Настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для стимуляции физиологической мобилизации, пролиферации и дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников, для стимуляции васкулогенеза, для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, и для получения фармацевтических композиций в целях лечения такого рода заболеваний, а также к фармацевтическим композициям, которые включают эритропоэтин и другие пригодные биологически активные вещества для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.

 

(57) Реферат / Формула:
изобретение относится к применению эритропоэтина для стимуляции физиологической мобилизации, пролиферации и дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников, для стимуляции васкулогенеза, для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, и для получения фармацевтических композиций в целях лечения такого рода заболеваний, а также к фармацевтическим композициям, которые включают эритропоэтин и другие пригодные биологически активные вещества для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.

 

---

2420-142097ЕА/22
ПРИМЕНЕНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА
ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для стимуляции физиологической мобилизации, пролиферации и дифференцировки эндотелиальных плеток-предшественников, для стимуляции васкулогенеза, для терапии заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, и для получения фармацевтических композиций в целях лечения таких заболеваний, а также к фармацевтическим композициям, которые включают эритропоэтин и другие пригодные биологически активные вещества для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.
Эндотелий сосудов представляет собой слой клеток, который выстилает кровеносные сосуды. Эндотелий отделяет кровь от других слоев сосудов, причем эндотелий является не только пассивным барьером, но и активно участвует в регуляции сосудистого тонуса. Соответственно этому, также говорят о зависимой от эндотелия вазодилатации. В силу своего положения эндотелий постоянно подвергается гемодинамическому стрессу и метаболическому стрессу. В случае патогенных состояний, например, в случае повышенного кровяного давления, повышенных содержаний липопротеинов низкой плотности (LDL), ограниченной почечной функции или повышенного уровня сахара в крови, поэтому часто возникают функциональные дефекты эндотелия, за которыми затем могут следовать морфологически конкретные повреждения, такие как образование атеросклеротических бляшек. Очень ранний симптом измененной, соответственно, редуцированной
эндотелиальной функции, соответственно, эндотелиальной дисфункции, представляет собой уменьшение зависимой от эндотелия вазодилатации.
В случае коронарной болезни сердца (КНК), а также в случае имеющихся факторов риска без КНК, таких как, например, гипертония, гиперлипопротеинемия или диабет, дефекты эндотелиальной функции проявляются в пониженном продуцировании N0 (= EDRF) и повышенном продуцировании эндотелина. Высокие уровни эндотелина в плазме приводят к анормальному росту
клеток, воспалениям, сосудистым разрастаниям и сильным сужениям сосудов. Нарушения эндотелиальной функции к тому же характеризуются усиленным продуцированием адгезивных молекул, таких как ICAM-1 и VCAM-1, за счет чего к эндотелию в повышенной мере прилипают тромбоциты и моноциты. Обусловленное этим происходит повышение сосудистого тонуса. Таким образом, в самых различных системах возникает неравновесие, что способствует вазоконстрикции, адгезии, агрегации, коагуляции, атеросклерозу и атеротромбозу. Даже ментальный стресс приводит к измеримой эндотелиальной дисфункции, которая может продолжаться вплоть до 4 часов.
Эндотелиальные клетки принимают участие также в образовании новых кровеносных сосудов. Образование кровеносных сосудов имеет значение в случае множества процессов, например, при эмбриогенезе, репродуктивном цикле у женщин, заживлении ран, росте опухолей и неоваскуляризации ишемических областей. Первоначально постнатальное образование кровеносных сосудов, т.е. образование кровеносных сосудов после родов, сводится главным образом к ангиогенетическим процессам. Под ангиогенезом понимают образование новых кровеносных сосудов за счет появления капилляров из уже существующей сосудистой системы. При ангиогенезе прежде всего с помощью протеолитических ферментов разрушается окружающая кровеносные сосуды базальная мембрана и внеклеточная матрица фрагментируется в периваскулярном пространстве. Высвобождающиеся при этом ангиогенные стимулы вызывают миграцию уже имеющихся, образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток в направлении хемотактического раздражителя, причем они одновременно пролиферируют и перестраиваются. За счет наложения друг на друга эндотелиальных клеток затем образуются новые сосудистые петли с капиллярообразными просветами. После этого происходит синтез новой базальной мембраны.
Однако проведенные в недавнее время исследования показывают, что образование новых кровеносных сосудов во взрослом организме основано не только на ангиогенезе, но и также на васкулогенетических механизмах. Под васкулогенезом
понимают сосудистое новообразование из дифференцирующихся in situ эндотелиальных клеток-предшественников. Догма, что васкулогенез ограничен эмбриогенезом, опровергнута за счет обнаружения эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС) в периферической крови здоровых людей и животных. При использовании животных моделей подтверждено, что происходящие из костного мозга эндотелиальные клетки-предшественники активно участвуют в неоваскуляризации. Также показано, что в ишемических областях находится специфическая СБ34-положительная подгруппа лейкоцитов, которая экспрессирует специфичные к эндотелию антигены. Сверх того, из клеток CD133+ и CD34 + in vitro могут получаться эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС), которые вносят значительный вклад в образование кровеносных сосудов во взрослом организме (Asahara и др. , Science, 275, 964-967 (1997); Crosby и др., Circ. Res., 87, 728-730 (2000); Gehling и др., Blood, 95, 3106-3112 (2000)). Далее, показано, что инъекция выделенных клеток CD34+ или культивированных эндотелиальных клеток-предшественников
ускоряет восстановление кровотока у больных диабетом мышей (Schatteman и др., J. Clin. Invest., 106, 571-578 (2000)) и in vivo улучшает неоваскуляризацию (Asahara и др., Circ. Res., 85, 221-228 (1999); Crosby и др., Circ. Res., 87, 728-730 (2000); Murohara и др., J. Clin. Invest., 105, 1527-1536 (2000)). Сверх того, показано, что индуцируемая за счет клеток CD34+ неоваскуляризация улучшает функцию сердца (Kocher и др., Nat. Med., 7, 430-436 (2001) ) .
Лежащие в основе мобилизации и дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников механизмы, однако, еще полностью не выяснены. Биологические исследования в отношении молекул и клеток указывают на то, что различные цитокины и ангиогенные факторы роста стимулирующе воздействуют на мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников в костном мозге. Так, известно, что проангиогенные факторы, такие как VEGF и GM-CSF, могут повышать число эндотелиальных клеток-предшественников (Asahara и др., EMBO J. , 18_, 3964-3972 (1999); Takahashi и др., Nat. Med., 5, 434-438 (1999)). В случае VEGF
(васкулярный эндотелиальный фактор роста) речь идет о находящемся в различных изоформах протеине, связывающем оба рецептора тирозинкиназы VEGF-Rl (flt-1) и VEGF-R2 (flk-1), которые находятся, например, на поверхности растущих эндотелиальных клеток (Wernert и др., Angew. Chemie, 21, 34323435 (1999)). Активация рецепторов VEGF через путь Ras-Raf-MAP-киназа приводит к экспрессии протеиназ и специфических интегринов на поверхности эндотелиальных клеток, соответственно, эндотелиальных клеток-предшественников и, наконец, к инициации пролиферации и миграции этих клеток в направлении ангиогенного стимула. В случае GM-CSF (стимулирующий колонии гранулоцитов и макрофагов фактор) речь идет о цитокине, который до сих пор был известен прежде всего для стимуляции лейкоцитов, включая нейтрофилы, макрофагов и эозинофилов. О PIGF (плацентарный фактор роста) известно, что он стимулирует мобилизацию эндотелиальных клеток-предшественников, но не стимулирует их пролиферацию. Из исследований Llevadot и др. (J. Clin. Invest., 108, 399-405 (2001)) явствует, что ингибиторы HMG-CoA-редуктазы, в особенности статины, которые используют в качестве снижающих уровень липидов лекарственных средств и которые снижают заболеваемость и смертность в случае коронарной болезни, могут мобилизовывать эндотелиальные клетки-предшественники. Dimmler и др. (J. Clin. Invest., 108, 391-397 (2001)), далее, показали, что статины, такие как аторвастатин и симвастатин, in vitro и in vivo могут значительно улучшать дифференцировку эндотелиальных клеток-предшественников в мононуклеарные клетки и стволовые клетки CD34+, которые выделяются из периферической крови. Так, обработка мышей статинами приводит к повышенному количеству дифференцированных эндотелиальных клеток-предшественников, причем статины обладают таким же сильным действием, как VEGF.
Стимуляция мобилизации и/или дифференцировки
эндотелиальных клеток-предшественников представляет собой важную новую терапевтическую стратегию для повышения постнатальной неоваскуляризации, в особенности васкулогенеза, и
для лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.
В основу изобретения положена техническая проблема получения средств и разработки способов для повышенной стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников и лечения заболеваний, которые связаны в особенности с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.
Согласно настоящему изобретению эта техническая проблема решается за счет применения эритропоэтина и/или его производных для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении
ангиогенного или васкулогенного стимула в организме человека или животного. Согласно настоящему изобретению, эта техническая проблема также решается за счет применения эритропоэтина и/или его производных для лечения заболеваний или болезненных состояний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.
Согласно изобретению неожиданно установлено, что обработка эритропоэтином приводит к физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, причем повышается количество циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников и индуцируется их дифференцировка, в особенности при сравнительно низких дозах эр> итропоэтина. Сверх того, компенсируются возникающие в случае определенных патологических состояниий функциональные дефициты эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению показано, что у пациентов с хроническим заболеванием почек в конечной стадии число циркулирующих стволовых клеток точно такое же высокое, как у здоровых испытуемых, однако, у этих пациентов эти стволовые клетки потеряли способность к дифференцировке в эндотелиальные клетки из эндотелиальных клеток-
предшественников. Так, у пациентов с хроническим заболеванием
почек количество клеток, которые являются адгезивноспособными и относятся к эндотелиальному клеточному фенотипу, отчетливо уменьшено по сравнению со здоровыми испытуемыми. Согласно изобретению, в настоящее время установлено, что после обработки этих пациентов эритропоэтином количество циркулирующих стволовых клеток значительно возрастает на более, чем 50%. При этом в особенности резко повышается количество клеток, которые относятся к эндотелиальному фенотипу. Как обнаружено с помощью функционального теста в отношении клеточной культуры, ухудшенная у пациентов с хроническим заболеванием почек способность эндотелиальных клеток-предшественников к адгезии за счет обработки эритропоэтином повышается в три раза. Способность дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, соответственно, эндотелиальных клеток к адгезии представляет собой одну из основных предпосылок образования новых тканей и/или сосудов. Эритропоэтин, таким образом, может индуцировать неоваскуляризацию, в особенности васкулогенез, в тканях или органах, в которых высвобождаются соответствующие васкулогенные или ангиогенные стимулы.
Согласно изобретению эритропоэтин (в дальнейшем называемый ЕРО) можно использовать для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников,
пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников,
дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или для миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула в организме человека или животного, в особенности взрослого организма. Согласно изобретению эритропоэтин поэтому предпочтительно можно использовать для стимуляции
новообразования сосудов за счет васкулогенеза в тканях или органах, в которых имеются патологические изменения сосудов. На основании стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников за счет эритропоэтина, сверх того, можно также индуцировать образование эндотелиальной ткани. Согласно изобретению эритропоэтин поэтому можно также использовать для лечения заболеваний организма человека или животного, которые связаны с
дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток.
Согласно настоящему изобретению под термином "эритропоэтин", соответственно, "ЕРО" понимают вещество, которое регулирует рост, дифференцировку и созревание стволовых клеток через эритробласты в эритроциты. Эритропоэтин представляет собой гликопротеии, который включает 166 аминокислот, три сайта гликозилирования и имеет молекулярную массу примерно 34 000 Да. В рамках индуцируемой эритропоэтином дифференцировки эритроцитных клеток-предшественников
индуцируется синтез глобулина и усиливается синтез гемкомплекса, а также увеличивается число рецепторов ферритина. Благодаря этому клетка может поглощать больше железа и синтезировать функциональный гемоглобин. В зрелых эритроцитах гемоглобин связывает кислород. Таким образом, эритроциты, соответственно, содержащийся в них гемоглобин, выполняют ключевую роль в отношении снабжения организма кислородом. Эти процессы возбуждаются за счет взаимодействия эритропоэтина с соответствующим рецептором на поверхности эритроцитных клеток-предшественников (Graber и Krantz, Ann. Rev. Med., 2_9, 51-56 (1978) ) .
Эритропоэтин образуется главным образом в почках, однако, в меньших количествах также в печени и в головном мозге. В незначительных количествах эритропоэтин находится также в сыворотке и в физиологических условиях по меньшей мере частично выделяется в моче. У пациентов с почечной недостаточностью эритропоэтин (в дальнейшем называемый ЕРО) может образовываться только в недостаточной степени, и вследствие этого они страдают анемией. Известна компенсация недостаточного снабжения эритропоэтином за счет введения эритропоэтина. Дальнейшие клинические использования эритропоэтина заключаются в применении эритропоэтина при ятрогенной анемии после химиотерапии или лучевой терапии злокачественных заболеваний или вирусных инфекций (Европейский патент ЕР 0456153-В1). Из патента США № 4732889 известно использование содержащих эритропоэтин композиций для лечения ассоциированной с
ревматоидным артритом анемии. Из Международной заявки WO-88/03808 известно лечение гемохроматоза с помощью содержащих эритропоэтин композиций.
Используемое в данном контексте понятие "эритропоэтин" включает эритропоэтин любого происхождения, в особенности человеческий или животный эритропоэтин. Используемое в данном контексте понятие включает не только естественно встречающиеся, то есть дикого типа, формы эритропоэтина, но и также его производные, аналоги, модификации, мутеины, мутанты или прочие, если они обладают биологическими действиями эритропоэтина дикого типа.
