Противомикробная композиция, содержащая биологически стабилизированные наночастицы серебра, стабилизированные с использованием "зеленого" биологического пути, со средним размером 1-100 нм в носителе, концентрация в котором составляет от 1 до 6 частей на миллион.

 

(57) Реферат / Формула:
композиция, содержащая биологически стабилизированные наночастицы серебра, стабилизированные с использованием "зеленого" биологического пути, со средним размером 1-100 нм в носителе, концентрация в котором составляет от 1 до 6 частей на миллион.

 

---

2420-141065ЕА/012 ПРОТИВОМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ
НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА
Данное изобретение относится к противомикробным композициям.
В соответствии с данным изобретением рассматривается противомикробная композиция, содержащая серебро. Предпосылки создания изобретения
Полезность серебра в качестве противомикробного агента известна на протяжении длительного времени. Цивилизации по всему миру тысячелетиями использовали серебро в качестве заживляющего и антибактериального агента. Его медицинские, защитные и восстанавливающие способности можно проследить до древних греков и Римской империи. Задолго до развития современной фармацевтики серебро использовали в качестве бактерицида и антибиотика.
Греки использовали серебряные сосуды для сохранения свежести воды и других жидкостей. Сочинения Геродота, греческого философа и историка, датируют применение серебра до Рождества Христова.
В Римской империи вино хранили в серебряных вазах для предотвращения гниения.
Применение серебра отмечено и сочинениях древней Индии и Египта.
В средние века изделия из серебра защищали состоятельных людей от высшей степени тяжести эпидемий чумы.
До появления современных бактерицидов и антибиотиков, было известно, что вызывающие заболевания патогены не выживают в присутствии серебра. Вследствие этого серебро использовали для изготовления посуды, сосудов для питья и столовой утвари.
В частности, состоятельные люди хранили и ели пищу из серебряных сосудов, чтобы предотвратить рост бактерий.
Китайские императоры и их двор ели с помощью серебряных палочек для еды.
Жрецы оставили подтверждения применения ими серебра.
Колонисты в необжитых местностях Австралии подвешивали
изделия из серебра в емкостях для воды, чтобы предотвратить ее порчу.
Пионеры, пересекавшие американский Запад на повозках, запряженных волами, установили, что если они помещали серебряные или медные монеты в бочки с питьевой водой, это предохраняло воду от размножения бактерий, водорослей и т.д.
Повсюду вдоль границы серебряные доллары помещали в молоко, чтобы сохранить его свежим.
Во время первой мировой войны в войсках листы серебра использовали для борьбы с инфекцией в длительно не заживающих ранах.
Перед введением антибиотиков в больницах широко использовали коллоидное серебро, которое было известно как бактерицид в течение по крайней мере 1200 лет.
В начале 1800-х годов врачи использовали серебряные нити для зашивания хирургических ран с весьма успешными результатами.
В аюрведической медицине серебро использовали в небольших количествах в качестве тонизирующего агента, эликсира или омолаживающего агента для пациентов, ослабленных вследствие возраста или болезни.
Незадолго до конца 1800-х г.г. ученые Востока вновь открыли, то, что было известно тысячелетиями, то есть то, что серебро представляет собой мощное средство борьбы с бактериями. Были разработаны лекарственные соединения серебра, и серебро стали в большинстве случаев использовать в качестве лекарственного средства. В начале 1900-х гг. применение серебра в качестве антибактериального вещества стало широко распространенным. К 1940 г. на рынке имелось приблизительно четыре дюжины различных соединений серебра, используемых для лечения любого известного инфекционного заболевания. Они были доступны в виде лекарственных форм для перорального, инъекционного и наружного применения. Однако такие лекарственные препараты серебра вызывали изменение цвета кожи, называемое аргирия, особенно в случае некоторых типов протеин-связанных соединений серебра и неправильно приготовленных и
нестабильных композиций.
Новые знания о химии организма привели к появлению огромного множества применений коллоидных дезинфицирующих и лекарственных средств и продолжающихся исследований способностей и возможностей для коллоидного серебра. Однако, "вновь найденная" популярность серебра в качестве превосходного средства для борьбы с инфекцией оказалась короткоживущей.
В период 1930-х гг. начали появляться синтетически изготовленные лекарственные средства, и приносимые прибыли, наряду с простотой производства данного нового источника лечения, стали мощной силой на рынке. Возникло большое возбуждение по поводу новых "чудесных лекарственных средств", и в то время не обнаруживалось устойчивых к антибиотикам штаммов организмов, вызывающих заболевания. Серебро быстро утратило свой статус по отношению к современным антибиотикам.
В господствующих тенденциях медицины сохранило жизнеспособность применение некоторых препаратов серебра. Среди них применение разбавленного нитрата серебра для защиты глаз новорожденных от инфекции и применение "сильвадина", мази на основе серебра, в ожоговых отделениях для уничтожения инфекции. Перевязочные материалы на основе серебра также были одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (США) и разрешены к продаже. Другие применения, к которым не утерян интерес, включают
Серебряные фильтры для очистки воды и таблетки используют для предотвращения роста водорослей и бактерий
- Устройства электрической ионизации, которые вводят в воду ионы серебра и меди, используют для дезинфекции воды в бассейнах без раздражающего воздействия хлора.
- Серебро используется для стерилизации рециркулируемой воды на космических кораблях.
- В Швейцарии серебряные фильтры используются дома и в офисах.
Городские власти используют серебро для обработки сточных вод
Серебро является популярным агентом для борьбы с
токсинами, переносимыми воздушным путем, а также другими промышленными ядами.
Но в целом, с открытием фармацевтических антибиотиков интерес к серебру в качестве противомикробного агента снизился почти до точки исчезновения.
