Настоящее изобретение относится к способу предотвращения тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, таких как инфаркт мозга (инсульт) или инфаркт миокарда, введением левозимендана или его метаболита (II), или любой из их фармацевтически приемлемых солей млекопитающему, нуждающемуся в такой профилактике.

 

(57) Реферат / Формула:
изобретение относится к способу предотвращения тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, таких как инфаркт мозга (инсульт) или инфаркт миокарда, введением левозимендана или его метаболита (II), или любой из их фармацевтически приемлемых солей млекопитающему, нуждающемуся в такой профилактике.

 

---

2420-140145ЕА/091 СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ТРОМБОЭМБОЛИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ
ОПИСАНИЕ
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу предотвращения тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, таких как инфаркт мозга (инсульт) или инфаркт миокарда, введением левозимендана или его метаболита (II), или любой из их фармацевтически приемлемых солей млекопитающему, нуждающемуся в этом.
Описание предшествующего уровня техники
Тромбоэмболическое заболевание, т.е. блокировка сосуда сгустком крови, поражает многих взрослых и может быть причиной смерти. Большинство спонтанно развивающихся сосудистых окклюзий вызваны формированием внутрисосудистых сгустков крови, известных как тромбы, которые, в конечном счете, блокируют артерию в точке их формирования. Такие окклюзии известны как тромботические окклюзии. Альтернативно, небольшие фрагменты сгустка (эмболы) могут отсоединиться от тела сгустка и перемещаться по системе кровообращения с попаданием в отдаленные органы. Затем эти эмболы захватываются и могут вызвать тяжелые осложнения, препятствующие нормальному кровообращению. Такие окклюзии, вызванные сгустком, который формируется где-либо в организме и перемещается с потоком крови, известны как эмболические окклюзии. Инфаркт мозга (инсульт), инфаркт миокарда (сердечный приступ) и инфаркты почек и легких представляют собой хорошо известные последствия тромбоэмболических феноменов. Обструкция кровеносного сосуда может также вызвать вторичный разрыв или утечку крови в артериальных стенках и последующее кровотечение
(кровоизлияние). Первичный разрыв кровеносного сосуда происходит без тромботической или эмболической окклюзии, например, в участке аневризмы (ослабленная область в стенке артерии). Примеры первичного церебрального кровотечения включают внутричерепное кровоизлияние и субарахноидальное кровоизлияние.
Основной белковый компонент сгустка представляет собой фибрин, который формирует относительно нерастворимую сеть. Сгустки формируются, когда растворимый фибриноген, который присутствует в высоких концентрациях в крови, превращается в нерастворимый фибрин под действием тромбина. Протеолитические, в частности, фибринолитические ферменты, использовались для растворения сосудистых окклюзий, поскольку разрушение фибриновой матрицы приводит к растворению сгустка.
Кровь млекопитающих также содержит фибринолитическую систему, называемую плазминогеновой системой, которая играет роль в тромболизисе. Фибринолитическая система содержит плазминоген, который под действием активаторов плазминогена (РА) превращается в активный фермент плазмин, который, в свою очередь, переваривает фибрин в растворимые продукты разрушения. Были идентифицированы два физиологических активатора плазминогена, называемые плазминогеном тканевого типа (t-PA) и плазминогеном типа урокиназы (u-РА).
Ингибирование активации плазминогена достигается ингибитором-1 активатора плазминогена (PAI-1), который образует устойчивый неактивный комплекс с t-PA. Большая часть реагирующего на сгусток PAI-1 накапливается внутри сгустка, придавая ему первоначально устойчивость к фибринолизу. Возросший уровень PAI-1 составляет важный тромботический фактор риска, например, инфаркта миокарда или тромбоза глубоких вен ввиду общего возросшего антифибринолитического потенциала.
PAI-1 становится функционально стабилизированным только в комплексе с витронектином (VN), присутствующим в изобилии в плазме гликопротеидом. Более того, VN играет решающую роль в связывании PAI-1 с фибрином. Аналогично PAI-1, кининоген (НК) с высокой молекулярной массой также связывается с VN и конкурирует с PAI-1 за проксимальные участки связывания VN. Таким образом, кининоген (НК) может ингибировать формирование комплекса PAI-1-VN или вызвать его диссоциацию и, посредством этого, способствовать уменьшению активности PAI-1. Действительно, исследования показали, что кининоген (НК) является скорее антитромботическим, чем протромботическим
фактором, и у пациентов с недостаточностью кининогена (НК) имеется повышенный риск тромбоза See Chavakis, Т. et al., "А Novel Antithrombotic Role for High Molecular Weight Kininogen as Inhibitor of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Function", Journal of Biological Chemistry, 277, 36, 32677-32682 (2002).
