Способ разделения конъюгатов альбумина и неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгаты альбумина и неконъюгированный альбумин, методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC). Раствор загружают на гидрофобную колонку, уравновешенную водньм буфером с высоким содержанием соли; применяют в отношении указанного носителя градиент понижения содержания соли; собирают элюированный конъюгат альбумина.

 

(57) Реферат / Формула:
разделения конъюгатов альбумина и неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгаты альбумина и неконъюгированный альбумин, методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC). Раствор загружают на гидрофобную колонку, уравновешенную водньм буфером с высоким содержанием соли; применяют в отношении указанного носителя градиент понижения содержания соли; собирают элюированный конъюгат альбумина.

 

---

СПОСОБ ОЧИСТКИ КОНЪЮГАТОВ АЛЬБУМИНА
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
(а) Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу очистки при выделении конъюгатов альбумина из раствора, содержащего как конъюгаты альбумина, так и неконъюгированный альбумин.
(б) Уровень техники
В Международных заявках WO 95/10302 и WO 99/24074 описано образование конъюгатов альбумина, в которых представляющая интерес молекула имеет связанную с ней реакционноспособную (реактивную) функциональность, которая способна ковалентно связываться с альбумином, образуя при этом конъюгат. Эти конъюгаты могут образовываться in vivo, но они могут также образовываться in vitro. Образование конъюгатов in vitro включает присоединение молекулы, связанной с реактивной функциональностью, к альбумину в растворе. Основные конечные продукты этой реакции представляют собой неконъюгированный альбумин, конъюгат альбумина и непрореагировавшую молекулу, связанную с реактивной функциональностью.
Было бы в высшей степени желательно иметь способ очистки конъюгата альбумина из раствора, содержащего конъюгат альбумина и неконъюгированный альбумин.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предлагается способ отделения конъюгата альбумина от неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгат альбумина и неконъюгированный альбумин, включающий:
а) нанесение раствора на гидрофобный твёрдый носитель, уравновешенный водным буфером с высоким содержанием соли;
б) подачу на носитель водного буфера с понижающимся с градиентом содержанием соли;
в) сбор элюированного конъюгата альбумина.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения конъюгат альбумина состоит из молекулы, содержащей акцептор Михаэля, ковалентно связанный с ней, который связывается с альбумином, и более предпочтительно, имеется связь между акцептором Михаэля и цистеином 34 альбумина.
В более предпочтительном варианте настоящего изобретения акцептором Михаэля является малеинимидная группа, и более предпочтительно, малеинимидная группа представляет собой малеинимид-пропионовую кислоту (MPА). Акцептор Михаэля необязательно связан с молекулой с помощью линкера. Линкер, предпочтительно, выбирают в группе, состоящей из гидроксиэтильных мотивов, таких как (2-амино)этоксиуксусная кислота (АЕА), этилендиамин (EDA), 2-[2-(2-амино)этокси]этоксиуксусная кислота (АЕЕА), аминоэтоксиэтиламиноянтарная кислота (AEEAS); один или более мотивов с алкильной цепью (С1-С10), таких как глицин, 3-аминопропионовая кислота (АРА), 8-аминооктановая кислота (АОА), октановая кислота (OA), 4-аминобензойная кислота (APhA). Предпочтительными линкерами являются OA, ADE, АЕА, АЕЕА и AEEAS. Можно также применять комбинацию двух линкеров, например, такую как AEEA-EDA, АЕЕА-АЕЕА, AEEAS-AEEAS и АЕА-АЕЕА.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения альбумин выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, рекомбинантного альбумина и альбумина из геномного источника.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения альбумин выбирают из группы, состоящей из человеческого альбумина, альбумина крысы, альбумина мыши, альбумина свиньи, бычьего альбумина, альбумина собаки и кроличьего альбумина, более предпочтителен бычий сывороточный альбумин.
В предпочтительном варианте изобретения альбумин модифицирован с помощью, по меньшей мере, одного реагента, выбранного из группы, состоящей из жирных кислот, ионов металла, малых молекул с высоким сродством к альбумину, и Сахаров, таких, но без ограничения, как глюкоза, лактоза и манноза.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения молекулу выбирают из группы, состоящей из пептида, ДНК, РНК, малой органической молекулы и их комбинации. Молекулярная масса пептида составляет, предпочтительно, по меньшей мере, 57 дальтон. Предполагается, что пептид включает, но без ограничения, GLP-1, GLP-2, ANP, К5, динорфин, GRF, инсулин, натрийуретический пептид, Т-20, Т-1249, С-34 и PYY. Предполагается, что малая молекула включает, но без ограничения, винорелбин, гемцитабин и паклитаксел. В более предпочтительном варианте настоящего изобретения, когда молекула представляет собой ДНК, РНК или малую органическую молекулу, она ковалентно связана с альбумином за счёт чувствительной к кислоте ковалентной связи или за счёт пептидной последовательности, чувствительной к протеолитическому расщеплению, тем самым обеспечивается отделение (отщепление) молекулы от альбумина и вход молекулы в клетку.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения гидрофобная твёрдая подложка (носитель) представляет собой колонку, содержащую гидрофобный полимер, такой как, но без ограничения, октил- сефароза, фенил- сефароза и бутил- сефароза, причём более предпочтительной является бутил- сефароза.
В другом варианте настоящего изобретения гидрофобный твёрдый носитель содержит гидрофобный лиганд, такой как Cibacron Blue F3G-A, либо изопропильные группы, ассоциированные с носителем, таким как матрица полистирол/изопропилбёнзол.
В.ещества разделяют за счёт их различной интенсивности гидрофобного взаимодействия с гидрофобными лигандами, иммобилизованными на незаряженной матрице. Этот способ обычно осуществляют при умеренно высоких концентрациях солей (1М) в начальном буфере (адсорбция, промотируемая солью). Элюцию проводят при линейном или постадийном снижении концентрации соли.
Тип лиганда, степень замещения, значение рН и тип и концентрация соли, применяемой на стадии адсорбции, оказывают значительное влияние на общую эффективность (например, селективность и (адсорбционную) способность) HIC матрицы (носителя (матрицы) для хроматографии гидрофобных взаимодействий).
Растворимость является одной из наиболее важных характеристик, которая влияет на производительность и селективность HIC (хроматографии гидрофобных взаимодействий). В целом, процесс адсорбции является более селективным, чем процесс десорбции. Следовательно, важно оптимизировать начальный буфер по рН, типу растворителя, типу соли и концентрации соли. Добавление к образцу различных "высаливающих" солей вызывает взаимодействия лиганд- белок в процессе HIC. По мере повышения концентрации соли количество связанного белка повышается до точки преципитации белка. Каждый тип соли отличается по своей способности промотировать гидрофобные взаимодействия. Влияние различных солей на гидрофобное взаимодействие подчиняется общеизвестному ряду Гофмейстера, представленному ниже:
Ряд Гофмейстера Эффект высаливания
Анионы:
Р043" > S042" > СН3СОО" > СГ > Br" > N03" > СЮ4" > Г > SCN"
Хаотропный эффект
Катионы:
NH4+ < Rb+ < К+ < Na+ < Cs+ < Li+ < Mg2+ < Ba2+
Возрастание эффекта высаливания усиливает гидрофобные взаимодействия, тогда как возрастание хаотропного эффекта ослабляет их. Следовательно, сульфат аммония вызывает более сильный эффект высаливания, чем хлорид натрия. Наиболее часто для ШС применяют соли: сульфат аммония ((NH^SC^), сульфат натрия (NaaSCu), сульфат магния (MgS04), хлорид натрия (NaCl), хлорид калия (КС1) и ацетат аммония (CH3COONH4).
Связывание белка с HIC адсорбентами промотируется концентрациями "высаливающих" солей от умеренных до высоких, большинство из этих солей также оказывают стабилизирующее действие на структуру белка благодаря предпочтительному исключению их из нативных глобулярных белков, т.е. взаимодействие между солью и поверхностью белка термодинамически невыгодно. Концентрация соли должна быть достаточно высокой (например, 500-1000 мМ) для того, чтобы вызывать взаимодействие лиганд- белок, но ниже концентрации, которая вызывает преципитации белка в образце. В случае альбумина концентрацию соли следует выдерживать ниже ЗМ (молей на литр). Основной механизм высаливания заключается в вызываемом солью повышении поверхностного натяжения воды (Melander and Horvath, 1977). Таким образом, компактная структура становится энергетически более выгодной, так как она соответствует меньшей площади пограничной (межфазной) поверхности белок- раствор.