В результате выдающейся работы Др. Марграфа, который установил, что применение разбгшленного до 5 процентного раствора нитрата серебра убивает инвазивные бактерии при ожогах и способствует заживлению ран, серебро опять возникло в качестве вспомогательной добавки при лечении антибиотиками. Важно, что не появились устойчивые штаммы. Нитрат серебра широко использовался в 1960-е годы для лечения жертв ожогов Мойера. Но нитрат серебра был далек от идеала. В конечном счете, он не рассматривался в качестве идеального противомикробного агента вследствие многих осложнений, таких как нейтрализация ионов Ад+ анионами С1~, НСОз- и белков в жидкостях организма (снижая тем самым его бактерицидную активность) и развитие косметических аномалий, то есть аргирии, вызываемой осаждением солей серебра на коже, что вызывает серо-голубое окрашивание.
Был разработан сульфадиазин серебра (Сильваден, Marion Laboratories), который в настоящее время используется в 70 процентах ожоговых центров. Открытый Др. Чарльзом Фоксом в Колумбийском университете, сульфадиазин также оказался удачным для лечения холеры, малярии и сифилиса. Он также останавливает вирус герпеса, который отвечает за появление герпесной лихорадки, опоясывающего лишая и заболеваний.
Благодаря исследованиям, показавшим превосходные
характеристики коллоидного серебра в борьбе с микробами, оно привлекло внимание ведущих ученых и исследователей-медиков по всему миру. Его преимущества стимулируют в настоящий момент новый интерес, поскольку 50 знаменитых врачей в настоящее время исследуют эффективность и применения коллоидного серебра для здоровья человека. В результате появилось много интересных исследований.
В соответствии с мнением экспертов, ни один из
протестированных когда-либо микроорганизмов не был способен выживать дольше шести минут при непосредственном воздействии коллоидного серебра.
Science Digest упоминает коллоидное серебро как "...чудо современной медицины" и далее указывает: "Антибиотики убивают возможно полдюжины различных болезнетворных микроорганизмов, но серебро убивает около 650. Резистентные штаммы не развиваются. Более того, серебро в сущности нетоксично. Коллоидное серебро, используемое в качестве противомикробного агента, не будет создавать сверхмикробов, как это делают антибиотики". Alfred Searle, основатель гиганта Searle Pharmaceuticals (теперь Monsanto) указывал: "Применение коллоидного серебра на людях было проведено для большого числа случаев при удивительно успешных результатах. Для внутреннего введения оно имеет то преимущество, что быстро вызывает смерть патогенов, не оказывая токсического действия на хозяина. Оно полностью стабильно." Дополнительная информация показывает, что коллоидное серебро не вызывает опасных взаимодействий с другими лекарственными средствами или наружным лечением. В лабораторных исследованиях коллоидного серебра оно убивало при контакте организмы бактерий, вирусов и грибов в течение нескольких минут. Larry С. Ford, доктор медицины факультета акушерства и гинекологии, UCLA Школы медицины, Центра наук о здоровье, сообщал 1 ноября 1988 г. : "Я протестировал их (растворы серебра) с использованием стандартных противомикробных тестов для дезинфицирующих средств. Растворы серебра обладали антибактериальными свойствами для концентраций растворов 105 организмов на мл в случае Streptococcus Pyogenes, Staphylococcus Aureus, Neisseria Gonorrhea, Gandnerella Vaginalis, Salmonella Typhi и других кишечных патогенов и фунгицидными для Candida Albicans, Candida Globata и M.Furfur".
Поскольку многие организмы выработали штаммы, устойчивые к действию современных антибиотиков, особый интерес представляют открытия Др. Robert Becker. Becker из университета Сиракуз утверждает: "Все организмы, которые мы протестировали, были чувствительными к генерированным электрически ионам серебра,
включая некоторые из них, которые были устойчивыми ко всем известным антибиотикам. Ни в одном из случаев не было видимого нежелательного побочного действия при лечении с использованием серебра".
Потенциал коллоидного серебра значителен, поскольку в отличие от антибиотиков, которые являются специфическими только для бактерий, коллоидное серебро выводит из строя некоторые ферменты, необходимые для анаэробных бактерий, вирусов, дрожжей и грибов, что приводит к разрушению данных ферментов. Дальнейшие указания таковы, что данные бактерии не могут выработать устойчивость к серебру, как они это делают в случае антибиотиков, поскольку серебро атакует их источник питания, а не непосредственно их самих.
Однако, в настоящее время стало понятным, что как нитрат серебра, так и сульфадиазин серебра повреждают фибробласты и пролиферацию эпителия, в конечном счете останавливая процесс заживления. Попытки найти лучшие средства от болезней на основе серебра имели ограниченный успех. Несколько интересных сообщений появилось в последние несколько лет, в которых описано применение покрытых серебром пленок при лечении ожогов. Такие пленки получали с использованием метода осаждения пара, так чтобы получить толщину около 300 нм. В одном из таких исследований пленки целенаправленно содержали химически закрытое нанокристаллическое серебро с типичным размером зерна ~50 нм. Такие пленки длительно доставляли высокие (5000-10000 мг/л) концентрации серебра, которые оказывали цитотоксическое действие. Значительная абсорбция ионов серебра через ожоговую рану могли происходить, когда пациентов обрабатывали наружными содержащими серебро препаратами. По оценке концентрация серебра в печени составляла 14 мг/г, когда использовали препараты серебра с основой крема, содержащие до 3000 мкг Ад+/г. Действие нитрата серебра на клетки фибробластов кожи человека исследовали Hidalgo et al., и было установлено, что низкая концентрация ионов серебра проявляет ингибирующее действие.
Соответственно существует необходимость в содержащем серебро препарате, который можно было бы эффективно
использовать в качестве противомикробного агента, не обладающего каким-либо цитотоксическим действием, и не содержащего каких-либо добавленных веществ, которые не являются биосовместимыми.
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в разработке противомикробной композиции, содержащей биологически
стабилизированные наночастицы серебра, которые стабилизированы с использованием "зеленого" биологического пути, со средним размером 1-100 нм, в носителе, концентрация в котором составляет от 1 до б частей на миллион.
Другая задача настоящего изобретения заключается в разработке противомикробной композиции, содержащей биологически стабилизированные наночастицы серебра, которые (а) проявляют противомикробную активность в очень низкой эффективной концентрации (благодаря чрезвычайно высокой площади поверхности) и (Ь) не являются цитотоксичными в данных концентрациях.