Согласно настоящему изобретению под термином "производные" понимают функциональные эквиваленты или производные эритропоэтина, которые при сохранении основной структуры эритропоэтина получают путем замещения одного или нескольких атомов или молекулярных групп, соответственно, остатков, в особенности путем замещения сахаридных цепей, таких как этиленгликоль, и/или аминокислотные остатки которых отличаются от естественно встречающегося человеческого или животного эритропоэтина по меньшей мере одной позицией, которые, однако, по существу обладают высокой степенью гомологии в отношении аминокислот и сравнимой биологической активностью. Производные эритропоэтина, которые, например, можно использовать согласно настоящему изобретению, известны, в частности, из Международной заявки W0-94/25055, Европейского патента ЕР 0148605-В1 или Международной заявки WO-95/054 65.
Термин "гомология" означает в особенности идентичность последовательностей по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85% и особенно предпочтительно по меньшей мере более, чем на 90%, 95%, 97% и 99%. Известный специалисту термин "гомология", таким образом, характеризует степень родства между двумя или несколькими полипептидными молекулами, которая определяется соответствием между последовательностями. При этом соответствие может означать как идентичное соответствие, так и консервативную замену аминокислоты,
Согласно изобретению понятие "производное" включает также
слитые протеины, у которых в N-концевой части, соответственно, в С-концевой части имеются функциональные домены другого протеина. Согласно одному варианту осуществления изобретения в случае этого другого протеина речь может идти, например, о GM-CSF, VEGF, PIGF, статине или другом факторе, который обладает стимулирующим воздействием на эндотелиальные клетки-предшественники. Согласно другому варианту осуществления изобретения в случае другого протеина речь может идти также о факторе, который проявляет стимулирующее воздействие на образовавшиеся путем дифференцировки эндотелиальные клетки, например, об ангиогенине или bFGF (главный фактор роста фибробластов) . О bFGF известно, что этот фактор роста оказывает сильное митогенное и хемотактическое воздействие на эндотелиальные клетки.
Различия между производным эритропоэтина и нативным эритропоэтином могут возникать, например, за счет мутаций, таких как, например, делеции, замещения, инсерции, присоединения, обмены оснований и/или рекомбинации нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные
последовательности эритропоэтина. Разумеется, при этом речь может идти также о естественно встречающихся вариациях последовательностей, например, о последовательностях из другого организма или о последовательностях, которые мутируют естественным образом, или о мутациях, которые с помощью обычных, известных в данной области средств, например, химических агентов и/или физических агентов, целенаправленно вводятся в кодирующие эритропоэтин нуклеотидные
последовательности. Согласно изобретению понятие "производное" поэтому включает также мутированные молекулы эритропоэтина, следовательно, мутеины эритропоэтина.
Согласно изобретению можно использовать также пептидные или белковые аналоги эритропоэтина. В соответствии с настоящим изобретением понятие "аналоги" включает соединения, которые не обладают никакой аминокислотной последовательностью, идентичной аминокислотной последовательности эритропоэтина, однако, трехмерная структура которых очень похожа на таковую
эритропоэтина и которые поэтому обладают сравнимой биологической активностью. В случае аналогов эритропоэтина речь может идти, например, о соединениях, которые содержат ответственные за связывание эритропоэтина с его рецепторами аминокислотные остатки в пригодной конформации и которые поэтому могут имитировать основные поверхностные свойства места связывания эритропоэтина. Такого рода соединения описываются, например, Wrighton и др., Science, 273, 458 (1996).
Используемый согласно изобретению эритропоэтин можно получать различным образом, например, путем выделения из человеческой мочи или из мочи и плазмы (включая сыворотку) пациентов, страдающих апластической анемией (Miyake и др., J. В. С, 252, 5558 (1977)). Человеческий эритропоэтин, например, также можно получать из тканевых культур человеческих почечных раковых клеток (JA-OS 555790/1979), из человеческих лимфобластов, которые обладают способностью к образованию человеческого эритропоэтина (JA-OS 40411/1982), и из гибридомной культуры, получаемой за счет слияния клеток человеческих клеточных линий. Эритропоэтин также можно получать путем генно-инженерных способов, тем, что с помощью пригодной ДНК или РНК, которая кодирует соответствующую аминокислотную последовательность эритропоэтина, путем генной инженерии получают желательный протеин, например, в бактерии, дрожжах, растительной или животной клеточной линии. Такого рода способы описываются, например, в Европейских патентах ЕР 0148605-В2 или ЕР 0205564-В2, а также в ЕР 0411678-В1.
Настоящее изобретение в особенности относится к применению эритропоэтина (в дальнейшем называемого ЕРО) и/или его производных для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации
эндотелиальных клеток-предшественников, дифференцировки
эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или для миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула в организме человека или животного, в особенности во взрослом организме.
Согласно настоящему изобретению под выражением
"эндотелиальные клетки-предшественники" (эндотелиальные клетки-предшественники; ЕРС) понимают циркулирующие в системе кровообращения клетки, которые обладают способностью к дифференцировке в эндотелиальные клетки. В случае эндотелиальных клеток-предшественников, встречающихся во время эмбрионального развития, речь идет о ангиобластах. В случае эндотелиальных клеток-предшественников, встречающихся во взрослом организме, речь идет о подобных ангиобластам клетках, которые могут получаться из мононуклеарных клеток, в особенности моноцитов CD34~CD14+ и/или стволовых клеток CD34+, выделяемых из периферической крови.
Согласно настоящему изобретению под термином "мобилизация" или "физиологическая мобилизация" понимают процесс активации стволовых клеток и/или клеток-предшественников из костного мозга с помощью факторов роста, причем стволовые клетки и/или клетки-предшественники попадают в круг кровообращения, в особенности в периферическую кровь.
Согласно настоящему изобретению под термином "пролиферация" понимают способность клеток к увеличению и к последующему делению на две или более дочерних клеток. Опосредованная эритропоэтином стимуляция эндотелиальных клеток-предшественников, таким образом, касается в особенности количества и вместе с тем поведения при делении эндотелиальных клеток-предшественников.
Согласно настоящему изобретению под термином "дифференцировка" эндотелиальных клеток-предшественников понимают развитие происходящих из костного мозга мононуклеарных клеток через эндотелиальные клетки-предшественники в эндотелиальные клетки. Под термином "эндотелиальные клетки" понимают клетки, которые образуют эндотелий, то есть монослойную клеточную выстилку сосудов и серозных полостей. Эндотелиальные клетки отличаются тем, что они высвобождают активные в отношении сосудов вещества, например, сосудорасширяющие вещества, такие как EDRF (происходящий от эндотелия расслабляющий фактор), или сужающие вещества, такие как эндотелии, факторы подавления или активации свертывания
крови и факторы регуляции проницаемости сосудов. Эндотелиальные клетки также синтезируют компоненты субэндотелиальной соединительной ткани, в особенности коллагены типа IV и V, клеточно-адгезивные протеины, такие как ламинин, фибронектин и тромбоспондин, факторы роста, например, для гладкомышечных клеток, и факторы новообразования сосудов.
Согласно настоящему изобретению под термином "миграция" эндотелиальных клеток-предшестЕенников понимают, что
находящиеся в кровообращении эндотелиальные клетки-предшественники перемещаются в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула и концентрируются в области васкулогенного или ангиогенного стимула. Под термином "васкулогенный стимул" понимают химический раздражитель в ткани или кровеносном сосуде организма человека или животного, который специфически действует на эндотелиальные клетки-предшественники и вызывает их перемещению к месту в организме, из которого исходит химический раздражитель. За счет васкулогенного стимула, таким образом, индуцируется процесс васкулогенеза. Под термином "ангиогенный стимул" понимают химичский раздражитель в ткани или кровеносном сосуде организма человека или животного, который специфически действует на образовавшиеся путем дифференцировки эндотелиальные клетки и вызывает их миграцию к месту в организме, из которого исходит химический раздражитель. Ангиогенный стимул таким образом вызывает индуцирование ангиогенеза.
Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных для повышения адгезивной способности
дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению, эритропоэтин в особенности применяют для улучшения способности эндотелиальных клеток-предшественников к адгезии, то есть к адгезии клетка-клетка. Адгезия дифференциирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, соответственно, образовавшихся путем дифференцировки
эндотелиальных клеток представляет собой одну из основных предпосылок для образования новых сосудов или новой
эндотелиальной ткани. Клеточная адгезия опосредуется протеиновой молекулой.
Настоящее изобретение относится также к применению эритропоэтина для стимуляции новообразования сосудов, в особенности стимуляции васкулогенеза. Согласно настоящему изобретению под термином "васкулогенез" понимают
новообразование сосудов из дифференцирующихся in situ эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению за счет использования эритропоэтина, следовательно, достигают того, что эндотелиальные клетки-предшественники в усиленной мере принимают участие в новообразовании сосудов, соответственно, в локальном новообразовании сосудов для восстановления поврежденных областей сосудов. Согласно изобретению, следовательно, предусматривается, что применение эритропоэтина и/или его производных способствует образованию новых кровеносных сосудов и/или замене поврежденных областей сосудов за счет локального новообразования кровеносных сосудов.
Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников в целях образования эндотелиальной ткани.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных для лечения болезненных состояний или заболеваний организма человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, или заболеваний, являющихся следствием предыдущих заболеваний.
Согласно настоящему изобретению под терминами "заболевания", "болезненные состояния" или "болезни" понимают нарушения жизненных процессов в органах или во всем организме с последствием субъективно ощущаемых, соответственно, объективно устанавливаемых физических, психических или умственных изменений. Согласно изобретению, речь идет в особенности о заболеваниях, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, то есть заболеваний, которые либо являются следствием такого рода дисфункции этих клеток, либо
опосредуются этими клетками. Под выражением "заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний", понимают вторичные заболевания, то есть присоединяющееся к первичной картине болезни второе заболевание.
Согласно настоящему изобретению под термином "дисфункция" эндотелиальных клеток-предшественников понимают нарушение существенных функций клеток, таких как интенсивности обмена веществ, ответ на раздражение, моторика, поведение при делении или поведение при дифференцировке этих клеток. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может состоять, например, в том, что эти клетки не пролиферируют или пролиферируют только в недостаточной мере. Так как благодаря применению эритропоэтина стимулируется пролиферация
эндотелиальных клеток-предшественников, за счет этого может компенсироваться недостаточное поведение при делении как эндотелиальных клеток-предшественников, так и уже образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток и может повышаться количество эндотелиальных клеток-предшественников, соответственно, эндотелиальных клеток. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может заключаться, например, в нарушенной способности этих клеток к дифференцировке в эндотелиальные клетки. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может быть также обусловлена их нарушенной способностью к адгезии и/или их нарушенной способностью к миграции в направлении ангиогенного или васкулогенного стимула. Такие дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников могут приводить к тому, что, например, ухудшается или предотвращается новообразование эндотелиальной ткани и/или васкулогенез. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может быть также обусловлена патогенно, например, за счет гипертонии, гиперлипопротеинемии, уремии или диабета. Дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников может выражаться, например, в уменьшенном продуцировании N0 (= EDRF) за счет NO-синтаз (N0S) из L-аргинина, повышенном продуцировании эндотелина и/или в усиленном продуцировании адгезивных молекул, таких как ICAM-1 и VCAM-1.
Согласно изобретению в случае заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, речь идет в особенности о гиперхолестеринемии, сахарном диабете, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваниях, таких как васкулиты, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, коронарная болезнь сердца, ишемия миокарда, стенокардия, обусловленное возрастом сердечнососудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, вызванная беременностью гипертония, хроническая или острая почечная недостаточность, в особенности терминальная почечная недостаточность, сердечная недостаточность, заживление ран, а также заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний.
"Гиперхолистеринемия" характеризуется повышенными
концентрациями холестерина в крови. Гораздо более частой формой первичных гиперхолестеринемий является полигенная
гиперхолестеринемия. Вторичные гиперхолестеринемии часто возникают при сахарном диабете, нефротическом синдроме, гипотиреозе и заболеваниях печени.
Под понятием "сахарный диабет" объединяют различные формы нарушений метаболизма глюкозы с различной этиологией и симптоматикой. За возникновение сосудисто-обусловленных диабетических осложнений ответственна в особенности система AGE-RAGE. AGE (образованные из гликатиона конечные продукты) образуются за счет ряда сложных реакций после продолжительной выдержки протеинов или липидов с редуцирующими сахарами, например, с глюкозой. Образование AGE происходит во время нормального процесса старения, а также в повышенной мере при сахарном диабете и болезни Альцгеймера. За счет связывания AGE возникает окислительный стресс, активация фактора транскрипции NF-кВ и вместе с этим нарушение эндотелиального гомеостаза.
"Опосредованные эндотелием хронические воспалительные заболевания" представляют собой заболевания или состояния организма человека или животного, которые основываются на защитной реакции организма и е^го тканей по отношению к причиняющим вред раздражителям, причем определенные сигнальные
молекулы изменяют свойства эндотелиальных клеток, так что вкупе с активацией других клеточных типов лейкоциты прилипают к эндотелиальным клеткам, наконец, внедряются в ткань и там вызывают воспаление. Примером опосредованного эндотелием воспаления является лейкоцитарный васкулит. Центральную роль при активации опосредованного эндотелием воспалительного явления играет фактор транскрипции NF-кВ. Другой системой, которая приводит к возникновению опосредованных эндотелием хронических воспалений, является система AGE-RAGE.
Под термином "эндотелиоз" понимают дегенеративные и пролиферативные изменения эндотелия при простой пурпуре. Под термином "ретикулоэндотелиоз" понимают заболевания
ретикулогистиоцитарной системы, такие как ретикулум, ретикулез, ретикулогистиоцитоз и болезнь Хенда-Шюллера-Кресчета.
