Настоящее изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где данные конъюгаты образуются при реакции восстановительного аминирования между по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя гидроксиалкилкрахмала или производного гидроксиалкилкрахмала и по меньшей мере одной аминогруппой белка таким образом, что гидроксиалкилкрахмал или его производное являются ковалентно связанными с белком посредством азометиновой связи или аминной связи. Настоящее изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов и конкретному применению конъюгатов.

 

(57) Реферат / Формула:
изобретение относится к конъюгатам гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где данные конъюгаты образуются при реакции восстановительного аминирования между по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя гидроксиалкилкрахмала или производного гидроксиалкилкрахмала и по меньшей мере одной аминогруппой белка таким образом, что гидроксиалкилкрахмал или его производное являются ковалентно связанными с белком посредством азометиновой связи или аминной связи. Настоящее изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов и конкретному применению конъюгатов.

 

---

2420-139254ЕА/011 КОНЪЮГАТЫ ГИДРОКСИАЛКИЛКРАХМАЛА И БЕЛКА, ПОЛУЧЕННЫЕ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫМ АМИНИРОВАНИЕМ
Настоящее изобретение относится к конъюгатам
гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где данные конъюгаты образованы реакцией
восстановительного аминирования между по меньшей мере одной альдегидной группой гидроксиалкилкрахмала или производного гидроксиалкилкрахмала, и по меньшей мере одной аминогруппой белка, таким образом, что гидроксиалкилкрахмал или его производное являются ковалентно связанными с белком посредством азометиновой связи или аминометиленовой связи. Настоящее изобретение также относится к способу получения данных конъюгатов и к определенным применениям конъюгатов.
Общепринято, что стабильность белков может быть улучшена, а иммунный ответ на данные белки снижен, когда данные белки связаны с полимерными молекулами. В W0 94/2 8 024 описано, что физиологически активные белки, модифицированные
полиэтиленгликолем (ПЭГ) проявляют пониженную иммуногенность и антигенность, а также циркулируют в системе кровообращения существенно дольше, чем неконъюгированные белки, т.е. имеют более длинный период полураспада в плазме крови.
W0 03/074087 относится к способу связывания белков с модифицированными полисахаридами, являющимися производными крахмала. Связывание между белком и полисахаридом, гидроксиалкилкрахмалом, осуществляется посредством ковалентной связи, которая образуется между концевой альдегидной группой или функциональной группой, образующейся в результате химической модификации указанной концевой альдегидной группы молекулы гидроксиалкилкрахмала, и функциональной группой белка. В качестве реакционноспособной группы белка рассматриваются аминогруппы, тиогруппы и карбоксильные группы. Более того, хотя в виде многочисленных списков приведено широкое множество возможностей различных связей, включающих различные функциональные группы, теоретически подходящие разнообразные линкерные молекулы и различные химические способы, в действующих
примерах описаны только две альтернативы: во-первых, используется окисленный гидроксиэтилкрахмал, который связывают непосредственно с белками с использованием активации с помощью этилдиметиламинопропилкарбодиимида (EDC), или используется не окисленный гидроксиэтилкрахмал, который связывается
непосредственно, т.е. в отсутствие связывающего соединения, с белком с образованием основания Шиффа, которое впоследствии восстанавливают до соответствующего амина. Таким образом, в иллюстративных примерах W0 03/074087 не описан единственный конъюгат, включающий гидроксиэтилкрахмал, белок и одну или несколько линкерных молекул. Кроме того, поскольку рассматриваются конъюгаты, образованные при восстановительном аминировании, в WO 03/074087 не содержится какой-либо информации, касающейся предпочтительной аминогруппы белка, для которой проводится восстановительное аминирование.
Следовательно, задача настоящего изобретения заключалась в разработке нового конъюгата гидроксиалкилкрахмала,
предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, где конъюгат обладал бы выигрышным терапевтическим действием при введении нуждающемуся в этом субъекту.
Следующая задача настоящего изобретения заключается в разработке нового конъюгата гидроксиалкилкрахмала,
предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и белка, который образуется посредством восстановительного аминирования при взаимодействии аминогруппы олигопептида или полипептида, содержащего альдегидную группу, или кетогруппу, или группу полуацеталя гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно
гидроксиэтилкрахмала, или его производного,
функционализированного альдегидными группами.
Еще одна задача настоящего изобретения заключается в разработке способа получения указанного нового конъюгата, где указанный способ применяется с использованием специфических и селективных условий реакции.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, включающего белок и полимер или производное полимера, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал,
где указанный способ включает ковалентное связывание по меньшей мере одной альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя полимера или производного полимера с по меньшей мере одной аминогруппой белка путем восстановительного аминирования; указанный способ дополнительно включает введение по меньшей мере двух альдегидных групп в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, и взаимодействие по меньшей мере одной из указанных альдегидных групп полимера с аминогруппой белка или взаимодействие полимера с по меньшей мере бифункциональным соединением, где указанное соединение включает две функциональные группы М и Q, при этом одна функциональная группа М взаимодействует с полимером, и одну функциональную группу Q модифицируют химически с получением производного полимера, функционализированного альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, которая взаимодействует с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или производное полимера, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал, который может быть получен с использованием способа получения конъюгата, где указанный способ включает ковалентное связывание по меньшей мере одной альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя полимера или производного полимера с по меньшей мере одной аминогруппой белка путем восстановительного аминирования; указанный способ дополнительно включает введение по меньшей мере двух альдегидных групп в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, и взаимодействие по меньшей мере одной из указанных альдегидных групп полимера с аминогруппой белка или взаимодействие полимера с по меньшей мере бифункциональным соединением, где указанное соединение включает две функциональные группы М и Q, при этом одна функциональная группа М взаимодействует с полимером, и одну функциональную группу Q модифицируют химически с получением производного полимера, функционализированного альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, которая взаимодействует с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
Термин "белок", как он используется в контексте настоящего изобретения, относится к любой последовательности аминокислот, содержащей по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15, более предпочтительно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 35, более предпочтительно по меньшей мере 40, более предпочтительно по меньшей мере 45, более предпочтительно по меньшей мере 50 и еще более предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислот.
Белок может быть получен химическими синтетическими способами или получен из любого источника, относящегося к человеку или другому млекопитающему, или он может быть получен очисткой белка, полученного из природных источников.
В соответствии с настоящим изобретением белок может представлять собой фактор роста, цитокин, активатор, ингибитор, фермент, антитело, антиген, транспортный белок, биоадгезивный белок, гормон, рецептор, суппрессор, или его функциональное производное или фрагмент. Термин "функциональное производное или фрагмент", как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к производному или фрагменту, который полностью или частично сохраняет желаемое биологическое свойство или активность первоначальной молекулы, например, по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 2 0%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 4 0%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 7 0%, более предпочтительно по меньшей мере на 8 0% и особенно предпочтительно по меньшей мере на 90% относительно желаемого биологического свойства или активности первоначальной молекулы. Особенно предпочтительными примерами таких фрагментов являются, например, фрагменты антител.
Примерами белков являются эритропоэтин (ЕРО) , такой как рекомбинантный ЕРО человека (rhEPO), колониестимулирующие факторы (CSF), такие как G-CSF, например, рекомбинантный G-CSF
(rhG-CSF) человека, альфа-интерферон (IFN альфа), бета-интерферон (IFN бета) или гамма-интерферон (IFN гамма), такие как IFN альфа и IFN бета, например, рекомбинантные IFN альфа и IFN бета человека (rhIFN альфа или rhIFN бета), интерлейкины, например, от IL-1 до IL-18, такие как IL-2 или IL-3, как например, рекомбинантные IL-2 или IL-3 человека (rhIL-2 или rhIL-З), белки сыворотки крови, такие как факторы коагуляции II-XIII, такие как факторы VII, VIII, IX, альфа1-антитрипсин (А1АТ), активированный белок С (АРС), плазминогенные активаторы, такие как плазминогенный активатор тканевого типа (tPA), такой как плазминогенный активатор тканей человека (hTPA), AT III, такой как рекомбинантный AT III человека (rhAT III), миоглобин, альбумин, такой как альбумин бычьей сыворотки (BSA), факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) , фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста мозгового происхождения (BDGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста В-клеток (BCGF), нейротропический фактор роста мозгового происхождения (BDNF), мерцательный-нейротрофический фактор (CNTF), трансформирующие факторы роста, такие как TGF альфа или TGF бета, BMP (костные морфогенные белки), гормоны роста, такие как гормон роста человека, факторы некроза опухолей, такие как TNF альфа или TNF бета, соматостатин, соматотропин, соматомедины, гемоглобин, гормоны или прогормоны, такие как инсулин, гонадотропин, меланоцит-стимулирующий гормон (альфа-MSH), трипторелин, гипоталамические гормоны, такие как антидиуретические гормоны (ADH и окситоцин, а также высвобождающие гормоны и ингибирующие высвобождение гормоны), паратироидный гормон, тироидные гормоны, такие как тироксин, тиротропин, тиролиберин, пролактин, кальцитонин, глюкагон, глюкагоно-подобные пептиды (GLP-1, GLP-2 и т.д.), эксендины, такие как эксендин-4, лептин, вазопрессин, гастрин, секретин, интегрины, глюкопротеиновые гормоны (например, LH, FSH и т.д.), меланозид-стимулирующие гормоны, липобелки и апо-липобелки, такие как апо-В, апо-Е, ano-La, иммуноглобулины, такие как IgG, IgE, IgM, IgA, IgD и их фрагменты, гирудин, ингибитор тканевого пути, растительные белки, такие как лектин и рицин, пчелиный яд,
змеиный яд, иммунотоксины, антиген Е, ингибитор альфа-протеиназы, аллерген амброзии, меланин, олиголизиновые белки, белки RGD или необязательно соответствующие рецепторы для одного из данных белков; или функциональные производные или фрагмент любого из данных белков или рецепторов.