Средство, способное предотвратить тромботические, эмболические и/или геморрагические расстройства, было бы очень благоприятным для пациентов с высоким риском тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств.
Левозимендан, который представляет собой (-)-энантиомер [[4-(1,4,5,6-тетрагидро-4-метил-6-оксо-3-
пиридазинил)фенил]гидразин]пропандинитрила, и способ его получения описан в ЕР 565546 В1. Левозимендан является сильнодействующим при лечении сердечной недостаточности. Левозимендан увеличивает сократительную способность сердца увеличением чувствительности к кальцию сократительных белков в сердечной мышце. Левозимендан представлен формулой:
Гемодинамические эффекты левозимендана у человека описаны Sundberg, S. et al., Am. J. Cardiol., 1995; 75: 1061-1066 и in Lilleberg, J. et al., J.Cardiovasc. Pharmacol., 26 (Suppl.l), S63-S69, 1995. Фармакокинетика левозимендана у человека после внутривенного и орального введения описана Sandell, Е.-Р. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 26(Suppl.l), S57-S62, 1995. Клинические исследования подтвердили благоприятные эффекты левозимендана у пациентов с сердечной недостаточностью.
Недавно было обнаружено, что левозимендан имеет активный метаболит (R) -N-[4-(1,4,5,6-тетрагидро-4-метил-6-оксо-3-
пиридазинил)фенил]ацетамида (II)/ который присутствует в организме человека после введения левозимендана. Эффекты (II) аналогичны левозимендану. Применение (II) для увеличения чувствительности к кальцию сократительных белков в сердечной
мышце было описано в W0 99/66932.
Введение левозимендана вместе с тромболитическим средством при лечении острого инфаркта миокарда было описано в W0 03/063870. Однако не было описано, что левозимендан оказывал бы антитромботический эффект, или что левозимендан снизил бы риск тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящее время было обнаружено, что левозимендан и его активный метаболит (II) заметно снижают частоту и объем поражений мозга, поведенческих расстройств и смертности, связанных с инсультом, на модели чувствительных к соли крыс. Более того, было обнаружено, что левозимендан в 10 раз увеличивает концентрацию кининогена в ткани крыс.
Эти результаты указывают на то, что левозимендан и его метаболит (II) способны снизить риск у млекопитающих тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, таких как инфаркт мозга (инсульт), вероятно, эффектами, опосредованными кининогеном. Поэтому, левозимендан и его метаболит (II) можно применять при профилактике тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств и, в частности, при снижении риска тромботических, эмболических и/или геморрагических явлений у млекопитающего, включая человека, имеющего высокий риск таких явлений.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ предотвращения тромботических, эмболических и/или
геморрагических расстройств у млекопитающего, причем указанный способ включает введение нуждающемуся , в такой профилактике млекопитающему эффективного количества левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей.
Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения риска тромботических, эмболических и/или геморрагических явлений у млекопитающего, имеющего высокий риск таких явлений, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в нем млекопитающему эффективного количества левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых
солей.
Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения риска тромботической или эмболической окклюзии кровеносного сосуда у млекопитающего, имеющего высокий риск такой окклюзии, причем указанный способ включает введение нуждающемуся в нем млекопитающему эффективного количества левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей.
Настоящее изобретение также предоставляет применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственного средства для профилактики тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств.
Настоящее изобретение также предоставляет применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственного средства для снижения риска тромботических, эмболических и/или геморрагических явлений у млекопитающего, имеющего высокий риск таких явлений.
Настоящее изобретение также предоставляет применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственного средства для снижения риска кровоизлияния или тромботической или эмболической окклюзии кровеносного сосуда у млекопитающего, имеющего высокий риск такого кровоизлияния или окклюзии.
Настоящее изобретение также предоставляет применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственного средства для предотвращения кровоизлияния или формирования тромба или эмбола.
Наконец, настоящее изобретение также предоставляет применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственного средства для предотвращения инсульта.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показано выживание (%) чувствительных к соли крыс линии Dahl, получающих рацион с высоким содержанием соли, после лечения левозименданом в двух различных дозах (Dahl HS+levo и Dahl HS+levolO), по сравнению с показателями выживания не леченых чувствительных к соли крыс линии Dahl, получающих рацион с высоким содержанием соли (Dahl HS) и чувствительных к соли крыс линии Dahl, получающих рацион с низким содержанием соли (Dahl LS).