Положения изобретения
В соответствии с настоящим изобретением разработана противомикробная композиция, содержащая
a) биологически стабилизированные наночастицы серебра размером в диапазоне от 1 до 100 нм и
b) носитель, в котором концентрация указанных биологически стабилизированных наночастиц серебра находится в диапазоне от 1 до 6 частей на миллион.
Обычно наночастицы серебра стабилизированы биологически водным раствором мацерированных кле;ток тканей растений.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, водный раствор разбавляют деионизированной водой вплоть до десятикратного разбавления.
Обычно ткань растения представляет собой по крайней мере одну ткань растения, выбранную из группы тканей растений, которая включает листья, корни, стебли, цветы и плоды следующих растений: люцерна, акация аравийская (Acacia arabica), кориандр (Coriandrum sativum), восточно-индийский кипрей (Ervatamia
coronaria) , бергавия раскидистая (Boerhavia diffusa), индийский барбарис (Berberris aristata), бархатцы (Calendula
officinalis), петрушка (Petroselinum sativum), горец перечный (Achyranthes aspera), кассия Теннера (Cassia auriculata), лаванда, бахед (Terminalia belerica), фенхель (Fenniculum vulgare), хвощ лесной (Equisetum arvense), малина (Rubus idaeus), алоэ вера (Aloe barbadensis), желтокорень канадский (Hydrastis canadensis), чеснок (Allium sativum), Echinacea spp., очанка (Euphrasis officinalis), эгле мармеладное (Aegle marmelos), индийский тмин (Trachyspermum ammi), ромашка горькая (Matricaria chamomilla), гвоздика (Syzygium aromaticum), имбирь (Zingiber officinale), базилик священный (Ocimum sanctum), акалифа индийская (Acalypha indica), дурман (Datura innoxia), мята (Mentha spp.), листья бетеля (Piper betle, Linn), календула (Calendula officinalis LINN), звездчатка (Trichobasis lychnidearum), огурец (Cucumis sativus, Linn.), акация аравийская, олива (Olea europea L.), нивяник обыкновенный, семена тмина (Cuminum cyminum), листья карри (Murraya koengi), укроп (Anethum graveolens), индийская мальва (Abutilon indicum), мелия индийская (Azadirachta indica), мадука индийская (Madhuca indica), тамаринд (Tamarindus indicus), куркума (Curcuma longa), зимняя зишня (Withania sommnifera), унаби (Zizyphus jujuba), тыква (Cucurbita pepo, Cucurbita maxima), американская липа (Tilia americana), аир (Acorus calamus), амарант (Amaranthus, spinosa), арника (Arnica Montana), американская бузина (Sambucus Canadensis), буквица (Stachys officinalis), евгения (Eugenia jambolana), календула (Calendula officinalis LINN), ромашка обыкновенная (Matricaria chamomilla), плаун (Lycopodium selago или clavatum), одуванчик (Taraxacum officinalem) , эхинацея (Echinacea angustifolia), эвкалипт (Eucalyptus globules], желтокорень канадский (Hydrastis Canadensis), норичник, окопник лекарственный (Symphytum officinale), примула (Primula veris (L)), подлесник европейский (Sunicula europaea), зербена европейская (Verbena officinalis), мелколепестник канадский, молодило (Sempervivum tectorum,Linn), лиственница (Larix laricina), медуница
(Pulmonaria angustifolia), лук (Alium сера), папайя (Carica papaya), персиковое дерево (Prunus persica), анютины глазки (Viola tricolor (LINN.)), анафалис жемчужный (Anaphalis margaritacea).
Носитель представляет собой крем, гель, мазь, жидкость, суспензию, аэрозольный спрей, марлевую прокладку, волокнистый тампон, мембрану, пленку, ленту, пластырь.
В соответствии с другим аспектом изобретения, разработан способ получения противомикробной композиции согласно любому из предшествующих абзацев, который включает стадии:
(1) получения обычным образом носителя, выбранного из группы носителей, которая включает крем, гель, мазь, жидкость, суспензию, аэрозольный спрей, марлевую прокладку, волокнистый тампон, мембрану, пленку, ленту, пластырь, брикет;
(2) получения водной дисперсии биологически стабилизированных наночастиц серебра размером в диапазоне от 1 до 100 нм;
(3) смешивания полученного количества указанной водной дисперсии в указанном носителе с образованием гомогенной матрицы, в которой концентрация биологически стабилизированных наночастиц серебра составляет от 1 до б частей на миллион.
Водную дисперсию биологически стабилизированных наночастиц получают с использованием стадий, включающих
a) растворение соли серебра з воде, имеющей проводимость менее, чем 3 микросименса, с получением раствора, в котором концентрация ионов серебра находится в диапазоне от 20000 до 50000 частей на миллион;
b) получение свежепрофильтрованного водного раствора экстракта биологической ткани;
c) разведение водного раствора деионизированной водой в соотношении, колеблющемся от 1:5 до 1:50 с получением раствора, имеющего потенциал открытой цепи между +0,2 и +0,2 вольта и рН между 5,5 и 7,5 и общее содержание органического углерода по меньшей мере 7500 частей на миллион;
d) поддерживание указанного водного раствора в условиях непрерывного перемешивания при температуре между 20 и 30
градусами Цельсия;
e) введение небольшого количества раствора соли серебра в указанный раствор водного экстракта в условиях непрерывного перемешивания так, чтобы конечная концентрация иона металла в реакционной смеси была в диапазоне от 50 до 300 частей на миллион;
f) продолжение перемешивания в течение от 30 минут до 3 часов в условиях хорошего освещения для получения коллоидной суспензии наночастиц серебра;
д) отделение наночастиц от коллоидной суспензии с использованием известного способа, такого как
центрифугирование.
Способ получения биологически стабилизированных наночастиц серебра может быть проиллюстрирован следующим образом.
Воду собирали с использованием системы очистки воды Labconco, США, имеющей предварительный фильтр, угольный фильтр и обратную осмотическую мембрану. Указанная вода имела проводимость 2,7 микросименса, в соответствии с измерением с помощью он-лайн цифрового измерителя, встроенного в прибор.