Предпочтительными ферментами являются, например, углевод-специфические ферменты, протеолитические ферменты, оксидазы, оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, киназы и лигазы. Конкретными неорганичивающими примерами являются аспарагиназа, аргиназа, аргининдеаминаза,
аденозиндеаминаза, глутаминаза, глутаминаза-аспарагиназа,
фенилаланин, триптофаназа, тирозиназа, супероксиддисмутаза (SOD), эндотоксиназа, каталаза, пероксидаза, калликреин, трипсин, химотрипсин, эластаза, термолизин, липаза, уриказа, аденозиндифосфотаза, пуриннуклеозидфосфорилаза, билирубиноксидаза, глюкозооксидаза, глюкоза, глюконатоксидаза, галактозидаза, глюкоцереброзидаза, глюкуронидаза, гиалуронидаза, тканевый фактор, стрептокиназа, урокиназа, МАР-киназы, ДНКазы, РНКазы, лактоферрин и их функциональные производные или фрагменты.
В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, G-CSF, IFN альфа, IFN бета, ATIII, IL-2, IL-3, миоглобина, SOD, А1АТ и BSA.
В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения белок выбирают из группы, состоящей из rhEPO, rhG-CSF, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, миоглобина, SOD, A1AT и BSA.
Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеиновый белок, необходимый для созревания эритроидных предшественников клеток в эритроциты. У взрослых людей он продуцируется в почках. ЕРО необходим для регулирования уровня красных кровяных клеток в системе кровообращения. Состояния, для которых характерны низкие уровни кислорода в тканях, вызывают повышенный биосинтез ЕРО, который в свою очередь стимулирует эритроцитопоэз. Утрата функции почек, как это, например, видно при хронической почечной
недостаточности, обычно приводит к сниженному биосинтезу ЕРО и сопутствующему снижению числа красных кровяных клеток. Эритропоэтин представляет собой кислый гликопротеиновый гормон массой приблизительно 34000 Да. Эритропоэтин человека представляет собой полипептид из 166 аминокислот, который в природе существует в виде мономера (Lin et al., 1985, PNAS82, 7580-7584, ЕР 148 605 В2, ЕР 411 678 В2). Идентификация, клонирование и экспрессия генов, кодирующих эритропоэтин, описаны, например, в патенте США 4703008. Очистка рекомбинантного эритропоэтина от клеточной культуральной среды, которая поддерживает рост клеток млекопитающих, содержащих рекомбинантные плазмиды эритропоэтина, описана, например, в патенте США 4667016. В данной области техники обычно полагают, что биологическая активность ЕРО in vivo главным образом зависит от степени связывания сиалиловых кислот с ЕРО (см., например, ЕР 428267В1). Теоретически, 14 молекул сиалиловой кислоты может связываться с одной молекулой ЕРО по терминальным концам углеводных боковых цепей, связанных с N- и О-сайтами гликозирования. Для получения высоко сиалилированных препаратов ЕРО необходимы высоко усовершенствованные стадии очистки. Подробную дополнительную информацию, касающуюся эритропоэтина, смотри в публикациях Krantz, Erythropoietin, 1991, Blood, 77 (3): 419-34 (обзор) и Cerami, Beyond erythropoiesis: novel applications for recombinant human erythropoietin, 2001, Semin Hematol., (3 Suppl 7): 33-9 (обзор).
G-CSF представляет собой гликопротеин в 21 кДа, стабилизированный двумя внутрицепочечными дисульфидными связями и содержащий единственный 0-связанный углеводный фрагмент. Зрелый G-CSF содержит 174 аминокислоты. В организме животного G-CSF синтезируется стромальными клетками костного мозга, макрофагами и фибробластами. Его основная функция заключается в том, что он является фактором роста и дифференциации для нейтрофилов и их клеток предшественников. Однако, в данной области также известно, что G-CSF активирует зрелые нейтрофилы. Кроме того, он стимулирует рост/дифференциацию других различных гемопоэтических клеток-предшественников (совместно с
дополнительными гемопоэтическими факторами роста) и промотирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Клинически G-CSF вводят для лечения дефектов на уровне нейтрофилов (вызываемых, например, апластической анемией, миелодисплазией, СПИДом или химиотерапией).
G-CSF можно получать химическими методами синтеза или происходить из любого человеческого источника (см., например, Burgess, A. W. et А1. 1977, Stimulation by human placental conditioned medium of hemopoietic colony formation by human marrow cells, Blood 49 (1977), 573-583; Shall, R. G. et al. 1977, Characterization of colony-stimulating activity produced by human monocytes and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes, Blood 50 (1977), 811) или иметь происхождение от других млекопитающих и может быть получен очисткой из таких природных источников как плацента человека, человеческая кровь или человеческая моча. Кроме того, множество эпителиальных карцином, клетки острой миелоидной лейкемии и различные опухолевые линии клеток (карциномы мочевого пузыря, меддулобластомы) способны экспрессировать данный фактор.
Кроме того, экспрессия G-CSF включает также вариант G-CSF, в котором одна или более аминокислот (например, от 1 до 25, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5, наиболее предпочтительно 1 или 2) были заменены на другие аминокислоты, и который проявляет активность G-CSF (см., например, Riedhaar-Olson, J. F. et al., 1996, Identification of residues critical to the activity of human granulocyte colony-stimulating фактор, Biochemistry 35: 9034-9041 1996; патенты США №№ 5581476; 5214132; 5362853; 4904584). В данной области описано измерение активности G-CSF (измерение активности G-CSF in vitro смотри, например, Shirafuji, N. et al., 1989, A new bioassay for human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders, Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119; измерение активности G-CSF in vivo смотри, например, Tanalca, H. et al., 1991, Pharmacokinetics of recombinant human
granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats, Cancer Research 51, 3710-3714, 1991). Дополнительные публикации, касающиеся измерения активности G-CSF приведены в патенте США No. 6555660; и Nohynek, G. J. et al., 1997, Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and nonneutropenic CD rats, Cancer Chemother Pharmacol (1997) 39; 259-266.
Предпочтительно G-CSF продуцируют рекомбинантным образом. Это включает экспрессию прокариотическими и эукариотическими клетками-хозяевами экзогенных последовательностей ДНК, полученных геномным или кДНК клонированием или путем синтеза ДНК. Подходящие прокариотические хозяева включают различные бактерии, такие как Е. coli. Подходящие эукариотические хозяева включают дрожжи, такие как S. cerevisiae и клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка и клетки обезьян.
Рекомбинантное продуцирование белка известно в технике. Обычно, он включает трансфекцию клеток-хозяев подходящим вектором экспрессии, культивирование клеток-хозяев в условиях, которые дают возможность продуцирования белка и очистку белка от клеток-хозяев. Подробная информация приведена в Souza, L. М. et al. 1986, Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 1986, 232: 61-65, 1986; Nagata, S. et. al., 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319: 415-418, 1986; Komatsu, Y. et al., 1987, Cloning of granulocyte colony-stimulating factor cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli, Jpn J Cancer Res.1987, 78 (11): 1179-1181.
В предпочтительном варианте осуществления, G-CSF имеет последовательность аминокислот зрелого G-CSF человека (см., например, Nagata, S. et. al., 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319: 415-418, 1986), и может дополнительно содержать метионин в качестве аминного конца, что приводит к белку из 175 аминокислот. Кроме того, G-CSF может содержать
остаток серина или треонина вместо метионина.
