Изобретение относится к синтетическим молекулам, которые спонтанно и стабильно включаются в липидные бислои, в том числе клеточные мембраны. Конкретно, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических мембранных якорей или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии клеточных поверхностных антигенов.

 

(57) Реферат / Формула:
относится к синтетическим молекулам, которые спонтанно и стабильно включаются в липидные бислои, в том числе клеточные мембраны. Конкретно, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических мембранных якорей или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии клеточных поверхностных антигенов.

 

---

СИНТЕТИЧЕСКИЕ "МЕМБРАННЫЕ ЯКОРИ"
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Изобретение относится к синтетическим молекулам, которые самопроизвольно и стабильно включаются в липидные бислои, включающие клеточные мембраны. В частности, хотя и не исключительно, изобретение относится к применению этих молекул в качестве синтетических "мембранных якорей" или синтетических молекулярных конструкций для осуществления качественных и количественных изменений в экспрессии антигенов клеточной поверхности.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Антигены клеточной поверхности опосредуют ряд взаимодействий между клетками и их окружающей средой. Эти взаимодействия включают в себя взаимодействие клетка-клетка, взаимодействия клетка-поверхность и взаимодействия клетка-растворенное вещество. Антигены клеточной поверхности опосредуют также внутриклеточную передачу сигнала.
Клетки характеризуются количественными и количественными различиями в экспрессированных антигенах клеточной поверхности. Количественные и количественные различия в экспрессированных антигенах клеточной поверхности изменяют как функцию клетки (способ действия), так и функциональность клетки (оказываемое действие).
Способность осуществлять качественные и/или количественные изменения в антигенах клеточной поверхности, экспрессированных клетками, имеет диагностическую и терапевтическую ценность. Трансгенные и нетрансгенные методы осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой, являются известными.
Окрашивание белка является нетрансгенным методом осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой. Этот метод использует способность GPI-связанных белков спонтанно прикрепляться к клеточной мембране через их липидные хвосты. Метод, описанный в описании, сопровождающем Международную патентную заявку № PCT/US98/15124 (WO 99/05255), включает в себя стадию встраивания GPI-связанного. белка, выделенного из биологического источника, в мембрану. Выделенные GPI-прикрепленные белки указываются как обладающие необычной способностью
реинтегрироваться с мембраной поверхности клетки.
Клетки существуют в водной окружающей среде. Клеточная мембрана является липидным бислоем, который служит в качестве полупроницаемого барьера между цитоплазмой клетки и этой водной окружающей средой. Локализацию антигенов на клеточной поверхности можно также достичь посредством применения гликолипидов в качестве "мембранных якорей".
Способ, описанный в описании, сопровождающем Международную патентную заявку № PCT/NZ02/00214 (WO 93/034074), включает в себя стадию встраивания регулируемого количества гликолипида в мембрану. Количество встроенного гликолипида регулируют для обеспечения клеток требуемым уровнем экспрессии антигена.
Способ, описанный в описании, сопровождающем Международную патентную заявку № PCT/NZ03/00059 (WO 93/087346), включает в себя стадию встраивания модифицированного гликолипида в мембрану в качестве "мембранного якоря". Модифицированный гликолипид обеспечивает локализацию антигенов на поверхности клетки или поликлеточной структуры. Тем самым клетке или поликлеточной структуре могут быть приданы новые характеристики.
Эти методы обычно включают в себя выделение гликолипида или связанного с гликолипидом антигена из биологического источника. Выделение гликолипидов или связанных с гликолипидом антигенов из биологических источников является дорогим, изменяемые и поддающиеся выделению количества их часто ограничены. Терапевтическое применение получаемых из зоологических источников реагентов является особенно проблематичным, особенно когда реагент или его продукты-производные нужно ввести субъекту, являющемуся человеком.
Предпочтительными являются синтетические молекулы, для которых риск загрязнения зоопатогенными агентами может быть исключен. Описаны синтетические аналоги для существующих в природе гликолипидов и синтетических неогликолипидов. Однако, синтетический гликолипид, который нужно применять в качестве "мембранного якоря", должен быть способен спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой из водной окружающей среды. Полезность синтетических гликолипидов в диагностических или терапевтических применениях дополнительно ограничивается теми синтетическими гликолипидами, которые могут образовывать раствор в солевом растворе.
Органические растворители и/или поверхностно-активные вещества, применяемые для облегчения растворения гликолипидов в солевом растворе, должны быть биосовместимыми. Растворители и поверхностно-активные вещества часто должны быть исключены или быстро удалены, так как они могут вредными для некоторых клеточных мембран. Удаление растворителей или поверхностно-активных веществ из таких препаратов может быть проблематичным.
Повреждение клеточных мембран должно быть исключено, особенно, когда подача клеток или поликлеточных структур ограничена, например, эмбрионов, или клетки являются особенно восприимчивыми к нарушению, например, гепатоциты.
Здесь существует потребность в водорастворимых синтетических молекулах, которые являются функционально эквивалентными существующим в природе гликолипидам и связанных с гликолипидом антигенам в отношении их способности спонтанно и стабильно включаться в липидные бислои, включая клеточные мембраны. Обеспечение такими синтетическими молекулами может устранить ограничения гликолипидов и связанных с гликолипидами антигенов, выделенных из биологических источников, и облегчить их способность осуществлять качественные и/или количественные изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой.
Задачей данного изобретения является обеспечение таких синтетических молекул и метода для их получения. Следующей задачей данного изобретения является предоставление синтетических молекул для применения в диагностических и терапевтических применениях. Предшествующие задачи должны быть истолкованы отдельно от настоящей задачи, чтобы, по меньшей мере, обеспечить общественность полезным выбором.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте изобретение заключается в применении молекулы структуры R-S2-L в качестве синтетического "мембранного якоря" или при получении синтетических молекулярных конструкций, где:
R представляет собой химически реакционноспособную функциональную группу;
S2 представляет собой спейсер, связывающий R с L; и
L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из
диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды, и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих церамид.
Предпочтительно, R выбран из группы, включающей в себя 6nc-(N-гидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис(пентафторфенил), бис(пентахлорфенил).
Предпочтительно, S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат (Ad)) и -СО(СН2)5СО-.
Предпочтительно, R и S2 являются связанными сложноэфирными связями.
Предпочтительно, L представляет собой липид, выбранный из группы, включающей в себя диацил- и диалкилглицеролипиды, включая глицерофосфолипиды. Более предпочтительно, L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученного из одной или нескольких из транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно, липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно, L выбран из группы, состоящей из 1,2-0-диолеоил-8п-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-0-дистеарил-зп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).
Предпочтительно, L представляет собой глицерофосфолипид и молекула его включает в себя структуру
О О
о-р-о
"УХ
где п равно 3-5 и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно, п равно 3.
В конкретных вариантах осуществления молекула имеет структуру:
обозначенную Ad-DOPE; структуру:
обозначенную Ad-DSPE.
М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
Во втором аспекте изобретение заключается в синтетической молекулярной конструкции структуры F-SrS2-L, где:
F представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина;
Si-S2 представляет собой спейсер, связывающий F с L; и
L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды, и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включая церамид.
Предпочтительно, молекула является водорастворимой.
Предпочтительно, молекула спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор молекулы контактирует с липидным бислоем. Более предпочтительно, молекула стабильно включается в липидный бислой.
Предпочтительно, F, Si, S2 и L ковалентно связаны.
Предпочтительно, F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов),
лецитинов, авидинов и биотина. Наиболее предпочтительно, F выбран из группы, состоящей из существующих в природе и синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).
Предпочтительно, L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды. Более предпочтительно, L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких из транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цтс-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно, липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно, L выбран из группы, состоящей из 1,2-0-диолеоил-8П-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-0-дистеарил-зп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).
Предпочтительно, L представляет собой глицерофосфолипид и молекула его включает в себя субструктуру.
0 0 О
где п равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно, п равно 3.
SrS2 выбран так, чтобы образовывалась водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция.
В первом варианте осуществления F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. Предпочтительно, F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более единиц Сахаров. Более предпочтительно, F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила,
глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила,
ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила,
изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила олигосахаридов. Более предпочтительно, F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара GalNAca1-3(Fuca1-2)Gaip; Gala1-3Gaip; Gaip; Galal-3(Fuca1-2)Galp; NeuAca2-3Galp; NeuAca2-6Galp; Fuca1-2Gaip; Gaipl-4GlcNAcpi-6(Galp1-4GlcNAcp1-3)Gaip; Fucct1-2Galp1-4GlcNAcp1-6(Fuca1-2Galp1 -4GlcNAcp1 -3)Gaip; Fucccl -2Gaipi -4GlcNAcp1 -6(NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcp1 -3)Galp; NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcp1 -6(NeuAca2-3Galp1 -
4GlcNAcp1 -3)Gaip; Galal -3Galp1 -4Glc; GalNAcpl -3Gala1 -4Galp1 -4Glc; GalNAcal-3GalNAcp1 -3Gala1 -4Galp1 -4Glc или GalNAcpl-3GalNAcp1 -3Gala1 -4Galp1-4Glc.
Когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-, предпочтительно, Si представляет собой С3. 5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила. Более предпочтительно, ST представляет собой 3-аминопропил.
Во втором варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность. Предпочтительно, F представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности. Более предпочтительно, F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах. Еще более предпочтительно, F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия. Наиболее предпочтительно, компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
В третьем варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество. Предпочтительно, F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно, F представляет собой
лиганд для антитела (иммуноглобулина).
В конкретных вариантах осуществления водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную ATpi1-sp-Ad-DOPE (I); структуру:
обозначенную Атри-spspi-Ad-DOPE (II); структуру:
обозначенную BTpM-sp-Ad-DOPE (VI); структуру:
обозначенную HTpM-sp-Ad-DOPE (VII); структуру:
обозначенную Fuca1-2Gaipi-3GlcNAcpi-3Galp1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII); или структуру:
°М 1 <Н*С)т""ЛРНЛСН,
crT(CHj)7
(СНгЫ^Нз
обозначенную Fuca1-2Gaipi-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
В третьем аспекте изобретение заключается в методе получения синтетической молекулярной конструкции F-Si-S2-L, включающем в себя стадии:
1. реакцию активатора (А) с липидом (L) с образованием активированного липида (A-L);
2. дериватизацию антигена (F) для получения производного антигена (F-S,) и
3. конденсацию A-L с для получения молекулы; в которой:
А представляет собой активатор, выбранный из группы, включающей в себя бис-(М-гидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис(пентафторфенил), бис(пентахлорфениловые) эфиры карбодиовых кислот (С3-С7);
L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды; и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих в себя церамид;
F представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина, и
Б^вг представляет собой спейсер, связывающий F с L, где Si выбран из группы, включающей в себя первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин, и S2 отсутствует или выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат) и -СО(СН2)5СО-.
Предпочтительно, молекула является водорастворимой.
Предпочтительно, молекула спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор молекулы контактирует с липидным бислоем. Более предпочтительно, молекула стабильно включается в липидный бислой.
Предпочтительно, F, S2 и L являются ковалентно связанными.
Предпочтительно, F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина. Наиболее предпочтительно, F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).
Предпочтительно, L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды. Более предпочтительно, L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот: транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты. Более предпочтительно, липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот. Наиболее предпочтительно, L выбран из группы, состоящей из 1,2-0-диолеоил-зп-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-0-дистеарил-sn-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-
диолеоилглицерина (DOG).
Предпочтительно, L представляет собой глицерофосфолипид и молекула его включает в себя структуру:
. о ?
где п равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н. Предпочтительно, п равно 3.
Предпочтительно, A (R-S2) и Si выбраны так, чтобы образовывалась водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция.
В первом варианте осуществления F представляет собой
существующий в природе или синтетический гликотоп. Предпочтительно, F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп, состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев Сахаров. Более предпочтительно, F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботераозила,
глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила,
ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила,
изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила олигосахаридов. Наиболее предпочтительно, F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара GalNAca1-3(Fuca1-2)Gaip; Gala1-3Galp; Galp; Galal-3(Fuca1-2)Galp; NeuAca2-3Galp; NeuAcoc2-6Galp; Fuca1-2Galp; Galpl-4GlcNAcpi-6(Gaipi-4GlcNAcp1-3)Gaip; Fucoc1-2Galp1-4GlcNAcp1-6(Fuca1-2Galp1-4GlcNAcp1-3)Galp; Fuca1-2Galp1-4GlcNAcp1-6(NeuAca2-3Galp1-4GlcNAcpi -3)Galp; NeuAca2-3Gaipi -4GlcNAcp1 -6(NeuAca2-3Gaipi -
4GlcNAcp1 -3)Galp; Galal -3Gaipi -4Glc; GalNAcpl -3Gala1 -4Gaipi -4Glc; GalNAca1-3GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc или GalNAcp1-3GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc.
Когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- (например, А представляет собой бис-(1Ч-гидроксисукцинимидил)адипат),
предпочтительно, ST представляет собой С3.5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила). Более предпочтительно, ST представляет собой 3-аминопропил.
Во втором варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность. Предпочтительно, F представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности. Более предпочтительно, F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах. Еще более предпочтительно, F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия. Наиболее предпочтительно, компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице
эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
В третьем варианте осуществления F представляет собой молекулу, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество. Предпочтительно, F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно, F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
В конкретных вариантах осуществления водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную ATp(1-sp-Ad-DOPE (I); структуру:
обозначенную ATpM-spsprAd-DOPE (II); структуру: он
обозначенную ATpM-sp-Ad-DSPE (III); структуру:
но-Д--0(рн он \
[но он
обозначенную BTp"-sp-Ad-DOPE (VI); структуру:
9*fH NHAc ОН
ом о Г
Y (Н2С)Т> Ч_^(СН2)7СН,
-(СН2)7СНз
-(СН^СН,
ом о ^^"^(снлсн, о
обозначенную HTpM-sp-Ad-DOPE (VII); структуру:
,NH
N^o-ro Y V°
н ом о
O^NcH2)7
-(СНг)7СН3
обозначенную Hfl"-sp-Ad-DOPE (VIII); структуру:
но.
,NH
о о
Н °М ? wJ^^CH^CH,
0^(СН2)7
-(СН^СНз
обозначенную Galp,-sp-Ad-DOPE (IX); структуру:
[но
о о
н ом ^(ЦоГ^снлсн, но' ;NH~ 0 (сн,),
Ас ^-(CHJTCH,
обозначенную Fuca1-2Galp1-3GlcNAcp1-3Gaipi-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII);
или структуру:
обозначенную Fuca1-2Gaipi-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К* или NH/.
В четвертом аспекте изобретение относится к водорастворимой синтетической молекулярной конструкции, полученной методом согласно третьему аспекту изобретения.
В пятом аспекте изобретение относится к методу осуществления качественных и количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессируемых клеточной или поликлеточной структурой, включающему стадию:
1. контактирования суспензии клеточной или поликлеточной структуры с синтетической молекулярной конструкцией согласно второму аспекту или четвертому аспекту изобретения в течение времени и при температуре, достаточных для осуществления качественного и/или количественного изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеточной или поликлеточной структурой.
Предпочтительно, клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
Предпочтительно, концентрация водорастворимой синтетической молекулярной конструкции в суспензии находится в диапазоне 0,1-10 мг/мл.
Предпочтительно, температура находится в диапазоне 2-37°С. Более предпочтительно, температура находится в диапазоне 2-25°С. Наиболее предпочтительно, температура находится в диапазоне 2-4°С.
В первом варианте осуществления клеткой является эритроцит.
В этот варианте осуществления, предпочтительно, F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара GalNAccc1-3(Fuca1-2)Galp; Gala1-3Galp; Galp; Gala1-3(Fuca1-2)Galp; NeuAca2-3Galp; NeuAca2
6Galp; Fuca1-2Galp; Gaipi-4GlcNAcp1-6(Galp1-4GlcNAcpi-3)Gaip; Fucccl-2Gaipi-4GlcNAcp1-6(Fuca1-2Galp1-4GlcNAcp1-3)Gaip; Fuca1-2Galp1-4GlcNAcp1 -6(NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcpi -3)Galp; NeuAca2-3Galp1 -
4GlcNAcp1-6(NeuAca2-3Gaipi-4GlcNAcpi-3)Gaip; Gala1-3Gaipi-4Glc; GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc; GalNAca1-3GalNAcp1-3Gala1-4Gaipi-4Glc или GalNAcpi-3GalNAcp1-3Galcc1-4Gaipi-4Glc.
Предпочтительно, синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя: ATpi1-sp-Ad-DOPE (I); Атри-spsp^Ad-DOPE (II); ATp"-sp-Ad-DSPE (III); BTpv)-sp-Ad-DOPE (VI); HTp"-sp-Ad-DOPE (VII); Hfl"-sp-Ad-DOPE (VIII); Galpi-sp-Ad-DOPE (IX); Fuca1-2Galp1-3GlcNAcp1-3Gaipr 4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Gaipi-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
Во втором варианте осуществления поликлеточной структурой является эмбрион.
В этом варианте осуществления, предпочтительно, F представляет собой молекулу присоединения, где молекула присоединения имеет аффинность в отношении компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.
Компонентом, экспрессируемым на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндотелия может быть экспрессируемый в природе компонент или экзогенно включаемый компонент.
Предпочтительно, синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя: ATPM-sp-Ad-DOPE (I); Атри-spsprAd-DOPE (II); ATp"-sp-Ad-DSPE (III); BTpv,-sp-Ad-DOPE (VI); HTpM-sp-Ad-DOPE (VII); HflM-sp-Ad-DOPE (VIII); GaiPi-sp-Ad-DOPE (IX); Fuccc1-2Gaipi-3GlcNAcpi-3Galpr 4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
Третьим вариантом осуществления клетки является эритроцит.
В этом варианте осуществления, предпочтительно, F представляет собой лиганд для молекулы связывания, где присутствие молекулы связывания является диагностическим для патологического состояния. Более предпочтительно, F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
В шестом аспекте изобретение заключается в клеточной или поликлеточной структуре, включающей в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию согласно второму или
четвертому аспекту изобретения.
Предпочтительно, клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
В первом варианте осуществления клеткой является эритроцит, включающей в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя: ATp"-sp-Ad-DOPE
(I) ; Атри-spspMd-DOPE (II); ATp"-sp-Ad-DSPE (III); BTp"-sp-Ad-DOPE (VI); Нтри-sp-Ad-DOPE (VII); Hfl"-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE (IX); Fucal-2Galp1-3GlcNAcp1-3Gaip,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Gaipi-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
Во втором варианте осуществления клеткой является эмбрион, включающий в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из: ATpi1-sp-Ad-DOPE (I); Атри-spsp^Ad-DOPE (II); ATp"-sp-Ad-DSPE (III); BTpM-sp-Ad-DOPE (VI); HTpi1-sp-Ad-DOPE (VII); Нди-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE (IX); Fuca1-2Galp1-3GlcNAcp1-3Gaip,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Galp1-3(Fuccc1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
В седьмом аспекте изобретение заключается в наборе, включающем в себя высушенный препарат или раствор молекулы согласно первому аспекту изобретения, или высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции согласно второму или четвертому аспекту изобретения.
Предпочтительно, молекула согласно первому аспекту изобретения выбрана из группы, состоящей из Ad-DOPE; sp^Ad-DOPE и ad-DSPE.
Предпочтительно, водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция согласно второму или четвертому аспекту изобретения выбрана из группы, состоящей из ATpM-sp-Ad-DOPE (I); ATp"-spspi-Ad-DOPE
(II) ; ATPH-sp-Ad-DSPE (III); BTpii-sp-Ad-DOPE (VI); HTpirsp-Ad-DOPE (VII); Нди-sp-Ad-DOPE (VIII); Gaip,-sp-Ad-DOPE (IX); Fuca1-2Galp1-3GlcNAcp1-3Gaip,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
В восьмом аспекте изобретение заключается в наборе, включающем в себя суспензию в суспендирующем растворе клеток или поликлеточных структур согласно шестому аспекту изобретения.