50 цельных цветков Hibiscus rosasinensis Linn (4 8,37 грамм сырого веса) вымачивали в 150 мл деионизированной воды в блендере (500 об/мин) в течение 10 минут, получая гомогенную вязкую суспензию. Данную вязкую суспензию фильтровали через бумажный фильтр Whatman №1 в вакууме, получая 165 мл прозрачного вязкого раствора. Аликвоту данного раствора, равную 10 мл, разводили водой до 100 мл.
Удаляли аликвоту, равную 7 мл, и контролировали потенциал открытой цепи при 25°С на электрохимическом анализаторе (СН Instruments 600В, США) с использованием трехэлектродной системы. В качестве электрода сравнения использовали Ag/AgCl(водн.), стеклянный углеродный электрод (диаметр 3 мм) в качестве рабочего электрода и Pt проволоку (длина 4 см) в качестве противоэлектрода. Найденное значение составляло +0,15 вольта. Аналогично контролировали рН свободно текущего раствора с использованием цифрового рН-метра (control Dynamics, Индия),
которое составляло, как было найдено, 5,6.
С использованием анализатора Beckman ТОС была измерена концентрация общего органического углерода, которая составляла, как было установлено, 22180 частей на миллион.
Синтез наночастиц серебра проводили методом восстановления боргидридом, как описано Jin. R, Cao. Y. W., Kelly К. L. , Schatz G. С., Zheng, J. G. и Chad A. Mirkin. (2001). Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms. Science: 294; 1901-1903. Кратко, 1Э мл водного экстракта цветов подвергали взаимодействию со 100 мкл исходного раствора нитрата серебра (100 нМ) с последующим добавлением 100 мкл боргидрида натрия (500 мМ) , что приводило к образованию коллоидной суспензии.
Образец коллоидной суспензии сканировали в диапазоне от 200 до 800 нм с использованием спектрофотометра с диодной матрицей (Ocean Optics, США) . Обнаруживали пик при 410 нм. Данный пик представлял собой характеристичный плазмонный пик для наночастиц серебра (фиг.1 в прилагаемых фигурах), обычно имеющий средний диаметр 5-120 нм.
Другую аликвоту коллоидной суспензии исследовали методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) при 200 кВ с использованием электронного микроскопа Philips, оборудованного полевой эмиссионной пушкой, т.е. СМ200 FEG. Образец ТЕМ получали, капая из пипетки 2 мкл коллоидного раствора на покрытую углем медную сетку и получая изображение. Средний размер, видимый на изображении, составлял 10-20 нм [фиг.2 прилагаемых рисунков].
Атомное силовое микроскопическое исследование образца проводили с использованием головки AFM Nanonics MultiView с Е сканером (Nanonics Imaging Ltd., Иерусалим, Израиль). Образец сканировали в неконтактном методе с зондом радиусом 20 нм и при резонансной частоте 80 КГц. Изображения. AFM фиксировали, обрабатывали и анализировали с использованием программного обеспечения QUARTZ, версия 1.00 (Cavendish Instruments Ltd., Великобритания). Для исследования 5 мкл образца помещали на предметное стекло 1 см2 (толщина 0,5 мм) и сушили в ламинарном
токе воздуха перед получением изображения. Наблюдали однородные частицы диаметром 50-100 нм и высотой 125 нм, как видно на фиг.За прилагаемых рисунков, которые представляют собой трехмерный AFM вид части образца, тогда как ЗЬ представляет собой двухмерный вид, показывающий анализ размера типичной частицы.
Оценка противомикробной активности
С целью оценки композиции получали следующим образом: Жидкая суспензия
Полученную, как указано выше суспензию наночастиц серебра разбавляли деионизированной водой в отдельных емкостях, в которых измеренная концентрация биологически стабилизированных наночастиц серебра находилась в диапазоне от 2,56 до 6 частей на миллион.
Мазь на кремовой основе
Жидкий парафин (400 мл) смешивали с оксидом цинка (25 г) и глицерином (25 г), получая гомогенную смесь. Воск (950 г), специальный воск (50 г) и стеариновую кислоту (11 г) нагревали на водяной бане при 100°С с образованием гомогенной жидкой смеси. Жидкую парафиновую смесь медленно выливали в смесь воска и интенсивно перемешивали, получая гомогенную массу. Лиофилизованный порошок биологически стабилизированных наночастиц серебра (5 мг) медленно и при непрерывном перемешивании вводили в массу, получая гомогенный крем, содержащий наночастицы серебра.
Куски марли
Стерилизованные куски марли пропитывали суспензией или мазью биологически стабилизированных наночастиц серебра, полученных, как указано выше.
Противомикробные возможности биологически
стабилизированных наночастиц серебра оценивали на основании следующих способов и тестов.
Микроорганизмы. В данном исследовании использовали следующие штаммы бактерий: Escherichia coli АТСС 117, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Salmonella abony NCTC 6017,
Salmonella typhimurium АТСС 23564, Klebsiella aerogenes ATCC 1950, Proteus vulgaris NCBI 4157, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus subtilis ATCC 6633 и Candida albicans (дрожжи).
Тестирование восприимчивости. Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) биологически стабилизированных наночастиц серебра для вышеуказанных штаммов определяли в соответствии с рекомендациями Национального комитета клинических лабораторных стандартов (NCCLS) в девяносто шести луночных микротитровальных планшетах, содержащих 200 мкл бульона МН. Концентрация серебра в лунках колебалась от 1,56 до 25 мкг/мл. Клеточные суспензии в логарифмическом масштабе разводили физиологическим раствором и инокулировали в лунки, получая конечную концентрацию инокуляции 1х105 колониеобразующих единиц/мл.. Микротитровальные планшеты инкубировали при 37°С и обследовали визуально с точки зрения наличия/отсутствия роста через 24 часа. Наименьшую концентрацию серебра, ингибирующую рост, регистрировали как минимальную ингибирующую концентрацию (MIC). Среду из лунок, где не наблюдался видимый рост, инокулировали в виде пятна на агаровые планшеты МН и инкубировали планшеты в течение 24 часов для определения минимальной концентрации серебра, которая является бактерицидной (МВС).
