Данное изобретение касается применения по крайней мере одного белка, в частности одного гидрофобина или по крайней мере одного его производного, для улучшения разделения фаз в составах, содержащих по меньшей мере две жидкие фазы, способа разделения по меньшей мере двух жидких фаз в составе, содержащем по меньшей мере две жидкие фазы, а также композиций, содержащих по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей, по меньшей мере, из горючего, топлива, сырой нефти или растворов полимеров, растворимых в воде или в масле, и по меньшей мере одного белка, в частности гидрофобина или его производного.

 

(57) Реферат / Формула:
изобретение касается применения по крайней мере одного белка, в частности одного гидрофобина или по крайней мере одного его производного, для улучшения разделения фаз в составах, содержащих по меньшей мере две жидкие фазы, способа разделения по меньшей мере двух жидких фаз в составе, содержащем по меньшей мере две жидкие фазы, а также композиций, содержащих по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей, по меньшей мере, из горючего, топлива, сырой нефти или растворов полимеров, растворимых в воде или в масле, и по меньшей мере одного белка, в частности гидрофобина или его производного.

 

---

ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ В КАЧЕСТВЕ ДЕЭМУЛЬГАТОРОВ
Описание
Настоящее изобретение касается применения, по крайней мере, одного гидрофобина или, по крайней мере, его производного для улучшения фазового разделения в составах, содержащих, по крайней мере, две жидкие фазы, способа разделения, по крайней мере, двух жидких фаз в составах, состоящих, по крайней мере, из двух жидких фаз, а также композиций, содержащих, по крайней мере, одно соединение из группы, состоящей из горючего, топлива, сырой нефти или растворов полимеров, растворимых в воде или в масле, и, по крайней мере, одного гидрофобина или его производного.
Гидрофобины - это низкомолекулярные белки из 100 - 500 аминокислот, характерные для нитевидных грибов, например. Schizophyllum commune. Во всех случаях они имеют 8 фрагментов цистеина.
Гидрофобины имеют ярко выраженное свойство разделения поверхностей раздела и поэтому годятся для покрытия поверхностей, чтобы изменить их раздел путем образования обволакивающих пленок. Таким образом, можно, например, нанести покрытие на тефлон с помощью гидрофобинов для получения гидрофильной поверхности.
Гидрофобины могут быть выделены из природных источников. Известны также способы получения гидрофобинов и их производных. Например, в DE 10 2005 007 480.4 опубликованы способы получения гидрофобинов и их производных.
Современный уровень техники предлагает использование гидрофобинов для различных применений.
WO 96/41882 предлагает использование гидрофобинов в качестве эмульгаторов, поверхностно-активных веществ, для придания гидрофильных свойств гидрофобным поверхностям, для улучшения водостойкости гидрофильных подложек, для изготовления эмульсий масло-в-воде или вода-в-масле. Предлагаются также применения в фармакологии, например, для приготовления мазей или кремов, а также в косметике как средства для защиты кожи или для изготовления шампуней или лосьонов для волос. WO 96/41882 описывает составы, содержащие гидрофобины, в особенности составы для фармацевтических применений.
В патенте ЕР-А 1 252 516 показано покрытие окон, контактных линз, биодатчиков, медицинских приспособлений, емкостей для проведения опытов или для их хранения, корабельных корпусов, твердых частиц или рам и кузовов легковых автомобилей раствором, содержащим гидрофобины, при температуре от 30 до 80°С.
В WO 03/53383 показано применение гидрофобина для обработки кератиновых материалов в косметических целях.
В WO 03/10331 показано, что гидрофобины обладают поверхностно-активными свойствами. Так, показан покрытый гидрофобином датчик, например, измерительный электрод, с которым связаны не ковалентно другие вещества, например, электроактивные вещества, антитела или энзимы.
В WO 2004/000880 также показано покрытие поверхностей гидрофобином или аналогичными ему веществами. Кроме того, показано, что даже такие эмульсии, как масло-в-воде или вода-в-масле могут быть стабилизированы путем добавки гидрофобинов.
В патенте WO 01/74864 рассматриваются также подобные гидрофинам белки и показано, что они могут использоваться для стабилизации дисперсий и эмульсий.
Применение белков для разделения фаз, в принципе, известно.
В GB 195,876 показан способ расслоения эмульсии вода-в-масле с применением коллоидов. В качестве коллоидов приведены характерные белки, такие как желатин, казеин, альбумин, или полисахариды, такие как гуммиарабик или трагакантовая камедь.
В JP-A 11-169177 показано применение белков с липазной активностью для расслоения эмульсий,
В WO 01/60916 показано применение не содержащих поверхностно-активных веществ смесей из, по меньшей мере, одного водорастворимого белка, по меньшей мере, одного водорастворимого полисахарида и, по меньшей мере, одного водорастворимого полимера, как например, окиси полиэтилена для различньгх использований, среди прочего и для деэмульгирования сырой нефти.
Ни одна из приведенных работ не указывает на применение гидрофобинов для разделения фаз.
Преимущество применения белков состоит в том, что речь идет о веществах природного происхождения, которые способны к биологическому расщеплению, и поэтому не загрязняют окружающую среду.
Для многих операций в крупных масштабах, например, для разделения эмульсий неочищенная нефть-в-воде, требуется возможно быстрое разделение фаз. Задачей изобретения было получение улучшенного способа разделения фаз с использованием белков.
Согласно изобретению эта задача решается путем применения, по меньшей мере, одного гидрофобина для улучшения разделения фаз в составах, содержащих, как минимум, две жидкие фазы.
При этом гидрофобии согласно изобретению может добавляться, в принципе, в любых количествах, пока не будет удостоверено, что улучшено разделение фаз в составах, содержащих, как минимум две жидкие фазы.
Под термином "улучшение разделения фаз" в рамках данного изобретения понимается, что разделение двух жидких фаз при добавлении какого-либо вещества к смеси осуществляется быстрее, чем без добавления вещества к этой же смеси, или что разделение двух жидких фаз вообще возможно только путем добавления этого вещества.
Понятие гидрофобии в рамках данного изобретения включает также его производные, а также модифицированный гидрофобии. Относительно модифицированного и дериватизированного гидрофобинов речь может идти.
например, о смеси белков с гидрофобином или о белках с аминокислотной последовательностью, которая идентична последовательности гидрофобина, как минимум, на 60%, например, не менее 70 %, лучше не менее 80 %, особенно предпочтительно не менее 90%, а наиболее предпочтительно не менее 95%, и которая до 50%, например, до 60%, лучше до 70%, и особенно предпочтительно до 80% удовлетворяет биологическим свойствам гидрофобина, в особенности свойству, которое путем нанесения этих белков так изменяет поверхностные свойства, что увеличение краевого угла смачивания водной капли перед нанесением белка и после его нанесения на стеклянную поверхность составляет не менее 20°, предпочтительно не менее 25°, особенно предпочтительно не менее 30°.
Неожиданно было найдено, что гидрофобины или их производные улучшают разделение, как минимум, двух жидких фаз.
Это имеет особенное преимущество, когда должно быть осуществлено быстрое разделение фаз, или для предотвращения образования эмульсии. При этом уже небольшие количества действуют чрезвычайно эффективно. Это свойство может быть также использовано, если необходимо разрушить уже образовавшуюся эмульсию. Соединения, которые разрушают эмульсию, называются деэмульгаторами.
Поэтому данное изобретение касается, по меньшей мере, одного гидрофобина или, по меньшей мере, одного производного гидрофобина для описанного выше применения, причем, по меньшей мере, один гидрофобии или, по меньше мере, одно производное гидрофобина используется в качестве деэмульгатора.
Для определения гидрофобинов решающим является специфичность структуры, а не последовательности. Аминокислотная последовательность природных гидрофобинов очень различная, однако они все имеют очень характерный участок из 8 постоянно присутствующих цистеиновых остатков. Эти остатки образуют четыре внутримолекулярных дисульфидных мостика.
N-конец и С-конец являются вариабельными в широком диапазоне. Здесь с помощью известных специалисту методов молекулярной биологии могут быть присоединены белки партнеров слияния с длиной от 10 до 500 аминокислот.
Исходя из этого, под понятием гидрофобины и их производные следует понимать в смысле данного изобретения белки с аналогичной структурой и функциональной эквивалентностью.
Под понятием "гидрофобины" в смысле данного изобретения следует понимать в дальнейшем полипептиды общей структурной формулы (I)
Xn-C'-Xi-5o-C2-Xo-5-C3-Xi.ioo-C4-Xi.ioo-C5-X].5o-C6-Xo-5-C7-X].5o-C8-Xm (I),
причем X может представлять любую из 20 аминокислот природного происхождения (Phe, Leu, Ser, Туг, Cys, Trp, Pro, His. Gin, Arg, lie Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly). При этом X могут быть одинаковыми или разными. Индексы, стоящие при X, представляют собой соответственно количество аминокислот, С представляет собой цистеин, аланин, серии, глицин, метионин или треонин, причем, по меньшей мере, четыре из названных С групп представляют цистеины. а индексы пит
независимо друг от друга представляют собой натуральные числа от 0 до 500, предпочтительно от 15 до 300.
Полипептиды согласно формулы (I) характеризуются тем свойством, что после нанесения их на стеклянную поверхность при комнатной температуре наблюдается увеличение краевого угла смачивания водной капли, по меньшей мере, на 20°, предпочтительно, не менее 25°. а особенно предпочтительно на 30°. по сравнению с краевым углом водной капли такого же размера на непокрытой стеклянной поверхности.
Обозначенные С - С аминокислоты являются предпочтительно цистеинами, но они могут быть заменены и другими аминокислотами подобной плотности упаковки, предпочтительно аланином, серином, треонином, метионином или глицином. Во всяком случае, по крайней мере, четыре, предпочтительно не менее 5, особенно предпочтительно не менее 6, а наиболее предпочтительно не менее 7 позиций от С1 до С8 должны быть цистеинами. Цистеины в белках согласно изобретению могут быть либо редуцированными, либо образовывать друг с другом дисульфидные мостики.
Особенно предпочтительно внутримолекулярное образование С-С мостиков, в особенности, по крайней мере, с одним дисульфидным мостиком, предпочтительно с двумя, особенно предпочтительно с 3, и наиболее предпочтительно с 4 внутримолекулярными дисульфидными мостиками. При описанном выше замещении цистеинов аминокислотами с аналогичным объемом попарно заменяются предпочтительно такие С-позиции, которые могут образовывать между собой внутримолекулярные дисульфидные мостики.
Если в позициях, обозначенных X, используются цистеины, серины, аланины, метионины или треонины, то нумерация отдельных С-позиций в общих формулах может соответствующим образом изменяться.
Для реализации данного изобретения предпочтительно применялись гидрофобины общей формулы (II)
Хп-С'-Хз.25-С2-Хо-2-С3-Х5.50-С4-Х2-35-С5-Х2.15-С6-Хо.2-С7-Хз.35-С8-Хт (II),
где X, С и стоящие при X и С индексы имеют описанные выше значения, индексы п и m представляют собой числа от 0 до 300. и белки выгодно характеризуются упомянутым выше свойством изменения краевого угла смачивания, и, по меньшей мере, для 6 обозначенных С остатков речь идет о цистеине. Особенно предпочтительно наличие цистеина во всех остатках С.
Особенно предпочтительно применение гидрофобинов общей формулы (III)
Xn-C'-X5-9-C2-C3-Xi |_з9-С4-Х2-23-С5-Х5.9-С6-С7-Хб-18-С8-Хт (III)
где X, С и стоящие при X и С индексы имеют описанные выше значения, индексы п и m представляют числа от 0 до 200, и белки выгодно характеризуются упомянутым выше свойством изменения краевого угла смачивания, и, по меньшей мере, для 6 обозначенных С остатков речь идет о цистеине. Особенно предпочтительно наличие цистеина во всех остатках С.
В случае остатков Х" и Хт речь может идти о последовательностях пептидов, которые также соединены естественно с гидрофобином. Однако в случае одного или обоих остатков может идти речь также о последовательностях пептидов, которые не соединены естественно с гидрофобином. Под такими остатками следует понимать остатки Х" и/или Хт, у которых встречающиеся в природе в гидрофобине последовательности пептидов удлиняются последовательностями пептидов, не встречающимися в гидрофобине в природе.
В случае, если для Хп и/или ХП1 речь идет о не соединенных естественно в гидрофобине последовательностях пептидов, такого рода последовательности имеют, как правило, длину не менее 20, предпочтительно не менее 35, особенно предпочтительно не менее 50 и наиболее предпочтительно не менее 100 аминокислот. Такой остаток, не соединенный естественно с гидрофобином, в дальнейшем будет обозначаться также как партнер слияния. Этим будет выражаться то, что белки могут состоять по меньшей мере из гидрофобиновой части и части партнера слияния, которые в природе в таком виде вместе не существуют.
Часть - партнер слияния может быть выбрана из множества белков. С гидрофобиновой частью могут также соединяться несколько партнеров слияния, например, у аминного конца (Хп) и у карбокси-конца (Хт) гидрофобиновой части. Однако с позициями (Хп или ХП1) белка согласно данному изобретению могут соединяться также, например, два партнера слияния.
Наиболее подходящими партнерами слияния являются белки, которые в природе встречаются в микроорганизмах, например, в Е. Coli или Bacillus subtilis. Примерами таких партнеров слияния являются последовательности yaad (SEQ ID NO:
15 и 16), уаае (SEQ ID NO: 17 и 18) и тиоредоксин. Подходят также фрагменты или производные этих вышеназванных последовательностей, которые охватывают только часть, например, 70 - 99%, предпочтительно 5 - 50% и наиболее предпочтительно 10 - 40% названных последовательностей, или у которых отдельные аминокислоты или, точнее говоря, нуклеотиды изменены по сравнению с названной последовательностью, причем процентные данные соответственно относятся к числу аминокислот.
В другом предпочтительном варианте осуществления фузионный гидрофобии имеет кроме партнера слияния в качестве группы Хп или Хт еще так называемые домены сродства (affinity tag / affinity tail). При этом речь идет в принципе об известных якорных группах, которые могут взаимодействовать с некоторыми комплементарными группами и предназначаться для облегчения обработки и очистки белков. Примерами таких доменов сродства служат (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- или (Cys)k-rpynnbi, причем k означает в общем случае натуральное число от 1 до 10. Предпочтительно может идти речь о (His)k-rpynne, причем к означает 4-6.