Предпочтительно, суспендирующий раствор по существу не содержит
липид.
Предпочтительно, клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
Предпочтительно, клетки являются эритроцитами, которые в природе не экспрессируют А- или В-антиген и включают в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из ATpM-sp-Ad-DOPE (I); ArpM-spspn-Ad-DOPE (II); ATp"-sp-Ad-DSPE (III); Втри-sp-Ad-DOPE (VI); HTpii-sp-Ad-DOPE (VII); H^-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE (IX); Fuc В девятом аспекте изобретение заключается в фармацевтическом препарате, включающем в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции согласно второму или пятому аспекту изобретения.
Предпочтительно, фармацевтический препарат находится в форме для ведения ингаляций.
Предпочтительно, фармацевтический препарат находится в форме для ведения инъекцией.
В десятом аспекте изобретение заключается в фармацевтическом препарате, включающем в себя клетки или поликлеточные структуры согласно шестому аспекту изобретения.
Предпочтительно, клетки или поликлеточные структуры имеют человеческое или мышиное происхождение.
Предпочтительно, фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
Предпочтительно, фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ Синтетические молекулярные конструкции изобретения спонтанно и стабильно включаются в липидный бислой, такой как мембрана, когда раствор молекулы контактируют с липидным бислоем. Без намерения быть связанным с теорией считают, что встраивание в мембрану липидных концов липида (L) термодинамически является предпочтительным. Считается, что последующее отделение диссоциацией синтетической молекулярной конструкции от липидной мембраны термодинамически не является предпочтительной. Неожиданным образом обнаружено, что
синтетические молекулярные конструкции, идентифицированные здесь, являются водорастворимыми.
Синтетические молекулярные конструкции применяют для трансформации клеток, что приводит к качественным и/или количественным изменениям в экспрессированных поверхностных антигенах. Должно быть понятно, что трансформация клеток согласно изобретению отличается от трансформации клеток генной инженерией. Изобретение обеспечивает фенотипическую трансформацию клеток без генетической трансформации.
В контексте данного изобретения термин "трансформация" в отношении к клеткам применяют для указания на встраивание или включение в клеточную мембрану экзогенно полученных синтетических молекулярных конструкций, чтобы тем самым осуществить качественные и/или количественные изменения в клеточных поверхностных антигенах, экспрессированных клеткой.
Синтетические молекулярные конструкции изобретения включают в себя антиген (F), связанный с липидной частью (или остатком) (L) через спейсер (S^Sa). Синтетические молекулярные конструкции можно получить конденсацией первичного аминоалкильного, вторичного алифатического аминоалкильного или первичного ароматического аминного производного антигена с активированным липидом. Описан обзор методов получения неогликоконъюгатов (Bovin, N. Biochem. Soc. Symp., 69, 143-160).
Требуемую фенотипическую трансформацию можно достичь с применением синтетических молекулярных конструкций.
Требуемую фенотипическую трансформацию можно достичь с применением синтетических молекулярных конструкций изобретения одностадийным методом или двухстадийным методом. В одностадийном методе водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция (F-S!-S2-L) включает в себя поверхностный антиген в качестве F.
В двухстадийном методе синтетическая молекулярная конструкция (F-S^Sa-L) включает в себя антиген (F), который служит в качестве функциональной группы, с которой поверхностный антиген может быть связан после встраивания синтетической молекулярной конструкции в мембрану. Функциональной группой может быть такая группа, как лецитин, авидин или биотин. При применении в двухстадийном методе синтетическая молекулярная конструкция действует в качестве синтетического мембранного якоря.
Согласно изобретению, первичный аминоалкил, вторичный
алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин и активатор липида выбирают для обеспечения образования синтетической молекулярной конструкции, которая является водорастворимой и будет спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактируют с липидным бислоем.
В контексте данного изобретения термин "водорастворимый" означает, что образуется стабильная, однофазная система, когда синтетическую молекулярную конструкцию контактируют с водой или солевым раствором (таким как PBS) в отсутствие органических растворителей или поверхностно-активных веществ, и термин "раствор" имеет соответствующее значение.
В контексте данного изобретения фраза "стабильно включается" означает, что синтетические молекулярные конструкции включаются в липидный бислой или мембрану с минимальным последующим обменом между липидным бислоем или мембраной и водной внешней окружающей средой липидного бислоя или мембраны.
Выбор первичного аминоалкила, вторичного алифатического аминоалкила или первичного ароматического амина и активатора зависит от физико-химических свойств антигена (F), который нужно связать с липидом (L).
Специалисту в данной области должно быть понятно, что для неспецифического взаимодействия, такого как взаимодействие между диацил- или диалкилглицеролипидом и мембраной, структурные изомеры и стереоизомеры существующих в природе липидов могут быть функционально эквивалентными. Например, авторами изобретения предполагается, что фосфатидат (3-фосфат диацилглицерина) может быть заменен 2-фосфатом диацилглицерина. Кроме того, авторами изобретения предполагается, что абсолютная конфигурация фосфатидата может быть либо R-, либо S-конфигурацией.
Авторы изобретения определили, что для получения синтетических молекулярных конструкций изобретения, в которых антиген (F) представляет собой олигосахарид, выбранный из группы гликотопов для А-, В- и Н-антигенов групп крови АВО, первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин и активатор должны быть выбраны так, чтобы обеспечить образование альтернативных структур SrS2 для водорастворимой синтетической
молекулярной конструкции (F-S1-S2-L), где F представляет собой углевод (или другой антиген) с одинаковыми физико-химическими свойствами с углеводной частью А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО, и L представляет собой глицерофосфолипид, Si выбран из -0(CH2)nNH- и S2 выбран из -0(СН2)пСО- или -CO(CH2)mNHCO(CH2)nCO- (n, т, независимо, равны 2-5).
Специалисту в данной области должно быть понятно, что после того, как структура спейсера (Si-S2) определена для данного класса антигенов, такая же структура спейсера может быть принята для получения синтетических молекулярных конструкций других классов антигена с подобными физико-химическими свойствами.
Например, структура спейсера для синтетических молекулярных конструкций (F-Si-S^L), где F представляет собой гликотоп А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО, может быть структурой спейсера, выбранного для получения синтетических молекулярных конструкций других антигенов с физико-химическими свойствами, подобными гликотопам А-, В- или Н-антигенов групп крови АВО.
В принципе гликотопом широкого диапазона связанных с группой крови гликолипидов или гликопротеинов может быть антиген (F) синтетической молекулярной конструкции F-Si-S^L, где Si-S2-L является идентичной или эквивалентной соответствующей части синтетических молекулярных конструкций, обозначенных ATpM-sp-Ad-DOPE (I); ATp"-spspi-Ad-DOPE (II); ATpM-sp-Ad-DSPE (III); BTp"-sp-Ad-DOPE (VI); HTpi1-sp-Ad-DOPE (VII); Нди-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE(IX); Fuccc1-2Galp1-3GlcNAcp1-3Gaip,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XII) и Fucal -2Gaipi -3(Fuccc1 -4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE(XIII).
Структуры известных, связанных с группой крови гликолипидов и гликопротеинов (см. ссылки) представлены в нижеследующем перечне: Гликолипиды*
(*В общем, почти для всех примеров А-антигенов концевой сахар А GalNAc может быть заменен сахаром В Gal. Кроме того, отсутствие либо А-, либо В-детерминанты создает эквивалентную детерминанту Н).
А-6-1
А-6-2
GalNAcal-^3Galp1-> 3GICNACP1-*-3Gaipi-"4Glcpi-> 1 Сег t
Fucal
GalNAca1-*3Gaipi-> 4GlcNAcp1-^3Gal|i1-)4Glcpi-> 1Cer t
Fucal
A-7-2 (ALey)
Ga INAcal -"3Gaipi -> 4GlcNAcpi -"3Gaipi -*4Glcp1 -И Cer 2 3 t t Fucal Fucal
A-7-1 (ALe")
GalNAcaW3Gaipi-"3GlcNAcpi-> 3Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cer
t t Fucal Fucal
A-7-4
GaINAcal-*3Galp1 -"3GalNAcpi -> 3Gala1 -> 4Galp1-"4GIc01 -И Cer 2 t
Fucal
A-8-2
Ga!NAcal^3Gaipi^GlcI^cpi-> 3Gaipi-> 4GlcNAcpi-*.3Galp1-HGicpi-> -1Cer
t . Fucal
A-9-3
Gal^a1^3G|lpW3Gal^aW3Ga!p1^Glcr^p1^3Galp1-HGIcpi-> 1Cer
t t FUcal Fucal
А-12-2
Fucal
1 2
GalNAca1-"3Gaipi-"4GlcNAcp1 g
Galpl -"4GlcNAcp1 -> 3Gaipi -"4Glcpi-> 1 Cer
GalNAca1-> 3Galp1-^4GlcNAcpi t
Fucal
A-14-2
Fucal
i 2
Ga№Wca1-^3Gaipi-> 4GlcNAcPl6
°Galp1-*GteNtep1-> 3Ga!P1-*Glcpi-*1Cer
GalNAcal -*3Gaipi -"4GlcNAcpi-> 3Gaipi -"4GlcNAcpi t
Fucal
A-16-2
Rical i
GalNA:a1-> 3Gaipi-> 4GlcNAcp1
Galp1-^loNIAcpi-"3Gaipi-> 4GlcNAcpi-> 3Gaipi-+4GlcP1-"1Cer 3
GalNAcal -v3Gaipi -+4GlcNAcpi -> 3Saipi-> 4GlcNAcpi t
RJOO1
Лактозилцерамид
Galpl -> 4Glcp1-> -4Cer Гематозид/СМз
NeuAca2-> 3Galp1-> 4Glcp1-> 1Cer Лактотриаозилцерамид
GlcNAcpi-> 3Galp1-> 4Glcp1-> 1 Cer Глоботриаозилцерамид/Р*
Gala1-*4Galp1-> > 4Glcp1-> 1Cer Глобозид/Р
GalNAcpi-> 3Gala1-> 4Galp1-> 4Glcpi-"1Cer Параглобозид/неолактотетраозилцерамид
Galp1-> 4GlcNAcp1-> 3Galp1-> 4Glcp1-HCer LeM/лактотетраозилцерамид
Galp1-> 3GlcNAcp1-> 3Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cer
Сиалоилпараглобозид/сиалоилнеолактотетраозилцерамид NeuAca2-> 3Gal|31 -> 4GlcNAcp1 -> 3Galp1 -"4Glcpi -> 1 Cer H-5-1
Galp1-> 3GlcNAcpi^3Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cer 2 t
Fucal
Lex-5
H-5-2
Lea-5
Gaipi-> 4GlcNAcpi-"3Gaipi-> 4Glcpi-HCer 3 t
Fucal
Gaipi-> 4GlcNAcpi-^3Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cer 2 t
Fucal
Gaipi-> 3GlcNAcpi-)> 3Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cer 4 t
Fucal
Сиалил Lex
NeuAca2-> 3Ga Ip1 -> 4Glc NAcpi -*3Gaipi -> 4Glc pi -*1 Cer
Fucal
Сиалил 1.еа-6/антиген жулудочно-кишечного рака (GICA или Са 29-9)
NeuAca2-^3Gaipi-> 3GIcNAcpi-> 3Galp1-^4GIcpi-> 1Cer
Fucal
Дисиалоил Lea-7
NeuAca2
t 6
Gaipi -> 3G!c NAc p 1 -> 3Ga ipi -"4Glc p 1 -И Cer
3 4 t t
NeuAca2
Fucal
Leb-6
Galp1-"3G!cNAcpi-> 3Gaipi-^4Glcpi-> -1Cer
Fucal Fucal
Ley-6
Galp1-"4GlcNAcp1-> 3Galp1-> 4Glcpi-"1Cer
2 3 t t Fucal Fucal
Р-подобный
GalNAcpl -> 3GalB 1 -> 4GlcNAcpi -> 3GalS1 -> 4Glcp1 -И Cer Антиген Форссмана
GalNAcal -> 3GalNAcp1 -> 3Gala1 -> 4Gaipi -"4Glcp1 -И Cer Эритроцит Cad
GalNAcpi-> 4Gaipi-> 4GIcNAcpi-"3Galp1-^4Glcpi-> 1Cer
GalNAcp1-"4Gaipi-> 3GalNAcp1^4Galpl-> 4Glcp1-> 1Cer
Gab1-> 4Gaipi^4GlcNAcpi-^3Gaipi-> 4Glcpi-^1Cer
LKETGL 7/SSEA-4
NeuAco2-> 3Gaipi-> 3GalNAcpi-> 3Gala1-^4Galp1-> 4Glcpi-)-1 Cer
NeuAca2
Антиген гепатокарциномы Cad
3 t
NeuAca2
3 t
NeuAca2
В-6-1
Н-6-4
В-6-2
BLeb-7
Gakx1-^3Galp1-> 3GlcNAcpi-> 3Gaipi-> -4Glcpi-"1Cer 2 t
Fucal
Galp1-^3GalNAcpi-> 3Gala1-> 4Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cer 2 t
Fucal
Gala1^3Gaipi-"4GIcNAcpi-> 3Galp1-> 4Glcpi-> 1Cer 2
Fucal
Gala1-> 3Gaipi-^3GlcNAcp1^3Ga!p1-> 4Glcpi^1Cer
t t Fucal Fucal
BLey-7
Gakx1-^3Galp1-^4GlcNAcpi-> 3Gaipi-> 4Glcp1^1Cer 2 3 t t Fucal Fucal
Антиген i/лакто-М-нор-гексаозилцерамид
Galpl -> 4GlcNAclp1 -"3Galp1 -> 4GlcNAcp1 -> -3Galp1 -> 4Glcpi -> 1 Cer Сиалил-нор-гексаозилцерамид/сиалоиллакто-М-нор-гексаозилцерамид
NeuAca2-^3Galp1-^4GlcNAclp1-> 3Galp1-> 4GlcNAcp1-> 3Gaipi-> 4Glcpi -ИСег
Lex-7
Galp1-*4G!c NAc lp1-+3Ga 101 -*3Glc NAcP 1-> 3Gaipi -*4Glc В1-И Cer t
Fucal
H-8-3
Gaipi^3GalNADa1-^3Gaipi-^4GlcNAcpi-> 3Gaipi-> 4G!cpi^1Cer 2 2 t t Fucal Fucal
Lex-8
Gaipi-> 4Glc NAcp 1-^3Ga ipi-^4Glc NAcpl-> 3Gaipi-> 4Glc P1 ^1 Cer 3 3 t t Fucal Fucal
Le"-8
Ga Ip1-"3Glc NAc p1-> 3Ga ipi-> 3Glc NAcpi-> 3Ga IP 1-> 4Glcpi-"1 Cer
t t Fucal Fucal
Lea-11
Gaipi^3GfcNAcp1-^3Galp1-^3GlcNAcpi^3Gaipi^3GlcNAcp1-*3Galp1-)-4GIcpi-^1Cer 4 4 4
t t t
Fucal Fucal Fucal
B-8-2
Gakxl -"3Ga Ip1 -> 4G!cNAc pi -> 3Ga ipi -"4Glc NAc pi -> 3Ga ipi -+4Glc p1 -И Cer 2
Fucal
Антиген I
Gaipi-+4GlcNAcpi e
Gaipi-> 4GlcNAcp1-^3Gaipi-> 4Glcpi-> 1Cei
Gaipi-*4GlcNAcpi 3
Lec-9 (фукозилированная главная цепь)
Galp1-> 3GlcNAcp1 6
3Gaipi-> 3GlcNAcpi-> 3Gaipi-^4Glcpi-> 1Cer
Ga!p1-"4GlcNAcpi 3 t
Fucal
Le°-9 (фукозилированная боковая цепь)
Fucal
¦if
Galpl -> 4GlcNAcp16
Galp1-^3GlcNAcpi^-3Gaipi-^4Glcp1-> 1Cer
Galpl-> 3GlcNAcpi3
VIM-2
Ga Ip1-*4Glc NAc 01-*3Ga Ipl^GlcNAcp^ 3 3
t t NeuAccc2 Fucal
Антиген эритроцита Fl
Fucal
I 2
Galp1-> 4GlcNAcp1 б
Galp1-> 4GlcNAcpi-> 3Galp1^-4Glcp1-^1Cer
Galp1-"4GlcNAcpi 3 t
NeuAca2
Lex-11
Galp1^GlcNlAcp1-^3Gaipi-^GfcNAcpi-> 3Gaipi^4GlcNIAcpi^3Gaipi-> 4Glcp1^1Cer 3 3 3
t t t
Fucal Fucal Fucal
В-12-2
Fucal
I 2
Gata1-> 3Ga!B1-"4GIcNAcpi g
Ga!B1-> 4GIcNAc31-*3Gaipi-> 4GlcB1-> 1Cer
Gala1-> 3Galp1-"4GlcNAcp13
Fucal
B-14-2
Fucal 2
Gakx1-"3Gaipi-"4GlcNAcp1 R
Gaipi^GlcNAcpi-"3Gaipi-"4Glcpi-HCer
GalaW3Galp1-+4GlcNAcp1-> 3Galp1-"4GlcNAcpi 3 2 t
Fucal
B-16-2
Rjcal
i 2
Gala1-*3Gaipi-"4GfcNAcPl
Gaipi-> 4Glc№topi-"3Gaipi-*4GlcNAepi-*36aipi-*4Gfcpi-"1Cer
GalaW3Gaipi-^GfchtoP1-*3Gaipi--> 4G!cNAcP1 3 2 t
Rjcal
1-Активный полигликозилцерамид
GIMGcNp-6 GIMGcNp-6 Gip-4GcNp-6
GIMGcNp-SG^Ip^GcNP-SGIMGcNp-SGlMGcNMGIMGcNMGIMGcNP-SGIMGcp-ICer
О-Связанные гликопротеины
Gaipi-"3GalNAca1-> &rfIhr 3
NeuAca2
Дисиалотетрасахарид
Ga !p1 -> 3Ga INAcal -> ЗэгЛЬг 3 б i i NeuAca2 NeuAca2
Олигосахарид с дисиалоильной группой
Ne uAc a2-"8Ne uAc a2
t 6
Gaipi-> -3GalNAca1-> -SBr/Trir 3
NeuAca2-> 8NeuAca2 Н-Активный трисахарид
Ga Ip1 -> "3Ga INAcal -> S &nHhr I
Fucal
Сиалилированный Н-активный тетрасахарид
Ga 1(31 -> 3Ga INAcal -> SfenHhr 2 6 J, I Fucal NeuAca2
Олигосахарид Cad
GalNacpi-> 4Gaipi-> 3GaINAca1-> &r/Thr 3 6 I i NeuAca2 NeuAca2
Олигосахарид GlcNAc
NeuAca2
t 3
Ga IP1 -"3Ga INAcal -> &r/lhr I
Gaipi-"4G!cNAcpi
Олигосахарид муцина/А-активный гликопротеин
Fucal
Ga INAcal -"3Gaipi-> 3Ga^NAca1 -"S3r/Thr
Gaipi-"4GlcNAcpi
А-активный гликопротеин-6а кисты яичника
Ga INAcal -"3Gaip 1 -"3Glc NAc p1-"3Gaipi -"3Ga INacal -"S3i/lfir 2 t
Fucal
А-активный гликопротеин-6Ь кисты яичника
Ga INAcal -> 3Galp1 -"4GlcNAcpi -> 3Ga Ip1 -"3GalNaca1 -"Ser/Thr 2 t
Fucal
1_еа-активный гликопротеин-7 кисты яичника
Fuca'
Gaipi-> 3Glc NAcpi-> 3Galp1-> 4GlcNAcpi
t 6
Ga ipi -"3Ga INAcal -"SB iflhr
1_еа-активный гликопротеин-10 кисты яичника
Fucal
I 4
Gaipi-> 3GlcNAcp1-> 3Ga!p1-^4GlcNAcp1
Gaipi^3GlcNAcpi-> 3Gaipi-> 3GaAca1-> SsnThr
Fucal
А-активный гликопротеин-18 кисты яичника Fucal Fucal
GalNAca1-"3Gaipi-> 4GlcNAcp1 Gaipi-"4GicNAcp1
t t 6 6 Gaipi^3Glc^cpi^4Galp1-^3GlcNAcpi-> 3Gaipi-> 3Ga!NAca1-> SBinhr
1 •
GalNAca1-*3G|ipi-> 3GlcNAcp1
t t Fucal Fucal
N-связанные гликопротеины
Тип комплекса/стабильная к щелочи цепь
NeuAca2 I
Gaipi-"4GlcNAcpi-> 2Manal Fucal
6 6
GlcNAcBl-> 4Manpi-^4GlcNAcpi-> -4GlcNAcpl-> Asn
3 t
Gaipi-HGIcNAcpi-> 2Manal t
NeuAca2 * Гибридный тип
Manal
Mana1_
Manal Manpi-HGIcNAcpl-> 4GlcNAcpi-^Asn
Gaipi-> 4G!cNAcp1-> 2Mana1 Гликопротеин Тамма-Хорсфалла
NeuAca2 I
GalNAcpi-*4Gaipi-> 4GlcNAcpi
..6 и
NeuAca2 Manal 1 2 3 ^ Ga INAc p1 -> 4Gaipi -> 4Glc NAc p1
NeuAca2 Manpl-"4GlcNIAcpi^4GlcNlAcpi-> Asn eu з
GalNAcpl-"4Gaipi-^4GlcNAcpi
t 2
NeuAca2 M*na1 1 4
3 * GalNAcpi-HGaipi-MGIcNAcpl
Тип с высоким содержанием манноза
Mana1-"2Mana1
Manal..