Результаты представлены на фиг.4 [Таблица 1] прилагаемых рисунков. Результаты показывают, что величины MIC для грам-положительных и грам-отрицательных бактерий колеблются в диапазоне от 1,56 до 3,12 частей на миллион биологически стабилизированных наночастиц серебра, тогда как величины МВС колеблются в диапазоне от 6,25 до 12,5 частей на миллион биологически стабилизированных наночастиц серебра. Величина MIC для дрожжей составляет 12,5 частей на миллион, а МВС равна 50, что показывает, что при выбранной концентрации значительно действия на дрожжи не имеется.
Влияние нейтрализующих агентов на биологически стабилизированные наночастицы серебра. Нейтрализацию активности биологически стабилизированных наночастиц серебра в присутствии сывороточного альбумина, хлорида натрия и тиогликолята натрия
исследовали в МНВ. Для этой цели для одного набора для опытов МНВ дополняли тремя разными концентрациями сывороточного альбумина (2%, 5%, 10%) наряду с 0,85% хлорида натрия, в другом наборе опытов добавляли 0,1%, 0,5% и 1% тиогликолята натрия, как предложено Furr et al (1994). MIC определяли, как описано выше.
Было установлено, что величины MIC остаются неизменными в присутствии вышеуказанных нейтрализующих агентов.
Кинетика время-подавление. Бактериальные культуры инокулировали (конечная плотность клеток 1x105
колониеобразующих единиц/мл) в 2 мл бульона МН, дополненного подходящими количествами биологически стабилизированных наночастиц серебра (в концентрации, соответствующей МВС для соответствующих культур). После воздействия биологически стабилизированных наночастиц серебра в течение определенных интервалов времени (примерно 0, 30, 60, 90 и 120 минут) 0,1 мл образца удаляли, серийно разводили и помещали на агаровые планшеты МН. Общее выжившее число (TVC) определяли после инкубирования планшетов при 37°С в течение 24 часов. Все эксперименты проводили в четырех повторностях. Конструировали кривые подавления путем графического изображения 1одю КОЕ/мл относительно времени. Данные кривые подавления показаны на фиг.5 прилагаемых рисунков.
Для всех протестированных бактериальных культур общая выжившая популяция клеток уменьшалась на 90% при коротком времени воздействия, составляющем 2 часа. Данные позволяют предположить, что биологически стабилизированные наночастицы серебра эффективно ингибируют рост грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, включая устойчивый к множеству лекарственных средств штамм Pseudomonas aeruginosa.
Пост-действие биологически стабилизированных наночастиц серебра. Пост-действие наночастиц серебра исследовали с использованием спектрофотометрического метода. Кратко, все бактериальные штаммы (105 КОЕ/мл) подвергали воздействию 4хМВС биологически стабилизированных наночастиц серебра в течение 1
часа при 37°С. В качестве контроля в данном эксперименте служили культуры, не подвергавшиеся воздействию биологически стабилизированных наночастиц серебра. Суспензии
центрифугировали при ЗОООхд в течение 10 минут и осадок клеток промывали несколько раз физиологическим раствором для удаления каких либо следов наночастиц серебра. Подсчет колоний проводили в момент времени ноль (Ninic) и после удаления биологически стабилизированных наночастиц серебра (NHaHocepe6po) • Осадок культур затем суспендировали в МНВ и рост культур контролировали периодически по измерению ОП при 660 нм. Все культуры инкубировали при 37°С при встряхивании и ОП измеряли через каждый 1 час. Пост-действие биологически стабилизированных наночастиц серебра рассчитывали как разницу во времени, требуемом для достижения увеличения в КОЕ на единицу в логарифмической шкале в тестируемых культурах подвергнутых воздействию биологически стабилизированных наночастиц серебра и в отсутствие воздействия.
Расчет пост-действия биологически стабилизированных наночастиц серебра
После определения Ninic и NHaHocepe6po и
спектрофотометрического контролирования роста контроля и культур, подвергнутых воздействию, проводили следующие стадии, (i) Построение графика в полулогарифмической шкале спектрофотометрического роста кривых контроля и культур после воздействия, представления оптической плотности (ОП) вдоль оси у и времени относительно оси х, обычно первое значимое значение ОП можно регистрировать для контрольной культуры через 4 или 5 часов после первоначального момента времени (tiniC=0) . (ii) Определение времени образования (tg) из кривых
спектрофотометрического роста. (iii) Расчет бактерицидного действия (г).
Г-Ninic / ^наносеребро
(iv) Графическое определение времени отделения спектрофотометрического роста кривых контрольных культур и культур после воздействия (tsep) . (v) Расчет пост-действия
биологически стабилизированных наночастиц серебра был сделан согласно следующей формуле:
пост-действие биологически стабилизированных наночастиц серебра= tsep-texpo-tg log r/log2
где tsep представляет собой время отделения спектрофотометрических кривых роста контрольных культур и культур после воздействия; texpo представляет собой время, эквивалентное 1 ч продолжительности, и treCpt представляет собой теоретическое время, которое требуется обработанной культуре для подсчета ее выживаемости (Nanti) , чтобы стать равной первоначальному счету (NiniC) , г представляет собой бактерицидное действие, и tg представляет собой время образования. На фиг.6а и 6Ь прилагаемых рисунков показано постдействие биологически стабилизированных наночастиц серебра на культуру грам-отрицательных бактерий и дрожжи, соответственно. Установлено, что пост-действие биологически стабилизированных наночастиц серебра составляет 6-8 часов, как указывает lag фаза в кривых роста.
