюкозинолатов мирозиназой с образованием изотиоцианатов. Таким образом, гидролиз необходим для биологической активности.
Пример 3. Индуцирующий потенциал достигает наивысших значений в семенах и снижается по мере созревания ростков.
Индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал наиболее высок в семенах и постепенно снижается в ходе культивирования рассады. Первоначально проводили поверхностную стерилизацию семян Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) сортов Сага и ДеСикко обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором гипохлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на 1 см2 на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С).
Ежедневно собирали растения с поверхности агара в нескольких контейнерах. Растения собирали быстро и осторожно, чтобы минимизировать гидролиз глюкозинолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Образцы, состоящие приблизительно из 40 проростков, гомогенизировали в 10 объемах растворителя DMF/ACN/DMSO при -50°С. При этом растворялся почти весь нелигноцеллюлозный растительный материал.
Собранные растения гомогенизировали и определяли QR-активность с добавлением или без добавления мирозиназы, как описано выше. Как видно на фиг. 1, индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал был наиболее высоким в семенах, но постепенно снижался по мере развития проростка. Не выявлялась индуцирующая QR-активность (менее 1000 единиц/грамм), если не добавляли мирозиназу.
Пример 4. Индуцирующий потенциал проростков выше, чем растений товарной стадии.
Заявленные в настоящем изобретении проростки имеют более высокий индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал, нежели растения товарной стадии. В частности, индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал проростков по меньшей мере в 5 раз выше по сравнению со зрелыми растениями. Например, общий индуцирующий потенциал семидневных проростков брокколи при экстракции DMF/ACN/DMSO и обработке мирозиназой, как описано выше, составлял 238000 и 91000 единиц на 1 г свежей массы в сравнении с 25000 и 20000 единиц на 1 г свежей массы для выращенных в поле головок (соцветий) брокколи сортов Сага и ДеСикко, соответственно.
К настоящему времени в биологическом тесте проверены экстракты проростков более 40 представителей семейства Cruciferae, и проростки брокколи остаются наиболее богатыми индукторами ферментов фазы 2 среди всех проверенных растений. В табл. 2 приведены данные об общем индуцирующем потенциале экстрактов в органических растворителях, приготовленных из брокколи и дайкона на стадии проростков и на товарной стадии.
- 10 -
008105
Таблица 2
Сравнение индуцирующего потенциала проростков и зрелых растений
Активность (ед/г свежего веса)
Разница (кратность)
Сорт овоща*
Зрелый овощ
Проросток**
ДАЙКОН
Миура
625
26316
Теншун
3333
33333
Хаккай
1471
16667
Охкура
2857
50000
БРОККОЛИ
Сага
25000
476000
ДеСикко
25000
625000
Эверест
8333
1087000
130
Эиералд Сити
12500
833000
Пэкман
20000
556000
* Отбирали образцы коммерческой части каждого растения (корнеплод Raphanus sativus разновидности radicola (редька) и соцветия Brassica oleracea разновидности italica (брокколи)). Ко всем тестируемым экстрактам добавляли мирозиназу.
** Проростки брокколи были однодневными, а проростки дайкона 4-5-дневными.
Проростки брокколи сорта Эверест содержали в 130 раз больше индуцирующего потенциала (единиц/грамм свежей массы), чем зрелые растения. Индуцирующая активность брокколи была значительно выше по сравнению с дайконом.
Пример 5. Индуцирующий потенциал экстрактов проростков брокколи.
Определяли индуцирующий потенциал серии водных экстрактов трехдневных проростков брокколи сорта Сага. Первоначально проводили поверхностную стерилизацию семян Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) сорта Сага обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором гипохлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на 1 см2 на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 72 ч. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С).
