Y рецепторные агонисты, селективные к Y2 и Y4 рецепторам по сравнению с Y1 рецептором, пригодные для лечения, например, ожирения, представляют собой (а) РР-складчатые пептиды или РР-складчатые пептиды-миметики, которые содержат (i) С-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания, представленную -X-Thr-Arg-X ³ -Arg-Tyr-C(=O)NR ¹ R ² , где R ¹ и R ² независимо обозначает водород или C ₁ -C ₆ алкил, X обозначает Val, Ile, Leu или Ala, a X ³ обозначает Gln или Asn, или её консервативно замещённый вариант, в котором Thr замещён на His или Asn, и/или Tyr замещён на Trp или Phe; и/или Arg замещён на Lys, и (ii) N-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания, представленную как H ₂ N-X ¹ -Pro-X ² -(Glu или Asp)- , где X ¹ отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, а X ² обозначает Leu или Ser, или консервативные замены Leu или Ser, или (б) указанный агонист содержит С-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания по определению в (i), и указанную последовательность Y рецепторного распознавания, связанную с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к N-концу указанной гексапептидной последовательности, причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации с помощью ковалентной внутримолекулярной связи, и необязательно N-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания по определению в (ii).

 

(57) Реферат / Формула:
рецепторные агонисты, селективные к Y2 и Y4 рецепторам по сравнению с Y1 рецептором, пригодные для лечения, например, ожирения, представляют собой (а) РР-складчатые пептиды или РР-складчатые пептиды-миметики, которые содержат (i) С-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания, представленную -X-Thr-Arg-X ³ -Arg-Tyr-C(=O)NR ¹ R ² , где R ¹ и R ² независимо обозначает водород или C ₁ -C ₆ алкил, X обозначает Val, Ile, Leu или Ala, a X ³ обозначает Gln или Asn, или её консервативно замещённый вариант, в котором Thr замещён на His или Asn, и/или Tyr замещён на Trp или Phe; и/или Arg замещён на Lys, и (ii) N-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания, представленную как H ₂ N-X ¹ -Pro-X ² -(Glu или Asp)- , где X ¹ отсутствует или обозначает аминокислотный остаток, а X ² обозначает Leu или Ser, или консервативные замены Leu или Ser, или (б) указанный агонист содержит С-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания по определению в (i), и указанную последовательность Y рецепторного распознавания, связанную с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим по меньшей мере один альфа-спиральный поворот, прилегающий к N-концу указанной гексапептидной последовательности, причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации с помощью ковалентной внутримолекулярной связи, и необязательно N-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания по определению в (ii).

 

---

СЕЛЕКТИВНЫЕ АГОНИСТЫ РЕЦЕПТОРОВ Y2/Y4 ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
Данное изобретение относится к пептидам или пептидным соединениям, которые ведут себя как селективные агонисты Y2 и Y4 относительно Y1 рецепторов, и их применению при лечении состояний, чувствительных к активации Y2 и/или Y4 рецепторов, например, при лечении ожирения и избыточного веса, и состояний, при которых они рассматриваются как содействующие факторы, и для регуляции/понижения секреции ЖКТ.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Семейство пептидов с РР-складкой - NPY (нейропептид Y) (человеческая последовательность SEQ ID. No:l), PYY (пептид YY) (человеческая последовательность SEQ ID. No:2) и РР (панкреатический пептид) являются секретируемыми в природе гомологичными, содержащими последовательность из 36 аминокислот, амидированными по С-концу пептидами, которые характеризуются общей трёхмерной структурой - РР-складкой,- поразительной устойчивой даже в разбавленном водном растворе и является важной для рецепторного распознавания.
Первоначально с помощью рентеновского кристаллографического анализа (РСА) более подробно была охарактеризована рентгеновская структура птичьего РР с разрешением до 0.98 А, и уникальная структура получила своё название от этого пептида {Blundell et al. 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4175-79; Glover et al. 1984, Eur. J. Biochem. 142: 379-85). Затем РР-складчатая структура других членов семейства была проанализирована, главным образом, с помощью ЯМР-спектроскопии. Как РСА, так и ЯМР- спектроскопии осуществляют, несомненно, в концентрированном или твёрдом состоянии; однако, точный анализ методом кругового дихроизма подтверждает, что NPY и РР даже в водном растворе принимает РР-складчатую структуру, необычную для такого малого пептида (Fuhlendorff et al. 1990 J. Biol. Chem. 265:11706-12). Важно отметить, что анализ протеолитической устойчивости пептидов и их фрагментов и аналогов чётко показывает, что, например, полноразмерный РР1- 36 в разбавленном водном растворе сохраняет складчатую конфигурацию, которая защищает его от разрушения под действием некоторых ферментов, которые быстро и легко разрушают аналоги, не способные принять РР-складчатую структуру вследствие минорных замен (Schwartz et al. 1990 Annals NY Acad. Sci. 611: 35-47).
РР-складчатая структура, общая для NPY, PYY и РР, состоит из 1) N-концевой полипролиноподобной спирали (соответствующей остаткам 1-8 с Рго2, Рго5 и Рго8), за которой следует 2) участок бета-поворота типа I (соответствующий остаткам с 9 по 12), далее следуют 3) амфифильная альфа-спираль (остатки 13-30), которая расположена антипараллельно полипролиновой спирали с углом около 152 градусов между осями спиралей, и 4) С-концевой гексапептид (остатки 31-36). Складчатая структура стабилизирована за счёт взаимодействий между боковыми цепями амфифильной альфа-спирали, которые тесно переплетаются с тремя гидрофобными остатками пролина (Schwartz et al. 1990). Помимо ключевых остатков в рецепторе, распознающем С-концевой гексапептид, именно ядерные гидрофобные остатки, которые являются консервативными в целом семействе РР-складчатых пептидов, стабилизируют РР-складчатую структуру. На Фиг. 1А изображена последовательность NPY с остатками, консервативными в ряду NPY, PYY и РР, показанными белыми буквами на тёмном фоне. На Фиг. 1А также показаны элементы РР-складчатой структуры, описанные выше. Полагают, что С-концевой гексапептид, важный для рецепторного узнавания, является неструктурированным, но РР-складка обеспечивает устойчивый каркас, который презентирует С-концевой гексапептид рецепторам (иллюстрируется на Фиг. 1В), которые до некоторой степени зависят или не зависят также от участков N-конца пептида. Анализ методом ЯМР- спектроскопии также показал, что дальние С- и N-концевые участки, например, NPY, являются скорее подвижными, это означает, что РР-складке постоянно угрожает опасность "расстегнуть молнию" на свободном конце.
NPY является весьма распространённым нейропептидом, обладающим разнообразным действием в различных частях как центральной, так и периферической нервной системы, действующий с помощью различных субтипов рецептора в организме людей: Yl, Y2, Y4 и Y5. Основными NPY рецепторами являются Y1 рецептор, который обычно является постсинаптическим рецептором, передающим "действие" NPY нейронов, и Y2 рецептор, который обычно является пресинаптическим, ингибирующим рецептором. Это действительно имеет место в гипоталамусе, где NPY нейроны- которые также экспрессируют антагонист/обратный агонист рецептора мелакортина AgRP (агути-родственный пептид) - ведут себя как первичные "сенсорные" нейроны в стимулирующей ветвь дугообразного (аркуатного) ядра. Поэтому в этом "сенсорном ядре" для регуляции аппетита и потребления энергии NPY/AgRP нейроны, вместе с ингибирующими POMC/CART нейронами, контролируют гормональный и питательный статус организма, так как эти нейроны являются мишенью как действующих продолжительно регуляторов, таких как лептин и инсулин, так и кратковременных
регуляторов, таких как грелин и PYY (см. ниже). Стимулирующие NPY/AgRP нейроны распространяются, например, на паравентрикулярное ядро- также гипоталамуса- где, как полагают, их постсинаптическими нацеленными рецепторами являются Y1 и Y5 рецепторы. NPY является наиболее эффективным из известных соединений, способствующих повышению потребления пищи, так грызуны после интрацеребровентрикулярной (ICV) инъекции NPY едят до тех пор, пока они в буквальном смысле не лопнут. AgRP, полученный при использовании NPY/AgRP нейронов, ведёт себя как антагонист, главным образом, в отношении рецепторов меланокортинов типа 4 (МС- 4) и блокирует действие пептидов из РОМС - в основном, aMSH- на этот рецептор. Так как МС4 рецепторный сигнал действует как ингибитор потребления пищи, действие AgRP- точно так же, как действие NPY- является стимулирующим сигналом для потребления пищи (т.е. ингибирование ингибирования, угнетение угнетения). На NPY/AgRP нейронах обнаружены ингибирующие-пресинаптические- Y2 рецепторы, которые являются мишенью как локально высвобождающегося NPY, так и кишечного гормона PYY - другого РР-складчатого пептида.
PYY выделяется в процессе еды - пропорционально калорийности пищи-энтероэндокринными клетками в дистальной части тонкого кишечника и ободочной кишки, действуя как на периферии на функцию ЖКТ, так и в центральной области как сигнал насыщения. Полагают, что периферически PYY действует как ингибитор - "удар под дых"- например, двигательной функции верхнего ЖКТ, секреции желудочной кислоты и секреции экзокринных клеток поджелудочной железы. Полагают, что "центрально" PYY действует, главным образом, на пресинаптические ингибирующие Y2 рецепторы на NPY/AgRP нейронах в дугообразном (аркуатном) ядре, к которому он поступает из крови (Batterham et al. 2002 Nature 418: 650-4). Пептид выделяется в виде PYY1-36, но часть - около 50%- циркулирует в кровотоке в виде PYY3-36, который является продуктом разложения дипептидилпептидазы-Г/, фермента, который удаляет дипептид с N- конца пептида, при условии, что Pro или Ala находятся в положении два, как во всех трёх РР-складчатых пептидах -РР, PYY и NPY (Eberlein et al. 1989 Peptides 10: 797-803). Таким образом, PYY в кровотоке представляет собой смесь PYY1-36, который действует как на Y1, так и на Y2 рецепторы (так же как Y4 и Y5 с различной аффинностью), и PYY3-36, который обладает более низкой аффинностью в отношении рецепторов Yl, Y4 и Y5 рецепторов, чем в отношении Y2 рецептора.
РР представляет собой гормон, который выделяется эндокринными клетками в панкреатических островках, хотя регулируется исключительно вагусно
холинергическими влияниями, выявляемыми, главным образом, при потреблении пищи (Schwartz 1983 Gastroenterology 85: 1411-25). РР оказывает различное действие на желудочно- кишечный тракт, но оно обычно не наблюдается в изолированных клетках и органах, и, очевидно, зависит от отсутствия нарушения вагусной иннервации (Schwartz 1983 Gastroenterology 85: 1411-25). В соответствии с этим РР рецепторы, называемые Y4 рецепторами, расположены, главным образом, в области пострема в стволе мозга с сильной экспрессией в моторных вагусных нейронах - активация которых вызывает периферические эффекты РР - и в ядрах одиночного пучка (NTS) - активация которых вызывает действие РР как гормона насыщения (Whitecomb et al. 1990 Am. J. Physiol. 259: G687-91, Larsen & Kristensen 1997 Brain Res. Mol. Brain Res. 48:1-6). Следует отметить, что РР в крови имеет доступ к этой области мозга, так как гематоэнцефалический барьер "пропускает" в этой области, где обнаруживаются различные гормоны с периферии. Недавно были приведены доводы, что влияние РР на потребление пищи частично опосредуется действием на нейроны - в особенности POMC/CART нейроны в дугообразном ядре (Batterham et at. 2004 Abstract 3.3 International NPY Symposium in Coimbra, Portugal). РР действует через Y4 рецепторы, к которым он обладает аффинностью в субнаномолярных концентрациях, в отличие от PYY и NPY, которые проявляют аффинность к этому рецептору в наномолярных концентрациях (Michel et al. 1998 Pharmacol. Rev. 50:143-150). РР также проявляет заметную аффинность к рецептору Y5, но она, по- видимому, не имеет физиологического значения для циркуляции РР вследствие как отсутствия доступа к клеткам в ЦНС, где этот рецептор главным образом экспрессируется, и вследствие относительно низкой аффинности к PP.. Рецепторы РР- складчатых пептидов
Существует четыре точно установленных типа рецепторов РР-складчатых пептидов у человека: Yl, Y2, Y4 и Y5, которые распознают NPY1-36 и PYY1-36 с аналогичной аффинностью. Было высказано предположение о типе рецептора Y3, который мог иметь предпочтение в отношении NPY по сравнению с PYY, но в настоящее время его не принимают как реальный подтип рецепторов (Michel et al. 1998 Pharmacol. Rev. 50:143-150). Был клонирован подтип рецепторов Y6, который в организме человека экспрессируется в усечённой форме, не содержащей TM-VII, а также в виде хвоста рецептора, и, следовательно, по меньшей мере, сам по себе, по- видимому, не может образовывать функциональную рецепторную молекулу.
Yl receptors - исследования по аффинности наводят на мысль, что Y1 одинаково хорошо связывается как с NPY, так и с PYY, но, в принципе, не с PP. Аффинность к Y1 зависит от идентичности обеих концевых последовательностей РР-складчатой молекулы
(NPY/PYY)- например, являются важными остатки Tyrl и Рго2- и зависит от того, чтобы пептидные концы были представлены "правильным образом". На С-конце, где важными являются боковые цепи некоторых остатков, Y1 рецептор - подобно Y5 и Y4 рецептору, но не Y2 рецептору -допускает некоторые замены в положении 34 (обычно Gin) - такие как Pro {Fuhlendorff et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 11706-12; Schwartz et al. 1990 Annals NY Acad. Sci. 61: 35-47). Сообщалось о некоторых исследованиях зависимости структура-функция, касающихся требований Y1 и Y2 рецепторов (Beck- Sickinger et al. 1994 Eur. J. Biochem. 225: 947-58; Beck- Sickinger and Jung 1995 Biopolymers 37: 123-42; Soil et al. 2001 Eur. J. Biochem. 268: 2828-37).
Y2 рецепторы - исследования аффинности наводят на мысль, что Y2 одинаково хорошо связывается как с NPY, так и с PYY, но, в принципе, не с PP. Для рецептора нужен, главным образом, С- конец РР- складчатого пептида (NPY/PYY). Таким образом, длинные С- концевые фрагменты- например, вплоть до NPY13- 36 (целая альфа- спираль плюс С- концевой гексапептид)- распознаются с относительно высокой аффинностью, т.е. в пределах десятикратной величины аффинности полноразмерного пептида (Sheikh et al. 1989 FEBS Lett. 245: 209-14, Sheikh et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 6648-54). Следовательно, различные N- концевые делеции, которые приводят к утрате связывания с Y1 рецептором, позволяют всё ещё до некоторой степени сохранять связывание с Y2 рецептором. Однако, аффинность С- концевых фрагментов снижается, примерно, в 10 раз по сравнению с NPY / PYY даже для сравнительно длинных фрагментов. Остаток Gin в положении 34 NPY и PYY является в высшей степени важным для распознавания лиганда Y2 рецептором (Schwartz et al. 1990 Annals NY Acad. Sci. 611: 35-47).
Y4 рецепторы - исследования аффинности указывают, что Y4 связывает РР в субнаномолярных концентрациях ("субнаномолярная аффинность"), соответствующих концентрациям, обнаруживаемым в плазме, тогда как NPY и PYY распознаются со значительно более низкой аффинностью. Такие исследования наводят на мысль, что Y4 рецептор в высшей степени зависим от С- конца РР- складчатых пептидов и что относительно короткие N-концевые делеции уменьшают аффинность лигандов. Сообщалось о некоторых исследованиях структура- активность, относящихся к Y4 рецептору (Gehlert et al. 1996 Mol. Pharmacol. 50: 112- 18; Walker et al. 1997 Peptides 18: 609-12).
Y5 рецепторы - исследования аффинности показывают, что Y5 одинаково хорошо связывается с NPY и PYY, но также связывается с РР с более низкой аффинностью, которая, однако, ниже обычных уровней этого гормона в кровотоке. PYY3-36 также хорошо распознаётся рецептором Y5, однако, этот рецептор по большей степени
экспрессируется в ЦНС, где такой пептид не может легко получить доступ к рецептору при введении на периферии.
РР- складчатые пептиды и их аналоги были предложены для применения при лечении ожирения и связанных с этим заболеваний, включая, например, синдром Прадера- Вилли, на основании действия этих пептидов, продемонстрированного на животных моделях и на человеке, и на основании того факта, что у людей с избыточным весом (ожирением) наблюдаются низкие базальные уровни PYY и РР, а также более слабые реакции этих пептидов на пищу (Hoist JJ et al. 1983 Int. J. Obes. 7: 529-38; Batterham et al. 1990 Nature). Первоначально было показано, что вливание РР больным с синдромом Прадера- Вилли РР снижает потребление пищи (Berntson et al. 1993 Peptides 14: 497- 503), и этот эффект был подтверждён вливанием РР здоровым людям (Batterham et al. 2003, Clin. Endocrinol. Metab. 88: 3989-92). РР-складчатые пептиды также были предложены для применения при аналогичном терапевтическом ангиогенезе (Zukowska et al. 2003 Trends Cardiovasc. Med. 13: 86-92) и при воспалительном заболевании кишечника (см., например, Международную заявку WO 03/105763).
Однако, нативные РР-складчатые пептиды не являются оптимальными для применения в качестве биофармацевтических веществ. Например, полноразмерные пептиды PYY1-36 и NPY1-36 реагируют слишком неизбирательно со всеми типами рецепторов Y и, следовательно, будут вызывать побочные эффекты в сердечнососудистой системе и, например, рвоту. кроме того, природные пептиды не оптимизированы по устойчивости белка, так как их готовят таким образом, чтобы они действовали в течение сравнительно короткого времени в качестве нейропептида или гормона. Природный, более селективный в отношении Y2 пептид, PYY3-36, имеет, например, искажённую тыльную сторону, так что его РР-складчатая структура ухудшена вследствие элиминирования важного остатка Рго2 полипролиновой спирали, который в полноразмерном пептиде взаимодействует с Туг27 в амфифильной спиральной области молекулы.
Для лечения состояний, откликающихся на Y- рецепторную модуляцию, желательно, следовательно, использовать Y рецепторные РР-складчатые пептиды или РР-складчатые пептиды- миметики, специфические в отношении выбранного Y рецептора, предполагаемого в качестве мишени, и которые устойчиво сохраняют элементы РР-складчатой структуры, важные для рецепторного связывания. В частности, было бы в высшей степени желательно использовать такие агенты, которые селективны в отношении Y2 и Y4 рецепторов по сравнению с Y1 рецептором. При некоторых состояниях, таких как ожирение и секреторная диарея, применение агониста как Y2, так и
Y4, является благотворным. Поэтому одно соединение, обладающее обоими этими свойствами - агонизм Y2 и Y4 - было бы в высшей степени выгодным. Однако, для клинических показателей важно, чтобы такое соединение было не только заметным агонистом рецептора Y1, так как стимуляция Y1 рецептора ведёт к нежелательным побочным эффектам, таким как вредное воздействие на сердечно- сосудистую систему (например, повышение артериального давления) и на почки (например, натрийурез). Существуют природные соединения, которые являются селективными агонистами Y2 рецептора в противоположность Y2 рецептору, такие как PYY3-36, и которые предлагаются, например, для лечения ожирения. Имеются также соединения, которые являются селективными агонистами Y4 рецептора по сравнению с Y1 рецептором, такие как природный пептид РР, которые также предлагаются для лечения ожирения. Имеются также соединения, которые, например, являются комбинированными агонистами Y1 и Y2 рецепторов, такие как природные пептиды PYY и NPY. Однако не сообщалось ни об одном известном соединении, которое было бы эффективным агонистом как Y2, так и Y4 рецептора. Более того, ранее не предлагалось использовать комбинированный Y2 и Y4 агонист с селективностью к Y1 рецептору для терапевтического применения.
Некоторые общие термины, применяемые в описании
Аффинность: Аффинность пептида к специфическому рецептору выражается, например, величиной IC50 или величиной К] или К <ь которая в конкретном неограничивающем примере определяется анализом, например, таким, как анализ конкурентного связывания. Значение IC50 соответствует концентрации пептида, который замещает- релевантный для данного рецептора- радиоактивный лиганд, применяемый в количестве, значительно меньшем, чем Kd для этого радиоактивного лиганда, на 50%.
Аппетит: Естественная потребность в еде или сильное желание еды. Повышенный аппетит обычно приводит к повышенному пищевому поведению.
Супрессоры аппетита: Соединения, понижающие потребность в еде.
Связывание: Специфическое взаимодействие между двумя молекулами, такое, что две молекулы взаимодействуют. Связывание с рецептором может быть специфическим и селективным, так что преимущественно связывается одна молекула по сравнению с другой молекулой. Специфическое связывание можно определять константой диссоциации K Индекс массы тела (ИМТ, BMI): Математическая формула для измерения массы тела, иногда также называемая индексом Кветеля. BMI рассчитывают как частное от деления массы (в кг) на рост (в метрах) . Современными стандартами как для мужчин, так и для женщин, принятыми за "нормальные", являются BMI около 20 кг/м2. В одном варианте изобретения для определения страдающего ожирением субъекта можно применять BMI выше 25 кг/м2. Первая степень ожирения соответствует BMI 25 кг/м2. Вторая степень ожирения соответствует BMI 30- 40 кг/м и третья степень ожирения соответствует BMI выше 40 кг/м2 (Jequier 1987 Ain. J. Clin. Nutr. 45:1035-47). Идеальный вес тела различен у разных видов и индивидуумов и зависит от роста, строения тела, строения костей и пола.
