Настоящее изобретение относится к фармацевтическим гидрогелевым препаратам полоксамера, содержащим интерферон. В частности, изобретение относится к гидрогелевым препаратам интерферона-бета пролонгированного действия, способу их получения и применения.

 

(57) Реферат / Формула:
изобретение относится к фармацевтическим гидрогелевым препаратам полоксамера, содержащим интерферон. В частности, изобретение относится к гидрогелевым препаратам интерферона-бета пролонгированного действия, способу их получения и применения.

 

---

2420-140530ЕА/015 ГИДРОГЕЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИНТЕРФЕРОНА
Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к фармацевтическим гидрогелевым препаратам, содержащим интерферон. В частности, изобретение относится к гидрогелевым препаратам бета-интерферона пролонгированного действия, способу их получения и применения. Уровень техники
Рекомбинантные белковые фармацевтические средства уже сейчас обеспечивают уникальные способы лечения некоторых ранее неизлечиваемых заболеваний, а в настоящее время разрабатываются многочисленные новые белковые лекарственные средства.
Белки обычно вводят парентерально, что может приводить к быстрой элиминации белка из кровотока. Для поддержания терапевтически эффективных уровней белка в крови, часто необходимо вводить большие или повторные дозы. Неудобство и возможные вредные побочные эффекты упомянутого способа можно обойти, применяя системы, которые обеспечивают непрерывную или контролируемую доставку белка.
С помощью систем пролонгированной доставки можно обеспечивать более постоянные уровни белковых терапевтических средств в крови по сравнению с уровнями, наблюдаемыми при применении болюсных доз, что приводит к улучшенной лекарственной эффективности и меньшему количеству вредных побочных эффектов. Упомянутые системы доставки лекарственных средств включают в себя масла для инъекций, эмульсии, суспензии, липосомы, микрочастицы (микрокапсулы или микросферы), имплантаты или гелевые системы.
Из числа гелевых систем, применяемых для доставки лекарственных средств, полоксамерные гели используют из-за их уникального свойства, такого как термореактивное гелеобразование веществ in situ. Полоксамеры представляют собой блоксополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида), хорошо известные как неионные поверхностно-активные вещества, которые образуют водные гели, претерпевающие превращения от состояния низкой вязкости до состояния высокой вязкости в результате повышения температуры,
называемые "термическое гелеобразование".
Кроме того, полоксамеры обладают хорошими смачивающими, анти-пенообразующими и солюбилизирующими свойствами, и их обычно применяют для фармацевтических и медицинских целей в качестве носителей для доставки лекарственных средств (Guzman et al., International Journal of Pharmaceutics, 80, 119-127; Ganger et al., 1986, Drug Dev. and Indust. Pharmacy, 12 (11-13), 16131623).
Полоксамеры, упоминаемые под торговым названием плуроники(r), представляют собой блоксополимеры из трех компонентов, характеризующиеся следующей формулой (I):
Н0+й"н"°"^й""Г0"~М-Г5"°^"н
Н2 Н2 М2 ?|| М2 М2
в которой (а) и (с) являются статистически равными, (Ь) равно или больше 15, а (а + с) формируют от 20 до 90% массы молекулы.
Две цепи полиэтиленоксида (РЕО) являются гидрофильными, тогда как цепь полипропиленоксида (РРО) является гидрофобной, что придает блоксополимерам РЕО-РРО-РЕО амфифильные свойства, которые можно модулировать, изменяя количество элементов (а) и (Ь) .
Вследствие их амфифильной природы, блоксополимеры РЕО-РРО-РЕО способны самоагрегироваться с образованием целого ряда ассоциированных структур, таких как мицеллы и жидкие кристаллические фазы, а также микроэмульсии.
Из числа плуроников(r), полоксамер 407 (Lutrol(r) F127 или плуроник(r) F127), полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=99 и (Ь)=65, и полоксамер 338 (Lutrol(r) F108 или плуроник(r) F108), полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=16, а (Ь)=4 6, известны благодаря их термическим гелеобразующим свойствам их водных растворов при концентрации 20-35% (Guzman et al., 1992, выше). В частности, 22-25% (мае./мае.) раствор полимера полоксамера 407 является жидким при относительно низких температурах, то есть,
4-10°С, но быстро образует твердый гель с высокой вязкостью при нагревании выше характерной температуры перехода, то есть, 18-20°С. Описанные гели используют, например, для жидких гидрогелевых препаратов для подкожных инъекций, местных применений, аэрозолей с тем, чтобы получить гель, когда они нагреваются до температуры тела (Guzman et al., 1992, выше).
Установлено, что гели полоксамера 4 07 повышают стабильность белков, введенных в гелевый матрикс (Stratton et al. , 1997, Journal of Pharmaceutical sciences, 86, 9, 1006-1010) и их используют в различных препаратах, включая лидокаин (Chen-Chow et al., 1981, International Journal of Pharmaceutics, 8, 89-99), индометацин (Miyazaki et al., 1986, Chem. Pharm. Bull. 34(4), 1801-1808) и IL-2 (Johnston et al., 1992, Pharmaceutical Research, 9(3), 425-434).
Интерфероны представляют собой цитокины, то есть, растворимые белки, которые передают сигналы между клетками и играют решающую роль в иммунной системе, помогая уничтожать микроорганизмы, которые' вызывают инфекции, и восстанавливая любое возникшее повреждение. Интерфероны естественно секретируются инфицированными клетками и впервые были идентифицированы в 1957 году. Свое название интерфероны получили вследствие того факта, что они влияют на вирусную репликацию и продукцию.
Интерфероны проявляют как противовирусную, так и антипролиферативную активность. На основании биохимических и иммунологических свойств природные интерфероны человека классифицируют в три основные класса: альфа-интерферон (лейкоцитарный), бета-интерферон (вырабатывается фибробластами) и гамма-интерферон (иммунный). В настоящее время в Соединенных Штатах и других странах альфа-интерферон апробируют для лечения злокачественного ретикулоэндотелиоза, остроконечных бородавок, саркомы Капоши (рак, обычно поражающий пациентов, страдающих синдромом приобретенного иммунного дефицита (AIDS; СПИД)) и хронического гепатита ни А, ни В.
Кроме того, интерфероны (IFNs) являются гликопротеинами,
продуцируемыми организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защитных клетках. Состоящие из низкомолекулярных белков, IFNs являются в высшей степени неспецифическими по действию, то есть, IFN, индуцированный одним вирусом, оказывается эффективным против большого разнообразия других вирусов. Они, однако, характеризуются видовой специфичностью, то есть, IFN, продуцируемый одним видом, будет стимулировать противовирусную активность только в клетках того же самого или близко родственного вида. IFNs оказались первой группой цитокинов, которые используют из-за их возможной противоопухолевой и противовирусной активностей.
Три основные вида IFNs называют IFN-a, IFN-(3 и IFN-y. Упомянутые основные виды IFNs первоначально классифицировали по их клеточному источнику (лейкоцит, фибробласт или Т-клетка). Однако стало ясно, что несколько типов могут продуцироваться одной клеткой. Следовательно, лейкоцитарный IFN в настоящее время называют IFN-a-, IFN фибробластов представляет собой IFN-P и IFN Т-клеток представляет собой IFN-y. Также существует четвертый тип IFN, лимфобластоидный IFN, продуцируемый в линии клеток Namalwa (получена из лимфомы Беркитта), которая, как оказалось, продуцирует смесь лейкоцитарного и фибробластного IFN.
Единица интерферона или международная единица интерферона (ЕД или МЕД для международной единицы) описана как мера активности IFN, определенная как количество, необходимое, чтобы защитить 50% клеток от вирусного поражения. Исследование, которое можно использовать для определения биоактивности, представляет собой исследование ингибирования цитопатического действия, которое описывают (Rubinstein, et al., 1981, J. Virol., 37, 755-758; Familletti et al., 1981, Methods in Enzymology, 78, Pestka Ed., Academic press, New York, 387-394). В упомянутом исследовании противовирусной активности интерферона, приблизительно 1 единица/мл интерферона составляет количество, необходимое, чтобы вызвать 50% цитопатическое действие. Единицы устанавливают относительно международного
контрольного стандарта для Hu-IFN-бета, предоставляемого Национальным институтом здоровья (Pestka, 1986, Methods in Enzymology, 78, Pestka Ed., Academic press, New York 119, 1423) .
Каждый класс IFN содержит несколько разных типов. IFN-p и IFN-y, каждый, представляют собой продукт одного гена.
Белки, классифицируемые как IFNs-a, являются наиболее разнообразной группой, содержащей приблизительно 15 типов. Существует кластер генов IFNs-a на хромосоме 9, содержащий, по крайней мере, 23 представителя, 15 из которых являются активными и транскрибируемыми. Зрелые IFNs-a не гликозилированы.
IFNs-a и IFN-(3, все, имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) и подобные биологические активности. IFNs-у содержат 14 6 аминокислот по длине и меньше напоминают классы а и Р. Только IFNs-y могут активировать макрофаги или индуцировать созревание Т-клеток-киллеров. Эти новые типы терапевтических средств иногда можно называть модификаторами биологического ответа (BRMs), так как они оказывают влияние на ответ организма на опухоль, воздействуя на распознавание через
иммуномодулирование.
Интерферон фибробластов человека IFN-P проявляет противовирусную активность и может также стимулировать природные киллерные клетки против опухолевых клеток. Интерферон представляет собой полипептид, с массой приблизительно 20000 Да, индуцируемый вирусами и двухцепочечными РНК. Из нуклеотидной последовательности гена интерферона фибробластов, клонированной по технологии рекомбинантных ДНК (Derynk et al., 1980, Nature, 285, 542-547), выведена полная аминокислотная последовательность белка. Последовательность содержит по длине 166 аминокислот.
Shepard et al., 1981, Nature, 294, 563-565 описывает мутацию в основании 842 (Cys -> Туг в положении 141), которая устраняет его противовирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.
Mark et al., 1984, Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 81(18),
5662-5666, внесли искусственную мутацию замещением основания 469 (Т) на (А) , вызывая изменение аминокислот Cys -" Ser в положении 17. Сообщают, что полученный IFN-y является настолько активным, насколько активен "нативный" IFN-р и стабилен во время длительного хранения (-70°С).
Rebif(r) (рекомбинантный интерферон-р от Serono), самая последняя разработка в терапии интерфероном рассеянного склероза (MS) представляет собой интерферон (IFN)-бета-la, продуцируемый линиями клеток млекопитающих. Его рекомендуемым международным непатентованным названием (INN) является "Интерферон-бета-1а".
В последние десятилетия были разработаны различные препараты IFNs с сополимерами. Среди них описаны препараты IFN-альфа для инъекции, содержащие полиоксиэтилен-
полиоксипропиленгликоль (JP 2003 342193), комбинированные препараты циклapaдин-IFN-aльфa (ЕР 0177153), наборы
полоксамеровых гелей интерферона-альфа комнатной температуры для местного применения (US 4469228), препараты микрочастиц IFNP (WO 01/58474), композиции, содержащие гликопротеины, химически связанные с сополимером полиоксиэтилен-полиоксипропилена, (ЕР 0098110) и препараты IFNp для доставки через слизистые, особенно для интраназальной доставки (WO 2004/002404).
Как в случае всех фармацевтических препаратов на белковой основе, одним основным стимулом для применения интерферона как терапевтического средства является поддержание терапевтически эффективной дозы в крови в течение определенного времени без увеличения вводимой дозы и возможных ассоциированных побочных эффектов. Следовательно, существует потребность в
фармацевтических композициях IFN, которые поддерживают уровни IFN в плазме в течение более длительного периода времени, чем жидкие препараты, и/или которые обеспечивают большую плазменную экспозицию IFN, тем самым, поддерживая или улучшая биологическую активность IFN.
