Изобретение относится к олигомерным пептидам с биологической активностью против ВИЧ инфекции, имеющим аминокислотную последовательность

(Z ₁ -LE-X ₂ -IP-X ₂ -X ₃ -X ₄ -P-X ₅ -X ₆ -X ₇ -X ₈ -X ₉ -X ₁₀ -K-X ₁₁ -X ₁₂ -X ₁₃ -X ₁₄ -X ₁₅ -Z ₂ ) _n ,

где n указывает число мономерных пептидных цепей, причем n равно 2, 3 или 4;

X ₁ представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;

X ₂ представляет собой цистеин, метионин или изолейцин;

X ₃ представляет собой серин, цистеин, лизин или глицин;

X ₄ представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин;

X ₅ представляет собой пролин, D-пролин или замещенный L-или D-пролин;

X ₆ представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;

X ₇ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

X ₈ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

X ₉ представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;

X ₁₀ представляет собой глицин, аланин или аспарагин;

X ₁₁ представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

X ₁₂ представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

X ₁₃ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

X ₁₄ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

X ₁₅ представляет собой фенилаланин или удален;

Z ₁ представляет собой NH ₂ или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

Z ₂ представляет собой COOH или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

и олигомерным пептидам, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты;

и при условии, что

(a) если X ₁₂ представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, то X ₁₃ , X ₁₄ и X ₁₅ представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или

(b) если X ₁₂ представляет собой фенилаланин, то X ₁₃ , X ₁₄ и X ₁₅ представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и

(c) в пептиде имеется максимально три цистеиновых остатка; и

(d) олигомерный пептид не представляет собой (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF) ₂ (VIR-576); и

(e) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между N-концом одной пептидной цепи и C-концом другой пептидной цепи.

 

(57) Реферат / Формула:
относится к олигомерным пептидам с биологической активностью против ВИЧ инфекции, имеющим аминокислотную последовательность

(Z ₁ -LE-X ₂ -IP-X ₂ -X ₃ -X ₄ -P-X ₅ -X ₆ -X ₇ -X ₈ -X ₉ -X ₁₀ -K-X ₁₁ -X ₁₂ -X ₁₃ -X ₁₄ -X ₁₅ -Z ₂ ) _n ,

где n указывает число мономерных пептидных цепей, причем n равно 2, 3 или 4;

X ₁ представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;

X ₂ представляет собой цистеин, метионин или изолейцин;

X ₃ представляет собой серин, цистеин, лизин или глицин;

X ₄ представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин;

X ₅ представляет собой пролин, D-пролин или замещенный L-или D-пролин;

X ₆ представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;

X ₇ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

X ₈ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;

X ₉ представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;

X ₁₀ представляет собой глицин, аланин или аспарагин;

X ₁₁ представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

X ₁₂ представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;

X ₁₃ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

X ₁₄ представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;

X ₁₅ представляет собой фенилаланин или удален;

Z ₁ представляет собой NH ₂ или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

Z ₂ представляет собой COOH или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;

и олигомерным пептидам, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты;

и при условии, что

(a) если X ₁₂ представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, то X ₁₃ , X ₁₄ и X ₁₅ представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или

(b) если X ₁₂ представляет собой фенилаланин, то X ₁₃ , X ₁₄ и X ₁₅ представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и

(c) в пептиде имеется максимально три цистеиновых остатка; и

(d) олигомерный пептид не представляет собой (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF) ₂ (VIR-576); и

(e) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между N-концом одной пептидной цепи и C-концом другой пептидной цепи.

 