Авторы обнаружили, что в одних и тех же условиях (т.е. буфер, содержащий SO4 РО43" или СН3СОО" с любым противоионом) то, как эти соли проявляют эффект высаливания в отношении практически всего конъюгированного альбумина по данному описанию, отличается от их поведения в отношении неконъюгированного альбумина (т.е. меркаптальбумина и альбумина, кэпированного цистеином), что делает возможным непрерывное хроматографическое разделение конъюгированного альбумина и неконъюгированного альбумина. То-есть, для того, чтобы инициировать взаимодействие между лигандом и конъюгированным альбумином, требуются более низкие концентрации соли, чем для инициирования взаимодействия между лигандом и неконъюгированным альбумином. Это хроматографическое разделение практически не зависит от (а) последовательности альбумина (например, человеческого, мыши, крысы и т.д.), (б) источника альбумина (т.е. из плазмы или рекомбинантного), (в)молекулярной массы конъюгированной молекулы, (г) положения акцептора Михаэля (или малеинимидной группы) в структуре молекулы, (д) пептидной последовательности или химической структуры молекулы, и (е) трёхмерной структуры конъюгированной молекулы, например, линейной структуры по сравнению с петлевой структурой.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения соль в водном буфере проявляет достаточный эффект высаливания. Для того, чтобы обеспечить достаточный эффект высаливания, соль, предпочтительно, но без ограничения, представляет собой фосфат, сульфат и ацетат. Более предпочтительно, соль является фосфатом или сульфатом. Выбор катиона в буфере менее важен и, следовательно, такой катион можно выбирать, без ограничения, из группы, состоящей из NH4+, Rb+, К+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+ и Ba2+.
Водный буфер, предпочтительно, представляет собой фосфат аммония, сульфат аммония и фосфат магния, и, более предпочтительно, сульфат аммония.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения рН буфера имеет значение 3.0-9.0; более предпочтительно, 6.0-8.0, и ещё более предпочтительно, рН 7.0
В предпочтительном варианте настоящего изобретения температура буфера и гидрофобного твёрдого носителя является комнатной (около 25°С), или равна 4°С, или её значение является промежуточным между двумя этими значениями.
В Таблице 1 показан пример влияния различных солей на очистку предварительно полученного конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 из раствора HSA с применением бутил- Сефарозы (структура первого аналога GLP-1 описана ниже, в Примере 1).
Таблица 1
Тип соли
Начальная концентрация соли 750 мМ
Начальная концентрация соли 1750 мМ
Фосфат аммония
Сульфат аммония
Хлорид аммония
нет
Иодид аммония
Нет
нет
Тиоцианат аммония
Нет
нет
Сульфат магния
Нет
Фосфат магния
Сульфат бария*
* означает, что соль нерастворима в концентрациях 1750 мМ или 750 мМ в растворе 20 мМ фосфата натрия (рН 7), 5 мМ каприлата
Да означает, что достигается успешное разделение между конъюгатом HSA: первый аналог GLP-1 и неконъюгированным HSA
Нет означает, что не достигается успешное разделение между конъюгатом HSA: первый аналог GLP- 1 и неконъюгированным HSA
Предполагается, что термин "пептид" означает аминокислотную последовательность с молекулярной массой, по меньшей мере, 57 дальтон. Пептидная последовательность может быть кольцевой (петлевая структура), такой как ANP, может
содержать более одной аминокислотной цепи, такой как инсулин, или может быть линейной, такой как К5, динорфин А, С-34 и GLP-1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Каждая фигура иллюстрирует ЖК/ЭМС анализ содержания в элюированных фракциях хроматографии, осуществленной в соответствии с настоящим изобретением для сепарации/очистки соединений, описанных в примерах. Каждая фракция была обессолена и концентрирована ранее ЖК/ЭМС анализа, как описано ниже.
На Фиг.1 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 1;
На Фиг.2 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GRF (SEQ ГО N0:2) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 2;
На Фиг.З иллюстрируется очистка неконъюгированного HSA по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 3;
На Фиг.4 иллюстрируется очистка конъюгата rHSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 4;
На Фиг. 5 иллюстрируется очистка HSA cortex по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 5;
На Фиг.6 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: аналог К5 (SEQ ГО N0:3) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 6;
На Фиг. 7 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первое производное инсулина (SEQ ГО N0:4) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 7;
На Фиг. 8 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второе производное инсулина (SEQ ГО N0:5) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 8;
На Фиг.9 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог С34 (SEQ ГО N0:6) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 9;
На Фиг. 10 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог С34 (SEQ Ю N0:7) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 10;
На Фиг. 11 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третий аналог С34 1 (SEQ Ш N0:8) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 11;
На Фиг. 12 иллюстрируется очистка L- цистеина по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 12;
На Фиг. 13 иллюстрируется очистка конъюгата L- цистеин: первый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 13;
На Фиг. 14 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:9) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 14;
На Фиг. 15 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третий аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:10) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 15;
На Фиг. 16 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:11) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 16;
На Фиг. 17 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: пятый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:12) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 17;
На Фиг. 18 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог эксендина- 4 (SEQ ГО N0:13) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 18;
На Фиг. 19 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог эксендина-4 (SEQ ГО N0:14) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 19;
На Фиг.20 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: МРА по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 20;
На Фиг.21 иллюстрируется очистка HSA по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 21;
На Фиг.22 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог с34 (SEQ Ш N0:3) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 22;
На Фиг.23 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог динорфина-А (SEQ Ш N0:15) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 23;
На Фиг.24 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог ANP (SEQ ГО N0:16) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 24;
На Фиг.25 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог динорфина А (SEQ ГО N0:17) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 25;
На Фиг.26 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: ингибитор АСЕ (SEQ ГО N0:18) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 26;
На Фиг.27 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: шестой аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:19) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 27;
На Фиг. 2 8 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: седьмой аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:20) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 28;
На Фиг.29 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: восьмой аналог GLP-1 (SEQ ID N0:21) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 29;
На Фиг. 30 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: девятый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:22) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 30;
На Фиг.31 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: десятый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:23) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 31;
На Фиг.32 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: одиннадцатый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:24) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 32;
На Фиг.ЗЗ иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третий аналог эксендина- 4 (SEQ Ш N0:25) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 33;
На Фиг.34 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: двенадцатый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:26) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 34;
На Фиг.35 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первое производное инсулина с модификацией в цепи В (SEQ ГО N0:4) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 35;
На Фиг. 36 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третье производное инсулина с модификацией в цепи В (SEQ ГО N0:27) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 36;
На Фиг.37 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второе производное инсулина с модификацией в цепи A (SEQ ГО N0:5) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 37;
На Фиг.38 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: четвёртое производное инсулина с модификацией в цепи В (SEQ ГО N0:28) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 38;
На Фиг. 39 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GRF (SEQ ГО N0:2) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 39;
На Фиг.40 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог GRF (SEQ ГО N0:29) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 40;
На Фиг.41 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третий аналог GRF (SEQ ГО N0:30) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 41;