Краткое изложение изобретения
Данное изобретение направлено на фармацевтические гидрогелевые композиции полоксамера или композиции полоксамера,
образующие гель in vivo, которые содержат интерферон (IFN), в частности рекомбинантный h-IFN|3la, и способы их получения. Названные фармацевтические композиции представляют собой гидрогели, приготовленные с полоксамерами, особенно с полоксамером 407. Такие фармацевтические композиции в описании называют "гидрогели" IFN, и они содержат интерферон (IFN) или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию.
Преимущество полоксамеровых гидрогелевых препаратов IFN изобретения заключается в том, что они in vivo образуют гель, который легко можно регулировать и который проявляет пролонгированное действие и/или более высокую биодоступность по сравнению с большей частью препаратов IFN.
Согласно одному осуществлению данного изобретения, гидрогели дополнительно содержат, по крайней мере, одно стабилизирующее средство.
Согласно другому осуществлению изобретения, гидрогели дополнительно содержат, по крайней мере, один модификатор температурного перехода раствора в гель в качестве наполнителя.
В первом аспекте, изобретение предоставляет
фармацевтическую композицию, содержащую интерферон (IFN) или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное или активную фракцию, при этом названный препарат представляет собой гидрогель полоксамера.
Во втором аспекте, изобретение предоставляет способ приготовления гидрогелевого препарата IFN согласно изобретению, при этом упомянутый способ включает в себя добавление рассчитанного количества полоксамера к забуференному раствору при температуре, при которой образуется гомогенный раствор полимера, а затем добавление интерферона или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или активной фракции.
В третьем аспекте, изобретение предоставляет применение гидрогелевого препарата IFN-бета согласно изобретению для получения фармацевтического средства для лечения рассеянного
склероза.
В четвертом аспекте, изобретение предоставляет способ лечения рассеянного склероза, включающий в себя введение препарата IFN-бета пролонгированного действия согласно изобретению пациенту в случае необходимости.
Подробное описание изобретения
В следующих параграфах дают определения различным химическим фрагментам, которые составляют соединения согласно изобретению, и которые предназначают для применения постоянно по всему описанию и в формуле изобретения, если не указано специально, что представленноё определение обеспечивает более широкое значение.
Используемый термин "интерферон" или "IFN" предназначают, чтобы охватить любую молекулу, определенную как таковую в литературе, включающий в себя, например, любые типы IFNs, упомянутые в вышеприведенном разделе "Уровень техники". В частности, вышеприведенное определение ,включает в себя IFN-a, I FN-Р и IFN-y. IFN-р является предпочтительным IFN в соответствии с данным изобретением. IFN-p, подходящий согласно данному изобретению, поставляется коммерчески, например, как Rebif(r) (Serono), Avonex(r) (Biogen) или Betaferon(r) (Schering).
Используемый термин "интерферон-бета (IFN-бета или IFN-p)" предназначают для включения интерферона фибробластов, в частности человека, который получают выделением из биологических жидкостей или методами рекомбинантных ДНК из клеток прокариотического или эукариотического хозяина, а также его солей, функциональных производных, вариатов, аналогов и активных фрагментов. Предпочтительно IFN-бета означает рекомбинантный интерферон-бета-1а.
IFN-p, подходящий согласно данному изобретению, поставляется коммерчески, например, как Rebif(r) (Serono), Avonex(r) (Biogen) или Betaferon(r) (Schering). Применение интерферонов человека также является предпочтительным согласно данному изобретению. Используемый в описании термин интерферон предназначают, чтобы охватить его соли, функциональные
производные, варианты, аналоги и активные фрагменты.
Rebif(r) (рекомбинантный интерферон-(3) является самой последней разработкой в терапии интерфероном рассеянного склероза (MS) и представляет значительный прогресс в лечении данного заболевания. Rebif(r) представляет собой интерферон (IFN)-6eTa la, продуцируемый клеточными линиями млекопитающих. Установлено, что интерферон-бета-1а, вводимый подкожно три раза в неделю, эффективен при лечении рецидивирующего-ремиссирующего рассеянного склероза (RRMS). Интерферон-бета-1а может оказывать положительное действие при длительном течении MS посредством снижения числа и тяжести рецидивов и уменьшения тяжести заболевания и интенсивности заболевания, оцениваемых с помощью MRI.
Дозирование IFN-P при лечении рецидивирующего-ремиссирующего MS согласно изобретению зависит от типа используемого IFN-p.
В соответствии с данным изобретением, когда IFN представляет собой рекомбинантный IFN-plb, продуцируемый в Е. Coli, коммерчески поставляемый под торговым названием Betaseron(r), предпочтительно IFN можно вводить подкожно через день в дозе приблизительно от 250 до 300 мкг или от 8 ММЕД (миллион международных единиц) до 9,6 ММЕД на субъекта.
В соответствии с данным изобретением, если IFN представляет собой рекомбинантный IFN-pia, продуцируемый в клетках яичников китайских хомяков (клетках СНО), коммерчески поставляемый под торговым названием Avonex(r), предпочтительно IFN можно вводить внутримышечно один раз в неделю в дозе приблизительно от 30 мкг до 33 мкг или от 6 ММЕД до 6,6 ММЕД на субъекта.
В соответствии с данным изобретением, если IFN представляет собой рекомбинантный IFN-pla, продуцируемый в клетках яичников китайских хомяков (клетках СНО), коммерчески поставляемый под торговым названием Rebif(r), IFN предпочтительно можно вводить подкожно три раза в неделю (TIW) в дозе от 22 мкг до 44 мкг или от б ММЕД до 12 ММЕД на субъекта.
Используемый термин "мутеины" относится к аналогам IFN, в которых один или более аминокислотных остатков природного IFN замещают различными аминокислотными остатками или удаляют, или один или более аминокислотных остатков добавляют к природной последовательности IFN, не изменяя значительно активность полученных продуктов по сравнению с диким типом IFN. Описанные мутеины получают по известным способам синтеза и/или методами сайт-направленного мутагенеза, или любым другим известным способом, подходящим для этого. Предпочтительные мутеины включают в себя, например, мутеины, описанные Shepard et al., 1981, выше или Mark et al., 1984, выше.
Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дуплицированных из последовательности IFN, например, чтобы иметь по существу подобную или даже лучшую активность относительно IFN. Биологическая функция интерферона хорошо известна специалистам в данной области, а биологические стандарты учреждены и могут быть получены, например, в Национальном институте биологических стандартов и контроля (http://immunology.org/links/N1BSC).
Биоисследование для определения активности IFN описано. Исследование IFN, например, можно проводить, как описывают Rubinstein et al., 1981, выше. Таким образом, стандартным экспериментированием можно установить, имеет ли любой данный мутеин по существу подобную или даже лучшую активность, чем IFN.
Мутеины IFN, которые можно использовать согласно данному изобретению, или, следовательно, кодирующая нуклеиновая кислота включают в себя ограниченный набор по существу соответствующих последовательностей, как замещенные пептиды или полинуклеотиды, которые обычно могут быть получены любым из специалистов в данной области без чрезмерного экспериментирования по способам и руководству, представленному в описании.
Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с данным изобретением, являются изменения, известные как "консервативные" замещения. Консервативные аминокислотные замещения полипептидов или белков изобретения могут включать в себя синонимические аминокислоты в пределах группы, которые
имеют достаточно похожие физико-химические свойства с тем, чтобы замещение представителями группы, сохраняло бы биологическую функцию молекулы. Ясно, что инсерции и делеции аминокислот также можно производить в описанных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если инсерции или делеции включают только несколько аминокислот, например меньше тридцати и предпочтительно меньше десяти, и не удаляют или не замещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации, например, остатки цистеина. Белки и мутеины, полученные с помощью таких делеций и/или инсерций, попадают в сферу действия данного изобретения.
Предпочтительно, группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в таблице I. Более предпочтительно, группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в таблице II; и наиболее предпочтительно, группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в таблице III.
ТАБЛИЦА I
Предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота Синонимическая группа
Ser
Ser,
Thr,
Gly,
Asn
Arg
Arg,
Gin,
Lys,
Glu,
His
Leu
He,
Phe,
Tyr,
Met,
Val,
Leu
Pro
Gly,
Ala,
Thr,
Pro
Thr
Pro,
Ser,
Ala,
Gly,
His,
Gin,
Thr
Ala
Gly,
Thr,
Pro,
Ala
Val
Met,
Tyr,
Phe,
He,
Leu,
Val
Gly
Ala,
Thr,
Pro,
Ser,
Gly
Met,
Tyr,
Phe,
Val,
Leu,
Phe
Trp,
Met,
Tyr,
He,
Val,
Leu,
Phe
Tyr
Trp,
Met,
Phe,
He,
Val,
Leu,
Tyr
Cys
Ser,
Thr,
Cys
His
Glu,
Lys,
Gin,
Thr,
Arg,
His
Gin
Glu,
Lys,
Asn,
His,
Thr,
Arg,
Gin
Asn
Gin,
Asp,
Ser,
Asn
Lys Glu, Gin,
Asp Glu, Asn,
Glu Asp, Lys,
Trp Trp.
His, Arg, Lys Asp
Asn, Gin, His, Arg, Glu
ТАБЛИЦА II
Более предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота
Синонимическая
группа
Ser
Ser
Arg
His,
Lys,
Arg
Leu
Leu,
He,
Phe,
Met
Pro
Ala,
Pro
Thr
Thr
Ala
Pro,
Ala
Val
Val,
Met,
Gly
Gly
He,
Met,
Phe,
Val, Leu
Phe
Met,
Tyr,
He,
Leu, Phe
Tyr
Phe,
Tyr
Cys
Cys,
Ser
His
His,
Gin,
Arg
Gin
Glu,
Gin,
His
Asn
Asp,
Asn
Lys
Lys,
Arg
Asp
Asp,
Asn
Glu
Glu,
Gin
Met
Met,
Phe,
He,
Val, Leu
Trp
Trp.
ТАБЛИЦА III
Наиболее предпочтительные группы синонимических
аминокислот Аминокислота Синонимическая группа Ser Ser Arg Arg
Leu Leu, He, Met
Pro Pro Thr Thr
Ala
Ala
Val
Val
Gly
Gly
He,
Met, Leu
Phe
Phe
Tyr
Tyr
Cys
Cys,
Ser
His
His
Gin
Gin
Asn
Asn
Lys
Lys
Asp
Asp
Glu
Glu
Met
Met,
He, Leu
Tip
Met.
Примеры производства аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для получения мутеинов IFN, для применения в данном изобретении, включают в себя любые стадии известных способов, такие как представлены в патентах США Mark et al. 4959314, 4588585 и 473746; Koths et al 5116943; Namen et al. 4965195; Chong et al., 4 879111; и Lee et al. 5017691; и лизин-замещенные белки, описанные в патенте США 4 904584 от Shaw et al. Специальные мутеины IFN-бета описывают, например, Mark et al., 1984, выше.
Термин "слитый белок" относится к полипептиду, содержащему IFN или его мутеин, слитый с другим белком, который, например, характеризуется длительным периодом пребывания в биологических жидкостях. Таким образом, IFN можно сливать с другим белком, полипептидом или тому подобным, например с иммуноглобулином или его фрагментом.
Используемое в описании выражение "функциональные производные" охватывает производные IFN и их мутеины и слитые белки, которые можно получать с помощью функциональных групп, находящихся на боковых цепях остатков или N- или С-концевых группах, по способам, известным в данной области, и которые включены в изобретение, поскольку они сохраняют фармацевтическую
приемлемость, то есть, они не уничтожают активность белка, которая в основном подобна активности IFN, и не придают токсические свойства композициям, содержащим их. Такие производные могут, например, включать в себя боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные участки и увеличивать пребывание IFN в биологических жидкостях. Другие производные включают в себя сложные алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп в результате взаимодействия с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацил-производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацил-фрагментом (например, группами алканоила или карбоциклического ароила), или О-ацил-производные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серила или треонила), образованные ацил-фрагментами.