Согласно изобретению белки, используемые в качестве гидрофобинов или производных гидрофобинов, могут также быть модифицированными в их полипептидной последовательности, например, путем гликозирования, ацетилирования или также за счет химической сшивки, например, глутаровым альдегидом.
Свойством используемых согласно изобретению гидрофобинов или их производных является изменение свойств поверхностей, если поверхности
покрываются белками. Изменение поверхностных свойств можно определить экспериментально, например, измеряя краевой угол капли воды до нанесения покрытия и после нанесения покрытия с белками на поверхность и определяя разницу между этими двумя измерениями.
Метод измерения краевых углов в принципе известен специалисту. Измерения проводятся при комнатной температуре на капле воды в 5 мкл при использовании в качестве субстрата стеклянных пластинок. Точные экспериментальные условия пригодного метода измерения краевого угла указаны в экспериментальной части. При названных там условиях используемые согласно данному изобретению слитые белки обладают свойством увеличивать краевой угол капли воды не менее чем на 20°, предпочтительно не менее чем на 25°, наиболее предпочтительно не менее чем на 30°, соответственно, по сравнению с краевым углом равной по величине капли воды на стеклянной поверхности без покрытия.
Наиболее предпочтительными гидрофобинами для осуществления данного изобретения являются гидрофобины типа dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, которые структурно охарактеризованы в нижеследующем протоколе последовательностей. Однако речь может идти только о части или производном. Также несколько гидрофобиновых частей, предпочтительно 2 или 3, с одинаковой или различной структурой могут соединяться друг с другом и с соответствующей подходящей последовательностью полипептидов, которая не связана естественно с гидрофобином.
Наиболее подходящими для данного изобретения являются слитые белки yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) или yaad-Xa
basfl-his (SEQ ID NO: 24) с указанными в скобках последовательностями полипептидов, а также кодирующими для них последовательностями нуклеиновых кислот, в особенности последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 19, 21, 23. Наиболее предпочтительные варианты осуществления представляют собой также белки, которые получаются, исходя из представленных в SEQ ID NO: 20, 22 или 24 последовательностей полипептидов, путем замещения, вставки или делении по меньшей мере одной аминокислоты, до 10, предпочтительно 5, в особенности 5% всех аминокислот, и которые обладают биологическими свойствами исходного белка еще по меньшей мере на 50%. Под биологическими свойствами белков следует понимать уже описанное изменение краевого угла по меньшей мере на 20°.
Наиболее подходящими для осуществления изобретения производными являются yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) или yaad-Xa-basf 1-his (SEQ ID NO: 24) за счет сокращения остатка, имеющего происхождение от yaad-партнера слияния. Вместо полного yaad-партнера слияния (SEQ ID NO: 16) с 294 аминокислотами с успехом может использоваться укороченный yaad-остаток. Но укороченный остаток должен включать по меньшей мере 20, предпочтительно не менее 35 аминокислот. Например, может использоваться укороченный остаток с 20 - 293, предпочтительно с 25 - 250, особенно предпочтительно с 35 - 150 и наиболее предпочтительно с 35 - 100 аминокислотами.
Место разрыва между гидрофобином и партнером слияния или слитыми партнерами может использоваться для того, чтобы высвободить чистый гидрофобии в неизмененном виде (например, путем BrCN-расщепления у метионина, расщепления фактором Ха, расщепления энтерокиназой, тромбинового расщепления, TEV-расщепления и т.п.).
Далее, можно получать поочередно слитые белки из партнера слияния, например yaad или уаае, и нескольких гидрофобинов. также с различными последовательностями, например, DewA-RodA или Sc3-DewA, Sc3-RodA). Также можно использовать гидрофобиновые фрагменты (например, укороченные с N- или С-концов) или мутеины, которые имеют до 70% гомологии. Выбор оптимальных конструктов происходит в расчете на соответствующее использование, т.е. применительно к разделяемым жидким фазам.
Используемые согласно данному изобретению гидрофобины, иначе гидрофобины, содержащиеся в композициях согласно данному изобретению, можно получать химическим путем с помощью известных методов синтеза пептидов, например, твердофазным синтезом по Меррифилду.
Встречающиеся в природе гидрофобины можно выделить из природных источников с помощью подходящих методов. Сошлемся, например, на работу Wosten et. al" Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) или WO 96/41882.
Получение слитых белков предпочтительно может осуществляться методами генной инженерии, при которых последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие для партнера слияния и для гидрофобиновой части, в частности последовательности ДНК, комбинируются таким образом, что в организме хозяина путем экспрессии генов комбинированной последовательности нуклеиновых кислот получается желаемый белок. Такой метод получения описан, например, в DE 10 2005 007 480.4.
Подходящими организмами-хозяевами для названного метода получения могут быть при этом прокариоты (включая Archaea) или эукариоты, особенно бактерии, включая галобактерии и метанококки, грибы, клетки насекомых, растений и млекопитающих, наиболее предпочтительны Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (или родственные клетки) и др.
Кроме того, предметом изобретения является применение экспресс ионных конструктов, содержащих кодирующую последовательность нуклеиновых кислот для используемого согласно изобретению полипептида, находящихся под генетическим контролем регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, а также векторы, включающие хотя бы один из таких экспрессионных конструктов.
Используемые конструкты предпочтительно охватывают выше 5'-конца от соответствующей промоторной кодирующей последовательности и ниже 3'-конца терминаторной последовательности, а также при необходимости другие обычные регуляторные элементы, а именно соответственно оперативно соединенные с кодирующей последовательностью.
Под понятием "оперативное соединение" в рамках данного изобретения понимают последовательное расположение промотора, кодирующей последовательности, терминатора и при необходимости других регуляторных элементов таким образом, что каждый из регуляторных элементов может выполнять по назначению свои функции при экспрессии кодирующей последовательности.
Примерами оперативно соединяемых последовательностей являются целевые последовательности, а также энханцеры, сигналы полиаденилирования и тому подобное. Другие регуляторные элементы включают способные к отбору маркеры, амплификационные сигналы, начала репликации и тому подобное. Подходящие регуляторные последовательности, например, описаны в книге Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
В дополнение к этим регуляторным последовательностям может еще иметь место естественная регуляция этих последовательностей от собственных структурных генов и при необходимости генетически она может быть изменена, так чтобы естественная регуляция исключалась и усиливалась экспрессия генов.
Предпочитаемый конструкт из нуклеиновых кислот предпочтительно содержит также один или несколько так называемых "энханцер"-последовательностей, функционально соединенных с промотором, которые дают возможность усиленной экспрессии последовательности нуклеиновых кислот. Также у 3'-конца последовательности ДНК могут помещаться дополнительные полезные последовательности, такие как другие регуляторные элементы и терминаторы. Нуклеиновые кислоты могут содержаться в конструкте в одной или нескольких копиях. В конструкте могут еще содержаться другие маркеры, такие как гены, комплементирующие устойчивость к антибиотикам или ауксотрофии, при необходимости для селекции на конструкте.
Предпочитаемые регулирующие последовательности для получения содержатся, например, в промоторах, таких как cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-,
Ipp-lac-, laclq-T7-, T5-, T3-. gal-, trc-. ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, лямбда-PR- или в лямбда-Р-промоторе, которые находят применение в грам-отрицательных бактериях. Другие предпочтительные регулирующие последовательности содержатся, например, в грам-положительных промоторах amy и SP02, в дрожжевых или грибковых промоторах ADC1, МРальфа, АС, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Для регуляции могут использоваться также искусственные промоторы.
Конструкт нуклеиновых кислот вставляется для экспрессии в организме хозяина предпочтительно в вектор, такой как, например, плазмида или фаг, который позволяет осуществлять оптимальную экспрессию генов в хозяине. Под векторами следует понимать кроме плазмид и фагов также все другие известные специалисту векторы, такие как, например, SV40, CMV, бакуловирус и аденовирус, транспозоны, IS-элементы, фазмиды, космиды, и линейные или кольцевые ДНК, а также системы агробактерий.
Эти векторы могут быть реплицированы в организм хозяина автономно или хромосомно. Подходящими плазмидами являются, например, в Е. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, рКСЗО, PRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,pIN-IU"3-Bl, tgtll или pBdCI, в Streptomyces plJlOl, pIJ364, plJ702 или pl.T361, в Bacillus pUBHO, pC194 или pBD214, в Corynebacterium pSA77 или pAJ667, в грибах pALSl, plL2 или рВВПб, в дрожжах 2альфа, pAG-1, YEp6, YEpl3 или pEMBLYe23 или в растениях pLGV23,pGHlac+. pBIN19, рАК2004 или pDH51. Названные плазмиды представляют собой небольшую выборку из возможных плазмид. Другие плазмиды известны специалисту и могут
быть взяты из книги Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
Предпочтительно конструкт из нуклеиновых кислот для экспрессии других содержащихся генов содержит еще 3'- и/или 5'-терминальные регуляторные последовательности для усиления экспрессии, которые выбираются для оптимальной экспрессии в зависимости от выбранного организма-хозяина и гена или генов.
Эти регуляторные последовательности должны давать возможность целенаправленной экспрессии генов и экспрессии белков. Это, например, в зависимости от организма-хозяина может означать то, что ген экспримируется или суперэкспримируется только после индукции, или что он экспримируется и/или суперэкспримируется немедленно.
Регуляторные последовательности или факторы при этом могут преимущественно оказывать положительное влияние на экспрессию внедренного гена и тем самым усиливать её. Так, усиление регуляторных элементов может происходить благоприятным образом на транскрипционном участке, тем что применяются сильные транскрипционные сигналы, такие как промоторы и/или "энханцеры". Наряду с этим возможно также усиление трансляции, тем что, например, улучшается стабильность мРНК.
В другом варианте вектора содержащий конструкт из нуклеиновых кислот или нуклеиновые кислоты вектор также вводится в микроорганизмы предпочтительно в форме линейной ДНК и интегрируется в геном организма-хозяина через гетерологичную или гомологичную рекомбинацию. Эта линейная ДНК может
состоять из линеаризованного вектора, такого как плазмида. или только из конструкта нуклеиновых кислот или из нуклеиновых кислот.
Для оптимальной экспрессии чужеродных генов в организмы предпочтительно следует изменять последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с применяемым в организме специфическим "синонимическим кодоном" ("codon usage"). "Синонимический кодон" ("Codon usage") можно легко определить, пользуясь компьютерной оценкой других, известных генов данного организма.
Получение экспрессионной кассеты происходит путем соединения подходящего промотора с подходящей кодирующей последовательностью нуклеотидов, а также сигналом терминатора или сигналом полиаденилирования. Для этого применяют общеупотребительные приемы рекомбинации и клонирования, какие описаны, например, Т. Maniatis, Е. F.Fritsch и J. Sambrook, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), a также в Т. J. Silhavy, M. L. Berman и L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и в Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Рекомбинантный конструкт нуклеиновых кислот или генный конструкт вводится для экспрессии в подходящий организм хозяина, предпочтительно в характерный для хозяина вектор, который дает возможность осуществления оптимальной экспрессии генов в хозяине. Векторы хорошо известны специалисту и
могут быть взяты из "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
С помощью векторов получаются рекомбинантные микроорганизмы, какие, например, трансформированы минимум одним вектором и могут использоваться для получения применяемого согласно изобретению гидрофобина или его производных. Вышеописанные рекомбинантные конструкты преимущественно вводятся с подходящую систему-хозяин и экспримируются. При этом используются преимущественно известные специалисту привычные методы клонирования и трансфекции, такие как соосаждение, слияние протопластов, электропорация, ретровиральная трансфекция и тому подобные, чтобы довести до экспрессии названные нуклеиновые кислоты в соответствующей экспрессионной системе. Подходящие системы описаны, например, в Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, или Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.
Можно также получать гомологичные рекомбинированные микроорганизмы. Для этого получают вектор, который содержит по меньшей мере участок используемого гена или кодирующей последовательности, в котором при необходимости для изменения последовательности по меньшей мере осуществлено удаление, присоединение или замещение аминокислоты, например, функционального разрыва ("нокаутирующий" вектор). Введенная последовательность может, например, также быть гомологом из родственного микроорганизма или происходить из клеток млекопитающего, дрожжевых клеток или клеток насекомого. Вектору, применяемому для гомологичной рекомбинации, альтернативно может быть придан такой вид, чтобы
эндогенный ген при гомологичной рекомбинации был мутирован или был изменен иным путем, но еще был способен кодировать функциональный белок (например, расположенная выше регуляторная область может изменяться таким образом, что вследствие этого изменяется экспрессия эндогенного белка). Измененный участок использованного согласно изобретению гена находится в гомологичном рекомбинантном векторе. Конструкция подходящих векторов для гомологичной рекомбинации описана, например, в работе Thomas, К. R. и Capecchi, М. R. (1987) Cell 51 : 503.
В качестве рекомбинантных организмов-хозяев для такого рода нуклеиновых кислот или такого рода конструктов из нуклеиновых кислот подходят в принципе все организмы, как прокариоты так и эукариоты. Предпочтительно в качестве организмов-хозяев используются такие микроорганизмы, как бактерии, грибы или дрожжи. Преимущественно применяются грам-положительные и грам-отрицательные бактерии, предпочтительно бактерии семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae или Nocardiaceae, наиболее предпочтительны бактерии родов Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium или Rhodococcus.
Организмы, применяемые в описанных выше способах получения слитых белков разводятся или выращиваются известными специалисту способами в зависимости от организма-хозяина. Микроорганизмы, как правило, выращиваются в жидкой среде, которая содержит источник углерода, чаще всего в форме Сахаров, источник азота чаще всего в форме источника органического азота, такого как экстракт дрожжей или соли, такие как сульфат аммония, микроэлементы, такие как соли железа, марганца и магния, а также при необходимости витамины, при
температуре от 0 до 100°С, предпочтительно от 10 до 60°С при насыщении кислородом. При этом величина рН в питательной жидкости может поддерживаться на постоянном значении, т.е. во время выращивания регулируется или не регулируется. Выращивание может происходить периодическим способом, полупериодическим способом или непрерывным способом. Питательные вещества могут загружаться полностью к началу ферментации или подаваться полупериодически или непрерывно. Энзимы могут выделяться из организмов в соответствии со способами, описанными в примерах, или могут применяться в реакции в виде неочищенного экстракта.
