Настоящее изобретение относится к метаболитам класса веществ, направленных на андрогеновый рецептор (ARTA). Соединения SARM и их метаболиты либо сами по себе, либо в виде композиции можно использовать для a) мужской контрацепции; b) лечения целого ряда гормональных расстройств, например расстройств, связанных с возрастным снижением уровня андрогена у мужчин (ADAM), таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушение эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, доброкачественная гиперплазия простаты, изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; c) лечения расстройств, связанных с понижением уровня андрогенов у женщин (ADIF), таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острой и/или хронической гипотрофии мышц; e) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; g) снижения степени, прекращения или регрессии рака простаты и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.

 

(57) Реферат / Формула:
изобретение относится к метаболитам класса веществ, направленных на андрогеновый рецептор (ARTA). Соединения SARM и их метаболиты либо сами по себе, либо в виде композиции можно использовать для a) мужской контрацепции; b) лечения целого ряда гормональных расстройств, например расстройств, связанных с возрастным снижением уровня андрогена у мужчин (ADAM), таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушение эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, доброкачественная гиперплазия простаты, изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; c) лечения расстройств, связанных с понижением уровня андрогенов у женщин (ADIF), таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острой и/или хронической гипотрофии мышц; e) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; g) снижения степени, прекращения или регрессии рака простаты и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.

 

---

2420-140219ЕА/012 МЕТАБОЛИТЫ СЕЛЕКТИВНЫХ МОДУЛЯТОРОВ АНДРОГЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ И
СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к метаболитам нового класса веществ, направленных на андрогеновые рецепторы (ARTA) , которые представляют собой селектиЕ;ные модуляторы андрогеновых рецепторов (SARM). Соединения SARM и их метаболиты можно использовать для а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормонозависимых растройств, например, растройств, связанных с возрастным снижением уровня андрогена у мужчин (ADAM), таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушение эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, остеопороз, доброкачественная гиперплазия простаты, изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; с) лечения состояний, связанных со снижением уровня андрогенов у женщин (ADIF), таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острых и/или хронической гипотрофии мышц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; д) снижения случаев, прекращения или регрессии рака простаты; и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.
Предпосылки создания изобретения
Андрогеновый рецептор ("AR") представляет собой лиганд-активированный транскрипционный регуляторный белок, который опосредует половое созревание и функционирование у мужчин через его активность с эндогенными андрогенами. Андрогены, в общем, известны как мужские половые гормоны. Андрогенные гормоны представляют собой стероиды, которые в организме вырабатываются в яичках и коре надпочечников или могут быть синтезированы в лаборатории. Андрогенные стероиды играют важную роль во многих
физиологическких процессах, включая развитие и поддержание половых признаков у мужчин, таких как мышечная и костная масса, развитие простаты, сперматогенез и мужской тип оволосения (Matsumoto, Endocrinol. Met. Clin. N. Am., 23:857-75 (1994)). Эндогенные стероидные андрогены включают тестостерон и дигидротестостерон ("DHT"). Тестостерон представляет собой главный стероид, секретируемый яичками и является основным циркулирующим гормоном в плазме у мужчин. Тестостерон превращается в DHT под действием фермента 5 альфа-редуктазы во многих периферических тканях. Как полагают, DHT служит внутриклеточным медиатором большинства воздействий андрогенов (Zhou et al., Molec. Endocrinol., 9:208-18 (1995)). Другие стероидные андрогены включают сложные эфиры тестостерона, такие как ципионатный, пропионатный, фенилпропионатный,
циклопентилпропионатный, изокарпоратный, энантатный и
деканоатный сложные эфиры и другие синтетические андрогены, таккие как 7-метил-нортестостерон ("MENT"), и его ацетатный сложный эфир (Sundaram et al., w7 Alpha-Methyl-Nortestosterone (MENT): The Optimal Androgen For Male Contraception", Ann. Med., 25:199-205 (1993) ("Sundaram"). Поскольку AR участвует в половом развитим и функционировании у мужчин, то AR является вероятной мишенью для осуществления мужской контрацепции или других форм гормон-заместительной терапии.
Рост населения во всем мире и общественная забота о планировании семьи способствовали большому числу исследований по контрацепции. Контрацепция является трудной темой при любых обстоятельствах. На нее накладываются культурное и общественное порицание, религиозные последствия и, безусловно, серьезной озабоченностью вопросами здоровья. Такое положение только усложняется, когда вопрос фокусируется на мужской контрацепции. Несмотря на доступность соответствующих контрацептивных средств, исторически общество считало женщину ответственной за принятие решения о контрацепции и его последствиях. Несмотря на то, что тревога по поводу заболеваний, передающихся половым путем, заставила мужчин осознать необходимость развития безопасных и ответственых сексуальных привычек, все же чаще
женщины несут тяжесть в принятии решения о конрацепции. У женщин есть несколько вариантов, от временных механических устройств, таких как тампоны и противозачаточные диафрагмы, до временный химических средств, таких как спермициды. Женщины также имеют в своем распоряжении более постоянные средства, такие как физические устройства., включая внутриматочные противозачаточные устройства (IUDs) и противозачаточные колпачки, вставляемые в шейку матки, а также более постоянные химические средства, такие как таблетки для предохранения от беременности и подкожные имплантаты. Однако на сегодняшний день единственной альтернативой для мужчин являются презервативы и вазектомия. Мужчины, однако, предпочитают не применять презервативы по причине снижения чувствительности, нарушения естественности секса и значительной возможности беременности, вызываемой разрывом или неправильным использованием презервативов. Вазектомия также не предпочтительна. Если мужчинам были бы доступны более удобное регулирование рождаемости, в особенности долговременные способы, не требующие подготовительных действий непосредственно перед половым актом, то такие способы смогли бы существенно увеличить вероятность того, что мужчины станут более ответственно подходить к контрацепции.
Применение мужских половых стероидов (например, тестостерона и его производных) оказалось особенно перспективным в этом отношении благодаря сочетанию гонадотропин-супрессирующих и андроген-заместительных свойств этих соединений (Steinberger et al. , "Effect of Chronic Administration of Testosterone Enanthate on Sperm Production and Plasma Testosterone, Follicle Stimulating Hormone, and Luteinizing Hormone Levels: A Preliminary Evaluation of a Possible Male Contraceptive, Fertility and Sterility 28: 132028 (1977)). Постоянное применение высоких доз тестостерона полностью предотвращает образование спермы (азооспермия) или понижает его до очень низкого уровня (олигоспермия). Степень подавления сперматогенеза, необходимая для достижения бесплодия, точно неизвестна. Однако в недавнем сообщении
Всемирной Организации Здравоохранения указано, что еженедельные внутримышечные инъекции энантата тестостерона приводят к азооспермии или тяжелой олигоспермии (т.е. менее чем 3 миллиона сперматозомдов на мл) и беслодию у 98% мужчин, получающих такую терапию (World Health Organization Task. Force on Methods And Regulation of Male Fertility, "Contraceptive Efficacy of Testosterone-Induced Azoospermia atnd Oligospermia in Normal Men, " Fertility and Sterility 65:821-29(1996)).
Был разработан ряд сложных эфиров тестостерона, которые медленнее абсорбируются после внутримышечной инъекции и, таким образом, вызывают больший андрогенный эффект. Энантат тестостерона является наиболее используемым из этих эфиров. Хотя энантат тестостерона и оказался ценным с точки зрения установления целесообразности гормональных агентов для мужской контрацепции, он имеет несколько недостатков, включая необходимость в еженедельных инъекциях и наличие супрафизиологических пиков тестостерона сразу после внутримышечной инъекции (Wu, "Effects of Testosterone Enanthate in Normal Men: Experience From a Multicenter Contraceptive Efficacy Study, " Fertility and Sterility 65: 626-36 (1996)).
Стероидные лиганды, которые связываются с андрогеновым рецептором (AR) и действуют как андрогены (например, энантат тестостерона) или как антиандрогены (например, ацетат ципротерона) известны уже много лет и применяются в клинике (Wu, 1998). Хотя нестероидные антиандрогены и применяются в клинике при гормон-зависимом раке простаты, однако для нестроидных андрогенах таких сообщений не было. По этой причине исследования по мужской контрацепции были сфокусированы исключительно на стероидных соединениях.
Рак простаты является одним из наиболее часто встречающихся видов рака у мужчин в США, и каждый год диагностируются сотни тысяч новых случаев. К сожалению, более шестидесяти процентов новых диагностируемых случаев рака простаты оказываются патологически запущенными, не поддающимися излечению и плохим прогнозом. Одним из подходов к этой проблеме заключается в раннем обнаружении рака простаты через программы
скрининга и, таким образом, снижением числа пациентов с запущенным раком простаты. Другой подход, однако, заключается в разработке лекарственных средств для профилактики рака простаты. Одна треть всех мужчин в возрасте старше 50 лет имеет латентную форму рака простаты, которая может активироваться в угрожающую жизни клиническую форму рака простаты. Частота латентных опухолей простаты, как оказалось, существенно возрастает каждые десять лет после 50 (5,3-14%) до 90 (40-80%). Число людей с латентным раком простаты одинаково среди всех культурных, этнических групп и рас, хотя частота клинически агрессивного рака заметно различается. Это позволяет предположить, что в активации латентной формы рака простаты могут играть роль факторы окружающей среды. Таким образом, разработка стратегий лечения и профилактики против рака простаты может иметь огромное влияние как в медицинском, так и с экономическом отношении на рак простаты.
Остеопороз представляет собой системное заболевание скелета или характеризуется низкой костной массой и ухудшением костной ткани с последующим увеличением хрупкости костей и подверженностью переломам. В США это состояние поражает более 25 миллионов человек и вызывает более 1,3 миллионов переломов каждый год, включая 500000 переломов позвоночника, 250000 переломов бедра и 24 0000 переломов запястья ежегодно. Переломы бедра являются наиболее серьезным последствием остеопороза, при этом ежегодно умирают 5-20% пациентов, а более 50% выживших остаются нетрудоспособными. Пожилые люди имеют больший риск развития остеопороза, причем, по прогнозам эта проблема значительно возрастает по мере старения населения. Прогнозируется, что частота переломов во всем мире увеличатся в три раза в течение следующих 60 лет и по оценкам одного исследования к 2050 году будет 4,5 миллиона случаев перелома бедра во всем мире.
Женщины больше подвержены риску остеопороза, чем мужчины. У женщин происходит острое ускорение потери костной массы в течение пяти лет после менопаузы. Другие факторы, которые повышают риск включают курение, злоупотребление алкоголем,
малоподвижный образ жизни и низкое потребление кальция. Но остеопороз также часто возникает и у мужчин. Твердо установлено, что минеральная плотность костей у мужчин понижается с возрастом. Снижение величины минерального содержания и плотности костей коррелирует с уменьшением плотности костей и располагает к переломам. Молекулярные механизмы, лежащие в основе плейотропных половых гормонов в нерепродуктивных тканях, только начинают понимать, но ясно, что физиологические концентрации андрогенов и эстрогенов играют важную роль в поддержании гомеостаза костей на протяжении жизни. Следовательно, при потере андрогена или эстрогена происходит увеличение скорости перестройки кости, что сдвигает баланс резорбции и образования в пользу резорбции, что способствует общему уменьшению костной массы. У мужчин естественное снижение половых гормонов в зрелом возрасте (непосредственное снижение уровня андрогенов, а также более низкий уровень эстрогенов, происходящих из периферической ароматизации андрогенов) связано с хрупкостью костей. Такой эффект также наблюдается у кастрированных мужчин.
Возрастное снижение уровня андрогена у мужчин (ADAM) обозначает прогрессирующее снижение выработки андрогенов, распространенное у мужчин среднего возраста. Для синдрома характерны изменения в физической и интеллектуальной сфере, которые коррелируют и могут быть скорректированы вмешательством в среду андрогена. ADAM характеризуется биохимическим снижением уровня не только андрогена в сыворотке крови, но и других гормонов, таких как гормон роста, мелатонин и дегидроэпиандростерон. Клинические проявления включают усталость, депрессию, пониженное либидо, половую дисфункцию, нарушение эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, ожирение, саркопению, остеопению, доброкачественную гиперплазию простаты и изменения настроения и познавательной способности.
Дефицит андрогенов у женщин (ADIF) относится к целому ряду гормон-зависимых расстройств, наблюдающихся обычно у женщин после среднего возраста. Для синдрома характерны половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гопогонадизм,
саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников.
Термин "гипотрофия мышц" обозначает прогрессирующее уменьшение массы мышц и/или прогрессирующее ослабление и дегенерацию мышц, в том числе скелетных или произвольно сокращающихся мышцы, которые контролируют движение, сердечные мышцы, которые контролируют работу сердца (кардиомиопатия) и гладкой мускулатуры. Хроническая гипотрофия мышц представляет собой хроническое состояние (т.е. продолжающееся на протяжении длительного промежутка времени), для которого характерно прогрессирующее снижение мышечной массы, ослабление и дегенерация мышц. Уменьшение мышечной массы, которая происходит при гипотрофии мышц, можно характеризоваться распадом или деградацией мышечного белка. Деградация белка происходит вследствие необычно высокой скорости деградации белка, необычно низкой скорости синтеза белка или комбинации этих двух факторов. Деградация белка, вызывается ли она высокой степенью деградации белка или низкой степенью синтеза белка, приводит к снижению мышечной массы и гипотрофии мышц. Гипотрофия мышц связана с хроническими, неврологическими, генетическими или инфекционными патологиями, заболеваниями, болезнями или состояниями. К ним относятся мышечные дистрофии, такие как мышечная дистрофия Дюшенна и миотоническая дистрофия; мышечные атрофии, такие как мышечная атрофия после полиомиелита (РРМ7А) ; кахексии, такие как сердечная кахексия, кахексия при СПИДе и раковая кахексия, недоедание, лепра, диабет, почечные заболевания или хроническое обструктивное заболевание легких (СОРД), рак, конечная стадия почечной недостаточности, эмфизема, остеомаляция (размягчение костей), ВИЧ инфекция, СПИД и кардиомиопатия. Кроме того, гипотрофия мышц может быть связана и вызывается другими обстоятельствами и состояниями. Они включают хронические боли в пояснице, пожилой возраст, травмы центральной нервной системы (ЦНС), травмы периферических нервов, травмы или химическик повреждения спинного мозга,
повреждения центральной нервной системы (ЦНС), повреждения периферических нервов, химические повреждения спинного мозга, ожоги, детренированность, которое происходит при иммобилизации конечности, длительная госпитализация вследствие болезни или травмы, и алкоголизм. Гипотрофия мышц, если ее не остановить, может иметь ужасные последствия для здоровья. Например, изменения, которые происходят во время мышечной гипотрофии, могут привести к ослабленному физическому состоянию, которое является пагубным для здоровья человека, приводя к повышенной подверженности инфекции, плохой работоспособности и подверженности повреждениям.
Существует настоятельная потребность в новых инновационных подходах как на уровне фундаментальной науки, так и на клиническом уровне в разработке соединений, применимых для: а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормон-зависимых расстройств, например, состояний, связанных с возрастным снижение уровня андрогена у стареющих мужчин (ADAM), таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушение эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, остеопороз, доброкачественная гиперплазия простаты, изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; с) лечения расстройств, связанных с ADIF, таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острой и/или хронической гипотрофии мышц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; и/или д) снижения случаев, прекращения или регрессии рака простаты.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к метаболитам класса веществ, направленных на андрогеновые рецепторы (ARTA). Вещества определяют новый подкласс соединений, которые являются селективными модуляторами андрогеновых рецепторов (SARM).
Соединения SARM и их метаболиты, сами по себе или в виде композиции, можно использовать для а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормо-зависимых расстройств, например, расстройств, связанных с возрастным снижением уровня андрогенов у мужчин (ADAM), таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушения эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, остеопороз, доброкачественная гиперплазия простаты, изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; с) лечения расстройств, связанных со снижением уровня андрогенов у женщин (ADIF), таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острой и/или хронической гипотрофии мышц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; д) снижения случаев, прекращения или регрессии рака простаты; и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы I:
где G представляет собой О или S; X представляет собой О;
Т представляет собой ОН, -OR, -NHCOCH3, или NHCOR; Z представляет собой N02, CN, СООН, COR, NHCOR или CONHR; Y представляет собой водород, алкил, гидрокси-алкил или алкиловый альдегид CF3, F, I, Br, Cl, CN, С(R)3 или Sn(R)3;
R представляет собой алкил, галогеналкил, дигалогеналкил,
тригалогеналкил, CH2F, CHF2, CF3, CF:!CF3, арил, фенил, галоген, алкенил или ОН;
Ri представляет собой СН3, CH2F, CHF2, CF3, СН2СН3 или CF2CF3, и
А представляет собой или
где R2, R3, R4, R5, R6 независимо представляют собой Н, галоген, CN, NHCOCF3, ацетамидо, или трифторацетамидо.
В одном из вариантов осуществления G в соединении I представляет собой О. В другом варианте осуществления Т в соединении I представляет собой ОН. В другом варианте осуществления Ri в соединении I представляет собой СН3. В другом варианте осуществления Z в соединении I представляет собой N02. В другом варианте осуществления Z в соединении I представляет собой CN. В другом варианте осуществления Y в соединении I представляет собой CF3. В другом варианте осуществления Q в соединении I представляет собой ШСОСН3. В другом варианте осуществления Q в соединении I находится в пара-положении. В другом варианте осуществления Z в соединении I находится в пара-положении. В другом варианте осуществления Y в соединении I находится в мета-положении. В другом варианте осуществления G в соединении I представляет собой О, Т представляет собой ОН, Ri представляет собой СН3, Z представляет собой N02, Y представляет собой CF3, и Q представляет собой NHCOCH3. В другом варианте осуществления G в соединении I представляет собой О, Т представляет собой ОН, Z представляет собой CN, Y представляет собой CF3, и Q представляет собой NHCOCH3.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы I представлено структурой формулы VII:
Rf T
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо. В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы VII представлен структурой:
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо. В другом варианте осуществления метаболит соединения SARM формулы VII представлен структурой:
R2N
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо, и NR2 представляет собой NO, NHOH, NHOS03 или NHO-глюкоронид.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы I представлено структурой формулы VIII:
Z _ л
-NHCOCH3
Rf "Т УШ
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы VIII представлен структурой:
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой гидроксилированное производное соединения
SARM формулы I. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
z. ^ но.
или I II II II -4-Q
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо. В другом варианте осуществления гидроксилированный метаболит представлен структурой:
или
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
В одном из вариантов осуществления SARM метаболит представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы I. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
глюкоронид-о-у |] ?i (| "^j-Q
Г5^4 NET X "X Kf т
или
Z^. глюкоронид-О^^
глюкоронид-О G
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо. В другом варианте осуществления глкжороднидный метаболит представлен структурой:
глюкоронид-O-f |1 П (Г "-}-Q
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы I.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы II:
где X представляет собой О;
Z представляет собой N02, CN, СООН, COR, NHCOR или CONHR;
Y представляет собой CF3, F, I, Br, Cl, CN, CR3 или SnR3;
Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо;
R представляет собой алкил, галогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, CH2F, CHF2, CF3, CF2CF3, арил, фенил, F, Cl, Br, I, алкенил или ОН;
и Ri представляет собой СН3, CH2F, CHF2/ CF3, СН2СН3 или CF2CF3.
В одном из вариантов осуществления Z в соединении II представляет собой N02. В другом варианте осуществления Z в соединении II представляет собой CN. В другом варианте осуществления Y в соединении II представляет собой CF3. В другом варианте осуществления Q в соединении II представляет собой NHCOCH3. В другом варианте осуществления Z в соединении II представляет собой N02, Y представляет собой CF3, и Q представляет собой NHCOCH3. В другом варианте осуществления Z в соединении II представляет собой CN, Y представляет собой CF3, и Q представляет собой NHCOCH3.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы II представлено структурой формулы IX:
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы IX представлен структурой:
Н3С ОН NH V X.
В другом варианте осуществления метаболит соединения SARM формулы IX представлен структурой:
Н3С ОН
где NR2 представляет собой NO, NHOH, NH0SO3 или NH0-глюкоронид.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы II представлено структурой формулы X:
н3с ОН
NHCOCH3
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы X представлен структурой:
Н3С ОН
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы II. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
Н3С он
Н3С ОН
или
В другом варианте осуществления гидроксилированный метаболит представлен структурой:
но нзсчон н3с он
У Y
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы II. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
В другом варианте осуществления глюкоронидный метаболит представлен структурой:
В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы II.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы III:
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы III представлен структурой:
н3с он
02N
CF3
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы IV:
Н3С ОН
0011
NHCOCH3 IV
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы IV представлен структурой:
Н3С ОН NH X Л
^^NH,
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы IV. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой: Н С ОН Н3С он
В другом варианте осуществления гидроксилированный метаболит представлен структурой:
но н3с он
Н3С он
NHCOCH3
В одном из вариантов осуществления метаболит
SARM
представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы IV. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
HjC он
r°tX_r }.......за,
глюкоронид-О-
Н3С ОН
vNHCOCH3
CF,
глюкоронид-0
NHCOCHj
В другом варианте осуществления глюкоронидный метаболит представлен структурой:
глюкоронид-
02N'
н3с он
Н3С он
или
NHCOCH3 °2N
NHCOCH3
О- глюкоронид
В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы IV.
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой агонист андрогеновых рецепторов. В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой антагонист андрогеновых рецепторов.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции, включающей метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению и подходящий носитель или разбавитель,.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению и подходящий носитель или разбавитель.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу связывания модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором, включающим стадию контактирования андрогеновых рецепторов с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для связывания селективного модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу подавления сперматогенеза у пациента, включающему контактирование андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для подавления образования спермы.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу контрацепции у субъектов мужского пола, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению, при этом осуществляя контрацепцию у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу гормональной терапии, включающему стадию контактирования андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для осуществления изменений андроген-зависимого расстройства.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу гормональной заместительной терапии, включающему стадию контактирования андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для осуществления изменения андроген-зависимого состояния.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, с гормональным расстройством, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для осуществления изменения андроген-зависимого состояния.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего раком простаты, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения рака простаты у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики рака простаты у пациента, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для профилактики рака простаты у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу замедления прогрессирования рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для замедления прогрессирования рака простаты у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для предотвращения рецидива рака простаты у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающему стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения рецидива рака простаты у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения сухости глаз у пациента, страдающего сухостью глаз, включающему стадию контактирования андрогеновых рецепторов пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения сухости глаз у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики сухости глаз у пациента, включающему стадию контактирования андрогеновых рецепторов пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых
рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для предотвращения сухости глаз у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции апоптоза в раковых клетках, включающему стадию контактирования данной клетки с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению в количестве, эффективном для индукции апоптоза в раковых клетках.
Новые метаболиты селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению, сами по себе или в виде фармацевтической композиции, можно использовать для а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормональных расстройств, например, состояний, связанных с ADAM, таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушения эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, доброкачественная гиперплазия простаты, и изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; с) лечения состояний, связанных с ADIF, таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо,
гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острых и/или хронической гипотрофии мыщц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; д) снижения случаев, прекращения или регрессии рака простаты; и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.
Метаболиты селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению обладают значительным преимуществом по сравнению с лечением стероидных андрогеном. Несколько соединений селективных модуляторов андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению обладают неожиданной андрогенной и анаболической активностью нестероидных лигандов андрогеновых рецепторов. Другие селективные модуляторы андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению обладают неожиданной антиандрогенной активностью нестероидного лиганда в отношении
андрогеновых рецепторов. Таким образом, применение селективных модуляторов андрогеновых рецепторов, не должно сопровождаться серьезными побочными действиями, неудобством способа введения или высокой стоимостью и при этом будет обладать преимуществами пероральной биодоступности, отсутствием перекрестной реакции с другими стероидными рецепторами и длительным периодом биологического полураспада.
Краткое описание рисунков
Настоящее изобретение будет понятно и оценено более полно из следующего подробного описания в сочетании с прилагаемыми рисунками, на которых изображено:
Фиг.1: Андрогенная и анаболическая активность соединения IV на крысах. Крыс не подвергали обработке (интактный контроль), кастрировали (кастрированный контроль), давали им тестостерон пропионат (TP) или соединение IV, и при этом определяли прибавление веса тела, а также вес андроген-чувствительных тканей (предстательной железы, семенных пузырьков и мышцы levator ani).
Фиг.2: Андрогенная и анаболическая активность соединения IV на крысах. Крыс не подвергали обработке (интактный контроль), кастрировали (кастрированный контроль), дали 0,1, 0,3, 0,5, 0,75 и 1,0 мг/день тестостерон пропионата (TP) или 0,1, 0,3, 0,5, 0,75 и 1,0 мг/день соединения IV, и определяли вес андроген-чувствительных тканей (предстательной железы, семенных пузырьков и мышцы levator ani).
Фиг.3: Андрогенная и анаболическая активность соединения III на крысах. Крыс не подвергали обработке (интактный контроль), кастрировали (кастрированный контроль), им давали 0,1, 0,3, 0,5, 0,75 и 1,0 мг/день тестостерон пропионата (TP) или 0,1, 0,3, 0,5, 0,75 и 1,0 мг/день соединения III, и определяли вес андроген-ответственных тканей (предстательной железы, семенных пузырьков и мышцы levator ani).
Фиг.4: Средние профили концентрация в плазме крови - время для соединения IV у собак биглей после введения соединения IV в дозе 3 и 10 мг/кг.
Фиг.5: Средние профили концентрация в плазме крови - время
для соединения IV у собак биглей после перорального введения в виде раствора в дозе 10 мг/кг.
Фиг.б: Средние профили концентрация в плазме крови - время для соединения IV у собак биглей после введения IV в виде капсул в дозе мг/кг.
Фиг.7: Влияние соединения III и соединения IV на уровень
LH.
FSH.
Фиг.8: Влияние соединения III и соединения IV на уровень
Фиг.9: Схема синтеза соединения IV.
Фиг.10: Масс-спектр MS2 спектр соединения IV и его аминного метаболита. Фиг.1OA: Характер фрагментации соединения IV. Фиг.ЮЬ: Характер фрагментации аминного метаболита.
Фиг.11: Рентгенограмма 24 часов образцов мочи и фекалий крысы после введения соединения IV. Фиг. НА: моча. Фиг. 11В: фекалии.
Фиг.12: Метаболический профиль соединения IV у крыс и собак.
Фиг.13: Метаболизм соединения IV in vitro под действием рекомбинантного CYP Supersomes(r) человека (п=2). Соединение IV (2 мкМ) инкубировали с рекомбинантным CYP Supersomes(r) человека (40 пмоль) при 37°С в течение 2 часов. Измеряли исчезновение соединения IV.
Фиг.14: Метаболизм соединения III in vitro под действием рекомбинантного CYP Supersomes(r) человека (п=2). Соединение III (2 мкМ) инкубировали с рекомбинантным CYP Supersomes(r) человека (40 пмоль) при 37°С в течение 2 часов. Измеряли исчезновение соединения III. После инкубации 20% соединения III метаболизировали с помощью CYP3A4 человека.
Фиг. 15: Метаболизм соединения IV in vitro в микросомах печени человека (HLM).
Фиг.16: Метаболизм соединения III in vitro в микросомах печени человека (HLM).
Фиг.17: Метаболизм in vitro соединения IV до Ml под действием CYP. Исчезновение Ml измеряли в трехкратной
повторности.
Фиг.18: Метаболизм in vitro соединения IV до Ml под действием HLM (0,2 мг/мл). Исчезновение Ml измеряли в трехкратной повторности.
Фиг.19: А. Фаза I пути метаболизма 14C-S4 (однородно меченое В-кольцо), определенная в препаратах печени человека, крысы и собаки. Радиохроматограмма отображает метаболизм 14C-S4 посредством собранного S9 печени человека.
Фиг. 20: Масс-спектр MS2 спектр (ESI метод отрицательных ионов) S4 и продуктов восстановления и деацетилирования Ml, М4 и М5.
Фиг.21: Масс-спектр MS2 спектр (ESI метод отрицательных ионов) продуктов окисления S4-OH, М1-0Н и М4-ОН. Были идентифицированы три различных метаболита окисления S4 с различным характером фрагментации (А, В и С).