На Фиг.42 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог GRF (SEQ ГО N0:31) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 42;
На Фиг.43 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: тринадцатый аналог GLP-1 CJC 1365 (SEQ ГО N0:32) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 43;
На Фиг.44 иллюстрируется очистка конъюгата HSA лактоза: первый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 44;
На Фиг.45 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог Т20 (SEQ ГО N0:33) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 45;
На^Фиг.46 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог Т1249 (SEQ ID N0:34) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 46;
На Фиг.47 иллюстрируется очистка соединения HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 47;
На Фиг.48 иллюстрируется очистка соединения HSA: первый аналог С34 (SEQ ГО N0:6) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 48;
На Фиг.49 иллюстрируется очистка соединения HSA: второй аналог GRF (SEQ ГО N0:29) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 49;
На Фиг.50 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: аналог винорельбина (SEQ ГО N0:35) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 50;
На Фиг. 51 иллюстрируется очистка L- цистеина по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 51;
На Фиг.52 иллюстрируется очистка конъюгата L- цистеин: аналог винорельбина (SEQ ГО N0:35) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 52;
На Фиг. 53 иллюстрируется очистка конъюгата RSA: третий аналог эксендина- 4 (SEQ ГО N0:25) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 53;
На Фиг.54 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог С34 (SEQ ГО N0:36) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 54;
На Фиг. 55 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: пятый аналог С34 (SEQ ГО N0:37) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 55;
На Фиг.56 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: шестой аналог С34 (SEQ Ш N0:38) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 56;
На Фиг.57 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: седьмой аналог С34 (SEQ ID N0:39) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 57;
На Фиг.58 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: восьмой аналог С34 (SEQ ГО N0:40) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 58;
На Фиг.59 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог PYY (SEQ ГО N0:41) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 59;
На Фиг.60 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог PYY (SEQ ГО N0:42) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 60;
На Фиг.61 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: пятое производное инсулина с модификацией в цепи В (SEQ ГО N0:43) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 61;
На Фиг. 62 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: шестое производное инсулина с модификацией в цепи В (SEQ ГО N0:44) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 62;
На Фиг.63 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: седьмое производное инсулина с модификацией в цепи В (SEQ ГО N0:45) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 63;
На Фиг. 64 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третий аналог PYY (SEQ ГО N0:46) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 64;
На Фиг.65 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог PYY (SEQ ГО N0:47) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 65;
На Фиг.66 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: пятый аналог PYY (SEQ ГО N0:48) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 66;
На Фиг. 67 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: шестой аналог PYY (SEQ ID N0:49) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 67;
На Фиг.68 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: второй аналог ANP (SEQ ID N0:50) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 68;
На Фигурах 69А- В иллюстрируется очистка конъюгата HSA: третий аналог ANP CJC 1681 (SEQ Ш N0:51) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 69;
На Фиг.70 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 70;
На Фиг.71 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 71;
На Фиг.72 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 72;
На Фиг.73 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 73;
На Фиг. 74 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ Ш N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 74;
На Фиг. 75 иллюстрируется очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-2 (SEQ Ш N0:52) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 75; и
На Фиг. 76 иллюстрируется очистка конъюгата RSA: первый аналог GLP-2 (SEQ Ш N0:52) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в Примере 76.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению охватывается способ очистки конъюгатов альбумина из раствора, содержащего конъюгаты альбумина и неконъюгированный альбумин.
Способы
Получение контрольного (неконъюгированного) человеческого сывороточного альбумина (HAS) и преформированных конъюгатов альбумина
Каждое соединение с акцетором Михаэля солюбилизируют в "наночистой" воде (или, если соединение трудно солюбилизируется, в ДМСО) с концентрацией 10 мМ, затем разводят до концентрации 1 мМ в растворе HAS (25%, 250 мг/мл, Cortex- Biochem, San Leandro, CA). Затем образцы инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Перед очисткой каждый конъюгат разводят до концентрации 5% 50 мг/мл HSA в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 мМ октаноата натрия. Начальную концентрацию соли, применяемой в градиентной элюции, можно добавить к буферу для разведения раствора смеси. Предпочтительно, начальная концентрация соли составляет около 750-1700 мМ (NH^SO^
Методика очистки по предпочтительному варианту изобретения Применяя хроматографическую систему очистки АКТА (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), каждый конъюгат при скорости потока 2.5 мл/мин наносят на колонку 50 мл с бутил- сефарозой 4 Fast Flow (FF) (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), уравновешенной с 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7), содержащим 5 мМ октаноата натрия и 750 мМ- 1.7 М (NH^SO^ В этих условиях увеличение молекулярной массы конъюгатов HAS составляет более 2 кДа относительно неконъюгированного HAS, нанесённого на гидрофобный полимер, тогда как практически весь неконъюгированный HAS элюируется из свободного объёма колонки. Для увеличения молекулярной массы менее 2 кДа можно использовать более высокое начальное содержание соли с последующим постадийным градиентом уменьшения содержания соли. Каждый конъюгат можно очищать далее от любого свободного неконъюгированного соединения с применением постоянного или постадийного (непостоянного) градиента понижения концентрации соли (от 750 до 0 мМ (NE^SO^ В объёме, равном 4 объёмам колонки. В предпочтительном варианте изобретения каждый очищенный конъюгат затем обессоливают и концентрируют диафильтрацией, например, используя ультрафильтры (30 кДа) Amicon(r) (Millipore Corporation, Bedford, MA). Наконец, для продолжительного хранения каждый раствор конъюгата, предпочтительно, помещают в жидкий азот и
лиофилизируют, используя систему для лиофилизации Labconco (FreeZone(r)4.5), и хранят при -20°С.
Примеры ЖХ/ЭМС (LC/EMS) анализа
После очистки 1 мкл каждого образца конъюгата, предпочтительно, инъецируют в систему LC/EMS. Конъюгат HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ГО N0:1) подтверждают, обнаруживая наиболее распространённую частицу с общей молекулярной массой 70160 Да, что соответствует массе меркаптальбумина (66 448 Да), в котором цистеин 34 находится в виде свободного тиола, плюс масса только одной молекулы аналога GLP-1 (3719.9 Да). Структура первого аналога GLP-1 (SEQ ГО N0:1) описана ниже, в Примере 1. Она иллюстрируется Таблицей 2.
Таблица 2
Компонент
Молекулярная масса
Абсолютное содержание
Относительное содержание
70160.58,
321970
100.00
65862.95
70008
21.74
64545.45
62888
19.53
70320.04
41167
12.79
61287.67
16842
5.23
60623ю81
16522
5.13
58090.04
12473
3.87
Структуру конъюгата HSA: первый аналог GRF (SEQ ГО N0:2) подтверждают, обнаруживая наиболее распространённую частицу с общей молекулярной массой 70086 Да, что соответствует массе меркаптальбумина (66448 Да), в котором цистеин 34 находится в виде свободного тиола, плюс масса только одной молекулы первого аналога GRF (3648.2 Да). Структура первого аналога GRF (SEQ ГО N0:2) описана ниже, в Примере 2. Она иллюстрируется Таблицей 3.
Таблица 3
Компонент
Молекулярная масса
Абсолютное содержание
Относительное содержание
70086.06
279413
100.00
63214.84
53333
19.09
62148.17
38582
13.81
70247.98
34870
12.48
56795.96
10523
3.77
62695.49
9813
3.51
Нижеприведённые примеры иллюстрируют некоторые соединения, содержащие малеинимидную группу в качестве акцептора Михаэля, которые были конъюгированы с альбумином и очищены в соответствии со способом по настоящему изобретению.
Нижеприведённые примеры даются с целью иллюстрации настоящего изобретения, но не с целью ограничения его объёма.
В нижеприведённых примерах номера градиента относятся к следующим особенностям (характеристикам) градиента, где CV означает объём колонки 50 мл.
Градиент №1: Линейный 750-0 мМ (NH4)2S04, 4CV, скорость потока 2.5 мл/мин.
Градиент №2: Ступенчатый градиент 1.75 М- 1.2 М (NH^SC^, 0.5CV,
затем 1.2 М- 875 мМ (NH4)2S04) 5CV, и наконец, 875 мМ- 0 мМ (NH4)2S04,
0.5CV, скорость потока 2.5 мл/мин.
Градиент №3: Линейный 900- 0 мМ (NH4)2S04, 4CV, скорость потока 2.5 мл/мин. Градиент №4: Ступенчатый градиент 1.5 М- 1.1 М (NH4)2S04, 0.5СV, затем 1.1 М- 375 мМ (NH4)2S04, 6CV, и наконец, 375 мМ- 0 мМ (NH^SCm, 0.5CV, скорость потока 2.5 мл/мин.
Градиент №5: Линейный 750- 0 мМ (NEU)2S04, 2CV, скорость потока 2.5'мл/мин. Градиент №6: Ступенчатый градиент 1.75 М- 0 М (NH^SCv, 6CV, скорость потока 2.5 мл/мин.
