[**]

Предоставлены композиции и способы придания инсектицидной активности клеткам хозяина. Предоставлены композиции, включающие кодирующую последовательность полипептида дельта-эндотоксина. Кодирующие последовательности могут использоваться в конструкциях ДНК или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в клетках хозяина. Композиции также включают трансформированные клетки хозяина. В частности, предоставлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты дельта-эндотоксина. Дополнительно охвачены аминокислотные последовательности, соответствующие полинуклеотидам, и антитела, специфически связывающиеся с этими аминокислотными последовательностями. В частности, настоящее изобретение предоставляет выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, продемонстрированную в SEQ ID NO: 4, 5, 6, 13 или 14, или нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 11 или 12, а также их варианты и фрагменты.

(57) Реферат / Формула:

Предоставлены композиции и способы придания инсектицидной активности клеткам хозяина. Предоставлены композиции, включающие кодирующую последовательность полипептида дельта-эндотоксина. Кодирующие последовательности могут использоваться в конструкциях ДНК или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в клетках хозяина. Композиции также включают трансформированные клетки хозяина. В частности, предоставлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты дельта-эндотоксина. Дополнительно охвачены аминокислотные последовательности, соответствующие полинуклеотидам, и антитела, специфически связывающиеся с этими аминокислотными последовательностями. В частности, настоящее изобретение предоставляет выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, продемонстрированную в SEQ ID NO: 4, 5, 6, 13 или 14, или нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 11 или 12, а также их варианты и фрагменты.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201071323 (13) A1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки: 2011.06.30
(22) Дата подачи заявки: 2009.07.02
(51) Int. Cl. C07K14/325 (2006.01) C12N15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01)
(54) AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163, AXMI-184 ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 61/077,812; 61/158,953
(32) 2008.07.02; 2009.03.10
(33) US
(86) PCT/US2009/049527
(87) WO 2010/003065 2010.01.07
(88) 2010.05.20
(71) Заявитель:
АТЕНИКС КОРПОРЕЙШН (US)
(72) Изобретатель:
Сэмпсон Кимберли С., Агарвал Шрути, Кэмпбелл Крис, МакНалти Брайан, Томсо Дэниел Дж., Кароцци Надин, Харджисс Трейси, Козил Майкл Г., Дак Николас Б., Хайнрихс Фолькер (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Предоставлены композиции и способы придания инсектицидной активности клеткам хозяина. Предоставлены композиции, включающие кодирующую последовательность полипептида дельта-эндотоксина. Кодирующие последовательности могут использоваться в конструкциях ДНК или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в клетках хозяина. Композиции также включают трансформированные клетки хозяина. В частности, предоставлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты дельта-эндотоксина. Дополнительно охвачены аминокислотные последовательности, соответствующие полинуклеотидам, и антитела, специфически связывающиеся с этими аминокислотными последовательностями. В частности, настоящее изобретение предоставляет выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, продемонстрированную в SEQ ID NO: 4, 5, 6, 13 или 14, или нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 11 или 12, а также их варианты и фрагменты.
2420-173234ЕА/016 AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 И AXMI-184: ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к области молекулярной биологии. Предоставлены новые гены, которые кодируют инсектицидные белки. Эти белки и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, пригодны при подготовке инсектицидных составов и при получении трансгенных, устойчивых к поражению насекомыми-вредителями растений.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Bacillus thuringiensis представляет собой
грамположительную спорогенную почвенную бактерию,
характеризующуюся способностью продуцировать кристаллические включения, которые особенно токсичны для определенных родов и видов насекомых, но безопасны для растений и других не являющихся целевыми организмов. По этой причине композиции, включающие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, могут использоваться в качестве экологически приемлемых инсектицидов для осуществления контроля за
сельскохозяйственными насекомыми-вредителями или векторами насекомых при множестве болезней животных или человека.
Кристаллические (Cry) белки (дельта-эндотоксины) Bacillus thuringiensis обладают потенциальной инсектицидной активностью, главным образом, по отношению к чешуекрылым, двукрылым и личинкам жесткокрылых. Также показано, что эти белки обладают активностью против насекомых-вредителей из отрядов Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и Acari, так же как и других родов беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). Эти белки были первоначально классифицированы как белки от Cryl до CryV на основании, прежде всего, их инсектицидной активности. Основные классы представляли собой Lepidoptera-специфический
(I), Lepidoptera- и Diptera-специфический (II), Coleoptera-специфический (III), Diptera-специфический (IV) и
нематодоспецифические (V) и (VI). Белки были в дальнейшем классифицированы в подсемейства; более высокородственным белкам в пределах каждого семейства были присвоены подразделяющие символы, такие как CrylA, CrylB, CrylC и т.д. Еще более близкородственным белкам в пределах каждого подразделения были присвоены названия, такие как CrylCl, CrylC2 и т.д.
Недавно была описана новая система условных обозначений для генов Cry, основанная на гомологии аминокислотных последовательностей, а не специфичности нацеленности на насекомое (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В новой классификации каждому токсину присвоено уникальное название, включающее первичный разряд (арабское число), вторичный разряд (прописная буква), третичный разряд (строчная буква) и четвертичный разряд (другое арабское число). В новой классификации римские цифры в первичном разряде были заменены на арабские цифры. Белки с менее чем 45%-ой идентичностью последовательности обладают различными первичными разрядами, а критерием для вторичных и третичных разрядов являются 78% и 95%, соответственно.
Кристаллический белок не проявляет инсектицидную активность до тех пор, пока не заглатывается и не становится растворимым в средней кишке насекомого. Проглоченный протоксин гидролизируется протеазами в пищеварительный трактате насекомого до активной токсичной молекулы (Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Этот токсин связывается с апикальными рецепторами щеточной каймы в средней кишке личинок-мишеней и встраивается в апикальную мембрану, создавая ионные каналы или поры, что приводит к гибели личинок.
Как правило, дельта-эндотоксины имеют пять консервативных доменов последовательностей и три консервативных структурных домена (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и вовлечен в мембранное встраивание и формирование поры. Домен II состоит из трех бета-листов,
образующих конфигурацию "греческого ключа", а домен III состоит из двух антипараллельных бета-листов в форме "рулета с джемом" (de Maagd et al., 2001, выше) . Домены II и III вовлечены в распознавание рецепторов и связывание, и поэтому считаются детерминантами токсинной специфичности.
Кроме дельта-эндотоксинов существует несколько других известных классов пестицидных белковых токсинов. Токсины VIP1/VIP2 (см., например, патент США 5770696) являются бинарными пестицидными токсинами, которые оказывают сильное воздействие на насекомых на основе механизма, который, как полагают, включает рецептор-обусловленный эндоцитоз,
сопровождаемый клеточной токсификацией, подобно способу действия других бинарных ("А/В") токсинов. Токсины А/В, такие как VIP, С2, CDT, CST или токсины В. anthracis, вызывающие отек и гибель, первоначально взаимодействуют с клетками-мишенями посредством специфического, рецептор-опосредованного связывания "В"-компонентов в виде мономеров. Эти мономеры затем образуют гомогептамеры. Комплекс гептамер "В"-рецептор затем действует в качестве причальной платформы, которая впоследствии связывает и обеспечивает транслокацию ферментативного "А"-компонента(ов) в цитозоль посредством рецептор-обусловленного эндоцитоза. Оказавшись в цитозоле клетки, "А"-компоненты ингибируют нормальную функцию клетки путем, например, АДФ-рибозилирования G-актина или увеличения внутриклеточных уровней циклического АМФ (цАМФ) . См. Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402.
Интенсивное использование инсектицидов на основе В. thuringiensis уже дало увеличение устойчивости к полевым популяциям капустной моли, Plutella xylostella (Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Наиболее общим механизмом устойчивости является уменьшение связывания токсина с его специфическим рецептором(ами) средней кишки. Кроме того, это может приводить к перекрестной устойчивости к другим токсинам, которые также используют тот же самый рецептор (Ferre and Van Rie (2002) ) .
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предоставлены композиции и способы для придания бактериям, растениям, клеткам растений, тканям и семенам устойчивости к насекомым. Композиции включают молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности полипептидов дельта-эндотоксина, векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки хозяев, содержащие векторы. Композиции также включают последовательности полипептида эндотоксина и антитела к этим полипептидам. Последовательности нуклеотидов могут
использоваться в конструкциях ДНК или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в организмах, включая микроорганизмы и растения. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут представлять собой синтетические последовательности, которые спланированы для экспрессии в организме, включая, но не ограничиваясь ими, микроорганизм или растение. Композиции также включают трансформированные бактерии, растения, клетки растений, ткани и семена.
В частности, предоставлены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие последовательностям нуклеиновых кислот дельта-эндотоксина. Дополнительно охвачены последовательности аминокислот, соответствующие полинуклеотидам. В частности, настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную
последовательность, кодирующую аминокислотную
последовательность, продемонстрированную в любой из SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14, или нуклеотидную последовательность, представленную в любой из SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12, а также их варианты и фрагменты. Также охвачены нуклеотидные последовательности, которые комплементарны нуклеотидной последовательности по изобретению, или нуклеотидные последовательности, гибридизующиеся с последовательностью по изобретению.
Композиции и способы по изобретению пригодны для получения организмов с инсектицидной устойчивостью, в особенности бактерий и растений. Такие организмы и композиции, полученные из них, являются желательными для сельскохозяйственных целей.
Композиции по изобретения также полезны для создания измененных или улучшенных белков дельта-эндотоксина, которые обладают инсектицидной активностью, или для детектирования присутствия белков или нуклеиновых кислот дельта-эндотоксина в продуктах или организмах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1А и 1В демонстрируют сравнительный анализ первичных структур AXMI-113 (SEQ ID N0:5), AXMI-005 (SEQ ID N0:4) и AXMI-115 (SEQ ID N0:6). Левые и правые стрелки отмечают границы области С-концевой трети белков.
Фиг.2 показывает домены в пределах AXMI-005 и AXMI-115, которые заменены для образования новых токсинов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам регулирования устойчивости к насекомым у организмов, особенно растений или клеток растений. Способы включают трансформацию организмов нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок дельта-эндотоксина по изобретению. В частности, нуклеотидные последовательности по изобретению пригодны для подготовки растений и микроорганизмов, которые обладают инсектицидной активностью. Таким образом, предоставлены трансформированные бактерии, растения, клетки растений, растительные ткани и семена. Композиции представляют собой нуклеиновые кислоты и белки дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis.
Последовательности находят применение при конструировании экспрессионных векторов для последующей трансформации в представляющие интерес организмы, в качестве зондов для выделения других генов дельта-эндотоксина и для создания измененных инсектицидных белков при помощи способов, известных в данной области, таких как перестановка доменов или перетасовка ДНК. См., например, Таблицу 2 и Фиг.2. Белки находят применение при контролировании или уничтожении чешуекрылых, жесткокрылых и других популяций насекомых, и для получения композиций с инсектицидной активностью.
Под "дельта-эндотоксином" подразумевают токсин Bacillus thuringiensis, который обладает токсической активностью в
отношении одного или более вредителей, включая, но не ограничиваясь ими, представителей отрядов Lepidoptera, Diptera и Coleoptera, или белок, который обладает гомологией с таким белком. В некоторых случаях белки дельта-эндотоксина были выделены из других организмов, включая Clostridium bifermentans и Paenibacillus popilliae. Белки дельта-эндотоксина включают аминокислотные последовательности, выведенных на основании полноразмерных нуклеотидных последовательностей, раскрытых здесь, и аминокислотные последовательности, которые короче, чем полноразмерные последовательности, либо вследствие
использования альтернативного нижерасположенного сайта инициации, либо вследствие процессинга, который приводит к образованию более короткого белка, имеющего инсектицидную активность. Процессинг может происходить в организме, в котором белок экспрессируется, или в насекомом-вредителе после заглатывания белка внутрь.
Дельта-эндотоксины включают белки, идентифицируемые как белки с cryl по cry43, cytl и cyt2, и Cyt-подобный токсин. В настоящее время существует более чем 250 известных разновидностей дельта-эндотоксинов с широким диапазоном специфичностей и токсичностей. В качестве расширенного перечня см. Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807813, и для регулярных обновлений см. Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," на сайте www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.
Здесь предоставлены новые выделенные нуклеотидные последовательности, которые наделены инсектицидной активностью. Также предоставлены аминокислотные последовательности белков дельта-эндотоксина. Белок, образуемый в результате трансляции этого гена, позволяет клеткам контролировать или уничтожать насекомых, которые его заглатывают.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот и их варианты и фрагменты
Один аспект изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, включающим нуклеотидные последовательности, кодирующие белки дельта
эндотоксина и полипептиды или их биологически активные участки, а также молекулы нуклеиновых кислот, достаточные для использования в качестве гибридизационных зондов для идентификации кодирующих дельта-эндотоксин нуклеиновых кислот. Как используется здесь, термин "молекула нуклеиновой кислоты" предназначен для включения молекул ДНК (например, рекомбинантной ДНК, кДНК или геномной ДНК) и молекул РНК (например, мРНК) и аналогов ДНК или РНК, полученных с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может являться одноцепочечной или двухцепочечной, однако предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.
"Выделенная" или "очищенная" молекула нуклеиновой кислоты или белок, или их биологически активная часть, в существенной степени свободна от другого клеточного материала или культуральной среды в случае, когда продуцируется рекомбинантными способами, или в существенной степени свободна от химических предшественников или других химических веществ в случае, когда синтезируется химически. Предпочтительно, "выделенная" нуклеиновая кислота свободна от
последовательностей (предпочтительно кодирующих белок
последовательностей), которые естественным образом фланкируют нуклеиновую кислоту (то есть, последовательности, расположенные на 5' - и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. В целях изобретения "выделенный" при использовании в отношении молекул нуклеиновых кислот не относится к выделенным хромосомам. Например, в различных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дельта-эндотоксин, может содержать менее чем приблизительно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые естественным образом фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота. Белок дельта-эндотоксин, который существенно свободен от клеточного материала, включает препараты белка, содержащие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, или 5% (по сухой массе) белка,
"отличного от дельта-эндотоксина" (также упоминаемый здесь как "контаминантный белок").
Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки по настоящему изобретению, включают последовательность,
приведенную в SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12, и ее вариантах, фрагментах, и их комплементы. Под "комплементом" подразумевают нуклеотидную последовательность, которая в существенной степени комплементарна данной нуклеотидной последовательности, так что она может гибридизоваться с данной нуклеотидной последовательностью с образованием вследствие этого стабильного дуплекса. Соответствующая аминокислотная последовательность белка дельта-эндотоксина, кодируемая этой нуклеотидной последовательностью, приведена в SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые являются фрагментами этих нуклеотидных последовательностей, кодирующих дельта-эндотоксин, также охвачены настоящим изобретением. Под "фрагментом" подразумевается часть нуклеотидной
последовательности, кодирующей белок дельта-эндотоксина. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активную часть белка дельта-эндотоксина, или это может быть фрагмент, который может использоваться в качестве зонда для гибридизации или ПЦР-праймера с использованием раскрытых ниже способов. Молекулы нуклеиновых кислот, которые являются фрагментами нуклеотидной последовательности дельта-эндотоксина, включают, по меньшей мере, приблизительно 50, 100,
200,
300, 400, 500,
600,
700, 8
Ю0, 900, 1000,
1050,
1100,
1150,
1200,
1250,
1300,
1350,
1400,
1450, 1500,
1550,
1600,
1650,
1700,
1750,
1800,
1850,
1900,
1950, 2000,
2050,
2100,
2150,
2200,
2250,
2300,
2350,
2400,
2450, 2500,
2550,
2600,
2650,
2700,
2750,
2800,
2850,
2900,
2950, 3000,
3050,
3100,
3150,
3200, 3250, 3300, 3350 смежных нуклеотидов, или вплоть до числа нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей дельта-эндотоксин, раскрытой здесь в зависимости от намеченного использования. Под "смежными" нуклеотидами подразумевают нуклеотидные остатки, которые непосредственно примыкают друг к другу. Фрагменты
нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению должны кодировать фрагменты белка, которые сохраняют биологическую активность белка дельта-эндотоксина и, следовательно, сохраняют инсектицидную активность. Под выражением "сохраняет активность" подразумевается, что фрагмент обладает, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 50%, по меньшей мере, приблизительно 70%, 80%, 90%, 95% или более инсектицидной активности белка дельта-эндотоксина. Способы определения инсектицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и Патент США № 5743477, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Фрагмент кодирующей дельта-эндотоксин нуклеотидной последовательности, которая кодирует биологически активную часть белка по изобретению, кодирует, по меньшей мере, приблизительно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 смежных аминокислот, или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке дельта-эндотоксина по изобретению.
Предпочтительные белки дельта-эндотоксина по настоящему изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью, достаточно идентичной нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12. Под "достаточно идентичной" подразумевается аминокислотная или нуклеотидная
последовательность, которая обладает, по меньшей мере, приблизительно 60%-ной или 65%-ной идентичностью
последовательности, приблизительно 70%-ной или 75%-ной идентичностью последовательности, приблизительно 80%-ной или 85%-ной идентичностью последовательности, приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%-ной или более идентичностью последовательности по сравнению с
последовательностью сравнения, с использованием одной из программ сравнительного анализа, описанных здесь при помощи
стандартных параметров. Любому специалисту в данной области понятно, что эти значения можно определенным образом скорректировать, чтобы выявить соответствующую идентичность белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, принимая во внимание вырожденность кодонов, сходство аминокислот, положение рамки считывания и т.п.
Для определения процентной идентичности двух
аминокислотных последовательностей или.двух последовательностей нуклеиновых кислот последовательности накладывают в целях оптимального сравнения. Процентная идентичность между этими двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, разделенных последовательностями (то есть, процент идентичности = число идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающиеся положения) х 100). В одном варианте осуществления эти две последовательности представляют собой последовательности одной и той же длины. В другом варианте осуществления сравнение проводится с последовательностью сравнения во всей ее полноте (например, во всей полноте таковой из SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12, или во всей полноте таковой из SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14) . Процент идентичности между двумя последовательностями можно определить, используя методики, подобные нижеописанным, с допущением пропусков или без допущения пропусков. При расчете процента идентичности, как правило, учитываются точные совпадения.
Определение процента идентичности между двумя последовательностями можно достичь, используя математический алгоритм. Неограничивающий пример математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, представляет собой алгоритм Karlin and Altschul (1990,) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифицированный Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTX от Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Нуклеотидные поиски BLAST можно выполнять при помощи программы BLASTN, при счете = 100, длине слов = 12, для выявления нуклеотидных последовательностей,
гомологичных дельта-эндотоксин-подобным молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Белковые поиски BLAST можно выполнять при помощи программы BLASTX, при счете = 50, длине слов = 3, чтобы получить последовательности аминокислот, гомологичные молекулам белка дельта-эндотоксина по изобретению. Для получения выравнивания с пропусками в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2,0), как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, для проведения повторного поиска, который обнаруживает отдаленные взаимоотношения между молекулами, можно использовать PSI-Blast. См. Altschul et al. (1997) выше. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание также можно выполнять вручную с контролем.
Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW сравнивает последовательности и выравнивает аминокислоты или последовательности ДНК во всей полноте, и таким образом может предоставить данные о консерватизме последовательности всей аминокислотной
последовательности. Алгоритм ClustalW используется в нескольких коммерчески доступных пакетах программ для анализа ДНК/аминокислот, таких как модуль ALIGNX набора программ Vector NTI (Корпорация Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). После выравнивания аминокислотных последовательностей при помощи ClustalW можно оценить процент аминокислотной идентичности. Неограничивающий пример программы, полезной для анализа выравниваний ClustalW, представляет собой GENEDOC(tm). GENEDOC(tm)
(Karl Nicholas) позволяет оценивать сходство аминокислот (или ДНК) и идентичность многих белков. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм содержится в программе ALIGN
(версия 2.0), которая является частью пакета программ GCG Wisconsin Genetics, Версия 10 (доступный от корпорации
Accelrys, 9685 Scranton Rd., Сан-Диего, Калифорния, США) . В случае использования программы ALIGN для сравнения последовательности аминокислот можно применять таблицу веса остатка РАМ 120, штраф длины пропуска 12 и штраф пропуска 4.
Если не заявлено иначе, при определении идентичности или сходства последовательностей будет применяться версия 10 GAP, в которой применяется алгоритм Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 (3) : 443-453, с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием GAP Weight 50 и Length Weight 3, и матрицы подсчета nwsgapdna.cmp; % идентичности или % сходства для последовательности аминокислот с использованием GAP Weight 8 и Length Weight 2, и программы подсчета BLOSUM62. Также можно использовать эквивалентные программы. Под "эквивалентной программой" подразумевается любая программа для сравнения последовательностей, которая для любых двух рассматриваемых последовательностей производит выравнивание, имеющее пары идентичных нуклеотидных остатков и сходный процент идентичности последовательностей, по сравнению с
соответствующим выравниванием, произведенным версией 10 GAP. Изобретение также охватывает вариантные молекулы нуклеиновых кислот. "Варианты" нуклеотидных последовательностей, кодирующих дельта-эндотоксин, включают те последовательности, которые кодируют белки дельта-эндотоксина, раскрытые здесь, но которые умеренно отличаются из-за вырожденности генетического кода, а также те, которые являются достаточно идентичными, как обсуждено выше. Встречающиеся в природе аллельные варианты можно идентифицировать с использованием известных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методики гибридизации, как обрисовано в общих чертах ниже. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, которые были образованы, например, с использованием сайт-направленного мутагенеза, но которые все еще кодируют белки дельта-эндотоксина, раскрытые в настоящем изобретении, как обсуждено ниже. Вариантные белки, охваченные настоящим
изобретением, являются биологически активными, то есть они продолжают обладать желательной биологической активностью нативного белка, то есть, сохраняют инсектицидную активность. Под "сохраняет активность" подразумевается, что вариант должен обладать, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 50%, по меньшей мере, приблизительно 70% или, по меньшей мере, приблизительно 80% инсектицидной активностью нативного белка. Способы определения инсектицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США 5743477, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Любой специалист в данной области может оценить, что изменения могут быть внесены путем введения мутаций в нуклеотидные последовательности по изобретению, приводя тем самым к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых белков дельта-эндотоксина, без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные выделенные молекулы нуклеиновой кислоты можно создать путем введения одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, раскрытую здесь, так, что одна или более аминокислотных замен, вставок или делеций вводится в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными методами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также охвачены настоящим изобретением.
Например, консервативные аминокислотные замены можно проводить для одного или более предполагаемых, несущественных аминокислотных остатков. "Несущественный" аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен в последовательности белка дельта-эндотоксина дикого типа без изменения биологической активности, тогда как "существенный" аминокислотный остаток требуется для биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой такую
замену, при которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области были определены группы аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи. Эти группы включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями
(например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями
(например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В большинстве случаев дельта-эндотоксины содержат пять доменов консервативных последовательностей и три консервативных структурных домена (см., например, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи альфа-спиралей и принимает участие в интеграции в мембрану и формирование поры. Домен II состоит из трех бета-листов, устроенных в конфигурации греческого ключа, а домен III состоит из двух антипараллельных бета-листов в виде "рулета с джемом" (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III вовлечены в узнавание рецептора и связывание и поэтому считаются детерминантами токсинной специфичности.
Замены аминокислот могут быть сделаны в неконсервативных областях, которые сохраняют функцию. Вообще, такие замены не следует проводить для консервативных аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, расположенных в пределах консервативного мотива, где такие остатки являются существенными для активности белка. Примеры остатков, которые являются консервативными и которые могут быть существенными для активности белка, включают, например, остатки, которые идентичны у всех белков при выравнивании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению и известных последовательностей дельта-эндотоксина. Примеры остатков, которые являются консервативными, но которые могут допускать
замены консервативных аминокислот и все еще сохранять активность, включают, например, остатки, у которых есть только консервативные замены среди всех белков, содержавшихся в выравнивании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению и известных последовательностей дельта-эндотоксина. Тем не менее, любому специалисту в данной области должно быть понятно, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.
Альтернативно можно получать вариантные нуклеотидные последовательности путем введения случайным образом мутаций по всей длине кодирующей последовательности или ее части, такой как насыщающий мутагенез, и полученные мутанты можно скринировать на способность придавать активность дельта-эндотоксина, чтобы идентифицировать мутанты, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок можно экспрессировать рекомбинантным образом, и активность белка можно определить с использованием стандартных методов проверки.
С использованием способов, таких как ПЦР, гибридизация и т.п., можно идентифицировать соответствующие последовательности дельта-эндотоксина, последовательности, имеющие существенную идентичность с последовательностями по изобретению. См., например, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) и Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).
В способе гибридизации можно использовать всю последовательность дельта-эндотоксина или ее часть для скрининга кДНК-овых или геномных библиотек. Способы конструирования таких кДНК-овых и геномных библиотек являются общеизвестными в данной области и раскрыты выше в Sambrook and Russell, 2001. Так называемые гибридизационные зонды могут представлять собой геномные фрагменты ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и могут быть мечены детектируемой группой, такой как 32Р, или любым другим детектируемым маркером, таким как другие радиоизотопы,
флуоресцентные соединения, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены путем мечения синтетических олигонуклеотидов на основе известной кодирующей дельта-эндотоксин нуклеотидной последовательности, раскрытой здесь. Дополнительно можно использовать вырожденные праймеры, спроектированные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в нуклеотидную последовательность или кодируемую аминокислотную последовательность. Как правило, зонды включают область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется при жестких условиях с, по меньшей мере, приблизительно 12, по меньшей мере, приблизительно 25, по меньшей мере, приблизительно 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, или 400 последовательными нуклеотидами кодирующей дельта-эндотоксин нуклеотидной последовательности по изобретению или ее фрагмента или варианта. Способы получения зондов для гибридизации являются общеизвестными в данной обасти и раскрыты выше в Sambrook and Russell, 2001, включенной здесь в качестве ссылки.