G-CSF, используемый в способах настоящего изобретения и конъюгаты согласно настоящему изобретению могут включать одну углеводную боковую цепь, присоединенную к G-CSF посредством 0-гликозилирования в положение Thr 133, т.е. G-CSF является гликозилированным (V. Gervais et al., Eur. J. Biochem., 1997, 247, 386-395). Структура углеводной боковой цепи может быть NeuNAc(альфа2-3)Gal(бета1-3) [NeuNAc(альфа2-6)]GalNAc и (альфа2-3)Gal(бета1-3)GalNAc (NeuNAc = N-ацетилнейраминовая кислота, GalNAc = N-ацетилгалактозамин).
Предлагались модификации G-CSF и других полипептидов для того, чтобы ввести по меньшей мере одну дополнительную углеводную цепь по сравнению с природным полипетидом (патент США 5218092). В зависимости от используемого хозяина, продукт экспрессии G-CSF может быть гликозилированным углеводами млекопитающих или других эукариотов. Обычно, когда G-CSF продуцируется в эукариотических клетках, белок гликозилируют посттрансляционно. В результате, углеводная боковая цепь может быть присоединена к G-CSF во время биосинтеза в клетках млекопитающих, особенно человека, насекомых или дрожжей.
Рекомбинантный G-CSF человека (rhG-CSF) обычно используется для лечения различных форм лейкопении. Таким образом, коммерческие препараты rhG-CSF доступны под названиями филграстим (Gran(r) и Neupogen(c)), ленограстим (Neutrogin(c) и Granocyte(c)) и нартограстим (Neu-up(c)). Gran(c) и Neupogen(c) являются негликозилированными и продуцируются в рекомбинантных клетках СНО, и Neu-up(r) является негликозилированным и содержит пять замещающих аминокислот в N-концевой области целого rhG-CSF, продуцируемого рекомбинантными клетками Е. coli.
Интерфероны представляют собой цитокины, которые опосредуют противовирусную, антипролиферативную и имммуномодулирующую активность в ответ на вирусную инфекцию и другие биологические индукторы. В противоположность IFN альфа, IFN бета является высоко специфическим в отношении различных разновидностей. Существует два подтипа IFN бета, IFN бета 1а и IFN бета lb. При промышленном получении основная разница между IFN бета 1а и IFN
бета lb заключается в соответствующих клеточных системах, используемых для их получения.
IFN бета 1а получают с использованием клеток млекопитающих и получают обозначенный 1а поскольку его последовательность аминокислот идентична последовательности природно существующего интерферона бета. IFN бета lb получают с использованием бактерий. Интерфероны, как большинство других белков млекопитающих модифицируют посттрансляционно путем
гликозилирования. Бактрии, однако, не обладают способностью гликозилировать белки, и поэтому IFN бета lb не включает углеводные боковые цепи, выявленные в природном материале. IFN бета 1а содержит 166 аминокислот и имеет молекулярную массу примерно 22500 Да, IFN бета lb содержит 165 аминокислот и имеет молекулярную массу примерно 18500 Да, поскольку в нем отсутствуют N-концевой метионин и гликозилирование вследствие способа получения на основе бактерий. Последовательность аминокислот интерферона бета человека приведена, например, в ЕР 0218 825 А1. О кристаллической структуре интерферона бета сообщалось в публикациях: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) pp 11813-11818, Biochemistry, Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, Goelz S. Коммерческими препаратами интерферона бета являются Betaseron(r) (IFN бета lb), Avonex(r) и Rebif(r) (IFN бета la). Интерферон бета lb производят путем бактериального ферментирования штамма Е. coli, который содержит генетически сконструированную плазмиду, содержащую ген интерферона бетазеГ17 человека. Природный ген был получен из фибробластов человека и изменен таким образом, чтобы он содержал остаток серина вместо остатка цистеина, найденного в положении 17. Интерферон бета 1а получают методами рекомбинантной ДНК технологии с использованием генетически сконструированных клеток яичника китайского хомячка (СНО), в которые был введен ген интерферона бета человека. Последовательность аминокислот IFN бета 1а идентична последовательности природного интерферона бета, полученного из фибробластов человека. Природный интерферон бета и интерферон бета 1а являются гликозилированными, где каждый из них содержит
N-связанный сложный углеводный фрагмент у Asn80. Лекарственные средства интерферона бета предназначены для лечения возвратного ослабленного рассеянного склероза. Однако, существует множество побочных действий, связанных с введением лекарственных продуктов интерферона бета. Кроме того, их вводят путем инъекции (внутримышечной или подкожно), что приводит к дополнительному риску. Сниженные побочные действия и более легкое (например, менее частое) введение являются причиной, почему проводится множество работ для усовершенствования свойств белков. Применяемый главным образом способ заключается в модификации интерферона полиэтиленгликолем, известный как ПЭГилирование.
Формы IFN альфа в природе продуцируются
моноцитами/макрофагами, лимфобластоидными клетками,
фибробластами и рядом различных типов клеток после индукции вирусами, нуклеиновыми кислотами, глюкокортикоидными гормонами и другими индукторами. Известно по меньшей мере 23 различных варианта IFN альфа. Индивидуальные белки имеют молекулярные массы между 19-26 кДа и состоят из белков длиной в 156-166 и 172 аминокислоты. Все подтипы IFN альфа обладают общей консервативной областью последовательности между положениями аминокислот 115-151, тогда как концевые аминосодержащие фрагменты являются переменными. Множество подтипов IFN альфа отличается в своих последовательностях только по одному или двум положениям. Дисульфидные мостики образуются между цистеинами в положениях 1/98 и 29/138. Дисульфидная связь 29/138 является незаменимой для биологической активности, тогда как связь 1/98 может быть восстановлена, не оказывая влияния на биологическую активность. Все формы IFN альфа содержат потенциальный сайт гликозилирования, но большинство подтипов не являются гликозилированными. В противоположность IFN гамма, белки IFN альфа стабильны при рН 2.
Промышленное получение IFN альфа проводят с использованием генетически модифицированной Е. coli. Поскольку бактерии не обладают способностью гликозилировать белок, два варианта IFN альфа (IFN альфа 2а, и IFN альфа 2Ь) , которые используются в разрешенных лекарственных продуктах, оба являются
негликозированными. Основным недостатком коммерческого IFN альфа являются побочные действия. По усовершенствованию лекарственных средств интерферона альфа, которые предназначены для лечения гепатита С, проводилась большая работа. Полимерная модификация белка представляет собой способ, который используется для улучшения свойств белка. Применяемый главным образом способ заключается в модификации интерферона полиэтиленгликолем, известный как ПЭГилирование. Два коммерчески доступных ПЭГилированых варианта IFN альфа известны как PEGIntron(r) (SP) и Pegasys(r) (Roche).