Подробное описание изобретения
Используемый термин "предотвращение тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств" означает снижение частоты или рецидива тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств. Аналогичным образом, термин "предотвращения инсульта" означает снижение частоты или рецидива инсульта.
Используемый термин "тромботические и/или эмболические расстройства" означает острые или хронические патологические состояния или условия, возникающие в результате окклюзии или частичной окклюзии кровеносного сосуда вследствие тромба или эмбола. Аналогичным образом, "тромботическая или эмболическая окклюзия" означает окклюзию или частичную окклюзию кровеносного сосуда вследствие тромба или эмбола. Примеры тромботических и эмболических расстройств включают, но не ограничиваются, церебральные тромботические и эмболические расстройства, такие как инфаркт мозга (инсульт), транзиторный ишемический приступ и сосудистую деменцию; тромботические и эмболические расстройства сердца, такие как инфаркт миокарда, острый коронарный синдром, нестабильная стенокардия и внезапная ишемическая смерть; инфаркты легких или почек, периферические циркуляторные расстройства и тромбоз глубоких вен.
Используемый термин "геморрагические расстройства" означает острые или хронические патологические состояния или условия, возникающие в результате кровотечения из поврежденного кровеносного сосуда. Примеры геморрагических расстройств включают, но не ограничиваются, церебральные кровоизлияния,
такие как внутримозговое кровоизлияние (ICH), субарахноидальное кровоизлияние (SAH) и геморрагический инсульт.
Один предпочтительный вариант осуществления изобретения представляет собой способ предотвращения церебральных тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, в частности, инфаркта мозга (инсульта), транзиторного ишемического приступа (TIA), внутримозгового кровоизлияния (ICH), субарахноидального кровоизлияния (SAH) или сосудистой деменции.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, левозимендан или его метаболит (II) или любая из их фармацевтически приемлемых солей применяется для предотвращения тромботических, эмболических и/или
геморрагических расстройств сердца, в частности, инфаркта миокарда, острого коронарного синдрома и нестабильной стенокардии.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, левозимендан или его метаболит (II) или любая из их фармацевтически приемлемых солей применяется для предотвращения тромботических, эмболических и/или
геморрагических расстройств, независимых от ингибирования мерцательной аритмии или других сердечных аритмий. Пациенты, подлежащие лечению, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, могут страдать или не страдать мерцательной аритмией или другими сердечными аритмиями.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, левозимендан или его метаболит (II) или любая из их фармацевтически приемлемых солей применяется для предотвращения тромботических, эмболических и/или
геморрагических расстройств, независимых от снижения повышенного артериального давления. Пациенты, подлежащие лечению, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, могут страдать или не страдать гипертонией.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, левозимендан или его метаболит (II) или любая из их фармацевтически приемлемых солей применяется для
предотвращения тромботических, эмболических и/или
геморрагических расстройств, независимых от ингибирования ишемии миокарда. Пациенты, подлежащие лечению, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, могут страдать или не страдать ишемией миокарда.
Состояния, которые связаны с высоким риском тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, включают, но не ограничиваются, ранее имевшееся тромботическое, эмболическое и/или геморрагическое явление/ ортопедические переломы или другие травмы; продолжительный постельный режим; хроническую недостаточность глубоких вен нижних конечностей; сахарный диабет; повышенные уровни липидов крови; атеросклероз; эндокардит; карциному; беременность; и послеоперационные периоды после хирургических операций, таких как кардиохирургические вмешательства, чрескожные вмешательства на коронарных артериях, ангиопластика и протезирование клапанов.
Способ в соответствии с изобретением относится к введению субъекту некоторого количества левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей, которые эффективны для профилактики тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, предпочтительно, ингибированием формирования кровяного сгустка, и/или индукцией фибринолиза кровяного сгустка. Не желая быть связанными теорией, заявители предполагают, что левозимендан, по меньшей мере, частично, предотвращает тромботические, эмболические и/или
геморрагические расстройства увеличением экспрессии и/или секреции кининогена. Предпочтительно, левозимендан
предотвращает тромботические, эмболические и/или
геморрагические расстройства без воздействия на гемостатический баланс, то есть без значимого ингибирования агрегации тромбоцитов или свертывания крови.
Введению левозимендана или его активного метаболита (II) может быть энтеральным, например, оральным или ректальным; парентеральным, например, внутривенным; или трансдермальным или через слизистые оболочки.
Подлежащее введению субъекту эффективное количество
левозимендана или его активного метаболита (II) зависит от подлежащего лечению или предотвращению состояния, пути введения, возраста, массы тела и состояния пациента. Оральная суточная доза левозимендана или его активного метаболита (II) у человека находится в диапазоне от примерно 0,05 до примерно 10 мг. Для длительной профилактики тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств у человека, в целом предпочтительны относительно низкие оральные дозы, например, оральная суточная доза от примерно 0,05 до примерно 5 мг, предпочтительно, от примерно 0,1 до примерно 4 мг, предпочтительнее, от примерно 0,2 до примерно 3 мг.