---

2420-141061ЕА/041 ОЛИГОМЕРНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИЧ ИНФЕКЦИЙ
Настоящее изобретение относится к олигомерным пептидам, которые проявляют ингибиторную активность в отношении инфицирования клеток человека вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). В частности, они представляют собой олигомерные пептиды, включающие мономерные пептидные цепи с аминокислотной последовательностью (Zi-LE-Xi-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-Xg-Xio-K-X11-X12-X13-X14-X15-Z2) где п указывает число мономерных
пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4; Xi представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту; Х2 представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Хз представляет собой серии, цистеин, лизин или глицин; Х4 представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин; Х5 представляет собой пролин, D-пролин или замещенный L- или D-пролин; Х6 представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту; Х7 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин; Х8 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин; Хд представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью; Хю представляет собой глицин, аланин или аспарагин; Хц представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или D-1,2,3,4-
тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Х12 представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту; Х13
представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью; Xi4 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью; Xi5 представляет собой фенилаланин или удален; Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков; и олигомерные пептиды, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные
производные и их мутанты; и при условии, что (а) если Х12 представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2, 3, 4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту, то Х13, Xi4 и Х15 представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или (Ь) если Xi2 представляет собой фенилаланин, то Х13, Х14 и Х15 представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и (с) в любой мономерной пептидной цепи олигомерного пептида существует максимально три цистеиновых остатка; и (d) олигомерный пептид не является последовательностью (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2 (VIR-57 6) и (е) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между N-концом одной пептидной цепи и С-концом другой пептидной цепи.
Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов по изобретению, за исключением тех молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют мономерные пептидные цепи, уже раскрытые в патенте W0 2004/056871. Настоящее изобретение также касается антител, которые специфически связываются с олигомерными пептидами, а также к лекарственному средству, включающему указанные пептиды, нуклеиновые кислоты и/или антитела. Раскрыто также применение олигомерных пептидов по изобретению для получения лекарственного средства для лечения ВИЧ инфекций. Настоящее изобретение также касается теста, включающего, по меньшей мере, один олигомерный пептид по изобретению, для определения молекул, способных
взаимодействовать с гибридным белком ВИЧ. Более того, настоящее изобретение действительно раскрывает диагностическое средство, содержащее, по меньшей мере, один из олигомерных пептидов по изобретению, и/или, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и/или, по меньшей мере, одно антитело по изобретению. Раскрывается также применение олигомерных пептидов по изобретению в указанном выше тесте, а также применение диагностического средства для тестирования выделенных плазмы, ткани, мочи, семенной жидкости и/или цереброспинальной жидкости на ВИЧ инфекцию.
Уровень техники
В последние годы выполнялись интенсивные исследования в области лекарств с активностью против ВИЧ инфекции. Разработано и протестировано несколько лекарств, которые задерживают и подавляют проявление СПИДа и снижают уровень ВИЧ в крови. В США продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных больных после проявления СПИДа поднялась с 11 месяцев в 1984 г. до 4 6 месяцев в 1997 г.
При поиске лекарств применяли различные стратегии, которые привели к нескольким классам лекарств, таким как блокаторы протеаз, ингибирующие протеазу, которая требуется вирусу для репликации, и лекарства, ингибирующие обратную транскриптазу вируса, которая существенна для репликации ретровирусов. Совсем недавно разработанная группа активных агентов представляла собой ингибиторы слияния, которые должны предотвращать слияние вируса с клетками-хозяевами. Выло показано также, что предоставление интерлейкина-2 в сочетании с другими активными агентами может повышать силу иммунного ответа.
Ингибиторы входа блокируют присоединение вирусных частиц ВИЧ к клеткам крови с помощью блокирования одной из молекулярных стадий, происходящих при прикреплении вируса к клетке-хозяину и входе в клетку-хозяина. Важной стадией является связывание ВИЧ с одним из главных корецепторов хемокинов CCR5 и CXCR4 (СС рецептор хемокинов 5 и CXCR рецептор хемокинов 4). Эти корецепторы локализованы на поверхности клеток крови и требуются для связывания белков оболочки ВИЧ перед внедрением вируса. Другая стадия взаимодействия вируса с клетками, требуемая для входа, представляет собой связывание белка оболочки ВИЧ др120 с клеточными рецепторами CD4. Эти стадии часто обозначаются как прикрепление вирусной частицы к клеткам-мишеням. Блокирование связывания ВИЧ с корецепторами хемокинов, как показано, подавляет вход вируса (Strizki J.M., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2001, 98, 12718-12723). To же самое происходит, как сообщалось, при блокировании взаимодействия др1120 с рецепторами CD4 (Lin et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 2003,100, 11013-11018). Белок gp41 также был признан как
потенциальная мишень для разработки лекарства против ВИЧ (Gordon et al., AIDS Research and Human Retroviruses 11,677686, 1995). Первый одобренный гибридный ингибитор представляет собой энфувирид (Т-20, Fuzeon, DP178) (патенты W0 01/51673 А2; WO 96/40191; Cervia J.S. et al., Clin. Infect. Dis, 2003, 37, 1102-1106; Kilby J.M., Nature Medicine, 1998, 4, 1302-1307). Этот гибридный ингибитор идентичен части белка др41 оболочки ВИЧ, названной HR-2, и ингибирует слияние ВИЧ-клеток путем связывания с сегментом HR-1 (HR = семичленный повтор) др41, таким образом предотвращая связывание HR-2 с сегментом HR-1 др41, что, в свою очередь, предотвращает образование шестиспирального пучка, требуемого для слияния вирусной частицы и клетки крови. Не было показано, что Т-20 связывает сегменты белка, отличные от HR-1 др41 ВИЧ, или даже другие молекулы вирусного или эукариотного происхождения. Другой агент с биологической активностью против ВИЧ описан недавно в патенте WO 01/34 640. Раскрывается пептид из 20 аминокислот, названный VI RIP (ингибирующий вирус пептид), который выделен из гемофильтрата человека, и обнаружено, что он ингибирует инфицирование клеток человека ВИЧ. Синтетические производные VIRIP с биологической активностью против ВИЧ раскрыты в патенте WO 2004/056871.
Несмотря на эти попытки и различные доступные лекарства, проблема остается нерешенной, так что все еще нет лечения против СПИДа, потому что известные лекарства, хотя и способны существенно снижать уровень ВИЧ в организме и инфицированных ВИЧ клетках крови, не удаляют вирус полностью. Конкретное препятствие заключается в том, что ВИЧ особенно склонен к мутациям, которые часто ведут к развитию устойчивости против определенных лекарств. В целом известные лекарства являются достаточно эффективными, только если они вводятся в сочетании с другими лекарствами. Такая комбинированная терапия в настоящее время увеличивает продолжительность жизни среднего больного, не обеспечивая излечение, и обычно сопровождается тяжелыми побочными эффектами и часто не позволяет больному вести "нормальную" жизнь.
В медицине существует огромная потребность в обеспечении новыми лекарствами и усовершенствованными лекарствами, которые будут вести к улучшенному лечению, меньшим побочным эффектам и существенному увеличению средней продолжительности жизни инфицированных ВИЧ перед или после проявления СПИДа.
Настоящее изобретение обращено к проблеме обеспечения новыми лекарствами, которые будут преодолевать проблемы, описанные выше, и предоставят эффективное лечение или внесут вклад в эффективную сочетанную терапию.
Краткое изложение сущности изобретения
Неожиданно проблема решается с помощью олигомерных пептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые взаимодействуют, по меньшей мере, с гибридным белком др41 ВИЧ. Гибридный пептид представляет собой самую аминоконцевую часть др41, состоящую из приблизительно 30 аминокислотных остатков. В настоящей модели гидрофобный гибридный пептид др41 служит в качестве якоря, связывающего вирусную частицу с мембраной клетки-хозяина (Dimitrov A.S. et al., Biochemistry, 2003, 42, 14150-14158; Mobley et al., Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1418, 1-18), и пептиды настоящего изобретения вмешиваются в процесс вхождения ВИЧ в клетку, и, таким образом, предотвращают вхождение вируса.
Пептиды настоящего изобретения представляют собой пептиды, проявляющие биологическую активность против инфицирования ВИЧ, включающие мономерные пептидные цепи с аминокислотной последовательностью (Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-
X11-X12-X13-X14-X15-Z2) ПЛ
где
п указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;
Xi представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;
Х2 представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Х3 представляет собой серии, цистеин, лизин или глицин; Х4 представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин;
Х5 представляет собой пролин, D-пролин или замещенный L-или D-пролин;
Хб представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;
Х7 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;
Хв представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;
Хд представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;
Хю представляет собой глицин, аланин или аспарагин;
Хц представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;
Х12 представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту;
Х13 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;
Xi4 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;
Х15 представляет собой фенилаланин или удален;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированкые, сульфатированные,
пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты,
и при условии, что
(a) если Xi2 представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту, то Х13, Х14 и Xi5 представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или
(b) если Х12 представляет собой фенилаланин, то Х13, Xi4 и
Xi5 представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и
(c) в пептиде существует максимально три цистеиновых остатка; и
(d) олигомерный пептид не представляет собой (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVFh (VIR-576);
(e) мономерные пептидные иепи не связаны пептидными связями между N-концом одной пептидной цепи и С-концом другой пептидной цепи.
В предпочтительном осуществлении указанного выше пептида с общей формулой (Z1-LE-XX-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-XH-X12-Xi3~Xi4-Xi5-Z2) п/ Х7 представляет собой фенилаланин, цистеин, валин, изолейцин, лейцин, 3,3-дифенилаланин, 1-нафтилаланин или п-фторфенилаланин; Х8 представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин, триптофан, глицин, цистеин, D-1,2,3,4-
тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту или L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту; Хд представляет собой фенилаланин или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту; и Zi предпочтительно представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Z2 предпочтительно представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков. Биологическая активность против ВИЧ инфекции указанных выше пептидов при измерении как 1С50 равна или ниже 6500 нМ.
Дополнительное осуществление пептидов по изобретению с биологической активностью против инфицирования ВИЧ представляет собой такое, где пептиды имеют аминокислотную
последовательность
(Zi-LE-Xi-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-Xio-K-Xii-FVF-Z2)n,
где
п указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;
Xi представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;
Хг представляет собой цистеин, метионин или изолейцин;
Хз представляет собой серии, цистеин или глицин;
Х4 представляет собой изолейцин или цистеин;
Х5 представляет собой пролин, D-пролин или любой замещенный L- или D-пролин;
Хб представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;
Х7 представляет собой фенилаланин, цистеин, валин, изолейцин или 3,3-дифенилаланин;
Хе представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин, глицин, цистеин, D-1,2,3, 4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту или L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту;
Хд представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;
Хю представляет собой глицин или аспарагин;
ХЦ представляет собой пролин или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные,
пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.
В предпочтительном осуществлении указанного выше олигомерного пептида с общей формулой (Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-Xi0-K-Xii-FVF-Z2) n, Xg представляет собой фенилаланин или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту, Zi представляет собой предпочтительно NH2 или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Z2 представляет собой предпочтительно СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков. Биологическая активность против ВИЧ инфекции указанного выше олигомерного пептида при измерении как 1С50 равна или ниже 2000 нМ.
Еще одно осуществление олигомерных пептидов по изобретению с биологической активностью против инфицирования ВИЧ
представляет собой такое, где пептиды имеют аминокислотную последовательность
(Zi-LE-Xi-ip-x2-x3-ip-X5-x6-X7-x8-F-Xi0-KPFVF-z2)n,
где
п указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;
Xi представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;
Х2 представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Х3 представляет собой серии или глицин;
Х5 представляет собой L-пролин, D-пролин или любой замещенный L- или D-пролин
Х6 представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;
Х7 представляет собой фенилаланин или валин;
Х8 представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин или L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту;
Хю представляет собой глицин или аспарагин;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные,
пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.
В предпочтительном осуществлении олигомерного пептида с общей формулой (Zi-LE-Xi-IP-X2-X3-IP-X5-X6-X7-X8-F-Xio-KPFVF-Z2)n, Zi представляет собой предпочтительно NH2 или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Z2 представляет собой предпочтительно СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков. Биологическая активность против ВИЧ инфекции пептида при измерении как IC50 равна или ниже 800 нМ.
Еще одно осуществление олигомерных пептидов изобретения с биологической активностью против инфицирования ВИЧ представляет собой такое, где пептиды имеют аминокислотную
последовательность
(Z1-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNK?FVF-Z2)n, где
п указывает число мономерных пептидных цепей, в соответствии с чем п равно 2, 3 или 4;
Х2 и Хб представляют собой цистеины или Х2 представляет собой метионин и Х6 представляет собой глутаминовую кислоту
Х5 представляет собой D-пролин или L-пролин;
Х8 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или лизин;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированкые, сульфатированные,
пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты,
при условии, что, по меньшей мере, имеет место одно из следующего:
Х2 и Х6 представляют собой цистеины; или
Х5 представляет собой D-пролин; или
Х8 не является лизином.
В предпочтительном осуществлении пептида с общей формулой (Z1-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNKPFVF-Z2)n, Zi представляет собой предпочтительно NH2 или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков, и Z2 представляет собой предпочтительно СООН или последовательность из от 1 до 3 аминокислотных остатков.
Предпочтительно в олигомерных пептидах изобретения цепи мономерных пептидов поперечно сшиты. Они могут быть поперечно сшиты с помощью либо прямых межмолекулярных связей между двумя боковыми цепями аминокислот двух мономерных пептидов, либо между боковой цепью аминокислоты одного мономерного пептида и N- или С-концом другого мономерного пептида. В другом
осуществлении изобретения связи представляют собой непрямые связи посредством бифункциональных линкерных молекул.
Осуществление олигомерных пептидов настоящего изобретения является также таковым, где цистеиновые остатки в мономерных пептидных цепях в положениях 6 и 11, б и 12, 7 и 12 или 8 и 13 связаны с помощью межмолекулярной дисульфидной связи. Таким образом, олигомерные пептиды с цистеиновыми остатками в этих положениях могут существовать с межмолекулярным мостиком между этими остатками одной мономерной пептидной цепи или с дисульфидными связями между мономерными пептидными цепями, т.е. олигомеризация достигается за счет дисульфидных связей. Таким образом, осуществлением являются также те олигомерные пептиды, где каждая мономерная пептидная цепь включает два цистеиновых остатка, где олигомеризация достигается посредством двух цистеиновых остатков, которые связаны дисульфидными связями с двумя цистеиновыми остатками второй мономерной пептидной цепи, что ведет к гомодимеру, включающему две мономерные полипептидные цепи, связанные посредством двух дисульфидных мостиков. Осуществлением являются также олигомерные пептиды с тремя цистеинами в каждой мономерной пептидной цепи, где два цистеиновых остатка в каждой мономерной единице вовлечены в межмолекулярную дисульфидную связь, и третий цистеин в каждой мономерной пептидной цепи принимает участие в олигомеризации путем образования дисульфидной связи с цистеиновым остатком мономерной цепи, не участвующей в межмолекулярной дисульфидной связи. Дополнительным осуществлением являются олигомерные пептиды с одним цистеиновым остатком в каждой мономерной пептидной цепи, где указанные цистеиновые остатки связаны друг с другом с помощью дисульфидной связи, связывая, таким образом, мономерные пептидные цепи олигомерного пептида. Гомодимер, образованный таким путем, предпочтителен. В другом осуществлении олигомерных пептидов с цистеиновыми остатками в каждой мономерной пептидной цепи, по меньшей мере, один цистеиновый остаток в каждой мономерной пептидной цепи поперечно сшит посредством бифункциональной небольшой органической спейсерной группы, содержащей две тиоловые группы,
