[**]

Заявленное изобретение относится к антимикробным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, в частности к слитым белкам, состоящим из энзима с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и удлиненной пептидной цепи, слитой с энзимом на N- или С-концах. Помимо этого, заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый слитый белок, векторам, содержащим упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяинам, содержащим либо упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Дополнительно, заявленное изобретение относится к применению упомянутого слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, средства диагностики или компонента косметических препаратов. Заявленное изобретение также относится к обработке или профилактике заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках. Кроме того, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей упомянутый слитый белок.

(57) Реферат / Формула:

Заявленное изобретение относится к антимикробным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, в частности к слитым белкам, состоящим из энзима с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и удлиненной пептидной цепи, слитой с энзимом на N- или С-концах. Помимо этого, заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый слитый белок, векторам, содержащим упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, и клеткам-хозяинам, содержащим либо упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Дополнительно, заявленное изобретение относится к применению упомянутого слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, средства диагностики или компонента косметических препаратов. Заявленное изобретение также относится к обработке или профилактике заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках. Кроме того, заявленное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей упомянутый слитый белок.

---

Антимикробные агенты
Заявленное изобретение относится к антимикробным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, а именно, к слитым белкам, включающим энзим с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и дополнительной удлиненной пептидной цепи, слитой с энзимом на N- или С-концах. Помимо этого, заявленное изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим упомянутый слитый белок, векторам, включающим упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты и клеткам-хозяинам, содержащим либо упомянутые молекулы нуклеиновой кислоты, либо упомянутые векторы. Дополнительно, заявленное изобретение относится к применению упомянутого слитого белка в качестве медикаментозного препарата, в частности, в лечении или профилактике инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в качестве средства диагностики или компонента косметического препарата. Заявленное изобретение также относится к обработке или профилактике заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования и помещений на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в медицинских стационарах и хирургических блоках. Помимо этого, заявленное изобретение относится к фармацевтическим или косметическим композициям, содержащим упомянутый слитый белок.
Грамотрицательные бактерии обладают внешней мембраной, с отличительным признаком в виде характерного ассиметричного двойного слоя. Внешний мембранный двойной слой состоит из внутреннего одинарного слоя, включающего фосфолипиды (преимущественно, фосфатидил этаноламин) и внешнего одинарного слоя, который по преимуществу состоит из одного гликолипида, липополисахарида (ЛПС). В мире бактерий существует огромное множество структур ЛПС, и структура ЛПС может изменяться в ответ на превалирующие условия окружающей среды. Стабильность слоя ЛПС и взаимодействие между различными молекулами ЛПС главным образом
происходят благодаря электростатическому взаимодействию бивалентных ионов (Mg2+, Са2+) с анионными компонентами молекулы ЛПС (фосфатные группы в липиде А, а также внутреннее ядро и карбоксигруппы KDO). Помимо этого, компактное и упорядоченное расположение гидрофобной группы липида А, характеризуемое отсутствием ненасыщенных жирных кислот, образует жесткую структуру с высокой вязкостью. Это придает ей меньшую проницаемость, предотвращающую от проникновения липофильных молекул, а также дополнительную устойчивость внешней мембраны (ВМ).
Известны различные типы агентов с бактерицидным или бактериостатическим действием, например, антибиотики, эндолизины, антимикробные пептиды и дефензины. Возрастающая микробная устойчивость в отношении антибиотиков, тем не менее, создает проблемы в лечении все большего числа инфекций, вызываемых бактериями, в частности, что касается инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, как например, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacteriaceae.
Эндолизины представляют собой пептидогликангидролазы, кодированные бактериофагами (или бактериальными вирусами). Они синтезируются во время экспрессии "поздних" генов в литическом цикле мультипликации фагов и опосредуют высвобождение прогенных вирионов из инфицированных клеток путем разрушения бактериального пептидогликана. Они являются либо 6(1,4)-гликолазами (лизосимами), трансгликолазами, амидазами или эндопептидазами. Антимикробное применение эндолизинов было предложено еще в 1991 г. Gasson (GB2243611). Несмотря на то, что способность к уничтожению микробов, наблюдаемая у эндолизинов, известна в течение длительного времени, использование данных энзимов в качестве антимикробных веществ игнорировали по причине успешного и доминирующего применения антибиотиков. Только после обнаружения бактерий с множественной устойчивостью к антибиотикам, стали проявлять интерес к применению эндолизинов в качестве препаратов против патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания у человека. Возникла насущная потребность в разработке совершенно новых классов антибактериальных агентов, и эндолизины, используемые в качестве "энизибиотиков" - термин-гибрид
("энзимы" и "антибиотики") прекрасно выполняют данную функцию. В 2001, Fischetti и соавторы впервые продемонстрировали терапевтический потенциал эндолизина бактериофага О в отношении стрептококков группы A (Nelson et al.,
2001) . С того времени, множество публикаций подтвердили функцию эндолизинов в качестве приемлемого и дополнительного альтернативного средства для контроля бактериальных инфекций, вызываемых в частности грамположительными бактериями. Впоследствии, была подтверждена эффективность в качестве энзибиотиков у различных эндолизинов, активных в отношении других грамположительных патогенов, как например Streptococcus pneumoniae (Loeffler и соавторы, 2001), Bacillus anthracis (Schuch и соавторы,
2002) , S. agalactiae (Cheng и соавторы, 2005) и Staphylococcus aureus (Rashel и соавторы, 2007). В настоящее время, самую насущную проблему в терапии с использованием эндолизинов представляет нечувствительность грамотрицательных бактерий к экзогенному действию эндолизинов, поскольку внешняя мембрана выполняет функцию щита, защищающего бактерии от проникновения эндолизинов из пептидогликанов. Данное свойство в настоящее время препятствует расширению перечня эффективных эндолизинов, применяемых в отношении важных грамотрицательных патогенов.
Антимикробные пептиды (АМП) представляют широкий спектр малых, катионных, ген-кодированных пептидных антибиотиков, которые можно обнаружить в практически любом организме. Различные АМП обладают различными свойствами, многие пептиды в данном классе являются предметом интенсивных научных исследований не только как антибиотики, но также как образцы для создания пептидов, проникающих через клеточную стенку. Несмотря на наличие нескольких схожих свойств (например, катионность, амфипатичность и малый размер), существует огромное разнообразие последовательностей АМП, и в связи с этим предложили как минимум четыре структурные группы (альфа-спиральные, бета-складчатые, растянутые и закольцованные) для систематизации всего разнообразия наблюдаемых АМП. Аналогичным образом, по мере появления новых антибиотиков было предложено несколько вариантов механизмов действия, и было доказано, что, например, основной мишенью многих из этих пептидов является клеточная
мембрана, в то время, как основной мишенью для других пептидов является проникновение в цитоплазматическую мембрану и нарушение основных функций метаболизма. АМП могут приобретать концентрацию, достаточную для синергического действия, несмотря на отсутствие специфического связывания мишеней; например, путем образования поры в мембране, как, например, в случае многих АМП. Тем не менее, данное явление наблюдается только в модельных фосфолипидных бислоях, а, в некоторых случаях, концентрация АМП в мембране была настолько высока, что необходимо соотношение одной пептидной молекулы на шесть фосфолипидных молекул. Данные концентрации приближаются к, и практически эквивалентны, состоянию полной мембранной насыщаемости. Поскольку минимальная подавляющая концентрация (МПК) для АМП, как правило, находится в пределах низкого микромолярного диапазона, значимость определения данных значений и их роль в проведении опытов in vivo сопровождается совершенно объяснимым скептицизмом (Melo et al., Nature reviews, Microbiology, 2009, 245).
Дефензины представляют собой большую группу малых, катионных, с повышенным содержанием цистеина и аргинина антимикробных пептидов, присутствующих как в позвоночной, так и межпозвоночной тканях. Дефензины подразделяют на пять групп, в соответствии с сеткой размещения цистеинов: растительные, межпозвоночные, а-, В-, и 9-дефензины. Последние три в большинстве случаев встречаются у млекопитающих, а -дефензины представляют собой белки, встречающиеся в нейтрофилах и эпителии ЖКТ. р-дефензины по преимуществу являются наиболее широко встречающимися и вырабатываются лейкоцитами и эпителиальными клетками различных видов. До настоящего времени, 9-дефензины редко обнаруживали, например, в лейкоцитах макак-резусов. Дефензины проявляют активность в отношении бактерий, грибков и многих вирусов с оболочкой и без. Тем не менее, для эффективного уничтожения бактерий необходимы по преимуществу высокие концентрации, например, в микромолярном диапазоне. Активность многих пептидов может снижаться в условиях, приближенных к условиям физиологической соли, бивалентных катионов и сыворотки. В зависимости от содержания гидрофобных
аминокислотных остатков, дефензины также проявляют гемолитическую активность.
Таким образом, присутствует необходимость в разработке новых антимикробных агентов.
Данной цели достигают путем практического воплощения сути заявленного изобретения, изложенного в формуле изобретения.
Термин "белок" в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, синонимично соотносится с термином "полипептид". Термин "белок" в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к линейному полимеру аминокислотных остатков, связанных пептидными связями в специфичной последовательности. Аминокислотные остатки белка могут быть модифицированы, например, ковалентными прикреплениями различных групп, как, например, углеводы и фосфаты. Прочие вещества могут быть более свободно ассоциированы с полипептидными цепочками, как, например, гемы или липиды, приводя к образованию конъюгированных белков, которые также обозначают термином "белок", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения. Описаны различные варианты с включением полипептидных цепей, в частности, что касается присутствия альфа-спиральных и бета-складчатых структур. Термин "белок" в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к четырем классам белков, а именно альфа, бета, альфа/бета и альфа-плюс-бета. Помимо этого, термин "белок" относится к комплексному соединению, причем комплекс представляет собой гомомер.
Термин "слитый белок", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к продукту экспрессии, являющемуся результатом слияния двух последовательностей нуклеиновых кислот. Такой белок получают, например, в системах экспрессии рекомбинантных ДНК. Помимо этого, термин "слитый белок", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к слиянию первой аминокислотной последовательности, как, например, энзиму, со второй или последующими аминокислотными последовательностями. Вторая или последующие аминокислотные последовательности могут определять домен
или прочие участки пептидной цепи. Более предпочтительно, упомянутые вторая или последующие аминокислотные последовательности чужеродны и по преимуществу не гомогенны с любой областью первой аминокислотной последовательности.
Термин "пептидная цепь", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому типу пептида, связанного с белком, например, с энзимом.
Термин "пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к малым полипептидам, состоящим из от примерно 2 до примерно 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно, от примерно 4 до примерно 50 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно от примерно 5 до 30 аминокислотных остатков, причем аминогруппа одного аминокислотного остатка соединена пептидной связью с карбоксигруппой другого аминокислотного остатка. Пептид может обладать специфической функцией. Пептид может представлять собой природный пептид или пептид, сконструированный и полученный синтетическим путем. Пептид могут, к примеру, извлекать или получать путем удаления из нативного белка при помощи энзиматического (ферментативного) или химического расщепления, либо могут приготавливать с использованием методов традиционного синтеза пептидов (например, твердофазный синтез) или способов молекулярной биологии (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Примерами природных пептидов могут служить антимикробные пептиды, дефензины, Sushi пептиды. Примерами синтетически полученных пептидов являются поликатионные, амфипатичные или гидрофобные пептиды. Пептид в описании заявленного изобретения не обозначает His-таги (-метки), Strep-таги, белки, связывающие тиоредоксин или мальтозу (МБР) и им подобные, которые используют для очистки или локализации белков.
Термин "эндолизин", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзиму, применение которого приемлемо для гидролиза клеточных стенок бактерий. "Эндолизины" состоят как минимум из одного "энзим-активного домена" (ЭАД), и обладают свойствами как
минимум одного из нижеперечисленных компонентов: эндопептидаза, хитиназа, Т4-подобная мураминидаза, лямбда-подобная мураминидаза, N-ацетил-мурамоил-Ь-аланин-амидаза (амидаза), мурамоил-Ь-аланин-амидаза,
мурамидаза, литическая трансгликолаза (С), литическая трансгликолаза (М), N-ацетил-мурамидаза, N-ацетил-глюкозаминидаза (лизосим) или трансгликолаза, как, например, KZ144 или EL188. Дополнительно, эндолизины могут включать также энзим-неактивные области, которые могут связываться с клеточной стенкой бактерии-хозяина, так называемые, домены связывания с клеточной стенкой.
Термин "ЭАД", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к энзим-активному домену эндолизина. ЭАД ответственен за гидролиз бактериальных пептидогликанов. Этот домен обладает как минимум одной энзим-функцией эндолизина. ЭАД также может состоять из более чем одного энзим-активного модуля.
Термин "аутолизины" относится к энзимам, подобным эндолизинам, но кодируемым бактериями и, например, вовлеченными в процесс клеточного деления. Подробное описание аутолизинов можно найти в "Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86".
Термин "бактериоцин", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к белковоподобным, полипептид-подобным или пептид-подобным веществам, которые могут ингибировать рост других бактерий. Более предпочтительно, упомянутый процесс ингибирования происходит специфически путем абсорбции упомянутых прочих бактерий специфическими рецепторами бактериоцина. Обычно, бактериоцины продуцируются микроорганизмами. Тем не менее, термин "бактериоцин" в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится как изолированной форме микроорганизма, так и синтетически получаемой форме, и относится к вариантам, которые преимущественно сохраняют свойства своих родительских бактериоцинов, но чьи последовательности были изменены путем инсерциимили делеции одного или более аминокислотных остатков.
Термин "антимикробные пептиды" (АМП), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к любому пептиду с микробицидной и/или микробиостатической функциями. Так, например, термин "антимикробный пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится, в частности, к любому пептиду с антимикробной, антигрибковой, антимикотической, антипаразитарной, антипротозойной, антивирусной, антиинфекционной, антиконтагиозной и/или бактерицидной, альгицидной, амебоцидной, микробицидной, бактерицидной, фунгицидной, паразитицидной, протозоицидной функцией.
Термин "дефензин", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептиду, встречающемуся в животном мире, предпочтительно, у млекопитающих, более предпочтительно, у человека, причем дефензин выполняет важную функцию в механизме внутренней защитной системы организма-хозяина, разрушая чужеродные вещества, как, например, инфекционные бактерии и/или инфекционные вирусы и/или грибки. Дефензин представляет собой микробицидный и/или туморицидный белок, пептид или полипептид типа "не-антитело". Примерами "дефензинов" могут являться "дефензины млекопитающих", альфа-дефензины, бета-дефензины, индолицин и магаинины. Термин "дефензины", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится как к изолированной форме из клеток животных, так и к синтетически получаемой форме, и также относится к вариантам, которые преимущественно сохраняют цитотоксические свойства своих родительских белков, но чьи последовательности изменили путем инсерции или делеции одного или более аминокислотных остатков.
Термин "Sushi пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к белкам комплементарного контроля с короткими повторениями транскрипции. Sushi модуль Sushi пептидов функционирует как домен взаимодействия "белок-белок" в различных белках. Доказано, что пептиды, содержащие Sushi домен, показывают антимикробную активность.
В контексте описания заявленного изобретения, термин "катионный пептид" относится к пептиду с положительно заряженными аминокислотными остатками. Предпочтительно, катионный пептид имеет значение рКа 9,0 или более. Как правило, как минимум четыре аминокислотных остатка катионного пептида могут быть положительно заряженными, например, лизин или аргинин. Термин "положительно заряженные" относится к боковым цепям аминокислотных остатков, имеющих номинальное значение номинального положительного заряда на уровне примерно физиологической среды. Примерами природных катионных пептидов, которые могут быть получены рекомбинантным способом, являются дефензины, магаинины, меллитин и цекропины.
Термин "поликатионные пептиды", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к синтетически получаемым пептидам, состоящим преимущественно из остатков лизина и/или аргинина.
Термин "амфипатичный пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидам, имеющим как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. Предпочтительно^ контексте описания заявленного изобретения, термин "амфипатичный пептид" относится к пептиду, имеющему определенное расположение гидрофильных и гидрофобных групп, например, амфипатичные пептиды могут являться альфа-спиральными, с превалирующими неполярными боковыми цепями вдоль одной стороны спирали и полярными остатками вдоль остальной части поверхности.
Термин "гидрофобная группа", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к химическим группам, как, например, аминокислотные боковые цепи, которые преимущественно водонерастворимы, но растворимы в масляной фазе, причем растворимость в масляной фазе выше, чем растворимость в воде или водной фазе. В воде, аминокислоты с гидрофобной боковой цепью, взаимодействуют друг с другом для получения неводной среды. Примерами аминокислот с гидрофобными боковыми цепями являются аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, гистидин, триптофан и тирозин.
Термин "делеция", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к делеции (удалению) 1, 2, 3, 4, 5 или более аминоксилотных остатков из соответствующей стартовой последовательности.
Термины "инсерция" или "аддиция", в том смысле, в котором они используются в описании заявленного изобретения, относятся к инсерции или аддиции 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных остатков соответствующей стартовой последовательности.
Термин "субституция", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к замене аминокислотного остатка, расположенного на определенной позиции, на другой аминокислотный остаток.
Заявленное изобретение относится к новым антибактериальным агентам, активным в отношении грамотрицательных бактерий, в частности, к слитым белкам, состоящим из энзима с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий и удлиненной пептидной цепи, слитой с энзимом на N- или С-концах или на обоих концах.
В одном из аспектов заявленного изобретения, энзим с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий представляет собой эндолизин, ау то лизин или бактериоцин.
В другом аспекте заявленного изобретения, энзим согласно заявленному изобретению может также содержать энзим-неактивные области, и связываться с клеточной стенкой бактерии-хозяина, так называемые домены связывания с клеточной стенкой.
Предпочтительные слитые белки в соответствии с заявленным изобретением представлены в SEQ ID N0:36 до 63. Слитые белки в соответствии с SEQ ID N0:36 до 63 могут содержать один или более дополнительных аминокислотных остатков на N-конце. Предпочтительно, дополнительным аминокислотным остатком является метионин.
Предпочтительно, эндолизин кодируют бактериофагами, специфичными в отношении грамотрицательных бактерий бактериальных групп, семейств, родов или видов, которые содержат штаммы, патогенные в отношении человека или животных, как, например, Enterobacteriaceae {Escherichia, в особенности Е. coli,
Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности К. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelid), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Предпочтительно, аутолизин кодируют грамотрицательными бактериями, как, например, грамотрицательные бактерии бактериальных групп, семейств, родов или видов, которые содержат штаммы, патогенные в отношении человека или животных, а именно Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности К. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelid), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Бактериоцин предпочтительно более или менее специфичен в отношении вышеупомянутых грамотрицательных бактерий.
Энзим в соответствии с заявленным изобретением обладает функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий бактериальдых групп, семейств, родов или видов, которые содержат штаммы, патогенные в отношении человека или животных, как, например Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, в особенности К pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella,
Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema и Borrelid), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae {Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Специфические примеры эндолизиновых составляющих, извлеченные из фага или эндолизин дикого типа, представлены в следующей таблице: Таблица 1:
Фаг
Источник(публикация)
Эндолизин дикого типа
Прогнозируемая функция эндолизина
ФУЮ
Perry, LL. and Applegate, В.М.
PhiV10p30
хитиназа
FELS-1
McClelland, M. and Wilson, R.K.
STM0907.FelsO
хитиназа
?15
Kropinksi, A.M. and McConnel, M.R.
epsilon15p25
хитиназа
YUA
Ceyssens. P. (Laboratory for Gene technology)
YuA20
литическая трансгликаза (С) /1 трансмембранно-воздушный домен (N)
Braid, M.D. and Kitts, C.L.
ORF23
литическая трансгликаза (С) / 2 трансмембранно-воздушный домен (N)
ВСЕРи
Summer, E.J. and Young, R.
BcepMu22
литическая трансгликаза (М) /1 трансмембранно-воздушный домен (N)
F116
Byrne, M. and Kropinski, A.M.
F116p62
мураминидаза (Т4-подобная)
FELS-2
McClelland, M. and Wilson, R.K.
STM2715.S.Fels2
мураминидаза (Т4-подобная)
ES18
Casjens, S.R. and Hendrix, R.W.
gp76
мураминидаза (Т4-подобная)
SETP3
De Lappe, N and Cormican, M.