Левозимендан можно вводить внутривенным вливанием с использованием скорости вливания от примерно 0,01 до примерно 5 мкг/кг/мин, обычно, от примерно 0,02 до примерно 3 мкг/кг/мин. Активный метаболит (II) можно вводить внутривенным вливанием с использованием скорости вливания, которая составляет от примерно 0,001 до примерно 1 мкг/кг/мин, предпочтительно, от примерно 0,005 до примерно 0,5 мкг/кг/мин.
Активный ингредиент по изобретению можно вводить ежедневно или несколько раз в день или периодически, например, 1 раз/нед или 2 раза/нед. В зависимости от потребностей пациента.
Для профилактики тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств особенно предпочтительно оральное введение. Особенно предпочтительным активным ингредиентом является левозимендан или его фармацевтически приемлемая соль.
Левозимендан или его активный метаболит (II) составляют в лекарственные формы, подходящие для профилактики
тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств с использованием принципов, известных в данной области. Его вводят пациенту в чистом виде или, предпочтительно, в комбинации с подходящими фармацевтическими эксципиентами в форме таблеток, гранул, капсул, суппозиториев, эмульсий, суспензий или растворов, причем содержание активного соединения в препаративной форме составляет примерно от 0,1 до 100% масс. Выбор подходящих ингредиентов для композиции представляет собой обычную процедуру для средних специалистов в данной области.
Очевидно, что можно также использовать подходящие носители, растворители, желатинизирующие ингредиенты, диспергирующие ингредиенты, антиоксиданты, красители, подслащивающие агенты, смачивающие соединения, компоненты, регулирующие высвобождение, и другие ингредиенты, обычно используемые в данной области технологии.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, лекарственная форма содержит левозимендан или его активный метаболит (II) в качестве единственного активного агента, предпочтительно, с инструкциями в упаковке, для применения лекарственного средства в профилактике тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств, в частности, в профилактике кровоизлияния или тромботической или эмболической окклюзии кровеносного сосуда.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, лекарственная форма содержит левозимендан или его активный метаболит (II) вместе с любым другим активным ингредиентом, который можно применять в профилактике тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств.
Для орального введения в виде таблетки, подходящие носители и эксципиенты включают, например, лактозу, кукурузный крахмал, стеарат магния, фосфат кальция и тальк. Для орального введения в форме капсулы, полезные носители и эксципиенты включают, например, лактозу, кукурузный крахмал, стеарат магния и тальк. Для оральных композиций с контролируемым высвобождением можно использовать компоненты, регулирующие высвобождение. Типичные компоненты, регулирующие высвобождение, включают гидрофильные полимеры, формирующие гель, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза,
карбоксиметилцеллюлоза, альгиновая кислота или их смеси; растительные жиры и масла, включая растительные твердые масла, такие как гидрированное соевое масло, отвердевшее касторовое масло или масло касторовых семян (продаваемое под торговым названием Cutina HR), масло семян хлопка (продаваемое под торговыми названиями Sterotex или Lubritab) или их смесь; сложные эфиры жирных кислот, такие как триглицериды насыщенных
жирных кислот или их смеси, например, глицерилтристеараты, глицерилпальмитаты, глицерилтримиристаты, глицерилтрибегенаты (продаваемые под торговым названием Compritol) и сложный эфир глицерилпальмитостеариновой кислоты.
Таблетки можно получить смешиванием активного ингредиента с носителями и эксципиентами и прессованием порошковой смеси в таблетки. Капсулы можно получить смешиванием активного ингредиента с носителями и эксципиентами и помещением порошковой смеси в капсулы, например, твердые желатиновые капсулы. Обычно таблетка или капсула включает примерно от 0,05 до 10 мг, обычнее, примерно от 0,2 до 4 мг левозимендана или его активного метаболита (II).
Препаративные формы, подходящие для внутривенного введения, такие как препаративная форма для инъекции или вливания, включают стерильные изотонические растворы левозимендана или его активного метаболита (II) и носитель, предпочтительно, водные растворы. Обычно раствор для внутривенного вливания включает примерно от 0,01 до 0,1 мг/мл левозимендана или его активного метаболита (II).
Соли левозимендана или его активного метаболита (II) можно получить известными способами. Фармацевтически приемлемые соли можно применять в качестве активных лекарственных средств, однако, предпочтительные соли представляют собой соли с щелочными или щелочноземельными металлами.
