|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[**] В заявке описан новый трансгенный вариант сахарной свеклы, обозначенный как GM RZ13. В заявке описаны также нуклеиновые кислоты, которые являются уникальными для варианта GM RZ13. В заявке описаны также анализы выявления присутствия варианта GM RZ13 на основе последовательностей ДНК рекомбинантных конструкций, встроенных в геном сахарной свеклы, которые приводят к образованию варианта GM RZ13, и геномных последовательностей, фланкирующих сайт инсерции. В заявке описаны также растения сахарной свеклы, имеющие генотип GM RZ13, и способы получения растения сахарной свеклы путем скрещивания растения сахарной свеклы, имеющего генотип GM RZ13, с этим же или другим сортом сахарной свеклы. В заявке описаны также семена растений сахарной свеклы, имеющие генотип GM RZ13.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула: В заявке описан новый трансгенный вариант сахарной свеклы, обозначенный как GM RZ13. В заявке описаны также нуклеиновые кислоты, которые являются уникальными для варианта GM RZ13. В заявке описаны также анализы выявления присутствия варианта GM RZ13 на основе последовательностей ДНК рекомбинантных конструкций, встроенных в геном сахарной свеклы, которые приводят к образованию варианта GM RZ13, и геномных последовательностей, фланкирующих сайт инсерции. В заявке описаны также растения сахарной свеклы, имеющие генотип GM RZ13, и способы получения растения сахарной свеклы путем скрещивания растения сахарной свеклы, имеющего генотип GM RZ13, с этим же или другим сортом сахарной свеклы. В заявке описаны также семена растений сахарной свеклы, имеющие генотип GM RZ13. 110794 15 Заявка № 201100945 Заявитель Зингента Партисипейшнс АГ, СН ТРАНСГЕННЫЙ ВАРИАНТ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ GM RZ13 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новому трансгенному варианту сахарной свеклы, обозначенному как GM RZ13, и к нуклеиновым кислотам, которые являются уникальными для варианта GM RZ13. Изобретение относится 25 также к анализам, предназначенным для выявления присутствия варианта GM RZ13 на основе последовательностей ДНК рекомбинантных конструкций, встроенных в геном сахарной свеклы, которые приводят к получению варианта GM RZ13, и к геномным последовательностям, фланкирующим сайт инсерции. Представлены также варианты осуществления изобретения, касающиеся 30 растений сахарной свеклы, содержащих генотип GM RZ13, которые являются устойчивыми к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы (BNYVV), способов получения растения сахарной свеклы путем скрещивания растения сахарной свеклы, содержащего генотип GM RZ13, с таким же растением или с - 2 - другим сортом сахарной свеклы. Семена растений сахарной свеклы, содержащие генотип GM RZ13, также являются объектами настоящего изобретения. Предпосылки создания изобретения Настоящее изобретение относится в целом к области молекулярной 5 биологии растений, трансформации растений и селекции растений. Более конкретно изобретение относится к устойчивым к болезням трансгенным растениям сахарной свеклы, содержащим новый трансгенный генотип, и к способам выявления присутствия ДНК растения сахарной свеклы в образце, и к комбинациям этих вариантов. 10 Вирус некротического пожелтения жилок свеклы (BNYVV) является возбудителем ризомании (Tamada и Baba, 1973), одной из наиболее важных болезней сахарной свеклы во всем мире, которая может снижать урожайность чувствительных сортов на величину, составляющую вплоть до примерно 90% (Johansson, 1985). У инфицированных растений сахарной свеклы может быть 15 также снижено содержание сахара в главных корнях на величину, составляющую от примерно 17% до примерно 11%. Ризомания впервые описана в Италии 1950-ых годах (Canova, 1959), но в настоящее время имеются данные о том, что ею поражено более 80% площадей, на которых возделывается сахарная свекла, во всем мире (Lennefors и др., 2005). BNYVV передается с помощью Polymyxa betae 20 (Tamada, 1975), представителя почвообитающих протоктистов, споры которого в покоящемся состоянии могут оставаться живыми в почве в течение более чем 15 лет (Abe и Tamada, 1986). Характерными симптомами заболевания разомании ("бешенство корней") у сахарной свеклы является наличие пожелтевших, карликовых, маленьких 25 главных корней и повышенное количество волокнистых корней. Для сосудистых тканей главного корня характерно изменение цвета на светло-коричневый. В редких случаях вирус распространяется системным путем на листья, приводя к некротическому пожелтению жилок, но, как правило, вирус остается ограниченным корневым тканями (Johansson, 1985; Tamada, 1975). 30 Различные генетические штаммы или изоляты BNYVV идентифицированы с помощью анализов на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов или полиморфизма конформации одной цепи (Kruse и др., 1994; Koenig и др., 1995). Основные группы (типы) европейских изолятов BNYVV обозначены как - 3 - А, В и Р, из которых тип А является наиболее широко распространенным. Для типов А и В характерно наличие четырех одноцепочечных геномных РНК, а тип Р содержит также пятый вид РНК. Р-тип считается более патогенным или вирулентым, чем А- и В-типы (Heijbroek и др., 1999). 5 Поскольку другие стратегии, такие, например, как биологическая борьба или внесение минеральных удобрений, не обеспечивают достаточные уровни устойчивости или требуют применения фунгицидов или фумигантов, то, как правило, считается, что для гарантии экономической рентабельности производства сахарной свеклы в почвах, зараженных ризоманией необходимо 10 осуществлять интрогрессию обусловливающих устойчивость генов в культивары сахарной свеклы. Вследствие распространения ризомании компании, занимающиеся выведением новых сортов сахарной свеклы, уже в течение 20 лет интенсивно осуществляют программы по селекции с целью создания устойчивых к ризомании сортов. Первый выпущенный на рынок устойчивый к ризомании 15 сорт, обозначенный как "Rizor", был получен на основе зародышевой плазмы из итальянских источников (Biancardi и др., 2002; De Biaggi, 1987). Однако наибольшее количество известных к настоящему времени коммерческих устойчивых к ризомании сортов получены с использованием в качестве источника линии Holly (Lewellen и др., 1987), в которой устойчивость к BNYVV 20 обусловливает основной доминантный ген Rzl (Pelsy и Merdinoglu, 1996; Scholten и др., 1996). В настоящее время этот традиционный тип устойчивости присутствует примерно в 90% устойчивых к ризомании сортов сахарной свеклы. Другими источниками устойчивости к BNYVV являются WB41 и WB42, которые были получены из двух растений Beta vulgaris ssp maritime, собранных в Дании 25 (Lewellen и др. 1987; Whitney, 1989). Создана линия устойчивой к ризомании сахарной свеклы С48 путем скрещивания WB41 и WB42 с линией С37 (Lewellen и Whitney, 1993). В настоящее время в нескольких сортах объединена устойчивость, присущая линии С48, с устойчивостью, присущей линии Holly. Другими источниками устойчивости к ризомания являются WB151, WB169, С28 30 и С50 (Lewellen, 1995). Однако устойчивость к BNYVV растений сахарной свеклы, полученная из традиционных источников, вероятно, является лишь частичной, поскольку имеет место заражение растений вирусом, который затем начинает размножаться. Хотя - 4 - размножение вируса является более низким по сравнению с размножением в чувствительных генотипах, такой уровень размножения вируса все еще дает ему возможность распространяться. Кроме того, при повышенных уровнях заражения вирусом существует риск того, что традиционные источники не 5 обеспечат достаточный уровень устойчивости. Кроме того, селекция по признаку устойчивости к ризомании ограничена стойкостью традиционного признака устойчивости в пуле зародышевой плазмы сахарной свеклы. Так, выраженные симптомы ризомании, вызываемые высокопатогенными измененными штаммами BNYVV, обнаружены у 10 устойчивых к ризомании устойчивых сортов, в которых в качестве источника применялась линии Holly (Liu и др., 2005). Эти высокопатогенные измененные штаммы BNYVV были обнаружены в некоторых областях в США и Европе в течение нескольких последних лет. Весьма вероятно (и уже даже обнаружено в полевых условиях) что частичная устойчивость, обусловленная традиционными 15 источниками устойчивости (типа Holly или С48) преодолевается этими высокопатогенными измененными штаммами BNYVV. В противоположность интрогрессии генов из традиционных источников устойчивости использование трансгенной экспрессии выведенных из вируса последовательностей является альтернативным решением вопроса борьбы с 20 вирусными болезнями, эта стратегия известна как выведенная из патогена устойчивость. Концепция выведенной из паразита или патогена устойчивости была создана Sanford и Johnston (1985) и впервые опробована на трансгенных растениях табака (Nicotiana tabacum), экспрессирующих ген оболочечного белка вируса табачной мозаики (Powell-Abel и др., 1986). После этого было 25 продемонстрировано, что она применима для многих различных культур и в отношении большого числа вирусов (Kaniewski и Lawson, 1998). Помимо растений, экспрессирующих гены оболочечных белков, устойчивость была достигнута также у растений, экспрессирующих и другие вирусные последовательности типа, например, репликазы или обусловливающих 30 дисфункцию транспортных белков (Baulcombe, 1996). Открытие того факта, что растения имеют врожденную защитную систему в отношении вирусных инвазий, основой которой является специфическое для последовательности расщепление чужеродных или аномальных РНК, обозначенное как пост-транскрипционное - 5 - молчание генов, нашло широкое применение и представляет собой инструмент для создания устойчивости к вирусам и значительно повышает возможности трансгенной экспрессии выведенных из вирусов последовательностей (Waterhouse и др., 1999; Voinnet, 2001). 5 Были высказаны предположения о механизмах, лежащих в основе трансгенной устойчивости к вирусным инфекциям. Однако, данные о том, что трансгенная устойчивость к вирусам и пост-транскрипционное молчание генов (PTGS) в некоторых случаев совместно участвуют во многих характеристиках, привели к возникновению новых взглядов и явились предпосылками создания 10 устойчивости к вирусам у растений (Waterhouse и др., 2001; Tenllado и др., 2004). Установлено, что трансформация табака конструкцией, содержащей инвертированный повтор вирусных последовательностей, которые выведены из вируса картофеля Y, приводящая к трансгенной экспрессии dsPHK, обеспечивает высокий уровень устойчивости с исключительно высокой частотой (Waterhouse 15 и др., 1998). Таким образом, может оказаться целесообразным обеспечивать устойчивость к BNYVV у сахарной свеклы путем трансформации сахарной свеклы конструкцией, содержащей инвертированный повтор вирусных последовательностей, выведенных из BNYVV, что приводит к трансгенной экспрессии dsPHK, обеспечивающей высокие уровни устойчивости к вирусу. 20 На экспрессию чужеродных генов в растениях может влиять их положение на хромосоме, возможно из-за структуры хроматина или близости регулирующих транскрипцию элементов к сайту интеграции (см., например, Weising и др., "Foreign Genes in Plants", Ann. Rev. Genet. 22, 1988, cc. 421-477). По этой причине часто необходимо осуществлять скрининг большого количества 25 вариантов для идентификации варианта, отличающегося оптимальной экспрессией интодуцированного представляющего интерес гена. Например, для растений и других организмов установлено, что между индивидуальными отобранными вариантами могут существовать широкие вариации в уровнях экспрессии гетерологичного гена, интродуцированного в хромосому 30 растительного генома. Могут иметься также различия в пространственных или временных схемах экспрессии, например, различия в относительном уровне экспрессии трангсгена в различных растительных тканях, что может не соответствовать схемам, ожидаемым на основе регулирующих транскрипцию - 6 - элементов, присутствующих в интродуцированной генной конструкции. Вариант, характеризующийся требуемым уровнем или схемой экспрессии трансгена, можно применять для интрогрессии трансгена в другие генетические фоны путем полового аутокроссинга с использованием традиционных методов 5 разведения. Потомство таких скрещиваний сохраняет характеристики трансгенной экспрессии исходного трансформанта. Эту стратегию применяют для гарантии надежности генной экспрессии в ряде сортов, которые хорошо адаптированы к местным условиям возделывания. Таким образом, актуальной является также обеспечение возможности 10 выявления присутствия конкретного варианта в растении с целью решения вопроса о том, будет ли потомство полового скрещивания содержать представляющий интерес трансген. Кроме того, важным является способ выявления конкретного варианта, удовлетворяющего, например, требованиям, которым необходимо соответствовать на стадии до поступления в продажу и 15 разработки этикетки для пищевых продуктов, полученным из рекомбинантных культурных растений. Выявление присутствия трансгена можно осуществлять с помощью хорошо известного метода обнаружения нуклеиновых кислот, включая (но, не ограничиваясь только ими) термальную амплификацию (полимеразная цепная реакция (ПЦР)) с использованием полинуклеотидных праймеров или 20 ДНК-гибридизацию с использованием нуклеотидйых зондов. Как правило, для простоты и однородности реагентов и методологий, применяемых для обнаружения конкретной конструкции ДНК, которую использовали для трансформации различных сортов растений, эти методы обнаружения, как правило, основаны на часто применяемых генетических элементах, например, 25 промоторах, терминаторах и маркерных генах, поскольку для многих конструкций ДНК область кодирующей последовательности является взаимозаменяемой. В результате такие методы могут оказаться непригодными для дискриминации конструкций, которые различаются только по кодирующей последовательности. Кроме того, указанные методы не пригодны для 30 дискриминации различных вариантов, прежде всего полученных с помощью одной и той же конструкции ДНК, если последовательность хромосомной ДНК, примыкающая к встроенной гетерологичной ДНК ("фланкирующая ДНК"), не является известной. - 7 - Исходя из вышеизложенного, следует считать, что существует необходимость в устойчивом к BNYVV трансгенном варианте сахарной свеклы, который отличается выраженной устойчивостью к BNYVV, превышающей устойчивость, полученную при использовании традиционных источников, и 5 отличается стабильной устойчивостью к высокопатогенным измененным штаммам BNYVV, которые обнаружены в настоящее время. Указанный устойчивый к BNYVV трансгенный вариант сахарной свеклы содержит нуклеотидные последовательности, уникальные для трансгенного варианта сахарной свеклы, которые можно применять для идентификации трансгенного 10 варианта сахарной свеклы и для обнаружения нуклеиновых кислот из трансгенного варианта сахарной свеклы в биологическом образце. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к трансформированной сахарной свекле (Beta vulgaris L.), обозначенной как GM RZ13 (или SBVR111, обозначение, 15 которое можно применять взаимозаменяемо с обозначением GM RZ13), которая имеет новый трансгенный генотип, включающий инвертированный повтор, который содержит часть транскрипта гена RNA-1 BNYVV. Эта часть гена RNA-1 BNYVV кодирует ген РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) или репликазы. Вариант GM RZ13 может содержать также ген тапА (известный также как pmi) 20 из Escherichia coli, который кодирует белок фосфоманнозоизомеразы (PMI), придающий клеткам сахарной свеклы способность утилизировать маннозу в качестве источника углерода. Вариант GM RZ13 обозначают также как SBVR111. Изобретение относится также к трансгенным растениям сахарной свеклы, которые имеют генотип, предлагаемый в изобретении, семенам 25 трансгенных растений сахарной свеклы, которые имеют генотип, предлагаемый в изобретении, и способам получения трансгенного растения сахарной свеклы (например, гибридного растения), которое имеет генотип, предлагаемый в изобретении, путем скрещивания инбредной линии сахарной свеклы, которая имеет генотип, предлагаемый в изобретении, с такой же или другой линией 30 сахарной свеклы, имеющей другой генотип. Трансгенные растения сахарной свеклы, предлагаемые в изобретении, могут иметь практически все морфологические и физиологические характеристики соответствующего изогенного нетрансгенного растения сахарной свеклы в дополнение к - 8 - характеристикам, которые придает растению сахарной свеклы новый генотип, предлагаемый в изобретении. В европейском патенте ЕР 1169463 описано применение последовательностей, которые содержат от 15 и вплоть до 6746 нуклеотидов 5 генома RNA1 вируса некротического пожелтения жилок свеклы (BNYVV), в антисмысловом подходе для придания устойчивости к BNYVV растению сахарной свеклы. Однако в этом патенте не представлены какие-либо данные о полевых опытах и, в частности, отсутствуют данные о полевых опытах на почвах, зараженных различными штаммами BNYVV, прежде всего новыми и 10 агрессивными высокопатогенными измененными штаммами BNYVV. Однако, с другой стороны, конкретный вариант, предлагаемый в настоящем изобретении, обеспечивает устойчивое и сильное снижение титра вируса всех типов BNYVV по сравнению с вариантами с традиционной устойчивостью, и, кроме того, обеспечивает строгий контроль нового высокопатогенного штамма BNYVV. 15 В публикации Lennefors с соавторами (2006), которая относится к опосредуемой dsPHK устойчивости к заражению BNAVV сахарной свеклы, описана трансформация сахарной свеклы с использованием конструкции, предлагаемой в настоящем изобретении, и устойчивые к BNYVV растения сахарной свеклы, полученные в результате указанной трансформации. Однако в 20 этой публикации не представлена какая-либо конкретная информация, касающаяся конкретного устойчивого к BNYVV варианта, предлагаемого в настоящем изобретении, и поэтому она не позволяет специалисту в данной области создавать указанный вариант. Настоящее изобретение относится также к композициям и способам 25 выявления присутствия нуклеиновых кислот из варианта GM RZ13 на основе последовательности ДНК инвертированного повтора, который содержит фрагмент гена репликазы BNYVV, встроенный в геном сахарной свеклы, что приводит к получению варианта GM RZ13, и геномных последовательностей, фланкирующих встроенный сайт. Вариант GM RZ13 можно характеризовать 30 также путем анализа уровней экспрессии белков PMI, а также путем оценки эффективности в отношении BNYVV. Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула - 9 - нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является уникальной для варианта GM RZ13. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей по 5 меньшей мере 10 смежных нуклеотидов гетерологичной последовательности ДНК, которая встроена в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM RZ13, и по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов геномной ДНК растения сахарной свеклы, фланкирующих сайт инсерции гетерологичной последовательности ДНК, встроенной в геном растения сахарной свеклы 10 варианта сахарной свеклы GM RZ13. В некоторых вариантах этого объекта изобретения молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся этим объектом изобретения, может содержать по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов гетерологичной последовательности ДНК, которая встроена в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной 15 свеклы GM RZ13, и по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов геномной ДНК растения сахарной свеклы, фланкирующих сайт инсерции гетерологичной последовательности ДНК, встроенной в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM RZ13. Следует понимать, что понятие "по меньшей мере х нуклеотидов" 20 включает молекулы нуклеиновых кислот, в которых количество нуклеотидов имеет любое численное значение, начинающееся с х, и выше. Например, под понятие "по меньшей мере 15 нуклеотидов" подпадают молекулы нуклеиновых кислот, имеющие 16, 17, 18, 19, 20 и большее количество нуклеотидов. В другом варианте этого объекта изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты, 25 прежде всего в выделенной форме, содержит в качестве последовательности, уникальной для варианта GM RZ13, нуклеотидную последовательность, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и их комплементы. В другом варианте этого объекта изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты, входящая в семя сахарной свеклы, 30 представляет собой молекулу, которая депонирована в NCIMB, Абердин, Шотландия под регистрационным № 41601. Следующим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула нуклеиновой кислоты, - 10 - содержащая по меньшей мере одну стыковочную последовательность варианта GM RZ13. Стыковочная последовательность охватывает область стыка между гетерологичной последовательностью ДНК, содержащей инвертированный повтор, который включает фрагмент гена репликазы BNYVV, встроенный в 5 геном сахарной свеклы, и ДНК из генома сахарной свеклы, которая фланкирует сайт инсерции, и она является диагностической для варианта GM RZ13. В одном из вариантов этого объекта изобретения стыковочную последовательность выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и их комплементы. 10 Следующим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула нуклеиновой кислоты, соединяющая гетерологичную молекулу ДНК с геномом растения сахарной свеклы в варианте сахарной свеклы GM RZ13, которая содержит последовательность, имеющую от примерно 11 до примерно 20 смежных 15 нуклеотидов. Следует понимать, что длина указанной выделенной нуклеотидной последовательности может иметь любое численное значение в указанном диапазоне. В одном из вариантов этого объекта изобретения нуклеиновую кислоту выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и их комплементы. 20 Другим объектом изобретения является ампликон, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в изобретении. В одном из вариантов этого объекта изобретения ампликон содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в изобретении, которую выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID 25 NO: 8, SEQ ID NO: 9 и их комплементы. Еще одним объектом изобретения являются праймерные фланкирующие последовательности, предназначенные для обнаружения варианта GM RZ13. Указанные праймерные фланкирующие последовательности содержат нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 10-15 30 смежных нуклеотидов из 5'- или 3'-фланкирующей последовательности. И в этом случае следует понимать, что длина указанной праймерной фланкирующей последовательности может иметь любое численное значение в указанном диапазоне. В одном из вариантов этого объекта изобретения смежные -11 - нуклеотиды выбирают из нуклеотидов 1-237 (включительно) SEQ ID NO: 8 (условно обозначена в контексте настоящего описания как 5'-фланкирующая последовательность, эта последовательность представлена в настоящем описании как SEQ ID NO: 9) или ее комплементов. В другом варианте этого 5 объекта изобретения смежные нуклеотиды выбирают из нуклеотидов 1-347 (включительно) SEQ ID NO: 2 (условно обозначена в контексте настоящего как 3'-фланкирующая последовательность, эта последовательность представлена в настоящем описании как SEQ ID NO: 3) или ее комплементов. Следующим объектом настоящего изобретения является пара 10 полинуклеотидных праймеров, содержащая первый полинуклеотидный праймер и второй полинуклеотидный праймер, которые функционируют вместе в присутствии в образце в качестве матрицы ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13 с образованием ампликона, диагностического для варианта GM RZ13. В одном из вариантов этого объекта изобретения одна из праймерных 15 последовательностей представляет собой или является комплементарной геномной последовательности растения сахарной свеклы, которая фланкирует сайт инсерции гетерологичной последовательности ДНК, встроенной в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM RZ13, а вторая полинуклеотидная праймерная последовательность представляет собой или 20 является комплементарной гетерологичной последовательности ДНК, встроенной в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM RZ13. В одном из вариантов этого объекта изобретения одну из праймерных последовательностей выбирают из SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9. В другом варианте этого объекта изобретения первый 25 полинуклеотидный праймер содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из SEQ ID N0:3 или из положений 461 - 807 SEQ ID NO: 2, или их комплементы, или содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из SEQ ID N0:9 или из положений 1 - 237 SEQ ID NO: 8, или их комплементы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первый 30 полинуклеотидный праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25 и их комплементы. В другом варианте этого объекта изобретения второй - 12 - полинуклеотидный праймер содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, выведенных из положений 1-460 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, или выведенных из положений 238-484 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, или их комплементы. В 5 следующем варианте этого объекта изобретения второй полинуклеотид праймер выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26 и их комплементы. В другом варианте этого объекта изобретения пару праймеров выбирают из группы пар праймеров, включающей (а) полинуклеотидный 10 праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 13, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (б) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 14, в качестве первого полинуклеотидного праймера, 15 и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (в) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 15, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ 20 ID NO: 18, и их комплементы; (г) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 16, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (д) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в 25 SEQ ID NO: 12, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в любой из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, в SEQ ID NO: 6, и их комплементы; (e) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 19, в качестве первого полинуклеотидного праймера, 30 и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24, и их комплементы; (ж) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный - 13 - праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24, и их комплементы; и (з) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого 5 представлена в SEQ ID NO: 26, и их комплементы. В другом варианте этого объекта изобретения пару праймеров выбирают из группы пар праймеров, включающей (а) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 13, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого 10 представлена в SEQ ID NO: 11 или в SEQ ID NO: 17, и их комплементы; (б) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 12, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 21 или в SEQ ID NO: 22, и их комплементы; полинуклеотидный праймер, 15 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 19, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23, и их комплементы; и полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй 20 полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23, и их комплементы. Следующим объектом изобретения являются способы выявления присутствия ДНК, уникальной для варианта GM RZ13, в биологическом образце. Указанные способы заключаются в том, что: (а) приводят в контакт образец, 25 содержащий ДНК, с парой праймеров, которые при их применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из варианта сахарной свеклы GM RZ13 продуцируют ампликон, который является диагностическим для варианта сахарной свеклы GM RZ13; (б) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и (в) 30 выявляют ампликон. В предпочтительном варианте осуществления изобретения применяемая в вышеуказанном способе пара праймеров представляет собой одну из указанных выше пар праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения способ - 14 - выявления присутствия ДНК, уникальной для варианта GM RZ13, в биологическом образце, представляет собой либо основанный на применении геля анализ, который включает стадии, на которых (I) приводят в контакт образец, содержащий нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, с парой 5 праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 