Применяемые согласно изобретению гидрофобины или функциональные, биологически активные их фрагменты могут формироваться способом рекомбинантного получения, при этом культивируют микроорганизм, продуцирующий полипептиды, при необходимости индуцируют экспрессию белков и выделяют их из культуры. Белки таким способом могут производиться в промышленном масштабе, если это будет желательно. Рекомбинантные микроорганизмы могут культивироваться и ферментироваться по известным методикам. Бактерии могут размножаться, например, в ТВ- или LB-среде при температуре от 20 до 40°С и величине рН от 6 до 9. В подробностях подходящие условия культивирования описаны, например, в книге Т. Maniatis, Е. F. Fritsch и J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Затем клетки, если белки не выделяются в питательную среду, подвергаются лизированию и продукт получается из лизата известными способами выделения белков. По выбору клетки могут переводиться в удобное для переработки состояние
высокочастотным ультразвуком, высоким давлением, таким как, например, в работающей под давлением ячейке (French-Druckzelle), осмолизом, воздействием детергентов, литических энзимов или органических растворителей, с помощью гомогенизаторов или комбинацией нескольких из перечисленных способов.
Очистка белков может достигаться с помощью известных хроматографических методов, таких как хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация), хроматография на Q-сефарозе, ионообменная хроматография и гидрофобная хроматография, а также с использованием других обычных способов, таких как ультрафильтрация, кристаллизация, высаливание, диализ и естественный гель-электрофорез. Подходящие способы описаны, например, в книгах Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin. New York или Scopes. R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
Особенно выгодным может быть, если для облегчения выделения и очистки снабдить слитый гидрофобии специальными якорными группами, которые могут привязываться к соответствующим комплементарным группам твердых носителей, в частности подходящих полимеров. Такого рода твердые носители могут использоваться, например, в качестве наполнителей для хроматографических колонок, и таким способом можно, как правило, заметно повысить эффективность разделения. Такие способы разделения также известны как аффинная хроматография. Для встраивания якорных групп можно использовать при получении белков векторные системы или олигонуклеотиды, которые удлиняют кДНК на определенную последовательность нуклеотидов и тем самым кодируют измененные белки или слитые белки. Для более легкой очистки модифицированные белки включают действующие в качестве якоря так называемые "таги" ("Tags") (метки), например,
известные модификации в виде гекса-гистидиновых якорей. Модифицированные гистидиновыми якорями слитые гидрофобины можно, например, очищать хроматографически при использовании никель-сефарозы в качестве заполнителя для колонки. После чего слитый гидрофобии с помощью подходящих средств для элюирования, таких как, например, раствор имидазола, снова вымывается с колонки.
В упрощенном способе очистки можно отказаться от хроматографической очистки. Для этого клетки сначала с помощью подходящего метода выделяются из ферментативного бульона, например, путем микрофильтрации или центрифугированием. Затем клетки с помощью подходящих методов, например, с использованием уже упомянутых выше методов, переводят в удобное для переработки состояние, и фрагменты разрушенных клеток отделяются от телец включений. Последнее удобно осуществлять путем центрифугирования. Наконец, тельца включений в принципе можно обычным путем переводить в удобное для переработки состояние, чтобы высвободить слитый гидрофобии. Это может, например, происходить с помощью кислот, оснований и/или детергентов. Тельца включений с использованным согласно изобретению слитым гидрофобином, как правило, могут полностью растворяться уже при использовании 0,1 М раствора NaOH в течение примерно 1 часа. Чистота полученного этим упрощенным способом слитого гидрофобина, как правило, составляет 60 - 80 вес.% по сравнению с количеством всех белков. Растворы, полученные описанным упрощенным способом очистки, могут использоваться без дальнейшей очистки для осуществления этого изобретения.
Гидрофобины, полученные, как описано, могут применяться как непосредственно в качестве слитых белков, так и после отщепления и отделения партнера слияния как "чистые" гидрофобины.
Если предусмотрено отделение партнера слияния, рекомендуется вводить потенциальное место расщепления в слитом белке (особенное место распознавания для протеаз) между гидрофобиновой частью и частью партнера слияния. В качестве мест расщепления пригодны в частности такие последовательности пептидов, которые не встречаются ни в гидрофобиновой части, ни в части партнера слияния, что легко можно определить с помощью биоинформационных технологий. Наиболее подходящими являются, например, BrCN-расщепление у метионина, или расщепление при посредничестве протеазы с фактором Ха-, расщепление энтерокиназой, тромбином, TEV-расщепление (протеаза Tobacca etch virus).
Согласно изобретению гидрофобины и их производные могут применяться в составах, имеющих, по крайней мере, две жидкие фазы, для улучшения разделения фаз. При этом речь идет о любых составах, если они содержат не менее двух жидких фаз.
В частности, речь может идти также о составах, которые до добавки, по меньшей мере, одного гидрофобина или его производного представляют собой эмульсию.
При этом состав в рамках данного изобретения может иметь больше двух жидких фаз.
Если речь идет о минимум двух жидких фазах, то имеются в виду две жидкие фазы разной плотности, например, масло и вода, два водных раствора разной плотности, два органических раствора разной плотности, горючее и вода, топливо и вода или растворитель и вода. При этом под водным раствором в рамках данного
изобретения понимаются растворы, содержащие воду, в некоторых случаях, в комбинации с еще одним растворителем. В рамках данного изобретения каждая жидкая фаза может при этом содержать дополнительные вещества.
Согласно изобретению речь идет о масле, преимущественно о сырой нефти.
Подходящими растворителями являются все жидкости, образующие с водой двухфазную смесь, в частности, органические растворители, например, простые эфиры, ароматические соединения как толуол или бензол, спирты, алканы, алкены, циклоалканы, циклоалкены, сложные эфиры, кетоны, нафтены или галогенированный углеводороды.
Согласно следующей форме исполнения данное изобретение затрагивает поэтому описанное ранее применение, по меньшей мере, одного гидрофобина или, по меньшей мере, одного его производного, причем состав, содержащий не менее двух жидких фаз, выбирается из группы, состоящей из
- составов, содержащих масло, предпочтительно сырую нефть, и воду,
- составов, содержащих горючее или топливо и воду,
- реакционных смесей, содержащих не менее двух жидких фаз.
В рамках данного изобретения соединение может содержать больше фаз. например, твердую или жидкую фазу, в частности твердую фазу.
Гидрофобии или его производные могут использоваться во всех известных специалисту применениях. В частности, в рамках данного изобретения следует назвать применение в качестве деэмульгатора в смесях автомобильный бензин / вода,
в качестве деэмульгатора в смесях воды с другими видами горючего или топлива, разделение фаз при химических реакциях, особенно в промышленных процессах, расщепление эмульсии на сырую нефть и воду при нефтедобыче или нефтепереработке, а также обессоливание сырой нефти путем экстракции сырой нефти с водой и последующее разделение полученной эмульсии. В качестве промышленных химических процессов рассматриваются все процессы, для которых должна привлекаться операция разделения фаз, например, гидрокомпозиция полиизобутена с катализаторами из кобальта, причем отделение катализатора осуществляется в воде. Гидрофобии или его производные согласно изобретению применяются также для улучшения разделения фаз составов, содержащих не менее двух жидких фаз, возникающих при протекании реакции, т.е. которые образуются в ходе реакции или появляются в результате добавки растворителя или компонента. Благодаря применению гидрофобина или их производных согласно изобретению достигается сокращение времени разделения фаз, что позволяет уменьшить потери ценных материалов. Согласно изобретению возможно также улучшить разделение фаз составов, содержащих две водные фазы разной плотности, причем под водной фазой подразумевается фаза, содержащая воду, в некоторых случаях в комбинации с другим растворителем. Гидрофобины или их производные согласно изобретению применяются для улучшения разделения фаз при фракционировании полимеров в водных системах. При этом, в частности, перегоняются водорастворимые полимеры.
Вообще следует назвать все известные специалисту растворимые в воде и в масле полимеры, в особенности полиакрилаты и их сополимеры, которые по условиям их изготовления получаются с молекулярно-массовым распределением или полидисперсностью больше, чем 1,1.
Благодаря добавке деэмульгаторов эмульсии могут быть разрушены. Так, например, добываемая нефть представляет собой, как правило, относительно стабильную эмульсию вода-в-масле, которая в зависимости от месторождения может содержать до 90 вес.% воды. При обработке и очистке сырой нефти после отделения большой части воды в сырой нефти все еще остается около 2-3 вес.% воды. Она образует с нефтью стабильную эмульсию, которая не разделяется полностью даже путем центрифугирования и добавлением обычных деэмульгаторов. Проблема заключается в том, что, во-первых, вода содержит соль и приводит к коррозии, а во-вторых, остаток воды увеличивает объем предназначенного для транспортировки и хранения продукта, что повышает его стоимость. Согласно изобретению было найдено, что применение гидрофобинов или их производных особенно выгодно для улучшения разделения фаз в таких составах. Достигается очень быстрое разделение.
При этом деэмульгатор должен быть ориентирован на вид образовавших эмульсию масел или жиров, а также на содержащиеся в некоторых случаях эмульгаторы и поверхностно-активные вещества, чтобы обеспечить оптимальную эффективность. Разрушение эмульсий может дополнительно поддерживаться повышенной температурой, например, температурой от 0 до 100°С, или от 10 до 80°С, в особенности от 20 до 60°С.
Следующие применения согласно изобретению охватывают, например, деэмульгаторы пропиточных эмульсий в текстильной промышленности и при изготовлении древесно-стружечных плит, а также для лекарственных эмульсий. Следующим применением является расщепление эмульсий сточных вод после органической обработки, например, промышленные сточные воды, в особенности с предприятий металлообработки, например, смазочно-охлаждающие жидкости после
обработки металлов, кожевенных заводов и нефтеочистительных установок, а также хозяйственных источников, имеющих дело с эмульсиями из масла и воды. Такие сточные воды появляются, например, при переработке нефти в очистительных и нефтехимических установках. Прежде чем эти сточные воды подать к очистным сооружениям, необходимо отделить остатки масла, которые в большинстве случаев представляют собой эмульсию.
Следующим применением согласно изобретению является расщепление эмульсии в составах масло-в-воде или вода-в-масле, например, эмульсий, которые должны использовались и в качестве смазочно-охлаждающих материалов и должны быть вторично возвращены в производство. Смесь воды с маслом образуется также на борту морских судов в виде трюмной воды. Для этого требуется разделение эмульсий, чтобы можно было отделить воду и уменьшить объем предназначенного для утилизации растворителя.
Количество используемого гидрофобина или его производного может варьироваться в больших пределах, причем приемлемое количество подбирается в соответствии с составом или, при необходимости, с компонентами, входящими в состав.
Если, например, состав содержит вещества, которые задерживают или ухудшают разделение, по крайней мере, двух жидких фаз, к примеру, поверхностно-активные вещества или эмульгаторы, то следует добавлять большее количество гидрофобина или его производного.
Поскольку масло, в особенности, сырая нефть, состоит из смеси многих химических соединений, то из-за отличающейся химической ее структуры, процента содержания воды и солей, а также в зависимости от конкретных условий расщепления эмульсии, как температура и длительность процесса расщепления, требуется подбирать способ подмешивания и химического взаимодействия с другими компонентами смеси и вид деэмульгатора в соответствии с конкретными условиями.
Неожиданно было найдено, что уже небольшие количества гидрофобина или его производного приводят к улучшению разделения фаз.
Согласно изобретению, по меньшей мере, один гидрофобии или его производное может быть добавлен в любом приемлемом количестве. Как правило, гидрофобии или его производное добавляется в количестве не менее 0,0001 - 1000 ррт относительно всего состава; предпочтительно в количестве от 0,001 до 500 ррт, особенно предпочтительно от 0,01 до 200 ррт или от 0,01 до 100 ррт, а наиболее предпочтительно 0,1 - 50 ррт.
В рамках данного описания данные в ррт означают мг на кг.
Поэтому данное изобретение в соответствии со следующей формой исполнения касается описанного ранее применения, причем используется, по меньшей мере, один гидрофобии или, по меньшей мере, одно его производное в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава. Концентрация устанавливается специалистом в зависимости от вида предназначенного для деэмульгирования состава.
Если речь идет о составе, содержащем горючее или топливо и воду, то гидрофобии или его производное применяются обыкновенно в количестве от 0,001 до 10 ррт, предпочтительно 0,005 - 2 ррт, лучше 0,01 - 1 ррт, особенно предпочтительно 0,05 - 0,5 ррт, а еще предпочтительней 0,01 - 0,1 ррт. Если речь идет о составе, содержащем сырую нефть и воду, то гидрофобии или его производное применяются обыкновенно в количестве от 1 до 1000 ррт, предпочтительно от 1 до 800 ррт, лучше от 5 до 500 ррт, особенно предпочтительно от 10 до 200 ррт, а еще предпочтительней от 15 до 100 ррт, к примеру, 20 - 50 ррт.
Если речь идет о составе, содержащем две водные фазы различной плотности, которые могут возникнуть, например, при разделении на фракции растворимых в воде полимеров, то гидрофобии или его производное применяются обыкновенно в количестве от 1 до 1000 ррт, предпочтительно от 1 до 500 ррт, лучше от 5 до 250 ррт, особенно предпочтительно от 10 до 200 ррт, а еще предпочтительней от 15 до 100 ррт.
Согласно изобретению возможно также, что состав кроме гидрофобина или его производного содержит другие соединения, которые улучшают разделение фаз. При этом речь может идти обо всех соединениях, известных специалисту для такого рода применений. Например, подходящими дополнительными соединениями для улучшения разделения фаз, особенно в качестве деэмульгаторов для нефтепродуктов, являются оксиалкилированная фенол-формальдегидная смола, ЕО/РО-сополимеры в виде блоков, сшитые диэпоксиды, полиамиды и их алкоксильные группы, соли сульфоновых кислот, этоксилированные алифатические амины, сукцинаты, а также соединения, приведенные для таких применений в патенте DE 10 2005 006 030.7.
Поэтому данное изобретение в соответствии со следующей формой исполнения касается описанного ранее применения, причем помимо гидрофобина или его производного используется, по меньшей мере, одно дополнительное соединение, которое улучшает разделение фаз.
В соответствии со следующим аспектом данное изобретение касается также способа разделения, по меньшей мере, двух жидких фаз в составе, содержащем не менее двух жидких фаз, включающего добавление к составу, по меньшей мере, одного гидрофобина или его производного.