В качестве "активных фракций" IFN, или мутеинов и слитых белков, данное изобретение охватывает любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, связанными еще, например, с сахаром или фосфатным остатком, или агрегаты белковой молекулы или сами остатки Сахаров при условии, что названная фракция не имеет никакой значительно сниженной активности по сравнению с соответствующим IFN.
В соответствии с данным изобретением, кроме того, применение рекомбинантного IFN-6eTa-la и соединений изобретения особенно предпочтительно.
Недавно описан особый вид варианта интерферона. Так называемые "консенсусные интерфероны" являются неприродными вариантами IFN (US 6013253). В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения соединения изобретения применяют в комбинации с консенсусным интерфероном.
Используемый в описании термин консенсус интерферона (IFN-соп) человека будет означать неприродный полипептид, который преимущественно включает в себя те аминокислотные остатки, которые обычно в субпопуляции IFN-альфа являются характерными для большинства из последовательностей подтипа природных человеческих лейкоцитарных интерферонов, и который включают в
себя в одном или более тех положений, где нет никаких аминокислот общих со всеми подтипами, аминокислоту, которая преимущественно встречается в таком положении, и ни в коем случае не включает остаток любой аминокислоты, который не присутствует в таком положении, по крайней мере, у одного природного подтипа. IFN-con, не ограничиваясь, охватывает аминокислотные последовательности, обозначенные IFN-conl, IFN-соп2 и IFN-сопЗ, которые описывают в патентах США №№4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие IFN-con, можно получать, как описывают в вышеупомянутых патентах, или другими стандартными способами.
В следующем предпочтительном осуществлении, слитый белок включает слияние Ig. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может содержать до от 1 до 3 аминокислотных остатков по длине, или быть больше, например, 13 аминокислотных остатков по длине. Названный линкер может быть трипептидом с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met) , например, или иметь линкерную последовательность из 13 аминокислотных остатков, содержащую Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, введенную между последовательностью IFN и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок может иметь улучшенные свойства, такие как продолжительное время пребывания в биологических жидкостях (период полувыведения), увеличенную специфическую активность, повышенный уровень экспрессии, или облегчается очистка слитого белка.
В другом предпочтительном осуществлении, IFN сливают с константной областью молекулы Ig. Предпочтительно, IFN сливают с областями тяжелой цепи, например, подобными доменам СН2 и СНз IgGi человека. Другие изоформы молекул Ig также подходят для образования слитых белков согласно данному изобретению, такие как изоформы IgG2, IgG3 или IgG,j или другие классы Ig, например, подобные IgM или IgA. Слитые белки могут быть мономерными, мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.
В следующем предпочтительном осуществлении, функциональное производное содержит, по крайней мере, один фрагмент, присоединенный к одной или более функциональных групп, которые
присутствуют на одной или более боковых цепях на аминокислотных остатках. Предпочтительно, фрагмент представляет собой полиэтиленовый (PEG; ПЭГ) фрагмент. Пегилирование можно осуществлять по известным способам, таким как способы, описанные, например, в W0 99/55377.
Дозы, вводимые индивидууму, будут очень зависеть от целого ряда факторов, включая фармакокинетические свойства, способ введения, состояния и характерных особенностей (пола, возраста, веса тела, здоровья и размера) пациента, степени симптомов, сопутствующего лечения, частоты курсов лечения и желаемого действия.
Стандартные дозы IFN-6eTa-la человека колеблются от 80000 МЕД/кг до 2 00000 МЕД/кг в день или б ММЕД (миллион международных единиц) до 12 ММЕД на субъекта в день или от 22 до 4 4 мкг (микрограмм) на субъекта. В соответствии с данным изобретением, IFN-6eTa-la предпочтительно можно вводить в дозе приблизительно от 1 до 500 мкг, более предпочтительно приблизительно от 10 до 308 мкг или приблизительно от 10 до 260 мкг на субъекта один раз в неделю или меньше.
Введение активных ингредиентов в соответствии с данным изобретением можно производить внутримышечным или подкожным способом. Предпочтительным способом введения IFN является подкожный способ.
IFN также можно вводить через день или реже. Предпочтительно, IFN вводят один раз, дважды или три раза в неделю.
Предпочтительным способом введения является подкожное введение, осуществляемое, например, один раз в неделю или реже.
Предпочтительно, концентрация IFN-6eTa-la в препарате составляет от 10 мкг/мл или приблизительно от 10 мкг/мл до 800 мкг/мл или приблизительно до 800 мкг/мл, более предпочтительно от 20 мкг/мл или приблизительно от 20 мкг/мл до 500 мкг/мл или приблизительно до 500 мкг/мл, еще более предпочтительно от 30 или приблизительно от 30 до 300 мкг/мл или приблизительно до 300 мкг/мл, наиболее предпочтительно 44, 8 8 или 2 64 мкг/мл или приблизительно 44, 88 или 2 64 мкг/мл.
Термин "гидрогель" относится к поперечно сшитой сетке гидрофильных полимеров, которые обладают способностью самопревращаться в трехмерную структуру, содержащую большие количества воды. Полоксамеры представляют собой полимеры, которые характеризуются свойством образовывать мицеллы в водном растворе. При более высоких концентрациях и/или повышенной температуре, полоксамеры претерпевают "гелеобразование" (переход раствор-в-гель) посредством ассоциации мицелл с образованием жидкой кристаллической фазы (геля) вследствие увеличивающихся межмицеллярных взаимодействий. Затем, при еще более высоких температурах гель снова плавится (Bromberg et al., 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31, 197-221).
Температуры фазового перехода зависят от концентрации полоксамера в воде. Обычно переход раствор-в-гель происходит при температурах от 5 до 30°С, а превращение гель-в-раствор происходит при 35-50°С в диапазоне концентрации полимера от 20 до 30 %/мас. Поэтому, термин "полоксамеровый гидрогель" согласно изобретению относится к раствору полоксамера, который обладает свойством проявлять гелеобразование (переход раствор-в-гель) при температуре тела человека. Например, гидрогели полоксамера изобретения содержат от 20 до 30 %/мас. полоксамера, обычно от 20 до 25 %/мас. Поэтому, термин "гидрогель" также относится к образованию геля in vivo.
Выражение "модификатор температурного перехода раствор-в-гель (или "sol-gel")" относится к наполнителю, который способен смещать, предпочтительно повышать температурный переход раствор-в-гель IFN-бета-содержащего гидрогеля. Примерами таких модификаторов являются, сахара, такие как трегалоза, полиэтиленгликоль, глицерин, такой как глицерин 30°, и циклодекстрины, предпочтительно гидроксипропил-р-циклодекстрин. Модификатор температурного перехода раствор-гель можно использовать, например, для повышения температурного превращения гидрогеля примерно комнатной температуры, для увеличения способности прохождения через шприц и/или температуры хранения. Гидрогель согласно изобретению может содержать, например,
приблизительно от 1 до 3% мае./мае. модификатера температурного перехода раствор-гель, предпочтительно приблизительно 2,6% мае./мае.
Термин "поверхностно-активное вещество" относится к растворимому соединению, которое снижает поверхностное натяжение жидкостей или снижает межфазное натяжение между двумя жидкостями или жидкостью и твердым веществом, поверхностное натяжение, являющееся силой, действующей на поверхность жидкости, имеющей тенденцию минимизировать область поверхности. Поверхностно-активные вещества иногда используют в фармацевтических препаратах, включая доставку низкомолекулярных лекарственных средств и полипептидов для того, чтобы модифицировать поглощение лекарственного средства или его доставку в ткани-мишени. Хорошо известные поверхностно-активные вещества включают в себя полисорбаты (производные полиоксиэтилена; твин), а также плуроники.
В соответствии с одним осуществлением изобретения, плуроники представляют собой поверхностно-активные вещества, которые предпочтительно присутствуют в жидком препарате стабилизированного IFN, используемого для приготовления гидрогелей изобретения.
В соответствии с другим осуществлением изобретения, плуроники, выбранные из плуроника(r) F77 (полоксамер 217), плуроника(r) F87 (полоксамер 237), плуроника(r) F88 (полоксамер 238) и плуроника(r) F68 (полоксамер 188), в особенности предпочтительно плуроника(r) F68, BASF), присутствуют в стабилизированном жидком препарате IFN, используемого для приготовления гидрогелей изобретения.
Плуроники предпочтительно присутствуют в жидком препарате стабилизированного IFN в концентрации, которая является достаточной для поддержания стабильности интерферона в течение требуемого периода хранения (например, от 12 до 24 месяцев), а также в концентрации, которая является достаточной для предотвращения потери белка вследствие абсорбции на поверхностях, таких как флакон, ампула ил,и картридж или шприц.
Обычно используют лутрол F68: между 25- и 200-кратным молярным избытком (относительно IFN) , предпочтительно 50-кратный молярный избыток (приблизительно 3 мг/мл, если дозировка IFN составляет приблизительно 150 мкг/мл).
Предпочтительно, концентрация плуроников, особенно плуроника(r) F68, в жидких стабилизированных препаратах IFN составляет от 0,01 мг/мл или приблизительно 0,01 мг/мл до 10 мг/мл или приблизительно 10 мг/мл, более предпочтительно от 0,05 мг/мл или приблизительно 0,05 мг/мл до 5 мг/мл или приблизительно 5 мг/мл, особо более предпочтительно от 0,1 мг/мл или приблизительно 0,1 мг/мл до 2 мг/мл или приблизительно 2 мг/мл, наиболее предпочтительно составляет 1 мг/мл или приблизительно 1 мг/мл.
Термин "антиоксидант" относится к соединению, которое предотвращает взаимодействие кислорода или свободных радикалов с другими поверхностно-активными веществами. Антиоксиданты относятся к числу целого ряда наполнителей, обычно добавляемых в фармацевтические системы, чтобы повысить физическую и химическую стабильность. Антиоксиданты добавляют, чтобы минимизировать или замедлить окислительные процессы, которые происходят с некоторыми лекарственными средствами или наполнителями при экспозиции с кислородом или в присутствии свободных радикалов. Упомянутые процессы часто могут катализироваться на свету, температурой, концентрацией водорода, в присутствии следовых количеств' металлов или перекисей. Сульфиты, бисульфиты, тиомочевину, метионин, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) и бутилированный гидроксианизол (ВНА) часто применяют в качестве антиоксидантов в лекарственных средствах. Установлено, что натрий-EDTA повышает активность антиоксидантов образованием хелатных комплексов с ионами металлов, которые иным образом катализируют реакцию окисления. Наиболее предпочтительным антиоксидантом является метионин.
Предпочтительно, антиоксиданты, и особенно метионин, являются стабилизаторами, которые присутствуют в жидком
препарате стабилизированного IFN, используемом для приготовления гидрогелей по изобретению. Обычно метионин можно использовать в концентрации с 100-800-кратным молярным избытком (относительно IFN), предпочтительно с 400-кратным молярным избытком (приблизительно 0,4 мг/мл, если дозировка IFN составляет приблизительно 150 мкг/мл).
Метионин может присутствовать или в его свободной основной форме или в его солевой форме. Любой стериоизомер (то есть, изомер L, D или DL) метионина можно использовать в данном способе или препарате по изобретению, пока метионин присутствует в его свободной основной форме или его солевой форме. Предпочтительно используют L-стериоизомер. Аналоги метионина также можно использовать в данном препарате по изобретению. Термин "аналог метионина" относится к ¦производному природного метионина. Аналоги метионина также можно использовать в данном препарате или в их свободной основной форме или их солевой форме.