Потребление калорий, потребление в калориях: Число калорий (энергия), потребляемых индивидуумом. В контексте настоящего изобретения этот термин идентичен термину "потребление энергии".
Косметическое лечение: Предполагается, что этот термин обозначает лечение не с медицинской целью, но для улучшения качества жизни субъекта, например, внешнего вида субъекта. Этот термин включает лечение субъекта, желающего снизить свой вес, не будучи человеком, страдающим избыточным весом или ожирением.
Потребление пищи: Количество пищи, потребляемой индивидуумом. Потребление пищи можно измерять объёмом или весом. Это выражение включает i) потребление пищи как общее количество поглощённой индивидуумом пищи; и ii) потребление пищи как количество белков, жиров, углеводов, холестерина, витаминов, минералов или любых других пищевых компонентов, поглощённых индивидуумом. Соответственно, выражение "потребление пищи" в контексте настоящего изобретения аналогично выражению "потребление энергии".
Нормальная дневная диета: Среднее потребление пищи индивидуумом данного вида. Нормальную дневную диету можно выражать терминами "потребление калорий", "потребление белков", "потребление углеводов" и/или "потребление жиров". Нормальная дневная диета человека обычно содержит следующее: от около 2000, около 2400 или около 2800 до значительно большего числа калорий. Кроме того, нормальная дневная диета человека обычно включает, примерно, 12-45 г белка, около 120-610 г углеводов и около 11-90 г жиров. Низкокалорийная диета составляет, примерно, не более 85% и, предпочтительно, не более 70% нормального потребления в калориях человека. У животных потребности в калориях или Б пище меняются в зависимости от вида и размера животного. Например, у кошек общее потребление калорий на кг, а также распределение
белков, жиров и углеводов в процентах меняется с изменением возраста кошки и репродуктивного состояния.
Ожирение: Состояние, при котором избыточный вес тела может стать причиной повышенного риска для здоровья человека (см. Barlow and Dietz, Pediatrics 102:E29, 1998; National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI), Obes. Res. (suppl. 2):51 S209S, 1998). Избыточный телесный жир является результатом дисбаланса между потреблением и расходом энергии. В одном варианте изобретения для оценки ожирения применяют индекс массы тела (BMI). В одном варианте изобретения BMI, примерно, от 22 кг/м2 (т.е., примерно, на 10% выше нормального значения) и, примерно, до 30 кг/м2 рассматривается как избыточный вес, особенно, примерно, от 25 кг/м2 до 30 кг/м , тогда как BMI30 кг/м или выше рассматривается как ожирение.
Избыточный вес: Вес индивидуума (человека), который выше идеального веса его тела. Человек с избыточным весом может страдать ожирением, но необязательно ожирением. В одном варианте изобретения человеком, страдающим избыточным весом, является любой индивидуум, желающий снизить свой вес. В другом варианте изобретения человек с избыточным весом является человек с BMI, примерно, от 22 кг/м2 (т.е., примерно, на 10% выше нормального значения) и, примерно, до 30 кг/м рассматривается как человек, страдающий избыточным весом, особенно, примерно, от 25 кг/м2 до 30 кг/м2. Следует отметить, что субъекты, имеющие BMI немногим выше нормального значения (например, около 22 кг/м2- 25 кг/м2), очень часто желают снизить вес, хотя только в косметических целях.
Эффективность (активность): In vitro эффективность соединения определяется величиной ЕС50, т.е. концентрацией, которая даёт 50% максимально достижимого эффекта, определяемого релевантным для данного рецептора анализом передачи сигнала.
Субъект: Субъект может быть любым субъектом, включая как человека, так и млекопитающих, следовательно, субъект может быть человеческим или нечеловеческим приматом, сельскохозяйственным животным, таким как свиньи, крупный рогатый скот, овцы и птицы, спортивным или домашним животным, таким как собаки, кошки, лошади, хомяки, и грызунами.
Терапевтически эффективное количество: Доза, достаточная для предупреждения, лечения или уменьшения интенсивности состояния или заболевания и/или для ослабления специфических признаков или симптомов конкретного состояния или заболевания. Термин (выражение) включает дозу, достаточную для предупреждения прогрессирования или для того, чтобы вызвать регрессию нарушения, или дозу, способную облегчить признак или симптом нарушения, или дозу, которая позволяет
достичь нужного результата. В вариантах изобретения, относящихся к косметическому лечению или к лечению избыточного веса или ожирения, терапевтический эффект рецепторного агониста определяется количеством, достаточным для ингибирования или прекращения увеличения веса тела, или количеством, достаточным для снижения аппетита, или количеством, достаточным для уменьшения потребления энергии или пищи или для повышения расхода энергии. Предполагается, что выражение (термин) "косметически эффективное количество" обозначает дозу, достаточную для достижения нужного эффекта при лечении субъекта.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В своём самом широком аспекте настоящее изобретение охватывает применение Y рецепторного агониста, селективного в отношении Y2 и Y4 рецепторов по сравнению с Y1 рецептором, для получения композиции для лечения состояний, откликающихся на активацию Y2 и/или Y4 рецепторов, причём
(а) указанный агонист является РР-складчатым пептидом или РР-складчатым пептидом- миметиком, который содержит
(i) С-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания, представленную как Х- Thr- Arg- X3- Arg- Туг- С^О)^^2, где R1 и R2, независимо, водород или С г С6 алкил, X обозначает Val, Не, Leu или Ala, а X обозначает Gin или Asn, или её консервативно замещённый вариант, в котором Thr замещён на His или Asn, и/или Туг замещён на Тгр или Phe; и/или Arg замещён на Lys, и
(ii) N-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания, представленную как H2N- X - Pro- X - (Glu или Asp)-, где X отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X2 обозначает Leu или Ser, или консервативные замены Leu или Ser, или
(б) указанный агонист содержит
С-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания по определению в (i), см. выше,
указанную последовательность Y рецепторного распознавания, слитую с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим, по меньшей мере, один альфа-спиральный поворот, прилегающий к N-концу указанной гексапептидной последовательности,
указанный поворот заключён в спиральной конфигурации с помощью ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно,
N-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания по определению в (ii), см. выше.
Специфическая терминология, относящаяся к изобретению
Агонисты, к которым относится настоящее изобретение, являются селективными в отношении Y2 и Y4 рецепторов по сравнению с Y1 рецептором. В контексте настоящего изобретения это условие выполняется, если величина IC50 агониста, по меньшей мере, в 10 раз ниже в отношении Y2 и Y4 рецепторов, чем в отношении Y1 рецептора, при определении методами анализа аффинности по данному описанию. В целом, что касается эффективности (активности), величина ЕС50 агонистов по данному изобретению также, по меньшей мере, в 10 раз ниже для Y2 и Y4 рецепторов, чем в отношении Y1 рецептора, как определено анализом активности по данному описанию. Некоторые из предпочтительных агонистов по данному изобретению имеют величины аффинности и эффективности, по меньшей мере, в 100 раз выше в отношении Y2 и Y4 рецепторов, чем в отношении Y1 рецептора.
Для целей данного описания РР-складчатый пептид представляет собой молекулу, имеющую 3-D структуру, которая, будучи картирована в оригинальной 3- D структуре птичьего РР, определённой методом РСА (Blundell et al. 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4175-79 ; Glover et al. 1984, Eur. J. Biochem. 142: 379-85), имеет домены, соответствующие доменам N- концевой полипролиноподобной спирали, области бета-поворота типа I, амфифильной альфа- спирали и С-концевого гексапептида указанного NPY, PYY и/или РР и практически выравниваемые в них (Фиг. 1). Таким образом, описание различных доменов РР-складчатьгх пептидов, применяемых в данном изобретении, относится к оригинальной рентгеновской структуре птичьего РР (Blundell et al. 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4175- 79 ; Glover et al. 1984, Eur. J. Biochem. 142: 379- 85; Schwartz et al. 1990).
РР-складчатый пептид- миметик по настоящему описанию обозначает молекулу, имеющую 3-D структуру, которая, при картировании на оригинальной 3-D структуре птичьего РР, по меньшей мере, имеет домены, соответствующие доменам последнего поворота амфифильной альфа-спирали и С-концевого гексапептида РР и практически выравниваемые в них. РР-складчатые пептид- миметики могут также, при вышеуказанном картировании, иметь домены, соответствующие одному или более остальных поворотов амфифильной альфа- спирали, N-концевой полипролиноподобной спирали и области бета-поворота типа I. Пептид- миметик необязательно состоит исключительно из последовательности альфа-аминокислот, связанных классическими
пептидными связями. Одна или более связей в такой последовательности может быть замещена пептидомиметическими связями, такими как обратная амидная и восстановленная пептидная связи, так что пептид- миметик можно рассматривать как псевдопептидную последовательность. Такие замены связей могут придать устойчивость к расщеплению эндопептидазой и улучшить фармакодинамические свойства молекулы.
Такие сравнения 3-D структуры, как упомянутые в выше приведённых определениях "РР-складчатого пептида" и "РР-складчатого пептида- миметика", можно делать, конструируя модели молекул сравнения на основании координат их атомов, определяемых, например, методом РСА, или с помощью одной или более компьютерных программ, выпускаемых для визуализации прогнозируемой на основании структурной формулы 3-D структуры молекулы, например "Maestro Modeling Environment" от Schrodinger Inc, 1500 S. W. First Avenue, Suite 1180 Portland, OR 97201; "Insight II Modeling Environment", версия 4.0, от Accelrys Inc. San Diego; и "SYBYL(r) 7.0" от Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144, USA. Следует отметить, что 3- D структура РР-складчатого пептида или РР-складчатого пептида- миметика по настоящему изобретению необязательно должна точно соответствовать, и обычно не соответствует точно, 3-D структуре природного NPY, PPY или PP. Наблюдаемая 3-D структура РР-складчатого пептида или РР-складчатого пептида- миметика в значительной степени зависит от применяемых экспериментальных условий, и в особенности малые пептиды могут казаться более или менее скрученными в определённых условиях. Однако, достаточно, чтобы РР-складчатый пептид или РР-складчатый пептид- миметик имел домены, соответствующие РР-складчатым доменам, описанным выше, и чтобы он имел структурные элементы для того, чтобы принять общую определённую форму, аналогичную форме нативного пептида, в котором С-концевая и, при наличии, N-концевая последовательности были нормально ориентированы.
Агонисты, к которым относится данное изобретение, имеют С-концевую последовательность Y- рецепторного распознавания (распознавания Y рецептором). Эта последовательность, обычно содержащая около 5-7 остатков и, в особенности, гексапептидную последовательность, расположена на С-конце агониста, которая, в случае её присутствия в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде- миметике, связывается с Y рецептором и активирует рецептор за счёт только лишь это связывающее взаимодействие, или в результате такого связывающего действия и связывания с Y рецептором N- концевой Y- рецепторной последовательности, имеющейся в агонисте. N-концевая последовательность Y-рецепторного распознавания (распознавания Y рецептором) представляет собой последовательность, обычно содержащая около 3-5
остатков, главным образом, 4 остатка, расположенную на N-конце агониста, которая, в случае её присутствия в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде- миметике, связывается с Y рецептором и активирует рецептор за счёт комбинации такого связывающего действия и связывания с Y рецептором С-концевой Y- рецепторной последовательности, имеющейся в агонисте. Классические С- и N- концевые последовательности Y- рецепторного распознавания представляют собой последовательности, обнаруживаемые в природных РР, NPY и PPY пептидах, но как станет очевидно из данного описания, эти классические последовательности можно модифицировать для того, чтобы распознавать Y2 и Y4, но уменьшить распознавание Y1.
В данном описании выражение, такое как "остаток, соответствующий положению N NPY" является ссылкой на аминокислотный остаток агониста, который, при картировании 3-D структуры агониста на NPY, отображается (картируется) наиболее близко к остатку N NPY. Действительная нумерация конкретного остатка в специфическом пептиде может отличаться от N, например, вследствие делеций в специфическом пептиде относительно природных пептидов.
В целом, РР-складчатые агонисты или РР-складчатые агонисты- миметики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, обычно имеют пептидный каркас или частично пептидный каркас, по меньшей мере, имеют С-концевую аминокислотную последовательность и, обычно, N- концевую аминокислотную последовательность, хотя остальная часть каркаса может представлять собой непептидный линкерный радикал, например, линейную или разветвлённую алкиленовую цепь. Аминокислоты, присутствующие на пептидном(ых) участке(ах) агонистов, обычно являются природными, особенно в С- и N-концевых последовательностях, которые взаимодействуют с Y2 и Y4 рецепторах, но также могут присутствовать неприродные альфа- аминокислоты, которые поддерживают РР-складку, но не предупреждают Y2 и Y4 рецепторное связывание.
Если агонист по настоящему изобретению содержит С- и N- концевые аминокислотные последовательности, то С-концы могут быть амидированы и/или N-концы могут быть ацилированы с целью придать резистентность карбокси- и/или аминопептидазам. На самом деле С-конец нативньгх NPY, PYY и РР пептидов амидирован, так что С-концевая аминокислота агониста по изобретению также амидирована.
В данном описании ссылки на аминокислоты даются в виде их обычных названий или в виде сокращений, например, валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Не), метионин (Met), фенилаланин (Phe), аспарагин (Asn), глутаминовая кислота (Glu), глутамин (Gin),
гистидин (His), лизин (Lys), аргинин (Arg), аспарагиновая кислота (Asp), глицин (Gly), аланин (Ala), серии (Ser), треонин (Thr), тирозин (Туг), триптофан (Тгр), цистеин (Cys) и пролин (Pro). Когда называется обычное название или аббревиатура без указания стереоизомерной формы, следует понимать, что речь идёт об L- форме рассматриваемой кислоты. Когда подразумевается D- форма, она специально указывается в названии аминокислоты. Иногда, когда этого требует контекст, L-форма скорее описывается, нежели подразумевается.
Термин "консервативная замена" по данному описанию обозначает, что одна или более аминокислот замещены на другой, биологически сходный остаток. Примеры включают замену на аминокислотные остатки со сходными характеристиками, например, малые аминокислоты, кислые аминокислоты, полярные аминокислоты, основные аминокислоты, гидрофобные аминокислоты и ароматические аминокислоты. Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают консервативные аминокислотные замены, представленные в приведённой ниже Таблице, и аналогичные замены исходного остатка неприродными альфа- аминокислотами с аналогичными характеристиками. Например, в предпочтительном варианте изобретения остатки Met замещаются на норлейцин (Nle), биоизостер Met, который, в отличие от Met, трудно окисляется. Другим примером консервативной замены на остаток, обычно не присутствующий в эндогенных пептидах и белках млекопитающих, является консервативная замена Arg или Lys, например, на орнитин, канаванин, аминоэтилцистеин или другая основная аминокислота. Более подробные сведения о фенотипически молчащих заменах в пептидах и белках даны, например, в Bowie et al. Science 247, 1306-1310, 1990.
Исходный остаток
Консервативная замена
Ala
Gly
Arg
Lys
Asn
Gin, His, Thr
Asp
Glu
Gin
Asn, His
Glu
Asp
His
Asn, Gin
lie
Leu, Val
Leu
He, Val
Lys
Arg
Met
Leu, He
Phe
Tyr, Trp, His
Ser
Thr, Asn
Thr
Ser, Asn, Gin
Trp
Туг, Phe, His
Туг
Trp, Phe, His
Val
He, Leu
Если не указано иначе в контексте, в котором он встречается, термин "замещённый" в применении к любому фрагменту по данному описанию означает имеющий до четырёх совместимых заместителей, каждый из которых, независимо, может представлять собой, например, (С]-Сб)алкил, (СгСб)алкокси, гидрокси, гидрокси(Сг Сб)алкил, меркапто, меркапто(С]-Сб)алкил, (СгСб)алкилтио, галоген (включая фтор, бром и хлор), трифторметил, трифторметокси, нитро, нитрил (-CN), оксо, фенил, -СООН, -COORA, -CORA, -S02RA, -CONH2, -S02NH2, -CONHRA, -S02NHRA, -CONRARB, -S02NRARB, -NH2, -NHRA, -NRARB, -OCONHRA, -OCONRARB, -NHCORA, -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHS02ORA, -NRBS02OH, -NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHR8, -NRACONHRB, -NHCONRARB или -NRACONRARB, где RA и RB, независимо, обозначают (СгСб)алкильную группу. "Возможный (необязательный) заместитель" может представлять собой одну из приведённых выше замещающих групп.
Если контекст не диктует иначе, ссылки по данному описанию на NPY, PYY и РР пептиды и их последовательности относятся к человеческим формам этих пептидов и их последовательностям. Однако, часто NPY, PYY и РР пептиды других млекопитающих составляют РР-складчатые пептиды- миметики человеческих NPY, PYY и РР или консервативно замещённых человеческих NPY, PYY и РР, когда эти термины применяются в данном описании.
Агонисты типа (а) для применения по данному изобретению
Обычно агонисты типа (а) являются РР-складчатыми аналогами NPY, PYY и РР или РР-складчатыми миметиками NPY, PYY и РР, имеющими модификации для того, чтобы гарантировать различие (разделение) аффинности и активности в отношении Y2 и Y4 рецепторов по сравнению с Y1 рецетором. Такие РР-складчатые аналоги и миметики включают пептиды, имеющие полный комплемент характеристик РР-складчатых пептидов (N- концевую полипролиноподобную спираль, бета- поворот, амфифильную альфа- спираль и С-концевой гексапептид), пептидные аналоги, в которых часть каркаса (например, остатки бета- поворота и прилегающие остатки) замещены на непептидную спейсерную цепь, и усечённые (процессированные) пептиды, содержащие С-концевой гексапептид и последний поворот амфифильной альфа- спирали, но не содержащие целую полипролиноподобную спираль или её часть и/или весь бета- поворот или его часть.
В С-концевой аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания агонистом по данному изобретению R1 и R2, каждый независимо, предпочтительно, обозначает водород. Предпочтительно также, остаток X обозначает Val или Не. В тех случаях, когда агонист по изобретению является РР последовательностью с модификациями по изобретению на С-конце, остаток X может представлять собой, например, Leu, Val или Не. В тех случаях, когда агонист по изобретению представляет собой PYY или NPY последовательность с С-концевыми модификациями по данному изобретению, остаток X может являться, например, Val или Не.
В одном варианте изобретения агонисты, которые рассматривает данное изобретение, содержат С-концевую последовательность Y- рецепторного распознавания, представленную как - ХА- Х- Thr- Arg- X3- Arg- Туг- C^CONR'R2, где остаток ХА не является основным или кислым, а последовательность -Х- Thr- Arg- X - Arg- Tyr-С(=0)№1^2 определяется выше. В этом случае не основный и не кислый аминокислотный остаток ХА может представлять собой, например, Leu, Met или Nle, Не, Val или Ala.
В другом варианте изобретения агонист содержит С-концевой ундекапептид, представленный как -Xе- Туг- Хв- Asn- ХА- Х- Thr- Arg- X3- Arg- Туг- C(=0)NR'R2, где последовательность -ХА- Х- Thr- Arg- X3- Arg- Туг- C^CONR'R2 определяется выше, Xе обозначает Arg или Lys, а Хв обозначает Не, Leu или Val. В агонисте такого класса С-концевая ундекапептидная последовательность представляет собой - Arg- Туг- Leu- Asn-(Leu или Met)- Val- Thr- Arg- Gin- Arg- Tyr- C(=0)NH2.
В другом варианте изобретения агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность, представленную как -Xе- Туг- Хв- Asn- ХА- Х- Thr- Arg- X3- Arg-Tyr- C(=0)NR'R2, где определение последовательности -ХА- Х- Thr- Arg- Gin- Arg- Tyr-C(=0)NR'R2 дано выше, Xе обозначает His, Asn или Gin, a Хв обозначает He, Leu или Val. В агонисте такого класса С-концевая ундекапептидная последовательность представляет собой - His- Туг- (Не или Leu)- Asn- Met- Leu- Thr- Arg- Gin- Arg- Tyr- C(=0)NH2.
В С-концевой аминокислотной последовательности Y- рецепторного распознавания агонистов типа (а), которые рассматриваются в настоящем изобретении, остаток X1, предпочтительно, обозначает Ala, или может отсутствовать, а остаток X2, предпочтительно, обозначает Leu, Не или Ser. Следовательно, одной предпочтительной N- концевой последовательностью является H2N- Ala- Pro-Leu- Glu-. Другой предпочтительной N- концевой последовательностью является последовательность H2N-Pro- Leu- Glu-.
Агонисты типа (b) для применения по данному изобретению
Обычно агонисты типа (Ь) можно рассматривать как типа (а) аналоги РР-складчатых пептидов или РР-складчатые миметики, минимальные структурные признаки которых (С-концевая последовательность Y-рецепторного распознавания и последний поворот альфа- спирали) стабилизированы с помощью определённой внутримолекулярной ковалентной связи.
Типа (Ь) агонисты, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут являться РР-складчатыми миметиками, которые содержат N-концевую последовательность Y-рецепторного распознавания, обсуждавшуюся выше в связи с агонистами типа (а), или они могут быть усечёнными по N- концу РР-складчатыми миметиками, которые не содержат N-концевой последовательности Y-рецепторного распознавания типа, описанного для агонистов типа (а) (хотя они могут иметь другие N-концевые аминокислотные последовательности). Следовательно, N-концевая последовательность распознавания рецептором по определению для агонистов типа (а) не обязательна для класса агониста типа (Ь).