При этом речь для состава может идти об описанном ранее составе, включающем не менее двух жидких фаз.
В соответствии с предпочтительной формой исполнения данное изобретение касается поэтому такого рода способа, при котором состав, содержащий, по меньшей мере, две жидкие фазы, выбирается из группы, состоящей из,
- составов, содержащих масло, предпочтительно сырую нефть, и воду,
- составов, содержащих горючее или топливо и воду,
- реакционных смесей, содержащих не менее двух жидких фаз.
В принципе, в рамках данного изобретения гидрофобины или их производные могут применяться в любых количествах, пока не будет достигнуто улучшение фазового разделения. В особенности пригодно применение гидрофобина или его производного в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава.
Данное изобретение касается также описанного ранее способа, причем, по меньшей мере, один гидрофобии или его производное применяются в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава. Предпочтительные количества для соответствующих систем уже были названы.
Способ согласно изобретению может включать дополнительные этапы, например, такие, которые улучшают разделение фаз или разрушение эмульсий. При этом речь может идти, например, о повышении температуры или о центрифугировании. Такого рода этап может выполняться до добавления, по меньшей мере, одного гидрофобина или его производного, во время этого действия или после него.
В соответствии со следующей формой исполнения данное изобретение касается, поэтому, описанного ранее способа, причем способ включает повышение температуры состава, содержащего не менее двух жидких фаз, до или после добавления, по меньшей мере, одного гидрофобина или, по меньшей мере, одного его производного.
Согласно изобретению могут добавляться гидрофобины или их производные, например, к композициям, содержащим горючее или топливо. При контакте композиции с водой это обеспечивает быстрое расслоение смеси и предотвращает образование эмульсий. Образование эмульсий, например, в складских резервуарах сделало бы необходимыми дорогостоящие операции по очистке композиции.
В такой же степени полезно добавлять гидрофобины или их производные к сырой нефти, чтобы предотвратить, например, образование эмульсии.
При этом композиция, содержащая горючее или топливо, в рамках данного изобретения может содержать другие добавки, которые обычно содержатся в такого рода композициях.
Подходящие добавки названы, например, в патенте WO 2004/087808.
Данное изобретение касается, поэтому, также композиции, содержащей, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из горючего, топлива, сырой нефти или растворов полимеров в воде или в масле, и, по крайней мере, одного гидрофобина или его производного.
Количество применяемого гидрофобина или его производного можно варьировать в зависимости от других добавок, пока не будет обеспечено улучшение разделения фаз при контакте композиции с водой.
Согласно изобретению количество применяемого гидрофобина или его производного лежит преимущественно в области между 0,0001 и 1000 ррт, предпочтительно от 0,001 до 500 ррт, особенно предпочтительно от 0,01 до 100 ррт.
Поэтому данное изобретение касается также описанной ранее композиции, причем гидрофобии или его производное содержится в композиции в количестве от 0,0001 до 1000 ррт по отношению ко всей композиции.
Если для композиции речь идет о смеси, содержащей сырую нефть, то количество добавляемого к такой композиции гидрофобина или его производного
составляет, как правило, от 1 до 1000 ррт, предпочтительно от 10 до 800 ррт, особенно предпочтительно от 10 до 500 ррт.
Если для композиции речь идет о смеси, содержащей горючее или топливо, то количество добавляемого к такой композиции гидрофобина или его производного составляет, как правило, от 0,001 до 0,5 ррт, предпочтительно от 0,005 до 0,3 ррт, особенно предпочтительно от 0,01 до 0,2 ррт.
Поэтому настоящее изобретение в соответствии со следующей формой исполнения касается описанной ранее композиции, причем композиция содержит, по крайней мере, одно горючее или топливо, и в композиции содержится гидрофобии или его производное в количестве от 0,001 до 0,5 ррт относительно всей композиции.
В рамках данного изобретения под топливом понимаются, например, легкие, средние или тяжелые мазуты.
В рамках данного изобретения под горючим понимаются, например, автомобильные бензины, дизельное или газотурбинное топливо. Особенно предпочтительно речь идет о бензинах.
Горючее может содержать дополнительные присадки. Обычные присадки в основном известны специалисту. Подходящие присадки и растворители названы, например, в патенте WO 2004/087808.
Например, согласно изобретению пригодными в качестве дополнительных компонентов являются присадки с моющим действием и/или препятствующие износу
седла клапана (называемые в дальнейшем моющие присадки). Такая моющая присадка содержит, по крайней мере, один гидрофобный углеводородный остаток со среднечисленным молекулярным весом Мп от 85 до 20 ООО г/моль и, по крайней мере, одну полярную группировку, выбранную из:
(a) моно- или полиаминогрупп с атомами азота до 6, причем, по крайней мере, один атом азота имеет свойства основания;
(b) нитрогрупп, в некоторых случаях в комбинации с гидроксильными группами;
(c) гидроксильных групп в комбинации с моно- или полиаминогруппами, причем по крайней мере, один атом азота имеет свойства основания;
(d) карбоксильных групп или их солей щелочных или щелочноземельных металлов;
(e) сульфогрупп или их солей щелочных или щелочноземельных металлов;
(f) полиокси-С2-С4-алкиловых группировок, которые оканчиваются гидроксиль-ными группами, моно- или полиаминогруппами, причем по крайней мере, один атом азота имеет свойства основания, или карбаматными группами;
(g) групп эфиров карбоновой кислоты;
(h) группировок, производных от ангидрида янтарной кислоты, с гидрокси- и/или амино- и/или амидо- и/или имидогруппами; и/или
(i) группировок, полученных реакцией обмена Манниха замещенных фенолов с альдегидами и моно- или полиаминами.
Гидрофобный углеводородный остаток в упомянутых выше моющих присадках, предназначенный для достаточной растворимости в горючем, имеет среднечисленный молекулярный вес (Мп) от 800 до 20 ООО, в особенности от 113 до 10 000, лучше всего от 300 до 5 000. В качестве типичного гидрофобного углеводородного остатка, в особенности в соединении с полярными группировками (а), (с), (h) и (i), рассматриваются полипропиленовый остаток, полибутениловый остаток и полиизобутениловый остаток с Мп = 300 - 5000, особенно 500 - 2500, лучше всего 700 - 2300.
В качестве примеров указанных выше групп моющих присадок можно назвать следующие:
Присадки, содержащие моно- или полиаминогруппы (а) являются преимущественно полиалкенмоно- или полиалкенполиаминами на основе полипропена или обычного (т.е. с двойными связями, расположенными преимущественно не на конце) полибутена или полиизобутена с Мп от 300 до 5000 г/моль. При изготовлении присадок на основе полибутена или полиизобутена с преимущественной срединной двойной связью (в большинстве случаев в бгзта- или
гамма-позиции) предлагается способ хлорирования с последующим аминированием или окисление двойной связи кислородом воздуха или озоном до карбонил-карбоксилсоединения с последующием аминированием при восстанавливающих (гидрирующих) условиях. Для аминирования здесь могут использоваться амины, например, аммиак, моноамины или полиамины, как диметиламинопропиламин, этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин или тетраэтиленпентамин. Соответствующие присадки на основе полипропена описаны, в частности, в патенте WO 94/24231.
Следующие предпочтительные присадки, содержащие моноаминогруппы (а), являются продуктами гидрирования продуктов реакции обмена из полиизобутенов со средней степенью полимеризации Р = 5-100 с оксидами азота или смесями из оксидов азота и кислорода, как это, в частности, описано в патенте WO 97/03946.
Следующие предпочтительные присадки, содержащие моноаминогруппы (а), являются соединениями, полученными из полиизобутенэпоксидов реакцией обмена с аминами и с последующей дегидратацией и восстановлением аминоспиртов, как это, в частности, описано в патенте DE-A 196 20 262.
Присадки, содержащие нитрогруппы (Ь), в некоторых случаях в комбинации с гидроксилгруппами, являются преимущественно продуктами реакции обмена из полиизобутенов средней степени полимеризации Р = 5-100 или 10-100 с оксидами азота или смесями из оксидов азота и кислорода, как это, в частности, описано в патентах WO 96/03367 и WO 96/03479. Эти продукты обмена представляют собой, как правило, смеси из чистых нитрополиизобутенов (например, альфа, бэта
динитрополиизобутены) и смешанных гидроксинитрополиизобутенов (например, альфа-нитро-бэта-гидроксиполиизобутены).
Присадки, содержащие нитрогруппы (Ь) в комбинации с моно- или полиаминогруппами (с) являются, в основном, продуктами обмена полиизобутенэпоксидов, полученных из полиизобутенов преимущественно с концевыми двойными связями и Мп = 300-5000, с аммиаком, моно- или полиаминами, как это, в частности, описано в патенте ЕР-А 0 476 485.
Присадки, содержащие карбоксильные группы или их соли щелочных или щелочноземельных металлов (d) являются преимущественно сополимерами С2-С40-олефинов с малеиновым ангидридом общей молярной массой от 500 до 20 000. карбоксильные группы которых полностью или частично превращаются в соли щелочных или щелочноземельных металлов, а остаток карбоксильных групп реагирует со спиртами или аминами. Такие присадки известны, в частности, из ЕР-А 0 307 815. Такого рода присадки служат, в основном, для предотвращения износа седла клапана и могут, как описано в WO 87/01126, с пользой использоваться в комбинации с обычными топливными присадками, как поли(изо)бутенамины или полиэфирамины.
Присадки, содержащие сульфогруппы или их соли щелочных или щелочноземельных металлов (е) являются преимущественно солями щелочных или щелочноземельных металлов алкилового эфира сульфоянтарной кислоты, как это. в частности, описано в патенте ЕР-А 0 639 632.
Такого рода присадки служат, в основном, для предотвращения износа седла клапана и могут с пользой использоваться в комбинации с обычными топливными присадками, как поли(изо)бутенамины или полиэфирамины.
Присадки, содержащие полиокси-Сг-С/галкиловые группировки, являются преимущественно полиэфирами или полиэфираминами, которые можно получить путем реакции обмена Сг-Сбо-шжанолов. Сб-Сзо-алкандиолов, моно- или ДИ-СУСЗО-алкиламинов, Ci-Сзо-алкилциклогексанолов или Ci-Сзо-алкилфенолов с 1 - 30 молями этиленоксида и/или пропиленоксида и/или бутиленоксида на каждую гидроксильную группу или аминогруппу и, в случае полиэфираминов путем последующего восстановительного аминирования аммиаком, моноаминами или полиаминами. Такого рода продукты описаны, в частности, в патентах ЕР-А 0 310 875, ЕР-А 0 356 725, ЕР-А 0 700 985 и US 4,877,416. В случае полиэфиров такие продукты удовлетворяют также свойствам масла-носителя. Типичными примерами: этому являются тридеканол- или изотридеканолбутоксилаты, изононилфенолбутоксилаты, а также полиизобутенолбутоксилаты и -пропоксилаты и соответствующие продукты реакции обмена с аммиаком.
Присадки, содержащие группы эфиров карбоновой кислоты (g) являются преимущественно сложными эфирами из моно-, ди- или трикарбоновых кислот с длинноцепочечными алканолами или полиолами, в особенности со средней вязкостью 2 мм2/с при 100°С, как описано, в частности, в патенте DE-A 38 38 918. В качестве моно-, ди- или трикарбоновых кислот могут использоваться алифатические или ароматические кислоты, в качестве сложных эфиров оксикислоты или многоатомных спиртов, прежде всего, пригодны длинноцепные представители, например, с 6 - 24 атомами углерода. Типичными представителями сложных эфиров являются
адипинаты, фталаты, изо-фталаты, терефталаты и тримеллитаты изо-октанола, изо-нонанола, изо-деканола и изо- тридеканола. Такого рода продукты удовлетворяют также свойствам масла-носителя.
Присадки, содержащие группировки, производные от ангидрида янтарной кислоты, с гидрокси- и/или амино- и/или амидо- и/или имидогруппами (п) являются преимущественно соответствующими производными ангидрида полиизобутенил-янтарной кислоты, которые получаются реакцией обмена нормального или высокоактивного полиизобутена с Мп = 300-5000 с ангидридом малеиновой кислоты при нагревании или через хлорированный полиизобутен. Особый интерес представляют также производные с алифатическими полиаминами, как этилендиамин. диэтилентриамин, триэтилентетрамин. Такого типа топливные присадки описаны, в частности, в патенте US 4,849,572.
Присадки, содержащие группировки, полученные реакцией обмена Манниха замещенных фенолов с альдегидами и моно- или полиаминами (i) являются преимущественно продуктами реакций обмена полиизобутензамещенных фенолов с формальдегидом и моно- или полиаминами, например, этилендиамином, диэтилентриамином, триэтилентетрамином, тетраэтиленпентамином или диметиламинопропиланимом. Полиизобутенилзамещенные фенолы могут получаться из нормального или высокоактивного полиизобутена с Мп = 300-5000. Такого типа "полиизобутеновые основания Манниха" описаны, в частности, в патенте ЕР-АО 831 141.
Для более точного определения отдельных приведенных топливных присадок здесь сделаны ссылки на публикации названных выше современных трудов.
Названные присадки применяются в количествах, которые определяются специалистом как пригодные для конкретного использования.
Кроме того, композиции согласно изобретению могут комбинироваться и с другими обычными компонентами и добавками. Здесь следует указать масла-носители без выраженного моющего действия.
Подходящими минеральными маслами-носителями являются получаемые при нефтепереработке фракции, например, брайтсток или базовые масла с вязкостью, например, класса SN 500-2000; а также ароматические углеводороды, парафиновые углеводороды и алкоксиалканолы. Согласно изобретению пригодна также фракция, известная как "гидрокрекинговое масло" ("hydrocrack oil") и получаемая при рафинировании минерального масла (этап вакуумной дистилляции с температурой кипения от 360 до 500°С, получение из каталитически гидрогенизированного и изомеризованного при высоком давлении, а также депарафинированного натурального минерального масла). Также пригодны смеси названных выше масел-носителей.
Примеры применимых согласно изобретению синтетических масел-носителей можно выбрать из: полиолефинов (полиальфаолефин или полиинтерналолефин), сложных полиэфиров, (поли)алкоксилатов, простых полиэфиров, алифатических аминов простых полиэфиров, инициированных алкилфенолом простых полиэфиров, аминов инициированных алкилфенолом простых полиэфиров и эфиры карбоновых кислот с длинноцепочечными алканолами.