12, или парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 18; (II) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и (III) выявляют ампликон; либо TaqMan(r)-aнaлиз, который включает стадии, на 10 которых (I) приводят в контакт образец, содержащий нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, с парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, и ТаяМап(r)-зондом, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; (II) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и 15 (III) выявляют повышение флуоресценции, испускаемой репортерным красителем, отщепленным от зонда и отделенным от гасителя красителем во время стадии амплификации (II). В другом варианте осуществления изобретения указанный метод заключается в том, что: (а) приводят в контакт образец с зондом, гибридизующимся в строгих условиях с геномной ДНК из варианта GM 20 RZ13 и не гибридизующимся в строгих условиях с ДНК из контрольного растения сахарной свеклы; (б) подвергают образец и зонд гибридизации в строгих условиях и (в) определяют гибридизацию зонда с молекулой нуклеиновой кислоты. В другом варианте этого объекта изобретения ампликон или зонд содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, 25 включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и их комплементы. Следующим объектом изобретения является набор, предназначенный для обнаружения нуклеиновых кислот, уникальных для варианта GM RZ13, в биологическом образце. Набор включает по меньшей мере одну молекулу 30 нуклеиновой кислоты, содержащую смежные полинуклеотиды, длина которых достаточна для того, чтобы функционировать в качестве праймера или зонда в методе обнаружения нуклеиновой кислоты, и которые при амплификации или гибридизации с нуклеотидной последовательностью-мишенью в образце с - 15 - последующим выявлением ампликона, или гибридизации с последовательностью-мишенью, являются диагностическими в отношении присутствия в образце нуклеотидных последовательностей, уникальных для варианта GM RZ13. Набор содержит также другие материалы, необходимые для 5 осуществления методов гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот. В одном из вариантов этого объекта изобретения молекула нуклеиновой кислоты, входящая в набор, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 10 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и их комплементы. Настоящее изобретение относится также к растению сахарной свеклы, 15 имеющему трансгенный генотип, предлагаемый в изобретении, где трансгенный генотип обусловливает устойчивость растения сахарной свеклы к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы или способность утилизировать маннозу в качестве источника углерода, или как устойчивость к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, так и способность утилизировать 20 маннозу в качестве источника углерода. В одном из вариантов этого объекта изобретения трансгенный генотип, обусловливающий устойчивость растения сахарной свеклы к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы и способность утилизировать маннозу в качестве источника углерода, содержит кодирующую последовательность pmi. Одним из объектов изобретения являются 25 растения и семена сахарной свеклы, устойчивые к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которые содержат одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении. Одним из примеров растения сахарной свеклы, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, является сахарная свекла, семена которой, содержащие молекулы 30 нуклеиновых кислот, предлагаемые в изобретении, депонированы 11 декабря 2008 г в NCIMB и имеют регистрационный № 41601. Изобретение относится также к растениям, полученным из растения сахарной свеклы, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, предлагаемого в настоящем -16 - изобретении, семена которого депонированы в NCIMB под регистрационным № 41601. Еще одним объектом изобретения являются семена, депонированные в NCIMB под регистрационным № 41601, а также трансгенное устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, 5 которое образуется, выведено или получено из этих семян. Еще одним объектом настоящего изобретения является биологический образец, полученный из растения, ткани или семени сахарной свеклы GM RZ13, где образец содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной последовательности, уникальной для 10 варианта GM RZ13, и где последовательность можно обнаруживать в образце с помощью метода амплификации нуклеиновых кислот или метода гибридизации нуклеиновых кислот. В одном из вариантов этого объекта изобретения нуклеотидная последовательность представляет собой или является комплементарной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. 15 Другим объектом настоящего изобретения является экстракт, полученный из растения, ткани или семени сахарной свеклы GM RZ13, где образец содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной последовательности, уникальной для варианта GM RZ13, и где последовательность можно обнаруживать в образце с помощью метода 20 амплификации нуклеиновых кислот или метода гибридизации нуклеиновых кислот. В одном из вариантов этого объекта изобретения нуклеотидная последовательность представляет собой или является комплементарной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. В предпочтительном варианте осуществления изобретения метод амплификации нуклеиновых кислот 25 или гибридизации нуклеиновых кислот, который можно применять для обнаружения нуклеотидной последовательности, которая представляет собой или является комплементарной последовательности, уникальной для варианта GM RZ13, в биологическом образце, предлагаемом в настоящем изобретении, или в экстракте, предлагаемом в настоящем изобретении, представляет собой 30 метод выявления присутствия молекулы нуклеиновой кислота, которая является уникальной для варианта GM RZ13, предлагаемого в настоящем изобретении и описанного выше. - 17 - Другим объектом настоящего изобретения является способ получения растения сахарной свеклы, устойчивого по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, заключающийся в том, что (а) осуществляют половое скрещивание первого родительского растения сахарной 5 свеклы и второго родительского растения сахарной свеклы, где первое или второе родительское растение сахарной свеклы содержит ДНК варианта GM RZ13, с получением множества растений поколения первой генерации; (б) отбирают растение поколения первой генерации, которое обладает устойчивостью по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок 10 свеклы, (в) дают самоопыляться растению поколения первой генерации, получая тем самым множество растений поколения второй генерации; и (г) отбирают из растений поколения второй генерации растение, которое обладает устойчивостью по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы; в котором растения поколения второй генерации содержат 15 нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7. В предпочтительном варианте способа получения растения сахарной свеклы, устойчивого по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, указанное первое или второе 20 родительское растение сахарной свеклы, применяемое на стадии а), которое содержит ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13, представляет собой устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении и описанное выше, или растение, полученное из семян, предлагаемых в настоящем изобретении и 25 описанных выше. Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридного семени сахарной свеклы. Способы заключаются в том, что: (а) получают устойчивую к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы линию сахарной 30 свеклы в качестве первой родительской линии, (б) получают вторую линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; где одна из родительских линия, полученных на стадии (а) или стадии (б), представляет собой линию с цитоплазматической мужской стерильностью - 18 - (ЦМС) и где другая родительская линия обладает мужской фертильностью, и (в) дают растениям родительской линии, обладающей мужской фертильностью, опылять цветки родительской линии, обладающей мужской стерильностью, дают развиваться семенам и собирают гибридные семена, где собранные гибридные 5 семена представляют собой семена устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридного растения сахарной свеклы. В одном из вариантов этого объекта изобретения обладающая мужской стерильностью (ЦМС) родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии (а) или (б), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит 10 нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта GM RZ13. В другом варианте этого объекта изобретения вторую родительскую линию выбирают из группы, включающей (а) инбредную линию растения сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которая 15 имеет другой генотип, но содержит одну или несколько или все нуклеотидные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении; (б) инбредную линию растения сахарной свеклы, устойчивую или толерантную по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которая имеет происхождение из встречающегося в естественных условиях источника, 20 выбранного из группы, включающий Holly-источник, WB41, WB42, WB151, WB169, С28, С48, С50 или Rizor, или получена в результате их скрещивания; и (в) инбредную линию растения сахарной свеклы, не обладающую устойчивостью к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего 25 изобретения является гибридное семя устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы. Согласно одному из объектов настоящего изобретения гибридное семя получают с помощью способа получения устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридного семени сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении. 30 Следующим объектом настоящего изобретения является устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, полученное путем выращивания гибридного семени, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно гибридное растение содержит ДНК варианта - 19 - сахарной свеклы GM RZ13. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является часть устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридного растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно указанную 5 часть выбирают из группы, включающей семена, микроспоры, протопласты, клетки, семяпочки, пыльцу, вегетативные части, семядоли, зиготы. Следующим объектом настоящего изобретения является применение устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы или его клеток или тканей, биологического образца или 10 экстракта, предлагаемого в настоящем изобретении, в способе, выбранном из группы, включающем способы получения сахара, способы аэробной ферментации и способы анаэробной ферментации. Предпочтительно указанное применение представляет собой применение устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы или его 15 клеток или тканей, биологического образца или экстракта, предлагаемого в настоящем изобретении, в способе получения сахара. Другие объекты настоящего изобретения относятся к способу получения сахара, в котором устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы или его клетки или ткани, биологический 20 образец или экстракт, предлагаемый в настоящем изобретении, перерабатывают с получением сахара. Кроме того, настоящее изобретение относится к сахару, полученному с помощью способа получения сахара, предлагаемого в настоящем изобретении. И, наконец, последним объектом настоящего изобретения является способ 25 получения одного или нескольких видов биотоплива, выбранного из группы, включающей этанол, бутанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, в котором устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы или его клетки или ткани, биологический образец или экстракт, предлагаемый в настоящем изобретении, перерабатывают с получением одного 30 или нескольких видов биотоплива, выбранного из группы, включающей этанол, бутанол, биогазы и/или дизельное биотопливо. Кроме того, изобретение относится к биотопливу или видам биотоплива, выбранному(ым) из группы, включающей этанол, бутанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, которое(ые) - 20 - получен(ы) с помощью способа получения одного или нескольких видов биотоплива, предлагаемого в настоящем изобретении. Вышеизложенные и другие объекты изобретения должны стать очевидными из приведенного ниже подробного описания изобретения. 5 Определения Приведенные ниже определения и способы представлены с целью лучшего понимания настоящего изобретения в качестве руководства, позволяющего обычному специалисту в данной области воплотить на практике настоящее изобретение. Понятия, применяемые в настоящем описании, если не указано 10 иное, имеют значения, которые используют обычные специалисты в соответствующей области. Определения общепринятых в молекулярной биологии понятий содержатся также у Rieger и др., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5-ое изд., изд-во Springer-Verlag: New York, 1994. Номенклатура оснований ДНК и аминокислот, применяемая в контексте настоящего описания, 15 представлена в 37 C.F.R. § 1.822. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения подразумевается, если из контекста ясно не следует иное, что употребляемое в единственном числе существительное включает также множественное число. Так, например, ссылка на "растение" включает одно или несколько растений, а 20 ссылка на "клетку" включает смеси клеток, тканей и т.п. Понятия "вирус некротического пожелтения жилок свеклы" или "BNYVV" в контексте настоящего описания относится к возбудителю ризомании. Вирус принадлежит к роду Benyvirus и переносится почвообитающими протоктистами (Polymyxa betae). 25 Понятие "ризомания" в контексте настоящего описания относится к одному из наиболее важных заболеваний сахарной свеклы, вызываемому заражением вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (BNYVV). Симптомами заболевания (называемого также "бешенством корней") являются пожелтение растений, карликовость, наличие маленьких главных корней и повышенное 30 количество волокнистых корней. Для сосудистых тканей главного корня характерно изменение цвета на светло-коричневый. Если в редких случаях вирус распространяется системным путем на листья, то это приводит к некротическому пожелтению жилок. - 21 - Понятие "кодирующая последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая транскрибируется в РНК, такую как мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК (малая ядерная РНК), смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме с образованием белка. 5 Она может представлять собой "непрерывную кодирующую последовательность", т.е. последовательность, в которой отсутствуют интрон, такую как кДНК, или может включать один или несколько интронов, ограниченных соответствующими сплайсинговыми стыками. "Интрон" представляет собой последовательность РНК, которая входит в первичный 10 транскрипт, но которая удаляется в результате расщепления и повторного лигирования РНК в клетке с образованием зрелой мРНК, которая может транслироваться в белок. В контексте настоящего описания понятие "сахарная свекла" относится ко всем видам и подвидам рода Beta, а также ко всем сортам культурной свеклы 15 Beta vulgaris на любой стадии развития. Культурные сорта свеклы подразделяют на четыре группы: листовая свекла, огородная свекла, кормовая свекла и сахарная свекла. Понятие "сахарная свекла" относится также ко всем культурным сортам свеклы, включая сорта, выращиваемые для целей, отличных от получения сахара, например, для получения этанола, пластиков или 20 индустриальных продуктов. В частности понятие "сахарная свекла" относится к кормовой свекле и сахарной свекле, но наиболее предпочтительно к сахарной свекле. Понятие "сахарная свекла" относится также к растениям сахарной свеклы, адаптированным для выращивания в тропических или субтропических регионах. 25 Понятие "культивируемые (культурные)" касательно растений сахарной свеклы относится к любому растению сахарной свеклы, которое выращено с целью его коммерческого производства. Понятие "культивируемое (культурное) растение сахарной свеклы" относится к растениям, которые подготавливали к культивированию и подвергали избирательной селекции с целью выращивания. 30 К культурным растениям сахарной свеклы не относятся виды дикого типа, которые содержат признак, предлагаемый в настоящем изобретении, в качестве встречающегося в естественных условиях признака и/или части их естественного генетического фона. - 22 - Понятие "клетка растения сахарной свеклы" относится к структурной и физиологической единице растения сахарной свеклы, включающей протопласт и клеточную оболочку. Клетка растения сахарной свеклы может находиться в форме выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки или 5 представлять собой часть высокоорганизованной единицы, такой, например, как ткань растения, орган растения или целое растение. Понятие "материал растения сахарной свеклы" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, пыльникам, зиготам, семенам, отводкам, культурам клеток или тканей или 10 любой другой части или продукту растения. Оно включает также каллус или ткань каллуса, а также экстракты (например, экстракты главных корней) или образцы. Как правило, понятие "материал растения сахарной свеклы" относится к относительно не переработанному растительному материалу, включающему интактные растительные клетки. 15 "Орган растения сахарной свеклы" обозначает отдельную и четко структурно оформленную дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, листовая почка или зародыш. В контексте настоящего описания понятие "ткань растения сахарной свеклы" относится к группе клеток растения сахарной свеклы, организованных в 20 виде структурной и функциональной единицы. Под это понятие подпадает любая ткань растения сахарной свеклы, присутствующая в самом растении или находящаяся в культуре. Это понятие включает (но, не ограничиваясь только ими) целые растения, органы растения, семена растения, культуру ткани и любые группы клеток растения сахарной свеклы, которые организованы в виде 25 структурных и/или функциональных единиц. Использование этого понятия в сочетании с указанием какого-либо конкретного типа ткани растения сахарной свеклы (или безотносительно к нему), как это имеет место выше или в ином месте в настоящем описании, не следует истолковывать в том смысле, что оно не может относиться к любому другому типу ткани растения сахарной свеклы. 30 Понятие "экспрессия" при применении касательно нуклеотидной последовательности, такой как ген, ОРС или их часть или трансгенное растение, относится к процессу преобразования генетической информации, кодируемой в гене, в РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК или мяРНК) посредством - 23 - "транскрипции" гена (т.е. посредством ферментативной активности РНК-полимеразы) и, если это возможно, в белок (когда ген кодирует белок) посредством "трансляции" мРНК. Экспрессию генов можно регулировать на многих стадиях этого процесса. Например, в случае антисмысловых 5 конструкций или конструкций dsPHK соответственно понятие "экспрессия" может относиться к транскрипции только антисмысловой РНК или только dsPHK. Кроме того, понятие "экспрессия" относится к транскрипции и стабильному накоплению смысловой (мРНК) или функциональной РНК. Понятие "экспрессия" может относиться также к производству белка. 10 В контексте настоящего описания понятие "набор для обнаружения" относится к набору, применяемому для выявления присутствия или отсутствия в образце ДНК из растений варианта GM RZ13. Набор для обнаружения включает нуклеотидные зонды и/или праймеры, предлагаемые в настоящем изобретении, которые гибридизуются специфически в строгих условиях с 15 последовательностью ДНК-мишени, и другие материалы, необходимые для осуществления методов гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего описания понятие "вариант (случай)" относится к рекомбинантному растению сахарной свеклы, полученному путем трансформации клетки или ткани растения сахарной свеклы гетерологичной 20 ДНК, например, кассетой экспрессии, которая включает представляющий интерес ген, и регенерации. Понятие "вариант (случай)" относится к исходному трансформанту и/или потомству трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Понятие "вариант (случай)" относится также к потомству, полученному путем полового ауткроссинга трансформанта и другой линии 25 сахарной свеклы. Даже после повторного возвратного скрещивания с рекуррентным (родительская форма, с которой гибрид скрещивается вновь) родителем встроенная ДНК и фланкирующая ДНК из трансформированного родительского растения присутствуют в потомстве, полученном от скрещивания, в той же самой локализации на хромосоме. Понятие "вариант (случай)" 30 относится также к ДНК из исходного трансформанта, который содержит встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно примыкающую к встроенной ДНК, которая, как ожидается, должна переноситься в потомство, которое приобретает встроенную ДНК, - 24 - включающую представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая включает встроенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), и родительской линии, которая не содержит встроенную ДНК. 5 Как правило, трансформация растительной ткани приводит к получению нескольких вариантов, каждый из которых несет инсерцию конструкции ДНК в различной локализации в геноме растительной клетки. Конкретный вариант можно отбирать на основе экспрессии трансгена или других требуемых характеристик. Понятия "вариант GM RZ13", "GM RZ13" или "GM RZ13- 10 вариант" можно использовать взаимозаменяемо для варианта сахарной свеклы GM RZ13 , предлагаемого в настоящем изобретении. Вариант сахарной свеклы GM RZ13 известен также как SBVR111. . В контексте настоящего описания понятие "уникальный" относится к отличительным характеристикам варианта GM RZ13. Таким образом, 15 нуклеиновые кислоты, уникальные для варианта GM RZ13, не встречаются в других, не относящихся к варианту GM RZ13 растениям сахарной свеклы. Вариант растения сахарной свеклы GM RZ13, обладающий устойчивостью к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, можно получать путем первого полового скрещивания первого родительского растения сахарной 20 свеклы, которое представляет собой растение сахарной свеклы, выращенное из трансгенного варианта растения сахарной свеклы GM RZ13, такое как растение сахарной свеклы GM RZ13, выращенное из семени, которое депонировано в NCIMB под регистрационным № 41601, и его потомство, полученное в результате трансформации кассетами экспрессии, представляющими собой 25 варианты осуществления настоящего изобретения, которые придают устойчивость к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, и второго родительского растения сахарной свеклы, у которого отсутствует устойчивость к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы или которое отличается лишь толерантностью или лишь частичной устойчивостью к вирусу, получая тем 30 самым множество растений поколения первой генерации; и последующего отбора растения поколения первой генерации, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы; и самоопыления растения поколения первой генерации с получением множества растений поколения второй - 25 - генерации; последующего отбора из растений поколения второй генерации растения, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. В эти стадии можно дополнительно включать возвратное скрещивание устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения 5 поколения первой генерации или устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения поколения второй генерации или растения поколения третьей генерации с получением растения сахарной свеклы, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. Растения, толерантные к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, представляют 10 собой растения, в которых скорость размножения патогена является высокой, но при этом развитие растения не замедляется. Частичная устойчивость присутствует в растениях сахарной свеклы в случаях, когда растения инфицируются, но скорость размножения вируса является более низкой, чем в растениях, имеющих чувствительный генотип. 15 В контексте настоящего описания "кассета экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью обеспечивать экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, она содержит промотор, функционально связанный с представляющей(ими) интерес нуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), 20 которая(ые) функционально связана(ы) с сигналами терминации. Она, как правило, содержит также последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной(ых) последовательности(ей). Кассета экспрессии может содержать также последовательности, которые не являются необходимыми для обеспечения экспрессии представляющей(их) интерес 25 нуклеотидной(ых) последовательности(ей), но присутствие которых связано с созданием соответствующих сайтов рестрикции, предназначенных для удаления кассеты из экспрессионного вектора. Кассета экспрессии, которая содержит представляющую(ие) интерес нуклеотидную(ые) последовательность(и), может быть химерной, т.е. по меньшей мере один из ее компонентов является 30 гетерологичным относительно по меньшей мере одного из других ее компонентов. Кассета экспрессии может представлять собой также кассету, которая встречается в естественных условиях, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако, как -26 - правило, кассета экспрессии является гетерологичной для хозяина, т.е. конкретная нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты не встречается в естественных условиях в клетке-хозяине и ее необходимо интродуцировать в клетку-хозяина или предшественника клетки-хозяина с 5 помощью известного в данной области метода трансформации. Экспрессия нуклеотидной(ых) последовательности(ей) в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только при воздействии на клетку-хозяина некоторых определенных внешних стимулов. В случае 10 многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфическим для конкретной ткани или органа или стадии развития. Кассету экспрессии или ее фрагмент при трансформации растения можно обозначать также как "встроенная последовательность" или "последовательность-вставка". Понятие "ген" относится к определенной области, которая локализована в 15 геноме и которая помимо указанной выше кодирующей последовательности может содержать другие, прежде всего регуляторные нуклеотидные последовательности, ответственные за контроль экспрессии, т.е. за транскрипцию и трансляцию кодирующей области. Ген может содержать другие 5'- и З'-нетранслируемые последовательности и терминирующие 20 последовательности. Могут присутствовать другие элементы, например, интроны. Понятие "представляющий интерес ген" относится к любому гену, который при переносе в растение придает растению требуемый признак или фенотип, такой, например, как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, 25 устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, толерантность к гербицидам, повышенная питательная ценность, улучшенные характеристики с позиций промышленного процесса или измененная репродуктивная способность. В контексте настоящего описания понятие "генотип" относится к 30 генетическому материалу, наследуемому от родительских растений сахарной свеклы, который не весь обязательно экспрессируется в потомстве растений сахарной свеклы. Генотип GM RZ13 относится к гетерологичному - 27 - генетическому материалу, которым трансформирован геном растения, а также к генетическому материалу, фланкирующему встроенную последовательность. "Гетерологичная" нуклеотидная последовательность обозначает нуклеотидную последовательность, которая не встречается в естественных 5 условиях в клетке-хозяине, в которую она интродуцирована, включая не встречающиеся в естественных условиях множественные копии встречающейся в естественных условиях нуклеотидной последовательности. Понятие "гетерологичный" касательно гена или нуклеиновой кислоты относится к гену, который кодирует фактор, который не встречается в его естественном 10 окружении (т.е. измененный человеком). Например, гетерологичный ген может включать ген из одного вида, интродуцированный в другой вид. Гетерологичный ген может также включать ген, нативный для организма, который изменен каким-либо образом (например, в результате мутаций, добавления множества копий, связывания с ненативной промоторной или энхансерной 15 последовательностью и т.