Под термином "ишемия миокарда" понимают анемию или недостаточный кровоток, следовательно, нарушение кровоснабжения мышечной стенки сердца вследствие недостаточного или отсутствующего артериального притока крови. В случае "инфаркта сердца" или "инфаркта миокарда" речь идет о некрозе описанного участка сердечной мышцы, который чаще всего появляется в качестве возникающего острого осложнения при хронической коронарной болезни сердца. В случае "коронарной болезни сердца" или "ишемической болезни сердца" речь идет о дегенеративном коронарном заболевании, которое, обусловленное сужением или закупоркой венечных сосудов сердца, приводит к уменьшенному кровоснабжению сердечной мышцы. Под термином "стенокардия" понимают активную коронарную недостаточность или стенокардию, которая может возникать за счет диспропорции предложения кислорода и потребности в кислороде при коронарной болезни сердца, коронарных спазмах, нарушениях кровотока, нарушениях сердечного ритма, гипертонии или гипотонии. Под термином "болезнь Рейно" понимают обусловленные вазоконстрикцией, то есть спазмами сосудов, возникающие приступообразно ишемические состояния чаще всего в артериях пальцев. Первичная болезнь Рейно представляет собой чисто функциональное нарушение маленьких кровоснабжающих сосудов конечностей, в то время как
основу вторичной болезни Рейно составляет другое заболевание, например, васкулит.
"Преэклампсия" представляет собой болезнь эндотелия и сосудов материнского организма и, по-видимому, является результатом воздействия эндотелиотропных веществ из плаценты. Преэклампсия представляет собой многосистемное заболевание, которое приводит к функциональным нарушениям многочисленных органов и может выражаться в разнообразных симптомах. Типичные для заболевания нарушения кровоснабжения являются следствием повышенного сопротивления сосудов, которое локально может проявляться различным образом. Цля преэклампсии считается гарантированным, что эндотелиальная дисфункция представляет собой центральный компонент патогенеза.
Под термином "почечная недостаточность" понимают, согласно настоящему изобретению, ограниченную способность почек к выделению обязательных для мочи веществ, причем на прогрессирующих стадиях происходит потеря также способности регуляции электролитного, водного и кислотно-основного баланса. Терминальная почечная недостаточность характеризуется совместным разрушением экскреторной и эндокринной почечной функции.
При почечной недостаточности речь может идти, согласно изобретению, о активной почечной недостаточности, которую называют также острая почечная недостаточность, шоковая почка или шоковая анурия. Острая почечная недостаточность характеризуется внезапной частичной или полной потерей экскреторной почечной функции как следствие чаще всего обратимого повреждения почек. Причиной могут быть недостаточная перфузия за счет гиповолемии, гипотонии и дегидратации вследствие кровопотерь (политравма, желудочно-кишечное или постпартальное кровотечение, большие операционные вмешательства в случае сердца, сосудов, брюшной полости или простаты), шок (инфаркт миокарда, эмболия), тяжелые инфекции (сепсис, перитонит, холецистит), гемолиз (гемолитически-уремический синдром, пароксизмальная гемоглобинурия, промежуточное падение трансфузии), миолиз (краш-синдром, рабдомиолиз, миозит, ожоги),
обезвоживания и потери электролитов (массивная рвота, диареи, чрезмерные потения, кишечная непроходимость, острый панкреатит). Другими причинами могут быть нефротоксины, такие как экзогенные токсины, например, анилин, гликолевые соединения, метанол и подобные, или эндогенные токсины, например, миоглобин и оксалаты. Дальнейшими причинами острой почечной недостаточности являются заболевания почек, такие как, например, воспалительные нефропатии или реакции отторжения после трансплантации почки. Острая почечная недостаточность может возникать также за счет задержки мочи вследствие затруднений мочевыделения. Предлагаемое согласно изобретению лечение острой почечной недостаточности с помощью эритропоэтина приводит, согласно изобретению, к предотвращению или по меньшей мере к уменьшению прогрессирования острой почечной недостаточности.
При почечной недостаточности, согласно изобретению, речь может идти также о хронической почечной недостаточности. Причинами хронической почечной недостаточности являются сосудистые, гломерулярные и тубулоинтерстициальные заболевания почек, инфекции, а также врожденные или приобретенные структурные дефекты. Причинами хронической почечной недостаточности являются, в частности, хроническая гломерулопатия, хронический пиелонефрит, нефропатия за счет анальгетиков, закупоривающая уропатия, а также артерио- и артериолосклероз. Хроническая почечная недостаточность в конечном счете переходит в уремию. Предлагаемое согласно изобретению лечение хронической почечной недостаточности с помощью эритропоэтина приводит, согласно изобретению, к уменьшению прогрессирования хронической почечной
недостаточности.
Согласно настоящему изобретению под термином "сердечная недостаточность" понимают картину болезни, которую также называют как недостаточность функционирования миокарда или слабость сердечной мышцы. Сердечная недостаточность характеризуется недостаточной функцией сердца, при которой сердце больше не в состоянии развивать соответствующую
требованиям мощность. Классификацию сердечной недостаточности можно осуществлять с различных точек зрения. Соответственно пораженной части сердца осуществляют, например, подразделение на правую сердечную недостаточность, левую сердечную недостаточность и недостаточность с обеих сторон (общая сердечная недостаточность). В зависимости от стабильности равновесия, на которое влияют физиологические и терапевтические механизмы, различают компенсированную и декомпенсированную сердечную недостаточность. Соответственно протеканию процесса осуществляют подразделение на острую и хроническую сердечную недостаточность. Причинами сердечной недостаточности являются, в частности, инфаркт сердца, кардиомиопатия, врожденный или приобретенный порок сердца, артериальная или легочная гипертония, нарушения сердечного ритма, коронарная болезнь сердца или миокардит.
Согласно настоящему изобретению под термином "заживление раны" понимают физиологические процессы для регенерации нарушенной ткани, соответственно, для закрытия раны, в особенности новообразование соединительной ткани и капилляров. При заживлении раны речь может идти о первичном заживлении раны (Sanatio per primam intenionem), которое характеризуется быстрым и без осложнений закрытием и дальнейшим Restitutio ad interum вследствие минимального новообразования соединительной ткани между с хорошим кровоснабжением и, в случае необходимости, адаптированными краями чистой раны. В случае ран с находящимися на расстоянии друг от друга, в особенности раздавленными или некротическими краями, соответственно, с раневыми инфекциями осуществляется замедленное вторичное заживление раны (Sanatio per secundam intenionem), при котором за счет (а)бактериального воспаления происходит восполнение дефекта ткани с помощью грануляционной ткани и расширенного образования рубцовой ткани. Эпителизация края завершает заживление раны. Заживление раны подразделяют на три фазы, а именно латентную фазу, фазу пролиферации и репаративную фазу. Латентную фазу снова подразделяют на экссудативную фазу с образованием струпа, в особенности в первые часы после
возникновения раны, и резорбтивную фазу с катабольным аутолизом, которая продолжается в течение периода времени от одного до трех дней после возникновения раны. Фаза пролиферации характеризуется анабольной репарацией с образованием коллагена за счет фибробластов и наступает на четвертый - седьмой день после возникновения раны. Начиная с восьмого дня после возникновения раны наступает репаративная фаза, которая характеризуется превращением грануляционной ткани в рубец.
Под термином "рана" согласно настоящему изобретению понимают нарушение связности тканей организма с потерей или без потери вещества, которое происходит за счет механического ранения или физически обусловленного повреждения клеток. Формами раны являются механические раны, термические раны, химические раны, обусловленные излучением раны и обусловленные болезнью раны. Механические раны образуются за счет внешнего насильственного воздействия и возникают прежде всего в виде резаных и колотых ран, ран от царапин и укушенных ран и огнестрельных ран. Термические раны возникают за счет воздействия нагрева или холода. Химические раны возникают в особенности за счет травления с помощью кислот или щелочей. Обусловленные излучением раны возникают, например, за счет воздействия актинического и ионизирующего излучения. Появляющиеся в результате болезни раны представляют собой в особенности обусловленные застоем раны, травматические раны, диабетические раны и т.д. Согласно изобретению в особенности предусматривается, что для заживления раны эритропоэтин предпочтительно применяют локально или внутривенно.
Настоящее изобретение относится поэтому к применению эритропоэтина для лечения гиперхолестеринемии, сахарного диабета, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваний, эндотелиоза, включая ретикулоэндотелиоз,
атеросклероза, коронарной болезни сердца, ишемии миокарда, стенокардии, обусловленных старением сердечно-сосудистых заоблеваний, ишемических заболеваний конечностей, преэклампсии, болезни Рейно, вызванной беременностью гипертонии, хронической или острой почечной недостаточности, в особенности терминальной
почечной недостаточности, сердечной недостаточности, заживления ран и заболеваний, являющихся следствием предыдущих заболеваний.
Согласно изобретению предусматривается, что эритропоэтин вводят пациенту в терапевтически эффективной дозе, которая является достаточной для лечения состояния вышеуказанного заболевания, в особенности заболевания, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, или для профилактики этого состояния, прекращения прогрессирования такого заболевания и/или облегчения симптомов такого заболевания. Вводимая пациенту доза зависит от множества факторов, например, от возраста, массы тела и пола пациента, тяжести заболеваний и т.д.
Особенно предпочтительно, согласно изобретению,
эритропоэтин в случае всех применений, способов и композиций, в соответствии с настоящим изобретением, используют в очень незначительных количествах, которые ниже используемых, как известно, количеств, причем в особенности вводят in vivo, то есть на пациента, дозы эритропоэтина от 200 единиц до 2000 единиц (Ед.; международные единицы) в неделю, предпочтительно дозы от 500 до 2000 Ед. в неделю, в зависимости от тяжести заболевания и в зависимости от функции почек. В случае предусматриваемых согласно изобретению доз от 200 единиц до 2000 единиц (Ед.) в неделю и на пациента, в особенности от 500 до 2000 Ед. в неделю и на пациента, речь идет о субполицитемических дозах, то есть дозах, которые не приводят к эритроцитозу со значениями гематокрита более, чем 50%. Предусматриваемые согласно изобретению субполицитемические дозы соответствуют еженедельным дозам примерно от 1 до 90 единиц (Ед.) ЕРО/кг массы тела, в особенности 1-45 Ед. ЕРО/кг массы тела, или сравнимой недельной дозе аранеспа 0,005-0,45 мкг/кг массы тела, в особенности 0,005-0,225 мкг/кг массы тела. В случае аранеспа речь идет о вдвое полиэтиленгликолированном эритропоэтине. Доза 200-2000 Ед. в неделю на пациента, в особенности 500-2000 Ед. в неделю и на пациента, которая предусматривается согласно изобретению для лечения заболеваний
или болезненных состояний, протекающих с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, является очень низкой по сравнению с обычно используемой для лечения ренальной анемии начальной дозой 50-150 Ед./кг массы тела в неделю (как правило, начинающейся с 4000-8000 Ед. в неделю, при неудовлетворительном результате лечения, однако, также значительно выше).
Особенно предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина и/или его производных в качестве биологически активного вещества для получения фармацевтической композиции или лекарственного средства в целях лечения болезненных состояний или заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников .
Согласно изобретению под термином "биологически активное вещество" понимают гомолочное или чужеродное вещество, которое при контакте с молекулами-мишенями или клетками-мишенями или тканями-мишенями влияет на специфические функции тканей, органов или организмов дифференцированным образом. Согласно изобретению также предусматривается, что эритропоэтин в качестве биологически активного вещества предлагаемой согласно изобретению фармацевтической композиции при контакте с эндотелиальными клетками-предшественниками влияет на их поведение в отношении пролиферации, дифференцировки и/или миграции в организме человека или животного таким образом, что компенсируются дисфункции эндотелиальных клеток-
предшественников и можно эффективно бороться, облегчать или устранять возникающие вследствие этих дисфункций заболевания, соответственно, можно эффективно предупреждать эти заболвания.
Согласно настоящему изобретению под выражением "фармацевтическая композиция" или "лекарственное средство" понимают смесь, используемую для диагностических,
терапевтических и/или профилактических целей, следовательно, способствующую или восстанавливающую здоровье организма человека или животного, которая включает по меньшей мере одно природное или синтетически полученное биологически активное вещество, которое оказывает терапевтическое действие.
Фармацевтическая композиция может быть как твердой, так и жидкой смесью. Например, фармацевтическая композиция, включающая биологически активное вещество, может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов. Сверх того, фармацевтическая композиция может включать обычно используемые в данной области добавки, например, стабилизаторы, средства для получения готовой формы, смазки, порофоры, эмульгаторы или другие, обычно используемые для получения фармацевтической композиции вещества.
Согласно изобретению в особенности предусматривается применение эритропоэтина и/или его производного в качестве биологически активного вещества для получения лекарственного средства в целях лечения гиперхолестеринемии, сахарного диабета, опосредованных эндотелием хронических воспалительных заболеваний, таких как васкулиты, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, коронарная болезнь сердца, ишемия миокарда, стенокардия, обусловленное старением сердечнососудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, вызываемая беременностью гипертония, острая или хроническая почечная недостаточность, в особенности терминальная почечная недостаточность, сердечная недостаточность, заживление раны, а также заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний.
Предлагаемая согласно изобретению фармацевтическая композиция может быть пригодна как для локального, так и для системного введения.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что фармацевтическая композиция применяется для парентерального, в особенности внутривенного, внутримышечного, интрадермального или подкожного введения. Содержащее эритропоэтин лекарственное средство предпочтительно имеет форму инъекции или инфузии.
Согласно следующему применению предусматривается, что содержащая эритропоэтин фармацевтическая композиция вводится перорально. Например, содержащее эритропоэтин лекарственное средство вводят в жидкой форме применения, такой как раствор,
суспензия или эмульсия, или твердой форме применения, такой как таблетка.