SPSV3_gp23
мураминидаза (Т4-подобная)
ФЕС032
Savalia, D and Severinov, К
phi32_17
мураминидаза (Т4-подобная)
НК022
Juhala , R and Hendrix, R.W.
HK022p54
мураминидаза (лямбда-подобная)
НК97
Juhala , R and Hendrix, R.W.
HK97p58
мураминидаза (лямбда-подобная)
НК620
Clark, A.J. and Dhillon, T.S.
HK620p36
мураминидаза (лямбда-подобная)
Pickard, D. and Dougan, G
VIP0007
мураминидаза (лямбда-подобная)
SF6
Casjens, S and Clark, A.J.
Sf6p62
мураминидаза (лямбда-подобная)
SFV
Allison, G.E. and Verma, N.K.
R(SfVp40)
мураминидаза (лямбда-подобная)
ВСЕРС6В
Summer, EJ and Young, R.
gp22
мураминидаза (лямбда-подобная)
BCEPNAZGUL
Summer, EJ and Young, R.
Nazgul38
мураминидаза (лямбда-подобная)
Christie, G.E. and Calender, R.
К(P2p09)
мураминидаза (лямбда-подобная)
W
Christie, G.E. and Esposito,
К (Wphi09)
мураминидаза (лямбда-подобная)
RV5
Kropinski, A.M. and Johnson
rv5_gp085
мураминидаза (лямбда-подобная)
JS98
Zuber, S and Denou, E.
EpJS98_gp116
мураминидаза (Т4-подобная)
13А
Savalia, D and Molineux, I.
gp3.5
мурамоил-Ь-аланин амидаза
ВАН
Savalia, D and Molineux, I.
gp3.5
мурамоил-Ьаланин амидаза
EC0DS1
Savalia, D and Molineux, I.
gp3.5
мурамоил-Ьаланин амидаза
K1F
Scholl, D and Merril, С
CKV1F_gp16
мурамоил-Ь-аланин амидаза
Pajunen, M.I. and Mollineux, I.J.
T3p18
мурамоил-1_-аланин амидаза
GH-1
Kropinski, A.M. and Kovalyova, I.V.
gh-1p12
мурамоил-Ь-аланин амидаза
К11
Molineux, I. and Savalia, D.
gp3.5
мурамоил-Ьаланин амидаза
ФСТХ
Nakayama, К and Hayashi, T.
ORF12
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ВСЕР43
Summer, EJ and Young, R.
Bcep43-27
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ВСЕР781
Summer, EJ and Young, R.
Bcep781-27
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ВСЕР1
Summer, EJ and Young, R.
Bcep1-28
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
BCEPNY3
Summer, EJ and Young, R.
BcepNY3gene26
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ФЕ12-2
DeShazer, D and Nierman, W.C.
gp45
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
Ф52237
DeShazer, D and Nierman, W.C.
gp28
ПГ-связывающий домен (N) / мурамидаза (С)
ФР27
Recktenwald, J and Schmidt, H.
P27p30
эндопептидаза
RB49
Monod, С and Krisch, H.M.
RB49p102
эндопептидаза
Arbiol, C. and Comeau, A.M.
phi1-p102
эндопептидаза
Pankova, N.V. and Ksenzenko, V.N.
lys (T5.040)
эндопептидаза
201phi2-1
Thomas etal., 2008
ПГ-связывающий домен (N) / неизвестный каталитический домен (С)
Aeh1
Monod, С and Krisch, H.M.
Aeh1p339
мураминидаза (Т4-подобная)
YYZ-2008
Kropinski, A.M.
YYZgp45
мураминидаза (лямбда-подобная)
Также предпочтительны эндолизиновые составляющие, извлеченные из эндолизинов Pseudomonas aeruginosa фагов OKZ и EL, Pseudomonas putida фага, Е. coli фага N4, фага LUZ24, gp61 мурамидазы, STM0016 эндолизина и PSP3 эндолизина.
Помимо этого, эндолизиновые составляющие выбирают из группы, включающей phiKZgpl44 в соответствии с SEQ ID NO:l, ELgpl88 в соответствии с SEQ ID N0:2, Salmonella эндолизин в соответствии с SEQ ID N0:3, эндолизин Т4 энтеробактериального фага в соответствии с SEQ ID NO:4,
Acinetobacter baumanii endolysin according to SEQ ID N0:5, эндолизин E.coli фага K1F в соответствии с SEQ ID NO: 18, OBPgpLYS в соответствии с SEQ ID N0:34, эндолизин PSP3 Salmonella (PSP3gplO) в соответствии с SEQ ID N0:20, эндолизин E.coli фага P2 (P2gp09) в соответствии с SEQ ID N0:21, мурамидаза Salmonella typhimurium фага STM0016 в соответствии с SEQ ID N0:22, E.coli фаг N4 мурамидаза N4-gp61 в соответствии с SEQ ID N0:23 и N4-gp61 в соответствии с SEQ ID NO:24, KZ144 в соответствии с SEQ ID NO:25.
В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, эндолизины, аутолизины и бактериоцины слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, содержат модификации и/или изменения аминокислотных последовательностей. Такие изменения и/или модификации могут включать мутации, как, например, делеции, инсерции и аддиции, субституции илисочетания вышеупомянутых и/или химические изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксигрупп. Упомянутые эндолизины, аутолизины и бактериоцины слитого белка в соответствии с заявленным изобретением показывают литическую активностть соответствующего эндолизина дикого типа, аутолизина и бактериоцинов. Тем не менее, упомянутая активность может быть на том же самом уровне, выше или ниже способности соответствующего эндолизина дикого типа. Упомянутая активность может находиться на уровне 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или примерно 200 % от уровня активности соответствующего эндолизина дикого типа, или даже более. Активность можно измерить опытным путем при помощи методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, как например, чашечный тест определения (гемолиза) или анализ в жидкой среде, которые описаны в публикациях Briers et al, J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007) или Donovan DM, Lardeo M, Foster-Frey J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec;265(1) или в аналогичных публикациях.
Предпочтительно, удлиненная пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, слита с N-концом и/или С-концом эндолизина, аутолизина или бактериоцина. В более предпочтительном варианте
практического воплощения заявленного изобретения, упомянутая удлиненная пептидная цепь слита только с N-концом энзима. В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, удлиненная пептидная цепь слита только с С-концом энзима. Тем не менее, предпочтительными также являются модифицированные слитые белки с удлиненной пептидной цепью на обоих N-конце и С-конце. Упомянутые пептидные цепи на N-конце и С-конце могут быть одинаковыми или различными пептидными цепями. Пептидная цепь может быть связана с энзимом дополнительными аминокислотными остатками, например, из-за клонирования. Предпочтительно, упомянутая пептидная цепь может быть связана со слитым белком при помощи как минимум 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения, пептидная цепь связана с энзимом дополнительными аминокислотными остатками глицина и серина (Gly-Ser) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). Более того, пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением может также содержать дополнительные аминокислоты на N-конце. Предпочтительно, пептидная цепь содержит аминокислоты метионин (Met), аланин и метионин и глицин (Ala-Met-Gly-Ser) или аланин и метионин и глицин и серии (Ala-Met-Gly-Ser).
Пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением предпочтительно связана ковалентной связью с энзимом. Предпочтительно, упомянутая пептидная цепь состоит из как минимум 5, более предпочтительно из как минимум 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или как минимум 100 аминокислотных остатков. Наиболее предпочтительной является пептидная цепь, содержащая от примерно 5 до примерно 100 аминокислотных остатков, от примерно 5 до примерно 50 или от примерно 5 до примерно 30 аминокислотных остатков. Более предпочтительной является пептидная цепь, содержащая от примерно 6 до примерно 42 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 39 аминокислотных
остатков, от примерно 6 до примерно 38 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 31 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 25 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 24 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 22 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 21 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 20 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 19 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 16 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 14 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 12 аминокислотных остатков, от примерно 6 до примерно 10 аминокислотных остатков или от примерно 6 до примерно 9 аминокислотных остатков.
Предпочтительно, пептидная цепь не содержит таг (метку), как, например, His-таг, Strep-таг, Avi-таг, Мус-таг, Gst-таг, JS-таг, цистеин-таг, FLAG-таг или прочих тагов, известных из уровня техники и никаких тиоредоксин- или мальтоза-связывающих белков (МБР). Тем не менее, пептидная цепь и/или эндолизин, аутолизин или бактериоцин в соответствии с заявленным изобретением могут содержать дополнительно такой таг(и).
Более предпочтительно, пептидная цепь обладает способностью направлять слитой белок через внешнюю мембрану, но также обладает активностью, в том числе ничтожной или минимальной, при введении без слития с энзимом. Функция проведения слитого белка через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий обусловлена потенциалом внешней мембраны или ЛПС разрушающей или проникающей или дестабилизирующей активностью упомянутой пептидной цепи.
В одном из аспектов заявленного изобретения, слитая пептидная цепь представляет собой амфипатичный пептид, который содержит один или более положительно заряженных аминокислотных остатков лизина, аргинина и/или гистидина, в сочетании с одним или более гидрофобными аминокислотными остатками валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина. Боковые цепи аминокислотных остатков предпочтительно ориентированы с учетом того, что катионные и гидрофобные поверхности упорядочены в кластеры на противоположных сторонах пептида.
Предпочтительно, более, чем примерно 30, 40, 50, 60 или 70% аминокислотных остатков в упомянутом пептиде являются положительно заряженными аминокислотами. Предпочтительно, более, чем примерно 30, 40, 50, 60 или 70%, аминокислотных остатков в упомянутом пептиде являются гидрофобными аминокислотными остатками. Предпочтительно, амфипатичный пептид слит с N-концом и/или С-концом энзима, обладающего способностью разрушать клеточную стенку, повышая таким образом амфипатичность упомянутых белков.
В другом варианте практического воплощения заявленного изобретения, амфипатичный пептид, слитый с энзимом, содержит как минимум 5, более предпочтительно как минимум 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения, как минимум примерно 30, 40, 50, 60 или 70% упомянутых аминокислотных остатков амфипатичного пептида являются остатками либо аргинина, либо лизина и/или как минимум 30, 40, 50, 60 или 70% упомянутых аминокислотных остатков амфипатичного пептида являются остатками гидрофобных аминокислот валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и/или глицина.
Предпочтительными амфипатичными пептидами являются Pleurocidin в соответствии с SEQ ГО N0:6, Cecropin PI в соответствии с SEQ ID N0:7, Buforin II в соответствии с SEQ ID NO:8, Buforin I в соответствии с SEQ ID N0:19 и Magainin в соответствии с SEQ ID N0:9. Более предпочтительными амфипатичными пептидами являются Cathelidicine e.g. LL-37 в соответствии с SEQ ID NO:10, Nigrocine 2 в соответствии с SEQ ID NO:26 и Ascaphine 5 в соответствии с SEQ ID NO:27.
В другом аспекте заявленного изобретения, слитая пептидная цепь представляет собой антимикробный пептид, который содержит номинальный положительный заряд и примерно 50% гидрофобных аминокислотных остатков. Антимикробные пептиды являются амфипатичными, с длиной примерно от 12 до примерно 50 аминокислотных остатков.
Специфические примеры антимикробных пептидов в соответствии с завяленным изобретением приведены в нижеследующей таблице.
Таблица 2:
Пептид
Последовательность
LL-37
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES
SEQ ID N0:10
SMAP-29
RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG
SEQ ID N0:11
Indolicidin
ILPWKWPWWPWRR
SEQ ID NO:12
Protegrin
RGGRLCYCRRRFCVCVGR
SEQ ID N0:13
Cecropin Р1
SWLS KTAKKLENSAKKRIS EG IAIAIQGG P R
SEQ ID N0:7
Magainin
GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS
SEQ ID N0:9
Pleurocidin
GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL
SEQ ID N0:6
Cecropin A (A.aegypti)
GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPWAGAKALRK
SEQ ID NO:14
Cecropin A (D. melanogaster)
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIPQQAANVAATARG
SEQ ID N0:15
Buforin II
TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
SEQ ID N0:8
Sarcotoxin IA
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR
SEQ ID N0:16
Apidaecin
ANRPVYIPPPRPPHPRL
SEQ ID N0:28
Ascaphine 5
Gl KDWIKGAAKKLIKTVASHIANQ
SEQ ID N0:27
Nigrocine 2
GLLSKVLGVGKKVLCGVSGLVC
SEQ ID N0:26
Pseudin 1
GLNTLKKVFQGLHEAIKLINNHVQ
SEQ ID N0:29
Ranalexin
FLGGLIVPAMICAVTKKC
SEQ ID N0:30
Melittin
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
SEQ ID N0:31
Еще в одном аспекте заявленного изобретения, слитая пептидная цепь представляет собой Sushi пептид, описанный в публикации Ding JL, Li Р, Но В Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8): 1202-19. The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria. Особенно предпочтительным является Sushi 1 пептид в соответствии с SEQ ID N0:32.
Предпочтительные Sushi пептиды - это Sushi пептиды S1 и S3 и их производные; FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13.
В еще одном аспекте заявленного изобретения, слитая пептидная цепь представляет собой дефензин, предпочтительно Cathelicidine, Cecropin PI, Cecropin А или Magainin II.
В еще одном аспекте заявленного изобретения, слитая пептидная цепь представляет собой гидрофобную пептидную группу. Apidaecine с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID N0:28, WLBU2-
Variant с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO:33 и Walmaghl с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO:35. Гидрофобный пептид с аминокислотной последовательностью Phe-Phe-Val-Ala-Pro (SEQ ID NO: 17) не является частью заявленного изобретения.
В еще одном аспекте заявленного изобретения, пептидные цепи слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, содержат модификации и/или изменения аминокислотных последовательностей. Такие изменения и/или модификации могут содержать мутации, как, например, делеции, инсерции и добавления, субституции или сочетания вышеупомянутых и/или химические изменения аминокислотных остатков, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксигрупп.
Специфические примеры слитых белков в соответствии с завяленным изобретением приведены в нижеследующей таблице:
Таблица 3:
Слитый белок
Слитый белок
Энзимная составляющая
Пептидная цепь (N-конец, если не указано иначе)
Р1-Е6
SEQ ID NO: 36
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Ascaphine 5 (SEQ ID N0:27)
Р2-Е6
SEQ ID NO: 37
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Apiadaecine (SEQ ID N0:28)
РЗ-Е6
SEQ ID NO: 38
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Nigrocine 2 (SEQ ID N0:26)
Р4-Е6
SEQ ID NO: 39
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Pseudin 1 (SEQ ID N0:29)
Р7-Е6
SEQ ID NO: 40
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Ranalexin (SEQ ID N0:30)
Р8-Е6
SEQ ID N0:41
KZ144
(SEQ ID N0:25)
WLBU2-Variant (SEQ ID N0:33)
Р9-Е6
SEQ ID NO: 42
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Sushi 1
(SEQ ID NO:32)
Р10-Е6
SEQ ID NO: 43
KZ144
Melittin
(SEQ ID NO:25)
(SEQ ID N0:31)
Р11-Е6
SEQ ID NO: 44
KZ144
(SEQ ID N0:25)
LL-37
(SEQ ID N0:10)
Р12-Е6
SEQ ID NO: 45
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Indolicidin (SEQ ID N0:12)
Р13-Е6
SEQ ID NO: 46
KZ144
(SEQ ID N0:25)
SMAP-29 (SEQ ID N0:11)
Р14-Е6
SEQ ID NO: 47
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Protegrin (SEQ ID N0:13)
Р15-Е6
SEQ ID NO: 48
KZ144
(SEQ ID NO:25)
Cecropin PI (SEQ ID N0:7)
Р16-Е6
SEQ ID NO: 49
KZ144
(SEQ ID NO:25)
Magainin (SEQ ID N0:9)
Р17-Е6
SEQ ID NO: 50
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Pleurocidin (SEQ ID N0:6)
Р18-Е6
SEQ ID NO: 51
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Cecropin A (A. aegypti) (SEQ ID N0:14)
Р19-Е6
SEQ ID NO: 52
KZ144
(SEQ ID N0:25)
Cecropin A (A.
melanogaster)
(SEQ ID N0:15)
Р20-Е6
SEQ ID NO: 53
KZ144
(SEQ ID NO:25)
Buforin II (SEQ ID N0:8)
Р21-Е6
SEQ ID NO: 54
KZ144
(SEQ ID N0:25)
SarcotoxinIA (SEQ ID N0:16)
Р1-ЕЗ
SEQ ID NO: 55
STM0016 (SEQ ID N0:22)
Ascaphine 5 (SEQ ID N0:27)
SEQ ID NO: 56
STM0016 (SEQ ID N0:22)
Nigrocine 2 (SEQ ID N0:26)
SEQ ID NO: 57
STM0016 (SEQ ID N0:22)
SMAP-29 (SEQ ID N0:11)
SEQ ID NO: 58
STM0016 (SEQ ID N0:22)
Sarcotoxin IA (SEQ ID N0:16)
Р10-Е4
SEQ ID NO: 59
N4-gp61
(SEQ ID NO:23)
Melittin
(SEQ ID NO:31)
SEQ ID NO: 60
N4-gp61
(SEQ ID N0:23)
SMAP-29 (SEQ ID NO: 11)
Р10-Е5
SEQ ID NO: 61
N4-gp61 trunc. (SEQ ID N0:24)
Melittin
(SEQ ID NO:31)
SEQ ID NO: 62
N4-gp61 trunc. (SEQ ID N0:24)
Cecropin PI (SEQ ID N0:7)
SEQ ID NO: 63
N4-gp61 trunc. (SEQ ID NO:24)
SMAP-29 (SEQ ID N0:11)
Слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, и, в особенности, наиболее предпочитаемые слитые белки в соответствии с SEQ ID N0: 36 до 63, могут дополнительно содержать метионин на N-конце.
Слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, и, в особенности, наиболее предпочитаемые слитые белки в соответствии с SEQ ID NO: 36 до 63 могут дополнительно содержать таг (метку), например, с целью пурификации. Предпочтительным является His6-Tar, предпочтительно, на С-конце и/или на N-конце слитого белка. Упомянутый таг можно связать со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков, например, по причине клонирования. Предпочтительно, упомянутый таг может быть связан со слитым белком при помощи как минимум 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, слитый белок содержит His6-Tar на С-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, слитый белок содержит His6-Tar на N-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu). Еще в одном предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, слитый белок содержит Hise-rar на N- и С-концах, связанный со слитым белком при помощи
дополнительных аминокислотных остатков лизина и глицина (Lys-Gly) или лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu).
В более предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, слитый белок содержит His6-Tar на С-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu), а пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением связана с N-концом энзима при помощи дополнительных аминокислотных остатков глицина и серина. В другом предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, слитый белок содержит His6-Tar на С-конце, связанный со слитым белком при помощи дополнительных аминокислотных остатков лейцина и глутаминовой кислоты (Leu-Glu), а пептидная цепь слитого белка в соответствии с заявленным изобретением связана с N-концом энзима при помощи дополнительных аминокислотных остатков глицина и серина (Gly-Ser), причем слитый белок содержит на N-конце дополнительные аминокислотные остатки метионина (Met) или аланина, метионина и глицина (Ala-Met-Gly) или аланина, метионина, глицина и серина (Ala-Met-Gly-Ser). Предпочтительно, применяют слитые белки в соответствии с SEQ ID NO: 77 до 90.
Слитые белки получают построением путем связывания как минимум двух последовательностей нуклеиновой кислоты, с использованием стандартных методов клонирования в соответствии с Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Такой белок можно получить, например, в системах экспрессии рекомбинантных ДНК. Подобные слитые белки в соответствии с заявленным изобретением можно получать путем слияния нуклеиновых кислот для эндолизина и соответствующей пептидной цепи.
Слитые белки в соответствии с заявленным изобретением можно слить или связать с другими дополнительными белками. Примером такого дополнительного белка является тиоредоксин.
Помимо вышеописанного, заявленное изобретение относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением. Заявленное изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты в
соответствии с заявленным изобретением. Упомянутый вектор может быть применим в конститутивной или индуцируемой экспрессии упомянутого слитого белка в соответствии с заявленным изобретением.