с цистеиновым остатком в другой мономерной пептидной цепи олигомерного пептида. Димеры являются предпочтительным осуществлением олигомерных пептидов, включающих, по меньшей мере, один цистеиновый остаток.
Еще одним осуществлением является олигомерный пептид, включающий, по меньшей мере, одну из описанных выше черт, где, по меньшей мере, в одной из мономерных пептидных цепей олигомерного пептида остаток лейцина в аминокислотном положении 1, и глутаминовая кислота в аминокислотном положении 2, ковалентно связаны N-алкилированной амидной связью или сложной эфирной связью, или восстановленной пептидной связью, или ретро-инверсной пептидной связью, или N-алкилированной ретро-инверсной пептидной связью. Предпочтительными являются димеры, где остаток лейцина в аминокислотном положении 1, и глутаминовая кислота в аминокислотном положении 2, ковалентно связаны N-алкилированной амидной связью или сложной эфирной связью, или восстановленной пептидной связью, или ретро-инверсной пептидной связью, или N-алкилированной ретро-инверсной пептидной связью.
Осуществлением является также олигомерный пептид, по меньшей мере, с одной из описанных выше черт, включающий 2, 3 или 4 повторяющиеся единицы мсномерной пептидной цепи в линейном порядке, где мономерные пептидные цепи ковалентно связаны посредством непрямой пептидной связи между Z2 и Zx последовательных мономерных пептидных цепей. Непрямая пептидная связь возникает, если небольшой органический бифункциональный спейсер с аминогруппой и карбоксильной группой связывает Z2 с Zi последовательных мономерных пептидных цепей. В таком линейном олигомерном пептиде с непрямой пептидной связью повторяющиеся единицы либо все являются идентичными мономерными пептидными цепями, приводя к гомогенному олигомерному пептиду, либо повторяющиеся единицы выбраны из различных мономерных пептидных цепей, так что тетрамер может включать 1, 2, 3 или 4 неидентичные мономерные пептидные цепи, тример - 1, 2 или 3 неидентичные мономерные пептидные цепи, или димер - 2 неидентичные мономерные пептидные цепи, приводя к гетерогенному
олигомерному пептиду. Предпочтительные линейные олигомерные пептиды с непрямой пептидной связью представляют собой таковые с двумя повторяющимися единицами, т.е. димеры. Осуществлением являются также циклические олигомерные пептиды, в частности таковые с 2, 3 или 4 мономерными пептидными цепями. Одна форма циклического олигомерного пептида включает повторяющиеся единицы мономерной пептидной цепи, где первая и все последующие мономерные пептидные цепи ковалентно связаны посредством прямой или непрямой пептидной связи между Z2 и Ъ\ последовательных мономерных пептидных цепей, и существует, по меньшей мере, одна дополнительная ковалентная связь между первой и второй, и/или первой и третьей, и/или первой и четвертой мономерными пептидными цепями, и/или второй с третьей, и/или второй с четвертой мономерными пептидными цепями, и/или третьей с четвертой мономерными пептидными цепями. По меньшей мере, одна дополнительная ковалентная связь может быть выбрана из группы амидных связей, в частности пептидных связей, таких как существующие между боковыми цепями аминокислотных остатков кислых и основных аминокислот, или аминоконцом первой мономерной пептидной цепи и карбоксиконцом последней мономерной пептидной цепи, оксимных связей, гидразоновых связей, тиазолидиновых связей, тиоэфирных связей, простых эфирных связей и дисульфидных связей между остатками цистеина и т.д.
Дополнительным осуществлением в соответствии с изобретением является любой из описанных выше линейных олигомерных пептидов, включающий в себя, по меньшей мере, один цистеиновый остаток, который либо образует прямую дисульфидную связь с цистеиновым остатком другого олигомерного пептида, включая линейный олигомерный пептид, по меньшей мере, с одним цистеиновым остатком, или где указанные цистеиновые остатки связаны друг с другом через короткий органический бифункциональный спейсер с двумя тиоловыми группами. Вместо или в дополнение к дисульфидному мостику между описанными выше линейными олигомерными пептидами и другим олигомерным пептидом связь между этими пептидами устанавливается через, по меньшей мере, одну амидную связь, образованную между одной
карбоксильной группой и одной аминогруппой аминокислотных остатков с кислой и основной боковыми цепями, соответственно. Указанные кислые и основные боковые цепи могут альтернативно связываться через короткий органический бифункциональный спейсер, включающий аминогруппу, а также карбоксильную группу.
Дополнительное осуществление олигомерных пептидов по изобретению является таковым, где мономерные пептидные цепи ковалентно связаны друг с другом через, по меньшей мере, одну амидную связь между двумя мономерными пептидными цепями, что достигается с помощью ковалентной связи между аминогруппой боковой цепи основной аминокислоты в одной мономерной пептидной цепи и карбоксильной группой боковой цепи кислой аминокислоты в другой мономерной пептидной цепи. В частности, такие амидные связи могут образовываться между боковыми цепями остатка лизина и боковой цепью остатка аспартата, и/или между боковыми цепями остатка лизина и остатка глутамата. В дополнительном осуществлении олигомеризация этих пептидных цепей достигается непрямо с помощью бифункциональной небольшой органической спейсерной группы, содержащей одну аминогруппу и одну карбоксильную группу, которая поперечно сшивает эти мономерные пептидные цепи с помощью ковалентного связывания ее аминогруппы с карбоксилом боковой цепи кислой аминокислоты одной пептидной цепи и ее карбоксильной группы с аминогруппой боковой цепи основной аминокислоты второй пептидной цепи. Тетрамеры, тримеры и димеры могут быть образованы посредством прямой или непрямой амидной связи между боковыми цепями кислых и основных аминокислот мономерных пептидных цепей, где димеры являются предпочтительным осуществлением. Осуществлением являются также олигомерные пептиды, которые содержат до четырех пептидных цепей, ковалентно связанных пептидной связью через их карбоксиконец с аминогруппами аминокислоты, содержащей две аминогруппы, такой как лизин и низшие производные лизина. Дополнительное осуществление представляет собой олигомерный пептид, который включает две или четыре мономерные пептидные цепи и, по меньшей мере, одно лизиновое ядро, которое ковалентно связывает мономерные пептидные цепи. Лизиновое ядро
функционирует в качестве линкерной молекулы (которая может быть также описана как спейсер) и имеет формулу "КХ", где "X" представляет собой либо аминокислоту, полиэтиленгликольную группу, либо отсутствует, т.е. "X" пропущен. Лизиновое ядро связывает две мономерные пептидные цепи путем образования двух пептидных связей с карбоксиконцами каждой мономерной пептидной цепи. Предпочтительной аминокислотой в лизиновом ядре является аланин, и предпочтительной полиэтиленгликольной группой является мини-ПЭГ. Лизиновое ядро может быть связано через аминокислоту с аминогруппами в ее боковых цепях, такими как остаток лизина или низший гомолог лизина, с другим лизиновым ядром посредством пептидной связи. Если оба лизиновых ядра ковалентно связывают две мономерные пептидные цепи, полученный олигомерный пептид включает 4 мономерные пептидные цепи. Лизиновое ядро также относится к дендримерной структуре, и мономерные пептидные цепи, как говорится, связываются с дендримерной структурой лизинового ядра. Дополнительным осуществлением являются олигомерные пептиды по изобретению, где мономерные пептидные цепи связаны через, по меньшей мере, одну оксимную, гидразоновую и тиазолидиновую связь, с применением реакционноспособных боковых цепей природных и неприродных аминокислот. Оксимные и гидразоновые связи могут возникать между альдегидной функциональной группой, образованной из аминокислоты с гидроксильной группой в боковой цепи, такой как серии, и гидроксиламиновой или гидразиновой боковой цепью, введенной через специальные аминокислоты, такие как аминооксиуксусная кислота, аминосерин или гидразинкарбоновая кислота. Образование тиазолидина может происходить между N-концевым остатком цистеина и альдегидными боковыми цепями (примеры: Chan W.C. et al. (editors), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000, p 243-263; Novabiochem 2004/5 Catalogue, Reagents for Peptide and High-Throughput Synthesis, p.5.2-5.3). Осуществлением согласно изобретению является также олигомерный пептид, в котором каждая мономерная пептидная цепь включает, по меньшей мере, один аминокислотный остаток с атомом серы в
боковой цепи, определяющий возможность ковалентной связи между мономерными пептидными цепями посредством тиоэфирного мостика. Среди тех олигомерных пептидов, которые связаны через, по меньшей мере, один тиоэфирный мостик, предпочтительны те, в которых связаны две мономерные пептидные цепи, т.е. димеры. Те олигомерные пептиды, в которых мономерные пептидные цепи связаны друг с другом через бифункциональную спейсерную молекулу, выбранную из группы органических спейсеров с двумя тиоловыми группами, органических спейсеров с двумя аминогруппами, органических спейсеров с двумя карбоксильными группами и органических спейсеров с одной карбоксильной группой и одной аминогруппой, являются дополнительным предпочтительным осуществлением; особенно олигомерные пептиды с двумя мономерными пептидными цепями, т.е. димеры.
Дополнительным осуществлением согласно изобретению являются олигомерные пептиды, которые взаимодействуют с гибридным пептидом др41 ВИЧ, характеризуемые 1С50, равной или ниже 6500 нМ, такие как VIR-574 (SEQ ID NO. 2) или VIR-577 (SEQ ID NO. 3) , предпочтительно 1С5о, равной или ниже 2000 нМ, и наиболее предпочтительно 1С50, равной или ниже 800 нМ, такие как VIR-673 (SEQ ID NO. 4) с 1С50 607 нМ. Осуществлениями согласно изобретению являются также нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов настоящего изобретения, за исключением тех нуклеиновых кислот, которые уже раскрыты в патенте WO 2004/056871. Таким образом, нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные пептидные цепи VIR-674, VIR-675, VIR-676, VIR-677, VIR-678, VIR-679, VIR-680, VIR-681, VIR-682, VIR-683, VIR-684, VIR-685, VIR-686, VIR-687, VIR-688, VIR-689, VIR-690, VIR-691, VIR-692, VIR-693 и VIR-694, которые соответствуют VIR-166, VIR- 175, VIR-261, VIR-273, VIR-274, VIR-344, VIR-345, VIR-348, VIR-352, VIR- 353, VIR357, VIR-358, VIR-448, VIR-449, VIR-454, VIR-455, VIR-483, VIR- 484, VIR-512, VIR-568 и VIR-580, соответственно, в патенте WO 2004/056871, не являются частью изобретения. Дополнительными осуществлениями являются антитела, специфически связывающиеся с этими олигомерными пептидами изобретения. Антитела являются
специфическими, так как они узнаю1:? олигомерные пептиды, но не выделенные мономерные пептидные цепи. Следовательно, сайт, связывающийся с антителом, включает часть молекулы, которая отлична от одной единичной мономерной цепи. Например, связывающий сайт может включать связь между двумя мономерными пептидными цепями.
Дополнительным осуществлением является лекарство, включающее любые из этих олигомерных пептидов, нуклеиновых кислот, за исключением тех, которые не заявляются, кодирующих мономерные пептидные цепи этих олигомерных пептидов, или специфических антител, направленных против этих олигомерных пептидов. В одном осуществлении лекарство находится в фармацевтических составах для перорального, внутривенного, внутримышечного, интраназального, внутрикожного, подкожного и/или внутриоболочечного введения. Дополнительным
осуществлением является указанное лекарство, включающее, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент. Осуществлением также является лекарство, в котором указанный, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор вирусных протеаз, ингибитор обратной транскриптазы, ингибитор слияния, цитокин, ингибитор цитокинов, ингибитор интегразы, ингибитор гликозилирования или ингибитор мРНК вируса и т.д. Применение этих олигомерных пептидов для получения лекарства для лечения ВИЧ инфекций представляет собой дополнительное осуществление. Осуществлением является также тест для определения молекул, способных взаимодействовать с гибридным белком ВИЧ, включающим любой из указанных выше олигомерных пептидов изобретения. Применение этих олигомерных пептидов в указанном тесте также представляет собой осуществление. Дополнительным осуществлением является диагностический агент, включающий любые из описанных выше олигомерных пептидов, нуклеиновых кислот или антител, за исключением тех, которые не заявляются. Еще одним осуществлением является применение диагностического агента для тестирующих систем для тестирования уровней ВИЧ инфекции в выделенных плазме, ткани, моче, семенной жидкости и/или
цереброспинальной жидкости.
Подробное описание изобретения
Олигомерные пептиды настоящего изобретения относятся к происходящему из гемофильтрата пептиду VIRIP (SEQ ID No. 1) , как раскрыто и описано в патенте WO01/34640, и пептидам, раскрытым и описанным в патенте РСТ/ЕРОЗ/15654, которые обладают биологической активностью в отношения предотвращения инфицирования ВИЧ. Пептиды настоящего изобретения отличаются от пептидов, раскрытых и описанных в патентах WO01/34640 РСТ/ЕРОЗ/15654, тем, что все они представляют собой олигомерную структуру, состоящую из, по меньшей мере, двух одинарных мономерных пептидных цепей.
Мономерные пептидные цепи связываются, по меньшей мере, одной ковалентной связью. Ковалентные связи могут представлять собой дисульфидную связь, амидную связь, в частности, пептидную связь, тиоэфирную связь, простую эфирную связь или оксимную, гидразоновую или тиазолидиновую связь. Для создания олигомерного пептида изобретения мономерные пептидные цепи олигомеризуют с помощью связывания, по меньшей мере, двух одинарных мономерных пептидных цепей с применением реакционноспособных групп боковых цепей аминокислот или концевых функциональных групп. Одинарные пептидные цепи либо синтезируются химически, либо продуцируются биотехнологически, т.е. с помощью экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих эти одинарные пептидные цепи, в микроорганизмах, таких как бактерии, например, Е. coli, в грибах, например, дрожжах, и/или в клетках млекопитающих в культуре, и затем ковалентно связываются с получением олигомеров. Олигомерные пептиды могут быть также синтезированы в виде дендримерных структур, которые содержат аминокислоты или группу, содержащую, по меньшей мере, две аминогруппы, к которым присоединяют мономерные пептидные цепи с применением способов твердофазного пептидного синтеза. Примерами таких групп являются орнитин, лизин, диаминомасляная кислота и диаминопропионовая кислота (Novabiochem 2004/5 Catalogue, Reagents for Peptide and High- Throughput Synthesis, p.26-29).
Олигомерные пептиды изобретения включают также полипептиды, которые собраны линейно из повторяющихся единиц мономерных пептидных цепей через непрямые пептидные связи, где повторяющиеся единицы соответствуют мономерным пептидным цепям. Непрямая пептидная связь возникает, если небольшой органический бифункциональный спейсер с аминогруппой и карбоксильной группой связывает Z2 с Zi последовательных мономерных пептидных цепей. Олигомерный пептид с последовательностью
(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2 (VIR-576), раскрытый в патенте РСТ/ЕРОЗ/15654, где димеризация достигается посредством дисульфидной связи между остатками цистеина в положении 6 двух мономерных пептидных цепей, не является олигомерным пептидом по изобретению. Однако димер с (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2 (SEQ ID: N0. 56) , где димеризация достигаемся любым другим способом, в частности через любой один из глутаматных остатков и небольшой бифункциональный линкер с двумя аминогруппами, который связывает две мономерные цепи путем образования двух амидных связей на глутаматных остатках, является частью настоящего изобретения. Частью настоящего изобретения является также димер с последовательностью (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2 (SEQ ID: N0. 57), где димеризация достигается через остаток лизина в аминокислотном положении 16 и небольшой бифункциональный линкер с двумя карбоксильными группами, который связывает две мономерные цепи путем образования двух амидных связей на двух остатках лизина.
Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов по изобретению все отличаются от VIRIP дикого типа (SEQ ID N0. : 1), по меньшей мере, в аминокислотном положении 13, где VIRIP содержит остаток лизина, тогда как мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов настоящего изобретения не содержат остатка лизина в аминокислотном положении 13. В дополнение к этому, мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов настоящего изобретения имеют дополнительные изменения аминокислот среди их 20 или 21 аминокислоты по сравнению с VIRIP (SEQ ID N0.: 1). Все олигомерные пептиды настоящего изобретения обладают существенно более высокой активностью против ВИЧ (измеряемой по
1С5о против двух штаммов ВИЧ-1) , чем VIRIP (SEQ ID NO. 1). Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов изобретения основаны на аминокислотной последовательности из 20 или 21 аминокислоты с возможными расширениями от 1 до 10 аминокислот на обоих концах, соответственно ZL и Z2, где расширение из 3 аминокислот предпочтительно. Применяемая здесь нумерация аминокислот всегда соответствует аминокислотам с 1 по 21 основной последовательности безотносительно к возможному N-концевому расширению, обусловленному остатком Zi, так что аминокислотное положение 1 соответствует лейцину и аминокислотное положение 21 - фенилаланину или отсутствует. Применяются обычные одно- или трехбуквенные коды аминокислот. Если не указано иначе, используются L-энантиомеры аминокислот. Строчная буква "р" обозначает D-пролин. Другие D-энантиомеры указаны приставкой "D-". "Tic" обозначает
тетрагидроизохинолинкарбоновую кислоту. "0ic" обозначает октагидроиндолкарбоновую кислоту.