Градиент №7: Линейный 750- 0 мМ (NH4)2S04,6CV, скорость потока 2.5 мл/мин.
Пример 1
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (е-АЕЕА-MPA)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
H(dA)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(AEEA-MPA)-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 1, разведённым в 9 мл буфера, полученного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 1 фракцию очищенного конъюгата элюирует в градиенте понижения
концентрации (NH^SOA как фракцию В (F8-F9), тогда как неконъюгированный альбумин элюируется из свободного объёма колонки (фракция А). Фракцию конъюгата концентрируют на фильтре Ultrafree(tm) 30 кДа и анализируют с помощью LC- EMS.
Пример 2
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GRF (SEQ ID NO:2)
Первый аналог'GRF представляет собой GRF (1-29) dAJa2 Gin8 Ala15 Leu27 Lys30 (e-MPA) CONH2 и имеет следующую последовательность:
YaDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILSRK(MPA)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GRF, разведённым в 9 мл буфера 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH02SO4, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 2 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (F6-F7), тогда как неконъюгированный альбумин элюируется из свободного объёма колонки (фракция А). Фракцию конъюгата концентрируют на фильтре Ultrafree(tm) 30 кДа и анализируют с помощью LC- EMS.
Пример 3
Очистка 1 мл неконъюгированного HSA
Очистку 1 мл 25% 250 мг/мл неконъюгированного HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, CA), разведённого в 9 мл буфера (рН 7.0), полученного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. Практически все молекулы альбумина элюируются из свободного объёма и никаких частиц белка не наблюдается при 280 нм в градиенте (NH4)2S04. На Фиг. 3 даётся кривая разделения.
Пример 4
Очистка конъюгата rHSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla Lys (s- AEEA-MPA)- CONH2 и его последовательность представлена в Примере 1.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 5 мл 5% rHSA (культура рекомбинантного HAS степени чистоты, доступной самыми современными методами) с
200 мкМ первого аналога GLP-1, разведёнными в 5 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (TSTH^SCU, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 4 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (F7- F8- F9).
Пример 5 Очистка 10 мл HSA
Очистку 10 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA), разведённоых в 40 мл буфера, полученного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH^SO,*, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. Практически все молекулы альбумина элюируются из свободного объёма и никаких частиц белка не наблюдается при 280 нм в градиенте (NH^SO^ На Фиг. 5 даётся полученная кривая разделения.
Пример 6
Очистка конъюгата HSA: аналог К-5 (SEQ ID NO:3)
Аналог К5 представляет собой Ас-К5 Lys8 (е- MPA)-NH2 и имеет следующую последовательность:
/ Р
Ac-PRKLYDY-N^
CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 4 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ аналога К- 5, разведённым в 16 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NIL;)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 6 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции А с альбумином и во фракции В (F6-F7-F8).
Пример 7
Очистка конъюгата HSA: первое производное инсулина (SEQ ID NO:4)
Первое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении В1 В цепи (SEQ ID N0:4) и нативной А цепью (SEQ ID NO: 35). Формула 1 представляет первое производное инсулина, описанное в настоящем примере, а также
другие производные инсулина, описанные в последующих примерах. Формула 1 дает представление о дисульфидном мостике в цепи А и двух дисульфидных мостиках между цепями А и В для всех производных инсулина.
Формула 1
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого производного инсулина, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NIL^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 7 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (F6- F7- F8).
Пример 8
Очистка конъюгата HSA: второе производное инсулина (SEQ ID NO:5)
Второе производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении А1 цепи A (SEQ ID NO: 5) и нативной цепью В (SEQ ID NO: 53) и изображено как Формула 1, Пример 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго производного инсулина, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NFL^SO^
проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 8 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (F6- F7- F8).
Пример 9
Очистка конъюгата HSA: первый аналог С34 (SEQ ID NO:6)
Первый аналог С34 представляет собой MPA-AEEA-C34-CONH2 и имеет следующую последовательность:
y-M-E-W-D-H-E'-l-N-N-Y-T-S-L-t-H-S-L- tr-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-CONH,
АЕЕА
МРА
Очистку конъюгата, полученного по реакции 5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, С А) с 1 мМ первого аналога С34, разведённым в 20 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 9 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции F2.
Пример 10
Очистка конъюгата HSA: второй аналог С34 (SEQ ID N0:7)
Второй аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Lys35 (е- АЕЕА- МРА)- CONH2 и имеет следующую структуру:
W-M-E-W-D-R-E-1-N-N-Y-T-S-L- f-H-3-L-1-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-^-CONHa
АЕЕА МРА
Очистку конъюгата, полученного по реакции 5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго аналога С34, разведённым в 20 мл 20 мМ
натрий- фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH^SO^, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 10 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции F2.
Пример 11
Очистка конъюгата HSA: третий аналог С34 (SEQ ID NO:8)
Второй аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Lys13 (е- АЕЕА- МРА)- CONH2 и имеет следующую структуру:
yy.m-E-yy-D-R-E- ^M-N-y-T-^-L-l-H-S-L- l-E-E-S-Q-N-Q-Q-E-K-N-E-Q-E-L-L-CONHa
АЕЕА МРА
Очистку конъюгата, полученного по реакции 5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ третьего аналога С34, разведённым в 20 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEL^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 11 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции F2.
Пример 12 Очистка L-цистеина
Очистку 121 мг L-цистеина в 2 мл буфера, полученного из 20 мМ фосфата натрия, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHO2SO4, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 12 показана полученная кривая разделения, на которой L- цистеин элюируется из свободного объёма колонки (F3).
Пример 13
Очистка конъюгата L-цистеин: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена в Примере 1.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 121 мг L-цистеина с 36.36 мг первого аналога GLP-1, разведёнными в 2 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 13 показана полученная кривая разделения, на которой избыток L- цистеина элюируется во фракции F3 (свободный объём колонки), а конъюгат L- цистеин: первый аналог GLP-1 элюируется при 0 мМ (NEU^SO,*.
Пример 14
Очистка конъюгата HSA: второй аналог GLP-1 (SEQ ID NO:9)
Второй аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys (г- МРА)- NH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(8-MPA)
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго аналога GLP- 1, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04,
проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 14 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 15
Очистка конъюгата HSA: третий аналог GLP-1 (SEQ ID N0:10)
Третий аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (е- МРА)- NH2 и имеет следующую последовательность:
H(dA)EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(MPA)-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, С А) с 1 мМ второго аналога GLP-1, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 15 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 16
Очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог GLP-1 (SEQ ID N0:11)
Четвёртый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lyszo (Е- АЕЕА- АЕЕА-МРА) и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(s- АЕЕА- АЕЕА- MPA)EFIAWLVKGR
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ четвёртого аналога GLP- 1, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHt)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 16 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 17
Очистка конъюгата HSA: пятый аналог GLP-1 (SEQ ID NO: 12)
Пятый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys34 (е- АЕЕА- АЕЕА-МРА) и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(e- АЕЕА- АЕЕА- MPA)GR
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ пятого аналога GLP- 1, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NIL^SOzb проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 17 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 18
Очистка конъюгата HSA: первый аналог эксендина- 4 (SEQ ID NO:13)
Первый аналог эксендина- 4 представляет собой эксендин-4 (1-39) Lys40 (е- МРА)-NH2 и имеет следующую последовательность:
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(8- МРА)- NH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога эксендина- 4, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 18 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 19
Очистка конъюгата HSA: второй аналог эксендина- 4 (SEQ ID NO:14)
Второй аналог эксендина-4 представляет собой эксендин-4 (9-39) Lys40 (s- AEEA-МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(s- АЕЕА- МРА)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3.5 мл 25% HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, С А) с 1 мМ второго аналога эксендина- 4, разведённым в 21.5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 19 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 20 Очистка HSA: МРА
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 2 мМ МРА, разведёнными в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На Фиг. 20 меркаптальбумин элюируется с фракцией A (F5), а кэпированный альбумин выходит с фракцией В (F7-F8). Фракцию конъюгата концентрируют с помощью фильтра Amicon(tm) 30 кДа.