Фиг.22:А. Реакция биотинилирования S4 с использованием NHS-биотина. В. Радиохроматограмма, отображающая отделение биотинилированного 14С-М2 и 14С-М2-ОН от 14С-М3.
Фиг.23: Масс-спектр MS2 спектр (ESI метод отрицательных ионов) продуктов гидролиза амидной связи МЗ, МЗ-ОН и биотинилированных М2 и М2-ОН (В, С).
Фиг.24: Относительное содержание основных метаболитов in vitro 14C-S4 после инкубирования с различными препаратами ферментов печени. А. Метаболический профиль 14C-S4 в присутствии S9 печени человека, крысы и собаки. В. Метаболический профиль 14C-S4 в присутствии различных субклеточных фракций печени человека.
Фиг.25: Ферментативная кинетика метаболизма S4 посредством CYP3A4, измеренная по исчезновению S4. Реакцию проводили в присутствии 200 пмоль/мл CYP3A4 в течение 10 минут при 37°С.
Фиг.26: Транскрипционная активация AR in vitro посредством Ml с использованием анализа сотрансфекции. Активация посредством Ml представлена как процент активации, полученной в присутствии 0,1 нМ DHT.
Фиг.27: Профили концентрация в плазме крови-время для S-1
после внутривенного и перорального введения самцам крыс Spargue-Dawley (п=5/группы дозировки). Непрерывные символы указывают дозировки при пероральном пути, тогда как прерывистые символы указывают дозы при внутривенном пути. Треугольник, 30 мг/кг; квадрат, 10 мг/кг; круг, 1 мг/кг; ромб, 0,1 мг/кг. Фиг.28: Фрагментация S-1 в масс-спектре.
Фиг.29: Предполагаемый путь фрагментации S-1 в условиях диссоциации, индуцированной соударением.
Фиг.30. Метаболиты S-1, идентифицированные в моче крысы.
Фиг.31. Сравнение хроматографического и масс-спектрального поведения Ml и синтетического стандарта - 3-(4-фторфенокси)-2-гидрокси-2-метилпропановой кислоты (с использованиеим подвижной фазы 2). А, образцы мочи крысы 0-12 часов, В, синтетический стандарт.
Фиг.32: Предполагаемый основной путь метаболизма S-1 у самцов крыс Spargue-Dawley.
Фиг.33: Цитотоксичность S-1 и S-4 в клетках HepG2, измеренная с помощью анализа SRB (п=3) после обработки в течение 72 часов. Данные представлены как среднее значение + среднеквадратичное отклонение.
Фиг.34. Влияние S-4 (2мкМ), S-1 (2мкМ), рифампицина (RIF) (10 мкМ) и Р-нафтофлавона (BNF) (50 мкМ) на активность и экспрессию CYP1A2. Активность фермента CYP измеряли в трехкратной повторности, и результаты представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Содержание фермента оценивали путем сравнения плотности полосы со стандартной кривой, полученной с использованием препаратов Supersorae(r), и нормализовали с помощью уровня экспрессии Р-актина. Образец микросом печени человека (HLM) включали в качестве положительного контроля для иммуноблота. Для контрольных образцов нормализовали кратность изменения уровня мРНК.
Фиг.35. Влияние S-4 (2мкМ), S-1 (2мкМ), рифампицина (RIF) (10 мкМ) и Р-нафтофлавона (BNF) (50 мкМ) на активность и экспрессию CYP2C9. Активность фермента CYP измеряли в трехкратной повторности, и результаты представлены как среднее
значение ± среднеквадратичное отклонение. Содержание фермента оценивали путем сравнения плотности полосы со стандартной кривой, полученной с использованием препаратов Supersome(r), и
нормализовали с помощью уровня экспрессии Р-актина. Образец микросом печени человека (HLM) включали в качестве положительного контроля для иммуноблота. Для контрольных образцов нормализовали кратность изменения уровня мРНК.
Фиг.36. Влияние S-4 (2мкМ), S-1 (2мкМ), рифампицина (RIF) (10 мкМ) и Р-нафтофлавона (BNF) (50 мкМ) на активность и экспрессию CYP2C19. Активность фермента CYP измеряли в трехкратной повторности, и результаты представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Содержание фермента оценивали путем сравнения плотности полосы со стандартной кривой, полученной с использованием препаратов Supersome(r), и нормализовали с помощью уровня экспрессии р-актина. Образец микросом печени человека (HLM) включали в качестве положительного контроля для иммуноблота. Для контрольных образцов нормализовали кратность изменения уровня мРНК.
Фиг.37. Влияние S-4 (2мкМ), S-1 (2мкМ), рифампицина (RIF) (10 мкМ) и Р-нафтофлавона (BNF) (50 мкМ) на активность и экспрессию CYP2D6. Активность фермента CYP измеряли в трехкратной повторности, и результаты представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Содержание фермента оценивали путем сравнения плотности полосы со стандартной кривой, полученной с использованием препаратов Supersome(r), и нормализовали с помощью уровня экспрессии р-актина. Образец микросом печени человека (HLM) включали в качестве положительного контроля для иммуноблота. Для контрольных образцов нормализовали кратность изменения уровня мРНК.
Фиг.38. Влияние S-4 (2мкМ), S-1 (2мкМ), рифампицина (RIF) (10 мкМ) и Р-нафтофлавона (BNF) (50 мкМ) на активность и экспрессию CYP3A4. Активность фермента CYP измеряли в трехкратной повторности, и результаты представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Содержание фермента
оценивали путем сравнения плотности полосы со стандартной кривой, полученной с использованием препаратов Supersome(r), и нормализовали с помощью_ уровня экспрессии Р-актина. Образец микросом печени человека (HLM) включали в качестве положительного контроля для иммуноблота. Для контрольных образцов нормализовали кратность изменения уровня мРНК. Подробное описание изобретения
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к метаболитам класса веществ, направленных на андрогеновый рецептор (ARTA). Эти вещества определяют новый подкласс соединений, которые являются селективными модуляторами андрогеновых рецепторов (SARM). Было установлено, что некоторые из соединений SARM обладают неожиданной андрогенной и анаболической активностью нестероидных лигандов андрогеновых рецепторов. Соединения SARM, сами по себе или в виде композиции, могут использоваться для а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормонозависимых расстройств, например, состояний, связанных с ADAM, таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушения эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, доброкачественная гиперплазия простаты, и изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; с) лечения состояний, связанных со снижением уровня андрогенов у женщин (ADIF), таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острых и/или хронической гипотрофии мыщц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; д) снижения случаев, прекращения или регрессии рака простаты; и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых
рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы I:
Rf 'Т I
где G представляет собой О или S; X представляет собой О;
Т представляет собой ОН, -OR, -NHCOCH3, или NHCOR;
Z представляет собой N02, CN, СООН, COR, NHCOR или CONHR;
Y представляет собой водород/ алкил, гидрокси-алкил или алкиловый альдегид CF3, F, I, Br, Cl, CN, С (R) 3 или Sn(R)3;
R представляет собой алкил, галогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, CH2F, CHF2, CF3, CF2CF3, арил, фенил, галоген, алкенил или ОН;
Rx представляет собой СН3, CH2F, CHF2, CF3/ СН2СН3 или CF2CF3, и
А представляет собой или
R5 'R4
где R2, R3/ R4, R5, R6 независимо представляют собой Н, галоген, CN, NHCOCF3, ацетамидо, или трифторацетамидо.
Как подразумевается в данном описании, настоящее изобретение относится к метаболитам селективного модулятора андрогеновых рецепторов формулы I. Однако также подразумевается, что в объем настоящего изобретения входят аналоги, изомеры, метаболиты, производные, фармацевтически приемлемые соли, фармацевтические продукты, гидраты, N-оксиды, примеси, полиморфы или кристаллы соединения формулы I или любое их сочетание.
В одном из вариантов осуществления данное изобретение относится к аналогу соединения формулы I. В другом варианте
осуществления данное изобретение относится к производному соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к изомеру соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к метаболиту соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к фармацевтически приемлемой соли соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к фармацевтическому продукту соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к гидрату соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к N-оксиду соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к примеси соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полиморфу соединения формулы I. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к кристаллу соединения формулы I.
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к комбинации любого из аналога, производного, метаболита, изомера, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, примеси, метаболита, полиморфа или кристалла соединения формулы I.
В одном из вариантов осуществления G в соединении I представляет собой О. В другом варианте осуществления Т в соединении I представляет собой ОН. В другом варианте осуществления Ri в соединении I представляет собой СН3. В другом варианте осуществления Z в соединении I представляет собой N02. В другом варианте осуществления Z в соединении I представляет собой CN. В другом варианте осуществления Y в соединении I представляет собой CF3. В другом варианте осуществления Q в соединении I представляет собой ШСОСН3. В другом варианте осуществления Q в соединении I находится в пара-положении. В другом варианте осуществления Z в соединении I находится в пара-положении. В другом варианте осуществления Y в соединении I находится в мета-положении. В другом варианте осуществления G в соединении I представляет собой О, Т представляет собой ОН, Ri представляет собой СН3, Z представляет собой N02, Y
представляет собой CF3, и Q представляет собой NHCOCH3. В другом варианте осуществления G в соединении I представляет собой О, Т представляет собой ОН, Rx представляет собой СН3, Z представляет собой CN, Y представляет собой CF;J, и Q представляет собой NHCOCH3.
Заместители Z и Y могут находиться в любом положении кольца, содержащего данные заместители (далее упоминаемое как "кольцо А"). В одном из вариантов осуществления заместитель Z находится в пара-положении кольца А. В другом варианте осуществления заместитель Y находится в мета-положении кольца А. В другом варианте осуществления заместитель Z находится в пара-положении кольца А, и заместитель Y находится в мета-положении кольца А.
Заместитель Q может находиться в любом положении кольца, содержащего данный заместитель (далее упоминаемое как "кольцо В"). В одном из вариантов осуществления заместитель Q находится в пара-положении кольца В. В другом варианте осуществления заместитель Q представляет собой ШСОСН3 и находится в пара-положении кольца В. В другом варианте осуществления заместитель Q представляет собой F и находится в пара-положении кольца В.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы I представлено структурой формулы VII:
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы VII представлен структурой:
В другом варианте осуществления метаболит соединения SARM формулы VII представлен структурой:
02N
H2N
Rf 1
где NR2 представляет собой NO, NHOH, NHOS03 или NHO-глюкоронид.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы I представлено структурой формулы VIII:
NHCOCH3
*f 'Т УШ
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы VIII представлен структурой:
Rf Т
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы I. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
НО.
или
В другом варианте осуществления метаболит представлен структурой:
или
гидроксилированный
rRf Т
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы I. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
В другом варианте осуществления глюкоронидный метаболит представлен структурой:
глюкоронид-О-
В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы I.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы II:
где X представляет собой О;
Z представляет собой N02, CN, СООН, COR, NHCOR или CONHR;
Y представляет собой CF3, F, I, Br, Cl, CN, CR3 или SnR3;
Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо;
R представляет собой алкил, галогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, CH2F, CHF2, CF3, CF2CF3, арил, фенил, F, Cl, Br, I, алкенил или ОН;
и Rx представляет собой СН3, CH2F, CHF2, CF3, СН2СН3 или CF2CF3.
Как подразумевается в данном описании, настоящее изобретение относится к метаболитам селективного модулятора андрогеновых рецепторов формулы II. Однако также подразумевается, что в объем настоящего изобретения входят аналоги, изомеры, метаболиты, производные, фармацевтически
приемлемые соли, фармацевтические продукты, гидраты, N-оксиды, примеси, полиморфы или кристаллы соединения формулы I или любое их сочетание.
В одном из вариантов осуществления данное изобретение относится к аналогу соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к производному соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к изомеру соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к метаболиту соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к фармацевтически приемлемой соли соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к фармацевтическому продукту соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к гидрату соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к N-оксиду соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к примеси соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к полиморфу соединения формулы II. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к кристаллу соединения формулы II.
В другом варианте осуществления данное изобретение относится к комбинации любого из аналога, производного, метаболита, изомера, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, примеси, метаболита, полиморфа или кристалла соединения формулы II.
В одном из вариантов осуществления Z в соединении II представляет собой N02. В другом варианте осуществления Z в соединении II представляет собой CN. В другом варианте осуществления Y в соединении II представляет собой CF3. В другом варианте осуществления Q в соединении II представляет собой NHCOCH3 .
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы II представлено структурой формулы IX:
Ч/^Q
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы IX представлен структурой:
Н3С ОН
В другом варианте осуществления метаболит соединения SARM формулы IX представлен структурой:
Н3С ОН 4 /
R2N
где NR2 представляет собой NO, NHOH, NHOS03 или NHO-глюкоронид.
В одном из вариантов осуществления соединение SARM формулы II представлено структурой формулы X:
Н3С ОН
NHCOCH3
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы X представлен структурой:
Н3С ОН
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой гидроксилированное производное соединение SARM формулы II. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
Н3С он
Y Y
В другом варианте осуществления метаболит представлен структурой:
или
НзС ОН
гидроксилированныи
но н3с он
4N V О.
Н3С ОН
или
У Y
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы II. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
H3q ОН
"л или
глюкоронид-о Z
У У
В другом варианте осуществления глюкоронидный метаболит представлен структурой:
НзС ОН
глюкоронид-O ОН
или
О-глюкоронид
В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы II.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM) , где соединение S.ARM представлено структурой формулы III:
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы III представлен структурой:
н3с ОН
0,N
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к метаболиту селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где соединение SARM представлено структурой формулы IV:
Н3С ОН
02N
I д
"ШСОСНз
CF3
В одном из вариантов осуществления метаболит соединения SARM формулы IV представлен структурой:
Н3С ОН NH X. .О.
0,N
NH2
CF3
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы IV. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
н3с он
H3C он NH V ,0^
ИЛИ
4NHC0CH3
CF3
В другом варианте осуществления метаболит представлен структурой:
но н3с он
o^^Y Ч^ННСОСНз <**
CF3
СОСНз
гидроксилированныи
Н3С он
шсосн.
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы IV. В соответствии с данным вариантом осуществления метаболит может быть представлен структурой:
Н3С он
или
vNHCOCH3
н3с он Ч"Ч Ян
глюкоронид-О-4- |1 II ||
OaN^S^ ° ^^NHCOCH, В другом варианте осуществления глюкоронидный метаболит представлен структурой:
Н3С он
глюкоронид-0
У Л
ИЛИ NHCOCH3
j^T ХХШСоснз
CF3
О- глюкоронид
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы IV.
В одном из вариантов осуществления метаболит SARM представляет собой агонист андрогеновых рецепторов. В другом варианте осуществления метаболит SARM представляет собой антагонист андрогеновых рецепторов.
В некоторых вариантах осуществления метаболиты могут быть идентифицированы с использованием различных ферментативных препаратов печени.
В некоторых вариантах осуществления метаболиты SARM по настоящему изобретению включают деацетилированные производные,
гидролизованные производные или производные, включающие окисленные или, в другом варианте осуществления, восстановленные нитрогруппы или восстановленные ароматические кольца.
В некоторых вариантах осуществления метаболиты будут включать модификации метаболически лабильных сайтов, которые в одном из вариантов осуществления улучшают метаболическую стабильность соединения и, в другом варианте осуществления, поддерживают агонистическую активность.
В одном из вариантов осуществления деацетилированные метаболиты связывают AR и полагают начало транскрипционной активности in vitro, что в другом варианте осуществления вносит свой вклад в фармакологическую активность соединения S4 in vivo.
Гидролиз амидной связи и деацитилирование ацетамида происходят как в цитозольной, так и в микросомальной фракциях препаратов печени человека, как проиллюстрировано в данном описании. Цитозольные ферменты главным образом катализируют реакции гидролиза, тогда как микросомальные ферменты в первую очередь катализируют реакцию деацетилирования, что позволяет предположить, что микросомальные ферменты CYP также могут быть ответственными за гидролиз и деацетилирование молекулы. CYP3A4 отвечает за метаболизм более чем 7 0% представленных на рынке лекарственных препаратов, при этом окисление является наиболее общей метаболической реакцией. Аналогично CYP3A4 отвечает за окисление S4 in vitro и даже бикалутамидное окисление в организме людей, однако неожиданно оказалось, что CYP3A4 человека является одним из главных микросомальных ферментов CYP, которые могут также катализировать реакции гидролиза.
В одном из вариантов осуществления идентификация метаболитов in vitro может быть осуществлена с использованием ВЭЖХ разделения и масс-спектрометрического анализа метаболитов. В одном из вариантов осуществления наличие как карбокси, так и аминогруппы в такой молекуле может приводить к тому, что она будет чрезвычайно гидрофильной, при этом такой анализ может быть трудновыполнимым, поскольку такая молекула будет не легко
отделяться от фронта растворителя или в кислотных, или в основных условиях. Для облегчения такого разделения без использования строгих условий при приготовлении образца и/или разделении можно использовать метод получения производных, часто используемый при анализе аминокислот, например, NHS-биотин используют для модификации первичных аминогрупп. Ароматическая аминогруппа может служить субстратом для аналогичной модификации. Присоединение большой молекулы биотина увеличивает время удерживания молекулы на колонке и эффективность ионизации при масс-спектрометрическом анализе, как проиллюстрировано в данном описании. Мягкие условия реакции (комнатная температура, нейтральный рН) исключают возможный гидролиз вследствие искусственных воздействий (например, сильнокислые условия). Разработанный в данной заявке дизайн обеспечивает, в других вариантах осуществления, стратегию анализа высоко гидрофильных метаболитов, которые содержат первичные аминогруппы. Определения
Заместитель R определен в данном описании как алкил, галогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, CH2F, CHF2/ CF3, CF2CF3, арил, фенил, F, Cl, Br, I, алкенил или гидроксил (ОН).
Термин "алкильная" группа относится в данном описании к насыщенному алифатическому углеводороду, включая линейные, разветвленные и циклические алкильные группы. В одном из вариантов осуществления алкильная группа содержит 1-12 атомов углерода. В другом варианте осуществления алкильная группа содержит 1-7 атомов углерода. В другом варианте осуществления алкильная группа содержит 1-6 атомов углерода. В другом варианте осуществления алкильная группа содержит 1-4 атомов углерода. Алкильная группа может быть незамещенной или замещенной одной или несколькими группами, выбранными из галогена (например, F, Cl, Br, I), гидрокси, алкокси, карбонила, амидо, алкиламидо, диалкиламидо, нитро, амино, аллкиламино, диалкиламино, карбоксила, тио и тиоалкила.
Термин "галогеналкильная" группа относится в данном описании к алкильной группе, как определено выше, которая
является замещенной одним илии несколькими атомами галогена, например, F, Cl, Вг, или I. Термин "галоген" относится к элементам Группы VII периодической системы, например, к F, С1, Вг, или I.
Термин "арильная" группа относится в данном описании к ароматической группе, имеющей по крайней мере одну карбоциклическую ароматическую группу или гетероциклическую ароматическую группу, которая может быть незамещенной или замещенной одной или несколькими группами, выбранными из галогена (например, F, Cl, Br, I), галогеналкила, гидрокси, алкоксикарбонила, амидо, алкиламидо, диалкиламидо, нитро, амино, алкиламино, диалкиламино, карбокси или тио, или тиоалкила. Не ограничивающими примерами арильных колец являются фенил, нафтил, пиранил, пирролил, пиразинил, пиримидинил, пиразолил, пиридинил, фуранил, тиофенил, тиазолил, имидазолил, изоксазолил и тому подобные.
Термин "гидроксильная" группа относится в данном описании к ОН группе. Термин "алкенильная" группа относится к группе, имеющей по крайней мере одну углерод-углеродную двойную связь.
Термин "арилалкильная" группа относится в данном описании к алкилу, связанному с арилом, где алкил и арил являются такими, как определено выше. Примером аралкильной группы является бензильная группа.
Как подразумевается в описании настоящего изобретения относится к использованию метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению. Однако также подразумевается, что в объем настоящего изобретения входят аналоги, изомеры, метаболиты, производные, фармацевтически приемлемые соли, фармацевтические продукты, гидраты, N-оксиды, примеси, полиморфы или кристаллы соединения по настоящему изобретению или любое их сочетание.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению аналога соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению производного соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению изомера соединения SARM. В другом
варианте осуществления изобретение относится к применению метаболита соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению фармацевтически приемлемой соли соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению фармацевтического продукта соединения SARM. В другом варианте; осуществления изобретение относится к применению гидрата соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению N-оксида соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению полиморфа соединения SARM. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению кристалла соединения SARM.
В другом варианте осуществления изобретение относится к применению любой комбинации аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата или N-оксида, метаболита, полиморфа или кристалла соединений SARM по настоящему изобретению.
Как определено в данном описании термин "метаболит" означает вещество, которое может бь::ть преобразовано in vivo в биологически активный агент посредством реакций гидролиза, этерификации, деэтерификации, активации, солеобразования и тому подобных.
Как определено в данном описании термин "изомер" включает, но не ограничивается указанным, оптические изомеры и аналоги, структурные изомеры и аналоги, конформационные изомеры и аналоги и тому подобное.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению различных оптических изомеров соединений SARM. Специалистам в данной области будет понятно, что соединения SARM по настоящему изобретению содержат по крайней мере один хиральный центр. Соответственно, соединения SARM,
использованные в способах по настоящему изобретению, могут существовать или быть выделены в виде оптически активных или рацемических форм. Некоторые соединения также могут проявлять полиморфизм. Следует понимать, что настоящее изобретение охватывает любые рацемические, оптически активные, полиморфные
или стереоизомерные формы или их смеси, где указанные формы обладают свойствами, полезными в описанных здесь способах. В одном из вариантов осуществления соединения SARM представляют собой чистые (R)-изомеры. В другом варианте осуществления соединения SARM представляют собой чистые (S)-изомеры. В другом варианте осуществления соединения SARM представляют собой смесь
(R)- и (S)-изомеров. В другом варианте осуществления соединения SARM представляют собой рацемическую смесь, включающую равное количество (R) - и (S)-изомеров. В данной области хорошо известно, каким образом получают оптически активные формы
(например, разделением рацемической формы методами перекристаллизации, синтезом из оптически активных исходных веществ, хиральным синтезом или хроматографическим разделением с использованием хиральной неподвижной фазы).
Данное изобретение включат фармацевтически приемлемые соли аминозамещенных соединений с органическими или неорганическими кислотами, например, лимонной кислотой или хлористоводородной кислотой. Изобретение также включает N-оксиды описанных здесь аминозамещенных соединений. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть получены из фенольных соединений с помощью обработки неорганическими основаниями, например, гидроксидом натрия. Также могут быть получены сложные эфиры фенольных соединений с алифатическими и ароматическими карбоновыми кислотами, например, сложные эфиры уксусной кислоты и бензойной кислоты.
Кроме того, данное изобретение включает производные соединений SARM. Термин "производные" включает, но не ограничивается указанным, производные простых эфиров, производные кислот, производные амидов, сложноэфирные производные и тому подобные. Помимо этого, данное изобретение кроме того дополнительно включает гидраты соединений SARM. Термин "гидрат" включает, но не ограничивается указанным, полугидрат, моногидрат, дигидрат, тригидрат и тому подобные.
Кроме того, данное изобретение включает метаболиты соединений SARM. Термин "метаболит" означает любое вещество, получаемое из другого вещества при метаболизме или
метаболическом процессе.
Кроме того, данное изобретение включает фармацевтические продукты соединений SARM. Термин "фармацевтический продукт" означает композицию, подходящую для фармацевтического применения (фармацевтическая композиция) , как определено в данном описании.
Кроме того, данное изобретение включает кристаллы соединений SARM. Более того, данное изобретение относится к полиморфам соединений SARM. Термин "кристалл" означает вещество в кристаллическом состоянии. Термин "полиморф" относится к определенному кристаллическому состоянию вещества, обладающему определенными физическими свойствами, такими как дифракция рентгеновских лучей, ИК-спектр, температура плавления и тому подобное.
Биологическая активность селективных модуляторов андрогеновых рецепторов
Селективные модуляторы андрогеновых рецепторов (SARM) представляют собой новый класс веществ, направленных на андрогеновый рецептор ("ARTA"), которые, как было показано ранее, можно использовать для а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормонозависимых растройств, например, растройств, связанных с возрастным снижением уровня андрогена у мужчин (ADAM), таких как усталость, депрессия, пониженное либидо, половая дисфункция, нарушение эрекции, гипогонадизм, остеопороз, выпадение волос, анемия, ожирение, саркопения, остеопения, остеопороз, доброкачественная гиперплазия простаты, изменения настроения и познавательной способности и рак простаты; с) лечения состояний, связанных со снижением уровня андрогенов у женщин (ADIF), таких как половая дисфункция, пониженное сексуальное либидо, гипогонадизм, саркопения, остеопения, остеопороз, изменения настроения и познавательной способности, депрессия, анемия, выпадение волос, ожирение, эндометриоз, рак молочной железы, рак матки и рак яичников; d) лечения и/или профилактики острых и/или хронической гипотрофии мыщц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; д) снижения
случаев, прекращения или регрессии рака простаты; и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках.
Как использовано в настоящем описании, рецепторы для внеклеточных сигнальных молекул собирательно именуются как "клеточные сигнальные рецепторы". Многие сигнальные рецепторы клетки представляют собой трансмембранные белки на клеточной поверхности; где при связывании с внеклеточной сигнальной молекулой (т.е. лигандом), они активируются и запускают каскад внутриклеточных сигналов, которые изменяют поведение клетки. Напротив, в некоторых случаях рецепторы находятся внутри клетки и сигнальный лиганд должен проникнуть в клетку для ее активации; поэтому такие сигнальные молекулы должны быть достаточно маленькими и гидрофобными, чтобы диффундировать через плазматическую мембрану клетки.
Стероидные гормоны представляют собой один из примеров небольших гидрофобных молекул, которые диффундируют непосредственно через плазматическую мембрану клеток-мишеней и связываются с внутриклеточными сигнальными рецепторами. Эти рецепторы близки по структуре и образуют суперсемейство внутриклеточных рецепторов (суперсемейство рецепторов сетероидных гормонов). К рецепторам стероидных гормонов относятся рецепторы прогестеронов, рецепторы эстрогенов, рецепторы андрогенов, рецепторы глюкокортикоидов и рецепторы минералокортикоидов. Настоящее изобретение конкретно относится к андрогеновым рецепторам.
В дополнение к лигандному связыванию с рецепторами, рецепторы могут быть блокированы для предотвращения лигандного связывания. Когда вещество связывается с рецептором, то трехмерная структура вещества хорошо подходит к пространству, созданному трехмерной структурой рецептора в конфигурации шар-углубление. Чем лучше шар подходит к углублению, тем более прочно он удерживается. Это явление называется аффинностью. Если аффинность вещества больше аффинности природного гормона, то он будет конкурировать с гормоном и чаще связываться с сайтом связывания. После связывания сигналы могут посылаться через рецептор в клетку, вызывая некоторым образом ответ
клетки. Это называется активацией. При активации активированный рецептор затем непосредственно регулирует транскрипцию специфических генов. Но для активации клетки вещество и рецептор могут иметь определенные свойства, отличные от аффинности. Могут образовываться химические связи между атомами вещества и атомами рецепторов. В некоторых случаях это приводит к изменению конфигурации рецептора, что достаточно для начала процесса активации (называемой сигнальной трансдукцией).
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к селективным модуляторам андрогеновых рецепторов, которые являются соединениями-агонистами. Ангонист рецептора представляет собой вещество, которое связывается с рецепторами и активирует их. Таким образом, в одном из вариантов осуществления соединения SARM по настоящему изобретению могут использоваться для связывания и активации рецепторов стероидных гормонов. В одном из вариантов осуществления соединение-агонист по настоящему изобретению представляет собой агонист, который связывается с андрогеновым рецептором. В другом варианте осуществления соединение обладает высокой аффинностью к рецептору андрогена. В другом варианте осуществления агонистическое соединение В-изо обладает анаболической активностью. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к селективным модуляторам андрогеновых рецепторов, которые обладают агонистической и анаболической активностью нестероидного соединения в отношении андрогеновых рецепторов.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к селективным модуляторам андрогеновых рецепторов, которые являются соединениями-антагонистами. Антагонист рецептора представляет собой вещество, которое связывается с рецепторами и инактивирует их. Таким образом, в одном из вариантов осуществления соединения SARM по настоящему изобретению можно использовать для связывания и инактивации рецепторов стероидных гормонов. В одном из вариантов осуществления соединение-антагонист по настоящему изобретению представляет собой антагонист, который связывается с
андрогеновым рецептором. В другом варианте осуществления соединение обладает высокой аффинностью к андрогеновому рецептору.