Повышенная и/или сохраненная стабильность при добавлении антиоксидантов (например, метионина) зависит от концентрации. То есть, увеличивающиеся концентрации антиоксидантов приводят к повышению и/или поддержанию стабильности препарата, содержащего интерферон-бета данного изобретения, если в таком препарате, содержащем интерферон-бета, обычно происходит окисление или образование агрегата/олигомера в отсутствие антиоксиданта. Определение количества оксиданта (например, метионина), который используют в данном препарате по изобретению, чтобы уменьшить окисление или образование олигомера/агрегата, можно легко осуществить без чрезмерного экспериментирования, используя способы в основном известные любому из специалистов в данной области.
Термин "бактериостатическое средство" относится к соединению или композициям, добавленным в препарат, которые действуют как противобактериальное средство. Примеры бактериостатических средств включают в себя фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобные), бензалконий
хлорид, бензетоний хлорид, дегидроацетат натрия и тимерозал. Предпочтительным бактериостатическим средством является бензиловый спирт.
Гидрогелевые препараты согласно изобретению могут быть в форме однократной дозы или многократных доз (мультидозовые). Описанные жидкие препараты интерферона по изобретению, которые предназначены для применения в виде многократных доз предпочтительно содержат бактериостатическое средство, такое как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобные), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимерозал. Особо предпочтительным является фенол, бензиловый спирт и м-крезол, более предпочтительным является бензиловый спирт. Бактериостатическое средство используют в количестве, которое будет обеспечивать концентрацию, которая эффективна для сохранения препарата по существу без бактерий (приемлемо для инъекции) в течение периода многократного введения дозы, который может составлять от 12 или 24 часов или приблизительно от 12 или 24 часов до 12 дней или приблизительно 12 дней, предпочтительно от 6 или приблизительно 6 до 12 дней или приблизительно 12 дней. Бактериостатическое средство предпочтительно присутствует в концентрации от 0,1% или приблизительно 0,1% (масса бактериостатического средства/масса растворителя) до 2,0% или приблизительно 2,0%, более предпочтительно от 0,2% или приблизительно 0,2% до 1,0% или приблизительно 1,0%. В случае бензилового спирта, особенно предпочтительными являются концентрации 0,2 или 0,3%.
Однако применение консервантов, например бензилового спирта, не ограничивают мультидозовыми препаратами, их также можно добавлять в препараты в форме однократной дозы. Одно осуществление данного изобретения относится к препаратам в форме однократной дозы, содержащим бензиловый спирт.
Предпочтительно, препараты данного изобретения имеют рН приблизительно между 3,0 и 5,0, более предпочтительно рН 3,8-4,0 или приблизительно 3,8-4,0. Предпочтительным буфером является ацетатный буфер с предпочтительными противоионами, являющимися
ионами натрия или калия. Ацетатные солевые буферные растворы хорошо известны в данной области. Концентрации буфера в общем растворе могут колебаться между или приблизительно 5 мМ, 9,5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет 10 мМ или приблизительно 10 мМ. Особо предпочтительным является буфер 50 мМ по ацетатным ионам с рН 3,8.
"Циклодекстринами", предназначенными для применения в изобретении, являются гидроксипропил-, гидроксиэтил-, глюкозил-, мальтозил- и мальтотриозил-производные бета-циклодекстрина и соответствующие производные гамма-циклодекстрина. Группы гидроксиалкила могут содержать одну или более гидроксильных групп, например гидроксипропил (2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил), дигидроксипропил и тому подобные. Производные глюкозила, мальтозила и мальтотриозила могут содержать один или более остатков сахара, например глюкозил или диглюкозил, мальтозил или димальтозил. Различные смеси производных циклодекстрина также можно использовать, например смесь производных мальтозила и димальтозила. Специальные производные циклодекстрина для применения в изобретении включают в себя гидроксипропил-бета-циклодекстрин (HPCD и HPBCD), гидроксиэтил-бета-циклодекстрин (HEBCD), гидроксипропил-гамма-циклодекстрин (HPGCD) , гидроксиэтил-гамма-циклодекстрин (HEGCD) ,
дигидроксипропил-бета-циклодекстрин (2HPBCD), глюкозил-бета-циклодекстрин (Gi~6eTa-CD или GiBCD) , диглюкозил-бета-циклодекстрин (2G Gi-бета-СО или 2 GiBCD), мальтозил-бета-циклодекстрин (G2~6eTa-CD или G2BCD), мальтозил-гамма-циклодекстрин (G2~raMMa-CD или G2GCD), мальтотриозил-бета-циклодекстрин (Сз-бета-CD или G3BCD), мальтотриозил-гамма-циклодекстрин (Сз-гамма-CD или G3GCD) и димальтозил-бета-циклодекстрин (2 G2-6eTa-CD или 2 G2BCD) и их смеси, такие как мальтозил-бета-циклодекстрин/димальтозил-бета-циклодекстрин.
Гидроксипропил-бета-циклодекстрин для применения в композициях данного изобретения поставляется коммерчески и является предпочтительным циклодекстрином согласно изобретению.
Диапазон количества интерферона в препаратах по изобретению
включает в себя концентрации приблизительно от 1,0 мкг/мл до 50 мг/мл, хотя более низкие и более высокие концентрации также используют и выбор концентрации зависит от носителя для предполагаемой доставки или способа введения, например препараты раствора будут отличаться от гелей, вводимых через слизистые (например, гелевые композиции IFN для трансбуккального или назального способа введения). Концентрация интерферона предпочтительно составляет от 5,0 мкг/мл или приблизительно 5,0 мкг/мл до 2 мг/мл или приблизительно 2 мг/мл, более предпочтительно от 10 мкг/мл или приблизительно 10 мкг/мл до 1 мг/мл или приблизительно 1 мг/мл, наиболее предпочтительно от 30 мкг/мл или приблизительно 30 мкг/мл до 100 мкг/мл или приблизительно 100 мкг/мл.
Предпочтительно препараты по изобретению сохраняют, по крайней мере, 60% или приблизительно 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 70% или приблизительно 70%, наиболее предпочтительно, по крайней мере, 80% или приблизительно 80% активности интерферона за время нахождения в упаковке в течение периода 24 месяцев.
Препараты пролонгированного действия данного изобретения можно получать по способу, который включает в себя добавление рассчитанных количеств раствора интерферона к гомогенному раствору полоксамера. Раствор интерферона предпочтительно представляет собой стабилизированный раствор интерферона, например раствор интерферона, содержащий эксципиенты, такие как стабилизаторы, подобные L-метионину, поверхностно-активные вещества, такие как полоксамеры, такие как полоксамер 188, или их комбинация.
В соответствии с одним осуществлением изобретения, препараты данного изобретения еще можно подвергнуть стадии фильтрации в стерильных условиях, например стерилизующую фильтрацию с использованием мембраны 0,22 мкм проводят при температуре, при которой вязкость полоксамерового гидрогеля
поддерживают низкой, например при 4°С.
Для улучшения способности прохождения через шприц
препаратов данного изобретения при комнатной температуре, можно добавлять эксципиенты, которые модифицируют температуру превращения раствор-в-гель полоксамерового гидрогеля,
предпочтительно к буферному раствору до образования раствора жидкого гидрогеля, то есть, до добавления полоксамера. Примерами эксципиентов, которые модифицируют температуру перехода раствор-гель полоксамерового гидрогеля, являются полиэтиленгликоль, глицерин, такой как глицерин 30° (по Боме), сахара, такие как трегалоза, и циклодекстрины, такие как гидроксипропил-р-циклодекстрин.
В соответствии с одним осуществлением изобретения, гидрогелевый препарат имеет вязкость при 4°С между вязкостью воды и областью 200 мПа.сек, предпочтительно в диапазоне между 100-150 мПа.сек, препарат может быть заключен в специальное приспособление, такое как автоинжектор или предварительно заполненные шприцы, и может образовывать "in situ" гель после подкожного введения.
Полученный раствор потом помещают во флаконы, ампулы, картриджи или предварительно заполненные шприцы.
Вариации описанного способа будут осознаны любым из специалистов в данной области. Например, порядок добавления компонентов, необходимость использования дополнительных добавок, температура и рН, при которых готовят препарат, все являются факторами, которые могут быть оптимизированы для _используемых концентраций и способов введения.
Стабилизированные препараты можно давать пациентам в виде прозрачных растворов, хранение которых предпочтительно осуществляют при температуре перехода раствор-гель гидрогеля.
Интеферон в гидрогелевых препаратах, описываемых в изобретении, можно вводить пациенту согласно данному изобретению с помощью целого ряда способов доставки, включая подкожную инъекцию, через слизистые, с помощью имплантата или другими способами, рассматриваемыми специалистами как хорошо известные в данной области.
Термин "флакон" относится вообще к резервуару, подходящему
для сохранения препарата интерферона пролонгированного действия согласно изобретению в твердой или жидкой форме в поддерживаемом стерильном состоянии. Примеры флаконов, которые используют в изобретении, включают в себя ампулы, картриджи, блистер-упаковки или другие такие резервуары, подходящие для доставки интерферона пациенту с помощью шприца или трансмукозального спрея.
Препараты согласно изобретению также можно продавать в виде предварительно заполненных шприцев.
Препараты изобретения можно вводить, используя признанные инъекционные приспособления. Примеры, включающие в себя такие одноразовые флаконные системы, охватывают автоинжекторные или карандаш-инжекторные приспособления для доставки раствора, такого как Reviject(r).
Иглы для инъекционного устройства выбирают с тем, чтобы они соответствовали плотности гидрогеля изобретения. Например, гидрогель изобретения можно вводить инъекционным устройством, имеющим различные калибры игл, такие как 18/23 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 18 и минимальный внешний диаметр калибра иглы 21) или 21/26 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 21 и минимальный внешний диаметр калибра иглы 26).
Предпочтительно, препараты изобретения можно вводить, используя признанные приспособления для гидрогелей. Например, способ инъекции с. использованием "Depot One Needle" (Imprit Pharmaceuticals) можно использовать для введения гидрогелей изобретения.
Термин "лечение" в контексте изобретения относится к любому благоприятному воздействию на прогрессирование заболевания, включая ослабление, снижение, уменьшение или устранение патологического развития после начала заболевания.
Фармацевтические композиции изобретения, содержащие IFN или изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, используют для диагностики, предупреждения и лечения (локально или системно) клинических симптомов, чувствительных к терапии упомянутым полипептидом.
Такие клинические показания включают в себя, например, нарушения или заболевания центральной нервной системы (ЦНС), мозга и/или спинного мозга, включая рассеянный склероз; аутоиммунные заболевания, включая ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона; и злокачественные новообразования, включая рак молочной железы, простаты, мочевого пузыря, почки и толстой кишки.
Все ссылки, цитируемые в изобретении, включающие в себя журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США и иностранные заявки, вышедшие в США, и иностранные патенты или любые другие ссылки, включены в описание цитированием в их полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание цитируемых рекомендаций в ссылках, приводимых в описании, также включены цитированием в их полном объеме.
Упоминание известных стадий способа, общепринятых стадий способов, известных способов или общепринятых способов не является никоим образом признанием, что любой аспект, описание или осуществление данного изобретения установлены, изложены или были предложены в соответствующей области.
Предшествующее описание специальных воплощений, таким образом, будет полностью раскрывать главную сущность изобретения, которую другие специалисты, применяя знания в данной области (включая содержания ссылок, цитируемых в описании) могут модифицировать и/или адаптировать для различных применений таких специальных воплощений без чрезмерного экспериментирования, не отступая от основной идеи данного изобретения. Поэтому полагают, что такие адаптации и модификации соответствуют ряду эквивалентов описываемых осуществлений, основанных на изложении и руководстве, представленных в описании. Понятно, что фразеология и терминология соответствует цели описания, а не ограничения так, что терминология и фразеология данного описания должны быть интерпретированы специалистами в свете изложений и руководства, представленных в изобретении, в сочетании со знаниями любого специалиста в данной области.