д.). Гетерологичные гены могут содержать также растительные генные последовательности, которые содержат формы кДНК растительного гена; последовательности кДНК можно экспрессировать либо в смысловой (с получением мРНК), либо в антисмысловой ориентации (с получением антисмыслового РНК-транскрипта, который является 20 комплементарным мРНК-транскрипту). Согласно одному из объектов изобретения гетерологичные гена отличаются от эндогенных растительных генов тем, что гетерологичные генные последовательности, как правило, сцеплены с нуклеотидными последовательностями, которые содержат регуляторные элементы, такие как промоторы, которые не ассоциированы в 25 естественных условиях с геном белка, кодируемого гетерологичным геном, или с растительными генными последовательностями в хромосоме, или ассоциированы с частями хромосомы, которые не встречаются в естественных условиях (например, гены, экспрессируемые в локусах, в которых ген в норме не экспрессируется) 30 "Гомологичная нуклеотидная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, которая в естественных условиях ассоциирована с клеткой-хозяином, в которую она интродуцирована. -28 - Понятие "полинуклеотид" в контексте настоящего описания относится к полимеру ДНК или РНК. Понятие "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, необязательно содержат 5 синтетические не встречающиеся в естественных условиях или измененные нуклеотидные основания, которые можно встраивать в полимеры ДНК или РНК, состоят из мономеров (нуклеотидов), которые содержат сахар, фосфат и основание, относящееся либо к пуринам, либо к пиримидинам. Если специально не указано иное, то под понятие подпадают нуклеиновые кислоты, которые 10 содержат известные аналоги встречающихся в естественных условиях нуклеотидов, обладающие сходными способностями к связыванию с нуклеиновой референс-кислотой, и которые метаболизируются аналогично пути метаболизма встречающихся в естественных условиях нуклеотидов. "Фрагмент нуклеиновой кислоты" представляет собой часть данной молекулы нуклеиновой 15 кислоты. В высших растениях дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой генетический материал, а рибонуклеиновая кислота (РНК) участвует в переносе информации, входящей в ДНК, на белки. Понятие "нуклеотидная последовательность" или "последовательность нуклеиновой кислоты" относится к полимеру ДНК или РНК, который может быть одно- или 20 двухцепочечным, необязательно содержащему синтетические, невстречающиеся в естественных условиях или измененные нуклеотидные основания, которые могут включаться в полимеры ДНК или РНК. Понятия "нуклеотидная последовательность" или "последовательность нуклеиновой кислоты" можно применять взаимозаменяемо для обозначения гена, кДНК, ДНК и РНК, 25 кодируемой геном. Понятие "выделенный" в контексте молекул нуклеиновых кислот, предлагаемых в настоящем изобретении, относится к нуклеотидной последовательности, идентифицированной в хромосоме и выделенной/отделенной от хромосомной нуклеотидной последовательности, 30 присутствующей в соответствующем организме-источнике. Выделенная нуклеиновая кислота не является нуклеиновой кислотой, которая встречается в естественных условиях, если реально существует ее встречающийся в естественных условиях дубликат. В противоположность этому, невыделенные - 29 - нуклеиновые кислоты представляют собой нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, которые находятся в таком же состоянии, в котором они встречаются в естественных условиях. Например, конкретная последовательность ДНК (например, ген) присутствует в хромосоме клетки-хозяина вблизи от соседних 5 генов. Выделенная нуклеотидная последовательность может находиться в одноцепочечной или двухцепочечной форме. В альтернативном варианте она может содержать смысловую и антисмысловую цепи (т.е. нуклеотидная последовательность может быть двухцепочечной). В контексте растительного генома молекула нуклеиновой кислоты, предлагаемая в изобретении, отличается 10 от ее встречающихся в естественных условиях дубликатов инсерционным участком, встроенным в геном, и последовательностями, фланкирующими указанный инсерционный сайт. В предпочтительном варианте осуществления изобретения подразумевается, что молекулы нуклеиновых кислот, предлагаемые в изобретении, должны быть выделенными. 15 Понятия "белок", "пептид" и "полипептид" в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо. Понятие "функционально связаны" относится к ассоциации нуклеотидных последовательностей на одном фрагменте нуклеиновой кислоты так, что функция одной оказывает воздействие на функцию другой. Например, промотор 20 функционально связан с кодирующей последовательностью или функциональной РНК, когда он обладает способностью воздействовать на экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК (т.е. транскрипция кодирующей последовательности или функциональной РНК находится под контролем промотора). Кодирующие последовательности в смысловой или 25 антисмысловой ориентации могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями. "Праймеры" в контексте настоящего описания означают выделенные нуклеиновые кислоты, которые обладают способностью к ренатурации с комплементарной цепью ДНК-мишени в результате гибридизации нуклеиновых 30 кислот с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени, а затем к удлинению цепи ДНК-мишени с помощью полимеразы, такой как ДНК-полимераза. Пары или наборы праймеров можно применять для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, например, с помощью полимеразной цепной - 30 - реакции (ПЦР) или других общепринятых методов амплификации нуклеиновых кислот. Понятие "ПЦР-праймер" в контексте настоящего изобретения относится к коротким фрагментам выделенной одноцепочечной ДНК, которые используют для ПЦР-амплификации специфических областей ДНК. 5 Понятие "ПЦР" или "полимеразная цепная реакция" в контексте настоящего изобретения относится к методу получения в относительно больших количествах специфических областей ДНК, что позволяет осуществлять различные анализы, основанные на использовании этих областей. В контексте настоящего описания понятие "амплифицированный" 10 относится к созданию множества копий молекулы нуклеиновой кислоты или множества копий последовательности, комплементарной молекуле нуклеиновой кислоты, с использованием по меньшей мере одной из молекул нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Системы амплификации включают систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему на основе лигазной цепной 15 реакции (ЛЦР), транскрипционный метод амплификации нуклеиновых кислот (амплификация на основе нуклеотидных последовательностей) (NASBA, фирма Cangene, Миссиссауга, провинция Онтарио), системы на основе Q-бета репликазы, транскрипционную систему амплификации (TAS) и амплификацию с удалением (вытеснением) цепи (SDA) (см., например, Diagnostic Molecular 20 Microbiology: Principles and Applications, под ред. D. H. Persing и др., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1993). Продукт амплификации называют ампликоном. "Зонд" обозначает выделенную нуклеиновую кислоту, с которой связана пригодная выявляемая метка или репортерная молекула, такая как 25 радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент, флуоресцентная метка или фермент. Такой зонд является комплементарным цепи нуклеиновой кислоты-мишени, или, в контексте описания настоящего изобретения - цепи геномной ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13. Геномную ДНК GM RZ13 можно получать из растения сахарной свеклы или из образца, который включает 30 ДНК указанного варианта. Согласно настоящему изобретению зонды включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие пригодные в качестве зонда материалы, которые - 31 - специфически связываются с последовательностью ДНК-мишени и которые можно применять для выявления присутствия последовательности ДНК-мишени. Праймеры и зонды, как правило, состоят из 10 - 15 или большего количества нуклеотидов. Праймеры и зонды могут состоять по меньшей мере из 5 20 или большего количества нуклеотидов или по меньшей мере из 25 или большего количества нуклеотидов, или по меньшей мере из 30 или большего количества нуклеотидов. Такие праймеры и зонды специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в строгих условиях гибридизации. Праймеры и зонды, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь 10 последовательность, полностью комплементарную последовательности-мишени, хотя с помощью общепринятых методов можно создавать зонды, отличающиеся от последовательности-мишени, но которые сохраняют способность гибридизоваться с последовательностями-мишениями. Следует понимать, что длина праймеров и зондов, предлагаемых в настоящем изобретении, может 15 иметь любое численное значение, находящееся в указанных в настоящем описании диапазонах. Например, к праймерам и зондам, состоящим из 10-15 или большего количества нуклеотидов, относятся праймеры и зонды, состоящие из 10, 11, 12, 13, 14 или 15 нуклеотидов, в то время как понятие "по меньшей мере 20 нуклеотидов" включает также праймеры и зонды, состоящие из 16, 17, 18, 19 20 или 20 нуклеотидов. Это применимо также к понятиям "по меньшей мере 25 или большее количество нуклеотидов" и "по меньшей мере 30 или большее количество нуклеотидов". Понятие "молчание гена" относится к зависящему от гомологии подавлению вирусных генов, трансгенов или эндогенных ядерных генов. 25 Молчание гена может быть транскрипционным, когда подавление обусловлено пониженной транскрипцией "пораженных" генов, или пост-транскрипционным, когда подавление обусловлено повышенным круговоротом (расщепление) видов РНК, гомологичных "пораженным" генам. Молчание гена включает индуцированное вирусом молчание гена. 30 Понятие "РНК-интерференция" (PHKi) относится к процессу осуществления специфического для последовательности посттранскрипционного молчания гена у растений и животных, опосредуемому малыми интерферирующими РНК (siPHK). Различные понятия, такие как siPHK, - 32 - молекула РНК-мишень, фермент Dicer или рибонуклеаза III, представляют собой концепции, известные специалистам в данной области, и в литературе имеется подробное описание указанных понятий и других концепций, относящихся к PHKi. Однако следует иметь в виду, что для воплощения на практике настоящего 5 изобретения не является необходимым основываться на какой-либо конкретной гипотезе, касающейся механизмов PHKi. "dsPHK" или "двухцепочечная РНК" представляет собой РНК с двумя комплементарными цепями, которая контролирует специфическое для последовательности расщепление мРНК посредством процесса, известного как 10 РНК-интерференция (PHKi). dsPHK превращаются в результате расщепления в siPHK, которые оказывают интерферирующее воздействие на экспрессию специфического гена. Понятие "инвертированный" повтор относится к нуклеотидной последовательности, присутствующей в двух сайтах одной и той же 15 нуклеотидной последовательности, но в противоположной ориентации. Понятие "siPHK" относится к малым интерферирующим РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения siPHK содержат дуплекс или двухцепочечную область, состоящую примерно из 21-23 нуклеотидов; часто siPHK содержат примерно от 2 до 4 неспаренных нуклеотидов на З'-конце 20 каждой цепи. По меньшей мере одна цепь дуплекса или двухцепочечной области siPHK является практическим гомологом или практически комплементарна молекуле РНК-мишени. Цепь, комплементарная молекуле РНК-мишени, представляет собой "антисмысловую цепь": цепь, гомологичная молекуле РНК-мишени, представляет собой "смысловую цепь", и она комплементарна также 25 антисмысловой цепи siPHK. siPHK могут содержать также дополнительные последовательности; примерами таких последовательностей являются (но, не ограничиваясь только ими) связывающие последовательности (последовательности-линкеры) или петли, а также "ствол" и другие складчатые структуры. Вероятно, siPHK функционируют в качестве имеющих решающее 30 значение посредников, участвующих в запуске РНК-интерференции, у беспозвоночных и позвоночных животных и в запуске специфического для последовательности расщепления РНК в процессе пост-транскрипционного молчания генов у растений. - 33 - Понятие "молекула РНК-мишень" относится к молекуле РНК, по отношению к которой по меньшей мере одна цепь короткой двухцепочечной области siPHK является гомологичной или комплементарной. Как правило, когда степень указанной гомологии или комплементарное(tm) составляет примерно 5 100%, то siPHK может вызывать молчание или ингибировать экспрессию молекулы РНК-мишени. Хотя, вероятно, мишенью для siPHK является процессированная мРНК, настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной гипотезой, и такие гипотезы не являются необходимыми для воплощения на практике настоящего изобретения. Так, подразумевается, что и 10 другие молекулы РНК также могут являться мишенями для siPHK. Указанные молекулы РНК-мишени представляют собой непроцессированную РНК, рибосомную РНК и вирусную геномную РНК. Не является необходимым, чтобы 100%-ная гомология между молекулой РНК-мишенью и dsPHK имела место по всей длине dsPHK, но "шпильки" dsPHK должны содержать участки, состоящие 15 по меньшей мере из 21 нуклеотида, предпочтительно по меньшей мере из 23 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере из 50 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере из 500 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 700 нуклеотидов и вплоть до 1000 нуклеотидов, для которых характерна гомология на уровне, составляющем по 20 меньшей мере 95%, предпочтительно 100%, с молекулой РНК-мишенью. В контексте настоящего описания "стэкинг" гена или признака означает объединение (группировку) требуемых признаков в одной трансгенной линии. Селекционеры растений объединяют трансгенные признаки, осуществляя скрещивания родителей, каждый из которых имеет требуемый признак, и затем, 25 идентифицируя потомство, которое имеет оба требуемых признака (так называемые полученные путем селекции группы). Другим путем объединения генов является одновременный перенос двух или большего количества генов в ядро клетки растения в процессе трансформации. Еще одним путем объединения генов является повторная трансформация трансгенного растения другим 30 представляющим интерес геном. Например, "стэкинг" генов можно применять для объединения двух различных признаков устойчивости к насекомым, признака устойчивости к насекомым и признака устойчивости к болезням или признака устойчивости к болезням и признака устойчивости к гербицидам - 34 - (например, устойчивости к глифосату). Применение серектируемого маркера помимо представляющего интерес гена следует рассматривать также как "стэкинг" генов. Представляющими интерес для осуществления "стэкинга" являются GM-признаки (признаки, полученные в результате генной 5 модификации, ГМ) и He-GM-признаки. Представляющими интерес GM- признаками являются, например, устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням, представляют интерес трансгенные растения, имеющие фенотип замедленного стрелкования или с заингибированным стрелкованием, трансгенные растения с измененным и/или 10 усиленным составом углеводов. Представляющими интерес He-GM-признаками являются, например, устойчивость к болезням или устойчивость к BNYVV, полученная из традиционных источников (типа Holly, WB41, WB42, WB151, WB169, С28, С48, С50 или Rizor или продуктов их скрещивания), или к вирусам, отличным от BNYVV, или толерантность к вредителям, таким, например, как 15 свекловичные нематоды, корневые тли, яванские галловые нематоды, или толерантность к грибам, таким, например, как представители Cercospora, Aphanomyces, Rhizoctonia, Fusarium, Ramularia, Erysipe, Peronospora, Erwinia, Sclerotium, Verticillium, Phoma или к возбудителям ржавчины, или толерантность к вирусам, таким, например, как вирус курчавости верхушки свеклы, вирус 20 пожелтения свеклы, мягкий вирус пожелтения свеклы, западный вирус пожелтения свеклы. Понятия "строгие условия гибридизации" и "условия отмывки, соответствующие строгой гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и нозерн-гибридизации, 25 зависят от последовательности и являются разными при применении различных параметров окружающей среды. Для специфичной гибридизации более длинных последовательностей используют более высокие температуры. Подробным руководством по гибридизации нуклеиновых кислот является работа Tijssen, 1993. Строгие условия гибридизации описаны, например, у Sambrook и др. 30 Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или нозерн-блоттинга для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного формамида с 1 мг гепарина при 42°С при осуществлении гибридизации в - 35 - течение ночи. Примером очень строгих условий отмывки является применение 0Д5М NaCl при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером строгих условий отмывки является отмывка 0,2*SSC при 65°С в течение 15 мин (описание SSC-буфера см. у Sambrook). 5 Понятие "трансформация" обозначает процесс интродукции гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или организм-хозяин. В частности, "трансформация" обозначает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма. Понятия "трансформированный "/"трансгенный "/"рекомбинантный " 10 относятся к организму растения, в который интродуцирована гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть стабильно интегрирована в геном растения-хозяина или молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать также в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может обладать способностью к саморепликации. 15 Следует понимать, что трансформированные клетки, ткани или растения включают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и его трансгенное потомство. Понятия "нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" хозяин относятся к организму растения дикого типа, который не содержит гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты. В 20 контексте настоящего описания понятие "трансгенный" относится к растению, растительной клетке или множеству структурированных или неструктурированных растительных клеток, объединенных с помощью хорошо известных методов генетических манипуляций и инсерций генов с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая соответствует 25 представляющему интерес гену в растительном геноме, и, как правило, находится в хромосоме клеточного ядра, митохондрии или других органеллах, содержащих хромосомы, в локусе, отличном от присутствующего обычно в нативном растении или растительной клетке, или имеет большее количество копий по сравнению с нативным растением или растительной клеткой. 30 Манипуляции или инсерции указанных нуклеотидных последовательностей для получения трансгенных растений отличаются от применения встречающихся в естественных условиях мутаций, предназначенных для получения невстречающегося в естественных условиях растения или растения с - 36 - невстречающимся в естественных условиях генотипом. Методы трансформации растений и растительных клеток хорошо известны в данной области, и они могут представлять собой, например, электропорацию, микроинъекцию, опосредуемую Agrobacterium трансформацию и баллистическую трансформацию. 5 "Трансгенное растение" представляет собой растение, несущее одну или несколько растительных клеток, которая(ые) содержат экспрессионный вектор. Понятие "сахар" относится к ферментируемым моносахаридам, дисахаридам и трисахаридам, прежде всего моно- и дисахаридам. Так, в контексте настоящего изобретения к сахарам относятся (но, не ограничиваясь 10 только ими) сахароза, фруктоза, глюкоза, галактоза, мальтоза, лактоза и манноза. Понятие "биотопливо" в контексте настоящего описания относится к любому биотопливу, полученному из биомассы, т.е. живших или живущих в настоящее время биологических организмов, таких как растительные или 15 животные остатки. Биотопливо включает (но, не ограничиваясь только ими) дизельное биотопливо, биоводород, биогаз, полученный из биомассы диметилфуран (ДМФ) и т.п. В частности, понятие "биотопливо" можно использовать для обозначения спиртов растительного происхождения, таких как этанол, метанол, пропанол или бутанол, которые при необходимости перед 20 применением можно денатурировать. Понятие "биотопливо" относится также смесевому топливу, содержащему полученное из растения топливо, такому как смеси спирта/газолина (т.е., газохолы). Газохолы могут иметь любое желаемое процентное содержание полученного из растений спирта (т.е. примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 25 90% или 95% полученного из растения спирта). Например, одной из известных смесей на основе биотоплива является Е85, которая содержит 85% этанола и 15% газолина. Понятие "биотопливо" относится к любому биотопливу, полученному с помощью аэробной или анаэробной ферментации растительного материала. 30 Понятие "ферментация" относится к процессу превращения органической молекулы в другую молекулу с помощью микроорганизма. Если не указано иное, понятие "ферментация" включает анаэробную и аэробную ферментацию. - 37 - Методы аэробной и/или анаэробной ферментации известны специалистам в данной области. Краткое описание чертежей и последовательностей На чертежах показано: 5 на фиг. 1 - карта бинарного вектора pSYN15965 (ранее был обозначен как pHiNK188), содержащего конструкцию для PHKi (включающую последовательность, полученную из гена RNA1 BNYVV), который применяли для трансформации сахарной свеклы; на фиг. 2 - результаты анализа методом нозерн-блоттинга накопления 10 мРНК (фиг. 2, верхняя панель) и siPHK (фиг. 2, нижняя панель), полученные при трансгенной экспрессии выведенного из гена репликазы BNYVV инвертированного повтора. Корни собирали через 0, 7, 14, 21 или 28 дней после пересадки (dpi) в почву, зараженную BNYVV В-типа, или в стерильный песок. Примечание к чертежу: а - трансгенное растение, выращенное в стерильном 15 песке; б - трансгенное растение, выращенное в зараженной почве; в - нетрансгенное растение, выращенное в зараженной почве; г - нетрансгенное растение, выращенное в стерильном песке; I - лист растения Nicotiana benthamiana, подвергнутого агроинфильтрации бинарным вектором pHiNK188, который применяли для трансформации сахарной свеклы. 5S рРНК (внизу) 20 применяли в качестве контроля одинаковой загрузки РНК; на фиг. 3 - результаты анализа с помощью ELISA титра BNYVV в образцах тонкоизмельченной (свекловичная мезга) сахарной свеклы, выращенной в процессе полевого опыта в США в 2009 г. (см. пример 7). Среднее значение уровня BNYVV на группу [нг BNYV/мл сока] составляло: 88 со 25 среднеквадратичным отклонением 39 для линии "Но11у" (протестировано 16 растений), 125 со среднеквадратичным отклонением 18 для линии "Но11у+С48" (протестировано 3 растения) и 5 со среднеквадратичным отклонением 5 для линии "Holly+GMRZ" (протестировано 9 растений) соответственно. Средние значения обозначены вертикальными линиями; 30 SEQ ID NO: 1-3'- стыковочная последовательность варианта GM RZ13; SEQ ID NO: 2 - последовательность, состоящая из 807 нуклеотидов, перекрывающая 460 нуклеотидов на 3'-конце RZ-вставки (нуклеотиды 1-460; правая пограничная последовательность) и 347 нуклеотидов геномной ДНК - 38 - сахарной свеклы, которая фланкирует вставку (нуклеотиды 461-807), в варианте GM RZ13; SEQ ID NO: 3 - последовательность геномной ДНК сахарной свеклы (347 нуклеотидов), которая фланкирует 3'-конец RZ-вставки в варианте GM RZ13; 5 SEQ ID NO: 4 - последовательность праймера FE1005; SEQ ID NO: 5 - последовательность праймера FE1006; SEQ ID NO: 6 - последовательность праймера FE1007; SEQ ID NO: 7 - 5'-стыковочная последовательность варианта GM RZ13; SEQ ID NO: 8 - последовательность, состоящая из 484 нуклеотидов, 10 перекрывающая 247 нуклеотидов геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует 5'-конец RZ-вставки (нуклеотиды 238-484), и 237 нуклеотидов 5'-конца RZ-вставки (нуклеотиды 1-237; левая пограничная последовательность), в варианте GM RZ13; SEQ ID NO: 9 - последовательность геномной ДНК сахарной свеклы (237 15 нуклеотидов), которая фланкирует 5'-конец RZ-вставки в варианте GM RZ13; SEQ NO: - последовательность праймера ESPCR0008; SEQ NO: - последовательность праймера FE0902; SEQ NO: - последовательность праймера FE02226; SEQ NO: - последовательность праймера FE02216; SEQ NO: - последовательность праймера FE02236; SEQ NO: - последовательность праймера FE02237; SEQ NO: - последовательность праймера FE02238; SEQ NO: - последовательность праймера FE0622; SEQ NO: - последовательность праймера FlkSeq0008; SEQ NO: - последовательность праймера FE0820; SEQ NO: - последовательность праймера FlkSeqOOlO; SEQ NO: - последовательность праймера FE0885; SEQ NO: - последовательность праймера FE0927; SEQ NO: - последовательность праймера FE02201; SEQ NO: - последовательность праймера FE02202; SEQ NO: - последовательность праймера FE06202; SEQ NO: - последовательность праймера FE06311; SEQ NO: - последовательность праймера FE06312; - 39 - SEQ ID NO: 28 - последовательность праймера HiNK285; SEQ ID NO: 29 - последовательность праймера HiNK283; SEQ ID NO: 30 - последовательность праймера HiNK284. Подробное описание изобретения 5 В настоящем изобретении предложена генетически улучшенная линия сахарной свеклы, которая содержит инвертированный повтор, включающий фрагмент гена репликазы BNYVV, и продуцирует фермент фосфоманнозоизомеразу (PMI), которая придает растению способность утилизировать маннозу в качестве источника углерода. Изобретение относится 10 прежде всего к трансгенному варианту сахарной свеклы, обозначенному как GM RZ13 (или SBVR111, указанное обозначение можно применять взаимозаменяемо с обозначением GM RZ13), имеющему новый генотип, а также к композициям и способам обнаружения в биологическом образце нуклеиновых кислот указанного варианта. Изобретение относится также к растениям сахарной 15 свеклы, имеющим генотип GM RZ13, трансгенным семенам указанных растений сахарной свеклы и к способам получения растения сахарной свеклы, имеющего генотип GM RZ13, путем скрещивания инбредой линии сахарной свеклы, имеющей генотип GM RZ13, с этой же линией или с другой линией сахарной свеклы с получением гибридов, которые имеют генотип GM RZ13, и к 20 применению устойчивых к BNYVV растений сахарной свеклы, предлагаемых в настоящем изобретении, для получения сахара или для аэробной или анаэробной ферментации, например, с целью получения одного или нескольких видов биотоплива. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является 25 молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является уникальной для варианта GM RZ13. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая 30 является уникальной для варианта GM RZ13, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывает гетерологичную молекулу ДНК, встроенную в геном растения сахарной свеклы варианта GM RZ13, с геномной ДНК растения - 40 - сахарной свеклы варианта GM RZ13 и которая содержит по меньшей мере 10 или более (например, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50) смежных нуклеотидов гетерологичной молекулы ДНК и по меньшей мере 10 или более (например, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50) смежных нуклеотидов геномной ДНК растения 5 сахарной свеклы, которая фланкирует сайт инсерции гетерологичной молекулы ДНК. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является уникальной для варианта GM RZ13, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенную молекулу 10 нуклеиновой кислоты, которая связывает гетерологичную молекулу ДНК, встроенную в геном растения сахарной свеклы варианта GM RZ13, с геномной ДНК растения сахарной свеклы варианта GM RZ13 и которая содержит по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов гетерологичной 15 молекулы ДНК и по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов геномной ДНК растения сахарной свеклы, которая фланкирует сайт инсерции гетерологичной молекулы ДНК. Изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям, которые содержат 10 или большее количество смежных 20 нуклеотидов, примыкающих к последовательности вставки из варианта GM RZ13 и по меньшей мере один нуклеотид фланкирующей ДНК из варианта GM RZ13, смежный с последовательностью вставки. Указанные нуклеотидные последовательности являются уникальными и диагностическими для варианта GM RZ13. Амплификация нуклеиновой кислоты геномной ДНК сахарной свеклы 25 варианта GM RZ13 позволяет получать ампликон, содержащий указанные уникальные последовательности и являющийся диагностическим для варианта GM RZ13. Одним из аспектов этого варианта осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность, уникальная для варианта GM RZ13, которая выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 1 (стыковочная 30 последовательность варианта GM RZ13), SEQ ID NO: 2 (последовательность, перекрывающая 460 нуклеотидов на 3'-конце RZ-вставки и 347 нуклеотидов геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует вставку в варианте GM RZ13), SEQ ID NO: 7 (5'-стыковочная последовательность варианта GM RZ13), - 41 - SEQ ID NO: 8 (последовательность, перекрывающая 247 нуклеотидов геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует 5'-конец RZ-вставки, и 237 нуклеотидов 5'-конца RZ-вставки в варианте GM RZ13) и их комплементы. Другим вариантом осуществления изобретения является молекула 5 нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая несет по меньшей мере одну стыковочную последовательность варианта GM RZ13, где стыковочная последовательность перекрывает область стыка между гетерологичной кассетой экспрессии, встроенной в геном сахарной свеклы, и ДНК из генома сахарной 10 свеклы, которая фланкирует сайт инсерции и которая является диагностической для варианта. Одним из аспектов этого варианта осуществления изобретения является стыковочная последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и их комплементы. Стыковочные последовательности перекрывают область стыка между гетерологичной кассетой 15 экспрессии, встроенной в геном сахарной свеклы, и ДНК из генома сахарной свеклы, которая фланкирует сайт инсерции. Поскольку известна только одна гетерологичная кассета экспрессии, встроенная в геном сахарной свеклы, которая приводит к образованию варианта GM RZ13, то как стыковочная последовательность, содержащая 5'-конец гетерологичной кассеты экспрессии, 20 который сцеплен с фланкирующей геномной последовательностью, так и стыковочная последовательность, содержащая З'-конец гетерологичной кассеты экспрессии, который сцеплен с фланкирующей геномной последовательностью, соответственно являются уникальными для варианта GM RZ13. Благодаря их уникальной природе, эти последовательности являются диагностическими для 25 варианта GM RZ13. Следующим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула нуклеиновой кислоты, связывающая гетерологичную молекулу ДНК с геномом растения сахарной свеклы в варианте сахарной свеклы GM RZ13, которая содержит 30 последовательность, включающую от примерно 11 до примерно 20 смежных нуклеотидов. В одном из вариантов этого объекта изобретения нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 и их комплементы. - 42 - Следующим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (последовательность 5 геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует 3'-конец RZ-вставки в варианте GM RZ13), SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 (последовательность геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует 5'-конец RZ-вставки в варианте GM RZ13) и их комплементы. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты 10 входит в семя сахарной свеклы, депонированное в NCIMB под регистрационным № 41601. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является ампликон, содержащий нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13. В одном из объектов этого варианта осуществления 15 изобретения ампликон, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении и описанную выше, предпочтительно выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и их комплементы. Одним из объектов настоящего изобретения является пара 20 полинуклеотидных праймеров, включающая первый полинуклеотидный праймер и второй полинуклеотидный праймер, в результате совместного функционирования которых в том случае, когда в образце присутствует в качестве матрицы ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13, происходит образование ампликона, диагностического для варианта GM RZ13. 25 В одном из вариантов этого объекта изобретения одна указанная праймерная последовательность представляет собой или является комплементарной геномной последовательности сахарной свеклы, которая фланкирует сайт инсерции гетерологичной последовательности ДНК, встроенный в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM 30 RZ13, а другая полинуклеотидная праймерная последовательность представляет собой или является комплементарной гетерологичной последовательности ДНК, встроенную в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM RZ13. - 43 - Как должно быть очевидно специалисту в данной области, как правило, одну из указанных праймерных последовательностей можно выводить из Т-ДНК-вставки, встроенной в геном сахарной свеклы, а другую праймерную последовательность можно выводить из последовательности, фланкирующей 5 вставку; или одну из праймерных последовательностей можно выводить из одной из стыковочных последовательностей, а другую праймерную последовательность можно выводить либо из Т-ДНК-вставки, либо из последовательности, фланкирующей вставку. В этом контексте следует подчеркнуть, что выражение "одна из праймерных последовательностей" может 10 означать первую праймерную последовательность, применяемую в ПЦР-реакции (т.е. либо прямой, либо обратный праймер), а "другая полинуклеотидная праймерная последовательность" может означать вторую праймерную последовательность, применяемую в ПЦР-реакции (т.е. либо прямой, либо обратный праймер) (или наоборот). 15 В предпочтительных вариантах осуществления изобретения первый полинуклеотидный праймер, входящий в пару полинуклеотидных праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, выводят из последовательности, фланкирующей вставку GM RZ, а второй полинуклеотидный праймер выводят из последовательности Вставки, встроенной в геном сахарной свеклы. 20 В одном из вариантов этого объекта изобретения одну из праймерных последовательностей выбирают из SEQ ID NO: 2 (последовательность, перекрывающая 460 нуклеотидов на 3'-конце RZ-вставки и 347 нуклеотидов геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует вставку в варианте GM RZ13, SEQ ID NO:3 (последовательность геномной ДНК сахарной свеклы, 25 которая фланкирует 3'-конец RZ-вставки в варианте GM RZ13), SEQ ID NO: 8 (последовательность, перекрывающая 247 нуклеотидов геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует 5'-конец RZ-вставки, и 237 нуклеотидов 5'-конца RZ-вставки в варианте GM RZ13) или SEQ ID NO: 9 (последовательность геномной ДНК сахарной свеклы, которая фланкирует 5'-конец RZ-вставки в 30 варианте GM RZ13). Следует отметить вновь, что выражение "одна из праймерных последовательностей" может означать первую праймерную последовательность, применяемую в ПЦР-реакции (т.е. либо прямой, либо обратный праймер). - 44 - В другом варианте этого объекта изобретения первый полинуклеотидный праймер содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 3 или из положения 461-807 SEQ ID NO: 2, или содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 9 или из положения 1-237 SEQ ID NO: 8 и 5 их комплементы. Таким образом, первый полинуклеотидный праймер содержит последовательности, выведенные из последовательности, которая фланкирует RZ-вставку, встроенную в геномную ДНК варианта GM RZ13. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первый полинуклеотид, входящий в пару полинуклеотидных праймеров, предлагаемых в 10 настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и их комплементы. В другом варианте этого объекта изобретения второй полинуклеотидный 15 праймер содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из положений 1460 SEQ ID NO: 2, или из положений 238-484 SEQ ID NO: 8 или представляет собой их комплементы. Таким образом, второй полинуклеотидный праймер содержит последовательности, выведенные из RZ-вставки, встроенной в геномную ДНК варианта GM RZ13. 20 В следующем варианте этого объекта изобретения второй полинуклеотидный праймер, входящий в пару полинуклеотидных праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23, SEQ 25 ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и их комплементы. В следующем варианте этого объекта изобретения пару праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, выбирают из группы праймерных пар, включающей: (а) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 13, в качестве первого полинуклеотидного праймера, 30 и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (б) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 14, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный -45 - праймер, последовательность которого представлена либо в SEQ ID NO: 10, либо в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (в) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 15, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, 5 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (г) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 16, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; (д) полинуклеотидный праймер, 10 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 12, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в любой из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, и их комплементы: (e) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ 15 ID NO: 19, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24, и их комплементы; (ж) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, 20 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24, и их комплементы; и (з) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 26, и их комплементы. 25 Следующим объектом настоящего изобретения являются пары праймеров, которые выбирают из группы пар праймеров, включающей: (а) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 13, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена либо в 30 SEQ ID NO: 11, либо в SEQ ID NO: 17, и их комплементы; (б) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 12, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена либо в SEQ ID NO: 21, либо -46 - в SEQ ID NO: 22, и их комплементы; (в) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 19, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23, и их комплементы; 5 и (г) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, в качестве первого полинуклеотидного праймера, и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23, и их комплементы. Полинуклеотидные праймеры, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 11, 17, 21 и 22, 10 выводят из фланкирующих последовательностей, которые выходят за пределы фланкирующих последовательностей, представленных в настоящем описании в SEQ ID NO: 3 и 9. Очевидно, что в компетенции специалиста в данной области является получение дополнительной последовательности также и из геномной 15 последовательности, фланкирующей любой конец встроенных гетерологичных последовательностей ДНК, для применения в качестве праймерной последовательности, которую можно использовать в указанных праймерных парах для амплификации последовательностей, являющихся диагностическими для варианта GM RZ13. В контексте настоящего описания фраза "также и из 20 геномной последовательности, фланкирующей любой конец встроенных гетерологичных последовательностей ДНК" относится конкретно к последовательному перемещению от концов встроенных гетерологичных последовательностей ДНК сайтов, в которых встроенные последовательности ДНК примыкают к нативной геномной последовательности ДНК, и в геномную 25 ДНК конкретной хромосомы, в которую встроены гетерологичные последовательности ДНК. Предпочтительно праймерная последовательность, соответствующая или комплементарная части встроенной последовательности, должна примировать транскрипционое удлинение образующейся цепи ДНК или РНК в сторону стыка с ближайшей фланкирующей последовательностью. 30 Следовательно, праймерная последовательность, соответствующая или комплементарная части встроенной последовательности, должна примировать транскрипционое удлинение образующейся цепи ДНК или РНК в сторону стыка с ближайшей фланкирующей последовательностью. Праймерная - 47 - последовательность может представлять собой или являться комплементарной гетерологичной последовательности ДНК, встроенной в хромосому растения, или геномной фланкирующей последовательности. Специалист в данной области легко может оценить пользу того, что праймерная последовательность должна 5 представлять собой или должна быть комплементарной последовательности, расположенной внутри встроенной гетерологичной последовательности ДНК, в зависимости от природы продукта, который требуется получить путем применения гнездового набора праймеров, предназначенных для применения при амплификации конкретной фланкирующей последовательности, содержащей 10 стык между геномной последовательностью ДНК и встроенной гетерологичной последовательностью ДНК. Следующим объектом изобретения является способ обнаружения в биологическом образце присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, которая является уникальной для варианта GM RZ13. Способы заключаются в том, что: 15 (а) приводят в контакт образец, содержащей ДНК, с парой праймеров, которые при их применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из варианта сахарной свеклы GM RZ13 продуцируют ампликон, который является диагностическим для варианта сахарной свеклы GM RZ13; (б) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем 20 самым ампликон; и (в) выявляют ампликон. В одном из вариантов осуществления изобретения применяемая в вышеуказанном способе на стадии (а) пара праймеров представляет собой одну из указанных выше пар праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, которые представлены в настоящем описании. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения 25 применяемая в вышеуказанном способе на стадии (б) пара праймеров представляет собой одну из указанных выше пар праймеров, предлагаемых в настоящем изобретении, которые представлены в настоящем описании. В одном из вариантов этого объекта изобретения ампликон, который получают и выявляют согласно указанному способу, содержит нуклеотидную 30 последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и их комплементы. - 48 - В другом предпочтительном варианте этого объекта изобретения в способе выявления в биологическом образце присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, которая является уникальной для варианта GM RZ13, применяют либо анализ, основанный на использовании геля, либо ТадМап(r)-анализ. Другие 5 методы выявления в биологическом образце присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, которая является уникальной для варианта GM RZ13, известны специалистам в данной области. Предпочтительно основанный на применении геля анализ включает стадии, на которых (I) приводят в контакт образец, содержащий нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, с парой праймеров, 10 которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 5 и 12, или парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 13 и 18; (II) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и (III) выявляют ампликон. Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является TaqMan(r)- 15 анализ, который включает стадии, на которых (I) приводят в контакт образец, содержащий нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, с парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 25 и 26, и TaqMan -зондом, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; (II) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, 20 получая тем самым ампликон; и (III) выявляют повышение флуоресценции, испускаемой репортерным красителем, отщепленным от зонда и отделенного от гасителя красителя во время стадии амплификации (II). Стандартные условия осуществления основанного на применения геля анализа и ТацМап(r)-анализа известны специалисту в данной области. Как в основанном на применения геля (r) 25 анализе, так и в TaqMan -анализе праймерная пара, которую применяют на стадии (а), может представлять собой любую праймерную пару, предлагаемую в (r) настоящем изобретении и описанную выше. TaqMan -зонд, который применяют в TaqMan -анализе, меченный на 5'-конце репортерным красителем и на 3'-конце гасителем красителя, должен обладать способностью к ренатурации с 30 нуклеиновыми кислотами сахарной свеклы в образце. Если зонд является интактным, гаситель подавляет флуоресценцию репортерного красителя. Во время реакции амплификации нуклеиновой кислоты на стадии (б) ДНК - 49 - полимераза Taq расщепляет зонд и тем самым вытесняет его из нуклеиновых кислот сахарной свеклы, продуцируя при этом ампликон. В процессе расщепления зонда репортерный краситель отделяется от гасителя красителя, что приводит к повышению флуоресценции. Повышенная флуоресценция 5 проявляется только, если происходит амплификация последовательности-мишени, которая комплементарна зонду, что позволяет предупреждать обнаружение неспецифической амплификации. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу выявления в образце присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, 10 которая является уникальной для варианта GM RZ13, заключающийся в том, что: (а) приводят в контакт образец с зондом, гибридизующимся в строгих условиях с геномной ДНК из варианта GM RZ13 и не гибридизующимся в строгих условиях с ДНК из контрольного растения сахарной свеклы; (б) подвергают образец и зонд гибридизации в строгих условиях и (в) определяют 15 гибридизацию зонда с ДНК. Обнаружение ампликона или зонда можно осуществлять с помощью любых средств, хорошо известных в данной области, включая (но, не ограничиваясь только ими) флуоресцентные, хемилюминесцентные, радиологические, иммунологические или др. В случае, когда предполагается применение гибридизации для амплификации конкретной 20 последовательности для получения ампликона, который является диагностическим для варианта сахарной свеклы GM RZ13, то можно применять любые хорошо известные в данной области средства получения и обнаружения ампликона, который служит признаком осуществления предполагаемой гибридизации с последовательностью-мишенью в том случае, когда применяют 25 один зонд или праймер, или последовательностей в том случае, когда применяют два или большее количество зондов или праймеров. Понятия "строгие условия" или "строгие условия гибридизации" относятся к условиям, при которых зонд должен гибридизоваться с последовательностью-мишенью в заметно более высокой степени, чем с другими 30 последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности-мишени и должны различаться в зависимости от структуры полинуклеотида. Контролируя строгость условий гибридизации и/или отмывки, можно идентифицировать последовательности-мишени, которые на 100% - 50 - комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Более длинные последовательности специфично гибридизуются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено у Tijssen в Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular 5 Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, часть I, глава 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays ", изд-во Elsevier: New York, 1993; и в Current Protocols in Molecular Biology, глава 2, под ред. Ausubel и др., изд-во Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1995, а также у Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5-oe 10 изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2001). Специфичность, как правило, определяется условиями отмывок после гибридизации, имеющими решающее значение факторами являются ионная сила и температура конечного раствора для отмывки. Как правило, выбирают очень строгие условия гибридизации и отмывки, при которых температура примерно 15 на 5°С ниже, чем конечная температура плавления (Тт) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Тт обозначает температуру (при определенной ионной силе и значении рН), при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с точно подобранным зондом. Как правило, в строгих условиях зонд должен гибридизоваться с 20 подпоследовательностью-мишенью, но не должен гибридизоваться с другими последовательностями. Примером строгих условий гибридизации на фильтре методом Саузерн- или нозерн-блоттинга для гибридизации комплементарных нуклеиновых кислот, которые имеют более 100 комплементарных остатков, является применение 50%-ного 25 формамида с 1 мг гепарина при 42°С, при осуществлении гибридизации в течение ночи. Примером очень строгих условий отмывки является применение 0,15М NaCl при 72°С в течение примерно 15 мин. Примером строгих условий отмывки является отмывка 0,2> 30 Для зондов, состоящих примерно из 10-50 нуклеотидов, строгие условия, как правило, включают концентрации солей, соответствующие менее чем 1,0М концентрации ионов Na, как правило, примерно от 0,01 до 1,0М концентрации ионов Na (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, при этом температура, как правило, - 51 - составляет по меньшей мере примерно 30°С. Строгие условия могут быть получены также при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Как правило, величина отношения сигнала к шуму, равная 2 (или выше) по сравнению с обнаруженной при применении неродственного зонда в конкретном 5 опыте по гибридизации, свидетельствует о наличии специфической гибридизации. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в строгих условиях, еще являются практически идентичными, если белки, которые они кодируют, являются практически идентичными. Это имеет место, например, в том случае, когда копию нуклеиновой кислоты создают с использованием максимальной вырожденности кодонов, 10 допускаемой генетическим кодом. Ниже приведены примеры наборов условий гибридизации/отмывки, которые можно применять для гибридизации нуклеотидных последовательностей, которые практически идентичны нуклеотидным последовательностям, предлагаемым в настоящем изобретении, с которыми проводится сравнение (референс- 15 последовательность): нуклеотидная референс-последовательность предпочтительно гибридизуется с нуклеотидной референс-последовательностью в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaP04, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 2> 20 предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaP04, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,5*SSC, 0,1% ДСН при 50°С, еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaP04, 1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,1 xSSC, 0,1% ДСН при 50°С, и еще более предпочтительно в 7%-ном додецилсульфате натрия (ДСН), 0,5М NaP04,1мМ ЭДТК при 50°С с отмывкой 0,1*SSC, 0,1% ДСН при 25 65°С. Последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно выявлять с использованием указанных выше условий. Для целей, указанных в изобретении, применяют строгие условия гибридизации. В компетенции специалиста в данной области находится применение различных методов для выявления присутствия в образце молекулы нуклеиновой 30 кислоты, которая является уникальной для варианта GM RZ13. Примерами этих методов, которые подпадают под объем настоящего изобретения, являются (но, не ограничиваясь только ими) обнаружение на уровне РНК или белка. - 52 - Примерами других методов являются ELISA, метод, основанный на применении тест-полосок с помощью системы Lateral flow, и метод, основанный на применении диагностических полосок (dipsticks). Обнаружение на уровне РНК может включать обнаружение последовательности siPHK, выведенной из гена 5 RNA1 BNYVV, включенного во вставку в GM RZ13. Обнаружение на уровне белка (с помощью например, ELISA, метода, основанного на применении тест-полосок с помощью системы Lateral flow, и метода, основанного на применении диагностических полосок (dipsticks), может включать обнаружение белка PMI, включенного во вставку GM RZ13, или белка, который является мишенью PHKi- 10 конструкции, входящей во вставку GM RZ13. Указанные методы обнаружения РНК и белков известны специалисту в данной области. Подразумевается, что понятие "биологический образец" относится к образцу, который содержит или может содержать нуклеиновую кислоту, состоящую из 5-10 нуклеотидов, находящихся на любой стороне от сайта, в 15 котором один или два конца встроенной гетерологичной последовательности ДНК контактируют с геномной последовательностью ДНК внутри хромосомы, в которую встроена гетерологичная последовательность ДНК, которые обозначены также как стыковочные последовательности. Кроме того, стыковочная последовательность содержит как минимум два нуклеотида: из них 20 первый нуклеотид расположен внутри фланкирующей геномной ДНК, и он примыкает и ковалентно связан с первым нуклеотидом во встроенной гетерологичной последовательности ДНК. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения ампликон или зон содержит нуклеотидную последовательность, выведенную из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID 25 NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и их комплементы. В этом контексте понятие "выведенный" означает, что ампликон или зонд может содержать полную последовательность одной из последовательностей, которые представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и их комплементы, 30 или содержать фрагмент или часть этих последовательностей. Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является набор, предназначенный для обнаружения в биологическом образце нуклеиновых кислот, которые являются уникальными для варианта GM RZ13. В - 53 - набор входит по меньшей мере одна молекула нуклеиновой кислоты, содержащая состоящий из смежных нуклеотидов полинуклеотид достаточной длины для того, чтобы функционировать в качестве праймера или зонда в методе обнаружения нуклеиновой кислоты, и которые после амплификации или 5 гибридизации с нуклеотидной последовательностью-мишенью в образце с последующим выявлением ампликона или гибридизации с последовательностью-мишенью, служат для диагностики присутствия в образце нуклеотидных последовательностей варианта GM RZ13. В набор входят также другие материалы, необходимые для осуществления методов гибридизации или 10 амплификации нуклеиновых кислот. В одном из объектов этого варианта осуществления изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты, входящая в набор, может представлять собой любую из последовательностей, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных выше, но предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, 15 включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и их комплементы. 20 Подразумевается, что фраза "молекула нуклеиновой кислоты, содержащая состоящий из смежных нуклеотидов полинуклеотид достаточной длины для того, чтобы функционировать в качестве праймера или зонда" относится к обеим последовательностям, которые (1) соответствуют конкретным нуклеотидным последовательностям, представленным выше, или последовательностям, которые 25 (2) выведены из конкретных нуклеотидных последовательностей, представленных выше. Можно применять различные методы обнаружения, включая (но, не ограничиваясь только ими) TAQMAN-анализ (фирма Perkin Elmer), термическую амплификацию, лигазную цепную реакцию, Саузерн-гибридизацию, методы на 30 основе ELISA и колориметрические и флуоресцентные методы обнаружения. В частности, настоящее изобретение относится к наборам для выявления присутствия в образце, который содержит геномную нуклеиновую кислоту из GM RZ13, последовательности-мишени, т.е. по меньшей мере одного - 54 - инвертированного повтора, который содержит фрагмент из последовательности гена репликазы BNYVV или стыковочную последовательность. В набор входит по меньшей мере один полинуклеотид, обладающий способностью связываться с сайтом-мишенью, или практически примыкающий к сайту-мишени, и по 5 меньшей мере одно из средств обнаружения связывания полинуклеотида с сайтом-мишенью. Средства обнаружения могут быть флуоресцентными, хемилюминесцентными, колориметрическими или изотопными и для обнаружения связывания их можно применяться в сочетании по меньшей мере с иммунологическими методами. Подразумевается также, что с помощью набора 10 можно выявлять присутствие в образце сайта-мишени, т.