Примерами для подходящего полиолефина являются полимеризаты олефина с Мп = 400-1800, прежде всего на основе полибутена или полиизобутена (гидрированного или не гидрированного).
Примерами подходящих простых полиэфиров или аминов простых полиэфиров предпочтительно являются соединения, содержащие группировки полиокси-Сг-Сгалкиленов, которые получаются реакцией обмена Сг-Сбо-алканолов, Сб-Сзо-алкандиолов, моно- или ди-С^Сзо-алкиламинов, С]-Сзо-алкилциклогексанолов или Ci-Сзо-алкилфенолов с 1 - 30 молями этиленоксида и/или пропиленоксида и/или бутиленоксида на каждую гидроксильную или аминогруппу, а, в случае аминов простых полиэфиров путем последующего восстановительного аминирования аммиаком, моноаминами или полиаминами. Такие продукты описаны, в частности, в патентах ЕР-А 0 310 875, ЕР-А 0 356 725, ЕР-А 0 700 985 и US 4,877,416. Например, в качестве аминов простых полиэфиров могут применяться поли-Сг-Сб-алкиленоксидамины или их функциональные производные. Типичными примерами этому являются тридеканол- или изотридеканолбутоксилаты,
изононилфенолбутоксилаты, и полиизобутенолбутоксилаты и -пропоксилаты, а также соответствующие продукты реакции обмена с аммиаком.
Примерами эфиров карбоновой кислоты с длинноцепными алканолами являются, в частности, сложные эфиры из моно-, ди- или трикарбоновых кислот с длинноцепными алканолами или полиолами, что описано, в частности, в патенте DE-А 38 38 918. В качестве моно-, ди- или трикарбоновых кислот могут использоваться алифатические или ароматические кислоты, в качестве сложных эфиров оксикислот пригодны, в первую очередь, длинноцепочечные представители, например, с 6 до 24 атомов углерода. Типичными представителями сложных эфиров являются адипаты.
фталаты, изо-фталаты, терефталаты и тримеллитаты изооктанола, изононанола, изодеканола и изотридеканола, как например, ди-(н- или изо-тридецил)-фталат.
Другие пригодные системы масел-носителей описаны, например, в патентах DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, ЕР-А 0 452 328 и ЕР-А 0 548 617.
Примерами наиболее подходящих синтетических масел-носителей являются инициированные спиртами простые полиэфиры с 5 - 35 или, например, 5 - 30 фрагментами Сз-Сб-алкиленоксидов, выбранных, например, из группы фрагментов пропиленохида, n-бутиленоксида и i-бутиленоксида или их смесей. Неограниченными примерами подходящих спиртов инициации являются длинноцепочечные спирты или фенолы, замещенные длинноцепочечными алкилами. причем длинноцепочечный алкильный остаток стоит за неразветвленным или разветвленным Сб-С^-алкильным остатком.
В качестве предпочтительных примеров следует назвать тридеканол и нонилфенол.
Другими пригодными синтетическими маслами-носителями являются алкоксилированные алкилфенолы, которые описаны в патенте DE-A 10 102 913.6.
Названные масла-присадки применяются в количествах, которые определяются специалистом как пригодные для конкретного использования.
Следующими общеупотребительными добавками являются ингибиторы коррозии, например, на основе склонных к образованию пленок солей аммония
органических карбоновых кислот или гетероароматических соединений для защиты от коррозии цветных металлов; антиокислители или стабилизаторы, например, на основе таких аминов, как р-фенилендиамин, дициклогексиламин или их производных, или таких производных фенола, как 2,4-ди-де/?е/я-бутилфенол, или пропионовые кислоты 3,5-ди-/и/?ея?-бутил-4-гидроксифенила: другие
употребительные деэмульгаторы; антистатические средства; органические соединения с атомом металла как ферроцен;
метилциклопентадиенилмангантрикарбонил; такие присадки, повышающие смазывающую способность, как определенные кислоты жирного ряда, алкениловый эфир янтарной кислоты, бис(гидроксиалкил)амины жирного ряда, гидроксиацетамиды или касторовое масло; а также красители (маркеры). В некоторых случаях используются также амины для уменьшения рН-показателя горючего.
Названные моющие присадки с полярными группировками (а) - (i) добавляются к горючему обычно в количестве от 10 до 5000 ррт по весу, в особенности от 50 до 1000 ррт по весу. Другие названные компоненты добавляются в принятых для них количествах.
В качестве горючего или топлива пригодны все, известные специалисту, марки, например, топливо для карбюраторных двигателей, марки которого описаны, например, в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5.Aufl. 1990, Band A16, S. 719ff. Подходящими типами топлива согласно изобретению являются также дизельное топливо, керосин и реактивное топливо.
Особенно пригодно топливо для карбюраторных двигателей с максимальным содержанием ароматических соединений 60 об.%, например, не более 43 об.% и
максимальным содержанием серы 2000 ррт по весу, например, не более 150 ррт по весу.
Содержание ароматических соединение в топливе для карбюраторных двигателей составляет, к примеру, 10-50 или 30 - 43 об.%, в особенности 32 -40 об.%. Содержание серы в топливе для карбюраторных двигателей составляет, к примеру, 2 - 500 или 5-150 ррт по весу, или от 10 до 100 ррт по весу.
Кроме того, подходящее топливо для карбюраторных двигателей может содержать олефины в количестве до 50 об.%, например, от 6 до 21 об.%, в особенности 7-18 об.%; бензол в количестве до 5 об.%, например, 0,5 - 1,0 об.%, в особенности 0,6 - 0,9 об.% и/или серу в количестве до 25 вес.%, например, до 10 вес.%) или 1,0 - 2,7 вес.%, в особенности от 1,2 до 2,0 вес.%.
В частности можно назвать такие сорта топлива для карбюраторных двигателей, которые одновременно содержат максимум 38 об.% ароматических соединений, максимум 21 об.%, олефинов, максимум 50 ррт по весу серы, максимум 1,0 об.% бензола и кислород от 1,0 до 2,7 вес.%о.
Содержание спиртов и эфиров в топливе для карбюраторных двигателей может варьироваться в широком диапазоне. Например, типичные максимальные содержания составляют для метанола 15 об.%. для этилового спирта 65 об.%. для изопропилового спирта 20 об.%, для третичного бутилового спирта 15 об.%, для изобутилового спирта 20 об.% и для эфиров с 5 или более атомами углерода в молекуле 30 об.%.
Давление пара летом над подходящим согласно изобретению топливом для карбюраторных двигателей составляет обычно не более 70 кПа, особенно 60 кПа (соответственно при 37°С).
Определенное по исследовательскому методу октановое число (ROZ) топлива для карбюраторных двигателей составляет, как правило, 75 - 105. Принятый диапазон для соответствующего октанового числа, определенного по моторному методу (MOZ), равен от 65 до 95.
Названные спецификации определяются обычными способами (DIN E^N 228).
Более подробно изобретение объясняется на примерах.
Примеры
Пример 1
Подготовительные работы для клонирования yaad-His^/yaaE-HiSft
С помощью олигонуклеотидов На1570 и На1571 (Hal 572 / Hal 573) была выполнена полимеразная цепная реакция. В качестве матрицы ДНК была использована геномная ДНК бактерии Bacillus subtilis. Полученный фрагмент ПЦР содержит кодирующую последовательность гена yaaD / уааЕ из Bacillus subtilis и на концах по одной рестриционной нуклеазе Ncol и BglH. Фрагмент ПЦР очищали и разрезали с помощью рестрикционных эндонуклеаз Ncol и BglH. Этот фрагмент ДНК использовали как вставку, и клонировали в ранее линеаризированный с помощью рестрикционных эндонуклеаз Ncol и BglH вектор pQE60 фирмы Qiagen. Созданные
таким образом векторы pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 могут применяться для экспрессии белков, состоящих из YAAD::HIS6 или YAAE::HIS6.
На1570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga На1571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc.
Пример 2
Клонирование yaad-гидрофобина DewA-His С помощью олигонуклеотидов КаМ 416 и КаМ 417 осуществляли цепную реакцию полимеразы. В качестве исходного образца ДНК использовали геномную ДНК плесневого грибка Aspergillus nidulans. Полученный фрагмент ПЦР содержал кодирующую последовательность гена гидрофобина dewA и N-концевое место расщепления фактора Ха протеиназы. Фрагмент ПЦР очищали и разрезали с помощью рестрикционной эндонуклеазы BamHI. Этот фрагмент ДНК использовали как вставку, и клонировали в ранее линеаризированный с помощью рестрикционной эндонуклеазы BglH вектор pQE60YAAD#2 .
Созданный таким образом вектор #508 может применяться для экспрессии
слитого белка, состоящего из YAAD::Xa::dewA::HIS6.
КаМ416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC КаМ417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGT-
TCTCCGTCTCCGC.
Пример 3
Клонирование yaad-гидрофобина RodA-His^
Клонирование плазмиды #513 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 434 и КаМ 435.
KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCT GC KaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Пример 4
Клонирование vaad-гидрофобина BASFl-His^
Клонирование плазмиды #507 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 417 и КаМ 418.
В качестве исходной ДНК использовали искусственно синтезированную последовательность ДНК - гидрофобии BASF1 (см. дополнение, SEQ ID N0. 11 и 12).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC
КаМ418: CTGCCATTCAGGGGАТСССATATGGAGGAGGGAGACAG
Пример 5
Клонирование yaad-гидрофобина BASF2-His6
Клонирование плазмиды #506 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 417 и КаМ 418.
В качестве исходной ДНК использовалась искусственно синтезированная последовательность ДНК - гидрофобии BASF2 (см. Приложение, SEQ ID NO. 13 и 14).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Пример 6
Клонирование vaad-гидрофобина SC3-His Клонирование плазмиды #526 осуществляется аналогично плазмиде #508 при использовании олигонуклеотидов КаМ 464 и КаМ 465.
В качестве исходной ДНК использовалась кДНК Schyzophyllum commune (см. Приложение, SEQ ID NO. 9 и 10).
КаМ464: CGTTAAGG ATCCGAGGATGTTG ATGGGGGTGC KaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Пример 7
Ферментация рекомбинантного штамма E.coli vaad-гидрофобин DewA-Hisf,
Инокуляция 3 мл жидкой LB-среды с экспримирующим штаммом E.coli yaad-гидрофобин DewA-Hisg в сосуде Грайнера на 15 мл. Инкубация 8 ч при 37°С на мешалке с 200 об/мин. По две колбы Эрленмейера емкостью 1 л с дефлектором и 250 мл LB-среды (+ 100 мкг/мл ампициллина) засевали 1 мл соответствующей предварительной культуры и инкубировали 9 ч при 37°С на качалке с 200 об/мин.
13,5 л LB-среды (+ 100 мкг/мл ампициллина) засевали в 20 л ферментёре 0,5 л предварительной культуры (СЮбоопт 1:10 измерено по сравнению с НгО). При ОБбОпт ~3.5 добавление 140 мл 100 мМ IPTG. Через 3 ч ферментёр охлаждали до 10°С и ферментативный бульон центрифугировали. Клеточный осадок использовали для последующей очистки.
Пример 8
Очистка рекомбинантного гидрофобин-слитого белка
(Очистка гидрофобин-слитого белка, который содержит С-концевую His6-
метку)
100 г клеточного осадка (100 - 500 мг гидрофобина) вместе с 50 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7,5 доводили до 200 мл и ресуспендировали. Суспензию обрабатывали с помощью Ultraturrax Тур Т25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) в течение 10 минут и затем инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 500 единицами бензоназы (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) для расщепления нуклеиновых кислот. Перед переведением клеток в
удобное для переработки состояние фильтровали с помощью стеклянного фильтрующего элемента (Р1). Для перевода клеток в удобное для переработки состояние и для разрезания остаточных геномных ДНК осуществляли две операции по гомогенизации при 1.500 бар (Microfluidizer М-ПОЕН; Microfluidics Corp.). Гомогенизат центрифугировали (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor. сосуд для центрифуги емкостью 250 мл, 60 минут, 4°С, 12.000 об/мин, 23.000 g), жидкость сверху поставили на лед, а осадок после центрифугирования ресуспендировали в 100 мл натрийфосфатного буфера, рН 7,5. Центрифугирование и ресуспендирование повторяли трижды, причем натрийфосфатный буфер при третьем повторе содержал 1% SDS (=додецилсульфат натрия). После ресуспендирования перемешивали 1 час и осуществляли заключительное центрифугирование (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, сосуд для центрифуги емкостью 250 мл, 60 минут, 4°С, 12.000 об/мин, 23.000 g). В соответствии с SDS-PAGE-анализом гидрофобии после заключительного центрифугирования содержится в жидкости (Рисунок 1). Опыты показали, что гидрофобии, по видимому, содержится в форме телец включений в соответствующих клетках E.coli. 50 мл жидкости, содержащей гидрофобии, наносили на колонку с 50 мл никель-сефарозы высокого качества 17-5268-02 (Amersham), которая приведена к равновесию с помощью 50 мМ буфера Tris-Cl рН 8,0. Колонку промывали 50 мМ буфера Tris-Cl рН 8,0 и гидрофобии элюировали затем с помощью 50 мМ буфера Tris-Cl рН 8,0, содержащего 200 мМ имидазола. Для удаления имидазола раствор подвергали диализу против 50 мМ буфера Tris-Cl рН 8,0.
На рисунке 1 показана очистка полученного гидрофобина.
След А: Нанесенный на колонку слой никель-сефарозы (1:10 разбавление) След В: Протекание = элюат стадии промывки
Следы С - E: 0D 280 максимумы фракций элюирования (WP1, WP2, WP3) След F отображает нанесенный маркер.
Гидрофобии на рисунке 1 имеет молекулярный вес около 53 кД. Более мелкие полосы представляют отчасти продукты разложения гидрофобина.
Пример 9
Технологические испытания; Характеристика гидрофобина с помощью изменения краевого угла капли воды на стекле
Субстрат:
Стекло (оконное стекло, Suddeutsche Glas, Mannheim): Использовали очищенный в соответствии с примером 8 гидрофобии.