Например, полная последовательность дельта-эндотоксина, раскрытая здесь, или одна или более ее частей, может использоваться в качестве зонда, обладающего способностью специфически гибридизоваться с соответствующими дельта-эндотоксин-подобными последовательностями и информационными РНК. Для достижения специфической гибридизации при множестве условий такие зонды включают последовательности, которые уникальны и представляют собой предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 10 нуклеотидов в длину, или, по меньшей мере, приблизительно 20 нуклеотидов в длину. Такие зонды можно использовать для амплификации соответствующих
последовательностей дельта-эндотоксина из выбранного организма путем ПЦР. Эту методику можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Способы гибридизации включают гибридизационное скринирование высеянных на чашки библиотек ДНК (или бляшки, или
колонии; см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Гибридизацию таких последовательностей можно проводить при жестких условиях. Под "жесткими условиями" или "жесткими условиями гибридизации" подразумеваются условия, при которых зонд должен гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью в детектируемо большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере, с 2-кратным превышением фона). Жесткие условия зависят от
последовательности и должны различаться в зависимости от обстоятельств. Контролируя жесткость гибридизации и/или условия отмывки, можно идентифицировать последовательности-мишени, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно, можно адаптировать жесткость условий для допущения некоторого несоответствия в последовательностях для того, чтобы детектировать более низкие степени сходства (гетерологичное зондирование). Как правило, зонд составляет менее чем приблизительно 1000 нуклеотидов в длину, предпочтительно, менее чем 500 нуклеотидов в длину.
Как правило, жесткие условия должны представлять собой условия, при которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,5 М ионов Na, типично, приблизительно от 0,01 до 1 М концентрации ионов Na (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3 и температуре, по меньшей мере, около 30°С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, около 60°С для длинных зондов (например, больше, чем 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих веществ, таких как формамид. Типичные условия с низкой жесткостью включают гибридизацию в буферном растворе с 30-35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (натрий додецилсульфат) при 37°С, и промывку в 1Х-2Х SSC (20Х SSC =3,0 NaCl/0,3 М тринатриевая соль лимонной кислоты) при температуре от 50 до 55°С. Типичные умеренно жесткие условия включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С, и промывку в 0,5Х-1Х SSC при температуре от 55 до 60°С. Типичные
условия с высокой жесткостью включают гибридизацию в 50% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37 °С, и промывку в 0,1Х SSC при б0-б5°С. Необязательно, отмывочные буферы могут включать от около 0,1% до около 1% SDS. Продолжительность гибридизации, как правило, составляет менее чем приблизительно 24 часа, обычно от около 4 до около 12 часов.
Специфичность, как правило, является функцией
послегибридизационных отмывок, критических факторов,
представляющих собой ионную силу и температуру конечного промывочного раствора. Для гибридов ДНК-ДНК Тга может быть аппроксимировано из уравнения Meinkoth и Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5°С+16,6(log M)+0,41(%GC)-0,61(% форм)-500/L; где M представляет собой молярность одновалентных катионов, %GC представляет собой процент гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм представляет собой процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. Тт представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН) , при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с идеально подобранным зондом. Тт уменьшается примерно на 1°С на каждый 1% несоответствия; таким образом, Тт гибридизации и/или условия отмывки можно адаптировать для гибридизации к последовательностям желательной идентичности. Например, если происходит поиск последовательностей с ^ 90%-ой идентичностью, Тт может быть уменьшена на 10°С. Как правило, жесткие условия подбирают на примерно 5°С ниже, чем тепловая точка плавления (Тт) для определенной последовательности и комплементарной ей при определенной ионной силе и рН. При этом очень жесткие условия можно использовать при гибридизации и/или промывке на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем тепловая точка плавления (Тт); умеренно жесткие условия можно использовать при гибридизации и/или промывке на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем тепловая точка плавления (Тга) ; нежесткие условия можно использовать при гибридизации и/или промывке на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем тепловая точка плавления (Тт) . С использованием уравнения, композиций гибридизации и отмывки и
желательной Tm, любой специалист в данной области поймет, что изменения в жесткости гибридизации и/или растворов для отмывки являются неотъемлемыми при описании. Если желательная степень несоответствия приводит к Тт меньше, чем 45°С (водный раствор) или 32 °С (раствор формамида), предпочтительно увеличить концентрацию SSC так, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Обширный справочник по . гибридизации нуклеиновых кислот обнаруживается в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); и Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). См. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Выделенные белки и их варианты и фрагменты
Белки дельта-эндотоксина также охвачены в пределах настоящего изобретения. Под "белком дельта-эндотоксина" подразумевают белок, обладающий аминокислотной
последовательностью, приведенной в SEQ ID N0:4 SEQ, 5, 6, 13 или 14. Также предоставлены его фрагменты, биологически активные части и варианты, и их можно использоваться при практиковании способов по настоящему изобретению.
"Фрагменты" или "биологически активные части" включают фрагменты полипептида, содержащие последовательности
аминокислот, достаточно идентичные последовательности
аминокислот, приведенной в любой из SEQ ID N0:4 SEQ, 5, б, 13, или 14, и проявляющие инсектицидную активность. Биологически активная часть белка дельта-эндотоксина может представлять собой полипептид, то есть, например, 10, 25, 50, 100 или больше аминокислот в длину. Такие биологически активные части можно подготовить при помощи рекомбинантных методик и оценить по инсектицидной активности. Способы определения инсектицидной активности известны в данной области. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of
Economic Entomology 78:290-293; и Патент США № 5743477, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Как используется здесь, фрагмент включает, по меньшей мере, 8 смежных аминокислот SEQ ID N0:4 SEQ, 5, 6, 13 или 14. Изобретение охватывает другие фрагменты, однако такие, как любой фрагмент в белке, больший, чем приблизительно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, или 1300 аминокислот.
Под "вариантами" подразумевают белки или полипептиды, обладающие аминокислотной последовательностью, которая идентична, по меньшей мере, приблизительно на 60%, 65%, приблизительно на 70%, 75%, приблизительно на 80%, 85%, приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности аминокислот любой из SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14. Варианты также включают полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты с SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12, или ее комплементами, при жестких условиях. Варианты включают полипептиды, которые отличаются по аминокислотной
последовательности вследствие мутагенеза. Различные белки, охваченные настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть, они продолжают обладать желательной биологической активностью нативного белка, то есть, сохраняют инсектицидную активность. Способы определения инсектицидной активности известны в данной области. См., например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и Патент США № 5743477, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Бактериальные гены, такие как гены axmi по этому изобретению, весьма часто обладают несколькими инициирующими кодонами метионина вблизи от начала открытой рамки считывания. Часто инициирование трансляции на одном или более из этих кодонов приводит к образованию функционального белка. Эти инициирующие кодоны могут включать кодоны ATG. Однако бактерии,
такие как Bacillus sp., также распознают кодон GTG в качестве инициирующего кодона, и белки, которые инициируют трансляцию на кодонах GTG, первой аминокислотой, содержат метионин. Кроме того, a priori не часто определяется, какие из этих кодонов природно используются в бактерии. Таким образом, подразумевается, что использование одного из дополнительных кодонов метионина может также приводить к образованию белков дельта-эндотоксина, которые кодируют инсектицидную активность. Эти белки дельта-эндотоксина охватываются настоящим изобретением и могут использоваться в способах по настоящему изобретению.
Также охватываются антитела к полипептидам по настоящему изобретению или к их вариантам или фрагментам. Способы продуцирования антител известны в данной области (см., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory-Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; U.S. Patent No. 4,196,265).
Измененные или улучшенные варианты
Общепризнанно, что последовательности ДНК дельта-эндотоксина могут быть изменены различными способами, и что эти изменения могут привести к последовательностям ДНК, кодирующим белки с аминокислотными последовательностями, отличными от последовательностей, кодируемых дельта-эндотоксином по настоящему изобретению. Этот белок может быть изменен различными способами, включая аминокислотные замены, делеций, укорочения и вставки одной или более аминокислот SEQ ID N0:4
SEQ, 5, 6, 13
или
14, включая вплоть
до приблизительно 2,
приблизительно
приблизительно
приблизительно
приблизительно
приблизительно
приблизительно
приблизитель но
приблизительно
приблизительно
15,
приблизительно
20,
приблизительно
25,
приблизительно
30,
приблизительно
35,
приблизительно
40,
приблизительно
45,
приблизительно
50,
приблизительно
55,
приблизительно
60,
приблизительно
65,
приблизительно
70,
приблизительно
75,
приблизительно
80,
приблизительно
85,
приблизительно
90,
приблизитель но
100,
приблизительно
105,
приблизительно
110,
приблизительно 115, приблизительно 120, приблизительно 125, приблизительно 130 или больше аминокислотных замен, делеций или вставок.
Способы таких манипуляций являются общеизвестными в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности белка дельта-эндотоксина можно получить путем мутаций в ДНК. Это также может выполнить путем одного из нескольких видов мутагенеза и/или направленного изменения. В некоторых аспектах изменения, кодируемые в аминокислотной последовательности, не будут существенно затрагивать функцию белка. Такие варианты будут обладать желательной инсектицидной активностью. Однако подразумевается, что способность дельта-эндотоксина обладать инсектицидной активностью может быть улучшена при помощи таких методик, исходя из композиций по данному изобретению. Например, можно экспрессировать дельта-эндотоксин в клетках хозяина, которые проявляют высокие уровни неправильного включения оснований во время репликации ДНК, таких как XL-1 Red (Stratagene). После наращивания таких штаммов можно выделить ДНК дельта-эндотоксина (например, путем подготовки плазмидной ДНК, или путем амплификации при помощи ПЦР и путем клонирования образующегося ПЦР-фрагмента в вектор), размножить мутации дельта-эндотоксина в немутагенном штамме и идентифицировать мутантные гены дельта-эндотоксина с инсектицидной активностью, например, путем проведения анализа по проверке инсектицидной активности. Обычно белок подмешивают и используют в испытаниях по кормлению. См., например Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие испытания могут включать приведение растений в контакт с одним или более насекомыми и определение способности растений приводить к выживанию и/или вызывать гибель насекомых. Примеры мутаций, которые приводят к увеличенной токсичности, встречаются в Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.
Альтернативно, можно провести изменения белковой последовательности многих белков на амино- или карбокси-конце без существенного влияния на активность. Это может включать вставки, делеций или изменения, введенные современными
молекулярными способами, такими как ГИДР, включая ПЦР-амплификации, которые изменяют или удлиняют кодирующую последовательность белка за счет включения кодирующих аминокислотных последовательностей в олигонуклеотиды, используемые при ПЦР-амплификации. Альтернативно, добавленные последовательности белка могут включать полные кодирующие белок последовательности, такие как используемые обычно в данной области для образования слитых белков. Такие слитые белки часто используются для (1) увеличения экспрессии представляющего интерес белка, (2) введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для облегчения либо очистки белка, обнаружения белка, либо другого экспериментального использования, известного в данной области, (3) направленной секреции или трансляции белка во внутриклеточную органеллу, такую как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий или эндоплпазматический ретикулум эукариотических клеток, в последней из которых часто происходит гликозилирование белка.
Выриантные нуклеотидные и аминокислотные
последовательности по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные в результате мутагенных и рекомбинантных процедур, таких как перетасовка ДНК. При такой процедуре можно использовать один или более различных кодирующих области белков дельта-эндотоксина для создания нового белка дельта-эндотоксина, обладающего желательными свойствами. Таким способом получают библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, включающих области последовательностей, которые имеют существенную идентичность последовательности и могут гомологично рекомбинировать in vitro или in vivo. Например, используя этот подход, мотивы последовательности, кодирующие представляющий интерес домен, могут быть перетасованы между геном дельта-эндотоксина по изобретению и другими известными генами дельта-эндотоксина, чтобы получить новый ген, кодирующий белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как увеличенная инсектицидная активность.
Стратегии для такой перетасовки ДНК известны в данной области. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 .-288-291; и патенты США №№ 5605793 и 5837458.
Обмен или перестановка доменов представляет другой механизм образования измененных белков дельта-эндотоксина. Домены II и III могут быть обменяны между белками дельта-эндотоксина, что приводит к гибридным или химерным токсинам с улучшенной инсектицидной активностью или спектром мишеней. Способы образования рекомбинантных белков и проверки их на инсектицидную активность известны в данной области (см., например, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990; J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).
Векторы
Последовательность дельта-эндотоксина по изобретению может быть предоставлена в экспрессионной кассете для экспрессии в представляющем интерес растении. Под "экспрессионной кассетой растения" подразумевают конструкцию ДНК, которая способна приводить к экспрессии белка с открытой рамки считывания в клетке растения. В основном они содержат промотор и кодирующую последовательность. Часто такие конструкции также содержат 3'-нетраслируемые области. Такие конструкции могут содержать "сигнальную последовательность" или "лидерную
последовательность", чтобы способствовать котрансляционному или посттрансляционному транспорту пептида к определенным внутриклеточным структурам, таким как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи.
Под "сигнальной последовательностью" подразумевают последовательность, о которой известно или о которой предполагают, что она приводит к котрансляционному или
посттрансляционному транспорту пептида через клеточную мембрану. У эукариотов они, в основном, вовлечены в секрецию в аппарат Гольджи, с некоторым имеющим место гликозилированием. Под "лидерной последовательностью" подразумевают любую последовательность, которая в случае трансляции приводит к аминокислотной последовательности, достаточной для переключения котрансляционного транспорта пептидной цепи во внутриклеточную органеллу. Таким образом, это включает лидерные последовательности, направляющие транспорт и/или
гликозилирование путем прохождения в эндоплазматический ретикулум, прохождения в вакуоли, пластиды, включая хлоропласты, митохондрии и т.п.
Под "вектором трансформации растения" подразумевают молекулу ДНК, которая необходима для эффективной трансформации клетки растения. Такая молекула может состоять из одной или более кассет для экспрессии в растении, и может быть организована в более чем одну "векторную" молекулу ДНК. Например, двойные векторы представляют собой векторы для трансформации растения, которые используют два несмежных ДНК-вектора, для кодирования всех необходимых функций, действующих как в цис-, так и в транс-положении, для трансформации клеток растения (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Вектор" относится к конструкции нуклеиновой кислоты, разработанной для передачи между различными клетками хозяина. "Вектор экспрессии" относится к вектору, который обладает способностью включать, интегрировать и экспрессировать последовательности гетерологичной ДНК или фрагменты в чужеродной клетке. Кассета должна включать 5' - и 3' -регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью по изобретению. Под "функционально связанный" подразумевают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, где промоторная
последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй
последовательности. В общем смысле, "функционально связанный" означает, что последовательности нуклеиновых кислот, будучи
связанными, являются смежными и, в случае необходимости, связывают две смежные белок-кодирующие области в одной и той же рамке считывания. Кроме того, кассета может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный ген, совместно передающийся и трансформирующий организм. Альтернативно, дополнительный ген(ы) может быть предоставлен в составе нескольких экспрессионных кассет.
"Промотор" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает непосредственную транскрипцию расположенной ниже кодирующей последовательности. Промотор вместе с другими транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот (также называемыми "контрольными последовательностями") необходим для экспрессии представляющей интерес последовательности ДНК.
Такая экспрессионная кассета снабжена множеством участков рестрикции для вставки последовательности дельта-эндотоксина для осуществления транскрипционной регуляции регулирующих областей.
Кассета экспрессии должна включать область инициации транскрипции и трансляции (то есть, промотор) в направлении транскрипции 5'-3', последовательность ДНК по изобретению и область терминации трансляции и транскрипции (то есть, область терминации), функционирующие в растениях. Промотор может являться нативным, или аналогичным, или чужеродным или гетерологичным по отношению к растению-хозяину и/или к последовательности ДНК по изобретению. Кроме того, промотор может являться природной последовательностью или, в качестве альтернативы, синтетической последовательностью. В случае, если промотор является "нативным" или "гомологичным" растению-хозяину, подразумевается, что промотор обнаружен в природном растении, в которое промотор вводится. В случае, если промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" последовательности ДНК по изобретению, то подразумевается, что промотор не является нативным или природным промотором для функционально связанных последовательностей ДНК по изобретению.
Область терминации может являться нативной с областью
инициации транскрипции, может являться нативной с функционально связанной последовательностью ДНК, представляющей интерес, может являться нативной с растением-хозяином, или может быть получена из другого источника (то есть, чужеродной или гетерологичной промотору, представляющей интерес
последовательности ДНК, растению-хозяину или любой их комбинации). Подходящие области терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:78917903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Если целесообразно, ген(ы) можно оптимизировать для увеличения экспрессии в трансформированной клетке хозяина. То есть, для улучшения экспрессии гены можно синтезировать с использованием предпочтительных для клетки хозяина кодонов, или можно синтезировать с использованием кодонов с предпочтительной для хозяина частотой использования кодонов. Как правило, GC-состав гена бывает увеличен. См., например, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11 для обсуждения предпочтительного для хозяев использования кодонов. В данной области доступны способы синтезирования предпочтительных для растений генов. См., например, Патенты США №№ 5380831 и 5436391, и Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные здесь в качестве ссылки.
В одном варианте осуществления дельта-эндотоксин предназначается для экспрессии в хлоропласте. Таким способом, в случае, где дельта-эндотоксин не встроен непосредственно в хлоропласт, экспрессионная кассета должна дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую транспортный пептид, для направления дельта-эндотоксина к хлоропластам. Такие транспортные пептиды известны в данной области. См., например, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et
al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
Ген дельта-эндотоксина, предназначенный для хлоропластов, может быть оптимизирован для экспрессии в хлоропласте, с учетом различий в использовании кодонов между ядром растения и этой органеллой. Этим способом можно синтезировать представляющие интерес нуклеиновые кислоты с использованием кодонов, предпочтительных для хлоропластов. См., например, Патент США № 5380831, включенный здесь в качестве ссылки.
Трансформация растений
Способы по изобретению включают введение нуклеотидной конструкции в растение. Под "введением" подразумевается представление растению нуклеотидной конструкции таким образом, что конструкция получает доступ к внутреннему пространству клетки растения. Способы по изобретению не требуют, чтобы использовался конкретный способ введения нуклеотидной конструкции в растение, только чтобы нуклеотидная конструкция получала доступ к внутреннему пространству, по меньшей мере, одной клетки растения. Способы введения нуклеотидных конструкций в растения известны в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, способы стабильной трансформации, способы транзиентной трансформации и вирус-опосредованные способы.
Под "растением" подразумеваются целые растения, органы растения (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, побеги, эмбрионы и их потомство. Клетки растения могут быть дифференцированными или
недифференцированными (например, каллюс, суспензия клеток культуры, протопласты, клетки листьев, клетки корней, клетки флоэмы, пыльца).
"Трансгенные растения", или "трансформированные растения", или "стабильно трансформированные", растения, или клетки, или ткани относятся к растениям, которые встроили или интегрировали экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или фрагменты ДНК в клетку растения. Эти последовательности нуклеиновых кислот включают последовательности, которые являются
экзогенными или не присутствуют в нетрансформированной клетке растения, а также последовательности, которые могут являться эндогенными или присутствовать в нетрансформированной клетке растения. Как правило, "гетерологичный" относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые не являются эндогенными для клетки или части нативного генома, в котором они присутствуют, и были добавлены к клетке путем инфицирования, трансфекции, микроинъекции, электропорации, микропроекции или подобного.
Трансформацию клеток растений можно проводить одним из нескольких способов, известных в данной области. Ген дельта-эндотоксина по изобретению можно изменить для получения или увеличения экспрессии в клетках растений. Обычно конструкция, которая экспрессирует такой белок, должна содержать промотор для управления транскрипцией гена, а также 31-нетранслируемую область для обеспечения терминации транскрипции и полиаденилирования. Устройство таких конструкций известно в данной области. В некоторых случаях может быть полезно спроектировать ген таким образом, чтобы образующийся пептид секретировался или иным образом направлялся в пределах клетки растения. Например, ген может быть спроектирован, чтобы содержать сигнальный пептид для обеспечения переноса пептида в эндоплазматический ретикулум. Также может являться предпочтительным конструирование экспрессионной кассеты растения с содержанием интрона таким образом, чтобы для экспрессии был необходим мРНК-процессинг интрона.
Обычно такую "экспрессионную кассету растения" вставляют в "вектор трансформации растения". Этот вектор трансформации растения может содержать один или более ДНК-векторов, необходимых для достижения трансформации растения. Например, обычной практикой в данной области является использование векторов трансформации растения, которые состоят из более чем одного смежного сегмента ДНК. Эти векторы часто упоминаются в данной области как "бинарные векторы". Бинарные векторы, так же как векторы со вспомогательными плазмидами, чаще всего используются для Agrobacteriил-опосредованной трансформации,
где размер и сложность сегментов ДНК, необходимых для достижения эффективной трансформации, являются весьма значительными, и представляется полезным распределение функции по разделенным молекулам ДНК.
Обычно бинарные векторы включают плазмидный вектор, который содержит цис-действующие последовательности,
необходимые для переноса Т-ДНК (такие как левая граница и правая граница), селективный маркер, который спроектирован, чтобы быть способным к экспрессии в клетке растения, и "представляющий интерес ген" (ген, спроектированный, чтобы быть способным к экспрессии в клетке растения, для которой желательна генерация трансгенных растений). Также присутствующими на этом плазмидном векторе являются последовательности, необходимые для бактериальной репликации. Цис-действующие последовательности устроены таким образом, чтобы обеспечить эффективный перенос в клетки растения и экспрессию там. Например, ген селективного маркера и дельта-эндотоксин расположены между левой и правой границами. Часто второй плазмидный вектор содержит транс-действующие факторы, которые опосредуют перенос Т-ДНК от Agrobacterium в клетки растения. Эта плазмида часто несет вирулентные функции (гены Vir) , которые позволяют Agrobacterium инфицировать клетки растения и переносить ДНК путем расщепления по граничным последовательностям и vir-обусловленному переносу ДНК, как понимается в данной области (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Несколько типов штаммов Agrobacterium (например. LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 и т.д.) можно использовать для трансформации растений. Второй плазмидный вектор не является необходимым для трансформации растений другими способами, такими как микропроекция, микроинъекция, электропорация, с использованием
полиэтиленгликоля и т.д.
Как правило, способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в клетки-мишени растения (например, незрелые или зрелые эмбрионы, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т.д.) с последующим
применением максимального порогового уровня соответствующей селекции (в зависимости от гена селективного маркера), чтобы отобрать трансформированные клетки растения из группы нетрансформированной клеточной массы. Как правило, эксплантаты переносят на новый источник той же среды и культивируют обычным способом. Впоследствии трансформированные клетки
дифференцируются при всходах после перемещения на регенерирующую среду с добавлением максимального порогового уровня селектирующего вещества. Всходы затем переносят на селективную среду для укоренения для получения укорененных всходов или проростков. Трансгенный проросток затем превращается в зрелое растение и производит фертильные семена (например, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Как правило, эксплантаты переносят на новый источник той же среды и культивируют обычным способом. Общее описание методик и способов производства трансгенных растений можно встретить в Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219239 и Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Так как трансформированный материал содержит много клеток, как трансформированные, так и нетрансформированные клетки присутствуют в любой части подвергнутого воздействию целевого каллюса или ткани, или группы клеток. Способность уничтожать нетрансформированные клетки и предоставлять возможность трансформированным клеткам пролиферировать приводит к образованию трансформированных культур растений. Часто способность удалять нетрансформированные клетки представляет собой ограничение для быстрого восстановления
трансформированных клеток растения и успешной генерации трансгенных растений.
Протоколы трансформации, так же как и протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут меняться в зависимости от типа растения или растительной клетки, то есть, однодольного или двудольного растения, предназначенного для трансформации. Генерацию трансгенных растений можно осуществить одним из нескольких способов,
включая, но не ограничиваясь ими, микроинъекцию, электропорацию, прямой генный перенос, введение гетерологичной ДНК при помощи Agrobacterium в клетки растения (Agrobacterium-обусловленная трансформация), бомбардировку клеток растения гетерологичной чужеродной ДНК, налипшей на частицы, баллистическое ускорение частиц, трансформацию аэрозольным пучком (опубликованная заявка США № 20010026941; Патент США № 4 945050; международная публикация № WO 91/00915; опубликованная заявка США № 2002015066), Lecl-трансформацию и различные другие, отличные от прямых опосредованных частицами, способы переноса ДНК.
Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. См., например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Способ основывается на обусловленной обстрелом частицами доставке ДНК, содержащей селективный маркер, и направлении ДНК в геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации. Дополнительно, пластидную трансформацию можно получить путем трансактивации молчащего присутствующего в пластиде трансгена при помощи ткане-предпочтительной экспрессии ядерно кодируемой и пластид-направленной РНК-полимеразы. О такой системе сообщили в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:73017305.
После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в клетки растения применяют максимальный пороговый уровень соответствующей селекции в среде для уничтожения нетрансформированных клеток и отбора и пролиферации предполагаемых трансформированных клеток, которые выживают после этой селективной обработки, путем периодического переноса на новую среду. Путем непрерывного пассажа и проведения соответствующей селекции идентифицируют и размножают клетки, которые трансформированы плазмидным вектором. Затем можно использовать молекулярный и биохимические способы для подтверждения присутствия интегрированного, представляющего интерес гетерологичного гена в геном трансгенного растения.
Клетки, которые были трансформированы, можно вырастить в растения в соответствии с общепринятыми способами. См., например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Эти растения можно затем вырастить и либо опылить тем же самым трансформированным штаммом, либо другими штаммами, и идентифицировать образующийся гибрид, конститутивно
экспрессирующий желательную фенотипичную особенность. Можно вырастить два или более поколения, чтобы гарантировать, что экспрессия желательной фенотипичной особенности устойчиво поддерживается и наследуется, и затем отобрать собранное, чтобы гарантировать, что экспрессия желательной фенотипичной особенности была достигнута. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет трансформированное семя (также называемое "трансгенным семенем") , обладающее нуклеотидной конструкцией по изобретению, например, экспрессионной кассетой по изобретению, устойчиво встроенной в его геном.