Пример 21 Очистка HSA
Очистку 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, CA), разведённого в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. При использовании градиента № 2, в отличие от градиентов №1 и №5, как конъюгированный альбумин, так и неконъюгированный альбумин адсорбируются на гидрофобном полимере в процессе нанесения образца. На Фиг. 21 показана полученная кривая разделения, на которой видно, что F4 и F5 обогащены меркаптальбумином, a F6, F7 и F8 обогащены кэпированным альбумином.
Пример 22
Очистка конъюгата HSA: второй аналог С34 (SEQ ID NO:3)
Второй аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Lys35 (s- АЕЕА- МРА)- CONH2 и его структура изображена в Примере 10.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго аналога С34, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На Фиг. 22 меркаптальбумин элюируется с фракцией A (F5), а кэпированный альбумин и очищенный конъюгат выходит с фракцией В (F7- F8).
Пример 23
Очистка конъюгата HSA: первый аналог динорфина A (SEQ ID NO:15)
Первый аналог динорфина А представляет собой Dyn А (1-13) (МРА)- NH2 и имеет следующую структуру: YGGFLRRIRPKLK(MPA)- CONH2.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога динорфина А, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NEUbSO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На Фиг. 23 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией A (Fl 1- F12).
Пример 24
Очистка конъюгата HSA: первый аналог ANP (SEQ ID N0:16)
Первый аналог ANP представляет собой МРА- АЕЕА- ANP (99-126)- CONH2 и имеет следующую структуру:
MPA-AEEA-Ser-I^u-Arg-Arg-Ser-Stf^^ Arg-De <}ly-Ala4jta-SCT^ly^
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога ANP, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NH^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На Фиг. 24 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией A (F14).
Пример 25
Очистка конъюгата HSA: второй аналог динорфина A (SEQ ID NO: 17)
Второй аналог динорфина А представляет собой Dyn А (7-13) Lys13 (МРА)- CJNH2 и имеет следующую последовательность: RIRPKLK(MPA)- CONH2.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго аналога динорфина А, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NHt)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На Фиг. 25 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией A (F9).
Пример 26
Очистка конъюгата HSA: ингибитор АСЕ (SEQ ID NO:18)
В данном примере ингибитор АСЕ представляет собой ацетил- Phe-His-циклогексилстатил- Ile-Lys (г- АЕЕА - МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
AcFH-HN ^[ > IK(AEEA-MPA)-CONH2
_ОН 0_
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ ингибитора АСЕ, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NEU^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На Фиг. 26 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией A (Fl 1-F12).
Пример 27
Очистка конъюгата HSA: шестой аналог GLP-1 (SEQ ID NO:19)
Шестой аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys23 (е- АЕЕА- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGK(AEEA- MPA)AAKEFIAWLVKGR- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ шестого аналога GLP-1, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (NEL^hSO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 27 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 28
Очистка конъюгата HSA: седьмой аналог GLP-1 (SEQ ID N0:20)
Седьмой аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys18 (е- АЕЕА- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSK(AEEA- MPA)YLEGQAAKEFIAWLVKGR- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ седьмого аналога GLP-1, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEU)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 28 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 29
Очистка конъюгата HSA: восьмой аналог GLP-1 (SEQ ID NO:21)
Восьмой аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys26 (е- АЕЕА- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK(AEEA- MPA)EFIAWLVKGR- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ восьмого аналога GLP- 1, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 29 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 30
Очистка конъюгата HSA: девятый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:22)
Девятый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys27 (г- АЕЕА- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKK(AEEA- MPA)FIAWLVKGR- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ девятого аналога GLP- 1, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 30 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 31
Очистка конъюгата HSA: десятый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:23)
Десятый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys37 (s- АЕЕА- АЕЕА-МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK- АЕЕА- АЕЕА- МРА- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ десятого аналога GLP-1, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEL^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 31 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 32
Очистка конъюгата HSA: одиннадцатый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:24)
Одиннадцатый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) LysJ/ (s- АЕЕА-МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(AEEA- МРА)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ одиннадцатого аналога GLP- 1, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHO2SO4, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 32 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 33
Очистка конъюгата HSA: третий аналог эксендина-4 (SEQ ID NO:25)
Третий аналог эксендина- 4 представляет собой эксендин- 4- (1-39) Lys40 (е-АЕЕА- МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK(s- АЕЕА- МРА)-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ третьего аналога эксендина- 4, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 33 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 34
Очистка конъюгата HSA: двенадцатый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:26)
Двенадцатый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) Lys34 (Е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(AEEA- MPA)GR- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ двенадцатого аналога GLP-1, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEL^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 34 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 35
Очистка конъюгата HSA: первое производное инсулина (SEQ ID NO:4)
Первое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении В1 цепи В (SEQ ID NO: 4) и нативной А цепью (SEQ ID NO: 35), и его структура подробно представлена в Примере 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого производного инсулина, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 35 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 36
Очистка конъюгата HSA: третье производное инсулина (SEQ ID NO:27)
Первое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с ОА-МРА в положении В1 цепи В (SEQ ID NO: 27) и нативной А цепью (SEQ ID NO: 35), и его структура показана на Формуле 1 в Примере 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 4 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ третьего производного инсулина, разведённым в 21 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 36 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 37
Очистка конъюгата HSA: второе производное инсулина (SEQ ID NO:5)
Второе производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении А1 цепи A (SEQ ID NO: 5) и нативной цепью В (SEQ ID NO: 53), и его структура представлена на Формуле 1 в Примере 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго производного инсулина, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NtL^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 37 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 38
Очистка конъюгата HSA: четвёртое производное инсулина (SEQ ID NO:28)
Четвёртое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении В29 цепи В (SEQ ID NO: 28) и нативной цепью A (SEQ ID NO: 35), и его структура представлена на Формуле 1 в Примере 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ четвёртого производного инсулина, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHt)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 38 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 39
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GRF (SEQ ID NO:2)
Первый аналог GRF представляет собой GRF (1- 29) dAla2 Gin8 Ala15 Leu27 Lys30 (e-MPA) CONH2, и его последовательность представлена в Примере 2.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3.7 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, С А) с 1 мМ первого аналога GRF, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 39 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 40
Очистка конъюгата HSA: второй аналог GRF (SEQ ID N0:29)
Второй аналог GRF представляет собой GRF (1-29) Lys30 (s- МРА) CONH2, и имеет следующую последовательность:
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRK(MPA)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ второго аналога GRF, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (NHO2SO4, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фиг. 40 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 41
Очистка конъюгата HSA: третий аналог GRF (SEQ ID N0:30)
Третий аналог GRF представляет собой GRF (1-29) dAla2 Gin8 dArg11 Ala15 Leu27
Lys (e- MP A)- CONH2, и имеет следующую последовательность:
YaDAIFTQSYrKVLAQLSARKLLQDILSRK(MPA)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ третьего аналога GRF, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHt^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фиг. 41 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 42
Очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог GRF (SEQ ID NO:31)
Четвёртый аналог GRF представляет собой GRF (1-29) dAla^ LysJU (s- МРА)-CONH2, и имеет следующую последовательность:
YaDAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRK(MPA)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ третьего аналога GRF, разведённым в 22.5 мл 20 мМ
натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (NHt)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фиг. 42 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 43
Очистка конъюгата HSA: тринадцатый аналог GLP-1 CJC 1365 (SEQ ID NO:32)
Тринадцатый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (9-36) LysJ' (е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK(e- АЕЕА- МРА)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ тринадцатого аналога GLP-1, разведённым в 21.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 43 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 44
Очистка конъюгата HSA лактоза: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и имеет последовательность, показанную выше, в Примере 1.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 4 мл 25% 250 мг/мл лактозаминированного альбумина (HSA, преинкубированного с избытком лактозы при 37°С, рН 7.0) с 200 мкМ первого аналога GLP- 1 в 4 мл буфера, приготовленного из 20 мМ фосфата натрия, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEU)2S04, (рН 7.0), проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 44 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 45
Очистка конъюгата HSA: первый аналог Т20 (SEQ ID NO:33)
Первый аналог Т20 представляет собой Ас-Т20 (1-36) Lys37 (Е- АЕЕА- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
Ac- YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFK(AEEA- МРА)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, С А) с 1 мМ первого аналога Т20, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NIL^SO^ проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 45 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 46
Очистка конъюгата HSA: первый аналог Т1249 (SEQ ID NO:34)
Первый аналог Т1249 представляет собой Ас-Т1249 .(1-39) Lys40 (Е- АЕЕА- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
Ac- WQEWEQKITALLEQAQQEKNEYELQKLDKWASLWEWFK(AEEA- МРА)-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% 250 мг/мл HSA с 1 мМ первого аналога Т1249 в 10.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEL^SO,*, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 49 очищенный конъюгат выходит во фракции F4.