Фармацевтические примеры
Пример 1. Оральная капсула
Твердая желатиновая капсула размера 3
Фармацевтический препарат в форме капсулы получают смешиванием левозимендана с лактозой и помещением порошковой смеси в твердую желатиновую капсулу.
Пример 2. Концентрат раствора для внутривенного вливания
Левозимендан 2,0 мг
Лактоза 198 мг
(а) левозимендан 2,5 мг/мл
(b) Kollidon PF12 10 мг/мл
(c) лимонная кислота 2 мг/мл
(d) дегидрированный этанол До 1 мл (785 мг) Концентрат раствора получают растворением лимонной
кислоты, Kollidon PF12 и левозимендана в дегидрированном этаноле в стерилизованном сосуде для приготовления в условиях перемешивания. Полученное основное количество раствора фильтруют через стерилизационный фильтр (0,22 мкм). Затем основное количество стерильного фильтрованного в асептических условиях раствора заливают в инъекционные флакончики емкостью 8 мл и 10 мм (при объемах заполнения 5 мл и 10 мл) и закрывают резиновыми пробками.
Перед использованием концентрат раствора для внутривенного вливания разбавляют водным носителем. Обычно концентрат раствора разбавляют водным изотоническим носителем, таким как 5% раствор глюкозы или 0,9% раствор NaCl, с тем, чтобы получить водный внутривенный раствор, где количество левозимендана в целом находится в диапазоне примерно от 0,001 до 1,0 мг/мл, предпочтительно, примерно от 0,01 до 0,1 мг/мл.
Эксперименты
Эксперимент 1. Воздействия на смертность на модели крыс, чувствительных к соли
Исследовали воздействие левозимендана на смертность на ранней стадии гипертонии у чувствительных к соли крыс линии Dahl. У чувствительных к соли крыс линии Dahl, получавших рацион с высоким содержанием соли, развилась гипертония и увеличилась смертность. На ранних стадиях гипертонии смертность почти полностью вызвана инсультом и внезапной смертью (см. Qu, P. et al., Hypertens. Res., 2000; 23:613-623).
6-недельные самцы чувствительных к соли крыс линии Dahl (SS/JrHsd) получали следующий рацион и медикаментозную схему в течение 7 нед: 1) Контроли Dahl SS, получавшие рацион с высоким содержанием соли, 2) Крысы Dahl SS, получавшие рацион с высоким содержанием соли, + высокую дозу левозимендана (10 мг/л левозимендана в питьевой воде), 3) Крысы Dahl SS, получавшие рацион с высоким содержанием соли, + низкую дозу левозимендана (1 мг/л левозимендана в питьевой воде), и 4) Контроли Dahl SS,
получавшие рацион с низким содержанием соли. Рацион с высоким содержанием соли получали добавлением NaCl в имеющийся в продаже рацион с низким содержанием соли.
Результаты изучения ранней выживаемости показаны на фиг.1 в виде графика Kaplan-Meier. Только 38% (9/24) крыс, получавших рацион с высоким содержанием соли, выжили в течение 7-недельного периода наблюдения. Ни одна из крыс из группы низкой дозы левозимендана (п=12) не умерла, и только 3 из 12 крыс умерли в группе высокой дозы левозимендана. Таким образом, левозимендан значительно снизил смертность чувствительных к соли крыс на ранних стадиях гипертонии, свидетельствуя о благоприятном эффекте левозимендана на связанную с инсультом смертность.
Эксперимент 2. Воздействия на частоту инсульта на модели крыс, чувствительных к соли
Исследовали воздействие левозимендана на частоту церебрального инсульта на модели инсульта у чувствительных к соли крыс линии Gahl с использованием магнитно-резонансной визуализации (MRI) и поведенческих тестов (балльная оценка Neuroscore и Арсенала Функционального наблюдения (FOB)).
Крыс линии Gahl делили на 3 группы лечения: рацион с высоким содержанием соли + носитель (п=20), рацион с высоким содержанием соли + левозимендан 1 мг/кг/д (п=20), и контроль рациона с нормальным содержанием соли (п=4). Рацион с высоким содержанием соли содержал 7% NaCl в имеющемся в продаже рационе с низким содержанием соли. Кормление рационом с высоким содержанием соли начинали в возрасте 6 нед и продолжали 7 нед до конца исследования. Левозимендан вводили через питьевую воду (2 мг/л левозимендана в питьевой воде). Введение начинали в то же самое время, что и кормление рационом с высоким содержанием соли, и продолжали до конца исследования. Контролировали потребление питьевой воды и пищи, а также массу тела и общее состояние здоровья животных. MRI выполняли 1 раз/нед в течение
2- ой-8-ой нед. Тестирование с использованием FOB и 7-точечной балльной оценки Neuroscore выполняли 1 раз/нед в течение 1-ой-
3- ей нед и дважды/нед в течение 4-ой-8-ой нед.