Заявленное изобретение также относится к способу получения описанных слитых белков из микроорганизма, как, например, генетически модифицированная приемлемая клетка-хозяин, которая экспрессирует упомянутые слитые белки. Упомянутая клетка-хозяин может представлять собой микроорганизм, как, например, бактерия или дрожжевая клетка, или клетка животного, например, млекопитающего, в частности, человека. В одном из вариантов практического воплощения заявленного изобретения, клетка-хозяин представляет собой клетку Pichia pastoris. Клетку-хозяина могут выбирать вследствие чисто биологических параметров, например, выход, растворимость, затраты, и пр., но также и по медицинских параметрам, например, непатогенные бактерии или дрожжи, клетки организма человека.
В другом из аспектов, заявленное изобретение относится к способу генетической трансформации приемлемой клетки-хозяина с целью получения слитых белков в соответствии с заявленным изобретением, при котором клетку-хозяина генетически модифицируют путем введения в клетку-хозяин генетического материала, кодирующего упомянутые слитые белки, и последующих трансляции и экспрессии с использованием методов генной инженерии, известных специалистам в данной области.
Еще в одном из аспектов, заявленное изобретение относится к композиции, предпочтительно, фармацевтической композиции, содержащей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяин, трансформированный с использованием молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
В предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, композиция дополнительно содержит агенты, пермеабилизирующие внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, как, например, хелаты металлов, как-то ЭДТК, ТРИС, молочная кислота, лактоферрин, полимиксин, лимонная кислота и/или другие вещества, как
описано в публикации Vaara (Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol. Rev. 1992 Sep; 56 (3):395-441). Предпочтительными также являются композиции, содержащие сочетания вышеупомянутых пермеабилизирующих агентов. Особенно предпочтительной является композиция, содержащая от примерно 10 мкМ до примерно 100 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 50 мкМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до примерно 10 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 птМ до примерно 2 тМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 0,5 мМ до 1 мМ ЭДТК. Тем не менее, предпочтительными также являются композиции, содержащие от примерно 10 мкМ до примерно 0,5 мМ ЭДТК. Также предпочтительной является композиция, содержащая от примерно 0,5 мМ до примерно 2 мМ ЭДТК, более предпочтительно от примерно 1 мМ ЭДТК и дополнительно от примерно 10 до примерно 100 мМ ТРИС.
Заявленное изобретение также относится к слитому белку в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением для применения в качестве медикаментозного препарата. В другом аспекте, заявленное изобретение относится к применению слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный слитый белок в соответствии с заявленным изобретением для применения в производстве медикаментозного препарата для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и прочих дисфункций, ассоциируемых с грамотрицательными бактериями. В частности, применение для лечения и/или профилактики расстройств, заболеваний и пр.дисфункций, которые могут быть вызваны грамотрицательными бактериями, бактериальными группами, семействами, родами или видами, содержащими штаммы, патогенные для человека или животных, а именно Enterobacteriaceae (Escherichia, в особенности Е. coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia,
Klebsiella, в особенности К. pneumoniae, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Yersinia), Pseudomonadaceae (Pseudomonas, в особенности P. aeruginosa, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas, Comamonas), Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae (Treponema and Borrelid), Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas), Acinetobacter, в особенности A. baumanii.
Заявленное изобретение также относится к медикаментозному препарату, содержащему слитый белок в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяину, трансформированному с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
Еще в одном из аспектов, заявленное изобретение относится к способу лечения заболеваний, расстройств или прочих дисфункций у пациентов в состоянии необходимости терапии и/или профилактики, причем способ предусматривает введение пациенту эффективной дозы слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективного количества хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением. Пациент может являться человеком или животным.
В частности, упомянутый способ лечения могут применять для лечения и/или профилактики инфекций кожи, мягких тканей, респираторной системы, легких, пищеварительного тракта, глаз, ушей, зубов, носоглотки, рта, костной системы, влагалища, осложнений в виде раневых поверхностей при бактериемии и/или эндокардите, вызываемых грамотрицательными бактериями, в частности, вышеперечисленными грамотрицательными бактериями.
Дозировка и путь введения, используемые в способе лечения (или профилактики) в соответствии с заявленным изобретением зависит от специфики заболевания/локализации инфекции. Путь введения, например, может быть
пероральный, наружный, внутриносовой, парентеральный, внутривенный, ректальный или другие.
Для введения слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или эффективного количества хозяина, трансформированного с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок в соответствии с заявленным изобретением или композицию в соответствии с заявленным изобретением, в место локализации (или возможного распространения инфекции), применяют такую форму упаковки, которая защищает активные компоненты от воздействий внешних факторов, таких как протеазы, окисление, иммунный ответ и т.п., вплоть до достижения ими очага инфекции. Следовательно, лекарственная форма может представлять собой капсулу, драже, таблетку, порошок, суппозиторий, эмульсию, гель, лосьон, крем, мазь, инъекционный раствор, сироп, спрей, состав для ингаляций или любую другую приемлемую по медицинским показаниям упаковку. Предпочтительно, фармацевтическая композиция может содержать подобранные носители, стабилизаторы, красители, буферы или другие подходящие реагенты. Например, для местного нанесения лекарственная форма может представлять собой лосьон, крем, гель, мазь или пластырь, для назофарингального применения - физраствор для интраназального нанесения при помощи спрея. Для перорального применения с целью лечения и/или профилактики очага инфекции, к примеру, во внутренних органах, возникает необходимость в дополнительной защите слитого белка в соответствии с заявленным изобретением от агрессивного воздействия среды желудочно-кишечного тракта вплоть до проникновения в очаг инфекции. Таким образом, при пероральном введении в очаг инфекции во внутренних органах требуется использование бактерии как носителя, который преодолеет начальные стадии пищеварения в желудке и только после этого секрецируется на слитый белок в соответствии с заявленным изобретением.
В одном из узконаправленных воплощений заявленного изобретения, использование слитого белка в соответствии с заявленным изобретением и/или хозяина, трансформированного с использованием вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью,
кодирующей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, для применения в производстве медикаментозного средства для лечения и/или профилактики дисфункции, заболевания или симптоматики, вызванных Pseudomonas, в особенности Pseudomonas aeruginosa в особенности, поражения внутренних органов, в частности у грудных младенцев, инфекционные менингиты, например, геморрагический менингит, инфекции среднего уха, кожного покрова (Ecthyma gangraenosum), в частности ожоги, мочеполового тракта, риниты, бактериальные пневмонии, в частности, при которых пациент страдает от кистозного фиброза (муковисцидоза) или гематологических осложнений, например, при лейкемии, при развитии нейтропении в период проведения иммунодепрессивной терапии, септицемии, в особенности вследствие длительной внутривенной или мочевой катетеризации, полостных хирургических операций и тяжелых ожоговых поражений, эндокардита, в частности, при котором пациент находится на внутривенном катетерном введении лекарственных препаратов, или пациент с осложнениями после открытого хирургического вмешательства на сердце, при тяжелых инфекциях глаз, в частности, после использования зараженных офтальмологических растворов или тяжелых ожоговых поражений лица, остеохондроза, в частности вследствие тяжелых травм или колотых ран с входным отверстием сквозь грязную одежду.
В другом специализированном варианте практического воплощения заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Burkholderia pseudomallei, в особенности болезнь Уитмора, хроническая пневмония, септицемия, в частности, при которой у пациента наблюдается травматическое поражение кожного покрова.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonella thyphimurium и Salmonella enteritidis, в особенности острые гастроэнтериты и локальные гнойные процессы, в частности остеомиелит, эндокардит, холецистит и особенно менингит, вызванный бактериями Salmonella thyphimurium, при котором возраст пациента менее 2 лет.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonella typhi, в частности тиф.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Salmonellparatyphi, в частности паратиф.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Acinetobacter baumannii, в частности, бронхит, пневмония, раневые инфекции и септицемия, в особенности вследствие внутривенной катетеризации.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Escherichia coli, в особенности экстраинтестинальные инфекции, в частности аппендицит, гнойный холецистит, периотонит, гнойный менингит и инфекции мочеполового тракта, интраинтестинальные инфекции, вызванные бактериями Е. coli, в частности эпидемический энтерит, а также инфекционные заболевания, подобные дизентерии, септицемия, энтеротоксемия, мастит и дизентерия.
В другом узконаправленном практическом воплощении заявленного изобретения, дисфункция, заболевание или симптоматика вызваны бактериями Klebsiella pneumoniae, в частности пневмония, бактериемия, менингит и инфекции мочеполового тракта.
Предпочтительно, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением используется как компонент терапии или профилактики, в случае, если инфекция вызвана мультирезистентными бактериальными штаммами, в частности, штаммами, устойчивыми к одному или более из следующей группы антибиотиков: стрептомицин, тетрациклин, цефалотин, гентамицин, цефатоксин, цефалоспорин, цефтазидим или имипенем. Кроме этого, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением применяют как компонент терапии путем введения в сочетании с традиционными антибактериальными препаратами, такими как антибиотики, лантибиотики, бактериоцины или эндолизины и т.п.
Заявленное изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащему одно или более отделений, причем как минимум одно отделение содержит один или более слитых белков эндолизина в соответствии с заявленным изобретением и/или один или более хозяинов, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, или композицию в соответствии с заявленным изобретением.
В другом аспекте практической реализации, заявленное изобретение относится к процессу приготовления фармацевтической композиции, причем данный процесс включает добавление путем смешивания одной или более слитых белков с заявленным изобретением и/или один или более хозяев, трансформированных с использованием нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, кодирующей слитый белок в соответствии с заявленным изобретением, с фармацевтически приемлемым растворителем, эксципиентом или носителем.
В более расширенном аспекте, композиция в соответствии с заявленным изобретением представляет собой косметическую композицию. Некоторые виды бактерий могут вызывать раздражение на открытых участках тела пациента, например, на кожном покрове. Для предотвращения появления таких раздражений кожного покрова или вероятного патогенного влияния упомянутых бактериальных организмов, представляется возможным применение специальных косметических составов, которые содержат достаточное количество слитого белка в соответствии с заявленным изобретением для разрушения уже размножившихся или потенциально опасных очагов инфекции, вызванных грамотрицательными бактериями.
В расширенном аспекте, заявленное изобретение относится к применению слитого белка в соответствии с заявленным изобретением в качестве средства диагностики в здравоохранении, пищевой и природоохранной промышленности, в частности в качестве средства диагностики для диагностирования бактериальных инфекций, вызванных в частности грамотрицательными бактериями. Слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять в качестве инструмента направленного разрушения патогенных
бактерий, в особенности грамотрицательных патогенных бактерий. Разрушению бактериальных стенок слитым белком в соответствии с заявленным изобретением можно способствовать путем добавления детергентов, как например Triton Х-100 или других добавок, которые ослабляют клеточную защиту бактерий, например, полимиксин В. Специально направленное разрушение клеток небходимо как начальный этап последующего направленного уничтожения бактерий с использованием НК-методов, как например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), гибридизация нуклеиновой кислоты или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот, иммунобиологических методов, например, IMS, иммунофлюоресценции или анализ ELISA, или методов, основанных на распознавании клеточного материала бактерий, как то энзим-анализы с использованием протеинов, чувствительных к определенным группам или видам бактерий (например, р-галактоидаза для энтеробактерий, коагулаза для коагулаз-позитивных штаммов).
В расширенном аспекте, заявленное изобретение относится к использованию слитого белка в соответствии с заявленным изобретением, для устранения, уменьшения и/или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на пищеперерабатывающих предприятиях, различных поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, как, например, полки и места хранения пищевых продуктов, а также в любой другой области, где присутствует вероятность заражения пищевых продуктов, медицинского инструментария или прочих поверхностей в клиниках и хирургических блоках патогенными, потенциально болезнетворными и пр. нежелательными бактериями.
В частности, слитые белки в соответствии с заявленным изобретением можно применять в профилактических целях в качестве обеззараживающего средства. Такое обеззараживающее средство можно использовать до или после хирургических вмешательств, или, например, во время гемодиализа. Кроме того, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно применять как компонент терапии у недоношенных детей, пациентов с ослабленной иммунной реакцией, или пациентов с протезными устройствами. Данную терапию можно проводить как профилактику, так и в острый период. В этом же контексте,
внутрибольничные инфекции, в особенности вызванные резистентными к антибиотикам штаммами, как например, бактериями Pseudomonas aeruginosa (FQRP), Acinetobacter и энтеробактерии, как, например E.coli, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia и Yersinia можно лечить - как профилактически, так и в стадии острого обострения - с использованием слитого белка в соответствии с заявленным изобретением. В связи с этим, слитый белок в соответствии с заявленным изобретением можно использовать в качестве дезинфицирующего средства, а также в сочетании с другими ингредиентами в составе дезинфицирующего раствора, как, например, детергенты, поверхностно-активные вещества, растворители, антибиотики, лантибиотики или бактериоцины.
Применение слитого белка в соответствии с заявленным изобретением в качестве дезинфицирующего средства, например, в клиниках, стоматологических и ветеринарных кабинетах, кухне или ванной комнате сопровождается приготовлением состава в виде жидкости, порошка, геля, или ингредиента дезинфицирующих салфеток или простыней. В данный состав можно дополнительно включить подходящий носитель, добавки, растворители и/или эксципиенты для различных способов применения, а также агенты, которые способствуют повышению антимикробной активности, такие, как, например, ЭДТК или агенты, повышающие антимикробную активность слитых белков. Слитые белки можно использовать с традиционными дезинфицирующими агентами, такими, как например, этиловые спирты, альдегиды, окислители, фенолы, четвертичные аммониевые соединения или УФ-излучение. Для дезинфекции, например, поверхностей, объектов и/или приборов, слитый белок можно наносить на указанные поверхности, объекты и/или приборы. Нанесение можно осуществлять при помощи мягкой ткани, смоченной в дезинфицирующем составе, нанесенном при помощи спрея или окунания. Слитые белки можно использовать в различных концентрациях, в зависимости от соответствующего способа нанесения и времени воздействия для достижения эффекта полного обеззараживания.
Другим аспектом заявленного изобретения является тот факт, что заявленное изобретение может служить универсальным алгоритмом, т.е., любая пептидная цепь, заявленная в описании, может быть слита с любым эндолизином, аутолизином или бактериоцином, также заявленными в описании. Таким образом, представляется возможным комбинировать соответствующую пептидную цепь, которая позволяет осуществить связывание слитого белка с соответствующими бактериями и эндолизином, аутолизином или бактериоцином, которые препятствуют росту соответствующих бактерий. Наконец, представляется возможным построение приемлемого слитого белка для любых бактерий, которые необходимо уничтожить.
Далее по тексту описания заявленного изобретения следует расширенное описание применимости заявленного изобретения; тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, при том, что таковые служат исключительно цели продемонстрировать примеры практического воплощения заявленного изобретения, не носят ограничительный характер, поскольку различные изменения и модификации, не выходящие за рамки цели и задач изобретения, понятны специалистам в данной области техники. Необходимо понимать, что как описание, так и примеры носят иллюстративный характер и не являются ограничительными касательно сути заявленного изобретения.
Если не указано иначе, в нижеследующих примерах использованы стандартные методики, принятые в молекулярной биологии, как, например, описано в издании Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка gpl44 и gpl88, модифицированных с использованием амфипатичного пептида.
В качестве доказательного примера, продемонстрировали потенциал ЛПС-разрушающей активности амфипатичных пептидов при направлении gpl44 и gpl88 через внешнюю мембрану и последующую антибактериальную активность в отношении грамотрицательных бактерий. Gpl44 и gpl88 представляют собой модульные эндолизины, полученные из Pseudomonas aeruginosa фагов (pKZ и EL
с N-концевым пептидогликанным связыванием и С-концевым каталитическим доменом (Briers et al., 2007).
Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей gpl44 или gpl88 с генным фрагментом, кодирующим амфипатичный а4 спиральный Т4 лизосом (аа 143-155: Pro-Asn-Arg-Ala-Lys-Arg-Val-Ile-Thr-Thr-Phe-Arg-Thr в соответствии с SEQ ID NO: 92), применили хвост PCR с удлиненным 5' праймером и стандартным 3' праймером. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионном векторе рЕХР5СТ/ТОРО(r) (Invitrogen, Carlsbad, СА, USA).
Экспрессию всех составляющих провели в клетках Е. coli BL21 (DE3) pLysS. Все белки подвергли очистке при помощи Ni2+ аффинной хроматографии с использованием С-концевого 6xHis-Tara. Выход при различных очистках представлен в табл.4. Показательно, что получение a4-KZ144 не оказало токсичного воздействия на хозяина, по сравнению с KZ144, приводя к значительно большему выходу.
Очищенные стоковые растворы показали степень очистки ~90%. Все производные gpl44 показали образование мультимеров, которые могут быть превращены в мономеры путем аддиции Б-меркапто-этанола, что доказывает, что меж-дисульфидные связи вызывают мультимеризацию.
Таблица 4 - Выходы рекомбинантной очистки эндолизинов, модифицированных с использованием амфипатичного пептида*.
Слитый белок
Эндолизин
gpl44
gpl88
сс4 спиральный
179 мг
38 мг
Примечание*. Показан общий выход очищенного рекомбинантного белка на литр экспрессионной культуры клеток Е. coli. Данное значение определили спектрофотометрическим измерением концентрации белка и общего объема очищенного стокового раствора. Очистку производных gpl88 провели при более жестких условиях (65 мМ имидазола), по сравнению с производными gpl44 (50 мМ имидазола) с целью обеспечения высокой степени очистки.
Характеристика gpl44 и gpl88, модифицированных с использованием амфипатичного пептида
1.А. Энзиматическая (ферментативная) активность gpl44 и gpl 88, модифицированных с использованием амфипатичного пептида
Для оценки влияния модификации на энзиматическую активность gpl44 или gpl88, измерили специфическую активность вариантов при помощи хлороформ-пермеабилизированных клеток Pseudomonas aeruginosa и сравнили с соответствующим немодифицированным эндолизином. Измерили различные величины прироста всех модифицированных эндолизинов с целью определения (построения) соответствующей кривой насыщаемости. Угловой коэффициент линейной регрессии линейной области данной кривой служит мерой специфичной активности и экспрессирован относительно углового коэффициента немодифицированных gpl44 или gpl88 (табл.5).
Таблица 5 - Энзиматическая активность gpl44 или gpl88, модифицированных с использованием амфипатичного пептида*.
Слитый белок
Эндолизин
gpl44
gpl88
сс4 спиральный
23%
146%
Примечание*. Определена специфичная энзиматическая активность различных вариантов, и экспрессирована относительно специфичной активности соответствующего начального эндолизина (=100%), с одновременным тестированием. Буферные условия теста представляли собой оптимальные условия соответствующих эндолизинов (КН2РО4/К2НРО4 I = 120 мМ рН 6,2 и I = 80 мМ рН 7,3 для gpl44 и gpl88, соответственно).
1.Б. Антибактериальная активность gpl44 и gpl88, модифицированных с использованием амфипатичного пептида
Экспоненциальные клетки (~106/мл) P. aeruginosa РА01 инкубировали при комнатной температуре с немодифицированными и модифицированными gpl44/gpl88. По истечении 1 часа, клеточные суспензии разбавили и поместили в чашки Петри. Остаточные колонии пересчитали после ночного инкубирования
(табл.6). Немодифицированный gpl44 gpl88 не уменьшает число клеток в значительной степени, по сравнению с отрицательным контролем. Данный факт наглядно демонстрирует эффективность внешней мембраны как защитного барьера. Слитые белки с амфипатичным а4-спиральным инактивирует Экспоненциальные клетки с 50 ± 11 и 34 ± 11 % для a4-KZ144 и a4-EL188, соответственно. При использовании стационарных клеток с 100-кратно увеличенной плотностью, данные величины одинаковы (35 ± 18 иа* 32 ± 17%, соответственно). Несмотря на довольно высокую вариабельность между различными репликами, данные величины значительно различаются от необработанных клеток (а = 0.05). В целом, модифицированные gpl44 производные показывают тенденцию к более высокой антибактериальной активности, чем gpl88 производные.
Таблица 6 - Антибактериальная активность эндолизинов gpl44 и gpl88 и их производных*.