Пример 47
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla0 LysJ' (e-AEEA-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена в Примере 1.
Очистку 114.45 мг преформированного конъюгата первого аналога GLP-1 в 12.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHt)2S04 проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 47 показана кривая разделения, полученная для конъюгата, обнаруженного во фракции F2.
Пример 48
Очистка конъюгата HSA: первый аналог С34 (SEQ ID NO:6)
Первый аналог С34 представляет собой МРА- АЕЕА- С34- CONH2 и имеет последовательность, представленную выше, в Примере 9.
Очистку 114.45 мг преформированного конъюгата первого аналога С-34 в 12.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04
проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 48 показана кривая разделения, полученная для конъюгата, обнаруженного во фракции F2.
Пример 49
Очистка конъюгата HSA: второй аналог GRF (SEQ ID NO:29)
Второй аналог GRF представляет собой GRF (1-29) Lys30 (е- МРА)- CONH2, и его последовательность показана выше, в Примере 40.
Очистку 125.53 мг преформированного конъюгата второго аналога GRF в 12.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHO2SO4, рН 7.0, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №5, описанном выше. На Фиг. 49 показана кривая разделения, полученная для конъюгата, обнаруженного во фракции F2.
Пример 50
Очистка конъюгата HSA: аналог винорельбина (SEQ ID NO:35)
Первый аналог винорельбина представляет собой молекулу винорельбина с присоединённым к ней фрагментом АЕЕА- МРА и имеет следующую структуру:
CF3COOH CFjCOOH
Очистку конъюгата, полученного из 2.5 мл 25% HSA и 1 мМ аналога винорельбина в 22.5 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NEL^SO^ рН 7.0, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №4, описанном выше. На Фиг. 50 очищенный конъюгат выходит во фракции F2. Фракцию конъюгата концентрируют на ультрафильтре Amicon(tm) 30 кДа.
Пример 51 Очистка L-цистеина
Очистку 2.5 мл 40 мМ L- цистеина в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 1500 мМ (NBL^SOi, рН 7.0, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №4, описанном выше. На Фиг. 51 показана кривая
разделения, полученная для L- цистеина, элюированного из свободного объёма колонки (фракция F3).
Пример 52
Очистка конъюгата L- цистеин: аналог винорельбина (SEQ ГО N0:35)
Аналог винорельбина представляет собой молекулу винорельбина с присоединённым к ней фрагментом АЕЕА-МРА, как иллюстрируется в Примере 50.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 40 мМ L-цистеина с 1 мМ аналога винорельбина в 22.5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №4, описанном выше. На Фиг. 52 иллюстрируется кривая разделения, полученная для конъюгата L- цистеина, элюирующегося с фракциями F8, F9 и F10.
Пример 53
Очистка конъюгата RSA: третий аналог эксендина- 4 (SEQ ID NO:25)
Третий аналог эксендина- 4 представляет собой эксендин- 4- (1-39) Lys40 (е-АЕЕА- МРА)- CONH2 и имеет последовательность, показанную в Примере 33.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 11 мл 5% RSA (сывороточный альбумин крысы) с 200 мкМ третьего аналога эксендина- 4 в 11 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 53 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 54
Очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог С34 (SEQ ID N0:36)
Четвёртый аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Lys (s- МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
WMEWDREINNYTK(MPA)LIHSLIEESQNQQEKNEQELL-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ четвёртого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 54 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 55
Очистка конъюгата HSA: пятый аналог С34 (SEQ ID NO:37)
Пятый аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Lys35 (е- МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLK(MPA)-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ пятого аналога С34 в 13 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 55 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 56
Очистка конъюгата HSA: шестой аналог С34 (SEQ ID NO:38)
Шестой аналог С34 представляет собой МРА- С34 (1-34)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
МРА- WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ шестого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 56 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 57
Очистка конъюгата HSA: седьмой аналог С34 (SEQ ID N0:39)
Седьмой аналог C34 представляет собой Ac- С34 (1-34) Glu Lys Lys Glu Glu Lys13 Lys'4 Glu16 Glu17 Lys20 Lys21 Glu23 Glu24 Lys27 Glu31 Lys34 Lys35 Lys36 (е- AEEA-MPA)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
Ac- WEEWDKMEEYTKMEELIKKSEEQQKKNEEELKKK(AEEA- MPA)-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ седьмого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и
750 мМ (NELOiSCU, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 57 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 58
Очистка конъюгата HSA: восьмой аналог С34 (SEQ ID N0:40)
Восьмой аналог С34 представляет собой МРА- АЕЕА- С34 (1-34) Glu2 Lys6 Lys7 Glu9 Glu10 Lys13 Lys14 Glu'6 Glu17 Lys20 Lys21 Glu23 Glu24 Lys27 Glu31 Lys34 Lys35 - CONH2 и имеет следующую последовательность:
МРА- АЕЕА- WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKSEEQQKKNEEELKK- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ восьмого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHi)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 58 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 59
Очистка конъюгата HSA: первый аналог PYY (SEQ ID NO:41)
Первый аналог PYY представляет собой PYY (3-36) Lys4 (Б- OA- МРА)- CONH2 и имеет следующую структуру:
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1.5 мл 25% HSA с 1 мМ первого аналога PYY в 6 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHt)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 59 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 60
Очистка конъюгата HSA: второй аналог PYY (SEQ ID N0:42)
Первый аналог PYY представляет собой МРА- OA- PYY (3-36)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1.5 мл 25% HSA с 1 мМ второго аналога PYY в 6 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 60 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 61
Очистка конъюгата HSA: пятое производное инсулина (SEQ ID NO:43)
Пятое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с AEEAS-AEEAS-MPA в положении В29 цепи В (SEQ ID NO: 43) и нативной цепью A (SEQ ID NO: 35) и изображено на Формуле 1, Пример 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ пятого производного инсулина в 15 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 61 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 62
Очистка конъюгата HSA: шестое производное инсулина (SEQ ID N0:44)
Шестое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с AEEAS-AEEAS-MPA в положении В1 цепи В (SEQ ID NO: 44) и нативной цепью A (SEQ Ш NO: 35) и изображено на Формуле 1, Пример 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% HSA с 1 мМ шестого производного инсулина в 15 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 62 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 63
Очистка конъюгата HSA: седьмое производное инсулина (SEQ ID NO:4S)
Седьмое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с ОА-МРА в положении В29 цепи В (SEQ ID N0: 45) и нативной А цепью (SEQ ID N0: 35) и изображено на Формуле 1, Пример 7.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% HSA с 1 мМ седьмого производного инсулина в 15 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 63 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 64
Очистка конъюгата HSA: второй аналог PYY (SEQ ID N0:46)
Третий аналог PYY представляет собой MPA-PYY (3-36)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
МРА- NH- IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% HSA с 1 мМ третьего аналога PYY в 18 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 64 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 65
Очистка конъюгата HSA: четвёртый аналог PYY (SEQ ID NO:47)
Четвёртый аналог PYY представляет собой PYY (3-36) Lys37 (е- МРА)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYK(MPA)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% HSA с 1 мМ четвёртого аналога PYY в 18 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 65 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 66
Очистка конъюгата HSA: пятый аналог PYY (SEQ ID NO:48)
Пятый аналог PYY представляет собой МРА- PYY (22-36)- CONH2 и имеет следующую последовательность:
(МРА)- ASLRHYLNLVTRQRY- CONH2.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 6 мл 25% HSA с 1 мМ пятого аналога PYY в 36 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фиг. 66 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 67
Очистка конъюгата HSA: шестой аналог PYY (SEQ ID NO:49)
Шестой аналог PYY представляет собой Ацетил- PYY (22- 36) LysJ/ (е- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
ASLRHYLNLVTRQRYK (МРА)- CONH2.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 6 мл 25% HSA с 1 мМ шестого аналога PYY в 36 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фиг. 67 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 68
Очистка конъюгата HSA: второй аналог ANP (SEQ ID N0:50)
Второй аналог ANP представляет собой МРА- ANP (99-126)- CONH2 и имеет следующую структуру:
MPA-Ser-I^u-Arg-Arg-Ser-Ser-Cy|-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ilc-GIy-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% HSA с 1 мМ шестого аналога ANP в 14 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фиг. 68 очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 69
Очистка конъюгата HSA: третий аналог ANP (SEQ ID NO:51)
Третий аналог ANP представляет собой ANP (99-126), прореагировавший с MAL-dPEG4(tm) (Quanta Biodesign, Powell, OH, USA), связанным с Ser". Полученный в результате аналог ANP представляет собой МРА- ЕЕЕЕР- ANP (99- 126), где ЕЕЕЕР обозначает этокси- этокси- этокси- этоксипропионовую кислоту; и имеет следующую последовательность:
NffA-EEEEP-Ser-I^u-Arg-Aig-SCT-Sw
ne-Gly-Ak4jto-Ser-Gly-I^u <}ly <^s-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr <:0^2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% HSA с 1 мМ шестого аналога CJC 1681 в 14 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (NELO2SO4, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На Фйг. 69А и 69В очищенный конъюгат выходит во фракции F2.