Антитромбин III (AT III) представляет собой ингибитор серинтротеазы, который ингибирует тромбин и фактор Ха (Travis, Annu. Rev. Biochem. 52: 655, 1983). В меньшей степени он также ингибирует факторы IXa, XIa, Xlla, tPA, урокиназу, трипсин, плазмин и калликреин (Menache, Semin. Hematol. 28: 1, 1991; Menache, Transfusion 32: 580, 1992; Lahiri, Arch. Biochem. Biophys. 175: 737, 1976). AT III человека синтезируется в печени в виде одноцепочечного гликопротеина из 432 аминокислот с молекулярной массой приблизительно 58000 Да. Его концентрация в плазме крови находится в диапазоне 14-20 мг/дл (Rosenberg, Rev. Hematol. 2: 351, 1986; Murano, Thromb. Res. 18: 259, 1 980). Белок содержит три дисульфидных мостика (Cys 8-128, Cys 21-95, Cys 247-430) и четыре N-связанных углеводных цепи (Asn 96,-135,-155,-192), что составляет 15% от общей массы (Franzen, J. Biol. Chem. 255: 5090, 1980; Peterson, The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis, Elsevier/North-Holland Biomedical Press 1979, p 43). Антитромбин представляет собой ингибитор серинпротеазы серпинового типа, что является особенно важным для контроля за свертываемостью крови. AT III представляет собой эндогенный антикоагулянт, циркулирующий в плазме крови человека в наибольшей концентрации. Данный ингибитор серинпротеазы участвует в регуляции свертывания при физиологическом и патологическом состояниях (Opal, Crit. Care Med. 2002, 30: 325). Он циркулирует в двух формах с низкой способностью ингибирования тромбина (Pike, J. Biol. Chem. 272: 19562, 1997; Ersdal-Badju, Fed. Proc. 44: 404, 1985) (85-95%
альфа изоформы с 4 биантеннальными, моно- и дисиалилированными олигосахаридными цепями, 5-15% представляет собой бета-изоформу с высокой аффинностью к гепарину, не имеющую гликозилирования в Asn 135, 2-6 концевой связи сиалиловой кислоты). Небольшая фракция циркулирующего AT III обычным образом связывается с протеогликанами на поверхности эндотелиальных клеток сосудов. Данные протеогликаны главным образом представляют собой гепаран сульфат, молекулу, структурно подобную гепарину, которая способна катализировать ингибирование тромбина таким же образом, что и гепарин. Связывание AT III с хорошо определенными пентасахаридными звеньями гепарина вызывает конформационное изменение этого белка (Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370: 644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116: 492, 1983; Olson, J. Biol. Chem. 266: 6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28: 10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78: 516, 1997). Такое связывание катализирует 1000-кратное увеличение ингибирующей активности AT III по отношению к тромбину и фактору Ха (Rosenberg, Fed. Proc. 44: 404, 1985; Bjork, Antithrombin and related inhibitors of coagulation proteinases in Barett, Salvesen (eds.): Proteinase Inhibitors, vol 17, Amsterdam, The Netherlands Elsevier Science Publishers (Biomedical Devision) 1986, p 489; Olson, J. Biol. Chem. 267: 12528, 1992). Такая локализация фракции AT III на эндотелиальной поверхности, где обычно генерируются ферменты внутреннего каскада коагуляции, дает возможность AT III быстро нейтрализовать данные гемостатические ферменты и защитить естественные поверхности от образования тромбов. Таким образом, ключевыми свойствами AT III для предотвращения тромботических случаев являются его способности связывать катализатор гепарин, подвергаться конформационному изменению, которое изменяет его ингибирующие свойства, и необратимо связывать тромбин или фактор Ха, ингибируя таким образом их активность. AT III также обладает превосходными противовоспалительными свойствами, некоторые из которых являются результатом его действия в коагуляционном каскаде (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13: 657). Активированные коагуляционные протеазы, такие как активированный фактор X и тромбин, вносят свой вклад в воспаление; например,
путем высвобождения про-воспалительных медиаторов. Ингибирование AT III данных протеаз предотвращает такие специфические взаимодействия с клетками и последующие реакции (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13: 657). Противовоспалительные свойства AT III, независимо от коагуляции, включают непосредственные взаимодействия с клетками, приводящие к высвобождению, например, простациклина. Связывание AT III с недавно идентифицированным клеточным рецептором, синдеканом-4, приводит к вмешательству во внутриклеточный сигнал, индуцированный медиаторами, такими как липополисахариды и, как следствие, к понижению модуляции воспалительной ответной реакции (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis. 2002, 13: 657). Помимо анализа свободной структуры AT III/ были проведены многочисленные исследования, оценивающие сайты
комплексообразования для олигосахаридных звеньев гепарина вследствие важности комплекса гепарин- AT III для физиологической функции AT III (Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370: 644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116: 492, 1983; Olson, J. Biol. Chem. 266: 6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28: 10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78: 516, 1997). AT III можно получать в соответствии с классическими методами фракционирования плазмы крови человека. Аффинная хроматография (гепарин-сефароза) с использованием высокой аффинности гепарина в качестве лиганда для AT III с последующей термической обработкой для дезактивации вируса используется для отделения от плазмы крови. Помимо фракционирования из плазмы для получения AT III доступны более современные альтернативы в соответствии с рекомбинантными методами получения, которые обеспечивают более безопасный доступ к такому важному терапевтическому белку (Levi, Semin Thromb Hemost 27: 405, 2001). ATryn(tm) представляет собой рекомбинантный AT III человека (rhAT III), продуцируемый GTC Biotherapeutics с использованием трансгенных коз. Были проведены подробные исследования по сравнению структурных и функциональных свойств AT III, полученного из плазмы крови (ph AT III) и rh AT III (Edmunds, Blood, 91: 4561, 1998). На основании данных экспериментов, rh AT III структурно идентичен rh AT III за
исключением гликозилирования. Олигоманнозные структуры связаны с Asn 155 в трансгенно продуцируемом веществе, тогда как сложные структуры идентифицируются в случае белка, полученного из плазмы. Некоторые из галактозных звеньев AT III в rh AT III заменены на звенья GalNac. Высокая степень фукозилирования в rh AT III является другим отличием. Наконец, характер сиалилирования обоих белков отличается по двум направлениям: rh AT III является менее сиалилированным и содержит N-ацетил-, а также N-гликолилнейраминовые кислоты, такое структурное различие между двумя углеводными частями обоих молекул также приводит к различным биохимическим свойствам. На европейском больничном рынке доступны следующие лекарственные средства AT III (источник: IMS-АТС группа 2001): Kybernin(c) (Aventis Behring), AT III (Baxter, Grifols), Atenativ(r) (Pharmacia), Aclotine(r) (LFB), Anbin(r) (Grifols) .
Фактор VIII принимает участие, во внутреннем каскаде свертывания крови протеиназами и служит в качестве кофактора в реакции фактора 1Ха, превращающей фактор X в его активную форму Ха, что, в конечном счете, приводит к образованию фибринового тромба. Отсутствие или нестабильность фактора VIII ведет к гемофилии А, обычному рецессивному х-связанному нарушению свертываемости крови. Частота гемофилии А в каждой этнической группе составляет 1-2 случая на 10000 рождений особей мужского пола. У пациентов либо действительно фактор VIII экспрессируется на уровне ниже нормального, либо они принадлежат к так называемой группе сrm-положительных пациентов (кросс-положительный материал) (примерно 5% пациентов), которые имеют достаточное количество фактора VIII в плазме крови (по меньшей мере 30% от нормального уровня), но у которых белок является нефункциональным. Примерно 50% всех пациентов страдает тяжелой гемофилией с активностью фактора VIII менее 1% от нормальной; у них часто происходят спонтанные кровотечения в суставы, мышцы и внутренние органы. Умеренная гемофилия А, которая наблюдается у 30-40% пациентов, связана с активностью в 5-30% от нормального уровня. Кровотечения происходят только после значительной травмы или хирургического вмешательства. Гемофилия средней тяжести
наблюдается примерно у 10% пациентов. В данном случае активность фактора VIII составляет 2-5% от нормального уровня, и кровотечение происходит уже после незначительной травмы. Период полураспада фактора VIII in-vivo у человека составляет обычно 10-15 часов, но следует отметить, что на кинетику высвобождения, стабильности и разложения также оказывает влияние другой фактор, фактор ван Виллебранда (van Willebrand). Фактор VIII получают или обычной экстракцией из плазмы донорской крови человека, или, в более недавнее время, с использованием рекомбинантных систем. Например, клетки почки детенышей хомяка (ВНК) используют для продуцирования Kogenate(c) (Bayer), тогда как клетки яичника китайского хомяка используют для получения другого продукта, Rekombinate(c) (Baxter) в виде полного одноцепочечного белка из 2 351 аминокислоты с номинальной молекулярной массой 2 67 кДа (Toole et al., 1984, Nature 312: 342) или в виде различных вариантов, где полный В-домен или его часть удалены для того, чтобы получать продукт, обладающий большей стабильностью, и с более высокими выходами при продуцировании (Bhattacharyya et al. 2003, CRIPS 4/3: 2-8). Продукт-предшественник перерабатывается в две полипептидные цепи по 2 00 и 8 0 кДа в аппарате Гольджи, и две цепи, которые удерживаются вместе ионом(ами) металла(ов), экспрессируются в крови (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 6352). Прокоагулирующая активность требует дальнейшего расщепления тромбина с получением фрагментов тяжелой цепи в 54 кДа и 44 кДа плюс фрагмент легкой цепи в 72 кДа (Aly et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 4933). Таким образом, в концентратах фактора VIII, полученных из плазмы крови человека было описано присутствие нескольких фрагментированных полностью активных форм фактора VIII (Anderson et al., 1986, Proc. Natl. Acad, Sci. 83: 2979). Наиболее общее побочное действие при введении плазматического или рекомбинантного фактора VIII заключается в иммунологических реакциях у большого числа пациентов (до 30%), что лишает его терапевтической ценности. В прошлом, были предприняты разнообразные попытки облегчить переносимость для пациентов с помощью пероральной индукции переносимости, но результаты оказались не слишком
обнадеживающими. Были предположены новые генетические способы индуцирования переносимости, которые пока еще не нашли широкого распространения. Авторами настоящего изобретения предполагается, что хезилированный (модифицированный гидроксиксиэтилкрахмалом) белок будет обладать пониженной степенью иммуногенности и таким образом сможет снизить данное осложнение. Фактор VIII очень богат лизиновыми остатками (более 220 в общем количестве 2350 аминокислот) , что можно использовать для подхода на основе восстановительного аминирования.