Растения быстро и осторожно собирали с поверхности агара, чтобы минимизировать гидролиз глю-козинолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Проростки (со свежей массой приблизительно 25 мг/проросток) немедленно помещали в 3 объема кипящей воды для инактивации эндогенной мирозиназы и для экстракции глюкозинолатов и изотиоцианатов из растительной ткани. Воду доводили до кипения и проводили экстракцию в течение 3 мин при помешивании. Затем проростки отцеживали от кипящего настоя (чай, суп) или гомогенизировали в нем, а осадок позже удаляли фильтрованием или центрифугированием.
Приведенные в табл. 3 данные относятся как к гомогенатам, так и к настоям. Препараты до тестирования хранили при -20°С. Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, приготовленных описанным способом, определяли, как описано выше в разделе "Определения".
Была обнаружена некоторая вариабельность величины индуцирующего потенциала ферментов фазы 2. Однако высокие уровни данного потенциала наблюдались постоянно.
Пример 6. Обработка водных экстрактов брокколи мирозиназой дайкона.
QR-активность водного экстракта брокколи повышалась в присутствии растительного источника мирозиназы. Водный экстракт трехдневных проростков брокколи сорта Сага, выращенных на влажном агаре, в котором мирозиназа была инактивирована 3-минутным кипячением, разделяли на 6 различных аликвот по 150 мл. Девятидневные проростки дайкона, богатый источник фермента мирозиназы, добавляли к этому охлажденному экстракту в количествах, эквивалентных 0, 5, 9, 17, 29 и 40% (вес./вес.) брокколи. Как описано в разделе "Определения", QR-активность контрольных экстрактов, содержащих 0% дайкона, составляла 26300 единиц на 1 г свежей массы, при том, что QR-активность экстрактов, в которые в качестве источника мирозиназы был добавлен дайкон, колебалась в пределах от 500000 до 833000 единиц на 1 г свежей массы брокколи. Соответственно, мирозиназа, присутствующая в проростках дай-кона, повышала QR-активность экстрактов брокколи более чем в 19 раз.
- 11 -
008105
Пример 7. Глюкорафанин и глюкоэруцин являются доминирующими глюкозинолатами в водных экстрактах проростков брокколи (сорт Сага). Хроматография парных ионов (PIC).
Центрифугированные водные экстракты трехдневных проростков брокколи (сорт Сага) подвергали аналитической и препаративной хроматографии парных ионов (PIC) на обратно-фазовой HPLC колонке С18 Партисил ODS-2 в ACN/H2O (1/1 по объему) с бромидом тетраоктиламмония (ТОА) в качестве про-тивоиона. Было обнаружено только три хорошо различимых пика: пик А элюировался через 5,5 мин, пик В - через 11,5 мин и пик С - через 13 мин в молярном соотношении [А:В:С]=2,5:1,6:1,0 (контроль вели по поглощению в УФ с длиной волны 235 нм). Данные пики исчезали при обработке исходных экстрактов высоко очищенной мирозиназой. Пики А, В и С не содержали сколько-нибудь значительной индуцирующей активности и циклоконденсатное определение мирозиназных гидролизатов показало, что только пики А и С содержат значительное количество изотиоцианатов, которыми и обусловлена вся индуцирующая активность. Zhang и соавт., Anal. Biochem., 205:100-107 (1992). Пик В далее не охарактеризовы-вали. Пики А и С, элюированные с HPLC колонки в виде солей ТОА, требовали конверсии в аммонийные соли для успешного проведения масс-спектроскопии, ядерного магнитного резонанса и биологического теста. Очищенный материал пиков упаривали в вакуумной центрифуге, растворяли в водном 20 мМ NH4Cl и экстрагировали хлороформом для удаления избытка ТОА бромида. Аммонийные соли глю-козинолатов оставались в водной фазе, которую затем упаривали.
Идентификация глюкозинолатов.