Оценка трансформации растения
После введения гетерологичной чужеродной ДНК в клетки растения трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в геном растения подтверждают различными способами, такими как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном.
ПЦР-анализ представляет собой быстрый способ скрининга трансформированных клеток, тканей или проростков на присутствие встроенного гена на более ранней стадии, чем пересадка в почву (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory-Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . ПЦР выполняют с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфических для представляющего интерес гена, или векторного окружения Agrobacterium и т.д.
Трансформация растения может быть подтверждена Саузерн-блот-анализом геномной ДНК (Sambrook and Russell, 2001, выше). Как правило, из трансформанта выделяют тотальную ДНК, расщепляют соответствующими ферментами рестрикции, разделяют в агарозном геле и переносят на нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану или "блот" затем зондируют, например,
меченным радиоактивным изотопом 32Р целевым фрагментом ДНК, чтобы подтвердить интеграцию введенного гена в геном растения, в соответствии со стандартными методиками (Sambrook and Russell, 2001, выше).
В Нозерн-блот-анализе из определенных тканей трансформанта выделяют РНК, фракционируют в формальдегидном агарозном геле и подвергают блоттингу на нейлоновом фильтре в соответствии со стандартными процедурами, которые обычно используются в данной области (Sambrook and Russell, 2001, выше). Экспрессию РНК, кодируемую дельта-эндотоксином, затем проверяют путем гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным из дельта-эндотоксина, при помощи способов, известных в данной области (Sambrook and Russell, 2001, выше).
Вестерн-блот, биохимические анализы и т.п. можно проводить на трансгенных растениях, чтобы подтвердить присутствие белка, кодируемого геном дельта-эндотоксина в соответствии со стандартными процедурами (Sambrook and Russell, 2001, выше), используя антитела, которые связываются с одним или более эпитопами, присутствующими в белке дельта-эндотоксина.
Инсектицидная активность в растениях
В другом аспекте изобретения можно создать трансгенные растения, экспрессирующие дельта-эндотоксин, которые обладают инсектицидной активностью. Способы, описанные выше посредством примера, могут быть использованы для создания трансгенных растений, однако метод, которым создаются трансгенные клетки растения, не являются критическим в отношении этого изобретения. Способы, известные или описанные в данной области, такие как АдгоЬасterium-обусловленная трансформация, биолистная трансформация, и способы, отличные от частице-обусловленных, могут использоваться на усмотрение экспериментатора. Растения, экспрессирующие дельта-эндотоксин, могут быть выделены общепринятыми способами, описанными в данной области, например, трансформацией каллюса, селекцией трансформированного каллюса и регенерацией фертильных растений из такого трансгенного каллюса. В таком процессе можно использовать любой ген в качестве селективного маркера, в случае, если его экспрессия в
¦ 35
клетках растения дает возможность идентифицировать или отбирать трансформированные клетки.
Для использования с клетками растений было разработано много маркеров, таких как устойчивость к хлорамфениколу, аминогликозид G418, гигромицин или подобное. Другие гены, которые кодируют продукт, вовлеченный в метаболизм хлоропластов, также могут использоваться в качестве селективных маркеров. Например гены, которые обеспечивают устойчивость к гербицидам растений, такие как глифосат, бромоксинил или имидазолинон, могут найти специфическое применение. О таких генах сообщали Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:63106314 (нитрилазный ген устойчивости к бромоксинилу); и Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (ген устойчивости к имидазолинону AHAS). Кроме того, раскрытые здесь гены полезны в качестве маркеров для оценки трансформации бактериальных или растительных клеток. Способы детектирования присутствия трансгена в растении, органе растения (например, листья, стебли, корни и т.д.), семени, клетке растения, побеге, эмбрионе или их потомстве известны в данной области. В одном варианте осуществления присутствие трансгена детектируется путем тестирования в отношении инсектицидной активности.
Фертильные растения, экспрессирующие дельта-эндотоксин, могут быть проверены на инсектицидную активность, и растения, показавшие оптимальную активность, отобраны для дальнейшего размножения. Способы оценки активности на насекомых доступны в данной области. Как правило, белок подмешивают и используют в испытаниях с кормлением. См., например, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.
Настоящее изобретение может использоваться для трансформации любых видов растений, включая, но не ограничиваясь ими, однодольные и двудольные растения. Примеры представляющих интерес растений включают, но не ограничиваясь ими, зерновые (кукурузу) , сорго, пшеницу, подсолнечник, томаты, крестоцветные, перцы, картофель, хлопок, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень и масличный рапс, Brassica sp., люцерну, рожь, просо, сафлор, арахисы, батат,
маниоку, кофе, кокосовый орех, ананас, деревья цитрусовых, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуаву, манго, оливу, папайю, анакард, макадамию, миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные.
Овощи включают, но не ограничиваясь ими, томаты, салат, зеленую фасоль, лимскую фасоль, горох, и представителей рода Curcumis, таких как огурец, канталупа и мускусная дыня. Декоративные растения включают, но не ограничиваясь ими, азалию, гортензию, гибискус, розы, тюльпаны, нарциссы, петунии, гвоздику, молочай и хризантему. Предпочтительно, растения по настоящему изобретению представляют собой хлебные злаки (например, кукурузу, сорго, пшеницу, подсолнечник, помидор, крестоцветные, перцы, картофель, хлопок, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и т.д.) .
Применение при контролировании насекомых
Общие способы применения штаммов, включающих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, или ее вариант, при контролировании насекомых или в разработке других организмов в качестве инсектицидных агентов известны в данной области. См., например Патент США № 5039523 и ЕР 0480762А2.
Штаммы Bacillus, включающие нуклеотидную
последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, или микроорганизмы, которые были генетически изменены, чтобы содержать инсектицидные ген и белок, могут использоваться для защиты сельскохозяйственных зерновых культур и продуктов от насекомых. В одном аспекте изобретения целые, то есть, нелизированные, клетки продуцирующего токсин (инсектицид) организма обрабатывают реактивами, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, в случае, когда клетку применяют в среде, окружающей целевое(ых) насекомое(ых).
Альтернативно, инсектицид продуцируют путем введения гена дельта-эндотоксина в клеточного хозяина. Экспрессия гена дельта-эндотоксина приводит, прямо или косвенно, к внутриклеточному продуцированию и поддержанию инсектицида. В одном аспекте этого изобретения данные клетки затем
обрабатывают при условиях, которые продлевают активность токсина, продуцируемого в клетке, когда клетку применяют в окружающей целевое насекомое(ых) среде. Образующийся продукт сохраняет токсичность токсина. Эти естественным образом инкапсулированные инсектициды можно затем сформулировать в соответствии с обычными способами для применения в окружающей среде, принимающей целевое насекомое, например, почве, воде и листве растений. См., например, ЕРА 0192319 и ссылки, процитированные там. Альтернативно, можно сформулировать клетки, экспрессирующие ген по данному изобретению, так, чтобы сделать возможным применение образующегося материала в качестве инсектицида.
Инсектицидные композиции
Активные компоненты по настоящему изобретению обычно применяются в виде композиций и могут быть нанесены на участок сельскохозяйственной культуры или растения, подлежащего обработке, одновременно или по очереди с другими соединениями. Эти композиции могут представлять собой удобрения, гербициды, криозащитные вещества, сурфактанты, детергенты, инсектицидные мыла, неактивные масла, полимеры, и/или композиции с пролонгированным действием или биоразлагаемые композиции, которые позволяют долговременно дозировать целевой участок после однократного нанесения состава. Они также могут являться селективными гербицидами, химическими инсектицидами,
противовирусными препаратами, противомикробными средствами, противоамебными веществами, пестицидами, фунгицидами,
бактерицидными средствами, нематоцидами, моллюскоцидами или смесями нескольких из этих препаратов, при необходимости, вместе с дополнительными агрономически приемлемыми носителями, сурфактантами или содействующими применению адъювантами, используемыми в соответствии с техническим условиями области составов. Подходящие носители и адъюванты могут быть твердыми или жидкими и соответствовать веществам, обычно используемым в технологии составов, например, натуральным или восстановленным минеральным веществам, растворителям, диспергаторам,
смачивающим агентам, веществам для повышения клейкости,
связующим веществам или удобрениям. Аналогично могут быть подготовлены составы для съедобных "приманок" или приспособленные под вредителя "ловушки" для предоставления возможности целевому вредителю питаться или принимать в пищу инсектицидный состав.
Способы применения активного компонента по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, которые содержат, по меньшей мере, один из инсектицидных белков, продуцированных бактериальными штаммами по настоящему изобретению, включают нанесение на листья, дражирование семян и нанесение на почву. Число нанесений и скорость нанесения зависит от плотности заражения соответствующим насекомым.
Композиция может быть составлена в виде порошка, пылевидного препарата, шарика, гранулы, спрея, эмульсии, коллоида, раствора или подобного, и может быть приготовлена такими общепринятыми способами, как сушка, лиофилизация, гомогенизирование, экстракция, фильтрация, центрифугирование, седиментация или концентрирование культуры клеток, включающих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат, по меньшей мере, один такой инсектицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации от приблизительно 1% до приблизительно 99% по массе.
Чешуекрылые, жесткокрылые или другие насекомые могут быть уничтожены или их число может быть уменьшено на заданной площади при помощи способов по изобретению, или способы можно применять в целях профилактики к области окружающей среды, чтобы предотвратить заражение чувствительным насекомым. Предпочтительно, насекомое заглатывает или контактирует с инсектицидно эффективным количеством полипептида. Под "инсектицидно эффективным количеством" подразумевают количество инсектицида, которое в состоянии вызвать гибель, по меньшей мере, одного насекомого или заметно замедлить рост, питание или нормальное физиологическое развитие насекомого. Это количество должно меняться в зависимости от таких факторов как, например, определенные подлежащие контролю целевые насекомые,
определенная окружающая среда, местоположение, растение, урожай или сельскохозяйственный участок для обработки, условия окружающей среды и способ, норма, концентрация, стабильность и количество нанесения инсектицидно эффективной полипептидной композиции. Составы также могут меняться в зависимости от климатических условий, экологических соображений и/или частоты нанесения и/или серьезности заражения насекомым.
Описанные инсектицидные композиции могут быть изготовлены в виде состава либо с бактериальной клеткой, кристаллом и/или суспензией спор, либо с выделенным белковым компонентом с желательным агрономически приемлемым носителем. Композиции могут быть составлены перед введением в соответствующих видах, таких как лиофилизированном, высушенном сублимацией, высушенном, или в водном носителе, среде или подходящем разбавителе, таком как физиологический раствор или другой буфер. Составленные композиции могут быть в виде пылевидного или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или водных или масляно-водных эмульсий, или в качестве смачиваемого порошка, или в комбинации с любым другим материалом-носителем, подходящим для сельскохозяйственного применения. Подходящие для сельского хозяйства носители могут являться твердыми или жидкими и являться известными в данной области. Термин "агрономически приемлемый носитель" охватывает все адъюванты, инертные компоненты, диспергаторы, сурфактанты, вещества для повышения клейкости, связующие вещества и т.д., которые обычно используются в технологии инсектицидных составов; они хорошо известны специалистам по инсектицидным составам. Составы могут быть смешаны с одним или более твердым или жидким адъювантами и приготовлены различными способами, например, путем гомогенного смешивания, перемешивания и/или перемалывания инсектицидной композиции с подходящими адъювантами, используя обычные способы составления. Подходящие составы и способы применения описаны в Патенте США № 6468523, включенном здесь в качестве ссылки.
"Вредитель" включает, но не ограничиваясь ими, насекомых, грибы, бактерии, нематоды, клещей, зудней и т.п. Насекомые
вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д., особенно Coleoptera, Lepidoptera и Diptera.
Отряд Coleoptera включает подотряды Adephaga и Polyphaga. Подотряд Adephaga включает суперсемейства Caraboidea и Gyrinoidea, в то время как подотряд Polyphaga включает суперсемейства Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucuj oidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea,
Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea и Curculionoidea. Суперсемейство Caraboidea включает семейства Cicindelidae, Carabidae и Dytiscidae. Суперсемейство Gyrinoidea включает семейство Gyrinidae. Суперсемейство Hydrophiloidea включает семейство Hydrophilidae. Суперсемейство Staphylinoidea включает семейства Silphidae и Staphylinidae. Суперсемейство Cantharoidea включает семейства Cantharidae и Lampyridae. Суперсемейство Cleroidea включает семейства Cleridae и Dermestidae. Суперсемейство Elateroidea включает семейства Elateridae и Buprestidae. Суперсемейство Cucujoidea включает семейство Coccinellidae. Суперсемейство Meloidea включает семейство Meloidae. Суперсемейство Tenebrionoidea включает семейство Tenebrionidae. Суперсемейство Scarabaeoidea включает семейства Passalidae и Scarabaeidae. Суперсемейство Cerambycoidea включает семейство Cerambycidae. Суперсемейство Chrysomeloidea включает семейство Chrysomelidae. Суперсемейство Curculionoidea включает семейства Curculionidae и Scolytidae.
Отряд Diptera включает подотряды Nematocera, Brachycera и Cyclorrhapha. Подотряд Nematocera включает семейства Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae и Cecidomyiidae. Подотряд Brachycera включает семейства Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae и Dolichopodidae. Подотряд Cyclorrhapha включает разделы Aschiza и Aschiza. Раздел Aschiza включает семейства Phoridae, Syrphidae и Conopidae. Раздел
Aschiza включает секции Acalyptratae и Calyptratae. Секция Acalyptratae включает семейства Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae и Drosophilidae. Секция Calyptratae включает семейства Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, An thornyiidae, Muscidae, Calliphoridae и Sarcophagidae.
Отряд Lepidoptera включает семейства Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridaer Arctiidae r Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae, Crambidae и Tineidae.
Нематоды включают паразитических нематод, таких как нематоды корневого нароста, кисты и повреждений, включая Heterodera spp., Meloidogyne spp. и Globodera spp.; в частности, члены нематод кисты, включая, но не ограничиваясь ими, Heterodera glycines (нематода кисты сои); Heterodera schachtii (нематода кисты свеклы); Heterodera avenae (нематода зерновой кисты); и Globodera rostochiensis и Globodera pailida (нематоды картофельной кисты). Нематоды повреждения включают Pratylenchus spp.
Насекомые-вредители по изобретению основных зерновых культур включают: Кукуруза: Ostrinia nubilalis, Европейский зерновой мотылек; Agrotis ipsilon, черная совка; Helicoverpa zea, кукурузная совка; Spodoptera frugiperda, падающие походные черви; Diatraea grandiosella, юго-западный кукурузный мотылек; Elasmopalpus lignosellus, малый точильщик стебля кукурузы; Diatraea saccharalis, точильщик сахарного тростника; Diabrotica virgifera, западная личинка, повреждающая корни кукурузы; Diabrotica longicornis barberi, северная личинка, повреждающая корни кукурузы; Diabrotica undecimpunctata howardi, южная личинка, повреждающая корни кукурузы; Melanotus spp., проволочники; Cyclocephala borealis, северный скрытый хрущ (белая личинка); Cyclocephala immaculata, южный скрытый хрущ (белая личинка); Popillia japonica, японский жук; Chaetocnema pulicaria, зерновая земляная блошка; Sphenophorus maidis, кукурузный долгоносик; Rhopalosiphum maidis, тля листьев кукурузы; Anuraphis maidiradicis, тля корня кукурузы; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка; Melanoplus
femurrubrum, красноногий кузнечик; Melanoplus sanguinipes, мигрирующий кузнечик; Hylemya platura, зерновая безногая личинка; Agromyza parvicornis, пятнистый минер листвы зерновых; Anaphothrips obscrurus, травяные трипсы; Solenopsis milesta, муравей-вор; Tetranychus urticae, двухпятнышковый паутинный клещ; Сорго: Chilo partellus, точильщик сорго; Spodoptera frugiperda, падающие "походные черви"; Helicoverpa zea, зерновая совка; Elasmopalpus lignosellus, малый точильщик стебля кукурузы; Feltia subterranea, зернистая совка; Phyllophaga crinita, белая личинка; Eleodes, Conoderus и Aeolus spp., проволочники; Oulema melanopus, жук листьев зерновых культур; Chaetocnema pulicaria, зерновой скрытый жук; Sphenophorus maidis, кукурузный долгоносик; Rhopalosiphum maidis; тля листьев зерновых культур; Sipha flava, желтая тля сахарного тростника; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка; Contarinia sorghicola, мошка сорго; Tetranychus cinnabarinus, пунцовый паутинный клещ; Tetranychus urticae, двухпятнышковый паутинный клещ; Пшеница: Pseudaletia unipunctata, армейский червь; Spodoptera frugiperda, падающие "походные черви"; Elasmopalpus lignosellus, малый точильщик корня зерновых; Agrotis orthogonia, западная совка/ Elasmopalpus lignosellus, малый точильщик корня зерновых; Oulema melanopus, жук листьев зерновых культур; Hyper punctata, долгоносик клеверного листа; Diabrotica undecimpunctata howardi, южная личинка, повреждающая корни зерновых культур; русская пшеничная тля; Schizaphis graminum, тля злаковая; Macrosiphum avenae, английская зерновая тля; Melanoplus femurrubrum, красноногий кузнечик; Melanoplus differentialis, отличительный кузнечик; Melanoplus sanguinipes, мигрирующий кузнечик; Mayetiola destructor, гессенская муха; Sitodiplosis mosellana, мошка пшеницы; Meromyza americana, безногая личинка стебля пшеницы; Hylemya coarctata, муха луковицы пшеницы; Frankliniella fusca, табачные трипсы; Cephus cinctus, пилильщик стебля пшеницы; Aceria tulipae, клещ завитка пшеницы; Подсолнечник: Suleima helianthana, моль зародыша подсолнечника; Homoeosoma electellum, моль подсолнечника; Zygogramma
exclamationis, жук подсолнечника; Bothyrus gibbosus, жук моркови; Neolasioptera murtfeldtiana, мошка семени подсолнечника; Хлопок: Heliothis virescens, хлопковая листовертка; Helicoverpa zea, хлопковый коробочный червь; Spodoptera exigua, свекольные "походные черви"; Pectinophora gossypiella, розовый коробочный червь; Anthonomus grandis, хлопковый долгоносик; Aphis gossypii, хлопковая тля; Pseudatomoscelis seriatus, хлопковая прыгающая блоха; Trialeurodes abutilonea, связаннокрылая белокрылка; Lygus lineolaris, тусклый слепняк; Melanoplus femurrubrum, красноногий кузнечик; Melanoplus differentialis, отличительный кузнечик; Thrips tabaci, луковые трипсы; Franklinkiella fusca, табачные трипсы; Tetranychus cinnabarinus, пунцовый паутинный клещ; Tetranychus urticae, двухпятнышковый паутинный клещ; Рис: Diatraea saccharalis, точильщик сахарного тростника; Spodoptera frugiperda, падающие "походные черви"; Helicoverpa zea, зерновая совка; Colaspis brunnea, виноградный коласпис; Lissorhoptrus oryzophilus, рисовый водяной долгоносик; Sitophilus oryzae, долгоносик риса; Nephotettix nigropictus, блоха листьев риса; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка; Acrosternum hilare, зеленый вонючий клоп; Соя: Pseudoplusia includens, пяденица сои; Anticarsia gemmatalis, вельветовая гусеница; Plathypena scabra, зеленый вредитель клевера; Ostrinia nubilalis, европейский точильщик зерновых; Agrotis ipsilon, черный совка; Spodoptera exigua, свекольные "походные черви"; Heliothis virescens, хлопковая листовертка; Helicoverpa zea, хлопковый коробочный червь; Epilachna varivestis, мексиканский бобовый жук; Myzus persicae, зеленая персиковая тля; Empoasca fabae, блоха картофельной листвы; Acrosternum hilare, зеленый вонючий клоп; Melanoplus femurrubrum, красноногий кузнечик; Melanoplus differentialis, отличительный кузнечик; Hylemya platura, зерновая безногая личинка; Sericothrips variabilis, соевые трипсы; Thrips tabaci, луковые трипсы; Tetranychus turkestani, земляничный паутинный клещ; Tetranychus urticae, двухпятнышковый паутинный клещ; Ячмень: Ostrinia nubilalis, европейский кукурузный мотылек;
Agrotis ipsilon, черная совка; Schizaphis graminum, тля злаковая; Blissus leucopterus leucopterus, клопа-черепашка; Acrosternum hilare, зеленый вонючий клоп; Euschistus servus, коричневый вонючий клоп; Delia platura, зерновая безногая личинка; Mayetiola destructor, гессенская муха; Petrobia latens, коричневый клещ пшеницы; Рапс: Brevicoryne brassicae, тля капусты; Phyllotreta cruciferae, скрытый жук; Mamestra configurata, "походные черви" Берта; Plutella xylostella, моль капустная; Delia ssp., корневые безногие личинки. Способы увеличения урожайности растений
Предоставлены способы увеличения урожайности растений. Способы включают введение в растение или клетку растения полинуклеотида, содержащего инсектицидную последовательность, раскрытую здесь. Как определено здесь, "урожайность" растения относится к качеству и/или количеству биомассы, произведенной растением. Под "биомассой" подразумевают любой измеряемый продукт растения. Увеличение производства биомассы представляет собой любое усовершенствование в урожайности измеряемого продукта растения. Увеличение урожайности растения имеет несколько коммерческих применений. Например, увеличение биомассы листьев растения может увеличить урожайность листовых овощей для потребления животными или человеком. Кроме того, увеличение биомассы листьев может использоваться для увеличения производства полученных из растения фармацевтических или промышленных продуктов. Увеличение урожайности может включать любое статистически значимое увеличение, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере, 1% увеличение, по меньшей мере, 3% увеличение, по меньшей мере, 5% увеличение, по меньшей мере, 10% увеличение, по меньшей мере, 20% увеличение, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 100% или большее увеличение урожайности по сравнению с растением, не экспрессирующим инсектицидную последовательность.
В определенных способах урожайность растения увеличивается в результате улучшенной устойчивости растения к насекомым, экспрессирующего инсектицидный белок, раскрытый здесь.
Экспрессия инсектицидного белка приводит к уменьшенной способности насекомого заражать или питаться растением, улучшая таким образом урожайность растения.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Пример 1. Открытие нового гена токсина Axmill5 из штамма Bacillus thuringiensis АТХ12983
Полная последовательность гена выбранного штамма была идентифицирована с помощью геномного подхода MiDAS следующим образом:
- Подготовка экстрахромосомной ДНК штамма.
Экстрахромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всего из следующего: плазмиды различного размера; хромосомы фага; геномные фрагменты ДНК, не отделенные протоколом очистки; другие неохарактеризованные экстрахромосомные молекулы.
Механическое или ферментативное разрезание экстрахромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов.
- Секвенирование фрагментированной ДНК.
- Идентификация предполагаемых генов токсина по гомологии и/или путем других компьютерных исследований.
При необходимости, завершение последовательности представляющего интерес гена путем одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, TAIL-PCR).
Новый ген упоминается здесь как axmi-115 (SEQ ID N0:3), и кодируемая аминокислота упоминается как AXMI-115 (SEQ ID N0:6). Синтетические нуклеотидные последовательности, кодирующие AXMI-115, приведены в SEQ ID N0:15 и 16.
Характеристики гена и белка
Длина гена, пары оснований ДНК: 240 9
Длина белка, аминокислотные остатки: 803
Предполагаемая молекулярная массы белка, Да: 90877
Известные гомологи и приблизительная процентная идентичность:
Vip3Afl - 70,7%
Axmi005 - 70,4% Axmi026 - 70,4% Vip3Aa7 - 70,1%
Пример 2. Новый инсектицидный белок AXMI-005 из штамма АТХ13002 Bacillus thuringiensis
Инсектицидный ген AXMI-005 был идентифицирован из штамма АТХ13002 с использованием подхода MiDAS, как описано в Патентной публикации США № 20040014091, который включен здесь в полном объеме в качестве ссылки, с использованием следующих стадий:
Стадии, сделанные в текущей стратегии по открытию гена: Стадия 1: Культуру штамма выращивали в больших количествах. Плазмидную ДНК затем отделяли от хромосомной ДНК при помощи градиента хлористого цезия, сформованного при ультрацентрифугировании. Очищенную плазмидную ДНК затем раздробляли в диапазоне размеров 5-10 т.п.н., соответствующему покрытию среднего размера кодирующей области. Концы фрагмента достраивали, затем лигировали в течение ночи в вектор, разрезанный ферментом рестрикции, образующим тупые концы.
Стадия 3: После проверки и подтверждения качества геномной библиотеки, колонии выращивали, подготавливали образцы и секвенировали в 96-луночном формате. Плашки библиотеки секвенировали с конца от векторной основы для начального скрининга.
Стадия 5: Все прочтения были собраны в единый проект и выровнены вместе, чтобы сформировать контиги. Эти контиги, наряду с любым индивидуальным прочтением, которое, возможно, не было добавлено к контиг, были проанализированы при помощи BLAST, используя формат партии, по отношению к внутренней базе данных, составленной из всех классов известных генов дельта-эндотоксина. Любые контиги или индивидуальные прочтения, которые проявляли какую-либо гомологию с известным геном, анализировались далее, путем отбора единственного клона из библиотеки, которая покрывала полную гипотетическую кодирующую область.
Стадия б: индивидуальный клон, покрывающий представляющую
интерес область, затем прочитывали шагами с перекрыванием при помощи разработанных праймеров для расширения
последовательности. Это делалось до тех пор, пока прочтения с обоих концов клона не соединились, и перекрытие составило, по меньшей мере, 2Х. Законченный контиг единственного клона затем анализировался при помощи BLAST (как blastn, так и blastx) в отношении общей базы данных всех известные инсектицидных генов. Лучшие варианты из обоих поисков затем извлекали из внутренней базы данных всех генов (лишь урезанных до кодирующей последовательности) и выравнивали с полной последовательностью клона из библиотеки, чтобы определить процент расхождения с известным геном.