В соответствии с одним осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, в которой указанны препарат представляет собой полоксамеровый гидрогель, содержащий интерферон-бета.
В следующем осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанная композиция представляет собой полоксамеровый гидрогель, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а.
В другом осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит буфер и антиоксидант.
В следующем осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит буфер и поверхностно-активное вещество.
В соответствии с другим осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода раствор-гель.
В соответствии со следующим осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода раствор-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина.
В соответствии с одним осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, в которой названный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 4 07.
В следующем осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанная композиция представляет собой гидрогель полоксамера 4 07, который содержит приблизительно от 20 до 25% мае./мае. полоксамера 407.
В соответствии с одним предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат содержит рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер и
L-метионин как антиоксидант.
В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 4 07, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер, L-метионин как антиоксидант и полоксамер 188 как поверхностно-активное вещество.
В соответствии со следующим предпочтительным
осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 407, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер, L-метионин как антиоксидант и полоксамер 188 как поверхностно-активное вещество и трегалозу в качестве модификатора температурного перехода раствор-гель.
В соответствии с еще одним предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 4 07, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер, L-метионин как антиоксидант и циклодекстрин в качестве модификатора температурного перехода раствор-гель, предпочтительно
гидроксипропил-бета циклодекстрин.
В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, выбранную из следующей группы:
Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 74,7% мае./мае. r-h-IFN-бета-1а - 0,012% мае./мае. L-Метионин - 0,03% мае./мае. Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае; Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мае./мае. r-h-IFN-бета-1а - 0,012% мае./мае. L-Метионин - 0,03% мае./мае.
Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае. Трегалоза - 2,6% мае./мае; Полоксамер 407 - 20% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 77 34% мае./мае. r-h-IFN-бета-1а - 0,015% мае./мае. L-Метионин - 0,04% мае./мае.
Гидроксипропил-(3-циклодекстрин - 2,6% мае. /мае; Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мае./мае.
r-h-IFN-бета-1а - 0,012% мае./мае.
Ь-Метионин - 0,03% мае./мае.
Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае.
Глицерин 30° Be' - 2,6% мае./мае;
Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мае./мае. r-h-IFN-бета-1а - 0,012% мае./мае. L-Метионин - 0,03% мае./мае. Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае. n3r(Lutrol(r)E400) - 2,6% мае./мае;
В другом осуществлении, изобретение предоставляет способ получения гидрогелевой фармацевтической композиции IFN согласно изобретению, где указанный способ включает добавление рассчитанного количества полоксамера в буферный раствор при температуре, при которой образуется гомогенный раствор полимера, а затем добавление интерферона или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или активной фракции.
В следующем осуществлении, изобретение предоставляет способ получения фармацевтической гидрогелевой композиции IFN согласно изобретению, где буферный раствор содержит модификатер температурного перехода раствор-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина, предпочтительно гидроксипропил-р-циклодекстрин.
В еще одном осуществлении, изобретение предоставляет способ получения фармацевтической гидрогелевой композиции IFN согласно
изобретению, где интерферон добавляют из раствора, содержащего стабилизаторы, предпочтительно выбранные из L-метионина и полоксамера 18 8 и их комбинации.
В следующем осуществлении, изобретение предоставляет применение гидрогеля IFN-бета согласно изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения рассеянного склероза.
В другом осуществлении, изобретение предоставляет способ лечения рассеянного склероза, включающий введение гидрогеля IFN-бета согласно изобретению пациенту в случае необходимости.
Далее изобретение будет описано с помощью следующих примеров, которые не следует истолковывать в любом отношении как ограничение данного изобретения. В примерах будут упоминаться фигуры, которые анализируют ниже.
Краткое описание фигур:
На фиг.1 показан процент высвобождения r-hIFNp la из полоксамерового гидрогеля r-hIFNP la (1) в PBS при рН 7,4 при
37°С, определенного с помощью SE-ВЭЖХ/флуоресцентного детектора (ромбы) и методом ELISA (твердрофазный иммуноферментный анализ) (закрашенные квадраты) в зависимости от времени после введения гидрогеля в PBS (пример 1).
На фиг.2 представлена противовирусная активность r-hIFNP la, высвобожденного через 2 часа из полоксамерового гидрогеля г-hlFNP la (1) (светлые ромбы) по сравнению с исходным r-hIFNP la (светлые квадраты) и исходным r-hIFNP la, смешанным с полоксамеровым гелем без r-hIFNP la (плацебо) (закрашенные треугольники). Противовирусную активность выражали как процент клеток (клетки WISH), выживших после введения VSV, как функцию концентрации r-hIFNP la (пример 2).
На фиг.З представлено изменение концентрации в крови г-hlFNP la в зависимости от времени у наивных обезьян cynomolgus после подкожного введения или однократной инъекции 3,6 мкг/кг полоксамерового геля r-hIFNp la (1) (закрашенные квадраты),
однократной инъекции 3,6 мкг/кг исходного r-hIFNP la (контроль 1: светлые треугольники) или трех инъекций в течение недели с
интервалами 48 часов (t=0, 48 час и 96 час) по 1,223 мкг/кг каждая (контроль 3: светлые ромбы) (пример 3).
На фиг.4 представлено изменение концентрации r-hIFNP la в крови в зависимости от времени у наивных обезьян cynomolgus после однократной подкожной инъекции 3,6 мкг/кг липогеля GMS г-hlFNP la (контроль 2: точки) или трех инъекций в течение недели с 48-часовыми интервалами (t=0, 48 час и 96 час) по 1,223 мкг/кг каждая (контроль 3: светлые ромбы) (пример 3).
На фиг.5 показаны профили вязкости гидрогелевого препарата лутрола (1) , -точки-, по сравнению с гидрогелевым препаратом лутрола, содержащим трегалозу 2,6% мае./мае. (2), -заполненные квадраты-, и гидрогелевым препаратом лутрола, содержащим 2,6% мае./мае. НР-бетаСО (3), - закрашенные треугольники.
На фиг.6 показан процент r-hIFNP la, высвобожденного из полоксамерового гидрогеля (3) (полоксамер 407 - 20% мае./мае; ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 77,34% мае./мае, r-hIFNP la -0,015% мае./мае, L-метионин - 0,04% мае./мае. и гидроксипропил-Р-циклодекстрин - 2,6% мае. /мае.) в PBS при рН 7,4 при 37°С, определенного с помощью SE-ВЭЖХ/флуоресцентного детектора.
ПРИМЕРЫ
Следующие сокращения относятся соответственно к
определениям ниже:
cm (сантиметр, см) , cps (сантипаузы) , Da (дальтон, Да) , g (грамм, г), цд (микрограмм, мкг), min (минута, мин.), mg (миллиграмм, мг) , mL (миллилитр, мл) , mm (миллиметр, мм) , шМ (миллимолярный, мМ) , mPas (миллиПаскаль-секунды, мПа.сек), rpm (оборотов в минуту), ша (нанометер, нм), СНО (яичник китайского
хомяка), IFN (интерферон), IU (международные единицы, МЕД), i.v. (внутривенный), ЕМЕМ (минимальная основная среда Игла с солями
Игла) , FBS (фетальная телячья сыворотка) , GMS
(глицерилмоностеарат) МТТ (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-
этансульфоновая кислота), MS (рассеянный склероз), MW (молекулярный вес), PBS (забуференный фосфатом физиологический
раствор), PES (полиэфирсульфон), РР (полипропилен), PVDF (фторид
поливинилидена), r-IFN-бета (рекомбинантный интерферон-бета), г
hlFNp la (рекомбинантный интерферон-бета la, продуцируемый в клетках СНО), RIA (радиоиммунный анализ), s.c. (подкожный), TIW (три раза в неделю), UI (международная единица, МЕД), VSV (вирус везикулярного стоматита).
Синтез полоксамера описан Schmolka 1977, Journal of the American Oil Chemist's Society 54, 110-116, и полоксамер поставляется коммерчески.
Пример 1: Гидрогель полоксамера 407-r-hIFN-p la (1)
Основной способ получения:
В полипропиленовый чан (низкая адсорбция белка), помещенный в баню со льдом, взвешенное количество Lutrol(r) F127 медленно добавляли к холодному (2-8°С) ацетатному буферу [50 мМ, рН 3,8] на при перемешивании с магнитом [при 500-800 оборотов в минуту] до полного растворения полимера.
В другой сосуд, небольшое количество ацетатного буфера, содержащего стабилизирующие средства (например, Lutrol (r) F68 и L-метионин) добавляли к концентрированному исходному раствору г-hIFN-бета (2 мг/мл). Этот составленный буфер добавляли в раствор полимера, уменьшая перемешивание до 100-200 оборотов в минуту, чтобы минимизировать механическое напряжение белка. Конечным препаратом заполняли полипропиленовые шприцы при 2-8°С.
Исходный раствор r-IFN-бета представляет собой раствор ацетатного буфера, сконцентрированный от 0,348 мг/мл до 2 мг/мл ультрафильтрирующим центрифугированием (Sartorius VivaSpin 20 мл, отсечка MW 5000 Да, 2500 оборотов в минуту). Концентрированный основной раствор всегда исследовали современным методом SEC-ВЭЖХ для анализа и определения чистоты (% мономера), как описано в примере 1, параграф 5,ниже.
2. r-hIFN-бета
Использовали исходный Rebifa(r) 0,348 мг/мл, а стабилизированный раствор r-hIFN-бета 1а получали в соответствии с общим способом по параграфу 1, приведенным выше, добавлением комбинации стабилизаторов, например Lutrol(r) F68/L-метионина.
3. ЭксципиенФЫ:
3.1. Lutrol F127(r) (полоксамер, плуроник, синпероник)
Lutrol F127 (блоксополимер их трех компонентов полиоксиэтилен-полиоксипропилен-полиоксиэтилена) BASF представляет собой блоксополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида. Включен в список неактивных ингредиентов по критерию FDA (Департамента по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств) (внутривенные инъекции, ингаляции, глазные препараты, пероральные порошки, растворы, суспензии и сироп, а также препараты для местного применения). Включен в список медикаментов для не парентерального применения, внесенных в Европейскую фармакопею Объединенного королевства 4, р. 1777; USP 24 NF19 р 2492-2493.
В плуронике(r) F127 процент полиоксиэтилена (гидрофильный) составляет 7 3%, (полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=67 и (Ь)=98).
Типичные свойства плуроника(r) F127 приведены ниже: Средний молекулярный вес: 12600 г/моль Точка плавления: 56°С
Физическая форма при 20°С: твердое вещество Вязкость при 77°С: 3100 cps (сантипауз)
Поверхностное натяжение при 25°С 0,1% конц.: 41 дина/см Смачивание (Draves Wetting) (загрузка 3 г, 0,1% конц. при
25°С: > 360 сек.
Высота пены (Ross Miles, 0,1% водный при 50°С: 40 мм Точка помутнения в водном растворе, 1% конц.: > 100°С HLB (гидрофильный-липофильный баланс) в воде при 25°С: 1823
Растворимость в воде при 25°С: > 10%.
3.2. Ледяная уксусная кислота, Sigma
3.3. Lutrol(r) F68 (полоксамер, плуроник, синпероник)
Lutrol F68 (блоксополимер полиоксиэтилена и
полиокипропилена), BASF представляет собой блоксополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида. Включен в список неактивных ингредиентов по критерию FDA (внутривенные инъекции,
ингаляции, глазные препараты, пероральные порошки, растворы, суспензии и сироп, а также препараты для местного применения). Включен в список медикаментов для не парентерального применения, внесенных в Европейскую фармакопею Объединенного королевства 4, р. 1777; USP 24 NF19 р 2492-2493.