Смертность:
Все животные, которым скармливали контрольный рацион, выжили до конца исследования. Только одно животное (5%) в группе левозимендана умерло в течение исследования, тогда как в группе носителя смертность в конце исследования достигла 70%.
MRI in vivo:
Диффузионную и Т2-взвешенную MRI с использованием консоля Varian Inova, сопряженного с горизонтальным магнитом 4,7 Т (Magnex Scientidic Ltd.), выполняли 1 раз/нед у крыс, наркотизированных галотаном. Т2-взвешенную визуализацию и количественную диффузионную визуализацию использовали для определения размера поражения и для характеристики вероятных ишемических поражений крыс Dahl SS. Типичные поражения были неоднородными и состояли из нескольких различных областей с различными MRI характеристиками. Повышенная интенсивность при Т2-взвешенной визуализации была обнаружена практически у всех животных с выявляемыми аномалиями. Это можно интерпретировать как отечную ткань, которая типична для ишемической ткани и в целом может выявляться, начиная приблизительно через 12-24 ч после окклюзии питающего сосуда. Кроме того, у большинства из животных с ишемией проявлялись локальные зоны отсутствия сигнала внутри области гиперинтенсивного поражения. В высоком магнитном поле (4,7 Т) , использованном в этом исследовании, любое ферромагнитное вещество вызывает локальное прерывание однородности магнитного поля, которое нарушает сигнал при Т2-взвешенной визуализации. Это представляет собой характерный MRI признак кровоизлияния, поскольку гемоглобин в крови содержит Fe. Таким образом, почти все поражения, выявленные в этом исследовании, можно характеризовать как связанные с кровоизлиянием.
У животных, получавших носитель, частота инсультов была выше, и объемы инсульта были больше, по сравнению с группой, получавшей левозимендан. На 6-ой нед исследования более чем у 50% животных, получавших носитель, были заметные Т2-взвешенные MRI изменения, тогда как в это время изменения в группе лечения левозименданом не наблюдались. При последнем MRI измерении
изменения Т2-взвешенных MRI наблюдали левозимендан животных и у 85% животных, (табл.1). Аббревиатуры: LS, левозимендан. Таблица 1. Объемы Т2 поражения (мм3)
неделя
контроль
1 о
1 100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
95%
100%
95%
100%
100%
90%
89%
1-60
51-100
10%
> 200
носитель
100%
100%
100%
100%
53%
33%
14%
1-50
20%
17%
14%
51-100
25%
14%
101-200
13%
> 200
17%
57%
MRI ex vivo:
Для визуализации ex-vivo мозг после смерти удаляли из черепа и погружали в 4% формалин на 4 8 ч, и затем хранили в 0,1 М PBS (солевом растворе с фосфатным буфером). Мозг заливали в перфторполиэфир, и MRI выполняли в магните 9,4 Т (Oxford), сопряженного с SMIS-консолем. Интерпретацию гиперинтенсивности и областей отсутствия сигнала проводили в соответствии с таковой для исследований in vivo. В исследованиях ex vivo можно было выявить только зрелые поражения со значительным отеком и разрушенной тканевой структурой. Исходный Т2 контраст, который можно выявить in vivo, может быть невидимым в исследованиях ех vivo. Данные исследований ex vivo подтверждают мысль о том, что большинство ишемических поражений были связаны с кровоизлиянием. MRI ex vivo также выявил, что у животных, получавших носитель, была более высокая частота инсультов и большие объемы инсульта, по сравнению с группой, получавшей лечение левозименданом (табл.2).
Аббревиатуры: LS, левозимендан.
у 10% получавших получавших носитель
Таблица 2. Частота Т2 изменений
контроль
100%
80%
1-50
20%
51-100
> 2€Ю
носитель
10%
1-50
60%
51-100
20%
101-200
10%
> 200
Поведенческое тестирование:
Тестирование с использованием (FOB) и балльной оценки Neuroscore выполняли 1 раз/нед в течение 1-ой-З-ей нед и дважды/нед в течение 4-ой-8-ой нед.
а) Балльная оценка Neuroscore
Семиточечную балльную оценку Neuroscore использовали для оценки двигательных и поведенческих дефицитов (модифицировано по Zauslnger et al. Brain Res. 863:94-105, 2000). Неврологический тест проводил исследователь, не знавший о статусе лечения крыс. Семиточечная шкала была следующей:
Степень 6: Нормальное вытягивание обеих передних конечностей в направлении к полу при осторожном подъеме за хвост.