Согласно следующему применению предусматривается, что фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения или для ингаляции. Согласно изобретению, следовательно, предусматривается, что эритропоэтин терапевтически эффективным образом вводится прямо в легкие пациента. Эта форма введения эритропоэтина позволяет быстро вводить дозу эритропоэтина пациенту без необходимости осуществления инъекции. При поступлении эритропоэтина через легкие в кровообращение могут вводиться значительные количества эритропоэтина через легкие, что приводит к повышенным количествам эритропоэтина в системе кровообращения. Согласно предпочтительному варианту
осуществления изобретения в случае вводимой через легкие фармацевтической композиции речь идет о водном или неводном растворе или о сухом порошке. При нахождении вводимого через легкие, содержащего эритропоэтин лекарственного средства в форме сухого порошка оно включает предпочтительно содержащие эритропоэтин частицы, причем частицы имеют диаметр меньше, чем 10 мкм, так что лекарственное средство может достигать также дистальных областей легких пациента. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения
предусматривается, что вводимое через легкие лекарственное средство находится в форме аэрозоля.
Особенно предпочтительный вариант осуществления
изобретения относится к применению эритропоэтина для получения фармацевтической композиции в целях лечения заболеваний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, причем фармацевтическая композиция, наряду с эритропоэтином в качестве биологически активного вещества, содержит по меньшей мере одно другое дополнительное биологически активное вещество для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников.
В случае другого биологически активного вещества речь идет предпочтительно о биологически активном веществе, которое в особенности стимулирует физиологическую мобилизацию
эндотелиальных клеток-предшественников из костного мозга.
Согласно изобретению в случае другого биологически активного вещества, однако, речь также может идти о биологически активном веществе, которое в особенности стимулирует поведение в отношении деления, следовательно, пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников. Согласно изобретению, однако, существует также возможность того, что другое биологически активное вещество стимулирует в особенности поведение в отношении дифференцировки и/или поведение в отношении миграции эндотелиальных клеток-предшественников. В случае другого стимулирующего эндотелиальные клетки-предшественники
биологически активного вещества особенно предпочтительно речь идет о VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибиторе HMG-CoA-редуктазы, в особенности о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, и/или о доноре N0, в особенности о L-аргинине.
Согласно изобретению также предусматривается, что по меньшей мере одно другое биологически активное вещество стимулирует в особенности образовавшиеся путем дифференцировки эндотелиальные клетки, то есть их пролиферацию и/или миграцию, но не эндотелиальные клетки-предшественники. При этом особенно предпочтительно речь идет о bFGF (основной фактор роста фибробластов) или ангиогенине.
Следующий вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина и/или е;го производных в качестве биологически активного вещества для получения фармацевтической композиции для стимуляции эндотелиальных клеток-
предшественников, в особенности в целях стимуляции мобилизации, пролиферации, дифференцировки в эндотелиальные клетки и/или для миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула. Согласно изобретению, далее, предусматривается применение эритропоэтина и/или его производных в качестве биологически активного вещества для получения фармацевтической композиции в целях стимуляции васкулогенеза и/или образования эндотелия, в особенности в организме взрослого человека или животного.
Настоящее изобретение таким образом относится также к фармацевтическим композициям для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, в особенности для стимуляции их
мобилизации, пролиферации, дифференцировки в эндотелиальные клетки и/или миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула, для стимуляции васкулогенеза и/или образования эндотелия и для лечения заболеваний организма человека или животного, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток. Настоящее изобретение в особенности относится к фармацевтическим композициям или лекарственным средствам, которые включают эритропоэтин в качестве биологически активного вещества и по меньшей мере одно другое билогически активное вещество для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников и/или образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые включают эритропоэтин и по меньшей мере одно другое биологически активное вещество, выбираемое из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы, в особенности статина, такого как симвастатин, мевастатин или аторвастатин, донора N0, в особенности L-аргинина, bFGF и ангиогенина.
Следующий предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения трансплантируемого препарата эндотелиальных клеток. Согласно изобретению, при этом в особенности предусматривается, что эндотелиальные клетки получают in vitro путем культивирования эндотелитальных клеток-предшестзенников в присутствии эритропоэтина и затем трансплантируют в организм реципиента, в особенности в организм, страдающий заболеванием, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников. Например, мононуклеарные клетки (MNC) можно выделять из крови посредством центрифугирования в градиенте плотности и культивировать in vitro в пригодных культуральных средах. Способы выделения и культивирования in vitro мононуклеарных клеток описываются, например, Asahara, Science, 275, 964-967 (1997); Dimmeler и др., J. Clin. Invest., 108, 391-397 (2001); и Llevadot и др., J. Clin. Invest., 108, 399-405 (2001). Затем
мононуклеарные клетки культивируют дальше в присутствии эритропоэтина, чтобы стимулировать содержащиеся в
мононуклеарных клетках эндотелиальные клетки-предшественники относительно их поведения в отношении пролиферации и дифференцировки и в особенности повышать количество дифференцированных адгезивных эндотелиальных клеток. Согласно изобретению также предусматривается, что культивирование мононуклеарных клеток осуществляют в присутствии эритропоэтина и по меньшей мере одного другого вещества, которое стимулирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных клеток-предшественников. В качестве другого вещества особенно предпочтительно используют VEGF, PIGF, GM-CSF, донор N0, такой как L-аргинин, или ингибитор HMG-CoA-редуктазы, такой как статин, в особенности симвастатин, мевастатин или аторвастатин.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается применение эритропоэтина для предварительной обработки и/или дальнейшей обработки трансплантируемых тканей или органов. При этом трансплантаты обрабатывают эритропоэтином перед трансплантацией,
предпочтительно непосредственно перед ней, еще в организме донора. Организм реципиента также можно обрабатывать эритропоэтином в момент трансплантации. За счет этой обработки эритропоэтином трансплантируемых органов или тканей, как непосредственно перед, так и после трансплантации, согласно изобретению достигают того, что в трансплантате после осуществленной трансплантации в организм на основании индуцированного васкулогенеза быстро образуются новые кровеносные сосуды и эти вновь образовавшиеся кровеносные сосуды быстро связываются с кровеносной системой организма реципиента. Таким образом, также быстро достигается образование эндотелия. Обработка трансплантатов органов или тканей с помощью эритропоэтина вызывает, таким образом, более быстрое врастание этих систем в организм, благодаря чему значительно уменьшается риск отторжения.
Согласно следующему варианту осуществления изобретения предусматривается, что трансплантаты органов или тканей перед
трансплантацией обрабатывают эритропоэтином в сочетании по меньшей мере с одним другим фактором, который стимулирует эндотелиальные клетки-предшественники. В случае этого фактора предпочтительно речь идет о веществе, выбираемом из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы, такого как, например, статин, в особенности симвастатин, мевастатин или аторвастатин, или донора N0, в особенности L-аргинина. Согласно следующему варианту осуществления предусматривается, что трансплантаты органов или тканей перед трансплантацией обрабатывают, наряду с эритропоэтином, с помощью другого вещества, которое стимулирует пролиферацию и миграцию образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток. В случае этого вещества особенно предпочтительно речь идет о ангиогенине или bFGF. Согласно следующему варианту осуществления предусматривается, что предварительную обработку трансплантатов органов или тканей эритропоэтином осуществляют при использовании выделенных и, в случае необходимости, культивированных in vitro эндотелиальных клеток-
предшественников .
Согласно другому, особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предусматривается, что эритропоэтин применяют для приготовления имплантируемых или
трансплантируемых, содержащих клетки, in vitro-органов или -тканей. Согласно изобретению, в особенности предусматривается, что полученный in vitro орган или ткань перед трансплантацией или имплантацией обрабатывают in vitro эритропоэтином, чтобы стимулировать находящиеся в организме реципиента эндотелиальные клетки-предшественники, в особенности их физиологическую мобилизацию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку. Предпочтительно, организм реципиента после трансплантации, соответственно, имплантации in vitro-органа или -ткани обрабатывают дальше эритропоэтином в предлагаемых согласно изобретению дозах. За счет обработки in vitro-органа или -ткани перед трансплантацией, соответственно, имплантацией с помощью эритропоэтина и, в случае необходимости, дополнительной обработки организма реципиента с помощью эритропоэтина согласно
изобретению достигают того, что в системе in vitro-органа или -ткани после осуществленной трансплантации или имплантации в организм на основании индуцированного васкулогенеза быстро образуются новые кровеносные сосуды и эти вновь образовавшиеся кровеносные сосуды быстро связываются с кровеносной системой организма реципиента. Таким образом, также быстро достигается образование эндотелия и тем самым реэндотелиализация. Обработка систем in vitго-органов или -тканей с помощью эритропоэтина, таким образом, вызывает более быстрое врастание этих систем в организм, благодаря чему значительно уменьшается риск отторжения, и служит для защиты трансплантата.
Под выражением "система in vitro-органа или -ткани" понимают трансплантируемую или имплантируемую, содержащую клетки ткань или орган, которую (который) получают in vitro при применении определенных клеток и/или определенной ткани и в определенных условиях культивирования. Под "имплантируемой системой in vitro-органа или -ткани" понимают систему, которая наряду с клетками включает чужеродные вещества. Под "трансплантируемой системой in vitro-органа или -ткани" понимают в особенности содержащую клетки систему, которая наряду с клетками содержит гомологичные тканям или органам одного и того же или другого индивидуума вещества. In vitro-органы или -ткани отличаются в особенности тем, что в отношении их строения они в значительной степени соответствуют заменяемым нативным органам или тканям и, таким образом, in vivo могут брать на себя функцию замененных нативных органов или тканей.
Согласно предлагаемому в изобретении варианту осуществления предусматривается, что системы in vitго-органов или -тканей перед трансплантацией, соответственно, имплантацией обрабатывают эритропоэтином в сочетании по меньшей мере с одним другим фактором, стимулирующим эндотелиальные клетки-предшественники. В случае этого фактора предпочтительно речь идет о вещетве, выбираемом из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы, в особенности симвастатина, мевастатина или аторвастатина, и донора N0. Согласно следующему варианту осуществления предусматривается,
что системы in vitro-органов или -тканей перед трансплантацией, соответственно, имплантацией обрабатывают, наряду с эритропоэтином, с помощью другого вещества, которое стимулирует пролиферацию и миграцию образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток. В случае этого вещества особенно предпочтительно речь идет о ангиогенине или bFGF. Согласно другому варианту осуществления, предусматривается, что системы in vitro-органов или -тканей дополнительно содержат выделенные и, в случае необходимости, in vitro культивированные эндотелиальные клетки-предшественники.
Дальнейший предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению эритропоэтина для получения протезов сосудов или сердечных клапанов, причем протезы сосудов или сердечные клапаны перед введением в организм, в особенности организм человека, покрывают эритропоэтином. За счет покрытия протезов сосудов или сердечных клапанов эритропоэтином достигают того, что в организме реципиента стимулируются эндотелиальные клетки-предшественники, причем стимулируются в особенности их мобилизация из костного мозга, их пролиферация, их дифференцировка в эндотелиальные клетки и их миграция к используемым протезам сосудов или сердечным клапанам. После введения таким образом полученного протеза сосуда или сердечного клапана в организм его можно обрабатывать далее с помощью эритропоэтина, в особенности в предлагаемых согласно изобретению дозах. Обусловленное: этим быстрее происходит образование эндотелиальных слоев на используемых протезах сосудов и более быстрое врастание в пораженные области организма. Согласно предпочтительному варианту осуществления предусматривается, что для покрытия протезов сосудов и сердечных клапанов дополнительно используют выделенные и, в случае необходимости, культивированные in vitro эндотелиальные клетки-предшественники.
Настоящее изобретение относится также к способу стимуляции образования эндотелиальных клеток in vitro, включающему:
а) выделение содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток из крови посредством
центрифугирования в градиенте плотности;
b) культивирование выделенных, содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в среде для культивирования клеток; и
c) культивирование популяций клеток в присутствии эритропоэтина.
Согласно изобретению культивирование популяций клеток можно осуществлять в присутствии другого вещества, которое стимулирует эндотелиальные клетки-предшественники.
Настоящее изобретение относится, далее, к способу лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, путем введения эритропоэтина в дозе от 200 до 2000 Ед. в неделю, в особенности в дозе от 500 до 2000 Ед. в неделю, пациенту с таким заболеванием. Предлагаемый согласно изобретению способ в особенности пригоден для лечения заболеваний человеческого организма, таких как
гиперхолестеринемия, сахарный диабет, опосредованные эндотелием хронические воспалительные заболевания, такие как васкулиты, эндотелиоз, включая ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, коронарная болезнь сердца, ишемия миокарда, стенокардия, обусловленное возрастом сердечно-сосудистое заболевание, ишемические заболевания конечностей, болезнь Рейно, преэклампсия, вызванная беременностью гипертония, острая или хроническая почечная недостаточность, в особенности терминальная почечная недостаточность, сердечная
недостаточность, заживление ран, а также заболевания, являющиеся следствием предыдущих заболеваний.
Согласно предпочтительному варианту осуществления предлагаемого в изобретении способа лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, предусматривается, что пациенту, наряду с эритропоэтином, вводят по меньшей мере одно другое биологически активное вещество, выбираемое из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы и донора N0. В случае вводимого ингибитора HMG-CoA-редуктазы речь идет предпочтительно о статине, таком как симвастатин, мевастатин
или аторвастатин. В случае вводимого донора N0 речь идет предпочтительно о L-аргинине.