Еще в одном из вариантов осуществления соединения SARM по настоящему изобретению могут быть классифицированы как частичные агонисты/антагонисты AR. Соединения SARM являются агонистами AR в некоторых тканях, вызывая повышенную транскрипцию AR-ответных генов (например, анаболическое действие в мышцах). В других тканях, эти соединения служат ингибиторами в отношении AR, предотвращая антагонистическое действие природных андрогенов.
Методы для определения того, являются ли соединения по настоящему изобретению агонистами или антагонистами AR, хорошо известны специалисту в данной области. Например, агонистическая активность в отношении AR может быть определена путем мониторинга способности соединений SARM поддерживать и/или стимулировать рост содержащий AR ткани, такой как предстательная железа и семенные пузырьки, измеряя их вес. Активность антагониста AR может быть определена путем мониторинга способности соединений SARM ингибировать рост содержащий AR ткани.
Соединения по настоящему изобретению связываются с андрогеновым рецептором либо обратимо, либо необратимо. В одном из вариантов осуществления андрогеновый рецептор представляет собой андрогеновый рецептор млекопитающего. В другом варианте осуществления андрогеновый рецептор представляет собой андрогеновый рецептор человека. В одном из вариантов осуществления соединения SARM обратимо связываются с андрогеновым рецептором млекопитающего, например человека. Выражение "обратимое связывание" соединения с рецептором означает, что соединение может отсоединяться от рецептора после связывания.
В другом варианте осуществления соединения SARM необратимо связываются с андрогеновым рецептором млекопитающего, например человека. Таким образом, в одном из вариантов осуществления соединения по настоящему изобретению могут содержать
функциональную группу (например, метку аффинности), которая делает возможным алкилирование андрогеновых рецепторов (т.е. образования ковалентной связи). Таким образом в данном случае соединения являются алкилирующими агентами, которые необратимо связываются с рецептором и, соответственно, не могут вытесняться на стероид, такой как эндогенные лиганды DHT и тестостерон. Термин "алкилирующий агент" определен в данном описании как агент, который алкилирует (образует ковалентную связь) с клеточным компонентом, таким как ДНК, РНК или фермент. Это химический агент, обладающий высокой реакционноспособной способностью, который вводит алкильные радикалы в биологически активные молекулы и тем самым предотвращает их надлежащее функционирование. Алклирующая группа представляет собой электрофильную группу, которая взаимодействует с нуклеофильными группами в клеточных компонентах.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ связывания метаболитов SARM по настоящему изобретению с андрогеновым рецептором путем контактирования андрогеновых рецепторов с метаболитом SARM и/или его аналогом, производным, изомером, метаболитом, фармацевтически приемлемой солью, фармацевтическим продуктом, гидратом, N-оксидом, метаболитом, полиморфом, кристаллом или любой их комбинацией в условиях, эффективных для того, чтобы вызвать связывание селективного модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором. Связывание селективных модуляторов андрогеновых рецепторов с андрогеновыми рецепторами делает возможным использовать соединения по настоящему изобретению в качестве мужского контрацептива и в некоторых видах гормональной терапии. Соединения-агонисты связываются с андрогеновым рецептором и активируют его. Соединения-агонисты связываются с андрогеновым рецептором и инактивируют его. Связывание соединений-агонистов либо антагонистов является либо обратимым, или необратимым.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения разработан способ подавления сперматогенеза у пациента путем контактирования андрогеновых
рецепторов в организме пациент с метаболитом SARM по настоящему изобретению и/или его аналогом, производным, изомером, метаболитом, фармацевтически приемлемой солью, фармацевтическим продуктом, гидратом, N-оксидом, метаболитом, полиморфом, кристаллом или любой их комбинацией в количестве, эффективном для связывания селективного модулятора андрогеновых рецепторов, с андрогеновым рецептором и подавления сперматогенеза.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу контрацепции пациента мужского пола, включающему стадию введения пациенту соединения SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для подавления образования спермы в организме пациента, и тем самым осуществления контрацепции у пациента.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ гормональной терапии пациента (т.е. страдающего от андроген-зависимого состояния), который включает контактирование андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом SARM по настоящему изобретению и/или его аналогом, производным, изомером, метаболитом, фармацевтически приемлемой солью, фармацевтическим продуктом, гидратом, N-оксидом, метаболитом, полиморфом., кристаллом или любой их комбинацией в количестве, эффективном для связывания селективного модулятора андрогеновых рецепторов, с андрогеновым рецептором и осуществления изменений андроген-зависимого состояния.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ гормональной заместительной терапии пациента, который включает контактирование андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом SARM по настоящему изобретению и/или его аналогом, производным, изомером, метаболитом, фармацевтически приемлемой солью, фармацевтическим продуктом, гидратом, N-оксидом, метаболитом,
полиморфом, кристаллом или любой их комбинацией в количестве, эффективном для связывания селективного модулятора андрогеновых рецепторов, с андрогеновым рецептором и осуществления изменений андроген-зависимого состояния.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ лечения пациента, имеющего гормональное заболевание, который включает введение пациенту метаболита SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для связывания соединения SARM с андрогеновым рецептором и осуществления изменений андроген-зависимого состояния.
К андроген-зависимым состояниям, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, относятся состояния, которые связаны со старением, такие как гипогонадизм, саркопения, эритропоэз, остеопороз и любые другие заболевания, определяемые как зависимые от низкого уровня андрогена (например, тестостерона).
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ лечения пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для лечения рака простаты у пациента.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ профилактики рака простаты у пациента, включающий стадию введения пациенту метаболита SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для предотвращения рака простаты у пациента.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ замедления развития рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для замедления прогрессирования рака простаты у пациента.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ профилактики рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для предотвращения рецидива рака простаты у пациента.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ лечения рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита SARM по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для лечения рецидива рака простаты у пациента.
Кроме того, стимуляция андрогеновых рецепторов стимулирует образование слез, и поэтому соединения SARM по настоящему изобретению могут использоваться для лечения сухости глаз. Следовательно, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ лечения сухости глаз у пациента, страдающего сухостью глаз, включающий стадию введения пациенту селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли,
фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для лечения сухости глаз у пациента.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения разработан способ профилактики сухости глаз у пациента, включающий стадию введения пациенту селективного модулятора андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению и/или его аналога, производного, изомера, метаболита, фармацевтически приемлемой соли, фармацевтического продукта, гидрата, N-оксида, метаболита, полиморфа, кристалла или любой их комбинации в количестве, эффективном для профилактики сухости глаз у пациента.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции апоптоза в раковых клетках, включающему стадию контактирования данной клетки с селективным модулятором андрогеновых рецепторов по настоящему изобретению и/или его аналогом, производным:, изомером, метаболитом, фармацевтически приемлемой солью, фармацевтическим продуктом, гидратом, N-оксидом, метаболитом, полиморфом, кристаллом или любой их комбинацией в количестве, эффективном для индукции апоптоза в раковых клетках.
Как определено в настоящем описании, термин "контактирование" означает, что метаболит SARM по настоящему изобретению вводят в образец, содержащий фермент в тест-пробирке, колбе, культиваторе ткани Chip, комплекте, планшете, микропланшете, капилляре или тому подобном и инкубируют при температуре и в течение времени, достаточном для связывания SARM с ферментом. Способы контактирования образцов с SARM или другими специфически связывающимися компонентами известны специалистам в данной области и могут быть выбраны в зависимости от типа протокола проводимого анализа. Способы инкубации также являются стандартными и известны специалистам в данной области.
В другом варианте осуществления термин "контактирование" означает, что метаболит SARM по настоящему изобретению вводят пациенту, проходящему лечение, и соединение SARM контактирует с
андрогеновым рецептором in vivo.
Термин "либидо", в контексте настоящего изобретения, означает сексуальное влечение.
Термин "эрекционный", в контексте настоящего изобретения, означает способность к эрекции. Пещеристая ткань представляет собой ткань, которая способна расширяться и становиться жесткой при расширении содержащихся в ней многочисленных кровеносных сосудов.
Термин "гипогонадизм" представляет собой состояние, возникающее или характеризующееся аномальным снижением функциональной активностьи половых желез, с замедлением роста и полового развития. Термин "остеопения" относится с пониженной кальцификации или плотности костей. Этот термин охватывает все скелетные системы, в которых отмечено такое состояние.
Термин "остеопороз" относится к истоньщению костей с уменьшением костной массы вследствие истощения кальция и белка костей. Остеопороз делает человека предрасположенным к переломам, которые зачастую медленно и плохо заживают. Неконтролируемый остеопороз может привести к изменениям осанки, физическим аномалиям и уменьшению подвижности.
"ВРН (доброкачественная гиперплазия простаты)"
представляет собой незлокачественное увеличение простаты и является наиболее распространенной незлокачественной
пролиферативной аномалией среди всех внутренних органов и главной причиной заболеваемости взрослых мужчин. ВРН встречается у более 75% мужчин в возрасте старше 50 лет и достигает 88% к 90-м годам жизни. ВРН часто приводит к постепенному сдавливанию той части мочеиспускательного канала, которая проходит через предстательную железу (простатическая уретра). Вследствие этого больные испытывают частые позывы к мочеиспусканию из-за неполного опорожнения мочевого пузыря и настоятельной потребности в мочеиспускании. Затруднение тока мочи может также привести к общей потере контроля за мочеиспусканием, включая трудности в произвольном начале мочеиспускания, а также трудности сдерживания испускания мочи из-за неспособности к опорожнению мочевого пузыря, это
состояние известно как недержание мочи вследствие переполнения мочевого пузыря, что может привести к закупорке мочевых путей и нарушению выведения мочи.
Термин "познание" относится к процессу познавания, в частности к процессу осознания, узнавания, мышления, обучения и суждения. Сознание относится к области психологии, лингвистики, вычислительной техники, нейронауки, математики, этологии и философии. Термин "настроение" относится к характеру или состоянию ума. Как подразумевается в настоящем описании, изменения означают любые изменения как положительные, так и отрицательные в познании и/или настроении.
Термин "депрессия" относится к заболеванию, которое затрагивает организм, настроение и мысли, что затрагивает способ питания и сна человека и самочувствия и мыслей о разных вещах. Признаки и симптомы депрессии включают потерю интереса к деятельности, потерю аппетита или переедание, потерю эмоционального самовыражения, опустошенность, ощущение безнадежности, пессимизма, чувства вины или беспомощности, уход в себя, усталость, нарушения сна, трудности в концентрировании, запоминании или принятии решений, беспокойство, раздраженность, головные боли, нарушения пищеварения или хронические боли.
Термин "выпадение волос", известный в медицине как алопеция, относится к облысению как в случае очень распространенного типа облысения по мужскому типу. Облысение, как правило, начинается с выпадения волос на небольшом участке кожи головы, и иногда оно прогрессирует до полного облысения и даже потери волос по всему телу. Выпадение волос поражает как мужчин, так и женщин.
Термин "анемия" относится к состоянию с меньшим, чем в норме, числом эритроцитов или содержанием гемоглобина в крови. При этом уменьшается кислородная емкость крови. Люди с анемией могут чувствовать усталость и легко утомляются, выглядят бледными, испытывают сердцебиение и обычно страдают отдышкой. Анемию вызывает четыре основных фактора: а) кровоизлияние (кровотечение); Ь) гемолиз (избыточное разрушение эритроцитов); с) недостаточная продукция эритроцитов; и d) недостаточность
нормального гемоглобина. Существует множество форм анемии, в том числе апластическая анемия, отравление бензолом, анемия Фанкони, гемолитическая болезнь новорожденных, наследственный сфероцитоз, железодефицитная анемию, остеопетроз,
злокачественная анемию, серповидноклеточная анемия, талассемия, миелодиспластический синдром, и целый ряд заболеваний костного мозга. Как подразумевается в настоящем изобретении, соединения SARM по настоящему изобретению можно использовать для профилактики и/или лечения любой одной или нескольких из вышеперечисленных форм анемии.
Термин "ожирение" относится к состоянию превышения нормального веса. Традиционно, человек считается тучным, если его вес более чем на 20 процентов превышает идеальный вес. Ожирение было более точно определено Национальным Институтом Здравоохранения (BMI) как индекс тела к массе равный 30 или выше. Ожирение часто является многофакторным как по генетическим, так и поведенческим факторам. Избыточный вес вследствие ожирения значительно способствует возникновению проблем со здоровьем. Он повышает риск возникновения ряда заболеваний, в том числе: диабета типа 2 (у взрослых); высокое кровяное давление (гипертензия), инсульт (цереброваскулярный инсульт или CVA), инфаркт (инфаркт миокарда или Ml); сердечная недостаточность (застойная сердечная недостаточность); рак (некоторые формы, такие как рак простаты и рак толстой и прямой кишки); желчекаменная болезнь и воспаление желчного пузыря (холецестит); подагру и подагрический артрит; остеоартрит (дегенеративный артрит) коленей, бедер и поясницы; апноэ во сне (неспособность нормально дышать во время сна, при этом снижается кислород в крови) и пиквикианский синдром (ожирение, красное лицо, недовентиляция и сонливость). Как подразумевается в настоящем описании термин "ожирение" включает любое из перечисленных выше состояний и заболеваний. Таким образом, соединения SARM по настоящему изобретению можно использовать для профилактики и/ли лечения ожирения и любого одного или нескольких связанных с ожирением состояний и заболеваний.
"Рак простаты" является одним из наиболее распространенных
видов рака среди мужчин в США, причем каждый год диагностируют сотни тысяч новых случаев. Более шестидесяти процентов новых диагностированных случаев рака простаты оказываются патологически запущенными, с невозможностью излечения и плохим прогнозом. Треть всех мужчин в возрасте старше 50 лет имеет латентную форму рака простаты, которая может активироваться в угрожающую жизни клиническую форму рака простаты. Показано, что частота латентных опухолей простаты существенно увеличивается каждые десять лет после 50 (5,3-14%) до 90 (40-80%). Число людей с латентным раком простаты одинаково по всем культурным, этническим группам и расам, однако частота клинически агрессивного рака заметно различается. Это позволяет предположить, что в активации латентного рака простаты могут играть роль факторы окружающей среды. Фармацевтические композиции
Способы лечения по настоящему изобретению включают, в одном из вариантов осуществления, ведение фармацевтического препарата, содержащего соединение SARM, например, метаболит SARM по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления способы лечения по настоящему изобретению включают ведение фармацевтического препарата, включающего аналог, производное, изомер, метаболит, фармацевтически приемлемую соль, фармацевтический продукт, N-оксид, полиморф, кристалл соединения SARM или любое их сочетание и фармацевтически приемлемый носитель.
Как использовано в настоящем описании выражение "фармацевтическая композиция" означает композицию, содержащую "эффективное количество" активного ингредиента, т.е. соединения SARM, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
Выражение "эффективное количество" в настоящем описании означает такое количество, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения. "Эффективное количество" соединений SARM, KciK использовано в данном описании, может находиться в диапазоне от 1 до 500 мг/день. В одном из вариантов осуществления дозировка находится в
диапазоне от 1 до 100 мг/день. В другом варианте осуществления дозировка находится в диапазоне от 45 до 60 мг/день. В другом варианте осуществления дозировка находится в диапазоне от 15 до 25 мг/день. В другом варианте осуществления дозировка находится в диапазоне от 55 до 65 мг/день. В другом варианте осуществления дозировка находится в диапазоне от 45 до 60 мг/день. Соединения SARM можно зводить ежедневно, в виде единичных препаративных лекарственных форм, содержащих полное количество, составляющее дневную дозу, или их можно вводить ежедневно в виде множества доз, например, дважды в день или три раза в день. Соединения SARM также можно вводить периодически, например, через день, 3 дня в неделю, четыре дня в неделю, пять дней в неделю и тому подобное.
Как использовано в настоящем описании, термин "лечение" охватывает профилактическое применение, а также ослабляющее тяжесть заболевания лечение. Как использовано в настоящем описании, термины "снижение", "подавление" и "ингибирование" имеют общепринятые значения, соответствующие уменьшению или понижению. Как использовано в настоящем описании, термин "способствующий" имеет общепринятое значение, соответствующее повышению скорости. Как использовано в настоящем описании, термин "усиливать" имеет общепринятое значение, соответствующее повышению. Как использовано в настоящем описании, термин "прогрессирование" означает увеличение размера или тяжести, распространение, нарастание или ухудшение.
Как использовано в настоящем изобретении, термин "введение" означает приведение пациента в контакт с соединением SARM по настоящему изобретению. Как использовано в настоящем описании, введение может быть осуществлено in vitro, т.е. в тест-пробирке, или in vivo, т.е. в клетках или тканях живых организмов, например, человека. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение охватывает введение соединений по настоящему изобретению пациенту. В одном из вариантов осуществления субъект представляет собой млекопитающее. В другом варианте осуществления субъектом является человек.
Фармацевтические композиции, содержащие агент SARM, можно вводить пациенту любым способом, известным специалисту в данной области, например, парентерально, параканцерально, через слизистую оболочку, чрезкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутрибрюшинно, подоболочечно,
интракраниально, внутривагинально или внутрь опухоли.
В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции вводят перорально и, следовательно, получают в виде формы, подходящей для перорального введения, т.е. в виде твердого или жидкого препарата. К подходящим твердым пероральным препаратам относятся таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, пилюли и тому подобного. К подходящим жидким пероральным препаратам относятся растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и тому подобное. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединения SARM вводят в состав препарата в виде капсулы. В соответствии с этим вариантом осуществления композиции по настоящему изобретению в виде твердой желатиновой капсулы включают в дополнение к SARM-активному соединению инертный носитель или разбавитель.
Кроме того, в другом варианте осуществления фармацевтические композиции, полученные в виде жидкого препарата, вводят путем внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекции. Подходящие жидкие препараты включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и тому подобное. В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции вводят внутривенно и, соответственно, получают в виде формы, подходящей для внутривенного введения. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции вводят внутриартериально, и, соответственно, получают в виде формы, подходящей для внутриартериального введения. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции вводят внутримышечно, и, соответственно, получают в виде формы, подходящей для внутримышечного введения.
Кроме того, в другом варианте осуществления фармацевтические композиции наносят местно на поверхность тела и, соответственно, их получают в виде формы, подходящей для
местного применения. К подходящим для местного применения формам относятся гели, мази, кремы, лосьоны, капли и тому подобное. Для местного применения агенты SARM или их физиологически переносимые производные, такие как соли, сложные эфиры, N-оксиды и тому подобные, получают и наносят в виде растворов, суспензий или эмульсий в физиологически приемлемом разбавителе в присутствии или в отсутствие фармацевтического носителя.
Кроме того, в другом варианте осуществления фармацевтические композиции вводят в виде суппозиториев, например, в виде ректальных суппозиториев или уретральных суппозиториев. Кроме того, в другом варианте осуществления фармацевтические композиции вводят путем подкожной имплантации пилюли. В следующем варианте осуществления пилюли разработаны для контролируемого высвобождения агента SARM в течение промежутка времени.
В другом варианте осуществления активное соединение можно доставлять в везикулах, в частности, в липосомах (см. Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp, 353-365 (1989); Lopez-Berenstein, ibid., pp. 317-327; см., в общем там же).
Использованное в данном описании выражение
"фармацевтически приемлемые носители или разбавители" хорошо известны специалистам в данной области. Носитель или разбавитель могут представлять собой твердый носитель или разбавитель для твердых форм, жидкий разбавитель или носитель для жидких препаратов или их смеси.
К твердым носителям/разбавителям относятся, но ими не ограничиваются, камедь, крахмал (например, кукурузный крахмал, желатинизированный крахмал), сахар (например, лактозу, маннит, сахарозу, декстрозу), целлюлозный материал (например, микрокристаллическую целлюлозу), акрилат (например,
полиметилакрилат), карбонат кальция, оксид магния, тальк или их смеси.
Для жидких форм фармацевтически приемлемые носители могут
представлять собой водные или незодные растворы, суспензии, эмульсии или масла. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферные среды. Примерами масел являются масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, оливковое масло, подсолнечное масло и масло печени рыб.
Парентеральные носители (для подкожной, внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекции) включают раствор хлорида натрия, дектрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированные масла Рингера и жирные (нелетучие) масла. Внутривенные носители включают жидкие и пищевые добавки для корректировки, электролитные добавки, такие как добавки на основе декстрозы Рингера и тому подобные. Примерами являются стерильные жидкости, такие как вода и масло, с добавлением поверхностно-активных веществ и других фармацевтически приемлемых адьювантов или без них. В общем, вода, физиологический раствор, водная дектроза и родственные растворы Сахаров, а также гликоли, такие как пропиленгликоли или полиэтиленгликоли являются предпочтительными жидкими носителями, в частности, для растворов для инъекций. Примерами масел являются минеральные масла, масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, оливковое масло, подсолнечное масло и рыбий жир.
Кроме того, композиция может дополнительно включать связывающие агенты (например, аравийскую камедь, кукурузный крахмал, желатин, карбомер, этилцеллюлозу, гуаровую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, повидон), дезинтегрирующие агенты (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, диоксид кремения, кроскармелозу натрия, кросповидон, гуаровую камедь, крахмал-гликолят натрия), буферы (например, Tris-HCl, ацетат,
фосфат) для различных рН и разной ионной силы, вспомогательные добавки, такие как альбумин или желатин для предотвращения абсорбции на поверхностях, детергенты (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчных кислот), ингибиторы протеазы, поверхностно-активные вещества (например,
лаурилсульфат натрия), усилители проницаемости,
солюбилизирующие агенты (например, глицерин,
полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия, бутилированный гидроксианизол), стабилизаторы (например, гидроксипропилцеллюлозу,
гидроксипропилметилцеллюлозу), повышающие вязкость агенты (например, карбомер, коллоидный диоксид кремния, этилцеллюлозу, гуаровую камедь), подсластители (например, аспартам, лимонную кислоту), консерванты (например, тримерозаль, бензиловый спирт, парабены), смазочные вещества (например, стеариновую кислоту, стеарат магния, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат натрия), добавки, повышающие текучесть (например, коллоидный диоксид кремния), пластификаторы (например, диэтилфталат,
триэтилцитрат), эмульгаторы (например, карбомер,
гидропропилцеллюлозу, лаурилсульфат натрия), полимерные покрытия (например, полоксамеры или полоксамины), агенты, образующие покрытия или пленкообразующие агенты (например, этилцеллюлозу, акрилаты, полиметакрилаты) и/или вспомогательные добавки.
В одном из вариантов осуществления разработанные здесь фармацевтические композиции представляют собой композиции с контролируемым высвобождением, т.е. композиции, в которых соединение SARM высвобождается в течение определенного промежутка времени после введения. Композиции с контролируемым или замедленным высвобождением включают препараты в липофильных депо (например, жирные кислоты, воски, масла). В другом варианте осуществления композиция представляет собой композицию немедленного действия, т.е. композицию, в которой соединение SARM высвобождается сразу после введения.
Еще в одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция может доставляться в виде системы контролируемого
высвобождения. Например, агент можно вводить с использованием внутривенного вливания, имплантированного осмотического насоса, чрезкожного пластыря, липосом или других способов введения. В одном из вариантов осуществления можно использовать насос (см. Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref.Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al. , Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al. , N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы. Еще в одном из вариантов осуществления система контролируемого высвобождения может быть расположена вблизи терапевтической мишени, т.е. мозга, при этом требуется лишь часть системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp. 115-138 (1984). Другие системы контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990).
Композиции также могут включать активное вещество, введенное внутрь или нанесенное на поверхность частиц, полученных из полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т.д., или на липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, спутники эритроцитов или сферопласты). Такие композиции будут оказывать влияние на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo.
Изобретение также охватывает композиции в виде частиц, покрытых полимерами (например, полоксамерами или полокаминами) и соединения, конъюгированные с антителами против тканеспецифических рецепторов, лигандов или антигенов, либо конъюгированные с лигандами тканеспецифических рецепторов.
Изобретение также охватывает соединения, модифицированные путем ковалентного присоединения вюдорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран,
поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин. Известно, что модифицированные соединения проявляют значительно более продолжительный период полураспада в крови после
внутривенной инъекции, чем соответствующие немодифицированные соединения (Abuchowski et al.,' 1981; Newmark et al., 1982; и Katre et al. , 1987). Такие модификации также могут повышать растворимость соединений в водных растворах, исключать агрегацию, увеличивать физическую и химическую стабильность соединения и сильно снижать иммуногенность и реакционную способность соединения. В результате этого требуемая биологическая активность in vivo может достигаться при менее частом введении продуктов полимер-соединение В или в меньших дозах чем в случае немодифицированных соединений.
Способы получения фармацевтических композиций, которые содержат активный компонент, хорошо известны в данной области, например, при помощи процессов смешивания, гранулирования или таблетирования. Активный терапевтический ингредиент часто смешивают с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Для перорального введения агенты SARM или их физиологически приемлемые производные, такие как соли, сложные эфиры, N-оксиды и тому подобные, смешивают с обычными для данных целей вспомогательными добавками, такими как носители, стабилизаторы или инертные разбавители, и преобразовывают с помощью обычных методов в подходящие для введения формы, такие как таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, твердые или мягкие желатиновые капсулы, водные, спиртовые или масляные растворы. Для парентерального введения агенты SARM или их физиологически переносимые производные, такие как соли, сложные эфиры, N-оксиды и тому подобные, преобразовывают в растворы, суспензии или эмульсии, при необходимости вместе с веществами, принятыми и подходящими для этой цели, например, солюбилизаторами или другими веществами.
Активный компонент может быть введен в композицию в виде нейтрализованной фармацевтически приемлемой соли.
Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные свободными аминогруппами полипептида или молекулы антитела), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная или
фосфорная кислота, или такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и тому подобные. Соли образованные свободными карбоксильными группами также могут быть получены из неорганических оснований таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и тому подобные.
Для применения в медицине соли SARM должны быть фармацевтически приемлемыми солями. Другие соли могут однако использоваться при получении соединений по изобретению или их фармацевтически приемлемых солей. Подходящие фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению включают кислотно-аддитивные соли, которые могут быть, например, получены при смешивании раствора соединения В ло изобретению с раствором фармацевтически приемлемой кислоты, такой как
хлористоводородная кислота, серная кислота, метансульфоновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, уксусная кислота, бензойная кислота, щавелевая кислота, лимонная кислота, винная кислота, угольная кислота или фосфорная кислота.
В одном из вариантов осуществления способы по настоящему изобретению включают введение соединения SARM в качестве единственного активного ингредиента. Однако рамки настоящего изобретения также охватывает способы а) мужской контрацепции; Ь) лечения целого ряда гормональных заболеваний, например, расстройств, связанных с возрастным снижением андрогена у мужчин (ADAM); с) лечения растройств, связанных со снижением уровня андрогенов у женщин (ADIF); d) лечения и/или профилактики острой и/или хронической гипотрофии мышц; е) профилактики и/или лечения сухости глаз; f) пероральной андроген-заместительной терапии; д) снижения степени, прекращения или регрессии рака простаты; и/или h) индукции апоптоза в раковых клетках, как описано в настоящем изобретении, которые включают введение соединений SARM в сочетании с одним или несколькими терапевтическими агентами.
Данные агенты включают, но ими не ограничиваются: аналоги LHRH, обратимые антиандрогены, антиэстрогены, противораковые лекарственные средства, ингибиторы 5-альфаредуктазы, ингибиторы ароматазы, прогестины или агенты, действующие через рецепторы других гормонов в ядре.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов в сочетании с аналогом LHRH. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с обратимым антиандрогеном. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с антиэстрогеном. В другом варианте осуществления настоящее .изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с противораковым лекарственным средством. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с ингибитором 5-альфаредуктазы. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с ингибитором ароматазы. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с прогестином. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим селективный модулятор андрогеновых рецепторов в сочетании с агентом, действующим посредством других рецепторов гормонов в ядре.
Следующие примеры представлены для более полной
иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Их никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие широкие рамки изобретения.