Новый ген, упомянутый здесь как axmi-005 (SEQ ID N0:1), и кодируемая аминокислота, называемая AXMI-005 (SEQ ID N0:4), были идентифицированы при помощи этого подхода. Поиск по общедоступным базам данных последовательностей, включая базы данных GENBANK(r), показал, что AXMI-005 представляет собой уникальный белок, который обладает самой высокой гомологией (94,9%) с инсектицидным белком vip3Aa (GenePept ID L48841).
Синтетическая последовательность, кодирующая белок AXMI-005, была разработана и названа optaxmi-005. Нуклеотидная последовательность изложена в SEQ ID N0:7 и кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0:9 (с дополнением С-концевого гистидинового тага). Ген optaxmi-005, раскрытый здесь, может использоваться с С-концевым гистидиновым тагом или без него.
Пример 3. Открытие нового гена токсина Axmi-113 штамма АТХ12987 Bacillus thuringiensis
Полная генная последовательность была идентифицирована из выбранного штамма посредством геномного подхода MiDAS следующим образом:
- Подготовка экстрахромосомной ДНК штамма.
Экстрахромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех из следующего: плазмиды различного размера; хромосомы фага; геномные фрагменты ДНК, не отделенные протоколом очистки; другие неохарактеризованные экстрахромосомные молекулы.
Механическое или ферментативное разрезание экстрахромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов.
- Секвенирование фрагментированной ДНК.
- Идентификация предполагаемых генов токсина по гомологии и/или путем других компьютерных исследований.
При необходимости, завершение последовательности представляющего интерес гена путем одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, TAIL-PCR).
Новый ген упоминается здесь как axmi-113 (SEQ ID N0:2), и кодируемая аминокислота упоминается как AXMI-113 (SEQ ID N0:5).
Характеристики гена и белка
Длина гена, пары оснований ДНК: 2385
Длина белка, аминокислотные остатки: 795
Предполагаемая молекулярная массы белка, Да: 8 9475
Известные гомологи и приблизительная процентная идентичность:
Vip3Ah - 99%
Vip3Aal8 - 79,8%
Axmi005 - 7 9%
Синтетическая последовательность, кодирующая белок AXMI-113, была разработана и названа optaxmi-113. Нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID N0:8, и кодирует последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID N0:4 или 14 (с добавлением С-концевого гистидинового тага). Ген optaxmi-113, раскрытый здесь, может использоваться с С-концевым гистидиновым тагом или без него.
Пример 4. Открытие новых генов токсина Axmi-163 и Axmi-184 штамма АТХ14775 Bacillus thuringiensis
Полная генная последовательность была идентифицирована из выбранного штамма посредством геномного подхода MiDAS следующим образом:
- Подготовка экстрахромосомной ДНК штамма.
Экстрахромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех из следующего: плазмиды различного размера; хромосомы фага; геномные фрагменты ДНК, не отделенные протоколом очистки;
другие неохарактеризованные экстрахромосомные молекулы.
Механическое или ферментативное разрезание экстрахромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов.
- Секвенирование фрагментированной ДНК.
- Идентификация предполагаемых генов токсина по гомологии и/или путем других компьютерных исследований.
При необходимости, завершение последовательности представляющего интерес гена путем одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, TAIL-PCR).
Новый ген упоминается здесь как axmi-163 и приведен в SEQ ID N0:6, и кодируемая аминокислота упоминается как AXMI-163 и приведена в SEQ ID N0:13.
Характеристики гена и белка
Длина гена, пары оснований ДНК: 2370
Длина белка, аминокислотные остатки: 7 90
Предполагаемая молекулярная массы белка, Да: 88700
Известные гомологи и приблизительная процентная идентичность:
SEQ ID N0:17 из Патента США 7129212 - 98%
Axmi005 - 78%
Новый ген, упомянутый здесь как axmi-184, приведен в SEQ ID N0:12, и кодируемая аминокислота, называемая AXMI-184, приведена в SEQ ID N0:14.
Синтетические нуклеотидные последовательности, кодирующие AXMI-184, приведены в SEQ ID N0:17 и 18.
Характеристики гена и белка
Длина гена, пары оснований ДНК: 2370
Длина белка, аминокислотные остатки: 7 90
Предполагаемая молекулярная массы белка, Да: 88300
Известные гомологи и приблизительная процентная идентичность:
Vip3Afl - 93%
Axmi005 - 86%
Пример_5_._Конструирование_синтетических
последовательностей
В одном аспекте изобретения созданы синтетические последовательности axmi. Эти синтетические последовательности имеют измененную последовательность ДНК относительно родительской последовательности axmi, и кодируют белок, который коллинеарен с родительским белком AXMI, которому она соответствует, но не содержит С-концевой "кристаллический домен", присутствующий во многих белках дельта-эндотоксина.
В другом аспекте изобретения измененные версии синтетических генов разработаны таким образом, чтобы образующийся пептид направлялся к органоиду растения, такому как эндоплазматический ретикулум или апопласт. Пептидные последовательности, известные тем, что могут привести к нацеливанию слитых белков в органеллы растения, известны в данной области. Например, N-концевая область гена фосфатазы из белого люпина Lupinus albus (Genebank ID GI: 14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606), как известно в данной области, приводит к направлению гетерологичных белков в эндоплазматический ретикулум. Если образующийся слитый белок также содержит последовательность задержки в эндоплазматическом ретикулуме, включающую пептид N-конец-лизин-аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота-лейцин (то есть мотив "KDEL" (SEQ ID SEQ NO: 19)) на С-конце, слитый белок будет направляться в эндоплазматический ретикулум. Если на С-конце слитого белка отсутствует последовательность направления в эндоплазматический ретикулум, то белок будет направляться в эндоплазматический ретикулум, однако в конечном счете будет выделен в апопласт.
Пример 6. Экспрессия в Bacillus
В качестве примера экспрессии генов и белков по изобретению в видах Bacillus инсектицидные ген, раскрытый здесь, амплифицируют путем ПЦР, и продукт ПЦР клонируют в вектор экспрессии рАХ916 Bacillus или другой подходящий вектор способами, известными в данной области. Получившийся штамм Bacillus, содержащий вектор с геном axmi, культивируют на традиционной среде роста, такой как среда CYS (10 г/л Bacto
казитона; 3 г/л дрожжевого экстракта; 6 г/л КН2РО4; 14 г/л К2НР04; 0,5 мМ MgS04; 0,05 мМ МпС12; 0,05 мМ FeS04) , до тех пор, пока путем микроскопического исследования не будет очевидна споруляция. Образцы приготавливают и проверяют на активность в биопробах.
Пример 7. Экспрессия в Е. coli
В качестве примера способа экспрессии генов и белков по изобретению в системах на основе Е. coli, полную открытую рамку считывания каждого гена axmi клонируют в вектор экспрессии Е. coli, основанный на pRSFlb. Образующиеся клоны подтверждают рестрикционным анализом и наконец, полным секвенированием клонированного гена.
Для экспрессии в Е. coli BL21*DE3 трансформируют вектором, экспрессирующим ген ахли. Отдельные КОЛОНИИ инокулируют в LB с добавлением канамицина и выращивают в течение ночи при 37°С. На следующий день новую среду инокулируют в двойном экземпляре 1% ночной культурой и выращивают при 37°С до логарифмической фазы. Впоследствии культуры индуцируют 1 мМ изопропил-13-D-l-тиогалактопиранозидом (IPTG) в течение 3 часов при 37°С или в течение ночи при 20°С. Каждый клеточный осадок суспендируют в 50 мМ буфере карбоната натрия, рН=10,5 с добавлением 1 мМ DTT (дитиотреитол) и озвучивают. Образцы подготавливают и проверяют на активность в биопробах.
Пример 8. Экспрессия AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005 в Е.
coli
Были получены клоны Е. coli, которые включали сегменты ДНК, содержащие полную открытую рамку считывания, а также часть области ДНК, природно расположенной "выше по течению" и смежной с каждым геном. Этот сегмент ДНК для каждого из axmi-113 (SEQ ID N0:5), axmi-115 (SEQ ID N0:6) или axmi-005 (SEQ ID N0:4) был амплифицирован и клонирован в вектор рАХ916 с образованием клонов рАХ5463, рАХ5464 и рАХ5465, соответственно. Получившиеся клоны были подтверждены рестрикционным анализом и полным секвенированием клонированных фрагментов.
Клетки Е. coli были трансформированы каждым из клонов рАХ54 63, рАХ54 64 и рАХ54 65.
Гены axmi005, ахтШЗ и axmill5, у которых кодоны были оптимизированы для экспрессии в зерновых и которые имели добавленный С-концевой 6-гистидиновый таг, также
экспрессировали в векторе экспрессии Е. coli, используя промотор Т7. Кроме того, также были произведены конструкции, которые экспрессировали версии optaxmi005 (рАХ5475, рАХ5478) и optaxmill5 (рАХ547б, рАХ5477) с N-концевым б-гистидиновым тагом или без него.
Отдельные колонии Е. coli axmi-115, axmi-113 и axmi-005-экспрессирующих клонов затем выращивали в течение ночи при 37°С в среде LB. На следующий день новую среду инокулируют в двойном экземпляре 1% ночной культурой и выращивают при 37°С до логарифмической фазы. Впоследствии культуры индуцируют 1 мМ IPTG в течение ночи при 20°С. Получившиеся клетки собирали центрифугированием и суспендировали либо в 50 мМ буфере карбоната натрия, рН 10,5 с добавлением с 1 мМ DTT, либо в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 8 с 1 мМ DTT перед обработкой ультразвуком. Анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия продемонстрировал экспрессию белка массой ~90 кДа во всех образцах.
Пример 9. Биопробы на насекомых экспрессированных в Е. coli белков
Растворимые экстракты, содержащие AXMI-005, AXMI-113 или AXMI-115, были проверены в испытаниях на насекомых с соответствующими контролями. В двадцатичетырехлуночные планшеты для культур тканей (Corning) вносили по 1 мл мультивидовой диеты (Bio-Serv) и давали возможность затвердеть. После затвердевания 40 мкл образца белка помещали на диетическую поверхность каждой лунки и давали возможность
впитаться/подсохнуть при комнатной температуре. В зависимости от эксперимента в каждую лунку помещали либо яичные массы, либо новорожденные личинки. Планшеты запечатывали газопроницаемыми мембранами (Research Products International) и инкубировали при 25°С и 90%-ой относительной влажности. После пяти или семи дней образцы подсчитывали визуально по сравнению образцом, содержащим только буфер, или контролем с нетрансформированным
экстрактом.
Сильную активность экстрактов AXMI-005 наблюдали относительно Helicoverpa zea (HZ), Heliothis virescens (HV) , падающих "походных червей" (FAW), черной совки (BCW), точильщика сахарного тростника (SCB) и бархатной бобовой гусеницы (VBC). AXMI-005 также продемонстрировал активность на юго-западном кукурузном мотыльке (SWCB).
Сильная активность экстрактов AXMI-115 наблюдалась относительно Heliothis virescens, падающих "походных червей", черной совки и бархатной бобовой гусеницы. AXMI-115 также продемонстрировал активность по отношению к европейскому кукурузному мотыльку (ЕСВ), SCB, SWCB и капустной моли (DBM). Активность AXMI-115 на Helicoverpa zea (HZ) была менее отчетливой, чем для других проверенных насекомых, но все еще являлась существенной.
Активность каждого из экстрактов AXMI-005 и AXMI-115 подсчитывали, и на основании относительной активности в испытании присваивали оценку от 1 до 5. Итог подсчетов в специфических тестах приведен в Таблице 1.
AXMI-005 продемонстрировал некоторую активность по отношению к SWCB (оценка 2) и высокие уровни активности по отношению к Hz, Hv, FAW, BCW и VBC (оценки 4-5) . AXMI-115 показал высокие уровни активности по отношению к SWCB (80%-ая смертность), ЕСВ, FAW и VBC (оценки 4-5) и меньшие активности по отношению к Hz и Hv. AXMI-113 также показал высокую активность по отношению к SWCB (оценка 4 с 20%-ой смертностью) и по отношению к SCB. На других проверенных насекомых не было отмечено никакой активности.
Таблица 1
Инсектицидная активность AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005*
Axmill5
Axmill5
Axmi005
Axmi005
Axmill3
(рН 10,5)
(рН 8)
(рН 10,5)
(рН 8)
(рН 10,5)
ЕСВ
живое насекомое
4/5
FAW
4/5
4/5
BCW
3/4
VBC
4/5
SWCB
4; 80% смертность
3; 50% смертность
4; 20% смертность
SCB
3; 25% смертность
4; 100% смертность
3; 50% смертность
DBM
2/3
* = представлена как остановка в росте и процент смертности, где остановку в росте подсчитывают в соответствии со следующей шкалой:
Оценка
Определение
Отсутствие активности
Слабая, неоднородная остановка в росте
Неоднородная остановка в росте
Однородная остановка в росте
Однородная остановка в росте со смертностью (выраженная в процентах)
Однородная остановка в росте со 100%-ой смертностью
Пример 10. Биотестирование Axmil84
Экспрессия гена и очистка
Область ДНК, кодирующая домен токсина Axmil84, была клонирована в вектор экспрессии pMAL-C4x Е. coli после гена malE, кодирующего мальтоза-связывающий белок (МБР). Это сливание в рамке привело к экспрессии слитого белка MBP-Axmi084 в Е. coli.
- Для экспрессии в Е. coli, BL21*DE3 был трансформирован индивидуальными плазмидами. Отдельную колонию засевали в LB с добавлением карбенициллина и глюкозы и 'выращивали в течение
ночи при 37°С. На следующий день новую среду засевали 1% ночной культурой и выращивали при 37°С до логарифмической фазы. Впоследствии культуры индуцировали 0,3 мМ IPTG в течение ночи при 2 0°С. Каждый осадок клеток суспендировали в 2 0 мМ буфере Трис-HCl, рН 7,4 + 2 00 мМ NaCl + 1 мМ DTT + ингибиторы протеаз и обрабатывали ультразвуком. Анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия подтвердил экспрессию слитых белков.
- Полные бесклеточные экстракты разделяли на амилозной колонке, присоединенной к прибору для жидкостной хроматографии быстрого разрешения (FPLC) для аффинной очистки слитого белка MBP-AXMI184. Связанный слитый белок элюировали со смолы с 10 мМ-ным раствором мальтозы. Очищенные слитые белки затем расщепляли либо фактором Ха, либо трипсином, чтобы удалить аминоконцевой МВР-таг из белка AXMI184. Расщепление и растворимость белков были определены методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) .
Расщепленные белки были проверены в испытании на насекомых с соответствующими контролями. Прочтение планшетов через 5 дней продемонстрировало следующие активности AXMI-184 против капустной моли.
Пример 11. Замена доменов
Гены axmi005, ахтШЗ и axmill5, которые содержат кодоны, оптимизированные для экспрессии в зерновых, использовали в этом примере. Плазмиды, экспрессирующие бестаговые версии optaxmi005 (рАХ5478), optaxmll3 (рАХ5493) и optaxmill5 (рАХ5477), использовали для планирования конструкций ДНК с заменами, как описано здесь.
AXMI-005, AXMI-113 и AXMI-115 обладают существенной идентичностью/сходством последовательностей, представляющих собой области в 2/3 с их N-конца. Оставшийся домен в 1/3 на их С-концах (СТ) показывает существенное расхождение
последовательностей, как видно из выравнивания белковых последовательностей, представленного на Фиг.1А и 1В.
Область белка AXMI-113 между прямой и обратной стрелками, показанными на Фиг.1, была заменена соответствующим фрагментом
либо AXMI-005 (с образованием рАХ54 92), либо AXMI-115 (рАХ54 94) .
Для экспрессии в Е. coli BL21*DE3 был трансформирован индивидуальными конструкциями. Отдельную колонию засевали в LB с добавлением канамицина глюкозы и выращивали в течение ночи при 37"С. На следующий день новую среду засевали в двойном экземпляре 1% ночной культурой и выращивали при 37°С до логарифмической фазы. Впоследствии культуры индуцировали 1 мМ IPTG в течение ночи при 20°С. Осадок клеток суспендировали в 50 мМ буфере карбоната натрия, рН 10,5 с добавлением 1 мМ DTT и обрабатывали ультразвуком. Анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия показал чрезвычайно хорошую экспрессию всех белков в растворимом виде.
Стерилизованные фильтрованием растворимые экстракты с экспрессией OptAxmi005, 113, 115, Optaxmil 13+СТ Optaxmi005 и Optaxmill3+CT Optaxmill5 были проверены в испытании на насекомых с соответствующими контролями. Как показано в Примере 9, AXMI-113 показал высокую активность по отношению к SWCB (25%-ая смертность). Он продемонстрировал дополнительную активность по отношению к SCB (50%-ая смертность).
Также, как показано в Примере 9, AXMI-005 продемонстрировал активность по отношению к SWCB, Hz, Hv, FAW, BCW и'VBC. Он показал дополнительную активность по отношению к SCB (25%-ая смертность). Было обнаружено, что AXMI-115 также обладает некоторой активностью по отношению к SCB.
Гибрид AXMI-113+CT AXMI-005 продемонстрировал все активности на насекомых, замеченные для AXMI-005. Другими словами, замена С-концевого фрагмента AXMI-113 таковым из AXMI-005 придавало ему активности в отношении насекомых, которые отсутствовали в его естественной форме.
Дополнительные последовательности белка токсина можно получить путем замены доменов из одного белка в другом. Например, один или более доменов AXMI-005, показанных на фиг.2, вводят в AXMI-115. Домены вводят при помощи смысловых ("s") и антисмысловых ("а") олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 2. Часть последовательности axmi-005, которая вводится в
последовательность axmi-115, выделена жирным шрифтом. Фланкирующие последовательности в каждом олигонуклеотиде представляют собой последовательности axmi-115, которые используются для отжига олигонуклеотидов на матрицу axmi-115. Число после термина "sub" в каждом названии праймера соответствует пронумерованным блокам на Фиг.2. Подобные олигонуклеотиды можно разработать для обмена доменов между разнообразными последовательностями, например, между
последовательностями AXMI-005, AXMI-113, AXMI-115, AXMI-163 и AXMI-184, описанными здесь.
Таблица 2
Олигонуклеотидный праймер
Последовательность
SEQ ID NO:
axmill5subl s
AAC ACC GGC GGC GTC AAT GGA АСА AGG
GCG CTC TTC ACC CA
axmil 15subl a
TGG GTG AAG AGC GCC CTT GTT CCA TTG ACG CCG CCG GTG TT
axmill5subl0 s
GCC CGG AGC TCA TCA ATG TCA АСА ACT GGA TCA GAA CTG GCA CCA CCT АСА TCA С
axmil 15sub 10 a
GTG ATG TAG GTG GTG CCA GTT CTG АТС CAG TTG TTG АСА TTG ATG AGC TCC GGG С
axmil 15subll s
ATG ATT GGG AGA GGT TCG GAA GCA CCC АСА TCA GCG GCA ATG AGC TGA GG
axmil 15sub 11 a
CCT CAG CTC ATT GCC GCT GAT GTG GGT GCT TCC GAA CCT CTC CCA АТС AT
axmil 15sub 12 s
СТА CAT CAC CGG CAA TAC CTT GAC GCT СТА CCA AGG AGG AGG AGG СТА CTT CCG С
axmil 15sub 12 a
GCG GAA GTA GCC TCC TCC TCC TTG GTA GAG CGT CAA GGT ATT GCC GGT GAT GTA G
axmil 15sub 14 s
CGA CAG СТА CAG CAC СТА CAG GGT GAA CTT CTC CGT CAC CGG CTG GGC CAA GGT
GAT
axmil 15subl4 a
АТС ACC TTG GCC CAG CCG GTG ACG GAG AAG TTC ACC CTG TAG GTG CTG TAG CTG TCG
axmil 15sub 15 s
GCT TCA GCG GCC TCG ACG CCA ATG TGA GGA TCA GAA АСА GCC GCG GC
axmil 15sub 15 a
GCC GCG GCT GTT TCT GAT CCT CAC ATT GGC GTC GAG GCC GCT GAA GC
axmil 15sub 16 s
GTG AAG AAC AGC CGC GAG GTG CTC TTC GAG AAG AGA TAC ATG AAT GGA AGC AGC
TAT GA
axmil 15subl6 a
TCA TAG CTG CTT CCA TTC ATG TAT CTC TTC TCG AAG AGC ACC TCG CGG CTG TTC TTC AC
axmil 15subl7 s
TTC GAG AAG GTG AAG AAC AGC GGC GCC AAG GAT GTT TCA GAG AGC TTC ACC ACC
axmil 15subl7 a
GGT GGT GAA GCT CTC TGA AAC АТС CTT GGC GCC GCT GTT CTT CAC CTT CTC GAA
axmil 15subl9 s
GCT TCT TCA TCG AGC TCA GCC AAG GCA АСА ACC TCT ATA GCA GCA CCT TCC AC
axmil 15sub 19 a
GTG GAA GGT GCT GCT ATA GAG GTT GTT GCC TTG GCT GAG CTC GAT GAA GAA GC
axmil 15sub2 s
GAA GCA AGG CGC TCT ATG TTC АСА AGG ATG GAG GCT TCA GCC AGT TCA TCG
axmil 15sub2 a
CGA TGA ACT GGC TGA AGC CTC CAT CCT TGT GAA CAT AGA GCG CCT TGC TTC
axmil 15sub20 s
CCG CCG AGA GGA CAG GAG GGC CGC TGG TGA AGT TCA GAG АСА TCA GCA TC
axmil 15sub20 a
GAT GCT GAT GTC TCT GAA CTT CAC CAG CGG CCC TCC TGT CCT CTC GGC GG
axmil 15sub21 s
AGC ACC TTC CAC AGC TTC AAT GAT GTG AGC АТС AAG TAA GGC GCG CCG
axmil 15sub21 a
CGG CGC GCC TTA CTT GAT GCT CAC АТС ATT GAA GCT GTG GAA GGT GCT
axmil 15sub3 s
CGA CAA GCT AAA GCC CAA GAC AGA ATA TGT CAT CCA GTA CAC CGT CAA G
axmil 15sub3 a
CTT GAC GGT GTA CTG GAT GAC ATA TTC TGT CTT GGG CTT TAG CTT GTC G
axmil 15sub5 s
CCT ACG AGG АСА CCA ATA АСА АСА ACC TGG AGG ACT ACC AAA CAA TTG CTG TGA AG
axmil 15sub5 a
CTT CAC AGC AAT TGT TTG GTA GTC CTC CAG GTT GTT GTT ATT GGT GTC CTC GTA GG
axmil 15sub6 s
GAG GAG TTC CAA АСА ATT ACC AAG AGG TTC ACC ACC GGC АСА GAT TTG AGC CAG ACC
axmil 15sub6 a
GGT CTG GCT CAA АТС TGT GCC GGT GGT GAA CCT CTT GGT AAT TGT TTG GAA CTC CTC
axmil 15sub7 s
CAC CTC AGA AAC AGA TTT GAA GGG CGT СТА CCT CAT CTT GAA GAG CCA AAA TGG ATAT
axmil 15sub7 a
ATA TCC ATT TTG GCT CTT CAA GAT GAG GTA GAC GCC CTT CAA АТС TGT TTC TGA GGT G
axmil 15sub9 s
TCC TGG AGG CCA AGC CAT CAG AGA AGC TGC TCA GCC CGG AGC TCA
axmil 15sub9 a
TGA GCT CCG GGC TGA GCA GCT TCT CTG ATG GCT TGG CCT CCA GGA
axmil 15subl3 s
АТС ATT CAA GAG GAG GCA ACC TCA AGC AGA ACC TCC AGC TTG АСА GCT TCA GCA
CCT ACG ACC TCA G
axmil 15sub 13 a
CTG AGG TCG TAG GTG CTG AAG CTG TCA AGC TGG AGG TTC TGC TTG AGG TTG CCT
CCT CTT GAA TGA T
axmil 15sub 18 s
GCT ATG AGG АСА TCT CAG AGA TCT TCA CCA CCA AGC TGG GCA AGG АСА ACT TC TAC A TCG AGC TCA CCG С
axmil 15sub 18 a
GCG GTG AGC TCG AT GTA G AAG TTG TCC TTG CCC AGC TTG GTG GTG AAG АТС TCT
GAG ATG TCC TCA TAG С
axmil 15sub4 s
CAA GGG CAA GCC GTC AAT CCA CCT CAA GAA TGA GAA CAC CGG СТА CAT CCA CTAC
GA GGA CAC CAA TGG
axmil 15sub4 a
CCA TTG GTG TCC TCG TAG TGG ATG TAG CCG GTG TTC TCA TTC TTG AGG TGG ATT
GAC GGC TTG CCC TTG
axmil 15sub8 s
CAA GAG CCA AAA TGG AGA TGA AGC ATG GGG AGA CAA CTT CAC CAT CCT GGA GAT
CTC GCT CTT CGA GAC ACC AGA A
TTC TGG TGT CTC GAA GAG CGA GAT CTC
axmil 15sub8 a
CAG GAT GGT GAA GTT GTC TCC CCA TGC
TTC АТС TCC ATT TTG GCT CTT G
Пример 12. Дополнительные исследования пестицидной активности
Способность инсектицидных белков действовать в качестве пестицида по отношению к вредителю часто оценивается многими способами. Один путь, известный в данной области, состоит в проведении испытания на кормление. В таком испытании на кормление, вредителя оставляют на образце, содержащем либо тестируемые композиции, либо контрольные образцы. Часто это осуществляют путем помещения материала, который следует проверить, или подходящим образом разведенного материала, на материал, который вредитель будет заглатывать, такой как искусственный рацион. Материал, который будет проверяться, может быть в жидкой, твердой форме или в виде суспензии. Материал, который будет проверяться, можно поместить на поверхность и затем предоставить ему возможность высохнуть или соединиться с пищей. Альтернативно материал, который будет проверяться, можно смешать с жидкой искусственной пищей, затем распределить в ячейки для испытания. Ячейка для испытания может представлять собой, например, чашку, блюдце или лунку планшета для микротитрования.