Термин "олигомерный пептид" относится к пептиду, включающему, в частности, две, три или четыре мономерные пептидные цепи, которые ковалентно связаны друг с другом. Предпочтителен димер, который представляет собой олигомерный пептид, образованный двумя ковалентно связанными мономерными пептидными цепями. Указанный димер" включает, по меньшей мере, одну ковалентную связь между мономерными пептидными цепями, но может также иметь больше ковалентных связей. Олигомерный пептид с тремя мономерными пептидными цепями называется тримером. Олигомерный пептид с четырьмя мономерными пептидными цепями называется тетрамером. В тримерах минимальное количество соединяющих ковалентных связей составляет, по меньшей мере, две, но может быть выше, и тетрамеры должны включать, по меньшей мере, три ковалентные связи.
Термин "мономерная пептидная цепь" относится к пептидной единице олигомерного пептида и представляет собой аминокислотную последовательность из 20 или 21 аминокислоты с возможными расширениями от 1 до 10 аминокислот на обоих концах, соответственно Ъ\ и Z2, где расширение из 3 аминокислот
предпочтительно. Олигомерный пептид изобретения включает п мономерных пептидных цепей.
Термин "олигомерный пептид", который обозначается формулой (последовательность)п, относится к молекуле, образованной п пептидами, ковалентно связанными друг с другом. При применении здесь ясно, что "олигомерный пептид" не ограничивается конкретным типом связи между мокомерными пептидными цепями. Связь может быть, например, цистеиновым мостиком или связью с участием боковой цепи лизина. Термин "олигомерный пептид" и формула (последовательность)п в контексте изобретения, таким образом, не понимается в том смысле, что п мономеров аминокислот все соединены с помощью традиционных пептидных связей между N- и С-концом.
Термин "поперечно сшитый" относится к любой межмолекулярной ковалентной связи между двумя мономерными пептидами, которая отличается от традиционной пептидной связи между N-концом одного мономерного пептида и С-концом другого мономерного пептида.
Термин "ковалентно связанный" вполне понятен специалисту в данной области техники и относится к связям, таким как амидные, тиоловые тиоэфирные, оксимные, гидразоновые и тиазолидиновые связи, которые вводятся для создания олигомерного пептида. В частности, это относится к двум, трем или четырем мономерным пептидным цепям, ковалентно связанным друг с другом, с созданием, таким образом, димеров, тримеров и тетрамеров, соответственно. Олигомерные пептиды изобретения описываются как "ковалентно связанные", однако это не требует того, чтобы каждая мономерная пептидная цепь олигомерного пептида должна быть связана с каждой другой мономерной пептидной цепью в олигомерном пептиде; димеры ковалентно связаны с помощью, по меньшей мере, одной из перечисленных выше химических связей; тримеры ковалентно связаны с помощью, по меньшей мере, двух из перечисленных выше химических связей; таким образом, для первой мономерной пептидной цепи достаточно быть связанной со второй мономерной пептидной цепью, а для второй - быть связанной с третьей мономерной пептидной цепью; тетрамеры ковалентно
связаны с помощью, по меньшей мере, трех из перечисленных выше химических связей, таким образом, для первой мономерной пептидной цепи достаточно быть связанной со второй мономерной пептидной цепью, а для второй -- быть связанной с третьей мономерной пептидной цепью, и для третьей мономерной пептидной цепи достаточно быть связанной с четвертой мономерной пептидной цепью. Мономерные пептидные цепи в олигомерном пептиде могут иметь идентичную или различную аминокислотную
последовательность. Олигомерные пептиды, созданные из идентичных мономерных пептидных цепей, обозначаются так же, как "гомогенные" олигомерные пептиды, и в случае димеров они обозначаются так же, как "гомодимеры". Если мономерные пептидные цепи в олигомерном пептиде отличаются, к олигомерному пептиду и его мономерным пептидным цепям применяется термин "гетерологичный". Ковалентная связь может быть "прямой связью" между соответствующими пептидными цепями, такой как дисульфидная связь, тиоэфирная связь, простая эфирная связь, амидная связь, оксимная связь, тиазолидиновая связь, гидразоновая связь, т.е. без спейсерной молекулы мостика. Пептидные цепи могут быть также ковалентно связаны с помощью спейсера любой химической природы (Houben-Weyl, Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2002), тогда говорится, что мономерные пептидные цепи связаны "непрямой связью". Предпочтительны небольшие органические бифункциональные спейсеры, такие как таковые с двумя тиоловыми группами, с двумя аминогруппами, с двумя карбоксильными группами и таковые с одной карбоксильной группой и одной аминогруппой.
Применяемый здесь термин "гидрофобная аминокислота" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к любой из существующих в природе аминокислот -глицину, аланину, валину, лейцину, изолейцину, метионину, пролину, фенилаланину, тирозину, триптофану и к неэндогенным гидрофобным аминокислотам. Сходные синтетические неэндогенные аминокислоты, имитирующие поведение существующих в природе аминокислот, могут быть также применены в той мере, если
биологическая активность против ВИЧ существенно не снижается.
Применяемый здесь термин "ароматические аминокислоты" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к любой из аминокислот - фенилаланину, тирозину, триптофану, гистидину и к неэндогенным ароматическим аминокислотам, таким как 1-нафтилаланин, 3,3-дифенилаланин, п-фторфенилаланин или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновая кислота или L-1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновая кислота и т.д. Сходные синтетические неэндогенные аминокислоты, имитирующие поведение таких аминокислот, могут быть также применены в той мере, если биологическая активность против ВИЧ существенно не снижается.
Термин "боковая цепь кислой аминокислоты" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к карбоксильной кислотной боковой цепи глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты и любой другой природной или неприродной аминокислоты, несущей карбоновую кислоту в качестве функциональной группы боковой цепи, такой как 2-аминоадипиновая кислота.
Термин "боковая цепь основной аминокислоты" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к аминогруппе боковой цепи лизина, орнитина или любой другой природной или неприродной аминокислоты, несущей аминогруппу в качестве функциональной группы боковой цепи, такой как диаминопропионовая кислота. Также аминокислоты с основными боковыми цепями, которые относятся к настоящему изобретению, представляют собой низшие производные лизина, которые обладают укороченной боковой цепью только из трех, двух или только одного углеродного атома (по сравнению с лизином), которые несут аминогруппу.
Термин "неприродная аминокислота" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к любой аминокислоте, которая не принадлежит к 20 эндогенно существующим аминокислотам, которые представляют собой: глицин, цистеин, аланин, валин, лизин, лейцин, изолейцин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, глутамин, аспарагин, аргинин,
гистидин, тирозин, фенилаланин, триптофан, серии, треонин, пролин и метионин.
Термин "мутанты" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к вариантам последовательностей, в которых одна или более аминокислот, как раскрыто, заменены, т.е. одна или более аминокислот заменены другой аминокислотой; в частности, если один или более заместителей аминокислот представляют собой D-форму замещенной аминокислоты, и биологическая активность олигомерного пептида существенно не снижается по сравнению с незамещенным олигомерным пептидом. Введение D-аминокислот может быть полезным, например, для улучшения устойчивости к действию протеолитических ферментов. Мутанты изобретения предпочтительно отличаются от олигомерного пептида по п. 1 по одной, двум, трем или четырем аминокислотам. В предпочтительном осуществлении мутации являются консервативными, мак что свойства боковой цепи измененных аминокислот не отличаются существенно от исходной аминокислоты. Мутанты включают также варианты
последовательностей, где одна или более аминокислот удалены из последовательности или вставлены в последовательность.
Термин "фрагменты" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к вариантам последовательностей, в которых последовательность укорочена с N- или С-конца. В предпочтительных осуществлениях у олигомерных пептидов отсутствует до 2, 4 или 6 аминокислот с N- или С-конца.
Термин "производное" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к химически модифицированному олигомерному пептиду. Эта модификация может представлять собой аминокислотную замену, множественные замены или различные химические модификации пептида на N- или С-конце, в боковых цепях пептида, в Са- и Na-атомах пептидного остова и атомах, образующих пептидные связи остова.
Термин "амидированный" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к модификации олигомерного пептида, при которой С-концевая карбоксильная
группа замещена CONR2-группой, где R представляет собой атом водорода или любую функциональную группу, которой можно заместить, по меньшей мере, один из атомов водорода.
Термин "ацилированный" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые содержат ковалентно связанный остаток карбоновой кислоты, отличный от аминокислоты у аминогрупп на N-конце и/или у боковых цепей аминогрупп.
Термин "алкилированный" впслне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые модифицированы алкильной группой различной длины и структуры у N-концевой аминогруппы, у любого атома остова и/или у любой функциональной группы боковой цепи.
Термин "сульфатированный" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, несущим сульфатную часть у гидроксильной группы тирозина или замещенного производного тирозинового остатка.
Термин "пэгилированный" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к пептидам, которые содержат ковалентно связанную полиэтиленгликольную (ПЭГ) часть, состоящую из, по меньшей мере, двух повторяющихся единиц -СН2-СН2-О-, типичных для полиэтиленгликоля. Предпочтительной является так называемая мини-ПЭГ группа. Пэгилированные группы могут иметь молекулярную массу до 20 кДа и могут связываться с различными функциональными группами в пептидной последовательности прямо или через спейсерную группу у N- или С-конца и/или у функциональных групп боковых цепей. Спейсерную группу выбирают из группы бифункциональных углеводородных цепей, характеризуемых остовом из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или девяти атомов углерода, и двумя функциональными группами, такими как две аминогруппы, две карбоксильные группы или одна аминогруппа и одна карбоксильная группа. Одна или более пэгилированных групп могут содержаться у различных сайтс> в пептида. В частности, предпочтительным является мини-ПЭГ на С-концевой стороне пептида, за которой следует остаток цистеина.
Термин "фосфорилированный" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, у которых гидроксильные группы боковых цепей треонина, серина, гидропролина, гидроксилизина, тирозина и/или любой другой неприродной гидроксиаминокислоты этерифицированы фосфатной группой.
Термин "гликозилированный" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые содержат мономерную и/или олигомерную углеводную часть, которая связана посредством гликозильной или спиртовой гидроксильной группы с боковыми цепями серина, треонина, тирозина, аспарагина и/или неприродных аминокислот.
Термин "циклический" вполне понятен специалисту в данной области техники. В частности, он относится к олигомерным пептидам, которые содержат циклический структурный мотив, по меньшей мере, в одной из его мономерных пептидных цепей или циклический структурный мотив, включающий, по меньшей мере, две мономерные полипептидные цепи. Циклизация может быть достигнута с помощью циклизации остова или путем связывания боковой цепи аминокислоты с боковой цепью другой аминокислоты, присутствующей в той же молекуле. В предпочтительном осуществлении изобретения два цистеиновых остатка или одна боковая цепь карбоновой кислоты и одна боковая цепь, содержащая аминогруппу, образуют циклический мотив посредством дисульфидной связи или амидной связи, соответственно.
Выражение "биологическая активность против инфицирования ВИЧ" относится к способности олигомерных пептидов, по меньшей мере, мешать или предотвращать вход вируса в клетки млекопитающих. Более конкретно, оно относится к его способности взаимодействовать с гибридным белком др41 ВИЧ. Биологическая активность против инфицирования ВИЧ измеряется по величине IC50. Предпочтительно, чтобы биологическая активность олигомерного пептида изобретения против ВИЧ инфекции была таковой, чтобы его величина IC50 была ниже величины IC50 VIRIP дикого типа.
Олигомерные пептиды изобретения проявляют благоприятные свойства в плане противовирусной активности против инфекции ВИЧ
и стабильности в плазме крови по сравнению с исходным VIRIP (SEQ ID NO.: 1) или мономерными аналогами. В частности, димерные пептиды обладают лучшими качествами и поэтому предпочтительны. Для получения димерных пептидов изобретения мономерные пептидные цепи химически соединяют с введением ковалентной связи между двумя пептидными цепями. Ковалентная связь может быть прямой связью между функциональными группами боковых цепей, такими как тиоловые группы остатков цистеина, или связью, включающей спейсер между пептидными цепями, имеющейся при связывании двух идентичных цепей пептида с двумя аминогруппами остатка лизина. Последнюю часто обозначают как наименьшая форма дендримера на основе лизина (Sadler К., J. Biotechnology, 2002, 90, 195-229) . Две пептидные цепи могут быть также соединены посредством амидной связи между одиночными пептидными цепями, которая обеспечивается ковалентной связью между аминогруппой боковой цепи одной пептидной цепи и карбоксильной группой боковой цепи второй цепи. Эта связь может быть также обеспечена путем применения малой бифункциональной органической спейсерной молекулы, которая сшивает две пептидные цепи ковалентной связью с карбоксильной боковой цепью одной пептидной цепи и аминогруппой боковой цепи второй пептидной цепи. Более того, эта органическая спейсерная молекула может быть использована для сшивки двух идентичных пептидных цепей по аминогруппам, если спейсерная молекула содержит две кислотные группы, или для сшивки двух идентичных пептидных цепей по карбоксильным группам, если спейсерная молекула содержит две аминогруппы (Pennington et al. (editors), Peptide synthesis protocols, Humana Press, Totowa 1994). Две пептидные цепи мономеров могут быть также соединены посредством образования оксима, гидразона и тиазолидина с применением реакционных боковых цепей природных или неприродных аминокислот (Rose К., J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 30-33; Shao, J. & Tam J. P., 1995, J. Am. Chem. Soc, 117, 3893-3899; Fisch I. et al, Bioconjugate Chem., 1992, 3, 147-153; Liu C.-F. & Tam J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6584-6588). Кроме того, олигомерные пептиды изобретения получают твердофазным пептидным
синтезом линейного олигомерного пептида, содержащего повторяющиеся единицы мономерных пептидных цепей.
Олигомерные пептиды согласно' изобретению, в частности, димерные пептиды изобретения структурно и биологически более стабильны и более активны по сравнению с VIRIP дикого типа (SEQ ID N0. 1) . Они проявляют повышенный период полужизни, что обеспечивает более высокую концентрацию в плазме. Кроме того, они вызывают повышение локальной концентрации противовирусно активной пептидной цепи в месте действия. Таким образом, олигомерные пептиды изобретения представляют собой молекулы, которые более благоприятно взаимодействуют с молекулой вирусного рецептора, вызывая более эффективную блокаду вхождения вируса.
Было также обнаружено, что путем избирательного варьирования аминокислотной последовательности мономерных пептидных цепей по отношению к VIRIIP дикого типа (SEQ ID N0. 1) получаются олигомерные пептиды со значительно повышенной активностью против ВИЧ. Наиболее значительное повышение активности наблюдается для олигомб:рных пептидов, в которых L-пролин в положении 10 олигомерной пептидной цепи заменен D-пролином и/или в положения аминокислот 6 и 11 введены два цистеина и/или когда положительно заряженный лизин в положении 13 заменен аминокислотой с гидрофобной или ароматической боковой цепью. Полагают, что повышение активности по сравнению с VIRIP дикого типа (SEQ ID NC. 1 обусловлено изменением структуры. Известно, что цистеиновые мостики оказывают влияние на структуру и значительно снижают гибкость пептида, как и введение D-пролина, который вызывает изменение в элементах вторичной структуры пептида и, таким образом, изменяет ориентацию различных частей пептида относительно друг друга. Более того, замена лизина незаряженной гидрофобной или ароматической аминокислотой должна изменять структуру, поскольку меняется вероятное взаимодействие положительно заряженной боковой цепи лизина с отрицательно заряженными аминокислотами в положениях 2 и 11 той же молекулы или с отрицательно заряженной частью молекулы рецептора.
Дополнительное значительное повышение активности против ВИЧ наблюдается при замене остатка аланина в положении 3 мономерной пептидной цепи олигомерного пептида положительно или отрицательно заряженным остатком путем замены остатками лизина или аспарагиновой кислоты. Введение заряженного остатка в положение 3 может повышать интенсивность связывания с соответствующей частью рецепторной молекулы за счет усиления электростатических или диполярных сил. Было обнаружено, что замена аминокислотных остатков в положениях 7 и/или 15 мономерных пептидных цепей олигомерного пептида небольшим аминокислотным остатком, в частности, глицином, повышает активность против ВИЧ олигомерных пептидов согласно изобретению. Остатки глицина являются остатками, вносящими наименьшие стерические затруднения, и обеспечивают оптимальную внутреннюю укладку пептида при связывании с рецепторной молекулой или при образовании агрегатов, притом, что они сами необходимы для связывания с рецепторной молекулой. Описанные замены могут сочетаться в мономерных пептидных цепях олигомерных пептидов изобретения.