В плуронике(r) F68 процент полиоксиэтилена (гидрофильный) составляет 80%, а молекулярная масса полиоксипропилена (гидрофобный) составляет приблизительно 1,967 Да (полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=79 и (Ь)=28).
Типичные свойства плуроника(r) F68 приведены ниже:
Средняя молекулярная масса: 8400;
Точка плавления/текучести: 52°С;
Физическая форма при 20°С: твердое вещество;
Вязкость (Brookfield) сантипауз: 1000 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердые вещества при 7 7°С];
Поверхностное натяжение, дины/см при 25°С; 0,1% конц.: 50,3 0,01% конц.: 51,2 0,001% конц.: 53,б
Межфазное натяжение, дины/см при 25°С против растительного масла;
0,1% конц.: 19,8 0,01% конц.: 24,0 0,01% конц.: 2 6,0
Смачивание (Draves Wetting), секунды, при 25°С 1,0% конц.: > 360 0,1% конц.: > 360 Высота пены
Ross Miles, 0,1%, мм при 50°С: 35 Ross Miles, 0,1%, мм при 26°С: 40 Динамическая, 0.1%, мм при 400 мл/мин: > 600 Точка помутнения в водном растворе, °С 1% конц.: > 100 10% конц.: > 100
HLB (гидрофильный-липофильный баланс): 29. 3.4. L-метионин, Sigma
L-метионин (L-Met) включали в препарат в количестве 0,03%, чтобы ограничить окисление и, следовательно, для стабильности раствора IFN-бета.
4. Композиция гидрогеля (1)
Гидрогель (1) , содержащий 120 мкг/мл r-hIFN-бета 1а получали со следующим составом:
Lutrol(r) F127 25,0% мае./мае.
Ацетатный буфер [50 мМ/рН 3,8] 74,7% мае./мае. r-hIFN-бета 1а 0,012% мае./мае. L-Метионин 0,03% мае./мае. Lutrol(r) F68 0,24% мае./мае.
Гидрогель (1) производили в соответствии с общим способом примера 1, параграф 1, и при этом использовали 25 г раствора лутрола F127 и 3 мг r-hIFN-бета 1а.
5. Физико-химические свойства -Вязкость
Исследование динамической вязкости проводили, чтобы охарактеризовать такой гидрогель и подтвердить соответствующий стандарт инъецируемости; использовали вращающийся вискозиметр марки viscoStar L Fungilab, получая прямое считывание в mPas (мПа-сек (сантипаузах) . Порцию 50 г гидрогеля (1) готовили и вносили в полипропиленовый флакон, содержали в бане со льдом (Т=5±2°С) во время исследования вязкости. Полученные величины вязкости колебались между 100-140 mPas (шпиндель п° 2, скорость вращения шпинделя 100 оборотов в минуту и время уравновешивания 3 минуты).
-Высвобождение белка
Для того чтобы моделировать физиологические подкожные процессы, высвобождение IFN-бета из гидрогеля (1) исследовали в PBS. Тестирование высвобождения лекарственного средства проводили, используя 1 г препарата (1) (распределяли, используя
предварительно заполненные шприцы) в 4 мл PBS рН 7,4 при 37 ± 2°С (скорость вибратора бани = 100 оборотов в минуту). Образцы
отбирали через: 5, 15, 30 минут, 1 и 2 часа.
Каждый образец исследовали методом SE-ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (флуоресценция Trp) и подтверждали методом ELISA (Toray Kit). Указанные способы подробно описывают ниже.
Количество IFN-бета, определенное в среде, выражали как процент общего высвобожденного белка. Профили высвобождения, полученные двумя методами, указывали на двухфазный характер высвобождения, с быстрой начальной фазой, за которой следовала более медленная скорость высвобождения лекарственного средства (фиг.1).
Способ экстракции и анализ методом SE-ВЭЖХ:
Испытания проводили, чтобы оптимизировать метод экстракции IFN-бета, введенного в системы гидрогелей, и оценить выход лекарственного средства.
Процедуру экстракции устанавливали следующим образом на основании смеси вода/органический растворитель, составленной из воды и ацетона:
• 500 мг гидрогелевого препарата (1) растворяли в 1,0 мл ацетона в центрифужной пробирке и разрушали ультразвуком в течение 2 минут в ультразвуковой бане при менее чем 10°С
• добавляли воду вплоть до 3 мл в виде конечного объема
• образец получали центрифугированием (5 минут при 10000 оборотов в минуту, при +4°С)
• жидкую фазу собирали и исследовали.
После процедуры экстракции, образцы исследовали SE-ВЭЖХ при следующих рабочих условиях:
• Колонка ВЭЖХ TSK G2000 SWXL, тип. 08540 (внутренний диаметр 7,8 мм х 30 см, 5 мкм)
• Объем инжекции 100 мкл
• Температура колонки - комнатная температура
• Температура образца - комнатная температура
• Скорость течения: 0,5 мл/мин. (изократная)
• Подвижная фаза: 70% об./об. очищенной воды (MILIQ-Millipore) - 30% об./об. ацетонитрил - 0,2% об./об. TFA
• Время работы 27 мин.
• Время уравновешивания 3 мин.
• Длины волн флуоресцентного детектора: возбуждение 280 нм, эмиссия 34 8 нм.
ELISA-анализ (твердофазный иммуноферментный анализ)
Иммуноанализ ELISA (Toray kit) использовали, чтобы оценить концентрацию IFN-бета, высвобожденного гидрогелем IFN (1) . В упомянутом анализе применяют одностадийный сэндвич-метод и используют 96-луночные микропланшеты, покрытые поликлональными антителами к r-hIFN-бета. Связанные с ферментом моноклональные антитела, специфические для r-hIFN-бета добавляли в лунки, а затем в лунки пипеткой добавляли стандарты и образцы; любой присутствующий r-hIFN-бета связывался с иммобилизованным антителом. После промывания, чтобы удалить любой несвязанный реагент антитело-фермент, в лунки добавляли раствор субстрата, а окраска развивалась соответственно количеству r-hIFN-бета, связанного на первоначальной стадии. Развитие окраски останавливали и измеряли интенсивность окрашивания.
Исследование проводили в соответствии с инструкцией с тем различием, что инкубацию образца проводили в течение всей ночи
при +4°С.
Покрытый антителом микропланшет промывали 4 00 мкл промывающего раствора и высушивали на бумаге. Затем 50 мкл/лунку антитела, меченного ферментом, добавляли в микропланшет, предварительно заполненный 100 мкл образца, полученного в экспериментах по высвобождению лекарственного средства из гидрогеля (1), или заполненный исходным r-hIFN-бета в соответствии с кривой изменения концентрации (0-200 МЕД/мл). Микропланшет закрывали и энергично встряхивали во время инкубации в течение 120 минут при комнатной температуре. В конце инкубации образцы удаляли, микропланшет промывали 3 раза и высушивали на бумаге. 100 мкл раствора с развившейся окраской добавляли в каждую лунку; после 30 минут инкубации добавляли 100 мкл стоп-реагента и абсорбцию считывали при двух длинах волн 4 50 нм и 650 нм (фиг.1).
-Предварительная стабильность
Стабильность гидрогеля IFN (1) оценивали в течение периода времени: t=0, 24 часам, 1 недели, 1 и 2 месяцам при 4°С. Проводимыми исследованиями были: анализ дозировки лекарственного средства с помощью визуального осмотра и по вязкости (шпиндель п° 2, 100 оборотов в минуту, Т=6±2°С) .
Препарат гидрогеля (1) был стабилен в течение, по крайней мере, 2 месяцев.
Пример 2: Биоактивность гидрогеля полоксамер 407 - r-hIFN-бета la (1)
Биологическую активность гидрогеля (1) оценивали по противовирусной активности r-hIFN-бета 1а, высвобожденного из препарата гидрогеля (1) по сравнению с противовирусной активностью, наблюдаемой с исходным IFN-бета.
Вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус, который вызывает заболевание копыта и полости рта домашнего скота, был выбран для применения в данном исследовании из-за его чувствительности к интерферонам.
Провидимое противовирусное исследование основано на индуцируемом IFN-бета ингибировании цитопатического действия вирусов на линиях .клеток WISH, помещенных в ЕМЕМ, содержащую 5% FBS, при 4 х 104 клеток/лунку (50 мкл/лунку) 96-луночного титрационного микропланшета, предварительно заполненного серийным разведением (разведение 1:1,5) образца гидрогеля г-hIFN-бета или стандартом (исходным) r-hIFN-бета 1а. Клетки
инкубировали в течение 18-22 часов при 37°С и 5% СОг перед добавлением 50 мкл/лунку суспензии вируса везикулярного стоматита (VSV), приготовленной в ЕМЕМ, содержащей 2,5% FBS. В контрольные клеточные лунки добавляли только среду и не добавляли никакой суспензии вируса, тогда как в контрольные вирусные лунки добавляли только суспензию VSV. Инфицированные клетки инкубировали в течение еще 20-24 часов при 37°С и 5% СОг, а затем окрашивали 5% раствором МТТ в течение 2 часов. В конце эксперимента, супернатанты отбрасывали, а соли формазана растворяли добавлением 200 мкл/лунку 96% этанола. Планшеты
считывали при 595 нм на планшет-ридере спектрофотометра. Результаты выражали как процент ингибирования цитопатического действия в сравнении с контрольными клетками.
Биологическую активность r-hIFN-бета la in vitro, высвобожденную из препарата гидрогеля (1) через 2 часа, оценивали, используя описанное выше WISH-исследование в двух различных сериях экспериментов. Концентрация r-hIFN-бета 1а составляла 37,7 мкг/мл. Любую позитивную интерференцию гидрогеля лутрола без r-hIFN-бета 1а (пласебо), использованного для приготовления геля также проверяли, по образованию пиков исходного r-hIFN-бета 1а в плацебо.
r-hIFN-бета 1а, высвобожденный через 2 часа из обоих порций, показал, что биоактивность сохранялась и выход был полным по сравнению с исходным r-hIFN-бета 1а, вставленным в плацебо (фиг.2). Поэтому оказалось, что гидрогели полоксамера способны сохранять полную биологическую активность r-hIFN-бета 1а при высвобождении лекарственного средства.
Пример 3: Фармакокинетический профиль гидрогеля полоксамера 407 - r-hIFN-бета la (1)
Для оценки характеристик пролонгированного высвобождения полоксамерового гидрогеля IFN изобретения, можно сравнивать фармакокинетический профиль гидрогеля с профилем буферных препаратов и других гелевых препаратов.
Фармакокинетический профиль препарата гидрогеля IFN-бета (1) изучали на наивных обезьянах cenomologus (2 самца и 2 самки в каждой группе) и сравнивали с фармакокинетическим профилем препарата липогеля IFN-бета.
Образцы обеспечивали в предварительно заполненных шприцах, снабженных иглой 19G. Исследование предназначали (таблица IV ниже) для сравнения подкожной инъекции один раз в неделю гидрогеля IFN-бета (1) с инъекцией один раз в неделю жидкого забуференного (рН 3,8) препарата исходного IFN-бета (контроль) или с подкожной инъекцией один раз в неделю липогеля IFN-бета (120 мкг/мл) (контроль 2).
Использовали другую контрольную группу, в которой обезьянам вводили три раза в неделю (TIW) (3 подкожные инъекции с 48
часовыми интервалами: t=0, 48 часов и 96 часов), имитируя распространенную схему приема Rebif(r) для лечения MS (контроль 3) .