Степень 5: Согласованное сгибание каждой из передних конечностей, варьирующееся от небольшого сгибания в запястном суставе и приведения плеча до крайнего расположения с полным сгибанием в запястном суставе, локтевом суставе и приведения с внутренним вращением плеча при осторожном подъеме за хвост.
Степень 4: Согласованно сниженная устойчивость к боковому толчку в обе стороны.
Степень 3: Вращение в обе стороны при потягивании и подъеме за хвост.
Степень 2: Вращение в обе стороны при потягивании за хвост.
Степень 1: Спонтанное вращение в обе стороны. Степень 0: Отсутствие спонтанных движений. Результаты:
Контрольные животные, а также животные, которым скармливали левозимендан, давали максимальные балльные оценки в течение всего исследования, тогда как балльные оценки в группе носителя начали уменьшаться, начиная с 5-ой нед исследования.
b) FOB:
Всех крыс наблюдали, используя стандартизированные процедуры. Эти процедуры включали наблюдение за крысами в клетке содержания, во время движения в открытой арене и посредством манипуляционных тестов. Показатели включали:
(1) Измерения в клетках содержания:
Положение тела, дыхание, вокализация и закрытие век.
(2) Наблюдения при удерживании рукой:
Реактивность при подъеме, манипулирование, слезотечение, слюнотечение, пилоэрекция и другие (сброс шерсти, метки укусов, отсутствующие когти, потеря массы тела и т.д.).
(3) Активность в новой среде/открытом поле:
Количество подъемов на задние лапы I (крыса не использует передние конечности), количество подъемов на задние лапы II (крыса упирается в стену), клоническое, непроизвольное движение, тоническое непроизвольное движение, походка, активность, возбуждение, возникновение стереотипных движений, аномальное поведение, количество дефекаций и количество мочеиспусканий.
(4) Реакция на стимул:
Реакция на приближение, реакция на прикосновение, рефлекс глазных век, рефлекс ушных раковин, реакция на звук и реакция на сдавливание хвоста.
(5) Нервные и мышечные показатели:
Аномальный тонус, тонус конечности и сила сжатия.
(6) Ректальная температура тела:
(7) Дополнительные данные:
Цвет глаз, секреция слизи дыхательных путей и периферическое кровообращение (уши, пальцы лап, хвост, нос).
Результаты:
Было обнаружено, что левозимендан значительно уменьшает и отсрочивает развитие связанных с инсультом поведенческих дефицитов, наблюдаемых при тестировании FOB.
Подводя итог, данный эксперимент показывает, что левозимендан снижает и/или отсрочивает смертность, возникновение и объем поражений мозга и поведенческие расстройства, связанные с церебральным инсультом у крыс Dahl SS, когда лечение начинается профилактически.
Эксперимент 3. Воздействие на экспрессию кининогена
Метод
Крысам орально вводили 20 мг/л левозимендана в водопроводной воде, а контролям давали только водопроводную воду в течение 8 д. Сердца замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Сердечную ткань лиофилизировали на льду в течение ночи и инкубировали в лизисном буфере;. 9 М мочевины, 20 мМ Tris-HCl рН 7,4, 50 мМ КС1, 3 мМ ЭДТА рН 7,5, 0,5% буфера IPG 3-10NL, 5мМ PMSF, 1% DTT и бензоаза 100 Единиц в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем белковый раствор обрабатывали ультразвуком 2x15 с и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочные жидкости собирали, и количество белка измеряли на основании набора для анализа белка от BioEad. 40 мкг белкового раствора разбавляли в 350 мкл регидрационного буфера; 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 2 мМ ТВР, 0,5% буфера IPG 3-10 NL, 4% CHAPS и 0,2% BFB, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 14000 об/мин.