Пример 70
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (Е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена выше, в Примере 1.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 1.75 М (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №6, описанном выше. На Фиг. 70 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции В.
Пример 71
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (Е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена выше, в Примере 1.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 1.75 М (сульфата магния, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №6, описанном выше. На Фиг. 71 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции F2.
Пример 72
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (Б- АЕЕА-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена выше, в Примере 1.
Пример с 750 мМ сульфата аммония. Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NHO2SO4, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 72 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции F2.
Пример 73
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (Е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена выше, в Примере 1.
Пример с 1.75 М фосфата аммония. Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 1.75 М фосфата аммония, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №6, описанном выше. На Фиг. 73 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции В.
Пример 74
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-1 (SEQ ID NO:l)
Первый аналог GLP-1 представляет собой GLP-1 (7-36) dAla8 Lys37 (Е- АЕЕА-МРА)- CONH2 и его последовательность представлена выше, в Примере 1.
Пример с 750 мМ фосфата аммония. Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex- Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ фосфата аммония, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 74 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции F2.
Пример 75
Очистка конъюгата HSA: первый аналог GLP-2 (SEQ ID NO:52)
Первый аналог GLP-2 представляет собой GLP-2 (1-33) Gly2 Lys34 (е- МРА)-CONH2 и имеет следующую последовательность:
HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDK(MPA)- CONH2
Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% 250 мг/мл HSA (Cortex-Biochem, San Leandro, CA) с 1 мМ первого аналога GLP- 2, разведённым в 14 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NH4)2S04, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 75 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции F2.
Пример 76
Очистка конъюгата RSA: первый аналог GLP-2 (SEQ ID NO:52)
Первый аналог GLP-2 представляет собой GLP-2 (1-33) Gly2 Lys34 (е- МРА)-CONH2 и его последовательность представлена в Примере 75.
Очистку конъюгата, полученного по реакции 9 мл 25% 250 мг/мл RSA (сывороточный альбумин крысы) с 1 мМ первого аналога GLP- 2, разведённым в 14 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий- фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№14)2804, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На Фиг. 76 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции F2.
Хотя изобретение описывается на его конкретных вариантах, понятно, что возможны его дальнейшие модификации, и предполагается, что данная заявка охватывает любые варианты, применения или улучшения изобретения, следующие, в целом, принципам изобретения и включающие такие отступления от настоящего описания, которые подпадают под известную или обычную практику в уровне техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, представленным выше в данном описании, и которые соответствуют объёму прилагаемой Формулы изобретения.
Формула изобретения
1. Способ отделения конъюгата альбумина от неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгат альбумина и неконъюгированный альбумин, причём конъюгат албумина состоит из молекулы, прореагировавшей с альбумином с образованием ковалентной связи с цистеином 34 альбумина, включающий:
а) нанесение раствора на матрицу для хроматографии гидрофобных взаимодействий, уравновешенную водным буфером с высоким содержанием соли;
б) подачу на матрицу градиента, понижающего содержание соли; и
в) сбор элюированного содержимого, содержащего конъюгат альбумина или неконъюгированный альбумин.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, чтоконъюгат альбумина состоит из молекулы, содержащей ковалентно присоединённый к ней акцептор Михаэля, который связывается с альбумином.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что связь осуществляется между акцептором Михаэля и цистеином 34 альбумина.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что акцептор Михаэля представляет собой малеинимидную группу.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что малеинимидная группа представляет собой малеинимид- пропионовую кислоту (МРА).
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, рекомбинантного альбумина и альбумина из геномного источника.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин выбирают из группы, состоящей из человеческого альбумина, альбумина крысы, альбумина мыши, альбумина свиньи, бычьего альбумина, альбумина собаки и кроличьего альбумина.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин модифицирован с помощью, по меньшей мере, одного агента, выбранного из группы, состоящей из жирных кислот, ионов металлов, молекул с высокой аффинностью к альбумину и Сахаров.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что сахара выбирают из группы, состоящей из глюкозы, лактозы и маннозы.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекулу выбирают из группы, состоящей из пептида, ДНК, РНК, органической молекулы, а элюированное содержимое, собранное на стадии с) представляет собой конъюгат альбумина.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептид имеет молекулярную массу, по меньшей мере, 57 дальтон.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептид выбран из группы, состоящей из GLP-1, эксендин-4, ANP, К5, динорфина, GRF, инсулина, натрийуретических пептидов, Т- 20, Т-1249, С-34, SC-35, PYY и их аналогов.
14. Способ по п.П, отличающийся тем, что органическая молекула выбрана из группы, состоящей из винорельбина, гемцитабина и паклитаксела.
15. Способ по п.П, отличающийся тем, что молекула ковалентно связана с альбумином чувствительной к кислоте ковалентной связью или пептидной последовательностью, чувствительной к протеолитическому расщеплению, что способствует отделению молекулы от альбумина и входу молекулы в клетку.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что матрица для хроматографии гидрофобных взаимодействий представляет собой колонку, содержащую гидрофобный полимер.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что гидрофобный полимер выбирают из группы, состоящей из октил-сефарозы, фенил-сефарозы и бутил-сефарозы.
18. Способ по п. 16, отличаюпшйся тем, что гидрофобный полимер представляет собой бутил-сефарозу.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль оказывает достаточный эффект высаливания.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль выбирают из группы, состоящей из фосфата аммония, сульфата аммония и фосфата магния.
21. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль представляет собой фосфат аммония или сульфат аммония.
22. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль представляет собой сульфат аммония.
23. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекула конъюгата альбумина представляет собой цистеин, а элюированное содержимое, собранное на стадии с) представляет собой неконъюгированный альбумин.
mAU 2000
e =
60.о
40.0
20.0
mAU 2000
69/76
вается
Перечень последовательностей
<110> КонджаЧем Инк.