Раствор IFN для контроля 1 (группа 2) состоял из 40 мкг/мл раствора IFN в 50 мМ ацетатном буфере.
Липогелевая композиция IFN-бета для контроля 2 (группа 3) была следующей:
Моностеарат глицерина (GMS), 22,37% мае./мае.
(RYLO(tm) MG20 PHARMA, Danisco Cultor) PEG400 63,09% мае./мае.
(Lutrol Е400, BASF) Уксусная кислота 4,03% мае./мае. Ацетатный буфер [50 мМ/рН 3,8] 9,94% мае./мае. г-hIFN бета 1 а 0,01% мае./мае. L-Метионин (Sigma) 0,03% мае./мае. Гидроксипропил-р-циклодекстрин 0,03% мае./мае. (Cavasol W7HP, Wacker)
Раствор IFN для контроля 3 (группа 4) состоял из 16 мкг/мл раствора IFN в 50 мМ ацетатном буфере.
Взятие образцов крови включало пре-дозу и было задумано, чтобы охватить 14 дней после инъекции (336 часов) для группы 1 и 3; 2 дня после инъекции для группы 2. Взятие образцов крови для группы 4 предназначали для того, чтобы учесть характеристики РК после первой и последней инъекции г-hIFN бета 1 а и полной характеристики неоптерина.
г-hIFN бета 1а количественно определяли с помощью иммуноанализа, ELISA (Fujirebio), как описывают выше. Уровни неоптерина оценивали количественно с помощью анализа RIA (ICN Biomedical).
Таблица IV
Группа
Тип препарата
Доза (мкг/кг)
Замечания
Гидрогель-IFN-бета
3,67
подкожно
Гидрогель полоксамера, инъекция в t=0
IFN-бета (Контроль 1)
3, 67
подкожно
Исходный раствор, инъекция в t=0
липогель IFN-бета (Контроль 2)
3, 67
подкожно
Липогель глицирил моностеарата в t=0
Исходный INF-бета (Контроль 3)
3x1,223 подкожно
Инъекция исходного раствора в t=0, 48 часов, 96 час
Высобождение p-IFN:
Результаты доказывают, что после однократной подкожной инъекции полоксамеровый гидрогель (1) (группа 1) высвобождает г-hlFN бета 1а контролируемым способом, поддерживая уровни в плазме выше 5 ЕД/мл приблизительно в течение недели, и, возможно, больше (фиг.З).
Биодоступность белка значительно выше (таблица V, ниже) по сравнению с забуференным жидким препаратом (как при подкожной однократной инъекции, так и инъекциях TIW) и препаратом липогеля, использованным в качестве контролей.
Высвобождение г-hIFN бета 1а полоксамеровом гидрогелем (1) продемонстрировало несомненный выраженный контролируемый характер по сравнению с профилем высвобождения г-hIFN бета 1а, полученный с липогелем на основе GMS (группа 3), как показано на фиг.З и 4. Профиль высвобождения г-hIFN бета 1а из липогеля (контроль 2) характеризовался более низким "всплеском" и низким, пролонгированным состоянием равновесия.
Полученные результаты показали, что липогелевый препарат, используемый как контроль, не подходит для пролонгированного высвобождения г-hIFN бета 1а.
Таблица V
Параметры РК
Гидрогель IFN-бета (1)
Липогель IFN-бета (Контроль 2)
IFN-бета
(Контроль
IFN-бета (Контроль 3) 1 день
IFN-бета (Контроль 3) 5 день
Т макс.
(час)
8,0±0,0
1,5±0,5
13±0,5
1,8±0,5
1,4±0,5
С макс. (МЕД/мл)
231,3±116,4
24,0±12,1
96,3153,4
31,3±0,9
26,1±16,5
Т Ч (час)
19,4±2,4
45,1±77,б
9,5+3,8
6,1±2,8
8,0±3,5
Увеличение уровней неоптерина в сыворотке:
Результаты фармакодинамического (PD) исследования
подтвердили биологическую активность г-hIFN бета 1а, высвобожденного из гелей. Уровни неоптерина повышались со сдвигом tmax приблизительно 24 часа для инъекции гидрогеля (1) по сравнению с контролем (контроль 1). Повторное введение доз (TIW) r-hIFN-бета 1а приводило к более низкому, но продолжительному профилю PD (контроль 3) . Препарат липогеля давал более низкий фармакодинамический профиль (контроль 2).
Получение контрольного препарата липогеля:
В полипропиленовом чане (низкая адсорбция белка) взвешенные количества GMS и ПЭГа смешивали в ацетатном буфере [50 мМ, рН 45] и содержали в водяной бане (4 0°С) в течение нескольких минут для того, чтобы получить расплавленный и гомогенный липидный матрикс.
В другой сосуд небольшое количество ацетатного буфера [50 мМ, рН 4-5], содержащего стабилизирующие средства и наполнители (например, циклодекстрин и L-метионин), добавляли, чтобы получить исходный раствор r-hIFN-бета 1а (2 мг/мл). Описанный приготовленный буфер сначала помещали в водяную баню (4 0°С) приблизительно на 1,5 минут и добавляли в липидную смесь.
Смесь затем оставляли в водяной бане приблизительно в течение 5-10 минут, а потом охлаждали до комнатной температуры при мягком перемешивании с полипропиленовым стержнем.
Полученные результаты показали, что гидрогель (1) имеет биологическую активность подобную активности контрольных, жидких препаратов r-hIFN-бета 1а и делает возможным поддержание уровней r-hIFN-бета 1а в плазме в течение, по крайней мере, одной недели и достижение улучшенной биодоступности.
Пример 4: Стерилизующая фильтрация гидрогеля полоксамера 407-r-hIFN-6eTa la (1)
Монофазный раствор гидрогеля, содержащий IFN-бета, можно обрабатывать стерилизующей фильтрацией. IFN-Гидрогель (1) получали, как описано в примере 1.
Две разные мембраны (PVDF: фторид поливинилидена, и PES: полиэфирсульфон) фирмы PALL Corporation с диаметром мембран 47 мм и пластиной 2 мм использовали при температуре, при которой вязкость раствора сохранялась низкой, например 4°С.
Вязкость определяли до и после фильтрации в реометре (ViscoStar L Fungilab): 50 мл гидрогеля (1) в полипропиленовом
флаконе содержали в бане со льдом (Т=5±2°С) , шпиндель п°С, 100 оборотов в минуту. Не наблюдали никаких значительных реологических изменений, обусловленных процессом фильтрации.
Содержание мономера IFN и кинетику высвобождения из нагруженного IFN гидрогеля (1) до и после фильтрации исследовали с помощью SEC ВЭЖХ/флуоресцентного детектора (PBS (рН 7,4), 37°С, 100 оборотов в минуту/1 г гидрогеля (1) в 4 мл PBS) . Полученные профили высвобождения после фильтрации оказались очень похожими на профили до фильтрации, следовательно, процесс фильтрации не модифицирует высвобождающие IFN свойства гидрогеля.
Пример 5: Гидрогель полоксамера 407-г-hIFN-бета 1а (2)
IFN-гидрогель (2) получали, как описывают в примере 1, и трегалозу (Sigma) 2,6% мае./мае. добавляли к раствору буфера до образования раствора гидрогеля полоксамера, то есть, до добавления полоксамера 4 07.
Композиция гидрогеля (2):
Полоксамер 407 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 72,04; мае./мае. r-hIFN-бета 1 а 0,012% мае./мае. L-Метионин 0,03% мае./мае. Полоксамер 188 0,24% мае./мае. Трегалоза 2,6% мае./мае.
-Вязкость
Исследование динамической вязкости проводили, чтобы охарактеризовать гидрогель (2) и охарактеризовать свойства его инъецируемости. Использовали вращающийся вискозиметр типа ViscoStar L Fungilab, получая прямое считывание в mPas (сантипаузах). Гидрогель (2) вносили в полипропиленовый флакон и измерения вязкости (SPL4, диапазон скорости - 200-300 оборотов в минуту) проводили во время изменения температуры и непрерывного считывания значений на дисплее вискозиметра.
Результаты указывают на другое реологическое поведение гидрогеля (2) по сравнению с гидрогелем (1) . Применение трегалозы в концентрации 2,6% мае./мае. в гидрогеле (2) изобретения приводит к повышению температуры перехода раствор-гель (фиг.5), что улучшает условия производства и манипулирования матриксом.
Пример 6: Гидрогель полоксамера 407-r-hIFN-6eTa 1 а (3)
IFN-гидрогель (3) получали, как описано в примере 1, но гидроксипропил-р-циклодекстрин (Cavasol W7HP, Wacker) 2,6% мае./мае. добавляли в буферный раствор при перемешивании с магнитом (500-700 оборотов в минуту) до добавления полоксамера 407. Затем, полоксамер 407 добавляли к раствору гидроксипропил-Р-циклодекстрин, как описано в примере 1, при перемешивании с магнитом.
Композиция гидрогеля (3):
Полоксамер 407 20% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 77,34; мае./мае.
r-hIFN-бета 1 а 0,015% мае./мае.
L-Метионин 0,04% мае./мае.
Cavasol W7HP 2,6% мае./мае.
-Вязкость
Исследование динамической вязкости проводили, чтобы охарактеризовать гидрогель (3) и охарактеризовать свойства его инъецируемости. Использовали вращающийся вискозиметр марки ViscoStar L Fungilab, получая прямое считывание в mPas (сантипаузах). Гидрогель (3) вносили в полипропиленовый флакон и
измерения вязкости (SPL4, диапазон скорости - 200-300 оборотов в минуту) проводили во время изменения температуры и непрерывного считывания значений на дисплее вискозиметра.
Результаты, представленные на фиг.5, указывают на другое реологическое поведение гидрогеля (3) по сравнению с гидрогелем (1) : температуры перехода раствор-гель гидрогеля (3) повышалась
приблизительно от 11°С до 23°С.
Поразительно, сдвиг температуры перехода раствор-гель гидрогеля (3) повышался значительно больше по сравнению со сдвигом температуры перехода раствор-гель гидрогеля, содержащего трегалозу, (2), несмотря на более низкую концентрацию использованного матрикс-образующего полоксамера 407 (20% мае./мае.) (фиг.5), что улучшает условия производства и обращение с матриксом.
-Высвобождение белка
Для моделирования физиологических подкожных процессов, высвобождение IFN-бета из гидрогеля (3) исследовали в PBS, как описано ранее. Тестирование высвобождения лекарственного средства проводили, используя 1 г препарата (3) (распределяли, используя предварительно заполненные шприцы) в 4 мл PBS рН 7,4 при 37±2°С (скорость вибратора бани = 100 оборотов в минуту). Образцы отбирали через: 5, 15, 30 минут, 1 и 2 часа.
Каждый образец исследовали методом SE-ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (флуоресценция Trp). Характеристики пролонгированного высвобождения (профиль высвобождения IFN-бета) циклодекстрин-содержащего гидрогеля (3) были сопоставимыми с характеристиками гидрогеля без модификатора температурного перехода раствор-гель, то есть, гидрогеля (1) несмотря на сдвиг в температуре перехода раствор-гель (фиг.6). При противовирусном исследовании, которое описано в примере 2, наблюдали, что r-hIFN la, высвобожденный через 2 часа из циклодекстрин-содержащего гидрогеля (3) , сохранял биоактивность, а выход был полным по сравнению с исходным r-hIFN-p la, введенным в плацебо. Следовательно, оказалось, что гидрогель, содержащий циклодекстрин, (3) способен сохранять полностью биологическую активность r-hIFN-(3 la при
высвобождении лекарственного средства.
Пример 7: Гидрогель полоксамера 407-r-hIFN-6eTa 1 а (4)
IFN-гидрогель (4) получали, как описано в примере 1 и
глицерин 30°Ве' (30 градусов по Боме) (Carlo Erba) 2,6% мае./мае. добавляли в буферный раствор до образования раствора гидрогеля полоксамера, то есть, до добавления полоксамера 407.