Согласно следующему предпочтительному варианту
осуществления предлагаемого в изобретении способа лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, предусматривается выделение
энотелиальных клеток-предшественников из крови организма человека, культивирование in vitro при применении эритропоэтина и дифференцировка в эндотелиальные клетки и, после очистки и выделения образовавшихся за счет дифференцировки эндотелиальных клеток, соответственно, дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, затем их целенаправленное
трансплантирование в область организма, ткань или орган пациента, которая (который) повреждена (поврежден) по причине дисфункции эндотелиальных клеток-предшественников и/или эндотелиальных клеток, чтобы индуцировать там локальное новообразование эндотелдия. Таким образом, возможно более целенаправленное и более быстрое лечение поврежденых областей организма, тканей и/или органов пациента. Этот вариант осуществления предлагаемого в изобретении способа лечения заболеваний, которые связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, включает следующие стадии:
a) выделение содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток из крови посредством центрифугирования в градиенте плотности;
b) культивирование содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в среде для культивирования клеток;
c) культивирование содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в присутствии эритропоэтина для стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников и/или их дифференцировки в эндотелиальные клетки;
d) выделение и очистка образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток; и
e) трансплантация образовавшихся путем дифференцировки
эндотелиальных клеток в организм с заболеванием, которое связано с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.
После трансплантации образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток в организм, его можно обрабатывать далее эритропоэтином, в особенности в предлагаемых согласно изобретению дозах от 200 до 2000 Ед. в неделю.
Согласно изобретению содержащие эндотелиальные клетки-предшественники популяции клеток культивируют in vitro в присутствии по меньшей мере одного другого биологически активного вещества, выбираемого из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы и донора N0. В случае используемого для культивирования ингибитора HMG-CoA-редуктазы речь идет предпочтительно о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.
Дальнейший предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения заболеваний сосудов, включающему:
a) выделение содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток из крови посредством центрифугирования в градиенте плотности;
b) культивирование содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в среде для культивирования клеток;
c) культивирование содержащих эндотелиальные клетки-предшественники популяций клеток в присутствии эритропоэтина для стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток-предшественников и/или их дифференцировки в эндотелиальные клетки;
d) выделение и очистка образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток; и
e) трансплантацию эндотелиальных клеток в организм с заболеванием сосудов.
После трансплантации эндотелиальных клеток в организм с заболеванием сосудов его можно обрабатывать далее с помощью эритропоэтина, предпочтительно в предлагаемых согласно изобретению дозах от 200 Ед. в неделю до 2000 Ед. в неделю.
Согласно изобретению существует возможность
культивирования содержащих эндотелиальные клетки-
предшественники популяций клеток в присутствии по меньшей мере одного другого биологически активного вещества, выбираемого из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF и/или ингибитора HMG-CoA-редуктазы. В случае применяемого для культивирования ингибитора HMG-CoA-редуктазы речь идет предпочтительно о статине, таком как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.
Согласно предлагаемому в изобретении способу лечения заболеваний сосудов, следовательно, предусматривается выделение эндотелиальных клеток-предшественников из крови человеческого организма, культивирование in vitro при применении эритропоэтина и дифференцировка в эндотелиальные клетки и, после очистки и выделения образовавшихся путем дифференцировки эндотелиальных клеток, соответственно, дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников, их трансплантация целенаправленно в поврежденный кровеносный сосуд или ишемическую область, чтобы там индуцировать локальную неоваскуляризацию. Таким образом, возможна более
целенаправленная и более быстрая терапия поврежденных кровеносных сосудов или ишемической ткани. Предлагаемый согласно изобретению способ лечения заболеваний сосудов в особенности пригоден для лечения таких заболеваний сосудов, как ишемия, в особенности церебральная ишемия, ишемические заболевания конечностей, ишемия миокарда, инфаркт сердца, инсульт, коронарная болезнь сердца, стенокардия, острая обтурация артерии, артериальное облитерирующее заболевание, болезнь Рейно и эрготизм.
Дальнейшие предпочтительные варианты осуществления изобретения следуют из зависимых пунктов формулы изобретения.
Изобретение поясняется подробнее с помощью нижеследующих фигур и примеров.
На фиг.1 представлены результаты анализа при использовании клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS) циркулирующих стволовых клеток CD34+ (cSC): (A-D): пробы пациентов; (E-F): изотипические контроли. Стволовые клетки
CD34+ идентифицируют с помощью дополнительной экспрессии маркера CD34 (В и F), с помощью характерной от незначительной до средней экспрессии антигена CD45 (С и G) и с помощью характерных свойств в отношении светорассеяния (D и Н) . Абсолютное количество cSC рассчитывают на 100000 моно- и лимфоцитов.
На фиг.2 представлено количественное определение циркулирующих стволовых клеток с помощью проточной цитометрии. На фигуре показано зависящее от времени действие обработки эритропоэтином при применении человеческого рекомбинантного эритропоэтина (rhEPO) спустя 0, 2, 4, 6 и 8 недель, п = 11, значения соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. Медиана представлена в виде линии.
*: р < 0,01 по сравнению с 2 неделями; ?.?.р < 0,05 по сравнению с 4 неделями; #: р < 0,05 по сравнению с 8 неделями.
На фиг.З представлено количественное определение культивированных эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС). На фигуре показано, что обработка с помощью rhEPO повышает относительное количество эндотелиальных клеток-
предшественников . Эндотелиальные клетки-предшественники
выделяют перед обработкой ренальных пациентов с помощью rhEPO, а также спустя 2, 4, б и 8 недель после обработки пациентов с помощью rhEPO и характеризуют с помощью их адгезивной способности и обоих маркеров acLDL-Dil и UEA-1 FITC. п = 11, значения соответствуют средним значениям ± стандартное отклонение. Медиана представлена в виде линии.
*: р < 0,01 по отношению к периоду времени перед обработкой; #: р < 0,001 по отношению к периоду времени перед обработкой.
На фиг.4 представлено количественное определение культивированных эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС). На фигуре показано, что абсолютное количество ЕРС до использования терапии с помощью rhEPO значительно уменьшено по сравнению со здоровыми испытуемыми, подобранными по возрасту и полу. Пациенты с ренальной анемией, следовательно, проявляют отчетливую дисфункцию ЕРС по сравнению со служащими в качестве
контроля людьми. Спустя 8 недель после начала терапии с помощью rhEPO в отношении ренальной анемии это уменьшенное число функциональных ЕРС компенсируется. EPCs выделяют до терапии ренальных пациентов с помощью rhEPO, а также спустя 2, 4, 6 и 8 недель после терапии пациентов с помощью rhEPO и характеризуют с помощью их адгезивной способности и обоих маркеров acLDL-Dil и UEA-1 FITC. п = 11. Представлен примерно ход процесса в течение 8 недель и все контроли. Абсолютные значения представлены, с одной стороны, в виде отдельных значений. Дополнительно представлены гистограммы (90-тый/75-тый/50-тый/25-тый и 10-тый процентиль, а также среднее значение). В качестве здорового контроля служат подобранные по возрасту и полу испытуемые, у которых аналогичным образом выделяют и характеризуют EPCs (п = 11) .
На фиг.5 представлено воздействие эритропоэтина на заживление раны. На фигуре показано, что при обработке стандартизированной кожной раны, которую наносят мышам посредством тканевого перфоратора, с помощью эритропоэтина рана полностью закрывается уже спустя от семи до восьми дней, в то время как при обработке раны с помощью физиологического раствора хлорида натрия (солевой раствор) рана полностью закрывается только спустя от тринадцати до четырнадцати дней. Обработку эритропоэтином, соответственно, физиологическим раствором хлорида натрия начинают за 7 дней до нанесения раны. Рекомбинантный человеческий эритропоэтин вводят однократно еженедельно (группа п = 5) путем подкожной инъекции (0,1 мкг/кг аранеспа).
На фиг.6 показано, что эритропоэтин уменьшает потерю почечной функции после острой почечной недостаточности. Для исследования использовали крыс Sprague Dawley (массой 200300 г) . Крыс наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг) и ромпуна (10 мг/кг). Одна из подопытных групп получала 0,1 мкг/кг массы тела аранесп один раз в сутки до индукции острой почечной недостаточности. В качесте сравнения служила группа подопытных животных, которым, соответственно, вводили путем подкожной инъекции в то же самое время раствор хлорида
натрия. Посредством закрепления артериального зажима на правой почечной артерии прерывали кровоток в почке на 4 5 минут. В это время с левой стороны осуществляли нефрэктомию. Псевдооперацию осуществляли в случае другой, контрольной группы. При этом вскрывали брюшную полость, препарировали левую почечную артерию, но кровоснабжение не прерывали и отнимали контралатеральную правую почку. Всех животных наркотизировали на 60 минут и спустя 24 часа после операции умерщвляли. Ишемия в течение 45 минут с последующей реперфузией оставшейся правой почки в случае обработанных хлоридом натрия животных приводила к очень большой потере почечной функции. Это отражается на содержании креатинина в сыворотке, которое спустя 24 часа после ишемии-реперфузии в 7 раз больше, чем значение до ишемии-реперфузии (р < 0,05). В противоположность этому, у обработанных аналогом эритропоэтина аранеспом животных обнаружили только четырехкратное увеличение содержания креатинина в сыворотке спустя сутки после индукции повреждения за счет ишемии-реперфузии. У левосторонне нефрэктомированных животных с псевдооперированной правой почкой не произошло никакого увеличения значений ретенции. На фигуре представлена концентрация креатинина в сыворотке обработанных эритропоэтином (ЕРО) животных (IR + ЕРО), обработанных с помощью NaCl животных (IR) и псевдооперированных животных (Schein-OP) до повреждения за счет ишемии-реперфузии (IR) и спустя 24 часа после этого. Из фигуры следует, что концентрация креатинина в сыворотке в случае обработанных аранеспом животных спустя 24 часа после повреждения за счет ишемии-реперфузии составляет почти половину по отношению к контролю без обработки с помощью ЕРО (обработка с помощью NaCl).
На фиг.7 представлены кривые выживаемости по Каплану-Майеру двух испытуемых групп после индукции хронической почечной недостаточности, которых обрабатывали либо с помощью аранеспа, либо с помощью NaCl. Для исследования использовали крыс Sprague Dawley в возрасте 8 недель. Крыс наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг) и ромпуна (10 мг/кг) . В день 0 у них отнимали правую почку, которую тотчас после отнятия
фиксировали в формалине для гистологического исследования. В случае левой почки лигировали сегментарные артерии, которые снабжают верхний и нижний полюс почки. Благодаря этому вызывают инфаркт соответствующих областей почки и функциональной сохраняется только средняя треть почки. Крысы получали один раз в неделю аранесп (0,1 мкг/кг массы тела) или NaCl путем подкожной инъекции. Обработанные с помощью аналога эритропоэтина аранеспа животные проявляют значительное преимущество в отношении выживаемости по сравнению с обработанными с помощью хлорида натрия животными (р = 0,027; Log Rank-тест).
На фиг.8-15 показаны наблюдаемые под микроскопом срезы почки спустя 6 недель после индукции хронической почечной недостаточности в случае двух испытуемых групп, которых обрабатывали либо с помощью аранеспа, либо с помощью NaCl, и относящиеся к ним кривые выживаемости по Каплан-Майеру представлены на фиг.7.
На фиг.8 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью NaCl, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлена средней величины прегломерулярная артерия с характерной типа луковой шелухи пролиферацией стенки сосуда при тяжелом гипертензивном повреждении, так называемом злокачественном нефросклерозе с переходом в эндартериит.
На фиг.9 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью NaCl, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые
снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен флоридный фокально-сегментальный гломерулосклероз в качестве так называемого пролиферативного FSGS (клубочек справа). Другой клубочек (слева) показывает ишемический коллапс лигатурной конволюты. В нижней части представлнной картины можно видеть маленький сосуд с тяжелыми повреждениями эндотелия. Наблюдаемые гистологические изменения соответствуют гипертензивным повреждениям органа, соответственно, изменениям в рамках перегрузочной нефропатии после 5/6 нефрэктомии.
На фиг.10 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью NaCl, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен почти полный склероз, соответственно, деструкция компенсирующе увеличенного клубочка с выраженным гиалинозом, соответственно, фибриноидным некрозом относящейся к этому афферентной артериолы.
На фиг.11 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью NaCl, начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре показана маленькая прегломерулярная артерия с характерной, в виде луковой шелухи, пролиферацией стенки сосуда и некрозом стенки при тяжелом гипертензивном повреждении, так называемым злокачественным нефросклерозом (сравнимое изображение справа). Слева можно видеть подлинную, (еще) неповрежденную артериолу.
На фиг.12 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после,
соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом. В тубулоинтерстиции нельзя констатировать никакой патологии.
На фиг.13 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени б недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом (630-кратное увеличение). В тубулоинтерстиции нельзя констатировать никакой патологии.
На фиг.14 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени б недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом. В тубулоинтерстиции нельзя констатировать никакой патологии.
На фиг.15 представлены гистологические изменения у крысы Spraque-Dawley с хронической почечной недостаточностью после, соответственно, однократной еженедельной обработки с помощью аранеспа (эритропоэтина) (0,1 мкг/кг аранеспа), начинающейся
непосредственно после индукции хронической почечной недостаточности, в течение периода времени 6 недель. Хроническая почечная недостаточность возникает за счет отнятия правой почки и лигирования сегментарных артерий, которые снабжают верхний и нижний полюс почки, левой почки. На фигуре представлен подлинный клубочек с тонким афферентным сосудом (630-кратное увеличение). В тубулоинтерстиции нельзя костатировать никакой патологии. Пример 1
Действие эритропоэтина в случае пациентов с ренальной анемией
Исследовали действие эритропоэтина в случае пациентов с ренальной анемией (НЬ < 10,5 г/дл) как следствие болезни почек в конечной стадии (претерминальная почечная недостаточность; клиренс креатинина < 35 мл/мин.). 11 пациентов в течение периода времени по меньшей мере 8 недель обрабатывали эритропоэтином в еженедельных дозах в среднем 5000 Ед. rhEPO (рекомбинантный человеческий эритропоэтин) внутривенно, соответственно, подкожно. После обработки эритропоэтином исследовали в течение 20 недель эндотелиальные клетки-предшественники в крови пациентов, причем спустя 0, 2, 4, 6 и 8 недель эндотелиальные клетки-предшественники анализировали относительно их количества, а также их дифференцировочного статуса, посредством проточной цитометрии и теста на культивирование.