Мономерные цепи пептидов изобретения могут быть химически синтезированы или получены рекомбинантной экспрессией нуклеиновых кислот, кодирующих мономерные пептидные цепи согласно изобретению. Из-за малого размера, т.е. малого количества аминокислот в мономерных пептидных цепях, находящихся в олигомерных пептидах изобретения, для химического синтеза таких мономерных пептидных цепей могут быть применены исключительно способы пептидного синтеза. По сравнению с синтезом гибридного ингибитора ВИЧ Т-20, для которого необходим синтез трех отдельных фрагментов с последующим соединением трех фрагментов с образованием конечного продукта Т-20, мономерные пептидные цепи настоящего изобретения можно синтезировать в большом масштабе с помощью ступенчатых твердофазных способов или при применении жидкофазной химии. Таким образом, способ получения мономерных пептидных цепей олигомерных пептидов настоящего изобретения является прямым, и поэтому издержки на производство олигомерных пептидов настоящего изобретения
являются низкими. Ковалентное связывание мономерных пептидов также является прямым, т.е. для него не требуются сложные химические реакции, и поэтому реакция присоединения не вносит значительного вклада в стоимость конечных продуктов, включающих олигомерные пептиды.
Дополнительным преимуществом олигомерных пептидов настоящего изобретения является их растворимость и стабильность в широком диапазоне рН (рН 2-8,5) в растворителях с разной ионной силой. В частности, следует отметить их стабильность в плазме крови. Химический синтез можно проводить на твердой основе с помощью твердофазных способов или в жидкой фазе, причем оба способа являются стандартными способами, известными специалистам. Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов изобретения можно также синтезировать лигированием двух или более фрагментов с защищенными или незащищенными боковыми цепями с применением стандартных способов, известных специалистам (Tam J.P., Biopolymers, 2001, 60, 194-205). Твердофазный синтез мономерных пептидных цепей олигомерных пептидов согласно изобретению или их фрагментов можно проводить с применением Fmoc/tBu- или Boc/Bzl-типа защиты аминокислот. Могут быть применены другие защитные группы, которые не входят в стандартную схему защиты Fmoc. Очистка синтетических мономерных пептидных цепей и олигомерных пептидов осуществляется способами хроматографии, такой как с обращенной фазой, ионообменная или исключающая по размеру. Упомянутые выше способы химического синтеза мономерных пептидных цепей и олигомерных пептидов изобретения рассмотрены в нескольких обзорных публикациях (примеры: Chan W.C. et al. (editors), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000; Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002; Goodman M., Houben-Weyl, Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2002).
Введение дисульфидной связи в мономерную пептидную цепь олигомерных пептидов изобретения может быть произведено
применением окислительных химических способов в отношении мономерных пептидных цепей, содержащих, по меньшей мере, два цистеиновых остатка, способов,, известных специалистам (Pennington et al. (editors), Peptide synthesis protocols, Humana Press, Totowa 1994; Chan W.C. et al. (editors), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000) . Дисульфидные связи между мономерными пептидными цепями олигомерных пептидов изобретения могут быть образованы при применении восстановленных мономерных пептидных цепей-предшественников, содержащих, по меньшей мере, один незащищенный цистеиновый остаток, полученных при твердофазном синтезе или синтезе в растворе, обработкой окислителем. В качестве окисляющих агентов могут быть применены кислород, диметилсульфоксид, соли железа(III), йод или другие. Дисульфиды мономерных пептидных цепей олигомерных пептидов изобретения можно альтернативно вводить в пептиды при применении предшественников, содержащих защитные группы на соответствующих цистеиновых остатках. В качестве защитных групп могут быть использованы ацетамидметил, трет-бутил, S-трет-бутил или другие. Удаление защитных групп и образование внутрицепочечной дисульфидной связи может быть осуществлено при применении таких агентов, как йод, фосфины или другие.
Циклические мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов, отличные от содержащих дисульфидную связь, могут быть получены посредством циклизации остова мономерной пептидной цепи или благодаря химической связи между, по меньшей мере, одной реакционной группой боковой цепи, такой как амино, карбокси, гидрокси или тио, и любой другой реакционной группой, находящейся в той же молекуле, как это известно специалисту (Li et al., Curr. Top. Med. Chem., 2002, 2, 325-341; Tam J.P., Biopolymers, 2001, 60, 194-205; Goodman M., Houben-Weyl, Methods of organic chemistry, Synthesis of peptides and peptidomimetics, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 2002).
Ковалентно связанные олигомеры мономерных пептидов получают соединением двух пептидных цепей с помощью химических связей разного типа. Связанные дисульфидом олигомеры
синтезируют соединением двух пептидов либо с помощью активированных цистеинов, либо без какой-либо предварительной активации цистеинов (Sacca В. et al., J. Pept. Sci., 2002, 8, 192-204; Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2 002) . Тиоэфирные связи, простые эфирные связи и пептидные связи между двумя пептидными цепями могут быть введены в соответствии с различными способами, известными специалисту и описанными в литературе (Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002). Дендримеры на основе лизина можно синтезировать присоединением Fmoc-Lys(Fmoc)-ОН к твердой основе. После снятия защиты с аминокислоты твердофазный пептидный синтез ведет к олигомерным пептидам (Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002; Chan W.C. (editors) Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000). Между лизиновым остатком карбоксильного конца и пептидными цепями могут быть помещены дополнительные остатки лизина. Лизин можно заменить любой другой аминокислотой, содержащей две аминогруппы, такой как орнитин и любая неприродная аминокислота, содержащая аминогруппу в боковой цепи, такая как диаминопропионовая кислота.
В предпочтительном олигомерном пептиде согласно изобретению соединение двух пептидных цепей посредством амидной связи между двумя отдельными пептидными цепями обеспечивается ковалентной связью между аминогруппой боковой цепи одной пептидной цепи с карбоксильной группой боковой цепи второй цепи. Эту связь можно также получить при применении небольшой бифункциональной органической спейсерной молекулы, которая сшивает две пептидные цепи путем ковалентного связывания с карбоксильной боковой цепью одной пептидной цепи и с аминогруппой боковой цепи второй пептидной цепи. Более того, эта органическая спейсерная молекула может быть использована для сшивки двух идентичных пептидных цепей по их аминогруппам, если спейсерная молекула содержит две кислотные группы, или для двух идентичных пептидных цепей по их карбоксильным группам, если спейсерная молекула содержит две аминогруппы. Данные
способы известны специалисту и описаны в литературе (Pennington et al. (editors), Peptide synthesis protocols, Humana Press, Totowa 1994).
Лигирование двух мономерных пептидных цепей с образованием оксима, гидразона или тиазолидина с использованием реакционных боковых цепей природных или неприродных аминокислот может быть осуществлено путем присоединения мономерного пептида с гидроксиламиновой или гидразиновой группой к пептиду, содержащему альдегидную группу, или путем присоединения пептида с N-концевым цистеином к пептиду с альдегидом с применением способов, известных специалисту и описанных в литературе (Chan W.C. et al. (editors), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000, p 243-263; Novabiochem 2004/5 Catalog, Reagents for Peptide and High-Throughput Synthesis, p.5.2-5.3; Rose K. , J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 30-33; Shao, J. & Tam J.P., 1995, J. Am. Chem. Soc, 117, 3893-3899; Fisch I., et al. , Bioconjugate Chem., 1992, 3, 147-153; Liu C.-F. & Tam J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6584-6588).
В следующем параграфе кратко описывается, как различные олигомерные пептиды изобретения ковалентно связываются. Все эти пептиды представляют собой димеры.
VIR-674: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-675: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-676: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-677: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys7 и Cysl2 одной мономерной пептидной цепи и Cys7 и Cysl2, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-678: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys7 и Cysl2 одной мономерной пептидной цепи и Cys7 и Cysl2, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-67 9: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-680: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-681: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-682: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-683: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-684: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-685: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys6 и Cysll одной мономерной пептидной цепи и Cys6 и Cysll, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-68 6: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-687: связан посредством амидной связи между Glull
одной единицы и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-68 9: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-690: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-691: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-692: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-693: связан посредством двух цистеиновых мостиков между Cys8 и Cysl3 одной мономерной пептидной цепи и Cys8 и Cysl3, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-694: связан посредством амидной связи между Glull одной мономерной пептидной цепи и Lysl6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-695: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-696: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-697: связан посредством цистеинового мостика между Cys7 одной мономерной пептидной цепи и Cys7 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-698: связан посредством цистеинового мостика между Cys7 одной мономерной пептидной цепи и Cys7 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-699: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-700: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-701: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-7 02: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-703: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-704: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-705: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-706: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-707: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-708: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-709: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VTR-710: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-711: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-712: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-713: связан посредством цистеинового мостика между Cys8 одной мономерной пептидной цепи и Cys8 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-714: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-715: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-716: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-717: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-718: связан посредством дендримера на основе лизина.
VIR-719: связан посредством цистеинового мостика между Cys6 одной мономерной пептидной цепи и Cys6 второй идентичной мономерной пептидной цепи.
VIR-720: связан посредством цистеинового мостика между остатками Cys карбоксильных концов двух мономерных пептидных цепей.
VIR-721: связан посредством цистеинового мостика между Cys7 одной мономерной пептидной цепи, которая в дополнение к указанному цистеиновому мостику содержит внутримолекулярный цистеиновый мостик между Cysб и Cysll, и Cys7 второй мономерной пептидной цепи, которая также содержит внутримолекулярный цистеиновый мостик между Cys6 и Cysll.
VIR-722: связан посредством цистеинового мостика между остатками Cys карбоксильных концов двух мономерных пептидных цепей, обе из которых содержат внутримолекулярный цистеиновый мостик между их Cys6 и Cysll.
VIR-723: связан посредством двух цистеиновых мостиков
между Cys6 и остатком Cys карбоксильного конца одной мономерной пептидной цепи и Cys б и остатком Cys карбоксильного конца, соответственно, второй идентичной мономерной пептидной цепи. Если данные олигомерные пептиды должны содержать дополнительные модификации, мономерные пептидные цепи модифицируют, как описывается ниже, до димеризации или, в более общем случае, до олигомеризации.
Амидированные пептидные мономеры получают твердофазным синтезом пептидов с применением смол, содержащих амидный линкер, на котором происходит сборка пептидной цепи. Кислотное отщепление соответствующим образом синтезированных пептидов дает амиды пептидов. При жидкофазном синтезе амидированные пептиды получают при использовании С-концевой аминокислоты в качестве строительного блока, который содержит на С-конце заранее образованный карбоксамид (Chan W.C. (editors) Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000).
Ацилированные пептидные мономеры могут быть получены специалистами путем превращения пептида со свободными амино-или гидроксильными группами с применением активированных реагентов ацилирования, полученных из карбоновых кислот, таких как ацилгалогениды или карбоксильный ангидрид или другие реакционные карбонильные соединения для соответствующего ацилированного пептида. В качестве альтернативы, ацилирование может быть осуществлено с применением свободных карбоновых кислот, которые активируют in situ соединениями типа фосфония или урония (Greene T.W., Protective groups in organic chemistry, John Wiley & Sons, New York, 1991; Kocienski P., Protecting groups, Thieme-Verlag, Stuttgart 1994; Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002) .
Алкилированные' пептидные мономеры могут быть получены путем включения предварительно алкилированных аминокислотных строительных блоков при проведении пептидного синтеза на твердой основе или в растворе. Такие аминокислоты присоединяют к пептидным цепям с применением стандартных протоколов
активации, известных специалисту (Chan W.C. (editors) Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000) . Алкилирование может быть также осуществлено после сборки пептидной цепи с помощью подходящих способов алкилирования, известных специалисту (Greene T.W., Protective groups in organic chemistry, John Wiley & Sons, New York, 1991; Kocienski P., Protecting groups, Thieme-Verlag, Stuttgart 1994). Такие способы могут быть применены в отношении реакционных групп, таких как амино-, гидроксильные-, тио- и пептидные связи в пептидном скелете частично защищенного пептида.
Сульфатированные пептиды получают с применением предварительно сульфатированных строительных блоков тирозина или производных тирозина при твердофазном пептидном синтезе или синтезе в растворе. О-сульфаты остаются присоединенными к гидроксильной группе при отщеплении пептида от смолы при применении для синтеза очень кислотолабильных смол, таких как 2-хлортритиловая смола (Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002).
Пэгилированные пептиды содержат остатки полиэтиленгликоля, связанные с функциональными группами пептида. Остатки полиэтиленгликоля отличаются гидрофильными линейными или разветвленными полимерными цепями с повторяющейся единицей -СН2-СНгО-. Остатки полиэтиленгликоля вводят в пептид после сборки пептидной цепи с помощью соответствующим образом функционально модифицированных и реакционных содержащих полиэтиленгликоль веществ. Различные активированные
полиэтиленгликолевые группы могут быть присоединены к пептидам специалистом с применением различных способов активации к различным боковым цепям или концевым функциональным группам пептида, таким как амино, карбоксильная, гидрокси или тио (Veronese F.M. et al., Bioconjug. Chem., 2001, 12, 62-70; Veronese F.M., Biomaterials, 2001, 22, 405-417).
Фосфорилированные пептиды можно синтезировать с помощью твердофазного пептидного синтеза или жидкофазного синтеза. Синтез фосфорилированных пептидов обычно обеспечивается
специалистом путем применения фосфорилированных
гидроксиаминокислотных строительных блоков и/или
фосфорилирования защищенных пептидов, содержащих одну или более свободных гидроксильных групп, после сборки цепи (Murray J.S., Biopolymers, 2001, 60, 3-31; Chan W.C. et al. (editors), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000; Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002).
Гликозилированные пептиды могут быть получены специалистом путем применения гликозилированных аминокислотных строительных блоков, которые могут быть введены в твердофазный синтез или в жидкофазный синтез пептидов или с помощью общего способа гликозилирования после сборки цепи (Davis B.G., Chem. Rev., 2002, 102, 579-602; Chan W.C. et al. (editors), Fmoc solid phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 2000; Seewald N. et al., Peptides: biology and chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002) .
Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов согласно изобретению. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами являются ДНК и РНК, особенно кДНК и мРНК.
Предметом изобретения также являются антитела, специфически связывающие пептиды изобретения. Термин "специфически" хорошо понятен специалисту. В частности, он означает, что антитела не связывают или по существу не связывают родственные пептиды, подобные VIRIP, которые не являются пептидами изобретения. Специалист в данной области техники получает антитела против пептидов изобретения с помощью традиционных способов, и он должен отобрать специфичные антитела изобретения с помощью известных способов скрининга.
Изобретение относится к олигомерным пептидам, которые специфически взаимодействуют с N-концевой областью белка оболочки др41 ВИЧ и связывают ее. Термин "взаимодействовать с" и "связываться с" легко понятен специалисту. Путем такого связывания и взаимодействия оли:?омерные пептиды изобретения блокируют инфекцию клеток-хозяев частицами ВИЧ. Настоящее