Экспоненциально растущие клетки
Эндолизины
gpl 44
gpl 88
Слитый
лог
лог
немодифицированный
0± 15
0.00 ± 0,06
10 ± 13
0,05 ± 0,06
а4 спиральный
50 ± И
0,31 ±0,09
34 ± 11
0,19 ±0,07
Примечание* Экспоненциально растущие клетки P. aeruginosa PAOl разбавили 100 х и инкубировали (конечная плотность ~106/мл) с 10 мкг недиализированного белка (конечная концентрация 100 мкг/мл, буфер: 20 мМ NaH.2P04-NaOH рН7.4; 0.5 М NaCl; 0.5 М имидазола) в течение 1 часа при комнатной температуре. Аликвоты разбавили поместили в чашки Петри. Антибактериальная активность выражена как относительная инактивация (%) (=100-(Ni/No)*100 м No = число необработанных клеток и N = число обработанных клеток) и в логарифмических единицах (=logioNo/Ni). Все образцы реплицировали в шесть раз. Представлены средние/стандартные отклонения. Статистический анализ осуществили с использованием Т-теста.
Пример 2. Клонирование, экспрессия и очистка gpl44 and gpl 88, модифицированных с использованием гидрофобного пептида.
В качестве доказательного примера, продемонстрировали потенциал ЛПС-разрушающей активности гидрофобных пентапептидов при направлении gpl44 и gpl88 через внешнюю мембрану и последующую антибактериальную активность
в отношении грамотрицательных бактерий. Gpl44 и gpl88 представляют собой модульные эндолизины, полученные из Pseudomonas aeruginosa фагов q> KZ и EL с N-концевым пептидогликанным связыванием и С-концевым каталитическим доменом (Briers et al., 2007).
Для удлинения 5' конца открытой рамки считывания, кодирующей gpl44 или gpl88, генным фрагментом, кодирующим 5 гидрофобных остатков (Phe-Phe-Val-Ala-Pro), применили хвост ПЦР с удлиненным 5' праймером и стандартным 3' праймером. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионном векторе рЕХР5СТ/ТОРО(r) (Invitrogen, Carlsbad, СА, USA).
Экспрессию всех составляющих провели в клетках Е. coli BL21 (DE3) pLysS. Все белки подвергли очистке при помощи Ni аффинной хроматографии с использованием С-концевого 6xHis-Tara. Выход при различных очистках представлен в табл.7.
Очищенные стоковые растворы показали степень очистки -90%. Все производные gpl44 показали образование мультимеров, которые могут быть превращены в мономеры путем аддиции В-меркапто-этанола, что доказывает, что междисульфидные связи вызывают мультимеризацию.
Таблица 7 - Выходы рекомбинантной очистки производных эндолизинов*.
Слитый белок
Эндолизин
gpl 44
gpl 88
Phe-Phe-Val-Ala-Pro
25 мг
85 мг
Примечание*. Показан общий выход очищенного рекомбинантного белка на литр экспрессионной культуры клеток Е. coli. Данное значение определили спектрофотометрическим измерением концентрации белка и общего объема очищенного стокового раствора. Очистку производных gpl 88 провели при более жестких условиях (65 мМ имидазола), по сравнению с производными gpl44 (50 мМ имидазола) с целью обеспечения высокой степени очистки.
Характеристика gpl44 и gpl88, модифицированных с использованием гидрофобного пентапептида
2.А. Энзиматическая (ферментативная) активность gpl44 и gpl 88, модифицированных с использованием гидрофобного пентапептида
Для оценки влияния модификации на энзиматическую активность gpl44 или gpl88, измерили специфическую активность вариантов при помощи хлороформ-пермеабилизированных клеток Pseudomonas aeruginosa и сравнили с соответствующим немодифицированным эндолизином. Измерили различные величины прироста всех модифицированных эндолизинов с целью определения (построения) соответствующей кривой насыщаемости. Угловой коэффициент линейной регрессии линейной области данной кривой служит мерой специфичной активности и экспрессирован относительно углового коэффициента немодифицированных gpl44 или gpl88 (табл.8).
Таблица 8 - Энзиматическая активность gpl44 или gpl88, модифицированных с использованием гидрофобного пептида*.
Слитый белок
Эндолизин
gpl 44
gpl 88
Гидрофобный пентапептид
150%
100%
Примечание*. Определена специфичная энзиматическая активность различных вариантов, и экспрессирована относительно специфичной активности соответствующего начального эндолизина (=100%), с одновременным тестированием. Буферные условия теста представляли собой оптимальные условия соответствующих эндолизинов (КН2РО4/К2НРО4 I = 120 мМ рН 6,2 и I = 80 мМ рН 7,3 для gpl44 и gpl88, соответственно).
2.Б. Антибактериальная активность gpl44 и gpl88, модифицированных с использованием гидрофобного пентапептида
Экспоненциальные клетки (~10б/мл) P. aeruginosa PAOI инкубировали при комнатной температуре с немодифицированными и модифицированными gpl44/gpl88. По истечении 1 часа, клеточные суспензии разбавили и поместили в чашки Петри. Остаточные колонии пересчитали после ночного инкубирования (табл.9). Немодифицированный gpl44 gpl88 не уменьшает число клеток в значительной степени, по сравнению с отрицательным контролем. Данный факт наглядно демонстрирует эффективность внешней мембраны как защитного барьера. Инкубация с использованием гидрофобных пентапептидных слитых
белков вызывает значительное снижение (а = 0.05) числа бактериальных клеток (83 ± 7 и 69 ± 21% для модифицированных gpl44 и gpl88, соответственно). В целом, модифицированные gpl44 производные показывают тенденцию к более высокой антибактериальной активности, чем gpl88 производные.
Таблица 9 - Антибактериальная активность эндолизинов gpl44 и gpl88 и их производных*.
Экспоненциально растущие клетки
Эндолизины
gpl44
gpl 88
Слитый
log
log
немодифицированный
0± 15
0,00 ± 0,06
10 ± 13
0,05 ± 0,06
Гидрофобный пентапептид
83 ±7
0,9 ± 0,2
69 ±21
0,7 ± 0,3
Примечание*. Экспоненциально растущие клетки P. aeruginosa PAOl разбавили 100 х и инкубировали (конечная плотность ~106/мл) с 10 мкг недиализированного белка (конечная концентрация 100 мкг/мл, буфер: 20 мМ NaH2P04-NaOH рН7.4; 0.5 М NaCl; 0.5 М имидазола) в течение 1 часа при комнатной температуре. Аликвоты разбавили поместили в чашки Петри. Антибактериальная активность выражена как относительная инактивация (%) (=100-(Ni/No)*100 с No = число необработанных клеток и Ni = число обработанных клеток) и в логарифмических единицах (=logioNo/Ni). Все образцы реплицировали в шесть раз. Представлены средние/стандартные отклонения. Статистический анализ осуществили с использованием Т-теста.
Пример 3: Клонирование, экспрессия и очистка KZ144 и STM0016, модифицированных с использованием различных пептидных цепей на N-конце эндолизина.
KZ144 в соответствии с SEQ ID NO: 25 представляет собой модульный эндолизин, получаемый из Pseudomonas aeruginosa фага cpKZ с N-концевым пептидогликанным связыванием и С-концевым каталитическим доменом (Briers et al., 2007). Эндолизин KZ144 кодируют молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 64. Молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 64 получили синтетическим путем с BamH I (5'-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и Xho I (5'-СТС GAG-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
STM0016 является гипотетическим белком с гомологией в отношении Е. coli фага N4 эндолизина N4-gp61. Эндолизин STM0016 кодируют молекулой
нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 65. Молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 65 получили синтетическим путем с BamH I (5'-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и Xho I (5'-СТС GAG-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
N4-gp61 является Е. coli N4 фагом эндолизина. Эндолизин кодируют молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 91. Молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO: 91 получили синтетическим путем с BamH I (5'-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты и Xho I (5 '-СТС GAG-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
Представленные в табл.10 пептидные цепи использовали для получения слитых белков с эндолизином KZ144 или STM0016:
Таблица 10:
Пептидная цепь
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептидную цепь
Pseudin 1 (SEQ ID N0:29)
SEQ IDNO: 66
Ranalexin (SEQ ID N0:30)
SEQ IDNO: 67
Sushi 1
(SEQ ID N0:32)
SEQ ID N0: 68
WLBU2-Variant (SEQ ID N0:33)
SEQ ID N0:69
Melittin
(SEQ ID N0:31)
SEQ ID N0:70
SMAP-29 (SEQ ID N0:11)
SEQ ID N0:71
Pleurocidin (SEQ ID NO: 6)
SEQ IDNO: 72
Cecropin A (A. aegypti)
SEQ ID N0:73
(SEQ ID N0:14)
Cecropin A (A. melanogaster) (SEQ ID NO: 15)
SEQ ID NO:74
Buforin II (SEQ ID N0:8)
SEQ ID N0:75
Sarcotoxin IA (SEQ ID N0:16)
SEQ ID N0:76
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие соответствующие пептидные цепи, получили синтетическим путем с Nde I (5 '-CAT ATG-3') сайтом рестрикции на 5 '-конце молекулы нуклеиновой кислоты и BamH I (5 '-GGA ТСС-3') сайтом рестрикции на 3'- конце молекулы нуклеиновой кислоты, за исключением молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей Sushi 1 пептид, который получили с Nco I сайтом рестрикции плюс два дополнительных нуклеотида (5'-ССА TGG GC-3') на 5'- конце молекулы нуклеиновой кислоты.
Слитые белки получают путем соединения как минимум двух последовательностей нуклеиновых кислот с использованием стандартных методов клонирования, описанных, например, в публикации Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептидные цепи, частично расщепили с соответствующими энзимами рестрикции Nde I и BamH I, и, в случае, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептидную цепь Sushi 1, поглощение осуществили с энзимами рестрикции Nco I и BamH I. После этого, расщепленные нуклеиновые кислоты, кодирующие пептидные цепи, лигандировали в рЕТ21 b экспрессионном векторе (Novagen, Darmstadt, Germany), который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции Nde land BamH I. Расщепленную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептидную цепь Sushi I лигандировали в модифицированный рЕТ32 b экспрессионный вектор (немодифицированный вектор производства компании Novagen, Darmstadt, Germany), который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции Nco I
and BamH I. Модификация pET32b экспрессионного вектора относится к делеции последовательности, кодирующей S-таг и центральный His-таг.
После этого, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин KZ144, частично расщепили с энзимом рестрикции BamH I и Xho I, таким образом, чтобы было возможно лигандировать эндолизин в рЕТ21Ь экспрессионном векторе (Novagen, Darmstadt, Germany) и в модифицированном рЕТ32 b экспрессионном векторе, соответственно, который также до этого подвергли расщеплению с соответствующими энзимами рестрикции BamH I and Xho I. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин STM0016 и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин N4gp61, подвергли частичному расщеплению с энзимом рестрикции BamH I and Xho I, таким образом, чтобы было возможно лигандировать эндолизин в рЕТ21Ь экспрессионном векторе (Novagen, Darmstadt, Germany).
Таким образом, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептидную цепь, лигандировали в соответствующем векторе на 5'-конце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин KZ144 или STM0016. Помимо этого, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин KZ144 или STM0016, лигандировали в соответствующей плазмиде, таким образом, чтобы молекула, кодирующая His-таг, состоящий из шести гистидиновых остатков, ассоциировалась на 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эндолизин.
Поскольку некоторые слитые белки могут либо проявлять токсичность после экспрессии в бактериальных клетках, либо терять гомогенность вследствие деградации белка, стратегическим выходом из сложившейся дилеммы была бы экспрессия данных слитых белков, в слиянии или соединении в другими белками. Примером такого прочего дополнительного белка является тиоредоксин, который показал способность опосредовать экспрессию токсичных антимикробных пептидов в клетках E.coli (TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L, Zhao Z, Li B, Cai Y, Zhang S. Protein Expr Purif. 2009 Apr;64(2):225-230). В случае слитого белка, состоящего из N-концевого Sushi 1 пептида и эндолизина KZ144, Sushi 1 пептид лигандируют в модифицированном рЕТ32 b экспрессионном
векторе, таким образом, чтобы дополнительный тиоредоксин ассоциировался на 5'-конце Sushi 1 пептида. Тиоредоксин можно удалить из экспрессированного слитого белка путем использования энтерокиназы, причем сайт рестрикции энтерокиназы вводят между молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей Sushi пептид и молекулой, кодирующей тиоредоксин.
Последовательность слияний эндолизин-пептид контролировали при помощи секвенирования ДНК, а корректные клоны трансформировали в E.coli BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany) для экспрессии белка.
Рекомбинантную экспрессию слитого белка в соответствии с SEQ ID NO: 77 до 90 осуществили в клетках Е. coli BL21 (DE3) pLysS и Е. coli BL21 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany). Клетки росли до достижения уровня значения оптической плотности OD600 0,5-0,8 мкм. Затем индуцировали экспрессию слитого белка с 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактозидом) и осуществили экспрессию при 37°С в течение 4 часов.
Клетки E.coli BL21 собрали центрифугированием в течение 20 мин при бОООг и дезинтегрировали путем разрушения ультразвуком на льду. Суммарный экстракт растворимой и нерастворимой фракций клеток E.coli сепарировали центрифугированием (Sorvall, SS34, 30 мин, 15 000 оборотов в минуту). Все белки очистили при помощи Ni аффинной хроматографии (Akta FPLC, GE Healthcare) с использованием С-концевого 6xHis-Tara, кодируемого векторами рЕТ21ЬирЕТ32Ь.
Как описано выше, некоторые слитые белки экспрессировали с использованием модифицированного рЕТ32Ь вектора (S-таг и центральный His-таг удалили), который соединяет слиянием тиоредоксин на N-конце необходимых белков. Вектор также содержит сайт расщепления энтерокиназы, как раз непосредственно перед необходимым белком. Данный сайт позволяет осуществить протеолитическое расщепление между тиоредоксином и необходимым белком, который может быть очищен через оставшийся С-концевой His-таг. Для повышения антимикробной активности слитого белка Sushi 1-KZ144, может возникнуть необходимость удаления тиоредоксина путем электролитического расщепления. В связи с этим, слитый белок расщепили с использованием 2-4 юнитов/мг рекомбинантной энтерокиназы (Novagen,
Darmstadt, Germany) для удаления тиоредоксина в соответствии с протоколом производителя. После энтекрокиназного расщепления, слитый белок очистили при помощи His-таг очистки, как описано далее по тексту.
Ni2+ аффинную хроматографию осуществили в 4 последовательных этапа, все при комнатной температуре:
1. Эквилибрация Histrap HP 5 мл колонки (GE Healthcare) с 10 объемами колонки отмывочного буфера (20 мМ имидазола, 1 М NaCl и 20 мМ Hepes (№2-гидроксиэтилпиперазин-1Ч-2-этансульфоновой кислоты) при рН 7,4) при скорости потока 3-5 мл/мин.
2. Загрузка всего лизата (с требуемым объемом слитого белка) в Histrap HP 5 ml колонки при скорости потока 3-5 мл/мин.
3. Отмывка колонки с 10 объемами колонки отмывочного буфера для удаления несвязанного образца, с последующей повторной отмывкой с 10% элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 М NaCl и 20 мМ Hepes при рН 7.4) при скорости потока 3-5 мл/мин.
4. Элюирование связанных слитых белков из колонки с линейным градиентом 4 объемов колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 0,5 мМ NaCl и 20 мМ Hepes при рН 7,4) до 100% при скорости потока 3-5 мл/мин.
Очищенные стоковые растворы слитых белков в элюирующем буфере (20 мМ Hepes рН 7,4; 0,5 М NaCl; 500 мМ имидазола) показали как минимум 90% степень чистоты, в соответствии с визуальным контролем на SDS-PAGE гелях (данные не приведены).
Пример 4: Антимикробная активность эндолизина KZ144, модифицированного с использованием различных пептидных цепей на N-конце.
Слитый белок, содержащий KZ144 и пептидную цепь а4 спираль построили в соответствии с описанием в примере 1. Другие слитые белки, содержащие KZ144 и соответствующие пептидные цепи, построили в соответствии с описанием в примере 3.
Клетки Е. coli DSMZ 11753, Acinetobacter baumannii DSMZ 30007 и Pseudomonas aeruginosa PAOlp (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol, 41(3):1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Инкубированные в течение ночного времени суток культуры разбавили в 10 раз в свежей среде Лурия-Бертани и вырастили до OD6oo=0.6. Культуру осадили центрифугированием и разбавили в 10 раз в буфере разбавления (10 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭДТК; рН 7.4). Бактерии инкубировали при комнатной температуре с 10 мкг недиализированного слитого белка при конечной концентрации 100 мкг/мл в буфере (20 мМ NaH2P04-NaOH рН 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола). По истечении 1 часа, в ФСБ построили серии разведения клеток и высеяли на среду Лурия-Бертани. Дополнительно, отрицательный контроль высеяли с использованием буфера (20 мМ NaH2P04-NaOH рН 7,4; 0,5 М NaCl; 0,5 М имидазола). Остаточные колонии пересчитали после ночной инкубации при 37°С. На основе чисел клеток, рассчитали антибактериальную активность в логарифмических юнитах (=logi0N0/Ni с N0 = число необработанных клеток и N, = число обработанных клеток) (табл.11), все образцы реплицировали как минимум в 4 раза.
Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице.
Таблица 11: Антимикробная активность KZ144, модифицированного с использованием различных пептидных цепей, в отношении грамотрицательных
бактерий
Слитый
Энзимная
Пептидная
Активность
Активность
Активность
белок
составляющая
цепь
в отношении
в отношении
(N-концевая,
Pseudomonas
отношении
Acinetobacter
если не
aeruginosa
Е. coli
baumannii
указано иначе)
DSMZ 11753
DSMZ 30007
SEQ ID
KZ144
Pseudin 1
NO: 77
(SEQ ID N0:25)
(SEQ ID NO:29)
не опр.
не опр.
SEQ ID
KZ144
Ranalexin
NO: 78
(SEQ ID N0:25)
(SEQ ID NO:30)
не опр.
не опр.
SEQ ID NO: 79
KZ144 (SEQ ID
Sushi 1 (SEQ ID
не опр.
N0:25)
NO:32)
SEQ ID NO: 80
KZ144 (SEQ ID N0:25)
WLBU2-Variant (SEQ ID N0:33)
не опр.
не опр..
SEQ ID NO: 81
KZ144 (SEQ ID N0:25)
Melittin (SEQ ID N0:31)
не опр.
не опр.
SEQ ID NO: 82
KZ144 (SEQ ID N0:25)
SMAP-29 (SEQ ID N0:11)
+++
+++
не опр.
SEQ ID NO: 83
KZ144 (SEQ ID N0:25)
Cecropin A (A. aegypti) (SEQ ID N0:14)
SEQ ID NO: 84
KZ144 (SEQ ID N0:25)
Pleurocidin (SEQ ID NO: 6)
не опр.
не опр.
SEQ ID NO: 85
KZ144 (SEQ ID NO:25)
Cecropin A (A. melanogaster)
(SEQ ID
N0:15)
не опр.
не опр.
SEQ ID NO: 86
KZ144 (SEQ ID N0:25)
Buforin II (SEQ ID N0:8)
не опр.
не опр.
SEQ ID NO: 87
KZ144 (SEQ ID N0:25)
Sarcotoxin IA (SEQ ID N0:16)
SEQ ID NO: 93
KZ144 (SEQ ID NO:25)
cc4 helix (SEQ ID N0:92)
не опр.
не опр.
Сокращения: ± < 1 лог; +: 1 лог; ++: 2-3 лог; +++: 4 или более лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Пример 5: Антимикробная активность эндолизина STM0016, модифицированного с использованием различных пептидных цепей на N-конце.
Слитые белки, состоящие из STM0016 и пептидную цепь Sarcotoxin IA или SMAP-29 построили в соответствии с описанием в примере 3.
Клетки Е. coli DSMZ 11753, Salmonella typhimujrium DSMZ 17058 and Pseudomonas aeruginosa PAOlp (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol, 41(3): 1192-1202) использовали в
качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитых белков, состоящих из эндолизина STM0016 и пептида Sarcotoxin IA или SMAP-29. Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице.