Испытания для сосущих вредителей (например, тли) может включать отделение проверяемого материала от насекомого путем отделения, в идеале, части, в которую могут проникнуть сосущие части рта сосущего насекомого, для предоставления возможности заглатывания исследуемого материала. Часто исследуемый материал смешивают со стимулятором питания, таким как сахароза, для стимулирования приема в пищу исследуемого соединения.
Другие типы испытаний могут включать микроинъекцию исследуемого материала в рот или кишку вредителя, а также разработку трансгенных растений с последующим тестированием способности вредителя питаться на трансгенном растении. Тестирование растения может включать выделение обычно
потребляемых частей растения, например, маленькие клетки, присоединенные к листьям, или выделение растений целиком в клетках, содержащих насекомых.
Другие способы и подходы проверки вредителей известны в данной области, и могут быть найдены, например в Robertson, J. L. & Н. К. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FL. Альтернативно, испытания обычно описываются в журналах "Arthropod Management Tests" и "Journal of Economic Entomology" или путем обсуждения с членами Энтомологического общества Америки (ESA).
Пример 13. Адаптация инсектицидных генов по изобретению для экспрессии в растениях
Каждая из кодирующих областей генов по изобретению независимо связана с соответствующими промоторными и терминаторными последовательностями для экспрессии на растениях. Такие последовательности известны в данной области и могут включать промотор актина риса или промотор убиквитина кукурузы для экспрессии в однодольных растениях, промотор UBQ3 Arabidopsis или промотор 35S CaMV для экспрессия в двудольных растениях, терминаторы nos или Pinll. Способы получения и подтверждения конструкций промотор-ген-терминатор также известны в данной области.
Пример 14. Трансформация генов по изобретению в клетки растений путем Agrobacteriom-обусловленной трансформации
Колосья собирают спустя 8-12 дней после опыления. Зародыши отделяют от колосьев, и зародыши размером в 0,8-1,5 мм используют для трансформации. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую среду для инкубации и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Впрочем, нет необходимости per se инкубировать зародыши в течение ночи. Зародыши контактируют со штаммом Agrobacterium, содержащим соответствующие векторы для Ti-плазмид-обусловленного переноса в течение 5-10 минут, и затем помещают на среду для совместного культивирования в течение 3 дней (25°С в темноте). После совместного культивирования эксплантаты пересаживают на среду для периода восстановления в течение пяти дней (при 25°С в темноте) . Эксплантаты инкубируют
в селективной среде в течение времени вплоть до восьми недель, в зависимости от природы и особенностей используемой специфической селекции. После периода селекции получившийся каллюс перемещают на среду для созревания зародышей до тех пор, пока не будет наблюдаться формирование зрелых соматических зародышей. Образующиеся зрелые соматические зародыши затем помещают под низким светом и начинают процесс регенерации, как известно в данной области. Образующимся проросткам предоставляют возможность укорениться на среде для укоренения, и получившиеся растения переносят в горшочки для рассады и размножают как трансгенные растения.
Пример 15. Трансформация клеток кукурузы инсектицидными генами по изобретению
Початки кукурузы собирают спустя 8-12 дней после опыления. Зародыши отделяют от колосьев, и зародыши размером в 0,8-1,5 мм используют для трансформации. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую среду для инкубации, такую как среда DN62A5S (3,98 г/л солей N6; 1 мл/л (ЮООх сток) витаминов N6; 800 мг/л L-аспарагина; 100 мг/л миоинозитола; 1,4 г/л L-пролина; 100 мг/л казаминовых кислот; 50 г/л сахарозы; 1 мл/л (из стока 1 мг/мл) 2,4-D) и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте.
Образующиеся эксплантаты переносят на сетчатые квадратные чашки (30-40 на чашку), переносят на осмотическую среду на 3045 минут, затем переносят на пластину для облучения (См., например, патентную публикацию РСТ № WO/0138514 и Патент США № 5240842) .
Конструкции ДНК, разработанные для экспрессии генов по изобретению в клетках растений, проникают в растительную ткань при помощи аэрозольного лучевого акселератора с использованием условий, по существу, как описано в патентной публикации РСТ № WO/0138514. После облучения зародыши инкубируют в течение 30 минут на осмотической среде, затем помещают на среда для инкубации на ночь при 25°С в темноте. Для отделения неправильно поврежденных облученных эксплантатов, их инкубируют в течение, по меньшей мере, 24 часов до передачи на восстановительную
среду. Зародыши затем распределяют на среде периода восстановления, в течение 5 дней, при 25 °С в темноте, затем переносят на селективную среду. Эксплантаты инкубируют на селективной среде в течение восьми недель, в зависимости от природы и особенностей используемой специфической селекции. После периода селекции получившийся каллюс перемещают на среду для созревания зародышей до тех пор, пока не будет наблюдаться формирование зрелых соматических зародышей. Образующиеся зрелые соматические зародыши затем помещают под низким светом и начинают процесс регенерации, как известно в данной области. Образующимся проросткам предоставляют возможность укорениться на среде для укоренения, и получившиеся растения переносят в горшочки для рассады и размножают как трансгенные растения. Ма териалы
Среда DN62A5S
Компоненты
на литр
Источник
Chu'S N6 основная смесь солей (Кат. Номер С 416)
3,98 г/л
Phytotechnology Labs
Chu's N6 раствор витаминов (Кат. Номер С 149)
1 мл/л (ЮООх сток)
Phytotechnology Labs
L-Аспарагин
800 мг/л
Phytotechnology Labs
Мио-инозитол
100 мг/л
Sigma
L-Пролин
1,4 г/л
Phytotechnology Labs
Казаминовые кислоты
100 мг/л
Fisher Scientific
Сахароза
50 г/л
Phytotechnology Labs
2,4-D (Кат. Номер D-7299)
1 мл/л (из стока 1 мг/мл)
Sigma
рН раствора доводят до 5,8 при помощи IN КОН/IN КС1, добавляют Gelrite (Sigma) до 3 г/л и автоклавируют. После охлаждения до 50 °С добавляют 2 мл/л стокового раствора с 5
мг/мл Silver Nitrate (Phytotechnology Labs). Эта пропись позволяет изготовить приблизительно 20 плашек.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в спецификации, показывают уровень квалификации специалистов в данной области, к которой принадлежит это изобретение. Все публикации и патентные заявки включены здесь в качестве ссылки в той же самой степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально обозначены, чтобы быть включенной в качестве ссылки.
Несмотря на то, что предшествующее изобретение было описано в некоторых деталях посредством иллюстрации и примера в целях ясности понимания, должно быть очевидным, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены в рамках прилагаемых пунктов формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Kimberly S. Sampson Daniel J. Tomso Nadine Carozzi Tracy Hargiss Michael G. Koziel Nicholas B. Duck Shruti Agarwal Brian McNulty Chris Campbell Volker Heinrichs
<120> AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163
И AXMI-184: ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 045600/374397
<150> 61/158,953 <151> 2009-03-10
<150> 61/077,812 <151> 2008-07-02
<160> 61
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 2370 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 1
atgaatatga
aatggcattt
gatacaggtg
atttctggta
ttaaatacag
aatgatgtta
attacatcta
tacttaagta
cttattaact
gaaaaatttg
tcgcctgctg
aaaaatgacg
aataatttat
gtgaaaacaa
ctacaagcaa
attgattata
aacatccttc
agtgatgaag
gaaatgagca
tatcaagttg
tgtccagatc
gtaattacta
aattcttatg
gaagcggagt
atcagtgaaa
agattaatta
agcaataaag
aatgggaact
gtagatcata
ttttcacaat
ataatactaa atggatttgc gtaatctaac aattggatgg aattatctaa ataacaaact tgttaagtga agcaattgca ctacacttac aagaattaac atattcttga ttgatggttt tcgggcgttc gtggcagtga aagcttttct cttctattat ctacactttc atgcaaagat atgattcaat ataaggattc aatctgaaca aaattgattt attcttctac ataggacgtt catttttgac ctttaacatg aaactaaatt tagagggaga caggcggagt ttattggaga attaaacgca cactggtatc cttagacgaa ggtaaatggg ggaaatctta cgatgcgata tgtaatgaag agaaatttct tgaaattaca ttttgctaca tgagttaact tgaattttac agctttaaaa agtaggaaat tactttaaca gaatgaacat taatactttt gattgtggaa cacagtatta cttatcggag aatttattat tactaagaaa aggagaaatt aagtgctaaa tccgattaat taaatcatat gatcgtcccg aaacttagag gaatggtact taagttaaaa agggccctac aaagacatta atcctaaaga agcttaaatg aaaattgcaa aatacgatgc caaaattatg gataaattag cctgcatatc gaaaccactt gaattaactg cttaatacat actgcttcag gtttataatt acatgccgaa ttaaataagg tctaatccta gctaaaccag aaagtatatg gttatttatg acaaataata atgaagactt gacttaaata gatgatggag gggtttggcc ttaagagaac ccaagtggtt ccgtggatag agagctttat ccgaaaactg cgagttttat tgaatatgat atcagcagtt atcttatcgc atgaacagaa ttcatatata cgctaagtct atattattaa aacggattaa taaaagtaaa aactagcgaa tccacgatgt aattaattgc tcttaattgt aattattagg aaaaagagga attatgcaaa gacatgcatt aggctaagct gtgatatgga tagtatttcc taagatatga agaagaaagt tgtatatgcc tccaagctga tactgttagc ttattagtaa caaataataa atgttcataa agtatgtaat tgattatttt ttttaaaacg actaaatgag acagggaaac tcaagtctta tctacctaaa gcaaatagaa cgtaaatgtt atatgtgaat aaaggatagc aagtgttaca aatggtagga taaagaaaat attaacagct cttagcagat atttagagta agttaaagga ggttgggttt aaaacaaaat taaattattg aaatgaatat ggtaacagct agaatcaagt gttaggtgtc tgaaaattca aacagactta tattgtagaa gaatgcgtat ggacggagga ccaatatact 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
gttaaaggaa gatacaaata gatttaaagg aactttacaa gtaaataatt cagggaggag gtgaattttt tttgaaaaac gggaaagata gtaaagttta aaccttctat acaatttaga gagtgtattt ttttggaaat ggattcgcac gaggaaatct ctgtgaccgg gatatatgag acttttatat acgatgtctc tcatttaaaa agattatcaa aattttaaaa tagtccttct gggatcaact aaaacaaaac agatgctaat cggtgctaaa agagctttct aattaagtaa aatgaaaata actattacta agtcaaaatg gaaaagttat catattagcg cttcaattag gtaaggatta gatgtttctg caagggaata ctggatatat aacgttttac gagatgaagc taagtccaga gtaatacact acagtttttc gaaattctag aaattttcac atttatatgg tcattatgaa tacaggaact ctggggagat attaatcaat cactctctat aacttataga ggaagtgtta tacaaaattg tggtcctctt
I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2370
<210> 2 <211> 2385 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 2
atgaacatga
aatggcattt
gatacaggtg
atttctggta
ttaaatacag
aatgatgtta
attacctcta
tacctaagta
cttattaact
gaaaaatttg
tctcctgcag
aaaaatgatg
aataatttat
gtgaaaacaa
ctgcaagcaa
attgattata
aacatccttc
agcgatgagg
gaaatgatta
tatcaagttg
tgtccagata
gtgattacag
aattattatg
gaagcagagt
atcagtgaaa
agactggtaa
agcaataaag
aatggggata
gttgatcata
ttttcacaat
gtaaaaggaa
gataaaaata
gattcttcag
aactttctaa
gaaaattgga
acaggtggga
gtaagatttt
gtactgtttg
acttttacta
tttggaagta ataatactaa atggatttgc gtgatctaac aattggatgg aattatctaa ataacaaact tgttaagtga aacagttgca ctacacttac aggaattaac atattcttga tggatggttt tcgggcgttc gtggcagtga aagcttttct cttctattat ctacactttc atgcggaagt atgatccaag ataagcagtc aatctcaaca aaattatttt agttctcttc atagtacgtt catttttgac ctttaacgtg caacaaaatt ttgaggctga caggtggggt ttattggaga atacttctat ataatttaga atgtttactt ttacagaaat ttggaatggg ggtcaatttt ctttaatggt aaaaaagtta caaaatcgat aagatgttgc attaagcaca cactggtatc cctagacgaa ggtaaatgga ggaaatatta tgatgcgata tgtaatgaaa agaaatttct tgaaattaca ttttgctaca tgagttaact tgaattttat agctttaaaa ggtcggaaat tactttaaca gaatgaacat taatactttt gattattcaa tccagcgtta attatctgaa aatgtattat tacaaagaaa aggagatatc aagtgttagt cccaattaaa taaatcatat aattgtccca caacatagaa gaatggaact taagttgaaa ttatttgaaa ggcttttcaa agtgtttaaa taggcctaag tggtagtaat aaaacaaaat aattggtaag tgtgaatgat tcaagataac atacttttat agagccttac aaagacatta attttaaaga agcttaaatg aaaattgcaa aatacgatgc caaaattatg gataaattgg cctgcgtatc gaaactaatt gagttaactg cttaatacat actgcatcgg gtttataact acatgccgaa ttaaataagg tctaatccta gctgaaccag aaagtgtatc actgtgtatg ctgcataata aagaacagtt gacttaaata aacgatgcta ggattcggac ttaagggaaa cctaatggtt ccatggaagg aaagctctgt tcgaaaactg gataaaaaaa actattacta tgcaaaaatg gaagtggtaa catgtaaacc ctccaattag gctaaggtta tctgaaggtg ttctatgtag aatttttcta caagttttat tgaacatgat atcagcagtt atcttatcgc atgaacaaaa tgcatatata cgctaagtct atattattaa aacggattaa taaaagtaaa aactagcgaa tccacgatgt aattaattac tcttaattgt aattattagg aaaaagagga attatataaa gacatgcttt aggctaaact gtgatatgga taacattccc taaggtatga agaagttagt tttatatgcc taacagttga ttctgttagc ttattagtaa gaaataataa acactcaaga agtatataat atgaaaatgt aaaggtttac gctataaagc gcccagaatt ctgattcact atagttattc ttataaggaa ttttagaagg aactttctaa ttaga tgattatttt ttttaaaacg actaaatgaa acagggaaac tcaagtttta tctacctaaa gcaaatagaa cgtaaatgta atatgtgaac aaaggatggc aagtgtaaca aatggtaggg taaagaaaat attaacagct cttagcagat atttagagta aactaaagga ggtgggattt aacaacaaat taaaatatta aaatgaatat ggtgatagca aaaatcaagt gctaggtgtt tgaaagttca aacagattta tttggtggaa aaatgcgtat tgatggggaa tcaatatact tatttatgaa tacagaattg ttggggagac gataaaagta tttgcttttt aacctataga ttcaagtgaa tgtttctgaa tgagggcact 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2385
<210> 3 <211> 2409 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 3
atgaacatga ataatactaa attaaacgca agggccttac caagttttat tgattatttt 60 aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaacatgat ttttaaaacg 120 gatacaggtg gtgatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgaa 180 atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240 ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300 aatgatgtta ataacaaact agatgcgata aatacgatgc ttaacatata tctacctaaa 360 attacatcta tgttaagcga tgtaatgaaa caaaattatg cgctaagtct gcagatagaa 420 tacctaagta gacagttaca ggaaatttca gataagttag atgttattaa tttaaatgtt 480 ttaattaatt ctactcttac tgaaatcaca ccttcatatc aacgtattaa atatgtaaat 540 gagaaatttg ataaattaac atttgccaca gaaagcactc taagagcaaa acaaggaatt 600 tttaacgagg atagttttga taataatact cttgaaaatt taactgatct agctgaacta 660 gctaaaagta taaccaaaaa tgatgtggat agtttcgaat tttatcttca cacatttcat 720 gatgtattaa ttggaaataa tttatttgga cgatcggctt taaaaacagc ttcagaatta 780 attactaaag acgagataaa gacaagtgga agtgagattg gaaaagttta tagtttctta 840 attgtgctaa cttctttaca agctaaagcc tttctcactt taacaacatg tagaaaatta 900 ttgggcttat cagatattga ttatacttct attatgaatg aacatctaaa taatgaaaaa 960 aatgaatttc gtgataacat acttcctgca ctgtcgaata agttttctaa ccctagctac 1020 gcaaaaacta taggtagtga caattatgca aaagttattt tagaatctga accaggttat 1080 gctttagtcg gattcgaaat tattaatgac ccaatcccgg tattaaaagc gtataaagca 1140 aaactaaaac aaaattatca agttgataat cagtcgttat cagagattgt ttatttagat 1200 atcgataaac tattttgtcc ggaaaattca gaacaaaaat attatactaa aaatctgaca 1260 tttcctgatg gctatgttat tactaaaatt acctttgaaa aaaaactgaa caacctaatt 1320 tatgaagcaa cagcaaattt ttatgaccca tctacaggag atattgactt aaataagaag 1380 caagtggaat ctacttttcc tcaaacggat tatattacta tggatatagg tgatgatgat 1440 ggtatttata tgccgttagg cgttatcagt gaaacgtttt tgactcctat taatagtttt 1500 ggattagaag ttgacgcgaa atcgaaaaca ttaaccttaa aatgtaaatc ttacctgcga 1560 gaatatttat tagagtccga tctaaaaaat aaagaaacag gcttgattgc cccgccaaat 1620 gtttttatta gtaatgttgt gaaaaattgg gatatagagg aagatagtct agaaccatgg 1680 gtagcaaata acaaaaatgc ctatgttgat aatacaggcg gtatagaaag atctaaagcc 1740 ctctttactc aaggtgacgg ggaattctca caatttattg gtgataaatt aaaacctaat 1800 acagattata ttattcaata tactgtaaaa ggaaaaccag ccatttattt aaaaaataaa 1860 agtactggat atattacgta cgaggataca aacggtaatt ctgaagaatt tcaaactata 1920 gctgtaaaat tcacttcaga aactgatctt tcacaaactc atttagtttt taaaagtcaa 1980 aatggttatg aggcttgggg agacaatttt attattttag aagctaagct atttgaaact 2040 cctgaaagtc cagaattgat aaaatttaat gattgggaaa gatttggtac tacttacatt 2100 acaggaaatg agcttagaat cgatcatagt cgtggaggtt attttagaca atctcttaat 2160 atagacagtt attcaactta tgatttgagc ttttctttta gtggattatg ggctaaggtt 2220 attgtgaaaa attcccgagg ggtagtattg tttgaaaaag tgaaaaacaa cggttcatca 2280 tatgaagata ttagtgaaag ttttactacc gcatcaaata aggatggatt ttttatagaa 2340 ctaacagccg aaagaacgag ctcaactttc catagctttc gtgatatttc tattaaggaa 2400 aagattgaa 2409
<210> 4 <211> 789 <212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis <400> 4
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
15 10 15
lie Asp Tyr Phe Asn Gly lie Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lie Lys Asp
20 25 30
lie Met Asn Met lie Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu lie Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Glu lie Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu He Ala Gin Gly Asn 65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu He Leu Lys He Ala Asn Glu Gin
85 90 95
Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala He Asn Thr
100 105 110
Met Leu His' He Tyr Leu Pro Lys He Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 115 120 125
Met Lys Gin Asn 130
Gin Leu Gin Glu 145
Leu He Asn Ser
Lys Tyr Val Asn 180
Thr Leu Lys Val 195
Leu Thr Glu Leu 210
Asp Gly Phe Glu 225
Asn Asn Leu Phe
Ala Lys Glu Asn 260
Asn Phe Leu He 275
Leu Thr Thr Cys 290
Ser He Met Asn 305
Asn He Leu Pro
Lys Val Lys Gly 340
Pro Gly His Ala 355
Val Leu Lys Val 370
Lys Asp Ser Leu 385
Cys Pro Asp Gin
Pro Asn Glu Tyr 420
Thr Leu Arg Tyr 435
Glu He Asp Leu 450
Arg Thr Leu Ser 465
He Ser Glu Thr
Asp Glu Asn Ser 500
Glu Leu Leu Leu 515
Val Pro Pro Ser 530
Glu Gly Glu Asn 545
Val Asp His Thr
Lys Asp Gly Gly 580
Thr Glu Tyr Val 595
Leu Lys Asn Glu 610
Asn Leu Glu Asp 625
Tyr Ala Leu Ser 135
He Ser Asp Lys 150
Thr Leu Thr Glu 165
Glu Lys Phe Glu
Lys Lys Asp Ser 200
Thr Glu Leu Ala 215
Phe Tyr Leu Asn 230
Gly Arg Ser Ala 245
Val Lys Thr Ser
Val Leu Thr Ala 280
Arg Lys Leu Leu 295
Glu His Leu Asn 310
Thr Leu Ser Asn 325
Ser Asp Glu Asp
Leu Val Gly Phe 360
Tyr Glu Ala Lys 375
Ser Glu Val He 390
Ser Glu Gin He 405
Val He Thr Lys
Glu Val Thr Ala 440
Asn Lys Lys Lys 455
Ala Lys Asp Asp 470
Phe Leu Thr Pro 485
Arg Leu He Thr
Ala Thr Asp Leu 520
Gly Phe He Ser 535
Leu Glu Pro Trp 550
Gly Gly Val Asn 565
Phe Ser Gin Phe
He Gin Tyr Thr 600
Asn Thr Gly Tyr 615
Tyr Gin Thr He 630
Leu Gin He Glu 140
Leu Asp He He 155
He Thr Pro Ala 170
Glu Leu Thr Phe 185
Ser Pro Ala Asp
Lys Ser Val Thr 220
Thr Phe His Asp 235
Leu Lys Thr Ala 250
Gly Ser Glu Val 265
Leu Gin Ala Lys
Gly Leu Ala Asp 300
Lys Glu Lys Glu 315
Thr Phe Ser Asn 330
Ala Lys Met He 345
Glu Met Ser Asn
Leu Lys Gin Asn 380
Tyr Gly Asp Met 395
Tyr Tyr Thr Asn 410
He Asp Phe Thr 425
Asn Ser Tyr Asp
Val Glu Ser Ser 460
Gly Val Tyr Met 475
He Asn Gly Phe 490
Leu Thr Cys Lys 505
Ser Asn Lys Glu
Asn He Val Glu 540
He Ala Asn Asn 555
Gly Thr Arg Ala 570
He Gly Asp Lys 585
Val Lys Gly Lys
He His Tyr Glu 620
Thr Lys Arg Phe 635
Tyr Leu Ser Lys
Asn Val Asn Val 160
Tyr Gin Arg He 175
Ala Thr Glu Thr 190
He Leu Asp Glu 205
Lys Asn Asp Val
Val Met Val Gly 240
Ser Glu Leu He 255
Gly Asn Val Tyr 270
Ala Phe Leu Thr 285
He Asp Tyr Thr
Glu Phe Arg Val 320
Pro Asn Tyr Ala 335
Val Glu Ala Lys 350
Asp Ser He Thr 365
Tyr Gin Val Asp
Asp Lys Leu Leu 400
Asn He Val Phe 415
Lys Lys Met Lys 430
Ser Ser Thr Gly 445
Glu Ala Glu Tyr
Pro Leu Gly Val 480
Gly Leu Gin Ala 495
Ser Tyr Leu Arg 510
Thr Lys Leu He 525
Asn Gly Asn Leu
Lys Asn Ala Tyr 560
Leu Tyr Val His 575
Leu Lys Pro Lys 590
Pro Ser He His 605
Asp Thr Asn Asn
Thr Thr Gly Thr 640
Asp Leu Lys Gly
Ala Trp Gly Asp 660
Leu Leu Ser Pro 675
Ser Thr His He 690
Gly Asn Leu Lys 705
Val Asn Phe Ser
Arg Glu Val Leu 740
Ser Glu He Phe 755
Leu Ser Gin Gly 770
Asp Val Ser He 785
<210> 5 <211> 795 <212> PRT <213> Bacillus
<400> 5
Met Asn Met Asn 1
He Asp Tyr Phe 20
He Met Asn Met 35
Asp Glu He Leu 50
Leu Asp Gly Val 65
Leu Asn Thr Glu
Asn Gin Val Leu 100
Met Leu His He 115
Met Lys Gin Asn 130
Gin Leu Gin Glu 145
Leu He Asn Ser
Lys Tyr Val Asn 180
Asn Leu Lys Val 195
Leu Thr Glu Leu 210
Asp Gly Phe Glu 225
Asn Asn Leu Phe
Thr Lys Glu Asn 260
Asn Phe Leu He 275
Val Tyr Leu He 645
Asn Phe Thr He
Glu Leu He Asn 680
Ser Gly Asn Thr 695
Gin Asn Leu Gin 710
Val Thr Gly Asp 725
Phe Glu Lys Arg
Thr Thr Lys Leu 760
Asn Asn Leu Tyr 775
Lys
thuringiensis
Asn Thr Lys Leu 5
Asn Gly He Tyr
He Phe Lys Thr 40
Lys Asn Gin Gin 55
Asn Gly Ser Leu 70
Leu Ser Lys Glu 85
Asn Asp Val Asn
Tyr Leu Pro Lys 120
Tyr Ala Leu Ser 135
He Ser Asp Lys 150
Thr Leu Thr Glu 165
Glu Lys Phe Glu
Lys Lys Asp Gly 200
Thr Glu Leu Ala 215
Phe Tyr Leu Asn 230
Gly Arg Ser Ala 245
Val Lys Thr Ser
Val Leu Thr Ala 280
Leu Lys Ser Gin 650
Leu Glu He Ser 665
Val Asn Asn Trp
Leu Thr Leu Tyr 700
Leu Asp Ser Phe 715
Ala Asn Val Arg ¦730
Tyr Met Ser Gly 745
Gly Lys Asp Asn
Gly Gly Pro Leu 780
Ser Thr Arg Ala 10
Gly Phe Ala Thr 25
Asp Thr Gly Gly
Leu Leu Asn Glu 60
Asn Asp Leu He 75
He Leu Lys He 90
Asn Lys Leu Asp 105
He Thr Ser Met
Leu Gin He Glu 140
Leu Asp He He 155
He Thr Pro Ala 170
Glu Leu Thr Phe 185
Ser Pro Ala Asp
Lys Ser Val Thr 220
Thr Phe His Asp 235
Leu Lys Thr Ala 250
Gly Ser Glu Val 265
Leu Gin Ala Lys
Asn Gly Asp Glu 655
Pro Ser Glu Lys 670
He Arg Thr Gly 685
Gin Gly Gly Gly
Ser Thr Tyr Arg 720
He Arg Asn Ser 735
Ala Lys Asp Val 750
Phe Tyr He Glu 765
Val Lys Phe Asn
Leu Pro Ser Phe 15
Gly He Lys Asp 30
Asp Leu Thr Leu 45
He Ser Gly Lys
Ala Gin Gly Asn 80
Ala Asn Glu Gin 95
Ala He Asn Thr 110
Leu Ser Asp Val 125
Tyr Leu Ser Lys
Asn Val Asn Val 160
Tyr Gin Arg He 175
Ala Thr Glu Thr 190
He Leu Asp Glu 205
Lys Asn Asp Val
Val Met Val Gly 240
Ser Glu Leu He 255
Gly Asn Val Tyr 270
Ala Phe Leu Thr 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp He Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser He Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val 305 310 315 320
Asn He Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr He
325 330 335
Lys Thr Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Glu Val He He Gin Ala Glu
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met He Asn Asp Pro Ser Pro
355 360 365