е. по меньшей мере одного инвертированного повтора, который содержит фрагмент из последовательности гена репликазы BNYVV или стыковочную последовательность, используя предпочтительно две или большее количество полинуклеотидных последовательностей, которые вместе обладают 15 способностью связываться с нуклеотидными последовательностями, примыкающими или расположенными внутри фрагмента длиной примерно 100 пар оснований или внутри фрагмента длиной примерно 200 пар оснований или внутри фрагмента длиной примерно 500 пар оснований или внутри фрагмента длиной примерно 1000 пар оснований последовательности-мишени, и которые 20 можно удлинять по направлению друг к другу с получением ампликона, который содержит по меньшей мере один сайт-мишень. Настоящее изобретение относится также к растению сахарной свеклы, имеющему трансгенный генотип, предлагаемый в изобретении, где трансгенный генотип придает растению сахарной свеклы устойчивость к вирусу 25 некротического пожелтения жилок свеклы или способность утилизировать маннозу в качестве источника углерода или как устойчивость к некротическому пожелтению жилок свеклы, так и способность утилизировать маннозу в качестве источника углерода. В одном из вариантов этого объекта изобретения трансгенный генотип, который придает устойчивость к некротическому 30 пожелтению жилок свеклы или способность утилизировать маннозу в качестве источника, несет кодирующую последовательность pmi. Одним из объектов изобретения являются растения и семена сахарной свеклы, устойчивые к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которые содержат молекулу - 55 - нуклеиновой кислоты, предлагаемую в изобретении, включающую нуклеотидную последовательность, которая является уникальной для варианта GM RZ13. Например, устойчивые к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы представляют собой сахарную свеклу, семена 5 которой содержат молекулы нуклеиновых кислот, депонированные 11 декабря 2008 г. в NCIMB под регистрационным № 41601. Изобретение относится также в растениям, полученным из устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы, предлагаемого в изобретении, семена которого депонированы в NCIMB под регистрационным № 41601. Другим 10 объектом настоящего изобретения является семя сахарной свеклы, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в изобретении, которая содержит нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13. Еще одним объектом изобретения являются семена, депонированные в NCIMB под регистрационным № 41601, а также трансгенное устойчивое к вирусу 15 некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, полученное из этих семян. Кроме того, настоящее изобретение относится также к потомству трансгенного устойчивого к BNYVV растения сахарной свеклы, депонированного в NCIMB под регистрационным № 41601. Понятие "полученные (выведенные)" касательно растений, полученных из устойчивого к 20 вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы, предлагаемого в изобретении, или полученных из трансгенного устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы, выведенного из семян, которые депонированы в NCIMB под регистрационным № 41601, относится к растениям, которые образовались или получены из 25 указанного устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения или семян сахарной свеклы. Трансгенное растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении, является устойчивым к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы и обозначено как GM RZ13 (или SBVR111). Трансгенная сахарная свекла 30 варианта GM RZ13 экспрессирует инвертированный повтор (RZM) части транскрипта гена RNA-1 BNYVV (см. пример 1, ниже). Эта часть гена RNA-1 кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) или белок репликазы. Экспрессия RZM под контролем промотора и интрона из гена убикитина - 56 - (Ubiquitin3) (Ubi3) Arabidopsis thaliana придает устойчивость к BNYVV путем направленного воздействия РНК-транскрипта репликазы инфицирующего вируса посредством PHKi-механизма и, как следствие, путем воздействия на репродуктивную систему вируса. Указанное воздействие приводит к ухудшению S развития вируса в растении. Кроме того, в трансгенном растении сахарной свеклы, предлагаемом в настоящем изобретении, имеет место экспрессия гена тапА (который известен также какpmi) из Escherichia coli. Этот ген кодирует фосфоманнозоизомеразу, PMI, фермент, который действует в качестве селектируемого маркера, 10 позволяющего трансформированным растительным клеткам утилизировать маннозу в качестве основного источника углерода. Экспрессия pmi находится под контролем промотора белка теплового шока (80) (из Brassica oleracea). ^трансформированные растения сахарной свеклы не могут использовать маннозу, и поэтому белок PMI служит в качестве селектируемого маркера, когда 15 растения выращивают в средах, содержащих маннозу в качестве единственного источника углерода. Вариант сахарной свеклы GM RZ13, предлагаемый в настоящем изобретении, создавали с помощью стандартных методов опосредуемой Agrobacterium tumefaciens трансфомации, которые описаны ниже в примере 2. 20 Карта плазмиды pSYN15965 (ранее обозначенной как pHiNK188), которую применяли для трансформации, представлена на фиг. 1. Размер, функция и сайты инициации каждого компонента pSYN15965 представлены в таблице 1. Другим объектом настоящего изобретения является растение сахарной свеклы, содержащее по меньшей мере первую и вторую последовательность 25 ДНК, которые связаны друг с другом с образованием смежной нуклеотидной последовательности, где первая последовательность ДНК находится в стыковочной последовательности и содержит по меньше мере примерно 11 смежных нуклеотидов, выбранных из группы, включающей нуклеотиды 461-807 SEQ ID NO: 2, нуклеотиды 1-237 SEQ ID NO: 8 и их комплементы, где вторая 30 последовательность ДНК находится в гетерологичной встроенной последовательности ДНК, которая соответствует нуклеотидам 1-460 SEQ ID NO: 2, нуклеотидам 283-484 SEQ ID NO: 8 и их комплементам; и где первую и вторую последовательность ДНК можно применять в качестве нуклеотидных - 57 - праймеров или зондов для выявления присутствия в биологическом образце нуклеотидных последовательностей варианта сахарной свеклы GM RZ13. В одном из аспектов этого варианта осуществления изобретения применяют нуклеотидные праймеры в методе амплификации ДНК для амплификации 5 последовательности ДНК-мишени с использованием в качестве матрицы ДНК, экстрагированной из растения сахарной свеклы, и растения сахарной свеклы можно отличать от других растений сахарной свеклы по образованию ампликона при использовании указанных первого и второго нуклеотидных праймеров в указанном методе амплификации ДНК. 10 Другим объектом настоящего изобретения является биологический образец, полученный из растения, ткани или семени сахарной свеклы варианта GM RZ13, где образец содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной нуклеотидной последовательности, уникальной для варианта GM RZ13, и где последовательность можно выявлять в 15 образце с помощью метода амплификации нуклеиновых кислот или гибридизации нуклеиновых кислот. В одном из вариантов этого объекта изобретения нуклеотидная последовательность, уникальная для варианта GM RZ13, представляет собой или является комплементарной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. 20 Образец можно получать из семени, стебля, листа, корня, цветка или их частей. Понятие "растение сахарной свеклы GM RZ13" в этом контексте относится к растению сахарной свеклы, предлагаемому в настоящем изобретении, которое содержит нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13. Понятие "ткань или семя сахарной свеклы GM RZ13" относится к ткани 25 или семени растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, которое содержит нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13. Следующим объектом настоящего изобретения является экстракт, полученный из растения, ткани или семени кукурузы варианта GM RZ13, 30 который содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной нуклеотидной последовательности, уникальной для варианта GM RZ13, и где последовательность можно выявлять в образце с помощью метода амплификации нуклеиновых кислот или - 58 - гибридизации нуклеиновых кислот. В одном из вариантов этого объекта изобретения нуклеотидная последовательность, которая уникальна для варианта GM RZ13, представляет собой или является комплементарной SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8. Метод амплификации 5 нуклеиновых кислот или гибридизации нуклеиновых кислот может представлять собой любой метод амплификации нуклеиновых кислот или гибридизации нуклеиновых кислот, известный специалисту в данной области. Предпочтительно метод амплификации нуклеиновых кислот или гибридизации нуклеиновых кислот представляет собой метод выявления присутствия в образце 10 нуклеотидной последовательности, уникальной для варианта GM RZ13, предлагаемого в настоящем изобретения. Другим объектом настоящего изобретения является способ обнаружения белка в биологическом образце варианта сахарной свеклы GM RZ13, заключающийся в том, что: (а) экстрагируют белок из образца ткани варианта 15 сахарной свеклы GM RZ13; (б) анализируют экстрагированный белок с помощью иммунологического метода, предусматривающего применение антитела, специфического для инсектицидного белка или белка селектируемого маркера, продуцируемого вариантом GM RZ13; и (в) определение связывания антитела с инсектицидным белком или белком селектируемого маркера. 20 Другим объектом настоящего изобретения является способ получения растения сахарной свеклы, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, заключающийся в том, что (а) осуществляют половое скрещивание первого родительского растения сахарной свеклы со вторым родительским растением сахарной свеклы, где первое или второе родительское 25 растение сахарной свеклы содержит ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13, получая тем самым множество растений поколения первой генерации; (б) отбирают растение поколения первой генерации, обладающее устойчивостью по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы; (в) дают само опылиться растению поколения первой генерации, получая тем самым 30 множество растений поколения второй генерации; (г) отбирают из растений поколения второй генерации растение, которое обладает устойчивостью по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы; где растения поколения второй генерации содержат нуклеотидную последовательность, - 59 - которая представляет собой или является комплементарной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7. В предпочтительном варианте этого объекта изобретения указанный способ представляет собой способ, в котором первое или второе родительское 5 растение сахарной свеклы, содержащее ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13, которое применяют на стадии (а), представляет собой устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении и описанное выше, или растение, полученное из семян, предлагаемых в настоящем изобретении и описанных 10 выше. В этом контексте выражение "растение сахарной свеклы, содержащее ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13" относится к растению сахарной свеклы, которое содержит нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что ДНК варианта 15 сахарной свеклы GM RZ13, предлагаемую в настоящем изобретении (т.е. нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, которая уникальна для варианта GM RZ13) можно интрогрессировать путем скрещивания с другими линиями сахарной свеклы, имеющими другие трансгенные или нетрансгенные генотипы. Например, инбредную линию 20 сахарной свеклы, содержащую ДНК варианта GM RZ13, предлагаемую в настоящем изобретении (т.е. растение сахарной свеклы, содержащее нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13), можно скрещивать с инбредной линией сахарной свеклы, имеющей трансгенный генотип, обусловливающий устойчивость к различным вирусам, которые, как 25 известно, заражают растения сахарной свеклы. Образовавшиеся семена и растения-потомки должны нести объединенные признаки устойчивости. Например, инбредную линию сахарной свеклы GM RZ13 можно скрещивать с инбредной линией сахарной свеклы, имеющей трансгенный генотип, который обусловливает устойчивость к глифосату, такой как вариант Н7-1 (заявка на 30 европейский патент ЕР-А1-1597373, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Образовавшиеся семена и растения-потомки имеют объединенные признаки устойчивости как к гербициду глифосату, так и к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. Кроме того GM (ГМ)-признаки типа - 60 - устойчивости к гербицидам, устойчивости к насекомым, устойчивости к болезням, трансгенные растения, имеющие фенотип замедленного или заингибированного стрелкования, трансгенные растения с измененным и/или усиленным составом углеводов, можно применять также для объединения с 5 трансгенными растениями, предлагаемыми в настоящем изобретении, которые содержат ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13 (т.е. растение сахарной свеклы, содержащее нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13). Примером устойчивости к гербицидам является, в частности, устойчивость к глифосату, обусловленная описанным выше 10 устойчивым к глифосату вариантом Н7-1, примерами устойчивости к насекомым являются устойчивость к насекомым, питающимся надземными частями (с использованием, например, гена VIP и/или гена Cry (такого как Cryl Ab (см., например, заявку на европейский патент ЕР 0618976В1, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки) или патенты, 15 принадлежащие к семейству этого патента), или VIP3 (см., например, международную заявку на патент WO 96/10083 или международную заявку на патент WO 98/44137 (обе заявки полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки) и патенты, принадлежащие к семейству этих заявок на патент), и устойчивость к насекомым, питающимся подземными частями (такая, 20 например, как устойчивость к нематодам (например, к свекловичной нематоде)); а примером устойчивости к грибам является устойчивость к одному или нескольким грибам. Примерами растений, которые имеют фенотип замедленного или заингибированного стрелкования, являются растения, в которых экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, включающей FT, AGL20, 25 FLC или PRR7, модифицирована. Кроме того, гены Cry и VIP и другие гены, являющиеся кандидатами для модификации связанного со стрелкованием поведения сахарной свеклы, хорошо известны специалистам в данной области. Растения сахарной свеклы с модифицированной экспрессией генов сахарной свеклы FT описаны в международной заявке на патент РСТ/ЕР2009/006319 30 (которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки), растения сахарной свеклы с модифицированной экспрессией генов AGL20 и FLC описаны в международной заявке на патент WO 2007/122086 (которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки), и растения - 61 - сахарной свеклы с модифицированной экспрессией гена PRR7 описаны в международной заявке на патент WO 2009/141446 (которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). Примеры модифицированного измененного и/или усиленного состава углеводов описаны в международной 5 заявке на патент WO 2004/099403 и в международной заявке на патент PCT/US2009/046968 (содержание обеих заявок полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения устойчивость к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы в растениях, предлагаемых в 10 настоящем изобретении, объединяют с любым из следующих факторов (а) устойчивость к глифосату, (б) устойчивость к насекомым (Vip3 или Cryl Ab, или оба); (в) трансгенный фенотип замедленного или заингибированного стрелкования в результате модификации экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, включающей FT, AGL20, FLC и PRR7; (г) 15 устойчивость к глифосату и устойчивость к насекомым (Vip3 или Cryl Ab, или оба) в качестве трехкомпонентного "стэка", (д) устойчивость к глифосату и трансгенный фенотип замедленного или заингибированного стрелкования в результате модификации экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, включающей FT, AGL20, FLC и PRR7, в качестве трехкомпонентного 20 "стэка"; (е) устойчивость к насекомым (Vip3 или Cryl Ab, или оба) и трансгенный фенотип замедленного или заингибированного стрелкования в результате модификации экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, включающей FT, AGL20, FLC и PRR7, в качестве трехкомпонентного "стэка"; и (ж) устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым (Vip3 или 25 CrylAb, или оба) и трансгенный фенотип замедленного или заингибированного стрелкования в результате модификации экспрессии одного или нескольких генов, выбранных из группы, включающей FT, AGL20, FLC и PRR7, в качестве четырехкомпонентного "стэка". В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения не-GM- 30 признаки типа устойчивости к болезням или устойчивости к BNYVV, полученной из традиционных источников (типа Holly, WB41, WB42, WB151, WB169, С28, С48, С50 или Rizor или продуктов их скрещивания), или к вирусам, отличным от BNYVV, можно применять также для объединения в трансгенных - 62 - растениях, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержат ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13 (т.е. растение сахарной свеклы, которое содержит нуклеотидную последовательность, уникальную для варианта GM RZ13). Толерантность к вредителям, таким, например, как свекловичные 5 нематоды, корневые тли, яванские галловые нематоды, или толерантность к грибам, таким, например, как представители Cercospora, Aphanomyces, Rhizoctonia, Fusarium, Ramularia, Erysipe, Peronospora, Erxvinia, Sclerotium, Verticillium, Phoma или к возбудителям ржавчины, или толерантность к вирусам, таким, например, как вирус курчавости верхушки свеклы, вирус пожелтения 10 свеклы, мягкий вирус пожелтения свеклы, западный вирус пожелтения свеклы, представляет собой дополнительные признаки, которые можно объединять в трансгенных растениях, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержат ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13 (т.е. растение сахарной свеклы, которое содержит нуклеотидную последовательность, уникальную для 15 варианта GM RZ13). Должно быть очевидно также, что другие комбинации или объединенные группы можно создавать в трансгенных растениях, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержат ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13 (т.е. растение сахарной свеклы, которое содержит нуклеотидную последовательность, 20 уникальную для варианта GM RZ13), и эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Специалисту в данной области должно быть очевидно также, что трансгенное семя сахарной свеклы, содержащее нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, которая является 25 уникальной для варианта GM RZ13, можно обрабатывать различными предназначенными для обработки семян химическими агентами, включая различные пестициды и инсектициды, для дополнительного повышения устойчивости к BNYVV. ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ13, предлагаемую в настоящем 30 изобретении (т.е. нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта GM RZ13) можно интрогрессировать в любую инбредную или гибридную линию сахарной свеклы с использованием известных в данной области методов скрещивания. Целью - 63 - скрещивания растений является объединение в одном сорте или гибриде различных требуемых признаков. Для полевых культур эти представляющие интерес GM-признаки и не-GM признаки могут включать перечисленные выше признаки и также агрономические признаки, такие, например, как повышенная 5 урожайность и более высокое агрономическое качество. При механическом сборе урожая многих культур является важной однородность характеристик растений, таких как прорастание и образование главного корня, скорость роста, созревание и размер корней. Растения, которым давали самоопыляться и отбирали в отношении типа в 10 течение многих генераций, становились гомозиготными практически по всем генным локусам и давали однородную популяцию чисто сортового потомства. Скрещивание между двумя различными гомозиготными линиям дает однородную популяцию гибридных растений, которые могут быть гетерозиготными по многим генным локусам. Скрещивание двух растений, 15 каждое из которых является гетерозиготным по нескольким генным локусам, должно приводить к получению популяции гибридных растений, которые отличаются генетически и не могут быть однородными. Методы скрещивания растений, которые известны в данной области и которые можно применять в программах селекции сахарной свеклы, включают 20 (но, не ограничиваясь только ими) рекуррентную (периодическую) селекцию, возвратное скрещивание, селекцию на базе родословной, селекцию повышенной эффективности на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, селекцию повышенной эффективности на основе генетических маркеров и трансформацию. Для создания гибридов сахарной свеклы в рамках программы 25 селекции сахарной свеклы требуется, в целом, создание гомозиготных инбредных линий, скрещивание этих линий и оценка результатов скрещивания (кроссов). Методы селекции на базе родословной и рекуррентной селекции используют для создания инбредных линий из предназначенных для разведения популяций. В программах селекции сахарной свеклы объединяют генетические 30 фоны из двух или большего количества инбредных линий или различных других источников зародышевой плазмы в пулы для разведения, из которых создают новые инбредные линии путем самоопыления и отбора требуемых фенотипов. Новые инбредные линии скрещивают с другими инбредными линиями и - 64 - гибриды, полученные в результате этих скрещиваний, оценивают для выявления тех из них, которые потенциально можно использовать для продажи. Разведение растений и создание гибридов при воплощении на практике программы селекции растений сахарной свеклы являются дорогостоящими и требующими 5 значительных временных затрат процессами. Селекция на базе родословной начинается со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одну или несколько требуемых характеристик, которые отсутствуют в другом, или которые дополняют другой. Если два исходных родителя не обеспечивают присутствие всех требуемых 10 характеристик, то в популяцию для разведения можно включать другие источники. При использовании метода селекции на базе родословной растения высшего качества опыляют и отбирают последовательные поколения. В последовательных поколениях гетерозиготное состояние позволяет получать гомозиготные линии в результате самоопыления и селекции. Как правило, при 15 использовании на практике метода селекции на базе родословной для самоопыления и селекции применяют пять или большее количество поколений: F1 -"• F2; F2 -* F3; F3 -> • F4; F4 -* F5 и т.д. Разведение на основе рекуррентной селекции, например, возвратное скрещивание, можно использовать для улучшения инбредной линии и гибрида, 20 созданного с использованием этих инбредных линий. Возвратное скрещивание можно применять для переноса конкретного требуемого признака из одной инбредной линии или из одного источника в инбредную линию, в которой отсутствует этот признак. Это можно осуществлять, например, путем первого скрещивания инбредной линии высшего качества (рекуррентный родитель) с 25 инбредной линией-донором (нерекуррентный родитель), которая несет соответствующий(ие) ген(ы), обусловливающий(е) представляющий интерес признак. Затем потомство этого скрещивания подвергают возвратному скрещиванию с рекуррентным родителем высшего качества с последующей селекцией образовавшего потомства в отношении требуемого признака, который 30 должен быть перенесен из нерекуррентного родителя. После получения 5 или большего количества поколений бэккроссов с их селекцией по требуемому признаку потомство должно быть гомозиготным по локусу, контролирующему характеристику, подлежащую переносу, но должно быть похоже на родителя - 65 - высшего качества касательно всех других генов. Затем последнее поколение бэккроссов опыляют с получением чисто сортового потомства в отношении гена(ов), подлежащего(их) переносу. Гибрид, созданный из инбредных линий, содержащих перенесенный(ые) ген(ы), является практически таким же, что и 5 гибрид, полученный из этих инбредных линий без перенесенного(ых) гена(ов). Элитные инбредные линии, которые представляют собой чисто сортовые (практически) гомозиготные инбредные линии, можно применять также в качестве исходного материала для селекции или популяций-источников, из которых создают другие инбредные линии. Эти инбредные линии выводят из 10 элитных инбредных линий с помощью описанных ранее методов разведения, таких как селекция на базе родословной и рекуррентная селекция. Например, когда возвратное скрещивание используют для создания этих выведенных линий при осуществлении программы селекции растений сахарной свеклы, элитные инбредные линии можно применять в качестве родительской линии или 15 исходного материала или популяции-источника, и они могут служить либо в качестве донора, либо в качестве рекуррентного родителя. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, выше изложены лишь некоторые различные пути, с помощью которых можно получать инбредную линию, предлагаемую в настоящем изобретении, выбранную для 20 интрогрессии ДНК сахарной свеклы варианта GM RZ13, предлагаемого в настоящем изобретении (т.е. нуклеотидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта GM RZ13), в другие линии сахарной свеклы. Специалисту в данной области должны быть известны и другие пути, поэтому приведенные выше примеры даны только с 25 целью иллюстрации. Простой гибрид получают в результате скрещивания двух инбредных линий, каждая из которых имеет генотип, комплементарный генотипу другого. Гибридное потомство первого поколения обозначают как F1. При создании предназначенных для продажи гибридов при осуществлении программы 30 селекции растений сахарной свеклы желательно применять только гибридные F1 -растения. Предпочтительные F1-гибриды являются более сильными, чем их инбредные родители. Эта гибридная сила или гетерозис может проявляться во - 66 - многих полигенных признаках, включая повышенный вегетативный рост и повышенную урожайность. Создание гибрида сахарной свеклы при осуществлении программы селекции растений сахарной свеклы включает три стадии: (1) отбор растений, 5 полученных из различных пулов зародышевой плазмы для начальных кроссбридингов; (2) самоопыление отобранных растений, полученных в результате кроссбридинга нескольких поколений, с получением серий инбредных линий, которые хотя отличаются друг от друга, являются чисто сортовыми и обладают высокой степенью однородности; и (3) скрещивание 10 отобранных инбредных линий с различными инбредными линиями с получением гибридного потомства (F1). В процессе инбридинга сахарной свеклы сила линий снижается. Сила восстанавливается, когда две различные инбредные линии скрещивают с получением гибридного потомства (F1). Важным результатом гомозиготности и гомогенности инбредных линий является то, что гибрид двух 15 различных пар инбредных линий всегда является тем же самым. После идентификации инбредных линий, которые дают гибрид высшего качества, гибридный семенной материал можно неограниченно размножать, если сохраняется гомогенность инбредных родителей. Простой гибрид получают в том случае, когда скрещивают две инбредные 20 линии с получением F1-потомства. Двойной гибрид получают в результате попарного скрещивания четырех инбредных линий (А х В и С х D), а затем два F1-гибрида скрещивают вновь (А х В) х (С х D). Трехлинейный гибрид получают из трех инбредных линий, при этом скрещивают две из этих инбредных линий (А * В), а затем образовавшийся F1-гибрид скрещивают с 25 третьей инбредной линией (А хВ) х С. Большая часть гибридной силы, характерной для F1-гибридов, теряется в следующем поколении (F2). Следовательно, семенной материал гибридов нельзя применять в качестве посадочного материала. При производстве гибридных семян предпочтительно элиминируют или 30 инактивируют производство пыльцы материнской особью. Неполное удаление или инактивация пыльцы оставляет потенциальную возможность самоопыления. Эти полученные в результате нежелательного самоопыления семена могут быть непреднамеренно собраны и упакованы вместе с гибридными семенами. После - 67 - посева семян можно идентифицировать и отбирать эти полученные в результате самоопыления растения. Эти полученные в результате самоопыления растения будут генетически эквивалентны женской инбредной линии, применяемой для получения гибрида. Как правило, эти полученные в результате самоопыления 5 растения можно идентифицировать и отбирать по их пониженной силе. Женские растения, полученные в результате самоопыления, идентифицируют по снижению силы вегетативных и/или репродуктивных характеристик. Идентификацию этих полученных в результате самоопыления линий можно осуществлять также с помощью анализа с использованием молекулярных 10 маркеров. Однако существует простая и эффективная система контроля опыления, гарантирующая наличие гетерозиса, путем исключения самоопыления при производстве предназначенных для продажи гибридных семян. Если один из родителей обладает самостерильностью (SI), цитоплазматической мужской 15 стерильностью (ЦМС) или ядерной мужской стерильностью (ЯМС), то растение не может самоопыляться или неспособно производить пыльцу, при этом должно иметь место только перекрестное опыление. Путем элиминации пыльцы одного из применяемых для скрещивания родительских сортов растениевод-селекционер гарантирует получение гибридного семенного материала 20 однородного качества при условии, что родители имеют однородное качество и селекционер осуществляет одно скрещивание. Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) представляет собой наследуемый по материнской линии признак, генетические детерминанты которого локализованы в геноме цитоплазматических органелл, митохондрий. У таких растений в значительной 25 степени нарушена способность образовывать функциональные пыльцевые зерна. Гены-восстановители системы ЦМС представляют собой доминантные ядерные гены, которые подавляют эффекты мужской стерильности, свойственные цитоплазме. Проявление мужской стерильности в растениях, обладающих ЦМС, является результатом несовместимости между рецессивным ядерным геном и 30 специфическим для мужской стерильности цитоплазматическим геномом. Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридного семени сахарной свеклы, устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. Способ заключается в том, что: (а) получают - 68 - устойчивую к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы линию сахарной свеклы в качестве первой родительской линии, (б) получают вторую родительскую линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; (в) дают растениям первой родительской лини, полученной 5 на стадии (а), и растениям второй родительской линии, полученной на стадии (б), опылять друг друга, дают развиваться семени и собирают гибридный семенной материал, где собранные гибридные семена представляют собой семена устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы. 10 В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения гибридных растений сахарной свеклы, предлагаемых в настоящем изобретении, применяют систему ЦМС. В этой системе мужскую стерильную линию, обладающую ЦМС, применяют в качестве материнской особи, которую опыляют мужской фертильной линией, применяемой в качестве отцовской особи. 15 Предпочтительно молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13, поддерживают в варианте, обладающем мужской стерильностью, для того чтобы избежать генномодифицированных (GM) загрязнений через пыльцу, содержащую признак, переносимый отцовской особью. Таким образом, в 20 предпочтительном варианте осуществления изобретения мужская родительская линия сахарной свеклы, обладающая ЦМС, полученная на стадии (а) или (б) описанного выше способа, представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, уникальную для варианта GM RZ13. Кроме того, в 25 такой системе оба родителя могут представлять собой трансгенные растения. Таким образом, другим предпочтительным вариантом способа является способ получения устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридного семени сахарной свеклы, заключающийся в том, что (а) получают устойчивую к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы 30 линию сахарной свеклы в качестве первой родительской линии, (б) получают вторую родительскую линию сахарную свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; где одна из родительских линий, применяемых на стадии (а) или стадии (б), представляет собой мужскую стерильную линию с - 69 - ЦМС и где другая родительская линия представляет собой линию с мужской фертильностью;(в) дают растениям родительской линии с мужской фертильностью опылять цветки родительской линии с мужской стерильностью, дают развиваться семени и собирают гибридный семенной материал, где 5 собранные гибридные семена представляют собой семена устойчивой к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы линии сахарной свеклы, предпочтительно гибридное семя устойчивой к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы линии сахарной свеклы, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем изобретении, которая 10 является уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13. В другом предпочтительном варианте этого объекта изобретения устойчивая к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы линия, применяемая в качестве первой родительской линии на стадии (а), представляет собой устойчивую к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы 15 инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13. В другом варианте этого объекта вторую родительскую линию выбирают из группы, включающей (а) инбредную линию сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к вирусу некротического 20 пожелтения жилок свеклы, имеющую другой генотип, но содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13; (б) инбредную линию сахарной свеклы, устойчивую по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которая имеет происхождение из встречающегося в 25 естественных условиях источника, такого как Holly-источник, WB41, WB42, WB151, WB169, С28, С48, С50 или Rizor, или продуктов их скрещивания; и (в) инбредную линию сахарной свеклы, не обладающую устойчивостью к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. Выражение "инбредная линия сахарной свеклы, устойчивая по меньшей 30 мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, имеющая другой генотип, но содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, которая является уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13" означает растение сахарной свеклы, которое содержит - 70 - нуклеотидную последовательность, предлагаемую в настоящем изобретении, но отличается по меньшей мере одним геном или признаком. Такое инбредное растение сахарной свеклы может содержать дополнительные GM-признаки или не-GM- признаки, указанные выше. Инбредное растение сахарной свеклы, 5 применяемое на стадии (а), может представлять собой устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении и описанное выше, или растение, полученное из семян устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении и 10 описанного выше. Понятие "имеет происхождение, получен" в контексте встречающихся в естественных условиях источников устойчивости к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, выбранных из группы, включающей Holly-источник, WB41, WB42, WB151, WB169, С28, С48, С50 или Rizor, или продукты их 15 скрещивания, относится к устойчивым к BNYVV растениям сахарной свеклы, устойчивость которых к BNYVV выведена из традиционных линий сахарной свеклы или диких типов сахарной свеклы, которые не имеют трансгенного происхождения. Эти традиционные источники устойчивости известны специалистам в данной области. Holly-устойчивость связана с генами, 20 присутствующими в источнике Holly (Lewellen и др., 1987), в котором основной доминантный ген Rzl обусловливает устойчивость к BNYVV (Pelsy и Merdinoglu, 1996; Scholten и др., 1996). Другими традиционными источниками устойчивости к BNYVV являются источники WB41H WB42, полученные из двух растений Beta vulgaris ssp maritime, собранных в Дании (Lewellen и др., 1987; 25 Whitney, 1989), а традиционная устойчивая к ризомании линия сахарной свеклы С48 была создана путем скрещивания WB41 и WB42 с линией С37. WB151, WB169, С28 и С50 представляют собой источники устойчивости к ризомании, описанные у Lewellen (1995). В целом, вторая родительская линия, применяемая для получения гибридов, 30 может представлять собой также линию растений сахарной свеклы, устойчивую к BNYVV, например, растение сахарной свеклы, предлагаемое в настоящем изобретении, которое содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем изобретении, уникальную для варианта сахарной свеклы GM RZ13. -71 - Предпочтительно первая родительская линия и вторая родительская линия, применяемые для получения гибридного семенного материла, отличаются различным генетическим фоном. Генетическое расстояние можно измерять с помощью молекулярных маркеров согласно методу, описанному, например, у 5 Knaak (1996). Однако вторая родительская линия может представлять собой также инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит другой фактор, определяющий устойчивость к глифосату Н7-1 (заявка на европейский патент ЕР-А1-1597373, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). Образовавшееся гибридное семя должно содержать объединенные признаки 10 устойчивости к гербициду глифосату и к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. Целью селекционера растений является объединение в одном сорте или гибриде различных требуемых признаков. Вторая родительская линия может содержать также другие признаки типа представляющих интерес GM-признаков и He-GM-признаков, которые включают (но, не ограничиваясь только 15 ими) перечисленные выше признаки, а также агрономические признаки типа, например, повышенной урожайности и улучшенного агрономического качества, могут также присутствовать во второй родительской линии, предназначенной для объединения с молекулой нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13, в гибридном 20 семени. Очевидно также, что можно создавать другие комбинации или объединенные группы с молекулой нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, уникальной для варианта сахарной свеклы GM RZ13, эти примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих объем изобретения. 25 Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является гибридное семя растения сахарной свеклы, устойчивого к BNYVV. Согласно одному из объектов настоящего изобретения гибридное семя получают с помощью способа получения устойчивого к BNYVV гибридного семени сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении. И еще одним 30 объектом настоящего изобретения является устойчивое к BNYVV гибридное растение сахарной свеклы, полученное путем выращивания гибридного семени, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно это гибридное растение содержит молекулу нуклеиновой кислоты, предлагаемую в настоящем - 72 - изобретении, уникальную для варианта сахарной свеклы GM RZ13. Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является часть указанного гибридного растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении. Предпочтительно указанную часть растения выбирают 5 из группы, включающей семена, зародыши, микроспоры, зиготы, протопласты, клетки, семяпочки, пыльцу, главные корни, семядоли или другие репродуктивные или вегетативные части. Другим объектом настоящего изобретения является применение устойчивого к BNYVV растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем 10 изобретении, или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта в способе, выбранном из группы, включающей способы получения сахара, способы аэробной ферментации и способы анаэробной ферментации. Предпочтительно такое применение предусматривает применение устойчивого к BNYVV растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, 15 или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта в способе получения сахара. Способ получения сахара может представлять собой любой метод, известный специалисту в данной области. В одном из вариантов этого объекта изобретения устойчивое к BNYVV растение сахарной свеклы, применяемое в способе получения сахара, а также его клетки или ткани, 20 биологический образец или экстракт получают из семян сахарной свеклы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, предлагаемые в изобретении, которые депонированы в NCIMB под регистрационным № 41601. Понятие "растения, полученные из семян сахарной свеклы" в этом контексте относится к растениям сахарной свеклы, выращенным из семян, а также к гибридам, 25 полученным с помощью растений сахарной свеклы, выращенным из семян. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является также способ применения устойчивого к BNYVV растения сахарной свеклы, предлагаемого в настоящем изобретении, или его клеток или тканей, биологического образца или экстракта в способе, выбранном из группы, 30 включающей способы получения сахара, способы аэробной ферментации и способы анаэробной ферментации. Изобретение относится также к способам получения сахара, в которых устойчивое к BNYVV растение сахарной свеклы, или его клетки или ткани, - 73 - биологический образец или экстракт, предлагаемые в настоящем изобретении, перерабатывают с получением сахара. Кроме того, изобретение относится к сахару, полученному с помощью способа получения сахара, предлагаемому в настоящем изобретении. Способ получения сахара может представлять собой 5 любой общепринятый метод получения сахара, известный специалисту в данной области. В одном из вариантов этого объекта изобретения устойчивое к BNYVV растение сахарной свеклы, его клетки или ткани получают из растения, которое выращено из семени сахарной свеклы, которое содержит молекулы нуклеиновых кислот, предлагаемые в изобретении, депонированные в NCIMB под 10 регистрационным № 41601. Кроме того, биологический образец или экстракт представляет собой биологический образец или экстракт, полученный из этого растительного материала. Понятие "растения, полученные из семян сахарной свеклы" в этом контексте относится к растениям сахарной свеклы, выращенным непосредственно из семян, а также к гибридам, полученным с использованием 15 растений сахарной свеклы, выращенных из семян. Другим объектом настоящего изобретения является способ получения одного или нескольких видов биотоплива, выбранного(ых) из группы, включающей этанол, бутанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, путем переработки устойчивого к BNYVV растения сахарной свеклы, его клеток или 20 тканей или биологического образца или экстракта, предлагаемых в настоящем изобретении с получением одного или нескольких видов биотоплива. Биотопливо может представлять собой любое биотопливо, получаемое путем аэробной или анаэробной ферментации растительного материала. Примером биотоплива являются (но, не ограничиваясь только ими) полученные с помощью 25 аэробной ферментации биоэтанол или биобутанол. Биотоплива, которые можно получать с помощью анаэробной ферментации, представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) биогазы и/или дизельное биотопливо. Методы аэробной и/или анаэробной ферментации известны специалистам в данной области. Под объем настоящего изобретения подпадают также виды биотоплива, 30 выбранные из группы, включающей этанол, бутанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, которые получают с помощью способа получения одного или нескольких видов биотоплива, предлагаемого в настоящем изобретении. - 74 - Понятие "ферментация" может относиться к процессу превращения органической молекулы в другую молекулу с помощью микроорганизма. Например, понятие "ферментация" может относиться к аэробному превращению Сахаров или других молекул из растительного материала, такого как 5 растительный материал, предлагаемый в настоящем изобретении, с образованием спиртов (например, этанола, метанола, бутанола); органических молекул (например, лимонной кислоты, уксусной кислоты, итаконовой кислоты, молочной кислоты, глюконовой кислоты); кетонов (например, ацетона), аминокислот (например, глутаминовой кислоты); газов (например, Нг и СОг), 10 антибиотиков (например, пенициллина и тетрациклина); ферментов; витаминов (например, рибофлавина, В12, бета-каротина); и/или гормонов. Ферментация может включать ферментацию, применяемую в промышленности, в которой применяется спирт (например, при производстве пива и вина), молочной промышленности (например, ферментированные молочные продукты), кожной 15 промышленности и табачной промышленности. Таким образом, ферментация включает спиртовую ферментацию. Ферментация включает также анаэробную ферментацию, например, для производства биогазов. Ферментацию можно осуществлять с помощью любого организма, пригодного для применения на требуемой стадии ферментации, включая (но, не ограничиваясь только ими) 20 бактерии, грибы, архаичные бактерии и простейшие. Приемлемыми для осуществления ферментации организмами являются организмы, которые могут превращать моно-, ди- и трисахариды, прежде всего глюкозу и мальтозу, или любую другую полученную из биомассы молекулу прямым или косвенным путем в требуемый продукт ферментации (например, этанол, бутанол и т.д.). 25 Приемлемыми для осуществления ферментации организмами являются также организмы, которые могут превращать молекулы, не относящиеся к сахарам, в требуемые продукты ферментации. Указанные организмы и методы ферментации известны специалистам в данной области. Как описано выше, селекция по признаку устойчивости к BNYVV 30 ограничена доступностью и стойкостью источников устойчивости в пуле зародышевой плазмы сахарной свеклы. При создании настоящего изобретения с успехом был применен метод молчания РНК для создания устойчивости к BNYVV путем трансгенной экспрессии инвертированного повтора длиной 428 - 75 - пар нуклеотидов из гена репликазы (ген RNA1 вирусного генома). Трансгенная устойчивость стабильно наследовалась в поколениях и, как установлено, обладала эффективностью при оценке не только в опытах в теплице, но также и в полевых условиях, что продемонстрировано в примерах 5- 8. 5 Фактически установлено, что индивидуальная устойчивость у трансгенных растений, предлагаемых в настоящем изобретении, или в сочетании с устойчивостью, полученной из Holly, превышала традиционную устойчивость, полученную из таких источников как Holly и С48 (см. примеры 5-7, ниже) даже при контрольном заражении BNYVV других типов и происхождения, включая 10 высокоагрессивные штаммы. В то время как частичная устойчивость, обнаруженная у устойчивых к BNYVV линий сахарной свеклы, несущих устойчивость из традиционных источников Holly, частично элиминировалась в гибридах, полученных с использованием этой линии (т.е. образовавшиеся гибриды становились существенно более чувствительными к BNYVV), 15 траснгенный вариант GM RZ13, предлагаемый в настоящем изобретении, отличался выраженной устойчивостью во всех изученных почвах, даже в случае гибридных растений, полученных с использованием растительного материала, содержащего вариант GM RZ13 (см. пример 8, ниже). Обнаруженная устойчивость оказалась существенно более сильной, чем устойчивость любого 20 из традиционных гибридов. Так, трансгенные растения, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержали вариант GM RZ13, отличались более выраженным снижением концентраций вируса по сравнению с растениями, полученными на основе подходов, в которых применяли нативные признаки (т.е. устойчивость, полученную из источника Holly или С48), при 25 оценке с использованием различных источников зараженных почв, содержащих различные известные типы BNYVV (см. пример 8, ниже). Кроме того, новые высокопатогенные штаммы также контролировались вариантом GM RZ13. Никакого отрицательного действия на содержание сахара, вес корней и чистоту сока (касательно таких показателей как содержание К, Na и амино-N) не 30 обнаружено у растений, содержащих признаки, характерные для варианта GM RZ13, в течение нескольких лет в различных областях в США и Европе. Таким образом, трансгенные гибриды, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают высокой ценностью при их применении в различных - 76 - ареалах в мире, в которых имеются зараженные ризоманией почвы, и прежде всего в ареалах с высоким давлением инфекции или с измененными типами вируса BNYVV, в которых традиционная устойчивость, связанная с Holly, или другими традиционными доступными в настоящее время источниками 5 устойчивости, не является достаточно сильной или уже преодолена вирусом. Приведенные ниже примеры даны только с целью иллюстрации одного или нескольких вариантов осуществления изобретения и не направлены на ограничение объема изобретения. Примеры 10 Пример 1. Конструирование векторов Корни сахарной свеклы, зараженные BNYVV В-типа, собирали в области Хартинг в Германии и общую РНК экстрагировали с помощью набора RNeasy Plant Mini фирмы Qiagen согласно инструкциям поставщика. Ген RNA1 BNYVV, кодирующий репликазу BNYVV, превращали в кДНК с помощью 15 SUPERSCRIPT1 m II РНКазы Н- обратной транскриптазы фирмы, в целом согласно инструкциям поставщика, и используя олигонуклеотид HiNK285 (5'-TCGTAGAAGAGAATTCАСССАААСТАТСС-3', SEQ ID NO: 28) в качестве обратного праймера. Затем амплифицировали максимальную перекрывающую RNA1 область длиной 1,4 т.п.н., несущую GDD-мотив, до 3' UTR с помощью 20 праймера HiNK283 (5'-AAGAATTGCAGGATCCACAGGCTCGGTAC-3', SEQ ID NO: 29) в сочетании с HiNK285 с использованием стандартной ПЦР. Последовательность RNA1 BNYVV с регистрационным номером Х05147 (Bouzoubaa и др., 1987) применяли в качестве референс-последовательности для создания различных олигонуклеотидов, последовательности, распознаваемые 25 рестриктазами ВатШ и EcoRl в представленных выше праймерных последовательностях, подчеркнуты. Полученный ПЦР-фрагмент сливали со вторым амплифицируемым фрагментом размером 0,4 т.п.н., перекрывающим только GDD-область, который амплифицировали с помощью праймеров HiNK283 и HiNK284 (5'-ТТССAACGAATTCGGTCTCAGACА-3', SEQ ID NO: 30 30). Оба фрагмента встраивали путем лигирования в сайты EcoRl, присутствующие в праймерах HiNK284 и HiNK285, так, что оба GDD-мотива находились в противоположном направлении, что приводило к образованию инвертированного повтора (конструкция, включающая инвертированный повтор - 77 - и последовательность из RNA1 BNYVV, обозначена как RZM в таблице 1 и на фиг. 1). Таким образом, инвертированный повтор состоял из GDD-области размером 0,4 т.п.н., прерывающейся З'-концом RNA1. Промотор Ubi3 из Arabidopsis thaliana, включающий родственную 5' UTR и интрон 1 (Norris и др., 5 1993), клонировали против хода транскрипции относительно инвертированного повтора, что обеспечивало конститутивную экспрессию. Сайт полиаденилирования располагался на терминаторе nos. Полную кассету интродуцировали в Т-ДНК соответствующего бинарного вектора за геном селектируемого маркера, который представлял собой ген 10 фосфоманнозоизомеразы (PMI) для селекции в отношении способности утилизировать маннозу (Reed и др., 2001), получая бинарный вектор pSYN 15965 (ранее известный как pHiNK188) (см. фиг. 1). Ген PMI находился под контролем промотора белка теплового шока (80) из Brassica oleracea и за ним располагался терминатор 35S. Компоненты pSYN15965 представлены также в таблице 1. 15 Таблица 1:- Размер, функция и источник компонентов вектора pSYN15965 Последовательность ДНК Размер последовательности Предполагаемая функция Источник и ссылка Убикитин 3 1,7 т.п.н Промотор, включая первый интрон Arabidopsis thaliana, Norris и др., 1993 RZM 1,6 т.п.н. Фактор, определяющий устойчивость к BNYVV BNYVV, Bouzoubaa и др., 1987 Nos 0,3 т.п.н. терминатор Agrobacterium tumefaciens, Fraley и др.,1983 Нар80 1,5 т.п.н. Промотор Brassica sp., Brunke и Wilson, 1993 PMI 1,2 т.п.н. Селектируемый маркер Escherichia coli, Joersbo и др., 1998 35S 0,2 т.п.н. Терминатор Вирус мозаики цветной капусты, Odell и др., 1985 Пример 2. Трансформация и селекция in vitro трансгенных ростков Традиционную чувствительную к ризомании линию для чистолинейного разведения фирмы Syngenta Seeds AB, Ландскруна, Швеция, обозначенную как 20 G018, применяли в качестве акцептора для трансформации. У семян сахарной свеклы стерилизовали поверхность и их проращивали in vitro. Осуществляли опосредуемую Agrobacterium трансформацию эксплантатов семядольного узла с использованием маннозоизомеразы в качестве селектируемого маркерного гена в целом согласно методу, описанному в Joersbo и др. (1998). Селекцию 25 трансгенных ростков сахарной свеклы начинали через 2-4 дня после - 78 - совместного культивирования путем постепенной замены сахарозы на D-маннозу до конечной концентрации 12 г/л в качестве основного источника углеводов в среде для регенерации. Селективная регенерация позволяла получать трансгенные ростки в течение 12-15 недель. Для подтверждения того, 5 что ростки были трансгенными, отбирали несколько верхушек листа с каждого регенерированного ростка и активность фосфоманнозоизомеразы (PMI) определяли с помощью парного ферментного анализа, описанного у Joersbo и др. (1998). Клональное размножение и укоренение трансгенных ростков осуществляли с использованием стандартной MS-среды (Murashige и Skoog, 10 1962), дополненной 0,25 мг/л ВА (6-бензиламинопурин) для размножения, и дополненной 5 мг/л IB А (индол-3-масляная кислота) для индукции корней. Размножение и укоренение осуществляли, поддерживая маннозу, применяемую для селекции, в концентрации 12 г/л для элиминации химерных растений. Каждое первичное полученное в результате регенерации растение (Ro-растение) 15 размножали in vitro для получения 3-6 Ro-растений, которые затем укореняли в песчаной почве в ростовой камере. После укоренения растения переносили в теплицу для оценки фенотипа. Ro-растения скрещивали с традиционными или устойчивыми к ризомании генотипами, гомозиготными по Holly, используя Ro-растения в качестве материнских особей. 20 Пример 3. Анализ накопления трансгенной мРНК и siPHK Рассаду, полученную согласно методу, описанному в примере 2, высаживали в стерильный песок и затем пересаживали в пробирки, содержащие 0,25 л стерильного песка или почвы, зараженной BNYVV В-типа. Для обнаружения трансгенной мРНК и siPHK образцы корней (по 0,2 г с растения) 25 отбирали в день 0 и через 7, 14, 21 и 28 дней после пересадки (после инокуляции, dpi (день после инокуляции)). В некоторых случаях корни некоторых растений объединяли для получения массы образца 0,2 г. Контрольные образцы, содержащие специфические для трансгена siPHK и мРНК, создавали путем инфильтрации листьев Nicotiana benthamiana штаммом 30 Agrobacterium tumefaciens ЕНА101, содержащим pHiNK188, согласно методу, описанному у Johansen и Carrington (2001). Общую РНК экстрагировали из корней сахарной свеклы или инфильтрованных листьев N. benthamiana, используя описанный ранее протокол - 79 - (Kreuze и др., 2005).