Взаимодействие лекарственных средств с биологически стабилизированными наночастицами серебра. Двухмерный метод шахматного макроразбавления использовали для
охарактеризовывания взаимодействий между биологически стабилизированными наночастицами серебра и лекарственными средствами (а именно, гентамицин, пенициллин, цефотаксим, цептазидим, канамицин, ванкомицин). Для описанного выше штамма Pseudomonas aeruginosa MDR проводили шесть экспериментов. Инокулят получали аналогично тому, который использовали в тесте на чувствительность. Для отдельных лекарственных средств с биологически стабилизированными наночастицами серебра проводили двукратное серийное разведение, и концентрации колебались от более низкой в четыре раза и более высокой в четыре раза чем MIC. Наиболее высокое разведение комбинации лекарственного средства и биологически стабилизированными наночастицами серебра, которое ингибирует видимый рост тестируемого организма, рассматривали как частичную ингибирующую концентрацию (FIC). Показатель частичной ингибирующей
концентрации (FICI) использовали для определения взаимодействия между двумя лекарственными средствами. FICI представляет собой сумму значений FIC для каждого из лекарственных средств. FIC рассчитывали следующим образом: MIC протестированного лекарственного средства в комбинации/MIC протестированного по отдельности лекарственного средства. Взаимодействие определяли как синергическое, если FICI был равен 0,5, как аддитивное, если FICI > 0,5 до 1,0, как индифферентное, если FICI > 1,0 до 2,0 и как антагонистическое, если FICI> 2,0.
Средние значения FICI, полученные в процессе проведения данной работы, показывали, что действие биологически стабилизированных наночастиц серебра было синергическим для цефотаксима и цефалоспорина, частично синергическим для цептазидима и индифферентным для гентамицина, пенициллина и ампициллина. Однако антагонистическое действие наблюдалось в сочетании с канамицином и ванкомицином.
Противомикробная активность биологически стабилизированных наночастиц серебра на марлевых прокладках. Марлевые прокладки (2 см х 2 см) обрабатывали в автоклаве и смачивали 100 мкл суспензии биологически стабилизированных наночастиц серебра или обрабатывали путем нанесения мази, содержащей биологически стабилизированные наночастицы серебра (оба имели концентрацию наночастиц серебра 4хМ1С для соответствующих культур) и инокулировали с использованием 105 клеток. Одновременно проводили контрольный опыт с использованием стерильного физиологического раствора. Марлевые прокладки помещали в стерильные чашки Петри и выдерживали в увлажненном инкубаторе, установленном при 37°С. Выживаемость культур контролировали в момент времени 0 часов и в интервал от 4 часов до 24 часов. Для этого марлевую прокладку удаляли, помещали в 10 мл физиологического раствора, встряхивали и суспензию серийно разводили и помещали на питательный агаровый планшет. TVC определяли после инкубации при 37°С в течение 24 часов. Для каждого времени реакции проводили шесть параллельных экспериментов как для обработанных, так и для контрольных
марлевых прокладок.
Число в масштабе 1одю организмов, выделенных с каждого типа марлевой прокладки, рассчитывали для всех шести параллельных экспериментов (предполагали одну колонию в случае обнаружения отсутствия колоний). Результаты изображены как средняя величина логарифма (Log) относительно времени реакции на фиг.7А. 7В и 7С прилагаемых рисунков.
Полученные результаты показывают, что время, необходимое для > 97% уменьшения в популяции тестируемых организмов, составляло 8 часов.
Исследование цитотоксичности in vitro. Клеточную линию лейкемии человека К562, клеточную линию гепатоклеточной карциномы HEPG2 и мышиные фибробласты L92 9 культивировали обычным образом в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Sigma, США), дополненной 10% околоплодной телячьей сыворотки и 1% коммерческого антибиотического-противогрибкового препарата (PenStrep, Sigma, США) . Культуры поддерживали при 37°С в атмосфере 5% С02.
Сравнительное действие четырех препаратов, а именно электрохимически синтезированных наночастиц серебра, стабилизированных глицерином (EC-Gly), электрохимически синтезированных наночастиц серебра, стабилизированных поливинилпирролидоном (EC-PVP), биологически стабилизированных наночастицы серебра (Chem-Bio) и нитрата серебра (AgN03) контролировали на пролиферацию и жизнеспособность клеток вышеуказанных трех клеточных линий с использованием набора для анализа ХТТ (Roche Molecular Biochemicals, Германия). Кратко, в микротитровальные планшеты (96 лунок), содержащие DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), высевали клетки при первоначальной плотности клеток 1х105 клеток/мл. Клеткам давали возможность размножаться в течение 2 4 часов при 37°С, 5% СОг. После инкубации супернатант осторожно удаляли и добавляли стерильную среду DMEM, дополненную наночастицами серебра в диапазоне 1,5-15 мкл/мл. Планшеты дополнительно инкубировали в течение 48 часов при 37°С в атмосфере 5% С02.
После инкубации добавляли в каждую лунку 50 мкл реагента ХТТ и планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере 5% С02 в течение 4 часов. Окрашивание, появляющееся вследствие образования формазана, оценивали количественно с использованием ридера ELISA ((xQuant, Biotech Instruments) при 450 нм. Планшеты сканировали при 690 нм таким образом, чтобы обеспечить коррекцию поглощения клетками. ХТТ анализ проводили в 6 повторностях с использованием подходящих контролей в отсутствие наночастиц серебра.
Полученные результаты показаны в таблицах, которые можно видеть на фиг.8, 9 и 10 прилагаемых рисунков.
Четко видно, что биологически стабилизированные наночастицы серебра являются нетоксичными для всех трех клеточных линий в концентрации от 1 до б частей на миллион. Также можно видеть, что химически стабилизированные наночастицы серебра, также как и нитрат серебра, являются высоко цитотоксичными даже в концентрации 3,12 частей на миллион.
Таким образом, в экспериментах, проведенных в соответствии с данным изобретением, установлено, что биологически стабилизированные наночастицы серебра обладают широким спектром противомикробного действия в диапазоне концентраций 1-6 частей на миллион. Кроме того, в данном диапазоне концентраций биологически стабилизированные наночастицы серебра не демонстрируют цитотоксичности in vitro.
Описанные в данном изобретении биологически
стабилизированные наночастицы серебра могут найти применение при лечении ожоговых ран, в качестве укрывающего материала для различных медицинских устройств, таких как катетеры, сердечные клапаны, биоактивные стекла, покрытые оболочкой нити для сшивания ран и ортопедические устройства. Немедицинское применение может заключаться в использовании в системах для очистки воды и воздуха.
Биологически стабилизированные наночастицы серебра в соответствии с данным изобретением можно использовать в качестве бактерицида и антибиотика при различных бактериальных
инфекциях.