<120> Способ очистки конъюгатов альбумина <130> 3310
<140> РСТ/СА2005/000614 <141> 2005-04-22
<150> US 60/565,228 <151> 2004-04-23
<160> 53
<170> Patentln version 3.1
<210> 1 <211> 31 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Хаа является D-Ala <220>
<221> САЙТ <222> 31
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 1
His Хаа Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30
<210> 2 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GRF <220>
<221> САЙТ
<222> 2
<223> Хаа является Ala или D-Ala <220>
<221> САЙТ <222> 8
<223> Хаа является Lys, связанной с МРА <400> 2
Туг Xaa Asp Ala lie Phe Thr Gin Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin 1 5 10 ' 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu. Ser" Arg Xaa 20 25 30
<210> 3 <211> 8 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог K5
<220> <221> САЙТ <222> 8
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 3
Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Xaa 1 5
<210> 4
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи В инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Хаа является Phe, связанной с МРА <400> 4
Xaa Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
<210> 5
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи А инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Хаа является Gly, связанной с МРА <400> 5
Xaa Не Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20
<210> 6 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог C34 <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Xaa является Trp, связанной с AEEA-MPA <400> 6
Xaa Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Ser Leu He His 15 10 15
Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu
<210> 7 <211> 35 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог C34 <220>
<221> САЙТ <222> 35
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 7
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Ser Leu He His 15 10 15
Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu Xaa 35
<210> 8 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог C34 <220>
<221> САЙТ <222> 13
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 8
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Xaa Leu He His 15 10 15
Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu
<210> 9 <211> 31 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 31
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА
<400> 9
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30
<210> 10 <211> 31 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Xaa является D-Ala <220>
<221> САЙТ <222> 31
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА
<400> 10
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30
<210> 11 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 20
<223> Xaa является Lys, связанной с AEEA-AEEA-MPA
<400> 11
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Xaa Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 12 <211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 28
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-АЕЕА-МРА
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Xaa Gly Arg 20 25 30
<210> 13 <211> 40 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог Эксендина-4 <220>
<221> САЙТ <222> 40
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 13
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu 1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40
<210> 14 <211> 32 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог Эксендина-4 <220>
<221> САЙТ
<222> 32
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 14
Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu 15 10 15
Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 20 25 30
<210> 15 <211> 13 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог Динорфина A
<220> <221> .САЙТ <222> 13
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 15
Tyr Gly Gly Phe Leu Arg Arg He Arg Pro Lys Leu Xaa 15 10
<210> 16 <211> 28 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог ANP
<220> <221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Ser, связанной с АЕЕА-МРА <400> 16
Xaa Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg He Gly 15 10 15
Ala Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25
<210> 17 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог Динорфина А <220>
<221> САЙТ <222> 7
<223> Хаа является Lys, связанной с МРА <400> 17
Arg Не Arg Pro Lys Leu Xaa 1.5
<210> 18 <211> 4 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Ингибитор ACE <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Xaa является His, связанной с cyclohexylstatyl <220>
<221> САЙТ <222> (4)
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 18
Phe Xaa He Xaa 1
<210> 19 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 17
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 19
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Xaa Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 20 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 12
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 20
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 21 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 20
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 21
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Xaa Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 22 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1
<220>
<221> САЙТ <222> 21
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 22
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Xaa Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30
<210> 23 <211> 31 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 31
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-АЕЕА-МРА
<400> 23
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30
<210> 24 <211> 31 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 31
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 24
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30
<210> 25 <211> 40 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог Эксендина-4 <220>
<221> САЙТ <222> 40
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 25
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gin Met Glu Gl 15 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Se 20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa 35 40
<210> 26 <211> 31 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 28
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 26
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gl; 15 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Xaa Gly Arg Lys 20 25 30
<210> 27
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи В инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Хаа является Phe, связанной с ОА-МРА <400> 27
Хаа Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15.
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
<210> 28
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи В инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 29
<223> Хаа является Lys, связанной с МРА <400> 28
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 20 25 30
<210> 29 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GRF <220>
<221> САЙТ <222> 8
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 29
Tyr Ala Asp Ala He Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 15 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Xaa 20 25 30
<210> 30 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GRF <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Xaa является D-Ala <220>
<221> САЙТ <222> 11
<223> Xaa является D-Arg <220>
<221> САЙТ <222> 30
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 30
Tyr Xaa Asp Ala He Phe Thr Gin Ser Tyr Xaa Lys Val Leu Arg Gin 15 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp He Leu Ser Arg Xaa 20 25 30
<210> 31 <211> 30 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GRF <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Xaa является D-Ala <220>
<221> САЙТ <222> 30
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 31
Tyr Xaa Asp Ala He Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin
15 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp He Met Ser Arg Xaa 20 25 30
<210> 32 <211> 29 <212> .БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог GLP-1 <220>
<221> САЙТ <222> 29
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА
<400> 32
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 1 5
Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala 10 15
Val Lys Gly Arg Xaa 25
<210> 33 <211> 37 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог T20 <220>
<221> САЙТ <222> 37
<223> Xaa является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 33
Tyr Thr Ser Leu He His Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin 15 10 15
Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30
Trp Asn Trp Phe Xaa 35
<210> 34 <211> 40 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог Т1249 <220>
<221> САЙТ <222> 40
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 34
Trp Gin.Glu Trp Glu Gin Lys He Thr Ala Leu Leu Glu Gin Ala Gin 15 10 15
He Gin Gin Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gin Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30
Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Xaa 35 40
<210> 35
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Цепь А инсулина <400> 35
Gly He Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20
<210> 36 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог C34
<220> <221> САЙТ <222> 13
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 36
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Xaa Leu He His 15 10 15
Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu
<210> 37 <211> 35 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <22б>
<223> Аналог C34 <220>
<221> САЙТ <222> 35
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 35
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Ser Leu He His 15 10 15
Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu Xaa 35
<210> 38 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог C34 <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Trp, связанной с МРА <400> 38
Xaa Met Glu Trp Asp Arg Glu He Asn Asn Tyr Thr Ser Leu He His 15 10 15
Ser Leu He Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu
<210> 39 <211> 36 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аналог С34 <220>
<221> САЙТ <222> 36
<223> Хаа является Lys, связанной с АЕЕА-МРА <400> 39
Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys He Glu Glu Tyr Thr Lys Lys He Glu 1 5 10 15
Glu Leu He Lys Lys Ser Glu Glu Gin Gin Lys Lys Asn Glu Glu Glu 20 25 30
Leu Lys Lys Xaa 35
<210> 40 <211> 35 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог C34 <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Trp, связанной с МРА <400> 40
Xaa Glu Glu Trp Asp Lys Lys He Glu Glu Tyr Thr Lys Lys He Glu 15 10 15
Glu Leu He Lys Lys Ser Glu Glu Gin Gin Lys Lys Asn Glu Glu Glu 20 25 30
Leu Lys Lys 35
<210> 41 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог PYY <220>
<221> САЙТ <222> 2
<223> Xaa является Lys, связанной с OA-MPA
<400> 41
Не Хаа Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Arg Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15
Arg Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25. 30
Arg Tyr
<210> 42 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог PYY <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Не, связанной с OA-MPA <400> 42
Xaa Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Arg Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15
Arg Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30
Arg Tyr
<210> 43
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи В инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 29
<223> Хаа является Lys, связанной с AEEAS-AEEAS-МРА <400> 43
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 20 25 30
<210> 44
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи В инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Хаа является Phe, связанной с AEEAS-AEEAS-МРА <400> 44
Хаа Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
<210> 45
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Производная цепи В инсулина <220>
<221> САЙТ <222> 29
<223> Хаа является Lys, связанной с ОА-МРА <400> 45
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr 20 25 30
<210> 46 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог PYY <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Хаа является Не, связанной с МРА <400> 46
Хаа Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Arg Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15
Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30
Arg Tyr
<210> 47 <211> 35 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог PYY
<220> <221> САЙТ <222> 35
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 47
He Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Arg Ser Pro Glu Glu Leu Asn 15 10 15
Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin 20 25 30
Arg Tyr Xaa 35
<210> 48 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог PYY
<220> <221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Arg, связанной с МРА <400> 46
Xaa Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin Arg Tyr 15 10 15
<210> 49 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог PYY <220>
<221> САЙТ <222> 16
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 49
Arg Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gin Arg Tyr Xaa 15 10 15
<210> 50 <211> 28 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог ANP <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Ser, связанной с МРА <400> 50
Xaa Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg He Gly 15 10 15
Ala Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25
<210> 51 <211> 28 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аналог ANP <220>
<221> САЙТ <222> 1
<223> Xaa является Ser, связанной с EEEEP-MPA <400> 51
Xaa Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg He Gly 15 10 15
Ala Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25
<210> 52 <211> 34 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220> ' <223> Аналог GLP-2
<220>
<221> САЙТ <222> 34
<223> Xaa является Lys, связанной с МРА <400> 52
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr He Leu Asp Asn 1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe He Asn Trp Leu He Gin Thr Lys He Thr 20 25 30
Asp Xaa
<210> 53
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Цепь В инсулина <400> 53
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 15 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30