Альфа1-Антитрипсин (А1АТ, также упоминаемый как ингибитор альфа1-протеиназы) представляет собой ингибитор протеиназы, который, как было показано, виртуально ингибирует все серинпротеиназы млекопитающих (Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p. 655), включая нейтрофилэластазу, тромбин, факторы Ха и XIa. А1АТ представляет собой синтезируемый в печени одноцепочечный гликопротеин из 394 аминокислот и имеющий молекулярную массу 53 кДа. Концентрация его в плазме крови находится в диапазоне 1-1,3 г/л. Присутствие только одного цистеина в целом белке не дает возможность образования внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Молекула содержит три углеводных боковых цепи (Asn 4 6, 83, 247) (Mega J Biol. Chem. 255 (1980) p. 4057; Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p. 4053; Carell FEBS Letters 135 (1981) p. 301; Hodges Biochemistry 21(1982) p. 2805), что составляет 12% его молекулярной массы. Были обнаружены два типа углеводных цепей, имеющие би- и триантеннальную структуру, соответственно (Hodges J: Biol. Chem. 254 (1979) p. 8208). A1AT человека существует по меньшей мере в двадцати различных формах в общей популяции. Микрогетерогенность является результатом различных количеств двух типов углеводных цепей. Ключевой функцией является контроль активности нейтрофилэластазы (Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p. 655). Неконтролируемая активность эластазы приводит к атаке по эпителиальным тканям, что приводит к непоправимому повреждению. Во время процесса дезактивации А1АТ выступает в качестве субстрата для эластазы, связываясь с активным центром протеазы, которая впоследствии дезактивируется за счет образования данного
комплекса. Дефицит А1АТ вызывает, например, эмфизему легких, которая связана с повреждением легочного эпителия. Распределение двух типов углеводных боковых цепей А1АТ по трем сайтам N-гликозилирования А1АТ отличается для каждого изотипа А1АТ. Классическое получение А1АТ проводят в соответствии с методами фракционирования плазмы крови с использованием различных стадий аффинной хроматографии плазмы крови человека. Однако более современным способом продуцирования А1АТ являются рекомбинантные технологии. Компания PPL Therapeutics разработала способ, который позволяет выделять рекомбинантный А1АТ человека (rHAlAT) из молока трансгенных овец (Olman Biochem. Soc. Symp. 63 (1998) p. 141; Tebbutt Curr. Opin. Mol. Cher. 2 (2000) p. 199; Carver Cytotechnology 9 (1992) p. 77; Wright Biotechnology (NY) 9(1991) p.830). Что касается белковой части молекулы rhAlAT, она имеет структуру, идентичную структуре pcLAlAT. Но, как и в случае других рекомбинантно продуцируемых белков человека, различие проявляется в углеводных боковых цепях, особенно в числе остатков сиалиловых кислот.
Активатор плазминогена тканевого типа (tPA) представляет собой трипсиноподобную серинпротеазу, существенную для лизиса тромбов. В присутствии фибринового тромба, tPA превращает плазминоген в плазмин, который разрушает фибрин. tPA проявляет повышенную активность в присутствии фибрина и в результате вызывает фибрин-специфическую активацию плазминогена (М. W. Spellman, L. J. Basa, С. К. Leonard, J. A. Chakel, J. V. O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100). Плазмин растворяет фибрин, приводя к продуктам разложения фибрина. За счет положительного механизма обратной связи фибрин усиливает свое собственное разрушение путем стимуляции tPA-опосредованной активации плазминогена (R. J. Stewart et. Al.The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp.10112-10120) . htPA является физиологическим активатором фибринолиза, который присутствуют в различных типах тканей. Он представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 68 кДа. В природном виде tPA существует в одноцепочечной форме (одноцепочечный активатор плазминогена
тканевого типа, sctPA), которая может быть преобразована путем расщепления плазмина по пептидной связи Arg 275-Ile 276 в двухцепочечную структуру (двухцепочечный активатор плазминогена тканевого типа, tctPA) . Для лечения фибринолиза его продуцируют рекомбинантными методами в виде rtPA (рекомбинантный активатор плазминогена тканевого типа). Существуют различные типы tPA, проявляющие структурные отличия в углеводной структуре. tPA типа I имеет N-связанные олигосахариды у аминокислот Asnll7, Asnl84 и Asn448. tPA типа II является гликозилированным по Asnll7 и Asn448. Оба типа содержат 0-связанный остаток фукозы у Thr61 (К. Mori et al. The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) pp. 32 61-32 67). При исследовании углеводной структуры tPA, экспрессированного в СНО-клетках, показано большое разнообразие ди-, три- и тетра-антеннальных структур в цепях Сахаров (М. W. Spellman, L. J. Basa, С.К. Leonard, J. A. Chakel, J. V. O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100). Первичная структура tPA содержит несколько цистеинов, которые, как предполагается, являются сшитыми, в дополнение к свободному цистеиновому остатку в положении 83, который может взаимодействовать с другим tPA, образуя димер. Несколько результатов показывают, что на выведение tPA in-vivo оказывает влияние углеводная структура, особенно за счет высокоманнозного олигосахарида, присоединенного в положении Asnll7. Другой предполагаемый механизм выведения включает распознавание О-связанного остатка фукозы в положении Thr61 высокоаффинными рецепторами на гепатоцитах. Данный остаток расположен поблизости от Cys83. Биосконструированный tPA (TNK-tPA) был разработан для увеличения продолжительности периода полураспада. Сайт гликозилирования в положении 117 был смещен в положение 103. аспарагин в положении 117 был заменен на Глутамин, а Треонин в положении 103 был заменен на аспарагин. TNK-tPA является устойчивым к дезактивации под действием ингибитора 1 активатора плазминогена вследствие тетра-аланинового замещения в домене протеазы (R. J. Stewart et. Al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp. 10112-10120). TNK-tpA представлен на рынке в виде Tenecteplase(c) (Boehringer Ingelheim). TNK-tPA можно
вводить пациенту в виде одного внутривенного болюса, тогда как tPA нужно вводит в виде болюса с последующей инфузией.
Активированный белок С (АРС) представляет собой модулятор свертываемости крови и воспаления, связанного с тяжелым сепсисом. Активированный белок С возникает из его неактивного предшественника (белка С) под действием тромбина, связанного с тромбомодулином. Данный комплекс отщепляет короткий N-концевой активированный пептид от тяжелой цепи белка С, приводя к активированному белку С. Дротрекогин (Drotrecogin) альфа (активированный) представляет собой рекомбинантный
активированный белок С (rhAPC). Его последовательность аминокислот идентична последовательности полученного из плазмы крови белка С, и он обладает аналогичными свойствами. Активированный белок С поставляется на рынок Eli Lilly как Xigris(r). Он продуцируется клеточной линией человека (НЕК293), в которую введены векторы экспрессии белка С. данную клеточную линию использовали благодаря ее способности осуществлять корректную серию комплекса пост-трансляционных модификаций, которые требуются для функциональной активности. Рекомбинантный активированный белок С человека представляет собой 2-цепочеченый гликопротеин, содержащий 4 сайта N-гликозилирования и 12 дисульфидных связей. Тяжелая цепь содержит 2 50 аминокислот. В данной цепи семь остатков представляют собой цистеин и имеется три сайта N-гликозилирования (Asn-248, Asn-313 и Asn-329). Семь цистеиновых остатков образуют три дисульфидных связи внутри тяжелой цепи и одну дисульфидную связь между цепями. Легкая цепь содержит N-связанный сайт гликозилирования (Asn-97) и 17 цистеиновых остатков, которые образуют восемь дисульфидных связей внутри легкой цепи и одну дисульфидную связь между цепями. Первые девять глутаминовых кислот легкой цепи являются гамма-карбоксилированными (Gla), а аспарагиновая кислота 71 является бета-гидроксилированной. RhAPC имеет идентичную последовательность аминокислот, что и полученный из плазмы крови активированный белок С, но отличается от последнего характером гликозилирования. Активированный белок С представляет собой протеазу, принадлежащую к семейству серинпротеаз. Он играет
важную роль в регулировании свертываемости крови. Благодаря своему антитромботическому действию активированный белок С обладает способностью ингибировать функцию тромбина. Кроме того, активированный белок С представляет собой важный модулятор воспаления, связанного с тяжелым сепсисом. Эндогенные ингибиторы серинпротеазы представляют собой природные ингибиторы активированного белка С, приводя к очень короткому (менее 30 минут) периоду полураспада активированного белка С в системе кровообращения in vivo. Выведение активированного белка С из системы кровообращения опосредовано сочетанием по меньшей мере трех процессов, включая ингибирование ферментативной активности активированного белка С с помощью эндогенных ингибиторов протеаз, выведение активированного белка С и/или комплексов активированный белок С-ингибитор серинпротеазы такими органами, как печень и почки, и разложение активированного белка С и/или комплексов активированный белок С-ингибитор серинпротеазы с помощью протеаз кровообращения или тканевых протеаз. Фаза I клинических исследований при 24-часовой инфузии в дозе 24 мкг/кг/ч приводила к устойчивому состоянию концентрации в плазме крови на уровне 7 0 нг/мл. Период полураспада rhAPC, измеренный в конце инфузии, составлял 0,5-1,9 часа. Концентрации rhAPC в плазме крови падали ниже уровня обнаружения, составляющего 10 нг/мл, через 2 часа после окончания инфузии. Вследствие его короткого физиологического и фармакокинетического периода полураспада при клиническом использовании для лечения сепсиса активированный белок С непрерывно вводят путем инфузии с определенной скоростью для поддержания желаемой концентрации в плазме крови. Были предприняты попытки для улучшения фармакокинетического профиля активированного белка С. Например, D. Т. Berg et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) pp. 442 3-4428, описали сконструированный вариант активированного белка С с пролонгированным периодом полураспада в плазме крови.