Раздел экспериментальных подробностей Пример 1
Нестероидные лиганды с андрогенной и анаболической активностью
Некоторые представленные в данном описании соединения SARM были разработаны, синтезированы и для них была оценена фармакологическая активность in vitro и in vivo. Была исследована аффинность связывания с андрогеновым рецептором in vitro и способность поддерживать рост андроген-зависимой ткани у кастрированных животных. Проводился мониторинг андрогенной активности как способности соединений SARM поддерживать и/или стимулировать рост предстательной железы и семенных пузырьков путем измерения их массы. Анаболическую активность контролировали как способность соединений SARM поддерживать и/или стимулировать рост поднимающей мышцы как измерения по . массе.
Методики синтеза
(2R)-1-Метакрилоилпирролидин-2-карбоновая кислота (R-129). D-Пролин (R-128, 14,93 г, 0,13 моль) растворяли в 71 мл 2н NaOH и охлаждали на ледяной бане: полученный щелочной раствор разбавляли ацетоном (71 мл) . Раствор метакрилоилхлорида 127 в ацетоне (71 мл) (13,56 г, 0,13 моль) и 2н раствор NaOH (71 мл) одновременно добавляли в течение 4 0 минут к водному раствору D-пролина на ледяной бане. В процессе добавления метакрилоилхлорида рН смеси поддерживали равным 10-11. После перемешивания (3 часа, комнатная температура) смесь упаривали в вакууме при температуре 35-45°С для удаления ацетона. Полученный раствор промывали диэтиловым эфиром и подкисляли до рН 2 с использованием концентрированной НС1. Подкисленный раствор насыщали NaCl и экстрагировали EtOAc (100 млхЗ). Объединенные экстракты сушили над Na2S04, фильтровали через целит и упаривали в вакууме, получая неочищенный продукт в виде бесцветного масла. Перекристаллизация масла и смеси этилового
эфира и гексанов давала 16,2 (68%) целевого соединения в виде бесцветных кристаллов: т.пл. 102-103°С (лит данные [214] т.пл. 102,5-103,5°С) ; ХН ЯМР (300 МГц, flMCO-d6) 6 5,28 (с) и 5,15 (с) для первого ротамера, 5,15 (с) и 5,03 (с) для второго ротамера (всего 2Н для обоих ротамеров, винильный СН2) , 4,48-4, 44 для первого ротамера 4,24-4,20 (м) для второго ротамера (всего 1Н для обоих ротамеров, СН при хиральном центре), 3,57-3,38 (м, 2Н, СНа) , 2,27-2,12 (1Н, СН) , 1,97-1, 72 (м, 6Н, СН2, СН, Me); 13С ЯМР (75 МГц, flMCO-d6) 5 для основного ротамера 173,3, 169, 1, 140,9, 116,4, 58,3, 48,7, 28,9, 24,7, 19,5; для минорного ротамера 174,0, 170,0, 141,6, 115,2, 60,3, 45,9, 31,0, 22,3, 19,7; ИК (КВг) 3437 (ОН), 1737 (С=0), 1647 (СО, СООН),
1584, 1508, 1459, 1369, 1348, 1178 см"1; [a]D26 +80, 8 (с=1, МеОН) ; Элементный анализ. Вычислено для СЭН13Ж)3: С 59,00, Н 7,15, N 7,65, Найдено: С 59,13, Н 7,19, N 7,61.
(3R,8aR)-З-Бромметил]-3-метилтетрагидропирроло[2,lc][1,4]оксазин-1,4-дион (R, R-130). Раствор NBS (23,5 г, 0,132 моль) в 100 мл ДМФ добавляли по каплям к перемешиваемому раствору соединения R-129 (16,1 г, 88 ммоль) в 7 0 мл ДМФ в атмосфере аргона при комнатной температуре, и полученную смесь перемешивали в течение 3 дней. Растворитель удаляли в вакууме, и в осадок выпадало желтое твердое вещество. Твердое вещество суспендировали в воде, перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, фильтровали и сушили, получая 18,6 (81%) (уменьшение веса при высушивали ~ 34%) указанного в заголовке соединения в виде
твердого вещества желтого цвета: т.пл. 152-154°С (лит данные [214] т.пл. 107-109°С для S-изомера); ХН ЯМР (300 МГц, ДМСО-dg) 5 4, 69 (дд, J=9,6 Гц, J=6,7 Гц, 1Н, СН при хиральном центре), 4,02 (д, J=ll,4 Гц, 1Н, СННа) , 3,86 (д, J=ll,4 Гц, 1Н, СННЬ) , 3,53-3,24 (м, 4Н, СН2) , 2,30-2,20 (м, 1Н, СН) , 2,04-1,72 (м, ЗН, СН2 и СН) , 1,56 (с, 2Н, Me); 13С ЯМР (75 МГц, flMCO-d6) 5 167,3, 163,1, 83,9, 57,2, 45,4, 37,8, 29,0, 22,9, 21,6; ИК (КВг) 3474, 1745 (С=0) , 1687 (С=0) , 1448, 1377, 1360, 1308,
1227, 1159, 1062 см"1; [a] D26 +124,5 (с=1,3, хлороформ);
Элементный анализ. Вычислено для C9H12BrN03: С 41,24, Н 4,61, N
5,34. Найдено: С 41,46, Н 4,64, N 5Г32.
(2R)-3-Бром-2-гидрокси-2-метилпропановая кислота (R-131).
Смесь бромлактона R-130 (18,5 г, 71 ммоль) в 300 мл 24% НВг нагревали при кипении с обратным холодильником в течение 1 часа. Полученный раствор разбавляли насыщенным раствором соли
(200 мл) и экстрагировали этилацетатом (100 мл х 4) . Объединенные экстракты промывали насыщенным раствором NaHC03
(100 мл х 4). Водный раствор подкисляли концентрированной НС1 до рН=1, полученный раствор, в свою очередь, экстрагировали этилацетатом (100 мл х 4). Объединенный органически раствор сушили над Na2S04, фильтровали через целит и упаривали в вакууме досуха. Перекристаллизация из толуола давала 10,2 г (86%) целевого соединения в виде бесцветных кристаллов: т.пл. 107-109°С (лит данные [214] т.пл. 109-113°С для S-изомера); ХН ЯМР
(300 МГц, ДМСО-dg) б 3,63 (д, J=10,l Гц, 1Н, СННа) , 3,52 (д, J=10,l Гц, 1Н, СННь) , 1,35 (с, ЗН, Me); ИК (КВг) 3434 (ОН), 3300-2500 (СООН), 1730 (С=0), 1449, 1421, 1380, 1292, 1193, 1085 см"1; [a]D26 +10,5 (с=2,6, МеОН) ; Элементный анализ. Вычислено для С4Н7Вг03: С 26,25, Н 3,86. Найдено: С 26,28, Н 3,75.
N-[4-Нитро-З-(трифторметил)фенил]-(2R)-3-бром-2-гидрокси-2-метилпропанамид (R-132). Хлористый тионил (8,6 г, 72 ммоль) добавляли по каплям в в атмосфере аргона к раствору бромкислоты R-131(ll,0 г, 60 ммоль) в 70 мл ДМА при -5 до -10°С. Полученную смесь перемешивали в течение 2 часов в тех же условиях. К вышеуказанному раствору добавляли по каплям раствора 4-нитро-З-трифторметиланилина (12,4 г, 60 ммоль) в 80мл ДМА и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя с использованием насоса для высокого вакуума; остаток разбавляли насыщенным раствором NaHC03 и экстрагировали этиловым эфиром (100 мл х 3). Объединенные экстракты сушили над безводным
Na2S04, фильтровали через целит и очищали флэш-хроматографией на силикагеле с использованием хлористого метилена в качестве элюента, получая 18,0 г (80%) целевого соединения: т.пл.98-100°С (Rf=0,2, силикагель, СН2С12) ; 2Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-dg) 5 10,54 (с, 1Н, NH), 8,54 (д, J=2,l Гц, 1Н, АгН), 8,34 (дд, J=9,0 Гц, J=2,l Гц, 1Н, АгН), 8,18 (д, J=9,0 Гц, 1Н, АгН), 6,37 (с, 1Н, ОН), 3,82 (д, J=10,4 Гц, 1Н, СННа) , 3,58 (д, J=10,4 Гц, 1Н, СННь) , 1,48 (с, ЗН, Me); 13С ЯМР (75 МГц, ДМСО-dg) 5 173,6 (С=0), 143,0, 127,2, 123,2, 122,6 (кв, J=33,0 Гц), 122,0 (кв, J=271,5 Гц), 118,3 (кв, J=6,0 Гц), 74,4, 41,4, 24,9; ИК (КВг) 3344 (ОН), 1680 (С=0), 1599, 1548 (С=С, Аг), 1427, 1363, 1161 см"1; Масс-спектр (ESI): т/z 370,8 (М)+; Элементный анализ. Вычислено для C11H10BrN2O4: С 35,60, Н 2,72, N 7,55. Найдено: С 35,68, Н 2,72, N 7,49.
N-[4-Нитро-З-(трифторметил)фенил]-(2S)-3-[4-(ацетиламино)фенокси]-2-гидрокси-2-метилпропанамид (S-147, соединение IV) . Указанное в заголовке соединение получали из соединения R-132 (0,37 г, 1,0 ммоль), 4-ацетамидофенола (0,23 г, 1,5 ммоль) К2С03 (0,28 г, 2,0 ммоль) и 10% хлорида бензилтрибутиламмония в виде катализатора межфазного переноса в 20 мл метилэтилкетона при нагревании при темпераутре кипения с обратным холодильником в течение ночи в атмосфере аргона. После реакции проводили ТСХ, полученную смесь фильтровали через целит и концентрировали в вакууме досуха. Очистка колоночной флэш-хроматографией на силикагеле (гексаны-этилацетат, 3:1) давала 0,38 г (86%) (Rf=0,18, гексаны-этилацетат, 3:1) целевого
соединения в виде порошка светло-желтого цвета: т.пл. 70-74°С; (твердое вещество может быть перекристаллизовано из смеси этилацетата и гексана) ; ХН ЯМР (300 МГц, flMCO-d6) 8 10,62 (с, 1Н, NH) , 9,75 (с, 1Н, NH) , 8,56 (д, J=l,9 Гц, 1Н, АгН), 8,36 (дд, J=9,l Гц, J=l,9 Гц, 1Н, АгН), 8,18 (д, J=9,l Гц, 1Н, АгН), 7,45-7,42 (м, 2Н, АгН), 6,85-6, 82 (м, 2Н, АгН), 6,25 (с, 1Н, ОН), 4,17 (д, J=9,5 Гц, 1Н, СННа) , 3,94 (д, J=9,5 Гц, 1Н, СННЬ) , 1,98 (с, ЗН, Me), 1,43 (с, ЗН, Me); 13С ЯМР (75 МГц, flMCO-d6) 8 174,6 (С=0), 167,7, 154,2, 143,3, 141,6, 132,8, 127,4, 123,0,
122,7 (кв, J=33,0 Гц), 122,1 (кв, J=271,5 Гц), 120,1, 118,3 (кв, J=6,0 Гц), 114,6, 74,9, 73,8, 23,8, 23,0; ИК (КВг) 3364 (ОН), 1668 (С=0), 1599, 1512 (С=С, Аг), 1457, 1415, 1351, 1323, 1239, 1150 1046 см"1; Масс-спектр (ESI) : m/z 464, 1 (M+Na)+; Элементный анализ. Вычислено для Ci?iHi8F3N306: С 51,71, Н 4,11, N 9,52. Найдено: С 52,33, Н 4,40, N 9,01.
В синтезе различных соединений SARM, который представляет собой конечную стадию реакции, используются обычные промежуточные соединения. Используют бромсодержащие
промежуточные соединения, которые дают возможность замены брома различными соединениями фенола с образованием целевого продукта простого эфира. Бромгидрид преобразовывали в эпоксид и раскрывали эпоксид с получением того же целевого продукта простого эфира.
Активность in vitro соединений SARM, в частности соединения IV, демонстрирует высокую аффинность связывания с андрогеновым рецептором (Ki=7,5 нм) ,. Исследования на животных с использованием соединений SARM, в частности соединения IV, показали, что оно представляет собой эффективный андрогенный и анаболический нестероидный агент. Для данных исследований использовали четыре группы крыс: (1) контроль без обработки, (2) кастрированный контроль, (3) кастрированные животные, обработанные тестостерон пропионатом (100 мкг/день), и (4) кастрированные животные, обработанные соединением IV (1000 мкг/день). Тестостерон и соединение IV доставляли с постоянной скоростью в течение 14 дней с использованием подкожных осмотических насосов.
Результаты данных исследований показаны на фиг.1. Кастрация значительно снижала массу андрогенных (т.е. предстательная железа и семенные пузырьки) и анаболических (т.е. поднимающая мышца) тканей, но оказывает незначительное действие на вес тела животного (BW). Обработка кастрированных животных тестостерон пропионатсм или соединением IV поддерживала массу андрогенных тканей в одинаковой степени. Соединение IV обладало андрогенной активностью подобной активности тестостерон пропионата (т.е. масса простаты и
семенных пузырьков была одинаковой), но было намного более эффективным в качестве анаболического агента. Соединение IV продемонстрировало большую анаболическую активность чем тестостерон пропионат в тестированных дозах (т.е. масса поднимающей мышцы была такой же, что у необработанных животных и превышала массу у животных, получавших тестостерон). Представленные здесь эксперименты являются первыми результатами in vivo, которые демонстрируют ткане-селективную андрогенную и анаболическую активность (т.е. различную андрогенную и анаболическую эффективность) нестероидного лиганда для андрогеновых рецепторов.
Пример 2
Нестероидные лиганды с андрогенной и анаболической активностью
На крысах была исследована эффективность in vivo и острая токсичность четырех новых нестероидных андрогенов (соединения III, IV, VI и VII). В анализах in vitro было установлено, что данные соединения связывают андрогеновый рецептор с очень высокой аффинностью. Структуры и названия четырех соединений представлены ниже.
O2N ^ ^ К
NH ус "О"
н3сг "'ОН
Соединение III R=F
Соединение IV R=NHCOCH3
Соединение VI R=COCH3
Соединение VII R=COC2H5
Экспериментальные методы
Материалы. S-изомеры соединений III, IV, VI и VII и R-изомер соединения III были синтезированы в соответствии со схемой, указанной на фиг.9. Тестостерон пропионат (TP), полиэтиленгликоль 300 (ПЭГ300, качество для использования в синтезе) и нейтральный забуференный формалин (10% вес/об) были получены от компании Sigma Chemical Company (St Louis, MO) . Осмотические насосы alzet (модель 2002) были закуплены у Alza
Corp. (Palo Alto, CA).
Животные. Молодые самцы крыс Sprague-Dawley весом от 90 до 100 г были получены от Harlan Biosciences (Indianapolis, IN). Животных содержали при 12-ти часовом светом цикле, со свободным доступом к пище и воде. Протокол содержания животных был рассмотрен и одобрен институционной Лабораторией ухода за животными и комитетом по применению.
Разработка исследования. Крыс случайным образом распределяли на двадцать девять (29) групп, из расчета 5 животных на группу. Группы обработки описаны в таблице 1. За день до получения лекарственного средства животных из групп 2-29 по отдельности вынимали из клетки, взвешивали и анестезировали внутрибрюшинно дозой смеси кетамин/ксилазин (87/13 мг/кг, приблизительно 1 мл на кг) . После удовлетворительного анестезирования (т.е. отсутствие ответной реакции на укол булавкой в палец ноги) уши животных маркировали в целях идентификации. Затем животных помещали на стерильную подстилку и их брюшко и мошонку промывали бетадином и 70%-ным спиртом. Яички удаляли через надрез мошонки по средней линии с использованием стерильной нити для перевязывания супра-тестикулярной ткани перед хирургическим удалением каждого яичка. Место хирургической раны закрывали стерильными зажимами для раны из нержавеющей стали, и место очищали бетадином. Животным давали возможность прийти в себя на стерильной подстилке (до тех пор, пока они были способны стоять) и затем возвращали в их клетки.
Через двадцать четыре часа животных из групп 2-2 9 повторно анестизировали смесью кетамин/ксилазин и помещали подкожно в область мошонки осмотический насос(ы) (модель 2002) Alzet. В этом случае область мошонки выбривали и очищали (бетадин и спирт) и делали небольшой надрез (1 см) с использованием стерильного скальпеля. Вводили осмотический насос и рану закрывали стерильным зажимом для раны из нержавеющей стали. Животным давали возможность прийти в себя и возвращали в их клетки. Осмотические насосы содержали подходящее лекарственное средство (обозначено в таблице 1) , растворенное в
полиэтиленгликоле 300 (ПЭГ300). Осмотические насосы наполняли подходящим раствором за день перед имплантацией. Животных контролировали ежедневно для выявления признаков острой токсичности при введении лекарственного средства (например, летаргия, жесткий мех).
Через 14 дней обработки лекарственным средством крыс анестезировали смесью кетамин/ксилазин. Затем животных умерщвляли путем обескровливания под анестезией. Образец крови отбирали с помощью венопункции брюшной аорты и передавали на полный анализ клеток крови. Часть крови помещали в отдельную пробирку, центрифугировали при 12000 g в течение 1 минуты и удаляли слой плазмы крови и замораживали при -20°С. Брюшные предстательные железы, семенные пузырьки, поднимающую мышцу, печень, почки, селезенку, легкие и сердце удаляли, очищали от внешних тканей, взвешивали и помещали в пузырьки, содержащие 10% нейтральный забуференный формашин. Зафиксированные ткани отсылали в GRx, Inc., для проведения гистопатологического анализа.
Для анализа данных массу всех органов нормализовали к массе тела и анализировали для получения любого статистически значимого различия с использованием однофакторного ANOVA. Массу простаты и семенных пузырьков использовали в качестве индексов для оценки андрогенной активности, а массу поднимающей мышцы использовали для оценки анаболической активности.
Результаты
Андрогенная и анаболическая активность S-изомеров соединений III, IV, VI и VII и R изомера соединения III были исследованы на модели кастрированной крысы после 14 дневного введения. В качестве положительного контроля анаболического и андрогенного воздействия использовали тестостерон пропионат.
Как показано на фиг.2 и фиг.З, масса простаты, семенных пузырьков и поднимающей мышцы у кастрированных обработанных носителем крыс снижалась незначительно вследствие удаления эндогенного продуцирования андрогена. Экзогенное введение тестостерона пропионата, андрогенного и анаболического
стероида, повышало массу простаты, семенных пузырьков и поднимающей мышцы у кастрированных крыс доза-зависимым образом. R-изомер соединения III и S-изомеры соединений VI и VII не оказали действия на массу простаты, семенных пузырьков и поднимающей мышцы у кастрированных животных (данные не показаны). S-изомеры соединения IV (фиг.2: V) и соединения III (фиг.З: III) приводили к доза-зависимому увеличению массы простаты, семенных пузырьков и поднимающей мышцы. Соединение IV проявило более низкую эффективность и присущую ему активность в повышении массы простаты и семенных пузырьков, но большую эффективность и присущую ему активность в повышении веса поднимающей мышцы. В частности, соединение IV в дозе до 0,3 мг/день было способно поддерживать массу поднимающей мышцы кастрированных животных на том же уровне, что и у некастрированных животных. Таким образом, соединение IV представляет собой эффективный нестероидный анаболический агент с меньшей андрогенной активностью, но большей анаболической активностью чем тестостерон пропионат. Это является существенным усовершенствованием предшествующих формул изобретений, поскольку данное соединение селективно стимулирует рост мышцы и другие анаболические действия, оказывая при этом меньшее действие на предстательную железу и семенные пузырьки. Это может быть особенно значимым для стареющих мужчин, где вопрос касается развития или прогрессирования рака простаты.
Соединение III является менее эффективным, чем соединение IV, но проявляет большую тканевую селективность (сравнительное воздействие на предстательную железу и семенные пузырьки на фиг.2 и 3). Соединение III значительно увеличивает вес поднимающей мышцы, но показывает незначительную способность или не обладает способностью стимулировать рост простаты и семенных пузырьков (т.е. масса простаты и семенных пузырьков была менее чем 20% от массы, наблюдаемой у некастрированных животных или животных, получавших тестостерон пропионат).
Результаты показывают, что ни одно из исследованных соединений не оказывает существенного действия на массу тела или массу других органов (т.е. печени, почек, селезенки, легких
и сердца). Ни одно из соединений не приводило к проявлению каких-либо признаков острой токсичности, как оценено диагностическими гематологическими тестами и визуальным исследованием животных, получавших лечение. Соединение IV не подавляло продуцирование лютеинизирующего гормона или фолликулостимулирующего гормона (FSH) в дозе 0,3 мг/день (т.е. доза, которая оказывает максимальное анаболическое действие).
В итоге, соединение IV проявляет анаболическую активность выше среднего уровня на животных поддерживая массу поднимающей мышцы после удаления эндогенного андрогена. Это открытие является большим прогрессов в развитии терапевтически полезных нестероидных андрогенов и значительным усовершенствованием (т.е. тканевая селективность и эффективность) по сравнению с предшествующими лекарственными средствами данного класса. Соединение III и соединение IV продемонстрировали селективную анаболическую активность по - сравнению с тестостероном пропионатом, являющимся андрогенным и анаболическим стероидом. Ткане-селективная активность действительно является одним из преимуществ нестероидных андрогенов в плане применений, связанных с анаболическим действием.
Несмотря на подобие структуры и in vitro функциональной активности, S-изомеры соединений III-IV и VI-VII проявляют чрезвачайную разницу в плане их активности in vivo. Соединение IV проявляет наиболее эффективную андрогенную и анаболическую активность на животных, при этом анаболическая активность превышает активность тестостерон пропионата. Соединение III продемонстрировало меньшую степень андрогенной активности, но обладало анаболической активностью сопоставимой с активностью тестостерон пропионата. Например, соединения VI и VII не проявляли какой-либо андрогенной или анаболической активности in vivo.
Данные исследования показали открытие двух членов (III и IV) нового класса селективных модуляторов андрогеновых рецепторов (SARMs), которые демонстрируют сильное анаболическое действие (например, рост мышц) с меньшей андрогенной активностью (например, рост простаты). Данный новый класс
лекарственных средств обладает несколькими преимуществами по сравнению с неселективными андрогенами, включая потенциальное терапевтическое применение для мужчин и женщин для модуляции способности к воспроизведению потомства эритропоэза, остеопороза, сексуального либидо, и у мужчин с высокой предрасположенностью к раку простаты.
Кроме того, на фиг.7 и 8 продемонстрировано действие соединения III и соединения IV на уровень LH и FSH у крыс. Данные результаты дополнительно демонстрируют новизну данных SARM вследствие их дифференцированного действия на данные репродуктивные гормоны, демонстрируя таким образом ткане-специфическую фармакологическую активность. На фиг.7 уровни LH у кастрированных животных, обработанных TP и соединением III, в дозах, превышающих или равных 0,3 мг/день, были существенно ниже, чем у необработанных животных (т.е. кастрированный контроль). Однако перед существенным снижением уровня LH в случае соединения IV требовались более высокие дозировки (т.е. 0,5 мг/день или выше). Таким образом, соединение IV не подавляет уровни LH в дозах, которые способны вызывать максимальную стимуляцию роста поднимающей мышцы. На фиг.8 уровни FSH у кастрированных животных обработанных соединением III были существенно ниже, чем уровни у необработанных животных (т.е. кастрированный контроль) в дозах 0,5 мг/день или выше. Аналогично, более низкие уровни FSH наблюдались у животных, обработанных ТР. Однако данное различие было существенным только при дозе 0,7 5 мг/день. Уровни FSH у животных, обработанных соединением IV при любом уровне протестированных дозировок, существенно не отличались от уровней, наблюдаемых у необработанных животных. Таким образом, соединение IV не подавляет уровни FSH в дозах, которые способны вызывать максимальную стимуляцию роста поднимающей мышцы.
Таблица 1
Группы животных и экспериментальная модель
Группа
Кастрированные
Лекарственное
Доза
Число
средство
животных
Нет
нет
нет
Нет
Только носитель
Тестостерон
0,1
мг/день
Тестостерон
0,3
мг/день
Тестостерон
0,5
мг/день
Тестостерон
0, 75 мг/день
Тестостерон
1,0
мг/день
R-III
1,0
мг/день
S-III
0,1
мг/день
S-III
0,3
мг/день
S-III
0,5
мг/день
S-III
0, 75 мг/день
S-III
1,0
мг/день
S-VI
0,1
мг/день
S-VI
0,3
мг/день
S-VI
0,5
мг/день
S-VI
0, 75 мг/день
S-VI
1,0
мг/день
S-VII
0,1
мг/день
S-VII
0,3
мг/день
S-VII
0,5
мг/день
S-VII
0, 75 мг/день
S-VII
1,0
мг/день
S-IV
0,1
мг/день
S-IV
0,3
мг/день
S-IV
0,5
мг/день
S-IV
0, 75 мг/день
S-IV
1,0
мг/день
нет
Только носитель
Пример 3
Фармакокинетика соединения IV у собак
Фармакокинетика S-соединения IV, нового селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM) была охарактеризована на собаках биглях. В данном исследовании был использована четырех-периодная перекрывающаяся модель четырех обработок, которая включала всего шесть собак биглей, по три штуки каждого пола. Каждое животное получало 3 мг/кг дозу IV, 10 мг/кг дозу IV, перорально 10 мг/кг дозу IV в растворе и 10 мг/кг дозу IV в виде капсулы в статистически заданном порядке. Между обработками имелся период вымывания в одну неделю. Образцы плазмы крови собирали в течение промежутка времени до 72 часов после введения лекарственного средства. Концентрации соединения
IV в плазме крови анализировали и оценивали методом ВЭЖХ. С использованием некомпартментных методов определяли клиренс (CL) , объем распределения (Vss) , период полураспада (Тх/г) и другие фармакокинетические параметры. Результаты показали, что соединение IV выводится из плазмы крови собак с ограниченным сроком Ti/2 примерно 4 часа, и CL 4,4 мл/мин/кг после введения IV. На фиг.4, 5 и 6 показаны профили концентрации в плазме крови от времени для соединения IV после введения в виде внутривенного раствора, перорального раствора и пероральной капсулы, соответственно. Фармакокинетика была доза- и пол-зависимой. Пероральная биодоступность соединения IV изменялась с изменением препаративной лекарственной формы и в среднем составляла 38% и 19% для раствора и капсулы, соответственно. Таким образом соединение IV продемонстрировало средний период полураспада, медленное выведение и среднюю биодоступность у собак биглей, что позволяет идентифицировать его как первый представитель нового класса перорально биодоступных ткане-селективных модуляторов андрогеновых рецепторов.
Пример 4
Анализ соединения IV с помощью ВЭЖХ
Анализ методом жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с обращенной фазой разрабатывали для количественной оценки концентрации соединения IV в плазме крови собак. Образцы крови собак получали путем венопунктуры и центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут. Образцы хранили замороженными при -2 0°С до анализа. Отдельные образцы быстро оттаивали и в аликвоту (0,5 мл) вкалывали внутренний стандарт (20 мкл 200 мг/мл водного раствора CM-II-87). Для осаждения белков плазмы крови к образцам добавляли аликвоту 1 мл ацетонитрила. Образцы встряхивали и затем центрифугировали при 1000 g в течение 15 минут. Супернатант декантировали в стеклянные экстракционные пробирки и добавляли 7,5 мл этилацетата. Экстракционную смесь оставляли при комнатной температуре на 20 минут и встряхивали несколько раз в течение данного промежутка времени. Затем образцы центрифугировали при ЮООд в течение 10
минут и органическую фазу удаляли и помещали в стеклянные пробирки с коническим дном. Органическую фазу упаривали в токе азота. Влагосодержание образцов восстанавливали с
использованием 200 мкл подвижной фазы (ацетонитрил:вода, 35:65) и переносили в емкость для автоподачи образца для ВЭЖХ впрыскивания (устройство для автоподачи образца Waters 717, Waters Corp., Milford, MA). Изократическую подвижную фазу, содержащую 35% (об/об) ацетонитрила в воде подавали насосом при скорости потока 1 мл/мин (модель 510, Waters Corp.). Неподвижная фаза представляла собой колонку С18 с обращенной фазой (Novapak С18, 3,9x150 мм). Анализируемые образцы контролировали с использованием УФ-обнаружения при 270 нм (модель 48 6 детектора поглощения, Waters Corp.). Времена удерживания для соединения IV и CM-II-87 составляли 11,1 и 16,9 минут соответственно. Хроматографические данные собирали и анализировали с использованием программного обеспечения Millennium. Концентрации соединения IV в плазме крови в каждом образце определяли путем сравнения с калибровочными кривыми. Калибровочные кривые создавали, добавляя известные количества соединения IV к плазме крови собак. Конечные концентрации соединения IV в образцах плазмы крови собак, использованные для калибровочных кривых, были 0,08, 0,2, 0,4, 2, 4, 10 и 2 0 мкг/мл. Калибровочные кривые были линейными в данном концентрационном диапазоне и имели коэффициенты корреляции (г2) 0,9935 или выше. Коэффициенты варьирования в течение одного дня и между днями для стандартов колебались от 6,4% для 0,08 мкг/мл до 7,9% для 2 0 мкг/мл.