Mana1-> 2Mana1 Manpi-^4GlcNAcpi^4GlcNAcpi-> Asn Ma na1 -> 2Ma na1 -> 2Ma na1
Дисиалилфоетальный антиген эритроцита
NAa3 I
GIB4GcNB3(GIS4GcN63)4GIB4GcNB2Ma6
GqNp4Mp4Gc Np4Gc NpAsn t
GJp4GcNp3GIp4GcNp2Ma3 NAa6
Трисиалоилфоетальный антиген эритроцита (дисиалоильная группа на разветвлении)
NAa6NAa3
Gip4GcNP3(Gip4GcNp3)4Gip4GcNP2Ma6
Gc NP4MP4GC NP4GC NpAsn f
^IB4GcNp3Gip4GcNP2Ma3 NAa6
Монофукозилмоносиалилфоетальный антиген эритроцита
(фукозилированная главная цепь)
NAa3 1
Gip4GcNP3(Glp4GcNp3)4Glp4GcNp2Ma6
Gc Np4Mp4Gc Np4Gc NpAsn t
(p4Gc Np3Glp4Gc NP2Ma3 Fa2
Монофукозилмоносиалилфоетальный антиген эритроцита (дисиалильная группа на разветвлении)
Fa2 I
Glp4GcNp3(Gip4GcNP3)4Gip4GcNp2Ma6
GcNp4Mp4GcNp4GcNpAsn t
GJP4GcNp3Gip4GcNp2Ma3 NAa6
Монофукозилдисиалилфоетальный антиген эритроцита (дисиалильная группа на разветвлении) j
NAct6NAa3
GIB4GcNp3(Gip4GcNp3)4Gip4GcNB2Ma6
Gc NP4MP4GC NB4Gc NpAsn t
GJp4GcNp3Glp4GcNp2Ma3 ¦ Fa2
Дифукозилфоетальный антиген эритроцита
Fa2
Glp4GcNp3(GIp4GcNp3)4Glp4GcNp2Ma6
GcNp4Mp4GcNp4GcNpAsn t
^P4GcNp3Gip4GcNp2Ma3 Fa2
Фоетальлактозаминогликан
(GlcNAc pl-"3Galpl-"4)eGfc NAcpi-42Manal
I 6
Galpl^4GIcNAcpl-^4Manpl-"4GlcNAcpl-> 4GlcNAcpi-"Asn
Galpl-> 4GIcNAcpi-"3Galpl-> 4G!cNAcpi-> 2Manal
Лактозаминогликан зрелой клетки
GIP4GCNP6 Gip4GcNP6 Gip4GeNP6
(Gip4GcNp3fG!M(GcNP3Glp4/GcNP3ilHGcNP3GI^GcNP3iip4GcNp3Glp4GcNp2№6
Glp4GcNP4MP4GcNP4GcNpAsn t
Gip4GcNp3Gip4GcNP3^ip4GcNP3Glp4GcNp2Ma3
GcNP6 GcNP6 t t GIP4 G1P4
Монофукозилмоносиалоильный антиген зрелого эритроцита Gip4GcNp6 Glp4GcNP6 Gip4GcNp6
(с^сырзМ^сссырзс^ссмрзе^осмрзб^соырзАисомрзо^смргмаб Fa6
Gip4GcNp4Mp4GcNp4GcNPAsn T
^ip4GoNP3Gip4GcNp3^ip4GcNp3GiP4GcNP2Ma3
NAot3 GcNp6 GcNpe f t GIP4 GIp4
Монофукозилмоносиалоильный антиген зрелого эритроцита
GIP4GCNP6 Glf34GcNj36 Glp4GcNp <5
(Glp4GcNp3)sGP4(GoNp3Gip4fGcNP3Glp4GcNP3Glp4GcNP3GiP4GcNp3G!p4GcNp2Ma6 Rx6
Gip4GcNP4Mp4GcNp4GcNPAsn t
^iP4GoNP3Gip4GcNP3^ip4GcNp3Gip4GcNP2Mo3 NAa6 GcNP6 GcNp6 GIP4 Gipl
Дифукозильный антиген зрелого эритроцита
Gip4GcNP| Gip4GcNp6 Gip4GcNP6
(Gip4GcNP3fGP4(GcNP3G§4fGcNP3Gip4GcNP3Glp4GcNp3iip4GcNp3Glp4GcNp2Ma6 Rx6
GIP4GC NP4Mp4Gc Np4Gc NPAsn t
Gip4GcNp3Gip4GcNP3^ip4GcNp3Gip4GcNp2Ma3
Fa2 G0NP6 GcNp6 t t GIP4 Glp4
Ключ: Gl = D-Gal, Gc = D-GIc, GcN = D-GlcNAc, M = D-Man, F = L-Fuc, NA = NeuAc.
Специалисту должно быть понятно, что синтетические молекулярные конструкции (F-Si-Sa-L) изобретения, где F представляет собой олигосахарид, можно применять в качестве "синтетических гликолипидов" и замещений для гликолипидов, полученных из биологических (ботанических и зоологических) источников.
В контексте данного изобретения термин "гликолипид" означает липид, содержащий углевод амфипатического характера, включающий в себя: гликозилированные глицеролипиды, такие как гликозилированные фосфоглицериды и гликозилглицериды; гликозилированные сфинголипиды (нейтральные гликолипиды), такие как гликозилцерамиды или цереброзиды; и ганглиозиды (кислотные гликолипиды).
В контексте данного изобретения фраза "связанный с гликолипидом антиген" означает липид, содержащий углевод, в котором антиген (например, белок) связан с гликолипидом через углеводную часть молекулы. Примеры связанных с гликолипидом антигенов включают в себя GPI-связанные белки.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что гликолипид сам является антигеном. Термин и фраза "гликолипид" и "связанный с гликолипидом антиген" применяют для проведения различия между существующими в природе молекулами", у которых антигеном является гликолипид, и существующими в природе молекулами", у которых антиген связан с гликолипидом через углеводную часть гликолипида. По аналогии синтетические молекулярные конструкции изобретения могут быть описаны
в качестве как "синтетических гликолипидов", так и синтетических мембранных якорей до степени, при которой антигеном может быть синтетический гликолипид per se или антиген присоединен к синтетическому гликолипиду.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что углеводная часть гликолипида может быть модифицирована и связана с другими антигенами методами, описанными в описании, сопровождающим Международную патентную заявку № PCT/NZ2003/00059 (опубликована как WO03087346).
В контексте данного описания изобретения термин "гликотоп" применяют для обозначения антигенной детерминанты, расположенной на углеводной части гликолипида. Классификация гликолипидных антигенов в серологии групп крови основана на структуре углеводной части гликолипида.
В серологии групп крови известно, что концевыми сахарами гликотопов А-антигенов являются GalNAcal-3(Fuca1-2)Gaip и концевыми сахарами гликотопов В-антигенов являются Gala1-3(Fuca1-2)Gaip. Включение в мембрану RBC водорастворимых синтетических молекулярных конструкций изобретения, в которых F представляет собой GalNAcal -3(Fuca1-2)Gaip или Gala1-3(Fuca1-2)Gaip, дает RBC, которые являются серологически эквивалентными А-антигену или В-антигену, экспрессируемому RBC, соответственно.
Концевые три сахара углеводной части присутствующего в природе А- или В-антигена, являются детерминантой определения групп крови А и В. Концевые четыре или пять Сахаров углеводной части присутствующего в природе А- или В-антигена, являются детерминантой подгрупп крови А типа 1 А и типа 2 А и т.д. Соответственно этому, RBC, включающие синтетические молекулярные конструкции изобретения, можно применять для характеризации и проведения различий между реагентами типирования крови (антителами) различной специфичности.
Водорастворимые синтетические молекулярные конструкции изобретения, которые исключают углеводную часть, рассматриваются изобретением. Антигены, другие, чем углеводы или олигосахариды, но со сходными физико-химическими свойствами, могут заменять F в описанных "синтетических гликолипидах".
Синтетические молекулярные конструкции изобретения, которые
I j
включают в себя антиген F с физико-химическими свойствами, отличными от физико-химических свойств углеводов или олигосахаридов, также рассматриваются авторами изобретения. Водорастворимые синтетические молекулярные конструкции, включающие в себя эти антигены, можно получить выбором разных спейсеров.
Преимущества, обеспечиваемые синтетическими молекулярными конструкциями данного изобретения, будут повышаться при применении на практике изобретений, описанных в описаниях Международных патентных заявок №№ PCT/N02/00212 (опубликована как WO03/034074) и PCT/NZ03/00059 (опубликована как WO03087346). Описания, сопровождающие эти заявки, включены здесь в качестве ссылки.
Синтетические молекулярные конструкции преодолевают многие из ограничений применяемых природных гликолипидов на практике этих изобретений. Конкретным преимуществом синтетических молекулярных конструкций является их превосходящая активность и способности быть пригодными для применения при трансформации клеток при пониженных температурах например, 4°С.
Как описано здесь, не все структуры спейсера (S!-S2) могут обеспечивать получение синтетической молекулярной конструкции (F-S^Sa-L), которая является водорастворимой и спонтанно и стабильно включается в липидный бислой, такой как клеточная мембрана. Обнаружено, что синтетические молекулярные конструкции, обозначенные Атри-зр-липид (IV) и Аури-PAA-DOPE (V), не являются водорастворимыми и/или не способны спонтанно и стабильно включаться в липидный бислой, такой как клеточная мембрана.
обозначенная Атри-зр-липид (IV).
обозначенная Атри-РАА-DOPE (V), где х, у = 0,05-0,2.
Изобретение теперь будет иллюстрировано ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры и фигуры прилагаемых графических материалов.
На фигуре 1 показаны результаты анализа Diamed сохраняемых в Cellstab(tm) клеток, трансформированных раствором природного гликолипида А для трансформации (L к R) при 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2 мг/мл, 2 мг/мл* и 1 мг/мл. Применяемыми антисыворотками являются албаклон (верх) и биоклон (низ). (* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не промывали после инкубации, его оставляли на ночь и промывали на следующий день (день 2)).
На фигуре 2 показаны результаты анализа Diamed сохраняемых в Cellstab(tm) клеток, трансформированных раствором природного гликолипида В для трансформации (L к R) при 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2 мг/мл, 2 мг/мл* и 1 мг/мл. Применяемыми антисыворотками являются албаклон (верх) и биоклон (низ). (* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не промывали после инкубации, его оставляли на ночь и промывали на следующий день (день 2)).
На фигуре 3 показан анализ FACS после трансформации in vitro Le(a-Ь)-эритроцитов человека природным 1еь-6-гликолипидом на протяжении времени при трех температурах трансформации, 37°С (верх), 22°С (середина) и 4°С (низ).
На фигуре 4 показаны результаты анализа Diamed клеток, трансформированных при 4°С раствором для трансформации ATpv)-sp-Ad-
I i
DOPE (I) (L to R (слева направо)): промытые, 0,08 мг/мл; не промытые, 0,08 мг/мл; промытые, 0,05 мг/мл; не промытые, 0,05 мг/мл; промытые, 0,03 мг/мл и не промытые, 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-А.
На фигуре 5 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации ATp"-sp-Ad-DOPE (I) (L to R): 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-А.
На фигуре 6 в левом столбце показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) (L to R): промытые, 0,6 мг/мл; не промытые, 0,6 мг/мл; промытые, 0,3 мг/мл; не промытые, 0,3 мг/мл; промытые, 0,15 мг/мл и не промытые, 0,15 мг/мл; в правом столбце показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации BTp"-sp-Ad-DOPE (VI) (L to R): промытые, 0,08 мг/мл; не промытые, 0,08 мг/мл; промытые, 0,05 мг/мл; не промытые 0,05 мг/мл; промытые, 0,03 мг/мл и не промытые, 0,03 мг/мл. Применяемой антисывороткой был биоклон анти-В.
На фигуре 7 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С раствором трансформации BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) (L to R): 0,6 мг/мл, 0,3 мг/мл и 0,15 мг/мл.
На фигуре 8 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 9 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTfm-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 10 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, промытые А 0,07 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 11 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTp"-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (to) содержат клетки, не промытые А 0,07 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 12 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpt1-sp-Ad-DOPE (I) и BTpvi-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, промытые А 0,06 А + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 13 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTp"-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 14 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATp"-sp-Ad-DOPE (I) и BTpi,-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, промытые А 0,06 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 15 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTp"-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,06 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 16 показаны результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, промытые А 0,05 А + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 17 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,3 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 18 показаны результаты Diamed анализа клеток,
трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATp"-sp-Ad-DOPE (I) и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, промытые А 0,05 А + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В. Лунки 3 и 4 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
На фигуре 19 показаны клетки, которые уже не промывали перед испытанием. Результаты Diamed анализа клеток, трансформированных при 4°С параллельной трансформацией ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTp"-sp-Ad-DOPE (VI). Лунки 1 и 2 (L to R) содержат клетки, не промытые А 0,05 + В 0,2 мг/мл против анти-А и анти-В.
Сравнительные примеры
Сравнительные примеры не образуют часть заявленного изобретения. Сравнительные примеры описывают трансформацию эритроцитов природными гликолипидами.
Сравнительный пример 1 - получение природных гликолипидов
Очистка ВЭЖХ
В первой стадии колонки заполняли сухим диоксидом кремния (15-25 мкм) перед каждым опытом. Можно применять относительно нечистые образцы при анализе ВЭЖХ, поскольку диоксид кремния можно разгрузить вместе с теоретически высоким уровнем необратимо связанных загрязняющих примесей.
Гликолипиды разделяли на силикагеле с подвижной фазой повышенной пористости. Программой был линейный градиент, начинающийся 100% смесью 80:20:1 (об./об.) хлороформ-метанол-вода и кончающийся 100% смесью 40:40:12 (об./об.) хлороформ-метанол-вода.
Применяемым оборудованием ВЭЖХ была система Shimadzu, способная перекачивать и смешивать четыре отдельных растворителя при программированных отношениях. Поскольку хлороформ, метанол и вода испаряются с разными скоростями, была разработана программа, при помощи которой компоненты растворителя не смешивали перед подачей для ВЭЖХ.
Четыре разные жидкости для ВЭЖХ Shimadsu смешивали быстрым отбором "выстрелом" их по очереди из каждой из четырех бутылей. "Выстрелы хлороформа и воды непосредственно друг за другом в линиях могут вызвать проблемы смешиваемости. Метанол был "прослойкой" между этими двумя несмешиваемыми компонентами. Кроме того, воду предварительно смешивали с метанолом в отношении 1:1 для дополнительного предотвращения появления проблем со смешиваемостью.
Сравнительный пример 2 - трансформация эритроцитов природными гликолипидами
Агглютинация
Трансформацию эритроцитов определяли агглютинацией с применением системы микротипирования Diamed-ID помимо применения общепринятой пробирочной серологии. Карты типирования Diamed АВО не применяли. Применяемыми картами были содержащие NaCI, ферментную пробу и не содержащие радиоактивное вещество карты агглютинина, которые предварительно не загружали какой-либо антисывороткой или другими реагентами. Это позволяет применять специфические антисыворотки в обоих методологиях.
Таблица 1. Гель-карты
Изготовитель
Каталог ref
Diamed
Содержащие
NaCI, ферментную пробу и не
содержащие
радиоактивное вещество карты
агглютинина
Сравнительное испытание проводили между пробирочной серологией и системой Diamed для установления эффективности двух систем. Клетки трансформировали при 25°С в течение 4 часов. Для измерения эквивалентности примеряли анти-А-сыворотки сераклон и альбаклон. Результаты показаны в приведенной ниже таблице 3.
Таблица 2. Антисыворотки, применяемые при сравнении пробирочной серологии с системой Diamed
Изготовитель Каталог ref Партия Дата окончания
Албаклон, SNBTS Анти-А Z0010770 12.12.04
Сераклон, Biotest 801320100 1310401 12.04.03
Таблица 3. Результаты агглютинации, сравнивающие пробирочную серотологию с системой Diamed
Гликолипид А (мг/мл)
1 0
Пробирка
Албаклон
0 0
Сераклон
0 0
Diamed
Албаклон
0 0
Сераклон
w+ 0
В этом эксперименте доказали, что система Diamed является более
чувствительной к более слабым реакциям, чем пробирочная серотология с сераклоном анти-А, но не с албаклоном. Эти реагенты изготовляют различно и, таким образом, не предполагается, что они выполняют анализ идентично. Однако, тот факт, что комбинация пробирочной серотологии с сераклоном анти-А не давала положительный результат, вероятно, является результатом интерпретации оператора. Более слабые реакции заведомо трудно оценить в баллах и разница между 1+ и 0 может быть трудно различимой в пробирках. Оптимизация
Изучали влияние изменения концентрации гликолипидов, температуры инкубации, продолжительности инкубации, разбавителя и раствора для хранения на жизнеспособность клеток. Эффективность и стабильность трансформации определяли агглютинацией соответствующим антителом.
Таблица 4. Определяемая пробирочной серологией агглютинация клеток, трансформированных природным гликолипидом А на протяжении различного времени и при разных температурах
2 1
0,1
0,01
0,001 0,0001
Сераклон (37°С в
0 0
течение 1,5 часа)
Сераклон (25°С в
течение 4 часов)
2+ 1 +
0 0
Концентрация гликолипида
Эксперименты с начальной трансформацией проводили с очень очищенным (ВЭЖХ) образцом 1_е"-гликолипида и менее чистым образцом гликолипида группы крови А. Трансформацию проводили при 37°С в течение 2,5 часа.
Образец гликолипида А содержал другие липидные примеси и, таким образом, сравнительно меньше молекул группы крови А по массе, чем образец 1_еь-гликолипида эквивалентной концентрации (масс/об.). По-видимому это подтверждается фактом, что более высокие концентрации гликолипида А, чем 1_е"-гликолипида, требовались для получения эквивалентной оценки агглютинации в баллах (см. таблицу 6).
Уровень примеси в образце гликолипида А может также
способствовать более низкой стабильности на протяжении периода 62 дней - А-трансформированные клетки "умирали" при самой высокой концентрации (получившие самую высокую дозу примеси).