Агонисты этого типа характеризуются внутримолекулярной связью, которая либо не имеет эквивалента в нативных NPY, PYY или РР пептидах, либо соответствует нековалентному взаимодействию, или замещает нековалентное взаимодействие с ковалентной связью, например, ковалентный дисульфидный мостик между Cys2 и D-Cys27 в [Cys2, D- Cys27, Gln34]PP (SEQ ГО N0:22). Установлено, что такая связь может служить для стабилизации обязательных элементов РР-складчатой структуры, в частности, подвижной С-концевой последовательности Y2- распознавания и последнего поворота альфа- спирали, и/или презентации N- конца. В полноразмерньгх или близких к полноразмерным пептидах такая связь может стабилизировать нативную РР-складчатую структуру как таковую. Это выгодно по двум причинам: во- первых, она стабилизирует С-концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания, оптимально повышая активность в отношении Y рецептора; во-вторых, за счёт стабилизации целой РР-складки как таковой пептид становится менее чувствительным к протеолитическому расщеплению, так как для такие ферментов часто требуется, чтобы такие целевые последовательности находились в относительно нескрученной форме (Schwartz et al. 1990). Внутримолекулярная связь может также способствовать Y2/Y4-селективным агонистам, которые трудно модифицируются сравнительно со структурой нативных пептидов, например, агонистам, у которых отсутствует один или более доменов, или участков доменов, имеющихся в нативных пептидах.
Одна группа такого типа (Ь) имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания с N-концевым участком агониста, в соответствии с доеном полипролина РР-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену. Сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь, например, дисульфидная или лактамная связь, в вышеприведённых случаях может простираться от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из остатков в полипролиноподобном домене. Если агонист является РР-складчатым миметиком, первые четыре аминокислотных остатка которого картируются на соответствующие N-концевые положения РР, NPY или PYY, сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь, например, дисульфидная или лактамная связь, в вышеприведённых случаях может тянуться от аминокислотного остатка в амфифильном домене до одного из этих четырёх N- концевых остатков, как например, в [Cys2,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ Ш N0:22).
В другой группе агонистов типа (Ь) сдерживающая спиральный поворот внутримолекулярная связь соединяет остатки в последнем спиральном повороте домена альфа- спирали, например, лактамная связь между остатками Lys и Glu в спиральном повороте, или остаток в С-концевой аминокислотной последовательности Y2-распознавания и остаток в последнем спиральном повороте домена альфа-спирали, например, лактамный мостик между Lys28 и Glu32 [Lys28,Glu32]PP25- 36 (SEQ Ш N0:28).
Агонисты типа (а) и (Ь)
В одной группе РР-складчатых агонистов- миметиков, рассматриваемых в данном изобретении, типа (а) и (Ь), в которых агонист содержит как С-концевую, так и N-концевую последовательность Y-рецепторного распознавания, С-концевая последовательность может быть слита по своему N-концу с доменом амфифильной аминокислотной последовательности, содержащим, по меньшей мере, один альфа-спиральный поворот, прилегающий к N-концу С-концевой гексапептидной последовательности, причём указанные С- и N-концевые аминокислотные последовательности соединены линкерным радикалом, который может представлять собой линейный или разветвлённый алкиленовый радикал, необязательно содержащий одну или более двойных или тройных связей. Например, С- и N- концевые аминокислотные последовательности могут соединяться пептидными связями, соответственно, с карбоксильной или аминогруппами аминокислоты формулы
NH2(CH2)nC02H, где n имеет значение от 2 до 12, главным образом 6, 7, 8, 9 или 10. Так, агонист может являться РР-складчатым миметиком NPY, PPY или РР, который содержит вышез'казанные С-концевую и N- концевую последовательности Y- рецепторного распознавания с описанным мостиком Cys- Cys, но при этом его аминокислотные остатки, соответствующие 5-24 нативного пептида, замещены на аминокарбоновую кислоту с углеродной цепью, содержащей 6-10 атомов углерода, выбранную их группы, состоящей из 6-аминогексановой кислоты (ипсилон- аминокапроновой кислоты), 7-аминогептановой кислоты, 8-аминооктановой кислоты, 9-аминононановой кислоты и аминодекановой кислоты. В конкретных вариантах изобретения предпочтительны 8-аминооктановые кислоты (в данном описании иногда сокращённо называемые "Аос"). Примером такого агониста является [Cys2,Aoc5- 24, D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:23).
Некоторые агонисты тех типов, к которым относится настоящее изобретение, можно рассматривать либо 1) как аналоги NPY или PYY пептидов, в которых остатки, имеющиеся в некоторых важных положениях в РР, но не в соответствующих положениях NPY или PYY, замещены на остатки, соответствующие РР остаткам, или на природные или неприродные остатки, сходные по структуре (консервативная замена) остаткам, соответствующим РР остаткам, или 2) как аналоги РР, в котором остатки в некоторых важных положениях NPY или PYY, но не в соответствующих положениях РР, замещены на остатки, соответствующие NPY или PYY остаткам, или на природные или неприродные остатки, сходные по структуре остаткам, соответствующим NPY или PYY остаткам. Как описано выше и как показано на Фиг.1, Y рецепторы распознают остатки, локализованные на общих С- и N-концах пептидов, представленных РР-складчатыми пептидами или РР-складчатыми миметиками. Обычно РР пептиды не распознаются Y2 рецептором вследствие присутствия остатков, главным образом, на С-конце РР, несовместимых с высокоаффинным связыванием и активностью пептида на Y2 рецепторе. Однако, заменой одного или более остатков в молекуле РР или РР-складчатого миметика РР на соответствующий остаток NPY или PYY можно повысить аффинность пептида на Y2 рецепторе без потери аффинности и активности на Y4 рецепторе, или только в сравнительно малой степени уменьшив аффинность и активность на Y4 рецепторе.
В представленной ниже таблице показаны остатки, отличающиеся в N- и С-концевых последовательностях РР, NPY и PYY, т.е. остатки в положениях 1, 3, 4, 26, 28, 30, 31 и 34. Заданную общую Y2 и Y4 высокую аффинность можно получить с помощью вышеописанной гомологичной замены в одном или более этих положений. Однако, предпочтительной заменой в РР для достижения высокой аффинности и активности на Y2
рецепторе при сохранении аффинности и активности на Y2 рецепторе является замена Рго34 на Gin или на неприродный остаток с аналогичными физико- химическими свойствами. Поэтому [Gln34]PP является в высшей степени предпочтительным пептидом, так же как РР аналоги или миметики, в которых Gln34 совмещается с заменой одного или более не-NPY/He-PYY остатка в РР на соответствующий остаток, или остаток с аналогичными физико- химическими свойствами, или неприродную аминокислоту с аналогичными свойствами.
Следует, однако, отметить, что разрешённые гомологичные замены по настоящему изобретению представляют собой такие замены, которые приводят к агонистам по данному описанию, так как не все возможные замены, предлагаемые в таблице, обеспечивают заданные свойства пептида. Например, введение Pro в положение 34 в PYY или NPY уменьшает аффинность пептидов в отношении Y2 рецептора слишком заметно для того, чтобы этот аналог применялся в настоящем изобретении, хотя эта замена обеспечивает высокую аффинность в отношении Y4 рецептора.
Положение
Ala
Leu
Glu
Arg
Met
Leu
Pro
NPY
Туг
Ser
Lys
His
lie
Leu
lie
Gin
PYY
Туг
lie
Lys
His
Leu
Leu
Val
Gin
Специфические агонисты для применения по данному изобретению
Ниже представлены конкретные примеры агонистов для применения по данному изобретению: [Gm34] РР (SEQ Ш No: 4)
[N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Gln34]PP (SEQ Ш N0:34)
[N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg-Ala)3- Lysl8,Gln34]PP (SEQ Ш N0:35)
[N- PEG5000- Lysl3,Gln34]PP (SEQ ID N0:36)
[Ile31,Gln34]PP (SEQ Ш No: 5)
[Val31,Gln34]PP (SEQ Ш No: 6)
[Leu30,Gln34]PP (SEQ ID No: 7)
[Nle30,Gln34]PP (SEQ ID No: 8)
[Leu28,Gln34]PP (SEQ ID No: 9)
[His26,Gln34]PP (SEQ ID N0:10)
[Ile3,Gln34]PP (SEQ Ш N0:11)
[Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:12)
[Alal,Glu4,N- (N- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ГО N0:37)
[Alal, Glu4,N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ГО N0:38)
[Alal,Glu4,N- PEG5000- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:39)
[Alal,Glu4,Arg26(Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ID N0:13)
[Alal,Glu4]PYY (SEQ ID N0:14) и [Alal,Glu4]NPY (SEQ ID N0:15)
[Arg26, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:16) и [Arg26, (Met30 или Nle30)]NPY
(SEQ ID N0:17)
[Glu4, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:18) и [Glu4, (МетЗО или Nle30)]NPY (SEQ ID N0:19)
[Glu4,Arg26]PYY (SEQ ID N0:20) и [Glu4,Arg26]NPY (SEQ ID N0:21) [Cys2,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:22) [Cys2,Aoc5- 24,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:23) [Cys2,Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:30).
[Cys2, N- (8- (8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)- Lysl3, D-Cys27,Gm34]PP (SEQ ID N0:31).
[Cys2,N- {(Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3}- Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:32).
[Cys2, N-{N'- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма- глутамоил-Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:33).
и их аналоги с консервативными заменами. Особенно предпочтительными У2/У4-селективными агонистами для применения по настоящему изобретению являются [Gln34] РР (SEQ ГО No: 4) и [Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:12) или их аналоги с консервативными заменами.
Агонисты, пригодные для применения по данному изобретению
До настоящего времени основные У2/У4-селективные агонисты для применения по настоящему изобретению были описаны в целом и приводились конкретные примеры таких агонистов. Однако, такие агонисты, включая специфически идентифицированные агонисты, молено подвергнуть различным модификациям с целью улучшения их фармакокинетических, фармакодинамических и метаболических свойств. Такие модификации могут включать связывание агониста с функциональными группами (также известными как мотивы), известными сами по себе в технике пептидных или белковых
фармацевтических веществ. Три конкретные модификации, дающие конкретное преимущество в случае агонистов, которые рассматривает настоящее изобретение, вне зависимости от типа (а) или (Ь), представляют собой элемент с мотивами связывания с сывороточным альбумином, или мотив связывания гликозаминогликана (GAG), или ПЭГилирование.
Мотивы связывания сывороточного альбумина
Мотивы связывания сывороточного альбумина (мотивы, связывающие сывороточный альбумин) обычно являются липофильными группами, вводимыми для того, чтобы способствовать продолжительному пребыванию в организме после введения, или по другим причинам, которые могут связываться различными известными способами с пептидными или белковыми молекулами, например, i) ковалентной связью, например, с помощью функциональной группы в боковой цепи аминокислотного остатка, ii) за счёт функциональной группы, встроенной в пептид или подходящим образом дериватизированный пептид, iii) в виде единого участка пептида. Например, в Международной заявке WO 96/29344 (Novo Nordisk A/S) и в статьях P. Kurtzhals et al. 1995 Biochemical J. 312: 725-31 и L.B. Knudsen et al. 2000 J. Med. Chem. 43: 1664-69, описан ряд липофильных модификаций, которые можно использовать для агонистов, которые рассматриваются в данном изобретении.
Подходящие липофильные группы включают необязательно замещённые, насыщенные или ненасыщенные, линейные или разветвлённые углеводородные группы, содержащие 10- 24 углеводных атома. Такие группы могут образовывать целую боковую цепь или часть боковой цепи в каркасе агониста, например, за счёт простой эфирной, тиоэфирной, сложноэфирной или амидной связи с боковой цепью аминокислотного остатка скелета, или с углеродным атомом скелета или боковой цепи каркаса (скелета) непептидного линкерного радикала в скелете РР-складчатого миметика- агониста. Химический способ присоединения липофильной группы не важен, но приведённые боковые цепи, включая липофильные группы, являются примерами групп, которые могут связываться со скелетным углеродом агониста или его подходящего ответвления:
CH3(CH2)nCH(COOH)NH- CO(CH2)2CONH-, где п обозначает целое число от 9
до 15,
СН3(СН2),СО- NHCH(COOH)(CH2)2CONH-, где г обозначает целое число от 9 до 15,
CH3(CH2)sCO- NHCH((CH2)2COOH)CONH-, где s обозначает целое число от 9 до 15,
CH3(CH2)mCONH-, где т обозначает целое число от 8 до 18, -NHCOCH((CH2)2COOH)NH- СО(СН2)рСН3, где р обозначает целое число от 10 до 16,
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH- CO(CH2)qCH3, где q обозначает целое число от 10 до 16,
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-, где п обозначает целое число от 9 до 15, CH3(CH2)pNHCO-, где р обозначает целое число от 10 до 18, -CONHCH(COOH)(CH2)4NH- CO(CH2)mCH3, где m обозначает целое число от 8 до 18,
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH- COCH((CH2)2COOH)NH- СО(СН2)рСН3, где р обозначает целое число от 10 до 16,
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH- CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3, где q обозначает целое число от 10 до 16, и
частично или полностью гидрированный циклопентанофенантреновый скелет.
В одном методе химического синтеза боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой Ci2, Си, С)6 ИЛИ Qg ацильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи остатка каркаса агониста.
Как указывалось, модификация агонистов с для применения с целью улучшить характеристики связывания с сывороточным белком является методом, который можно применять в целом и, в частности, в случае специфических агонистов, перечисленных выше. Так например, [Lysl l,Gln34]-PP и его аналоги с консервативными заменами могут быть модифицированы вышеописанным способом, например,
тетрадеканоилацетилированием Lysll, или [Lysl3,Gln34]PP может модифицироваться с образованием: [N-(N'-reKcafleKaHOM)-raMMa-rayTaMOM-Lysl3,Gln34]PP, а
[Alal,Glu4,Lysl3,Arg26,Nle30]PYY может модифицироваться с образованием: [[Alal,Glu4,N-(N'- гексадеканоил)- гамма- nryTaMOHn-Lysl3,Arg26, Nle30]PYY.
GAG- связывание
Как и в случае мотивов липофильного связывания с сывороткой, обсуждавшегося выше, агонисты, рассматриваемые в данном изобретении, можно модифицировать, вводя мотив GAG связывания в качестве боковой цепи, или участка боковой цепи скелета агониста. Известные GAG- связывающие мотивы для введения таким способом включают аминокислотные последовательности ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает остаток основной аминокислоты, а X обозначает любую аминокислоту.
Несколько, например, три, таких последовательности можно ввести с образованием конкатамерньгх (линейная цепь) или дендримерньгх (боковая цепь) мотивов. Специфические конкатамерные GAG мотивы включают Ala-Arg-Arg-Arg- Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg- Arg-Ala-Ala-Arg-Ala и Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala (каждый из которых может, например, соединяться амидной связью, образующейся между С-концом конкатамерного мотива GAG-связывания и аминогруппой в боковой цепи аминокислоты в каркасе агониста, такой как ипсилон-аминогруппа Lys 18 в агонисте [Lysl8,Gln34]PP (SEQ ED N0:24), с образованием: [N-(Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl8,Gln34]PP, или Lys 13 в агонисте [Alal,Glu4,Lysl3,Arg26,Nle30]PYY с образованием: [Alal,Glu4,N- (Ala-Arg- Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY.
Вместо того, чтобы присоединяться к агонисту в виде боковой цепи, или части боковой цепи каркасного остатка, GAG мотив может ковалентно связываться с С- или (предпочтительно) с N- концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал. В этом случае GAG-связывающий мотив может также содержать аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток, например, последовательность [ХВВВХХВХ^, где п обозначает число от 1 до 5, В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток, в частности, Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- [Gln34]PP (SEQ ED N0:26).
Y2/Y4 селективные агонисты, к которым относится настоящее изобретение, применимы, среди прочего, для терапевтического ангиогенеза. В частности, для такого применения агонисты, предпочтительно, содержат мотив, связывающий гликозаминогликан (GAG), обсуждавшийся выше. Такие мотивы гарантируют, что агонисты связываются с GAG во внеклеточной матрице, и тем самым обеспечивают пролонгированную локальную экспозицию Y рецепторов в этой ткани. Факторы роста, хемокины и т.д. связываются с GAG за счёт участков основных аминокислот, которые взаимодействуют с кислыми сахарами GAG. Эти положительно заряженные эпитопы на факторах роста обычно состоят боковых цепей основных остатков, которые в последовательности необязательно расположены последовательно, но часто находятся в непосредственной близости за счёт элемента вторичной структуры, такого как а- спираль или поворот, или за счёт общей трёхмерной структуры белка. Описаны некоторые GAG-связывающие линейные последовательности, обсуждавшиеся выше, например, ХВВХВХ и ХВВВХХВХ где В представляет собой основной остаток (Hileman et al. Bioassays 1998,
20: 156-67). Методом кругового дихроизма было показано, что эти сегменты при связывании с GAG образуют а- спирали. Если такие последовательности помещены, например, в конкатамерную или дендримерную конструкцию, где присутствует три таких последовательности - например, каждая в виде ARRRAARA последовательности -результирующий 24- мерный пептид - например, ARRRAARA-ARRRAARA-ARRPvAARA - гарантирует сохранение во внеклеточной матрице, аналогичной высокомолекулярному полилизину, т.е. он не вымывается в течение 4- часового вливания (Sakharov et al. FEBS Lett 2003, 27: 6- 10).
Таким образом, факторы роста и хемокины естественно создаются с двумя типами связывающих мотивов: один мотив связывания рецептора, с помощью которого осуществляется сигнальная трансдукция, и один мотив связывания с GAG, с помощью которого достигается присоединение и пролонгированная локальная активность. Пептиды, такие как NPY и РР, являются нейропептидами и гормонами, которые достаточно быстро вымываются из ткани, а не оптимизируются для пролонгированной активности. Присоединяя GAG- связывающий мотив к Y2/Y4 селективному агонисту по настоящему изобретению, создают бифункциональную молекулу, аналогичную факторам роста и хемокинам, содержащую как эпитоп, ответственный за связывание с рецептором на РР-складчатом пептидном участке, так и GAG- связывающий мотив. Кроме того, за счёт включения GAG- связывающего мотива модифицированный пептид имеет свойство дольше оставаться в ткани при инъекции, например, подкожно или внутримышечно или трансдермально, или аналогичным образом доставляться в ткань как таковой. Поэтому GAG- модифицированный пептид также входит в состав препарата пролонгированного действия, который может быть в высшей степени предпочтительным для медленного высвобождения в кровоток и пролонгированного способа действия.
Другим подходящим положением для введения GAG-связывающего мотива-такого как конкатамерная или дендримерная конструкция- РР-складчатых пептидов является положение 14 для NPY пептидов и их аналогов, и положение 13 для PYY и РР пептидов. Как для пептидов типа NPY, PYY, так и для пептидов типа РР другими предпочтительными положениями являются положения 11 и 18. Однако, как обсуждалось выше, остаток, содержащий GAG- связывающий мотив, можно ввести в любое положение в агонистах при условии, что это введение согласуется с сохранением РР-складчатой структуры, требуемой в агонистах типа (а), (Ь) и (с), рассматриваемых в данном изобретении, и нужной С-концевой последовательностью Y2- распознавания. Так, GAG- связывающий мотив можно в качестве части спейсерной конструкции поместить в аналоги, в которых часть РР-складки замещена на непептидный спейсер.
ПЭГилирование
При ПЭГилировании полиалкиленоксидный радикал или радикалы ковалентно связан/связаны с пептидными или белковыми лекарствами с целью увеличения эффективного периода полужизни в организме после введения. Термин происходит от названия предпочтительного полиалкиленоксида, применяемого в таких процессах, а именно, образованного из этиленгликоля полиэтиленгликоля, или "ПЭГ" ("PEG").
Подходящий радикал ПЭГ может присоединяться к агонисту любым подходящим химическим методом, например, за счёт каркасного аминокислотного остатка агониста. Например, в случае молекулы, подобной ПЭГ, в качестве присоединяющей группы часто применяется ипсилон- аминогруппа лизина или N- концевая аминогруппа. Другие присоединяющие (встраивающие) группы включают свободную карбоксильную группу (например, свободная карбоксильная группа С-концевого аминокислотного остатка или остатка аспарагиновой или глутаминовой кислоты), подходящим образом активированные карбонильные группы, меркаптогруппы (например, меркаптогруппы цистеинового остатка), остатки ароматических кислот (например, Phe, Туг, Trp), гидроксигруппы (например, гидроксигруппы в Ser, Thr или OH-Lys), гуанидин (например, Arg), имидазол (например, His) и частицы окисленных углеводов.
Если агонист является ПЭГилированным, он обычно содержит 1- 5 молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ), например, 1, 2 или 3 молекулы ПЭГ. Каждая молекула ПЭГ имеет молекулярную массу, примерно, от 5 кДа (килоДальтон), примерно, до 100 кДа, например, молекулярная масса составляет около 10-40кДа, около 12 кДа или, предпочтительно, не более 20 кДа.
Подходящие молекулы ПЭГ выпускаются фирмами Shearwater Polymers, Inc. и Enzon, Inc., и их можно выбрать из SS-PEG, NPC-PEG, альдегид-ПЭГ, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC, SC-PEG, трезилированный mPEG (Патент США 5880255), или оксикарбонил- окси- N- дикарбоксиимид- ПЭГ (Патент США 5122614).
В особом варианте изобретения вышеупомянутый агонист [Lys 13, Gln34]PP можно ПЭГилировать по Lysl3 с образованием: [N- PEG5000- Lysl3,Gln34]PP (SEQ ID No: 40) или [Alal,Glu4,Lysl8,Arg26, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:25) можно ПЭГировать no Lysl8.