В случае циркулирующих периферических стволовых клеток крови (CPBSC) речь идет о маленькой популяции клеток, которые экспрессируют как антиген CD34, так и антиген CD45. На основе рекомендаций ISHAGE разработан тест для определения количества CPBSC посредством проточной цитометрии (Sutherland и др., J. Hematother., 5_, 213-226 (1996)). При использовании этого теста определяли как этот образец экспрессии клеток CD34 и CD45, так и морфологию стволовых клеток. Таким образом определяли как абсолютное количество CPBSC на мкл, так и процентную долю CPBSC в общем количестве лейкоцитов.
На фиг.1 представлены результаты анализа при использовании
клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ) циркулирующих стволовых клеток CD34+ на основе рекомендаций ISHAGE.
На фиг.2 показано количество определенных посредством FACS-анализа стволовых клеток CD34" в течение периода времени 8 недель.
Тест в отношеии клеточной культуры
Мононуклеарные периферические клетки крови (РВМС) выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности в фиколле из человеческих проб крови по способу, описанному Asahara, Science, 275, 964-967 (1997). Клетки помещали на культуральные планшеты с фибронектином и сохраняли в базальной среде ЕС. Назальная среда ЕС состоит из квот базальной среды ЕВМ-2 (фирма Clonetics) и EGM-2 (hEGF; GA-1000 (гентамицин, амфотерицин-В) FBS, VEGF, hFGF-B (w/гепарин), R3-IGF-1, аскорбиновая кислота, гепарин). После культивирования в течение 4 дней неадгезивные клетки удаляли путем промывки планшетов. Остающиеся адгезивные клетки обрабатывали трипсином и снова высевали. Затем их культивировали в течение следующих трех дней. Клетки с эндотелиальным фенотипом в день 7 после выделения идентифицировали путем положительного окрашивания относительно двух различных эндотелиальных маркеров. При этом речь идет о маркированном Dil ацетилированном липопротеине низкой плотности (acLDL-Dil) и аглютинине-1 Ulex europaeus (UEA-1). Результаты этого исследования представлены на фиг.З.
Результаты показывают, что эритропоэтин может мобилизировать эндотелиальные клетки-предшественники и повышать количество циркулирующих эндотелиальных клеток-
предшественников. При этом могут компенсироваться
функциональные дефициты, которые возникают при определенных патологических состояниях, таких как ренальная анемия. Эти результаты представлены на фиг.4.
Посредством проточной цитометрии определено, что у пациентов с почечной недостаточностью в конечной стадии количество циркулирующих стволовых клеток CD34+ соответствует количеству циркулирующих стволовых клеток CD34+ в крови
здоровых испытуемых. После начала обработки эритропоэтином значительно повышается количество стволовых клеток CD34+ в системе кровообращения на более, чем 50%. При использовании теста в отношении клеточной культуры определено, что после обработки эритропоэтином резко увеличивается количество клеток, которые относятся к эндотелиальному фенотипу. В случае функционального теста в отношении клеточной культуры очень ухудшенная способность эндотелиальных клеток-предшественников увеличивается более, чем в три раза. Пример 2
Улучшенное заживление раны за счет систематического использования рекомбинантнохю человеческого эритропоэтина (rhEPO)
Мышей FVB/N наркотизировали путем ингаляционной анестезии с помощью изофлорана. Волосяной покров обеих задних ног удаляли с помощью лосьона для депиляции и дезинфицировали с помощью 70%-ного спирта. С помощью стерильного четырехмиллиметрового одноразового перфоратора для биопсийной ткани в каждом случае наносили кожную рану на правый бок мышей. Противоположная сторона служила в качестве внутреннего контроля. Однократно осуществляли послеоперационную антибиотическую защиту с помощью пенициллина G (20000 единиц/кг). В течение всего периода исследования осуществляли один раз в неделю подкожные инъекции аналога рекомбинантного человеческого эритропоэтина аранеспа (0,1 мкг/кг массы тела). Обработку начинали за семь дней до взятия перфоратором ткани. Результаты представлены на фиг.5. Они показывают, что введение эртропоэтина значительно ускоряет процесс заживления раны.
Пример 3
Уменьшение прогрессирования хронической почечной недостаточности за счет терапии эритропоэтином
Крыс Spraque-Dawley в возрасте восьми недель наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг) и ромпуна (10 мг/кг). В день 0 у крыс отнимали правую почку, которую тотчас после отнятия фиксировали в формалине для гистологического исследования. В случае левой почки лигировали
сегментарные артерии, которые снабжают верхний и нижний полюс почки. Благодаря этому вызывают инфаркт соответствующих областей почки, причем функциональной сохраняется только средняя треть почки. Крысы получали один раз еженедельно аналог эритропоэтина аранесп в дозе 0,1 мкг/кг массы тела или для контроля NaCl, подкожно (s.c).
На фиг.7 представлена кривая выживаемости по Каплану-Майеру обеих испытуемых групп. Обработанные с помощью аранеспа животные имеют отчетливо повышенную выживаемость по сравнению с обработанными с помощью хлорида натрия контрольными животными.
На фиг.12-15 показано, что после обработки эритропоэтином почечная ткань не показывает никаких патологических изменений, в то время как после обработки с помощью NaCl видны тяжелые патологические изменения (сравниваемые фиг.8-11). Дальнейшие гистологические исследования показали, что в случае обработанных аранеспом животных можно наблюдать отчетливо более высокую плотность сосудов (CD31), чем у обработанных с помощью хлорида натрия животных (данные не представлены).
Пример 4
Уменьшение прогрессирования острой почечной
недостаточности
Для этого исследования использовали крыс Spraque-Dawley с массой тела 250-300 г. Перед индукцией острой почечной недостаточности подопытные животные получали один раз в сутки аранесп в дозе 0,1 мкг/кг массы тела. Крыс наркотизировали с помощью кетамина (120 мг/кг массы тела) и ромпуна (10 мг/кг). В качестве сравнения служила группа подопытных животных, которым, соответственно, в то же самое время вводили путем подкожной инъекции раствор хлорида натрия. Кровоток в почке прерывали на 45 минут тем, что помещали артериальный зажим на правую почечную артерию. В это время с левой стороны осуществляли нефрэктомию. Псевдооперацию проводили в случае другой, контрольной группы. При этом вскрывали брюшную полость, препарировали левую почечную артерию, но кровоснабжение не прерывали, и отнимали контралатеральную правую почку. Всех животных наркотизировали на период времени 60 минут и спустя
24 часа после операции умерщвляли.
Ишемия в течение 45 минут с последующей реперфузией оставшейся правой почки в случае обработанных хлоридом натрия животных приводила к очень большой потере почечной функции. Это нашло свое выражение в повышенном в 7 раз количестве креатинина в сыворотке (р < 0,05). В противоположность этому, у обработанных аналогом эритропоэтина аранеспом животных обнаружили только четырехкратное увеличение содержания креатинина в сыворотке спустя сутки после индукции повреждения за счет ишемии-реперфузии. У левосторонне нефрэктомированных животных с псевдооперированной правой почкой не произошло никакого увеличения значений ретенции. Результаты представлены на фиг.6.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение эритропоэтина (ЕРО) для получения фармацевтической композиции, содержащей субполицитемическую дозу ЕРО, соответствующую еженедельной дозе 1-90 Международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела, для терапии гиперхолестеринемии, сахарного диабета, опосредованных эндотелием хронических воспалительных нарушений, эндотелиоза, в том числе ретикулоэндотелиоза, атеросклероза, ишемических заболеваний конечностей, преэклампсии, болезни Рейно или индуцированной беременностью гипертензии.
2. Применение по п. 1, где эта фармацевтическая композиция пригодна для парентерального, в частности, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного или подкожного введения.
3. Применение по п. 2, где эта фармацевтическая композиция находится в форме инъекционного или инфузионного раствора.
4. Применение по любому из пп. 1-3, где эта фармацевтическая композиция пригодна для легочного введения.
5. Применение по п. 4, где эта фармацевтическая композиция находится в форме водного раствора, неводного раствора или порошка.
6. Применение по п. 4 или 5, где эта фармацевтическая композиция находится в форме аэрозольного продукта.
7. Применение по п. 1, где эта фармацевтическая композиция пригодна для перорального введения.
8. Применение по п. 7, где эта фармацевтическая композиция находится в форме раствора, суспензии, эмульсии или таблетки.
9. Применение по пп. 1-8, где эта фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников .
10. Применение по п. 9, где этим дополнительным активным ингредиентом является VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитор HMG-CoA-редуктазы и/или донор N0, в частности, L-аргинин.
11. Применение по п. 10, где ингибитором HMG-CoA-редуктазы является статин, такой как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.
12. Применение эритропоэтина для приготовления трансплантируемого препарата эндотелиальных клеток.
13. Применение по п. 12, где эндотелиальные клетки получают in vitro культивированием эндотелиальных клеток-предшественников в присутствии эритропоэтина.
14. Применение по п. 12 или 13, где культивирование эндотелиальных клеток-предшественников имеет место в присутствии по меньшей мере одного дополнительного активного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы, в частности, симвастатина, мевастатина или аторвастатина, и донора N0, в частности, L-аргинина.
15. Применение эритропоэтина для предобработки и/или дополнительной обработки трансплантатов тканей или органов.
16. Применение по п. 15, где предобработка трансплантатов тканей или органов имеет место с использованием выделенных эндотелиальных клеток-предшественников.
17. Применение эритропоэтина для получения имплантируемых или трансплантируемых систем клеткосодержащих органов или тканей in vitro, где эти системы органов или тканей in vitro обрабатывают эритропоэтином перед трансплантацией или имплантацией для индукции образования и развития сосудов (васкулогенеза) и/или образования эндотелиальных клеток.
18. Применение по п. 17, где эти системы органов или тканей in vitro содержат эндотелиальные клетки-предшественники.
19. Применение эритропоэтина для получения сосудистых протезов или клапанов сердца, где эти сосудистые протезы или клапаны сердца покрыты эритропоэтином.
20. Применение по п. 19, где покрытие сосудистых протезов или клапанов сердца содержит эндотелиальные клетки-предшественники .
21. Применение эритропоэтина и/или его производных в субполицитемической дозе ЕРО, соответствующей еженедельной дозе 1-90 международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела, для стимуляции физиологической мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников, пролиферации эндотелиальных клеток
предшественников, дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки и/или миграции эндотелиальных клеток-предшественников в направлении
ангиогенного или васкулогенного стимула.
22. Применение по п. 21, где адгезионная способность дифференцирующихся эндотелиальных клеток-предшественников увеличивается.
23. Применение по п. 21 или 22, где стимуляция эндотелиальных клеток-предшественников приводит к образованию эндотелиальной ткани.
24. Применение по любому из пп. 21-23, где стимуляция эндотелиальных клеток-предшественников приводит к образованию новых кровеносных сосудов.
25. Применение эритропоэтина для получения фармацевтической композиции, содержащей субполицитемическую дозу ЕРО, соответствующую еженедельной дозе 1-90 Международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела, для стимуляции образования эндотелиальной ткани.
26. Применение по любому из пп. 1-25, где эритропоэтином является эритропоэтин человека или животного.
27. Применение по п. 26, где эритропоэтином является производное, аналог, модификация или мутеин эритропоэтина.
28. Применение по п. 2 6 или п. 27, где эритропоэтин выделен из мочи человека, мочи или плазмы пациентов, страдающих от апластической анемии, культур ткани клеток рака почки человека, лимфобластных клеток человека, способных продуцировать эритропоэтин человека, или гибридомной культуры, полученной слиянием клеток клеточной линии человека.
29. Применение по п. 26 или 27, где эритропоэтином является эритропоэтин, полученный способами рекомбинантных ДНК.
30. Фармацевтическая композиция для стимуляции эндотелиальных клеток-предшественников, для стимуляции образования эндотелиальной ткани, для стимуляции васкулогенеза и/или для лечения заболеваний или патологических состояний, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, содержащая эритропоэтин и/или его производное, аналог,
модификацию или мутеин в качестве активного ингредиента в субполицитемической дозе ЕРО, соответствующей еженедельной дозе 1-90 международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела, и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы и донора N0.
31. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или терапии гиперхолестеринемии, сахарного диабета, опосредованных эндотелием хронических воспалительных нарушений, эндотелиоза, в том числе ретикулоэндотелиоза, атеросклероза, ишемических заболеваний конечностей, преэклампсии, болезни Рейно или индуцированной беременностью гипертензии, хронической или острой почечной недостаточности, в частности, терминальной почечной недостаточности, заживления ран и их последствий, содержащая эритропоэтин и/или и/или его производное, аналог, модификацию или мутеин в качестве активного ингредиента в субполицитемической дозе ЕРО, соответствующей еженедельной дозе 1-90 международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела.
32. Фармацевтическая композиция по п. 34, дополнительно содержащая дополнительный активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из VEGF, PIGF, GM-CSF, ингибитора HMG-CoA-редуктазы и донора N0.
33. Фармацевтическая композиция по п. 30 или 32, где ингибитором HMG-CoA-редуктазы является статин, такой как симвастатин, мевастатин или аторвастатин.
34. Фармацевтическая композиция по п. 30 или 32, где донором N0 является L-аргинин.
35. Применение эритропоэтина и/или его производных в субполицитемической дозе ЕРО, соответствующей еженедельной дозе 1-90 международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела, для стимуляции васкулогенеза.