изобретение также относится к олигомерным пептидам, которые связываются с синтетическими пептидами, соответствующими гибридному пептиду др41 ВИЧ. Специалист в данной области техники определяет связывание и взаимодействие любого из олигомерных пептидов изобретения с синтетическим гибридным пептидом др41 ВИЧ путем применения количественных тестов для соотношения структура/активность (QSAR). Эти тесты включают, но не ограничиваются этим, определение подавления гемолитического действия синтетического гибридного пептида (Mobley P.W. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1139, 251-256; Gordon L., Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1139, 257-274), микрокалориметрию (Gohlke H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2002, 41, 26442 676) или ЯМР-спектроскопические способы, которые могут представлять собой эксперименты по титрованию химического сдвига, спектроскопию разности переноса насыщения или двумерные способы (Meyer et al., Ernst Schering Res. Found. Workshop, 2004, 44, 149-167).
Изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему олигомерные пептиды, нуклеиновые кислоты или антитела изобретения. Лекарственное средство предпочтительно предлагается в виде лекарственных средств для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного и/или интратекального введения.
В предпочтительном осуществлении лекарственное средство включает, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент. Указанный, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент может представлять собой ингибитор вирусной протеазы, ингибитор обратной транскриптазы, ингибитор слияния, цитокин, ингибитор цитокина, ингибитор
гликозилирования или ингибитор вирусной мРНК и т.д. Предпочтительно такие ингибиторы направлены против ВИЧ. Такие сочетанные лекарства очень эффективны в лечении СПИДа. Пептиды, нуклеиновые кислоты и антитела изобретения предпочтительно применяют при производстве лекарства для лечения инфекций ВИЧ. ВИЧ включает все известные штаммы ретровируса ВИЧ (вируса иммунодефицита человека), в особенности наиболее
распространенные штаммы ВИЧ-1. ВИЧ-1 связан с вспышкой СПИДа.
Изобретение также относится к диагностическому средству, включающему олигомерные пептиды, нуклеиновые кислоты и/или антитела изобретения. Диагностическое средство может быть использовано в аналитических системах для тестирования выделенных плазмы, сыворотки, ткани, мочи, семенной и/или спинномозговой жидкости на предмет инфекции ВИЧ.
Изобретение также относится к аналитическим системам, в которые включен, по меньшей мере, один из олигомерных пептидов изобретения, в качестве инструмента для идентификации веществ, которые связываются с белком оболочки др41 ВИЧ, в особенности с N-концевым гибридным пептидом др41. Такие анализы могут представлять собой любую систему, которая пригодна для измерения связывания любого вещества с гибридным пептидом, либо включенным в природный белок др41 в выделенной, вирусной или любой другой форме, . либо находящимся в синтетической форме с длиной до 35 аминокислотных остатков, начиная с самого N-конца др41. В таких анализах, которые могут быть любым спектроскопическим, клеточным или радиолигандным анализом, измеряют связывание вещества, конкурентное по отношению, по меньшей мере, к одному олигомерному пептиду изобретения. В результате таких конкурентных анализов с применением в качестве инструмента олигомерных пептидов изобретения достигается идентификация веществ с повышенными сродством и специфичностью к сайтам связывания др41 ВИЧ. Такие вещества обладают повышенной способностью блокировать инфекцию клеток частицами ВИЧ. Их можно использовать в качестве улучшенных терапевтических агентов для лечения СПИДа.
После химического синтеза нескольких олигомерных пептидов настоящего изобретения определяли выход и молекулярную массу полученных продуктов. Для всех пептидов был получен высокий выход, и была подтверждена ожидаемая молекулярная масса (см. таблицу 1), что отражает правильность процесса синтеза. Пептиды настоящего изобретения подвергали различным тестам.
В первой серии экспериментов была подтверждена эффективность пептидов настоящего изобретения в ингибировании
инфекции ВИЧ (см. таблицу 2). Пептиды тестировали на штамме NL4-3 ВИЧ-1, и были рассчитаны величины 1С5о. Пептидами со значительной активностью были те, которые имели IC50, равную или ниже 2000 нМ (VIR-673, SEQ ID N0.4), и 1С50, равную или ниже 6500 нМ (VIR-574, SEQ ID N0.:2; VIR-577, SEQ ID N0.3). Тестированные олигомерные пептиды обладали повышенной активностью по сравнению с природным VIRIP (SEQ ID NO. 1); было обнаружено, что природный VIRIP (SEQ ID NO. 1) обладает IC50, равной 15000, при тестировании со штаммом NL4-3 ВИЧ, соответственно. Из таблицы 2 можно заключить, что пептиды настоящего изобретения обладают от 5- до 22-кратно повышенной активностью против ВИЧ по сравнению с природным VIRIP.
Вторая серия экспериментов касалась стабильности пептидов настоящего изобретения в плазме млекопитающих. К выделенной от различных животных и человека плазме добавляли различные пептиды настоящего изобретения в определенной концентрации. В плазме человека пептиды проявляли значительно улучшенные период полужизни и метаболизм. Пептиды также проявляют повышенную стабильность в плазме живых животных.
По существу пептиды настоящего изобретения отличаются своей активностью против ВИЧ, которая при представлении в виде 1С50 равна 6500 нМ или ниже, благодаря чему наиболее активные пептиды обладают 1С50 ниже 2000 нМ. Было обнаружено, что отдельные пептиды настоящего изобретения обладают IC50 ниже 800 нМ (см. таблицу 1). Пептиды изобретения также отличаются повышенным периодом полужизни в плазме.
Пример 1: Химический синтез пептидов настоящего изобретения
А. Синтез мономерных пептидных цепей:
Мономерные пептидные цепи олигомерных цепей согласно изобретению синтезировали химически на основе принципа твердофазного химического синтеза и стратегии защитной группы Fmoc или Вое (Atherton and Sheppard, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press; Merrifield, 1986, Solid phase synthesis, Science 232, 341-347), но их можно также синтезировать с помощью синтеза в фазе раствора или путем соединения защищенных
или незащищенных фрагментов пептидов согласно изобретению.
В качестве примера здесь описывается синтез мономерной пептидной цепи олигомерного пептида VIR-577 [аминокислотная последовательность: LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF] (SEQ ID N0. 55) с применением защищенных флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) аминокислот на автоматизированном: синтезаторе пептидов 4 3 ЗА (Applied Biosystems). Синтез мономерного пептида проводили с применением предварительно загруженной смолы Fmoc-Phe-Wang с емкостью загрузки 1 ммоль/г смолы при стандартной активации HBTU [ (2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3, 3-
тетраметилуронийгексафторфосфат]/HOBt (1-гидроксибензотриазол) и циклами кепирования с применением уксусного ангидрида в N-метилпирролидоне (NMP) в масштабе 0,1 нмоль. Боковые цепи примененных аминокислотных строительных блоков защищали следующим образом: Glu(OtBu), Lys(Вое), Cys(Trt). Стадии ацилирования сборки пептидной цепи проводили в течение 15-60 мин., и после каждого ацилирования производили удаление защитных групп Fmoc с помощью пиперидина в NMP. После снятия защиты с остатка лейцина в положении 1 полученную защищенную пептидильную смолу промывали NMP, 2-пропанолом и дихлорметаном и сушили. Высушенную смолу обрабатывали при комнатной температуре свежей смесью трифторуксусная
кислота/этандитиол/вода (94:3:3, об./об./об., 4 0 мл/г смолы) в течение 2-4,5 час. Смесь фильтровали в охлажденный на льду трет-бутилметиловый простой эфир (ТВМЕ) для облегчения преципитации пептида. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали ТВМЕ и сушили в вакууме. Сырой пептид анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на С18 и масс-спектрометрии с электрораспылэнием (API 100, Perkin Elmer) (фигуры 1 + 2).
В. Олигомеризация мономерных пептидных цепей в димерный VIR-577:
Сырые мономерные пептидные цепи VIR-577 растворяли в смеси CH3CN/H20 (1:4) при концентрации пептида 4 мг/мл. К раствору добавляли 8% ДМСО, и рН доводили до ~8 разбавленным аммиаком. Раствор интенсивно перемешивали при комнатной температуре в
течение ночи. Через 18 час сырую смесь подкисляли уксусной кислотой и наносили на препаративную колонку Vydac С18 (47x300 мм, 15-20 мкм, скорость потока 40 мл/мин; растворитель А, 0,07% по объему ТФУ; растворитель В, 0,07% по объему ТФУ в смеси ацетонитрил/Н20 80:20 (об.%); УФ определение при 215 нм; при следующем градиенте: 45-70 об.% В за 50 мин. Фракции, содержащие желаемый олигомерный пептид, выявляемые масс-спектрометрией (API 100, Perkin Elmer) и аналитической ВЭЖХ С18 или, альтернативно, капиллярным зональным электрофорезом, объединяли и сушили путем лиофилизации. Лиофилизированный олигомерный пептид использовали для анализа чистоты и молекулярной массы с помощью аналитической ВЭЖХ С18 (фигура 3), капиллярного зонального электрофореза и масс-спектрометрии (фигура 4). Выход пептида (LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2 (SEQ ID N0. 3) составил 7 мг.
С. Синтез дендримеров на основе лизина:
Для синтеза дендримеров на основе лизина применяют смолу Fmoc-Gly-Wang или смолу Fmoc-Wang-Ala. К первой аминокислоте присоединяют производное Fmoc-Lys(Fmoc) или производное Fmoc-Orn (Fmoc). После снятия защиты Fmoc с помощью 20% пиперидина в NMP смола содержит две функциональные аминогруппы, на которых проводят синтез линейных VIRIP-пептидов с помощью стандартных циклов Fmoc. Данную лизиновую основу можно легко расширить путем присоединения к основе другого производного Fmoc-Lys (Fmoc) или Fmoc-Orn(Fmoc) с получением четырех свободных аминогрупп для синтеза линейных пептидов. В качестве примера описан синтез VIR-574 [аминокислотная последовательность: (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G] (SEQ ID NO. 2) с применением флуоренилметоксикарбонил (Fmoc)-защищенных аминокислот на автоматизированном пептидном синтезаторе 4 33А (Applied Biosystems). Синтез проводили с применением предварительно загруженной смолы Fmoc-Gly-Wang с емкостью загрузки 0,68 ммоль/г смолы при стандартной активации HBTU [(2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-
тетраметилуронийгексафторфосфат]/HOBt (1-гидроксибензотриазол) и циклами кепирования с применением уксусного ангидрида в N
метилпирролидоне (NMP) в масштабе 0,1 нмоль. Боковые цепи использованных аминокислотных строительных блоков были защищены следующим образом: Glu(OtBu), Lys(Вое), Lys(Fmoc), Ser(tBu). Стадии ацилирования для сборки пептидных цепей проводили в течение 15-60 мин, и защитные группы Fmoc удаляли с помощью пиперидина в NMP после каждого ацилирования. После снятия защиты с остатка лейцина в положении 1 полученную защищенную пептидильную смолу промывали NMP, 2-пропанолом и дихлорметаном и затем сушили. Сухую смолу обрабатывали при комнатной температуре свежей смесью трифторуксусная
кислота/этандитиол/вода (94:3:3, об./об./об., 4 0 мл/г смолы) в течение 2-4,5 час. Смесь фильтровали в охлажденный на льду трет-бутилметиловый простой эфир (ТВМЕ) для облегчения преципитации пептида. Полученный осадок отделяли
центрифугированием, промывали ТВМЕ и сушили в вакууме. Сырой олигомерный пептид растворяли в разбавленной уксусной кислоте и наносили на препаративную колонку Vydac С18 (47x300 мм, 1520 мкм, скорость потока 40 мл/мин; растворитель А, 0,07 об.% ТФУ; растворитель В, 0,07 об.% ТФУ в смеси ацетонитрил/НгО 80:20 (об.%); УФ определение при 215 нм; при следующем градиенте: 45-70 об.% В за 50 мин. Фракции, содержащие желаемый чистый олигомерный пептид, выявляемые масс-спектрометрией (API 100, Perkin Elmer) и аналитической ВЭЖХ С18 или, альтернативно, капиллярным зональным электрофорезом, объединяли и сушили путем лиофилизации. Лиофилизированный олигомерный пептид использовали для анализа чистоты и молекулярной массы с помощью аналитической ВЭЖХ С18 (фигура 5), капиллярного зонального электрофореза и масс-спектрометрии (фигура 6).
Процесс синтеза адаптировали также для пептидного синтеза множества пептидов в малом масштабе. Олигомерные пептиды согласно изобретению, содержащие две межмолекулярные дисульфидные связи, обрабатывали воздухом при рН 7,5-8,5 в присутствии или в отсутствие диметилсульфоксида, а затем йодом для облегчения образования цистеинового мостика при использовании предшественников с одним цистеином, защищенным ацетамидометилом, и одним незащищенным цистеином для
образования димеров.
D. Синтез мономерных пептидных цепей с защитой цистеинов с помощью Асш:
Мономерные пептидные цепи олигомерных пептидов согласно изобретению синтезировали химически на основе принципа твердофазного химического синтеза и стратегии защитной группы Fmoc или Вое (Atherton and Sheppard, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press; Merrifield, 1986, Solid phase synthesis, Science 232, 341-347), но их можно также синтезировать с помощью жидкофазного синтеза или путем соединения защищенных или незащищенных фрагментов пептидов согласно изобретению.
В качестве примера здесь описывается синтез защищенной Аст мономерной пептидной цепи олигомерного пептида VIR-7 05 [аминокислотная последовательность: LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF] (SEQ ID NO. 36) с применением защищенных
флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) аминокислот на
автоматизированном пептидном синтезаторе 433А (Applied Biosystems). Синтез мономерного пептида проводили с применением предварительно загруженной смолы Fmoc-Phe-Wang с емкостью загрузки 1 ммоль/г смолы при стандартной активации HBTU [ (2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-
тетраметилуронийгексафторфосфат]/HOBt (1-гидроксибензотриазол) и циклами кепирования с применением уксусного ангидрида в N-метилпирролидоне (NMP) в масштабе 0,1 нмоль. Боковые цепи примененных аминокислотных строительных блоков защищали следующим образом: Glu(OtBu), Asn(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Cys(Acm). Стадии ацилирования сборки пептидной цепи проводили в течение 15-60 мин, и после каждого ацилирования производили удаление защитных групп Fmoc с помощью пиперидина в NMP. После снятия защиты с остатка лейцина, в положении 1 полученную защищенную пептидильную смолу промывали NMP, 2-пропанолом и дихлорметаном и сушили. Высушенную смолу обрабатывали при комнатной температуре свежей смесью трифторуксусная кислота/этандитиол/вода (94:3:3, об./об./об., 4 0 мл/г смолы) в течение 2-4,5 час. Смесь фильтровали в охлажденный на льду трет-бутилметиловый простой эфир (ТВМЕ) для облегчения
преципитации пептида. Полученный осадок отделяли
центрифугированием, промывали ТВМЕ, и сушили в вакууме. Сырой пептид анализировали с помощью аналитической ВЭЖХ на С18 и масс-спектрометрии с электрораспылением (API 100, Perkin Elmer) (фигуры 8 + 9).
Е. Олигомеризация мономерных защищенных Асан пептидных цепей в димерный VIR-705:
Сырые мономерные пептидные цепи VIR-577 растворяли в смеси НОАс/Н20 (4:1) при концентрации пептида б мг/мл. К раствору добавляли 4 эквивалента йода из 0,05 М раствора 12 в НОАс. Раствор интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 60 минут, и оставшийся 12 восстанавливали с помощью раствора аскорбиновой кислоты. Сырую смесь разбавляли 5 объемами Н20 и наносили на препаративную колонку Vydac С18 (47x300 мм, 15-20 мкм, скорость потока 40 мл/мин; растворитель А, 0,07% по объему ТФУ; растворитель В, 0,07% по объему ТФУ в смеси ацетонитрил/Н20 80:20 (об.%); УФ определение при 215 нм; при следующем градиенте: 45-70 С'б.% В за 50 мин. Фракции, содержащие желаемый чистый олигомерный пептид, выявляемые масс-спектрометрией (API 100, Perkin Elmer) и аналитической ВЭЖХ С18 или, альтернативно, капиллярным зональным электрофорезом, объединяли и сушили путем лиофилизации. Лиофилизированный олигомерный пептид использовали для анализа чистоты и молекулярной массы с помощью аналитической ВЭЖХ С18 (фигура 10), капиллярного зонального электрофореза и масс-спектрометрии (фигура 11). Выход пептида (LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF) 2 (SEQ ID NO. 36) составил 97 мг.
Процесс синтеза олигомерных пептидов согласно изобретению адаптировали для большего масштаба в диапазоне от 0,5 до 20 ммоль, что обеспечивало выход очищенных пептидов настоящего изобретения в количестве от 1 г до 5 г.
С помощью данных общих подходов к синтезу наряду с другими были синтезированы, очищены с помощью способов хроматографии до 98% чистоты и проанализированы олигомерные пептиды, показанные в таблице 1:
Таблица 1
Выход и молекулярная масса синтетических олигомерных
пептидов
Пептид
Выход
Молекулярная
Молекулярная масса
[мг]
масса
(определенная с
(рассчитанная)
помощью масс-
спектрометрии)
VIR-574
4726, 4
4726,8
VIR-577
4589,6
4590,0
VIR-673
5052,0
5052,9
VIR-705
4549,5
4549,9
VIR-706
4551,4
4551,3
VIR-712
4529,5
4529,7
VIR-716
4643,7
4644,3
VIR-717
4617,5
4617,7
VIR-577 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 7. VIR-574 представляет собой гомодимер, связанный лизиновой основой. VIR-673 представляет собой дисульфидно связанный гомодимер с остатком цистеина и ПЭГ-спейсером между цистеином и пептидной последовательностью. VIR-705 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-7 06 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-712 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-716 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-717 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6.
Пример 2: Инхтсбирование инфекции ВИЧ олихюмерными пептидами настоящего изобретения
Для оценки того, являются ли олигомерные пептиды согласно изобретению эффективными ингибиторами инфекции ВИЧ-1,
использовали индикаторные клетки P4-CCR5 (Charneau et al., 1994; Journal of Molecular Biology 241,651-662), экспрессирующие основной рецептор CD4 и оба главных кофактора входа ВИЧ-1, CXCR4 и CCR5. Данные клетки содержат В-галактозидазный репортерный ген под контролем промотора ВИЧ-1. Таким образом, активация В-галактозидазного репортерного гена позволяет измерять эффективность инфекции ВИЧ-1 и, соответственно, количественно оценивать эффективность ингибиторов ВИЧ-1 (Detheux М. et al., 2000; Journal of Experimental Medicine 192, 1501-1508; Munch et al., 2002; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46, 982-990).