Фактор VII участвует во внутреннем каскаде коагуляции протеиназ и промотирует гемостаз путем активации внешнего пути каскада коагуляции. F VII превращается в фактор Vila с помощью фактора Ха, фактора XI1а, фактора 1Ха или тромбина за счет
незначительного протеолиза. В присутствии тканевого фактора и ионов кальция фактор Vila затем превращает фактор X в фактор Ха за счет ограниченного протеолиза. Фактор Vila будет также превращать фактор IX в фактор 1Ха в присутствии тканевого фактора и ионов кальция. Фактор VII представляет собой витамин К-зависимый гликопротеин, состоящий из 406 остатков аминокислот (MW 50 кДальтон). Фактор VII получают или обычной экстракцией из плазмы донорской крови человека, или, в более недавнее время, с использование рекомбинантных систем. Novo Nordisk использует клетки почки детенышей хомяка (ВНК) для продуцирования NovoSeven(c), экспрессируемый в виде одноцепочечного белка из 406 аминокислот с номинальной молекулярной массой 55 кДа (Thim, L. et al., Biochemistry 27:7785-7793 (1988). Молекула содержит четыре углеводных боковых цепи. Две О-связанные углеводные боковые цепи расположены у Ser52, 60 и две N-связанные углеводные боковые цепи расположены при Asn 145, 322 (Thim, L. et al., Biochemistry 27: 7785-7793 (1988).
Фактор VII предназначен для лечения случаев кровотечения у пациентов с гемофилией А или В, имеющих ингибиторы фактора VIII или фактора IX. Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-Фактор VII для получения лекарственного средства для лечения случаев гемофилии А или В у пациентов, обладающих ингибиторами фактора VIII или фактора IX.
Фактор IX витамин К-зависимый белок плазмы крови, который участвует во внутреннем пути свертывания крови с помощью фактора X, превращающего его в активную форму в присутствии ионов Са (2+), фосфолипидов и фактора Villa. Фактор IX представляет собой гликопротеин с примерной молекулярной массой 55000 Да, состоящий из 415 аминокислот в виде единственной цепи Yoshitake S. et al., Biochemistry 24: 3736-3750 (1985)). Фактор IX получают или обычной экстракцией из плазмы донорской крови человека, или, в более недавнее время, с использованием рекомбинантных систем. Wyeth использует клетки яичников китайского хомяка (СНО) для продуцирования BeneFIX(r). Он имеет первичную последовательность аминокислот идентичную Ala 148 аллельной форме полученного из плазмы крови фактора IX, и обладает структурными и
функциональными характеристиками, аналогичными таковым для эндогенного фактора IX. Белок содержит восемь углеводных боковых цепей. Шесть О-связанных углеводных боковых цепей расположены при Ser 53, 61 и у треонина 159, 169, 172, 179 и две N-связанных углеводных боковых цепи расположены при Asn 157, 167 (Yoshitake S. et al., Biochemistry 24: 3736-3750 (1985); Balland A. et al., Eur J Biochem. 1988; 172 (3) : 565-72) .
Фактор IX предназначен для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (например, при врожденном дефиците фактора IX или болезни Кристмаса) , включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах. Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-Фактор IX для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (например, при врожденном дефиците фактора IX или болезни Кристмаса), включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах.
В контексте настоящего изобретения, термин
"гидроксиалкилкрахмал" (HAS) относится к производному крахмала, который является замещенным по меньшей мере одной гидроксиалкильной группой. Предпочтительный гидроксиалкилкрахмал по настоящему изобретению имеет строение, соответствующее формуле (I)
HAS'
где восстановительный конец молекулы крахмала показан в его неокисленной форме и концевое сахаридное звено показано в виде его полуацеталя, который, в зависимости, например, от растворителя, может существовать в равновесии с его альдегидной формой.
Термин "гидроксиалкилкрахмал", как он использован в настоящем изобретении, не ограничен соединениями, в которых концевые углеводные фрагменты включают гидроксиалкильные группы Ri, R: и/или R3, как показано для краткости в формуле (I)/ но также относится к соединениям, в которых где-либо присутствует по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа; либо концевой углеводный фрагмент и/или оставшаяся часть молекулы крахмала, HAS', замещена гидроксиалкильными группами Ri, R2 или R5.
Также допустим гидроксиалкилкрахмал, включающий две или более различные гидроксиалкильные группы.
По меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, имеющаяся в HAS, может содержать две или более гидроксильных групп. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, имеющаяся в HAS, содержит одну гидроксильную группу.
Выражение "гидроксиалкилкрахмал" также включает
производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В данном контексте является предпочтительным, чтобы алкильная группа была замещена галогеном, особенно фтором, или арильной группой. Кроме того, гидроксильная группа в гидроксиалкильной группе может быть этерифицирована с образованием сложного или простого эфира.
Помимо этого, вместо алкила можно использовать линейные или разветвленные замещенные или незамещенные алкеновые группы.
Гидроксиалкилкрахмал является производным, представляющим собой простой эфир крахмала. Помимо указанных простых эфиров в контексте настоящего изобретения также можно использовать другие производные крахмала. Например, можно использовать производные, которые включают этерифицированные с образованием сложного эфира гидроксильные группы. Данные производные могут, например, представлять собой производные незамещенных моно или дикарбоновых кислот, имеющих 2-12 атомов углерода или их замещенные производные. В частности, можно использовать производные незамещенных монокарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода, в частности производные уксусной кислоты. В данном контексте предпочтительными являются ацетилкрахмал,
бутирилкрахмал и пропионилкрахмал.
Кроме того, предпочтительными являются производные незамещенных дикарбоновых кислот, имеющих 2-6 атомов углерода.
В случае производных дикарбоновых кислот, полезно, чтобы вторая карбоксильная группа дикарбоновой кислоты также была этерифицирована. Кроме того, в контексте настоящего изобретения также можно использовать моноалкиловые эфиры дикарбоновых кислот. Для замещенных моно- или дикарбоновых кислот замещающие группы предпочтительно могут быть такими же, как отмечалось для замещенных алкильных остатков.
Методы этерификации крахмала с образованием сложноэфирных производных известны в данной области (см., например, Klemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, особенно часть 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN3-527-29489-9).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, используется гидроксиалкилкрахмал, соответствующий вышеуказанной формуле (I). В формуле (I) подробно показанное сахаридное кольцо и остатки, обозначенные как HAS', представляют вместе предпочтительную молекулу гидроксиалкилкрахмала. Другие сахаридные кольцевые структуры, включенные в HAS', могут быть такими же или могут отличаться от подробно показанного сахаридного кольца.
Что касается остатков Rlr R2 и R3 в соответствии с формулой (I), то здесь нет особых ограничений. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления Ri, R; и R3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 2 до 10 атомов углерода в соответствующем алкильном остатке, или группу формулы (CHLCH30) n-Н, где п представляет собой целое число, предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Водород и гидроксиалкильные группы, имеющие от 2 до 10 атомов углерода являются предпочтительными. Более предпочтительно, гидроксиалкильная группа имеет от 2 до б атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода и еще более предпочтительно от 2 до
3 атомов углерода.
Таким образом "гидроксиалкилкрахмал"
предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал,
гидроксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, где
гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал являются особенно предпочтительными и гидроксиэтилкрахмал является наиболее предпочтительным.
Алкильная, арильная, аралкильная и/или алкарильная группа может быть линейной или разветвленной и замещенной подходящим образом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где Ri, R3 и R3 независимо представляют собой водород или линейную или разветвленную гидроксиалкильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода.