Аммонийные соли пиков А и С охарактеризовывали методами масс-спектроскопии и ядерного магнитного резонанса: (а) атомная бомбардировка отрицательными ионами (FAB) на тиоглицериновом мат-риксе дала значения 436 amu (Пик А) и 420 amu (Пик С) для отрицательных молекулярных ионов, и (б) ядерный магнитный резонанс высокого разрешения, как видно из фиг. 2, обеспечил недвусмысленную идентификацию структуры. Пик А представлял собой глюкорафанин [4-метилсульфинилбутил глюкози-нолат], а пик С - близкородственный ему глюкоэруцин [4-метилтиобутил глюкозинолат]. Данные определения, а также чистота препаратов хорошо согласовывались с индуцирующим потенциалом; после гидролиза мирозиназой пики А и С обладали потенциалом 36100 и 4360 единиц/мкмоль, соответственно, в сравнении с известными значениями CD 0,2 мкМ (33333 единиц/мкмоль) для сульфорафана и 2,3 мкМ (29000 единиц/мкмоль) для эруцина. Величины CD представляют собой концентрации вещества, необходимые для удвоения специфической QR-активности в клетках мышиной гепатомы Нера 1с1с7. Поскольку других глюкозинолатных пиков не было выявлено, и индуцирующая активность пиков А и С обуславливала общую индуцирующую активность экстрактов, очевидно, что в растениях данного сорта брокколи не содержится значимых количеств других индукторов, т.е. индол - или гидроксиалкенил глюкозино-латов. Таким образом, выделенные соединения были по существу очищенными.
Пример 8. Сравнение методов экстракции индуцирующего потенциала водой и органическими растворителями.
Первоначально проводили поверхностную стерилизацию семян Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) сорта Сага обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором гипохлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на 1 см2 на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 72 ч. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С).
Растения быстро и осторожно собирали с поверхности агара, чтобы минимизировать гидролиз глю-козинолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Небольшую порцию проростков гомогенизировали в 10 объемах растворителя DMF/ACN/DMSO при -50°С, как описано в примере 1. Данный растворитель растворяет практически весь растительный нелигноцеллюлозный материал. Основную порцию собранных проростков помещали в 5 объемов кипящей воды на 3 мин для инактивации эндогенной мирозиназы и экстракции глюкозинолатов и изотиоцианатов. Охлажденную смесь гомогенизировали, центрифугировали и супернатант хранили при -20°С.
Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, приготовленных двумя описанными методами, определяли биологическим методом в микротитровальных планшетах, как описано выше. Обычные средние значения индуцирующих потенциалов для 5 препаратов составляли 702000 (экстракты DMF/ACN/DMSO) и 505000 (водные экстракты) единиц на 1 г свежей массы проростков.
Спектрофотометрическое определение циклоконденсационного продукта реакции изотиоцианатов с 1,2-бензолдитиолом проводили, как описано в работе Zhang и соавт., Anal. Biochem., 205:100-107 (1992). Глюкозинолаты быстро превращались в изотиоцианаты после добавления мирозиназы. Около 6% общего экстрагируемого горячей водой материала составляли глюкозинолаты. Данные результаты свидетельствуют, что а) уровень изотиоцианатов в грубых растительных экстрактах крайне низок; б) мирозиназа быстро превращает избыточные глюкозинолаты в изотиоцианаты; в) при экстракции горячей водой экстрагируется приблизительно 70% индуцирующей активности, если принять за 100% активность, экстрагируемую смесью трех растворителей, причем подобные препараты безопасны для потребления челове
- 12 -
008105
ком; г) более 95% индуцирующего потенциала в интактном растении представлено в виде глюкозинола-тов, и других индукторов в биологически значимых количествах не обнаруживается. Пример 9. Регуляция продукции глюкозинолатов в ходе развития.
Предварительные эксперименты с выращенной в полевых условиях брокколи (сорт ДеСикко), собранной с одного и того же поля через определенные временные интервалы, показали, что индуцирующий потенциал снижается от ранних стадий вегетации до стадии коммерческого сбора урожая, но, по-видимому, возрастает к началу цветения (поздний урожай). Эти данные позволили предположить, что индуцирующий потенциал должен быть наиболее высоким в семенах. Дальнейшие исследования показали, что при поверхностной стерилизации и последующем выращивании семян восьми сортов брокколи в гнотобиотических условиях индуцирующий потенциал в отношении ферментов фазы 2 был наивысшим в семенах и прогрессивно снижался ( в расчете на свежую массу) в течение 14 дней роста.