Температуры плавления определяли на капиллярном устройстве для определения температуры плавления Томаса-Гувера (Thomas-Hoover) и не корректировали. Инфракрасные спектры регистрировали на ИК-фурье спектрофотометре Perkin Elmer System 2000 FT-IR. Углы оптического вращения определяли на автоматическом поляриметре Autopol(r) III (Rudolph Research ModelIII-589-10, Fairfield, New Jersey). Спектры протонного и 13-углеродного магнитного резонанса получали на спектрометре
Bruker AX 300 (300 и 75 Мгц для 1Н и 13С соответственно) . Величины химических сдвигов выражены в миллионных долях (8) относительно тетраметилсилана (ТМС). Спектральные данные соответствовали заданным структурам. Масс-спектры
регистрировали на приборе Bruker-HP Esquire LC System. Элементный анализ проводили в Atlantic Microlab Inc. (Norcross, GA), и найденные значения находились в пределах 0,4% от теоретических значений. Рутинную тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на силикагеле на алюминиевых пластинах (силикагель 60F 254, 20x20 см, Alclrich Chemical Company Inc., Milwaukee, WI). Флэш-хроматографию проводили на силикагеле (Merck, качество 60, 230-400 меш, 60) . Тетрагидрофуран (ТГФ) сушили перегонкой над металлическим натрием. Ацетонитрил (MeCN) и хлористый метилен (СН2С12) сушили перегонкой над Р205.
Пример 5
Метаболизм соединения IV у крыс и собак
Н3С ОН
NHCOCH3
Цель
Соединение IV представляет собой сильный и эффективный селективный модулятор андрогеновых рецепторов (SARM). В данных исследованиях оценивали метаболические профили соединения в моче и фекалиях крыс и собак.
Методы
Исследования метаболизма. Крысы получали перорально дозу 300 мг/кг и собаки бигли получали внутривенно дозу 100 мг/кг соединения IV. Мочу и фекалии собирали перед введением дозы и через 8 и 24 часа после введения дозы. Образцы фекалий гомогенизировали в 10 мл воды на 6 г фекалий. Все образцы хранили при -2 0°С до анализа. Образцы анализировали в использованием ЖХ/МС/МС для определения структуры метаболита.
Радиоактивный анализ конечного распределения. Отдельные
исследования с использованием С-14 меченного соединения IV проводили на крысах для количественной оценки общего распределения и массового баланса соединения IV после внутривенного дозирования. Катетеры имплантировали в яремную вену крыс Sprague-Dawley и животным давали возможность прийти в себя в течение 24 часов. Затем животных помещали в пластиковые метаболические клетки Nalgene(r). Подходящее количество [14С] соединения IV растворяли в этаноле и разводили в ПЭГ-300. Конечная концентрация этанола была меньше, чем 5% для дозированного раствора. Болюсную дозу IV в 100 мКи [14С] соединения IV вводили через яремный катетер в течение 5 минут. Образцы фекалий и мочи собирали перед введение дозы и через 8, 24 и 4 8 часов после введения дозы. Животных умерщвляли через 24 и 48 часов после введения дозы и собирали печень, селезенку, сердце, почки, кишечник (малый и большой), поднимающую мышцу, поджелудочную железу, стенки желудка, брюшной жир и предстательную железу.
Получение образца и ЖХ/МС анализ. Образцы плазмы крови и фекалий готовили для анализа с использованием метода экстракции жидкость-жидкость. Образцы органов взвешивали и крошили скальпелем. Аликвоты каждого органа помещали в 1 мл солюбилизатора для тканей ScintiGest(r) (Fisher Scientific Company, Fair Lawn, NJ) и затем гомогенизировали с использованием гомогенизатора Pro 200 (Pro Scientific, Monroe, CT). Образцы инкубировали при 60°С до растворения ткани. Общую радиоактивность тканей, мочи и образцов фекалий определяли с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика Beckman LS 6000 JC (Beckman-Counter, Fullerton, СА). Радиоактивные образцы мочи и фекалий также разделяли с использованием колоночной хроматографии с обращенной фазой для идентификации фракций исходного лекарственного средства и метаболитов. Элюированные при ВЭЖХ фракции собирали с 2 минутными интервалами и считывали с помощью счетчика, как указано выше. Нерадиоактивные образцы мочи и фекалий фильтровали и анализировали с использованием ЖХ/MCn. Система ЖХ/МС состояла
из насоса Surveyor MS, устройства для автоматической подачи образца Surveyor и жидкостного хроматомасс-спектрометра LCQ Deca MS (Thermo-Finnigan, San Jose, CA). Пустые образцы фекалий и мочи использовали для вычитания спектра фона из спектра обработанных образцов для идентификации пиков, относящихся к лекарственному средству. Для идентификации пиком метаболитов путем сравнения МС и МС2 спектров метаболитов со спектрами аутентичного соединения IV использовали программное обеспечение Metabolite ID. Результаты
МС2 спектр соединения IV и его аминного метаболита. Фрагментация соединения IV (m/z 44С) приводила к трем основным дочерним ионам (m/z 150, 261 и 289) (фиг.ЮА). Место метаболического превращения было идентифицировано сравнением принципа фрагментации соединения IV с его аминным метаболитом (m/z 410) (фиг. 10В). Кроме того, для основных дочерних ионов каждого метаболита и соединения IV были получены МСЗ спектры для дополнительного подтверждения структуры (не показано).
Предлагаемый принцип фрагментации и метаболиты соединения IV у крыс и собак. Структура метаболитов была определена с использованием ЖХ/МС и ЖХ/МС2 фрагментации пиков метаболитов. Принципы фрагментации метаболитов сравнивали с исходными соединениями для определения мест метаболической модификации. Результаты представлены в таблице 2. Структуры внизу каждого ряда показывают структурную информацию, полученную с использованием и ЖХ/МС2 фрагментации.
Таблица 2
Молекулярный ион [М-Н] -
Образующийся ион (m/z)
Приписываемые структуры и предлагаемый принцип фрагментации
440 (Соединение IV)
Дочерний ион 2 61
150, 205, 261, 289
190, 218, 233
/ (tm)
о*-^-ю -!-j- -сп,- -о-^°^> -w-1-СН, V т го
/-\ ( 1 f'f0
OjN-~т-С--^ *
FjC 190 233
410
Дочерний ион 25 9
150, 259, 308, 380
175, 201, 209
и/я-/ 131 j-j-CU
Н)К-^ ^-NH- -
FjC I" л
426
166, 220, 259, 324, 336, 365, 396, 408
0i"-^~"У~"и-!-^-^|-о-к"-1-сп,
[М-Н20]- 408
506
Дочерний ион 42 6
225, 275, 366,
406, 426
275
-я-^ ^-ум-1-оц
454
150, 303
*> "
- -О- & > -Я1-С-СИ|
44 0 (Соединение IV)
150, 205, 261, 289
424 (Соединение IV-0)
Дочерний ион 245
150, 245, 273 183, 202
ON-Р J-НИ-"--с- -О
==N--C^j-|"
368
Дочерний ион 259
108, 175, 201, 231, 259
175, 201, 209
HjN-Z' \-Nti
/ / F3C 175
М,--О-№, И"
fir: 1
[. -с- -г-с*
> /
201
426
Дочерний ион 24 5
150, 245, 275, 405
159
ОН [ _. у
Ohn-/ \-
F5C
13В
-NH-С-|"
161, 216,
275
Дочерний ион 216
160, 186
Радиоактивное конечное распределение
Радиография 24-часовых образцов мочи и фекалий крыс.
A. Моча (фиг. НА): можно наблюдать два основных пика при 5 и 4 7 минутах. Пик при 5 минутах (продукт гидролиза) соответствует 25% от введенной дозы, тогда как меньший пик при 47 минутах (аминный метаболит) соответствует 11% введенной дозы.
B. Фекалии (фиг.11В): можно наблюдать два основных пика при 43 и 51 минутах и три минорных пика при 7, 15 и 27 минутах. Пик при 51 минуте (исходное соединение) соответствует 18,5% введенной дозы. Три минорных пика (метаболиты фазы II) соответствуют 0,8% введенной дозы.
Предложенный метаболический профиль у собак и крыс. Основной метаболит соединения IV представляет собой продукт гидролиза, выявленный в моче крыс. N-деактилированный метаболит (m/z 368) был уникальным для собак. Eice метаболиты фазы II были найдены в фекалиях. Метаболический профиль соединения IV суммирован на фиг.12.
Соединение IV являлось первым из нескольких новых нестероидных андрогенов, которое было выявлено во время скрининга in vitro селективных модуляторов андрогеновых рецепторов (SARM). Соединение IV продемонстрировало линейную фармакокинетику и доза-зависимую пероральную биодоступность. Данные, полученные в этих исследованиях, показывают, что соединение IV в значительной степени метаболизировало, при этом менее 1 % неизмененного исходного лекарственного средства было найдено в моче крыс и собак. Метаболические профили для мочи и фекалий показали, что соединение IV метаболизировало с участием метаболических ферментов как фазы I, так и фазы II.
Выводы:
Исследования метаболизма и конечного распределения соединения IV показали:
1. Метаболиты как в моче, так и в фекалиях, при этом основной метаболит является продуктом гидролиза, образующимся за счет расщепления амидной связи.
2. Большая часть введенной в виде инъекции дозы была найдена в виде исходного соединения в фекалиях. Это может быть связано с выделением с желчью исходного соединения или его глюкуронидированных метаболитов.
3. Показано, что N-деактилированный метаболит, найденный в моче собак, является антагонистом андрогеновых рецепторов в исследованиях транскрипционной активации in vitro. Однако, при исследовании радиоактивного распределения на крысах существенные уровни данного метаболита найдены не были. Это связано с тем, что у крыс имеется N-ацетилтрансфераза, тогда как у собак ее нет.
Подводя итог, метаболизм соединения IV сильно отличается от метаболизма бикалутамида. Продукт восстановления нитрогруппы в соединении IV был идентифицирован в качестве основного метаболита у крыс и собак. Крысы и собаки показали сходные метаболические профили, хотя N-деактилированный метаболит соединения IV, который был выявлен у собак, не могли выявить у крыс. Показано, что данный N-деактилированный продукт является антагонистом андрогена при исследованиях in vitro.
Пример 6
Исследование фазы I метаболизма селективных модуляторов андрогеновых рецепторов (SARMs) - соединения III и IV с
использованием микросом печени человека
CF3
CF3
Ш IV
Цель
Соединения III и IV представляют собой сильные и
эффективные селективные модуляторы андрогеновых рецепторов (SARM). Цель данного исследования in vitro заключалась в идентификации метаболитов основной фазы I, где цитохром Р450 вовлечен в метаболизм фазы I соединений III и IV, с использованием объединенных микросом печени человека (HLM) и рекомбинантных CYP. Методы
Метаболизм in vitro соединений III и IV под действием рекомбинантных CYP человека Supersomes(r). Рекомбинантные CYP человека Supersomes(r) были получены от BD Gentest (Woburn, MA) . Все образцы оттаивали при 37°С и инкубацию проводили в двухкратной последовательности с использованием 4 0 пмоль фермента вместе с 2 мкМ соединения IV в реакционном буфере в
течение 2 часов при 3 7°С. Контрольные образцы получали таким же образом за исключением того, что препарат фермента не добавлялся. Реакцию останавливали путем добавления охлажденного на льду ацетонитрила (1:1, об:об), содержащего внутренние стандарты для ВЭЖХ анализа. Концентрацию соединения III и соединения IV в каждом инкубате измеряли с помощью ВЭЖХ. Оба соединения III и IV обнаруживали по их УФ поглощению при 230 нм.
Идентификация метаболитов соединений III и IV in vitro с использованием HLM. Микросомы печени человека инкубировали с 2 мкМ соединения III или соединения IV в 100 мМ фосфатном буфере
(рН 7,5) и 1 мМ NADPH в течение 2 часов при 37°С. Реакцию останавливали путем добавления охлажденного на льду ацетонитрила (1:1, об:об). После осаждения белков супернатант анализировали с использованием ЖХ-масс-спектрометрии для идентификации основных метаболитов в инкубатах.
Измерение кинетических параметров образования Ml с использованием HLM и рекомбинантных CYP человека. HLM
(0,2 мг/мл) или рекомбинантный CYP (10 пмоль для каждой реакции) инкубировали с NADPH (1 мМ) и соединением IV (от 0,2 мкМ до 150 мкМ). Инкубаты выдерживали при 37°С в течение 10 минут и реакцию останавливали путем добавления охлажденного на
льду ацетонитрила (1:1, об:об}, содержащего внутренние стандарты для ВЭЖХ анализа. Концентрацию Ml в каждом инкубате измеряли с помощью ВЭЖХ. Первоначальную скорость реакции рассчитывали, основываясь на появлении Ml и строили график скорости относительно концентраций субстрата. Стандартные субстраты, фенацетин, диклофенак, мефенитоин, буфуралол и тестостерон также включали для тестирования активности CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP3A4 соответственно. Кинетические параметры Km и V max определяли путем регрессионного анализа с использованием WinNonlin (версия 4.0, Pharsight Corporation, Mountain View, CA) и сигмоидальной модели Emax. Результат:
Метаболизм in vitro соединения IV под действием рекомбинантных CYP человека Supersomes(r) (п=2). Соединение IV (2 мкМ) инкубировали с рекомбинантными CYP человека Supersomes(r) (40 пмоль) при 37°С в течение 2 часов. Измеряли исчезновение соединения IV. Как показано на фиг.13, после инкубации более 95% соединения IV метаболизировало под действием CYP3A4 человека.
Метаболизм in vitro соединения III под действием рекомбинантных CYP человека Supersomes(r) (п=2). Соединение III (2 мкМ) инкубировали с рекомбинантными CYP человека Supersomes(r)
(40 пмоль) при 37°С в течение 2 часов. Измеряли исчезновение соединения III. Как показано на фиг.14, после инкубации 20% соединения III метаболизировало под действием CYP3A4 человека.
Метаболизм in vitro соединения IV в HLM. Как показано на фиг.15, основной метаболизм фазы I соединений включает деацетилирование аминогруппы (Ml), гидролиз амидной связи и окисление.
Метаболизм in vitro соединения III в HLM. Как показано на фиг.16, основной путь метаболизма in vitro соединения III в HLM представляет собой окисление.
Метаболизм in vitro соединения IV в Ml под действием CYP. Появление Ml измеряли в трехкратной последовательности. Следующие кинетические параметры для CYP3A4: Km (1,65 мкМ) и
Vmax (19,7 нмоль/пмоль СУР*мин)) были определены после инкубирования соединения IV (от 0,2 мкМ до 100 мкМ) вместе с CYP. Ml не обнаруживался, когда более низкие концентрации соединения IV инкубировали вместе с CYP2C19, CYP2D6 и CYP1A2. При тестированных концентрациях Ml не образовыавлся, когда соединение IV инкубировали вместе с CYP2C9. Результаты показаны на фиг.17.
Метаболизм in vitro соединения IV в Ml под действием HLM (0,2 мг/мл). Появление Ml измеряли в трехкратной последовательности. Кинетические параметры Km (58,4 мкМ) и Vmax (348,6 пмоль/мг белка*мин)) были определены после инкубирования соединения IV (от 0,2 мкМ до 150 мкМ) вместе с HLM. Результаты показаны на фиг.18.
Выводы
Цитохром Р450-опосредованное окисление представляет собой основной путь метаболизма соединения III в HLM.
CYP3A4-опосредованное деацетилирование представляет собой основной путь метаболизма соединения IV в HLM. Окисление и гидролиз также происходят, но в меньшей степени.
Видимая Km, составляющая 1,65 мкМ для соединения IV с рекомбинантным CYP3A4, намного ниже, чем видимая Km для образования Ml в HLM (58,4 мкМ, фиг.18). Это вероятно связано с присутствием CYP 2С19, 2D6 и 1А2, которые вносят свой вклад в образование Ml при более высоких концентрациях соединения IV.
Оказывается, что CYP3A4 представляет собой фермент основной фазы I, который вносит свой вклад в метаболизм соединения IV в клинически значимых концентрациях.
Кратко, соединения III и IV представляют собой нестероидные SARM, которые проявляют ткане-селективные андрогенное и анаболическое действие (JPET 304(3): 1334-1340, 2003). Предварительные исследования метаболизма фазы I с микросомами печени человека показали, что как соединение III (2 мкМ), так и соединение IV (2 мкМ) метаболизируют главным образом посредством CYP3A4.
Пример 7
Метаболизм селективного модулятора андрогеновых рецепторов
(SARM) у людей, крыс и собак Материалы и методы Материалы
Соединения S4 и Ml и 14C-S4 были синтезированы в лаборатории заявителей. Рекомбинантные ферменты CYP человека (Supersome(r)), объединенные микросомы печени человека, крысы и собаки, цитозоль и препараты S9 были получены от BD Gentest (Woburn, MA). 4'-Гидрокси-диклофенак, 4'-гидрокси-мефенитоин, мефенитоин, 1'-гидрокси-буфуралол и буфуралол также были получены от BD Gentest. Сцинтилляционный "коктейль" EcoLite(tm)(+) был получен от ICN Research Products Division (CostaMesa, CA) . Все другие химические соединения и реагенты были получены от Sigma Chemical Company (St Louis, MO). Все аналитические колонки были получены от Waters Corporation (Milford, MA). NHS-Biotin был получен от PIERCE (Rockfold, IL).
Реакции метаболизма in vitro
Ферментативные реакции in vitro проводили в соответствии с инструкциями, предоставленными BD Gentest. Все реакции фазы I приводили при 37°С в присутствии 1 мМ NADPH
(никотинамидадениндинуклеотид фосфат, восстановленная форма) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 7,4) в течение различных промежутков времени. Для микросом печени, цитозоля или препаратов печени S9 в реакции использовали общую концентрацию белка 2 мг/мл, а рекомбинантные ферменты CYP использовали в конечной концентрации 200 пмоль/мл. Обычно время инкубирования составляло 2 часа для идентификации метаболита, тогда как для определения ферментативных кинетических параметров время инкубирования составляло 10 минут. Кинетические параметры, Km и Vmax, были определены с помощью нелинейного регрессионнного анализа с использованием WinNonlin (версия 4.0, Pharsight Corporation, Mountain View, CA) и сигмоидальной модели Emax. Реакции останавливали путем добавления охлажденного на льду ацетонитрила (1:1, об:об), содержащего внутренний стандарт
(CM-II-87, структурный аналог S-4) для ВЭЖХ анализа. Белок, присутствующий в реакционной смеси, осаждали центрифугированием
(> 16000 g, 30 минут при 4°С) и супернатант или разводили подходящей подвижной фазой или непосредственно использовали в ВЭЖХ анализе. S-4 отделяли на колонке с обращенной фазой
(Symmetry(r) С8, 3,9x150 мм) с использованием в качестве подвижной фазы 45% ацетонитрил и 50мМ фосфатный буфер (рН 4,8) в деионизированной воде, при скорости потока 1,0 мл/мин, и обнаружение проводили по УФ-поглощению при 230 нм. Идентификация метаболита S4 фазы I
14C-S4 (2 мкМ) инкубировали с препаратами печени человека, крысы или собаки при 37°С в течение 2 часов. После осаждения белка с использованием ацетонитрила (об:об/1:1) органическую фазу, оставшуюся в супернатанте упаривали в атмосфере азота и полученные концентрированные образцы использовали для ВЭЖХ анализа. 14C-S4 и его метаболиты были разделены с использованием колонки с обращенной фазой (NovaPak С18,
3,0x300 мм) с использованием в качестве подвижной фазы ацетонитрил в деионизированной воде, при скорости потока 1,0 мл/мин. Первоначальная подвижная фаза содержала 0% ацетонитрила и данный состав поддерживали в течение 3 минут. Процент ацетонитрила увеличивали линейно до 5% в течение следующих 7 минут и далее увеличивали до 30% в течение следующих 5 минут. Процент ацетонитрила опять медленно увеличивали до 35% в течение следующих 15 минут, затем быстро изменяли на 95% в течение следующих 5 минут и поддерживали данный состав в течение 5 минут. Наконец процент ацетонитрила уменьшали до 0% в течение последних 5 минут. Элюированные фракции (30 секунд на фракцию) из ВЭЖХ колонки собирали и общую радиоактивность (DPM) каждой фракции подсчитывали в сцинтилляционном "коктейле" EcoLite(tm)( + ) .
Аналогичный эксперимент проводили с использованием не меченного радиоактивно S4. В данном случае элюированные фракции, содержащие возможные метаболиты, анализировали с использованием масс-спектрометрии с ионизацией отрицательных ионов электрораспылением (масс спектрометр с ионной ловушкой ThermoFinnigan LCQ DECA, San Jose, CA) , как описано ранее (Wu
et al., 2004). Для масс-спектрометрической системы температуру капиллярного нагревателя устанавливали при 200°С, напряжение распыления составляло 3,5 кВ, и скорость потока газа в трубке и вспомогательного газа составляли 60 и 20 мл/мин, соответственно. Все другие параметры устанавливали для оптимизированных условий для ионизации и детектирования S4. Набор данных контролировали с использованием программного обеспечения Xcalibur (Revision В, ThermoQuest Corp., San Jose, CA). Для MC2 анализа S4 или ионы метаболитов выделяли с шириной захвата 1,5 m/z и фрагментировали с использованием энергии фрагментации, колеблющейся от 15 до 50%.
Биотинилирование метаболитов гидролиза
ВЭЖХ элюат, полученный в течение первых трех минут градиентного прогона, как описано выше, собирали и концентрировали в атмосфере азота. NHS-Биотин растворяли в ДМСО и добавляли к концентрированному ВЭЖХ элюату (1:10/об:об) до конечной концентрации 20 мМ. Реакцию биотинилирования проводили при комнатной температуре в течение одного часа. Реакционную смесь затем центрифугировали и супернатант подвергали ВЭЖХ анализу с использованием тех же условий, как описано выше.
Анализ связывания андрогеновых рецепторов
Аффинность связывания деацетилированного метаболита, Ml, была определена с использованием цитозольного AR, полученного из брюшной простаты кастрированных самцов крыс Spargue-Dawley (примерно 250 г), как описано ранее (Mulherjee et al., 1996).
Анализ транскрипционной активации
Способность соединений оказывать влияние на
AR-опосредованную транскрипционную активацию исследовали с использованием системы котрансфекции, как описано ранее (Yin et al., 2003b). Транскрипционную активность Ml измеряли при множестве концентраций, колеблющихся от 0,1 до 1000 нМ и выражали как процент транскрипционной активации, наблюдаемой в присутствии 0,1 нМ DHT.
Результаты
Идентификация метаболитов S4 фазы I
14C-S4 (2 мкМ) инкубировали с S9 печени при 37°С в течение двух часов и 14С-метаболиты разделяли с помощью ВЭЖХ. Концентрацию выбирали в соответствии с гепатической концентрацией S4 в фармакологически значимых дозах, как определено с использованием ауторадиографии всего тела для крыс (данные не показаны). Аналогичный эксперимент повторяли с использованием не меченного S4 и фракции, соответствующие 14С-метаболитам собирали и подвергали масс-спектрометрическому анализу.
Были идентифицированы четыре основных пути метаболизма (фиг.19А): 1) деацетилирование ацетамидной группы В-кольца; 2) гидролиз амидной связи; 3) восстановление нитрогруппы А-кольца; и 4) окисление В-ароматического кольца. Радиохроматографии, соответствующие идентифицированным метаболитам
проиллюстрированы на фиг.19В. МС2 спектр и предлагаемый принцип фрагментации S4 и его метаболитов показаны на фиг.20, 21 и 23.
Продукт деацетилирования Ml, продукты гидролиза М2, М2-ОН и МЗ и продукт восстановления М4 были основными метаболитами S4 in vitro в S9 печени. S4 и Ml созместно имеют очень похожий принцип фрагментации (фиг.20), за исключением того, что ион фрагментации при 150 m/z не присутствует в МС2 спектре для Ml вследствие деацетилирования ацетамидной группы В-кольца. Аналогичный принцип также наблюдался для М4 и М5.
Помимо основных метаболитов также наблюдались соответствующие продукты окисления S4-0H, М1-ОН и М4-ОН. Как показано на фиг.19А и фиг21А-С, было идентифицировано множество продуктов окисления S4, что может быть связано в различием в расположении гидроксила в В-кольце. Продукта гидроксилирования А-кольца в S4 не наблюдалось. Однако, в отличие от S4, окисление Ml и М4 наблюдалось только для А-кольца, а не для В-кольца. Принцип фрагментации Ml-ОН и М4-ОН также резко изменялись, как показано на фиг.2Ю и Е. Также два различных продукта окисления Ml наблюдались при разделении ВЭЖХ (фиг.19В). Однако, два продукта имели одинаковый принцип фрагментации, как показано на фиг.2Ю.
Среди всех идентифицированных метаболитов продукты гидролиза были наиболее гидрофильными вследствие присутствия карбоксильной группы и большинство из них элюировалось совместно с фронтом растворителя (фиг.19В). МЗ, в частности, содержит аминогруппу в В-кольце, которая имитирует структуру аминокислоты и затрудняет анализ метаболита. Для облегчения разделения и обнаружения молекулы, авторы настоящего изобретения собирали и концентрировали соответствующий ВЭЖХ элюат и модифицировали ароматическую аминогруппу. NHS-Биотин представляет собой обычно используе-мый реагент для маркирования белка, который специфически модифицирует первичные аминогруппы (фиг.22А). Биотинилирование аминогруппы В-кольца существенно облегчает ВЭЖХ разделение метаболитов гидролиза, которые содержат ароматическую аминогруппу, как показано на хроматограмме на фиг.22В. С другой стороны, МЗ, продукт гидролиза с незатронутой ацетамидогруппой в В-кольце не модифицировали и он все еще совместно элюировался с фронтом растворителя. МС2 принципы фрагментации для МЗ, МЗ-ОН и биотинилированного метаболита М2 показаны на фиг.23.
Хотя МЗ не может быть модифицирован, кислотные условия могли снизить ионизацию карбоксильной группы и увеличить время удерживания на колонке, тогда как продукты гидролиза с аминогруппой могли бы быть высоко ионизированными и элюироваться с фронтом растворителя. ВЭЖХ элюат (первые три минуты), содержащий МЗ, как разделено при нейтральном рН (как описано выше), собирали и концентрировали в атмосфере азота. МЗ дополнительно отделяли от фронта растворителя с использованием аналогичных ВЭЖХ условий при рН 4,0 (0,2% уксусной кислоты) и элюировали при 15 минутах (данные не показаны).
Характеристики метаболитов S4 фазы I для различных видов Профиль метаболизма S4 для различных видов был охарактеризован и проведено его сравнение с использованием S9 печени человека, крысы и собаки. Для всех реакций использовали аналогичную общую концентрацию белка (2 мг/мл). Относительное содержание каждой фракции в различных реакционных смесях представлено на фиг.24А как процент метаболизированного 14C-S4.
Аналогично, все четыре пути метаболизма наблюдались для всех протестированных видов. Доминирующий метаболит, Ml, составлял 61%, 44% и 58% метаболизированного S4 в случае S9 человека, крысы и собаки, соответственно. Однако относительный вклад другого пути был абсолютно разным для данных трех видов.
В S9 человека, помимо деацетилирования, другие три метаболических пути вносили очень похожий вклад в метаболизм S4, представляющие гидролиз, восстановление и окисление, •насчитывающие 11%, 16% и 12% от метаболизированного S4, соответственно. Однако при сравнении с крысой (7%) и собакой (2), восстановление S4 способствовало метаболизму S4 в относительно большей степени (16%).