- Концентрация гидрофобина в растворе: 100 мкг/мл, раствор содержит еще
50 мМ натрийацетатного буфера, а также 0,1% полиоксиэтилен(20)-сорбит-монолаурата (Tween(r) 20), величина рН раствора: 4
- Погружение стеклянной пластинки в этот раствор на ночь (температура
80°С)
- После чего покрытая гидрофобином стеклянная пластинка извлекается из раствора и промывается дистиллированной водой,
- После этого инкубация 10 мин / 80°С / 1% раствор SDS (=додецилсульфата
натрия) в дистиллированной воде
- Повторное промывание в дистиллированной воде
Образцы сушили на воздухе и определяли краевой угол (в градусах) между каплей воды в 5 мкл и обработанной стеклянной поверхностью при комнатной температуре.
Измерение краевого угла осуществляли на приборе Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). Измерение происходило в соответствии с данными изготовителя.
Необработанное стекло давало краевой угол 30 ± 5°;
Стеклянная пластинка, покрытая гидрофобином в соответствии с примером 8 (yaad-dewA-his6), давала краевой угол 75 ± 5°. ==> Увеличение краевого угла: 45°.
Пример 10
Применение концентрата гидрофобина (yaad-Xa-dewA-His6) в качестве присадки к горючему.
Принцип исследования:
Современное горючее содержит обычно ряд различных присадок (так называемый пакет присадок). Если на этапе изготовления или эксплуатации в горючее попадет вода, то эти присадки могут проявить эмульгирующее действие и привести к образованию нежелательной эмульсии из горючего и воды. Для предотвращения этого эффекта к горючему добавляются деэмульгаторы.
Испытания деэмульгатора проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (SEQ ID NO. 19 и 20).
Концентрат гидрофобина разбавлялся этиловым спиртом и добавлялся к стандартному в Европе высокосортному топливу (согласно стандарту EN 228), в котором уже содержалось 725 мг/кг специального эффективного пакета присадок А. Этот пакет присадок состоит из полиизобутенамина Kerocom PIBA, смесей масел-носителей, растворителя, ингибитора коррозии и модификатора трения.
Приготовлялись пробы топлива с гидрофобином в количествах 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,14 и 0,28 мг/кг. В качестве сравнительного образца (10 - VI) служило топливо с пакетом присадок А без гидрофобина. В следующем сравнительном испытании (10 - V2) использовался принятый в торговле деэмульгатор D на основе фенольных полимеров (ADX 606, фирмы Lubrizol) в количестве 1,45 мг/кг.
С каждой пробой топлива были проведены эмульсионные тесты согласно стандарту DIN 51415. Для этого интенсивно перемешивались по 80 мл топлива и 20 мл воды. Затем наблюдался процесс расслоения смеси в зависимости от времени. Результаты оценивались на основании заданных в стандарте норм, причем 1 оценивалось очень хорошее расслоение, а большими цифрами - худшее расслоение. Детали приведены в указанном стандарте DIN.
В таблице 1 представлены результаты испытаний. Приведены оценки слоев фазового разделения после 1 минуты, 5, 30 и 60 минут. Как правило, результат 1 или lb получался после 5 минут.
Таблица 1
1 мин.
5 мин.
30 мин.
60 мин.
10 - VI (сравнение)
10 - V2 (сравнение)
А + 1,45 мг/кг D
10-1
А+ 0,01 мг/кг Н.
10-2
А + 0,03 мг/кг Н.
10-3
А + 0,05 мг/кг Н.
10-4
А + 0,07 мг/кг Н.
10-5
А + 0,14 мг/кг Н.
10-6
А + 0,28 мг/кг Н.
Комментарий:
Без добавки деэмульгатора наблюдается лишь очень медленное разрушение эмульсии. Оценка 4 неприемлема, речь идет о стабильной эмульсии.
Гидрофобины уже в крайне малых количествах оказывают очень хорошее деэмульгирующее действие. Всего 0,01 ррт гидрофобина в течение 1 минуты приводит к приемлемому результату. Такой же эффект, как с 0,07 мг/кг гидрофобина, получается при добавлении к топливу 1,45 мг/кг принятого в торговле деэмульгатора на основе фенольных полимеров. При применении гидрофобина достаточно 1/20 количества традиционного деэмульгатора для получения такого же эффекта.
Сравнительный пример 11
Применение других белков в качестве присадки к топливу
Аналогично примеру 10 исследовались белки, кроме гидрофобина, для применения в горючем.
Испытания проводились с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и казеином. Эти белки доступны в торговой сети. Далее использовался yaad согласно SEQ ID NO 15 и 16, поскольку это партнер слияния, не связанный самостоятельно с гидрофобином.
Соответствующий белок в концентрации 0,07 мг/кг добавлялся к высококачественному топливу торговой марки (согласно EN 228), которое уже содержало упомянутый выше пакет присадок А. Для сопоставления служило топливо только с пакетом присадок А без белка.
Тестирование эмульсий выполнялось согласно стандарту DIN 51415, как описано выше. Результаты испытаний приведены в таблице 2.
Таблица 2
1 мин.
5 мин.
30 мин.
60 мин.
11 - V3 (сравнение)
11-1
А + 0,07 мг/кг БСА
11-2
А + 0,07 мг/кг yaad
11-2 А + 0,07 мг/кг казеина
Комментарий:
Расслоение эмульсии без добавки деэмульгатора протекает также медленно, как в примере 10. Оценка 4 неприемлема, речь идет о стабильной эмульсии.
Применяемые белки способствовали разрушению эмульсии, но скорость деэмульгирования была ниже, чем при применении гидрофобинов.
Пример 12
Применение концентрата гидрофобина (Yaad-Xa-dewA-Hisft) в качестве деэмульгатора для сырой нефти
Испытания проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (SEQ ID N0. 19 и 20).
Для испытаний к 50 мл сырой нефти (пробы от АО Wintershall, зонд 301; содержание остаточной воды после добавления обычных деэмульгаторов около 3%) добавлялся концентрат гидрофобина в разных количествах. Концентрация гидрофобина в сырой нефти составляла 1 ррт, 10 ррт и 40 ррпт. После гомогенизации смеси центрифугировались в течение 10 минут при 2000 об/мин. Результаты испытаний воспроизведены в таблице 3.
Таблица 3
Добавка гидрофобина
Свободная водная фаза
Эмульсионная фаза
Без добавки
0,4 %
2,4 %
1 ррт
0,8 %
2,0 %
10 ррт
2,4 %
0,4 %
40 ррт
2,4 %
0,4 %
При добавлении 10 и 40 ррт концентрата гидрофобина образуется подавляющая часть свободной водной фазы.
Пример 13
Применение концентрата гидрофобина (Yaad-Xa-dewA-Hisfi)_согласно
примеру 8 для разделения полимеров на фракции
Испытания проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (SEQ IDNO: 19 и 20).
В два химических стакана помещалось по 150 г полиакриловой кислоты в виде ее натриевой соли (Sokalan(r) CP 10 S; молекулярный вес 4000 г/моль, согласно DE 199 50 941 А1), затем в каждый добавлялось по 75 г изопропанола. Перемешивание в течение 5 минут, затем добавлялось по 146 г изопропанола и воды (в соотношении 1:1) и смесь перемешивалась в течение 5 минут.
В химический стакан А добавлялись 50 ррт гидрофобина (1,64 м, 11,3 мг/мл) и в течение 5 минут смесь перемешивалась. Гидрофобии образовывал белые слизи в прозрачном растворе, которые спустя 5 минут полностью растворялись. В оба
химические стакана добавлялось по 19,75 г 50%-ной NaOH, и смесь перемешивалась в течение 15 минут.
С гидрофобином раствор сразу же приобретал молочный цвет, без добавки гидрофобина раствор становился очень мутным. После 15 минут перемешивания содержимое стаканов пропускалось через делительную воронку емкостью 500 мл, встряхивалось и проводилось наблюдение, как долго длилось разделение фаз.
В пробе с гидрофобином четкое разделение фаз наблюдалось через 10 минут, без добавки гидрофобина сначала образовывался пенный "промежуточный слой", но четкого разделения фаз не наблюдалось. Без добавки гидрофобина четкая граница между фазами образовывалась лишь по прошествии 40 минут.
Продолжительность процесса разделения до появления четкой границы между фазами:
- с гидрофобином: 12 минут
- без гидрофобина: 40 минут.
Пример 14, Сравнительный пример 15
Применение слитого гидрофобина (Yaad-Xa-dewA-Hisa) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве деэмульгатора для эмульсии масло-в-воде при 55°С
Исследования проводились с концентратом гидрофобина согласно примеру 8 (SEQ ID NO. 19 и 20) и с доступным в продаже раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА).
Проверка способности деэмульгирования осуществлялась следующим образом: В качестве масла использовалось масло для гидросистем.
40 мл дистиллированной воды вливалось в мерный цилиндр емкостью 100 мл и добавлялся соответствующий белок в количестве 5 ррт относительно воды или 2,5 ррт относительно всего состава. Затем добавлялись 40 мл гидрофобина, и система нагревалась в водяной бане до температуры 55°С. Время термообработки составляло 20 минут. После перемешивания в течение 5 минут при 1500 об/мин образовывалась эмульсия масла и воды. Таким образом, масло эмульгировало в водную фазу. Затем наблюдалось разделение фаз. Результаты отображают количество вновь отделенной водной фазы в мл.
В одной серии испытаний использовался водный раствор обоих белков без изменения. Результаты представлены на диаграмме 1.
Во второй серии испытаний рН раствора обоих белков сначала доводился до рН 1 при комнатной температуре с добавлением НС1 и выдерживался 24 часа при рН 1. Затем с помощью NaOH показатель рН вновь устанавливался равным 7. Результаты представлены на диаграмме 2.
Скорость деэмульгирования эмульсии масло-в-воде при добавлении БСА лишь незначительно выше по сравнению с пробой без деэмульгатора. При добавлении гидрофобина наблюдается четкое ускорение деэмульгирования. ^
Комментарий:
Диаграмма 1: Сравнение гидрофобина (Н*белок А) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), неизмененные пробы
Диаграмма 2: Сравнение гидрофобина (Н*белок А) и бычьего сывороточного альбумина, перед испытанием пробы выдерживались 24 часа при рН 1
Деэмульгирование эмульсий масло-в-воде с 2,5 ррт белка
Рисунок 1
1/1
След А В С D Е F
Сопоставление названий последовательностей с последовательностями ДНК и последовательностями полипептидов в протоколе последовательностей
dewA последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 1
dewA последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 2
rodA последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 3
rodA последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 4
hypA последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 5
hypA последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 6
hypB последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 7
hypB последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 8
sc3 последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 9
sc3 последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 10
basfl последовательность ДНК и SEQ ID NO: 11 последовательность полипептидов
basfl последовательность полипептидов SEQIDNO:12
basf2 последовательность ДНК и ; SEQ ID NO: 13 последовательность полипептидов :
basf2 последовательность полипептидов SEQIDNO:14
yaad последовательность ДНК и SEQ ID NO: 15 последовательность полипептидов
yaad последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 16
уаае последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 17
уаае последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 18
yaad-Xa-dewA-his последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 19
yaad-Xa-dewA-his последовательность SEQ ID NO: 20 полипептидов
yaad-Xa-rodA-his последовательность ДНК и SEQ ID NO: 21 последовательность полипептидов
yaad-Xa-rodA-his последовательность 1 SEQ ID NO: 22 полипептидов
yaad-Xa-basfl-his последовательность ДНК и последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 23
yaad-Xa-basf 1 -his последовательность полипептидов
SEQ ID NO: 24
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БАСФ Акциеигезелыиафт
<120> Применение протеинов в качестве демульгаторов
10 <130> АЕ 200500040
<160> 24
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 405
20 <212> ДНК
<213> basf-dewA
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (405) 30 <223>
<400> 1
atg cgc ttc ate gtc tct etc etc gec ttc act gee gcg gec acc gcg 48 Met Arg Phe He Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 35 1 5 10 15
acc gec etc ccg gec tct gee gca aag aac gcg aag ctg gec acc teg 96
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
gcg gee ttc gee aag cag get gaa ggc acc acc cgc aat gtc ggc teg 144
Ala Ala Phe Ala Lys Gin Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45
45 ate get tgc tgc aac tec ccc get gag ace aac aac gac agt ctg ttg 192 He Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60
age ggt ctg etc ggt get ggc ctt etc aac ggg etc teg ggc aac act 240 50 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gxy Leu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
ggc age gec tgc gec aag gcg age ttg ate gac cag ctg ggt ctg etc 238 Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu He Asp Gin Leu Gly Leu Leu 55 85 90 Q5
get etc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc 336 Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn He Val 100 105 110
get tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gec gtc gac aac get 384 Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125
65 ggc get ggt acc aag get gag Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
405
130 135
<210> 2
<211> 135
<212> PRT
<213> basf-dewA
<400> 2
Met Arg Phe Не Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 15 10 15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser 20 25 30
Ala Ala Phe Ala Lys Gin Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser 35 40 45
He Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 7 0 7 5 8 0
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu He Asp Gin Leu Gly Leu Leu 85 90 95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn He Val 100 105 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala 115 120 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135
<210> 3
<211> 471
<212> ДНК
<213> basf-rodA
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (471)
<223>
<400> 3
atg aag ttc tec att get gec get Met Lys Phe Ser He Ala Ala Ala 1 5
gcg gee etc cct cct gee cat gat Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp 20
ggc aac aag ggc aac age aac gtc Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val 35 40
acc gtc aag cag gee tec gac aag gtc gtt get ttc gee gec tec gtc Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 10 15
tec cag ttc get ggc aat ggt gtt Ser Gin Phe Ala Gly Asn Gly Val 25 30
aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg Lys Phe Pro Val Pro Glu Asr Val 45
tgc ggt gac cag gec cag etc tct
Thr Val Lys Gin Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser 50 55 60
tgc tgc aac aag gee acg tac gee ggt gac асе аса acc gtt gat gag Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80
ggt ctt ctg tct ggt gec etc ago ggc etc ate ggc gec ggg tct ggt Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu lie Gly Ala Gly Ser Gly 85 90 95
gee gaa ggt ctt ggt etc ttc gat cag tgc tec aag ctt gat gtt get Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gin Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 100 105 110
gtc etc att ggc ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac Val Leu He Gly He Gin Asp Leu Val Asn Gin Lys Cys Lys Gin Asn 115 120 125
att gee tgc tgc cag aac tec ccc tec age gcg gat ggc aac ctt att He Ala Cys Cys Gin Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu He 130 135 140
ggt gtc ggt etc cct tgc gtt gee ctt gg" tec ate etc Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser He Leu 145 150 155
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> basf-rodA
<400> 4
Met Lys Phe Ser He Ala Ala Ala 1 5
Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val
10 15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gin Phe Ala Gly Asn Gly Val 20 25 30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val 35 40 45
Thr Val Lys Gin Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser 50 55 60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80
15 Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu He Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gin Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala 20 100 105 110
Val Leu He Gly He Gin Asp Leu Val Asn Gin Lys Cys Lys Gin Asn 115 120 125
He Ala Cys Cys Gin Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu He 130 135 140
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser He Leu 145 150 П5
35 <210> 5
<211> 336
<212> ДНК
40 <213> basf-HypA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336) 50 <223>
<400> 5
55 atg ate tct cgc gtc ctt gtc get get etc gtc get etc ccc get ctt 48
Met He Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 15 10 15
gtt act gca act cct get ccc gga aag cct aaa gec age agt cag tgc 96 60 Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gin Cys 20 25 30
gac gtc ggt gaa ate cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144 Asp Val Gly Glu He His Cys Cys Asp Thr Gin Gin Thr Pro Asp His 65 35 40 45
acc age gec gec gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc ate aac ctt ggt 192
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro He Asn Leu Gly 50 55 60
get ttc etc ggt ttc gac tgt acc ccc att tec gtc ctt ggc gtc ggt 240 5 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro He Ser Val Leu Gly Val Gly
65 70 75 80
ggc aac aac tgt get get cag cct gtc tgc tgc аса gga aat caa ttc 288 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gin Pre Val Cys Cys Thr Gly Asn Gin Phe 10 85 90 95
acc gca ttg att aac get ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac etc 336 Thr Ala Leu He Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 HO
<210> 6 <211> 112
<212> PRT <213> basf-HypA
<400> 6
Met He Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 30 1 5 10 15
Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gin Cys 20 25 30
Asp Val Gly Glu He His Cys Cys Asp Thr Gin Gin Thr Pro Asp His 35 40 45
Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro He Asn Leu Gly 50 55 60
45 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro He Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80
Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gin Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gin Phe 50 85 90 95
Thr Ala Leu He Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu 100 105 110
<210> 7 <211> 357
<212> ДНК <213> basf-HypB
<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (357)
<223>
<400> 7
atg gtc age acg ttc ate act gtc gca aag acc ctt etc gtc gcg etc
Met Val Ser Thr Phe He Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu
15 10 15
etc ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag Leu Phe Val Asn He Asn He Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
cat tgt age acc ggt cct ate gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct His Cys Ser Thr Gly Pro He Glu Cys Cys Lys Gin Val Met Asp Ser 35 40 45
aag age cct cag get acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg Lys Ser Pro Gin Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60
ggt gtc ctt get ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc age cct Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Vai Gly Ala Asn Cys Sei Pro 65 70 75 80
ate acg gca att ggt att ggc tec ggc age caa cgc tct ggc cag acc He Thr Ala He Gly He Gly Ser Gly Ser Gin Cys Ser Gly Gin Thr 85 90 95
gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc get att ggt tgc Val Cys Cys Gin Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala He Gly Cys 100 105 110
act ccc att aat gee aat gtg Thr Pro He Asn Ala Asn Val 115
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> basf-HypB
<400> 8
Met Val Ser Thr Phe He Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15
Leu Phe Val Asn He Asn He Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys 20 25 30
His Cys Ser Thr Gly Pro He Glu Cys Cys Lys Gin Val Met Asp Ser 35 40 45
Lys Ser Pro Gin Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu 50 55 60
5 Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 7c> 80
He Thr Ala He Gly He Gly Ser Gly Ser Gin Cys Per Gly 10 85 90
Val Cys Cys Gin Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala He Gly Cys 100 105 110
Thr Pro He Asn Ala Asn Val 115
<210> 9 <211> 408 25 <212> ДНК
<213> basf-sc3
<220>
<221> CDS 35 <222> (1),.(408) <223>
<400> 9
atg ttc gec cgt etc ccc gtc gtg ttc etc tac gee ttc gtc gcg ttc 48 Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe 15 10 15
ggc gec etc gtc get gec etc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg 96 Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr 20 25 30
50 ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc teg acg acg 144 Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr 35 40 45
acc ate gee gee ggt ggc acg tgt act acg ggg ccg cte tct tgc tgc 192 55 Thr He Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys 50 55 60
aac cag gtt caa teg gcg age age age cct gtt acc gee etc etc ggc 240 Asn Gin Val Gin Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly 60 65 7 0 7 5 8 0
ctg etc ggc att gtc etc age gac etc aac gtt etc gtt ggc ate age 288
Leu Leu Gly He Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly He Ser
85 90 9 5
tgc tct ccc etc act gt c ate ggc gtc ggc; ggc age gg ? tgt * то gey ~~> f
Cys Ser Pro Leu Thr Val He Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100
105
110
cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg ate aac ate 384 Gin Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gin Phe Asn Gly Leu He Asn He 5 115 120 125
ggt tgc acc ccc ate aac ate etc 408 Gly Cys Thr Pro He Asn He Leu 130 135
<210> 10 <211> 136
<212> PRT <213> basf-sc3
<400> 10
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe 25 1 5 10 15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr 20 25 30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr 35 40 45
Thr He Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys 50 55 60
40 Asn Gin Val Gin Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly 65 70 75 80
Leu Leu Gly He Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly He Ser 45 85 90 95
Cys Ser Pro Leu Thr Val He Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala 100 105 HO
Gin Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gin Phe Asn Gly Leu He Asn He
115 120 125
Gly Cys Thr Pro He Asn He Leu 130 135
60 <210> 11
<211> 483
<212> ДНК
<213> basf-BASFl
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(483)
<223>
<400> 11
atg aag ttc tec gtc tec gec gec gtc etc gee ttc gec gec tec gtc
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val
15 10 15
gee gec etc cct cag cac gac tec gee gee ggc aac ggc aac ggc gtc Ala Ala Leu Pro Gin His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gee acc Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gin Ala Thr 35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gec cag etc tec tgc tgc aac aag gee acc Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 " 60
tac gec ggc gac gtc etc acc gac ate gac gag ggc ate etc acc ggc Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp He Asp Glu Gly He Leu Ala Gly 65 70 75 80
etc etc aag aac etc ate ggc ggc ggc tec ggc tec gag ggc etc ggc Leu Leu Lys Asn Leu He Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95
etc ttc gac cag tgc gtc aag etc gac etc cag ate tec gtc ate ggc Leu Phe Asp Gin Cys Val Lys Leu Asp Leu Gin He Ser Val He Gly 100 105 110
ate cct ate cag gac etc etc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag He Pro He Gin Asp Leu Leu Asn Gin Val Asn Lys Gin Cys Lys Gin 115 120 125
aac ate gec tgc tgc cag aac tec cct tec gac gec acc ggc tec etc Asn He Ala Cys Cys Gin Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu 130 135 140
gtc aac etc ggc etc ggc aac cct tgc ate cct gtc tec etc etc cat Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys He Pro Val Ser Leu Leu His 145 150 155 160
atg Met
<210> 12
<211> 161
<212> PRT
<213> basf-BASFl
<400> 12
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
Ala Ala Leu Pro Gin His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gin Ala Thr 35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 50
Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp He Asp Glu Gly He Leu Ala Gly 65 70 75 80
Leu Leu Lys Asn Leu He Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly 85 90 95
Leu Phe Asp Gin Cys Val Lys Leu Asp Leu Gin He Ser Val He Gly 100 105 110
He Pro He Gin Asp Leu Leu Asn Gin Val Asn Lys Gin Cys Lys Gin 115 120 125
Asn He Ala Cys Cys Gin Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu 130 135 140
Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys He Pro Val Ser Leu Leu His 145 150 155 160
Met
<210> 13
<211> 465
<212> ДНК
<213> basf-BASF2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(465)
<223>
<400> 13
atg aag ttc tec gtc tec gec gee gtc etc gee ttc gec gec tec gtc
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
gec gee etc cct cag cac gac tee gec gee ggc aac ggc aac ggc gtc Ala Ala Leu Pro Gin His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gec acc Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gin Ala Thr 35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gec cag etc tec tgc tgc aac aag gec acc Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr 50 55 60
tac gec ggc gac gtc acc gac ate gac gag ggc ate etc gec ggc etc Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp He Asp Glu Gly He Leu Ala Gly Leu 65 70 73 80
etc aag aac etc ate ggc ggc ggc tec ggc tec gag ggc etc ggc; etc Leu Lys Asn Leu He Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu 85 90 95
ttc gac cag tgc gtc aag etc gac etc cag ate tec gtc ate ggc ate Phe Asp Gin Cys Val Lys Leu Asp Leu Gin He Ser Val He Gly He
100 105 110
cct ate cag gac etc etc aac cag cag tgc aag eag aac ate gec tgc Pro He Gin Asp Leu Leu Asn Gin Gin Cys Lys Gin Asn He Ala Cys 115 120 125
tgc cag aac tec cct tec gac gec acc ggc tec etc gtc aac etc ggc Cys Gin Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 130 135 140
aac cct tgc ate cct gtc tec etc etc cat atg Asn Pro Cys He Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155
<210> 14
<211> 155
<212> PRT
<213> basf-BASF2
<400> 14
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
Ala Ala Leu Pro Gin His Asp Ser Ala Ala G^y Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gin Ala Thr 35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55
Туг Ala Gly Asp Val Thr Asp He Asp Glu Gly He Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80
Leu Lys Asn Leu He Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
8 5 90 9 5
Phe Asp Gin Cys Val Lys Leu Asp Leu Gin He Ser Val He Gly He 100 105 110
Pro He Gin Asp Leu Leu Asn Gin Gin Cys Lys Gin Asn He Ala Cys 115 120 125
Cys Gin Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 130 135 .140
Asn Pro Cys He Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155
<210> 15
<211> 882
<212> ДНК
<213> basf-yaad
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(882)
<223>
<400> 15
atg get caa аса ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg
Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys 20 25 30
ate get gaa gaa get gga get gtc get gta atg gcg eta gaa cqt gtg He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
cca gca gat att cgc gcg get gga gga gtc gec cgt atg get gac cct Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60
аса ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct ate ccg gta ctg gca Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 65 70 75 80
aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa get atg
Lys Ala Arg He Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg get gac gaa
Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac аса gtt cct ttt gtc tgt ggc
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca аса cgc cgt att gcg gaa ggt get tct
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc аса aaa ggt gag cct gga аса ggt aat att gtt gag get
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala
145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac get caa gtg cgc aaa gta gtt gcg
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val "a: Aia
165 170 175
atg agt gag gat gag eta atg аса gaa gcg aaa aac eta ggt get cct
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt
Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gee get ggc ggc gta gca act cca get gat get get etc atg
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt get gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa
Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys
225 230 235 240
tea gac aac ect get aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca аса act
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate get gag tc;g tea aaa gag ctt gg*:
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Lou Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tea aac tta ctt cca gaa cag cgt
Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg Met Gin Glu Arg Gly Trp 290
<210> 16 <211> 294 <212> PRT
<213> basf-yaad
<400> 16
Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys 20 25 30
He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60
Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg He Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pre Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 20C 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pre A La Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220
Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
5 Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg 275 280 285
Met Gin Glu Arg Gly Trp 10 290
<210> 17 15 <211> 591 <212> ДНК <213> basf-yaae
<220> 25 <221> CDS
<222> (1)..(591) <223>
<400> 17
atg gga tta аса ata ggt gta eta gga ctt caa gga gca gtt aga gag 48
35 Met Gly Leu Thr He Gly Val Leu Gly Lea Gin Gly Ala Val Arg Glu
15 10 15
cac ate cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg get ggt ctt gtc gta aaa 96 His He His Ala He Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys 40 20 25 30
cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg age ggt 144
Arg Pro Glu Gin Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu He Leu Pro Gly Gly
35 40 45
gag age acg acg atg ego cgt ttg ate gat acg tat caa ttc atg gag 192
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu He Asp Thr Tyr Gin Phe Met Glu 50 55 60
50 ccg ctt cgt gaa ttc get get cag ggc aaa ccg atg ttt gga аса tgt 240 Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gin Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80
gec gga tta att ata tta gca aaa gaa att gee ggt tea gat aat cct 288 55 Ala Gly Leu He He Leu Ala Lys Glu He Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85 90 95
cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tea ttt ggc egg 336 His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg 60 100 105 110
cag gtt gac age ttt gaa get gat tta аса att aaa ggc ttg gac gag 384 Gin Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr He Lys Gly Leu Asp Glu 115 120 125
cct ttt act ggg gta ttc ate cgt get ccg cat att tta gaa get ggt 432 Pro Phe Thr Gly Val Phe He Arg Ala Pro His He Leu Glu Ala Gly
130 135 140
gaa aat gtt gaa gtt eta teg gag cat aat ggt egt att gta gee gcg Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg He Val Ala Ala
145 150 155 160
aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tea ttc cat ccg gag ctg аса gaa Lys Gin Gly Gin Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu 165 170 175
gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag Asp His Arg Val Thr Gin Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys 180 185 190
caa aag gca ctt gta Gin Lys Ala Leu Val 195
<210> 18
<211> 197
<212> PRT
<213> basf-yaae
<400> 18
Met Gly Leu Thr He Gly Val Leu Gly Leu Gin Gly Ala Val Arg Glu 15 10 15
His He His Ala He Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys 20 25 30
Arg Pro Glu Gin Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu He Leu Pro Gly Gly 35 40 45
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu He Asp Thr Tyr Gin Phe Met Glu 50 55 60
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gin Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80
Ala Gly Leu He He Leu Ala Lys Glu He A La Gly Ser Asp Asn Pro 85 90 L= <5
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg 100 105 110
Gin Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr He Lys Gly Leu Asp Glu 115 120 125
Pro Phe Thr Gly Val Phe He Arg Ala Pro His He Leu Glu Ala Gly 130 135 140
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg He Val Ala Ala 145 150 155 160
Lys Gin Gly Gin Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
165 170 175
Asp His Arg Val Thr Gin Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lyj 180 185 190
Gin Lys Ala Leu Val 195
<210> 19
<211> 1329
<212> ДНК
<213> basf-yaad-Xa-dewA-his <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1329)
<223>
<400> 19
atg get caa аса ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys 20 25 30
ate get gaa gaa get gga get gtc get gta atg gcg eta gaa cgt gtg He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val. Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
cca gca gat att cgc gcg get gga gga gtt gee cgt atg get gac cct Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60
аса ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct ate ccg gta atg gca Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala
65 70 75 80
aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa get atg Lys Ala Arg He Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg get gac gaa Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac аса gtt cct ttt gtc cgt ggc Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca аса cgc cgt att gcg gaa ggt get tct Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140
atg ctt cgc аса aaa ggt gag cct gga аса ggt aat att gtt gag get Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala 145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac get caa gtg cgc aaa gta gtt gcg Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175
atg agt gag gat gag eta atg аса gaa gcg aaa aac eta ggt get cct Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pre '.'al Val 195 200 203
aac ttt gec get ggc ggc gta gca act cca get gat get get etc atg Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pre Ala Asp Ala Ala Leu Ще> г 210 215 220
atg cag ctt ggt get gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys 225 230 235 240
tea gac aac cct get aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca аса act Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr
24 5 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate get gag ttg cca aaa gag ctt ggt His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tea aac tta ctt cca gaa cag cgt Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg 275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tec att gaa ggc cgc atg cgc ttc ate Met Gin Glu Arg Gly Trp Arg Ser He Glu Gly Arg Met Arg Phe He 290 295 300
gtc tct etc etc gee ttc act gee gcg gee acc gcg acc gee etc ecg Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320
gec tct gec gca aag aac gcg aag ctg gee acc teg gcg gee ttc gee Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala 325 330 335
aag cag get gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc teg ate get tgc tgc Lys Gin Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser He Ala Cys Cys 340 345 350