Ala Leu Lys Val Tyr Gin Ala Lys Leu Thr Thr Asn Tyr Gin Val Asp
370 375 380
Lys Gin Ser Leu Ser Glu Thr Val Tyr Gly Asp Met Asp Lys He Leu 385 390 395 400
Cys Pro Asp Lys Ser Gin Gin Met Tyr Tyr Leu His Asn He Thr Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val He Thr Glu He He Phe Thr Lys Lys Lys Asn
420 425 430
Ser Leu Arg Tyr Glu Val He Ala Asn Tyr Tyr Glu Phe Ser Ser Gly
435 440 445
Asp He Asp Leu Asn Lys Lys Leu Val Lys Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Ser Thr Leu Ser Val Ser Asn Asp Ala He Tyr Met Pro Leu Gly Val 465 470 475 480
He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro He Lys Gly Phe Gly Leu Thr Val
485 490 495
Asp Glu Ser Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu He Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Ala Thr Lys Leu He
515 520 525
Val Pro Pro Asn Gly Phe He Ser Asn Leu Val Glu Asn Gly Asp He
530 535 540
Glu Ala Asp Asn He Glu Pro Trp Lys Gly Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Thr Gin
565 570 575
Asp Asp Gly Glu Phe Ser Gin Phe He Gly Asp Lys Leu Lys Ser Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr He He Gin Tyr Thr Val Lys Gly Asn Thr Ser He Tyr
595 600 605
Leu Lys Asp Lys Lys Asn Glu Asn Val He Tyr Glu Asp Lys Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Ala Phe Gin Thr He Thr Lys Arg Phe Thr Thr Glu Leu 625 630 635 640
Asp Ser Ser Asp Val Tyr Leu Val Phe Lys Cys Lys Asn Gly Tyr Lys
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Leu He Thr Glu He Arg Pro Lys Glu Val
660 665 670
Val Ser Pro Glu Leu He Lys Val Glu Asn Trp He Gly Met Gly Gly
675 680 685
Ser Asn His Val Asn Pro Asp Ser Leu Leu Leu Phe Thr Gly Gly Arg
690 695 700
Ser He Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Arg 705 710 715 720
Val Arg Phe Ser Leu Met Val He Gly Lys Ala Lys Val He He Arg
725 730 735
Asn Ser Ser Glu Val Leu Phe Glu Lys Ser Tyr Val Asn Asp Ser Glu
740 745 750
Gly Val Leu Glu Gly Val Ser Glu Thr Phe Thr Thr Lys Ser He Gin
755 760 765
Asp Asn Phe Tyr Val Glu Leu Ser Asn Glu Gly Thr Phe Gly Ser Lys
770 775 780
Asp Val Ala Tyr Phe Tyr Asn Phe Ser He Arg 785 790 795
<210> б <211> 803 <212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 6
Met Asn Met Asn 1
He Asp Tyr Phe 20
He Met Asn Met 35
Asp Glu He Leu 50
Leu Asp Gly Val 65
Leu Asn Thr Glu
Asn Gin Val Leu 100
Met Leu Asn He 115
Met Lys Gin Asn 130
Gin Leu Gin Glu 145
Leu He Asn Ser
Lys Tyr Val Asn 180
Thr Leu Arg Ala 195
Asn Thr Leu Glu 210
Thr Lys Asn Asp 225
Asp Val Leu He
Ala Ser Glu Leu 260
He Gly Lys Val 275
Lys Ala Phe Leu 290
Asp He Asp Tyr 305
Asn Glu Phe Arg
Asn Pro Ser Tyr 340
He Leu Glu Ser 355
Asn Asp Pro He 370
Asn Tyr Gin Val 385
He Asp Lys Leu
Lys Asn Leu Thr 420
Glu Lys Lys Leu 435
Asn Thr Lys Leu 5
Asn Gly He Tyr
He Phe Lys Thr 40
Lys Asn Gin Gin 55
Asn Gly Ser Leu 70
Leu Ser Lys Glu 85
Asn Asp Val Asn
Tyr Leu Pro Lys 120
Tyr Ala Leu Ser 135
He Ser Asp Lys 150
Thr Leu Thr Glu 165
Glu Lys Phe Asp
Lys Gin Gly He 200
Asn Leu Thr Asp 215
Val Asp Ser Phe 230
Gly Asn Asn Leu 245
He Thr Lys Asp
Tyr Ser Phe Leu 280
Thr Leu Thr Thr 295
Thr Ser He Met 310
Asp Asn He Leu 325
Ala Lys Thr He
Glu Pro Gly Tyr 360
Pro Val Leu Lys 375
Asp Asn Gin Ser 390
Phe Cys Pro Glu 405
Phe Pro Asp Gly
Asn Asn Leu He 440
Asn Ala Arg Ala 10
Gly Phe Ala Thr 25
Asp Thr Gly Gly
Leu Leu Asn Glu 60
Asn Asp Leu He 75
He Leu Lys He 90
Asn Lys Leu Asp 105
He Thr Ser Met
Leu Gin He Glu 140
Leu Asp Val He 155
He Thr Pro Ser 170
Lys Leu Thr Phe 185
Phe Asn Glu Asp
Leu Ala Glu Leu 220
Glu Phe Tyr Leu 235
Phe Gly Arg Ser 250
Glu He Lys Thr 2 65
He Val Leu Thr
Cys Arg Lys Leu 300
Asn Glu His Leu 315
Pro Ala Leu Ser 330
Gly Ser Asp Asn 345
Ala Leu Val Gly
Ala Tyr Lys Ala 380
Leu Ser Glu He 395
Asn Ser Glu Gin 410
Tyr Val He Thr 425
Tyr Glu Ala Thr
Leu Pro Ser Phe 15
Gly He Lys Asp 30
Asp Leu Thr Leu 45
He Ser Gly Lys
Ala Gin Gly Asn 80
Ala Asn Glu Gin 95
Ala He Asn Thr 110
Leu Ser Asp Val 125
Tyr Leu Ser Arg
Asn Leu Asn Val 160
Tyr Gin Arg He 175
Ala Thr Glu Ser 190
Ser Phe Asp Asn 205
Ala Lys Ser He
His Thr Phe His 240
Ala Leu Lys Thr 255
Ser Gly Ser Glu 270
Ser Leu Gin Ala 285
Leu Gly Leu Ser
Asn Asn Glu Lys 320
Asn Lys Phe Ser 335
Tyr Ala Lys Val 350
Phe Glu He He 365
Lys Leu Lys Gin
Val Tyr Leu Asp 400
Lys Tyr Tyr Thr 415
Lys He Thr Phe 430
Ala Asn Phe Tyr 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp He Asp Leu Asn Lys Lys Gin Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gin Thr Asp Tyr He Thr Met Asp He Gly Asp Asp Asp 465 470 475 480
Gly He Tyr Met Pro Leu Gly Val He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
He Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu He Ala Pro Pro Asn Val Phe He Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp He Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp 545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly He Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gin Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gin Phe
580 585 590
He Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr He He Gin Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala He Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
He Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gin Thr He 625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gin Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gin Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe He He
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu He Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr He Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg He Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gin Ser Leu Asn 705 710 715 720
He Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val He Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp He Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe He Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp He Ser He Lys Glu 785 790 795 800
Lys He Glu
<210> 7 <211> 2388 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая AXMI-005 w/ с-концевое расширение
<400> 7
atgaacatga асаасассаа gctcaatgca aatggcatct atggcttcgc caccggcatc gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60 aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120 atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180 agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240 aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360 atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420 tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480 ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540 gagaagtttg aggagctcac cttcgccacc gagacaacat tgaaggtgaa gaaggacagc 600 tcgccggcgg acatcctgga tgagctcacc gagctaacag agctggccaa gagcgtcacc 660 aagaatgatg ttgatggctt cgagttctac ctcaacacct tccatgatgt gatggtgggc 720 aacaacctct tcggccgctc ggcgctcaag acggcgtcgg agctgatcgc caaggagaat 780 gtcaagacaa gtggatcaga ggtgggcaat gtctacaact tcctcatcgt gctgacggcg 840 ctgcaagcca aggccttcct caccttgaca acctgccgca agttgctggg cctcgccgac 900 atcgactaca cctccatcat gaatgagcac ctcaacaagg agaaggagga gttccgcgtc 960 aacatcctgc caacattgag caacaccttc agcaacccca actacgccaa ggtgaagggc 1020 tcagatgaag atgccaagat gattgtggag gccaagcctg gccatgctct ggtgggcttc 1080 gagatgagca acgacagcat caccgtgctg aaggtctacg aggccaagct gaagcagaac 1140 taccaggtgg acaaggacag cttgtctgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgcta 1200 tgtccagatc aaagcgagca gatctactac accaacaaca tcgtctttcc aaatgaatat 1260 gtcatcacca agatcgactt caccaagaag atgaaaacat tgagatatga ggtgacggcc 1320 aacagctacg acagcagcac cggcgagatc gacctcaaca agaagaaggt ggagagctca 1380 gaagctgagt acaggacgct ctccgccaag gatgatggcg tctacatgcc gctcggcgtc 1440 atctcagaaa ccttcttgac gcccatcaat ggcttcggcc tccaagctga tgagaacagc 1500 aggctcatca ccttgacctg caagagctac ctcagggagc tgctgctggc caccgacctc 1560 agcaacaagg agacaaagct catcgtgccg ccatcaggct tcatcagcaa catcgtggag 1620 aatggcaacc tggaaggaga gaacctggag ccatggatag ccaacaacaa gaatgcttat 1680 gttgatcaca ccggcggcgt caatggaaca agggcgctct atgttcacaa ggatggaggc 1740 ttcagccagt tcatcggcga caagctgaag eccaagacag aatatgtcat ccagtacacc 1800 gtcaagggca agccatcaat ccacctcaag aatgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860 gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcacca agaggttcac caccggcacc 1920 gacctcaagg gcgtctacct catcttgaag agccaaaatg gagatgaagc atggggagac 1980 aacttcacca tcctggagat ctcgccatca gagaagctgc tctcgccgga gctcatcaat 2040 gtcaacaact ggatcagaac tggaagcacc cacatcagcg gcaacacctt gacgctctac 2100 caaggaggag gaggcaacct caagcagaac ctccagcttg acagcttctc cacctacagg 2160 gtgaacttct ccgtcaccgg cgacgccaat gtgaggatca gaaattcaag ggaggtgctc 2220 ttcgagaaga gatacatgag cggcgccaag gatgtttctg agatcttcac caccaagctg 2280 ggcaaggaca acttctacat cgagctgagc caaggcaaca acctctatgg agggccgctg 2340 gtgaagttca atgatgtgag catcaagcat caccaccatc atcactaa 2388
<210> 8 <211> 2430 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая AXMI-113 w/ с-концевое расширение
<400> 8
atgaacatga асаасассаа gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60 aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120 gacaccggcg gcgacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180 atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240 ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300 aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tcaacatcta cctgccaaag 360 atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420 tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg atgtcatcaa cctcaatgtg 480 ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccaagctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540 gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600 ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660 gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720 gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780 atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840 atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900 ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020 gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080 gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140 aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200 atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 12 60 ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320 tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380 caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440 ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500 ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560 gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620 gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680 gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740 ctcttcaccc aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800 accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860 agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920 gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980 aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040 ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100 accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160 atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220 attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 22 8 0 tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340 ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400 aagattgaac atcaccacca tcatcactaa 2430
<210> 9 <211> 795 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> AXMI-005 w/ с-концевое расширение
<400> 9
Met
Asn
Met
Asn
Asn
Thr
Lys
Leu
Asn
Ala
Arg
Ala
Leu
Pro
Ser
Phe
Asp
Tyr
Phe
Asn
Gly
Tyr
Gly
Phe
Ala
Thr
Gly
Lys
Asp
Met
Asn
Met
Phe
Lys
Thr
Asp
Thr
Gly
Gly
Asn
Leu
Thr
Leu
Asp
Glu
Leu
Lys
Asn
Gin
Gin
Leu
Leu
Asn
Glu
Ser
Gly
Lys
Leu
Asp
Gly
Val
Asn
Gly
Ser
Leu
Asn
Asp
Leu
Ala
Gin
Gly
Asn
Leu
Asn
Thr
Glu
Leu
Ser
Lys
Glu
Leu
Lys
Ala
Asn
Glu
Gin
Asn
Gin
Val
Leu
Asn
Asp
Val
Asn
Asn
Lys
Leu
Asp
Ala
Asn
Thr
100
105
110
Met
Leu
His
Tyr
Leu
Pro
Lys
Thr
Ser
Met
Leu
Ser
Asp
Val
115
120
125
Met
Lys
Gin
Asn
Tyr
Ala
Leu
Ser
Leu
Gin
Glu
Tyr
Leu
Ser
Lys
130
135
140
Gin
Leu
Gin
Glu
Ser
Asp
Lys
Leu
Asp
Asn
Val
Asn
Val
145
150
155
160
Leu
Asn
Ser
Thr
Leu
Thr
Glu
Thr
Pro
Ala
Tyr
Gin
Arg
165
170
175
Lys
Tyr
Val
Asn
Glu
Lys
Phe
Glu
Glu
Leu
Thr
Phe
Ala
Thr
Glu
Thr
180
185
190
Thr
Leu
Lys
Val
Lys
Lys
Asp
Ser
Ser
Pro
Ala
Asp
Leu
Asp
Glu
195
200
205
Leu
Thr
Glu
Leu
Thr
Glu
Leu
Ala
Lys
Ser
Val
Thr
Lys
Asn
Asp
Val
210
Asp Gly Phe Glu 225
Asn Asn Leu Phe
Ala Lys Glu Asn 260
Asn Phe Leu He 275
Leu Thr Thr Cys 290
Ser He Met Asn 305
Asn He Leu Pro
Lys Val Lys Gly 340
Pro Gly His Ala 355
Val Leu Lys Val 370
Lys Asp Ser Leu 385
Cys Pro Asp Gin
Pro Asn Glu Tyr 420
Thr Leu Arg Tyr 435
Glu He Asp Leu 450
Arg Thr Leu Ser 465
He Ser Glu Thr
Asp Glu Asn Ser 500
Glu Leu Leu Leu 515
Val Pro Pro Ser 530
Glu Gly Glu Asn 545
Val Asp His Thr
Lys Asp Gly Gly 580
Thr Glu Tyr Val 595
Leu Lys Asn Glu 610
Asn Leu Glu Asp 625
Asp Leu Lys Gly
Ala Trp Gly Asp 660
Leu Leu Ser Pro 675
Ser Thr His He 690
Gly Asn Leu Lys 705
Val Asn Phe Ser 215
Phe Tyr Leu Asn 230
Gly Arg Ser Ala 245
Val Lys Thr Ser
Val Leu Thr Ala 280
Arg Lys Leu Leu 295
Glu His Leu Asn 310
Thr Leu Ser Asn 325
Ser Asp Glu Asp
Leu Val Gly Phe 360
Tyr Glu Ala Lys 375
Ser Glu Val He 390
Ser Glu Gin He 405
Val He Thr Lys
Glu Val Thr Ala 440
Asn Lys Lys Lys 455
Ala Lys Asp Asp 470
Phe Leu Thr Pro 485
Arg Leu He Thr
Ala Thr Asp Leu 520
Gly Phe He Ser 535
Leu Glu Pro Trp 550
Gly Gly Val Asn 565
Phe Ser Gin Phe
He Gin Tyr Thr 600
Asn Thr Gly Tyr 615
Tyr Gin Thr He 630
Val Tyr Leu He 645
Asn Phe Thr He
Glu Leu He Asn 680
Ser Gly Asn Thr 695
Gin Asn Leu Gin 710
Val Thr Gly Asp
220
Thr Phe His Asp 235
Leu Lys Thr Ala 250
Gly Ser Glu Val 265
Leu Gin Ala Lys
Gly Leu Ala Asp 300
Lys Glu Lys Glu 315
Thr Phe Ser Asn 330
Ala Lys Met He 345
Glu Met Ser Asn
Leu Lys Gin Asn 380
Tyr Gly Asp Met 395
Tyr Tyr Thr Asn 410
He Asp Phe Thr 425
Asn Ser Tyr Asp
Val Glu Ser Ser 460
Gly Val Tyr Met 475
He Asn Gly Phe 490
Leu Thr Cys Lys 505
Ser Asn Lys Glu
Asn He Val Glu 540
He Ala Asn Asn 555
Gly Thr Arg Ala 570
He Gly Asp Lys 585
Val Lys Gly Lys
He His Tyr Glu 620
Thr Lys Arg Phe 635
Leu Lys Ser Gin 650
Leu Glu He Ser 665
Val Asn Asn Trp
Leu Thr Leu Tyr 700
Leu Asp Ser Phe 715
Ala Asn Val Arg
Val Met Val Gly 240
Ser Glu Leu He 255
Gly Asn Val Tyr 270
Ala Phe Leu Thr 285
He Asp Tyr Thr
Glu Phe Arg Val 320
Pro Asn Tyr Ala 335
Val Glu Ala Lys 350
Asp Ser He Thr 365
Tyr Gin Val Asp
Asp Lys Leu Leu 400
Asn He Val Phe 415
Lys Lys Met Lys 430
Ser Ser Thr Gly 445
Glu Ala Glu Tyr
Pro Leu Gly Val 480
Gly Leu Gin Ala 495
Ser Tyr Leu Arg 510
Thr Lys Leu He 525
Asn Gly Asn Leu
Lys Asn Ala Tyr 560
Leu Tyr Val His 575
Leu Lys Pro Lys 590
Pro Ser He His 605
Asp Thr Asn Asn
Thr Thr Gly Thr 640
Asn Gly Asp Glu 655
Pro Ser Glu Lys 670
He Arg Thr Gly 685
Gin Gly Gly Gly
Ser Thr Tyr Arg 720
He Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu He Phe Thr Thr Lys Leu Gly Lys Asp Asn Phe Tyr He Glu
755 760 765
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Leu Val Lys Phe Asn
770 775 780
Asp Val Ser He Lys His His His His His His 785 790 795
<210> 10 <211> 809 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AXMI-113 w/ с-концевое расширение
<400> 10 Met Asn Met Asn 1
He Asp Tyr Phe 20
He Met Asn Met 35
Asp Glu He Leu 50
Leu Asp Gly Val 65
Leu Asn Thr Glu
Asn Gin Val Leu 100
Met Leu Asn He 115
Met Lys Gin Asn 130
Gin Leu Gin Glu 145
Leu He Asn Ser
Lys Tyr Val Asn 180
Thr Leu Arg Ala 195
Asn Thr Leu Glu 210
Thr Lys Asn Asp 225
Asp Val Leu He
Ala Ser Glu Leu 260
He Gly Lys Val 275
Lys Ala Phe Leu 290
Asp He Asp Tyr 305
Asn Glu Phe Arg
Asn Thr Lys Leu 5
Asn Gly He Tyr
He Phe Lys Thr 40
Lys Asn Gin Gin 55
Asn Gly Ser Leu 70
Leu Ser Lys Glu 85
Asn Asp Val Asn
Tyr Leu Pro Lys 120
Tyr Ala Leu Ser 135
He Ser Asp Lys 150
Thr Leu Thr Glu 165
Glu Lys Phe Asp
Lys Gin Gly He 200
Asn Leu Thr Asp 215
Val Asp Ser Phe 230
Gly Asn Asn Leu 245
He Thr Lys Asp
Tyr Ser Phe Leu 280
Thr Leu Thr Thr 295
Thr Ser He- Met 310
Asp Asn He Leu 325
Asn Ala Arg Ala 10
Gly Phe Ala Thr 25
Asp Thr Gly Gly
Leu Leu Asn Glu 60
Asn Asp Leu He 75
He Leu Lys He 90
Asn Lys Leu Asp 105
He Thr Ser Met
Leu Gin He Glu 140
Leu Asp Val He 155
He Thr Pro Ser 170
Lys Leu Thr Phe 185
Phe Asn Glu Asp
Leu Ala Glu Leu 220
Glu Phe Tyr Leu 235
Phe Gly Arg Ser 250
Glu He Lys Thr 265
He Val Leu Thr
Cys Arg Lys Leu 300
Asn Glu His Leu 315
Pro Ala Leu Ser 330
Leu Pro Ser Phe 15
Gly He Lys Asp 30
Asp Leu Thr Leu 45
He Ser Gly Lys
Ala Gin Gly Asn 80
Ala Asn Glu Gin 95
Ala He Asn Thr 110
Leu Ser Asp Val 125
Tyr Leu Ser Arg
Asn Leu Asn Val 160
Tyr Gin Arg He 175
Ala Thr Glu Ser 190
Ser Phe Asp Asn 205
Ala Lys Ser He
His Thr Phe His 240
Ala Leu Lys Thr 255
Ser Gly Ser Glu 270
Ser Leu Gin Ala 285
Leu Gly Leu Ser
Asn Asn Glu Lys 320
Asn Lys Phe Ser 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr He Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
He Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala' Leu Val Gly Phe Glu He He
355 360 365
Asn Asp Pro He Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gin
370 375 380
Asn Tyr Gin Val Asp Asn Gin Ser Leu Ser Glu He Val Tyr Leu Asp 385 390 395 400
He Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gin Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val He Thr Lys He Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu He Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp He Asp Leu Asn Lys Lys Gin Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gin Thr Asp Tyr He Thr Met Asp He Gly Asp Asp Asp 465 470 475 480
Gly He Tyr Met Pro Leu Gly Val He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
He Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu He Ala Pro Pro Asn Val Phe He Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp He Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp 545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly He Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gin Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gin Phe
580 585 590
He Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr He He Gin Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala He Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
He Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gin Thr He 625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gin Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gin Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe He He
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu He Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr He Thr Gly Asn Glu
690 695 . 700
Leu Arg He Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gin Ser Leu Asn 705 710 715 720
He Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val He Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp He Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe He Glu' Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp He Ser He Lys Glu 785 790 795 800
Lys He Glu His His His His His His 805
<210> 11 <211> 2370
<212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 11
gtgagggtaa
gattatttta
tttaaaacga
cttaatgaga
caaggaaact
agggttttaa
ttacctaaaa
cagatagaat
gtaaatgtac
tatgtaaatg
caagatagct
agtgtaacaa
atgattggga
aaagaaaatt
ttaacagctc
ttagcagata
tttagagtga
gctagaggga
gttggatttg
aaacacaact
aaattattat
aatgaatatg
gtcacagcga
gaatcaagtg
ataggtacta
gaaaattcaa
acagacttaa
attgtagaaa
aatgcgtatg
gatggtgagt
caatatattg
atttatgaag
acgggaacag
tttggaggaa
ttgattaagt
aatattaata
acctatagta
gaagtagtat
acaacaacaa
gttataaatt
acatgcagaa atgggattta atacaggagg tttctggcaa tgaatactga atgatgtaaa ttacttctat acctaagcaa tcattaactt aaaaatttga ctcatacaga aaaatgacgt ataatctatt tgaaaacaag tgcaagcaaa ttgattatac acatccttcc gtgataagga aaataagtaa atcaaattga gtccggatca ttatcactaa atttttatga aggcggagtt taagtgaaac gactagtaac gtaataaaga atgggaactt tagatcatac tctcacaatt taaagggaaa aaacaaataa attcttcaag actttattat tggatgcttg gtaatgtaaa tgaactttaa ttgaaaggag ccaataatac tcggagattt aaataataaa cggattcgcc ggatctaacc actggatgga attatctaag tacaaagctt gttaagtgat acaattaaag tacacttact agcattaacc tattcttgat ggatggcttt tggacgttca tggcagtgag agcttttctt tcctattatg tacactttct tgcgaaaatc ggattcaatt taaggattcg atctgaacaa aattgctttt ctcttctaca tagtatgcta atttttgact tttgacatgt aactaaactg agagggagaa cggaggtgta tattggggaa agctgctatt tgaattagaa agttcattta ttcagaaatt ggttggatct tggaaccttt tgtgaatgga ttatctacag tgggttatat ttcaatcaag ttaagtgtaa actggtatca ttagacgaaa gtgaatggca gaaatattaa gatgcgataa gtaatgaagc gaaatttcag gaaattacac tctgctacag gagttaacag gaattttacc gctttaaaaa gtaggaaatg actttaacta aatgaacacc aatacttttt attatggaag gcagtattaa ttatcagaaa atgtattata actaaaaaac ggagatattg aatgctaata ccaattaatg aaatcatatt attgtcccac aacttagagc aatggaacta aaattgaaat tatttaaaag gattttcaaa atttttacca aggccatccg cagggaactt cgacaaaacc tttggcaagg ttttcctcta gtagaacttt gggctttacc aagatattat tattaaaaaa gcttaaatga aaattgcaaa atttaatgct aaaattatgc ataagctaga ctgcctatca aaaccaattt agctaacgga ttaatacatt cagcctcgga tttataattt catgccggaa taaataaaga ctaatcctaa ctaaacctgg aagtttatca ttgtttatgg caaataaaat tgaacagttt atctaaataa atgagggtgt gatttggcct taagagagac ctaatggttt cgtggaaagc aagttttata tgaaaacaga atgaaaaaaa ctgttactaa gtcaaaatgg aagagttatt ggatctcagg tttcgttaga tgacaataag aatatatttc ctcgtgcttc aagtttcatt gaacatgatt tcaacagtta tcttctcgca tgaacagaat taacacatat attaggtttg tgttattaat aaggattaaa aaaaacaaaa actagcgaaa ccacgatgta attaattgcg cttaattgta attattgggc aaaagaggaa ttatgaaaaa atatgcttta ggcaaagcta tgatatagat agcatttcca aagatatgag gaaaaaaata ttatatgccg cgtagtcgat attgttagca tattagcaat aaataacaaa tgttcatgag atatgtaatt tggggattac acgttttatt cgaggaagca aagtccagaa aaattctctc aagttattca aaattctcgt agaaaaattc gtctggggga 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2370