Сывороточный альбумин, GAG и ПЭГ
Вне зависимости от того, осуществляется ли модификация агониста за счёт присоединения групп для того, чтобы способствовать связыванию сывороточного
альбумина, GAG- связыванию или повысить устойчивость с помощью ПЭГилирования, мотив связывания сывороточного альбумина, или мотив GAG- связывания, или ПЭГ радикал может являться боковой цепью или образовывать часть боковой цепи при каркасном углероде агониста, соответствующем любому из следующих положений PYY или РР: 1, 3, б, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32, соответствующем любому из следующих положений NPY: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.
Конъюгация с биомолекулами большего размера
Как описывается выше, можно присоединять некоторые мотивы в различных положениях в РР-складчатом пептиде или РР-складчатом пептиде- миметике, не ослабляя их высокую Y- рецепторную аффинность (см. примеры). Аналогичным образом комбинированные селективные в отношении Y2- Y4 рецепторов агонисты можно использовать в качестве химерных (гибридных, слитых) белков, в которых они связаны, например, с альбумином или молекулой другого белка или носителя, что обеспечивает благоприятную фармакокинетику или другие свойства, например, пониженное выведение почками. Как известно в технике, существует множество химических модификаций и линкеров, которые можно использовать для такого ковалентного соединения, так же как молено использовать множество белков или носителей. Особенно предпочтительно ковалентное присоединение селективного Y2-Y4 пептидного агониста к альбумину и в одном из пололеений РР-складчатой структуры, которое указано в другом месте данного описания в связи с модификациями с помощью различных мотивов. Такие гибридные белки можно получать различными полусинтетическими методами, когда пептид молено получать пептидным синтезом по данному описанию, а биомолекулу - методом рекомбинантной ДНК. Гибридный белок можно также получать целиком как рекомбинантную молекулу, экспрессированную, например, в виде молекулы-предшественника, удлинённую за счёт последовательности Gly-Lys-Arg, которая, будучи экспрессирована в виде секреторного белка в эукариотических клетках, отщепляется биосинтетическими ферментами и Gly превращается в карбоксамид на С-концевом остатке Туг С-концевой последовательности Y2- рецепторного распознавания.
Стабилизация
Как указывается в разных местах в данном описании, многие из селективных Y2-Y4 агонистов по настоящему изобретению стабилизируются различными способами, например, N- концевым ацилированием или замещением каркасных участков агониста на
непептидный линкер, или внутренней циклизацией за счёт мостиковых связей для стабилизации РР-складчатой структуры. Эта стабилизация в большинстве случаев служит двум целям, причём одной целью является презентировать эпитопы рецепторного распознавания оптимальным образом в отношении Y2 и Y4 рецепторов за сёт сохранения РР-складки; а второй целью является стабилизация пептида против расщепления, т.е., главным образом, против протеолитического расщепления. Это особенно важно, когда селективные Y2-Y4 агонисты также модифицированы для того, чтобы продлить период полужизни, достичь пролонгированного высвобождения и/или продолжительной экспозиции с тканями, за счёт присоединения различных мотивов, обсуждавшихся выше. Обычно пептидные агонисты очень быстро выводятся, главным образом, через почки, и устойчивость белка как таковая может быть неважна; однако, когда присутствие пептида в различных жидкостях организма продлевается одним или более способами на несколько часов, особенно важно, чтобы биологическая активность пептида также оставалась интактной, т.е. чтобы пептид стабилизировался в форме, устойчивой к протеолитическому воздействию, описанному как вообще, так и в отношении специфических примеров селективных Y2-Y4 пептидов- агонистов, например, РР-складчатых стабилизированных, циклических [Cys2,D- Cys27]PP и их различных аналогов. Так, в предпочтительных вариантах изобретения объединенные Y2- Y4 селективные агонисты как стабилизированы структурно, с помощью структурных изменений, некоторые из них конкретно указаны в представленных ниже примерах, так и "декорированы" различными мотивами и/или слиты с биомолекулами и/или приготовлены фармацевтическими методами, которыми добиваются продолжительного высвобождения и т.д., для пролонгированной экспозиции с рецептором.
Пептиды, индуцирующие спираль
Ацилирование по N- концу агонистов, которые рассматривает данное изобретение, упоминалось как способ стабилизации агониста против действия аминопептидаз. Другая стабилизирующая модификации включает ковалентное присоединение стабилизирующей пептидной последовательности из 4-20 аминокислотных остатков ковалентно на N- и/или С-конце, предпочтительно, на N-конце. Аминокислотные остатки в таком пептиде выбирают из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met и т.д. В интересном варианте изобретения присоединяемый N- концевой пептид содержит 4, 5 или 6 остатков Lys, например, Lys- Lys- Lys- Lys- Lys- Lys- [Gln34PP} (SEQ Ш N0:29). Они могут присоединяться на N- конце РР- складчатого пептидного агониста или они могут быть помещены на N- конце усечённого по N- концу РР
складчатого агониста- миметика, или укороченного на N- конце РР-складчатого агониста-миметика, если спейсерный пептид вводится между новым N- концом стабилизирующего пептида. Общее описание таких удлинений (расширений) стабилизирующего пептида дано в Международной заявке WO 99/46283 (Zealand Pharmaceuticals), которая вводится в данное описание в качестве ссылки.
Рецепторные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретению, можно получать общеизвестными методами, например, синтетическими, полусинтетическими и/или методами рекомбинантной ДНК. Способы включают стандартные методы получения пептидов, такие, например, как синтез в растворе и твердофазный синтез. Руководствуясь учебником и общими знаниями в данной области техники, специалист в этой области поймёт, как получать агонисты и их производные и модификации.
Далее описаны конкретные агонисты по изобретению наряду с их молекулярными фармакологическими свойствами, а также химическими свойствами и описанием устойчивости пептидов.
[IIe31,GIn34)PP (SEQ ID No: 5)
Этот пептид является аналогом РР, созданным с целью достижения высокой аффинности к Y2 рецептору путём введения Не в положение 31 и Gin в положение 34, соответствующих остаткам, обнаруженным в этих положениях в NPY (Fuhlendorff et al. JBC 1990,265: 11706- 12).
Профиль рецепторного распознавания- [Ile31 ,Gln34]PP имеет выражаемую однозначным числом наномолярную активность к человеческому Y4 рецептору (IC50 = 1.2 нМ), сходную с аффинностью РР (IC50 = 0.5 нМ), а аффинность [Ile31 ,Gln34]PP к Y2 рецептору 54 нМ, a IC50 в отношении Y1 рецептора составляет более 1000 нМ - и, соответственно, [He31,Gln34]PP является селективным Y2-Y4 агонистом по сравнению с Y1 рецептором (Таблица 1). Величины аффинности к Y рецепторам сообщались ранее, в то время был доступен только Y4 рецептор крысы, где было показано, что аффинность [Ile31,Gln34]PP равна около 50 нМ к Y4 рецептору крысы, что, примерно в 100 раз ниже аффинности РР (Fuhlendorff et al. JBC 1990, 265: 11706-12, Schwartz et al. NYAC, 1990, 611: 35-47). Что касается активности, [He31,Gln34]PP проявляет in vitro активность в случае Y4 рецептора 0.91 нМ (величина ЕС50), в отношении Y2 рецептора ЕС50 6.5 нМ и в отношении Y1 рецептора величина ЕС50 составляет 48 НМ (Таблица 2). Таким образом, по сравнению с ранее опубликованными данными по аффинности (Fuhlendorff et
al. JBC 1990, 265: 11706- 12, Schwartz et al. NYAC, 1990, 611: 35-47) удивительным является то, что [Ile31,Gln34]PP на самом деле является агонистом с активностью, выражаемую однозначным числом, как против Y2, так и против Y4 рецептора, в отличие от выражаемой двузначным числом активности в отношении Y1 рецептора. Устойчивость белка - аналогична устойчивости РР1- 36.
[VaI31,Gln34]PP (SEQ ID No: 6)
Так же как и [Ue31,Gln34]PP (SEQ Ш No: 5), этот пептид является РР аналогом, созданным с целью достижения высокой аффинности к Y2 рецептору, но при сохранении высокой аффинности к Y4 рецептору, однако, в данном случае путём введения Val в положение 31, соответствующего остатку, находящемуся в PYY в этом положении, и, опять же, Gin в положение 34, соответствующего остатку, обнаруженному в этом положении в NPY и PYY. Это новое соединение.
Профиль рецепторного распознавания - Аффинность [Val31,Gln34]PP к Y4 рецептору составляет 0.93 нМ, а к Y2pe4enTopy - 69 нМ, тогда как аффинность к Y1 рецептору не удаётся измерить даже при концентрациях > 1000 нМ (Таблица 1) - Таким образом, [Val31,Gln34]PP является Y2-Y4 селективным лигандом. Что касается in vitro активности, [Val31,Gln34]PP имеет величину ЕС50 1.0 нМ в отношении Y4 рецептора и 9.9 нМ в отношении Y2 рецептора, тогда как его активность в отношении Y1 рецептора составляет 99 нМ (Таблица 2).
Устойчивость белка- аналогична устойчивости РР1- 36.
[Gln34]PP (SEQ ID No: 4)
Так же как [Ile31,Gln34]PP (SEQ Ш No: 5) и [Val31,Gln34]PP (SEQ ГО No: 6), этот пептид является РР аналогом, созданным с целью достижения высокой аффинности к Y2 рецептору, однако, в данном случае, за счёт введения одного лишь Gin в положение 34, соответствующего остатку, обнаруженному в этом положении как в NPY, так и в PYY. Вследствие того, что положение 34 не является важным для распознавания РР Y4 рецептором, пептид проявляет двойственную высокую аффинность к Y2 и к Y4 рецепторам. В бычьем РР Gin вводят в положение 34, и обнаружено, что его аффинность к Y4 рецептору очень сходна с аффинностью самого бычьего РР, но этот пептид не испытывался в отношении Y2 рецептора (Gehlert et al 1996 Mol Pharmacol. 1996 50: 1128). В настоящем изобретении сделана замена Pro на Gin в человеческом РР1-36 и показано, что [Gln34]PP неожиданно имеет высокую аффинность к Y2 рецептор)', сходную с аффинностью NPY и PYY, и что он не связывается с Y1 рецептором. Таким
образом, [Gln34]PP (т.е. [ОЬ34]человеческий РР1-36) является новым соединением, селективным к Y2 и Y4 рецептору в отличие от Y рецептора.
Профиль рецепторного распознавания - Аффинность связывания [Gln34]PP с Y4 рецептором равна 1.2 нМ, а с Y2 рецептором - 9.0 нМ, тогда как аффинность к Y1 рецептору не удаётся измерить даже при концентрациях > 1000 нМ (Таблица 1). Что касается in vitro активности, [Gln34]PP имеет величину ЕС50 1.1 нМ в отношении Y4 рецептора и 3.0 нМ в отношении Y2 рецептора, тогда как его активность в отношении Y1 рецептора составляет 388 нМ (Таблица 2).
Устойчивость белка- аналогична устойчивости РР1- 36.
In vivo селективность рецептора- В исследовании с эскалацией дозы [Gln34]PP вводили внутривенным вливанием анестезированным собакам с последующей 30-минутной инфузией в дозах 0.3, 1, 3, 10, 30 и 100 мкг/кг. Уровни [Gln34]PP в плазме измеряют радиоиммунным анализом, который показывает линейную зависимость от дозы. При наивысших дозах уровни в плазме 100 нМ получают у собак. Тем не менее, никакого зависящего от дозы действия ни на кровяное давление, ни на частоту сердечных сокращений не наблюдают. Хорошо известно, что NPY и PYY, которые являются агонистами как к Y1, так и к Y2 рецепторам, при значительно более низких уровнях в плазме повышают кровяное давление. Таким образом, эти эксперименты показывают, что [Gln34]PP также in vivo является высокоселективным пептидом в отсутствие измеримой Y1- рецепторной активности.
In vivo действие на срочный приём пищи у мышей - PYY3-36, [Gln34]PP или физиологический солевой раствор вводят в виде подкожных инъекций группам из 8 мышей в дозах 3 или 30 мкг (PYY3-36) или 1 и 10 мкг ([Gln34]PP) каждому животному после 16 часов в отсутствие пищи. На Фиг.2 показано аккумулированное потребление пищи у мышей. PYY3-36 в дозе 30 мкг ингибирует потребление пище в течение первых двух часов, но действие постепенно ослабевает в последующие 2-6 часов. [Gln34]PP проявляет более выраженный и продолжительный ингибирующий эффект в отношении потребления пищи у мышей, чем PYY3-36. Так, даже в дозе 1 мкг наблюдается более эффективное ингибирование потребления пищи и этот эффект длится более 8 час. Фиг. 2. Таким образом, [Gln34]PP, который в 10 раз менее активен в отношении Y2 рецептора, как определено in vitro анализами (значения ЕС50 3.0 по сравнению с 0.24 для PYY3-36, Таблица 2), тем не менее, очевидно, более активен и оказывает более продолжительное действие на срочный приём пищи у мышей, предположительно, благодаря его действию также в качестве Y4 агониста.
[Gln34]PP может - по аналогии с другими представленными в данном описании примерами пептидов - модифицироваться далее для различных фармакокинетических или других целей, при этом сохраняя общую Y2- Y4 селективность по сравнению с Y1. Например, остатки Met в положении 17 и/или 30 можно заместить например, на Leu или Ме, один или более Lys или других, предрасположенных к присоединению, остатков можно ввести в различные положения для введения различных мотивов и т.д. При этом можно получить группу селективных Y2-Y4 пептидных агонистов, из которых можно выбрать соединения в качестве лекарств для лечения ожирения и т.д., представленные в другом месте данного описания.
[Leu30,Gln34]PP (SEQ ID No: 7), [Nle30,Gln34]PP (SEQ ID No: 8), [Leu28,GIn34]PP (SEQ ID No: 9), [His26,Gln34]PP (SEQ ID N0:10)
Так же как [He31,Gln34]PP (SEQ ГО No: 5) и [Val31,Gln34]PP (SEQ ID No: 6) эти пептиды являются аналогами РР, созданными с целью высокой аффинности к Y2 рецептору, однако, в этих случаях замена Рго34 на Gin совмещается с заменой других не-NPY / не-PYY остатков в С- концевой последовательности РР: Met30 на Leu (как в NPY и PYY), или Пе28 на Leu (как в PYY, NPY имеет Не, как РР), или Arg26 на His (как в NPY и PYY). Например, замена Met30 на Leu или Nle имеет то преимущество, что она исключает возможность окисления природного остатка Met. [Leu30,Gln34]PP, [Nle30,Gln34]PP, [Leu28,Gln34]PP и [His26,Gln34]PP представляют собой новые соединения.
[Ile3,Gln34]PP (SEQ ID NO:ll)
[Ile3,Gln34]PP представляет собой пептиды, модифицированные как на С, так и на N- конце каркаса РР с целью получить объединённую (общую) Y2-Y4 селективность относительно Y1. Так же как, например, [Ile31,Gln34]PP и |Val31,Gln34]PP, этот пептид являются аналогом РР, созданным с целью получения высокой аффинности к Y2 рецептору, однако, в этом случае замена Рго34 на Gin совмещается с заменой других не-NPY / не- PYY остатков в N- концевой последовательности РР: Leu3 на Не (как в PYY - в NPY это Ser). [Ile3,Gln34]PP является новым соединением.
[Alal,Glu4,Arg26,Met30]PYY (SEQ ID NO:12).
Этот пептид представляет в данном описании группу аналогов PYY и NPY, в которых один или более не- РР остатков на N- и/илиг С- конце (концах) заменяе(ю)тся остатком(амии), имеющимися в РР, с целью получения заданной общей Y2-Y4 селективности относительно Yl. [Alal,Glu4,Arg26,Met30]PYY создан с целью получения
высокой аффинности к Y4 рецептору за счёт введения в целом четырёх РР- подобных остатков в С- и N-концевые последовательности. Остаток Pro не вводится в положение 34, так как это оказывает большое влияние на аффинность пептидов к Y2 рецептору, хотя и повышает аффинность пептидов к Y4 рецептору. [Alal,Glu4,Arg26,Met30]PYY является новым соединением.
Профиль рецепторного распознавания- [Alal,Glu4,Arg26,Met30]PYY проявляет высокую активность в отношении стимулирования человеческого Y2 рецептора (ЕС50 = 1.0 нМ) и человеческого Y4 рецептора (ЕС50 = 1.4 нМ), тогда как его активность в отношении человеческого Y1 составляет лишь 87 нМ (Таблица 2).
Устойчивость белка- аналогична устойчивости PYY1- 36.
[Alal,Glu4,Arg26,Met30]PYY можно - по аналогии с другими представленными в данном описании примерами пептидов - модифицировать далее для различных фармакокинетических или других целей, при этом сохраняя общую Y2-Y4 селективность по сравнению с Y1. Например, остатки Met в положении 17 и/или 30 можно заместить например, на Leu или Nle, один или более Lys или других, предрасположенных к присоединению, остатков можно ввести в различные положения для введения различных мотивов и т.д. При этом можно получить группу селективных Y2- Y4 пептидных агонистов, из которых можно выбрать соединения в качестве лекарств для лечения ожирения и т.д., представленные в другом месте данного описания.
[Alal,Glu4]PYY(SEQ ID NO:14), [Arg26,Met30]PYY (SEQ ID NO:16), [GIu4,Met30]PYY (SEQ ID NO:18), [Glu4,Arg26]PYY (SEQ ID N0:20)
Эти новые пептиды, наряду с [Alal,Glu4,Arg26,Met30]PYY, представляют собой группу пептидных агонистов на основе PYY или NPY, в которых на С- и/или на N-концах заменены остатки, чтобы получить селективность к Y2 плюс Y4 рецепторам в отличие от Y1 рецептора. Тем самым, и вместе с другими пептидами на основе РР, получены многообразные пептиды, из которых можно выбрать пептиды с оптимальным сочетанием высокой активности в отношении Y2 и Y4 с меняющейся активностью в отношении Y1 с целью использования в качестве лекарств против ожирения и т.д.
Профили рецепторного распознавания - в качестве примеров в Таблице 1 показано, что аффинность [Arg26,Met30]PYY к Y2 и Y4 рецепторам составляет 0.13 нМ и 2.3 нМ, соответственно, в отличие от аффинности к Y1 рецептору, равной 65 нМ. Другой пример, аффинность PYY к Y1 рецептору снижается с 16 нМ до 367 нМ при замене Glu вместо Lys в положении 4 и Arg вместо His в положении 26 в [Glu4,Arg26]PYY, в то же
время за счёт этих замен повышается аффинность к Y4 с 30 нМ (для PYY) до 3.3 нМ для [Glu4,Arg26]PYY, таким образом создаётся "окно селективности" более чем в 100 раз (Таблица 1).
[Cys2,D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID NO:22)
Здесь данный аналог РР представляет группу Y2- Y4 селективных агонистов, в которых повышенная устойчивость белка [Cys2,D-Cys27]PP пептида сочетается с двойной селективностью в отношении Y2 и Y4 в сравнении с Y1 рецепторной селективностью пептида [Gm34]PP. Это новое соединение. На основании рассмотрения вышеприведённых пептидов ясно, что этот пептид можно модифицировать далее для различных фармакокинетических или других целей, при этом сохраняя общую Y2- Y4 селективность по сравнению с Y1. Например, остатки Met в положении 17 и/или 30 можно заместить например, на Leu или Nle, один или более Lys или других, предрасположенных к присоединению, остатков можно ввести в различные положения для введения различных мотивов и т.д. При этом можно получить группу селективных Y2- Y4 пептидных агонистов, из которых можно выбрать соединения в качестве лекарств для лечения ожирения и т.д., представленные в другом месте данного описания.
[Cys2,Aoc-24,D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID NO:23)
В данном РР аналоге двойная рецепторная специфичность [Gln34]PP встроена в малый подходящий аналог РР типа [Cys2,Aoc-24,D-Cys27]PP. Это новое соединение.
Клинические показания
У2Л74-специфические агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, важны для лечения состояний, откликающихся на активацию Y2 и/или Y4 рецепторов. Такие состояния включают состояния, для которых показаны регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм, контроль интестинальной секреции или индукция ангиогенеза. Для применения в каждом таком случае агонист может включать модификацию или мотив, которые придают устойчивость к пептидазам, свойства связывания с сывороточным белком, или ПЭГилирование для того, чтобы продлить период полужизни в сыворотке и/или в ткани. Главным образом, для индукции ангиогенеза агонист может содержать GAG- связывающий мотив для продления периода полужизни в тканях и экспозиции с Y рецептором.
Заболевания или состояния, при котом показана регуляция потребления энергии или энергетический метаболизм, включают ожирение и избыточный вес и состояния, при
которых ожирение и избыточный вес рассматриваются как способствующие факторы, такие как булимия, нейрогенная булимия, Синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), гипергликемия, устойчивость к инсулину, нарушенная толерантность к глюкозе, сердечно- сосудистое заболевание, гипертензия, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемия, гиперлипидемия, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.
Заболевания или состояния, при которых показана регуляция интестинальной секреции, включают различные формы диареи или кишечную гиперсекрецию.
Заболевания или состояния, при которых показана индукция ангиогенеза, включают заболевание периферических сосудов, заболевание коронарных сосудов, инфаркт миокарда, удар, состояния, при которых всё вышеперечисленное рассматривается как способствующий фактор, заживление ран и восстановление тканей.