350 мкл надосадочной жидкости наносили на полоску IPG 18 см, рН 3-10 NL (Amersham Pharmacia Biotech), и полоски помещали в держатели полосок. 600 мкл парафинового масла наносили поверх каждой полоски, и полоски затем обрабатывали на электрофоретическом блоке 1РСфор в соответствии со следующей программой:
0 в 7 ч,
20 в 7 ч,
100 в 5 ч,
500 в 1 ч, 1000 в 1 ч, 3000 в 1 ч, 8000 в 5,5 ч
Сфокусированные полоски уравновешивали в следующем буфере: 6 М мочевина, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,8, 2% SDS, 30% глицерин, 2% DTT, 2,5% йодацетамид и 0,2% BFB 2x10 мин при комнатной температуре. Затем полоски наносили на 11% SDS-PAGE и покрывали 0,75% агарозой, и обрабатывают при 4°С 100 В в течение 4 ч. Гели SDS-PAGE окрашивали серебряным окрашиванием, в соответствии с имеющимся в продаже набором (PlusOne) от Amersham Pharmacia Biotech. После окрашивания гели сканировали визуализирующим денситометром (откалиброванным визуализирующим денситометром GS-710, Biorad). Окрашенные серебром гели анализировали программным обеспечением PD-QUEST(6.2)2-DE (BIORAD) . После выявления белкового пятна и обработки геля, по 6 гелям конструировали комплект подбора: 3 повтора сердец после введения левозимендана и 3 контроля. Анализ геля проводили сравнением образца левозимендана с контролем. Двукратное различие O.D. (оптической плотности) использовали в качестве пороговой величины для дифференциальной экспрессии белка.
На основании анализа PD-QUEST, окрашенные белковые пятна отсекали от геля, и окрашенные серебром гелевые срезы хранили при -20°С. Переваривание белка для масс-фингерпринтинга проводили в соответствии с процедурой переваривания в геле (Rosefeld, J. et al., Anal. Biochem., 203:173-179, 1992). Перед перевариванием белок восстанавливали и алкилировали. Белки переваривали 2 мкл раствора модифицированного трипсина в концентрации 0,04 мкг/мкл (Sequencing Grade Modified Trypsin, свиной, Promega).
Все образцы получали пипеточными наконечниками обращенной фазы (ZipTip, Millipore). Образец 3 мкл элюировали в а-циано-4-гидроксициннамовой кислоте, разбавленной в 50% ацетонитриле и 0,1% трифторуксусной кислоте, и образец наносили на пластинку для образцов MALDI-TOF. Образцы анализировали в масс-спектрометре TOF (Voyager-DE PRO). Масс анализ завершали
режимом положительной ионизации, и диапазон массы для расчета материнской массы "времени полета" охватывал от 500 до 3500 МГц. Массы полученных пептидов анализировали программой подгонки масс спектров на сервере Peptident Expasy Molecular Biology.
Результаты
Экстракты сердец из групп левозимендана/контроля анализировали на гелях 2-DE, и на основании анализа окрашивания серебром было получено всего примерно 1500 пятен. Десятикратная стимулированная экспрессия белка наблюдалась для белка, который соответствовал цепи 1: Kininogen-Rattus novergicus pi 6.22 с молекулярной массой 68,9 кДа с идентификационным номером Р08934.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей для изготовления лекарственного средства для предотвращения тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств.
2. Применение по п.1, где подлежащее предотвращению расстройство представляет собой церебральное тромботическое, эмболическое и/или геморрагическое расстройство.
3. Применение по п. 2, где церебральное тромботическое, эмболическое и/или геморрагическое расстройство представляет собой инфаркт мозга (инсульт), транзиторный ишемический приступ, внутримозговое кровоизлияние, субарахноидальное кровоизлияние (SAH) или сосудистую деменцию.
4. Применение по п.1, где подлежащее предотвращению расстройство представляет собой тромботическое, эмболическое и/или геморрагическое расстройство сердца.
5. Применение по п. 4, где тромботическое, эмболическое и/или геморрагическое расстройство сердца представляет собой инфаркт миокарда, острый коронарный синдром или нестабильную стенокардию.
6. Применение по п.1, где подлежащее предотвращению расстройство представляет собой инфаркт легких или почек, периферические циркуляторные расстройства и тромбоз глубоких вен.
7. Применение левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей для изготовления лекарственного средства для снижения риска кровоизлияния или тромботической или эмболической окклюзии кровеносного сосуда у млекопитающего, имеющего высокий риск такого кровоизлияния или окклюзии.
8. Способ предотвращения тромботических, эмболических и/или геморрагических расстройств у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в таком предотвращении млекопитающему эффективного количества левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей.
9. Способ снижения риска тромботических, эмболических
и/или геморрагических состояний у млекопитающего, имеющего высокий риск таких состояний, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества левозимендана или его метаболита (II) или любой из их фармацевтически приемлемых солей.
По доверенности
1/1
140145ЕА
ГРАФИК KAPLAN-MEIER
100908070605040302010-
"Т" 10 20
1^ 40
Dahl LS
Dahl HS + levo 1 Dahl HS + levo 10
Dahl HS
"1 50
ВРЕМЯ ДО ВОЗНИКНОВЕНИЯ СОСТОЯНИЯ (ДНИ)
Фиг.1