<210> 12 <211> 2370 <212> ДНК
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 12
atgaacatga
tattttaatg
aaaacggata
aatgatattt
ggaaacttaa
gttttaaatg
cctaaaatta
atagaatacc
aatgtactta
gtgaacgaaa
gatagcgctt
gtaacaaaaa
gtaggaaata
acaagaataa gcatttatgg caggtggtga ctggtaaatt atacagaatt atgttaataa cctctatgtt taagtagaca ttaactctac aatttgaaga ctgcagatat atgatgtgga atttattcgg tactaaatta atttgccact tctaacccta ggatggggtg atctaaggaa caaactcgat aagtgatgta attacaagaa acttactgaa attaactttt tcttgatgag tggttttgaa gcgttcgact agcgcaagag ggcatcaaag gacgaaattt aatggaagct atattaaaaa gcgataaata atgaaaccaa atttcagata attacacctg gctacagaaa ttaacggagt ttttacctta ttaaaaactg ctttaccaag atattatgaa taaagaatca taaatgatct ttgcaaatga cgatgcttca attatgcgct agctagatat cgtatcaatg ctactttaaa taactgaact atacattcca cttcggaatt ttttattgat catgattttt gcagttacta tatcgcacag acaaaatcaa tgtatatcta aagtatgcaa tatcaacgta gattaaatat agtaaaaaat tgcgaaaagt cgatgtaatg aattgctaaa 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
gaaaatgtga acagctctac gcagatattg agagtaaaca aaaggaagtg gggtttgaaa caaaattacc ttattgtgcc gaatatgtaa acagctaatt tcaagtaaag ggtgtcatca aattcaagat gacttaagca gtagagaatg gcttatgtag gggggggttt tatactgtta tatgaagata ggaactgatt ggagataact attaatccga attagcttgg tatagtataa gtattatatg actgaatcca catatatcat aaacaagtgg aagcaaaagc attatacatc tccttcctat atgaagatgc ttagtaatga aagttgataa cagatcaatc ttactaaaat cttatgattc cggagtatag gtgaaacatt taattacttt ataaagaaac ggtccataga atcatacagg cacaatttat aaggaaaacc caaataatga taatgagagt ttacaatttt attcttggat ggacaaatgg gctttactgc aacgaaacaa ataataccgg ttgaaaacat cagtgaggta ttttcttact tattatgaat actttctaat aaagatgatt ttcaatgaca ggattcctta tgaaaaaatt tgattttact ttctacagga gacgttaagt tttgactcca aacgtgtaaa taaattgatt agagggccac cggagtgaat gggagataaa ttctattcat tttagaagat gtatttaatt ggaaattaag tacaactcaa gacctttaga atcgggacca ccttatgtct attatatgta ttctattaaa ggaaatgttt ttaacaacat gaacatttaa actttttcta gtggaagcta gtattaaaag tcggaagtca tattatacaa aagaaaatga gaaattgact gctaataatg attaatggat tcatatttaa gtcccgccaa ttagagcctt ggtactaaag ttaaaaccga ttaaaagatg ttccaaacta ttaaaaagtc cctgcggagg ggggctagca caaaatcttt tttaatgtga tcaactagtc gaactttccc ataatttctt gccgaaaatt ataaggaaaa atcctaatta aaccaggaca tatatgaagc tttatggtga ataatatagt aaactttaag taaataaaaa atggagtata ttggcctcca gggaactact atagttttat ggaaagcaaa ctctatatgt aaactgagta aaaatactgg taactaaaag aaagtggtca ctttagtaag tttcaggaga cattaaacag cggtaagaaa atatttctgg gtcgttctgg agttgtatta attaggccta agaggaattt tgcaaaagtt tgcattggtt taagctaaaa tatggataaa atttccaaat atatgaggta gaaagtagaa tatgccgtta agctgatgaa actagcgaca tagcaatatt taataagaac tcatgaggat tgtaattcaa atatattctt gttcacaaca cgaagcttgg cccagaattg taaacttttt ttattcaact ttctagggaa ggaattcaaa tggtgctggt 840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2370
<210> 13 <211> 790 <212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 13 Met Arg Val 1
Pro Ser Phe
He Lys Asp 35
Leu Thr Leu 50
Ser Gly Lys 65
Gin Gly Asn
Asn Glu Gin
He Asn Leu 115
Ser Asp Val
130 Leu Ser Lys 145
Val Asn Val
Gin Arg He
Thr Glu Thr 195
Leu Asp Glu
210 Asn Asp Val 225
Asn Met Gin 5
He Asp Tyr 20
He Met Asn
Asp Glu He
Leu Asp Gly 70
Leu Asn Thr 85
Asn Arg Val 100
Met Leu Asn
Met Lys Gin
Gin Leu Lys 150
Leu He Asn
165 Lys Tyr Val 180
Asn Leu Lys
Leu Thr Glu
Asp Gly Phe 230
Lys Asn Asn
Phe Asn Gly 25
Met He Phe 40
Leu Lys Asn 55
Val Asn Gly
Glu Leu Ser
Leu Asn Asp 105
Thr Tyr Leu
120 Asn Tyr Ala 135
Glu He Ser
Phe Thr Leu
Asn Glu Lys 185
Thr Lys Gin
200 Leu Thr Glu 215
Glu Phe Tyr
Lys Leu Ser 10
He Tyr Gly
Lys Thr Asn
Gin Gin Leu 60
Ser Leu Asn 75
Lys Glu He 90
Val Asn Thr
Pro Lys He
Leu Gly Leu 140
Asp Lys Leu 155
Thr Glu He 170
Phe Glu Ala
Asp Ser Ser
Leu Ala Lys 220
Leu Asn Thr 235
Val Arg
Phe Ala
30 Thr Gly 45
Leu Asn
Asp Leu
Leu Lys
Lys Leu 110 Thr Ser 125
Gin He
Asp Val
Thr Pro
Leu Thr 190 His Thr 205
Ser Val Phe His
Ala Leu 15
Thr Gly
Gly Asp
Glu He
Leu Ala 80
He Ala 95
Asp Ala
Met Leu
Glu Tyr
He Asn 160 Ala Tyr 175
Ser Ala
Asp He
Thr Lys
Asp Val 240
Met He Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser
245 250 255
Glu Leu He Ala Lys Glu Asn Leu Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly
260 265 270
Asn Val Tyr Asn Phe Leu He Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Lys Ala
275 280 285
Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp He
290 295 300
Asp Tyr Thr Pro He Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu 305 310 315 320
Phe Arg Val Asn He Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro
325 330 335
Asn Tyr Glu Lys Ala Arg Gly Ser Asp Lys Asp Ala Lys He He Met
340 345 350
Glu Ala Lys Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu He Ser Lys Asp
355 360 365
Ser He Ala Val Leu Lys Val Tyr Gin Ala Lys Leu Lys His Asn Tyr
370 375 380
Gin He Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu He Val Tyr Gly Asp He Asp 385 390 395 400
Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Met Tyr Tyr Thr Asn Lys
405 410 415
He Ala Phe Pro Asn Glu Tyr Val He Thr Lys He Ala Phe Thr Lys
420 425 430
Lys Leu Asn Ser Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser
435 440 445
Ser Thr Gly Asp He Asp Leu Asn Lys Lys Lys He Glu Ser Ser Glu
450 455 460
Ala Glu Phe Ser Met Leu Asn Ala Asn Asn Glu Gly Val Tyr Met Pro 465 470 475 480
He Gly Thr He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro He Asn Gly Phe Gly
485 490 495
Leu Val Val Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser
500 505 510
Tyr Leu Arg Glu Thr Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr
515 520 525
Lys Leu He Val Pro Pro Asn Gly Phe He Ser Asn He Val Glu Asn
530 535 540
Gly Asn Leu Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys 545 550 555 560
Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Val Leu
565 570 575
Tyr Val His Glu Asp Gly Glu Phe Ser Gin Phe He Gly Glu Lys Leu
580 585 590
Lys Leu Lys Thr Glu Tyr Val He Gin Tyr He Val Lys Gly Lys Ala
595 600 605
Ala He Tyr Leu Lys Asp Glu Lys Asn Gly Asp Tyr He Tyr Glu Glu
610 615 620
Thr Asn Asn Glu Leu Glu Asp Phe Gin Thr Val Thr Lys Arg Phe He 625 630 635 640
Thr Gly Thr Asp Ser Ser Arg Val His Leu He Phe Thr Ser Gin Asn
645 650 655
Gly Glu Glu Ala Phe Gly Gly Asn Phe He He Ser Glu He Arg Pro
660 665 670
Ser Glu Glu Leu Leu Ser Pro Glu Leu He Lys Leu Asp Ala Trp Val
675 680 685
Gly Ser Gin Gly Thr Trp He Ser Gly Asn Ser Leu Asn He Asn Ser
690 695 700
Asn Val Asn Gly Thr Phe Arg Gin Asn Leu Ser Leu Glu Ser Tyr Ser 705 710 715 720
Thr Tyr Ser Met Asn Phe Asn Val Asn Gly Phe Gly Lys Val Thr He
725 730 735
Arg Asn Ser Arg Glu Val Val Phe Glu Arg Ser Tyr Leu Gin Phe Ser 740 745 750
Ser Lys Tyr He Ser Glu Lys Phe 755 760
Leu Tyr Val Glu Leu Ser Arg Ala
770 775
Gly Asp Phe Ser He Lys
785 790
Thr Thr Thr Thr Asn Asn Thr Gly 765
Ser Ser Gly Gly Val He Asn Phe 780
<210> 14 <211> 790 <212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 14 Met Asn Met Asn 1
Ser Phe He Asp 20
Lys Asp He Met 35
Thr Leu Asp Glu 50
Gly Lys Leu Asp 65
Gly Asn Leu Asn
Glu Gin Asn Gin 100
Asn Thr Met Leu 115
Asp Val Met Lys 130
Ser Arg Gin Leu 145
Asn Val Leu He
Trp He Lys Tyr 180
Glu Thr Thr Leu 195
Asp Glu Leu Thr 210
Asp Val Asp Gly 225
Val Gly Asn Asn
Leu He Ala Lys 260
Val Tyr Asn Phe 275
Leu Thr Leu Thr 290
Tyr Thr Ser He 305
Arg Val Asn He
Tyr Ala Lys Val 340
Ala Lys Pro Gly 355
Met Thr Val Leu 370
Val Asp Lys Asp 385
Lys Asn Asn Thr 5
Tyr Phe Asn Gly
Asn Met He Phe 40
He Leu Lys Asn 55
Gly Val Asn Gly 70
Thr Glu Leu Ser 85
Val Leu Asn Asp
His Val Tyr Leu 120
Pro Asn Tyr Ala 135
Gin Glu He Ser 150
Asn Ser Thr Leu 165
Val Asn Glu Lys
Lys Val Lys Asn 200
Glu Leu Thr Glu 215
Phe Glu Phe Tyr 230
Leu Phe Gly Arg 245
Glu Asn Val Lys
Leu Val Val Leu 280
Thr Cys Arg Lys 295
Met Asn Glu His 310
Leu Pro He Leu 325
Lys Gly Ser Asp
His Ala Leu Val 360
Lys Val Tyr Glu 375
Ser Leu Ser Glu 390
Lys Leu Ser Ala 10
He Tyr Gly Phe 25
Lys Thr Asp Thr
Gin Gin Leu Leu 60
Ser Leu Asn Asp 75
Lys Glu He Leu 90
Val Asn Asn Lys 105
Pro Lys He Thr
Leu Ser Met Gin 140
Asp Lys Leu Asp 155
Thr Glu He Thr 170
Phe Glu Glu Leu 185
Asp Ser Ala Ser
Leu Ala Lys Ser 220
Leu Asn Thr Phe 235
Ser Thr Leu Lys 250
Thr Ser Gly Ser 265
Thr Ala Leu Gin
Leu Leu Gly Leu 300
Leu Asn Lys Glu 315
Ser Asn Thr Phe 330
Glu Asp Ala Lys 345
Gly Phe Glu He
Ala Lys Leu Lys 380
Val He Tyr Gly 395
Arg Ala Leu Pro 15
Ala Thr Gly He 30
Gly Gly Asp Leu 45
Asn Asp He Ser
Leu He Ala Gin 80
Lys He Ala Asn 95
Leu Asp Ala He 110
Ser Met Leu Ser 125
He Glu Tyr Leu
He He Asn Val 160
Pro Ala Tyr Gin 175
Thr Phe Ala Thr 190
Ala Asp He Leu 205
Val Thr Lys Asn
His Asp Val Met 240
Thr Ala Ser Glu 255
Glu Val Gly Asn 270
Ala Lys Ala Phe 285
Ala Asp He Asp
Lys Glu Glu Phe 320
Ser Asn Pro Asn 335
Met He Val Glu 350
Ser Asn Asp Ser 365
Gin Asn Tyr Gin
Asp Met Asp Lys 400
Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Lys He Tyr Tyr Thr Asn Asn He
405 410 415
Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val He Thr Lys He Asp Phe Thr Lys Lys
420 425 430
Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser
435 440 445
Thr Gly Glu He Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Lys Ala
450 455 460
Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu 465 470 475 480
Gly Val He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro He Asn Gly Phe Gly Leu
485 490 495
Gin Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu He Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr
500 505 510
Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys
515 520 525
Leu He Val Pro Pro Asn Ser Phe He Ser Asn He Val Glu Asn Gly
530 535 540
Ser He Glu Glu Gly His Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn 545 550 555 560
Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr
565 570 575
Val His Glu Asp Gly Gly Val Ser Gin Phe Met Gly Asp Lys Leu Lys
580 585 590
Pro Lys Thr Glu Tyr Val He Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser
595 600 605
He His Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr He Leu Tyr Glu Asp Thr
610 615 620
Asn Asn Asp Leu Glu Asp Phe Gin Thr He Thr Lys Arg Phe Thr Thr 625 630 635 640
Gly Thr Asp Leu Met Arg Val Tyr Leu He Leu Lys Ser Gin Ser Gly
. 645 650 655
His Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Thr He Leu Glu He Lys Pro Ala
660 665 670
Glu Ala Leu Val Ser Pro Glu Leu He Asn Pro Asn Ser Trp He Thr
675 680 685
Thr Gin Gly Ala Ser He Ser Gly Asp Lys Leu Phe He Ser Leu Gly
690 695 700
Thr Asn Gly Thr Phe Arg Gin Asn Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr 705 710 715 720
Tyr Ser He Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg
725 730 735
Asn Ser Arg Glu Val Leu Tyr Glu Arg Asn Asn Leu Met Ser Ser Thr
740 745 750
Ser His He Ser Gly Glu Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu
755 760 765
Tyr Val Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Ala Gly His He Ser Phe
770 775 780
Glu Asn He Ser He Lys 785 790
<210> 15 <211> 2409 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность, кодирующая AXMI-115
<400> 15
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agagctcttc cttccttcat cgactacttc
aatggcatct gacactggag atctcaggga ctcaacacag aatgatgtca atcacctcaa tacctctcaa ctgatcaaca gagaagttcg ttcaatgagg gccaagagca gatgtgctga atcaccaagg atcgtcctca ctgggcctct aatgagttca gcaaaaacca gctctggtgg aagctgaagc atcgacaagc ttccctgatg tatgaagcca caggtggaga ggcatctaca ggcctggagg gagtacctgc gttttcatca gtggccaaca ctcttcaccc accgactaca agcaccggct gctgtgaagt aatggatatg ccagaatctc actggaaatg atcgacagct atcgtcaaga tatgaggaca ctcaccgccg aagatcgag atggcttcgc gagatctcac agctggatgg agctctccaa acaacaagct tgctctctga ggcagctgca gcaccttgac acaagctcac acagcttcga tcaccaagaa ttggcaacaa atgagatcaa ccagcctcca ccgacatcga gagacaacat tcggcagcga gcttcgagat agaactacca tcttctgccc gatatgtcat ccgccaactt gcaccttccc tgccgctcgg tggatgccaa tggagagtga gcaatgtggt acaagaatgc aaggagatgg tcatccagta acatcacata tcacctcaga aagcatgggg cagagctcat agctgaggat acagcacata acagcagagg tctcagagag agaggacaag caccggcatc cttggatgag cgtcaatgga ggagatcctc ggatgccatc tgtgatgaag agagatctcc agagatcacc cttcgccaca caacaacacc tgatgtggac cctctttgga gacatctgga ggccaaggcc ctacacctcc cctgccggcg caactacgcc catcaatgat ggtggacaac agagaacagc caccaagatc ctatgatcca tcaaacagac cgtcatctca gagcaagacc tctgaagaac gaagaactgg ttatgtggac agagttctca caccgtcaag tgaggacacc aacagatctc agacaacttc caagttcaat tgatcattca tgatctctcc agtggtgctc cttcaccacc cagcaccttc aaggacatca atcctcaaga agcctcaatg aagatcgcca aacaccatgc cagaactatg gacaagctgg ccaagctacc gaatcaaccc ttggagaact agcttcgagt agaagcgcgc tcagagattg ttcctcaccc atcatgaatg ctctccaaca aaggtgatcc cccatccccg cagagcctct gagcagaagt accttcgaga tcaactggag tacatcacca gaaaccttcc ctcaccttga aaggaaacag gacattgaag aacaccggcg cagttcatcg ggcaagccgg aatggcaaca tcccaaaccc atcatcctgg gattgggaga agaggaggct ttctccttct ttcgagaagg gccagcaaca cacagcttca tgaacatgat accagcagct atctcattgc atgagcagaa tgaacatcta ctctctccct atgtcatcaa agaggatcaa tccgcgccaa tgacagatct tctacctcca tcaagacagc gcaaggtgta tcaccacctg agcacctcaa agttcagcaa tggagagcga tgctgaaggc cagagatcgt actacaccaa agaagctcaa acatcgacct tggacattgg tcacccccat aatgcaagag ggctgatcgc aagattcatt gcattgaaag gcgacaagct ccatctacct gcgaggagtt acctggtgtt aggccaagct gatttggcac acttccgcca ccggcctctg tgaagaacaa aggatggctt gagacatctc cttcaagaca gctgaatgag tcaaggaaac ccaggtgctg cctccccaag ccagatcgag cctcaatgtg atatgtcaat gcaaggcatc tgctgagctg caccttccat ttcagagctc cagcttcctc ccggaagctg caatgagaag cccttcatat gcctggatat ctacaaggcc ctacctggac gaacctcacc caacctcatc gaacaagaag agatgatgat caacagcttc ctacctcagg gccgccaaat ggagccatgg aagcaaggcg gaagccaaac caagaacaag ccaaaccatt caagagccaa ctttgaaaca cacctacatc gagcttgaac ggccaaggtc tggaagcagc cttcatcgag catcaaggag 120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2409
<210> 16 <211> 2409 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность, кодирующая AXMI-115
<400> 16
atgaacatga
aatggcatct
gacactggag
atctcaggga
ctcaacacag
aatgatgtca
atcacctcaa
tacctctcaa
ctgatcaaca
gagaagttcg
ttcaatgagg
gccaagagca acaacaccaa atggcttcgc gagatctcac agctggatgg agctctccaa acaacaagct tgctctctga ggcagctgca gcaccttgac acaagctcac acagcttcga tcaccaagaa gctcaatgca caccggcatc cttggatgag cgtcaatgga ggagatcctc ggatgccatc tgtgatgaag agagatctcc agagatcacc cttcgccaca caacaacacc tgatgtggac agagctcttc aaggacatca atcctcaaga agcctcaatg aagattgcaa aacaccatgc cagaactatg gacaagctgg ccaagctacc gaatcaaccc ttggagaact agcttcgagt cttccttcat tgaacatgat accagcagct atctcattgc atgagcagaa tgaacatcta ctctctccct atgtcatcaa aaaggatcaa tccgcgccaa tgacagatct tctacctcca cgactacttc cttcaagaca gctgaatgag tcaaggaaac ccaggtgctg cctccccaag ccagatcgag cctcaatgtg atatgtcaat gcaaggcatc tgctgagctg caccttccat 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
gatgtgctga atcaccaagg atcgtcctca ctgggcctct aatgagttca gcaaaaacca gctctggtgg aagctgaagc atcgacaagc ttccctgatg tatgaagcca caggtggaga ggcatctaca ggcctggagg gagtacctgc gttttcatca gtggccaaca ctcttcaccc accgactaca agcactggct gctgtgaagt aatggatatg ccagaatctc actggaaatg atcgacagct atcgtcaaga tatgaggaca ctcaccgccg aagattgaa ttggcaacaa atgagatcaa ccagcctcca ccgacatcga gagacaacat tcggcagcga gcttcgagat agaactacca tcttctgccc gatatgtcat ccgccaactt gcaccttccc tgccgctcgg tggatgccaa tggaatcaga gcaatgtggt acaagaatgc aaggagatgg tcatccagta acatcacata tcacctcaga aagcatgggg cagagctcat agctgaggat acagcacata acagcagagg tctcagagag agaggacaag cctctttgga gacatctgga ggccaaggcc ctacacctcc cctgccggcg caactatgcc catcaatgat ggtggacaac agagaacagc caccaagatc ctatgatcca tcaaacagat cgtcatctca gagcaagacc tctgaagaac gaagaactgg ttatgtggac agagttctca caccgtcaag tgaggacacc aacagatctc agacaacttc caagttcaat tgatcattca tgatctctcc agtggtgctc cttcaccacc cagcaccttc agaagcgcgc tcagaaattg ttcctcaccc atcatgaatg ctctccaaca aaggtgatcc cccatccctg caaagcctct gagcagaagt accttcgaga tcaactggag tacatcacca gaaaccttcc ctcaccttga aaggaaacag gacattgaag aacaccggcg cagttcatcg ggcaagccgg aatggcaaca tcccaaaccc atcatcctgg gattgggaaa agaggaggct ttctccttct ttcgagaagg gccagcaaca cacagcttca tcaagacagc gcaaggtgta tcaccacctg agcacctcaa agttcagcaa tggagagcga tgctgaaggc cagagatcgt actacaccaa agaagctcaa acattgatct tggacattgg tcacccccat aatgcaagag ggctgatcgc aagattcatt gcattgaaag gcgacaagct ccatctacct gcgaggagtt acctggtgtt aggccaagct gatttggcac acttccgcca ccggcctctg tgaagaacaa aggatggctt gagacatctc ttcagagctc cagcttcctc ccggaagctg caatgagaag cccttcatat gcctggatat ctacaaggcc ctacctggac gaacctcacc caacctcatc gaacaagaag agatgatgat caacagcttc ctacttgagg gccgccaaat ggagccatgg aagcaaggcg gaagccaaac caagaacaag ccaaacaatt caagagccaa ctttgaaaca cacctacatc gagcttgaac ggccaaggtc tggaagcagc cttcatcgag catcaaggag 780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2409
<210> 17 <211> 2364 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность, кодирующая AXMI-184
<400> 17
atgaacaaga acaacaccaa gctctccgcg cgcgcgctgc cctccttcat cgactacttc 60 aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagaca 120 gacactggag gagatctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgac 180 atctcaggga agctggatgg cgtcaatgga agcctcaatg atctcattgc tcaaggaaac 240 ctcaacacag agctctccaa ggagatcctc aagatcgcca atgagcagaa ccaggtgctg 300 aatgatgtca acaacaagct ggatgccatc aacaccatgc tgcatgtcta cctccccaag 360 atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag ccaaactatg ctctctccat gcaaattgag 420 tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480 ctgatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc aatggatcaa atatgtcaat 540 gagaagtttg aggagctcac cttcgccaca gaaacaacct tgaaggtgaa gaatgattca 600 gcttctgctg acatcctgga tgagctgaca gagctgacag agctggccaa gagcgtcacc 660 aagaatgatg ttgatggctt cgagttctac ctcaacacct tccatgatgt gatggtgggc 720 aacaacctct ttggaagaag caccctcaag acagcttcag agctgatcgc caaggagaat 780 gtcaagacat ctggaagcga ggtgggaaat gtctacaact tcctggtggt gctgacggcg 840 ctgcaagcaa aggccttcct caccctcacc acctgccgga agctgctggg cctcgccgac 900 atcgactaca cctcaatcat gaatgagcac ctcaacaagg agaaggagga gttcagagtg 960 aacatcctcc ccatcctctc caacaccttc agcaacccca actacgccaa ggtgaagggc 1020 tcagatgaag atgccaagat gattgtggag gccaagcctg gccatgctct ggtgggcttc 1080 gagatcagca atgacagcat gacggtgctg aaggtgtatg aagcaaagct gaagcagaac 1140 taccaggtgg acaaggacag cctctccgag gtgatctatg gagacatgga caagctgctc 1200 tgcccagatc aatcagagaa gatctactac accaacaaca tcgtctttcc aaatgaatat 1260 gtcatcacca agatcgactt caccaagaag atgaaaacct tgagatatga agtcaccgcc 1320 aacagctatg attcttcaac tggagagatc gacctcaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380
aaggcagagt atctcagaaa aggctcatca tccaacaagg aatggaagca gtggaccaca gtttcacagt gtcaagggca gacaccaaca gatctgatga aacttcacca cccaacagct cttggaacaa atcagcttca tatgaaagga agcaacaaca agcttcgaga acaggacgct ccttcttgac ccctcacctg aaacaaagct ttgaagaagg ccggcggcgt tcatgggaga agccaagcat atgatttaga gggtgtacct tcctggagat ggataacaac atggcacctt ccgcctcagg acaacttgat ccggcctcta acatctccat ctccgccaac gcccatcaat caagagctac gattgttcct ccacctagag caatggcacc caagctgaag ccacctcaag agatttccaa catcctcaag caagccagca acaaggagct ccgccagaac ccccttcaat gagcagcacc tgtggagctc caag aatgatggcg ggcttcggcc ctcagggagc ccaaacagct ccatggaagg aaggcgctct ccaaaaacag gatgagaaca accatcacca agccaaagtg gaagctctgg tcaatttctg ctctccctca gtcaccgtca agccacatct tcaagaagaa tctacatgcc tccaagctga tgctgctggc tcatcagcaa ccaacaacaa atgttcatga aatatgtcat ccggctacat agaggttcac gtcatgaagc tgtcgccgga gtgacaagct acagctacag ggaacagcag ctggagagtt gcggcggcgc gctcggcgtc tgagaacagc caccgacctc catcgtggag gaatgcatat agatggagga ccagtacacc cctctacgag cactggaaca atggggagac gctcatcaac cttcatctcc cacctacagc ggaggtgctg caagacagaa cggccacatc 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2364
<210> 18 <211> 2364 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность, кодирующая AXMI-184
<400> 18
atgaacaaga
aatggcatct
gacactggag
atctcaggga
ctcaacacag
aatgatgtca
atcacctcaa
tacctctcaa
ctcatcaaca
gagaagtttg
gcttctgctg
aagaatgatg
aacaacctct
gtcaagacat
ctgcaagcaa
atcgactaca
aacatcctcc
tcagatgaag
gagatcagca
taccaggtgg
tgcccagatc
gtcatcacca
aacagctatg
aaggcagagt
atctcagaaa
aggctcatca
tccaacaagg
aatggaagca
gttgatcaca
gtttcacagt
gtcaagggca
gacaccaaca
gatctgatga
aacttcacca
cccaacagct acaacaccaa atggcttcgc gagatctcac agctggatgg agctctccaa acaacaagct tgctctctga ggcagctgca gcaccttgac aggagctcac acatcctgga ttgatggctt ttggaagaag ctggatcaga aggccttcct cctcaatcat ccatcctctc atgccaagat atgacagcat acaaggacag aatcagagaa agatcgactt attcttcaac acaggacgct ccttcttgac ccctcacctg aaacaaagct ttgaagaagg ccggcggcgt tcatgggaga agccaagcat atgatttaga gggtgtacct tcctggagat ggataacaac gctctccgcg caccggcatc cttggatgag cgtcaatgga ggagatcctc ggatgccatc tgtgatgaag agagatctcc agagatcacg cttcgccaca tgagctgaca cgagttctac caccctcaag ggttggaaat caccctcacc gaatgagcac caacaccttc gattgtggag gacagtgctg cctctcagag gatctactac caccaagaag tggagagatc ctccgccaac gcccatcaat caagagctac gattgttcct ccacctagag caatggcacc caagctgaag ccacctcaag agattttcaa catcctcaag caagccagca acaaggagct cgcgcgctgc aaggacatca atcctcaaga agcctcaatg aagattgcaa aacaccatgc ccaaattatg gacaagctgg ccggcctacc gaaacaacat gagctgacag ctcaacacct acagcttcag gtctacaact acctgccgga ctcaacaagg agcaacccca gccaagcctg aaggtttatg gtgatctatg accaacaaca atgaaaacat gacctcaaca aatgatggcg ggcttcggcc ttgagggagc ccaaacagct ccatggaagg aaggcgctct ccaaaaacag gatgaaaaca accatcacca agccaaagtg gaagctctgg tcaatttctg catccttcat tgaacatgat accagcagct atctcattgc atgagcagaa tgcatgtcta ctctctccat acatcatcaa aatggatcaa tgaaggtgaa agctggccaa tccatgatgt agctgatcgc tcttggtggt agctgctggg agaaggagga actatgccaa gccatgctct aagcaaagct gagacatgga tcgtctttcc tgagatatga agaagaaggt tctacatgcc tccaagctga tgctgctggc tcatcagcaa ccaacaacaa atgttcatga aatatgtcat ctggctacat agaggttcac gtcatgaagc tgtcgccgga gtgacaagct cgactacttc cttcaagaca gctgaatgac tcaaggaaac ccaggtgctg cctccccaag gcaaattgag tgtcaatgtt atatgtcaat gaatgattca gagcgtcacc gatggtgggc caaggaaaat gctgacggcg cctcgccgac gttcagagtg ggtgaagggc ggtgggcttc gaagcagaac caagctgctc aaatgaatat agtcaccgcc ggagagcagc gctcggcgtc tgaaaacagc caccgacctc cattgtggag gaatgcatat agatggagga ccagtacacc cctctatgag cactggaaca atggggagac gctcatcaac cttcatctcc 60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