1. Ожирение и избыточный вес
Было показано, что PYY3-36 снижает аппетит, потребление пищи и вес тела у различных у различных грызунов при периферическом введении (Batterham et al. Nature 2002, 418: 595-7; Chaflis et al. BBRC Nov. 2003, 311: 915-9), а также для снижения аппетита у человека также при периферическом введении (Batterham et al 2002). Данные на животных, включая исследования нокаутированных по рецептору животных, чётко показывает, что это действие PYY3-36 опосредуется с помощью Y2 рецепторов и NPY/AgRP и РОМС нейронов в дугообразном ядре. Сообщалось, что уровни PYY и пищевая реакция на PYY часто ниже у субъектов, страдающих ожирением, и находятся в обратной корреляции с их BMI (индексом массы тела). Важно отметить, что субъект, страдающий ожирением, не резистентен к действию PYY, так как инфузия PYY3-36 в течение 90 минут снижает потребление пищи у субъектов, страдающих ожирением, аналогичным образом в течение длительного времени (Batterham et al. 2003, NEJM349: 941-48).
Накопленные в последних исследованиях на животных многочисленные данные показывают, что РР является мощным и эффективным анорексигенным пептидом при периферическом введении peripherally (Asakawa et al. Peptides 1999, 20; 1445-8; Katsuura
et al. Peptides 2002, 23: 323-9; Asakawa et al. Gastroenterology 2003,124: 1325-36). Так как РР не оказывает влияния на аппетит, потребление пищи и т.д. у нокаутированных по Y4 животных, весьма вероятно, что РР действует с помощью Y4 рецептор, снижая аппетит и потребление пищи (Batterham et al. 2004, тезисы S3.3 from International NPY symposium in Coimbra Portugal). РР также оказывает влияние на потребление пищи у животных, чьё ожирение вызвано диетой. РР рецепторы обнаружены в основном в стволе мозга в двигательных нейронах блуждающего нерва и в ядрах одиночного пучка (NTS), каждый из которых является поверхностью, где гематоэнцефалический барьер неэффективен и где гормоны кровотока, такие как РР, могут получить доступ к нейронам. Весьма вероятно, что Y4 рецепторы в NTS в стволе мозга являются основной мишенью, через которую действует РР, подавляя аппетит и потребление пищи. Однако, последние результаты также указывают на возможность того, что РР могут действовать с помощью Y рецепторы в дугообразном ядре, возможно, на РОМС, а, возможно, также на NPY/AgRP нейронах (Batterham et al. Coimbra NPY meeting abstract S3.3). Низкие уровни РР обнаружены у субъектов, страдающих ожирением, особенно у субъектов с синдромом Прадера- Вилли (Zipfet al. J.C.E.M.1981, 52: 1264-6, Hoist et al 1983, Int. J. Obes. 7: 52938; Glaser et al Horm. Metab. 1988, 20: 288-92) , а высокие уровни РР обнаружены у пациентов с нейрогенной анорексией. Важно отметить, что инфузия РР человеку понижает аппетит и потребление пищи в течение до 24 часов (Batterham et al. JCEM 2003, 88: 3989-92). Таким образом, действие РР на потребление пищи наблюдают после того, как уровни РР в кровотоке вернулись к нормальным значениям. Такое продолжительное действие на аппетит и т.д. хорошо известно также после инъекции ICV, особенно AgRP. Важно отметить, что также показано, что инфузия РР снижает потребление пищи у больных с синдромом Прадера- Вилли, страдающих вызванным болезнью ожирением (Berntson et al 1993 Peptides 14: 497-503).
Вследствие того, что действие PYY с помощью Y2 рецепторов - ингибирование стимулирующих NPY/AgRP нейронов - возможно, главным образом, в дугообразном ядре, а действие РР с помощью Y4 рецепторов, по- видимому, стимуляция ингибирующих РОМС нейронов, главным образом, в области пострема и в NTS в стволе мозга, но также в дугообразном ядре (Batterham et al 2004 International NPY symposium, Coimbra abstract S3.3), общий эффект Y2 агониста и Y4 агониста является аддитивным или даже синергическим эффектом, т.е. более эффективное действие достигается при совместном лечении, чем при лечении каждым из них по отдельности.
Известно, что сам по себе PYY при периферическом введении является сильным рвотным средством, на самом деле, PYY был открыт - "во второй раз" - в 1989 году, как
биологически активный компонент в хроматографической фракции интестинального экстракта, вызывающий рвоту у собак (Harding and McDonald 1989 Peptides 10: 21-24). Был сделан вывод, что PYY является наиболее мощным идентифицированным пептидом в кровотоке, вызывающим рвоту, и что этот эффект опосредуется с помощью области пострема, известной тем, что она имеет "негерметичный" гематоэнцефалический барьер. Также сообщалось, что PYY3-36 может вызывать тошноту при периферическом введении людям (Nastech press release 29th of June 2004). С физиологической точки зрения кажется логичным, что PYY, и биологически активные продукты его превращения, который обычно сначала секретируется в больших количествах в процессе приёма большого количества пищи, или когда происходит демпинг (сбрасывание) пищи в нижние отделы кишечника в результате различных хирургических вмешательств, способен вызывать рвоту, чтобы избавить субъекта от ситуации явного переедания. Интересно, что в статье было отмечено, что РР в сходных дозах не вызывает рвоты у этих собак (Harding and McDonald 1989). РР действует с помощью Y4 рецепторов, также расположенных в области пострема ствола мозга, но не вызывает рвоту. Большие дозы комбинированных Y2-Y4 пептидных агонистов, таких как [Gln34]PP, можно вводить животным, таким как обезьяны циномолгус (супо), достигая уровня в плазме 12-13 нМ, не наблюдая никакой рвоты у животных и никаких побочных эффектов со стороны ЖКТ. Это является неожиданным, так как [Gln34]PP имеет относительно высокую активность в отношении Y2 рецептора, к которому PYY3- 36 является полностью селективным. Так, неожиданно, комбинированный Y2-Y4 селективный агонист не вызывает рвоты в той же степени, в какой селективный Y2 агонист - соединение PYY3-36 - вызывает. Очевидно, Y4-рецепторная активация, предположительно, в области пострема, предупреждает рвотное действие Y2 активации того же соединения. Это свойство комбинированного Y2-Y4 селективного агониста является очень благоприятным для лечения ожирения и связанных с ним состояний.
Следовательно, Y2/Y4 селективные агонисты, которые рассматриваются в настоящем изобретении, пригодны для применения для субъекта, такого как млекопитающее, включая человека, чтобы регулировать потребление энергии. Соответственно, изобретение относится к способам изменения потребления энергии, потребления пищи, аппетита и расхода энергии. В данном описании раскрывается способ уменьшения потребления энергии или пищи путём введения субъекту косметически или терапевтически эффективного количества такого агониста. В одном варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к снижению количества, или общего веса, или
общего объёма, или калорийности (содержания калорий) пищи. В другом варианте изобретения это может вызывать снижение потребление компонента пищи, например, снижение приёма липидов, углеводов, холестерина или белков. В некоторых других способах по данному описанию могут вводиться предпочтительные соединения, которые подробно обсуждаются в данном описании. В дополнительном варианте изобретения раскрывается способ снижения аппетита путём введения терапевтически эффективного количества такого агониста. Аппетит можно измерять (определять) любыми способами, известными специалисту в данной области техники.
Например, пониженный аппетит можно определять с помощью физиологической оценки. В таком варианте изобретения введение рецепторного агониста приводит к изменению чувства голода, насыщения и/или сытости. Голод можно оценивать любыми способами, известными специалисту в данной области техники. В одном варианте изобретения голод оценивают с помощью физиологических анализов, таких как оценка чувства голода и сенсорного восприятия, используя, например, анкету.
В другом варианте изобретения раскрывается способ снижения моторики верхних отделов ЖКТ, например, замедление опорожнения желудка. Способ включает введение терапевтически эффективного количества такого агониста субъекту, тем самым снижается моторика ЖКТ. Общеизвестно, что соединения, которые замедляют опорожнение желудка, также оказывают благотворное действие при снижении потребления пищи, так как субъект чувствует насыщение или сытость. Известно, что как PYY3- 36, прототип Y2 агониста, так и РР, прототип Y4 агонистов, замедляют опорожнение желудка. Комбинированный Y2-Y4 агонист оказывает аддитивное или даже синергическое действие при ингибировании моторики верхних отделов ЖКТ.
В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию изменения энергетического метаболизма у субъекта. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества такого агониста, тем самым изменяется расход энергии. Энергия сжигается в физиологических процессах. Организм может непосредственно изменять расход энергии, модулируя эффективность этих процессов или изменяя количество или природу протекающих процессов. Например, в процессе пищеварения повышается энергия в организме при прохождении через пищеварительный тракт и усвоении пищи, и в клетках, при этом эффективность клеточного метаболизма может меняться, выделяя больше или меньше тепла. В другом варианте изобретения раскрывается способ по данному описанию любых и всех манипуляциях дугообразной цепи, описанных в данной заявке, которые согласованно изменяют потребление пищи и соответственно изменяют расход энергии. Расход энергии является результатом
клеточного метаболизма, белкового синтеза, интенсивности обмена веществ и усвоения калорий. Таким образом, периферическое введение приводит к повышенному расходу энергии и пониженной эффективности усвоения калорий. В одном варианте изобретения терапевтически эффективное количество рецепторного агониста по изобретению вводят субъекту, тем самым повышая расход энергии.
В некоторых вариантах изобретения как при терапевтическом, так и при косметическом применении Y2/Y4 селективный агонист можно использовать для контроля веса и лечения, снижения или предупреждения ожирения, в частности, для достижения одного или более из нижеприведённых результатов: предупреждение и снижение увеличения массы тела; индукция и промотирование потери веса; и уменьшение ожирения, определяемого с помощью индекса массы тела. Как указано выше, изобретение также относится к применению Y2/Y4 селективного агониста для регуляции одного или более чувств: аппетита, сытости или голода, в частности, одного или более из нижеперечисленного: индукции, увеличения, повышения и промотирования сытости и ощущения насыщения; и уменьшения, ингибирования и подавления голода и ощущения голода. Это раскрытие относится далее к применению Y2/Y4 селективного агониста для поддержания одного или более из нижеперечисленного: заданного веса тела, заданного индекса массы тела, желаемого внешнего вида и хорошего здоровья.
В другом, или альтернативном, аспекте данное изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения пониженного энергетического метаболизма, нарушений питания, нарушения аппетита, избыточного веса, ожирения, булимии, нейрогенной булимии, Синдрома X (метаболического синдрома), или связанных с этим осложнений или рисков, включая диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно- сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, застойную сердечную недостаточность, удар, инфаркт миокарда, тромбоэмболические заболевания, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезни желчного пузыря, остеоартрит, остановка дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки, причём способ заключается во введении субъекту, такому как млекопитающее, включая человека, эффективной дозы одного или более Y2/Y4 селективных агонистов по данному описанию.
2. Кишечная гиперсекреция
Известно, что как NPY, так и PYY оказывают антисекреторное действие как на тонкий, так и на толстый кишечник. С помощью исследований, проведённых на выделенных тканях человеческой толстой кишки, было продемонстрировано, что это действие опосредуется как Y1, так и Y2 рецепторами, а с помощью ТТХ было показано, что основная часть Y2 компонента опосредуется с помощью нейронного компонента (Сох & Tough 2001 Br. J. Pharmacol. 135: 1505-12). РР также оказывает сильное антисекреторное действие, и оно, очевидно опосредуется Y4 рецепторами, расположенными на эпителиальных клетках, а не по нейронным механизмом (Сох & Tough 2001). Таким образом, вследствие аналогичного эффекта, но опосредуемого другими механизмами, комбинированный Y2- Y4 агонист оказывает аддитивное или даже синергическое антисекреторное действие на ЖКТ. Было показано in vivo, что периферическое введение PYY может вызвать продолжительную реакцию на кишечную секрецию, индуцированную вазоактивным кишечным полипептидом у людей с илеостомией (Playford et al 1990 Lancet 335: 1555-57). Был сделан вывод, что PYY пептид может быть терапевтическим агентом против диареи, однако, например, натрийуретический и гипертензивный эффекты комбинированного Y1 и Y2 агониста препятствуют этому. Комбинированные селективные Y2-Y4 агонисты по настоящему изобретению особенно применимы для лечения или защиты против гиперсекреции ЖКТ, включая различные формы диареи, вне зависимости от того, вызваны они непосредственно гиперсекрецией или нет. Одно особенно интересное показание представляет собой гиперсекрецию у пациентов с илеостомией, которые часто теряют большие количества жидкости.
2. Терапевтический ангиогенез
Ряд in vitro исследований влияния на рост клеток сосудов гладких мышц гипертрофию вентрикулярных кардиомиоцитов, а также на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток наводят на мысль, что NPY может действовать как ангиогенный фактор (Zukowska- Grojek et al. 1998 Circ. Res. 83: 187-95). Важно отметить, что исследования in vivo как на мышиной модели корнеальных микрокарманов, так и анализ хорион- аллантоисной мембраны (САМ) цыплят подтвердили, что NPY является мощным ангиогенным фактором, который приводит к возникновению васкулярных структур, подобных сосудистому дереву, с проявляющейся вазодилатацией, как наблюдалось в ином случае только для фактора роста фибробластов-2 (FGF-2), а не на примере ангиогенных структур сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР, VEGF) (Ekstrand et al. 2003 PNAS 100: 6033-38). При развитии эмбрионов цыплят NPY
индуцировал прорастание сосудов из ранее имевшихся кровеносных сосудов. Действие NPY не наблюдается у животных, нокаутированных по Y2 рецептору, это указывает, что Y2 рецептор отвечает за ангиогенный эффект NPY (Ekstrand et al. 2003). Это замечание подтверждается также наблюдениями, показывающими, что Y2 рецептор является высокоактивированным в ишемических сосудах, и фермент, который генерирует эндогенный, селективный Y2 лиганд PYY3-36, дипептидилпептидазу-Г/, также является высокоактивированным. Пептиды по настоящему изобретению, все, представляют собой Y2 агонисты, имеющие, по меньшей мере, дополнительное свойство - являться также Y4 агонистами и быть селективными, в то же время они являются слабыми агонистами Y1. Таким образом, свойство этих пептидов быть Y2 агонистами делает их пригодными в качестве терапевтических ангиогенных агентов, a Y4 агонизм оказывает благотворное действие на снижение или избавление от нежелательной стимуляции тошноты или рвоты, как известно, ассоциируемых с высокими уровнями Y2 агонистов в плазме.
При различных- сердечно- сосудистых заболеваниях, например, таких как атеросклероз, считается, что в периферических сосудах, а также в коронарных сосудах индукция ангиогенеза является благотворной. Также считают, что индукция благотворна для обеспечения реперфузии после инфаркта микарда. Полагают, что FGF-2 является эффективным агентом для индукции ангиогенеза у пациентов с сердечно- сосудистыми заболеваниями. Однако, подобно большинству ангиогенных факторов, FGF-2 является фактором роста и может также стимулировать рост опухолей, вызывая ангиогенез. Как представлено выше, NPY, действующий через Y2 рецепторы, индуцирует неоваскуляризацию типа, аналогичного неоваскуляризации, индуцируемой FGF-2, однако, NPY является нейропептидом, а не классическим фактором роста и не вызывает осложнений в виде индукции роста опухоли, таким образом, Y2 агонист является агентом, пригодным для терапевтического ангиогенеза. Однако, особенно важно для такого применения то, что агонист не проявляет Y1-рецепторного агонизма, так как это оказывало бы нежелательное действие на сердечно- сосудистую систему. Это означает, что пептиды, которые рассматриваются в данном изобретении, являющиеся Y2 селективными рецепторными агонистами, являются особенно подходящими терапевтическими агентами с учётом того, что они вызывают ангиогенез. Они особенно применимы после модификации с присоединением GAG-связывающего мотива, обсуждавшегося выше. Дальнейшее уточнение: Действие FGF-2, как действие большинства классических факторов, частично опосредуется или регулируется с помощью их связывания с гликозаминогликаном (GAG) во внеклеточной матрице. Это связывание с GAG гарантирует, что ангиогенный фактор действует в соответствующем
пространстве и времени и что он не скоро вымывается из ткани. Для применения в терапевтическом ангиогенезе малых пептидов и пептидов- миметиков, таких как описанные в настоящем изобретении, это особенно важно. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения пептиды включают один или более GAG-связывающих мотивов, которые гарантируют, что они присоединятся к GAG во внеклеточной матрице, с целью индуцировать оптимальный ангиогенез после введения. Это можно осуществлять, например, внутривенным или внутриартериальным введением, или, например, можно вводить непосредственно в коронарные артерии, чтобы индуцировать ангиогенез в сердце при болезни коронарной артерии и/или после острого инфаркта миокарда. Аналогично, такое соединение можно вводить внутриартериальной инъекцией в бедренную артерию для лечения болезни периферических сосудов. Его можно также, например, применять для топического, местного введения в кожные поражения, чтобы стимулировать более быстрое заживление ран. Продолжительной экспозиции с Y рецептором, эффективной для индукции ангиогенеза, можно также добиться, используя пептид по настоящему изобретению, модифицированный мотивом, связывающим сывороточный альбумин.
Таким образом, в предпочтительном варианте изобретения Y2/Y4 селективные агонисты содержат GAG-связывающий мотив, который вводят в положение, где он не снижает устойчивости пептида или не снижает активности и селективности пептида. Соответственно, в одном варианте данное изобретение относится к применению модифицирующих изменений Y2/Y4 рецепторного агониста в системе ангиогенеза, особенно, для индукции ангиогенеза, такого как ангиогенез, ассоциированный заболеваниями или состояниями, например, такими как сердечно-сосудистые заболевания, включая болезнь периферических сосудов и инфаркт миокарда; процессы репарации тканей, включая заживление ран на коже, воспалительные состояния, включая воспалительные состояния в желудочно-кишечном тракте, такие, например, как язвы, колит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона и т.д.
Специфический вариант изобретения включает применение рецепторного агониста для индукции ангиогенеза в сердце или в кровеносных сосудах, или в тканях, таких как ткань слизистой оболочки, включая слизистую оболочку желудочно- кишечного тракта и кожу.
3. Заживление ран
Сообщалось, что у животных, у которых Y2 рецептор селективно выделяется (элиминирует) за счёт делеции его гена, заживление ран замедляется, и что ухудшается ассоциированная с этим неоваскуляризация (Ekstrand et al. 2003 PNAS 100: 6033-38).
Поэтому селективные Y2- Y4 агонисты по настоящему изобретению применимы для улучшения заживления ран за счёт их свойства - быть агонистами Y2. Для этого пептиды можно вводить различными способами, включая парентеральное введение. Однако, предпочтительным способом применения является топическое введение, например, в виде раствора, дисперсии, порошков, плиток, крема, мази, лосьона, геля, гидрогеля, трансдермальной системы доставки, включая пластыри и т.д. Для топического применения их можно использовать в обычной форме. Однако, в предпочтительном варианте изобретения пептиды модифицируют с помощью одного или более GAG-связывающих мотивов по данному описанию для того, чтобы гарантировать продолжительное местное действие пептида с помощью связывания GAG в ткани.
4. Воспалительное заболевание кишечника
Ранее было описано применение PYY для предупреждения и/или лечения воспалительного заболевания кишечника; см. Международную заявку 03/105763, принадлежащую Amylin Pharmaceuticals, Inc., вводимую в данное описание в качестве ссылки. Следовательно, агонисты по данному изобретению являются также эффективными для лечения или предупреждения воспалительного заболевания кишечника. Соответственно, настоящее изобретение также относится к применению агонистов по данному описанию для тако1 медицинской цели. В представляющем интерес варианте изобретения пептиды содержат один или более GAG- связывающих мотивов, ср. выше.
Дополнительные комментарии относительно применения Y2/Y4 агонистов для лечения или предупреждения ожирения и родственных заболеваний
В процессе еды широкий спектр желудочно- кишечных гормонов и нейромедиаторных систем активируется тщательно согласованно, последовательно или с наложением. Кроме того, компоненты пищи влияют не только на секрецию ЖК гормонов и активность различных путей афферентных нейронов, но эти компоненты пищи, после всасывания, также непосредственно влияют на различные гормоны и центры в ЦНС. Поэтому регуляция потребления пищи и расхода энергии представляет собой в высшей степени сложный и многоаспектный процесс. С этой точки зрения удивительным является, что некоторые гормоны, такие как агонисты Y2, могут на самом деле заметно влиять на систему при введении таким образом, который приводит, например, только к 3-4х- кратным уровням в плазме, которые достигаются в процессе еды.
Частью проблемы является то, что применение таких соединений -комбинированных Y2-Y4 агонистов - вызывает оптимальный эффект, если соединения дают натощак в описанных эффективных дозах. Если Y2-Y4 агонисты дают в ситуации, когда различные гормональные и нейронные системы активны вследствие присутствия компонентов пищи в ЖКТ или ожидания пищи, эффекта не наблюдается или наблюдаемый эффект значительно меньше. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения комбинированный Y2-Y4 агонист вводят натощак в эффективной дозе либо подкожно, назально, либо другими способами, указанными в другом месте данного описания. В данном контексте термин "натощак" означает, что субъект не принимал никакой пищи или питья в течение, по меньшей мере, последних 2 часов перед введением комбинированного Y2- Y4 рецепторного агониста, например, по меньшей мере, в течение последних 3 часов, по меньшей мере, в течение последних 4 часов, по меньшей мере, в течение последних 5 часов, по меньшей мере, в течение последних 6 часов, по меньшей мере, в течение последних 7 часов, по меньшей мере, в течение последних 8 часов, по меньшей мере, в течение последних 9 часов, по меньшей мере, в течение последних 10 часов, по меньшей мере, в течение последних 11 часов, по меньшей мере, в течение последних 12 часов перед введением дозы.