С другой стороны, гидролиз играл большую роль в метаболизме S4 под действием S9 крысы, насчитывая 27% от метаболизированного S4 по сравнению с 11% и 14% в случае S9 человека и собаки. Более интересно, что МЗ был единственным продуктом гидролиза, наблюдавшимся в случае S9 крысы, тогда как продукты гидролиза под действием S9 человека и собаки содержали М2, МЗ и их окисленные продукты, что указывает на то, что в случае S9 крысы гидролиз был более быстрым процессоом, чем деацетилирование или окисление.
Также окисление S4 и Ml насчитывало более 20% метаболизированного S4 с использованием S9 крысы и собаки, но только 12% метаболизированного 84 в случае S9 человека. Учитывая тот факт, что больше окисленных метаболитов гидролиза наблюдалось при инкубации с S9 собаки по сравнению с S9 крысы, окисление может более существенно способствовать метаболизму S4 в случае с S9 собаки.
В общем, основные пути метаболизма, наблюдавшиеся для трех исследованных видов были аналогичными: продукт деацетилирования Ml представлял собой главный метаболит S4 для фазы I, наряду с продуктами гидролиза, восстановления и окисления, также наблюдавшимися для всех трех видов.
Определение характеристик фазы I метаболизма S4 в различных субклеточных фракциях
Метаболизм фазы I для S4 был дополнительно охарактеризован
при инкубировании с различными субклеточными фракциями препаратов печени человека, включая объединенные микросомы печени человека (HLM) и цитозоль печени человека. Метаболические профили S4 после инкубирования с HLM и фракциями цитозоля печени человека были чрезвычайно различными (фиг.24В). Поскольку большинство ферментов фазы I находится в HLM, метаболический профиль, наблюдаемый в реакциях с HLM был очень похож на профиль, наблюдаемый для S9 печени человека (фиг.24А), как описано выше. Однако, в присутствии цитозоля печени человека продукт деацетилирования Ml больше не представлял собой главный наблюдаемый метаболит, составляя только 16% от метаболизированного S4 по сравнению с 53% как наблюдалось при инкубации с HLM. Напротив, продукт восстановления М4 насчитывал более 50% от метаболизированного под действием цитозоля печени человека S4 по сравнению с 11%, наблюдавшимися при инкубировании в HLM. Данные результаты позволяют предположить, что в печени человека S4 в первую очередь может претерпевать деацетилирование под действием микросомальных ферментов, хотя он в основном восстанавливается под действием цитозольных ферментов.
Хотя обычно предполагается, что реакция гидролиза амидной связи катализируется под действием эстераз, присутствующих в цитозольной фракции, гидролиз S4 вносит вклад в метаболизм S4 под действием HLM в намного большей степени, 20%, по сравнению с 9% в цитозольной фракции. Также, поскольку реакция деацетилирования была предпочтительной в микросомальной фракции, МЗ оказывается основным продуктом гидролиза в цитозольных инкубатах печени человека, тогда как ацетилированный (МЗ) и деацетилированный продукты гидролиза (М2 и М2-ОН) в аналогичном количестве наблюдались в HLM инкубатах. Следовательно, логично предположить, что цитохром Р450 ферменты в микросомальной фракции могли бы вносить вклад в гидролиз S4.
Для дополнительной идентификации основных ферментов CYP, ответственных за фазу I метаболизма S4 пять основных ферментов CYP человека, включая ферменты CYP 1А2, 2С9, 2С19, 2D6 и ЗА4, были исследованы путем измерения исчезновения S4 после
инкубирования с S4 (2 мкМ) в течение 2 часов при 37°С. Среди пяти протестированных ферментов CYP3A4 был выявлен в качестве основного фермента, ответственного за метаболизм S4 при 2 мкМ (данные не показаны) . При инкубироЕ.ании вместе с 14C-S4 (2 мкМ) метаболический профиль S4 под действием CYP3A4 был аналогичен наблюдавшемуся после инкубирования вместе с HLM (фиг.24В). Рекомбинантный CYP3A4 человека главным образом катализирует реакции деацетилирования, гидролиза и окисления, что насчитывает 43%, 30% и 24% соответственно от
метаболизированного S4.
Кинетика метаболизма S4 под действием рекомбинантного CYP3A4 человека
Исчезновение S4 определяли как первоначальное измерение для оценки ферментативных кинетических параметров CYP3A4 (фиг.24). S4 показал аналогичную аффинность по отношению к CYP3A4 (16,1 мкМ), что и тестостерон (13 мкМ), но более низкую величину Vmax (1,6 пмоль/пмоль*мин)) по сравнению с тестостероном (7,6 пмоль/пмоль*мин)) (данные не показаны).
Определение характеристик Ml в качестве активного метаболита S4
Продукт деацетилирования S4, Ml, сохраняет ядерную структуру фармакофора, что позволяет предположить, что он также может взаимодействовать с AR и действовать в качестве активного метаболита. Анализ связывания рецептора in vitro показал, что Ml связывает AR с относительно низкой аффинностью (Ki 24,6 нМ) по сравнению с S4 (Ki 4,0 нМ) (фиг.25). Кроме того, он ведет себя как частичный агонист в анализе транскрипционной активации in vitro (фиг.26) с относительной агонистической активностью в 42% при 1 мкМ по сравнению с 0,1 нМ для DHT. На основании данных результатов можно предполагать, что Ml также мог бы активировать AR и может вносить свой вклад в фармакологическую активность S4 in vivo.
Пример 8
Метаболизм пропанамидного селективного модулятора андрогеновых
рецепторов (SARM)
Материалы и методы
Химические вещества и реагенты
S-1, 3-(4-фторфенокси)-2-гидрокси-2-метил-N-[4-нитро-З-
(трифторметил)фенил]пропанамид синтезировали с использованием ранее описанных способов (Marhefka et al., 2004). Два внутренних стандарта, 4-хлор и 4-бром-аналоги S-1, также были получены с использованием данных методов. 3-(4-Фторфенокси)-2-гирокси-2-метил-пропановую кислоту синтезировали с
использованием аналогичных способов. Химическую чистоту подтверждали с использованием данных элементного анализа, масс-спектрометрии и протонного ядерного магнитного резонанса. Ацетонитрил качества для ВЭЖХ, воду и уксусную кислоту получали от Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ) . Полиэтиленгликоль-300 (ПЭГ-300) и диметилсульфоксид получали от Sigma Chemical Company (St.Louis, МО). Этанол получали от Pharmaco products Inc. (Brookfield, CT).
Животные и методики
Самцов крыс Sprague-Dawley весом приблизительно 250 г от Harlan Biosciences (Indianapolis, IN) содержали в соответствии с протоколом содержания животных, одобренным институционной Лабораторией ухода за животными и комитетом по применению при университете штата Огайо. Животных содержали при 12-ти часовом светом цикле, при этом пища и вода были доступны по необходимости. За двадцать часов перед дозированием в правую яремную вену каждой крысы имплантировали катетер (Harlan Teklad 22/5 питание для грызунов) и кровь удаляли. Крыс обеспечивали водой по необходимости и взвешивали непосредственно перед введением дозы. Пищу возвращали через 12 часов после дозирования. Сорок самцов крыс Sprague-Dawley относили случайным образом к группе обработки и они получали или внутривенно или перорально дозу S-1 при уровне дозировки 0,1, 1, 10 или 30 мг/кг. Дозированные растворы получали в 5% ДМСО в ПЭГ-300 (об/об) за 12 часов перед дозированием и хранили при
20°С. Катетер в яремной вене наполняли до краев водным раствором гепаринизированного физиологического раствора (100 Ед/мл, объем равный объему дозированного раствора) сразу же после введения внутривенной доза. Собирали серийные образцы крови через 5, 10, 20, 30, 60, 120, 240, 480, 720 и 1140 минут после введения посредством внутривенного пути, тогда как после дозирования перорально с помощью зонда образцы крови получали через 30, 60, 90, 180, 240, 360, 480, 720, 1800 и 2160 минут после введения дозы. Плазму крови сразу же отделяли центрифугированием (800 g в течение 10 минут при 4°С) и образцы хранили при -2 0°С до анализа. Пероральный дозированный раствор включал 5% ДМСО в ПЭГ-300 (об/об), и 5 или 10% этанола в ПЭГ-300 использовали при уровне дозировки 10 мг/кг при внутривенном и пероральном путях для исследования влияния растворимости или носителя на пероральное всасывание или выведение S-1. Для построения метаболического профиля внутривенную дозу S-1 (50 мг/кг) вводили самцам крыс Sprague-Dawley (п=2). Образцы мочи и фекалий собирали с 6-12 часовыми интервалами в течение 4 8 часов с использованием метаболических клеток и объединяли перед анализом для обеспечения достаточных объемов мочи и концентраций метаболита для анализа и защиты от разложения при комнатной температуре. Все образцы мочи и фекалий хранили при -80°С до анализа. Методика экстракции для ВЭЖХ метода. В аликвоты плазмы крови крыс (100 мкл) вкалывали внутренний стандарт (30 мкл 4-бром-аналога S-1 использовали в качестве стандарта) и смешивали с 1 мл ацетонитрила. Образцы центрифугировали при 16100 g в течение 10 минут. Супернатант удаляли и упаривали досуха в токе азота в чистой пробирке для центрифугирования. Остаток восстанавливали с использованием 150 мкл подвижной фазы для ВЭЖХ, центрифугировали при 16100 g в течение 5 минут и аликвоту, равную 100 мкл, впрыскивали в ВЭЖХ прибор.
ВЭЖХ-УФ измерение S-1 в плазме крови
Концентрации в плазме крови для групп с дозировкой 10 и 30 мг/кг, введенной внутривенно и перорально, были определены с
использованием утвержденного метода. ВЭЖХ. ВЭЖХ анализ проводили с использованием модели 515 насоса для ВЭЖХ (Waters), модели 717 плюс устройства для автоподачи образца (Waters) и модели 486 детектора поглощения (Waters). ВЭЖХ разделение проводили с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил/Н20 (54:46 об/об) на колонке Waters Nova-pak С18 (3,9x150 мм, 4 мкм) (Milford, MA) при скорости потока 1 мл/мин при длине волны детектирования 2 97 нм. Аналитические данные получали с использованием программного обеспечения Millenium (Waters Corporation, Milford, MA) . Предел количественной оценки ВЭЖХ анализа составлял 0,05 мкг/мл. Стандартные калибровочные кривые создавали в диапазоне 0,05-100 мкг/мл. В пределах дня и между днями безошибочность определения имела коэффициент варьирования от 1,8 до 18,2%, и точность составляла 90,0-92,4% от номинальной концентрации. Относительное выделение S-1 в плазме крови крысы колебалось от 90,5 до 97,5%.
Методика экстракции для ЖХ/МС анализа
В аликвоты плазмы крови крыс (100 мкл) вкалывали внутренний стандарт (Istd) (30 мкл, 4-хлор-аналог S-1 использовали в качестве внутреннего стандарта) и смешивали с 1 мл ацетонитрила. Образцы центрифугировали при 16100 g в течение 10 минут. Супернатант удаляли и смешивали с 1 мл воды перед экстракцией этилацетатом (7,5 мл) в ' 13 мл пробирке для экстракции. Образцы встряхивали при комнатной температуре в течение 10 минут и затем центрифугировали при 1540 g в течение 10 минут. Органический супернатант удаляли и упаривали досуха в атмосфере азота в чистой пробирке для анализа. Влагосодержание остатка восстанавливали, добавляя 150 мкл первоначальной подвижной фазы, центрифугировали при 16100 g в течение 5 минут и аликвоту в 100 мкл вводили в ЖХ/МС прибор.
ЖХ/МС измерение S-1 в плазме крови
Концентрации в плазме крови для групп с дозировкой 1,0 и 0,1 мг/кг, введенной внутривенно и перорально, были определены с использованием утвержденного метода ВЭЖХ. ЖХ/МС (Agilent 1100 series, Palo Alto, CA) анализ проводили с использованием
источника ESI и следующих условий: поток сухого газа 12 л/мин; давлений распылителя 4 5 фт/кв.дюйм; температура сухого газа 350°С, напряжение 1500 В и напряжение разрушителя 180 В. Все другие ЖХ/МС параметры были установлены по умолчанию. Контроль единичного иона (SIM) при m/z 401,10 и 417,10 в методе отрицательного иона использовали для обнаружения S-1 и внутреннего стандарта, соответственно. Индивидуальные образцы впрыскивали на монолитную колонку (SpeedRod RP 18 е, 4,6x50 мм, Merck KGaA, Darmstadt, Германия), поддерживаемую при температуре 25°С во время анализа. Представляющие интерес соединения отделяли от помех с использованием градиента подвижной фазы, включающей ацетонитрил (А) и 0,1% уксусную кислоту в воде (В) при скорости потока 1 мл/мин. Подвижная фаза включала смесь компонентов А и В в соотношении 50:50 в течение первых 5 минут каждого хроматографического прохода, повышалась до 100% В с линейным градиентом от 5,1 до 7,5 минут и затем возвращалась до 50% В при 7,6 минутах. Время уравновешивания колонки с использованием первоначальной подвижной фазы составляло 1,5 минуты. Аналитические данные получали с использованием программного обеспечения ChemStation. Предел количественной оценки в ЖХ/МС анализе составлял 0,3 нг/мл. Стандартные калибровочные кривые создавали в диапазоне 0,3-3 0 нг/мл. В пределах дня и между днями безошибочность определения имела коэффициент варьирования от 0,4 до 12,4%, и точность составляла 87,1-104,8 % от номинальной концентрации. Относительное выделение S-1 в плазме крови крысы колебалось от 99,4 до 105,7%.
Анализ фармакокинетических данных
Данные концентрация в плазме крови-время анализировали с помощью нонкомпартментного анализа с использованием WinNonlin 4.0 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA) . Площадь под кривой концентрация в плазме крови-время от нулевого момента времени до бесконечности (AUC0- ) рассчитывали по формуле трапеции с экстраполяцией до бесконечности. Конечный период полураспада (tl/2) рассчитывали как 0, 693/A.z, где Xz
100
представляло собой константу элиминирования конечной фазы. Клиренс в плазме крови (CL) рассчитывали как СЬ=доза, i. v. /AUC, i. v. , 0-°°, и доза (i. v.) и AUC (i . v. ) , 0-°° представляют собой внутривенную дозу и соответствующую площадь под кривой в момент времени от нуля до бесконечности, соответственно. Максимальная концентрация в плазме крови (Сшах), и время когда она наблюдается (Ттах) в группе с пероральным дозированием были получены путем визуального обследования кривых концентрация в плазме крови-время. Видимый объем распределения при равновесии (Vdss) рассчитывали как Vdss=CL"MRT, где MRT представляет собой среднее время обработки после введения внутривенно болюсной дозировки. MRT рассчитывали как MRT=(AUMC,i.v. ,0-°°) / (AUC,i.v. ,0 -) , где AUMC, i . v., 0-°° представляет собой площадь под кривой концентрация в плазме крови-время в первоначальный момент, экстраполированной до бесконечности. Пероральную биодоступность (F) для каждой дозы рассчитывали с использованием
F= (AUC, р. о . хдоза, i . v. ) / (AUC, i . v. хдоза, р. о . ) , где доза,р.о., доза,i.v., AUC,i.v. и AUC,p.o. представляют собой среднюю пероральную дозировку, среднюю внутривенную дозировку и соответствующие средние площади под кривой в момент времени от нуля до бесконечности, соответственно, при каждой дозировке. Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием однофакторного анализа отклонений (ANOVA). Р <0,05
рассматривалось как статистически значимое различие.
Идентификация метаболитов
Образцы мочи оттаивали и экстрагировали этилацетатом в объеме, в пять раз превышающем объем образцов мочи. Процедуру экстракции повторяли дважды и объединенные органические и объединенные водные фазы упаривали на роторном испарителе при 35°С. Образцы фекалий оттаивали и экстрагировали 30 мл метанола. Метанольные фракции центрифугировали при 1540 g в течение 10 минут супернатант упаривали досуха в атмосфере азота. Остаток растворяли в 3 мл смеси метанол/Н20 (50:50) и
экстрагировали 7,5 мл этилацетата. Процедуру экстракции повторяли дважды. Объединенные органические и объединенные водные фазы упаривали досуха в атмосфере азота. Остаток органической фазы и водной фазы растворяли с использованием смесей ACN:H20 (50:50) и ACN:H20 (10:90) соответственно. Каждый раствор фильтровали через шприцевой фильтр Acrodisc (0,2 мкм, 13 мм, Pall Corporation, East Hills, NJ) . Двадцать микролитров каждой фракции впрыскивали непосредственно в масс-спектрометр с квадрупольной ионной ловушкой Thermo Finnigan LCQDECA (Thermo Electron, Franklin, MA) с использованием метода ионизации отрицательных ионов с помощью электрораспыления. ВЭЖХ разделение проводили на колонке Waters XTerra С18 (2,1x150 мм,
3.5 мкм) с использованием учетверенной колонки Xterra (2,1x150 мм, 3,5 мкм) при скорости потока 0,2 мл/мин с использованием градиента подвижной фазы, включающей ацетонитрил (А) и воду (В) при скорости потока 1 мл/мин. Подвижная фаза включала смесь компонентов А и В в соотношении 90:10 в течение первых 10 минут каждого хроматографического прохода, повышалась до 60% В с линейным градиентом от 10 до 60 минут и затем дополнительно повышалась до 95% В в промежуток от 60 до 65 минут и выдерживалась в течение 10 минут и наконец возвращалась до 10% В при 7 6 минутах. Колонку уравновешивали первоначальной подвижной фазой в течение 10 минут. Вторую система подвижной фазы, которая включала 0,1% уксусной кислоты в обоих компонентах А и В, использовали в некоторых случаях. В обоих системах подвижной фазы использовали оду и ту же программу градиента. Капиллярный нагреватель устанавливали при температуре от 180 до 225°С и напряжение распыления составляло
3.6 кВ. Полный анализ сканирования был запрограммирован на сканирование m/z от 100 до 900 каждую секунду.
Результаты
Фармакокинетику S-1, который имеет следующую структуру:
102
оценивали на самцах крыс Sprague-Dawley. Кривые концентрация в плазме крови-время после внутривенного и перорального введения S-1 показаны на фиг.27. Концентрация в плазме крови склонялась мультиэкспоненциальным образом после внутривенного введения S-1. Системный клиренс (CL) для S-1 составлял 5,2, 4., 4, 4,0 и 3,6 мл/мин/кг при уровнях дозировки 0,1, 1, 10 и 30 мг/кг при внутривенном введении, соответственно. Несмотря на тенденцию к более низким значениям CL при более высоких дозах, статистический анализ не выявил значимого различия между величинами CL при четырех уровнях дозировки, что демонстрирует тот факт, что CL для S-1 не является доза-зависимым на протяжении изученного диапазона дозировки (т.е. от 0,1 до 30 мг/кг). Предшествующие исследования in vivo, проведенные в лаборатории авторами настоящего изобретения, показали, что дозировки, требуемые для проявления анаболического действия на кастрированных крысах или селективного уменьшения веса простаты у незатронутых крыс, были менее 25 мг/кг/день при подкожном введении с использованием осмотического насоса или при ежедневной подкожной инъекции, соответственно. Следовательно, S-1 проявляет линейную фармакокинетику в пределах фармакологического диапазона дозировки. Период полураспада (tl/2) для S-1 составлял 217, 241, 248 и 315 минут при соответствующих уровнях дозировки, составляющих 0,1, 1,10, 30 мг/кг при введении посредством перорального пути. AUC увеличивалась пропорционально с увеличение дозы. Статистическое объемное распределение (Vss) для S-1 составляло примерно 1,5 л/кг при четырех исследованных уровнях внутривенной дозировки, позволяя предположить, что S-1 умеренно распределялся. Данные по выведению с мочой показали, что менее чем 0,4% дозы выводилось в неизменном виде, указывая, что выведение почками S-1 является незначительным. Основываясь
103
на CL для S-1 как составляющем 5,2 мл/мин/кг и печеночном кровотоке у крыс, равном 55,2 мл/мин/кг, печеночный коэффициент извлечения для S-1 составляет менее чем 0,1. Это позволяет предположить, что метаболизм в печени по первому прохождению не будет значительно ограничивать подвергание S-1 воздействию после перорального введения. Tmax S-1 колебалось от 4,6 до 8,5 часов после перорального введения, указывая на медленное всасывание S-1. Конечный период полураспада S-1 после перорального введения был сопоставим с наблюдаемым после внутривенного введения S-1 при соответствующем уровне дозировки. Пероральная биодоступность S-1 составляла примерно 60% и не изменялась при изменении дозы.
Статистический анализ проводили с использованием однофакторного анализа отклонений (ANOVA). Р <0,05
рассматривалось как статистически значимое различие. Сравнение влияния дозировки носителя с использованием этанола вместо ДМСО вместе с ПЭГ-300 на фармакокинетические параметры S-1 проводили при уровне дозировки 10 мг/кг. Профили концентрация в плазме крови относительно времени показаны на фиг.28. Применение этанола в дозированном растворе не оказывало влияния на CL или Vss для S-1, но понижало Tmax от 4,8 до 1,77 часа и увеличивало биодоступность от 54,9 до 85,9%, что позволяет предположить, что растворимость является важным фактором, управляющим пероральным поглощением S-1.
Идентификация метаболитов S-1 в моче и фекалиях крыс Исследования метаболизма проводили для идентификации основных путей метаболизма и метаболитов S-1, особенно тех, которые являются химически реакционными метаболитами и для дополнительной оценки клинического потенциала S-1. Кроме того, полный метаболический профиль S-1 будет облегчать модификацию структуры пропанамидного образца для получения более сильных и метаболически стабильных пропанамидных соединений,
функционирующих в качестве SARM. Фрагментация S-1 в масс-спектре показана на фиг.28. Путь фрагментации S-1 в условиях индуцированной столкновением диссоциации предложен на фиг.29. Идентификация метаболитов S-1 была основана на понимании пути
104
фрагментации исходного соединения. Метаболиты S-1, идентифицированные в моче и фекалиях крысы, перечислены на фиг.30. S-1 элюировался при 58,39 минуты при использовании обоих подвижных фаз. Всего сорок метаболитов S-1 фазы I и фазы II было найдено в моче и фекалиях самцов крыс Sprague-Dawley, которые получали посредством внутривенного введения 50 мг/кг S-1. Метаболиты, идентифицированные в образцах мочи и фекалий крыс, собранные в промежуток времени 24-48 часов, были выявлены в образцах мочи и фекалий, собранных в промежуток времени 0-24 часа.
Два основных метаболита S-1 в моче представляли собой карбоновую кислоту и сульфатный конъюгат 4-нитро-З-трифторметилфениламина, который возникает при амидном гидролизе S-1 или его метаболитов. Ml был подтвержден как 3-(4-фторфенокси)-2-гидрокси-2-метилпропановая кислота, показывая то же хроматографическое (т.е. время удерживания) и массовое (т.е. масса молекулярного иона и принцип фрагментации) поведение, что и синтетические стандарты (фиг.31). Ml наблюдался в образцах мочи крысы, собранных в промежутки 0-24 часа и 24-48 часов. Обычно, что ограничения фрагментации применяют к ионам с m/z около 200 при использовании масс-спектрометра с квадрупольной ионной ловушкой (т.е. LCQDECA). Поэтому структуры метаболитов, имеющих одно кольцо, выясненные с использованием метода MS1 или MS2 с использованием LCQDECA и предложенные на фиг.28 и 29, необходимо дополнительно подтвердить или с использованием синтетических стандартов для сравнения или получением ЯМР данных для подтверждения после выделения и очистки. Однако, данные метаболиты, имеющие одно кольцо, четко появляются в образцах мочи и фекалий крыс после дозирования S-1 по сравнению с чистой мочой, собранной от тех же крыс. Основываясь на собственных наблюдениях по эффективности ионизации электрораспылением отрицательных ионов в присутствии слабой кислоты (Wu et al., 2004), авторы настоящего изобретения указывают, что метаболиты, имеющие одно кольцо, обладают меньшей эффективностью ионизации, чем метаболиты, содержащие два кольца, особенно если метаболиты с одним кольцом являются
105
более липофильными. Авторы настоящего изобретения сравнили эффективность ионизации доступного синтетического стандарта (Ml) с таковой для исходных соединений после одинаковых хроматографических и масс-спектральных условий (данные не показаны) и подтвердили вышеуказанный вывод. Хотя невозможно количественно оценить метаболиты без стандартов с использованием ЖХ/МС, логично оценить относительное количество на основании понимания хроматографического разделения и эффективности ионизации. Метаболиты, имеющие одно кольцо, проявляют аналогичную или дажее более высокую интенсивность сигналов, чем метаболиты, содержащие два кольца, что позволяем предположить, что они присутствовали в более высоких концентрациях. Другими словами, был сделан вывод, что Ml и Мб являются двумя основными метаболитами S-1.
Метаболиты фазы I, возникающие за счет восстановления нитрогруппы в А-кольце до ароматического амина и гидроксилирования В-кольца, также были идентифицированы в образцах мочи и фекалий крыс. Кроме того, множество метаболитов фазы II, возникающих за счет сульфирования, глюкуронидирования или метилирования, также были выявлены. В дополнение к упоминавшимся выше метаболитам гидролиза, восстановление нитрогруппы в А-кольце, а также гидроксилирование В-кольца играют важную роль в биотрансформации S-1, поскольку большинство из содержащих два кольца метаболитов включает восстановленную нитрогруппу, включая гидроксиламинные промежуточные соединения, и/или гидроксилирование в В-кольце. Подводя итог, S-1 был подвержен трем метаболическим путям фазы
I - гидролизу амидной связи, восстановлению нитрогруппы в А-кольце и гидроксилированию В-кольца. Метаболические пути фазы
II для S-1 включали сульфирование, глюкуронидирование и метилирование.
Основные метаболические пути S-1 показаны на фиг.31. Также высказано предположение о ферментах, которые вероятны в метаболизме S-1. Существует три основных метаболических пути в метаболизме S-1 - восстановление нитрогруппы, гидроксилирование В-кольца и гидролиз амидной связи. Хотя и медленно, амидный
106
гидролиз может происходить под действием неспецифических эстераз плазмы крови. Более вероятно, амидная связь в S-1 может гидролизоваться под действием амидазы печени, однако было установлено, что амидаза повсеместно экспрессируется в любой ткани и физиологической жидкости. Р450 также может быть ответственным за восстановление нитрогруппы, но также могут быть включены другие ферменты (например, ксантиноксидаза, микросомальный NADPH-цитохром С) . Кроме того, для перорально вводимых лекарственных средств восстановление может протекать под действием ферментов редуктазы анаэробных бактерий кишечника.
Бикалутамид, нестероидный антиандроген, имеет структуру, подобную S-1, с цианогруппой вместо нитрогруппы в А-кольце и сульфонильной связью вместо простой эфирной связи с В-кольцом. Бикалутамид проявляет два основных метаболических пути: гидролиз амидной связи и гидроксилирование В-кольца. Во время фармакокинетическких исследований бикалутамида на крысах, период полуразложения, CL и V для рацемического бикалутамида составляли 17,7 часа, 0,80 мл/мин/кг, 1,23 л/кг соответственно при уровне дозировки 0,5 мг/кг. S-1 имеет подобное бикалутамиду V, но примерно в шесть раз более высокий CL при в пять раз более коротком времени полураспада.
Данное явление можно было объяснить различным метаболизмом этих двух соединений. У крыс наблюдалось большое число нитро-восстановленных метаболитов S-1, позволяя предположить, что данный путь может вносить значительный вклад в быстрый CL соединения. Кроме того, присутствие нитрозаместителя в А-кольце может влиять на скорость амидного гидролиза и дополнительно вносить вклад в более быстрый метаболизм S-1. Для сравнения, сульфонильная связь, присутствующая в бикалутамиде, представляет собой сильную электроноакцепторную группу, которая вероятно деактивирует В-кольцо и делает его менее подверженным окислению, тогда как циано-заместитель в А-кольце бикалутамида менее подвержен восстановлению. Таким образом, бикалутамид проявляет более продолжительный период полураспада чем S-1 наряду с аналогичными объемами распределения, что и S-1. Как
107
таковые, нитро-восстановление и гидроксилирование В-кольца вероятно играют более важную роль,, чем гидролиз в метаболизме S-1 in vivo. Авторы настоящего изобретения исследовали метаболический профиль S-1 во временные интервалы 0-24 часа и 24-48 часов. Ферментативное кинетическое исследование будет проведено в ближайшем будущем с использованием радиоактивно меченного S-1 для понимания каким образом данные реакции трех метаболических путей фазы I и связанной фазы II управляют метаболизмом S-1.