aac tec ccc get gag acc aac aac gac agt ctg ttg age ggt ctg etc Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 355 360 365
ggt get ggc ctt etc aac ggg etc teg ggc aac act ggc age gee tgc Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys 370 375 380
gee aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg etc get etc gtc gac
Ala Lys Ala Ser Leu He Asp Gin Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp 385 390 395 400
cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc get tgc tgc cct His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn He Val Ala Cys Cys Pro
4 05 410 4 15
gag gga acc acc aac tgt gtt gec gtc gac aac get ggc get ggt acc Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr 420 425 430
aag get gag gga tct cat cac cat cac cat cac Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His 435 440
<210> 20 <211> 443 <212> PRT
<213> basf-yaad-Xa-dewA-his <400> 20
Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys 20 25 30
He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60
Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg He Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val lys Gly 115 12 0 12 5
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala
145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220
Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys
225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg 275 280 285
Met Gin Glu Arg Gly Trp Arg Ser He Glu Gly Arg Met Arg Phe He 290 295 300
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
325 330 335
Lys Gin Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser He Ala Cys Cys
340 345 350
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 355 360 365
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys 370 375 380
Ala Lys Ala Ser Leu He Asp Gin Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp 385 390 395 400
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn He Val Ala Cys Cys Pro 405 410 415
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr 420 425 430
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His 435 440
<210> 21
<211> 1395
<212> ДНК
<213> basf-yaad-Xa-rodA-his <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1395)
<223>
<400> 21
atg get caa аса ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg
Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met
15 10 15
caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys
20 25 30
ate get gaa gaa get gga get gtc get gta atg gcg eta gaa cgt gtg He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
cca gca gat att cgc gcg get gga gga gtt gee cgt atg get gac cct Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60
аса ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct ate ccg gta atg gca Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 65 70 75 80
aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa get atg Lys Ala Arg He Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg get gac gaa Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac аса gtt cct ttt gtc tgt ggc Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca аса cgc cgt att gcg gaa ggt get tct Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 " 140
atg ctt cgc аса aaa ggt gag cct gga аса ggt aat att gtt gag get Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala 145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac: get caa gtg cgc aaa gta gtt gcg Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175
atg agt gag gat gag eta atg аса gaa gcg aaa aac eta ggt get cct Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gee get ggc ggc gta gca act cca get gat get get etc atg Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220
atg cag ctt ggt get gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys 225 230 235 240
tea gac aac cct get aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca аса act Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate get gag ttg tea aaa gag ctt ggt His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tea aac tta ctt cca gaa cag cgt Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg 275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag etc tec Met Gin Glu Arg Gly Trp Arg Ser He Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300
att get gec get gtc gtt gec ttc gec gec tec gtc gcg gec etc cct He Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Lee Pro 305 310 315 320
cct gec cat gat tec cag ttc get ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc Pro Ala His Asp Ser Gin Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335
aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gin 340 345 350
gee tec gac aag tgc ggt gac cag gee cag etc tct tgc tgc aac aag Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365
gec acg tac gec ggt gac асе аса асе gtt gat gag ggt ctt ctg tct Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380
ggt gec etc age ggc etc ate ggc gee ggg tct ggt gee gaa ggt ctt Gly Ala Leu Ser Gly Leu He Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400
ggt etc ttc gat cag tgc tee aag ctt gat gtt get gtc etc att ggc Gly Leu Phe Asp Gin Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu lie Gly 405 410 415
ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gee tgc tgc He Gin Asp Leu Val Asn Gin Lys Cys Lys Gin Asn He Ala Cys Cys 420 425 430
cag aac tec ccc tec age gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt etc 1344 Gin Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu He Gly Val Gly Leu 435 440 445
cct tgc gtt gec ctt ggc tec ate etc gga tct cat cac cat cac cat 1392 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser He Leu Gly Ser His His His His His 450 ' 455 460
10 cac 1395 His 465
15 <210> 22 <211> 465 <212> PRT
<213> basf-yaad-Xa-rodA-his
25 <400> 22
Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys
20 25 30
35 He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 40 50 55 60
Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg He Gly His He Va.l Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110
55 Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser 60 130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220
Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg
275 280 285
Met Gin Glu Arg Gly Trp Arg Ser He Glu Gly Arg Met Lys Phe Sei 290 295 300
He Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320
Pro Ala His Asp Ser Gin Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly 325 330 335
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gin 340 345 350
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys 355 360 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser 370 375 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu He Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400
Gly Leu Phe Asp Gin Cys Ser Lys Lei; Asp Val Ala Val Leu He Gly 405 410 415
He Gin Asp Leu Val Asn Gin Lys Cys Lys Gin Asn He Ala Cys Cys 420 425 430
Gin Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu He Gly Val Gly Leu 4 35 440 445
5 Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser He Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460
His 10 465
<210> 23
15 <211> 1407
<212> ДНК
<213> basf-yaad-Xa-BASFl-his
<220> 25 <221> CDS
<222> (1) .. (1407) <223>
<400> 23
atg get caa аса
35 Met Ala Gin Thr 1
caa aaa ggc ggc
Gin Lys Gly Gly
40 20
ate get gaa gaa
He Ala Glu Glu 35
cca gca gat att
Pro Ala Asp He 50
50 аса ate gtg gaa
Thr He Val Glu 65
aaa gcg cgt ate
55 Lys Ala Arg He
ggt gtt gac tat
Gly Val Asp Tyr
60 100
gaa ttt cat tta
Glu Phe His Leu 115
tgc cgt gat ctt
Cys Arg Asp Leu
ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48 Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 5 10 15
gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96 Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys 25 30
get gga get gtc get gta atg gcg eta gaa cgt gtg 144 Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
40 4 5
cgc gcg get gga gga gtt gec cgt atg get gac cct 192 Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 55 60
gaa gta atg aat gca gta tct ate ccg gta atg gca 240 Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 70 75 80
gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa get atg 288 Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg get gac gaa 336 He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 105 110
aat aaa aat gaa tac аса gtt cct ttt gtc tgt ggc 384 Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 120 125
ggt gaa gca аса cgc cgt att gcg gaa ggt get tct 4 32
Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc аса aaa ggt gag cct gga аса ggt aat att gtt gag get Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala 145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac get caa gtg cgc aaa gta gtt gcg Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag eta atg аса gaa gcg aaa aac eta ggt get cct Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205
aac ttt gee get ggc ggc gta gca act cca get gat get get etc atg Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220
atg cag ctt ggt get gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys 225 230 235 240
tea gac aac cct get aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca аса act Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate get gag ttg tea aaa gag ctt ggt His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tea aac tta ctt cca gaa cag cgt Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg 275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tec Met Gin Glu Arg Gly Trp Arg Ser He Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300
gtc tec gec gec gtc etc gec ttc gec gec tec gtc gec gee etc cct Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320
cag cac gac tec gee gec ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc Gin His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335
cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gec acc gac aag tgc ggc Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gin Ala Thr Asp Lys Cys Gly 340 345 350
gac cag gee cag etc tec tgc tgc aac aag gec acc tac gee ggc gac Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365
gtc etc acc gac ate gac gag ggc ate etc gec ggc etc etc aag aac Val Leu Thr Asp He Asp Glu Gly He Leu Aia Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380
etc ate ggc ggc ggc tec ggc tec gag ggc etc ggc etc ttc gac cag Leu He Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gin 385 390 395 400
tgc gtc aag etc gac etc cag ate tec gtc ate ggc ate cct ate cag
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gin He Ser Val He Gly He Pro He Gin 405 410 415
gac etc etc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac ate gee tgc Asp Leu Leu Asn Gin Val Asn Lys Gin Cys Lys Gin Asn He Ala Cys 420 425 430
tgc cag aac tec cct tec gac gee acc ggc tec etc gtc aac etc ggc Cys Gin Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445
etc ggc aac cct tgc ate cct gtc ccc etc etc cat atg gga tct cac Leu Gly Asn Pro Cys He Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly His 450 455 460
cac cat cac cat cac His His His His His 465
<210> 24 <211> 469 <212> PRT
<213> basf-yaad-Xa-BASFl-his <400> 24
Met Ala Gin Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
Gin Lys Gly Gly Val He Met Asp Val He Asn Ala Glu Gin Ala Lys 20 25 30
He Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val 35 40 45
Pro Ala Asp He Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro 50 55 60
Thr He Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser He Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg He Gly His He Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met 85 90 95
Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu 100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg He Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn He Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gin Val Arg Lys Val Val Ala 165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro 180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gin He Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val 195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220
Met Gin Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gry Ser Gly He Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala He Val Glu Ala Thr Thr 245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu He Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly 260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly He Glu He Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gin Arg 275 280 285
Met Gin Glu Arg Gly Trp Arg Ser He Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser 290 295 300
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320
Gin His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe 325 330 335
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gin Ala Thr Asp Lys Cys Gi; 340 345 350
Asp Gin Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp 355 360 365
Val Leu Thr Asp He Asp Glu Gly He Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn 370 375 380
Leu He Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gin 385 390 395 400
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gin He Ser Val He Gly He Pro He Gin 405 410 415
Asp Leu Leu Asn Gin Val Asn Lys Gin Cys Lys Gin Asn He Ala Cys 420 425 430
Cys Gin Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly 435 440 445
Leu Gly Asn Pro Cys He Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His 450 455 460
15 His His His His His 465
Уточненная формула изобретения
1. Применение, по меньшей мере, одного гидрофобина для улучшения разделения фаз в составах, содержащих, по меньшей мере, две жидкие фазы.
2. Применение по п. 1, причем, по меньшей мере, один гидрофобии используется в качестве деэмульгатора.
3. Применение по п. 1 или 2, причем, по крайней мере, один гидрофобии является слитым гидрофобином.
4. Применение по п. 3, отличающееся тем, что для слитого гидрофобина речь идет, по крайней мере, об одном выбранном из группы (SEQ ID NO: 20), (SEQ ID NO: 22) или (SEQ ID NO: 24) гидрофобине.
5. Применение по одному из пп. 1 - 4, причем состав, содержащий, по меньшей мере, две жидкие фазы, выбран из группы, состоящей из
- составов, содержащих масло и воду;
- составов, содержащих горючее или топливо и воду;
- реакционных смесей, содержащих, по меньшей мере, две жидкие фазы.
6. Применение по одному из пп. 1-5, причем используется, по крайней мере, один гидрофобии в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава.
7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что речь идет о составе сырая нефть-в-воде, и используется, по крайней мере, один гидрофобии в количестве от 1 до 800 ррт относительно всего состава.
8. Применение по п. 6, отличающееся тем, что речь идет о составе горючее или топливо и вода, и используется, по крайней мере, один гидрофобии в количестве от 0,001 до 10 ррт относительно всего состава.
9. Применение по одному из п.п. 1 - 8, причем кроме, по крайней мере, одного гидрофобина используется, по крайней мере, одно дополнительное соединение, которое улучшает разделение фаз.
10. Способ разделения, по крайней мере, двух жидких фаз в составе, содержащем, по крайней мере, две жидкие фазы, включающий добавление к составу, по крайней мере, одного гидрофобина.
11. Способ по п. 10, причем, по крайней мере, один гидрофобии является слитым гидрофобином или его производным.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что для слитого гидрофобина речь идет, по крайней мере, об одном выбранном из группы (SEQ ID NO: 20), (SEQ ID NO: 22) или (SEQ ID NO: 24) гидрофобине.
13. Способ по одному из пп. 10 - 12, причем структура, содержащая, по меньшей мере, две жидкие фазы, выбрана из группы, состоящей из
- составов, содержащих масло и воду;
- составов, содержащих горючее или топливо и воду;
- реакционных смесей, содержащих, по меньшей мере, две жидкие фазы.
14. Способ по одному из пп. 10 - 13, причем используется, по крайней мере, один гидрофобии в количестве от 0,0001 до 1000 ррт относительно всего состава.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что речь идет о составе сырая нефть-вводе, и используется, по крайней мере, один гидрофобии в количестве от 1 до 800 ррт относительно всего состава.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что речь идет о составе горючее или топливо и вода, и используется, по крайней мере, один гидрофобии в количестве от 0,001 до 10 ррт относительно всего состава.
17. Способ по одному из пп. 10 - 16, причем способ включает повышение температуры состава, содержащего, по крайней мере, две жидкие фазы, перед добавлением, по крайней мере, одного гидрофобина или после его добавления.
18. Композиция, содержащая, по крайней мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из горючих, топлив или растворимых в воде или в масле полимерных растворов, и, по меньшей мере, одного гидрофобина.
19. Композиция по п. 18, причем композиция содержит, по крайней мере, топливо или горючее, и в ней содержится гидрофобии или его производное в количестве от 0,001 до 0,5 ррт относительно всей композиции.
20. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что для топлива или горючего речь идет о топливе, выбранном из группы автомобильных бензинов, дизельного топлива или газотурбинного топлива.
21. Композиция по одному из пп. 18 - 20, причем, по крайней мере, один белок является слитым гидрофобином или его производным.
22. Композиция по п. 21, отличающаяся тем, что для слитого гидрофобина речь идет, по крайней мере, об одном выбранном из группы (SEQ ID NO: 20), (SEQ ID NO: 22) или (SEQ ID NO: 24) гидрофобине.