В подгруппе популяции комбинированный Y2-Y4 агонисты могут не оказывать предполагаемого действия вследствие генетических изменений, таких как полиморфизм в гене Y4 рецептора. Утрата функциональных мутаций в этих рецепторах связана, по-видимому, с ожирением. Поэтому в предпочтительном варианте изобретения осуществляют анализ Y4 рецепторного гена субъекта, которого нужно лечить, чтобы проверить эти гены на полиморфизм/мутации и идентифицировать такой полиморфизм. На основании такого анализа можно проводить оптимальное лечение субъектов. Например, только субъекты с нормальным генотипом или с полиморфизмом, который не влияет на функцию Y4 агонистов, включая комбинированные Y2-Y4 агонисты, можно лечить с применением таких агонистов. Другая возможность - повысить дозу комбинированного Y2- Y4 агониста, вводимую субъектам с ослабленным рецептором, чтобы гарантировать оптимальное действие лекарства. В случае, когда ожирение субъекта вызвано недостаточностью функции Y4 рецептора, можно утверждать, что лечение - например, большими дозами - комбинированного Y2-Y4 агониста является формой заместительной терапии - при условии, что релевантная рецепторная функция всё ещё сохраняется - например, у гетерозиготных пациентов. В ситуации, когда невозможно или по финансовым причинам не удаётся провести такой генетический анализ, применение селективного комбинированного Y2-Y4 агониста особенно подходит,
так как он - вследствие его двойного действия на две различные мишени - будет эффективен даже в тех случаях, когда одна из мишеней не функциональна или имеет пониженную функциональность из- за генетического полиморфизма.
Перед началом постоянного лечения, чтобы быть уверенными, что лечение проходят только чувствительные к нему субъекты, можно провести тщательный тест для того, чтобы гарантировать, что эти соединения оказывают предполагаемое действие на субъекта, которого нужно лечить.
Селективные Y2-Y4 агонисты по изобретению можно комбинировать при лечении ожирения, диабета и родственных заболеваний с различными другими лекарствами, имеющими целью аппетит и расход энергии, эти лекарства включают, но без ограничения, лекарства, такие как ингибиторы липаз ЖКТ, ингибиторы обратного захвата нейромедиаторов, антагонисты каннабиноидных рецепторов и обратные агонисты, а также другие типы нейромедиатора - включая, но без ограничения, 5Н рецепторы- и/или гормона - включая, но без ограничения, агонисты или антагонисты GLP- 1, МС4, МСЗ-рецепторов. Так как селективные Y2-Y4 агонисты направлены на гомеостатический регуляторный механизм для связи между ЖКТ и ЦНС - т.е. на Y2 и Y4 рецепторы обычно нацелен опосредующий насыщение гормон PYY из кишечника и РР из поджелудочной железы - особенно полезно совмещать лечение комбинированными Y2-Y4 селективными агонистами с лечением лекарством, направленным на важнейший гедонический механизм аппетита и расхода энергии, таким как СВ1 рецепторы, например, являющиеся частью системы поощрения. Поэтому применение селективных Y2- Y4 агонистов при лечении ожирения и родственных заболеваний в комбинации с СВ1 антагонистом является предпочтительным вариантом настоящего изобретения. Дозировки
Терапевтически эффективное количество Y2/Y4 рецепторного агониста по данному изобретению зависит от конкретного применяемого агониста, возраста, веса и состояния субъекта, проходящего лечение, тяжести и типа состояния или заболевания, которое нужно лечить, способа введения и эффективности применяемой композиции. Например, терапевтически эффективное количество Y2/Y4 рецепторного агониста может меняться, примерно, от 0.1 мкг на килограмм (кг) массы тела, примерно, до 1г на кг массы тела, например, от около 5 мкг до около 1 мг на кг массы тела. В другом варианте изобретения рецепторный агонист вводят субъекту в количестве 0.5-135 пикомолей (пмоль) на кг массы тела, или 72 пмоля на кг массы тела. В одном конкретном неограничивающем примере, примерно, 5-50 нмолей вводят в виде подкожной инъекции, например, около 2-20 нмолей, или около 1.0 нмоля. Точную дозу специалист в данной
области техники легко определит исходя из активности конкретного применяемого соединения (такого как агонист рецептора), возраста, веса, пола и физиологического состояния субъекта. Доза агониста может быть молярным эквивалентом терапевтически эффективной дозы PYY3- 36. Это количество можно разделить на одну или несколько доз для применения ежедневно, через день, еженедельно, через каждые две недели, ежемесячно или с любой другой подходящей частотой. Обычно приём осуществляют один или два раза в день.
Способы применения
Агонист можно вводить любым способом, включая энтеральный (например, оральное введение) или парентеральный способ. В конкретном варианте изобретения предпочтительным является парентеральный способ, он включает внутривенную, внутрисуставную, интраперитонеальную (внутрибрюшинную), подкожную, внутримышечную, надчревную инъекцию и инфузию, а также сублингвальный (подъязычный), трансдермальный (чрескожный), топический, трансмукозный, включая назальный, способ, или ингаляция, например, лёгочная ингаляция. В конкретных вариантах изобретения предпочтительным является подкожный и/или назальный способ применения.
Агонисты рецепторов можно как таковые в подходящем носителе, или их можно вводить в виде подходящей фармацевтической или косметической композиции. Такие композиции также входят в объём настоящего изобретения. Ниже описаны подходящие фармацевтические композиции. Специалист в данной области техники знает, что такая композиция может быть также пригодна для косметического применения, или он знает, как скорректировать композицию, чтобы сделать el косметической, используя подходящие косметически приемлемые эксципиенты.
Фармацевтические композиции
Агонисты рецепторов (рецепторные агонисты, также называемые "соединения") по данному изобретению для применения в медицине или косметике обычно бывают в виде фармацевтической композиции, содержащей конкретное соединение или его производное совместно с одним или более физиологически или фармацевтически приемлемых эксципиентов.
Соединения можно вводить животному, включая млекопитающих, таких как, например, человек, любым подходящим способом введения, например, таким как оральный, трансбуккальный, назальный, окулярный, лёгочный, топический, трансдермальный, вагинальный, ректальный, парентеральный (включая, наряду с
другими, подкожный, внутримышечный и внутривенный, ср. выше) способ, в дозе, которая эффективна для индивидуальных целей. Специалист в данной области техники знает, как выбрать подходящий способ введения. Как указывалось выше, предпочтительным является парентеральное введение. В конкретном варианте изобретения рецепторный агонист вводят подкожно и/или назально. Общеизвестно в уровне техники, что подкожные инъекции может делать себе сам пациент.
Композицию, пригодную для конкретного способа применения, индивидуально для каждого пациента легко определит практикующий врач. Различные фармацевтически приемлемые носители и их состав описаны в обычных монографиях о препаратах, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin.
Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по изобретению, может быть в виде твёрдой, полутвёрдой или жидкой композиции. Для парентерального применения композиция обычно находится в жидком виде или в виде полутвёрдом или твёрдом виде для имплантации.
Жидкие композиции, которые представляют собой стерильные растворы или дисперсии, могут применяться, например, для внутривенной, внутримышечной, внутриоболочечной, эпидуральной, интраперитонеальной или подкожной инъекции или инфузии. Соединения можно также приготовить в виде стерильной твёрдой композиции, которую можно растворять или диспергировать до или во время введения, например, в стерильной воде, физиологическом растворе или другой подходящей стерильной среде для инъекций.
Композиции в жидком виде может представлять собой раствор, эмульсию, включая наноэмульсии, суспензию, дисперсию, липосомную композицию, смесь, спрей или аэрозоль (два последних типа являются особенно релевантными для назального применения).
Подходящие среды для растворов или дисперсий обычно бывают на водной основе или на основе фармацевтически приемлемых растворителей, например, таких как масло (например, кунжутное или арахисовое масло) или органический растворитель, например, такой как пропанол или изопропанол. Кроме того, композиция по изобретению содержит фармацевтически приемлемые эксципиенты, например, такие как агенты, корректирующие рН, осмотически активные агенты, например, для того, чтобы довести изотоничность композиции до физиологически приемлемых уровней, агенты коррекции вязкости, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты и т.д. Предпочтительной средой является вода.
Композиции для назального применения могут также содержать нераздражающие носители, например, такие как полиэтиленгликоли, гликофурол, и т.д., а также энхансеры всасывания, хорошо известные специалисту в данной области техники (например, со ссылкой на Remington's Pharmaceutical Science).
Для парентерального применения в одном варианте изобретения агонист рецептора можно вообще готовить смешением агониста рецептора заданной степени чистоты в виде стандартной лекарственной формы для инъекций (в виде раствора, суспензии или эмульсии) с фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, т.е. таким, который не является токсическим для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и который совместим с другими ингредиентами композиции.
Обычно препараты готовят с помощью однородного и тщательного смешения (контактирования) рецепторного агониста с жидкими носителями, или с тонкоизмельчёнными твёрдыми носителями, или с теми и другими.
Затем, при необходимости, продукту придают форму нужного препарата. Предпочтительно, носитель представляет собой парентеральный носитель, более предпочтительно, раствор, изотонический с кровью реципиента. Примеры таких носителей включают воду, физиологический солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Также применимы по данному описанию неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат, а также липосомы. Благодаря амфифильной природе пептидов по данному описанию подходящие формы также включают мицеллярные препараты, липосомы и другие типы препаратов, содержащие один или более соответствующих липидов, таких, например, как фосфолипиды и т.п.
Предпочтительно, они суспендируются в водном носителе, например, в изотоническом буферном растворе при рН около 3.0- 8.0, предпочтительно, при рН около 3.5-7.4, 3.5-6.0 или около 3.5-5. Применимые буферные вещества включают ацетатный, цитратный, фосфатный, боратный, карбонатный буферы, например, такие как цитрат натрия- лимонная кислота или фосфат натрия- фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота.
Композиции также могут быть предназначены для контролируемой или пролонгированной доставки рецепторного агониста после введения, чтобы создать схему с менее частым введением. Обычно подходящей считается схема приёма лекарственного вещества 1-2 раза в сутки, но в объём настоящего изобретения также входят другие схемы применения, такие, например, как более частое и более редкое введение. Для осуществления пролонгированной доставки рецепторного агониста можно применять подходящий носитель, включающий, например, липиды или масла, чтобы образовать
депо в месте введения, из которого рецепторный агонист медленно высвобождается в систему кровообращения, или можно использовать имплантат. Подходящие с этой точки зрения композиции включают липосомы и биоразрушаемые частицы, в которые включён рецепторный агонист.
В таких ситуациях, когда нужны твёрдые композиции, эти композиции могут быть в виде таблеток, таких как обычные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, формованные таблетки, в виде пеллет, порошков, гранул, гранулятов, материала в виде макрочастиц, твёрдых дисперсий или твёрдых растворов.
Полутвёрдая форма композиции может представлять собой жевательную резинку, мазь, крем, линимент, пасту, гель или гидрогель.
Другие подходящие лекарственные формы фармацевтических композиций по изобретению могут представлять собой вагитории, суппозитории, пластыри, накладки, таблетки, капсулы, саше, пастилки, устройства и т.д.
Лекарственная форма может быть предназначена для неограниченного (свободного) или контролируемого высвобождения, например, за счёт того, что таблетки могут иметь соответствующие покрытия.
Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.
Содержание соединения по изобретению в фармацевтической композиции по изобретению составляет, например, около 0.1- 100% вес/вес фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции можно готовить любым способом, хорошо известным специалисту в области приготовления фармацевтических препаратов.
В фармацевтических композициях соединения обычно объединяются с фармацевтическим эксципиентом, т.е. терапевтически инертным веществом или носителем.
Носитель может иметь весьма разнообразные формы в зависимости от заданной лекарственной формы и способа применения.
Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут представлять собой, например, наполнители, связующие, вещества, способствующие расщеплению, разбавители, вещества, способствующие проглатыванию, растворители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, стабилизаторы, энхансеры, вещества, придающие вкус и запах, агенты коррекции рН, замедлители, увлажняющие средства, поверхностно- активные агенты, консерванты, антиоксиданты и т.д. Подробности можно найти в
фармацевтических справочниках, например, таких как Remington's Pharmaceutical Science или Pharmaceutical Excipient Handbook.
Синтез
Пептидные агонисты по данному изобретению можно синтезировать твердофазным пептидным синтезом, применяя либо автоматический синтезатор пептидов, либо обычный лабораторный синтез. Твёрдым носителем может являться, например, полимер хлортритила (С1) или Ванга (Wang), каждый из которых можно легко приобрести. Активные группы этих полимеров легко реагируют с карбоксильной группой N- Fmoc аминокислоты, при этом связывая её с полимером ковалентной связью. Связанный с полимером амин можно депротекционировать экспозицией с пиперидином. Затем вторую N- аминокислоту можно присоединить к элементу полимер- аминокислота. Эти стадии повторяют до тех пор, пока не получат нужную последовательность. По окончании синтеза связанный с полимером защищенный пептид можно депротекционировать и отщепить от смолы под действием трифторуксусной кислоты (ТФК, TFA). Ниже даны примеры реагентов, облегчающих присоединение новых аминокислот к связанной с полимером аминокислотной цепи: тетраметилурония гексафторфосфат (HATU), О- (1Н- бензотриазол-1-ил)- N,N,N',N'- тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU), 0-(1Н- бензотриазол-1-ил)- N,N,N',N'- тетраметилурония гексафторборат (TBTU), 1Н- гидроксибензотриазол (HOBt).
Также предпочтительнее бывает пептидный синтез в растворе, нежели твердофазный пептидный синтез.
Модификация боковых амино- и карбоксильных групп аминокислоты пептидной цепи, например, введением GAG- связывающего или другого мотива, описанного выше, является простым способом введения и снятия (депротекции) защиты других реакционноспособных групп боковых цепей, не участвующих в реакции.
Пример
Для иллюстрации способов, применяемых в синтезе агонистов по изобретению, описано получение последовательности [Gln34]PP. Схема синтеза:
Твердофазный пептидный синтез защищенной пептидной последовательности, связанной с нерастворимой подложкой, с постадийным
построением пептидной цепи_
_I_
Отщепление пептида от полимера и_
депротекция____
_I_
Стадии очистки с помощью RPC_
_I_
Концентрация и лиофилизация_
_±_
_[Gln34]_
Химические реактивы
Используют следующие исходные материалы и растворители:
Исходные материалы Fmoc- Rink- TentaGel- resin (полимер) Fmoc- Ala- OH.H20 Fmoc- Arg(Pbf)- OH Fmoc- Asn(Trt)- OH Fmoc- Asp(OtBu)- OH Fmoc- Gln(Trt)- OH Fmoc- Glu(OtBu)- OH Fmoc- Gly- OH Fmoc- lie- OH. Fmoc- Leu- OH Fmoc- Met- OH Fmoc- Pro- OH Fmoc- Thr(tBu)- OH Fmoc- Tyr(tBu)- OH Fmoc- Val- OH
Растворители и реагенты, применяемые в синтезе и для очистки
Уксусная кислота
Растворитель
Уксусный ангидрид
Реагент
Аммония ацетат
Реагент
Аммония йодид
Реагент
Диизопропилкарбодиимид (DIC)
Реагент
Диметилформамид (ДМФА, DMF)
Растворитель
Дитиотреитол (DTT)
Реагент
Этанол
Растворитель
1- Гидроксибензотриазол (HOBt)
Реагент
Изопропанол
N- Метилморфолин (NMM) Пиперидин
Трифторуксусная кислота (ТФК, TFA)
Растворитель
Реагент
Реагент
Растворитель
Нужный продукт собирают с помощью Fmoc-SPPS на полимере Fmoc- Rink-TentaGel- resin. Аминокислоты с защитными группами в боковой цепи суть следующие: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), Thr(tBu) и Tyr(tBu).
Взаимодействие (связывание) осуществляют в ДМФА, изменяя эквиваленты аминокислот, с применением DIC и HOBt для активации. После каждой конденсации (связывания) следует кэпирование уксусным ангидридом и NMM. Мониторинг каждой конденсации (связывания) осуществляют с применением теста Кайзера/с нингидрином или хлоранилом. Между каждыми циклами связывания группу Fmoc удаляют пиперидином в ДМФА.
Защищенный пептид- полимер отщепляют от носителя с помощью ТФК и нейтрализуют в водном растворе ацетата аммония, получают сырой продукт. После обработки полимер отфильтровывают.
Сырой продукт очищают препаративной ВЭЖХ, используя материал для обращено- фазовой хроматографии на основе силикагеля или полистирола. Раствор пептида концентрируют упариванием и фильтруют перед выделением лиофилизацией.
Структура подтверждена масс- спектрометрией с диссоциацией, индуцированной столкновениями/масс- спектрометрии (СП) MS/MS), аминокислотным анализом, LC- MS и хиральной чистотой. Чистоту проверяют с помощью ВЭЖХ и хиральной чистоты.
Химический анализ пептидов:
Для иллюстрация применяемых способов и полученных результатов ниже представлены аналитические данные пептидов по изобретению, синтезированные вышеуказанными методами:
Данные
Пептид
Молекулярная формула
Теоретическая
величина m/z
Полученная
масса
M/z
Rt мин
Чистота
Метод ВЭЖХ
[Gln34]PP
C185H288N 54055S2
4212.8
4212
20.8
94.8
IIe31,Gln34]PP
C185H288N 54055S2
4212.8
4211.6
20.5
97.1
[Val31,Gln34]PP
C184H286N 54055S2
4198.8
4197.2
25.0
96.3
Leu30,Gln34]PP
C186N289N 53056S
4195.8
840.2 [M+5H]
840.0 [М+5Н]
19.7
96.5
His26,Gln34]PP
C185H282N 52056S2
4194.8
839.9 [M+5H]
839.9 [М+5Н]
19.1
95.0
[Ala1,Glu4,Arg26, Met30]PYY
C186H288N 54059S
4256.8
710.4 [M+6H]
710.4 [М+6Н]
19.4
96.4
[Arg26,Met30]PYY
C193H298N 56057S1
4346.9
870.7 [M+5H]
870.7 [М+5Н]
20.2
91.3
Glu4,Arg26]PYY
C193H295N 55059
4329.8
867.5 [M+5H]
867.5 [M+5HJ
17.4
95.3
Аналитическая ВЭЖХ, метод А
Колонка = Vydac С18 Peptide-Protein (для пептидов- белков), 250 х 4.6 мм
Буфер А = 0.05% ТФК в воде
Буфер В = 0.05% ТФК в 100% MeCN
Градиент = 0% В - 60% В за 20 мин
Скорость потока =1.00 мл/мин
Длина волны =215нм
Масс- спектроскопия = MALDI- TOF с гентизиновой или а- цианогидрогсикоричной кислотой в качестве матрицы
Аналитическая ВЭЖХ, метод В
Колонка = Hypersil ODS- 2, 250 х 4.6 мм
Буфер А =0.1 % ТФК в 100% MeCN
Буфер В = 0.1% ТФК в 100% воде
Градиент = 24% А - 35% А за 25 мин
Скорость потока = 1.00 мл/мин Длина волны = 220 нм
Масс- спектроскопия = ESI [скорость газа в распылителе: 1.5 л/мин; CDL- 20.0 В; CDL темп.: 250°С; Темп, блока: 200°С; напряжение (смещение) в датчике: +4.5 кВ; Детектор: 1.5 кВ; Т. поток: 0.2 мл/мин; В конц.: 50% Н20/50% CAN.]
Аналитическая ВЭЖХ, метод С
Буфер А Буфер В Градиент
Колонка
= Vydac С18 218ТР54, 250 х 4.6 мм
= 20 мл MeCN и 2 мл ТФК в воде (общий объём 2000 мл)
= 2 мл ТФК в 100% воде (общий объём 2000 мл)
= 25% В - 75% В за 27 мин
Скорость потока Длина волны = 1.00 мл/мин
= 215 нм
Для дальнейшей иллюстрации синтетических методов, которые можно применять для получения Y2/Y4 селективных агонистов, которые рассматриваются в настоящем изобретении, только в качестве примера, представлены нижеприведённые протоколы:
Синтез [Cys2,Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:30) и его аналогов
Ниже описывается синтез циклического Y2 селективного пептида [Cys2,Lysl3, D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID NO:30) и синтез его аналогов с GAG- связывающим мотивом, мотивом, связывающим сывороточный белок или фрагментом полиэтиленгликоля, присоединёнными к ипсилон- аминогруппе Lysl3.
Как правило, защитной группой в боковой цепи является Fmoc, за исключением:
Arg = Fmoc Arg(Pbf)- ОН
Asn, Gin = Fmoc Asn(Trt)- OH
Thr, Ser, Asp, Glu, Tyr = tButyl (трет- бутил)
Lys = Fmoc Lys(tBoc)- OH
Ala-Ser 22-23 = Fmoc AlaSer псевдопролин
В случае [Cys2,Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP для того, чтобы добиться селективной депротекции, используют следующие защитные группы: Lys 13 = Fmoc Lys(Dde)- ОН
Пептид синтезируют твердофазным синтезом на полимере PAL Peg-PS (полимер, который при отщеплении образует биологически важную карбоксиамидную группу) с применением Fmoc защиты с 5-кратным молярным избытком реагента. Конденсацию осуществляют с помощью HCTU в ДМФА в качестве реагента. Снятие Fmoc после каждой стадии конъюгации осуществляют 20% раствором пиперидина в ДМФА в течение
Cys 27 = Fmoc DLys(Trt)- ОН
10-15 минут. Присоединение проверяют на каждой стадии количественным анализом с нингидрином. В некоторых случаях можно осуществлять двойное связывание (присоединение).