Таблица 5. Анти-А и анти-Le", применяемые при начальном тестировании трансформации природным гликолипидом
Изготовитель Каталог ref Номер Дата
партии окончания
Anti-A
Seraclone, Biotest 801320100 1310401 12.04.03
Anti-Leb
CSL 12801
Таблица 6. Стабильность RBC, трансформированных природным гликолипидом А и Le", оцениваемая агглютинацией пробирочной серологией на протяжении периода 62 дней
Гликолипи д (мг/мл)
Leb
День 1
День 25
День 62
День 1
День 25
День 62
2-3+
2-3+
1-2+
1 +
1 +
0,1
0,01
0,001
0,0001
Указанные выше клетки оценивали также для гемолиза и эти результаты приводятся ниже в таблице 7.
Таблица 7. Гемолиз, подсчитываемый визуально. День 1 - в супернатанте первого промывания после трансформации; дни 25 и 62 - в растворе консервации клеток перед тем, как клетки ресуспендируют после хранения. Шкала подсчета в баллах аналогична шкале агглютинации от 4+ до 0; hhhh - сильно гемолизованные, hhh - очень гемолизованные, hh - умеренно гемолизованные, h - средне гемолизованные, w - слабо гемолизованные и 0 - гемолиз не виден.
i i
Концентрация
Гемолиз
гликолипида
Leb
(мг/мл)
День 1
День 25
День 62
День 1
День 25
День 62
погибли
hhh
hhh
hhhhh
hhh
hhhh
0,1
hhh
0,01
0,001
0,0001
Контроль
Можно обнаружить, что эти результаты показывают, что гемолиз клеток ассоциирован с трансформацией с высокими концентрациями гликолипида. Не ясно, является ли лежащим в основе этого механизма разрыв мембраны плазмы большими количествами встраиваемого гликолипида, скорость такого встраивания или это, возможно, обусловлено количеством ассоциированных примесей. Однако, оказалось, что результаты для Leb на день 62 поддерживают первое объяснение.
Образец Leb был очень очищенным перед растворением, он был порошком чистого белого цвета и поэтому маловероятно, что гемолиз был обусловлен вредным влиянием примесей. Из данных ясно видно, что на день 62 степень имеющего место гемолиза уменьшается в соответствии со снижением концентрации гликолипида. Температура инкубации
Эксперименты проводили для исследования возможных механизмов снижения гемолиза RBC во время стадии встраивания. Предыдущие эксперименты показали, что гемолиз снижался при более высоких концентрациях гликолипида, чем при более низких концентрациях, и, считается, что гемолиз может быть также связан со скоростью встраивания гликолипида. Поскольку считается, что температура влияет на скорость встраивания, эксперименты проводили для сравнения трансформации при 37°С с трансформацией при комнатной температуре (к.т.; 25°С).
Поскольку предполагается, что скорость снижается, когда снижается температура, период инкубации для эксперимента при к.т. был 4 часа. Гемолиз оценивали визуально и считали в баллах после встраивания. Тесты серологии также проводили на клетках. Результаты показаны в
таблице 8.
Таблица 8. Влияние температуры инкубации на гемолиз и агглютинацию во время встраивания гликолипидов в мембраны RBC. Гемолиз оценивали в баллах визуально при каждой из трех промывок.
Гликолипид
Гемолиз
Серология
(мг/мл)
К.т.
37°С
К.т.
37°С
Промыв
Промыв
Промыв
Промыв
Промыв
Промыв
1 +
Продолжительность промывки
Инкубацию при 37°С проводили в течение 1 и 2 часов и ее влияние на гибель и трансформацию клеток оценивали агглютинацией подходящим антителом
Таблица 9. Антисыворотки, применяемые при различных продолжительностях опытов инкубации
Изготовитель
Каталог ref
Номер партии
Дата
окончания
Албаклон, SNBTS Биоклон, OCD Албаклон, SNBTS Биоклон, OCD
Анти-А
Анти-А, эксп. реагент Анти-В
Анти-В, эксп. реагент
Z0010770 DEV01102 Z0110670 DEV01103
12.12.04 01.07.05
Таблица 10. Влияние времени инкубации на агглютинацию клеток, трансформированных природными гликолипидами
Гликолипид
Концентрация (мг/мл)
Албаклон
1 час 2 часа
Биоклон 1 час
2 часа
0,5
1 +
1 +
1 +
1 +
1 +
0,5
1 +
Эти результаты показывают, что повышение продолжительности
инкубации во время встраивания природных гликолипидов не повышает агглютинацию. Фактически, баллы счета агглютинации снижаются после двух часов инкубации. Это может быть обусловлено дестабилизацией мембраны или возвращением гликолипидов обратно в раствор. Разбавитель
Эксперименты проводили также для определения может ли замена раствора для разведения гликолипида снижать гемолиз. Рабочую эффективность PBS сравнивали с рабочей эффективностью 2 х PBS и 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Клетки инкубировали при 37°С в течение 1,5 часа. Результаты показаны в таблице 11.
Таблица 11. Исследование по влиянию на гемолиз замены растворов для разведения гликолипидов во время встраивания гликолипидов в мембраны
RBC
Концентрация
гликолипида
(мг/мл)
Раствор для разведения гликолипида
PBS
2 x PBS
2% BSA в PBS
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
hhh
Стабильность
После того, как гликолипиды групп крови А и В были очищены ВЭЖХ до приемлемого уровня, проводили эксперимент для нахождения подходящих концентраций для проведения опытов по стабильности
Таблица 12. Исследование ранней стабильности клеток, трансформированных природным гликолипидом А
Эксп
День
0,1
0,01
0,001
0,0001
3-4+
1 +
1 +
1 +
1 +
Таблица 13. Антисыворотки, применяемые в испытаниях стабильности (таблица 14 и таблица 15)
Изготовитель
Каталог ref
Номер партии
Дата
окончания
Албаклон, SNBTS Биоклон, OCD Албаклон, SNBTS Биоклон, OCD
Анти-А
Анти-А, экспер. реагент Анти-В
Анти-В, экспер. реагент
Z0010770 DEV01102 Z0110670 DEV01103
12.12.04 01.07.05
Таблица 14. Пробирочная серология О RBC, трансформированных гликолипидом А, для установления подходящих концентраций для проведения испытаний стабильности
Анти-А
Эксп.
Гликолипид А (мг/мл)
0,5
0,1
0,01
0,001
Alba
1 +
Bio
1 +
1 и 2 Трансформация при 25°С в течение 4 часов.
Таблица 15. Пробирочная серотология О RBC, трансформированных гликолипидом В, для установления подходящих концентраций для проведения испытаний на стабильность
Анти-В
Эксп.
Гликолипид В (мг/мл)
0,5
0,1
0,01
0,001
Alba
1 +
1 +
1 +
Bio
1 +
1 +
1 и 2 Трансформация при 25°С в течение 4 часов.
Два набора клеток трансформировали при различных концентрациях природного гликолипида А. Трансформацию проводили при 25°С. Один набор клеток тестировали в течение длительного времени и один набор клеток тестировали еженедельно на агглютинацию. Результаты агглютинации, проводимой пробирочной серологией и Diamed, показаны ниже в таблице 16. Все клетки хранили в Cellstab(tm) в бутылях с плоскими основаниями. Клетки обнаружили от минимального гемолиза до отсутствия
гемолиза в любой точке времени.
Таблица 16. Результаты агглютинации клеток, трансформированных различными концентрациями природного гликолипида А. Результаты получали с применением албаклона анти-А
Гликолипид А (мг/мл)
0,1
Контроль
Длительное
тестирование
День 1 Пробир.
Diamed
День 17 Пробир.
Diamed
1 +
Еженедельное
тестирование
День 1 Пробир.
Diamed
День 8 Пробир.
1 +
Diamed
День 15 Пробир.
1 +
Diamed
День 22 Пробир.
Diamed
День 29 Пробир.
*+w
Diamed
*3+
День 36 Пробир.
Diamed
*3+
День 43 Пробир.
Diamed
* - Албаклон, тогда как во все других опытах применяли сераклон анти-А.
Раствор для хранения
Сравнение двух растворов для хранения клеток, Celpresol (CSL) и Cellstab(tm) (Diamed) проводили для тестирования их относительных способностей поддерживать модифицированные RBC.
Испытывали стабильность RBC, трансформированных растворами антигенов групп крови А и В с различными концентрациями, при хранении в двух разных растворах для хранения клеток - Cellstab(tm) и Alsevers(tm).
В серологическом тестировании применяли антисыворотки А и В из двух разных источников.
Все клетки тестировали с применением стандартной платформы пробирочной серотологии в течение до 42 дней, при таком времени реакции агглютинации клеток становились слишком трудными для ручного счета (см. таблицу 17 для результатов А и таблицу 18 для результатов В).
Тестирование гель-карт Diamed проводили до 56 дней для клеток, сохраняемых в Alsevers, и прерывали в день 63 вследствие грибковым загрязнением (несмотря, однако, на повторение позитивных оценок в баллах).
Хранение клеток в Cellstab(tm) продолжали в течение до 70 дней до тестирования, они были все же жизнеспособными в этой точке (см. фигуру 1 для результатов А и фигуру 2 для результатов В).
Реагенты, применяемые в испытании стабильности, показаны в таблице 13.
Таблица 17. Результаты испытания пробирочной серологией стабильности клеток, трансформированных с изменяемыми концентрациями гликолипида А и хранимых либо в Cellstab(tm), либо в Alsevers(tm)
День
Раствор для
хранения
клеток
Албаклон анти-А (SNBTS)
Биоклон анти-А (OCD-разработанный реагент)
Раствор для трансформации (мг/мл)
Alsevers
1 +
1 +
1 +
Cellstab(tm)
1 +
1 +
1 +
Alsevers
1 +
1 +
1 +
1 +
Cellstab(tm)
1 +
Alsevers
1 +
Cellstab(tm)
Alsevers
Cellstab(tm)
Alsevers
1 +
1 +
1 +
1 +
Cellstab(tm)
2+++
2+++
1 +
Alsevers
1 +
1 +
Cellstab(tm)
з+++
2+++
з+++
Alsevers
1 +
1 +
Cellstab(tm)
4+++
4+++
* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не отмывали после инкубации, его оставляли на ночь и отмывали на следующий день.
- положительная оценка клеток в баллах, но число клеток уменьшается (оценка в баллах становится невозможной).
Таблица 18. Серологические результаты испытания стабильности клеток, трансформированных с измененяемыми концентрациями гликолипида В и сохраняемых либо в Cellstab(tm), либо в Alsevers(tm)
День
Раствор для
хранения
клеток
Албаклон анти-В (SNBTS)
Биоклон анти-В
(OCD-разработанный реагент)
Раствор для трансформации (мг/мл)
Alsevers
1 +
1 +
1 +
1 +
1 +
1 +
Cellstab(tm)
1 +
1 +
Alsevers
1 +
1 +
Cellstab(tm)
1 +
1 +
1 +
Alsevers
1 +
1 +
Cellstab(tm)
1 +
1 +
1 +
Alsevers
Cellstab(tm)
Alsevers
1 +
1 +
Cellstab(tm)
Alsevers
1 +
1 +
1 +
Cellstab(tm)
Alsevers
1 +
Cellstab(tm)
* - раствор для трансформации (содержащий гликолипиды) не отмывали после инкубации, его оставляли на ночь и отмывали на следующий день.
++ - положительная оценка клеток в баллах, но число клеток уменьшается (оценка в баллах становится невозможной). FACS-анализ встраивания гликолипида
Проводили трансформацию 1_е(а-Ь)-тромбоцитов человека природным 1_еь-6-гликолипидом на протяжении времени при трех температурах трансформации (37°С, 22°С и 4°С) (фигура 3). Природный 1_еь-6-гликолипид растворяли в плазме и применяли для трансформации RBC при конечной концентрации 2 мг/мл и конечной суспензии 10%.
Реакционную способность определяли FACS-анализом с
применением гамма-анти-Leb. (Уровень серологического детектирования был приблизительно 102 молекул. Встраивание природных гликолипидов при 4°С в течение 8 часов не поддавалось детектированию агглютинацией антителами). Проецирование кривой скорости встраивания из FACS-анализа не указывало, что скорость встраивания при 4°С могла достичь уровней детекции агглютинации через 24 часа. Инкубация при низкой температуре
Трансформацию RBC природным гликолипидом А или В проводили при 37°С в течение 1 часа и 2°С в течение варьируемых интервалов. Клетки агглютинировали биоклоном анти-А или биоклоном анти-В. Результаты представлены в таблицах 19 и 20.
Таблица 19. Результаты Diamed сравнения трансформации природным гликолипидом А при 37°С в течение 1 часа и 2°С в течение варьируемых интервалов
Темп.
Время (часы)
Природный гликолипид А (мг/мл)
37°С
2-3+
2°С
1-2+
2-3+
1-2+
2-3+
2-3+
3-4+
Таблица 20. Результаты Diamed сравнения трансформации природным гликолипидом В при 37°С в течение 1 часа и 2°С в течение варьируемых интервалов
Темп.
Время (часы)
Природный гликолипид А (мг/мл)
37°С
2-3+
2°С
1 +
1-2+
1 +
Скорость трансформации является медленной как для природного гликолипида А, так и для природного гликолипида В, что демонстрируется отрицательными оценками в баллах агглютинации после 1 часа при 2°С. Значительное встраивание было показано при 37°С для этого интервала времени.
Встраивание природного гликолипида А при 2°С требовало 48 часов для достижения такого же уровня встраивания, который можно получить трансформацией при 37°С. После этого времени дальнейшее встраивание не наблюдалось. Подобным же образом, встраивание природного гликолипида В при 2°С не было таким же быстрым, как трансформация при 37°С. Подсчет агглютинации в баллах не повышался при продолженной инкубации и, таким образом, оказалось, что встраивание достигло максимума в этой точке времени для этих концентраций. ПРИМЕРЫ
В примерах описана трансформация эритроцитов синтетическими молекулярными конструкциями изобретения. В контексте этих примеров термин "синтетические гликолипиды" применяют для обозначения этих конструкций.
Пример 1 - Получение синтетических гликолипидов
Материалы и методы
Анализы ТСХ проводили на пластинах силикагеля 60 F254 (Merck), соединения детектировали окрашиванием 8% фосфорной кислотой в воде с последующим нагреванием при температуре выше, чем 200°С. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 (0,2-063 мм, Merck) или сефадексе LH-20 (Amersham). 1Н ЯМР-спектры снимали на спектрометре Брукер DRX-500. Химические сдвиги указываются в м.д. (5) относительно CD3OD.
Синтез активированного 1,2-диолеоил-зп-глицеро-3-
фосфатидилэтаноламина (DOPE) и 1,2-дистереоил-вп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DSPE) (глицерофосфолипиды)
К раствору бис-(М-гидроксисукцинимидмл)адипата (а) (70 мг, 205 мкмоль) в сухом N.N-диметилформамиде (1,5 мл) добавляли DOPE или DSPE (L) (40 мкмоль) в хлороформе (1,5 мл) с последующим добавлением триэтиламина (7 мкл). Смесь выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем нейтрализовали уксусной кислотой и частично концентрировали в вакууме.
Колоночная хроматография (сефадекс LH-20, смесь 1:1 хлороформ-метанол, 0,2% уксусной кислоты) остатка дала активированный липид (A-L) (37 мг, 95%) в виде бесцветного сиропа; ТСХ (хлороформ-метанол-вода, 6:3:0,5): R, = 0,5 (DOPE-A), Rf = 0,55 (DSPE-A).
1Н ЯМР (CDCI3/CD3OD, 2:1), 8: DOPE-A - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,39 (м, 1Н, -ОСН2СНО-СН20-), 4,58 (дд, 1Н, J=3,67, J=11,98, -ССООНСН-СНО-СН20-), 4,34 (дд, 1Н, J=6,61, J=11,98, -ССООНСН-СНО-СН20-), 4,26 (м, 2Н, PO-CHa-CH2-NH2), 4,18 (м, 2Н, -CHgOP), 3,62 (м, 2Н, PO-CtU-CH2-NH2), 3,00 (с, 4Н, ONSuc), 2,8 (м, 2Н, -Chk-CO (Ad), 2,50 (м, 4Н, 2х(-СНа-СО), 2,42 (м, 2Н, -ChU-CO (Ad), 2,17 (m, 8Н, 2x(-CJi> -СН=СН-СНа-), 1,93 (м, 4Н, СОСНзСНаСН^СНгСО), 1,78 (м, 4Н, гх^ОСНгСН^-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,04 (м, 6Н, 2 СН3). DSPE-A - 5,39 (м, 1Н, -ОСН2СНО-СН20-), 4,53 (дд, 1Н, J=3,42, J=11,98, -ССООНСН-СНО-СН20-), 4,33 (дд, 1Н, J=6,87, J=11,98, -ССООНСН-СНО-СН20-), 4,23 (м, 2Н, PO-Chb-CH2-NH2), 4,15 (м, 2Н, -СН^ОР), 3,61 (м, 2Н, РО-CH2-CHrNH2), 3,00 (с, 4Н, ONSuc), 2,81 (м, 2Н, -CHz-CO (Ad), 2,48 (м, 4Н, 2x(-CH^-CO), 2,42 (м, 2Н, -СНг-СО (Ad), 1,93 (м, 4Н, СОСН2СН^СН2СН2СО), 1,78 (м, 4Н, 2х(СОСН2СН2.-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,04 (м, 6Н, 2 СН3).
Конденсация активированного DOPE (или DSPE) с аминспропилгликозидом
К раствору активированного DOPE (или DSPE) (A-L) (33 мкмоль) в N.N-диметилформамиде (1 мл) добавляют 30 мкмоль Sug-Si-NH2 (F-Si-NH2) и 5 мкл триэтиламина. Например, Sug может быть любым аминопропилгликозидом (F-SrNH2) либо трисахарида GalMAca1-3(Fucct1-2)GalB (А-гликотоп) (F), либо трисахариада Gala1-3(Fuca1-2)Gaip (В-гликотоп) (F).
Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Колоночная хроматография (сефадекс LH-20 в смеси 1:1 хлороформ-метанол, затем силикагель в смеси 4:3:1 об. /об./об.) этилацетат-изопропанол-вода) смеси обычно дает 85-90% синтетической молекулярной конструкции, например, ATpi1-sp-Ad-DOPE (I) или ATp"-sp-Ad-DOPE (VI).