Однако в расчете на отдельное растение в течение данного периода активность оставалась неизменной, что указывает на отсутствие синтеза глюкозинолатов на ранних этапах роста растения. Но при сравнении глюкозинолатных профилей товарных соцветий брокколи и 3-дневных проростков (сорт Император) были обнаружены сильные различия в составе глюкозинолатов.
Проводили поверхностную стерилизацию семян Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) сорта Император обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором ги-похлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на 1 см2 на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 72 ч. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С).
Растения быстро и осторожно собирали с поверхности агара, чтобы минимизировать гидролиз глю-козинолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Проростки (приблизительно 25 мг свежей массы/проросток) немедленно помещали в 3 объема кипящей воды для инактивации эндогенной мирозиназы и для экстракции глюкозинолатов и изотиоцианатов из растительной ткани. Воду доводили до кипения и проводили экстракцию в течение 3 мин при помешивании. Затем проростки отцеживали от кипящего настоя (чай, суп), который до анализа хранили при -20°С .
Соцветия брокколи товарной стадии получали, проращивая семена одной партии в теплицах в гор-шочной земле, перенося рассаду на органически удобряемое поле в Гаррет Каунти (Мэриленд) и затем собирая соцветия. Соцветия после сбора немедленно замораживали, доставляли в лабораторию на льду и приготавливали экстракты аналогично тому, как это делали с проростками с той разницей, что для экстракции брали приблизительно 3 г цветковой ткани.
Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, полученных описанным способом, определяли биологическим методом в микротитровальных планшетах, ках показано в примере 1. Хроматография парных ионов выявила два главных пика, предположительно глюкобрассицин и неоглюкобрассицин, в экстрактах, приготовленных из соцветий брокколи рыночной стадии, со сходным временем задержки для глюкобрассицина (индол-3-илметил глюкозинолат) и неоглюкобрассицина (1-метоксииндол-3-илметил глюкозинолат). Данное наблюдение совпадает с опубликованными результатами по составу глюкозино-латов в зрелых растениях брокколи. Однако хроматография парных ионов в тех же условиях идентично приготовленных экстрактов 3-дневных проростков выявила отсутствие глюкобрассицина или неоглю-кобрассицина. Кроме того, 3-дневные проростки различных сортов брокколи продуцируют различные смеси глюкозинолатов. Соответственно, продукция глюкозинолатов меняется в ходе развития растения.
Пример 10. Оценка антиканцерогенной активности препаратов проростков брокколи на модели Хаггинса (вызванные ДМБА, а именно 9,10 диметил-1,2-бензантраценом, опухоли молочной железы).
Первоначально проводили поверхностную стерилизацию семян Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) сорта Сага обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором гипохлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на квадратный сантиметр на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 72 ч. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С).
Растения быстро и осторожно собирали с поверхности агара, чтобы минимизировать гидролиз глю-козинолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Большое количество собранных проростков немедленно помещали в 3 объема кипящей воды для инактивации эндогенной мирозиназы и для экстракции глюкозинолатов и изотиоцианатов из растительной ткани. Воду доводили до кипения и проводили экстракцию в течение 3 мин при помешивании. Затем проростки отцеживали от кипящего настоя (чай, суп), который лиофилизировали и хранили в виде сухого порошка при -20°С [Препарат А]. Аналогично приготовленную другую порцию проростков экстрагировали кипящей водой, остужали до 25°С и смешивали с таким количеством семидневных проростков дайкона, которое было эквивалентно приблизительно 0,5% исходной свежей массы проростков брокколи. Данную смесь
- 13 -
008105
гомогенизировали при помощи гомогенизатора Бринкман Политрон, инкубировали 2 ч при 37°С, фильтровали через стеклянный фильтр, лиофилизировали, как описано выше и хранили в виде сухого порошка при -20°С [Препарат В].