После синтеза полноразмерных пептидов защитную группу в ипсилон-аминогруппе Lys 13 селективно снимают обработкой 2 % раствором гидразина в ДМФА в течение 15-20 мин, в то же время пептид ещё остаётся связанным с полимером.
Затем полимер делят на три различных части для получения недериватизированного пептида, а также пептидов, модифицированных тремя различными мотивами:
1. [Cys2,Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:30) - "материнский пептид " -отщепляют от полимера и депротекционируют обработкой смесью 95% трифторуксусной кислоты: 2.5% воды: 2.5% трипропилсилана в течение 2-3 часов.
Внутримолекулярный стабилизирующий дисульфидный мостик между Cys2 и D-Cys27 получают окислением на воздухе, растворяя пептид с концентрацией <1 мг/мл в ацетате аммония рН 8.5 - 9 при перемешивании в течение 24-28 часов до тех пор, пока не исчезнут свободные тиолы, определяемые реактивом Эллмана.
Пептид очищают обращено- фазовой ВЭЖХ: колонка Vydac 300 А, 250 мм х 10 мм, элюент (буфер А = 0.05% ТФК в воде; буфер В = 60% MeCN : 40% воды : 0.05% ТФК) в градиенте 30- 80% буфера В в течение 20 минут, 2 мл/мин. Определяют OD при 215 нм и элюент, содержащий конкретный пептид, собирают и лиофилизируют.
Структуру пептида подтверждают масс- спектрометрией, аминокислотным анализом и, при необходимости, также анализом аминокислотной последовательности.
2. [Cys2, N- (8- (8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)-Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID NO:31) - Для того, чтобы присоединить мотив связывания сывороточного альбумина, 8-(8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)-октаноильную группу связывают со свободной ипсилон- аминогруппой остатка Lys 13 после удаления защитной Dde группы, пептидным синтезом, с помощью защищенной аминооктановой кислоты а затем дважды- с помощью защищённой гамма- глутаминовой кислоты, в то время как пептид всё ещё остаётся связанным со смолой.
Пептид, модифицированный с применением мотива, депротекционируют, циклизуют и очищают как описано выше для "материнского пептида".
3. Флуоресцеин- [Cys2,N-{(Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3}- Lysl3,D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID NO:32) - Для того, чтобы присоединить GAG- связывающий мотив, мотив строят постадийно пептидным синтезом, используя свободную ипсилон-аминогруппу Lysl3, после удаления Dde группы, на пептиде [Cys2,Lysl3,D-Cys27,Gln34]PP, всё ещё связанном с полимером, используя стандартный метод с Fmoc, как в целом описано выше: GAG- связывающая последовательность, полученная таким образом, представляет собой Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala-Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala. Флуоресцеиновую метку присоединяют для in vitro и in vivo для аналитических целей в виде его 5,6 изомера -NHS эфира, 10х избыток в течение 72 часов - к N-концу окончательной GAG-связывающей последовательности.
Пептид, модифицированный с помощью GAG-связывающего мотива, отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают как описано выше для "материнского пептида".
4. [Cys2, N-{N'-(21-aMHHO-4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}-гамма-глутамоил- Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID NO:33)
Для того, чтобы присоединить фрагмент полиэтиленгликоля к Y2-Y4 селективному пептиду, защищенную 21-амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозановую кислоту связывают пептидным синтезом, используя свободную ипсилон- аминогруппу Lysl3, после удаления Dde группы, на пептиде [Cys2,Lysl3,D-Cys27,Gln34]PP, всё ещё связанном с полимером, а затем присоединяют защищённую гамма- глутаминовую кислоту.
ПЭГилированный пептид отщепляют от полимера, депротекционируют, циклизуют и очищают как описано выше для "материнского пептида".
Используя описанные выше методы, синтезируют следующие агонисты по изобретению, приведённые в качестве примеров:
[N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Gln34]PP (SEQ Ш N0:34)
[N-(Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl8,Gln34]PP (SEQ ID N0:35)
[N- PEG5000- Lysl3,Gln34]PP (SEQ ED N0:36)
[Ile31,Gln34]PP (SEQ ED No: 5)
[Val31,Gln34]PP (SEQ ED No: 6)
[Leu30,Gln34]PP (SEQ JD No: 7)
[Nle30,GIn34]PP (SEQ ID No: 8)
[Leu28,Gln34]PP (SEQ Ш No: 9) [His26,Gm34]PP (SEQ Ш N0:10) [Ile3,Gln34]PP (SEQ Ю N0:11)
[Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:12)
[Alal,Glu4,N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Arg26]Nle30]PYY
(SEQ ID N0:37)
[Alal,Glu4,N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:38)
[Alal,Glu4,N-PEG5000- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:39) [Alal,Glu4,Arg26(Met30 или Nle30)]NPY (SEQ Ш N0:13) [Alal,Glu4]PYY (SEQ ID N0:14) и [Alal ,Glu4]NPY (SEQ ED N0:15) [Arg26, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ Ш N0:16) и [Arg26, (Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ED N0:17)
[Glu4, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ED N0:18) и [Glu4, (Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ID N0:19)
[Glu4,Arg26]PYY (SEQ ID N0:20) и [Glu4,Arg26]NPY (SEQ ID N0:21) [Cys2,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ED N0:22) [Cys2,Aoc5-24,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ED N0:23)
Биологические анализы и результаты
I. IN VITRO АНАЛИЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФФИННОСТИ И АКТИВНОСТИ ПЕПТИДОВ
Анализ аффинности к человеческому Y2 рецептору
Аффинность тестируемых соединений к человеческому Y2 рецептору определяют анализом конкурентного связывания, используя 125I-PYY связывание в клетках COS- 7, транзиторно трансфецированньгх человеческим Y2 рецептором трансфекцией с фосфатом кальция.
Трансфецированные C0S-7 клетки переносят в культуральные планшеты через день после трансфекции при плотности 40 х 103 клеток на лунку, добиваясь 5 - 8 % связывания радиоактивного лиганда. Через два дня после трансфекции проводят эксперименты по конкурентному связыванию в течение 3 часов при 4°С, используя 25 пМ 1251- PYY (Amersham, Little Chalfont, UK), анализы связывания проводят в 0.5 мл 50 мМ буфера Hepes, рН 7.4, дополненного 1 мМ СаСЬ, 5 мМ MgCb и 0.1 % (вес/об) бычьего сывороточного альбумина и 100 мкг/мл бацитрацина. Неспецифическое связывание определяют как связывание в присутствии 1 мкМ немеченого PYY. Клетки дважды
отмывают в 0.5 мл охлаждённого льдом буфера и добавляют 0.5- 1 мл буфера для лизиса (8 М мочевина, 2 % NP40 в 3 М уксусной кислоте) и гамма- счётчиком считают связанную радиоактивность. Определения делают в двойном повторе. Связывания в стационарном (равновесном) состоянии достигают в этих условиях. Величины ЕС50 рассчитывают, используя программу работы со стандартными фармакологическими данными, Prism 3.0 (graphPad Sofware, San Diego, USA).
Анализ аффинности к человеческому Y4 рецептору
Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Y2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Y4 клетки COS-7, в конкурентном анализе используют 125I-PP, и для определения неспецифического связывания используют PP.
Анализ аффинности к человеческому Y1 рецептору
Используется такой же протокол, как для анализа аффинности к Y2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Y1 клетки COS-7, и переносят в культуральные планшеты при плотности 1.5 х 106 (?) клеток на лунку, в конкурентном анализе используют 125I-NPY, и для определения неспецифического связывания используют NPY.
Результаты тестирования NPY, PYY, PYY3- 36, РР и [Gln45]PP, [Ile31,Gln34]PP, [Val31,Gln34]PP, [Arg26,Met30]PYY [Glu4,Arg26]PYY агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах аффинности даны в Таблице 1:
Таблица 1
| Агонист
| Y4
IC50 nm
SEM
IC50 nm
SEM
IC50 nm
SEM
NPY
0.30
O.07
2.3
0.3
PYY
0.22
O.02
8.0
PYY(3-36)
0.20
O.03
343
> 1000
> 1000
0.41
0.05
> 1000
[GIn34]-PP
9.0
1.8
1.2
0.1
> 1000
He31,Gln34]-PP
1.1
0.1
> 1000
[Va!31,Gln34]-PP
0.93
0.16
> 1000
[Arg26,Met30]PYY
0.13
2.3
[Glu4,Arq26]PYY
3.3
367
Анализ активности к человеческому Y2 рецептору
Активность тестируемых соединений к человеческому Y2 рецептору измеряют определяют в экспериментах доза- эффект в клетках COS-7, транзиторно трансфецированных человеческим Y 2 рецептором, а также смешанным G белком, Gqi5, который гарантирует, что Y2 рецептор связывается через Gq путь, ведущий к повышению метаболизма инозитолфосфатов.
Метаболизм фосфатидилинозитола- Через день после трансфекции клетки COS-7 инкубируют в течение 24 часов, используя 5мкКи [ЗН]- мио- инозитола (Amersham, РТ6- 271) в 1 мл среды, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 0.01 мг/мл гентамицина на лунку. Клетки дважды отмывают в буфере, 20 мМ HEPES, рН 7.4, дополненном 140 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 1 мМ MgS04, 1 мМ СаС12, 10 мМ глюкозы, 0.05% (вес/об.) бычьей сыворотки; и инкубируют в 0.5 мл буфера, дополненного 10 мМ LiCl при 37°С в течение 30 мин. После стимуляции при различных концентрациях пептида в течение 45 мин при 37°С клетки экстрагируют 10% ледяной перхлорной кислотой с последующей инкубацией на льду в течение 30 мин. Полученные супернатанты нейтрализуют КОН в буфере HEPES и полученный [ЗН]- инозитолфосфат очищают на анионообменной смоле Bio- Rad AG 1- Х8 и считают бета- счётчиком. Определения делают в двойном повторе. Величины ЕС50 рассчитывают, используя программу для работы со стандартными фармакологическими данными, Prism 3.0 (graphPad Sofware, San Diego, USA).
Анализ активности к человеческому Y4 рецептору
Используется такой же протокол, как для анализа активности к Y2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Y4 клетки COS- 7.
Анализ активности к человеческому Y1 рецептору
Используется такой же протокол, как для анализа активности к Y2, за исключением того, что применяют человеческие трансформированные с помощью Y1 клетки COS- 7.
Результаты тестирования NPY, PYY, PYY3- 36, РР и [Gln45]PP, [ПеЗ 1 ,Gln34]PP, [Val31,Gln34]PP (SEQ ED No: 6), [Alal, Glu4, Arg26,Met30]PYY, [ Leu30,Gln34]PP (SEQ ID No: 7) и [His26,Gln34]PP (SEQ ED NO:10) агонистов по изобретению в вышеуказанных анализах активности даны в Таблице 2:
Таблица 2
| Агонист
EC50 nm
SEM
EC50 nm
SEM
EC50 nm
SEM
NPY
1.5
0.5
167
1.7
0.4
PYY
0.23
0.O6
0.6
0.1
PYY(3-36)
0.36
0.O7
> 1000
0.64
0.07
Гв1п341-РР
3.5
0.7
1.2
0.1
388
He31,Gln34I-PP
6.5
2.0
0.91
0.04
[Val31,Gln34l-PP
9.9
3.2
1.0
0.04
fLeu30,Gln341PP
8.6
0.7
4.5
0.4
102
[His26,Gln34]PP
6.1
1.1
9.2
0.3
130
[Ala1 ,Glu4,Arg26,Met30]PYY
1.0
0.2
1.4
0.2
3 I
II. IN VITRO АНАЛИЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ БЕЛКОВ
Важным показателем для многих пептидов по изобретению является устойчивость белков, в особенности устойчивость, например, к расщеплению ферментами, так как эти пептиды создаются так, чтобы иметь повышенную устойчивость по сравнению, например, с PYY3-36, или даже повышенную устойчивость по сравнению с полноразмерными PYY и PP.
Устойчивость РР-складки- определяют как устойчивость пептидов к расщеплению эндопептидазами, которые расщепляют, например, в области петли, которая является относительно гибкой (как описано в О'Hare, М. & Schwartz, Т. W. 1990 In Degradation of Bioactive Substances: Physiology and Pathophysiology. J. Henriksen, ed. CRC Press, Boca Raton, Fl). В качестве модельного фермента используют эндопротеиназу Asp-N (Pierce). Этот фермент расщепляет на N-концевой стороне остатков Asp, например, между остатками 9 и 10 (Asp) PP. Пептиды инкубируют с эффективной дозой эндопептидазы Asp- N как указано производителем в 0.01 М Tris/HCl буфере, рН 7.5 при комнатной температуре и образцы извлекают через 24 часа. Образцы анализируют методом ВЭЖХ и затем проводят последовательную деградацию (отщепление) во времени. Пептиды сравнивают по стабильности с PYY, PYY3- 36 и PP.
Устойчивость к аминопептидазам- определяют как описано выше для эндопептидаз, но вместо них используют аминопептидазу N и дипептидилпептидазу IV. Некоторые из пептидов специально предназначены для того, чтобы быть устойчивыми к этим аминопептидазам, например, PYY2-36, ацилированные по N- концу пептидные производные и пептидные дериваты, алкилированные фрагментом, связывающим альбумин, на N-конце. Пептиды сравнивают по стабильности (устойчивости) с PYY, PYY3-36 и PP.
III. IN VITRO АНАЛИЗ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАНИЯ С ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНАМИ (GAGS)
Способность тестируемых соединений связываться с GAGS проверяют in vitro анализом с применением иммобилизованного гепарина, т.е. гепарин- агарозы, в качестве аффинной матрицы. Применяют либо колонку HiTrap с гепарин- сефарозой (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), либо колонки с гепарином для ВЭЖХ, элюируют в 50-мин. линейном градиенте 0.- 0.5 М NaCl в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7.3),
содержащем 2 мМ DTT и 1 мМ MgEDTA при скорости потока 1 мл/мин. Для регенерации колонку промывают 1 М NaCl в буфере А в течение 51-55 минут.
IV. IN VIVO ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ НА АППЕТИТ, ПОТРЕБЛЕНИЕ ПИЩИ И МАССУ ТЕЛА
Действие селективных к Y2/Y4, по сравнению с Y1, агонистов, на быстрое потребление пищи у мышей
Берут мышей линии ddy весом 34-37 г в возрасте 8-9 недель (Japan SLC, Shizuuoka, Japan). Мышей индивидуально помещают в регулируемую среду (22°С, влажность 55%) с 12-часовым световым циклом "день- ночь" с включением света в 7 час. утра. Пищу и воду дают неограниченно, за исключением времени непосредственно перед экспериментами (см. ниже). Мыши привыкают к подкожным инъекциям в течение недели перед началом экспериментов. Мышей в экспериментах используют по одному разу. Непосредственно перед применением пептиды разводят в физиологическом солевом растворе и вводят в виде подкожной инъекции в объёме 100 мкл. Результаты представлены как среднее +/- SE. Для оценки разницы между группами применяют дисперсионный анализ, а затем тест Бонферрони.
Мышей отлучают от пищи, но оставляют свободный доступ к воде за 16 часов до данного теста и эксперименты начинают в 10 час. утра на следующий день. Используют стандартную диету (CLEA Japan,,Inc., Tokyo, Japan) и потребление пищи измеряют, вычитая вес несъеденной пищи из начальной предварительно взвешенной пищи после введения и проверки потерь пищи. Восемь животных в каждой группе получают физиологический раствор, 3 мкг PYY3-36, 30 мкг PYY3- 36, 10 мкг тестируемого соединения или 100 мкг тестируемого соединения.
Результаты для [Gln34]PP (названного на Фиг. ТМ30333) в качестве испытуемого соединения даны на Фиг.2.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
NPY (SEQ ID No: 1)
H2N-Tyr--Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ajg-His-T^
PYY (SEQ ID No: 2)
H2NTyi--Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyi--Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Trn--Arg-Gln-Ajg-Tyr-CONH2
PP (SEQ ID NO: 3)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile^
[GIn34] PP (SEQ ID No: 4)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Tru--Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gm-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Ajg-Tyr-Ile-^
[Ile31,Gln34]PP (SEQ ID No: 5)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyi--Ala-Ala-Asp-Leu-Axg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met41e-Thr-Arg-Gln-Ajg-Tyr-CONH2
[Val31,Gln34]PP (SEQ ID No: 6)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr41e-Asn-Met-Val-Tlu-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Leu30,Gln34]PP (SEQ ID No: 7)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Axg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-^
[Nle30,Gln34]PP (SEQ ID No: 8)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gb-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Ajg-Axg-Tyr-Ile-Asn-M^
[Leu28,Gln34]PP (SEQ ID No: 9)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Axg-Axg-Tyr-Leu-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[His26,Gln34]PP (SEQ ID No: 10)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-His-Tyr41e-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ile3,Gln34]PP (SEQ ID No: 11 )
H2N-Ala-Pi^-Ile-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Tlrr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr41e-Asn-Met-Leu-Trrr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID No: 12)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gty
Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Axg-Ty^
CONH2
[Alal,GIu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ID No: 13)
H2N-Ala-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Mel-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Met or Nle)-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-
CONH2
[Alal,Glu4]PYY (SEQ ID No: 14)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Alal,Glu4]NPY (SEQ ID No: 15)
H2N-Ala-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Tlrr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Arg26, (Met30 or N I еЗ О)] PYY (SEQ ID No: 16)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met or Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Arg26, (Met30 or Nle30)]NPY (SEQ ID No: 17)
H2N-Tyr--Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr- Ser-Ala-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ue-Asn-(Met or Nle)-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4, (Met30 or Nle30)]PYY (SEQ ID No: 18)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-(Met or Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[GIu4, (Met30 or Nle30)]NPY (SEQ ID No: 19)
H2N-Tyr-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-(Met or Nle)-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4,Arg26]PYY (SEQ ID No: 20)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4,Arg26]NPY (SEQ ID No: 21)
H2N-Tyr-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Cys2,D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID No: 22)
H2N-Ala- Cys -Leu -GbrPro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-ANr^^rg-(D-Cys)--Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2 1
^ S
[Cys2,Aoc5-24,D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID No: 23)
S- S
H2N-Ala-Cys-Leu-Glu-Aoc5-24-Arg-Arg-(D-Cys)-Jle-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Lysl8,Gln34]PP (SEQ ID No: 24)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Lys-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr41e-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Alal ,Glu4,Lysll ,Arg26,(Met30 or Nle30)]PYY (SEQ ID No: 25)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met or Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-[GIn34]PP (SEQ ID No:26)
H2N-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Ajg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Alal ,Glu45Lysl8, Arg26, (Met30 or Nle30)]PYY (SEQ ID No: 27)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met or Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Lys28,Glu32]PP25-36 (SEQ ID No: 28)
H2N-Arg-Tyr-Lys-Asn-Met-Leu-Glu-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[Gln34PP} (SEQ ID No: 29).
H2N- Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-
Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ate
Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Cys2,Ly S > -Cys27,Gln34]PP (SEQ ID No: 30).
H2N-Ala-Cys-Leu^G4u^ro-VaL
Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Lel> 4Jg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Tlir-Arg-Gk CONH2
[Су82^-(8-(8-гамма-глутамоиламино-октамоиламино)-октаноил)-Еу813,0-Cys27,GIn34]PP (SEQ ID No: 31).
s H2NCH(COOH)CH2CH2CONH(CH2)7CONH(CH2)7CONJ
H2N-Ala-Cy^T^t> 4^Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-L Gln-Tyr- Ala-Ala- Asp^TJbbArj-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Cys2,N-{(AIa-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lysl3,D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID No: 32).
g Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH
H2N-Ala-dys5^Gh> Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-G^ Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp^tkArg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-M CONH2 1
^ S
[Cys2, N-{N'-(21-aминo-4,7,10,13,16,19-гeкcaoкcaгeнэйкoзaнoил)}-raMMa-r^TaM0imI-Lysl3,D-Cys27,GIn34]PP (SEQ ID No: 33).
H2N(CH2CH20)6CH2CH2CONH
H2N-Ala-dys^Leb> Glu^ro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-L^^rj-Arg-D-Cys-Ile-Asn-M CONH2
^-^'-гексадеканоил)-гамма-глутамоил-Ьу813,С1п34]РР (SEQ ID No: 34)
CH3(CH2)i4CONHCH(COOH)CH2CH2CONH
H2N-Ala-Cys-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-
Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Ajg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-
CONH2
[N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-AIa)3-Lysl3,GIn34]PP (SEQ ID No: 35)
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH
H2N-Ala-Cys-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-
Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-D-Cys-IIe-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-
CONH2
[N-PEG5000-Lysl3,Gln34]PP (SEQ ID No: 36)
NH-PEG5000
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-VaI-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Alal,Glu4,N-(N,-гeкcaдeкaнoил)-гaммa-глyтaмoил-LyslЗ,Arg26,NleЗO]PYY (SEQ ID No: 37)
CH3(CH2)i4CONHCH(COOH)CH2CH2CONH
H2N-Ala-Pro-IIe-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-GIu-Asp-Ala-Lys-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Nle-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Alal,GIu4,N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-AIa)3-Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID No: 38)
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Lys-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Nle-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C0NH2
[Alal,Glu4,N-PEG5000-Lysl3,Arg26,NIe30]PYY (SEQ ID No: 39)
NH-PEG5000
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Lys-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Nle-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[N-PEG5000-Lysl3,GIn34]PP (SEQ ID No: 40)
NH-PEG5000
H2N-Ala-Cys-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-
Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Aj-g-Gln-Arg-Tyr^
CONH2
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение Y рецепторного агониста, селективного в отношении Y2 и Y4 рецепторов по сравнению с Y1 рецептором, для получения композиции для лечения состояний, восприимчивых к активации Y2 и/или Y4 рецепторов, причём
(а) указанный агонист является РР-складчатым пептидом или РР-складчатым пептидом- миметиком, который содержит
(i) С-концевую аминокислотную последовательность Y- рецепторного распознавания, представленную как Х- Thr- Arg- X3- Arg- Туг- Q^^NR'R2, где R1 и R2, независимо, обозначают водород или Ср Сб алкил, X обозначает Val, Не, Leu или Ala, а X обозначает Gin или Asn, или её консервативно замещённый вариант, в котором Thr замещён на His или Asn, и/или Туг замещён на Trp или Phe; и/или Arg замещён на Lys, и
(ii) N- концевую аминокислотную последовательность Y-рецепторного распознавания, представленную как H2N- X1- Pro- X2- (Glu или Asp)-, где X1 отсутствует или обозначает любой аминокислотный остаток, а X2 обозначает Leu или Ser, или консервативные замены Leu или Ser, или
(б) указанный агонист содержит
С-концевую аминокислотную последовательность Y рецепторного распознавания по определению, данному в (i),
указанную последовательность Y рецепторного распознавания, связанную с амфифильным доменом аминокислотной последовательности, содержащим, по меньшей мере, один альфа- спиральный поворот, прилегающий к N-концу указанной гексапептидной последовательности,
причём указанный поворот заключён в спиральной конфигурации за счёт ковалентной внутримолекулярной связи, и, необязательно,
N-концевую последовательность, которая начинается с аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания по определению, данному в (ii).