1Н ЯМР (CDCI3/CD3OD, 1:1), 8:
ATp"-sp-Ad-DOPE (I) - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,43-5,37 (м, 2Н, Н-1 (GalNHAc) и -ОСН2-СНО-СН20-), 5,32 (д, 1Н, Н-1, J=3,5 Н-1 Fuc), 2,50 (м, 4Н, гх^СН^-СО), 2,40 (м, 4Н, COCH^CHzCHzCH^CO), 2,20 (м, 8Н, 2х(-СНг-CH=CH-Chb-), 2,1 (с, ЗН, NHAc), 1,92 (м, 2Н, -O-CHzChkCHz-NH), 1,8 (m, 8Н,
COCHzChUChbCHzCO и 2х(СОСН2СНг-), 1,43, 1.47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,40 (д, ЗН, J= 6,6, СНз Fuc), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
Атри-spsp^Ad-DOPE (II) - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,43-5,37 [м, 2Н, Н-1 (GalNHAc) и -ОСН2-СНО-СН20-], 5,32 (д, 1Н, Н-1, J=3,6 Н-1 Fuc), 2,50 (м, 4Н, гх^СН^-СО), 2,40-2,32 (м, 6Н, COChbCH2CH2CbbCO и СОСШ- (spi), 2,18 [м, 8Н, 2x(-CtU-CH=CH-Chb-)], 2,1 (с, ЗН, NHAc), 1,95 (м, 2Н, 0-CH2ChUCH2-NH), 1,8 [м, ЮН, COCHzCHaCH^CHzCO, 2х(СОСН2СН2-...), -COCHzCHzjCHzbNH-], 1,68 (м, 2Н, CO(CH2)3CHaCH2NH-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 42Н, 22 СН2), 1,37 (д, ЗН, J=5,6, СНз Fuc), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
Атри-sp-Ad-DOPE (III) - 5,42-5,38 (м, 2Н, Н-1 (GalNHAc) и -ОСН2-СНО-СН20-), 5,31 (д, 1Н, Н-1, J=3,5 Н-1 Fuc), 2,48 [м, 4Н, 2х{-СН2-СО)], 2,42 (м, 4Н, COChbCHzCHzChkCO), 2,18 (с, ЗН, NHAc), 1,95 (м, 2Н, O-CHzCH^CHz-NH), 1,8 [m, 8Н, СОСНгСН^СНзСНзСО и гх^ОСНгСН^-), 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 56Н, 28 СН2), 1,38 (д, ЗН, J= 6,6, СН3 Fuc), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
BTpH-sp-Ad-DOPE (VI) - 5,5 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,42-5,38 [м, 2Н, Н-1 (Gal) и -ОСН2-СНО-СН20-], 5,31 (д, 1Н, Н-1, J=3,7 Н-1 Fuc), 2,48 [м, 4Н, 2х(-CHz-CO)], 2,39 (м, 4Н, СОСНаСНгСНгСНЦСО), 2,18 [м, 8Н, 2х(-СНгСН=СН-СНа-), 1,93 (м, 2Н, 0-CH2ChbCH2-NH), 1,8 [m, 8Н, COCH2CH^C]i> CH2CO и 2x(COCH2CHa-)], 1,43, 1,47 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,36 (д, ЗН, J= 6,6, СН3 Fuc), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
HTpM-sp-Ad-DOPE (VII) - 5,5 [м, 4Н, 2х(-СН=СН-)], 5,4 (м, 1Н, -ОСН2-СНО-СН20-), 5,35 (д, 1Н, Н-1, J=3,2, Н-1 Fuc), 4,65, 4,54 (2д, J=7,4, J=8,6, Н-1 Gal, Н-1 GlcNHAc), 4,46 (дд, 1Н J=3,18, J=12, -ССООНСН-СНО-СН20-), 4,38-4,28 (м, 2Н, Н-5 Fuc, ССООНСН-СНО-СН20-), 2,48 [м. 4Н, 2x(-CHz.-CO)], 2,40 (м, 4Н, COChbCH2CH2ChUCO), 2,18 [м, 8Н, 2х(-СНа-СН=СН-СН2-)], 2,08 (с, ЗН, NHAc), 1,92 (м, 2Н, 0-CH2CHz.CH2-NH), 1,82-1,72 [м, 8Н, COCH2CH^C]i> CH2CO и 2х(СОСН2СН2-)], 1,48, 1,45 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,39 (д, ЗН, J=6,5, СНз Fuc), 1,05 (м, 6Н, 2 СН3).
HflH-sp-Ad-DOPE (VIII) - 5,49 (м, 4Н, 2х(-СН=СН-), 5,37 (м, 1Н, -ОСН2-CHO-CHzO-), 5,24 (д, 1Н, Н-1, J=2,95, Н-1 Fuc), 4,46 (д, J--=7,34, Н-1 Gal), 2,48 [м, 4Н, 2x(-ChU-CO)], 2,42-2,35 (м, 4Н, COCH^CHzCHzCIHaCO), 2,17 [м, 8Н, 2х(-СН2-СН=СН-СН2-)], 1,95 (м, 2Н, 0-CH2CH^CH2-NH), 1,8-1,74 [м, 8Н, COCHzChbChkCHzCO и 2x(COCH2CHz-)], 1,45, 1,41 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,39 (д, ЗН, J=6,5, СНз Fuc), 1,03 (м, 6Н, 2 СН3).
Galp-sp-Ad-DOPE (IX) - 5,51 [м, 4Н, 2х(-СН=СН-)], 5,4 (м, 1Н, -ОСН2-СНО-СН20-), 4,61 (дд, 1Н J=3,18, J=12, -ССООНСН-СНО-СН20-), 4,41 (д, J=7,8, Н-1 Gal), 4,37 (дд, 1Н, J=6,6, J=12, -CCOOHCIH^CHO-CHzO-), 2,50 [м,
4Н, 2x(-CH^-C0)], 2,40 (м, 4H, COCHgCHzCHzCHzCO), 2,20 [м, 8Н, 2x(-Ctb-СН=СН-СН2-)], 1,97 (м, 2Н, 0-CH2CHzCH2-NH), 1,82-1,72 [м, 8Н, СОСНгСН^СЬЦСНгСО и гх^ОСНгСН^-)], 1,48, 1,45 (2 ушир. с, 40Н, 20 СН2), 1,05 (м, 6Н, 2 СНз).
Пример 2 - растворимость синтетических гликолипидов
Для применения при трансформации клеток первым критерием для того, чтобы синтетические гликолипиды были удовлетворительными, является то, чтобы они были растворимыми в водных растворителях, например, забуференном фосфатом солевом растворе. Сначала применяли ряд методик, включающих в себя нагревание и обработка ультразвуком, для достижения максимума растворимости испытуемых синтетических гликолипидов (таблица 21).
Синтетический гликолипид должен быть способен встраиваться в мембрану и быть распознаваемым для подходящего антитела для трансформации, чтобы детектироваться агглютинацией. Первоначальные тесты на молекулы должны были устанавливать растворимость и тем самым элиминировать те молекулы, которые были неподходящими для применения при трансформации клеток.
Результаты этих первоначальных тестов представлены в таблице 22.
Таблица 21. Диапазон испытанных синтетических гликолипидных молекул Липидные хвостовые части DOPE
BTpvrsp-Ad-DOPE(Vl) ATpM-sp-Ad-DOPE (i) GalB-sp-Ad-DOPE (IX) HflM-sp-Ad-DOPE (\7Ш) HTp"-sp-Ad-DOPE (VII) Атри-spspi-Ad-DOPE (II) BTp"-PAA-DOPE (V)
Различные липидные хвостовые части
ATpM-sp-lipid (IV)
ATpH-sp-Ad-DSPE (III)
Таблица 22. Растворимость синтетических гликолипидов в горячем PBS и способность их к трансформации
Синтетические
Растворимость в воде
Способность к
гликолипиды
детектируемой трансформации
ATpM-sp-lipid (IV)
Нет
Нет
Втри-PAA-DOPE (V)
Нет
Нет
BTpM-sp-Ad-DOPE(VI)
Есть
Есть
ATp"-sp-Ad-DOPE (1)
Есть
Есть
Gaip-sp-Ad-DOPE (IX)
Есть
Нет
Нди-sp-Ad-DOPE (VIII)
Есть
Нет
HTpM-sp-Ad-DOPE (VII)
Есть
Есть
Атри-spsprAd-DOPE (II)
Есть
Есть
ATpM-sp-Ad-DSPE(lll)
Есть
Есть
Считали, что отсутствие детектируемой трансформации для Galp-sp-Ad-DOPE (IX) и HflM-sp-Ad-DOPE (VIII) обусловлено неспособностью антитела узнавать гликотоп этих синтетических молекул. Атри-5р-липид (IV) имеет моноацильную, а не диацильную хвостовую часть и было предположено, что не имелось встраивания этой синтетической молекулы в мембранный бислой.
Пример 3 - низкотемпературная трансформация REJC синтетическими гликолипидами ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI)
RBC являются здоровыми при хранении при 4°С и, считается, что подобным же образом являются здоровыми при трансформации при 4°С. На основании предыдущих исследований (см. сравнительные примеры) и исследований других авторов (Schwarzmann, 2000) не предполагалось, что довольно высокая скорость встраивания синтетических гликолипидов может иметь место при 4°С. Эти исследования проводили с природными гликолипидами. Удивительно, что эти исследования не предсказали поведение синтетических гликолипидов изобретения.
Хотя и без желания быть связанными с теорией, считают, что в исследованиях Schwarzmann низкая скорость встраивания природных гликолипидов может быть обусловлена физико-химическими свойствами хвостовой части природного гликолипида, сфинголипида и жирной кислоты.
Диацильная хвостовая часть гликолипида может быть важной в
определении скорости встраивания. Некоторые диацильные хвостовые части могут сохранять более высокую текучесть при более низких температурах. В альтернативном случае, домен мембраны плазмы, в который диацильный хвост этих гликолипидов встраивается, может сохранять эту более высокую текучестью.
Известно, что сфинголипидные хвосты природных гликолипидов скапливаются в жестких доменах и эти домены могут не позволить дальнейшее включение гликолипида при низких температурах. Синтетические гликолипиды с цис-ненасыщенными диацильными хвостами могут быть благоприятными для применения.
Впервые была оценена трансформация RBC синтетическими гликолипидами с различными липидными хвостами (таблицы 22 и 24).
Таблица 23. Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в таблицах 24-27
Анти-А
Изготовитель
Каталог ref
Номер партии
Дата окончания
Албаклон,
Z0010770
12.12.04
SNBTS
Экспериментальный
01102
Биоклон, OCD
реагент
Анти-В
Номер партии
Дата окончания
Изготовитель
Каталог ref
Z0110600
27.04.03
Албаклон,
01103
SNBTS
Экспериментальный
Биоклон, OCD
реагент
Таблица 24. Оценка встраивания различных липидных хвостов агглютинацией приемлемыми антисыворотками
Молекула
Анти-сыворотка
Раствор для трансформации (мкг/мл)
100 0
500
250
125
100
ATpM-sp-Ad-
Alba
DOPE (I)
Bio
1 +
Alba
Bio
4+*
4+*
DBA
Втри-sp-Ad-
Alba
DOPE (VI)
Bio
Alba
1 +
Bio
1 +
Атри-spspi-
Alba
Ad-DOPE (II)
Bio
Alba
Bio
3+*
4+*
DBA
ATpM"Sp-
Alba
ЛИПИД
Bio
(IV)
Alba
ATpH-sp-Ad-
Bio
DSPE (III)
Alba
2-3+
Bio
2-3+
DBA
* - сплаттер.
Затем оценивали трансформацию RBC синтетическими гликолипидами ATp"-sp-Ad-DOPE (I) и BTpi1-sp-Ad-DOPE (VI) при 4°С (таблицы 25-28). Эти трансформации были направлены на получение клеток, экспрессирующих низкие уровни гликотопов А, В или А и В ("слабые клетки для А, В и АВ").
Для получения "слабых клеток для А и В" растворы для трансформации (20 мкл ATpM-sp-Ad-DOPE (I) при 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6, 0,3, 0,15, 0,08, 0,05 и 0,03 мг/мл) в 1х PBS смешивали с промытой эритроцитарной массой RBC группы О (60 мкл).
Для получения "слабых клеток для АВ" растворы для трансформации (20 мкл ATpM-sp-Ad-DOPE (I) при 0,07, 0,06 и 0,05 мг/мл и Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,3 и 0,2 мг/мл) в 1х PBS смешивали с промытой эритроцитарной массой RBC группы О (60 мкл). Комбинациями были: Атри-sp-Ad-DOPE (I) при 0,07 мг/мл + BTpvi-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,3 мг/мл; ATp"-sp-Ad-DOPE (I) при 0,07 мг/мл + BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,2 мг/мл; ATpii-sp-Ad-DOPE (I) при 0,06 мг/мл + BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,3 мг/мл; ATp"-sp-Ad-DOPE (I) при 0,06 мг/мл + BTPH-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,2 мг/мл; ATpM-sp-Ad-
DOPE (I) при 0,05 мг/мл + BTp"-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,3 мг/мл и ATp"-sp-Ad-DOPE (I) при 0,05 мг/мл + BTp"-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,2 мг/мл.
Клетки и растворы для трансформации помещали в холодильник при 4°С. Смешивание пипеткой проводили с интервалами. Клетки удаляли для тестирования через интервалы времени против подходящих антисывороток и тестировали как в промытых, так и непромытых состояниях (т.е. промытые образцы имели удаленный раствор для трансформации).
Спустя 48 часов к клеткам добавляли Celpresol(tm), так чтобы конечное отношение клетки: неклетки было 3:5 (об./об.). Клетки продолжали тестировать через интервалы времени. Тестирование прерывали через 10 дней, так как клетки становились коричневыми.
Это изменение цвета может быть приписано ряду факторов, включающих в себя следующие факторы: клетки были уже возраста 21 дня, когда их трансформировали; 48-часовая трансформация была в PBS, но не в Celpresol(tm), поэтому клетки в течение этого времени подвергались стрессу; и с клетками могли неправильно обращаться при транзите между лабораториями трансформации и тестирования. Это можно уменьшить трансформацией клеток в Celpresol(tm), в противоположность PBS.
Таблица 25. Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией А, трансформированных при 4°С против анти-А
Время
ATpM-sp-Ad-DOPE (I) (мг/мл)
Промытые
Непромытые
0,08
0,05
0,03
0,08
0,05
0,03
2 час
4 час
1 +
6 час
8 час
2-3+
12 час
2-3+
1 +
24 час
3-4+
1 +
3-4+
30,5 час
3-4+
1 +
3-4+
48 час
72 час
2-3+
96 час
2-3+
2-3+
День 7
3-4+
День 10
3-4+
Таблица 26. Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией В,
трансформированных при 4°С против анти-В
Время
BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) (мг/мл)
Промытые
Непромытые
0,6
0,3
0,15
0,6
0,3
0,15
2 час
4 час
1 +
6 час
1 +
8 час
12 час
2-3+
24 час
30,5 час
2-3+
2-3+
48 час
1 +
72 час
96 час
3-4+
2-3+
3-4+
2-3+
День 7
2-3+
День 10
Таблица 27. Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией АВ,
трансформированных при 4°С в блок-титре против анти-А
День
BTpM-sp-Ad-
ATpM-sp-Ad-DOPE (VI) (мг/мл)
DOPE (VI)
Промытые
Непромытые
(мг/мл)
0,07
0,06
0,05
0,07
0,06
0,05
0,3
1-2+
2-3+
1 +
0,2
1-2+
2-3+
1 +
0,3
1-2+
1 +
2-3+
1-2+
0,2
1-2+
2-3+
1-2+
0,3
2-3+
0,2
2-3+
1-2+
Таблица 28. Результаты Diamed RBC со слабой экспрессией АВ, трансформированных при 4°С в блок-титре против анти-В
День
Втри-sp-Ad-
ATpil-sp-Ad-DOPE (VI) (мг/мл)
DOPE (VI)
Промытые
Непромытые
(мг/мл)
0,07
0,06
0,05
0,07
0,06
0,05
0,3
2-3+
0,2
1 +
1-2+
1-2+
0,3
1 +
0,2
1 +
0,3
0,2
1 +
1 +
Пример 4 - Эффективность трансформации RBC встраиванием синтетических гликолипидов ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и BTp"-sp-Ad-DOPE (VI)
Растворы-супернатанты после трансформации (из ATp"-sp-Ad-DOPE (I) при 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,3 мг/мл и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли неразбавленными и при разведении 1:2 к промытой, эритроцитарной массе RBC (60 мкл). Пробирки инкубировали при 37°С на водяной бане в течение одного часа, причем перемешивание проводили каждые 15 минут.
Трансформированные RBC промывали Зх PBS и затем суспендировали в Cellstab(tm) при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Таблица 29. Пробирочный серологический тест
Конц. перед трансформацией (мг/мл)
Оценка в баллах
Атри-sp-Ad-DOPE (I) при 0,08
1:2 ATpM-sp-Ad-DOPE (I) при 0,08
Атри-sp-Ad-DOPE (I) при 0,05
1:2 ATpM-sp-Ad-DOPE (I) при 0,05
Атри-sp-Ad-DOPE (I) при 0,03
1:2 Атри-sp-Ad-DOPE (I) при 0,03
Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,60
VW+
1:2 Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,60
Оценка в баллах, проведенная с раствором-супернатантом после трансформации (из раствора перед трансформацией 0,08 мг/мл), не является одинаковой с оценкой в баллах раствора для трансформации 0,3
мг/мл при первом пассаже (w+). Эти результаты указывают, что > 75% молекул встраивается в мембраны RBC при первом пассаже.
Кроме того, растворы после трансформации концентрировали 20х и сравнивали соответственно с растворами трансформации известной концентрации. Тестировали только растворы после трансформации, полученные из растворов 0,08 мг/мл ATpii-sp-Ad-DOPE (I) и 0,6 мг/мл Втри-sp-Ad-DOPE (VI).
Растворы после трансформации (20 мкл) диализовали (размер пор 500 Да) против деионизированной воды в течение 2 дней. Образцы оставляли для сушки в вытяжном шкафу в течение 10 дней. В конце этого времени их переносили в колбу роторного испарителя и устанавливали на роторный испаритель для вращения при включении вакуума с нагреванием на протяжении ночи.
Образцы сушили на водяной бане при 40°С и промывали в меньшие сосуды смесью 2:1 хлороформ-метанол, получая оставшиеся значительные количества высушенного клеточного материала. Промывочные растворы хлороформ-метанол, 2:1, сушили, промывали снова в тест-пробирки смесью 2:1 хлороформ-метанол и сушили. Эти образцы снова растворяли в 1 мл 1 х PBS и применяли для экспериментов по трансформации. Клеточный материал на дне склянок промывали водой в другой набор пробирок.
Растворы после трансформации (из ATpM-sp-Ad-DOPE (I) при 0,08 мг/мл и Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли к промытой, эритроцитарной массе RBC (60 мкл). Параллельно растворы для трансформации (ATpM-sp-Ad-DOPE (I) при 0,08 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,03 мг/мл и BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,6 мг/мл, 20 мкл) добавляли к высушенной, эритроцитарной массе RBC (60 мкл).
Пробирки инкубировали на водяной бане при 37°С в течение одного часа, причем перемешивание проводили каждые 15 минут. Трансформированные RBC промывали Зх PBS и затем суспендировали в Cellstab(tm) при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Таблица 30. Серология Diamed
Концентрация (мг/мл)
Оценка в баллах
ATpM-sp-Ad-DOPE (1) при 0,08
ATpM-sp-Ad-DOPE (1) при 0,05
Атри-sp-Ad-DOPE (1) при 0,03
1 +
Из ATpM-sp-Ad-DOPE (1) при 0,08
Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,60
Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при 0,60
Эти результаты позволяют предположить, что имеется недостаточное число молекул в растворе после трансформации, даже когда концентрация 20х, чтобы быть детектированными серологией.
Пример 5 - трансформация мышиных RBC синтетическим гликолипидом HTpM-sp-Ad-DOPE (VII)
Мышиные клетки трансформировали при 37°С в течение 1 часа.
Таблица 31. Реагенты анти-Н, применяемые для получения результатов, приведенных в таблицах 32 и 33,
Антисыворотка
Изготовитель
Партия
Анти-Н IgM
Japanese Red Cross
HIRO-75
UEA
Lome Laboratories
11549E D.O.E. 06.2004
Blo-UEA
EY Labs
201105-2
Таблица 32. Пробирочная серология
Клетки
Антисыворотки H
IgM
UEA
Bio-UEA
T = 0
T = 20
Мышиные RBC (- контроль)
Мышиные RBC + 0,01 мг/мл Нтри-sp-Ad-DOPE (VII)
Мышиные RBC + 0,05 мг/мл'Нтри-sp-Ad-DOPE (VII)
1 +
Мышиные RBC + 0,1 мг/мл HTpM-sp-Ad-DOPE (VII)
Мышиные RBC + 0,25 мг/мл HTpM-sp-Ad-DOPE (VII)
1 +
Мышиные RBC + 1 мг/мл HTpM-sp-Ad-DOPE (VII)
Человеческие О RBC (+ контроль)
1 +
2/3+
Таблица 33. Diamed
Клетки
Оценка в баллах
Мышиные RBC + 0,01 мг/мл HTpM-sp-Ad-DOPE (VII)
Мышиные RBC + 0,05 мг/мл HTp"-sp-Ad-DOPE (VII)
Мышиные RBC + 0,1 мг/мл HTp"-sp-Ad-DOPE (VII)
Мышиные RBC + 0,25 мг/мл HTpi1-sp-Ad-DOPE (VII)
Пример 6 - трансформация RBC фильтрованным синтетическим гликолипидом ATpH-sp-Ad-DOPE (I)
Некоторое количество ATpM-sp-Ad-DOPE (I) фильтровали в стерильных условиях через фильтр 0,2 мкм. Для исследования того, будет ли трансформация одинаковой с этим продуктом проводили сравнительный опыт.