Индуцирующую QR-активность и индуцирующий потенциал растительных экстрактов, приготовленных как описано выше, определяли биологическим методом при использовании планшетов для микротитрования, как описано ранее. Индукция QR-активности в препарате А была в значительной степени обусловлена глюкозинолатами, в основном глюкорафанином, представляющим собой глюкозинолат сульфорафан, но этот препарат содержал и некоторое количество глюкоэруцина, сульфидного аналога глюкорафанина. Индукция QR-активности в препарате В была почти полностью обусловлена изотиоциа-натами, образовавшимися в результате обработки глюкозинолатов мирозиназой.
В опыте использовали случайно выбранных самок крыс Спраг-Доули в возрасте 35 дней; по 4 животных в пластиковой клетке. Все животные получали 10 мг ДМБА через желудочный зонд в 1 мл кунжутного масла в 50-дневном возрасте. Препараты проростков (А или В) или контрольный носитель вводили также через зонд за 3, 2 и 1 день до введения ДМВА, в день введения ДМВА (за 2 ч) и на следующий день после введения ДМВА.
Использованный носитель представлял собой смесь 50% Эмульфора 620Р/50% воды. Животные получали полуочищенную диету AIN-76A ad libitum с начала введения ДМВА до окончания опыта (в возрасте 167 дней).
Таблица 4
Антиканцерогенная активность экстрактов проростков брокколи на модели вызванных DMBA опухолей молочной железы
Группа
Препарат
Количество обработанных животных
Общее количество опухлей
Множественность: количество опухлей на крысу
Контроль
только DMBA
1,79
Препарат А глюкозинолат
324 мг/дозу (эквивалент 100 мкМ
сульфорафана)
1,05
Препарат В изотиоцианат
424 м г/дозу (эквивалент 100 мкМ сульфорафана)
0,55
Введение экстрактов проростков задерживало образование пальпируемых опухолей по меньшей мере на 5 недель. У крыс, обработанных препаратом А или препаратом В, развилось значительно меньше опухолей в сравнении с необработанным контролем, и множественность опухолей (число опухолей на крысу) была значительно ниже у животных, получавших препараты А или В. Пример 11. Метаболизм и клиренс глюкозинолатов у людей.
Двум некурящим здоровым мужчинам-добровольцам в возрасте 35 и 40 лет была предложена низкоовощная диета без желтых и зеленых овощей, исключающая потребление приправ, горчицы, редьки, помидоров и папайи. После 24 ч подобной диеты всю мочу добровольцев собирали 8-ми часовыми порциями. Через 24 ч после начала эксперимента испытуемым давали 100 мл супа из проростков брокколи (приготовленного, как описано далее), содержащего 520 мкмоль глюкозинолатов.
Проводили поверхностную стерилизацию семян Brassica oleracea разновидности italica (брокколи) сорта Император обработкой 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором ги-похлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на квадратный сантиметр на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 72 ч. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С). Растения быстро и осторожно собирали с поверхности агара, чтобы минимизировать гидролиз глюкози-нолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Большое количество проростков немедленно помещали в 3 объема кипящей воды для инактивации эндогенной мирозиназы и для экстракции глюкозинолатов и изотиоцианатов из растительной ткани. Воду доводили до кипения и
- 14 -
008105
проводили экстракцию в течение 3 мин при помешивании. Затем проростки гомогенизировали в экстракте в течение 1 мин при помощи гомогенизатора Бринкман Политрон, а затем препарат хранили в замороженном состоянии при -79°С до использования.
Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, приготовленных описанным способом, определяли биологическим методом в микротитровальных планшетах, как указано выше. Индуцирующий потенциал был почти полностью обусловлен присутствием глюкозинолатов, в основном глюкорафанина, являющегося глюкозинолатом сульфорафана, однако, выявлялось и некоторое количество глюкоэруцина, сульфидного аналога глюкорафанина. При конверсии изотиоцианатов под действием очищенной миро-зиназы индуцирующий потенциал в отношении ферментов фазы 2 составлял 100000 единиц/мл при содержании 5,2 мкмоль изотиоцианатов на мл, как определено реакцией циклоконденсации, описанной в примере 7. Таким образом, испытуемые получили в сумме 520 мкмоль глюкозинолатов.
Сбор 8-часовых порций мочи продолжали еще в течение 30 ч. Выведение конъюгатов изотиоциана-тов (тиокарбаматов) с мочой контролировали с использованием реакции циклоконденсации, как описано в примере 7.
Таблица 5
Выведение дитиокарбаматов двумя испытуемыми, получившими 520 микромолей глюкозинолатов, экстрагированных из брокколи сорта Сага
Время
Состояние
Индивидуум 1
Индивидуум 1
Время сбора (часы)
мкМ дитиокарбамата на 8-часовую порцию мочи
точка отсчета
1,4
2,7
точка отсчета
2,1
0,9
точка отсчета
1,7
5,4
Первые 8 ч после введения
23,2
20,4
Вторые 8 ч после введения
9,9
36,8
Третьи 8 ч после введения
4,4
14,0
Четвертые 8 ч после введения
4,2
4,1
Общее кол-во за вычетом среднего исходного значения
39,8
63,2
Общее кол-во как процент от дозы
6,7%
12,2%
В организме обоих испытуемых происходило метаболическое превращение значительной доли потребленных глюкозинолатов в изотиоцианаты, которые затем превращались в родственные дитиокарба-маты и определялись в моче.
Пример 12. Эффекты физических воздействий на развитие проростков и продукцию индукторов хинон-редуктазы.
Проводили поверхностную стерилизацию семян Paphanus sativum (дайкона) 70% этанолом в течение 1 мин, затем в течение 15 мин 1,3% раствором гипохлорита натрия, содержащего приблизительно 0,001% детергента Алконокс. Семена засевали в стерильные пластиковые контейнеры с плотностью приблизительно 8 семян на квадратный сантиметр на 0,7% агаровую подложку, не содержащую дополнительных питательных веществ. Семена проращивали в течение 7 дней. Условия проращивания тщательно контролировали в отношении освещения (флуоресцентные лампы широкого спектра), влажности и температуры (16 ч освещения, 25°С/8 ч темноты, 20°С).
Проростки облучали бактерицидным УФ-светом в течение получаса на 5- и 6-й дни. Облученные проростки достигали только половины высоты по сравнению с необлученным контролем. На 7-й день растения быстро и осторожно собирали с поверхности агара, чтобы минимизировать гидролиз глюкози-нолатов эндогенной мирозиназой, высвобождающейся при повреждении растений. Собранные проростки немедленно помещали в 10 объемов DMF/ACN/DMSO (1:1:1) при температуре -50°С для инактивации эндогенной мирозиназы и для экстракции глюкозинолатов и изотиоцианатов. Проростки немедленно гомогенизировали при помощи стеклянных ступки и пестика, а затем препарат хранили в замороженном состоянии при -20°С.
- 15 -
008105
Индуцирующий потенциал растительных экстрактов, приготовленных описанным способом, определяли биологическим методом в микротитровальных планшетах, как указано выше. Индуцирующий потенциал УФ-облученных проростков был более чем в три раза выше по сравнению с необлученным контролем. Таким образом, обработка проростков УФ-облучением повышала индуцирующий ферменты фазы 2 потенциал в растительной ткани.