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной
1 2
последовательности Y-рецепторного распознавания агониста каждый из R и R обозначает водород.
3. Применение по п.п.Г или 2, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Y- рецепторного распознавания агониста остаток X обозначает Val или Не.
4. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую последовательность Y-рецепторного распознавания, представленную как -XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=0)NR1R2, где остаток ХА является некисльгм и неосновным, а последовательность -X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(=0)NR1R2 имеет значение по определению в любом из п.п.1- 3.
5. Применение по п.4, отличающееся тем, что в С- концевой последовательности Y- рецепторного распознавания агониста указанный некислый и неосновной аминокислотный остаток представляет собой Leu, Met, Не, Val, or Ala.
6. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С- концевой ундекапептид, представленный как -Xе- Туг- Хв- Asn- ХА- Х- Thr- Arg- X3- Arg- Tyr-C^CONR'R2, где последовательность -XA- X- Thr- Arg- X3- Arg- Tyr- C(=0)NR!R2 имеет значение по определению в п.п.4 или 5, Xе обозначает Arg или Lys, а Хв обозначает Не, Leu или Val.
7. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С- концевую ундекапептидную последовательность, представленную как -Xе- Туг- Хв- Asn- ХА- X-Thr- Arg- X3- Arg- Туг- С(=0)№1^2, где последовательность -ХА- Х- Thr- Arg- X3- Arg-Tyr- C(=0)NR1R2 имеет значение по определению в п.п.4 или 5, Xе обозначает His, Asn или Gin, а Хв обозначает Не, Leu или Val.
8. Применение по любому из п.п.1- 7, отличающееся тем, что в С-концевой аминокислотной последовательности Y- рецепторного распознавания X3 обозначает Gin.
9. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность -Arg- Туг- Leu- Asn- (Leu или Met)- Val- Thr- Arg-Gln- Arg- Tyr- C(=0)NH2.
10. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист содержит С-концевую ундекапептидную последовательность -His- Туг- (Не или Leu)- Asn- Met- Leu- Thr- Arg-Gln- Arg- Tyr- C(=0)NH2.
11. Применение по любому из п.п.1-10, отличающееся тем, что в N-концевой аминокислотной последовательности Y- рецепторного распознавания остаток X1, в случае его присутствия, обозначает Ala, или он отсутствует.
12. Применение по любому из п.п.1-11, отличающееся тем, что в N-концевой аминокислотной последовательности Y-рецепторного распознавания остаток X , в случае его присутствия, обозначает Leu, Не или Ser.
13. Применение по любому из п.п.1-10, отличающееся тем, что N-концевая последовательность представляет собой H2N- Ala- Pro- Leu- Glu- или H2N- Pro- Leu- Glu-.
14. Применение по любому из п.п.1-13, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь), с N- концевой последовательностью Y-рецепторного распознавания, и имеет РР-складчатую структуру, в которой ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь тянется от аминокислотного остатка в амфифильном домене до точки связывания на N- концевом участке агониста, соответствующем домену полипролина РР-складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
15. Применение по п. 14 отличающееся тем, что в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой дисульфидную или лактамную связь.
16. Применение по п. 15, отличающееся тем, что ковалентная внутримолекулярная связь в агонисте является дисульфидной связью, образующейся между остатком L- или D- Cys в альфа- спирали и остатком Cys, расположенным в N- концевой части агониста, соответствующей домену полипролина РР- складчатого пептида, который тянется антипараллельно амфифильному домену.
17. Применение по любому из п.п.1- 12, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (Ь), и в агонисте ограничивающая спиральный поворот внутримолекулярная связь представляет собой лактамную связь, образованную между остатками Lys и Glu в указанном спиральном повороте, или между остатком Lys или Glu в указанном спиральном повороте и остатком Glu или Lys в С- концевой последовательности Y- рецепторного распознавания.
18. Применение по любому из п.п.1-17, отличающееся тем, что агонист содержит как С-концевую, так и N-концевую последовательность Y-рецепторного распознавания, причём С-концевая последовательность по своему N-концу связана с аминокислотной последовательностью амфифильного домена, содержащего, по меньшей мере, один поворот альфа- спирали, прилегающий к N- концу указанного эпитопа, причём указанные С- и N-концевые аминокислотные последовательности связаны пептидными связями, соответственно, с карбоксильными и аминогруппами аминокислоты формулы NH2(CH2)nC02H, где п обозначает целое число от 2 до 12.
19. Применение по п. 18, отличающееся тем, что п обозначает 6, 7, 8, 9 или 10.
20. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист выбирают из [GIn34] РР (SEQ ID No: 4)
[N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Gln34]PP (SEQ ГО N0:34)
[N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg-Ala)3- Lysl8,Gln34]PP (SEQ ГО N0:35)
[N- PEG5000- Lysl3,Gln34]PP (SEQ ED N0:36)
[Ile31,Gln34]PP (SEQ ED No: 5)
[Val31,Gln34]PP (SEQ ED No: 6)
[Leu30,Gln34]PP (SEQ ID No: 7)
[Nle30,Gln34]PP (SEQ ED No: 8)
[Leu28,Gln34]PP (SEQ ED No: 9)
[His26,Gln34]PP (SEQ ED N0:10)
[Ile3,Gln34]PP (SEQ ED N0:11)
[Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:12)
[Alal,Glu4,N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ГО N0:37)
[Alal, Glu4,N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:38)
[Alal,Glu4,N- PEG5000- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:39)
[Alal,Glu4,Arg26(Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ID N0:13)
[Alal,Glu4]PYY (SEQ ID N0:14) и [Alal,Gm4]NPY (SEQ ID N0:15)
[Axg26, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:16) и [Arg26, (МетЗО или Nle30)]NPY
(SEQ ID N0:17)
[Glu4, (МегЗО или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:18) и [Glu4, (Met30 или Nle30)]NPY
(SEQ Ш N0:19)
[Glu4,Arg26]PYY (SEQ Ш N0:20) и [Glu4,Arg26]NPY (SEQ ID N0:21) [Cys2,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:22) [Cys2,Aoc5- 24,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ГО N0:23) [Cys2,Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ Ш N0:30).
[Cys2, N- (8- (8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)- Lysl3, D-Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:31).
[Cys2,N- {(Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3}- Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ГО N0:32).
[Cys2, N-{N'- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма- глутамоил-Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:33).
и их консервативно замещённых аналогов.
21. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Gln34] РР (SEQ ID No: 4) или [Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:12), или их аналог с консервативной заменой.
22. Применение по любому из п.п.1- 21, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему N- концу с целью придать резистентность к аминопептидазной активности.
23. Применение по п.22, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему N-концу, причём углеродная цепь ацилирующей группы содержит 2- 24 углеродных атома.
24. Применение по п.22, отличающееся тем, что агонист ацилирован по своему N-
концу.
25. Применение по любому из п.п.1-24, отличающееся тем, что агонист содержит мотив связывания с сывороточным альбумином, или мотив связывания с гликозаминогликаном (GAG), или мотив, индуцирующий спираль, или является ПЭГилированным.
26. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания с сывороточным альбумином представляет собой липофильную группу.
27. Применение по п.26, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа содержит необязательно замещённую, насыщенную или ненасыщенную, линейную или разветвлённую углеводородную группу, включающую 10-24 углеродных атома.
28. Применение по п.п.25 или 26, отличающееся тем, что в агонисте липофильная группа представляет собой боковую цепь или часть боковой цепи каркаса агониста
29. Применение по п.28, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, связана с остатком в каркасе молекулы простой эфирной, тиоэфирной, амино, сложноэфирной или амидной связью.
30. Применение по п.29, отличающееся тем, что в агонисте боковую цепь, содержащую липофильную группу, выбирают из группы, состоящей из:
CH3(CH2)nCH(COOH)NH- CO(CH2)2CONH-, где п обозначает целое число от 9 до 15,
СНз(СН2)гСО- NHCH(COOH)(CH2)2CONH-, где г обозначает целое число от 9 до 15, и
CH3(CH2)sCO- NHCH((CH2)2COOH)CONH-, где s обозначает целое число от 9 до 15.
CH3(CH2)mCONH-, где m обозначает целое число от 8 до 18, -NHCOCH((CH2)2COOH)NH- СО(СН2)рСН3, где р обозначает целое число от 10 до 16, и
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH- CO(CH2)qCH3, где q обозначает целое число от 10 до 16.
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-, где п обозначает целое число от 9 до 15, CH3(CH2)pNHCO-, где р обозначает целое число от 10 до 18, -CONHCH(COOH)(CH2)4NH- CO(CH2)mCH3, где m обозначает целое число от 8 до 18,
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH- COCH((CH2)2COOH)NH- СО(СН2)рСН3, где р обозначает целое число от 10 до 16,
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH- CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3, где q обозначает целое число от 10 до 16, и
частично или полностью гидрированнового циклопентанофенантренового скелета.
31. Применение по п.28, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой Сп, Си, С\в или С\$ ацильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи каркасного остатка агониста.
32. Применение по п.28, отличающееся тем, что в агонисте боковая цепь, содержащая липофильную группу, представляет собой тетрадеканоильную группу, ацилирующую аминогруппу в боковой цепи каркасного остатка агониста.
33. Применение по п.1, отличающееся тем, что агонист представляет собой Lysl 1-тетрадеканоил - [Lysll,Gln34]PP, [N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил-Lysl3,Gln34]PP (SEQ ГО N0:34), [Alal,Glu4,N- (N'- гексадеканоил)- гамма- глутамоил-Lysl3,Arg26Nle30]PYY (SEQ ГО N0:37) или [Cys2, N- (8- (8- гамма- глутамоиламино-октаноиламино)- октаноил)- Lysl3, D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ГО N0:31),
или его консервативно замещённый аналог.
34. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив представляет собой аминокислотную последовательность, которая является боковой цепью или частью боковой цепи каркаса агониста
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
36. Применение по п.п.34 или 35, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив является конкатамерным или дендримерным.
37. Применение по любому из п.п.34-36, отличающееся тем, что GAG-связывающий мотив представляет собой Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg-Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного мотива GAG- связывания и ипсилон- аминогруппой остатка Lys 18 в [Lysl8,Gln34]PP (SEQ ГО N0:24) или Lys 11 в агонисте [Alal,Glu4,Lysll,Arg26,(Met30 или Nle30]PYY (SEQ ГО N0:25).
38. Применение по п.п.34-36, отличающееся тем, что GAG- связывающий мотив представляет собой Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg-Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala, связанный амидной связью, образованной между С-концом конкатамерного мотива GAG- связывания и ипсилон- аминогруппой остатка Lys 18 в [Lysl8,Gln34]PP (SEQ ED N0:24) или Lys 11 в агонисте [Alal,Glu4,Lysll,Arg26,(Met30 или Nle30]PYY (SEQ ГО N0:25).
39. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив ковалентно связан с С- или N-концом агониста либо непосредственно, либо через линкерный радикал.
40. Применение по п.39, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив ковалентно связан, либо непосредственно, либо через линкерный радикал, с N-концом агониста.
41. Применение по п.п.39 или 40, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность ХВВХВХ и/или ХВВВХХВХ, где В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
42. Применение по п.п.39 или 40, отличающееся тем, что в агонисте GAG-связывающий мотив содержит аминокислотную последовательность [ХВВВХХВХ],,, где п обозначает число от 1 до 5, В обозначает основной аминокислотный остаток, а X обозначает любой аминокислотный остаток.
43. Применение по п.п.39, отличающееся тем, что пептид представляет собой Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala- Ala-Arg- Arg- Arg-Ala- Ala-Arg- Ala- [Gln34]PP (SEQ ID N0:26), [Alal,Glu4,N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:38) или [Cys2,N- {(Ala-Arg- Arg- Arg-Ala- Ala-Arg- Ala)3}- Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:32).
44. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте ПЭГ (PEG) обозначает полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид с молекулярной массой не более 20 кДа.
45. Применение по п.25, отличающееся тем, что агонист представляет собой [Lysll,Gln34]PP, ПЭГилированньш по остатку Lysll, или [Alal,Glu4,Lysl8,Arg26, (МегЗО или Nle30]PYY, ПЭГилированньш по остатку Lys 18, или [Alal,Glu4,N- PEG5000-Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ED N0:39), или [Cys2, N-{N'-(21- амино- 4,7,10,13,16,19-гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма- глутамоил- Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ED N0:33).
46. Способ по п.25, отличающийся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан, либо непосредственно, либо через линкерный радикал, с С-или N- концом агониста.
47. Применение по п.25, отличающееся тем, что в агонисте пептид, индуцирующий спираль, ковалентно связан либо непосредственно, либо через линкерный радикал, с N- концом агониста.
48. Применение по п.п.46 или 47, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4- 20 аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met, Orn, и аминокислотных остатков формулы -NH- C(R1)(R2)- CO-, где Rl обозначает необязательно замещённый С]- Сб алкил, фенил или фенилметил, или R1 и R2 вместе с атомом С, с которым они связаны, образуют циклопентильное, циклогексильное или циклогептильное кольцо.
49. Применение по п.п.46 или 47, отличающееся тем, что пептид, индуцирующий спираль, содержит 4, 5 или 6 остатков Lys.
50. Применение по п.п.46 или 47, отличающееся тем, что агонист представляет собой Lys- Lys- Lys- Lys- Lys- Lys- Lys- [Gln34]- PP.
51. Применение по любому из п.п.26- 35, 42 или 43, отличающееся тем, что в агонисте мотив связывания сывороточного альбумина, или GAG- связывающий мотив, или ПЭГ радикал является боковой цепью или образует часть боковой цепи каркасного углерода, соответствующего любому из нижеприведённых положений PYY или РР: 1,3, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32, или соответствующего любому из нижеприведённых положений NPY: 1, 3, 6, 7, 10, 11, 12, 14, 15,16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30 и 32.
52. Применение по п.51, отличающееся тем, что агонист является агонистом типа (с), а мотив связывания сывороточного альбумина, или GAG-связывающий мотив, или ПЭГ радикал является боковой цепью, или образует часть боковой цепи каркасного углеродного атома, соответствующего любому из приведённых ниже положений PYY, NPY или РР: 2, 5, 8, 9, 13, 14, 20 и 24.
53. Применение по п.51, отличающееся тем, что агонист имеет значение по определению в п. 12, а мотив связывания сывороточного альбумина, или GAG-связывающий мотив, или ПЭГ радикал является боковой цепью, или образует часть боковой цепи каркасного линкерного радикала - (СНг),,-.
54. Y рецепторный агонист, отличный от [Gln34] РР (SEQ Ю No: 4) или [Ile31,Gln34]PP (SEQ ГО No: 5), селективный к Y2 и Y4 рецепторам по сравнению с Y1 рецептором.
55. Y рецепторный агонист, селективный к Y2 и Y4 рецепторам по сравнению с Y1 рецептором, выбранный из
[N- (N- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Gln34]PP (SEQ Ш N0:34) [N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg-Ala)3- Lysl8,Gln34]PP (SEQ JD N0:35) [N- PEG5000- Lysl3,Gln34]PP (SEQ ED N0:36) [Val31,Gln34]PP (SEQ ED No: 6) [Leu30,GLn34]PP (SEQ ED No: 7) [Nle30,Gln34]PP (SEQ ED No: 8) [Leu28,Gln34]PP (SEQ Ш No: 9) [His26,Gln34]PP (SEQ ED N0:10) [Ile3,Gln34]PP (SEQ ED N0:11)
[Alal,Glu4,Ai-g26,(Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ED N0:12)
[Alal,Glu4,N- (N- гексадеканоил)- гамма- глутамоил- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ГО N0:37)
[Alal, Glu4,N- (Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:38)
[Alal,Glu4,N- PEG5000- Lysl3,Arg26,Nle30]PYY (SEQ ID N0:39)
[Alal,Glu4,Arg26(Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ID N0:13)
[Alal,Glu4]PYY (SEQ ID N0:14) и [Alal,Glu4]NPY (SEQ ID N0:15)
[Arg26, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ ID N0:16) и [Arg26, (Met30 или Nle30)]NPY
(SEQ Ш N0:17)
[Glu4, (Met30 или Nle30)]PYY (SEQ Ш N0:18) и [Glu4, (Met30 или Nle30)]NPY (SEQ ID N0:19)
[Glu4,Arg26]PYY (SEQ Ю N0:20) и [Glu4,Arg26]NPY (SEQ ID N0:21) [Cys2,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ Ш N0:22) [Cys2,Aoc5- 24,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ID N0:23) [Cys2,Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ED N0:30).
[Cys2, N- (8- (8- гамма- глутамоиламино- октаноиламино)- октаноил)- Lys 13, D-Cys27,Gln34]PP (SEQ Ш N0:31).
[Cys2,N- {(Ala-Arg- Arg- Arg- Ala- Ala-Arg- Ala)3}- Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ Ш N0:32).
[Cys2, N-{N'- (21- амино- 4,7,10,13,16,19- гексаоксагенэйкозаноил)}- гамма- глутамоил-Lysl3,D- Cys27,Gln34]PP (SEQ ED N0:33).
и их консервативно замещённых аналогов.
56. Y рецепторный агонист, селективный к Y2 и Y4 рецепторам по сравнению с Y1 рецептором, представляющий собой [Alal,Glu4,Arg26,(Met30 или Nle30)]PYY или его аналог с консервативной заменой.
57. Способ лечения состояний, восприимчивых к активации Y2 и/или Y4 рецепторов, заключающийся во введении нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества Y2 и Y4 селективного рецепторного агониста по в любом из п.п.1- 56.
58. Применение по любому из п.п.1-53 или способ по п.56, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показаны регуляция потребления энергии или энергетического метаболизма, контроль интестинальной секреции, снижение моторики желудочно-кишечного тракта или индукция ангиогенеза.
59. Применение или способ по п.58, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что Y2 и Y4 селективный рецепторный агонист содержит GAG- связывающий мотив.
60. Применение или способ по п.58, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что Y2 и Y4 селективный рецепторный агонист содержит мотив связывания с сывороткой.
61. Применение или способ по п.58, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, является состоянием, для которого показана индукция ангиогенеза, и тем, что Y2 селективный рецепторный агонист является ПЭГилированным.
62. Применение или способ по любому из п.п.58-61, отличающееся (или отличающийся) тем, что лечение проводят с целью замедления опорожнения желудка.
63. Применение или способ по п.58, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой ожирение или избыточный вес, состояние, при котором ожирение или избыточный вес рассматривается как способствующий фактор.
64. Применение или способ по п. 63, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой булимию, нейрогенную булимию, Синдром X (метаболический синдром), диабет, сахарный диабет типа 2 или инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), гипергликемию, устойчивость к инсулину, нарушенную толерантность к глюкозе, сердечно- сосудистое заболевание, гипертензию, атеросклероз, заболевание коронарных артерий, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов, удар, тромбоэмболическое заболевание, гиперхолистеринемию, гиперлипидемию, болезнь желчного пузыря, остеоартрит, остановку дыхания во сне, репродуктивные нарушения, такие как синдром поликистоза яичников, или рак молочной железы, простаты или толстой кишки.
65. Способ по п.п.63 или 64, отличающийся тем, что агонист вводят пациенту натощак.
66. Применение или способ по п.58, отличающееся (или отличающийся) тем, что состояние, лечение которого проводится, представляет собой диарею или кишечную гиперсекрецию.
67. Способ по любому из п.п.57-66, отличающийся тем, что агонист вводят пациенту парентерально, включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, назальное, трансдермальное или трансбуккальное введение.
68. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более Y2 и Y4 селективных рецепторных агонистов по определению в любом из п.п. 1-56 вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
69. Косметическая композиция, содержащая один или более Y2 и Y4 селективных агонистов по определению в любом из п.п. 1-56 вместе с косметически приемлемым эксципиентом.
Полипролиноподобная спираль
Фиг. 1А
Фиг. 1В
2/2
Суммарное потребление пищи, подкожное введение мышам .
3 мкг/мышь, 30 мкг/мышь, 1 мкг/мышь, 10 мкг/мышь
Фиг. 2