Таблица 34. Анти-А, применяемая для получения результатов, представленных в таблице 35
Изготовитель
Каталог ref
Номер партии
Дата окончания
Биоклон, OCD
Экспериментальный реагент
01102
Таблица 35. Колоночная агглютинация RBC А, трансформированных с варьируемыми концентрациями фильтрованного в стерильных условиях Атри-sp-Ad-DOPE (I) по сравнению с нефильтрованным ATpM-sp-Ad-DOPE (I)
Концентрация (мг/мл)
Фильтрованный в стерильных условиях ATpM-sp-Ad-DOPE (I)
Нефильтрованный Атри-sp-Ad-DOPE (I)
0,2
0,1
3-4+
0,05
2-3+
2-3+
0,01
Контроль при 37°С
Контроль при 25°С
Эти результаты не показывают значительное различие между двумя
препаратами ATpH-sp-Ad-DOPE (I) и позволяют предположить, что
фильтрование через фильтр 0,2 мкМ не удаляет молекулы или не изменяет состав или свойства жидкости до точки, которая влияет на трансформацию. Пример 7 - хранение трансформированных клеток
Для исследования того, изменяет ли хранение при 4°С или 37°С результаты агглютинации трансформированных ATpM-sp-Ad-DOPE (I) и природным гликолипидов О RBC, идентифицированные как клетки "син-А" и "прир-А", соответственно, эти клетки делили на две части и суспендировали до 5% в Cellstab(tm).
Одну партию клеток хранили при 4°С и другую партию хранили при 37°С на водяной бане. Оценивали агглютинацию трансформированных клеток после хранения (таблица 36).
Таблица 36
Время
Платфор-
Темп.
Син-А
Прир-А
Контроль
(час)
(°С)
ATpM-sp-Ad-DOPE
При 1
При 10
(1) при 0,1 мг/мл
мг/мл
мг/мл
Пробирка
1-2+
Колонка
Колонка
Пример 8 - трансформация RBC синтетическими А- и В-антигенными гликолипидами с разными неуглеводными структурами
Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные Атри-sp-Ad-DOPE (I), ATpn-spiSps-Ad-DOPE (II), Атри-sp-Ad-DSPE (III) и Втри-sp-Ad-DOPE (VI), получали согласно методу, описанному в примере 1 с необходимыми модификациями.
Промытую эритроцитарную массу эритроцитов (RBC) группы О (3 объемные части) и раствор синтетического гликолипида (1 объемная часть, варьируемые концентрации) добавляли в пробирку Эппендорфа. Пробирку инкубировали на водяной бане при 37°С в течение одного часа, перемешивая содержимое каждые 15 минут. Трансформированные RBC промывали Зх PBS и затем суспендировали в Cellstab(tm) при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Результаты пробирочного серологического теста и Diamed гель-карт для RBC, трансформированных различными синтетическими молекулярными конструкциями, представлены в таблице 38. Результаты
стабильности RBC, трансформированных различными синтетическими гликолипидами при различных концентрациях, представлены в таблицах 3944.
Таблица 37. Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в таблицах 38-44.
Антисыворотки
Изготовитель
Партия
Албаклон анти-А
SNBTS
Z0010770-D.O.E. 12.12.04
Биоклон анти-А
Ortho Diagnostics
01102 - D.O.M. 16.05.02
Албаклон анти-В
SNBTS
Z0110670 - D.O.E. 12.12.04
Биоклон анти-В
Ortho Diagnostics
01102 - D.O.M. 16.05.02
Таблица 38. Сравнение трансформации RBC при применении А-антигенных синтетических гликолипидов при разных концентрациях
Синтетич. гликолипид
Конц. мг/мл
Антисыворотка А
Албаклон анти-А
Биоклон анти-А
Пробирка
Diamed
Пробирка
Diamed
Атри-sp-Ad-DOPE (I)
0,25
н.о.
н.о.
0,1
н.о.
4+/3+
н.о.
4+/3+
0,05
0,04
н.о.
1 +
н.о.
0,03
н.о.
н.о.
0,02
н.о.
н.о.
0,01
Атри-sp-Ad-DSPE (III)
0,25
н.о.
н.о.
0,1
н.о.
н.о.
0,05
0,04
н.о.
н.о.
0,03
н.о.
н.о.
0,02
н.о.
н.о.
0,01
ATpM-spisp2-Ad-DOPE (II)
0,25
н.о.
н.о.
0,1
н.о.
н.о.
4+/3+
0,05
0,04
н.о.
н.о.
0,03
н.о.
н.о.
0,02
н.о.
н.о.
0,01
Инкубир. контроль
н.о.
н.о.
Лаборат. контроль
н.о.
н.о.
Аббревиатура: н.о. - не определяли
Таблица 39. Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при высоких концентрациях (1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией.
День
Раствор для
хранения
клеток
Албаклон анти-А
Биоклон анти-А
Концентрация раствора для трансформации (мг/мл)
0,5
0,25
0,5
0,25
Alsevers
4+°
4+°
4+°
Cellstab1 м
4+°
4+°
4+°
Alsevers
4+°
4+°
Cellstab,M
4+°
3+°
4+°
4+°
4+и
Alsevers
4+°
4+°
4+°
Cellstab,M
4+°
4+°
4+°
Alsevers
Cellstab,M
4+°
Аббревиатура: 0 - сплаттер
Таблица 40. Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при низких концентрациях (0,1 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,025 мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией.
День
Раствор для
хранения
клеток
Албаклон анти-А
Биоклон анти-А
Концентрация раствора для трансформации (мг/мл)
0,1
0,05
0,025
0,1
0,05
0,025
Alsevers
3+/2+
1 +
1+/W+
2+/1 +
1 +
CellstabIM
3+/2+
1 +
3+/2+
3+/2+
Alsevers
1 +
3+/2+
Cellstab,M
1+/W+
3+°
1 +
Alsevers
1 +
Cellstab,M
1 +
Alsevers
CellstabIM
1 +
Alsevers
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
CellstablM
Аббревиатура: не определяли, 0 - сплаттер
Таблица 41. Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при высоких концентрациях (1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли на Diamed гель-картах.
День
Раствор для
хранения
клеток
Албаклон анти-А
Биоклон анти-А
Концентрация раствора для трансформации (мг/мл)
0,5
0,25
0,5
0,25
Alsevers
Cellstab,M
Alsevers
Cellstab(tm)
Alsevers
CellstabiM
Alsevers
Cellstab(tm)
Alsevers
CellstabIM
Alsevers
Cellstab,M
Alsevers
Cellstab,M
Alsevers
Cellstab,M
Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования, контрольные опыты прекращали
Таблица 42. Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (I) при низких концентрациях (0,1 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,025 мг/мл). Агглютинацию определяли на Diamed гель-картах.
День
Раствор для
Албаклон анти-А
Биоклон анти-А
хранения
Концентрация раствора для трансформации
клеток
(мг/мл)
0,1
0,05
0,025
0,1
0,05
0,025
Alsevers
1 +
Cellstab,M
1 +
Alsevers
1 +
CellstabIM
1 +
Alsevers
3+/2+
1 +
Cellstab,M
1 +
Alsevers
3+/2+
Cellstab,M
1 +
Alsevers
CellstabIM
Alsevers
CellstabIM
4+/3+
1 +
Alsevers
CellstabIM
1 +
Alsevers
3+/2+
Cellstab,M
Alsevers
Cellstab,M
4+/3+
Alsevers
Cellstab'M
4+/3+
Alsevers
CellstabIM
4+/3+
Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования,
контрольные опыты прекращали.
Таблица 43. Исследование стабильности RBC, трансформированных Атри-sp-Ad-DOPE (VI) при высоких концентрациях (1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25
мг/мл). Агглютинацию определяли мануальной пробирочной серологией.
День
Раствор для
Албаклон анти-А
Биоклон анти-А
хранения
Концентрация раствора для трансформации
клеток
(мг/мл)
0,5
0,25
0,5
0,25
Alsevers
1 +
1 +
Cellstab|М
1 +
Alsevers
CellstabIM
Alsevers
Cellstab,M
Alsevers
CellstabIM
Alsevers
Cellstab,M
3+°
3+°
Alsevers
1 +
1 +
CellstabIM
2+/1 +
4+°
1 +
Alsevers
1 +
Cellstab"*
и.о.
Alsevers
CellstabIM
H.O.
Аббревиатуры: 0 - сплаттер
Таблица 44. Исследование стабильности RBC, трансформированных Втри-sp-Ad-DOPE (VI) при высоких концентрациях (1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл). Агглютинацию определяли на Diamed гель-картах.
День
Раствор для
хранения
клеток
Албаклон анти-А Биоклон анти-А
Концентрация раствора для трансформации (мг/мл)
0,5
0,25
0,5
0,25
Alsevers
CellstabIM
Alsevers
Cellstab,M
Alsevers
1 +
Cellstab,M
Alsevers
Cellstab'"
Alsevers
Cellstab,M
Alsevers
CellstabIM
Alsevers
CellstabIM
4+/3+
Alsevers
Cellstab'"
Alsevers
1 +
Cellstab'"
Alsevers
Cellstab'"
3+/2+
Alsevers
Cellstab'"
4+/3+
1 +
4+/3+
2+/1 +
116
Alsevers
Cellstab1"
4+/3+
1 +
Когда имелось недостаточное количество клеток для тестирования,
контрольные опыты прекращали.
Пример 9 - трансформация эритроцитов Н-антигенными синтетическими гликолипидами
Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные HTpM-sp-Ad-DOPE (VII), Нди-sp-Ad-DOPE (VIII) и GalB-sp-Ad-DOPE (IX), получали согласно методу, описанному в примере 1 с необходимыми модификациями.
Промытую эритроцитарную массу мышиных RBC (3 объемные части) и растворы синтетических гликолипидов (1 объемная часть варьирующихся концентраций) добавляли к пробирке Эппендорфа. Пробирку инкубировали на водяной бане при 37°С в течение одного часа, перемешивая каждые 15 минут. Трансформированные RBC промывали Зх РВС и затем суспендировали в Cellstab(tm) при концентрации, подходящей для серологического тестирования.
Результаты пробирочной серологии и анализа на Diamed гель-картах для RBC, трансформированных различными синтетическими гликолипидами, представлены в таблице 46. Результаты показывают, что три сахара (Нтри) требуется для детектирования анти-Н IgM, по меньшей мере, применяемым реагентом.
Таблица 45. Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в таблице 46
Антисыворотки
Изготовитель
Партия
Анти-Н IgM
Japanese Red Cross
HIRO-75
UEA
Lome Laboratories
11549E D.O.E.06.2004
Bio-UEA
EY Labs
201105-2
Таблица 46. Сравнение трансформации RBC с применением Н-антигенных синтетических гликолипидов с различными гликотопами, приготовленными при различных концентрациях
Синтетич. гликолипид
Конц. мг/мл
Н-антисыворотка
lg М
UEA
Bio-Uea
Пробирка
Diamed
Пробирка ТО
Пробирка Т20
Пробирка
HTPH-sp-Ad-DOPE (VII)
н.о.
Н.о.
н.о.
0,25
н.о.
н.о.
1 +
0,1
н.о.
н.о.
н.о.
0,05
1 +
н.о.
н.о.
н.о.
0,01
Н.о.
н.о.
н.о.
Нди-sp-Ad-DOPE (VIII)
0,25
н.о.
Н.о.
н.о.
н.о.
0,1
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
0,05
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
0,01
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
Galp-sp-Ad-DOPE (IX)
0,25
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
0,1
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
0,05
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
0,01
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
О клетки человека
н.о.
1 +
2/3+
Инкубиров
энный
контроль
н.о.
н.о.
Лаборат. контроль
н.о.
н.о.
н.о.
н.о.
Аббревиатура: н.о. - не определяли
Пример 10 - встраивание синтетических липидов Hfl"-sp-Ad-DOPE (VIII) и Galp-sp-Ad-DOPE (IX) в мышиные эритроциты
Водорастворимые синтетические гликолипиды, обозначенные Нди-sp-Ad-DOPE (VIII) и Gaip-sp-Ad-DOPE (IX), получали согласно методу, описанному в примере 1 с необходимыми модификациями.
Мышиные RBC промывали Зх в 1х PBS. 30 мкл эритроцитарной массы RBC смешивали с 30 мкл HflM-sp-Ad-DOPE (VIII) и 30 мкл эритроцитарной массы RBC смешивали с 30 мкл Gaip-sp-Ad-DOPE (IX), соответственно. Обе синтетические молекулярные конструкции применяли при концентрации 1,0 мг/мл. 30 мкл 1х PBS добавляли к 30 мкл эритроцитарной массы RBC для действия в качестве контрольной группы. Клетки инкубировали в течение 90 минут во встряхиваемой водяной бане при 37°С. RBC промывали Зх в 1х PBS.
Три группы эритроцитарной массы RBC инкубировали в равном объеме лецитина UEA-1 в течение 30 минут при комнатной температуре. Лецитин получали в 1х PBS при концентрации 1 мг/мл. 50 мкл 3% клеточной суспензии вращали в течение 15 секунд в иммунофуге при низкой скорости. Результаты считывали пробирочной серологией. Результаты представлены в таблице 48. Результаты показывают, что ни анти-Н IgM, ни UEA-1 не
детектирует два сахара (Нди).
Таблица 47. Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в таблице 48
Антисыворотки
Изготовитель
Партия
Биотест анти-Н
Biotest AG
UEA
EY Labs
201105-2
Таблица 48. Мышиные RBC, трансформированные GalB-sp-Ad-DOPE или HflM-sp-Ad-DOPE, оцененные агглютинацией
Тип клеток
Встроенная молекула
UEA-1
Мышиный IgM"
Мышиные RBC
GalB (1 мг/мл)
н.о.
Мышиные RBC
Нди (1 мг/мл)
Мышиные RBC
Контроль (PBS)
RBC человека
Контроль (PBS)
Аббревиатуры: н.о. - не определяли
Пример 11 - получение контролей чувствительности
Синтетические гликолипиды изобретения можно применять при получении "контролей чувствительности" (называемых также "клетками контроля качества", "контролями серологии" или "контролями способа"), как описано в описании, прилагаемом к Международной патентной заявке № PCT/NZ02/00214 (WO 03/034074). Синтетические гликолипиды обеспечивают преимущество, состоящее в том, что трансформация RBC может быть достигнута при пониженных температурах. Растворы для трансформации RBC Применяют два исходных раствора:
Раствор 1: 1 мг/мл ATpM-sp-Ad-DOPE (I), суспендированного в растворе Celpresol(tm).
Раствор 2: 5 мг/мл DTpM-sp-Ad-DOPE (VI), суспендированного в растворе Celpresol(tm).
Гликолипиды получали в виде белого сухого порошка. Гликолипиды в этой форме (заключенные в герметизированный контейнер при регулируемой температуре) являются стабильными в течение неограниченного периода времени. Гликолипиды суспендируют в растворе (например, Celpresol(tm)) по массе, чтобы приготовить растворы для трансформации.
После того, как растворы для трансформации получают при CSL, их фильтруют (через фильтр 0,22 мк MILLEXO-GV) в асептических условиях.
Процессинг RBC
Доноров RBC обрабатывают с применением устройства-центрифуги для мойки с непрерывным потоком в асептических условиях. Доноров RBC промывают в забуференном солевом растворе, затем в растворе Celpresol(tm). PCV доноров RBC измеряют на анализаторе Beckman Coulter АсТ Diff. Объем доноров затем регулируют до 50% объема эритроцитарной массы (PCV) добавлением Celpresol(tm).
Трансформация RBC для получения "клеток со слабой экспрессией АВ"
RBC промывают в буферном солевом растворе и Celpresol(tm). Клетки
суспендируют в растворе Celpresol(tm) до > 50% PCV. PCV эритроцитов
измеряют с применением Beckman Coulter АсТ Diff. Массу раствора
эритроцитов определяют взвешиванием.
Количество ATpM-sp-Ad-DOPE (I), BTpM-sp-Ad-DOPE (VI) и Celpresol(tm)
для трансформации вычисляют с применением следующих уравнений
а= PxF S
b = PxF S
С=Р_(1 _P)_a-b
где
а равно количеству ATp"-sp-Ad-DOPE (I), которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл),
b равно количеству BTp"-sp-Ad-DOPE (VI), которое нужно добавить на 1 мл эритроцитов (мл),
с равно количеству Celpresol(tm), которое нужно добавить на 1 мл
эритроцитов (мл), чтобы развести клетки до 50% PCV,
Р равно PCV раствора эритроцитов,
F равно конечной требуемой концентрации гликолипида,
S равно концентрации исходного раствора гликолипида.
Для определения количества гликолипида и Celpresol(tm), которое нужно добавить к объемной массе образца эритроцитов, каждое из чисел а, b и с умножают на объем эритроцитов. К объемной массе образца в асептических условиях добавляют ATp"-sp-Ad-DOPE (I), BTp"-sp-Ad-DOPE (VI) и Celpresol(tm).
Образец инкубируют в течение 3 часов при 20°С в регулируемых температурных условиях и постоянном осторожном перемешивании. В конце периода 3 часов в асептических условиях отбирают образец эритроцитов и образец тестируют для подтверждения трансформации RBC. Определение группы крови проводят с применением методик пробирочной реакции агглютинации, агглютинации на керамической плитке или технологии колоночной агглютинации (CAT).
Образец эритроцитов инкубируют в течение 3 часов при 2-8°С в регулируемых температурных условиях и постоянном осторожном перемешивании в течение 18 часов. В конце 3 часового периода в асептических условиях отбирают образец эритроцитов и образец тестируют для подтверждения трансформации эритроцитов. Определение группы крови проводят с применением пробирочной методики, методики на керамической плитке и CAT.
Трансформированные эритроциты промывают с применением метода центрифугирования с непрерывным потоком в асептических условиях и с применением раствора Celpresol(tm). Измеряют PCV промытых эритроцитов и величину регулируют до 50% PCV добавлением раствора Celpresol(tm). Препарат и его распределение
В асептических условиях объем трансформированных RBC объединяют с объемом имитирующей разбавитель плазмы (SPD). Плазма может содержать моноклональные и поликлональные антитела. Антитела выбирают согласно требуемым характеристикам контролей чувствительности. Плазма может дополнительно содержать тартразин и бычий сывороточный альбумин.
Определение группы и скрининг антител проводят на образцах массы с применением пробирочной методики, методики на керамической плитке и CAT. Затем смесь трансформированных RBC-SPD в асептических условиях распределяют в пробирки BD Vacutainer и пробирки соответственно метят. Тестирование валидности
Клетки со слабой экспрессией АВ, продуцированные с применением синтетических гликолипидов (обозначенных AWBW в таблицах 51-53), применяли для обоснования диапазона платформ для тестирования параллельно с существующими в природе клетками со слабой экспрессией А, В и АВ.
Таблица 49. Реагенты и карты, применяемые при валидации тестирования.