Таблица 12:
Слитый белок
Энзимная составляющая
Пептидная цепь
(N-концевая, если не указано иначе)
Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa
Активность в
отношении Е. coli DSMZ 11753
Активность в
отношении Salmonella typhimurium
DSMZ
17058
SEQ ID NO: 88
STM0016 (SEQ ID NO: 22)
Sarcotoxin IA (SEQ ID N0:16)
не опр.
SEQ ID NO: 89
STM0016 (SEQ ID NO: 22)
SMAP-29 (SEQ ID NO: И)
Сокращения: +: 1 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с
соответствующим слитым белком.
Пример 6: Антимикробная активность эндолизина N4gp61, модифицированного с использованием пептидной цепи на N-конце.
Слитый белок, содержащий N4gp61 и пептидную цепь SMAP-29 спираль построили в соответствии с описанием в примере 3.
Клетки Е. coli DSMZ 11753, Salmonella typhimujrium DSMZ 17058 и Pseudomonas aeruginosa PAOlp (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol, 41(3): 1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитого белка, состоящего из эндолизина N4gp61 и пептида SMAP-29. Антимикробная активность данного слитого белка представлена в следующей таблице.
Таблица 13:
Слитый белок
Энзимная составляющая
Пептидная цепь
(N-концевая, если не указано иначе)
Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa
Активность в отношении Е. coli
DSMZ 11753
Активность в отношении Salmonella typhimurium DSMZ 17058
SEQ ID NO: 90
N4-gp61
(SEQ ID NO:
23)
SMAP-29 (SEQ ID NO: П)
Сокращения: +: 1 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Пример 7: Антимикробная активность эндолизина gpl88, модифицированного с использованием пептидной цепи на N-конце.
Слитые белки, содержащие эндолизин gpl88 и пептидные цепи а4 спирали, SMAP-29 или Sarcotoxin IA построили в соответствии с описанием в примере 1. Клетки Е. coli DSMZ 11753, Acinetobacter baumannii DSMZ 30007 и Pseudomonas aeruginosa PAOlp (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol, 41(3): 1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитого белка, состоящего из эндолизина gpl88 и соответствующих пептидных цепей. Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице.
Таблица 14:
Слитый белок
Энзимная составляющая
Пептидная цепь (N-концевая, если не указано иначе)
Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa
Активность в отношении Е. coli DSMZ 11753
Активность в отношении Acinetobacter baumannii DSMZ 30007
SEQ IDNO: 94
gpl88
(SEQ ID N0:2)
ос4 helix
(SEQ ID NO: 92)
n.d.
n.d.
SEQ ID NO: 95
gpl 88
(SEQ ID N0:2)
SMAP-29 (SEQ IDNO: 11)
SEQ ID NO: 96
gpl 88
(SEQ ID N0:2)
Sarcotoxin IA (SEQ IDNO: 16)
Сокращения: ± < 1 лог; +: 1 лог; ++: 2-3 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Пример 8: Антимикробная активность эндолизина Salmonella, модифицированного с использованием пептидной цепи SMAP-29 на N-конце.
Слитые белки, содержащие эндолизин Salmonella с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 3 и пептидной цепью SMAP-29 построили в соответствии с описанием в примере 3. Клетки Е. coli DSMZ 11753 и Salmonella typhimurium DSMZ 17058 использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитого белка. Антимикробная активность данного слитого белка представлена в следующей таблице.
Таблица 15:
Слитый белок
Энзимная составляющая
Пептидная цепь
(N-концевая, если не указано иначе)
Активность в отношении Е. coli DSMZ 11753
Активность в отношении Salmonella typhimurium DSMZ 17058
SEQ IDNO: 97
Salmonella endolysin (SEQ ID N0:3)
SMAP-29 (SEQIDNO: 11)
Сокращения: +: 1 лог;
Пример 9: Антимикробная активность эндолизина Acinetobacter baumannii, модифированного с различными пептидными цепями на N-конце.
Слитые белки, содержащие эндолизин Acinetobacter baumannii с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 5 и пептидными цепями SMAP-29, Pseudin 1 и Sushi 1 построили в соответствии с
описанием в примере 3. Клетки Acinetobacter baumannii DSMZ 30007 и Pseudomonas aeruginosa PAOlp (Burn wound isolate, Queen Astrid Hospital, Brussels; Pirnay JP et al. (2003), J Clin Microbiol, 41(3):1192-1202) использовали в качестве тест-штаммов. Исследовали в соответствии с описанием в примере 4 антимикробную активность слитых белков. Антимикробная активность данных слитых белков представлена в следующей таблице 16.
Таблица 16:
Слитый белок
Энзимная составляющая
Пептидная цепь
(N-концевая, если не указано иначе)
Активность в отношении Pseudomonas aeruginosa
Активность в отношении Acinetobacter baumannii DSMZ 30007
SEQ ID NO: 98
Acinetobacter baumannii эндолизин (SEQ ID N0:5)
Pseudin 1 (SEQ ID NO: 29)
не опр.
SEQ ID NO: 99
Acinetobacter baumannii эндолизин (SEQ ID N0:5)
SMAP-29 (SEQ ID NO:
11)
SEQ IDNO: 100
Acinetobacter baumannii эндолизин (SEQ ID N0:5)
Sushi 1
(SEQ ID NO: 32)
Сокращения: ± < 1 лог; +: 1 лог; ++: 2-3 лог; не опр. обозначает, что данный штамм не был тестирован с соответствующим слитым белком.
Слитые белки в табл.11-16 без тагов (меток) и линкеров также были протестированы в соответствии с вышеописанными опытами по определению активности. Все они показали антимикробную активность в отношении используемых бактериальных штаммов (данные не приведены).
Регистрационный номер 134
Владимир В, Гончаров
Евразийский патентный поверенный
SEQUENCE LISTING
<110> Katholieke Universiteit Leuven Lysando Holding Est.
<120> ANTIMICROBIAL AGENTS
<130> LYS-002 PCT
<140> unknown <141> 2010-06-28
<150> 09 163 953.4 <151> 2009-06-26
<160> 100
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> phiKZgpl44 <400> 1
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu 15 10 15
Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly 20 25 30
lie Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp 35 40 45
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly lie Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu 50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro lie Pro Tyr Lys Thr lie Pro Met 65 70 75 80
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala 85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala 100 105 110
Ser lie Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu lie Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115
120
125
Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met lie 130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala 145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg lie Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu lie 165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn lie Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr 180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg 195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro 210 215 220
Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser lie Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser 225 230 235 240
Pro Lys Thr lie Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala 245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> ELgpl88 <400> 2
Met Asn Phe Arg Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gin Ala Leu Val 15 10 15
Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Gin lie Asp Gly Val Trp Gly Lys 20 25 30
Gly Thr Ser Ser Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val
35 40 45
Val Gly Lys Asn Thr Gly Gly lie Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala 50 55 60
Ser Gly Tyr Asn Val lie Thr Ala Leu Gin Arg Asn Leu Ala Phe Leu 65 70 75 80
Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Val Asp Gly lie Trp Gly Asn Gly Thr Leu 85 90 95
Ser Gly Leu Asp Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr 100 105 110
Pro Thr Tyr Asp lie Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr 115 120 125
Ala Lys Val Lys Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg Ala 130 135 140
Pro His Trp Leu Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gin Thr Phe 145 150 155 160
Ser Pro Ser lie Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu lie 165 170 175
Gin Phe Met Ser Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val 180 185 190
lie Arg Ser Met Asp Gin Leu Thr Gin Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr 195 200 205
Phe Glu Met Trp Met Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gin Leu Glu Asp 210 215 220
Phe Tyr Leu Thr lie Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp 225 230 235 240
Glu Val Leu Phe Leu Gin Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gin Asn Lys Gly 245 250 255
Phe Asp Val Asp Lys Asp Gly Lys lie Thr Leu Gly Glu lie Ser Ser 260 265 270
Thr Leu Tyr Thr Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg His 275 280 285
Val lie Ser Tyr 290
<210> 3
<211> 181
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Salmonella endolysin <400> 3
Met Lys Pro Lys Asp Glu lie Phe Asp Glu lie Leu Gly Lys Glu Gly 15 10 15
Gly Tyr Val Asn His Pro Asp Asp Lys Gly Gly Pro Thr Lys Trp Gly 20 25 30
lie Thr Glu Lys Val Ala Arg Ala His Gly Tyr Arg Gly Asp Met Arg 35 40 45
Asn Leu Thr Arg Gly Gin Ala Leu Glu lie Leu Glu Thr Asp Tyr Trp 50 55 60
Tyr Gly Pro Arg Phe Asp Arg Val Ala Lys Ala Ser Pro Asp Val Ala 65 70 75 80
Ala Glu Leu Cys Asp Thr Gly Val Asn Met Gly Pro Ser Val Ala Ala 85 90 95
Lys Met Leu Gin Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn Gin Gly Gly Arg Leu 100 105 110
Tyr Pro Asp Met Asp Thr Asp Gly Arg lie Gly Pro Arg Thr Leu Asn 115 120 125
Ala Leu Arg Val Tyr Leu Glu Lys Arg Gly Lys Asp Gly Glu Arg Val 130 135 140
Leu Leu Val Ala Leu Asn Cys Thr Gin Gly Glu Arg Tyr Leu Glu Leu 145 150 155 160
Ala Glu Lys Arg Glu Ala Asp Glu Ser Phe Val Tyr Gly Trp Met Lys 165 170 175
Glu Arg Val Leu lie 180
<210> 4
<211> 163
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Enterobacteria phage T4 endolysin <400> 4
Met Asn lie Phe Glu Met Leu Arg lie Asp Glu Gly Leu Arg Leu Lys 15 10 15
lie Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr lie Gly lie Gly His Leu 20 25 30
Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys 35 40 45
Ala lie Gly Arg Asn Cys Asn Gly Val lie Thr Lys Asp Glu Ala Glu 50 55 60
Lys Leu Phe Asn Gin Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly lie Leu Arg 65 70 75 80
Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg 85 90 95
Cys Ala Leu He Asn Met Val Phe Gin Met Gly Glu Thr Gly Val Ala 100 105 110
Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gin Gin Lys Arg Trp Asp Glu 115 120 125
Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gin Thr Pro Asn 130 135 140
Arg Ala Lys Arg Val He Thr Thr Phe Arg Thr Gly Thr Trp Asp Ala 145 150 155 160
Tyr Lys Asn
<210> 5
<211> 280
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Acinetobacter baumanii endolysin <400> 5
Met Glu Tyr Asp Met He Leu Lys Phe Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val 15 10 15
Ala Thr Leu Gin Lys Gin Leu Ala Lys Met Gly Tyr Lys Gly Val Lys 20 25 30
Asp Lys Pro Leu Ser Val Asp Gly His Phe Gly Glu Ser Thr Glu Phe 35 40 45
Ala Val He Gin Leu Gin Arg Lys Phe Gly Leu Val Ala Asp Gly Lys 50 55 60
Val Gly Asp Lys Thr Arg Gin Ala Leu Ala Gly Asp Ser Val Ser Lys 65 70 75 80
Phe Leu Lys Asp Glu Asp Tyr Lys Lys Ala Ala He Arg Leu Lys Val 85 90 95
Pro Glu Leu Val He Arg Val Phe Gly Ala Val Glu Gly Leu Gly Val 100 105 110
Gly Phe Leu Pro Asn Gly Lys Ala Lys He Leu Phe Glu Arg His Arg 115 120 125
Met Tyr Phe Tyr Leu Cys Gin Ala Leu Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser 130 135 140
Gin Val Lys He Thr Pro Asn He Val Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr 145 150 155 160
Lys Gly Asp Ala Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala He Asn He 165 170 175
His Lys Glu Ser Ala Leu Met Ser Thr Ser Trp Gly Gin Phe Gin He 180 185 190
Met Gly Glu Asn Trp Lys Asp Leu 195 200
Val Asp Gin Gin Gin Leu Asn Glu 210 215
Arg Phe He 225
Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Leu 245
Leu Gly Tyr Gin Ala Lys Phe Gin 260
He Tyr Arg Glu Lys Thr Ala Ala 275 280
Gly Tyr Ser Ser Val Gin Glu Phe 205
Gly Asn Gin Leu Glu Ala Phe He 220
Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gin 235 240
Tyr Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys 250 255
Lys Glu Trp Asp His Leu Glu Pro 265 270
Glu Trp Lys Pro Gly Leu 230
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> amphipatic peptide Pleurocidin <400> 6
Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Val Gly Lys His Val 15 10 15
Gly Lys Ala Ala Leu- Thr His Tyr Leu 20 25
<210> 7
<211> 31
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> amphipatic peptide Cecropin PI
<400> 7
Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys 1 5 10 15
Arg He Ser Glu Gly He Ala He Ala He Gin Gly Gly Pro Arg 20 25 30
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> amphipatic peptide Buforin II <400> 8
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Val Gly Arg Val His 15 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys 20
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> amphipatic peptide Magainin <400> 9
Gly He Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 15 10 15
Val Gly Glu He Met Asn Ser 20
<210> 10
<211> 37
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> amphipatic peptides Cathelidicine LL-37
<400> 10
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys He Gly Lys Glu 15 10 15
Phe Lys Arg He Val Gin Arg He Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser 35
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29 <400> 11
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly 20 25
<210>
<211>
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Indolicidin
<400> 12
He Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 15 10
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Protegrin <400> 13
Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val 15 10 15
Gly Arg
<210> 14
<211> 36
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin A (A.aegypti) <400> 14
Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg 15 10 15
Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys 20 25 30
Ala Leu Arg Lys 35
<210> 15 <211> 40 <212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin A (D. melanogaster) <400> 15
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin His 15 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Pro Gin Gin Ala Ala 20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly
<210>
<211>
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Sarcotoxin
<400>
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin His 1 5 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Ala Gin Gin Ala Ala 20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg 35
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pentapeptide
<400> 17
Phe Phe- Val Ala Pro 1 5
<210> 18
<211> 152
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> E. coli phage KlF <400> 18
Met Val Ser Lys Val Gin Phe Asn Pro Arg Ser Arg Thr Asp Ala He 15 10 15
Phe Val His Cys Ser Ala Thr Lys Pro Glu Met Asp He Gly Val Glu 20 25 30
Thr He Arg Met Trp His Lys Gin Gin Ala Trp Leu Asp Val Gly Tyr 35 40 45
His Phe He He Lys Arg Asp Gly Thr Val Glu Glu Gly Arg Pro Val 50 55 60
Asn Val Val Gly Ser His Val Lys Asp Trp Asn Ser Arg Ser Val Gly 65 70 75 80
Val Cys Leu Val Gly Gly He Asn Ala Lys Gly Gin Phe Glu Ala Asn 85 90 95
Phe Thr Pro Ala Gin Met Asn Ser Leu Arg Asn Lys Leu Asp Asp Leu 100 105 110
Lys Val Met Tyr Pro Gin Ala Glu He Arg Ala His His Asp Val Ala 115 120 125
Pro Lys Ala Cys Pro Ser Phe Asp Leu Gin Arg Trp Leu Ser Thr Asn 130 135 140
Glu Leu Val Thr Ser Asp Arg Gly 145 150
<210> 19 <211> 39 <212> PRT
<213> unknown <220>
<223> Buforin I <400> 19
Ala Gly Arg Gly Lys Gin Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr 15 10 15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg 20 25 30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr 35
<210> 20
<211> 165
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> PSP3 gplO Salmonella endolysin <400> 20
Met Pro Val He Asn Thr His Gin Asn He Ala Ala Phe Leu Asp Met 15 10 15
Leu Ala Tyr Ser Glu Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg 20 25 30
Gly Tyr Asp Val He Val Thr Gly Phe Asp Gly Ser Pro Glu He Phe 35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Pro Lys Val 50 55 60
Phe Asn Arg Arg Gly Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gin Gin 65 70 75 80
Leu Tyr He Phe Trp Pro His Tyr Lys Lys Gin Leu Ala Leu Pro Asp 85 90 95
Phe Ser Pro Leu Ser Gin Asp Lys Leu Ala He Gin Leu He Arg Glu 100 105 110
Arg Gly Ala He Asp Asp He Arg Ala Gly Arg He Glu Arg Ala Val 115 120 125
Ser Arg Cys Arg Asn He Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly 130 135 140
Gin Arg Glu His Ser Leu Glu Lys Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala 145 150 155 160
Gly Gly Val Met Ala 165
<210>
<211>
165
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
E. coli
<400> 21
Met Pro Val He Asn Thr His Gin Asn He Ala Ala Phe Leu Asp Met 15 10 15
Leu Ala Val Ser Glu Gly Thr Ala Asn His Pro Leu Thr Lys Asn Arg 20 25 30
Gly Tyr Asp Val He Val Thr Gly Leu Asp Gly Lys Pro Glu He Phe 35 40 45
Thr Asp Tyr Ser Asp His Pro Phe Ala His Gly Arg Pro Ala Lys Val 50 55 60
Phe Asn Arg Arg Gly Glu Lys Ser Thr Ala Ser Gly Arg Tyr Gin Gin 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Phe Trp Pro His Tyr Arg Lys Gin Leu Ala Leu Pro Asp 85 90 95
Phe Ser Pro Leu Ser Gin Asp Arg Leu Ala He Gin Leu He Arg Glu 100 105 110
Arg Gly Ala Leu Asp Asp He Arg Ala Gly Arg He Glu Arg Ala He 115 120 125
Ser Arg Cys Arg Asn He Trp Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Tyr Gly 130 135 140
Gin Arg Glu His Ser Leu Glu Lys Leu Val Thr Val Trp Arg Thr Ala 145 150 155 160
Gly Gly Val Pro Ala 165
<210>
<211>
176
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
STM0016
<400>
Asn Pro He He Asp Gly He He Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe 1 5 10 15
Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala Thr His Trp Gly He Thr Glu Ala 20 25 30
Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His 35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Ala He Leu Glu Glu Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly 50 55 60
Phe Asp Val He Ser Thr Leu Ser Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys 65 70 75 80
Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin 85 90 95
Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He 100 105 110
His Val Asp Gly Asn He Gly Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His 115 120 125
Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala 130 135 140
Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn 145 150 155 160
His Asn Asn Glu Gin Phe He Tyr Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr 165 170 175
<210> 23
<211> 208
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> E.coli Phage N4 muramidase N4-gp61 <400> 23
Met Ala He Ser Lys Lys Lys Val Gly Gly Val Gly Gly Val He Ala 15 10 15
Ala He He Ala Ala Val Phe Ala Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp 20 25 30
Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr He Gin Val 35 40 45
Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly 50 55 60
Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn 65 70 75 80
Asp Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro 85 90 95
Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala 100 105 110
Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125
Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly 130 135 140
Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu 145 150 155 160
Ala Cys Lys Leu He Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr 165 170 175
Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn 180 185 190
Arg He Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp He Val Asn 195 200 205
<210>
<211>
184
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
24 N4-gp61
<400>
Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr 15 10 15
Asn His Gly Val Thr He Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu 20 25 30
Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu 35 40 45
Met Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn Asp Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe 50 55 • 60
Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp 65 70 75 80
Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu 85 90 95
Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin 100 105 110
Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu 115 120 125
Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu He Leu Lys Ser 130 135 140
Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu 145 150 155 160
Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu Glu 165 170 175
Arg Cys Asn Glu Asp He Val Asn 180
<210>
<211>
259
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
E.coli ;
<400>
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin 15 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He 20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn 35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro 65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 100 105 110
He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu 130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu 145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys 165 170 175
Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp 180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg 195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys 210 215 220
Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 225 230 235 240
Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 245 250 255
His Arg Lys
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Nigrocine 2
<400> 26
Gly Leu Leu Ser Lys Val Leu Gly Val Gly Lys Lys Val Leu Cys Gly 15 10 15
Val Ser Gly Leu Val Cys 20
<210> 27
<211> 24
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ascaphine 5 <400> 27
Gly He Lys Asp Trp He Lys Gly Ala Ala Lys Lys Leu He Lys Thr 15 10 15
Val Ala Ser His He Ala Asn Gin 20
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Apidaecin <400> 28
Ala Asn Arg Pro Val Tyr He Pro Pro Pro Arg Pro Pro His Pro Arg 15 10 15
Leu
<210> 29
<211> 24
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pseudin 1
<400> 29
Gly Leu Asn Thr Leu Lys Lys Val Phe Gin Gly Leu His Glu Ala He 15 10 15
Lys Leu He Asn Asn His Val Gin 20
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ranalexin <400> 30
Phe Leu Gly Gly Leu He Val Pro Ala Met He Cys Ala Val Thr Lys 15 10 15
Lys Cys
<210> 31
<211> 26
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Melittin <400> 31
Gly He Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 15 10 15
He Ser Trp He Lys Arg Lys Arg Gin Gin 20 25
<210> 32
<211> 34
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Sushi 1
<400> 32
Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg He Ser Cys Leu Pro Asn Gly 15 10 15
Gin Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys He Arg Glu Cys Ala Met Val 20 25 30
Ser Ser
<210> 33
<211> 27
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> WLUB2 variant
<400> 33
Lys Arg Trp Val Lys Arg Val Lys Arg Val Lys Arg Trp Val Lys Arg 15 10 15
Val Val Arg Val Val Lys Arg Trp Val Lys Arg
<210>
<211>
332
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
OBPgpLYS
<400>
Met Gly Ser Lys Asn Ser Glu Lys Asn Ala Ser He He Met Ser He 1 5 10 15
Gin Arg Thr Leu Ala Ser Leu Ser Leu Tyr Gly Gly Arg He Asp Gly 20 25 30
Leu Phe Gly Glu Lys Cys Arg Gly Ala He He Leu Met Leu Asn Lys 35 40 45
Val Tyr Pro Asn Phe Ser Thr Asn Lys Leu Pro Ser Asn Thr Tyr Glu 50 55 60
Ala Glu Ser Val Phe Thr Phe Leu Gin Thr Ala Leu Ala Gly Val Gly 65 70 75 80
Leu Tyr Thr He Thr He Asp Gly Lys Trp Gly Gly Thr Ser Gin Gly 85 90 95
Ala He Asp Ala Leu Val Lys Ser Tyr Arg Gin He Thr Glu Ala Glu 100 105 110
Arg Ala Gly Ser Thr Leu Pro Leu Gly Leu Ala Thr Val Met Ser Lys 115 120 125
His Met Ser He Glu Gin Leu Arg Ala Met Leu Pro Thr Asp Arg Gin 130 135 140
Gly Tyr Ala Glu Val Tyr He Asp Pro Leu Asn Glu Thr Met Asp He 145 150 155 160
Phe Glu He Asn Thr Pro Leu Arg He Ala His Phe Met Ala Gin He 165 170 175
Leu His Glu Thr Ala Cys Phe Lys Tyr Thr Glu Glu Leu Ala Ser Gly 180 185 190
Lys Ala Tyr Glu Gly Arg Ala Asp Leu Gly Asn Thr Arg Pro Gly Asp 195 200 205
Gly Pro Leu Phe Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gin He Thr Gly Arg Leu 210 215 220
Asn Tyr Val Lys Cys Gin Val Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Lys Asp Pro 225 230 235 240
Thr Phe Asp He Thr Ser Ser Val Thr Cys Ala Gin Gin Leu Ser Glu 245 250 255
Ser Pro Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Gly Tyr Phe Trp Arg Phe He 260 265 270
Lys Pro Lys Leu Asn Glu Thr Ala Asp Lys Asp Asp He Tyr Trp Val 275 280 285
Ser Val Tyr Val Asn Gly Tyr Ala Lys Gin Ala Asn Pro Tyr Tyr Pro 290 295 300
Asn Arg Asp Lys Glu Pro Asn His Met Lys Glu Arg Val Gin Met Leu 305 310 315 320
Ala Val Thr Lys Lys Ala Leu Gly He Val Lys Gly 325 330
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 35 Walmaghl
<400> 35
Gly Phe Phe He Pro Ala Val He Leu Pro Ser He Ala Phe Leu He 1 5 10 15
Val Pro
<210> 36
<211> 283
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ascaphine5-KZl44 <400> 36
Gly He Lys Asp Trp He Lys. Gly Ala Ala Lys Lys Leu He Lys Thr 15 10 15
Val Ala Ser His He Ala Asn Gin Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg 20 25 30
Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr 35 40 45
Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin 50 55 60
Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val 65 70 75 80
Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He 85 90 95
Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala 100 105 110
Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser 115 120 125
Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu 130 135 140