Для проведения типичного анализа инфекции клетки P4-CCRS (Charneau et al., 1994; Journal of Molecular Biology 241, 651662; Charneau et al., Virology. 1994 205, 247-53) поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% по объему FCS. Эта линия клеток совместно экспрессирует CD4 и оба корецептора ВИЧ-1, CCR5 и CXCR4, и содержит ген В-галактозидазы под контролем промотора ВИЧ-1. Запас вирусов получали способом копреципитации кальцием, как описано (Detheux et al., J Exp Med. 192: 1501-8; 2000), и количественно измеряли уровень антигена р2 4 с помощью набора ИФА для р24 ВИЧ, полученного по программе NIH AIDS Reagent Program. Клетки высевали в плоскодонные 96-луночные планшеты, культивировали в течение ночи и инкубировали с различными дозами в течение 2 час перед инфекцией вирусом, содержащим 1 нг антигена р24 в суммарном объеме среды 50 мл. После инкубации в течение ночи клетки дважды промывали свежей культуральной средой без ингибиторного пептида. Через три дня после инфекции клетки лизировали, и инфективность количественно определяли с помощью набора Galacto-Light PlusTm для хемилюминесцентного репортерного анализа (Trpoix, Bedford, MA) в соответствии с рекомендацией производителя. Инфекцию проводили в пяти параллелях.
Результаты данного анализа показывают, что олигомерные пептиды согласно изобретению обладают существенно повышенной активностью против ВИЧ-1 по сравнению с VIRIP. Олигомерные пептиды изобретения ингибировали инфекцию Х4-тропным NL4-3 ВИЧ
1 до 22-кратной степени (таблица 2). Эти данные показывают, что олигомеризация и специфические модификации последовательности VIRIP дикого типа значительно повышают эффективность против ВИЧ-1 олигомерных пептидов согласно изобретению. Ниже представлены величины IC50 пептидов изобретения, полученные с помощью описанного анализа инфекции.
Таблица 2
Аминокислотная последовательность и активность против ВИЧ
Пептид
Аминокислотная последовательность
SEQ ID
IC50
NO.
NL4-3
[нМ]
VIR-574
(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G
3085
VIR-577
(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2
3270
VIR-673
(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-iMMPEG-C-aMHfl)2
664
VIR-705
(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF) 2
484
VIR-706
(LEAIPCGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF}2
VIR-712
(N-Me-LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF}2
195
VIR-716
(N-Me-LEKIPCSIPPEFLFGKPFVF}2
182
VIR-717
(JM-Me-LEDIPCSIPPEFLFGKPFVF)2
635
VIR-577 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 7. VIR-574 представляет собой гомодимер, связанный лизиновой основой. VIR-67 3 представляет собой дисульфидно связанный гомодимер с остатком цистеина и ПЭГ-спейсером между цистеином и пептидной последовательностью. VIR-705 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-706 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-712 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-716 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется цистеином в аминокислотном положении 6. VIR-717 представляет собой гомодимер; межмолекулярный дисульфидный мостик образуется
цистеином в аминокислотном положении б. Краткое описание фигур: Фигура 1:
Запись С18 ВЭЖХ VIR-577 мономера [LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF] (SEQ ID N0. 55). Условия: Vydac С18 (4, 6x250 мм, 300 А, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин., буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).
Фигура 2:
Масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ESI-MC) мономера VIR-577 [LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF] (SEQ ID NO. 55) . Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Sciex API 100. Показаны молекулярные ионы для [М+2Н]2+ (m/z 1148,5) и [М+1Н]1+ (m/z 2296, 5) .
Фигура 3:
Запись С18 ВЭЖХ VIR-577 [ (LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF) 2] (SEQ ID NO. 3). Условия: Vydac C18 (4,6x250 мм, 300 A, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин., буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).
Фигура 4:
Масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ESI-MC) VIR-577 [ (LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF) 2] (SEQ ID NO. 3) .Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Sciex API 100. Показаны молекулярные ионы для [М+4Н]4+ (m/z 1148,5), [М+ЗН]3+ (m/z 1531,0) и [М+2Н]2+ (m/z 2294,5).
Фигура 5:
Запись С18 ВЭЖХ VIR-574 [ (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF) 2-K-G] (SEQ ID NO. 2). Условия: Vydac C18 (4, 6x250 мм, 300 A, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин., буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).
Фигура 6:
Масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ESI-MC) VIR-577 [ (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF) 2-K-G] (SEQ ID NO. 2). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Sciex API 100. Показаны
молекулярные ионы для [М+4Н]4+ (m/z 1183,0), [М+ЗН]3+ (m/z 1576,5) и [М+2Н]2+ (m/z 2364, 0). Фигура 7:
Химическое изображение VIR-574 [ (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF) 2-К-G] (SEQ ID NO. 2) в качестве примера дендримера на основе лизина.
Фигура 8:
Запись С18 ВЭЖХ VIR-705 мономера
[LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF] (SEQ ID NO. 36). Условия: Vydac C18 (4, 6x250 мм, 300 A, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 60 мин, буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил). Фигура 9:
Масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ESI-MC) VIR-705 мономера [LEKIPC (Acm)SIPpEVAFNKPFVF] (SEQ ID NO. 36). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Sciex API 100. Показаны молекулярные ионы для [М+ЗН]3+ (m/z 696,5), [М+2Н]2+ (m/z 1174,5) и [М+1Н]1+ (m/z 2347, 5). Фигура 10:
Запись С18 ВЭЖХ VIR-705 димера [(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)2] (SEQ ID NO. 36). Условия: Vydac С18 (4,6 х 250 мм, 300 А, 5 мкм, скорость потока: 0,8 мл/мин, градиент: 10-70% по объему В в течение 30 мин., буфер А: 0,07% по объему ТФУ, буфер В: 0,05% по объему ТФУ, 80% по объему ацетонитрил).
Фигура 11:
Масс-спектр с электрораспылением-ионизацией (ESI-MC) VIR-705 димера [ (LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF) 2] (SEQ ID NO. 36). Масс-спектр записывали с помощью масс-спектрометра Sciex API 100. Показаны молекулярные ионы для [М+4Н]4+ (m/z 1138,5), [М+ЗН]3+ (m/z 1517,5) и [М+2Н]2+ (m/z 2276, 0).
Сокращения:
СПИД: синдром приобретенного иммунодефицита Вое: трет-бутилоксикарбонил CXCR4: рецептор СХС хемокинов 4 CCR5: рецептор СС хемокинов 5
ESI-MC: масс-спектроскопия с электрораспылением-ионизацией
FP: гибридный пептид
ВИЧ: вирус иммунодефицита человека
ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография
HR-1, HR-2: семичленный повтор 1, 2
MALDI-TOF: время пролета при лазерной десорбции/ионизации с применением матрикса
Мини-ПЭГ: -NH- (СН2)2-0- (СН2) 2-0-CH2-CO-NH- (СН2)2-0- (СН2)2-0-CH2-CO-NH2
ЯМР: ядерный магнитный резонанс
Oic: октагидроиндолил-2-карбоновая кислота
ПЭГ: пэгил, полиоксиэтиленгликоль
QSAR: количественное соотношение структура-активность
tBu: трет-бутил
ТФУ: трифторуксусная кислота
Tic: 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновая кислота Trt: тритил
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, включающие мономерные пептидные цепи с аминокислотной последовательностью
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7--X8-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-X15-
Z2) пг
где
п указывает число мономерных пептидных цепей, в причем п равно 2, 3 или 4;
Xi представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;
Хг представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Хз представляет собой серии, цистеин, лизин или глицин; Х4 представляет собой изолейцин, аланин, фенилаланин или цистеин;
Х5 представляет собой пролин, D-пролин или замещенный L-или D-пролин;
Х6 представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;
Х7 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;
Х8 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или цистеин;
Х9 представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;
Хю представляет собой глицин, аланин или аспарагин;
ХЦ представляет собой пролин, аспарагиновую кислоту, октагидроиндолил-2-карбоновую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;
X12 представляет собой фенилаланин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту;
Х13 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;
Х14 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью;
Х15 представляет собой фенилаланин или удален;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, в частности, амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные,
фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты;
и при условии, что
(a) если Xi2 представляет собой аланин, глицин, глутаминовую кислоту или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту, то Xi3, Xi4 и Xi5 представляют собой фенилаланин, валин и фенилаланин, соответственно; и/или
(b) если Xi2 представляет собой фенилаланин, то Xi3, Хц и Х15 представляют собой валин, фенилаланин и удаление, соответственно; и
(c) в любой мономерной пептидной цепи олигомерного пептида имеется максимально три цистеиновых остатка; и
(d) олигомерный пептид не представляет собой (LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2 (VIR-576) ; и
(e) мономерные пептидные цепи не связаны пептидными связями между N-концом одной пептидной цепи и С-концом другой пептидной цепи.
2. Олигомерные пептиды по п. 1с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, имеющие аминокислотную
последовательность
(Zi-LE-Xi-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-Xii-FVF-Z2)n,
где
п указывает число мономерных пептидов, причем п равно 2, 3 или 4 ;
Xi представляет собой лизин,, аланин или аспарагиновую кислоту;
Х2 представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Хз представляет собой серии, цистеин или глицин;
Х4 представляет собой изолейцин или цистеин;
Х5 представляет собой пролин, D-пролин или любой замещенный L- или D-пролин;
Хб представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;
X? представляет собой фенилаланин, цистеин, валин, изолейцин или 3,3-дифенилаланин;
Х8 представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин, глицин, цистеин, D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту или L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту;
Хд представляет собой аминокислоту с ароматической боковой цепью;
Хю представляет собой глицин или аспарагин;
ХЦ представляет собой пролин или D-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, которые представляют собой их фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные, пэгилированные,
фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.
3. Олигомерные пептиды по пп. 1 или 2 с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, имеющие аминокислотную последовательность
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-IP-X5-X6-X7-X8-F-Xio-KPFVF-Z2)n,
где
п указывает число мономерных пептидных цепей, прчем п равно 2, 3 или 4;
Xi представляет собой лизин, аланин или аспарагиновую кислоту;
Х2 представляет собой цистеин, метионин или изолейцин; Хз представляет собой серии или глицин;
Х5 представляет собой L-пролин, D-пролин или любой
замещенный L- или D-пролин
Хб представляет собой цистеин или глутаминовую кислоту;
Х7 представляет собой фенилаланин или валин;
Х8 представляет собой фенилаланин, лейцин, аланин или L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-З-карбоновую кислоту;
Хю представляет собой глицин или аспарагин;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков, и
олигомерные пептиды с биологической активностью против инфицирования ВИЧ, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные,
ацилированные, сульфатированные, пэгилированные,
фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты.
4. Олигомерные пептиды по любому из пп. 1-3, имеющие аминокислотную последовательность
(Zi-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNKPFVF-Z2)n, где
п указывает число мономерных пептидных цепей, причем п равно 2, 3 или 4;
Х2 и Х6 представляют собой цистеины или Х2 представляет собой метионин и Х6 представляет собой глутаминовую кислоту
Х5 представляет собой D-пролин или L-пролин;
Х8 представляет собой аминокислоту с гидрофобной или ароматической боковой цепью или лизин;
Zi представляет собой NH2 или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
Z2 представляет собой СООН или последовательность из от 1 до 10 аминокислотных остатков;
и олигомерные пептиды, которые представляют собой фрагменты и/или производные, особенно амидированные, алкилированные, ацилированные, сульфатированные,
пэгилированные, фосфорилированные и/или гликозилированные производные и их мутанты с биологической активностью против
инфицирования ВИЧ,
при условии, что, по меньшей мере, имеет место одно из следующего:
Х2 и Х6 представляют собой цистеины;
Х5 представляет собой D-пролин; или
Хв не является лизином.
5. Олигомерные пептиды по любому из пп. 1-4, где мономерные пептидные цепи поперечно сшиты.
6. Олигомерные пептиды по любому из пп. 1-5, где цистеиновые остатки в положениях б и 11, б и 12, 7 и 12 или 8 и 13 связаны с помощью межмолекулярной дисульфидной связи.
7. Олигомерный пептид по любому из пп. 1-6, где остаток лейцина в аминокислотном положении 1 и глутаминовая кислота в аминокислотном положении 2 ковалентно связаны N-алкилированной амидной связью или сложной эфирной связью, или восстановленной пептидной связью, или ретро-инверсной пептидной связью, или N-алкилированной ретро-инверсной пептидной связью.
8. Олигомерный пептид по любому из пп. 1-5 или 7, где, по меньшей мере, две мономерные пептидные цепи, обе имеют, по меньшей мере, один единственный цистеиновый остаток, которые ковалентно связаны друг с другом посредством дисульфидной связи.
9. Олигомерный пептид по любому из пп. 1-7, где, мономерные пептидные цепи ковалентно связаны друг с другом через, по меньшей мере, одну амидную связь между СООН группой боковой цепи кислой аминокислоты и NH2 группой боковой цепи основной аминокислоты.
10. Олигомерный пептид по любому из пп. 1-9, где мономерные пептидные цепи связаны друг с другом через бифункциональную спейсерную молекулу, выбранную из группы органических спейсеров с двумя тиоловыми группами, органических спейсеров с двумя аминогруппами, органических спейсеров с двумя карбоксильными группами и органических спейсеров с одной карбоксильной группой и одной аминогруппой.
11. Олигомерный пептид по любому из пп. 1-10, включающий две или четыре мономерные пептидные цепи и, по меньшей мере,
один остов лизина, который ковалентно связывает мономерные пептидные цепи.
12. Пептиды по любому из пп. 1-11 с одной из следующих аминокислотных последовательностей
VIR-574
(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G
SEQ ID NO. 2
VIR-577
(LEAIPMC1PPEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO. 3
VIR-673
(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-мини РЕС-С-амид)2
SEQ ID NO. 4
VIR-674
(LEAIPCSIPPCVA(D-Tic)NKP(D-Tic)FVF)2
SEQ ID NO. 5
VIR-675
(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF);.
SEQ ID NO. 6
VIR-676
(LEAIPMSIPpE(3,3- дифенилаланин )AFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-677
(LEAIPMCIPPECFFNKPFVF)2
SEQ ID NO. 8
VIR-678
(LEAIPMCIPPECLFGKPFVF)2
SEQ ID NO. 9
VIR-679
(LEAIPCSIPPCVFFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-680
(LEAIPCSIPPCFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-681
(LEAIPCSIPpCVGFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-682
(LEAIPCSIPpCVFFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-683
(LEAIPCSIPpCFLFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-684
(LEDIPCSIPpCVAFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-685
(LEKIPCSIPpCVAFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-686
(LEAIPMGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-687
(LEAIPMGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-688
(LEKIPMSIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-689
(LEKIPMSIPpEV(L-Tic)FNKPFVF):!
SEQ ID NO.
VIR-690
(LEKIPIGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-691
(LEKIPIGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-692
(N-Me-LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-693
(LEAIPN1SCPPEFCFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-694
(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-WIHHPEG)2
SEQ ID NO.
VIR-695
(LEAIPCSIPPEVA(D-Tic)NKP(D-Tic)FVF)2
SEQ ID NO.
VIR-696
(LEAIPCSIPpE(3,3-дифенилаланин )AFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-697
(LEAIPMCIPPEVFFNKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-698
(LEAIPMCIPPEVLFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-699
(LEAIPCSIPPEVFFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
V1R-700
(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-701
(LEAI PCSIPpEVG FGKPFVF)2
SEQ ID NO.
VIR-702
(LEAIPCSIPpEVFFNKPFVF)2
SEQ ID NO. 33
VIR-703
(LEAIPCSIPpEFLFNKPFVFh
SEQ ID NO. 34
VIR-704
(LEDIPCSIPpEVAFNKPFVF)2
SEQ ID NO. 35
VIR-705
(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF) 2
SEQ ID NO. 36
VIR-706
(LEAIPCGIPpEV(D-T)c)FNKPFVF)2
SEQ ID NO. 37
VIR-707
(LEAIPCGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF).,
SEQ ID NO. 38
VIR-708
(LEKIPCSIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO. 39
VIR-709
(LEKIPCSIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)::
SEQ ID NO. 40
VIR-710
(LEKIPCGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2
SEQ ID NO. 41
VIR-711
(LEKIPCGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF);,
SEQ ID NO. 42
VIR-712
(N- M e- LE Al PCSIPPE FLFGK PFVF) 2
SEQ ID NO. 43
VIR-713
(LEAIPMSCPPEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO. 44
VIR-714
(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF-^ИНИ PEG)2-aMHfl)2
SEQ ID NO.45
VIR-715
(N-Me-LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF- (миниРЕС)2-амид)2
SEQ ID NO. 46
VIR-716
(N-Me-LEKIPCSIPPEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO. 47
VIR-717
(N-Me-LEDIPCSIPPEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO. 48
VIR-718
(LEKIPIGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF) 2-KA
SEQ ID NO. 49
VIR-719
(N-Me-LEAIPCSIPpEFLFGKPFVF)2
SEQ ID NO. 50
VIR-720
(LEKlPIGlPpEV(L-Tic)FNKPFVF-MMHMPEG-C)2
SEQ ID NO. 51
VIR-721
(LEKIPCCIPpCVAFNKPFVF)2
SEQ ID NO. 52
VIR-722
(N-Me-LEDIPCSIPpCVAFNKPFVF-MMHMPEG-C)2
SEQ ID NO. 53
VIR-723
(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF-(MMHMPEG)2-C)2
SEQ ID NO. 54
13. Олигомерные пептиды по любому из пп.
1-12, кот
взаимодействуют с гибридным пептидом ВИЧ.
14. Олигомерные пептиды по любому из пп. 1-13, которые имеют 1С50, равную или ниже 6500 нМ, такие как VIR-574, VIR-577 и VIR-673.
15. Нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные пептидные цепи любого из мономерных пептидов по п. 12, за исключением нуклеиновых кислот, кодирующих мономерные пептидные цепи VIR-674, VIR-675, VIR-676, VIR-677, VIR-678, VIR-679, VIR-680, VIR-681, VIR-682, VIR-683, VIR-684, VIR-685, VIR-686, VIR-687, VIR-688, VIR-689, VIR-690, VIR-691, VIR-692, VIR-693 и VIR-694.