Таким образом, Ri, и R3 предпочтительно могут
представлять собой гидроксигексил, гидроксипентил,
гидроксибутил, гидроксипропил, такой как 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 2-гидроксиизопропил, гидроксиэтил, такой как 2-гидроксиэтил, водород, и 2-гидроксиэтильная группа является особенно предпочтительной.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где Ri, R3 и R3 независимо представляют собой водород или 2-гидроксиэтильную группу, особенно предпочтительным является вариант осуществления, где по меньшей мере один остаток Ri, R3 и R3 представляет собой 2-гидроксиэтильную группу.
Гидроксиэтилкрахмал (HES) является наиболее
предпочтительным для всех вариантов осуществления настоящего изобретения.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер представляет собой гидроксиэтилкрахмал и производное полимера представляет собой производное гидроксиэтилкрахмала.
Гидроксиэтилкрахмал (HES) представляет собой производное существующего амилопектина в природе, и в организме он разлагается альфа-амилазой. HES представляет собой замещенное производное углеводного полимера амилопектина, которое
присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95% по массе. HES проявляет благоприятные биологические свойства и используется в качестве агента для объемной замены крови и при гемодилюционной терапии в клиниках (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; и Weidler et al, 1991, Arzneim.- Forschung/Drug Res., 41, 494-498).
Амилопектин состоит из фрагментов глюкозы, где в основной цепи присутствуют альфа-1,4-гликозидные связи, а в местах разветвления выявлены альфа-1,б-гликозидные связи. Физико-химические свойства данной молекулы главным образом определяются типом гликозидных связей. Благодаря гибридной альфа-1,4-гликозидной связи образуются спиральные структуры, содержащие примерно шесть мономеров глюкозы на один виток спирали. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы путем замещения. Введение гидроксиэтильной группы можно осуществить посредством щелочного гидроксиэтилирования. Приспосабливая соответствующим образом реакционные условия, можно использовать различную реакционную способность соответствующей гидроксильной группы в незамещенном мономере глюкозы применительно к гидроксиэтилированию. Благодаря этому, специалист в определенной степени способен влиять на характер замещения.
HES характеризуется главным образом молекулярно-массовым распределением и степенью замещения. Существует две возможности описания степени замещения:
1. Степень замещения может быть описана как часть замещенных мономеров глюкозы по отношению ко всем фрагментам глюкозы.
2. Степень замещения может быть описана как молярное замещение, где указывается число гидроксиэтильных групп на фрагмент глюкозы.
В контексте настоящего изобретения степень замещения, обозначенная как DS, относится к молярному замещению, как описано выше, см., также Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278, как процировано выше, в частности на стр.273).
Растворы HES присутствуют в полидисперсных композициях, где каждая молекула отличается от другой в отношении степени полимеризации, числа и характера сайтов разветвления и характера замещения. Следовательно, HES представляет собой смесь соединений с различной молекулярной массой. Поэтому, конкретный раствор HES определяется с использованием средней молекулярной массы с помощью статистических способов. В данном контексте, М" рассчитывается как среднее арифметическое в зависимости от числа молекул. Альтернативно, М" (или MW) , средняя масса, представляет собой единицу, которая зависит от массы HES.
В контексте настоящего изобретения гидроксиэтилкрахмал предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу (среднюю массу) от 1 до 300 кДа. Гидроксиэтилкрахмал, может далее обладать предпочтительной молярной степенью замещения от 0,1 до 3, предпочтительно 0,1 до 2, более предпочтительно, от 0,1 до 0,9, предпочтительно 0,1 до 0,8, и предпочтительным соотношением между С2 : Сб замещением в диапазоне от 2 до 20 в отношении гидроксиэтильных групп.
Термин "средняя молекулярная масса", как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к массе, определенной в соответствии со способом LALLS-(рассеяние света лазера под малым углом)-GPC, как описано в Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; и Weidler et al, 1991, Arzneim.- Forschung/Drug Res., 41, 494-498. Для средней молекулярной массы 10 кДа и меньше, дополнительно проводят калибрование по стандарту, масса которого предварительно была определена с использованием LALLS-GPC.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала составляет от 1 до 300 кДа, более предпочтительно от 2 до 2 00 кДа, более предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Примером HES, имеющим среднюю молекулярную массу примерно 130 кДа, является HES со степенью замещения от 0,1 до 0,9, предпочтительно от 0,2 до 0,8, как например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно от 0,4 до 0,7, как например,
0,4, 0,5, 0,6 или 0,7.
Примером HES, имеющим среднюю молекулярную массу примерно 130 кДа, является Voluven(r) от Fresenius. Voluven(r) представляет собой искусственный коллоид, используемый, например, для объемного замещения, применяемого по терапевтическим показаниям для лечения и профилактики гиповолемии. Voluven(r) характеризуется средней молекулярной массой 130 кДа +/-20000 Да, молярным замещением, составляющим 0,4, и соотношением С2:С6, равным приблизительно 9:1.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу от 4 до 100 кДа, предпочтительно от 4 до 70 кДа.
Предпочтительными диапазонами средней молекулярной массы являются, например, 4-70 кДа или 10-70 кДа, или 12-70 кДа, или 18-70 кДа, или 50-70 кДа, или 4-50 кДа, или 10-50 кДа, или 12-50 кДа, или 18-50 кДа, или 4-18 кДа, или 10-18 кДа, или 12-18 кДа, или 4-12 кДа, или 10-121 кДа, или 4-10 кДа.
В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне более 4 кДа и менее 7 0 кДа, как например, примерно 10 кДа, или в диапазоне от 9 до 10 кДа, или от 10 до 11 кДа, или от 9 до 11 кДа, или примерно 12 кДа, или в диапазоне от 11 до12 кДа, или от 12 до 13 кДа, или от 11 до 13 кДа, или примерно 18 кДа, или в диапазоне от 17 до 18 кДа, или от 18 до 19 кДа, или от 17 до 19 кДа, или примерно 50 кДа, или в диапазоне от 4 9 до 50 кДа, или от 50 до 51 кДа, или от 4 9 до 51 кДа.
Что касается более высокого предела молярной степени замещения (DS), то также возможны значения вплоть до 3,0, такие как 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0, значения ниже 2,0 являются предпочтительными, значения ниже 1,5 являются более предпочительными, значения ниже 1,0, такие как 0,7, 0,8 или 0,9 являются еще более предпочтительными.
Следовательно, предпочтительные диапазоны молярной степени
замещения составляют от 0,1 до 2, или от 0,1 до 1,5, или 0,1 до 1,0, или от 0,1 до 0,9, или от 0,1 до 0,8. Более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,2 до 2, или от 0,2 до 1,5, или от 0,2 до 1,0, или от 0,2 до 0,9, или 0,2 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,3 до 2 или от 0,3 до 1,5, или от 0,3 до 1,0, или от 0,3 до 0,9, или от 0,3 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярной степени замещения составляют от 0,4 до 2 или от 0,4 до 1,5, или от 0,4 до 1,0, или от 0,4 до 0,9, или от 0,4 до 0,8.
Поскольку рассматривается степень замещения (DS), DS предпочтительно составляет по меньшей мере 0,1, более предпочтительно по меньшей мере 0,2, более предпочтительно по меньшей мере 0,4 и более предпочтительно по меньшей мере 0,4. Предпочтительные диапазоны DS составляют от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, более предпочтительно от 0,1 до 0,8, более предпочтительно от 0,2 до 0,8, более предпочтительно от 0,3 до 0,8 и даже более предпочтительно от 0,4 до 0,8, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,7, более предпочтительно от 0,2 до 0,7, более предпочтительно от 0,3 до 0,7 и более предпочтительно от 0,4 до 0,7. Особенно предпочтительными значениями DS являются, например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9, где значения 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 являются более предпочтительными, значения 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 являются даже более предпочтительными, значения 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 являются еще более предпочтительными, и, например, 0,4 и 0,7 являются особенно предпочтительными.
В контексте настоящего изобретения данное значение молярной степени замещения, такое как 0,9, может представлять собой точное значение, или можно понимать, что значение находится в диапазоне от 0,85 до 0,94 или 0,8 может представлять собой точное значение, или можно понимать, что значение находится в диапазоне от 0,75 до 0,84. Следовательно, например, данное значение 0,1, может представлять собой точное значение, равное 0,1, или находиться в диапазоне от 0,05 до 0,14, данное значение
0,4, может представлять собой точное значение, равное 0,4, или находиться в диапазоне от 0,35 до 0,44, или данное значение 0,7, может представлять собой точное значение, равное 0,7, или находиться в диапазоне от 0,65 до 0,74.