Композиция гидрогеля (4):
Полоксамер 407 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 72,04; мае./мае. r-hIFN-бета 1 а 0,012% мае./мае. L-Метионин 0,03% мае./мае. Полоксамер 188 0,24% мае./мае. Глицерин 30°Ве' 2,6% мае./мае.
Пример 8: Гидрогель полоксамера 407-r-hIFN-6eTa 1 а (5)
IFN-гидрогель (5) получали, как описано в примере 1, и ПЭГ (Lutrol(r)E400, Basf) 2,6% мае./мае. добавляли в буферный раствор до образования раствора гидрогеля полоксамера, то есть, до добавления полоксамера 4 07.
Композиция гидрогеля (5):
Полоксамер 407 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 72,04; мае./мае.
г-hIFN-бета 1 а 0,012% мае./мае.
L-Метионин 0,03% мае./мае.
Полоксамер 188 0,24% мае./мае.
n3r(Lutrol(r)E400) 2,6% мае./мае.
Пример 9: Исследование введения шприцем
Для тестирования подкожного введения шприцем полоксамеровых гидрогелей IFN, исследование введения шприцем можно осуществлять, используя различные типы игл.
В частности, исследование введения шприцем проводили, используя новую технологию инъекции, названную Depot One (Imprint Pharmaceuticals)
Выбранные иглы Depot One представляют собой следующее:
-18/23 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 18 и минимальный внешний диаметр соответствует калибру иглы 21)
-21/26 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 21 и минимальный внешний диаметр соответствует калибру иглы 2 6)
Пропиленовые шприцы, 3 мл, заполняли 0,5 мл гидрогеля (1) или гидрогеля (3) (хранили при 4°С) и приблизительно через 15 минут при комнатной температуре выдавливали в полистироловый флакон. "Производительность шприца" устанавливали на основании силы, необходимой, чтобы выдавить шприцы.
Исследования введения шприцем при комнатной температуре показало, что гидрогель (3) имеет очень хорошие характеристики введения шприцем при комнатной температуре.
Пример 10: Фармакокинетический профиль гидрогеля
полоксамера 407-r-hIFN-p la (3)
Фармакокинетические характеристики гидрогеля полоксамера 407-r-hIFN-6eTa la (3) можно оценивать на самцах наивных обезьян cynomolgus (выращенная в неволе Масаса fascicularis) любым предшествующим способом лечения r-hIFN-бета 1а и другим исследуемым лекарственным средством.
Животные:
Диапазон веса тела животных: 2-4 кг в начале исследования Диапазон возраста: приблизительно 5 лет Количество животных на группу: 4
Препараты вводили животным, которые голодали в течение ночи (то есть, приблизительно в течение 16 часов) до введения. Пищу можно снова давать через 4 часа после лечения. Воду можно давать ad libitum.
Препарат гидрогеля r-hIFN-p la (3) готовили в предварительно заполненные шприцы по 320 мг каждый с иглой 21 G при концентрации 174 мкг r-hIFN-p la на грамм. Вследствие термообратимой природы препарата геля, предварительно заполненные шприцы следует хранить при 4°С и содержать при комнатной температуре только в течение времени, необходимом для введения.
Однократную дозу, которая составляла 4 4 мкг r-hIFN-P la на животное, вводили под кожу одной из ног. 200-250 мг из одного предварительно заполненного гидрогелевым препаратом r-hIFN-бета
la (3) шприца вводили каждой обезьяне (один шприц для каждой обезьяны) в группе 1 (от 1 до 4 животных) . Стеклянные предварительно заполненные шприцы взвешивали до и после введения, чтобы произвести точную оценку введенной дозы.
Кровь собирали из латеральной подкожной вены в пробирки в соответствии со схемой, подробно представленной в таблице ниже:
Время взятия образца
Время взятия образца, исследование IFN-бета
Время взятия образца,
исследование
неоптерина
Общее
количество
собранной
крови
Предварительное
0,5 мл
исследование
(день-1)
Предварительное
1, 5 мл
исследование (0
час)
3 0 мин
1,0 мл
1 час
1, 0 мл
2 час
1, 0 мл
4 час
1,0 мл
6 час
0,5 мл
8 час
1,0 мл
24 час
1, 5 мл
32 час
1,5 мл
4 8 час
1,5 мл
56 час
1, 5 мл
72 час
1, 5 мл
96 час
1, 5 мл
104 час
1,5 мл
120 час
1, 5 мл
168 час
1, 5 мл
Образцы крови оставляли для свертывания в течение 60 минут при комнатной температуре. Сгусток отделали центрифугированием при 2500 g (3350 оборотов в минуту) при 4°С в течение 15 минут.
Если собирали 0,5 мл крови, готовили 2 аликвоты сыворотки, 1-ая, по крайней мере, 0,125 мл сыворотки, 2-ая с оставшейся сывороткой.
Если собирали 1,0 мл крови, готовили 2 аликвоты сыворотки, 1-ая, по крайней мере, 0,250 мл сыворотки, 2-ая с оставшейся сывороткой.
Если собирали 1,5 мл сыворотки, готовили 3 аликвоты сыворотки, 1-ая и 2-ая, по крайней мере, по 0,250 мл сыворотки, 3-ая с оставшейся сывороткой.
Образцы сыворотки для исследования r-hIFN-бета 1а хранили при -80°С.
Образцы сыворотки для исследования неоптерина хранили при -
20°С.
Следующие фармакокинетические параметры получали из индивидуальных сывороточных концентраций r-hIFN(5 la (как МЕД/мл) в зависимости от времени (часы) после каждого введения.
Непосредственно при наблюдении:
Сшах: наиболее высокая величина концентрации, установленная в сыворотке
Тмах: время от введения, при котором установлена величина
Tz: время взятия последнего образца, в которое обнаружена количественно определяемая концентрация
Cz: величина концентрации, полученная во время Tz взятия образца
При использовании программы WinNonlin(r):
AUCz: площади области под кривой изменения сывороточной концентрации в зависимости от времени вплоть до времени взятия образца Tz, рассчитанная по "Log-линейному правилу трапеции" (линейная вплоть до Стах, логарифмическая после Стах) •
Tlin: первая точка, рассматриваемая для определения периода полувыведения.
\ъ: константа скорости элиминации, рассчитанная по наклону кривой линейной регрессии, полученной построением естественных логарифмов величин конечной концентрации в зависимости от времени (от Tlin до Tz).
tl/2: период полувыведения, рассчитанный по уравнению:
tl/2 =(In2)Az
AUC: площадь области под кривой изменения сывороточной концентрации в зависимости от времени, рассчитанная по следующему уравнению:
AUC=AUCz+CzAz
%AUCext: процент экстраполированного AUC (то есть, полученного экстраполяцией), рассчитанный по следующему уравнению:
%AUCext=(AUC-AUCz)/AUC 100
Описанный эксперимент можно проводить с параллельной группой 2 животных, используя коммерческий препарат IFNP в качестве стандарта (такой как Rebif(r): раствор препарата, содержащий человеческий сывороточный альбумин (HAS)), маннит и ацетат натрия в качестве наполнителей, упакованный в предварительно заполненные шприцы с иглой 21 G объемом инъекции 0,5 мл при концентрации 44 мкг r-hIFNP la (12 ММЕД). В этом случае, все содержимое (0,5 мл) одного предварительно заполненного шприца Rebif(r) вводили каждой обезьяне (один шприц на животное) в группе 2 (от 5 до 8 животных).
Анализируемое вещество: интерферон бета (r-hIFNP la):
T макс.
С макс.
AUC-послед-
AUC(0-72)
(час)
[МЕД/мл]
ний
последнее
последнее
[час*МЕД/мл]
[час*МЕД/мл]
[час]
[МЕД/мл]
Mean
1930
54300
9, 64
53900
8,0
992
16000
5,10
15800
CV%
513
29, 4
52, 9
29, 3
Полученные результаты показали, что гидрогелевый препарат r-hIFNp la (3) характеризуется высокой биодоступностью.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, содержащая интерферон (IFN), где указанная композиция представляет собой гидрогель полоксамера.
2. Композиция по п.1, в которой интерферон представляет собой IFN-бета.
3. Композиция по п.1 или 2, в которой интерферон представляет собой рекомбинантный IFN-бета.
4. Композиция по любому из предшествующих пп., в которой интерферон представляет собой рекомбинантный IFN-бета 1а.
5. Композиция по любому из предшествующих пп., где композиция дополнительно содержит буфер и антиоксидант.
6. Композиция по любому из предшествующих пп., где композиция дополнительно содержит буфер и поверхностно-активное вещество.
7. Композиция по любому из предшествующих пп., где композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода твердое вещество-гель.
8. Композиция по любому из предшествующих пп., где композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода твердое вещество-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина.
9. Композиция по любому из предшествующих пп., в которой полоксамер представляет собой полоксамер 407.
10. Композиция по любому из предшествующих пп., где композиция содержит от 20 до 25% мае./мае. полоксамера 407.
11. Композиция по п.1, где указанная композиция представляет собой гидрогель полоксамера 407, содержащий рекомбинантный IFN-бета 1а, и дополнительно содержит буфер и L-метионин.
12. Композиция по п.11, где композиция дополнительно содержит полоксамер 188.
13. Композиция по п.12, где композиция дополнительно содержит трегалозу.
14. Композиция по п.11, где композиция дополнительно содержит гидроксипропил-бета-циклодекстрин.
15. Композиция по любому из предшествующих пп., где композицию выбирают из группы:
Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 74,7% мае./мае. r-hIFN-бета 1 а - 0,012% мае./мае. L-Метионин - 0,03% мае./мае. Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае. Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мае./мае.
r-hIFN-бета 1 а - 0,012% мае./мае.
L-Метионин - 0,03% мае./мае.
Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае.
Глицерин 30°Ве' - 2,6% мае./мае.
Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мае./мае. r-hIFN-бета 1 а - 0,012% мае./мае. L-Метионин - 0,03% мае./мае. Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае.
n3r(Lutrol(r)E400) - 2,6% мае./мае. Полоксамер 407 - 25% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мае./мае.
r-hIFN-бета 1 а - 0,012% мае./мае.
L-Метионин - 0,03% мае./мае.
Полоксамер 188 - 0,24% мае./мае.
Трегалоза - 2,6% мае./мае.
Полоксамер 407 - 20% мае./мае.
Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 77,34% мае./мае. r-hIFN-бета 1 а - 0,015% мае./мае. L-Метионин - 0,04% мае./мае.
Гидроксипропил~Р-циклодекстрин - 2,6% мае./мае.
16. Способ получения гидрогелевой композиции IFN по пп.1-15, где указанный способ включает добавление рассчитанного количества полоксамера к забуференному раствору при температуре, при которой образуется гомогенный раствор полимера, а затем
добавление интерферона.
17. Способ по п.16, где раствор буфера содержит модификатор температурного перехода раствор-в-гель.
18. Способ по п. 16, где раствор буфера содержит модификатор температурного перехода раствор-в-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина.
19. Способ по пп.16-18, где интерферон добавляют из раствора, содержащего стабилизаторы, выбранные из L-метионина и полоксамера 18 8 и их комбинации.
20. Применение гидрогелевой композиции IFN по пп.1-15 для получения фармацевтического препарата для лечения рассеянного склероза.
По доверенности
ФИГ. 1
Время (час)
2/6
ФИГ. 2
IFN (пг/мл)
3/6
ФИГ.З
Время (час)
4/6
ФИГ. 4
Время (час)
5/6
ФИГ. 5
10 15 20 25
Температура (°С)
ФИГ. 6
100
Время (мин)