Описанное и заявленное изобретение не должно ограничиваться частными вариантами его осуществления, приведенными здесь, поскольку примеры приводятся только в целях иллюстрации некоторых аспектов данного изобретения. Предполагается, что любые равнозначные варианты осуществления изобретения входят в его объем. Действительно, различные модификации изобретения, дополняющие те, которые раскрыты в настоящем описании, очевидным образом следуют из него и понятны специалисту в данной области исследований. Такие модификации также охватываются заявленными пунктами формулы. Все публикации и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, отражают уровень техники в той области, к которой относится изобретение, и приведены здесь в качестве ссылок.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Семена крестоцветных, за исключением Brassica oleracea capitata, Lepidium sativum, Sinapis alba, Sinapis nigra и Raphanus sativus, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 200000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян, при этом указанные семена не содержат или содержат только нетоксичные уровни индолглюкозинолатов, продуктов их расщепления или гидрокси-бутенил глюкозинолатов.
2. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 300000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.
3. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 400000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.
4. Семена крестоцветных по п.1, отличающиеся тем, что указанные семена дают проростки, содержащие по крайней мере 500000 единиц индуцирующего ферменты фазы 2 потенциала на 1 г свежей массы при измерении после трех дней с начала проращивания семян.
5. Порошок, состоящий из растительного материала, отличающийся тем, что он получен из семян по любому из пп.1-4.
6. Экстракт в нетоксичном растворителе из семян крестоцветных по любому из пп.1-4 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в указанных пунктах и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа.
7. Диетический продукт, отличающийся тем, что он содержит семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов.
8. Применение диетического продукта по п.7 для снижения уровня канцерогенов у млекопитающего.
9. Применение диетического продукта по п.7 для повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего.
10. Пилюля или таблетка, отличающаяся тем, что она содержит семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов.
11. Пилюля или таблетка по п.10, отличающаяся тем, что она предназначена для использования в способе снижения уровня канцерогенов у млекопитающего при введении млекопитающему указанной пилюли или таблетки.
12. Пилюля или таблетка по п.10, отличающаяся тем, что она предназначена для использования в способе повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 у млекопитающего при введении млекопитающему указанной пилюли или таблетки.
13. Способ получения диетического продукта по п.7, отличающийся тем, что смешивают семена крестоцветных по любому из пп.1-4, порошок по п.5, экстракт по п.6 или проростки крестоцветных, охарактеризованные в пп.1-4 и собранные между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любую комбинацию указанных компонентов с каким-либо съедобным ингредиентом.
14. Способ получения экстракта по п.6, заключающийся в том, что семена крестоцветных или проростки крестоцветных по любому из пп.1-4 гомогенизируют в избытке смеси диметилсульфоксида, аце-тонитрила и диметилформамида при температуре, достаточной для подавления активности мирозиназы.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что соотношение диметилсульфоксид: ацетонит
- 16 -
008105
рил:диметилформамид составляет 1:1:1.
16. Применение семян крестоцветных по любому из пп.1-4, порошка по п.5, экстракта по п.6 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в пп.1-4 и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любой комбинации указанных компонентов для получения пищевого продукта, используемого для повышения хемопротективного количества ферментов фазы 2 в организме млекопитающего.
17. Применение семян крестоцветных по любому из пп.1-4, порошка по п.5, экстракта по п.6 или проростков крестоцветных, охарактеризованных в пп.1-4 и собранных между стадией прорастания и вплоть до стадии второго листа, или любой комбинации указанных компонентов для получения пищевого продукта, используемого для снижения уровня канцерогенов в организме млекопитающего.
О g
Индуцирующая активность проростков брокколи Влияние на возраст растения
Без мирозиназы о.оА--z?s-z &r
3 4 5
Возраст растений (дни)
Фиг. 1
ЯМР высокого разрешения (600 МГц) в D2O. Примечание: хиральность в пике А индуцирует множественность для CH2SO (пик А), что не наблюдается для CH2S (пик С)
Пик А
CH3SO
Глюкоза
Н2.НЗ Н4.Н5
CH2(N)S
IH6 Н6- I J cH2SO I _ JULU_flJJ
CH2CH2
Пик С
3!0 ", _ 2.5 2.0 PPm
CH2S CH3S
I CH2(N)S 1
im II
CH2CH2
5.0 4.0 3.5
3.0
2.5
2.0 PPm
Фиг. 2
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 17 -