36. Применение эритропоэтина в субполицитемической дозе ЕРО, соответствующей еженедельной дозе 1-90 международных единиц (ME) ЕРО/кг массы тела, для терапии патологических состояний или заболеваний организма человека или животного, связанных с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников.
37. Применение по п. 36, где дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников состоит в их нарушенной способности пролиферации, их нарушенной способности дифференцировки в эндотелиальные клетки, их нарушенной способности адгезии и/или их нарушенной способности миграции в направлении васкулогенного или ангиогенного стимула.
38. Применение по п. 36 или 37, где дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников ухудшает или предотвращает образование эндотелиальной ткани и/или кровеносных сосудов.
39. Применение по любому из пп. 36-38, где дисфункция эндотелиальных клеток-предшественников обусловлена патогенным фактором.
40. Применение по любому из пп. 36-39, где патологическими состояниями или заболеваниями, связанными с дисфункцией эндотелиальных клеток-предшественников, являются гиперхолестеринемия, сахарный диабет, опосредованных эндотелием хронические воспалительные нарушения, эндотелиоз, в том числе ретикулоэндотелиоз, атеросклероз, ишемические заболевания конечностей, преэклампсия, болезнь Рейно или индуцированная беременностью гипертензия, хроническая или острая почечная недостаточность, в частности, терминальная почечная недостаточность, заживление ран и их последствия.
По доверенности
ФИГ.1
о со
n еч
CD45FITCLog
- J (tm)
сом*
1•.
6*-:
CDMPELog
COU Clui
CD45FITCLog
CMSCIw
10" 10' 10' 103 10* 10' ИР 10" 10' ИГ 10" 105 CD45 FITC Log lgG-1 РЕ Log CD45 FITC Log
FSLin
itHtrCl.il
FSUn
1023
О CD
-si
ФИГ.2
До введения 2 недели ЕРО
4 недели 6 недель 8 недель
ФИГ.З
До введения 2 недели ЕРО
4 недели 6 недель 8 недель
4/15
До обработки с помощью ЕРО
Спустя 8 недель Здоровые
контрольные испытуемые
ФИГ.4
5/15
ФИГ.5
6/15
500
р < 0,05
400
о 300
Г Ч
200
100 -
IR + EPO
Псевдооперация
ФИГ.6
7/15
1.1
ФИГ.7
8/15
ФИГ.8
9/15
ФИГ.9
ФИГ.10
11/15
ФИГ.11
12/15
ФИГ.12
13/15
ФИГ.13
W15
ФИГ.14
15/15
ФИГ.15
INTERNATIONALER RECHERCHENBEERICHT
Internationales Aktenzelchen
PCT/EP 03/08229
A. KLASSIFIZIERUNG DES ANMELDUNGSGEGENSTANDES
IPK 7 A61K38/18 A61P9/00 A61L27/38
Nach der Inlernalionalen Palenlklassifikalion (IPK) oder nach der nationalen Klassilikation und der IPK
B. RECHERCHIERTE GEBIETE
Recherchierter Mindestpriifstoft (Klassiflkalionssyslem und Klassilikalionssymbole )
IPK 7 A61K A61P A61L
Recherchierte aber nichl zum Mindestprufstoff gehorende Veroflentlichuncen, soweil diese unler die recherchierten Gebiete fallen
Wahrend der inlernationalen Recherche konsultierte elektronische Dalenbank (Name der Datenbank und evil, verwendete Suchbegriffe)
EPO-Internal, WPI Data, PAJ, BIOSIS, EMBASE, CHEM ABS Data
C. ALS WESENTLICH ANGESEHENE UNTERLAGEN
Kategorie" Bezeichnung der Veroffentlichung, soweit erforderlich unler Angabe der in Betracht kommenden Teile
Betr. Anspruch Nr.
P,X
WO 03/057242 A (BRUS RONALD HENDRIK PETER ; CRUCELL HOLLAND В V (NL); DE BOER RUDOLF A) 17. Juli 2003 (2003-07-17) Anspruche
W0 02/14356 A (ALTHOFF CLAUDIA LAWRENCE H (US)) 21. Februar 2002 (2002-02-21) Anspruche 1,42
THOMPSON
US 2002/065214 Al (SILVERBERG DONALD S ET AL) 30. Mai 2002 (2002-05-30)
Ы2,
15-25,
37-40,42
Ы2,
15-25,
37-40,42
1-12,
15-25,
37-40
Anspruche
Weitere Veroffentlichungen sind der Fortsetzung von Feld С zu enlnehmen
Siehe Anhang Patentfamilie
° Besondere Kalegorien von angegebenen Veroffentlichungen
"A- Veroffentlichung, die den alkjemeinen Stand derTechnikdefiniert, aber nichl als besonders bedeutsam anzusehen 1st
'E* alteres Dokument, das jedoch erst am oder nach dem inlernationalen Anmeldedatum veroffentlicht worden ist
'L' VerSffentlichung, die geeignet ist. einen Prioritatsanspruch zweifelhaft er-scheinen zu lassen, oder durch die das Verdffentlichungsdatum einer anderen im Recherchenbericht genannten Veroffentlichung belegt warden soli oder die aus einem anderen besonderen Grund angegeben ist (wie ausgefuhrt)
'O' Veroffentlichung, die sich auf eine mundliche Offenbarung,
eine Benutzung, eine Ausstellung oder andere MalBnahmen bezleht
"P" Veroffentlichung, die vor dem internationalen Anmeldedatum, aber nach dem beanspruchten Prioritatsdatum veroffentlicht worden ist _
'T' Spatere Veroffentlichung, die nach dem internationalen Anmeldedatum oder dem Prioritatsdatum verSffenllicht worden ist und mil der Anmeldung nicht kollidiert, sondem nur zum Verstandnis des der Erfindung zugrundeliegenden Prinzips oder der ihr zugrundeliegenden Theorie angegeben ist
'X' Veroffenllichung von besonderer Bedeulung; die beanspruchte Erfindung kann allein aufgrund dieser Veroffentlichung nicht als neu oder auf erfinderischer Tatigkeit beruhend betrachtet werden
¦V Veroffenllichung von besonderer Bedeutung; die beanspruchte Erfindung kann nicht als auf erfinderischer Tatigkeit beruhend betrachtet werden, wenn die Veroffentlichung mil einer Oder mehreren anderen Veroffentlichungen dieser Kategorie in Verbindung gebracht wird und diese Verbindung Юг einen Fachmann naheliegend ist
•A" Ver6ffentlichung, die Mltglied derselben Patentfamilie ist
Datum des Abschlusses der internationalen Recherche
30. Maerz 2004
Absendedatum des internationalen Recherchenberichts
2 0. 04. 2004
Name und Postanschrift der Internationalen Recherchenbehorde
Europaisches Patentamt, P.B. 5818 Patentlaan 2 NL - 2280 HV Rijswijk Tel. (+31-70) 340-2040. Tx. 31 651 epo nl, Fax: (+31-70) 340-3016
Bevollmachtigter Bediensteter
Winger, R
Formblatl PCT/ISA/210 (Blatt 2) (Januat 2004)
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Internationales Aktenzelchen
PCT/EP 03/08229
C(Fortsetzung) ALS WESENTLICH ANGESEHENE UNTERLAGEN
Kalegorie"
Bezeichnung der Veroffentlichung, soweil erfordertich unler Angabe der in Belrachl kommenden Teile
Belr. Anspruch Nr.
WO 00/61164 A (KENNETH S WARREN LAB)
1-12,
19. Oktober 2000 (2000-10-19)
15-25,
37-40,42
Anspruche 1,6,7
WO 98/10650 A (ANAGN0ST0U ATHANASIUS A ;
1-12,
SIG0UNAS GEORGE (US); UNIV EAST CAROLINA
15-25,
(US) 19. Marz 1998 (1998-03-19)
37-40,42
Seite 4, Spalte 20 - Spalte 35; Anspruch
1 л
1-42
Seite 7, Zeile 25 - Seite 8, Zeile 4
US 5 980 887 A (ISNER JEFFREY M ET AL)
1-12,
9. November 1999 (1999-11-09)
15-25,
37-40,42
Spalte 3, Absatz 1; Anspruche 7-11
1-42
BUEMI M ET AL: "Recombinant
1-12,
erythropoietin prevents the progression of
15-25,
atherosclerosis in Watanabe rabbits with
37-40,42
heredi tary hypocholesterolemi a"
NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION,
Bd. 12, Nr. 9, 1997, Seite A190,
XP0009021639
& ANNUAL CONGRESS OF THE EUROPEAN RENAL
ASSOCIATION AND THE EUROPEAN DIALYSIS AND
TRANSPLANT ASS0CIATI; GENEVA, SWITZERLAND;
SEPTEMBER 21-24, 1997
ISSN: 0931-0509
Zusammenfassung
BUEMI M ET AL: "Recombinant human
1-12,
erythropoietin (rHuEPO): More than just
15-25,
the correction of uremic anemia"
37-40,42
JOURNAL OF NEPHROLOGY 2002 ITALY,
Bd. 15, Nr. 2, 2002, Seiten 97-103,
XP0009021789
ISSN: 1121-8428
Seite 99, Spalte 1
1-42
Seite 101, Spalte 1
Seite 101, Spalte 2
MASUDA SEIJI ET AL: "Erythropoietic,
1-12,
neurotrophic, and angiogenic functions of
15-25,
erythropoietin and regulation of
37-40
erythropoietin production"
INTERNATIONAL JOURNAL OF HEMATOLOGY,
Bd. 70, Nr. 1, Juli 1999 (1999-07), Seiten
1-6, XP0009021621
& ISSN: 0925-5710
Seite 3, Spalte 2, Absatz 3 - Seite 4,
1-42
Spalte 1, Absatz 3; Abbildung 1
-/--
Formblatt PCT/ISA/210 (Forlsetzung von Blatt 2) (Januar 2004)
Seite 2 von 5
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Internationales Aktenzeichen
PCT/EP 03/08229
C(Fortsetzung) ALS WESENTLICH ANGESEHENE UNTERLAGEN
Kategorie"
Bezeichnung der Veroffentlichung, soweil erforderlich unler Angabe der in Belracht kommenden Teile
Belr. Anspruch Nr.
KRAUSE К ET AL: "Recombinant human
1-6
erythropoietin and VEGF have equal
angiogenic potency: Investigation in a
novel in vitro assay of human vascular
tissues"
EUROPEAN HEART JOURNAL,
Bd. 22, Nr. Abstract Supplement,
September 2001 (2001-09), Seite 154,
XP0001097312
& XXIII CONGRESS OF THE EUROPEAN SOCIETY
OF CARDIOLOGY TOGETHER WITH THE 36TH
ANNUAL GENERAL MEETING 0; STOCKHOLM,
SWEDEN; SEPTEMBER 01-05, 2001
ISSN: 0195-668X
Zusammenfassung
1-42
MASCHI0 G: "Erythropoietin and systemic
1-27,
hypertension"
37-42
NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION,
Bd. 10, Nr. SUPPL. 2, 1995, Seiten 74-79,
XP0009021640
& ISSN: 0931-0509
Zusammenfassung
P,Y
DATABASE BIOSIS 'Online!
1-27,
BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE,
37-42
PHILADELPHIA, PA, US;
November 2002 (2002-11),
KASHIWAGI M ET AL: "Hypertension in a
pregnancy with renal anemia after
recombinant human erythropoietin (rhEPO)
therapy."
XP002275413
Database accession no. PREV200300039039
Zusammenfassung
& ARCHIVES OF GYNECOLOGY AND OBSTETRICS,
Bd. 267, Nr. 1, November 2002 (2002-11),
Seiten 54-56,
ISSN: 0932-0067
DATABASE BIOSIS 'Online!
1-27,
BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE,
37-42
PHILADELPHIA, PA, US; 1997,
CONRAD KIRK P ET AL: "Placental cytokines
and the pathogenesis of preeclampsia"
XP002275414
Database accession no. PREV199799525116
Zusammenfassung
& AMERICAN JOURNAL OF REPRODUCTIVE
IMMUNOLOGY,
Bd. 37, Nr. 3, 1997, Seiten 240-249,
ISSN: 1046-7408
-/--
Fotmblatt PCT/ISA/210 (Fortsetzung von Blatt 2) (Januar 2004)
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Internationales Aktenzelchen
PCT/EP 03/08229
C.(Fortsetzung) ALS WESENTLICH ANGESEHENE UNTERLAGEN
Kategorie" Bezeichnung der Veroffentlichung, soweit erforderlich unler Angabe der in Betrachl kommenden Teile
Betr. Anspruch Nr.
P,X
P,X
WO 03/037273 A (UNIV UTAH RES FOUND) 8. Mai 2003 (2003-05-08)
Anspruche
DATABASE EMBASE 'Online!
ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM,
NL; 2000,
CASES A: "Recombinant human erythropoietin treatment in chronic renal failure: Effects on hemostasis and vasculature" XP002275415
Database accession no. EMB-20G0364537
Zusammenfassung
& DRUGS OF TODAY 2000 SPAIN,
Bd. 36, Nr. 8, 2000, Seiten 541-556,
ISSN: 0025-7656
DATABASE MEDLINE 'Online!
US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM),
BETHESDA, MD, US; Mai 1996 (1996-05),
BRAGA J ET AL: "Maternal and perinatal
implications of the use of human
recombinant erythropoietin."
XP002275416
Database accession no. NLM8677769 Zusammenfassung
& ACTA OBSTETRICIA ET GYNEC0L0GICA
SCANDINAVICA. MAY 1996,
Bd. 75, Nr. 5, Mai 1996 (1996-05), Seiten
449-3,
ISSN: 0001-6349
WO 02/085940 A (ESCARY JEAN-LOUIS GENODYSSEE (FR)) 31. Oktober 2002 (2002-10-31) Anspruche 28-30
DATABASE BIOSIS 'Online!
BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE,
PHILADELPHIA, PA, US;
16. November 2001 (2001-11-16),
ARCASOY MURAT О ET AL: "Erythropoietin
(EPO) stimulates angiogenesis 1n vivo and
promotes wound healing"
XP002275417
Database accession no. PREV200200261552 Zusammenfassung
-/-
1-12,
15-25,
37-40,42
1-12,
15-25,
37-40,42
1-12,
15-25,
37-40,42
1-12,
15-25,
37-40,42
1-12,
15-25,
37-40,42
Fotmblatt PCWSA/2tO (Forlsetzung von Blatt 2) (Januar 2004)
Spitp 4 vnn R
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Internationales Aktenzeichen
PCT/EP 03/08229
C(Fortsetzung) ALS WESENTLICH ANGESEHENE UNTERLAGEN
Kategorie0
Bezeichnung der Veroffenllichung, soweil erforderiich unler Angabe der in Betracht kommenden Teile
Belr. Anspruch Nr.
& BLOOD,
Bd. 98, Nr. 11 Part 1,
16. November 2001 (2001-11-16), Seiten
822a-823a,
43RD ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN
SOCIETY OF HEMATOLOGY, PART 1; ORLANDO,
FLORIDA, USA; DECEMBER 07-11, 2001
ISSN: 0006-4971
W0 89/07944 A (US COMMERCE ; AMERICAN NAT
28-40
RED CROSS (US))
8. September 1989 (1989-09-08)
Seite 16, Zeile 10 - Zeile 15
Seite 19, Zeile 16 - Zeile 27
Anspruche
W0 92/15323 A (CREATIVE BI0M0LECULES INC)
28-40
17. September 1992 (1992-09-17)
Seite 3, Zeile 5; Anspruche
US 4 992 419 A (GRUBER WERNER ET AL)
41-43,45
12. Februar 1991 (1991-02-12)
Anspruche 1,4; Beispiel 7
US 5 198 417 A (DONAHUE ROBERT E)
41-43
30. Marz 1993 (1993-03-30)
Anspruche 1-3; Beispiele 1-3
DATABASE BIOSIS 'Online!
41-43
BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE,
PHILADELPHIA, PA, US;
November 1998 (1998-11),
ALVAREZ ARROYO MARIA VICTORIA ET AL: "Role
of vascular endothelial growth factor on
erythropoietin-related endothelial cell
proliferation"
XP002275418
Database accession no. PREV199800506855
Zusammenfassung
& JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF
NEPHROLOGY,
Bd. 9, Nr. 11, November 1998 (1998-11),
Seiten 1998-2004,
ISSN: 1046-6673
Fotmblatt PCT/ISA/210 (Fortsetzung von Blatt 2) (Januar 2004)
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Internationales Aktenzeichen PCT/EP 03/08229
Feld I Bemerkungen zu den Anspruchen, die sich als nicht recherchierbar erwiesen haben (Fortsetzung von Punkt 2 auf Bl;
GemaB Artikel 17(2)a) wurde aus folgenden Grunden fur bestimmte Anspruche kein Recherchenbericht erstellt:
I X | Anspriiche Nr.
weil sie sich auf Gegenstande beziehen, zu deren Recherche die Behflrde nicht verpflichtet Ist, namlich
Obwohl die Anspruche 1-14, 28 und 31 sich auf ein Verfahren zur Behandlung dei menschlichen/tierischen Korpers beziehen, wurde die Recherche durchgefiihrt unc grundete sich auf die angefuhrten Wirkungen der Verbindung.
Anspriiche Nr.
weil sie sich auf Teile der internationalen Anmeldung beziehen, die den vorgeschriebenen Anforderungen so wenig entsprechen, da!3 eine sinnvolle Internationale Recherche nicht durchgefiihrt werden kann, namlich
3. Anspruche Nr.
weil es sich dabei um abhangige Anspruche handelt, die nicht entsprechend Satz 2 und 3 der Regel 6.4 a) abgefaBt sind.
Feld II Bemerkungen bei mangelnder Einheitiichkeit der Erfindung (Fortsetzung von Punkt 3 auf Blatt 1)
Die international Recherchenbehfirde hat festgestellt, daR diese internationale Anmeldung mehrere Erflndungen enthalt:
siehe Zusatzblatt
1. I " I Da der Anmelder alle erforderlichen zusatzlichen Recherchengebiihren rechtzeitig entrichtet hat, erstreckt sich dieser L^-l internationale Recherchenbericht auf alle recherchierbaren Anspruche.
?Da fur alle recherchierbaren Anspriiche die Recherche ohne einen Arbeitsaufwand durchgefiihrt werden konnte, der eine zusatzliche Recherchengebuhr gerechtfertigt hatte, hat die BehOrde nicht zur Zahlung einer solchen Gebiihr aufgefordert.
3. I I Da der Anmelder nur einige der erforderlichen zusatzlichen Recherchengebiihren rechtzeitig entrichtet hat, erstreckt sich dieser '-' internationale Recherchenbericht nur auf die Anspriiche, fur die Gebiihren entrichtet worden sind, namlich auf die Anspruche Nr.
4. | | Der Anmelder hat die erforderlichen zusatzlichen Recherchengebiihren nicht rechtzeitig entrichtet. Der internationale Recherchenbericht beschrSnkt sich daher auf die in den Anspruchen zuerst erwahnte Erfindung; diese ist in folgenden Anspruchen er-faRt:
Bemerkungen hinslchtlich eines Widerspruchs [ | Die zusatzlichen Gebiihren wurden vom Anmelder unter Widerspruch gezahlt.
| X | Di6i Zahlung zusatzlicher Recherchengebiihren erfolgte ohne Widerspruch.
Formblatt PCT/ISA/210 (Fortsetzung von Blatt 1 (1))(Juli 1998)
Seite 1 von 2
Internationales Aktenzeichen РСТ/ ЕР 03/08229
WEITERE ANGABEN PCT7ISA/ 210
Fortsetzung von Feld 1.1
Obwohl die Anspruche 1-14, 28 und 31 sich auf ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen/tierischen Korpers beziehen, wurde die Recherche durchgefiihrt und grundete sich auf die angefiihrten Wirkungen der Verbindung.
Seite 2 von 2
Internationales Aktenzeichen P СТ/ E P 03 /08229
WEITERE ANGABEN PCT/ISA/ 210
Die internationale Recherchenbehorde hat festgestellt, dass diese Internationale Anmeldung mehrere (Gruppen von) Erfindungen enthalt, naml i ch:
1. Anspriiche: 1-6, 7-24 (teilweise), 36-40 (teiweise), 42
Verwendung von EPO zur Stimulation endothelialer Vorlauferzel len und zur Therapie von Krankheiten des kardiovaskularen Formenkrei ses (Hypercholesterinamie* Diabetes, chronische Entziindungserkrankungen, Atherosklerose, koronare Herzkrankheit, Myokard-Ischamie, Angina pectoris, altersbedingte Herz-Kreislauferkrankung, ischamische Erkrankungen, Raynaud-Krankheit, Herzinsuffizienz) sowie pharmazeutische Zusammensetzungen zur medizinischen Verwendung umfassend EPO.
2. Anspriiche: 7-24 (teilweise), 36-40 (teilweise)
Verwendung von EPO zur Therapie von Endotheliose.
3. Anspriiche: 7-24 (teilweise), 36-40 (teilweise)
Verwendung von EPO zur Therapie von Praeklampsie und schwangerschaftsi nduzierter Hypertonie.
4. Anspruche: 7-24 (teilweise), 36-40 (teilweise)
Verwendung von EPO zur Therapie von Niereninsuffizienz.
5. Anspruche: 7-24 (teilweise), 36-40 (teilweise)
Verwendung von EPO zur Wundheilung.
6. Anspruche: 28-35, 36-40 (teilweise)
Verwendung vo EPO zur Herstellung von transplanterbaren Endothelzell-Praparaten, zur Herstellung zellhaltiger Organ-oder Gewebesysteme und zur Herstellung von Herzklappen.
7. Anspruche: 25-27, 36-40 (teilweise), 41, 43-45
Pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend EPO sowie einen weiteren Wirkstoff und deren Verwendung.
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Angaben zu Veroffenllichungen, die zur selben Patentfamilie gehoren
Internationales Aktenzeichen
PCT/EP 03/08229
lm Recherchenbericht angefiihrtes Patentdokument
Datum der Veroffentlichung
Mitglied(er) der Patentfamilie
Datum der Veroffentlichung
WO 03057242 A 17-07-2003 W0 03057242 Al 17-07-2003 W0 0214356 A 21-02-2002 AU 9175501 A 25-02-2002
BR 0113189 A 16-09-2003
CA 2418531 Al 21-02-2002
CZ 20030406 A3 18-06-2003
WO 0214356 A2 21-02-2002
EP 1317276 A2 11-06-2003
HU 0300740 A2 29-09-2003
2002065214
30-
-05-
2002
KEINE
0061164
19-
-10-
•2000
4348700
14-11-2000
106058
29-12-2002
0009737
14-01-2003
2383940
19-10-2000
20013695
13-02-2002
1171147
16-01-2002
0201598
28-09-2002
2003520194
02-07-2003
20014991
15-11-2001
352223
11-08-2003
14412001
05-03-2002
200103785
21-06-2002
0061164
19-10-2000
200108407
13-02-2003
9810650
19-
-03-
¦1998
2002052309
02-05-2002
2265547
19-03-1998
1429623
16-07-2003
1235512 A ,B
17-11-1999
0933995
11-08-1999
2001503028 T
06-03-2001
9810650
19-03-1998
5922674
13-07-1999
5980887
09-
-11-
-1999
743267
24-01-2002
5243298 A
29-05-1998
2271690 Al
14-05-1998
0941125 Al
15-09-1999
2001503407
13-03-2001
9819712
14-05-1998
6569428
27-05-2003
WO 03037273
08-
-05-
-2003
2003083251 Al
01-05-2003
03037273 A2
08-05-2003
WO 02085940
31-
-10-
-2002
2823220 Al
11-10-2002
2443373 Al
31-10-2002
02085940 A2
31-10-2002
1383927 A2
28-01-2004
2003050269 Al
13-03-2003
WO 8907944
08-
-09-
-1989
4072189 A
22-09-1989
202790 A
23-08-1990
0424386 Al
02-05-1991
3503167 T
18-07-1991
8907944 Al
08-09-1989
Fonnblatl PCT71SA/210 (Anhang Patenttamilie) (Januar 2004)
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Angaben zu Veroffenllichungen, die zur selben Patenlfamilie gehoren
Internationales Aktenzeichen
PCT/EP 03/08229
lm Recherchenbericht
Datum der
Mitglied(er) der
Datum der
angefiihrtes Patentdokument
Veroffentlichung
Patentfamilie
Veroffentlichung
WO 9215323 A
17-09-1992
203166
15-08-2001
660019
08-06-1995
1754392
06-10-1992
2104678
12-09-1992
2363965
17-09-1992
69231946
23-08-2001
69231946
04-04-2002
575555
05-11-2001
0575555
29-12-1993
2161693
16-12-2001
3036950
31-01-2002
6506360
21-07-1994
2003125230
03-07-2003
9215323
17-09-1992
2003105004
05-06-2003
5656593
12-08-1997
6333312
25-12-2001
6153583
28-11-2000
2003104993
05-06-2003
6211146
03-04-2001
2003109445
12-06-2003
6395883
28-05-2002
6565843
20-05-2003
5674844
07-10-1997
6194376
27-02-2001
6288031
11-09-2001
6077823
20-06-2000
5849686
15-12-1998
5741641
21-04-1998
6495513
17-12-2002
5834179
10-11-1998
6399569
04-06-2002
5972884
26-10-1999
5739107
14-04-1998
6531445
11-03-2003
5652337
29-07-1997
6090776
18-07-2000
5652118
29-07-1997
5707810
13-01-1998
5733878
31-03-1998
6071708
06-06-2000
5854071
29-12-1998
5994131
30-11-1999
2002049159
25-04-2002
6506729
14-01-2003
2003224979
04-12-2003
US 4992419 A
12-02-1991
3729863
16-03-1989
77556
15-07-1992
2173988
27-04-1989
1330301
21-06-1994
1031801
A ,B
22-03-1989
8805901
13-12-1990
273004
01-11-1989
3872334
30-07-1992
483188
06-03-1989
0306824
15-03-1989
2051806
01-07-1994
Foimblatt FCT/ISA^IO (Anhang Patentfamilie) (Januar 2004)
INTERNATIONALER RECHERCHENBERICHT
Angaben zu Veroffentlichungen, die zur selben Patentfamilie gehoren
Internationales Aktenzeichen
PCT/EP 03/08229
lm Recherchenbericht angefuhrtes Patentdokument
Datum der Veroffentlichung
Mitglied(er) der Patentfamilie
Datum der Veroffentlichung
US 4992419 A
884051
A ,B,
06-03-1989
3005454
24-05-1993
89495
16-06-1995
47863
28-04-1989
60310
29-06-1994
87628
08-07-1993
1071818
16-03-1989
2057196
23-05-1996
7080782
30-08-1995
9609929
25-07-1996
10178
A ,B
20-10-1994
10393
A ,B
20-02-1995
12880
01-12-1993
883926
A ,B,
06-03-1989
225975
26-07-1991
25618
08-08-1991
274485
17-04-1989
88417
A ,B
31-07-1989
2043118
10-09-1995
2100032
27-12-1997
8806528
30-05-1989
US 5198417
30-03-1993 US
4921837
01-05-1990
79761
15-09-1992
589731
19-10-1989
6739787
01-07-1987
3686582
01-10-1992
3686582
28-01-1993
0246322
25-11-1987
7064742
12-07-1995
63502342
08-09-1988
8703204
04-06-1987
Formblatt PCT/ISA/210 (Anhang Patentfamilie) (Januar 2004)