He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr 145 150 155 160
Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val 165 170 175
Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala 180 185 190
Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro 195 200 205
Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe 210 215 220
Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu 225 230 235 240
Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He 245 250 255
Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn 260 265 270
Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280
<210>
<211>
276
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Apidaecine-
<400>
Ala Asn Arg Pro Val Tyr He Pro Pro Pro Arg Pro Pro His Pro Arg 15 10 15
Leu Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu 20 25 30
Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly 35 40 45
He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp 50 55 60
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu 65 70 75 80
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met 85 90 95
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala 100 105 110
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala 115 120 125
Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser 130 135 140
Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He 145 150 155 160
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala 165 170 175
Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He 180 185 190
Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr 195 200 205
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg 210 215 220
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro 225 230 235 240
Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser 245 250 255
Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala 260 265 270
Ala His Arg Lys 275
<210> 38
<211> 281
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Nigrocine2-KZ144 <400> 38
Gly Leu Leu Ser Lys Val Leu Gly Val Gly Lys Lys Val Leu Cys Gly 15 10 15
Val Ser Gly Leu Val Cys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp 20 25 30
Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val 35 40 45
Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val 50 55 60
Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys 65 70 75 80
Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr 85 90 95
Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr 100 105 110
Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu 115 120 125
Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys 130 135 140
Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr 145 150 155 160
Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr 165 170 175
Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met 180 185 190
Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu 195 200 205
Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly 210 215 220
Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala 225 230 235 240
Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala" Asn Pro Ser He Phe Tyr 245 250 255
Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met 260 265 270
Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280
<210>
<211>
283
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Pseudinl-
<400>
Gly Leu Asn Thr Leu Lys Lys Val Phe Gin Gly Leu His Glu Ala He 15 10 15
Lys Leu He Asn Asn His Val Gin Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg 20 25 30
Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr 35 40 45
Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin 50 55 60
Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val 65 70 75 80
Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He 85 90 95
Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala 100 105 110
Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser 115 120 125
Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu 130 135 140
He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr 145 150 155 160
Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val 165 170 175
Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala 180 185 190
Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro 195 200 205
Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe 210 215 220
Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu 225 230 235 240
Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He 245 250 255
Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn 260 265 270
Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280
<210> 40
<211> 277
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ranalexin-KZ144
<400> 40
Phe Leu Gly Gly Leu He Val Pro Ala Met He Cys Ala Val Thr Lys 15 10 15
Lys Cys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin 20 25 30
Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp 35 40 45
Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys 50 55 60
Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala 65 70 75 80
Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro 85 90 95
Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn 100 105 110
Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe 115 120 125
Ala Ser He Glu Ser :Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser 130 135 140
Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met 145 150 155 160
He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly 165 170 175
Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu 180 185 190
He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro 195 200 205
Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala 210 215 220
Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe 225 230 235 240
Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly 245 250 255
Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val
265 270
260
Ala Ala His Arg Lys
275
<210>
<211>
286
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
WLBU2-Variant
<400> 41
Lys Arg Trp Val Lys Arg Val Lys Arg Val Lys Arg Trp Val Lys Arg 1 5 10 15
Val Val Arg Val Val Lys Arg Trp Val Lys Arg Lys Val Leu Arg Lys 20 25 30
Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu 35 40 45
Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr 50 55 60
Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp 65 70 75 80
Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser 85 90 95
Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser 100 105 110
Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly 115 120 125
Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe 130 135 140
Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin 145 150 155 160
Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys 165 170 175
Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg 180 185 190
He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He 195 200 205
Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu 210 215 220
Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly 225 230 235 240
Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn 245 250 255
Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu 260 265 270
Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 285
<210> 42
<211> 293
<212> PRT
<213> unknown
<220> <223>
Sushil-KZ144
<400> 42
Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg He Ser Cys Leu Pro Asn Gly 15 10 15
Gin Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys He Arg Glu Cys Ala Met Val 20 25 30
Ser Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin 35 40 45
Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp 50 55 60
Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys 65 70 75 80
Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala 85 90 95
Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro 100 105 110
Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn 115 120 125
Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe 130 135 140
Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser 145 150 155 160
Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met 165 170 175
He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly 180 185 190
Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu 195 200 205
He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro 210 215 220
Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala 225 230 235 240
Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe 245 250 255
Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly 260 265 270
Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val 275 280 285
Ala Ala His Arg Lys 290
<210>
<211>
285
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Melttin-
<400>
Gly He Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 15 10 15
He Ser Trp He Lys Arg Lys Arg Gin Gin Lys Val Leu Arg Lys Gly 20 25 30
Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys 35 40 45
Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe 50 55 60
Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly 65 70 75 80
He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro 85 90 95
Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg 100 105 110
Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val 115 120 125
Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp 130 135 140
Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe 145 150 155 160
Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr 165 170 175
Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He 180 185 190
Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu 195 200 205
Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala 210 215 220
His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin 225 230 235 240
Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro 245 250 255
Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val 260 265 270
Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
280 285
275
<210>
<211>
296
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
LL-37-KZ144
<400>
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys He Gly Lys Glu 15 10 15
Phe Lys Arg He Val Gin Arg He Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu 35 40 45
Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly 50 55 60
Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys 65 70 75 80
Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn 85 90 95
Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys 100 105 110
Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 115 120 125
Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu 130 135 140
Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala 145 150 155 160
Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp 165 170 175
Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 180 185 190
Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly 195 200 205
Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys 210 215 220
Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro 225 230 235 240
Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala 245 250 255
Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn 260 265 270
Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp 275 280 285
Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 290 295
<210> 45
<211> 272
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Indolicidin-KZ144 <400> 45
He Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Val Leu 15 10 15
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu 20 25 30
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn 35 40 45
Asn Thr Phe'Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp 50 55 60
Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys 65 70 75 80
Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn 85 90 95
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala 100 105 110
Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser 115 120 125
Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp 130 135 140
Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp 165 170 175
Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met 180 185 190
Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu 195 200 205
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr 210 215 220
Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin 225 230 235 240
Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He 245 250 255
Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 260 265 270
<210>
<211>
288
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
SMAP-29-
<400>
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Lys Val Leu 20 25 30
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu 35 40 45
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn 50 55 60
Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp 65 70 75 80
Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys 85 90 95
Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn 100 105 110
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala 115 120 125
Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser 130 135 140
Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp 145 150 155 160
Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly 165 170 175
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp 180 185 190
Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met 195 200 205
Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu 210 215 220
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr 225 230 235 240
Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin 245 250 255
Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He 260 265 270
Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 285
<210>
<211>
277
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Protegrin-
<400>
Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val 1 5 10 15
Gly Arg Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin 20 25 30
Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp 35 40 45
Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys 50 55 60
Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala 65 70 75 80
Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro 85 90 95
Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn 100 105 110
Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe 115 120 125
Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser 130 135 140
Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met 145 150 155 160
He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly 165 170 175
Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu 180 185 190
He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro 195 200 205
Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala 210 215 220
Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe 225 230 235 240
Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly 245 250 255
Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val 260 265 270
Ala Ala His Arg Lys 275
<210>
<211>
290
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Cecropin
<400>
Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys 1 5 10 15
Arg He Ser Glu Gly He Ala He Ala He Gin Gly Gly Pro Arg Lys 20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr 35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe 50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys 65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe 85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr 100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu 115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He 130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr 145 150 155 160
Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn 165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg 180 185 190
Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu 195 200 205
Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr 210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe 225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu 245 250 255
Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys 260 265 270
Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His 275 280 285
Arg Lys 290
<210> 49
<211> 282
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Magainin-KZl44
<400> 49
Gly Не Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 15 10 15
Val Gly Glu He Met Asn Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly 20 25 30
Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp 35 40 45
Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val 50 55 60
Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly 65 70 75 80
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro 85 90 95
Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala 100 105 110
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin 115 120 125
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He 130 135 140
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly 145 150 155 160
Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu 165 170 175
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu 180 185 190
Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val 195 200 205
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe 210 215 220
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu 225 230 235 240
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe 245 250 255
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu 260 265 270
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280
<210>
<211>
284
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Pleurocidin-
<400>
Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Val Gly Lys His Val 1 5 10 15
Gly Lys Ala Ala Leu Thr His Tyr Leu Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp 20 25 30
Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly 35 40 45
Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn 50 55 60
Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He 65 70 75 80
Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro 85 90 95
He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala 100 105 110
Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg 115 , 120 125
Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr 130 135 140
Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu 145 150 155 160
Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly 165 170 175
Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser 180 185 190
Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg 195 200 205
Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His 210 215 220
Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn 225 230 235 240
Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser 245 250 255
He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr 260 265 270
Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280
<210>
<211>
295
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Cecropin
<400>
Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg 15 10 15
Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys 20 25 30
Ala Leu Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val 35 40 45
Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys 50 55 60
Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe 65 70 75 80
Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr 85 90 95
Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr 100 105 110
He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val 115 120 125
Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu 130 135 140
Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys 145 150 155 160
Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys 165 170 175
Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro 180 185 190
Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala 195 200 205
Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg 210 215 220
Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly 225 230 235 240
Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr 245 250 255
His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys 260 265 270
Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly 275 280 285
Lys Val Ala Ala His Arg Lys 290 295
<210> 52
<211> 299
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin A (D.melanogaster)-KZ144 <400> 52
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin His 15 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Pro Gin Gin Ala Ala 20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg 35 40 45
Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr 50 55 60
Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin 65 70 75 80
Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val 85 90 95
Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He 100 105 110
Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala 115 120 125
Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser 130 135 140
Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu 145 150 155 160
He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr 165 170 175
Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val 180 185 190
Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala 195 200 205
Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro 210 215 220
Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe 225 230 235 240
Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu 245 250 255
Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He 260 265 270
Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn 275 280 285
Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 290 295
<210>
<211>
280
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Buforinll
<400>
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Val Gly Arg Val His 15 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu 20 25 30
Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly 35 40 45
Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys 50 55 60
Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn 65 70 75 80
Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys 85 90 95
Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 100 105 110
Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu 115 120 125
Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala 130 135 140
Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp 145 150 155 160
Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 165 170 175
Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly 180 185 190
Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys 195 200 205
Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro 210 215 220
Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala 225 230 235 240
Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn 245 250 255
Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp 260 265 270
Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280
<210> 54
<211> 298
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Sarcotoxin IA-KZ144 <400> 54
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin His 1 5 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Ala Girt Gin Ala Ala ' 20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly 35 40 45
Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp 50 55 60
Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val 65 70 75 80
Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly 85 90 95
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro 100 105 110
Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala 115 120 125
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin 130 135 140
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He 145 150 155 160
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly 165 170 175
Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu 180 185 ,190
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu 195 200 205
Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val 210 215 220
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe 225 230 235 240
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu 245 250 255
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe 260 265 270
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu 275 280 285
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 290 295
<210> 55
<211> 200
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ascaphine 5-STM0016 <400> 55
Gly He Lys Asp Trp He Lys Gly Ala Ala Lys Lys Leu He Lys Thr 15 10 15
Val Ala Ser His He Ala Asn Gin Asn Pro He He Asp Gly He He 20 25 30
Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala 35 40 45
Thr His Trp Gly He Thr Glu Ala Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala 50 55 60
Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His Ala Glu Ala Tyr Ala He Leu Glu 65 70 75 80
Glu Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly Phe Asp Val He Ser Thr Leu Ser 85 90 95
Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala 100 105 110
Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His 115 120 125
Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He His Val Asp Gly Asn He Gly Pro 130 135 140
Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu 145 150 155 160
Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr 165 170 175
Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn His Asn Asn Glu Gin Phe He Tyr 180 185 190
Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr 195 200
<210> 56
<211> 198
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Nigrocine2-STM0016 <400> 56
Gly Leu Leu Ser Lys Val Leu Gly Val Gly Lys Lys Val Leu Cys Gly 15 10 15
Val Ser Gly Leu Val Cys Asn Pro He He Asp Gly He He Ala Leu 20 25 30