cttggaacaa atggcacctt ccgccagaac ctctccctca acagctacag cacctacagc 2160
atcagcttca ccgcctcagg acccttcaat gtcaccgtca ggaacagcag ggaggtgctg 2220
tatgaaagga acaacttgat gagcagcacc agccacatct ctggagagtt caagacagaa 2280
agcaacaaca ccggcctcta tgtggagctc tcaagaagaa gcggcggcgc cggccacatc 2340
agcttcgaga acatctccat caag 2364
<210> 19 <211> 4 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид, направляющий в эндоплазматический ретикулум
<400> 19 Lys Asp Glu Leu 1
<210> 20 <211> 41 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 20
aacaccggcg gcgtcaatgg aacaagggcg ctcttcaccc a
<210> 21 <211> 41 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 21
tgggtgaaga gcgcccttgt tccattgacg ccgccggtgt t 41
<210> 22 <211> 55 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 22
gcccggagct catcaatgtc aacaactgga tcagaactgg caccacctac atcac 55
<210> 23 <211> 55 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена
<400> 23
gtgatgtagg tggtgccagt tctgatccag ttgttgacat tgatgagctc cgggc 55
<210> 24 <211> 50 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 24
atgattggga gaggttcgga agcacccaca tcagcggcaa tgagctgagg
<210> 25 <211> 50 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 25
cctcagctca ttgccgctga tgtgggtgct tccgaacctc tcccaatcat
<210> 26 <211> 55 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 26
ctacatcacc ggcaatacct tgacgctcta ccaaggagga ggaggctact tccgc
<210> 27 <211> 55 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 27
gcggaagtag cctcctcctc cttggtagag cgtcaaggta ttgccggtga tgtag
<210> 28 <211> 57 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 28
cgacagctac agcacctaca gggtgaactt ctccgtcacc ggctgggcca aggtgat
<210> 29 <211> 57 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены.домена
<400> 29
atcaccttgg cccagccggt gacggagaag ttcaccctgt aggtgctgta gctgtcg 57
<210> 30 <211> 47 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 30
gcttcagcgg cctcgacgcc aatgtgagga tcagaaacag ccgcggc 47
<210> 31 <211> 47 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 31
gccgcggctg tttctgatcc tcacattggc gtcgaggccg ctgaagc 47
<210> 32 <211> 59 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 32
gtgaagaaca gccgcgaggt gctcttcgag aagagataca tgaatggaag cagctatga 59
<210> 33 <211> 59 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 33
tcatagctgc ttccattcat gtatctcttc tcgaagagca cctcgcggct gttcttcac 59
<210> 34 <211> 54 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 34
ttcgagaagg tgaagaacag cggcgccaag gatgtttcag agagcttcac cacc 54
<210> 35 <211> 54 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 35
ggtggtgaag ctctctgaaa catccttggc gccgctgttc ttcaccttct cgaa 54
<210> 36 <211> 53 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 36
gcttcttcat cgagctcagc caaggcaaca acctctatag cagcaccttc cac 53
<210> 37 <211> 53 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 37
gtggaaggtg ctgctataga ggttgttgcc ttggctgagc tcgatgaaga age 53
<210> 38 <211> 51 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 38
gaagcaaggc gctctatgtt cacaaggatg gaggcttcag ccagttcatc g 51
<210> 39
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена
<400> 39
cgatgaactg getgaagect ccatccttgt gaacatagag cgccttgctt с 51
<210> 40 <211> 50 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 40
ccgccgagag gacaggaggg ccgctggtga agttcagaga catcagcatc 50
<210> 41 <211> 50 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 41
gatgctgatg tctctgaact tcaccagcgg ccctcctgtc ctctcggcgg 50
<210> 42 <211> 48 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 42
agcaccttcc acagcttcaa tgatgtgagc atcaagtaag gcgcgccg 48
<210> 43 <211> 48 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 43
cggcgcgcct tacttgatgc tcacatcatt gaagctgtgg aaggtgct 48
<210> 44
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена
<400> 44
cgacaagcta aagcccaaga cagaatatgt catccagtac accgtcaag 4 9
<210> 45 <211> 49 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 45
cttgacggtg tactggatga catattctgt cttgggcttt agcttgtcg 49
<210> 46 <211> 56 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 46
cctacgagga caccaataac aacaacctgg aggactacca aacaattgct gtgaag 56
<210> 47 <211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 47
cttcacagca attgtttggt agtcctccag gttgttgtta ttggtgtcct cgtagg 56
<210> 48 <211> 57 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 48
gaggagttcc aaacaattac caagaggttc accaccggca cagatttgag ccagacc 57
<210> 49 <211> 57 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 49
ggtctggctc aaatctgtgc cggtggtgaa cctcttggta attgtttgga actcctc 57
<210> 50 <211> 58 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 50
cacctcagaa acagatttga agggcgtcta cctcatcttg aagagccaaa atggatat 58
<210> 51 <211> 58 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 51
atatccattt tggctcttca agatgaggta gacgcccttc aaatctgttt ctgaggtg 58
<210> 52
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена
<400> 52
tcctggaggc caagccatca gagaagctgc tcagcccgga gctca
<210> 53 <211> 45 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 53
tgagctccgg gctgagcagc ttctctgatg gcttggcctc cagga 45
<210> 54 <211> 67 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 54
atcattcaag aggaggcaac ctcaagcaga acctccagct tgacagcttc agcacctacg 60 acctcag 67
<210> 55 <211> 67 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 55
ctgaggtcgt aggtgctgaa gctgtcaagc tggaggttct gcttgaggtt gcctcctctt 60 gaatgat 67
<210> 56 <211> 70 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 56
gctatgagga catctcagag atcttcacca ccaagctggg caaggacaac ttctacatcg 60 agctcaccgc 70
<210> 57 <211> 70 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 57
gcggtgagct cgatgtagaa gttgtccttg cccagcttgg tggtgaagat ctctgagatg 60 tcctcatagc 70
<210> 58 <211> 69 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 58
caagggcaag ccgtcaatcc acctcaagaa tgagaacacc ggctacatcc actacgagga 60 caccaatgg 69
<210> 59 <211> 69 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 59
ccattggtgt cctcgtagtg gatgtagccg gtgttctcat tcttgaggtg gattgacggc 60 ttgcccttg ' 69
<210> 60 <211> 76 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 60
caagagccaa aatggagatg aagcatgggg agacaacttc accatcctgg agatctcgct 60 cttcgagaca ccagaa 76
<210> 61 <211> 76 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> олигонуклеотидный праймер для замены домена <400> 61
ttctggtgtc tcgaagagcg agatctccag gatggtgaag ttgtctcccc atgcttcatc 60 tccattttgg ctcttg 7 6
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
a) нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12 или ее комплемента;
b) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 96%-ную идентичность, последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:1 или 12, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью, или ее комплемента;
c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%-ную идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:3, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью, или ее комплемента;
d) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14;
e) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:4 или 14, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью;
f) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:6, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью; и
д) нуклеотидной последовательности, кодирующей
инсектицидный полипептид, который представляет собой вариант SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14, где указанный вариант является результатом обмена одного или более доменов SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14 с соответствующим доменом (ами) SEQ ID N0:4, 5, б, 13
или 14.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой синтетическую последовательность, которая была разработана для экспрессии в растении.
3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, где указанная синтетическая последовательность выбрана из любой из SEQ ID N0:15, 16, 17 или 18.
4. Экспрессионная кассета, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
5. Экспрессионная кассета по п.4, дополнительно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный полипептид.
6. Растение или бактериальная клетка-хозяин, которые содержат экспрессионную кассету по п.4.
7. Выделенный полипептид с инсектицидной активностью, выбранный из группы, состоящей из:
a) полипептида, включающего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14;
b) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:4 или 14, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью;
c) полипептида, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:6, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью;
d) полипептида, который кодируется любой нуклеотидной последовательностью из SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12;
e) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 96% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:1 или 12, где указанный полипептид обладает инсектицидной активностью;
f) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 90% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:3, где указанный полипептид обладает инсектицидной активностью; и
д) полипептида, который представляет собой вариант SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14, где указанный вариант является результатом обмена одного или более доменов SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14 с соответствующим доменом(ами) SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14, где указанный полипептид обладает инсектицидной активностью.
8. Полипептид по п.7, дополнительно включающий гетерологичные аминокислотные последовательности.
9. Антитело, которое селективно связывается с полипептидом по п. 7 .
10. Композиция, включающая полипептид по п.7.
11. Композиция по п.10, где указанная композиция выбрана из группы, состоящей из порошка, пылевидного препарата, шарика, гранулы, спрея, эмульсии, коллоида и раствора, и где указанную композицию необязательно приготавливают при помощи сушки, лиофильной сушки, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрации культуры клеток Bacillus thuringiensis.
12. Способ контролирования или уничтожения популяции чешуекрылых или жесткокрылых насекомых-вредителей, включающий приведение указанной популяции в контакт с инсектицидно эффективным количеством полипептида по п.7.
13. Способ продуцирования полипептида с инсектицидной активностью, включающий культивирование клеток-хозяев по п. б в условиях, при которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид.
14. Растение, имеющее стабильно встроенную в свой геном конструкцию ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью, где указанную нуклеотидную последовательность выбирают из группы, состоящей из:
а) нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID N0:1,
2, 3, 11 или 12;
b) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:1 или 12, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью;
c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:3, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью;
d) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14;
e) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:4 или 14, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью;
f) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:6, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью; и
д) нуклеотидной последовательности, кодирующей
инсектицидный полипептид, который представляет собой вариант SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14, где указанный вариант является результатом обмена одного или более доменов SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14 с соответствующим доменом (ами) SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14;
где указанная нуклеотидная последовательность является функционально связанной с промотором, который направляет экспрессию кодирующей последовательности в клетке растения.
15. Растение по п.14, где указанное растение представляет
собой клетку растения.
16. Трансгенное семя растения по п.14, где указанное семя включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
a) нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12;
b) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:1 или 12, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью;
c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:3, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью;
d) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14;
e) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:4 или 14, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью;
f) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:6, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью; и
д) нуклеотидной последовательности, кодирующей
инсектицидный полипептид, который представляет собой вариант SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14, где указанный вариант является результатом обмена одного или более доменов SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14 с соответствующим доменом(ами) SEQ ID N0:4, 5, б, 13
или 14.
17. Способ защиты растения от насекомого-вредителя, включающий введение в указанное растение или его клетку, по меньшей мере, одного экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует инсектицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
a) нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID N0:1, 2, 3, 11 или 12;
b) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:1 или 12, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью;
c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:3, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, обладающий инсектицидной активностью;
d) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14;
e) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 96%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:4 или 14, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью; и
f) нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%-ую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:6, где указанная аминокислотная последовательность обладает инсектицидной активностью;
д) нуклеотидной последовательности, кодирующей
инсектицидный полипептид, который представляет собой вариант
SEQ ID N0:4, 5, 6, 13 или 14, где указанный вариант является результатом обмена одного или более доменов SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14 с соответствующим доменом (ами) SEQ ID N0:4, 5, б, 13 или 14.
18. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, полипептид по п.7, растение по п.14, клетка растения по п. 15, семя по п. 16 или способ по п. 17, где указанные один или более доменов выбраны из доменов, охарактеризованных на Фигуре 2 .
19. Растение по п.14, клетка растения по п.17, семя растения по п.18 или способ по п.19, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, помидора, крестоцветных, перцев, картофеля, хлопка, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.
По доверенности
1/3
173234
Optaxmi113 MNMNNTKLSTRALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMNMIFKTDTGGDLTLDEILKNQQLLNE 60
Optaxmi005 MNMNNTKLNARALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMffiyllFKTDTGGNLTLDEILKNQQLLNE 60
Optaxmill5 Ml^NNTKXNARALPSFIDYFNGIYGFATGIKDI> DMIFKTDTGGDLTLDEILKNQQLLNE 60
******** .**********************************•***************
Optaxmill3 ISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVLNDVNNKLDAINTMLHIYLPK 120
Optaxmi005 ISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVLNDVNNKLDAINTMLHIYLPK 120
Optaxmill5 ISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVLNDVNNKLDAINTMLNIYLPK 120
******* ******** ***************************************;*****
Optaxmill3 ITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSKQLQEISDKLDIINVNVLINSTLTEITPAYQRIKYVN 18 0
Optaxmi005 ITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSKQLQEISDKLDIINVNVLINSTLTEITPAYQRIKYVN 18 0
Optaxmill5 ITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSRQLQEISDKLDVINLNVLINSTLTEITPSYQRIKYVN 180
*********************** - ********** . **- ************* - ********
0ptaxmill3 EKFEELTFATETNLKVKK-----DGSPADILDELTELTELAKSVTKNDVDGFEFYLNTFH 235
Optaxmi005 EKFEELTFATETTLKVKK-----DSSPADILDELTELTELAKSVTKNDVDGFEFYLNTFH 235
Optaxmill5 EKFDKLTFATESTLRAKQGIFNEDSFDNNTLENLTDLAEIAKSITKMDVDSFEFYLHTFH 240
***-; ******. ш*.e* - *^ • *..**.*.*****.******_*****.***
Optaxmill3 DVMVGNNLFGRSALKTASELITKENVKTSGSEVGNVYNFLIVLTALQAKAFLTLTTCRKL 295
Optaxmi005 DVMVGNNLFGRSALKTASELIAKENVKTSGSEVGNVYNFLIVLTALQAKAFLTLTTCRKL 295
Optaxmill5 DVLIGNNLFGRSALKTASELITKDEIKTSGSEIGKVYSFLIVLTSLQAKAFLTLTTCRKL 300
**..*****************•*• • .******.*.**_******•***************
Optaxmill3 LGLADIDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPNYIKTKGSDEDAEVIIQAEPGH 355
Optaxmi005 LGLADIDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPNYAKVKG5DEDAKMIVEAKPGH 355
Optaxmill5 LGLSDIDYTSIMNEHLNNEKNEFRDNILPALSNKFSNPSYAKTIGSDNYAKVILESEPGY 360
***.*************-**.*** ****.***ш****r* *^ ***.
Optaxmill3 ALVGFEMINDPSPALKVYQAKLTTNYQVDKQSLSETVYGDMDKILCPDKSQQMYYLHNIT 415
Optaxmi005 ALVGFEMSNDSITVLKVYEAKLKQNYQVDKDSLSEVIYGDMDKLLCPDQSEQIYYTNNIV 415
Optaxmill5 ALVGFEIINDPIPVLKAYKAKLKQNYQVDNQSLSEIVYLDIDKLFCPENSEQKYYTKNLT 420
******. ** ** *.*** *****..**** -* *-**..**..*.* ** ;*;.
Optaxmill3 FPNEYVITEIIFTKKKNSLRYEVIANYYEFSSGDIDLNKKLVKS-SEAEYSTLSVSND- 472
Optaxmi005 FPNEWITKIDFTKKMKTLRYEVTANSYDSSTGEIDLNKKKVES-SEAEYRTLSAKDD- 472
Optaxmill5 FPDGYVITKITFEKKLNNLIYEATANFYDPSTGDIDLNKKQVESTFPQTDYITMDIGDDD 480
**. ****** * ** - * ** ** *• *.*.****** *.* ...* *. .*
Optaxmill3 Optaxmi005 Optaxmill5
Optaxmill3 Optaxmi005 Optaxmill5
AIYMPLGVISETFLTPIKGFGLTVDESSRLVTLTCKSYLREILLATDLSNKATKLIVPPN 532 GVYMPLGVISETFLTPINGFGLQADENSRLITLTCKSYLRELLLATDLSNKETKLIVPPS 532 GIYMPLGVISETFLTPINSFGLEVDAKSKTLTLKCKSYLREYLLESDLKNKETGLIAPPN 540
.***************•_*** _* *; ***_******* ** .**^** * **_**_
GFISNLVENGDIEADN^EPWKGNNKNAYVDHTGGVNGTKALYTQDDGEFSQFIGDKLKSK 592 GFISNIVENGNLEGENLEPWIANNKNAYVDHTGGVNGTRALYVHKDGGFSQFIGDKLKPK 592 VFISNWKNWDIEEDSLEPWVANNKNAYVDNTGGIERSKALFTQGDGEFSQFIGDKLKPN 600 ****•*•* -•* • .*** ********-***-. ..**. . ** ********** .
Optaxmill3 TEYIIQYTVKGNTSIYLKT)KKNENVIYEDKNNNLEAFQTITKRFTTELDSSDVYLVFKCK 652
Optaxmi005 TEYVIQYTVKGKPSIHLKNENTGYIHYEDTNNNLEDYQTITKRFTTGTDLKGVYLILKSQ 652
Optaxmill5 TDYIIQYTVKGKPAIYLKNKSTGYITYEDTNGNSEEFQTIAVKFTSETDLSQTHLVFKSQ 660
*-*.*******• .*.**.. . *** * * * .***• .**. * .*..* -
ФИГ.1А
2/3
Optaxmill3 MGYKAKGDNFLITEIRPKE-VVSPELIKVENWIGMGGSNHVNPDSLLLFTGGRSILKQNL 711
Optaxmi005 KGDEAHGDNFTILEISPSEKLLSPELINVNNWIRTG-STHISGNTLTLyQGGGGMLKONb 711
Optaxmill5 KGYEAWGDNFIILEAKLFETPESPELIKFNDWERFG-TTYITGNELRIDHSRGSYFRQSL 719
** . ****** * *
Optaxmill3 OLDSYSTYRVRFSIiMVIGKAKVIIRNSS-SVLFEKSYVNDSEGVLEGVSETFTTKSIQDN 770
OptaxmiOOS QLDSFSTYRVNFS- -VTGDANVRIRN5R-EVLFEKRYMSG----AKDVSEIFTTKLGKDN 761
Optaxmill5 NIDSYSTYDLSFS- FSGLWAKVIVKNSRGWLFBKVKNNGSS - -YEDISESFTTASNKDG 776
* . * . - * *
Optaxmill3 FYVELSNEGTFGSKDVAYFYNFSIR---- 795
Optaxmi005 FYIELSQGNNLYGGPLVKPNDVSIK.---- 789
Ootaxmill5 FFIELTAER--TSSTFHSFRDISIKEKIE 803
ФИГ.1В
(91_ ю ......20...........за <и...... ' *go so то ^ tii s8
.....:................................................................_, ".........,.,"......................_.........,.....................-,-............................Section 2
(so) so , ,106 ," W t & № № ......._______________j.g> ........................"..................m
.................................................................................................................... ........................... .............. .............................................. Seeticn 3
(179) 179 ISO 200 210 220 2ЭЭ 233 ZBO 267
"","085 (174) ушоЖьта^
................................................................................................,,............................... Seeh oc" 4
pes) a> 8 2so 300 3io..... . зга ..... ш .....yo .t , . ass
мшИКСги) T303EfЈKVTSFuRTLT§L0AKAfLTLT^
,.......,., ...".,........................,..................................................."...........................................................................................................-.......:., ,...................-...................................................................... ..............................•-¦.......-C"^Hw> <
557...... 37Q 380___ЗЭО........^ и | 400' . 410. , и|.......f№...................im :iil.....330 n......u.........^..... :...............^
"*miOC5 (3S.i) KP5?Ab/ &f fcl|S"03ITVIKViEAXlI'OJrfO^K &SlSESjlYGPtlKt.LCPDastOIYY-llWlVf ITKII)FTKK§KTLRUVTA swrtie <3S?) EPGY &LVC%fSIIHJD-PIfVLKXYmiK0KY3Vra03tSEb'?YLDlPKI,FCpjEe;'EQKVҐTKKЈT)- PDGWltKITfESKfiHMiХТЙАТА
(*Ф .ft? ...........................
m № 433 |S0 ffO 520 534
sss)536 ii0...._.......^............gso.................S60u............... ........s?^.....^l^sa
ЗЙ"Ш (535) r u 'NVf ^W/K4liDt?E"3tE'-V^/ <'4' " П'ЦГЧ flSft"**
rtroT......t
610
%dter> 7 4 4"
-1 '-йвевоп"**'
prat т--Ца-~, р-щО* -41^ р^йЛб-^р-^-п р-щЗД-n ?gibJI----^#-~ir-^^[
№5^ -I7S0)
EKIE