Таким образом композицию, полученную с использованием биологически стабилизированных наночастиц серебра, можно использовать при лечении карбункулов, грибкового заболевания ног, фурункулов, кандидомикотического сепсиса,
цереброспинального менингита, колита, цистита, дерматита, дифтерии, диплококков, E.coli, гонореи, импетиго, инфекции, пневмококков, стригущего лишая, опоясывающего лишая, стафилококков, туберкулеза, бородавок, коклюша.
Биологически стабилизированные наночастицы серебра могут быть получены в виде суспензии/раствора, в которых растворитель может представлять собой очищенную воду, воду для инъекций, которая используется для стерильного препарата, или любой другой неводный сорастворитель, который может представлять собой, например, полигликоли, спирты, инертные ожиженные газы и другие галогенуглеродные соединения, как будет предпочтительно.
Другие эксципиенты могут включать поверхностно-активные вещества, суспендирующие агенты и модифицирующие вязкость агенты, воски, целлюлозные полимеры, карбополы и необязательно консерванты, буферные агенты, регулирующие осмотическое давление агенты или регулирующие изотоничность агенты, углеводороды и низкокипящие растворители.
Эксципиенты в препаратах могут включать полисорбат, карбополы, гидроксипропилметилцеллюлозу, вазелиновую основу, воски, хлорид натрия, маннит, лимонные кислоты, фосфаты, ацетаты, бензиловые спирты, бутиратный гидрокситолуол (ВНТ), бутиратный гидроксианизол (ВНА), гликоли, такие как глицерин, полиэтиленгликоли, пропиленгликоли, сорбит, инертные газы, такие как азот, водород и другие, углеводороды могут представлять собой этанол, бутанолы и другие, фторуглероды.
Композиции могут представлять собой глазные капли, ушные капли, капли для носа, растворы, мази, кремы, лосьоны и другие препараты для перевязки ожогов или инфекций.
Указанные композиции, которые подразумевают наружное нанесение на инфицированную площадь, могут также содержать другие синергические активные ингредиенты, такие как усилители
для растирания, которые могут представлять собой по крайней мере один из выбранных из ментола, метилсалицилата, олеумной жидкой мази, капсаицина.
Данный раствор вместе с низкокипящими растворителями или сжатыми ожиженными газами или углеводородами или комбинациями любых двух из них, может быть помещен с использованием подходящего устройства в систему под давлением, из которой лекарственное средство распыляют на инфицированную область для непосредственного действия.
Мазь может быть получена с использованием раствора/суспензии биологически стабилизированных наночастиц серебра вместе с указанными активными ингредиентами и может быть вместе с вышеуказанными сорастворителями. Модифицирующие вязкость агенты используют в подходящей концентрации таким образом, чтобы получать желаемую вязкость как требуется для препарата.
Композиции для наружного применения также могут быть получены с использованием природных ингредиентов без консервантов. Очень мелкий размер частиц в композиции обеспечивает лучшую биодоступность и всасывание.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Нецитотоксическая противомикробная композиция, содержащая
a) биологически стабилизированные наночастицы серебра размером в диапазоне от 1 до 100 нм и
b) носитель, в котором концентрация указанных биологически стабилизированных наночастиц серебра находится в диапазоне от 1 до 6 частей на миллион.
2. Противомикробная композиция по п.1, в которой наночастицы серебра стабилизированы биологически водным раствором мацерированных клеток тканей растений.
3. Противомикробная композиция по п.2, в которой водный раствор разбавлен вплоть до десятикратного разведения деионизированной водой.
4. Противомикробная композиция по п.2, в которой ткань растения представляет собой по меньшей мере одну ткань растения, выбранную из группы тканей растений, которая включает листья, корни, стебли, цветы и плоды следующих растений: люцерна, акация аравийская (Acacia arabica), кориандр
(Coriandrum sativum), восточно-индийский кипрей (Ervatamia coronaria), бергавия раскидистая (Boerhavia diffusa), индийский барбарис (Berberris aristata), бархатцы (Calendula
officinalis) , петрушка (Petroselinum sativum), горец перечный
(Achyranthes aspera) , кассия Тб^ннера (Cassia auriculata) , лаванда, бахед (Terminalia belerica), фенхель (Fenniculum vulgare), хвощ лесной (Equisetum arvense), малина (Rubus idaeus), алоэ вера (Aloe barbadensis) , желтокорень канадский
(Hydrastis canadensis), чеснок (Allium sativum), Echinacea spp., очанка (Euphrasis officinalis), эгле мармеладное (Aegle marmelos), индийский тмин (Trachyspermum ammi), ромашка горькая
(Matricaria chamomilla), гвоздика (Syzygium aromaticum), имбирь
(Zingiber officinale), базилик священный (Ocimum sanctum), акалифа индийская (Acalypha indica), дурман (Datura innoxia), мята (Mentha spp.), листья бетеля (Piper betle, Linn), календула (Calendula officinalis L^NN), звездчатка (Trichobasis lychnidearum), огурец (Cucumis sativus, Linn.), акация
аравийская, олива (Olea europea L.), нивяник обыкновенный, семена тмина (Cuminum cyminum), листья карри (Murraya koengi), укроп (Anethum graveolens), индийская мальва (Abutilon indicum), мелия индийская (Azadirachta indica), мадука индийская (Madhuca indica), тамаринд (Tamarindus indicus), куркума (Curcuma longa), зимняя вишня (Withania sommnifera), унаби (Zizyphus jujuba), тыква (Cucurbita pepo, Cucurbita maxima), американская липа (Tilia americana), аир (Acorus calamus), амарант (Amaranthus, spinosa), арника (Arnica Montana), американская бузина (Sambucus Canadensis), буквица
(Stachys officinalis), евгения (Eugenia jambolana), календула
(Calendula officinalis LINN), ромашка обыкновенная (Matricaria chamomilla), плаун (Lycopodium selago или clavatum), одуванчик
(Taraxacum officinalem), эхинацея (Echinacea angustifolia), эвкалипт (Eucalyptus globules), желтокорень канадский
(Hydrastis Canadensis), норичник, окопник лекарственный
(Symphytum officinale), примула (Primula veris (L)), подлесник европейский (Sunicula europaea), вербена европейская (Verbena officinalis), мелколепестник канадский, молодило (Sempervivum tectorum,Linn), лиственница (Larix laricina), медуница
(Pulmonaria angustifolia), лук (Alium сера), папайя (Carica papaya), персиковое дерево (Prunus persica), анютины глазки
(Viola tricolor (LINN)), анафалис жемчужный (Anaphalis margaritacea).