Glu Gly Gly Tyr Val Phe Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala Thr His 35 40. 45
Trp Gly He Thr Glu Ala Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala Gly Asp 50 55 60
Met Arg Asp Leu Thr His Ala Glu Ala Tyr Ala He Leu Glu Glu Asp 65 70 75 80
Tyr Trp He Lys Pro Gly Phe Asp Val He Ser Thr Leu Ser Trp Pro 85 90 95
Val Ser Phe Glu Leu Cys Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala Tyr His 100 105 110
Pro Ser Ala Trp Leu Gin Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His Glu Gly 115 120 125
Lys Arg Tyr Pro Asp He His Val Asp Gly Asn He Gly Pro Arg Thr 130 135 140
Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu Gly Glu 145 150 155 160
Ala Val Leu Val Lys Ala Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr Tyr Leu 165 170 175
Asn Val Ala Glu Lys Asn His Asn Asn Glu Gin Phe He Tyr Gly Trp 180 185 190
He Lys Asn Arg Val Thr 195
<210> 57
<211> 205
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29-STM0016
<400> 57
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Asn Pro He 20 25 30
He Asp Gly He He Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Asn Pro Lys 35 40 45
Asp Lys Gly Gly Ala Thr His Trp Gly He Thr Glu Ala Thr Ala Arg 50 55 60
Ala His Gly Tyr Ala Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His Ala Glu Ala 65 70 75 80
Tyr Ala He Leu Glu Glu Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly Phe Asp Val 85 90 95
He Ser Thr Leu Ser Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys Asp Ala Ala 100 105 110
Val Asn He Gly Ala Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin Arg Trp Leu 115 120 125
Asn Val Phe Asn His Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He His Val Asp 130 135 140
Gly Asn He Gly Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala 145 150 155 160
Trp Arg Gly Gin Glu Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala Leu Asn Cys 165 170 175
Ser Gin Gly Thr Tyr Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn His Asn Asn 180 185 190
Glu Gin Phe He Tyr Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr
200 205
195
<210>
<211>
215
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Sarcotoxin
<400>
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin His 15 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Ala Gin Gin Ala Ala 20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Asn Pro He He Asp Gly He He Ala 35 40 45
Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala Thr 50 55 60 '
His Trp Gly He Thr Glu Ala Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala Gly 65 70 75 80
Asp Met Arg Asp Leu Thr His Ala Glu Ala Tyr Ala He Leu Glu Glu 85 90 95
Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly Phe Asp Val He Ser Thr Leu Ser Trp 100 105 110
Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala Tyr 115 120 125
His Pro Ser Ala Trp Leu Gin Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His Glu 130 135 140
Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He His Val Asp Gly Asn He Gly Pro Arg 145 150 155 160
Thr Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu Gly 165 170 175
Glu Ala Val Leu Val Lys Ala Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr Tyr 180 185 190
Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn His Asn Asn Glu Gin Phe He Tyr Gly 195 200 205
Trp He Lys Asn Arg Val Thr 210 215
<210> 59
<211> 233
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Melittin-N4gp61
<400> 59
Gly lie Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 ' 10 15
He Ser Trp He Lys Arg Lys Arg Gin Gin Ala He Ser Lys Lys Lys 20 25 30
Val Gly Gly Val Gly Gly Val He Ala Ala He He Ala Ala Val Phe 35 40 45
Ala Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu 50 55 60
Thr Asn His Gly Val Thr He Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu 65 70 75 80
Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin 85 90 95
Glu Met Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn Asp Tyr He Leu Lys Pro Gly 100 105 110
Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val 115 120 125
Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin 130 135 140
Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He 145 150 155 160
Gin Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser 165 170 175
Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu He Leu Lys 180 185 190
Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro 195 200 205
Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu 210 215 220
Glu Arg Cys Asn Glu Asp He Val Asn 225 230
<210> 60
<211> 236
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29-N4gp61
<400> 60
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Ala He Ser 20 25 30
Lys Lys Lys Val Gly Gly Val Gly Gly Val He Ala Ala He He Ala 35 40 45
Ala Val Phe Ala Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro 50 55 60
Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr He Gin Val Ala Gin Lys His 65 70 75 80
Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn 85 90 95
Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn Asp Tyr He Leu 100 105 110
Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu 115 120 125
Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg 130 135 140
Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr 145 150 155 160
Pro Lys He Gin Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala 165 170 175
Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu 180 185 190
He Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu 195 200 205
Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg He Gly Asn 210 215 220
Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp He Val Asn 225 230 235
<210> 61
<211> 210
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Melittin-N4gp61trunc <400> 61
Gly He Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 15 10 15
He Ser Trp He Lys Arg Lys Arg Gin Gin Val Glu Gly Gly Tyr Val 20 25 30
Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr He 35 40 45
Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp 50 55 60
Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser Ser He Tyr 65 70 75 80
Tyr Asn Asp Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val 85 90 95
Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly 100 105 110
Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser 115 120 125
Arg Asn Gly Lys Asp Tyr'Pro Lys He Gin Val Asp Gly Lys Val Gly 130 135 140
Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys 145 150 155 160
Val Glu Ala Cys Lys Leu He Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu 165 170 175
Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He 180 185 190
Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp He 195 200 205
Val Asn 210
<210>
<211>
215
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Cecropin
<400>
Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys 15 10 15
Arg He Ser Glu Gly He Ala He Ala He Gin Gly Gly Pro Arg Val 20 25 30
Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn 35 40 45
His Gly Val Thr He Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu 50 55 60
Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met 65 70 75 80
Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn Asp Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe Val 85 90 95
Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala 100 105 110
Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser 115 120 125
Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin Val 130 135 140
Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin 145 150 155 160
Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu He Leu Lys Ser Leu 165 170 175
Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr 180 185 190
Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg 195 200 205
Cys Asn Glu Asp He Val Asn 210 215
<210>
<211>
213
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
SMAP-2 9-:
<400>
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Val Glu Gly 20 25 30
Gly Tyr Val Asn Asp Pro Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly 35 40 45
Val Thr He Gin Val Ala Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met 50 55 60
Tyr Asn Trp Asp Gly Ser Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser 65 70 75 80
Ser He Tyr Tyr Asn Asp Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe 85 90 95
Ala Asp Val Ser Pro Ala Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val 100 105 110
Asn Thr Gly Pro Ala Arg Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn 115 120 125
Ala Phe Ser Arg Asn Gly Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin Val Asp Gly 130 135 140
Lys Val Gly Ser Gly Thr Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys 145 150 155 160
Arg Gly Lys Val Glu Ala Cys Lys Leu He Leu Lys Ser Leu Asp Gly 165 170 175
Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr 180 185 190
Gly Trp He Ala Asn Arg He Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn 195 200 205
Glu Asp He Val Asn 210
<210> 64
<211> 777
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> KZ144 <400> 64
aaagtattac gcaaaggcga taggggtgat gaggtatgtc aactccagac actcttaaat 60 ttatgtggct atgatgttgg aaagccagat ggtatttttg gaaataacac ctttaatcag 120 gtagttaaat ttcaaaaaga taattgtcta gatagtgatg gtattgtagg taagaatact 180
tgggctgaat
tattcagtaa
atattctcca
cctattcctt
ataaaactat
ccctatgcca
240
actgcaaata
aatcacgtgc
agctgcaact
ccagttatga
atgcagtaga
aaatgctact
300
ggcgttcgta
gccagttgct
actaacattt
gcttctattg
aatcagcatt
cgattacgaa
360
ataaaagcta
agacttcatc
agctactggt
tggttccaat
tccttactgg
aacatggaaa
420
acaatgattg
aaaattatgg
catgaagtat
ggcgtactta
ctgatccaac
tggggcatta
480
cgtaaagatc
cacgtataag
tgctttaatg
ggtgccgaac
taattaaaga
gaatatgaat
540
attcttcgtc
ctgtccttaa
acgtgaacca
actgatactg
atctttattt
agctcacttc
600
tttgggcctg
gtgcagcccg
tcgtttcctg
accactggcc
agaatgaatt
agctgctacc
660
catttcccaa
aagaagctca
ggcaaaccca
tctatttttt
ataacaaaga
tgggtcacct
720
aaaaccattc
aagaagttta
taacttaatg
gatggtaaag
ttgcagcaca
tagaaaa
111
<210> 65 <211> 528 <212> DNA <213> unknown
<220>
<223> STM0016
<400> 65 aacccgatta
tcgatggcat
tatcgcgctg
gaaggaggtt
acgtctttaa
tccgaaagat
aagggtggag
caacacattg
gggtattaca
gaagcgacgg
cacgagcaca
tggttatgca
120
ggagacatgc
gtgatctaac
tcatgccgaa
gcctacgcaa
tacttgagga
ggattactgg
180
atcaaaccgg
gttttgatgt
tatctcaacg
ctgtcgtggc
ctgtgagctt
tgaattgtgt
240
gatgcagcgg
ttaacatagg
tgcataccac
cctagtgcct
ggttacagag
atggcttaac
300
gtgttcaatc
acgaaggcaa
acgctatcca
gacattcatg
tagacggcaa
cattggtccc
360
aggactttag
cagccttaga
acattacttg
gcttggagag
ggcaagaagg
tgaagctgta
420
ctggtgaaag
ctctgaattg
cagccaaggg
acctactatc
taaacgtcgc
tgagaagaac
480
cacaacaacg
aacagttcat
ctacggttgg
atcaagaatc
gtgtgacc
528
<210> 66
<211> 528
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Pseudin 1
<400> 66 aacccgatta
tcgatggcat
tatcgcgctg
gaaggaggtt
acgtctttaa
tccgaaagat
aagggtggag
caacacattg
gggtattaca
gaagcgacgg
cacgagcaca
tggttatgca
120
ggagacatgc
gtgatctaac
tcatgccgaa
gcctacgcaa
tacttgagga
ggattactgg
180
atcaaaccgg
gttttgatgt
tatctcaacg
ctgtcgtggc
ctgtgagctt
tgaattgtgt
240
gatgcagcgg
ttaacatagg
tgcataccac
cctagtgcct
ggttacagag
atggcttaac
300
gtgttcaatc
acgaaggcaa
acgctatcca
gacattcatg
tagacggcaa
cattggtccc
360
aggactttag
cagccttaga
acattacttg
gcttggagag
ggcaagaagg
tgaagctgta
420
ctggtgaaag
ctctgaattg
cagccaaggg
acctactatc
taaacgtcgc
tgagaagaac
480
cacaacaacg
aacagttcat
ctacggttgg
atcaagaatc
gtgtgacc
528
<210> <211> <212> <213>
67 54 DNA
unknown
<220> <223>
Ranalexin
<400> 67 ttcctgggcg
gtctgattgt
tccagctatg
atctgtgcgg
tgaccaaaaa
atgc
<210> <211> <212> <213>
102
DNA
unknown
<220> <223>
Sushi 1
<400> 68 ggcttcaaac
tgaaaggtat
ggctcgtatc
tcctgtctgc
caaacggtca
gtggtctaac
tttccaccga
aatgcatccg
tgaatgcgcg
atggttagct
102
<210> <211> <212> <213>
69 81 DNA
unknown
<220> <223>
WLBU2-Variant
<400> 69 aaacgctggg
ttaaacgcgt
gaaacgtgtc
aaacgttggg
tcaaacgtgt
tgtccgtgta
gtgaaacgtt gggtgaaacg с 81
<210> 70
<211> 78
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Melittin <400> 70
ggtatcggtg ctgtgctgaa agttctgacc actggtctgc cggcactgat ttcttggatc 60 aaacgcaaac gtcagcag 78
<210> 71
<211> 87
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29 <400> 71
cgtggtctgc gtcgcctggg tcgcaaaatt gcgcacggcg tcaaaaaata cggcccgacc 60 gtgctgcgca ttatccgcat cgctggt 87
<210> 72
<211> 75
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Pleurocidin <400> 72
ggctggggtt ctttctttaa aaaagcggct cacgttggca aacatgtagg taaagcagct 60 ctgacccact atctg 75
<210> 73
<211> 108
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin A (A. aegypti) <400> 73
ggcggcctga aaaaactggg caaaaaactg gaaggtgccg gcaaacgtgt gttcaacgct 60 gcagaaaaag cactgccggt tgtagctggt gctaaagctc tccgtaaa 108
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin A (D. melanogaster) <400> 74
ggctggctga aaaaaattgg caaaaaaatc gaacgcgtgg gccagcacac gcgtgatgca 60 accatccagg gtctgggtat cccacagcag gcagctaacg tagccgcgac tgctcgtggt 120
<210> 75
<211> 63
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Buforin II
<400> 75
acccgtagct ctcgtgctgg cctgcagttt ccggttggtc gcgtgcaccg tctgctccgc 60 aaa 63
<210> 76
<211> 117
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> Sarcotoxin IA <400> 76
ggatggctca aaaagattgg caagaaaatc gagcgagtcg gtcagcatac gcgtgatgca 60 actatccagg gtttaggtat cgcacagcaa gcagctaatg tagcagctac tgctcgg 117
<210> 77
<211> 294
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pseudin 1-KZ144 <400> 77
Met Gly Leu Asn Thr Leu Lys Lys Val Phe Gin Gly Leu His Glu Ala 15 10 15
He Lys Leu He Asn Asn His Val Gin Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys 20 25 30
Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu 35 40 45
Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr 50 55 60
Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp 65 70 75 80
Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser 85 90 95
Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser 100 105 110
Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly 115 120 125
Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe 130 135 140
Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin 145 150 155 160
Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys 165 170 175
Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg 180 185 190
He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He 195 200 205
Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu 210 215 220
Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly 225 230 235 240
Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn 245 250 255
Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu 260 265 270
Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu 275 280 285
His His His His His His 290
<210>
<211>
288
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Ranalexin-
<400>
Met Phe Leu Gly Gly Leu He Val Pro Ala Met He Cys Ala Val Thr 15 10 15
Lys Lys Cys Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu 20 25 30
Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly 35 40 45
Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys 50 55 60
Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn 65 70 75 80
Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys 85 90 95
Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro 100 105 110
Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu 115 120 125
Leu Thr Phe Ala Ser He Glu, Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala 130 135 140
Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp 145 150 155 160
Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp 165 170 175
Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly 180 185 190
Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys 195 200 205
Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro 210 215 220
Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala 225 230 235 240
Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn 245 250 255
Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp 260 265 270
Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu His His His His His His 275 280 285
<210>
<211>
306
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Sushil-
<400>
Ala Met Gly Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg He Ser Cys Leu 15 10 15
Pro Asn Gly Gin Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys He Arg Glu Cys 20 25 30
Ala Met Val Ser Ser Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly 35 40 45
Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp 50 55 60
Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val 65 70 75 80
Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly 85 90 95
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro 100 105 110
Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala 115 120 125
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin 130 135 140
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He 145 150 155 160
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly 165 170 175
Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu 180 185 190
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu 195 200 205
Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val 210 215 220
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe 225 230 235 240
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu 245 250 255
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe 260 265 270
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu 275 280 285
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu His His His His 290 295 300
His His
305^
<210>
<211>
297
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
WLBU2-Variant-
<400>
Met Lys Arg Trp Val Lys Arg Val Lys Arg Val Lys Arg Trp Val Lys 15 10 15
Arg Val Val Arg Val Val Lys Arg Trp Val Lys Arg Gly Ser Lys Val 20 25 30
Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu 35 40 45
Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly 50 55 60
Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu 65 70 75 80
Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser 85 90 95
Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala 100 105 110
Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn 115 120 125
Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu 130 135 140
Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly 145 ¦ 150 155 160
Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr 165 170 175
Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys 180 185 190
Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn 195 200 205
Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp 210 215 220
Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu 225 230 235 240
Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala 245 250 255
Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr 260 265 270
He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg 275 280 285
Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210> 81
<211> 296
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Melttin-KZ144 <400> 81
Met Gly He Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala 15 10 15
Leu He Ser Trp He Lys Arg Lys Arg Gin Gin Gly Ser Lys Val Leu 20 25 30
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu 35 40 45
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn 50 55 60
Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp 65 70 75 80
Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys 85 90 95
Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn 100 105 110
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala 115 120 125
Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser 130 135 140
Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp 145 150 155 160
Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly 165 170 175
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp 180 185 190
Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met 195 200 205
Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr. Asp Leu 210 215 220
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr 225 230 235 240
Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin
245. 250 255
Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He 260 265 270
Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 275 280 285
Leu Glu His His His His His His 290 295
<210>
<211>
299
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
SMAP-29-
<400>
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys 15 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Gly Ser 20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin 35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He 50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn 65 70 75 80
Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu 85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro 100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val 115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser 130 135 140
lie Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala 145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu 165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu 180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys 195 200 205
Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp 210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg 225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys 245 250 255
Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro 260 265 270
Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala 275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210>
<211>
306
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Cecropin
<400>
Met Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys 15 10 15
Arg Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala 20 25 30
Lys Ala Leu Arg Lys Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly 35 40 45
Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp 50 55 60
Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin Val 65 70 75 80
Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val Gly 85 90 95
Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He Pro 100 105 110
Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala 115 120 125
Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gin 130 135 140
Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu He 145 150 155 160
Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr Gly 165 170 175
Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu 180 185 190
Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala Leu 195 200 205
Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro Val 210 215 220
Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe 225 230 235 240
Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu Leu 245 250 255
Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He Phe 260 265 270
Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin. Glu Val Tyr Asn Leu 275 280 285
Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu His His His His 290 295 300
His His 305
<210> 84
<211> 295
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pleurocidin-KZ144
<400> 84
Met Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Val Gly Lys His 15 10 15
Val Gly Lys Ala Ala Leu Thr His Tyr Leu Gly Ser Lys Val Leu Arg 20 25 30
Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn 35 40 45
Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn 50 55 60
Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser 65 70 75 80
Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr 85 90 95
Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys 100 105 110
Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr 115 120 125
Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala 130 135 140
Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe 145 150 155 160
Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met 165 170 175
Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro 180 185 190
Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn 195 200 205
He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr 210 215 220
Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr 225 230 235 240
Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala 245 250 255
Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin 260 265 270
Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu 275 280 285
Glu His His His His His His 290 295
<210> 85
<211> 310
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin A (D.melanogaster)-KZ144 <400> 85
Met Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin 15 10 15
His Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Pro Gin Gin Ala 20 25 30
Ala Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys 35 40 45
Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu 50 55 60
Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr 65 70 75 80
Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp 85 90 95
Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser 100 105 110
Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser 115 120 125
Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly 130 135 140
Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe 145 150 155 160
Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin 165 170 175
Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys 180 185 190
Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg 195 200 205
He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He 210 215 220
Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu 225 230 235 240
Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly 245 250 255
Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn 260 265 270
Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu 275 280 285
Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu 290 295 300
His His His His His His 305 310
<210> 86
<211> 291
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> BuforinII-KZ144 <400> 86
Met Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Val Gly Arg Val 15 10 15
His Arg Leu Leu Arg Lys Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg 20 25 30
Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr 35 40 45
Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gin 50 55 ' 60
Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly He Val 65 70 75 80
Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro He 85 90 95
Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala 100 105 110
Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser 115 120 125
Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu 130 135 140
He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe Leu Thr 145 150 155 160
Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val 165 170 175
Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He Ser Ala 180 185 190
Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu Arg Pro 195 200 205
Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe 210 215 220
Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin Asn Glu 225 230 235 240
Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro Ser He 245 250 255
Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val Tyr Asn 260 265 270
Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu His His His 275 280 285
His His His 290
<210>
<211>
309
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Sarcotoxin
<400>
Met Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin 15 10 15
His Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Ala Gin Gin Ala 20 25 30
Ala Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ser Lys Val Leu Arg Lys Gly 35 40 45
Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu Asn Leu Cys 50 55 60
Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn Asn Thr Phe 65 70 75 80
Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly 85 90 95
He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro 100 105 110
Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg 115 120 125
Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly Val 130 135 140
Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser Ala Phe Asp 145 150 155 160
Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gin Phe 165 170 175
Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr 180 185 190
Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg He 195 200 205
Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met Asn He Leu 210 215 220
Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala 225 230 235 240
His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gin 245 250 255
Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin Ala Asn Pro 260 265 270
Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He Gin Glu Val 275 • 280 285
Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys Leu Glu His 290 295 300
His His His His His
305
<210>
<211>
226
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Sarcotoxin
<400>
Met Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin 15 10 15
His Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Ala Gin Gin Ala 20 25 30
Ala Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly Ser Asn Pro He He Asp Gly 35 40 45
He He Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Asn Pro Lys Asp Lys Gly 50 55 60
Gly Ala Thr His Trp Gly He Thr Glu Ala Thr Ala Arg Ala His Gly 65 70 75 80
Tyr Ala Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His Ala Glu Ala Tyr Ala He 85 90 95
Leu Glu Glu Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly Phe Asp Val He Ser Thr 100 105 110
Leu Ser Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys Asp Ala Ala Val Asn He 115 120 125
Gly Ala Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin Arg Trp Leu Asn Val Phe 130 135 140
Asn His Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He His Val Asp Gly Asn He 145 150 155 160
Gly Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His Tyr Leu Ala Trp Arg Gly 165 170 175
Gin Glu Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala Leu Asn Cys Ser Gin Gly 180 185 190
Thr Tyr Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn His Asn Asn Glu Gin Phe 195 200 205
He Tyr Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr Leu Glu His His His His 210 215 220
His His 225
<210> 89
<211> 216
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29-STM0016 <400> 89
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys 15 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Gly Ser 20 ' 25 30
Asn Pro He He Asp Gly He He-Ala Leu Glu Gly Gly Tyr Val Phe 35 40 45
Asn Pro Lys Asp Lys Gly Gly Ala Thr His Trp Gly He Thr Glu Ala 50 55 60
Thr Ala Arg Ala His Gly Tyr Ala Gly Asp Met Arg Asp Leu Thr His 65 70 75 80
Ala Glu Ala Tyr Ala He Leu Glu Glu Asp Tyr Trp He Lys Pro Gly 85 90 95
Phe Asp Val He Ser Thr Leu Ser Trp Pro Val Ser Phe Glu Leu Cys 100 105 110
Asp Ala Ala Val Asn He Gly Ala Tyr His Pro Ser Ala Trp Leu Gin 115 120 125
Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn His Glu Gly Lys Arg Tyr Pro Asp He 130 135 140
His Val Asp Gly Asn He Gly Pro Arg Thr Leu Ala Ala Leu Glu His 145 150 155 160
Tyr Leu Ala Trp Arg Gly Gin Glu Gly Glu Ala Val Leu Val Lys Ala 165 170 175
Leu Asn Cys Ser Gin Gly Thr Tyr Tyr Leu Asn Val Ala Glu Lys Asn 180 185 190
His Asn Asn Glu Gin Phe He Tyr Gly Trp He Lys Asn Arg Val Thr 195 200 205
Leu Glu His His His His His His 210 215
<210> 90
<211> 247
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-2 9-N4gp61 <400> 90
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys 15 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Gly Ser 20 25 30
Ala He Ser Lys Lys Lys Val Gly Gly Val Gly Gly Val He Ala Ala 35 40 45
He He Ala Ala Val Phe Ala Val Glu Gly Gly Tyr Val Asn Asp Pro 50 55 60
Lys Asp Pro Gly Gly Glu Thr Asn His Gly Val Thr He Gin Val Ala 65 70 75 80
Gin Lys His Lys Gin Glu Leu Glu Ser Met Tyr Asn Trp Asp Gly Ser 85 90 95
Met Lys Asn Leu Thr Gin Glu Met Ala Ser Ser He Tyr Tyr Asn Asp 100 105 110
Tyr He Leu Lys Pro Gly Phe Val Lys Phe Ala Asp Val Ser Pro Ala 115 120 125
Val Thr Glu Lys Leu Val Asp Ala Gly Val Asn Thr Gly Pro Ala Arg 130 135 140
Pro Ser Arg Trp Leu Gin Glu Ser Leu Asn Ala Phe Ser Arg Asn Gly 145 150 155 160
Lys Asp Tyr Pro Lys He Gin Val Asp Gly Lys Val Gly Ser Gly Thr 165 170 175
Leu Ser Ala Tyr Lys Ser Leu Gin Asn Lys Arg Gly Lys Val Glu Ala 180 185 190
Cys Lys Leu He Leu Lys Ser Leu Asp Gly Lys Gin Leu Asn Tyr Tyr 195 200 205
Leu Ser Leu Asn Met Pro Glu Tyr Thr Thr Gly Trp He Ala Asn Arg 210 215 220
He Gly Asn Val Pro Leu Glu Arg Cys Asn Glu Asp He Val Asn Leu 225 230 235 240
Glu His His His His His His 245
<210> 91
<211> 624
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> N4gp61
<400> 91 atggccatct
cgaagaaaaa
agttggaggt
gttggtggag
ttattgcggc
aatcattgct
gcagtatttg
ccgttgaagg
tggatacgtt
aatgacccga
aagatccagg
aggtgaaaca
120
aaccatggtg
taactattca
ggtcgcacaa
aaacacaagc
aagaacttga
gtcgatgtat
180
aactgggacg
ggtcaatgaa
gaatctgaca
caggagatgg
cctcaagtat
atattacaac
240
gattatatcc
tcaagcctgg
ctttgtgaaa
tttgcggatg
taagtccagc
ggttacggaa
300
aaacttgtgg
atgctggagt
aaatacaggt
ccagcaagac
caagccgttg
gttacaagaa
360
tccttgaatg
ctttctcacg
caacggcaaa
gattatccga
aaatccaagt
tgacgggaaa
420
gtaggttctg
gaactttgag
tgcttacaaa
agcctgcaga
ataagcgagg
aaaagtggaa
480
gcctgcaaat
taatactgaa
gtctctggat
ggcaagcagc
taaactacta
tctgagcctc
540
aatatgcctg
agtataccac
aggttggatt
gcgaatcgta
ttggaaatgt
gcctttggaa
600
cgctgtaatg
aagatatcgt
caac
624
<210> 92
<211> 13
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> beta 4 helix <400> 92
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val He Thr Thr Phe Arg Thr 15 10
<210> 93
<211> 272
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> beta 4 helix:KZ144 <400> 93
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val He Thr Thr Phe Arg Thr Lys Val Leu 15 10 15
Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gin Leu Gin Thr Leu Leu 20 25 30
Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly He Phe Gly Asn 35 40 45
Asn Thr Phe Asn Gin Val Val Lys Phe Gin Lys Asp Asn Cys Leu Asp 50 55 60
Ser Asp Gly He Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe Ser Lys 65 70 75 80
Tyr Ser Pro Pro He Pro Tyr Lys Thr He Pro Met Pro Thr Ala Asn 85 90 95
Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala 100 105 110
Thr Gly Val Arg Ser Gin Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser He Glu Ser 115 120 125
Ala Phe Asp Tyr Glu He Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp 130 135 140
Phe Gin Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met He Glu Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp 165 170 175
Pro Arg He Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu He Lys Glu Asn Met 180 185 190
Asn He Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu 195 200 205
Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr 210 215 220
Thr Gly Gin Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gin 225 230 235 240
Ala Asn Pro Ser He Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr He 245 250 255
Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys 260 265 270
<210>
<211>
304
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
beta 4
<400>
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val He Thr Thr Phe Arg Thr Asn Phe Arg 15 10 15
Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gin Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly 20 25 30
Leu Tyr Thr Gly Gin He Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser 35 40 45
Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn 50 55 60
Thr Gly Gly He Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn 65 70 75 80
Val He Thr Ala Leu Gin Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser 85 90 95
Leu Thr Val Asp Gly He Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp 100 105 110
Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp 115 120 125
He Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys 130 135 140
Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu 145 150 155 160
Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gin Thr Phe Ser Pro Ser He 165 170 175
Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu He Gin Phe Met Ser 180 185 190
Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val He Arg Ser Met 195 200 205
Asp Gin Leu Thr Gin Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr Phe Glu Met Trp 210 215 220
Met Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gin Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Thr 225 230 235 240
He Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp Glu Val Leu Phe 245 250 255
Leu Gin Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gin Asn Lys Gly Phe Asp Val Asp 260 265 270
Lys Asp Gly Lys He Thr Leu Gly Glu He Ser Ser Thr Leu Tyr Thr 275 280 285
Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg His Val He Ser Tyr 290 295 300
<210> 95
<211> 320
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29:gpl88 <400> 95
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Asn Phe Arg 20 25 30
Thr Lys Asn Gly Tyr Arg Asp Leu Gin Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly 35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Gin He Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser 50 55 60
Ser Thr Glu Thr Leu Leu Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn 65 70 75 80
Thr Gly Gly He Gly Leu Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn 85 90 95
Val He Thr Ala Leu Gin Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser 100 105 110
Leu Thr Val Asp Gly He Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp 115 120 125
Lys Ala Phe Glu Val Tyr Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp 130 135 140
He Ala Trp Ser Gly Lys Val Ser Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys 145 150 155 160
Asp Trp Cys Gly Val His Val Pro Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu 165 170 175
Met Ala Cys Met Ala Phe Glu Thr Gly Gin Thr Phe Ser Pro Ser He 180 185 190
Lys Asn Ala Ala Gly Ser Glu Ala Tyr Gly Leu He Gin Phe Met Ser 195 200 205
Pro Ala Ala Asn Asp Leu Asn Val Pro Leu Ser Val He Arg Ser Met 210 215 220
Asp Gin Leu Thr Gin Leu Asp Leu Val Phe Lys Tyr Phe Glu Met Trp 225 230 235 240
Met Lys Arg Gly Lys Arg Tyr Thr Gin Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Thr 245 250 255
He Phe His Pro Ala Ser Val Gly Lys Lys Ala Asp Glu Val Leu Phe 260 265 270
Leu Gin Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Gin Asn Lys Gly Phe Asp Val Asp 275 280 285
Lys Asp Gly Lys He Thr Leu Gly Glu He Ser Ser Thr Leu Tyr Thr 290 295 300
Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Glu Asn Arg His Val He Ser Tyr 305 310 315 320
<210> 96
<211> 330
<212> PRT
<213> unknown
<220> -
<223> Sarcotoxin IA:gpl88
<400> 96
Gly Trp Leu Lys Lys He Gly Lys Lys He Glu Arg Val Gly Gin His 1 5 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr He Gin Gly Leu Gly He Ala Gin Gin Ala Ala 20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Asn Phe Arg Thr Lys Asn Gly Tyr Arg 35 40 45
Asp Leu Gin Ala Leu Val Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Thr Gly Gin He 50 55 60
Asp Gly Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80
Arg Gly Tyr Ala Glu Val Val Gly Lys Asn Thr Gly Gly He Gly Leu 85 90 95
Pro Thr Thr Ser Asp Ala Ser Gly Tyr Asn Val He Thr Ala Leu Gin 100 105 110
Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Val Asp Gly He 115 120 125
Trp Gly Asn Gly Thr Leu Ser Gly Leu Asp Lys Ala Phe Glu Val Tyr 130 135 140
Lys Glu Arg Tyr Arg Thr Pro Thr Tyr Asp He Ala Trp Ser Gly Lys 145 150 155 160
Val Ser Pro Ala Phe Thr Ala Lys Val Lys Asp Trp Cys Gly Val His 165 170 175
Val Pro Asn His Arg Ala Pro His Trp Leu Met Ala Cys Met Ala Phe 180 185 190
Glu Thr Gly Gin Thr Phe Ser Pro Ser He Lys Asn Ala Ala Gly Ser 195 200 205
Glu Ala Tyr Gly Leu He Gin Phe Met Ser Pro Ala Ala Asn Asp Leu 210 215 220
Asn Val Pro Leu Ser Val He Arg Ser Met Asp Gin Leu Thr Gin Leu 225 230 235 240
Asp Leu Val Phe Lys Tyr Phe Glu Met Trp Met Lys Arg Gly Lys Arg 245 250 255
Tyr Thr Gin Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Thr He Phe His Pro Ala Ser 260 265 270
Val Gly Lys Lys Ala Asp Glu Val Leu Phe Leu Gin Gly Ser Lys Ala 275 280 285
Tyr Leu Gin Asn Lys Gly Phe Asp Val Asp Lys Asp Gly Lys He Thr 290 295 300
Leu Gly Glu He Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Thr Tyr Tyr Lys Gly Leu 305 310 315 320
Leu Pro Glu Asn Arg His Val He Ser Tyr 325 330
<210>
<211>
209
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
SMAP-29
<400>
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 15 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He He Arg He Ala Gly Lys Pro Lys 20 25 30
Asp Glu He Phe Asp Glu He Leu Gly Lys Glu Gly Gly Tyr Val Asn 35 40 45
His Pro Asp Asp Lys Gly Gly Pro Thr Lys Trp Gly He Thr Glu Lys 50 55 60
Val Ala Arg Ala His Gly Tyr Arg Gly Asp Met Arg Asn Leu Thr Arg 65 70 75 80
Gly Gin Ala Leu Glu He Leu Glu Thr Asp Tyr Trp Tyr Gly Pro Arg 85 90 95
Phe Asp Arg Val Ala Lys Ala Ser Pro Asp Val Ala Ala Glu Leu Cys 100 105 110
Asp Thr Gly Val Asn Met Gly Pro Ser Val Ala Ala Lys Met Leu Gin 115 120 125
Arg Trp Leu Asn Val Phe Asn Gin Gly Gly Arg Leu Tyr Pro Asp Met 130 135 140
Asp Thr Asp Gly Arg He Gly Pro Arg Thr Leu Asn Ala Leu Arg Val 145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Arg Gly Lys Asp Gly Glu Arg Val Leu Leu Val Ala 165 170 175
Leu Asn Cys Thr Gin Gly Glu Arg Tyr Leu Glu Leu Ala Glu Lys Arg 180 185 190
Glu Ala Asp Glu Ser Phe Val Tyr Gly Trp Met Lys Glu Arg Val Leu 195 200 205
<210> 98
<211> 303
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pseudin 1:Acinetobacter baumannii endolysin
<400> 98
Gly Leu Asn Thr Leu Lys Lys Val Phe Gin Gly Leu His Glu Ala He 1 5 ,10 15
Lys Leu He Asn Asn His Val Gin Glu Tyr Asp Met He Leu Lys Phe 20 25 30
Gly Ser Lys Gly Asp Ala Val Ala Thr Leu Gin Lys Gin Leu Ala Lys 35 40 45
Met Gly Tyr Lys Gly Val Lys Asp Lys Pro Leu Ser Val Asp Gly His 50 55 60
Phe Gly Glu Ser Thr Glu Phe Ala Val He Gin Leu Gin Arg Lys Phe 65 70 75 80
Gly Leu Val Ala Asp Gly Lys Val Gly Asp Lys Thr Arg Gin Ala Leu 85 90 95
Ala Gly Asp Ser Val Ser Lys Phe Leu Lys Asp Glu Asp Tyr Lys Lys 100 105 110
Ala Ala He Arg Leu Lys Val Pro Glu Leu Val He Arg Val Phe Gly 115 120 125
Ala Val Glu Gly Leu Gly Val Gly Phe Leu Pro Asn Gly Lys Ala Lys 130 135 140
He Leu Phe Glu Arg His Arg Met Tyr Phe Tyr Leu Cys Gin Ala Leu 145 150 155 160
Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser Gin Val Lys He Thr Pro Asn He Val 165 170 175
Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Lys Gly Asp Ala Ala Glu Tyr Thr Arg 180 185 190
Leu Ser Met Ala He Asn He His Lys Glu Ser Ala Leu Met Ser Thr 195 200 205
Ser Trp Gly Gin Phe Gin He Met Gly Glu Asn Trp Lys Asp Leu Gly 210 215 220
Tyr Ser Ser Val Gin Glu Phe Val Asp Gin Gin Gin Leu Asn Glu Gly 225 230 235 240
Asn Gin Leu Glu Ala Phe He Arg 245
Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gin Asp 260
Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys Leu 275 280
Glu Trp Asp His Leu Glu Pro He 290 295
<210> 99
<211> 308
<212> PRT
<213> unknown
<220> <223>
<400> 99
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg 1 5
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg He 20
Met He Leu Lys Phe Gly Ser Lys 35 40
Lys Gin Leu Ala Lys Met Gly Tyr 50 55
Ser Val Asp Gly His Phe Gly Glu 65 70
Leu Gin Arg Lys Phe Gly Leu Val 85
Thr Arg Gin Ala Leu Ala Gly Asp 100
Phe He Glu Trp Lys Pro Gly Leu 250 255
Trp Asp Thr Val Phe Thr Leu Tyr 265 270
Gly Tyr Gin Ala Lys Phe Gin Lys 285
Tyr Arg Glu Lys Thr Ala Ala 300
Lys He Ala His Gly Val Lys Lys 10 15
He Arg He Ala Gly Glu Tyr Asp 25 30
Gly Asp Ala Val Ala Thr Leu Gin 45
Lys Gly Val Lys Asp Lys Pro Leu 60
Ser Thr Glu Phe Ala Val He Gin 75 80
Ala Asp Gly Lys Val Gly Asp Lys 90 95
Ser Val Ser Lys Phe Leu Lys Asp 105 110
SMAP-2 9: Acinetobacter baumannii endolysin
Glu Asp Tyr Lys Lys Ala Ala He Arg Leu Lys Val Pro Glu Leu Val 115 120 125
He Arg Val Phe Gly Ala Val Glu Gly Leu Gly Val Gly Phe Leu Pro 130 135 140
Asn Gly Lys Ala Lys He Leu Phe Glu Arg His Arg Met Tyr Phe Tyr 145 150 155 160
Leu Cys Gin Ala Leu Gly Lys Thr Phe Ala Asn Ser Gin Val Lys He 165 170 175
Thr Pro Asn He Val Asn Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Lys Gly Asp Ala 180 185 190
Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala He Asn He His Lys Glu Ser 195 200 205
Ala Leu Met Ser Thr Ser Trp Gly Gin Phe Gin He Met Gly Glu Asn 210 215 220
Trp Lys Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Val Gin Glu Phe Val Asp Gin Gin 225 230 235 240
Gin Leu Asn Glu Gly Asn Gin Leu Glu Ala Phe He Arg Phe He Glu 245 250 255
Trp Lys Pro Gly Leu Leu Glu Ala Leu Arg Lys Gin Asp Trp Asp Thr 260 265 270
Val Phe Thr Leu Tyr Asn Gly Lys Asn Tyr Lys Lys Leu Gly Tyr Gin 275 280 285
Ala Lys Phe Gin Lys Glu Trp Asp His Leu Glu Pro He Tyr Arg Glu 290 295 300
Lys Thr Ala Ala
305
<210>
100
<211>
313
<212>
PRT
<213>
unknown
<220>
<223>
Sushi 1
<400>
100
Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg He Ser Cys Leu Pro Asn Gly 1 5 10 15
Gin Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys He Arg Glu Cys Ala Met Val 20 25 30
Ser Ser Glu Tyr Asp Met He Leu Lys Phe Gly Ser Lys Gly Asp Ala 35 40 45
Val Ala Thr Leu Gin Lys Gin Leu Ala Lys Met Gly Tyr Lys Gly Val 50 55 60
Lys Asp Lys Pro Leu Ser Val Asp Gly His Phe Gly Glu Ser Thr Glu 65 70 75 80
Phe Ala Val He Gin Leu Gin Arg Lys Phe Gly Leu Val Ala Asp Gly 85 90 95
Lys Val Gly Asp Lys Thr Arg Gin Ala Leu Ala Gly Asp Ser Val Ser 100 105 110
Lys Phe Leu Lys Asp Glu Asp Tyr Lys Lys Ala Ala He Arg Leu Lys 115 120 125
Val Pro Glu Leu Val He Arg Val Phe Gly Ala Val Glu Gly Leu Gly 130 135 140
Val Gly Phe Leu Pro Asn Gly Lys Ala Lys He Leu Phe Glu Arg His 145 150 155 160
Arg Met Tyr Phe Tyr Leu Cys Gin Ala Leu Gly Lys Thr Phe Ala Asn 165 170 175
Ser Gin Val Lys He Thr Pro Asn He Val Asn Thr Leu Thr Gly Gly 180 185 190
Tyr Lys Gly Asp Ala Ala Glu Tyr Thr Arg Leu Ser Met Ala He Asn 195 200 205
He His Lys Glu Ser Ala Leu Met Ser Thr Ser Trp Gly Gin Phe Gin 210 215 220
He Met Gly Glu Asn Trp Lys Asp Leu Gly Tyr Ser Ser Val Gin Glu 225 230 235 240
Phe Val Asp Gin Gin Gin Leu Asn Glu Gly Asn Gin Leu Glu Ala Phe 245 250 255
He Arg Phe He Glu Trp Lys Pro Gly Leu Leu Glu Ala Leu Arg Lys 260 265 270
Gin Asp Trp Asp Thr Val Phe Thr Leu Tyr Asn Gly Lys Asn Tyr Lys 275 280 285
Lys Leu Gly Tyr Gin Ala Lys Phe Gin Lys Glu Trp Asp His Leu Glu 290 295 300
Pro He Tyr Arg Glu Lys Thr Ala Ala 305 310
Формула изобретения
1. Слитый белок, состоящий из энзима, с функцией разрушения клеточной стенки грамотрицательных бактерий, и удлиненной пептидной цепи, слитой с энзимом на N- или С-концах или на обоих концах, в котором удлиненная пептидная цепь представляет собой амфипатичный пептид, Sushi пептид, дефензин, гидрофобный пептид или антимикробный пептид.
2. Слитый белок по п.1, характеризующийся тем, что имеет последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 63 до 90.
3. Слитый белок по пп.1 или 2, характеризующийся тем, что имеет дополнительный аминокислотный остаток на N-конце.
4. Слитый белок по любому из предшествующих п.п., характеризующийся тем, что включает таг или дополнительный белок на С- и/или N-концах.
5. Слитый белок по п.4, характеризующийся тем, что таг или дополнительный белок связаны со слитым белком одним или более дополнительными аминокислотными остатками.
6. Слитый белок по любому из предшествующих п.п., характеризующийся тем, что удлиненная пептидная цепь связана со слитым белком одним или более дополнительными аминокислотными остатками.
7. Слитый белок по п.1, в котором энзим представляет собой эндолизин, аутолизин или бактериоцин.
8. Слитый белок по п.7, в котором энзим имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 22-25.
9. Слитый белок по п.1, в котором антимикробный пептид имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6 до 16 или 26 до 31.
10. Слитый белок по п.1, в котором Sushi пептид имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 32.
11. Слитый белок по п.1, в котором гидрофобный пептид имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 28, 33 или 35.
12. Слитый белок по любому из предшествующих пп., в котором грамотрицательные бактерии относятся к группе, включающей Enterobacteriaceae,
в частности Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, и Yersinia, Pseudomonadaceae,
в частности Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Shewanella, Sphingomonas и Comamonas, Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, Brucella, Francisella, Bordetella, Legionella, Bartonella, Coxiella, Haemophilus, Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Gardnerella, Spirochaetaceae,
в частности Treponema и Borrelia, Leptospiraceae, Campylobacter, Helicobacter, Spirillum, Streptobacillus, Bacteroidaceae,
в частности Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella и Porphyromonas, и Acinetobacter,
в частности A. baumanii.
13. Слитый белок по п.1, в котором амфипатичный пептид состоит как минимум из одного положительно заряженного аминокислотного остатка, относящегося к группе, включающей остатки лизина, аргинина и гистидина, в сочетании с как минимум одним гидрофобным аминокислотным остатком из группы, включающей остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина.
14. Слитый белок по п.1, в котором либо как минимум 70% упомянутых аминокислотных остатков в упомянутом амфипатичном пептиде представляют собой остатки аргинина или лизина, либо как минимум примерно 30% упомянутых аминокислотных остатков в упомянутом амфипатичном пептиде представляют собой остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина, гистидина, треонина, серина, пролина и глицина.
15. Слитый белок по любому из предшествующих п.п., в котором удлиненная пептидная цепь состоит из как минимум примерно от 5 до 100
аминокислотных остатков, в частности от 5 до 50 аминокислотных остатков, в частности от 5 до 30 аминокислотных остатков.
16. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-15.
17. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16.
18. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16 или вектор по п. 17.
19. Клетка-хозяин по п. 18, характеризующаяся тем, что представляет собой бактериальную или дрожжевую клетку.
20. Применение слитого белка по любому из п.п. 1-15 в качестве медикаментозного препарата, средства диагностики или компонента косметического препарата.
21. Применение слитого белка по любому из п.п. 1-15 в качестве медикаментозного препарата для лечения или профилактики инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями.
22. Применение слитого белка по любому из п.п. 1-15 в качестве дезинфектанта.
23. Применение слитого белка по любому из п.п. 1-15 для обработки или профилактики заражения грамотрицательными бактериями пищевых продуктов, оборудования на предприятиях пищевой промышленности, поверхностей, контактирующих с пищевыми продуктами, медицинского оборудования, поверхностей в стационарах и хирургических блоках.
24. Применение слитого белка по любому из п.п. 1-15 в качестве средства диагностики в медицине, пищевой промышленности и природоохранной деятельности.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по любому из п.п.1-15.
Евразийский патентный поверенный
Владимир В. Гончаров
Регистрационный номер 184