Лекарственные средства, содержащие первичный амин, обычно связаны с высоким процентом идиосинкратических реакций на лекарственные средства. Ариламинные соединения, чьи реакционные метаболиты включают окисление до гидроксиламина с последующим конъюгированием кислорода с лучшей уходящей группой (например, ацетат или сульфат), приводит к карциногенным реакциям посредством иона нитрения, возникающего из конъюгатов, теряющих лучшую уходящую группу. Однако первичные ариламины, содержащие электроноакцепторную группу в пара-положении к амино группе, образуют ион нитрения с пониженной скоростью. Такие метаболиты могут приводить к ковалентному связыванию через нитрозо-метаболиты. Хотя сульфгидрильная группа может взаимодействовать с нитрозо-метаболитами с образованием сульфинамида, сульфинамид легко гидролизуется обратно до амина в очень слабо кислых или щелочных условиях. Ариламины также могут подвергаться хлорированию под действием активированных нейтрофиллов с образованием реакционноспособных метаболитов, которые вызывают агранулоцитоз.
В дополнение к ковалентному связыванию промежуточные метаболиты ариламинов подвержены исчерпывающей
восстановительной циклизации, приводящей к метемоглобинемии и гемолитической анемии. Ароматические нитросодержащие
лекарственные средства аналогичны ариламинам в образовании некоторых химически реакционноспособных метаболитов, поскольку те же самые гидроксиламинные и нитрозо метаболиты образуются при восстановлении нитрогрупп, как они же образуются при окислении ариламинов. Таким образом, ароматические
108
нитросодержащие лекарственные средства также связаны с высоким процентом идиосинкратических реакций лекарственных средств. На фиг.28 и 29 метаболиты, полученные при гидролизе и восстановлении нитрогруппы (например, Мб, 13. 14, 15 и т.д.), могут рассматриваться как химически реакционноспособные метаболиты. Кроме того, наблюдаемые М34 и М40 приводят к образованию другого химически реакционно способного метаболита в образцах мочи. М4 0 представляет собой диол, который in vivo обладает способностью окисляться в альдегид, а затем в карбоновую кислоту. При потере группы карбоновой кислоты и молекулы воды, может образовываться акцептор Михаэля (m/z 259), который представляет собой мягкий электрофил, который, легко взаимодействуя с сульфгидрильными группами, может вызвать различные типы идиосинкратических реакций лекарственных средств. Другой акцептор Михаэля (m/z 289), также может образовываться посредством потери молекулы воды в М39. Поскольку акцепторы Михаэля представляют собой мягкие электрофилы, которые легко реагируют с сульфгидрильными группами, стабильный продукт, образующийся в результате захвата глутатиона, наблюдался при m/z 452 (М37) который представляет собой конъюгат меркаптуровой кислоты с таким акцептором Михаэля. Данные наблюдения подтвердили, что акцептор Михаэля (m/z 289) существовал in vivo, хотя наблюдалась только форма конъюгата меркаптуровой кислоты. Такой акцептор Михаэля (m/z 289) образовывался при О-дезалкилировании под действием микросомальной оксидазой смешанных функций в печени, почках, легких и кишечнике. Низкая интенсивность сигнала М37 может указывать на низкую концентрацию данного акцептора Михаэля (m/z 289) и его глутатионового конъюгата in vivo, тогда как метаболит карбоновой кислоты, образованный в результате гидролиза амидной связи показал значимо высокие уровни в испражнениях, особенно в моче.
К настоящему моменту в предклинических исследованиях метаболизма S-1 было выявлено три типа химически реакционноспособных метаболитов. Они представляют собой первичные амины, метаболиты восстановления нитрогруппы и
109
акцепторы Михаэля.
Физико-химические свойства соединений играют важную роль в определении абсорбции, распределения, метаболического выделения и токсичности лекарственных средств, представляющих собой небольшие молекулы. Химические структуры лекарственных средств являются функцией их физико-химических свойств. Сравнение фармакокинетических параметров, физико-химических свойств и структурной информации для S-1 и бикалутамида помогает идентифицировать разницу в метаболизме этих двух химических продуктов. S-4, основное соединение, исследованное в качестве SARM, представляет собой структурный аналог S-1, имеющий те же самые химические фрагменты и основную цепь, что и S-1, с единственным исключением введения ацетамидо группы вместо фтора в пара-положение В-кольца. Фармакокинетические исследования S-4 показали, что он обладает более коротким временем полураспада, меньшим объемом распределения и пониженным выведением по сравнению с S-1. Более высокая величина Log Р для S-1 и меньшее связывание с белками плазмы могут объяснить более высокий объем распределения по сравнению с S-4. Меньшая электротрицательность ацетамидо-заместителя по сравнению с фтор-группой может приводить к более быстрому окислению В-кольца в S-4. Однако деацетилизование и ацетилирование ацетамидо-заместителя в процессе биотрансформации приводит к сложности в предсказании фармакокинетики S-4 с использованием структурной информации.
Галогеновые группы часто используются для блокирования метаболизма или потенциального дезактивирования кольцевых систем. Тип, число, положение томов галогена, все эти факторы играют важную роль в регулировании физических и биохимических свойств, в особенности метаболизма галогенированных ароматических соединений. Очевидно, природа кольцевой структуры также оказывает потенциальное влияние. Обычно, скорость окислительного метаболизма снижается с ростом
электроотрицательности галогенидного заместителя
(электроотрицательность F 4,0; С1, 3,0; Вг, 2,8; I, 2,5). Кроме того, скорости метаболизма обычно уменьшаются при увеличении числа галогенов в ароматическом кольца вследствие стерических
препятствий. Липофильность соединений способствует абсорбции и распределению, тогда как смежные незамещенные атомы углерода предрасположены к метаболизму и таким образом выведению. С-б представляет собой другой структурный аналог S-1, имеющий группы хлора и фтора в пара- и мета-положениях В-кольца, соответственно и имеет такой химический каркас и другие фрагменты, что и S-1. Фармакокинетические исследования С-б показали, что он обладает более продолжительным временем полураспада, меньшим объемным распределением и меньшим клиренсом, чем S-1. Более низкий клиренс С-б может объясняться способностью его галогеновых заместителей стерически и электронно предотвращать метаболизм. Неожиданно Сб, имеющий более высокий LogP (6,171) чем S-1, продемонстрировал более низкий объем распределения. Данное; наблюдение можно объяснить более высоким связыванием С-6 с белками плазмы крови. Более высокая величина LogP для С-6 вероятно вносит вклад в его лучшую абсорбцию и более высокую AUC после внутривенного и перорального введения. Можно было бы ожидать, что различные замещения (т.е. число и положение) атомов галогена в В-кольце будут дополнительно блокировать окислительный метаболизм в большей степени, когда замещенные пропанамиды будут являться фармакологически активными.
Суммируя вышесказанное, S-1, обладающий высокой степенью эффективности и действенности на животных моделях, приемлемой фармакокинетикой на предклинических видах и подходящими физико-химическими свойствами, представляет собой многообещающий потенциальное лекарственное средство SARM для клинической разработки.
Пример 9
Влияние SARM на экспрессию фермента цитохром Р450 Материалы
Рекомбинантные ферменты CYP человека (Supersome(r)), микросомные препараты печени, свежие гепатоциты человека, среда Hepato-STIM и вспомогательные добавки, и первичные антитела для ферментов CYP 1А2, 2С9, 2С19, 2D6, ЗА4 были получены от BD Gentest (Woburn, MA). 4'-Гидрокси-диклофенак, 4'-гидрокси
мефенитоин, мефенитоин, V -гидрокси-буфуралол, и буфуралол также были получены от BD Gentest. Кроличьи противоактиновые IgG, козьи противомышиные IgG и кроличьи противокозьи IgG были получены от Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA). бР-Гидрокси-тестостерон был получен от Steraloids Inc. (Newport, RI). Усовершенствованный хемолюминисцентный набор был получен от Amersham Biosciences (Buckinghamshire, UK) . Реагент Trizol(r) и система синтеза первой цепи (First-strand Synthesis System) Superscript(tm) была получены от Invitrogen Corp. (Carlsbad, California). ПЦР праймеры были синтезированы IDT, Inc. (Coralville, IA) . Гелевый краситель нуклеиновых кислот SYBR(r) зеленый был получен от Cepheid Molecular Probes (Eugene, OR) Добавка Smart Cucle* была получена (Sunnyvale, CA) . Bee другие химикаты и реагенты были получены от Sigma Chemical Company (St Louis, MO) . Все аналитические колонки получены от Waters Corporation (Milford, MA).
Цитотоксичность в клетках Hep62
Клетки HepG2 размещали в 24-луночных планшетах и обрабатывали растворителем (0,1% ДМСО) или различными концентрациями (от 1 до 100 мкМ) S-1 или S-4 в течение 72 часов. Для каждой концентрации использовали по три лунки. Среду меняли каждые 24 часа. В конце обработки число клеток измеряли с использованием колориметрического анализа с использованием сульфородамина В (SRB) и выражали в процентах от наблюдавшегося в контрольных образцах.
Первичная культура гепатоцитов человека
Первичные культуры гепатоцитов человека, полученные от одного донора (BD Gentest, Lot# 54, Донор# НН129, женщина, белая, 49 лет, умерла от инсульта) помещали в 24- или 48-луночные планшеты и перевозили в течение 24 часов после выделения. Культуры поддерживали в среде Hepato-STIM при 37°С. Культуральная среда не включала фенол красный, но была дополнена эпидермальным фактором роста (EGF, 1 мг/100 мл) и дексаметазоном (0.1 мкМ).
Гепатоциты выдерживали в среде Hepato-STIM в течение двух
112
дней после прибытия, чтобы дать им возможность восстановиться после транспортировки и затем инкубировали с S-1 (2 мкМ), S-4 (2 мкМ), рифампицином (RIF) (10 мкМ), Р-нафтофлавоном (BNF) (50 мкМ) и растворителем (0,1 % ДМСО) в течение 72 часов. В каждую обработку включали пятнадцать лунок и по три лунки использовали для каждого анализа активности. Клетки без обработки также были включены в качестве контроля. Содержащие лекарственное средство растворы получали каждый день свежеприготовленными в ДМСО и затем разводили до желаемой концентрации в культуральной среде. Культуральную среду с лекарственным средством меняли каждые 24 часа. Функциональный анализ CYP фермента
После трех дней обработки в 48-луночных планшетах целые гепатоциты промывали три раза пустой средой и затем инкубировали со специфическими по отношению к ферментам CYP субстратами, включая фенацетин (100 мкМ) (CYP1A2); диклофенак (100 мкМ) (CYP2C9); мефенитоин 100 мкМ (CYP2C19); буфуралол 100 мкМ (CYP2D6) и тестостерон 200 мкМ (CYP3A4) в течение одного часа при 37°С для исследования активности ферментов. Для каждой реакции использовали по три лунки и появление метаболитов в среде оценивали с помощью ВЭЖХ анализа в присутствии подходящего внутреннего стандарта (таблица 1).
Таблица 1
Специфические субстраты для рекомбинантных ферментов CYP человека, NAT1 и NAT2 и внутренние стандарты, использованные
для ВЭЖХ анализа
Фермент
Субстраты
Метаболиты
Внутренний стандарт для ВЭЖХ анализа
CYP1A2
фенацетин
Ацетамидофенол
ацетамидофенол
CYP2C9
Диклофенак
4'-гидрокси-диклофенак
Изоксикам
CYP2C19
Мефенитоин
4'-гидрокси-мефенитоин
Фенобарбитал
113
CYP2D6
Буфуралол
1'-гидрокси-буфуралол
CM-II-87*
CYP3A4
Тестостерон
6|3-гидрокси-тестостерон
дексаметазон
* структурный аналог S-4
Клетки лизировали после функционального анализа и определяли общее содержание белка в лизате с использованием метода Брадфорда (Bio-Rad Protein Assay). Все данные активности ферментов нормализовали по общему содержанию белка в каждой лунке.
Ацетамидофенол (метаболит CYP1A2) отделяли на колонке с обращенной фазой (uBondaPak С18, 3,9x300 мм) с использованием в качестве мобильной фазы 15% ацетонитрила в деионизированной воде при скорости потока 1,5 мл/мин и проводили детектирование по УФ поглощению при 244 нм. 4'-Гидроксидиклофенак (метаболит CYP2C9) отделяли на колонке с обращенной фазой (NovaPak С18, 3,9x150 мм) с использованием в качестве мобильной фазы 40% ацетонитрила и 0,5% муравьиной кислоты (рН 2,65) в деионизированной воде при скорости потока 1 мл/мин и проводили детектирование по УФ поглощению при 280 нм. 4'-Гидроксимефенитоин (метаболит CYP2C19) отделяли на колонке с обращенной фазой (NovaPak С18, 3,9x300 мм) с использованием в качестве мобильной фазы 25% ацетонитрила и 25 мМ фосфата калия (рН 7,4) в деионизированной воде при скорости потока 1 мл/мин и проводили детектирование по УФ поглощению при 214 нм. 1'-Гидроксибуфуралол (метаболит CYP2D6) отделяли на колонке с обращенной фазой (NovaPak С18, 3,9x150 мм) с использованием в качестве мобильной фазы 50% ацетонитрила и 2 мМ перхлорной кислоты в деионизированной воде при скорости потока 1 мл/мин и проводили детектирование с использованием флуоресцентного детектора с длинной волны возбуждения 252 нм и длиной волны эмиссии 302 нм. бр-Гидрокситестостерон (метаболит CYP3A4) отделяли на колонке с обращенной фазой (NovaPak С18, 3,9x300 мм) с использованием в качестве мобильной фазы 40% ацетонитрила в деионизированной воде при скорости потока 1
114
мл/мин и проводили детектирование по УФ поглощению при 254 нм. Иммуноанализ методом вестерн-блоттинга
Лизат клеток, полученный после функционального анализа, использовали для иммуноанализ методом блоттинга ферментов CYP. Бета-актин также анализировали в качестве загрузочного контроля. Сигнал обнаруживали с использованием
усовершенствованного хемолюминисцентного набора от Amersham Biosciences (Buckinghamshire, UK) . Стандартную кривую для каждой изоформы CYP создавали с использованием рекомбинантного CYP человека Supersome(r) с известным содержанием фермента. Плотность полосы анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij).
ПЦР анализ в режиме реального времени
Отдельный 24-луночный планшет гепатоцитов обрабатывали аналогично описанному выше. В каждую обработку включали четыре лунки. После обработки в течение 72 часов суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol(r). Образцы кДНК получали из образца выделенной суммарной РНК с использованием системы синтеза первой нити Superscript(tm) и затем использовали для ПЦР анализа в режиме реального времени. Генспецифические праймеры были разработаны для CYP1A2, 2С9, 2С19, 2D6, ЗА4 и GAPDH (Таблица 2) с использованием программы Primer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.htm 1.) .
Таблица 2
Олигонуклеотидная последовательность для ПЦР-анализа в режиме
реального времени
Праймер
Последовательность (5'к 3' направлении)
Т.пл.7
CYP1A21
Прямой
Обратный
CAGAATGCCCTCAACACCTT CTGACACCACCACCTGATTG
89°С
CYP2C92
Прямой
Обратный
AAGAACCTTGACACCACTCCA TAATGCCCCAGAGGAAAGAG
89°С
115
CYP2C193
Прямой
Обратный
TGGGACAGAGACAACAAGCA TGGGGATGAGGTCGATGTAT
88°С
CYP2D64
Прямой
Обратный
AGGGAACGACACTCATCACC CAGGAAAGCAAAGACACCAT
92°С
CYP3A45
Прямой
Обратный
AATAAGGCACCACCCACCTA CTTGGAATCATCACCACCAC
86°С
GAPDH6
Прямой
Обратный
GTCAGTGGTGGACCTGACCT TGAGCTTGACAAAGTGGTCG
91°С
1на основании опубликованной последовательности CYP1A2 (NM 000761.2)
2на основании опубликованной последовательности CYP2C9 (NM 000771)
Зна основании опубликованной последовательности CYP2C19 (NM 000769)
4на основании опубликованной последовательности CYP2D6 (NM 000106)
5на основании опубликованной последовательности CYP3A4 (NM 017460)
6на основании опубликованной последовательности GAPDH(NM 002046)
7Температуры плавления Amplicon(tm) получены анализом кривых плавления
Амплификацию проводили с использованием Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) следующим образом: 300 сек. при 95°С, 35 циклов по 20 сек при 95°С, 30 сек при 58°С и 30 сек при 72°С. За циклом распространения в 300 сек при 72°С проводили анализ плавления, начиная при 60°С и повышая до 95°С, при скорости 0,2°С/сек. Отрицательные первые производные пики, которые характерны для температуры плавления продукта ПЦР, использовали для идентификации конкретных продуктов ПЦР. Условия реакции: 1 мкл (50-100 нг) раствора кДНК, 14,6 мкл DEPC воды, ПЦР буфер
116
(10 мМ Tris-HCI, рН 8,3, 50 мМ KC1 и 1,5 мМ MgCl2) , 200 мкМ dNTP, no 200 нМ смыслового и антисмыслового праймеров, разведение 1:12500 гелевого красителя нуклеиновых кислот SYBR(r) зеленого, 10000Х в ДМСО, 1,0 Ед,.Тад ДНК-полимеразы и 5 мкл вспомогательной добавки Smart Cycler(r) для общего объема 25 мкл на реакцию. Каждый образец и ДНК подвергали взаимодействию из двух пробегов для каждой изоформы CYR для GAPDH.
Для количественной оценки мРНК использовали сравнительный метод Ct (Livak KJ and Schmittgen TD (2001) Methods 25: 402408). В методе сравнивается относительная экспрессия представляющего интерес гена с экспрессией ссылочного гена, такого как GAPDH. Число циклов, требуемое для достижения произвольной пороговой величины флуоресценции Ct, использовали
для подсчета Дельта Ct (Act) путем вычитания Ct ссылочного гена из Ct целевого гена. Act рассчитывали для контроля (инкубация в среде) и экспериментально обработанных клеток. Вычитание величины Act экспериментальной группы из Act контрольной группы давало AACt. Кратность изменения относительно контроля определяли с использованием формулы 2-AACt. Статистический анализ всех параметров проводили с использованием однофакторного ANOVA с установкой априори величины альфа при р <0,05.
Результаты
Цитотоксичность S-1 и S-4 в клетках HepG2
Цитотоксичность S-1 и S-4 была оценена в клетках HepG2, клеточная линия гепатоклеточной карциномы, для определения концентрации, которая будет использоваться для лечения гепатоцитов человека. S-1 и S-4 показали некоторую токсичность в клетках HepG2 при концентрациях, превышающих 10 мкМ (фиг.33). Однако токсичности не наблюдалось при более низких концентрациях. Концентрация, требуемая для проявления токсичности, была намного больше, чем наиболее высокие концентрации S-4 в плазме крови (примерно 0,03 мкМ), наблюдавшиеся во время I фазы клинических испытаний. Чтобы полностью оценить действие S-1 и S-4 на экспрессию CYP, не
117
вызывая цитотоксичность, концентрация равная 2 мкМ была выбрана для исследований на гепатоцитах человека.
Действие S-1 и S-4 на функцию фермента CYP, экспрессию белка и уровни мРНК
Результаты для отдельного фермента CYP суммированы на фиг. 34-38, включая ферментативную активность, измеренную как преобразование исследуемого субстрата в метаболит, уровень экспрессии белка фермента CYP, определенный с использованием иммуноблота, и относительный уровень мРНК, количественно оцененный ПЦР-реакцией в режиме реального времени.
Активность CYP1A2 (фиг.34) в необработанных контрольных клетках составляла около 50 пмоль/(мг*мин). Обработка растворителем (0,1% ДМСО), S-1 (2 мкМ) и S-4 (2 мкМ) не вызывала значительно изменения активности CYP1A2, уровня экспрессии белка или уровней мРНК. Сигнал мРНК в образцах, обработанных растворителем, не обнаруживался вследствие ограниченного количества доступного РНК. BNF (50 мкМ) , известный индуктор CYP1A2, значительно повышал активность CYP1A2 в 10 раз вместе с сопутствующим увеличением экспрессии белка CYP1A2. Соответственно, уровень мРНК фермента также увеличивался более чем в 7 раз после обработки BNF, показывая что увеличение активности CYP1A2 было связано с индукцией экспрессии фермента под действием BNF.
Как активность ферментов CYP2C9 (фиг.35) и CYP2C19 (фиг.36), так и экспрессия продемонстрировали очень похожие изменения в ответ на различные обработки. Обработка растворителем и BNF показывали небольшое воздействие на активность ферментов и уровни экспрессии ферментов CYP 2С9 и 2С19. Обработка RIF (10 мкМ) увеличивала активность CYP2C9 и CYP2C19 в 2 раза и 6 раз, соответственно, при незначительном увеличении в уровнях экспрессии белка, но не увеличивала значительно уровни мРНК. S-1 и S-4 не вызывали значительных изменений в экспрессии белка ферментов CYP 2С9 и 2С19 или уровнях мРНК. Однако обе обработки понижали активность ферментов в отношении их исследуемого субстрата. S-4 понижал активность ферментов CYP 2С9 и 2С19 на 57% и 73%,
118
соответственно; тогда как S-1 понижал активность ферментов CYP 2С9 и 2С19 на 16% и 47%, соответственно. Поскольку значительных изменений в экспрессии фермента не наблюдалось и полагая, что S-4 обладает некоторой аффинностью в отношении CYP2C19 при более высоких мкМ концентрациях (данные не показаны), снижение активности ферментов в образцах, обработанных S-1 и S-4, могла быть связана с прямым ингибированием активности ферментов с помощью SARM и/или их метаболитов.
Экспрессия CYP2D6 (фиг.37) слегка увеличивалась при обработке RIF и BNF, тогда как активность CYP2D6 также повышалась более чем в 2 раза. При обработке с использованием S-1 или S-4 значительных изменений в ферменте CYP2D6, мРНК или активности не наблюдалось.
Хотя S-4 представляет собой субстрат для CYP3A4, он не влияет на экспрессию фермента или активность гепатоцитов (фиг.38). Аналогичные результаты наблюдались в образцах, обработанных растворителем, S-1 и BNF. RIF является более сильным индуктором CYP3A4, который значительно увеличивает активность фермента (7-кратное увеличение) и экспрессию фермента как на уровне мРНК (в 3,69 раз) и уровне белков (более чем в 10 раз), позволяя предположить, что повышение активности фермента было связано с увеличением экспрессии фермента.
RIF (10 мкМ) значительно увеличивает ферментативную активность ферментов CYP 2С9, 2С19 и ЗА4 в 2, 6 и 7 раз соответственно. BNF (50 мкМ) значительно увеличивает ферментативную активность CYP1A2 в 10 раз. Данные изменения в активности ферментов больше относятся к изменениям в экспрессии ферментов поскольку аналогичные изменения также наблюдались в уровнях экспрессии белка после обработки RIF и BNF. В гепатоцитах, обработанных S-4, ферментативная активность CYP2C9 и 2С19 снижалась на 57% и 73% соответственно. В гепатоцитах, обработанных S-1, ферментативная активность CYP2C9 и 2С19 снижалась на 16% и 47% соответственно. Однако в клетках, обработанных S-1 и S-4, значительных изменений в уровнях белка или мРНК любых таких ферментов не наблюдалось, позволяя предположить, что наблюдаемые снижения в ферментативной
119
активности вероятно происходят благодаря непосредственному ингибированию ферментов.
Как отмечено ранее, NR играют очень важную роль в регулировании экспрессии фермента CYP. Оба модельных индуктора, использованных в данном исследовании, RIF и BNF, действительно представляют собой лиганды NR. BNF индуцирует экспрессию CYP1A2 путем активации арилуглеводородного рецептора (AhR), тогда как RIF индуцирует экспрессию ферментов CYP 2С9 и ЗА4 путем активации PXR человека (рецептор прегнана X). В недавних исследованиях с использованием промотора CYP2C19 также установлены сайты связывания для CAR (конститутивный рецептор андростана) и GR. Гель-шифт анализ показал, что PXR человека связывается также с CAR-отвечающим элементом, что позволяет предположить, что экспрессия CYP 2С19 также могла бы непосредственно регулироваться PXR-лигандом (т.е.
рифампицином). Исследование индукции гена CYP 2С с использованием основных гепатоцитов человека также показали, что рифампицин индуцирует экспрессию ферментов CYP 2С9 и 2С19 на уровне как белка, так и мРНК. Результаты, наблюдавшиеся в данном исследовании, согласуются с указанными данными.
Экспрессия CYP2D6 человека регулируется другим одиночным рецептором, ядерным фактором 4а гепатоцитов (HNF4cc) . Не существует подтверждений, чтобы показать, что RIF или BNF являются лигандами HNF4cc. Хотя HNF40C непосредственно регулирует генную экспрессию PXR и CAR, не ясно, могут ли PXR и CAR регулировать экспрессию HNF4a. Индукция экспрессии CYP2D6 с помощью RIF и BNF может быть связана с "перекрестным разговором" между PXR, CAR и HNF4a.
Обработка SARM не вызывала каких-либо значимых изменений в основной экспрессии фермента CYP, что позволяет предположить, что AR может быть не включен в непосредственное регулирование экспрессии данных ферментов CYP и маловероятно, чтобы существовало какие-либо взаимодействия между SARM и одиночными рецепторами, которые непосредственно регулируют экспрессию ферментов CYP.
120
Хотя S-1 и S-4 не показали каких-либо регулирующих действий на экспрессию фермента CYP на уровне транскрипции или экспрессии белка, обработка S-1 и S-4 снижала активность ферментов CYP 2С9 и 2С19, что могло быть результатом прямого ингибирования фермента остаточными количествами лекарственных средств или метаболитов, оставшимися в культуре; общая проблема, наблюдаемая в исследованиях индукции ферментов с использованием гепатоцитов. Тем не менее, возможны взаимодействия лекарственное средство-лекарственное средство при рассмотрении взаимодействий, наблюдаемых между SARM и ферментами CYP 2С.
В целом, S-1 и S-4 не индуцируют и не подавляют экспрессию основных ферментов CYP в основополагающих гепатоцитах человека, хотя данные лекарственные средства могли бы непосредственно ингибировать ферментативную активность ферментов CYP 2С9 и 2С19. Однако концентрация лекарственного средства, использованная в данном исследовании (2 мкМ) была выше в 50 раз, чем концентрация в плазме; крови, которая могла бы достигаться при клинически значимых дозах. Таким образом, ингибирующее действие S-1 и S-4 на ферменты CYP 2С9 и 2С19 может не наблюдаться in vivo.
Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение не ограничено конкретно показанным и описанным выше. Точнее, объем изобретения определен в следующей формуле изобретения.
121
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Метаболит соединения селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где указанный SARM представлен структурой формулы I:
где G представляет собой О или S; X представляет собой О;
Т представляет собой ОН, OR, -NHCOCH3, или NHCOR;
Z представляет собой N02, CN, СООН, COR, NHCOR или CONHR;
Y представляет собой водород, алкил, гидрокси-алкил или алкиловый альдегид CF3, F, I, Br, Cl, CN, C(R)3 или Sn(R)3;
R представляет собой алкил, галогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, CH2F, CHF2, CF3, CF2CF3, арил, фенил, галоген, алкенил или ОН;
Ri представляет собой СН3, CH2F, CHF2, CF3, СН2СН3 или CF2CF3, и
А представляет собой или
где R2, R3, R4, R5, R6 независимо представляют собой Н, галоген, CN, NHCOCF3, ацетамидо или трифторацетамидо.
2. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где G представляет собой О.
3. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Т представляет собой ОН.
4. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Rx представляет собой СН3.
5. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Z представляет собой CN.
6. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Y представляет собой CF3.
7. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Q расположен в пара-положении.
8. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Z расположен в пара-положении.
9. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где Y расположен в мета-положении.
10. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный метаболит представляет собой агонист андрогеновых рецепторов.
11. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный метаболит представляет собой антагонист андрогеновых рецепторов.
12. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный SARM представлен структурой формулы II:
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
13. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный SARM представлен структурой формулы VII:
02N
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
14. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.13, где указанный метаболит представлен структурой:
123
H2N
где Q представляет собой ацетгмидо или трифторацетамидо.
15. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.13, где указанный метаболит представлен структурой:
Rf Т
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо, и где NR2 представляет собой NO, NHOH, NH0S03 или NH0-глюкоронид.
16. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный SARM представлен структурой формулы VIII:
17. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.16, где указанный метаболит представлен структурой:
модулятора
андрогеновых
Kf 'Т
18. Метаболит селективного рецепторов по п.1, где указанный метаболит представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы I.
19. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.18, где указанный метаболит представлен структурой:
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
20. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.18, где указанный метаболит представлен структурой:
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
21. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный метаболит представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы I.
22. Метаболит . селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.21, где указанный метаболит представлен структурой:
глюкоронид-О-
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
23. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.21, где указанный метаболит представлен структурой:
глюкоронид-i
где Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо.
24. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный метаболит представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы I.
25. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный SARM представлен структурой формулы III:
125
02N-
H3C ОН ^ NH V J*
CF3
26.
рецепторов структурой:
Метаболит
селективного модулятора
андрогеновых
по п.25, где указанный метаболит представлен
Н3С ОН
щ^р/ .о. о
02N^ ^ - CF3
27. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1, где указанный SARM представлен структурой формулы IV:
Н3С ОН
МНСОСН3
28. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.27, где указанный метаболит представлен структурой:
Н3С ОН NH V .0.
02КГ ^ "NH2 CF3
29. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.21, где указанный метаболит представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы IV.
30. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.29, где указанный метаболит представлен структурой:
126
31. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.29, где указанный метаболит представлен структурой:
дасоснз
32. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.27, где указанный метаболит представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы I.
33. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.32, где указанный метаболит представлен структурой:
NHCOCHa
34. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.32, где указанный метаболит представлен структурой:
NHCOCH3
35. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.27, где указанный метаболит представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы IV.
36. Композиция, содержащая метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1; и подходящий носитель или разбавитель.
37. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество метаболита селективного модулятора андрогеновых
127
рецепторов по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
38. Способ связывания соединения модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором, включающий стадию контактирования андрогеновых рецепторов с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для связывания метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором.
39. Способ подавления сперматогенеза у пациента, включающий контактирование андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для подавления образования спермы.
40. Способ контрацепции пациента мужского пола, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для подавления образования спермы в организме пациента, осуществляя тем самым контрацепцию у пациента.
41. Способ гормональной терапии, включающий стадию контактирования андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве эффективном для осуществления изменений при андроген-зависимом заболевании.
42. Способ гормональной заместительной терапии, включающий стадию контактирования андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве эффективном для осуществления изменений при андроген-зависимом заболевании.
43. Способ лечения пациента с гормональным заболеванием, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для осуществления изменений при андроген-зависимом заболевании.
44. Способ лечения пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве,
128
эффективном для лечения рака простаты у пациента.
45. Способ профилактики рака простаты у пациента, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для профилактики рака простаты у пациента.
46. Способ замедления развития рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для замедления развития рака простаты у пациента.
47. Способ профилактики рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для профилактики рецидива рака простаты у пациента.
48. Способ лечения рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для лечения рецидива рака простаты у пациента.
49. Способ лечения сухости глаз у пациента, страдающего сухостью глаз, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для лечения сухости глаз у пациента.
50. Способ профилактики сухости глаз у пациента, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для профилактики сухости глаз у пациента.
51. Способ индукции апоптоза в раковых клетках, включающий стадию контактирования клеток с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.1 в количестве, эффективном для индукции апоптоза раковых клеток.
52. Метаболит соединения селективного модулятора андрогеновых рецепторов (SARM), где указанный SARM представлен структурой формулы II:
129
Н3С ОН
где X представляет собой О;
Z представляет собой N02, CN, СООН, COR, NHCOR или CONHR;
Y представляет собой CF3, F, I, Br, Cl, CN, CR3 или SnR3;
Q представляет собой ацетамидо или трифторацетамидо;
R представляет собой алкил, галогеналкил, дигалогеналкил, тригалогеналкил, CH2F, CHF2, CF3, CF2CF3, арил, фенил, F, Cl, Br, I, алкенил или ОН;
и Rx представляет собой СН3, CH2F, CHF2, CF3, СН2СН3 или CF2CF3.
53. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где Z представляет собой CN.
54. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где Y представляет собой CF3.
55. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанное соединение представляет собой агонист андрогеновых рецепторов.
56. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанное соединение представляет собой антагонист андрогеновых рецепторов.
57. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный SARM представлен структурой формулы IX:
58. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.57, где указанный метаболит представлен
130
структурой:
JTTT
H3C он
59. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.57, где указанный метаболит представлен структурой:
н3с он
где NR2 представляет собой NHOH, NO, NH0S03 или NH0-глюкоронид.
60. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный SARM представлен структурой формулы X:
НзС ОН
NHCOCH3
61. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.60, где указанный метаболит представлен структурой:
Н3С ОН
62. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный метаболит представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы II.
63. Метаболит селективного модулятора андрогеновых
131
рецепторов по п.62, структурой:
Н3С он
где указанный метаболит представлен
или || Y
НзС ОН NH V а ^
64. Метаболит рецепторов по п.62, структурой:
но Н3С он SN .CL
селективного модулятора андрогеновых где указанный метаболит представлен
н3с он
или ] Y
65. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный метаболит представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы II.
66. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.65, где указанный метаболит представлен структурой:
Н3С ОН
глюкоронид-0-j-¦ у"* Y
67. Метаболит рецепторов по п.65, структурой:
глюкоронид-О
Н3С ОН NH jC. Л.
ИЛИ
селективного модулятора андрогеновых где указанный метаболит представлен
Н3С он
или
О-глюкоронид
Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный метаболит представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы II.
69. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный SARM представлен структурой
132
формулы III:
02N'
H3C ОН ^ NH У OS
CF3
70. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.69, где указанный метаболит представлен структурой:
71. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52, где указанный SARM представлен структурой формулы IV:
Н3С ОН
о2> г у NHCOCH3
CF3
72. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.71, где указанный метаболит представлен структурой:
Н3С ОН
NH V а
NH2
73. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.71, где указанный метаболит представляет собой гидроксилированное производное соединения SARM формулы IV.
74. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.73, где указанный метаболит SARM представлен
133
структурой:
•nhcoch3
75. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.73, где указанный метаболит представлен структурой:
NHCOCH3
76. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.71, где указанный метаболит представляет собой О-глюкоронидное производное соединения SARM формулы IV.
77. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.7 6, где указанный метаболит представлен структурой:
NHCOCHj
78. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.7 6, где указанный метаболит представлен структурой:
NHCOCH3
79. Метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.71, где указанный метаболит представляет собой метилированное производное соединения SARM формулы IV.
80. Композиция, содержащая метаболит селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52; и подходящий носитель или разбавитель.
81. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное
134
количество метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
82. Способ связывания соединения модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором, включающий стадию контактирования андрогеновых рецепторов с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52 в количестве, эффективном для связывания метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов с андрогеновым рецептором.
83. Способ подавления сперматогенеза у пациента, включающий контактирование андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для подавления образования спермы.
84. Способ контрацепции у пациента мужского пола, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для подавления образования спермы в организме пациента, осуществляя тем самым контрацепцию пациента.
85. Способ гормональной терапии, включающий стадию контактирования андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для осуществления изменения андроген-зависимого состояния.
86. Способ гормональной заместительной терапии, включающий стадию контактирования андрогеновых рецепторов в организме пациента с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для осуществления изменения андроген-зависимого состояния.
87. Способ лечения пациента, страдающего гормональным заболеванием, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52 в количестве, эффективном для осуществления изменения андроген-зависимого состояния.
88. Способ лечения пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного
135
модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для лечения рака простаты у пациента.
89. Способ профилактики рака простаты у пациента, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для профилактики рака простаты у пациента.
90. Способ замедления прогрессирования рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.32 в количестве эффективном для замедления развития рака простаты у пациента.
91. Способ профилактики рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для профилактики рецидива рака простаты у пациента.
92. Способ лечения рецидива рака простаты у пациента, страдающего раком простаты, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52 в количестве, эффективном для лечения рецидива рака простаты у пациента.
93. Способ лечения состояния сухости глаз у пациента, страдающего сухостью глаз, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для лечения сухости глаз у пациента.
94. Способ профилактики состояния сухости глаз у пациента, включающий стадию введения пациенту метаболита селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п. 52 в количестве, эффективном для профилактики сухости глаз у пациента.
95. Способ индукции апоптоза в раковой клетке, включающий стадию контактирования указанной клетки с метаболитом селективного модулятора андрогеновых рецепторов по п.52 в количестве, эффективном для индукции апоптоза указанной раковой клетки.
По доверенности
BW ПРИРОСТ
ПРЕДСТАТЕЛЬНАЯ ЖЕЛЕЗА
СЕМЕННОЙ ПУЗЫРЕК
ПОДНИМАЮЩАЯ МЫШЦА
У///Л НЕЗАТРОНУТЫЙ КОНТРОЛЬ I. I КАСТРИРОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ
ESS TP 100 мкг/день
R-NTF-O AT 1000 мкг/день
(соединение Ш)
(СКОРРЕКТИРОВАНО ДЛЯ 100 Г МАССЫ ТЕЛА)
ФИГ. 1
ПРЕДСТАТЕЛЬНАЯ ЖЕЛЕЗА
СЕМЕННОЙ ПУЗЫРЕК
ПОДНИМАЮЩАЯ МЫШЦА
А: СТАТИСТИЧЕСКИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ НЕЗАТРОНУТОГО КОНТРОЛЯ
В: СТАТИСТИЧЕСКИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ КАСТРИРОВАННОГО КОНТРОЛЯ
С: СТАТИСТИЧЕСКИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ГРУППЫ ДОЗИРОВКИ_
НЕЗАТРОНУТЫЙ КОНТРОЛЬ --¦ КАСТРИРОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ
1-1 (НОСИТЕЛЬ)
ОБРАБОТАННЫЕ ТЕСТОСТЕРОН ПРОПИОНАТОМ
Г~71 ОБРАБОТАННЫЕ СОЕДИНЕНИЕМ TV
мкг/день
ФИГ. 2
140т
120-
100-
80-
60-
40-
20-
А в
А В т
А В
А В
А В С
А В
А В
А В I
fife
о р о о
Ы Ol "3
о о о о
^ ы bi ч сл
о о о р ^ ы bi ч сл
ПРЕДСТАТЕЛЬНАЯ ЖЕЛЕЗА
СЕМЕННОЙ ПУЗЫРЕК
ПОДНИМАЮЩАЯ МЫШЦА
А: СТАТИСТИЧЕСКИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ НЕЗАТРОНУТОГО КОНТРОЛЯ
В: СТАТИСТИЧЕСКИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ КАСТРИРОВАННОГО КОНТРОЛЯ
С: СТАТИСТИЧЕСКИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ГРУППЫ ДОЗИРОВКИ_
НЕЗАТРОНУТЫЙ КОНТРОЛЬ
|-1 КАСТРИРОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ
¦-' (НОСИТЕЛЬ)
Г^уЧ] ОБРАБОТАННЫЕ ТЕСТОСТЕРОН ПРОПИОНАТОМ
Г~71 ОБРАБОТАННЫЕ СОЕДИНЕНИЕМ Щ
мкг/день
ФИГ. 3
ФИГ. 4
ФИГ. 5
-9-
- СОБАКА 1, САМКА
-и-
- СОБАКА 3, САМКА
-A-
-СОБАКА6, САМКА
-СОБАКА2, САМЕЦ
- СОБАКА 4, САМЕЦ
- СОБАКА 5, САМЕЦ
ФИГ. 6
КАСТРИРОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ (СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ± S.D.)
ШШ НЕЗАТРОНУТЫЙ КОНТРОЛЬ (СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ± S.D.)
-,-1-1-1-j-1-J-1-1-1-1-
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2
-о-ТР
СОЕДИНЕНИЕ III
-•-(
СОЕДИНЕНИЕ ГУ
ДОЗА (мг/день)
ФИГ. 7
v\ 20-1
КАСТРИРОВАННЫЙ КОНТРОЛЬ (СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ± S.D.)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2
ДОЗА (мг/день)
НЕЗАТРОНУТЫЙ КОНТРОЛЬ (СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ± S.D.)
-о-ТР
СОЕДИНЕНИЕ ill
СОЕДИНЕНИЕ IV
ФИГ. 8
С! _ "________^ ______ГЛЛ
Q^C02H 2Н NaQH/Ацетон QaH NBS/ДМФ OcUo
Р 0^С/К.Т./Зч. К.Т./4 дня Л
н 68% ^fj 34.7% a Jh^
R-129 R.R-130
24% HBr^ j?
КИПЯЧУ 1 ч. НО ""> <> Вг + N02-4 > 67% СНз он
R-131
S0CI2
'-10-5"С/7ч. 80%
У1 НзС ОН F3C R-132
ОБЩЕЕ ПРОМЕЖУТОЧНОЕ СОЕДИНЕНИЕ
\ /-NHC0CH3
КгСОз/ВТВАС
КИПЯЧ./2 дня
NHC0CH3
S-147
СОЕДИНЕНИЕ ГУ
ФИГ. 9
10/48
182302-01 #402 RR 7.Э9 AV: 1 NL 4.2SE4 . * - e АРСЯ ЙД ms2440.00040.00 Г 120.00-600.00]
261 J)
1Kb
a. -
о о
33 •
8 зек
150.1
2052
150
200
247.0
I I I J( 250
289.0
aa.7
150
( Г
•св,-
-°-\
39М
¦т-с-сн,
] | I I I I I и 300 350
т-т-I-п-г-]-I I I-I | I 1 1 1 I 1 400 450 500 650 600
ФИГ. 10А
62102-02*306 RT:6.H AVM NU: 3.61 Б4 eAPCI Fullms2410.00(r)40.00 [ 11O.O0-S00.0O] 160.00
ЗКЮОт
34000^
32000т.
30000;
2BO00i
2400CP
ггооо|
гооооЕ
1SD0O=
16000т
14O00t
1200oi
1000 &f
8000=
8000=
4000т
200oi
-О-^ ^-NH-l-CHi
17857
_l_
230.6B
1S0
¦i i I i 200
Т-ГТ 250 308.16 Я7
330.03
¦i I I I 300
I 'I I I I 1 350
i I 1 400
i I l 450
600
' I 1 650
TT-|
600
Длина волны (нм)
11/48
ФИГ. 10 В
-". OS СЛ -ч| СО -А. -* -ль -А.-А 1ЧЭ ГО IVSIV3 Ю OS OS OS OS OS -Г*. 4w J*. СЛ СЛ СЛ СЛ СЛ о <Л о> о> о>
-ЬО> О1-4С0-J-OSOI~*I со-сосл -I СО -*- СО СЛ '-i со -^ со сл -J CD -ь- со en -~i со.-*
Время
ФИГ. ПА
20000 18000 16000 14000 12000
Jwooo
Q 8000 6000 4000 2000
12/48
ФИГ. 11В
•Г "Л. J m/z424 I
-^-^S°*_*-^-^-"-J-си, /^_"J-Г-а.,-0-"""
- '/ m/z 410 \. * m/2 368
m/z 252
25% введенной крысе дозы
m/z f 10
11% введение! кры се дозы мфча
Л}иЛ^и "'Ч> Л"{-^-6^Х" JLp^J-^Q-J-^
ч^_Л-^-(5^-1^. ,/ф_Л-?*_0-_и „?^J^„q__U
m/z602 m/z 506 * m Все глюкуронированные и сульфированные метаболиты составляли 2% введенной крысе дозы
13/48
ФИГ. 12
Метаболизм in vitro соединения IV в HLM
ФИГ. 13
120
ФИГ. 14
16/48
ФИГ. 15
Метаболиз in vitro соединения III в HLM
Окисление
° он
ФИГ. 16
ФИГ. 17
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Концентрация S-4 (мкМ)
ФИГ. 18
19/48
О 10 20 30 40
Время (мин)
ФИГ. 19
20/48
ФИГ. 20
21/48
ФИГ. 21
22/48
т/га
HN NH
pH7-"
KWMl Q
400
300
200 ¦
a a
100-
M2-OH-blotin
М2-ЫОЙП,
-i-r--1--1-1
0 10 20 30 40 50
Время(мин)
ФИГ. 22
23/48
ФИГ. 23
24/48
Цитозоль человека
HLM
N13 WI2+M2-OH
CYP3A4
МЗ-ОН
МЗ МЗ-ОН
М1-ОК
S4-OH
Восстановление Гидролиз Окисление Деацетилирование
ФИГ. 24
25/48
S-4(uM)
ФИГ. 25
26/48
AR транскрипционная активация посредством Ml
Концентрация; (нМ)
ФИГ. 26
27/48
ФИГ. 27
28/48
ФИГ. 28
№2#1 RT:0.01 AVM NLS.13E7-T: - с FU1 ms [ 80.DCM20.00J
10(b
Щ 90=
70=
8 55^
g ^ S 40=
О зо=
25| 20= "f 10^ 5=
"12
100
ДЛ2-2
Ь.,г...и
135.2 17JA
175,4 204.6 i j 18*2 |"""
"Г1 150
200
31.3
392.S
250 mfc
да.З г(r)"-3 З2?5 339.4 370.2 3B7.1
h.....ll'....#^j|..J.\T nH.i.l.Hl'lltni'lllfllllMHIW.VI.HV
402.2
400
2В1ШЙЯ KV.Om Ж1 NU4.48E4 _^
т:-сРи11го83401ло(r)зо.оо2в1ЛО(r)".оо[110Л)-10оола]
10Or)
! MS
1B &2
149.4 187.2
140
160
178.2
ill-.i|iI.I 180
198Л
2113
24'
200 mfc
Oet2^>
220 240 rrjft
280
29/48
ФИГ.29
m/z 218 m/z 204 m/z 246 н
m/z 401 m/z Ш
ФИГ. 30 Метаболиты S-1, выявленные в моче крыс в промежуток 0-24 часа (с использованием системы 1 подвижной фазы
Метаболит ID
Время удерживания
[М-Н]-m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
15.56
213
н"с чон
20.87
591
415;
MS3 of 415 -> 287, 127
MS4 of287-> * 229, 215,203,197
XX ju
-CHa I CH, /\\
"Л /
P COOH
21.66
579
403;
MS3 of 403-*" 143
HlH\^%. OH
COOH
21.69
563
387;
MS3 of387-> 259, 245,127
COOH
28.17
575
399;
MS3 of 399-*- 287, 259 203
MS4 of287-> 229
tCLXc
1 H,0 °"
- -CH, ^_^
- -CH, / \ -
Метаболит ID
Время удерживания
[М-Н]-m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
29.00
301
221;
MS3 of 221 -*¦ 191, 171
F,C^0^Nh
--SOjK
29.18
415
287,203,127;
MS3 of287 -> 229, 2Д5,197
MS4 of229-*172
XX JU
CHj i CHS /\\
29.44
547'
435,371,259, 231,201, 175
MS3 of435-"- 277,
MS4 of277 231, 171
jf HjC "он
30.59
467
387,127;
MS3 of387 -> 259, 127
H2N^ F3C
¦SOJJH
31.86
415
287,259,229,203;
MS3 of287 244, 229,215,203,189
MS4 of229-*> 201,189
IX ju
1 H,/
-CHj |_
Метаболит ID
Время удерживания
[М-НГ m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
32.30
483
403;
MS3 of403 ~*" 143
F3C^^^^N^^^ ~)
т-SOsH F
32.43
467
387;
MS3 of387 -*¦ 259, 127
HiN^^-. OH
-SOjH
34.65
483
403;
MS3 of403-P- 275, 259,221
MS4 of275-** 255, 201
^^^f^yC^\ // ¦
-S03H
34.90
263
221;
MS3 of 221 -* 191, 171
35.03
343
263;
MS3 of263 _> 221
MS4 of 221 -> 191, 171
-вОзН
Метаболит ID
Время удерживания
[М-НГ m/z
MS/MS ш/z
Предлагаемая структура
36.5
467
387;
MS3 of387-*- 275, 255,191,171,111
MS4 of275-> 255,
191
-асЯ-
36.66
387
307,275,259,127
i и/ 'он
37.20
263
221;
MS3 of 221 -> 191, 171
38.07
513
433;
MS3 of433 -> 307, 289,261,227,205, 143
F8CX^^^N'/^ <^^0-/\ / 1 Н3/
- -SO3H
38.55
415
287,127;
MS3 of287 -> 259,
245,229,217,203,201
FjCT
-сн3
-СНэ
MS4 of229 > 189
Метаболит ID
Время удерживания
[M-HJ-
m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
38.69
387
259,127;
MS3 of259 229, 201,175
HaN^^%. он i H3/ V
513
433;
MS3of433 ~*275, 204
- - HN- OH
if 1 1 /H=y-0CHi
н нз/ Ч°н
-S03H
40.43
513
433;
MS3 of433 -*- 289, 261,227,205,143
^v^^Ss n OH
V УЧ - V-У
1 Нз/ ОН
-S03H
40.91
577
401;
MS3 of 401 * 289, 261,205
MS4 of 261-*246,218, 204,190
FSCT \ \;_/ COOH
[ J, Нз/
41.74
247
205
Метаболит ID
Время удерживания
[М-Н]-m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
41.89
513
433;
MS3 of433 ~+ 289, 275,227,205,183,143
-SOjH
42.78
403
143
Н "3°
43.64
385
273,245,225,217,189
MS3 of245 ~~* 225, 205,203
MS4 of225-> 205
H,N
44.5
387
259,201,127;
H2N
45.49
497
417;
MS3 of 417-> 289, 205,127
MS4 of205-> 175
SO3H
Метаболит ID
Время удерживания
[М-Н]" m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
45.52
387
275,255,191,111; MS3 of275 255
F3C
46.62
371
259,231, 111;
MS3 of259 229, 201,175
1 H3/ 'OH
47.31
385
273,245,225,217,189;
MS3 of245 -*-225, 203
J F3C'
- у X
-CHj
47.9
563
307;
MS3 of307 -* 289, 261,205
I H3/ SOH
-SC"H OH
-V---?-^V~OH
COOH
51.50
417
289,261,205;
MS3 of289-> 261
MS4 of 261 -> 246, 218,204,190
\ и,/ 'он
Метаболит Ш
Время удерживания
[М-Н]' m/z
MS/MS
m/z
Предлагаемая структура
55,55
417
305,289,261,205,127
MS3 of 261-> 246, 218,204,190
1 Из/ ЧОН
66.26
452
407,289,261
MS3 of289 -> 261, 244,233,231,205
НООС^ .Й. -СН3
т т
02N. J 0
II 1 0 F3C'^^SSN^> ^^N,^'^SV^'^V,OH
Н СНз
Цифры, написанные жирным шрифтом, представляют собой значения m/z для основных массовых пиков в соответствующем масс-спектре (MS)
Метаболиты S-1, выявленные в фекалиях крыс в промежуток 0-24 (с использованием системы 2 подвижной фазы)
Метаболит ID
Время удерживания
(мин)
[М-Н]' m/z
MS/MS
Предлагаемая структура
26.62
213
111
О . , Нас Ън
29.40
467
387, 127;
MS3 of 387-*¦ 259, 201,175 127
MS4 of259-^229,209,201, 175
^N^^5;. ОН
н н,/ 'он
-SOjH
32.34
387
259, 127; MS3 of259 -> 201, 175 .
H2N. ОН н Нз/ 'О"
32.55
467
387,127;
MS3 of387-*" 259,201, 175 127
MS4 of259-> 230,201, 175
Yli
1 н,/ 'он
-80jH
38.
301
221;
MS3 of 221 -* 191,171
-80,Н
Метаболит ID
Время удерживания
(М-Н]-m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
38.14
467
387, 127;
MS3of387-*259,201, 175 127
MS4 of259-^229,209,201, 175
H2N. F*C
Д н,с# он
-S03H
39.01
387
259,201,127;
MS3 of259 -> 229,201, 175
F3C
1 н*Г он
40.18
451
371;
MS3 of 371*"**259,231,201, Г75, Ш
MS4 of259-> 201,175
^ У < ^ \ //
1 н3/ Чон
-SOaH
44.84
387
259,127;
45.52
387
275,255, llli MS3of275"~> 255
F3C
,1 Hrff чон
Метаболит ID
Время удерживания
(мин)
[М-Н]' m/z
MS/MS m/z
Предлагаемая структура
47.19
371
259,231,201,175, 111;
MS3 of259-+- 229,201, 175
1 н,/ 'он
50.01
577
401,307,261,205,175
COOH
52.56
307
289,245,205; MS3 of289-> 245,204
i H,/
Цифры, написанные жирным шрифтом, представляют собой значения m/z для основных массовых пиков в соответствующем масс-спектре (MS)
41/48
fMDWA.umUR3iO.ei ИТ: ОДО-74М
ППМНОВЛКИРЫ
w n-j "" <31 Ur iX Ml и.и им
Ml min"t хаяо-
1Ч10| MS
cmvnai
p *¦" "Я 4119 J^M 4t" 61Я7 "l J < ид шш ИД" ШГ "a njg
HjC OH
' tit' ' ""s
r3T
nil
вишаммтм-пп ят-.ппггм m.a ни зло
F;-eraiFuinw22moe5sror55J"a"UI01
8 "3
5? "e
ou Да
as.1 _(c)is to*
HO'
HjC" OH
0.1 Ш "4J" "W"B3 ИЗЗ 881
I И I I I I I I I 1'1'H И Л I I > T'I Ill|'l'll?l4|.....I I l' I I I I IT ill I и 11 I I 1 '1 I * ' M * I 1
то n ютаиооооковожииязж!
OlDVMiUCA OK iM и чип. m-i
onrnMotKMSAH
i "Д"Л> " Kg ПО Л Ч> ЛМ
"11T п i i ¦ 11 i n 11 'i Л i 'i . 'i' п f
• " " " M
1. Синтетический стандарт
-no*-0ffl
Ша|
гам-
3K20|U"
слои"и
**" Mi 3M5 HBffli Л" (IS1 МЯКВЦП .ВД.ИД1 ЮИИД
ri IT . . i I Г""Г", 1'ЧП1 ' '-¦ 14 I , I ¦ ¦ ¦¦! . I i 11~' ' V i
ю ss n Л й я "" "• я
CA0*u"l"us"l.lH0W7 RT:2BX1M03S AV:M NLS.HB
г. -в саам м i гшммэц
s-гтт-i-i-i-i-r-i-i-i-i-пл гаг и."
H3C OH
ran
!-\-1-•
F;-eBWFianaZZ"30eSU"[SSJIIM> WJKI) " "
"ч e",i ¦ тмд иц,
но' > r **0'V1 4 H3C OH
№.i.iM nti wmisi wa mi -rat тал mi зад аи. гид_
ae"n"i ФИГ. 31
42/48
ФИГ. 32
ФИГ. 33
700 600
§ I 400
5-1 300
•e о 200
i w 100
§ 0
CYP1A2 (фмоль)
р-актин
44/48 CYP1A2
Контроль 5^ g_-|
Растворитель
RIF BNF
231 150 149 164 184 1068 HLM
Уровень мРНК 1.00 ND 0.75 1.65 1.52 7.56
ФИГ. 34
45/48 CYP2C9
Уровень мРНК 1.00 1.86 0.68 0.39 0.65 0.33
ФИГ. 35
46/48
CYP2C19
Контроль
Растворитель
RIF BNF
CYP2C19 (фмоль)
P- актин
423 339 364 566 545 575 HLM
Уровень мРНК 1.00 1.05 0.71 0.34 0.65 0.29.
ФИГ. 36
47/48
8 ч s
100
s 60
•e-
CYP2D6
Контроль
Растворитель
CYP2D6 (фмоль)
Р-актин
42 51 34 55 91 77 HLM
Уровень мРНК 1.00 1.41 0.53 0.09 0.22 0.11
ФИГ. 37
48/48
18 S
я 5
s n
CYP3A4
1200 1000 800 600 400 200 0
CYP3A4 (фмоль)
р-актин
Контроль
BEflU ИРвВ
_Ц8_Щга_
S-4 S-1 RIF BNF
Растворитель
174 171 127 234 2522 507 HLM
Уровень мРНК 1.00 1.17 0.97 0.41 3.69 0.27
ФИГ. 38