5. Противомикробная композиция по n.l или 2, в которой носитель представляет собой крем, гель, мазь, жидкость, суспензию, аэрозольный спрей, марлевую прокладку, волокнистый тампон, мембрану, пленку, ленту, пластырь.
6. Способ получения противомикробной композиции согласно любому из предшествующих пунктов, который включает стадии:
a) получения обычным образом носителя, выбранного из группы носителей, которая включает крем, гель, мазь, жидкость, суспензию, аэрозольный спрей, марлевую прокладку, волокнистый тампон, мембрану, пленку, ленту, пластырь, брикет;
b) получения водной дисперсии биологически стабилизированных наночастиц серебра размером в диапазоне от 1
до 100 нм;
с) смешивания полученного количества указанной водной дисперсии в указанном носителе с образованием гомогенной матрицы, в которой концентрация биологически стабилизированных серебряных наночастиц составляет о:? 1 до б частей на миллион.
7. Способ получения противомикробной композиции по п. б, в которой водную дисперсию биологически стабилизированных наночастиц получают с использованием стадий, включающих
a) растворение соли серебра в воде, имеющей проводимость менее, чем 3 микросименса с получением раствора, в котором концентрация ионов серебра находится в диапазоне от 20000 до 50000 частей на миллион;
b) получение свежепрофильтрованного водного раствора экстракта биологической ткани;
c) разведение водного раствсра деионизированной водой в соотношении, составляющем от 1:5 до 1:50 с получением раствора, имеющего потенциал открытой цепи между +0,2 и +0,2 вольта и рН между 5,5 и 7,5, и общее содержание органического углерода по крайней мере 7 500 частей на миллион;
d) поддерживание указанного водного раствора в условиях непрерывного перемешивания при температуре между 20 и 30 градусами Цельсия;
e) введение небольшого количества раствора соли серебра в указанный раствор водного экстракта в условиях непрерывного перемешивания так, чтобы конечная концентрация иона металла в реакционной смеси была в диапазоне от 50 до 300 частей на миллион;
f) продолжение перемешивания в течение от 30 минут до 3 часов в условиях хорошего освещения для получения коллоидной суспензии наночастиц серебра;
д) отделение наночастиц ст коллоидной суспензии с использованием известного способа, такого как
центрифугирование.
По доверенности
141065
1/7
ФИГ.2
2/7
ФИПЗВ
3/7
Таблица 1
Культура
Наносеребро
MIC±SD
(мкг/мл)
MBC
(мкг/мл)
Escherichia coli АТСС 117
3.12 ±0.840
12.50
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
3.12 ±0.553
12.50
Salmonella abony NCTC 6017
3.12 ±0.822
12.50
Salmonella typhimurium ATCC 23564
3.12 ±0.791
12.50
Klebsiella aerogenes ATCC 1950
1.56 ±0.798
6.25
Proteus vulgaris NCBI4157
3.12 ±0.374
12.50
Staphylococcus aureus ATCC 6538P
1.56 ±0.778
12.50
Bacillus subtilis ATCC 6633
1.56 ±0.848
12.50
Candida albicans ATCC 2091
12.5 ± 13.46
ФИГ.4
4/7
5. aureus
P. aeruginosa E. coli
S. typhimurium
K. aerogenes
-o- 5. abony
B. subtilis
--P. vulgaris
-=- P. aeruginosa MDR
Время (мин)
ФИГ.5
5/7
Контроль Наносеребро
О т-I-I-I-I-I-I-I-I I t 0 2 4 6 8 101214161820 Время (час)
ФИГ.6А
8 -]
7 •
1 6 '
а подсчитанного числа жизнеспо
-Ф- Контроль -в- Наносеребро
X X
X . л
Log вели бактерий
л J
2 4
i i i i i i i i 6 8 1012 14 16 18 20
Время (час)
ФИГ.6В
6/7
У О
Р ?
с 2
it 1
!" О
4 3 2
I н о
-•- Контроль _¦_Наносеребро
О 4 8 12 16 20 24 28
Время (час)
ФИГ.7А
Контроль ¦- Наносеребро
О 4 8 12 16 20 24 28
Время (час)
4 -
3 -2
1 Н 0
^¦¦¦3 ..0-
-О- Контроль -а- Наносеребро
1-I-I-I-I-I-I
0 4 8 1216202428
Время (час)
ФИГ.7В
ФИГ.7С
7/7
Препарат % Жизнеспособности относительно различных концентраций серебра (млн.-1) для серебра клеточной линии Hep G-2
3.12
6.12
12.5
Контроль
EC-Gly
59%
52.50%
44%
22%
18%
100%
EC-PVP
90.50%
48%
29.50%
20%
15%
100%
Chem-Bio
100%
99%
99%
98%
.65%
100%
AgNOj
27%
10%
100%
ФИГ.8
Препарат серебра
% Жизнеспособности относительно различных концентраций серебра (млн.-1) для клеточной линии К-562
3.12
6.12
12.5
Контроль
EC-Gly
62%
58.50%
44%
35%
28%
100%
EC-PVP
90%
54%
32%
26%
20%
100%
Chem-
100%
99%
90%
85%
75%
100%
Bio
AgNQ3
14%
100%
ФИГ.9
Препарат % Жизнеспособности относительно оазличных концентраций серебра (млн.-1) для -опдКп- клеточной линии L-929
3.12
6.12
12.5
Контроль
EC-Gly
70%
65.50%
48%
37%
21%
100%
EC-PVP
94%
88%
76%
68%
45%
100%
Chem-
99%
99%
96%
84%
65%
100%
Bio
AgN03
12%
100%
ФИГ.10