Метод
Реагент
Пробирки
Эпиклон
Плитки
Эпиклон
Ref
Изготовитель и тип
Партия
Дата окончания
CAT 1
OCD BioVue ABD/Rev
ABR528A
16.06.05
CAT 2
OCD BioVue ABD/Rev
ABR521A
06.05.06
CAT 3
OCD BioVue ABD/ABD
ACC255A
24.05.05
CAT 4
Diamed ID-MTS
50092.10.02
Апр.-05
CAT 5
Типирование донора Diamed ID-MTS
51051.05.04
Май-05
CAT 6
Типирование реципиента Diamed ID-MTS
50053.07.02
Апр.-05
CAT 7
Типирование клеточного столбика Diamed ID-MTS
50961.08.03
Июль-05
Таблица 50. Методология платформы тестирования для валидации
тестирования
Плитка
1 капля 3% клеток, 2 капли реагента, 15 мин при к.т. во влажной камере
Пробирка
2 капли при к.т., 10 мин
ID-MTS
Как по инструкциям изготовителя с применением Dil-2
BioVue
Как по инструкциям изготовителя с применением 0,8% RCD
Таблица 51. Результаты валидации всех методов против анти-А
Клетка
Тип
Платформа тестирования
Пробирка
Плитка
CAT 1
CAT 2
CAT 3
CAT 4
CAT 5
CAT 6
CAT 7
1 +
AiB
А2В
1 +
1 +
1 +
1 +
1 +
1 +
А3В
AWBW
Таблица 52. Результаты валидации всех методов против анти-В
Клетка
Тип
Платформа тестирования
Пробирка
Плитка
CAT 1
CAT 2
CAT 3
CAT 4
CAT 5
CAT 6
CAT 7
A,B
А2В
0 .
А3В
1 +
1 +
AWBW
1 +
1 +
1 +
Таблица 53. Результаты валидации всех методов против анти-АВ
Клетка
Тип
Платформа тестирования
Пробирка
Плитка
CAT 1
CAT 2
CAT 3
CAT 4
CAT 5
CAT 6
CAT 7
A,B
А2В
А3В
AwBw
Пример 12 - присоединение модифицированных эмбрионов к трансформированным эндометриальным клеткам
Исследовали возможности осуществлять количественные и качественные различия в антигенах клеточной поверхности, экспрессированными типами клеток, другими, чем RBC. Способность повышать адгезию эмбрионов к эндометриальным клеткам принимали как модельную систему.
Синтетические молекулы можно применять в качестве синтетических мембранных якорей и/или синтетических молекулярных конструкций. Следовательно, их можно применять также в способе повышения имплантации эмбрионов, как описано в Международной патентной заявке № PCT/NZ2003/000059 (опубликована как WO 03/087346), которая включена в качестве ссылки.
• Трансформация эндотелиальных клеток Встраивание водорастворимой синтетической молекулярной конструкции
Получали суспензию отдельных эндометриальных эпителиальных клеток. Эндометриальные клетки промывали Зх ресуспендированием в CMF HBSS и центрифугированием при 2000 об./мин в течение 3 минут.
Препарат промытых клеток ресуспендировали в 50 мкл М2.
Получали пробирки микроцентрифуги, причем каждая из них содержала 50 мкл раствора 5М/мл эндометриальных клеток. К отдельным пробиркам эндометриальных клеток добавляли 50 мкл синтетических гликолипидов ATpM-sp-Ad-DOPE (I) или BTp"-sp-Ad-DOPE (VI) или 50 мкл М2 добавляли к контрольным клеткам. Клетки инкубировали в течение 90 минут при 37°С на смесителе. Эндометриальные клетки промывали Зх ресуспендированием в среде CMF HBSS и центрифугированием при 2000 об./мин в течение 3 минут. Препарат промытых клеток ресуспендировали в 50 мкл М2.
Тест на встраивание с применением флуоресцентного зонда:
50 мкл соответствующего первичного мышиного моноклонального
антитела добавляли к каждой пробирке. Каждую пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Клетки промывали Зх в среде М2. 10 мкл мышиного анти-lgG FITC добавляли к каждой пробирке. Пробирки инкубировали при комнатной температуре в темных условиях в течение 10 минут. Эндометриальные клетки помещали на предметные стекла и рассматривали под флуоресцентным микроскопом. Тест для прямой агглютинации:
5 мкл каждой группы клеток помещали на отдельные предметные стекла микроскопа. К каждой 5 мкл капле клеток добавляли 5 мкл соответствующего антитела. Клетки осторожно смешивали на предметном стекле в течение 2 минут. Агглютинацию визуально наблюдали под микроскопом. Результаты представлены в таблице 55.
Таблица 64. Антисыворотки, применяемые для получения результатов, представленных в таблице 55
Антисыворотки
Изготовитель
Биоклон анти-А
Ortho Diagnostics
01102. D.O.M. 16.05.02
Биоклон анти-В
Ortho Diagnostics
Developmental reagent
Таблица 55. Эндометриальные клетки, трансформированные Атри-sp-Ad-DOPE (I) или Втри-sp-Ad-DOPE (VI), визуализируемые с применением флуоресценции
Тип клеток
Встроенный антиген
Антитело 1°
Флуоресцентный подсчет после инкубации с зондом IgFITC
Реакция агглютинации, определяемая микроскопической
визуализацией
Эндометриальные клетки
Атри-sp-Ad-DOPE (1)(1 мг/мл)
Биоклон анти-А
Эндометриальные клетки
Втри-sp-Ad-DOPE (Vl)(1 мг/мл)
Биоклон анти-В
1 +
Эндометриальные клетки
Контроль (среда М2)
Биоклон анти-А
•Модификация эмбриона
Встраивание водорастворимой синтетической молекулярной конструкции:
Прозрачную зону эмбрионов удаляли обработкой эмбрионов 9,5% протаназой в термостате при 37°С в течение 6 минут или до тех пор, пока не будут удалены все зоны. Микрокапли получали добавлением 5 мкл синтетического гликолипида ATpM-sp-Ad-DOPE (I) или BTpM-sp-Ad-DOPE (VI)
при концентрации 1 мг/мл к 45 мкл капле среды М2, покрытой минеральным маслом. Все группы эмбрионов инкубировали в 50 мкл микрокапель в течение 1 часа при 37°С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали Зх средой М2. Тест на встраивание:
Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп помещали в микрокаплю соответствующего антитела и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали Зх средой М2.
Эмбрионы из всех экспериментальных и контрольных групп помещали в микрокапли антимышиного lg FITC (разведение 1:50 антимышиного lg FITC в М2) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Эмбрионы из экспериментальных и контрольных групп промывали Зх средой М2. Эмбрионы помещали на предметные стекла микроскопа в 5 мкл каплю М2 и капли покрывали маслом.
Предметные стекла изучали под флуоресцентным микроскопом. Результаты представлены в таблицах 56 и 57. Отрицательный результат для трансформации BTpi,-sp-Ad-DOPE (VI) относят к отсутствию чувствительности у антитела 1°.
Таблица 56. Эмбрионы, трансформированные ATp"-sp-Ad-DOPE (I), визуализуемые с применением флуоресценции
Тип клеток
Встроенный антиген
Антитело 1°
Флуоресцентный подсчет после
инкубации с зондом IgFITC
Морфология эмбриона через 24 час. после встраивания
Эмбрионы
Атри-sp-Ad-DOPE (I)
Биоклон анти-А
2+/1 +
Становится видимой
Эмбрионы
Контроль
Биоклон анти-А
Становится видимой
Таблица 57. Эмбрионы, трансформированные ATpM-sp-Ad-DOPE (I) или Втри-sp-Ad-DOPE (VI), визуализуемые с применением флуоресценции
Тип клеток
Встроенный антиген
Антитело 1°
Флуоресцентный подсчет после
инкубации с зондом IgFITC
Морфология эмбриона через 24 час. после встраивания
Эмбрионы
Атри-sp-Ad-DOPE (1)
Биоклон анти-А
н.о.
Эмбрионы
Втри-sp-Ad-DOPE (VI)
Биоклон анти-В
н.о.
Эмбрионы
Контроль (среда М2)
Биоклон анти-А
н.о.
Аббревиатуры: н.д. - не определяли
Повышенное прикрепление трансформированных эндотелиальных клеток к модифицированным эмбрионам
Модифицированные эмбрионы (BioG-Avidin-BiolgGB и BioG-Avidin-BiolgMA) получали согласно методам, описанным в описании, сопровождающем Международную патентную заявку № PCT/NZ03/000059 (опубликована как WO03/087346).
Получали два вогнутых предметных стекла, одно с двумя лунками эндометриальных клеток, в которые встроен синтетический гликолипид Атри-sp-Ad-DOPE (I), и другое с двумя лунками эндометриальных клеток, в которые встроен синтетический гликолипид BTpM-sp-Ad-DOPE (VI).
Две группы эмбрионов переносили в каждое из вогнутых предметных стекол:
Предметное стекло 1 эмбрионы ATpH/lgGB
эмбрионы Атри/1дМА
Предметное стекло 2 эмбрионы BTpM/lgGB
эмбрионы Втри/1дМА
Эмбрионы окружали эндометриальными клетками. Лунки покрывали минеральным маслом и инкубировали в течение 15 минут при 37°С. С применением ручных пипеток с широким просветом каждую группу эмбрионов осторожно переносили в свежую каплю среды М2. Эмбрионы осторожно промывали. Эмбрионы осторожно переносили в 2 мкл среды М2 на маркированном предметном стекле микроскопа. Каждую каплю покрывали минеральным маслом.
Определяли число эндотелиальных клеток, прилипших к эмбрионам в
| i
каждой группе, под центральной плоскостью фокуса на микроскопе Olympus. Число клеток, прилипших к каждому эмбриону, регистрировали. Результаты представлены в таблице 58.
Таблица 58. Эндотелиальные клетки, трансформированные Атри-sp-Ad-DOPE (I) или Втри-sp-Ad-DOPE (VI), и эмбрионы, модифицированные BioG-Avidin-BiolgGB или BioG-Avidin-BiolgMA. Оценка по прикреплению эндометриальных клеток к эмбрионам.
Тип клеток
Трансформированные эндометриальные клетки
Модифицированные эмбрионы
Среднее число
эндометриальных
клеток,
прикрепленных к
модифицированным
эмбрионам
Эндометриальные клетки
Атри-sp-Ad-DOPE (1)
BioG-Avidin-BiolgGb
2,3
BioG-Avidin-BiolgMA
7,25
Эндометриальные клетки
BTPH-sp-Ad-DOPE (VI)
BioG-Avidin-BiolgGB
6,7
BioG-Avidin-BiolgMA
3,4
Когда в предшествующем описании приведена ссылка на целые числа или компоненты, имеющие известные эквиваленты, то такие эквиваленты включены здесь, как будто указанные индивидуально.
Хотя изобретение было описано путем примеров и со ссылкой на возможные его варианты осуществления, должно быть понятно, что к ним могут быть сделаны усовершенствования и/или модификации, не выходящие за пределы объема или сущности изобретения.
ССЫЛКИ
Abe К, McKibbin JM & Hakomori SL. (1983) The monoclonal antibody directed to difucosylated type 2 chain (Fucal-> 2Galj1-> 4[Fucc1-> 3]GlcNAc; Y determinant). J. Biol. Chem. 258: 11793-11797.
Adamany AM, Blumenfeld 00, Sabo В & McCreary J. (1983) A carbohydrate structural variant of MM glycoprotein (glycophorm A). J. Biol. Chem. 258:11537-11545.
Blanchard D, Cartron JP, Fournet B, Mountreuil! J, van Halbeek H & Vliegenthart JFG. (1983) Primary structure of the oligosaccharide determinant of blood group Cad specificity, J. Biol. Chem. 258:7691-7695,
Fukuda M, Dell A & Fukuda M, (1984a} Structure of fetal lactosaminoglycan. The carbohydrate moiety of band 3 isolated from human umbilical cord erythrocytes. J. Biol. Chem. 259:4782-4791.
Fukuda M, Dell A, Oates JE & Fukuda M. (1984b) Structure of branched lactosaminoglycan, the carbohydrate moiety of band 3 isolated from adult human erythrocytes. J. Biol. Chem. 259:8260-3273.
Fukuda M, Lauffenberger M, Sasaki H, Rogers ME & Dell A, (1987) Structures of novel sialylated O-linked oligosaccharides isolated from human erythrocyte glycophorins. J. Biol. Chem. 262:11952-11957,
Fukuda MN, Dell A, Oates JE, Wu P, Klock JC & Fukuda M. (1985) Structures of glycosphingolipids isolated from human granulocytes. The presence of a series of linear poly-N-acetyllactosaminylceramide and its significance in glycolipids of whole blood cells. J. Biol. Chem. 260: 1067-1082.
Gillard BK, Blanchard D, Bouhours JF, Cartron JP, van Kuik JA, Kamerling JP, Vliegenthart JFG & Marcus DM. (1988) Structure of a ganglioside with Cad blood group antigen activity. Biochemistry, 27: 4601-4604.
Hakomori SI, Nudelman E, Levery SB & Kannagi R. (1984) Novel fucolipids accumulating in human adenocarcinoma. I. Glycilipids with di- or trifucosylated type 2 chain. J. Biol. Chem. 259; 4672-4680
Hanfland P. (1975) Characterisation of В and H blood group active glycosphingolipids from human В erythrocyte membranes. Chem. Phys. Lipids. 15:105-124.
Hanfland P, Kordowicz M, Niermann H, Egge H, Dabrowski U, Peter-Katalinic J & Dabrowski J. (1984) Purification and structures of branched blood-group-B-active glycosphingolipids from human erythrocyte membranes. Eur. J. Biochem. 145: 531-542,
Hanfland p, Kordowicz M, Peter-Katalinic J, Pfannschmidt G, Crawford
RJ, Graham HA & Egge H. (1986) immunochemistry of the Lewis blood-group system: isolation and structures of Lewis-c active and related glycosphingolipids from the plasma of blood-group О Le(a-b-) nonsecretors. Arch. Biochem. Blophys. 246: 655-672.
Hiraiwa N, Tsuyuoka K, Li YT, Tanaka M, Seno T, Okubo Y, Fukuda Y, Imura H & Kannagi R. (1990) Gangliosides and siatoglycoproteins carrying a rare blood group antigen determinant, Cad, associated with human cancers as detected by specific monoclonal antibodies. Cancer Res. 50: 5497-5503.
Kannagi R, Nudelman E, Levery SB, & Hakomori SI. (1982) A series of human srythrocytes glycosphingolipids reacting to the monoclonal antibody directed to a developmentally regulated antigen, SSEA-1. J. Biol. Chem. 257: 14865-14874.
Kewitz S, Grop HJ, Kosa R & Roelcke D. (1995) Anti=Pr cold agglutinins recognise immunodominant a2,3- or a2,6-sialyl groups on glycophorins. Glycocon. J. 12: 714-720.
Koscielak J, Miller-Podraza H, Krauze R & Piasek A. (1976) Isolation and characterisation of poly(glycosyl)ceramides (megaloglycolipids) with A, H, and I blood group activities. Eur. J. Biochem. 71:9-18.
Laine RA. (1994) Invited commentary. Glycobiol 4: 759-767
Lidowska E, Duk M & Dahr W. (1980) Comparison of alkali-labile oligosaccharide chains of M and N blood-group glycopeptides from human erythrocyte membrane. Carbohydr. Res. 79: 103-113.
Lloyd КО & Kabat EA. (1968) Immunochemical studies on blood groups. XLI. Proposed structures for the carbohydrate portions of blood group А, В, H, Lewis8, and Lewis" substances. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 61: 1470-1477.
Lundblad A. (1977) Urinary glycoproteins, glycopeptides, and oligosaccharides. In: The Glycoconjugates Eds Horowitz Ml & Pigman W. Vol 1: 441-458.
Magnani JL, Nilsson B, Brockhaus M, Zopf D, Steplewski Z, Koprowski H & Ginsburg V. (1986) A monoclonal antibody-defined antigen associated with gastrointestinal cancer is a ganglioside containing sialylated lacto-N-fucopentaose II. J, Biol. Chem. 257:14365-14369.
Nudelman E, Fukushi Y, Levery SB, Higuchi T & Hakomori SI. (1986) Novel fucolipids of human adenocarcinoma: disialoyl Lea antigen (IH4Fuclll4NeuAclV3NeuAcLc4) of human colonic adenocarcinoma and the monoclonal antibody (FH7) defining this structure. J. Biol. Chem. 261:54875495.
Slomiany A, Zdebska E & Slomiany BL. (1984) Structures of the neutral oligosaccharides isolated from A-active human gastric mucin. J. Biol. Chem. 259:14743-14749.
Takasaki S, Yamashita К & Kobata A. (1978) The sugar chain structures of ABO blood group active glycoproteins obtained from human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem, 253: 6086-6091.
Tanaka M, Dube VE & Anderson B. (1984) Structures of oligosaccharides cleaved by base-borohydride from an I, H, and Lea active ovarian cyst glycoprotein. Biochim. Biophys. Acta. 798: 283-290,
Thomas DB & Winzler RJ. (1969) Structural studies on human erythrocytes glycoprotein. Alkali-labile oligosaccharides. J. Biol: Chem, 244: 5943-5946.
Watkins WM, (1966) Blood group substances. Science. 152:172-181. Yoshima H, Furthmayr H & Kobata A. (1980) Structures of the asparagine-linked sugar chains of glycophorin A. J. Biol. Chem. 255: 9713-9718.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Молекула структуры R-S2-L для применения в качестве синтетического "мембранного якоря" или при получении синтетических молекулярных конструкций, где:
R представляет собой химически реакционноспособную
функциональную группу;
S2 представляет собой спейсер, связывающий R с L; и
L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из
диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя
глицерофосфолипиды, и полученных из сфингозина диацил- и
диалкиллипидов, включающих в себя церамид.
2. Молекула по п. 1, где R выбран из группы, включающей в себя бис-(N-гидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис(пентафторфенил), бис(пентахлорфенил).
3. Молекула по п. 1 или 2, где S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат (Ad)) и -СО(СН2)5СО-.
4. Молекула по любому из п.п. 1-3, где R и S2 являются связанными сложноэфирными связями.
5. Молекула по любому из п.п. 1-4, где L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды.
6. Молекула по п. 5, где L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученного из одной или нескольких кислот: транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты.
7. Молекула по п. 6, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.
8. Молекула по п. 7, где L выбран из группы, состоящей из 1,2-0-диолеоил-эп-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-0-дистеарил-sn-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2
диолеоилглицерина (DOG).
9. Молекула по любому из п.п. 1-8, где L представляет собой глицерофосфолипид и молекула включает в себя структуру:
где п равно 3-5 и * представляет собой остаток, другой, чем Н.
10. Молекула по п. 9, где п равно 3.
11. Молекула по п. 1, где молекула имеет структуру:
О О
I и ом о г
R Н I (Н2С)7=^(СН2)7СНз
0^(СН2)7
^МСН2)7СН3
обозначенную Ad-DOPE, и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
12. Молекула по п. 1, где молекула имеет структуру:
^-(СН2)7СН3
обозначенную sp^Ad-DOPE, и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К* или NH4+.
13. Молекула по п. 1, где молекула имеет структуру:
п о
R Н °М ? (СН2)16СН3
0^(СН2)16СНз
обозначенную Ad-DSPE, и где М обычно представляет собой Н, но может
быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
14. Синтетическая молекулярная конструкция структуры F-Sn-S2-L,
где:
- F представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина;
- в^вг представляет собой спейсер, связывающий F с L; и
- L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды, и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включая церамид.
15. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где синтетическая молекулярная конструкция является водорастворимой.
16. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14 или 15, где синтетическая молекулярная конструкция спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактирует с липидным бислоем.
17. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 16, где синтетическая молекулярная конструкция стабильно включается в липидный бислой.
18. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1417, где F, Si, S2 и L являются ковалентно связанными.
19. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1418, где F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина.
20. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 19, где F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).
21. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1420, где L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолиипиды.
22. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 21, где L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот: транс-2-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цтс
9-гексадеценовой кислоты, цис-б-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11-октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты.
23. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 22, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.
24. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 23, где L выбран из группы, состоящей из 1,2-0-диолеоил-зп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-О-дистеарил-зп-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).
25. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1424, где L представляет собой глицерофосфолипид и синтетическая молекулярная конструкция включает в себя субструктуру:
0 0 О
где п равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н.
26. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 25, где п равно 3.
27. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1424, где SrS2 выбран так, чтобы обеспечить образование водорастворимой синтетической молекулярной конструкции.
28. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1427, где F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп.
29. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 28, где F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. состоящий из трех (трисахарид) или более звеньев Сахаров.
30. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 28, где F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда олигосахаридов лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила.
31. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 28, где F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара GalNAcal -3(Fuca1-2)Galp; Gala1-3Galp; Galp; Gala1-3(Fuca1-2)Galp; NeuAca2-3Gaip; NeuAca2-6Gaip; Fuca1-2Galp; Gaipi-4GlcNAcp1-6(Galp1-4GlcNAcp1-3)Galp; Fuca1-2Galp1-4GlcNAcp1-6(Fuca1-2Gaipi-4GlcNAcp1-3)Galp; Fuca1-2Gaipi-4GlcNAcp1 -6(NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcpi -3)Galp; NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcpi-6(NeuAca2-3Gaipi-4GlcNAcp1-3)Gaip; Gala1-3Galp1-4Glc; GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc; GalNAca1-3GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc или GalNAcp1-3GalNAcpi-3Gala1-4Galp1-4Glc.
32. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1431, где, когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-.
33. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1432, где ST представляет собой С3.5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила.
34. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 33, где Si представляет собой 3-аминопропил.
35. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1427, где F опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность.
36. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 35, где F представляет собой углевод, белок, липид, лецитин, авидин или биотин с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности.
37. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 36, где F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах.
38. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 37, где F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.
39. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 38, где компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессированным в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
40. Синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 1427, где F опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество.
41. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 40, где F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния.
42. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 41, где F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
43. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную ATp"-sp-Ad-DOPE (I), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
44. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную ATpv,-spspi-Ad-DOPE (II), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
45. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную ATp"-sp-Ad-DSPE (III), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
46. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную BTpi1-sp-Ad-DOPE (VI), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
47. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он?"
Н ОМ О ЯйГ'^СНАСН,
обозначенную HTp"-sp-Ad-DOPE (VII), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К* или NH4+.
48. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он?н
lu Н ОМ О (нД (СН2)7СН3
"v.
(СН^тСНз
обозначенную Hfll1-sp-Ad-DOPE (VIII), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
49. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он?н о о
0^[СН2)7
(НгСЪ^^СНЖСНз
СН2)7СН3
обозначенную GalpVsp-Ad-DOPE (IX), и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
50. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную Fucal-2Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII), и M обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, Ю или NH4+.
51. Синтетическая молекулярная конструкция по п. 14, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную Fucal -2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (ХШ)и М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
52. Метод получения синтетической молекулярной конструкции структуры F-S^Sz-L, включающий в себя стадии:
- реакцию активатора (А) с липидом (L) с образованием активированного липида (A-L);
- дериватизацию антигена (F) с получением дериватизированного антигена (F-Sn) и
- конденсацию A-L с F-Sn с получением конструкции; в которой:
А представляет собой активатор, выбранный из группы, включающей в себя бис-(г\1-гидроксисукцинимидил), бис-(4-нитрофенил), бис(пентафторфенил), бис(пентахлорфениловые) эфиры карбодиовых кислот (С3-С7);
L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из
диацил- и диалкилглицеролипидов, включающих в себя глицерофосфолипиды; и полученных из сфингозина диацил- и диалкиллипидов, включающих в себя церамид;
F представляет собой антиген, выбранный из группы, состоящей из углеводов, белков, липидов, лецитинов, авидинов и биотина, и
Si-S2 представляет собой спейсер, связывающий F с L, где Si выбран из группы, включающей в себя первичный аминоалкил, вторичный алифатический аминоалкил или первичный ароматический амин, и S2 отсутствует или выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат) и -СО(СН2)5СО-.
53. Метод по п. 52, где синтетическая молекулярная конструкция является водорастворимой.
54. Метод по п. 51 или 52, где синтетическая молекулярная конструкция спонтанно включается в липидный бислой, когда раствор синтетической молекулярной конструкции контактирует с липидным бислоем.
55. Метод по п. 54, где синтетическая молекулярная конструкция стабильно включается в липидный бислой.
56. Метод по любому из п.п. 52-55, где F, Si, S2 и L являются ковалентно связанными.
57. Метод по любому из п.п. 52-56, где F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов, антител (иммуноглобулинов), лецитинов, авидинов и биотина.
58. Метод по п. 57, где F выбран из группы, состоящей из существующих в природе или синтетических гликотопов или антител (иммуноглобулинов).
59. Метод по любому из п.п. 52-58, где L представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из диацил- и диалкилглицеролипидов, включая глицерофосфолипиды.
60. Метод по п. 59, где L выбран из группы, состоящей из диацилглицеролипидов, фосфатидата, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозита, фосфатидилглицерина и дифосфатидилглицерина, полученных из одной или нескольких кислот: транс-3-гексадеценовой кислоты, цис-5-гексадеценовой кислоты, цис-7-гекадеценовой кислоты, цис-9-гексадеценовой кислоты, цис-6-октадеценовой кислоты, цис-9-октадеценовой кислоты, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-11
октадеценовой кислоты, цис-11-октадеценовой кислоты, цис-11-эйкозеновой кислоты или цис-13-докозеновой кислоты.
61. Метод по п. 60, где липид получен из одной или нескольких цис-дезтауратированных жирных кислот.
62. Метод по п. 61, где L выбран из группы, состоящей из 1,2-0-диолеоил-зп-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DOPE), 1,2-О-дистеарил-sn-глицеро-З-фосфатидилэтаноламина (DSPE) и рац-1,2-диолеоилглицерина (DOG).
63. Метод по любому из п.п. 52-62, где L представляет собой глицерофосфолипид и синтетическая молекулярная конструкция включает в себя субструктуру:
I и 0 0
X м I
где п равно 3-5, X представляет собой Н или С и * представляет собой остаток, другой, чем Н.
64. Метод по п. 63, где п равно 3.
65. Метод по любому из п.п. 52-62, где А и Si выбраны так, чтобы обеспечить образование водорастворимой синтетической молекулярной конструкции.
66. Метод по любому одному из п.п. 52-65, где F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп.
67. Метод по п. 66, где F представляет собой существующий в природе или синтетический гликотоп. состоящий из трех (трисахарид) или более единиц Сахаров.
68. Метод по п. 66, где F представляет собой гликотоп, выбранный из группы, состоящей из ряда олигосахаридов лактонеотетраозила, лактотетраозила, лактоноргексаозила, лактоизооктаозила, глоботетраозила, глобонеотетраозила, глобопентаозила, ганглиотетраозила, ганглиотриаозила, ганглиопентаозила, изоглоботриаозила, изоглоботетраозила, мукотриаозила и мусотетраозила.
69. Метод по п. 66, где F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара GalNAca1-3(Fuca1-2)Gaip; Gala1-3Gaip; Galp; Galal-3(Fuca1-2)Galp; NeuAcot2-3Galp; NeuAccc2-6Galp; Fuca1-2Galp; Galpl-4GlcNAcp1-6(Gaipi-4GlcNAcp1-3)Galp; Fuca1-2Gaipi-4GlcNAcp1-6(Fuca1
2Galp1-4GlcNAcpi-3)Galp; Fuca1-2Gaipi-4GlcNAcp1-6(NeuAca2-3Gaipi-4GlcNAcp1-3)Galp; NeuAccc2-3Gaipi-4GlcNAcp1-6(NeuAca2-3Galp1-4GlcNAcp1-3)Galp; Gala1-3Galp1-4Glc; GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc; GalNAca1-3GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc или GalNAcpi-3GalNAcp1-3Gala1-4Gaipi-4Glc.
70. Метод по любому из п.п. 52-69, где, когда F представляет собой гликотоп, L представляет собой глицерофосфолипид и S2 выбран из группы, включающей в себя -СО(СН2)3СО-, -СО(СН2)4СО- (адипат), -СО(СН2)5СО- и -CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-.
71. Метод по любому из п.п. 52-70, где Si представляет собой С3_ 5аминоалкил, выбранный из группы, состоящей из 3-аминопропила, 4-аминобутила или 5-аминопентила.
72. Метод по п. 71, где Si представляет собой 3-аминопропил.
73. Метод по любому из п.п. 52-65, где F представляет собой синтетическую молекулярную конструкцию, которая опосредует взаимодействие клетка-клетка или клетка-поверхность.
74. Метод по п. 73, где F представляет собой углевод, белок или липид с аффинностью для компонента, экспрессированного на являющейся целью клетке или поверхности.
75. Метод по п. 74, где F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточных матрицах.
76. Метод по п. 75, где F имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.
77. Метод по п. 76, где компонент, экспрессируемый на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессируемым в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
78. Метод по любому из п.п. 52-65, где F представляет собой синтетическую молекулярную конструкцию, которая опосредует взаимодействие клетка-растворенное вещество.
79. Метод по п. 78, где F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния.
80. Метод по п. 79, где F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
81. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он?н
АС/ \
он?н о о
обозначенную ATp"-sp-Ad-DOPE (I), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
82. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
ок?н
Ас'
NH\ ОН?н
й о
''^O-P-O^V^Y0
О'ПОНаЬ
[снижен,
обозначенную ATp"-spspi-Ad-DOPE (II), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
83. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он?н
Ас'
;NH\ оьРН
X н ом о ТНг)1вСНз
0*^(CH2)ieCH3
100
обозначенную ATpM-sp-Ad-DSPE (III), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
84. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру: он?"
Д\ он?н
O^CHjJr
(НгСЬ^^СНгЭтСН, V_(cH2)7CHa
обозначенную BTpi1-sp-Ad-DOPE (VI), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4*.
85. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
-(ОЩгСНа
н ом о
-I'll
о о
он?н
.(СИЛ
п ом о ЛЯГ^РЧЛСН,
обозначенную HTp"-sp-Ad-DOPE (VII), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
86. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
0М ? (НгЧт^^ССН^тСНэ 0*П;СН2)7
(СН^Нз
101
обозначенную HAM-sp-Ad-DOPE (VIII), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
87. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он°н о о
^-(СН2)7СН3
обозначенную Galprsp-Ad-DOPE (IX);
88. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
он он
обозначенную Fuccc1-2Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII), и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
89. Метод по п. 52, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция имеет структуру:
обозначенную Fuca1-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (ХШ)и где М обычно представляет собой Н, но может быть заменен другим одновалентным катионом, таким как Na+, К+ или NH4+.
102
90. Водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция, полученная методом по любому из п.п. 52-89.
91. Метод осуществления качественных и/или количественных изменений в поверхностных антигенах, экспрессируемых клеточной или поликлеточной структурой, включающий стадию:
- контактирования суспензии клеточной или поликлеточной структуры с водорастворимой синтетической молекулярной конструкцией по любому из п.п. 14-51 или 90 в течение времени и при температуре, достаточных для осуществления качественного и/или количественного изменения в поверхностных антигенах, экспрессированных клеточной или поликлеточной структурой.
92. Метод по п. 91, где клеточная или поликлеточная структура является структурой человеческого или мышиного происхождения.
93. Метод по п. 91 или 92, где концентрация водорастворимой синтетической молекулярной конструкции в суспензии находится в диапазоне 0,1-10 мг/мл.
94. Метод по любому из п.п. 91-93, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с водорастворимой синтетической молекулярной конструкцией при температуре в диапазоне 2-37°С.
95. Метод по п. 94, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с раствором водорастворимой синтетической молекулярной конструкции при температуре в диапазоне 2-25°С.
96. Метод по п. 95, где суспензию клеточной или поликлеточной структуры контактируют с раствором водорастворимой синтетической молекулярной конструкции при температуре в диапазоне 2-4°С.
97. Метод по любому из п.п. 91-96, где F выбран из группы гликотопов, включающих в себя концевые сахара GalNAcal-3(Fuca1-2)Gaip; Gala1-3Gaip; Galp; Gala1-3(Fuca1-2)Gaip; NeuAca2-3Galp; NeuAca2-6Galp; Fuca1-2Galp; Galp1-4GlcNAcp1-6(Gaipi-4GlcNAcpi-3)Galp; Fuca1-2Gaipi-4GlcNAcp1-6(Fuca1-2Galp1-4GlcNAcp1-3)Gaip; Fuca1-2Gaipi-4GlcNAcpi-6(NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcpi -3)Galp; NeuAca2-3Galp1 -4GlcNAcpi -6(NeuAca2-3Galp1-4GlcNAcpi-3)Galp; Gala1-3Galp1-4Glc; GalNAcpi-3Gala1-4Galp1-4Glc; GalNAca1-3GalNAcp1-3Gala1-4Galp1-4Glc или GalNAcpl-3GalNAcpi-3Gala1-4Gaipi-4Glc.
98. Метод по n. 97, где F выбран из группы гликотопов, состоящей из олигосахаридов GalNAca1-3(Fuca1-2)Gaip и Gala1-3(Fuca1-2)Gaip.
103
99. Метод по любому из п. 91 или 96, где синтетическая молекулярная конструкция выбрана из группы, включающей в себя: Атри-sp-Ad-DOPE (I); ATp"-spspi-Ad-DOPE (II); ATpvi-sp-Ad-DSPE (III); BTpM-sp-Ad-DOPE (VI); Нтри-sp-Ad-DOPE (VII); Hfl"-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE (IX); Fucal-2Galp1-3GlcNAcpi-3Gaipr4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
100. Метод по любому из п.п. 91-99, где клеточной или поликлеточной структурой является эмбрион.
101. Метод по п. 100, где F представляет собой молекулу присоединения, где молекула присоединения имеет аффинность для компонента, экспрессированного на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия.
102. Метод по п. 101, где компонент, экспрессированный на эпитеальных клетках или внеклеточной матрице эндометрия, может быть экспрессированным в природе компонентом или экзогенно включенным компонентом.
103. Метод по любому из п.п. 91-99, где клеточной или поликлеточной структурой является эритроцит.
104. Метод по п. 103, где F представляет собой лиганд для связывания молекулы, когда присутствие связывающей молекулы является диагностическим для патологического состояния.
105. Метод по п. 104, где F представляет собой лиганд для антитела (иммуноглобулина).
106. Клеточная или поликлеточная структура, включающая водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию по любому из п.п. 14-51 или 90.
107. Клеточная или поликлеточная структура по п. 106, где клеточная или поликлеточная структура имеет человеческое или мышиное происхождение.
108. Клеточная или поликлеточная структура по п. 106 или 107, где клеточной или поликлеточной структурой является эритроцит, включающий водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя: ATpM-sp-Ad-DOPE (I); ATp"-spspi-Ad-DOPE (II); ATpi1-sp-Ad-DSPE (III); BTpM-sp-Ad-DOPE (VI); HTpi1-sp-Ad-DOPE (VII); Нди-sp-Ad-DOPE (VIII); Galpi-sp-Ad-DOPE (IX); Fuca1-2Gaipi-3GlcNAcpi-3Galp,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Gaipi-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE
104
(XIII).
109. Клеточная или поликлеточная структура по п. 106 или 107, где клеточной или поликлеточной структурой является эмбрион, включающий водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, включающей в себя: ATpM-sp-Ad-DOPE (I); ATp"-spspi-Ad-DOPE (II); ATpM-sp-Ad-DSPE (III); BTp"-sp-Ad-DOPE (VI); HTpirsp-Ad-DOPE (VII); Нди-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE(IX); Fuca1-2Galp1-3GlcNAcpi-3Galp,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fucal-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
110. Набор, включающий в себя препарат молекулы по любому из п.п. 1-13 или высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции по любому из п.п. 14-51 или 90.
111. Набор по п. 110, где молекула по любому из п.п. 1-13 выбрана из группы, состоящей из Ad-DOPE; sp^Ad-DOPE и Ad-DSPE.
112. Набор по п. 1, где водорастворимая синтетическая молекулярная конструкция по любому из п.п. 14-51 ил 90 выбрана из группы, состоящей из: ATpM-sp-Ad-DOPE (I); ATpM-spspi-Ad-DOPE (II); ATpM-sp-Ad-DSPE (III); BTpM-sp-Ad-DOPE (VI); HTPH-sp-Ad-DOPE (VII); HflM-sp-Ad-DOPE (VIII); GaiPrsp-Ad-DOPE (IX); Fucal-2Galp1-3GlcNAcp1-3Galp,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
113. Набор, включающий в себя суспензию в суспендирующем растворе клеток или поликлеточных структур по любому из п.п. 106-109.
114. Набор по п. 113, где суспендирующий раствор по существу не содержит липид.
115. Набор по п. 113 или 114, где клеточная или поликлеточная структура имеет человеческое или мышиное происхождение.
116. Набор по любому из п.п. 113-115, где клетками являются эритроциты, которые в природе не экспрессируют А- или В-антиген и включают в себя водорастворимую синтетическую молекулярную конструкцию, выбранную из группы, состоящей из: ATpM-sp-Ad-DOPE (I); Атри-spsp^Ad-DOPE (II); ATpM-sp-Ad-DSPE (III); BTpM-sp-Ad-DOPE (VI); HTpM-sp-Ad-DOPE (VII); Нди-sp-Ad-DOPE (VIII); Galp,-sp-Ad-DOPE (IX); Fuca1-2Gaipi-3GlcNAcp1-3Galp,-4GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XII) и Fuca1-2Galp1-3(Fuca1-4)GlcNAc-sp-Ad-DOPE (XIII).
117. Набор по n. 116, где суспендирующий раствор дополнительно содержит одно или несколько антител.
118. Набор по п. 117, где клетки являются контролями
105
чувствительности.
119. Фармацевтический препарат, включающий в себя высушенный препарат или раствор водорастворимой синтетической молекулярной конструкции по любому из п.п. 14-51 или 90.
120. Фармацевтический препарат по п. 119, где фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
121. Фармацевтический препарат по п. 120, где фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
122. Фармацевтический препарат, включающий в себя клетки или поликлеточные структуры по любому из п.п. 106-109.
123. Фармацевтический препарат по п. 122, где клетки или поликлеточные структуры имеют человеческое или мышиное происхождение.
124. Фармацевтический препарат по п. 122 или 123, где фармацевтический препарат находится в форме для введения ингаляцией.
125. Фармацевтический препарат по п. 122 или 123, где фармацевтический препарат находится в форме для введения инъекцией.
WO 2005/090368
1/10
PCT/NZ2005/000052
День 2 День 70
ФИГ. 1
День 2 День 70
ФИГ. 2
WO 2005/090368
2/10
PCT/NZ2005/000052
ФИГ. 3
WO 2005/090368
3/10
PCT/NZ2005/000052
2 часа
Все клетки дают отрицательный результат
4 часа
24 часа
30,5 часов
ФИГ. 4
WO 2005/090368
4/10
PCT/NZ2005/000052
День 7 День 10
ФИГ. 5
WO 2005/090368
5/10
PCT/NZ2005/000052
2 часа
Все клетки дают отрицательный результат 4 часа
6 часов
8 часов
12 часов
¦ ,,,":.."M.^:"'i:'-;-jT^--t.'T*i,i!ii; ¦'XV"
24 часа
30,5 часов
48 часов
72 часа
96 часов
ФИГ. 6
WO 2005/090368
6/10
PCT7NZ2005/000052
День 7
День 10
ФИГ. 7
ФИГ. 8
День 8
ФИГ. 9
WO 2005/090368
7/10
PCT/NZ2005/000052
День 1
ФИГ. 11
День 1
ФИГ. 12
WO 2005/090368
8/10
PCT/NZ2005/000052
День 8
ФИГ. 13
День 1
ФИГ. 14
День 8
ФИГ. 15
WO 2005/090368
9/10
PCT/NZ2005/000052
День 1
День 5
ФИГ. 16
День 8
ФИГ. 17
День 1
День 5
ФИГ. 18
WO 2005/090368
10/10
PCT/NZ2005/000052
День 8
ФИГ 19