16. Антитела, специфически связывающие олигомерные пептиды по любому из пп. 1-12.
17. Лекарственное средство, включающее, по меньшей мере, один из олигомерных пептидов по любому из пп. 1-14, нуклеиновые кислоты по п. 15 и/или антитела по п. 16.
18. Лекарственное средство по п. 17 в фармацевтических
составах для перорального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного и/или внутриоболочечного введения.
19. Лекарственное средство по п. 17 или 18, включающее, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент.
20. Лекарственное средство по п. 19, где указанный, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор вирусных протеаз, ингибитор обратной транскриптазы, ингибитор слияния, цитокин, ингибитор цитокинов, ингибитор гликозилирования или ингибитор мРНК вируса.
21. Применение олигомерных пептидов по любому из пп. 1-12 для получения лекарственного средства для лечения ВИЧ инфекций.
22. Тест для определения молекул, способных взаимодействовать с гибридным белком ВИЧ, включающий, по меньшей мере, один олигомерный пептид по любому из пп. 1-12.
23. Применение олигомерных пептидов по любому из пп. 1-12 для теста по п. 22.
24. Диагностическое средство, включающее, по меньшей мере, один олигомерный пептид по любому из пп. 1-12, нуклеиновые кислоты по п. 15 или антитела по п, 16.
25. Применение диагностического средства по п. 24 для тестирования выделенных крови, плазмы, ткани, мочи, семенной жидкости и/или цереброспинальной жидкости на ВИЧ инфекцию.
По доверенности
1/12
141061ЕА
4000-1 3000-
^ 2000- <
10000~I-1--1-1
10 20 30 40
Время (мин)
ФИГ. 1
2/12
ГМ+2Н]2+ 1148.5J
I, iL
400 700 1000
ГМ+1Н] 2296.5J
1300 1600
m/z
i i-1-1-
1900 2200 2500 2800
ФИГ. 2
3/12
ФИГ.З
4/12
О 400
[М+4Н]4+ 1148.5
[М+ЗН] 1531.0 2+
700 1000 1300 1600 1900 2200 2500 2800
m/z
ФИГ. 4
5/12
Время (мин)
ФИГ. 5
6/12
ФИГ. 6
7/12
H2N- LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-N
H2N- LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-N
ФИГ. 7
8/12
200п
-тон-1-1-1--1-1-1-"-i i
0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время (мин)
ФИГ. 8
9/12
ФИГ. 9
10/12
750-,
500-
<
250-
-2500 10 20 30 Время (мин) 40 -1 50
ФИГ. 10
11/12
ФИГ. 11
12/12
VIR-димер 301104
ICS0 НМ
¦ VIR-576 682,4
A VIR-717 984,1
Ў VIR-705 4651
¦ VIR-716 602,6
" VIR-712 530,5
VIR-706 256,2
~ T20 ~800
э-1-1-1-1--r-
10-9 Ю-* 10 ' 106 10''
Концентрация(M)
VIR-димер 301104
IC50hM
¦ VIR-576 118,9
* VIR-717 635,9
* VIR-705 484,1
* VIR-716 182,7 "¦ VIR-712 195,3
VIR-706 74,38
<* T20 200,7
3i-1-1-1--1-
10 s 10 s 10-' 10'! 10 s
Концентрация(M)
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> IPF Pharmaceuticals GmbH
<120> Олигомерные пептиды и их применение для лечения инфекций ВИЧ
<130> 051320wo ME/FM
<140> РСТ/ЕР2005/052833 <141> 2005-06-17
<150> ЕР 04014304.2 <151> 2004-06-18
<150> US 60/580,384 <151> 2004-06-18
<150> US 60/675,861 <151> 2005-04-29
<160> 54
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные
пептидные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи
<400> 1
Leu Glu Ala lie Pro Cys Ser lie Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 2 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-574 <220>
<221> NON_TER <222> (20)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные
цепи, которые соединены посредством С-концевой лизиновой основы (Lys-Gly)
<400> 2
Leu Glu Ala lie Pro Met Ser lie Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 3 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-577 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (7)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные
пептидные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи
<400> 3
Leu Glu Ala lie Pro Met Cys lie Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 4 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-673 <220>
<221> NONJTER <222> (20)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, где концевые аминокислоты модифицированы, миниПЭГ-Суз-амидом и две цепи связаны посредством дисульфидной связи через указанный цистеин
<400> 4
Leu Glu Ala lie Pro Met Ser lie Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe
<210> 5 <211> 21 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-674 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные пептидные цепи, которые соединены посредством двух дисульфидных связей, одна из которых находится в положении 6.
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные пептидные цепи, которые соединены посредством двух дисульфидных связей, одна из которых приходится на цистеин в положении 11
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (14)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <220>
<221> МУТАГЕН <222> (18)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <400> 5
Leu Glu Ala lie Pro Cys Ser lie Pro Pro Cys Val Ala Xaa Asn Lys 15 10 15
Pro Xaa Phe Val Phe 20
<210> 6 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-675 <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные
пептидные цепи, которые соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные
пептидные цепи, которые соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи
<400> 6
Leu Glu Ala lie Pro Met Ser lie Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 7 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-676 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (12)
<223> Xaa представляет собой 3,3 дифенилаланин <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две их;ентичные мономерные пептидные цепи, которые соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные пептидные цепи, которые соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи
<400> 7
Leu Glu Ala Не Pro Met Ser He Pro Xaa Glu Xaa Ala Phe Asn Lys
Pro Phe Val Phe 20
<210> 8 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-677 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (7)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 7
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (12)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 12
<400> 8
Leu Glu Ala Не Pro Met Cys He Pro Pro Glu Cys Phe Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 9 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-678 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (7)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 7
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (12)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи
между цистеинами в положении 12 <400> 9
Leu Glu Ala Не Pro Met Cys He Pro Pro Glu Cys Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 10 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-67 9 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 10
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Cys Val Phe Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 11 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-680 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 11
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Cys Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 12 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-681 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 12
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Cys Val Gly Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 13 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-682
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 13
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Cys Val Phe Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 14 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-683 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-прлин <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 14
Leu Glu Ala He Pro Cys Ser He Pro Xaa Cys Phe Leu Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 15 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-684 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 15
Leu Glu Asp Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Cys Val Ala Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 16 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-685 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (11)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 11
<400> 16
Leu Glu Lys Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Cys Val Ala Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 17 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-686 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Xaa представляет собой D-Tic <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 17
Leu Glu Ala He Pro Met Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 18 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-687 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Xaa представляет собой L-Tic <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 18
Leu Glu Ala Не Pro Met Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 19 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-688
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 19
Leu Glu Lys Не Pro Met Ser He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 20 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-68 9 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Xaa представляет собой L-Tic <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 20
Leu Glu Lys Не Pro Met Ser He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Glu 20
<210> 21 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-690 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Xaa представляет собой D-Tic <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 21
Leu Glu Lys He Pro He Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 22 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-691 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Xaa представляет собой L-Tic <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 22
Leu Glu Lys Не Pro Не Gly Не Pro Хаа Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 23 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-692
<220>
<221> NON_TER <222> (1)
<223> N-концевая аминокислота алкилирована N-Me <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<400> 23
Leu Glu Ala Не Pro Met Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 24 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-693 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (8)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 8
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (13)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 13
<400> 24
Leu Glu Ala Не Pro Met Ser Cys Pro Pro Glu Phe Cys Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 25 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-694 <220>
<221> САЙТ <222> (11)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> САЙТ <222> (16)
<223> Димерный пептид, в котором две идентичные мономерные
пептидные цепи соединены посредством одной амидной связи между глутаматом 11 одной цепи и лизином 16 другой цепи.
<220>
<221> NON_TER <222> (20)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, в котором концевые аминокислоты каждой цепи модифицированы миниРЕС
<400> 25
Leu Glu Ala Не Pro Met Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 26 <211> 21 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-695 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи
между цистеином в положении 6 одной цепи и цистеином в положении 6 другой цепи.
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (14)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <220>
<221> МУТАГЕН <222> (18)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <400> 26
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Val Ala Xaa Asn Lys 15 10 15
Pro Xaa Phe Val Phe 20
<210> 27 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-696 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (12)
<223> Хаа представляет собой 3,3-дифенилаланин <400> 27
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Xaa Ala Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 28 <211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VTR-697 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (7)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 7
<400> 28
Leu Glu Ala Не Pro Met Cys He Pro Pro Glu Val Phe Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 29 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-698 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (7)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 7
<400> 29
Leu Glu Ala Не Pro Met Cys He Pro Pro Glu Val Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 30 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-699 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные
цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<400> 30
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Val Phe Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 31 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-700 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<400> 31
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 32 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-701 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <400> 32
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Val Gly Phe Gly Lys
Pro Phe Val Phe 20
<210> 33 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-702 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <400> 33
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Val Phe Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 34 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-703 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <400> 34
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Phe Leu Phe Asn Lys
Pro Phe Val Phe 20
<210> 35 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-704 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <400> 35
Leu Glu Asp Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Val Ala Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 36 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-705 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <400> 36
Leu Glu Lys Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Val Ala Phe Asn Lys
Pro Phe Val Phe 20
<210> 37 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-706 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <400> 37
Leu Glu Ala Не Pro Cys Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 38 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-707 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН
<222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой L-Tic <400> 38
Leu Glu Ala Не Pro Cys Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 39 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-708 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <400> 39
Leu Glu Lys Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 40 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-709
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой L-Tic <400> 40
Leu Glu Lys Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 41 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-710 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой D-Tic <400> 41
Leu Glu Lys Не Pro Cys Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe
<210> 42 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-711 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Хаа представляет собой D-пролин <220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой L-Tic <400> 42
Leu Glu Lys Не Pro Cys Gly He Pro Xaa Glu Val Xaa Phe Asn Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 43 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-712 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> NON_TER <222> (1)
<223> N-концевая аминокислота алкилирована N-Me
<400> 43
Leu Glu Ala lie Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 44 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-713 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (8)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 8
<400> 44
Leu Glu Ala Не Pro Met Ser Cys Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 45 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-714 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> NON_TER <222> (20)
<223> Димерный пептид, в котором концевые аминокислоты обеих мономерных цепей модифицироЕ.аны (миниРЕС)2амидом.
<400> 45
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 46 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-715 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> NON__TER <222> (1)
<223> An Asp-Me образует действительный N-конец каждой мономерной цепи
<220>
<221> NON_TER <222> (20)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные
мономерные цепи, в котором концевые аминокислоты каждой мономерной цепи модифицированы (MHHHPEG)2амидом
<400> 46
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 47 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-716 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> NON_TER <222> (1)
<223> An Asp-Me образует действительный N-конец каждой мономерной цепи
<400> 47
Leu Glu Lys Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 48 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-717 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении 6
<220>
<221> NON_TER <222> (1)
<223> An Asp-Me образуют действительный N-конец каждой мономерной цепи
<400> 48
Leu Glu Asp Не Pro Cys Ser He Pro Pro Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 49 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-718 <220>
<221> МУТАГЕН <222> (10)
<223> Xaa представляет собой D-пролин
<220>
<221> МУТАГЕН <222> (13)
<223> Хаа представляет собой L-Tic <220>
<221> NON_TER <222> (20)
<223> Димерный пептид, включающий две мономерные цепи,
которые соединены посредством С-концевой лизиновой основы (Lys-Ala)
<400> 49
Leu Glu Lys Не Pro Не Gly Не Pro Хаа Glu Val Xaa Phe Asn Lys 1 5 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 50 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-719 <220>
<221> ДИСУЛЬФИД <222> (6)
<223> Димерный пептид, включающий две идентичные мономерные цепи, которые соединены посредством дисульфидной связи между цистеинами в положении б
<220>
<221> NON_TER <222> (1)
<223> N-концевая аминокислота алкилирована N-Me <400> 50
Leu Glu Ala Не Pro Cys Ser He Pro Xaa Glu Phe Leu Phe Gly Lys 15 10 15
Pro Phe Val Phe 20
<210> 51 <211> 20 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: VIR-720