Фракцию высокомолекулярной (HMW) РНК применяли для выявления трансгенной мРНК и вирусной РНК. Фракцию низкомолекулярной (LMW) РНК применяли для обнаружения siPHKn (Kreuze и др., 2005). Создавали 32Р смысловой и антисмысловой РНК-зонды, меченные [а- ]-УТФ с помощью 5 набора RiboMAX фирмы Promega согласно протоколу поставщика. Для анализа методом нозерн-блоттинга 10 мкг HMW-PHK вносили в содержащие формальдегид (1,2% агарозы) гели и осуществляли разделение с помощью электрофореза. Для обнаружения siPHK 15 мкг LMW-PHK смешивали в соотношении 1:1с буфером для образца, представляющим собой Трис-борат-10 ЭДТК-мочевину (фирма Bio-Rad), инкубировали при 95°С в течение 5 мин и осуществляли разделение в 15%-ном полиакриламидном геле (ТВЕ-7М Urea Ready Gel, фирма Bio-Rad) до тех пор пока происходила миграция красителя бромфенолового синего до нижней части геля. Разделенные РНК переносили на найлоновую мембрану типа Hybond-N (фирма Amersham) путем капиллярного 15 блоттинга. Блоты обрабатывали с помощью УФ-кросслинкера (1200 мкДж/см , УФ-кросс-линкер, фирма Amersham), предварительно гибридизовали, гибридизовали при 55°С и 37°С для HMW- и LMW РНК соответственно и отмывали согласно методу, описанному у Kreuze и др. (2005). Отмытые мембраны заворачивали в полиэтиленовую пленку и экспонировали в кассете 20 для экспонирования в течение 1-48 ч. Затем кассету сканировали с помощью устройства Molecular Imager FX фирмы Molecular Dynamics (см. фиг. 2). Анализ методом нозерн-блоттинга HMW-PHK, экстрагированных из корней устойчивых растений согласно описанному выше методу, продемонстрировал очень низкие уровни накопления трансгенной мРНК (фиг. 2, верхняя панель), 25 это позволяет предположить, что трансген приобретал пост-трансляционное молчание. Это было подтверждено наличием значительных количеств гомологичной трансгену siPHK во фракции LMW-PHK из корней всех проанализированных растений кроме нетрансгенных растений (фиг. 2, нижняя панель). Молчание трансгена и накопление siPHK выражено коррелировало с 30 устойчивостью, так как РНК BNYVV была обнаружена только в корнях нетрансгенных контрольных растений и никогда в корнях устойчивых растений (фиг. 2, верхняя панель, полосы 5, 9, 12 и 15). - 80 - Пример 4. Оценка фенотипа Ro-растений в отношении устойчивости к ризомании Семена проращивали в стерильном песке и развившиеся растения после укоренения переносили в теплицу. После акклиматизации в условиях теплицы 5 растения подвергали контрольному заражению путем высаживания подгруппы трансгенных Ro-клонов в горшки в почву, зараженную изолятом BNYVV В-типа из Германии. Зараженную почву разводили в соотношении 1:1 песком. Растения выращивали в пробирках, содержащих 0,25 л почвы; в экспериментах, в которых вегетационный период составлял более 2 месяцев, использовали горшки 1О объемом по 2,0 л. Все эксперименты проводили в теплице, в которой дневная и ночная температура составляла 22°С и 20°С соответственно и в которой поддерживали 16-часовой фотопериод. Растения в популяциях, в которых происходила сегрегация по трансгенному локусу, оценивали в отношении PMI-активности или с помощью ПЦР-анализа для определения трансгенного и 15 нетрансгенного потомства растений. Нетрансгенные сегреганты служили в качестве чувствительных контролей. Все эти чувствительные контрольные растения подвергали такому же протоколу регенерации in vitro, за исключением того, что их не подвергали селекции по признаку ассимиляции маннозы. Через 4 недели после контрольного заражения растения выкапывали и экстрагировали 20 сок из корней и определяли титры вируса с помощью ELISA (Clark и др., 1977; Gidner и др., 2005). Во все эксперименты включали в качестве чувствительного контроля традиционные гибрид, для которого известно, что он обладает высокой чувствительностью к BNYVV. Традиционные устойчивые к ризомании гибриды фирмы Syngenta Seeds, несущие устойчивость, полученную из источников Alba, 25 Rizor, С48 и/или Holly, включали в эксперименты в качестве эталона. Все эксперименты рандомизировали согласно рандомизированной блок-схеме с использованием 2-4 повторностей. Из 47 протестированных независимых Ro-клонов у 27 были обнаружены высокие уровни устойчивости, при этом титры вируса оказались ниже или равны 30 титрам, обнаруженным в устойчивых контрольных растениях. Все контрольные чувствительные растения имели высокие концентрации BNYVV. Устойчивые Ro-клоны отбирали и получали их следующее поколение путем перекрестного опыления оставшихся Ro-растений, которые поддерживали в стерилизованной - 81 - почве. Отобранные растения перекрестно опыляли чувствительным генотипом, а также гомозиготным по фактору Holly устойчивым генотипом для обеспечения сегрегации потомства по признаку трансгенной устойчивости чувствительного или гетерозиготного по Holly генетического фона. 5 Пример 5. Фенотипические характеристики трансгенной устойчивости к ризомании Для определения спектра и уровня устойчивости по сравнению с встречающимся в естественных условиях источниками устойчивости к ризомании трансгенные Т]-растения тестировали в почве, содержащей 10 различные типы BNYVV. Опыты осуществляли в климатической камере, в которой дневную температуру поддерживали на уровне от +17 до +19°С, а ночную температуру поддерживали на уровне +17°С. Из-за тепла, испускаемого лампами, в климатической камере дневная температура повышалась примерно до +2115 +22°С. Растения не подвергали избыточному увлажнению; длина светового дня составляла 16 ч. Тестируемые растения представляли собой потомство устойчивых Ro-растений, которые все несли одну копию Т-ДНК, что определено с помощью анализа методом Саузерн-блоттинга (данные не представлены). Генотипирование Ti-растений с помощью анализа PMI или ПЦР 20 продемонстрировало сегрегационное отношение 1:1, что и ожидалось для однокопийных вставок, и позволяло идентифицировать трансгенные и нетрансгенный сегреганты. Нетрансгенные сегреганты служили в качестве чувствительных контролей. Для осуществления первого подхода использовали почвы, полученные из 25 Испании (содержащие BNYVV А-типа), Германии (содержащие BNYVV В-типа), из области Питивье Франции (содержащие BNYVV Р-типа. Тест апостериорных множественных сравнений Дункана продемонстрировал, что титры вируса в трансгенном Т]-потомстве были существенно более низкими по сравнению с титрами в устойчивы гибридах, несущих традиционные факторы 30 устойчивости, при оценке в почве, зараженной В-типом (таблица 2А), за исключением потомства 2 (статистическая CD-группа), для которого не обнаружено существенного отличия от комбинации С48 х Holly (статистическая С-группа), но результаты оказались более высокими по сравнению со всеми - 82 - другими традиционными источниками устойчивости. При сравнении друг с другом чувствительного или Holly генетического фона установлено, что трансгенное потомство не отличалось существенно (статистические группы DE и Е), за исключением опять потомства 2 чувствительного генетического фона 5 (статистическая CD-группа), которое оказалось слегка менее устойчивым. В отличие от потомства 2 для уровней устойчивости потомства 1 и 3 не обнаружено никакого существенного улучшения при объединении с традиционной устойчивостью, связанной с фактором Holly, вероятно из-за очень высоких уровней устойчивости, обусловленной этими двумя трансгенными 10 вариантами индивидуально. Результаты статистического анализа опытов с помощью дисперсионного анализа и апостериорных множественных сравнений Дункана представлены ниже в таблицах 2А-2В. Титры вируса, измеренные в значениях, обозначенных одной и той же буквой, не являются достоверно различными при уровне 15 значимости 95%. Чувствительный контроль представлял собой нетрансгенных сегрегантов, которые не наследовали трансгенный локус. Во всех таблицах уровни вируса выражали в виде logio нг мл-1 в соке корней растений сахарной свеклы, подвергнутых контрольному заражению BNYVV. Таблица 2А: Растения-потомки поколения Т\, выращенные в теплице в 20 течение 1 месяца в почве, зараженной BNYVV В-типа Растения, линия Среднее значение Количество Группа по Дункану log нг BNYVV мл растений 25 ~ ~~ Holly х чувствительная 2,70 Holly х Holly 2,15 Holly х Rizor 2,01 C48 x Holly 0,92 Tj-потомство 2 0,65 С D Ti-потомство 1 + Holly 0,45 D Е Т[-потомство 3 0,43 D Е Ti-потомство 1 0,32 D Е Т)-потомство 2 + Holly 0,21 Tj-потомство 3 + Holly 0,19 He включен в дисперсионный анализ: чувствительный контроль > 2,95 - 83 - Для оценки трансгенной устойчивости к отношении более вирулентного Р-типа осуществляли контрольное заражение Т]-потомства одиннадцати Ro-клонов в почве, собранной в области Питивье во Франции. Несмотря на более высокие титры в почве Р-типа по сравнению с В-типом, у трансгенного потомства при объединении с Holly или индивидуально обнаружен существенно более низкий уровень BNYVV по сравнению с комбинацией С48 х Holly, которая представляла собой наиболее эффективную комбинацию традиционных источников устойчивости (Таблица 2Б). Этот результат свидетельствует о том, что трансгенная устойчивость оказалась эффективной даже при давлении высоковирулентных штаммов BNYVV, прежде всего с учетом того, что все гомозиготные по фактору Holly устойчивые контрольные растения имели такие же титры вируса, как и чувствительные контроли. Таблица 2Б: Растения-потомки поколения Tj, выращенные в теплице в течение 1 месяца в почве, зараженной BNYVV Р-типа Растения, линия Среднее значение Количество Группа по Дункану log нг BNYVV мл растений С48 xHolly 1,90 Т] -потомство 1 1,44 Tj-потомство 4 1,24 Т]-потомство 5 1,21 Tj-потомство 6 1,11 -потомство 7 1,10 Т] -потомство 8 1,09 Т j-потомство 9 1,08 Т] -потомство 10 0,95 Т]-потомство 11 0,86 Т]-потомство 12 0,63 Ti-потомство 13 0,59 Tj-потомство 1 + Holly 1,18 Не включены в дисперсионный анализ: чувствительный контроль > 2,95 Holly* Holly > 2,95 В другом опыте 10 трансгенных и 10 нетрансгенных растений выращивали в почве из Испании, которая содержала BNYVV А-типа. В качестве контроля такую же группу и такое же количество растений выращивали в почве, зараженной вирусом В-типа. Образцы сока трансгенных растений, выращенных - 84 - в почве, зараженной вирусом А- и В-типа, содержали 1,12 и 1,65 logio нг BNYVV мл 1 соответственно (данные не представлены). Более высокий титр вируса, обнаруженный у устойчивых растений в этом эксперименте, вероятно, обусловлен очень высокой температурой в теплице и, как следствие, более 5 высокой интенсивностью полива, что наиболее вероятно придает грибному переносчику более высокую активность по сравнению с активностью в других экспериментах, проведенных в зараженной В-типом почве, приводя к более высокому уровню контрольного заражения. Однако у всех нетрансгенных растений обнаружены существенно более высокие титры вируса, превышающие 10 2,95 logio нг BNYVV мл Эти результаты свидетельствуют о том, что трансгенная устойчивость является эффективной в отношении А-типа также как и В-типа. В описанных выше экспериментах все растения выкапывали и анализировали через 1 месяц после выращивания в зараженной ризоманией 15 почве. Для решения вопроса о том, сохранялась ли трансгенная устойчивость в течение периода времени, соответствующего вегетационному периоду культуры сахарной свеклы в полевых условиях, Тг-потомство двух независимых Ro-клонов выращивали в течение 5 месяцев в почве, зараженной BNYVV В-типа или Р-типа. Для обоих трансгенных вариантов был выявлен существенно более низкий 20 уровень вируса по сравнению с гомозиготным Holly-контролем, но не обнаружено достоверной разницы с гомозиготной линией С48 при выращивании в почве, зараженной В-типом (Таблица 2В). В почве, содержащей Р-тип, происходило сильное заражение всех контрольных растений, гомозиготных по фактору Holl, при этом титры вируса превышали 2,95 logio нг мл-1. Однако у 25 трансгенных растений поддерживался уровень их устойчивости и в них обнаружены существенно более низкие титры по сравнению как с гомозиготными по Holly, так и с гомозиготными по С48 растениями (таблица 2В). В целом эти результаты свидетельствуют о том, что продолжительность присутствия трансгенной устойчивости соответствовала периоду выращивания 30 культуры, она составляла 5 месяцев в почве, содержащей В-тип или более вирулентный Р-тип, в то время как связанная с Holly устойчивость уже не обеспечивала требуемое защитное действие. - 85 - Таблица 2В: Растения-потомки поколения Тг, выращенные в теплице в течение 5 месяцев в почве, зараженной BNYVV либо В-типа, либо Р-типа Растения, линия Среднее значение log нг BNYVV мл -1 Количество растений Группа по Дункану B-тип BNYVV Holly х Holly 1,88 С48 х С48 0,91 Т2 потомство 1 0,59 Т2 потомство 2 0,49 Не включен в дисперсионный анализ: чувствительный контроль > 2,95 Р-тип BNYVV С48 х С48 1.41 Т2 потомство 1 0,65 Т2 потомство 2 0,61 Не включены в дисперсионный анализ: чувствительный контроль > 2,95 Holly х Holly > 2,95 10 10 10 10 10 10 10 А В В В А В В При осуществлении второго подхода использовали почву, полученную из 25 долины Империал (США). Основой второго подхода являлись несколько публикаций о том, что штаммы BNYVV преодолевают устойчивость, обусловленную "Но11у". Пока неизвестно, могут ли определенные последовательности в геноме вызывать повышенную агрессивность изолятов. В этом проведенном в теплице опыте применяли почвы, при использовании 30 которых устойчивость "Но11у"-типа, вероятно была преодолена. Эти почвы содержали агрессивные изоляты BNYVV из Испании (А-тип), из долины Империал, США (А-тип) и из Питивье, Франция (Р-тип) соответственно. Для сравнения использовали почву из Германии, содержащую "традиционный" штамм BNYVV (В-типа; не обладающий исключительной агрессивностью). 35 Растения, применяемые при осуществлении этого подхода, представляли собой трансгенный вариант GM RZ 13 индивидуально или скрещенный с традиционной линией, несущий устойчивость типа "НоПу". Традиционные Holly-гибриды и гибриды с групповой устойчивостью типа "НоНу и С48" применяли в качестве контроля. Традиционные гибриды, не обладающие 40 устойчивостью, служили в качестве чувствительного контроля. Растения выращивали и анализировали согласно описанному выше методу. - 86 - Результаты, полученные с использованием почвы из Испании, с высоким уровнем заражения агрессивным штаммом BNYVV А-типа, продемонстрировали, что в растительном материале, несущем вариант GM RZ13, который содержал также фактор устойчивости из традиционной линии Holly, 5 обнаружен очень низкий уровень BNYVV, который оказался существенно более низким, чем в растениях, несущих только традиционный фактор устойчивости (Таблица ЗА). Таблица ЗА: Растения, выращенные в почве из Испании, зараженной BNYVV А-типа L0 Растения, линия Среднее значение Количество Группа по Дункану log нг BNYVV мл растений Традиционная Holly 3,91 9 А 15 Традиционная Holly 3,9 8 А Holly+ С48 3,39 9 А GMRZ13 +Holly 1,83 8 В Результаты, полученные с использованием почвы из долины Империал 20 (США) или почвы из области Питивье, Франция соответственно, оказались аналогичными, демонстрирующими, что в растительном материале, несущем только вариант GM RZ13, или этот вариант в сочетании с устойчивостью, полученной из Holly, обнаружен очень низкий уровень BNYVV даже в этих почвах (таблицы ЗБ и ЗВ). Титр вируса оказался существенно более низким, чем 25 титр BNYVV в растительном материале, содержащем традиционный фактор устойчивости Holly. Одна несущая традиционный фактор Holly линия (обозначенная как Holly + С48 2 в таблицах ЗБ и ЗВ, ниже) также обладала устойчивостью, но гибрид, полученный из этой линии, который содержал также фактор устойчивости из С48 (обозначенный как Holly + С48 1 в таблицах ЗБ и 30 ЗВ, ниже) обладал в значительной степени более низкой устойчивостью. Уровень заражения агрессивным штаммом BNYVV А-типа почвы из долины Империал был чрезвычайно высоким; однако в этой почве отсутствовал почвообитающий вирус мозаики свеклы (BSBMV). - 87 - Таблица ЗБ: Растения, выращенные в почве из долины Империал (США), зараженной BNYVV А-типа Растения, линия Среднее значение Количество Группа по Дункану log нг BNYVV мл растений Традиционная Holly 1 4,54 19 А Традиционная Holly 2 4,39 19 А Традиционная Holly 3 4,34 9 А В 10 Чувствительный контроль 4,3 10 А В Holly+ С48 1 4,00 20 В Но11у + С48 2 2,21 20 С GMRZ13+Holly 1,66 20 D GMRZ13 1,09 20 Е Таблица ЗВ: Растения, выращенные в почве из области Питивье, Франция, зараженной BNYVV Р-типа Растения, линия Среднее значение log нг BNYVV мл-' Количество растений Группа по Дункану Чувствительный контроль 4,28 Традиционная Holly 1 4,28 Традиционная Holly 2 3,93 А В Традиционная Holly 3 3,98 А В Holly + С48 1 3,6 Holly + С48 2 2,12 GM RZ13 + Holly 1,59 GM RZ13 1,52 30 Результаты, полученные с использованием почвы из Германии, продемонстрировали, что в растительном материале варианта GM RZ13, который нес также устойчивость из линии Holly, практически отсутствовал BNYVV (см. таблицу ЗГ). Как и ожидалось, уровень устойчивости оказался также очень высоким в растительном материале, устойчивость которого была 35 обусловлена только трансгенным вариантом GM RZ1, но также и в растительном материале одной линии (обозначена как Holly + С48 2 таблице ЗГ, ниже), устойчивость которой связана с Holly и С48. И в этом случае растительный материал линии, который был получен из одной линии, обозначенной как Holly + С48 2, оказался существенно в большей степени инфицированным BNYVV, 40 чем растения самой линии. - 88 - Таблица ЗГ: Растения, выращенные в почве из Германии, зараженной BNYVV В-типа Растения, линия Среднее значение log нг BNYVV мл-1 Количество растений Группа по Дункану Чувствительный контроль 4,37 Традиционная Holly 1 2,93 Традиционная Holly 2 2,92 Традиционная Holly 3 3,18 Holly + С48 1 2,94 Holly + С48 2 0,92 GM RZ13 + Holly 0,28 GMRZ13 1,02 15 В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что растительный материал, содержащий вариант GM RZ13 индивидуально или в сочетании с устойчивостью, полученной из линии Holly, а также растительный материал из линии, в которой объединена традиционная устойчивость, полученная при использовании в качестве источника Holly и С48, содержал наименьший уровень 20 BNYVV при контрольном заражении BNYVV различных типов и происхождения. Однако высокая устойчивость линии частично элиминировалась в гибридах, полученных при скрещивании этой линии с другой линией, не обладающей какой-либо устойчивостью (т.е. гибриды являлись гетерозиготными по традиционным факторам устойчивости); образовавшиеся растения 25 становились существенно более чувствительными к BNYVV. Растительный материал, содержащий вариант GM RZ 13, обладал очень высокой устойчивостью при использовании всех изученных почв и проявлял существенно более выраженную устойчивость, чем любой из традиционных гибридов. Пример 6. Полевые опыты, проведенные в Швеции 30 Полевые опыты проводили в период вегетации в 2004 и 2005 г.г. на юго- востоке Швеции на зараженном ризоманией поле, в котором, как установлено на основе серьезности заболевания у растений сахарной свеклы в предыдущие годы, присутствовал BNYVV В-типа (данные не представлены). Три различных трансгенных гибрида (Тг-поколения), полученные из Ro-клона 4, один из 35 которых нес гетерозиготный генетический фон по Holly (соответствует трансгенному Тг-гибриду С в таблицах 4А и 4Б. ниже) и два несли полностью чувствительный генетический фон (соответствуют трансгенным Тг-гибридам А и - 89 - В в таблицах 4А и 4Б, ниже), сравнивали с традиционными гибридами, гетерозиготными по Holly, гетерозиготными по Rizor, С48 х Holly, Rizor х Holly, Alba х Holly, и полностью чувствительным гибридом. Опыты начинали в апреле каждого года в трех повторностях, используя по 3 ряда на делянку, по 6 м на 5 ряд. Расстояние между растениями в ряду составляло 15 см. В конце периода вегетации в сентябре каждого года отбирали по 5 см самой концевой области верхушки каждого главного корня, отмывали и измельчали в шелушильной машине для картофеля. Сок экстрагировали из срезов эпидермиса, которые включали корневые волоски, и определяли титр вируса с помощью ELISA. В 10 этом же соке анализировали PMI-активность с целью идентификации трансгенных и нетрансгенных растений-потомков. Полевые опыты осуществляли в соответствии с директивами Шведского комитета по проведению экспериментов с генномодифицированными организмами (Swedish committee for the Experimental release of Genetically Modified Organisms) 15 (Jordbruksverket), утвержденными под регистрационным номером DNR22-6371/03. Когда растения выкапывали в конце сентября, у всех чувствительных контрольных растений обнаружены выраженные симптомы ризомании. Зараженные растения имели более мелкие листья с признаками хлороза и на 20 главном корне, как правило, присутствовали в избыточном количестве вторичные боковые корни, в отличие от трансгенных растений, которые избежали заражения, и у них отсутствовали какие-либо видимые симптомы. Результаты визуальных наблюдений коррелировали с титрами вируса, измеренными в корнях (таблица 4А). 25 Таблица 4А: Т2-гибриды, выращенные в Швеции в 2004 г. на поле с естественным заражением BNYVV В-типа Растения, линия Среднее значение Количество Группа по Дункану log нг BNYVV мл растений 30 Rizor х Holly 1,70 59 ~ А Alba х Holly 1,59 57 А Rizor х чувствительная 1,57 56 А Holly х чувствительная 1,51 60 А Тг-гибрид А из Ro-клона 4 0,89 70 В 35 С48 х Holly 0,73 60 ВС Тг-гибрид В из Ro-клона 4 0,57 75 ВС Тг-гибрид С из Ro-клона 4 - 90 - + Holly 0,33 62 С He включен в дисперсионный анализ: чувствительный контроль > 2,95 50 Чувствительные контрольные растения оказались сильно зараженными, уровни вируса превышали 2,95 logio нг мл-1. У трансгенных гибридов обнаружены существенно более низкие титры по сравнению с чувствительными контролями, а также по сравнению с устойчивыми гибридами Rizor х Holly, Alba 10 х Holly, гетерозиготными по Rizor и гетерозиготными по Holly. С помощью теста апостериорных множественных сравнений Дункана установлено, что трансгенные гибриды превышали их по всем изученным параметрам устойчивости за исключением комбинации С48 xHolly (статистическая группа ВС), которая по устойчивости не отличалась достоверно от трансгенных 15 гибридов (статистические группы В и ВС). Важно отметить, что гибриды, гетерозиготные как по Holly, так и по трансгенной устойчивости (статистическая группа С), отличались более низкими титрами вируса во все случаях, хотя различия не всегда были статистически значимыми. Тем не менее, эти данные иллюстрируют возможность объединения источников трансгенной и 20 традиционной устойчивости для достижения еще более высокой устойчивости к ризомании. Аналогичные результаты были получены в полевом опыте, проведенном в 2005 г., эти результаты представлены в таблице 4Б. В трансгенных растениях, которые также несли устойчивость, связанную с Holly, обнаружены существенно 25 более низкие уровни BNYVV по сравнению со всеми другими изученными вариантами. В двух гибридах Holly х С48 обнаружены существенно более низкие уровни вируса по сравнению с вариантами, несущими только устойчивость, связанную с Holly. Таблица 4Б: Тг-гибриды, выращенные в Швеции в 2005 г. на поле с 30 естественным заражением BNYVV В-типа Растения, линия Среднее значение Количество Группа по Дункану log нг BNYVV мл растений Чувствительный гибрид 2,58 39 В 35 Традиционный Holly гибрид 1,87 40 С Традиционный Holly гибрид 1,50 79 CD Традиционный Holly + С48 гибрид 1,20 40 DE Традиционный Holly + С48 гибрид 0,84 40 Е - 91 - Традиционный Holly + С48 гибрид 0,77 40 Е GM RZ 13 + традиционный Holly 0,28 40 F гибрид He включен 5 в дисперсионный анализ: чувствительный контроль > 2,95 50 Таким образом, в обоих проведенных в Швеции полевых опытах установлено, что в трансгенных вариантах уровень BNYVV оказался 10 существенно более низким, чем во всех традиционных устойчивых гибридах за исключением гибридов на основе комбинации Holly и С48. Пример 7. Полевые опыты, проведенные в США Дополнительный полевой опыт проводили в период вегетации в 2009 г. на зараженном ризоманией поле в Раймонде, шт. Миннесота, США, которое, как 15 установлено, заражено отклоняющимся от нормы способным преодолевать устойчивость штаммом BNYVV А-типа. Семена сахарной свеклы трансгенного варианта GM RZ13, скрещенного с традиционной линией, несущей устойчивость типа "Но11у", обрабатывали стандартными фунгицидами согласно рекомендациям производителя [апрон (металаксил, фирма Syngenta, Гринсборо, 20 шт. Северная Каролина) и тирам (тетрамтилтиурам-дисульфид, фирма Bayer CropScience, Исследовательский треугольный парк, шт. Северная Каролина)] и высаживали согласно рандомизированной блок-схеме (6 повторностей/вариант). Каждая повторность представляла собой одну делянку площадью 10 м (110 кв. футов) с 3 рядами, отделенными друг от друга на 56 см (22 дюйма), в которые 25 высаживали семена на расстоянии 13 см (5 дюймов) друг от друга с помощью пневматической сеялки John Deere. Применяли соответствующую агрономическую практику для поддержания требуемого состояния здоровья растений, включая применение гербицидов и пестицидов в микродозах и культивирование. Примерно через 14 недель после посадки свеклу обрезали; 30 урожай на каждой делянке выкапывали и упаковывали в мешки с помощью применяемой для исследовательских целей уборочной машины для сахарной свеклы. Урожай каждой делянки перерабатывали индивидуально с помощью тарной линии сахарной свеклы (фирма Relobo, Парма, Италия). После автоматической промывки, взвешивания и нарезки с использованием тарной 35 линии, четыре образца массой по 30 г мезги сахарной свеклы автоматически экструдировали и собирали сахар и проводили анализ примесей с помощью - 92 - автоматической системы для анализа сахарной свеклы типа Venema (фирма Venema, Гронинген, Нидерланды). Образцы мезги применяли для анализа сахара и количественной оценки уровня BNYVV с помощью ELISA. Титры вируса определяли с помощью ELISA 5 с использованием метода, описанного у Clark и др., 1977 и Gidner и др., 2005. Для осуществления ELISA 0,2 г мезги на образец разводили и тщательно смешивали в буфере для экстракции, содержащем ЗФР-Твин-альбумин (1:20 мае./об.; буфер для экстракции представлен в описании метода ELISA). В полевом опыте, проведенном в 2009 г., растения, несущие традиционную 10 устойчивость к ризомании, применяли в качестве контролей. Контрольные растения, имеющие устойчивость, обусловленную Holly ("Но11у") или Holly и С48 ("Но11у + С48"), соответственно, оказались более значительно зараженными BNYVV по сравнению с трансгенными растениями, несущими вариант GM RZ13 в сочетании с традиционной устойчивостью Holly ("Но11у"; см. фиг. 3). Для 15 трансгенных растений, несущих вариант GM RZ13, четко продемонстрировано наличие наиболее низких уровней вируса по сравнению с контролем, имеющим традиционную устойчивость, обусловленную только Holly, но также и по сравнению с растениями с комбинированной традиционной устойчивостью, обусловленной Holly и С48 (фиг. 3). 20 Пример 8. Обобщение результатов опытов в климатической камере и в полевых условиях Растения сахарной свеклы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержали только вариант GM RZ13, характеризовались более высокой устойчивостью по сравнению с вариантами на основе нативных источников, 25 которые представлены в таблице 4. В качестве тестируемого материала применяли растительный материал, содержащий вариант GM RZ13 ("GM RZ13"), растительный материал, содержащих оба традиционных источника устойчивости Holly и С48 ("Но11у + С48"), растительный материал, содержащий традиционный источник устойчивости Holly ("Но11у"), и растительный 30 материал, не содержащий ни трансгенного варианта, ни фактора устойчивости из традиционного источника ("чувствительный"). - 93 - Таблица 5. Обобщение результатов полевых опытов с различными типами BNYVV, описанных в примерах 5-7, выше Описание почвы Тестируемый растительный материал Тип вируса GM RZ13 Holly + С48 Holly Чувствительный Давление заражения от среднего до высокого; почвы из США, Испании и Ирана +++ Высокий уровень заражения/отклоняющиеся от нормы штаммы; почвы из США и Испании +++ Давление заражения от среднего до высокого; почвы из Германии и Швеции +++ Давление заражения от среднего до высокого; почвы из Франции (Питивье) +++ Очень высокое давление заражения; почвы из Франции (Питивье) +++ Контрольная шкала: 5 +++ очень низкий уровень вируса ++ средний уровень вируса + высокий уровень вируса очень высокий уровень вируса/уровень, соответствующий чувствительной линии 10 Как видно из таблицы 5, растения, содержащие вариант GM RZ13, характеризовались устойчивым и в значительной степени более низким титром вируса BNYVV всех типов по сравнению с традиционной устойчивостью. Кроме того, растения, содержащие вариант GM RZ13, предлагаемый в настоящем изобретении, характеризовались также способностью в значительной степени 15 контролировать новый высокопатогенный штамм BNYVV, размножение которого не снижается вообще или снижается лишь частично при наличии устойчивости, обусловленной традиционными факторами. Депозит В соответствии с Будапештским договором заявители депонировали семя 20 сахарной свеклы описанного выше варианта GM RZ13 11 декабря 2008 г. в NCIMB Ltd. Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Шотландия под регистрационным номером NCIMB 41601. Депозит должен - 94 - сохраняться в депозитарии в течение периода, составляющего 30 лет, или в течение 5 лет после последнего требования, или в течение времени действия патента, и даже в течение более длительного периода времени, и должен при необходимости заменяться в течение этого периода. Заявители не налагают 5 никаких ограничений на доступность депонированного материала из АТСС; однако заявители не уполномочены отказываться от каких-либо ограничений, налагаемых законом о переносе биологического материала или его транспортировании для продажи. Заявители не уполномочены отказываться от каких-либо нарушений их прав, гарантированных этим патентом согласно Акту 10 о защите сортов растений (Plant Variety Protection Act) (7 USC 2321 и далее). Все публикации и опубликованные патентные документы включены в настоящее описание в качестве ссылки в той степени, если бы каждая индивидуальная публикация или патентный документ были специально и индивидуально включены в него в качестве ссылки. 15 Ссылки Abe Н., Tamada Т., Association of Beet Necrotic Yellow Vein Virus with isolates of Polymyxa betae Keskin. Ann Phytopath Soc Jpn 52, 1986, cc. 235-247; Baulcombe D.C., Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. Plant Cell 8, 1996, cc. 1833-1844; 20 Biancardi E., Lewellen R.T., De Biaggi M., Erichsen A.W., Stevanato P., The origin of rhizomania resistance in sugar beet. Euphytica 127, 2002, cc. 383-397; Bouzoubaa S., Quillet L., Guilley H., Jonard G., Richards K., Nucleotide sequence of Beet Necrotic Yellow Vein Virus RNA-1. J Gen Virol 68, 1987, cc. 615626; 25 Canova A., Appunti di patologia della barbabietola. Informatore Fitopatologico 9, 1959, cc. 390-396; Clark M.F., Adams A.N., Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J Gen Virol 34, 1977, cc. 475-483; 30 De Biaggi M., Me'thodes de selection-un cas concret. Proceedings of the 50th IIRB winter congress, Brussels, том II, 1987, cc. 157-163; - 95 - Gidner S., Lennefors B-L., Nilsson N-O., Bensefelt J., Johansson E., Gyllenspetz U., Kraft Т., QTL mapping of BNYVV resistance from the WB41 source in sugar beet. Genome 48, 2005, cc. 279-285; Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Petersen S.G., Brunstedt J., Okkels F.T., 5 Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol Breed 4, 1998, cc. 111-117; Johansen L.K., Carrington J.C., Silencing on the spot Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiol 126, 2001, cc. 930-938; 10 Kaniewski W., Lawson C, Coat protein and replicase-mediated resistance to plant viruses, в: Plant virus disease control., под ред. Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H., изд-во APS PRESS, Saint-Paul, Minnesota, USA, 1998, cc. 65-78; Koenig R., Luddecke P., Haeberle' A.M., Detection of Beet Necrotic Yellow Vein Virus strains, variants and mixed infections by examining single-strand 15 conformation polymorphisms of immunocapture RT-PCR products. J Gen Virol 76, 1995, cc. 2051-2055; Kreuze J.F., Savenkov E.I., Cuellar W., Li X., Valkonen J.P.T., Viral class 1 RNase III involved in suppression of RNA silencing. J Virol 79, 2005, cc. 7227-7238; Kruse M., Koenig R., Hoffmann A., Kaufmann A., Commandeur U., Solovyev 20 A.G., Savenkov I., Burgermeister W., Restriction fragment length polymorphism analysis of reverse transcription-PCR products reveals the existence of two major strain groups of Beet Necrotic Yellow Vein Virus. J Gen Virol 75, 1994, cc. 18351842; Lennefors B-L., Savenkov E.I., Mukasa S.B., Valkonen J.P.Т., Sequence 25 divergence of four Soilborne Sugar Beet-infecting Viruses. Virus Genes 31, 2005, cc. 57-64 ; Lennefors B-L., Sarenkov E.I., Bensefeld J., Wremerth-Weich E., van Roggen P., Tuvesson S., Valkonen J.P.T., Gielen J., dsRNA-mediated resistance to Beet Necrotic Yellow Vein Virus infection in sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris). 30 Mol Breeding 18, 2006, cc. 313-325; Lewellen R.T., Skoyen I.O., Erichsen A.W., Breeding sugar beet for resistance to rhizomania: Evaluation of host-plant reactions and selection for and inheritance of - 96 - resistance. Proceedings of the 50th IIRB winter congress, Brussels, том II, 1987, cc. 139-156; Lewellen R.T., Whitney E.D., Registration of germplasm lines developed from composite crosses of sugarbeet x Beta maritima. Crop Sci 33, 1993, cc. 882-883; 5 Lewellen R.T., Performance of near-isolines of sugarbeet with resistance to rhizomania from different sources. In: Proc 58th IIRB cong, 1995, cc. 83-92; Liu H-Y., Sears J.L., Lewellen R.T., Occurrence of resistance-breaking Beet Necrotic Yellow Vein Virus of sugar beet. Plant Dis 89, 2005, cc. 464-468; Murashige Т., Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with 10 tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 1962, cc. 473-497; Norris S.R., Meyer S.E., Callis J., The intron of Arabidopsis thaliana polyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant of chimeric gene expression. Plant Mol Biol 21, 1993, cc. 895-906; Paul H., Henken В., Alderlieste M.F.J., A greenhouse test for screening sugar 15 beet (Beta vulgaris) for resistance to Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV). Neth J Plant Pathol 98, 1992, cc. 65-75; Pelsy F., Merdinoglu D., Identification and mapping of random amplified polymorphic DNA markers linked to a rhizomania resistance gene in sugar beet (Beta vulgaris L.) by bulked segregant analysis. Plant Breeding 115, 1996, cc. 371-377; 20 Powell-Abel P., Nelson R.S., De В., Hoffmann N., Rogers S.G., Fraley R.T., Beachy R.N., Delay of disease development in transgenic plants that express the Tobacco Mosaic Virus coat protein gene. Science 232, 1986, cc. 738-743; Reed J., Privalle L., Powell M.L., Meghji M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Wenck A., Launis K., Kramer C, Chang Y.F., Hansen G., Wright M., 25 Phosphomannose isomerase: an efficient selectable marker for plant transformation. In Vitro Cell Dev Biol Plant 37, 2001, cc.127-132; Sanford J.C., Johnston S.A., The concept of parasitederived resistance- Deriving resistance genes from parasite's own genome. J Theor Biol 113, 1985, cc. 395-405; 30 Scholten O.E., Jansen R.C., Keizer L.C.P., De Bock T.S.M., Lange W., Major genes for resistance to Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) in Beta vulgaris. Euphytica 91, 1996, cc. 331-339; - 97 - Tamada Т., Baba Т., Beet Necrotic Yellow Vein Virus from rhizomania-affected sugar beet in Japan. Ann Phytopathol Soc Jpn 39, 1973, cc. 325-332; Tamada Т., Beet Necrotic Yellow Vein Virus. C.M.I./ A.A.B. Descriptions of plant viruses, No. 144; 5 Tenllado F, Llave C, Diaz-Ruiz JR (2004) RNA interferente as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants. Virus Res 102, 1975, cc. 85-96; Voinnet O., RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet 17, 2001, cc. 449-459; 10 Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M-B., Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc Nat Acad Sci USA 95, 1998, cc. 13959-13964; Waterhouse P.M., Smith N.A., Wang M.B., Virus resistance and gene silencing: killing the messenger. Trends Plant Sci 4, 1999, cc. 452-457; 15 Waterhouse P.M., Wang M.B., Lough Т., Gene silencing as an adaptive defence against viruses. Nature 411, 2001, cc. 834-842; Whitney E.D., Identification, distribution, and testing for resistance to rhizomania in Beta maritima. Plant Dis 73, 1989, cc. 287-290. - 98 - ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Зингента Партисипейшнс АГ <120> Трансгенный вариант сахарной свеклы GM RZ13 <130> 71793РСТ <150> ЕР08172387.6 <151> 2008-12-19 <160> 30 <170> Patentln, версия 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> 3'-стыковочная последовательность между RZ-вставкой и геномной ДНК сахарной свеклы <400> 1 acaccacaat ttataccaac 20 <2Ю> 2 <211> 807 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Последовательность, перекрывающая 3'-конец вставки и фланкирующая геномную ДНК сахарной свеклы <220> <221> misc_feature <222> (1)..(460) <223> Последовательность 3'-конца вставки (правая пограничная последовательность) <220> <221> misc_feature <222> (461)..(807) <223> Геномная ДНК сахарной свеклы, фланкирующая 3'-конец вставки <400> 2 ggtgaatcag cgtttattgc cgccaacgaa tcaccggtga ctgtcaaagg ccacggccgt 60 ttagcgcgtg tttacaacaa gctgtaagag cttactgaaa aaattaacat ctcttgctaa 120 gctgggagct cgtcgacgca tgcccgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 180 - 99 - ctctctataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttct tatagggttt 240 cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc 300 tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccaggg gtacgatctc gagagatctg 360 ctagccctgc aggaaattta ccggtgcccg ggcggccagc atggccgtat ccgcaatgtg 420 10 ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat ttataccaac caaacaacac 480 ttaacatgag aggaggaact ggtggtgcta tggtggaaga gaggtaggag aaagaaaaaa 540 aatttatacc aaccaaacaa cacttaacat ctaagggttt tgcttccctt tccctctcta 600 cccctttctt gattccattc cctttacccc ttgacaacca aacgccccct cagttctcat 660 gagttaggaa gtaagaagga gattctaaca cataagaaaa cttccaaaga cggaaagtgg 720 tgaatttata cctagaagca aatattcacg ccaataaata ccccaaatat gaggatgatg 780 agagtcgaac tcccgaccat aaggttg 807 25 <210> 3 <211> 347 <212> ДНК <213> Beta vulgaris 30 <400> 3 ttataccaac caaacaacac ttaacatgag aggaggaact ggtggtgcta tggtggaaga 60 gaggtaggag aaagaaaaaa aatttatacc aaccaaacaa cacttaacat ctaagggttt 120 35 tgcttccctt tccctctcta cccctttctt gattccattc cctttacccc ttgacaacca 180 aacgccccct cagttctcat gagttaggaa gtaagaagga gattctaaca cataagaaaa 240 cttccaaaga cggaaagtgg tgaatttata cctagaagca aatattcacg ccaataaata 300 ccccaaatat gaggatgatg agagtcgaac tcccgaccat aaggttg 347 <210> 4 45 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> 50 <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 4 -100- cggccagcat ggccgtat 18 <210> 5 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 5 ccagcatggc cgtatccgca at 22 <210> 6 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 6 catggccgta tccgcaatgt gtta 24 <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> 5'- стыковочная последовательность между RZ-вставкой и геномной ДНК сахарной свеклы <400> 7 cggatgcgac tcaaacactg 20 <210> 8 <211> 484 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Последовательность, перекрывающая 5'-конец вставки и фланкирующую геномную ДНК сахарной свеклы <220> <221> misc feature - 101 - <222> (1)..(237) <223> Последовательность вставки на 5'-конце RZ-вставки (левая пограничная последовательность) 5 <220> <221> misc_feature <222> (238)..(484) <223> Геномная ДНК сахарной свеклы, фланкирующая 5'-конец RZ-вставки 10 <400> 8 gatcaccgaa accctaaccc gaccaccgaa accctaaccc aaccaccgtt tgaagctctg 60 tttttacaga catgctggcg gaaccctaac tcacgacgct attggatggg cggacgcgac 120 15 aacaggggag gagagtggag aagaatacga gggtggcggg cgggcggatg cgacgcaggg 180 20 gagggggtgc gagaagacgc gacgcagggg agagggtggc gggcgggcgg atgcgactca 240 aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct gatcatgagc ggagaattaa 300 gggagtcacg ttatgacccc cgccgatgac gcgggacaag ccgttttacg tttggaactg 360 acagaaccgc aacgctgcag gaattggccg cagcggccat ttaaatcaat tgggcgcgcc 420 25 gaattcccga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agttgcgcgc 480 tata 484 30 <210> 9 <211> 237 <212> ДНК <213> Beta vulgaris 35 <400> 9 gatcaccgaa accctaaccc gaccaccgaa accctaaccc aaccaccgtt tgaagctctg 60 40 tttttacaga catgctggcg gaaccctaac tcacgacgct attggatggg cggacgcgac 120 aacaggggag gagagtggag aagaatacga gggtggcggg cgggcggatg cgacgcaggg 180 gagggggtgc gagaagacgc gacgcagggg agagggtggc gggcgggcgg atgcgac 237 45 <210> 10 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность 50 <220> <223> Полинуклеотидная последовательность - 102 - <400> 10 cagcgttgcg gttctgtcag ttccaa <210> 11 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 11 atgagatggg tttttatgat tagagtcccg ca <210> 12 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 12 tcgactctca tcatcctcat atttggg <210> 13 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 13 agaagacgcg acgcagggga ga <210> 14 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 14 agacatgctg gcggaaccct aactcac - 103 - <210> 15 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 15 cctaactcac gacgctattg gatgggc <210> 16 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 16 gcgacaacag gggaggagag tggagaa <210> 17 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 17 gacctaatcc aaccaccacc ataggatgt <210> 18 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 18 tgcagcgttg cggttctgtc agtt <210> 19 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность - 104 - <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 19 ggtgaatcag cgtttattgc cgccaacgaa t <210> 20 10 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> 15 <223> Полинуклеотидный праймер <400> 20 gccgtatccg caatgtgtta 20 25 <210> 21 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 21 30 gatgggcgca catccgaaaa gcagtt <210> 22 <211> 23 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность 40 <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 22 gcatgcaagc ttcgtacgtt aat 23 45 <210> <211> <212> 23 27 ДНК <213> Искусственная последовательность 50 <220> <223> Полинуклеотидная последовательность - 105 - <400> 23 cgaccctcac aaagacaaag aaatatc 27 J <210> 24 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность 10 <22 0> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 24 caaccttatg gtcgggagtt eg 22 <210> 25 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность 25 <400> 25 gggcggatgc gactcaa 17 <210> 26 30 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> 35 <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 26 ccttaattct ccgctcatga tea 23 <210> 27 <211> 15 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность - TaqMan-зонд <220> <221> <222> misc_feature (1) ¦ . (1) - 106 - <223> Связана с красителем ТЕТ на 5'-конце зонда (ТЕТ = 6-карбоксил-4,7,2' ,71-тетрахлорфлуоресцеин) < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Связана с красителем MGB на 3'-конце зонда (MGB = агент, связывающийся с минорным желобком) <400> 27 cgggaaacga caatc 15 <210> 28 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность < 210 > 2 9 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> 29 aagaattgca ggatccacag gctcggtac 29 <210> 30 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Полинуклеотидная последовательность <400> tcgtagaaga gaattcaccc aaactatcc <400> ttccaacgaa ttcggtctca gaca - 107 - ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая является уникальной для варианта GM RZ13. 2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где молекула нуклеиновой кислоты связывает гетерологичную молекулу ДНК, встроенную в геном варианта GM RZ13, с геномной ДНК варианта GM RZ13, содержащая по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов гетерологичной молекулы ДНК и по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20 и более предпочтительно по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов геномной ДНК, фланкирующей сайт инсерции гетерологичной молекулы ДНК. 3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1 или п. 2, в которой нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и их комплементы. 4. Молекула нуклеиновой кислоты по одному из п.п. 1-3, где молекула нуклеиновой кислоты содержится в семени сахарной свеклы, депонированном в NCIMB под регистрационным № 41601. 5. Пара полинуклеотидных праймеров, включающая первый полинуклеотидный праймер и второй полинуклеотидный праймер, которые функционируют вместе в образце в присутствии в качестве матрицы ДНК сахарной свеклы варианта GM RZ13 с образованием ампликона, диагностического для варианта сахарной свеклы GM RZ13. 6. Пара полинуклеотидных праймеров по п. 5, в которой одна из праймерных последовательностей представляет собой или является комплементарной геномной последовательности растения сахарной свеклы, фланкирующей сайт инсерции гетерологичной последовательности ДНК, -108- встроенной в геном растения сахарной свеклы варианта сахарной свеклы GM RZ13, и в которой другая полинуклеотидная праймерная последовательность представляет собой или является комплементарной гетерологичной последовательности ДНК, встроенной в геном растения сахарной свеклы 5 варианта сахарной свеклы GM RZ13. 7. Пара праймеров по п. 5 или п. 6, в которой одна из праймерных последовательностей выбрана из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9. 8. Пара полинуклеотидных праймеров по одному из п.п. 5-7, в которой первый полинуклеотидный праймер представляет собой праймер, выбранный из группы, включающей а) полинуклеотидный праймер, содержащий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 3 или из положений 461-807 в SEQ ID NO: 2 или их комплементы; и б) полинуклеотидный праймер, содержащий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 9 или из положений 1-237 в SEQ ID NO: 8 или их комплементы. 9. Пара полинуклеотидных праймеров по п. 8, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25 и их комплементы. 10. Пара полинуклеотидных праймеров по одному из п.п. 5-7, в которой второй полинуклеотидный праймер представляет собой праймер, выбранный из группы, включающей 30 а) полинуклеотидный праймер, содержащий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из положений 1-460 в SEQ ID NO: 2 или их комплементы; и б) полинуклеотидный праймер, содержащий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов из положений 238-484 в SEQ ID NO: 8 или их комплементы. - 109 - 11. Пара полинуклеотидных праймеров по п. 10, в которой второй полинуклеотидный праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26 и их комплементы. 12. Пара полинуклеотидных праймеров по одному из п.п. 7-11, в которой пара праймеров выбрана из группы пар праймеров, включающей: а) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 13, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; б) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 14, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена либо в SEQ ID NO: 10, либо в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; в) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 15, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; г) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 16, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и их комплементы; д) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 12, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в любой из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, и их комплементы; е) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 19, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй - по - полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24, и их комплементы; ж) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй 5 полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24, и их комплементы; и з) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ 10 ID NO: 26, и их комплементы. 13. Пара полинуклеотидных праймеров по п. 5 или п. 6, где пара праймеров выбрана из группы пар праймеров, включающей: а) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена 15 в SEQ ID NO: 13, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена либо в SEQ ID NO: 11, либо в SEQ ID NO: 17, и комплементы; б) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 12, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй 20 полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена либо в SEQ ID NO: 21, либо в SEQ ID NO: 22, и их комплементы; в) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 19, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ 25 ID NO: 23, и их комплементы; и г) полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, в качестве первого полинуклеотидного праймера и второй полинуклеотидный праймер, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23, и их комплементы. 14. Способ выявления присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, которая является уникальной для варианта GM RZ13, в образце, содержащем нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, заключающийся в том, что: - Ill - а) приводят в контакт образец с парой праймеров, которые при их применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с ДНК из варианта сахарной свеклы GM RZ13 продуцируют ампликон, который является диагностическим для варианта сахарной свеклы GM RZ13; 5 б) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и в) выявляют ампликон. 15. Способ по п. 14, в котором на стадии а) способа применяют пару 10 праймеров по одному из п.п. 5-13. 16. Способ по п. 14 или п. 15, где способ представляет собой либо а) основанный на применении геля анализ, который включает стадии, на которых (I) приводят в контакт образец, содержащий нуклеиновые кислоты 15 сахарной свеклы, с парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 5 и 12, или парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 13 и 18; (II) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, получая тем самым ампликон; и (III) выявляют ампликон; либо 20 б) TaqMan -анализ, который включает стадии, на которых (I) приводят в контакт образец, содержащий нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, с парой праймеров, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 25 и 26, и TaqMan -зондом, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; (II) осуществляют реакцию амплификации нуклеиновой 25 кислоты, получая тем самым ампликон; и (III) выявляют повышение флуоресценции, испускаемой репортерным красителем, который отщеплен от зонда и отделен от гасителя красителя во время стадии амплификации (II). 17. Способ выявления присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, которая является уникальной для варианта GM RZ13, в образце, содержащем нуклеиновые кислоты сахарной свеклы, заключающийся в том, что: - 112 - а) приводят в контакт образец с зондом, гибридизующимся в строгих условиях с геномной ДНК из варианта GM RZ13 и не гибридизующимся в строгих условиях с ДНК из контрольного растения сахарной свеклы; б) подвергают образец и зонд гибридизации в строгих условиях и 5 (в) обнаруживают гибридизацию зонда с молекулой нуклеиновой кислоты. 18. Способ по одному из п.п. 14-17, в котором ампликон или зонд содержит нуклеотидную последовательность, выведенную из группы, которая включает SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ 10 ID NO: 9 и их комплементы. 19. Набор, предназначенный для обнаружения нуклеиновых кислот, уникальных для варианта GM RZ13, в биологическом образце, где набор включает по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую 15 смежные полинуклеотиды с длиной, достаточной для того, чтобы функционировать в качестве праймера или зонда в способе обнаружения нуклеиновой кислоты, и которые при амплификации или гибридизации с нуклеотидной последовательностью-мишенью в образце с последующим выявлением ампликона или гибридизации с последовательностью-мишенью, 20 являются диагностическими в отношении присутствия в образце нуклеотидных последовательностей, уникальных для варианта GM RZ13. 20. Набор по п. 19, в котором молекула нуклеиновой кислоты, содержащая смежные полинуклеотиды с длиной, достаточной для того, чтобы 25 функционировать в качестве праймера или зонда, выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID N0:7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID 30 NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и их комплементы. -113- 21. Трансгенное устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы или его клетки или ткани, которые все содержат молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1 или п. 2. 5 22. Трансгенное устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы по п. 21, где семя указанного растения депонировано в NCIMB под регистрационным № 41601. 23. Растение, полученное из трансгенного устойчивого к вирусу 10 некротического пожелтения жилок свеклы семени сахарной свеклы по п. 22. 24. Семя сахарной свеклы, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1 или п. 2. 15 25. Семя сахарной свеклы по п. 24, где семя депонировано в NCIMB под регистрационным № 41601. 26. Трансгенное устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы, полученное из семени по п. 24 или п. 25. 27. Биологический образец или экстракт, полученный из растения, ткани или семени сахарной свеклы варианта GM RZ13, где образец или экстракт содержит нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной нуклеотидной последовательности, выбранной из 25 группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и где последовательность можно выявлять в образце с помощью метода амплификации нуклеиновых кислот или гибридизации нуклеиновых кислот. 28. Способ получения растения сахарной свеклы, устойчивого по меньшей 30 мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, заключающийся в том, что а) осуществляют половое скрещивание первого родительского растения сахарной свеклы и второго родительского растения сахарной свеклы, где первое -114- или второе родительское растение сахарной свеклы содержит ДНК варианта GM RZ13, с получением множества растений поколения первой генерации; б) отбирают растение поколения первой генерации, которое обладает устойчивостью по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, в) дают самоопыляться растению поколения первой генерации, получая тем самым множество растений поколения второй генерации; г) отбирают из растений поколения второй генерации растение, которое обладает устойчивостью по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы; в котором растения поколения второй генерации содержат нуклеотидную последовательность, которая представляет собой или является комплементарной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7. 29. Способ по п. 28, в котором первое или второе родительское растение сахарной свеклы, содержащее ДНК варианта сахарной свеклы GM RZ1, применяемое на стадии а), представляет собой устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы по п.п. 21, 22 или 23, или растение, полученное из семян по п. 24 или 25. 30. Способ получения устойчивых к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридных семян сахарной свеклы, заключающийся в том, что: а) получают устойчивую к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы линию сахарной свеклы в качестве первой родительской линии; б) получают вторую линию сахарной свеклы с другим генотипом в качестве второй родительской линии; где одна из родительских линий, полученных на стадии а) или стадии б), представляет собой линию, обладающую ЦМС, и где другая родительская линия обладает мужской фертильностью, и в) дают растениям родительской линии, обладающей мужской фертильностью, опылять цветки родительской линии, обладающей мужской стерильностью, дают развиваться семенам и собирают гибридные семена, -115- где собранные гибридные семена представляют собой семена устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридного растения сахарной свеклы. 5 31. Способ получения устойчивых к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридных семян сахарной свеклы по п. 30, в котором обладающая ЦМС родительская линия сахарной свеклы, полученная на стадии а) или б), представляет собой инбредную линию сахарной свеклы, которая содержит нуклеотидную последовательность по п. 1 или п. 2. 32. Способ получения устойчивых к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы гибридных семян сахарной свеклы по п. 30 или п. 31, в котором вторую родительскую линию выбирают из группы, включающей а) инбредную линию растения сахарной свеклы, устойчивую по меньшей 15 мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которая имеет другой генотип, но содержит нуклеотидную последовательность по п. 1 или п. 2; б) инбредную линию растения сахарной свеклы, устойчивую или толерантную по меньшей мере к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, которая имеет происхождение из встречающегося в естественных 20 условиях источника, выбранного из группы, включающий Holly-источник, WB41, WB42, WB151, WB169, С28, С48, С50 или Rizor, или получена в результате их скрещивания; и в) инбредную линию растения сахарной свеклы, не обладающую устойчивостью или толерантностью к вирусу некротического пожелтения жилок 25 свеклы. 33. Гибридное семя сахарной свеклы, устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы. 34. Гибридное семя по п. 33, где семя получено с помощью способа по одному из п.п. 28-32. -116 - 35. Гибридное растение сахарной свеклы, устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы, выращенное из гибридного семени по п. 33 или п. 34. 5 36. Применение трансгенного устойчивого к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растения сахарной свеклы или его клеток или тканей по одному из п.п. 21-26, биологического образца или экстракта по п. 27 в способе, выбранном из группы, включающей способы получения сахара, способы аэробной ферментации и способы анаэробной ферментации. 37. Применение по п. 36, в котором трансгенное устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы или его клетки или ткани по одному из п.п. 21-26, биологический образец или экстракт по п. 27 используют в способе получения сахара. 38. Способ получения сахара или одного или нескольких видов биотоплива, выбранного из группы, включающей этанол, бутанол, биогазы и/или дизельное биотопливо, в котором трансгенное устойчивое к вирусу некротического пожелтения жилок свеклы растение сахарной свеклы или его клетки или ткани 20 по одному из п.п. 21-26, биологический образец или экстракт по п. 27 перерабатывают с получением сахара или одного или нескольких видов биотоплива. 1/3 oCOLE (807 пар оснований) oVSl (405 пар оснований) cRepA (1074 пары оснований) ') Spec (789 пар оснований) LB (25 пар оснований) t35S (193 пары оснований) PMI (1176 пар оснований) EcoRV (5786) RB (25 пар оснований) Pstt (265) tNOS (253 пары оснований) повтор rBNYVVl (428 пар оснований) спейсер BNYVV 1 (779 пар оснований) RZM (1613 пар оснований) повтор rBNYVVl (428 пар оснований) Щ xiUBQ3 (357 пар оснований) -\ EcoRV (2456) KcoRV (2801) W // prUBQ3-02 (1722 пары оснований) й/яН! С3992) prHSP80 (1560 пар оснований) Рз" (56If) Фиг. 1 (c) к н мРНК контроль 7ф, |4 ф| 21 dpi 28 dpi a d a b с i a b с a b с a b с BNYWRNA1 - тгансгенная мРНК -9Ш //ш ///л у//// <й$/ ////л ///// 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ^•-prruv BNYW7 I мл сока so 4- н 40 со Holly + С48 Hoiiy *
|