Особенно предпочтительными сочетаниями молекулярной массы гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и его степени замещения DS являются, например, 10 кДа и 0,4, или 10 кДа и 0,7, или 12 кДа и 0,4, или 12 кДа и 0,7, или 18 кДа и 0,4, или 18 кДа и 0,7, или 50 кДа и 0,4, или 50 кДа и 0,7, или 100 кДа и 0,7.
Что касается рассматриваемого соотношения С2:С6 замещения, указанное замещение находится в диапапзоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапапзоне от 2 до 15 и еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.
В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящего изобретения, также можно использовать смеси гидроксиэтилкархмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и/или различные степени замещения и/или различные соотношения С2:Сб замещения. Следовательно, можно использовать смеси гидроксиэтилкархмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и различные степени замещения и различные соотношения С2:Сб замещения, или имеющих различные средние молекулярные массы и различные степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:Сб замещения, или имеющих различные средние молекулярные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и различные соотношения С2:Сб замещения, или имеющих одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени замещения и различные соотношения С2:Сб замещения, или имеющих различные средние молекулярные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:Сб замещения, или имеющих одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые или примерно одинаковые степени замещения и одинаковые или примерно одинаковые соотношения С2:Сб замещения, или одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые или
примерно одинаковые степени замещения и различные соотношения С2:Сб замещения, или имеющих примерно одинаковые средние молекулярные массы и примерно одинаковые степени замещения и примерно одинаковые соотношения С2:Сб замещения.
В различных конъюгатах и/или различных способах согласно настоящему изобретению можно использовать различные гидроксиалкилкрахмалы, предпочтительно различные
гидроксиэтилкрахмалы и/или смеси различных
гидроксиалкилкрахмалов, предпочтительно смеси различных гидроксиэтилкрахмалов.
Реакцию восстановительного аминирования согласно изобретению, где полимер или производное полимера ковалентно связывают через по меньшей мере одну альдегидную группу с по меньшей мере одной аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования, предпочтительно проводят при температуре от 0 до 4 0°С, более предпочтительно от 0 до 37°С, более предпочтительно от 0 до 25°С, в частности от 4 до 21°С, но особенно предпочтительно от 0 до 21°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 0,5 до 72 часов, более предпочтительно от 2 до 4 8 часов и особенно предпочтительно от 4 до 7 часов. В качестве растворителя для реакции предпочтительной является водная среда.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С, но особенно предпочтительно от 0 до 21°С.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в водной среде.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С, но особенно
предпочтительно от 0 до 21°С, в водной среде.
Термин "водная среда", как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к растворителю или смеси
растворителей, включающих воду в диапазоне по меньшей мере от 10% по весу, более предпочтительно по меньшей мере от 20% по
весу, более предпочтительно
по меньшей
мере
30% по
весу,
более предпочтительно по меньшей мере
от 4 0%
. по
весу,
более
предпочтительно
меньшей
мере
50%
весу,
более
предпочтительно
меньшей
мере
60%
весу,
более
предпочтительно
меньшей
мере
70%
весу,
более
предпочтительно
меньшей
мере от
80% по
весу, еще
более
предпочтительно по меньшей мере от 90% по весу до 100% по весу из расчета на вес использованных растворителей. Предпочтительной реакционной средой является вода.
Значение рН реакционной среды обычно находится в диапазоне от 4 до 9, или от 4 до 8, или от 4 до 7,5 или от 4 до 7,3.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, рН, при котором проводят реакцию восстановительного аминирования, составляет ниже 10, предпочтительно ниже 7,5, предпочтительно 7,3, более предпочтительно меньше или равное 7, и наиболее предпочтительно ниже 7, т.е. в кислотном диапазоне. Предпочтительные диапазоны следовательно составляют от 3 до ниже 7, более предпочтительно от 3,5 до 6,5, еще более предпочтительно от 4 до 6, еще более предпочтительно от 4,5 до 5,5 и особенно предпочтительно примерно 5,0, т.е. 4,6, или 4,7, или 4,8, или 4,9, или 5,0, или 5,1, или 5,2, или 5,3, или 5,4.
Предпочтительными диапазонами, наряду с прочими являются 3-6,9, или 3-6,5, или 3-6, или 3-5,5, или 3-5, или 3-4,5, или
3- 4, или 3-3,5, или 3,5-6,9, или 3,5-6,5, или 3,5-6, или 3,5-5,5, или 3,5-5, или 3,5-4,5, или 3,5-4, или 4-6,9, или
4- 6,5, или 4-6, или 4-5,5, или 4-5, или 4-4,5, или 4,5-6,9 или 4,5-6,5, или 4,5-6, или 4,5-5,5, или 4,5-5, или 5-6,9, или
5- 6,5, или 5-6, или 5-5,5, или 5,5-6,9, или 5,5-6,5, или 5,5-6, или 6-6,9, или 6-6,5, или 6,5-6,9.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при рН 7 или менее, более предпочтительно при рН 6 или менее.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 0 до 21°С, предпочтительно от 4 до 21°С, при рН 7,5 или менее, предпочтительно 7 или менее, предпочтительно б или менее.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в водной среде при рН 7 или менее, более предпочтительно при рН б или менее.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С, в водной среде при рН 7 или менее, более предпочтительно при рН б или менее.
Молярное соотношение производное полимера:белок, используемое в реакции, предпочтительно находится в диапазоне от 200:1 до 5:1, более предпочтительно от 100:1 до 10:1 и особенно предпочтительно от 75:1 до 20:1.
Неожиданно было установлено, что возможно, особенно в приведенных выше предпочтительных диапазонах рН, в частности при рН ниже 7 и больше или равном 4, проводить взаимодействие производного полимера главным образом по аминогруппе, расположенной на N-конце белка. Термин "главным образом", как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к варианту осуществления, где по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 8 5% доступных N-концевых аминогрупп взаимодействует в реакции восстановительного аминирования. Также возможно осуществить взаимодействие по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, или по меншей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по мнеьшей мере 98%, или по меньшей мере 99% доступных N-концевых аминогрупп. Хотя связывание аминогрупп, отличающихся от N-концевых аминогрупп нельзя полностью регулировать, предполагается, что связывание посредством восстановительного аминирования согласно настоящему изобретению при рН ниже 7, предпочтительно ниже 6, происходит селективно по N-концевым
аминогруппам. В частности, данные условия реакции являются предпочтительными для белков, которые являются стабильными при данных условиях. Если белок, например, является лабильным к действию кислот, такой как альфа1-антитрипсин, то является предпочтительным выбирать подходящие условия реакции, в частности от рН ниже чем 7,5 до значения, превышающего 5.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где белок включает N-концевую аминогруппу и по меньшей мере одну дополнительную аминогруппу; указанный конъюгат включает полимер, который главным образом связан с N-концевой аминогруппой.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу связывания гидроксиалкилкрахмала, функционализированного
альдегидной, кето или полуацетальной группой, или производного гидроксиалкилкрахмала, функционализированного альдегидной, кето или полуацетальной группой, с N-концевой аминогруппой белка, при этом указанный способ включает введение указанного гидроксиалкилкрахмала или его производного в реакцию восстановительного аминирования при рН 7 или менее, предпочтительно при рН 6 или менее, указанную реакцию восстановительного аминирования предпочтительно проводят в водной среде.
В соответствии с настоящим изобретением
гидроксиалкилкрахмал, функционализированный альдегидными
группами, или производное гидроксиалкилкрахмала,
функционализированное альдегидными группами, являются
предпочтительными.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу связывания гидроксиэтилкрахмала, функционализированного
альдегидной, кето или полуацетальной группой, или производного гидроксиэтилкрахмала, функционализированного альдегидной, кето или полуацетальной группой, селективно с N-концевой аминогруппой белка, при этом указанный способ включает введение указанного гидроксиалкилкрахмала или его производного в реакцию
восстановительного аминирования при рН 7 или менее, предпочтительно при рН б или менее, указанную реакцию восстановительного аминирования предпочтительно проводят в водной среде; используемый гидроксиэтилкрахмал предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и DS примерно 0,7.
Взаимодействие производного полимера и белка, которое протекает между альдегидной группой или кето группой, или группой полуацеталя и аминогруппой, представляет собой восстановительное аминирование, при котором образуется основание Шиффа. Впоследствии после взаимодействия данное основание может быть восстановлено с использованием по меньшей мере одного восстановительного агента, с образованием стабильной связи между производным полимера и белком. Также возможно проводить реакцию в присутствии по меньшей мере одного восстановительного агента. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реакцию восстановительного аминирования проводят в присутствии по меньшей мере одного восстановительного агента.
Предпочтительные восстановительные агенты представляют собой боргидрид натрия, цианоборгидрид натрия, органические комплексные соединения бора, такие как 4-(диметиламино)пиридин-борановый комплекс, N-метилморфолин-борановый комплекс, N-фенилморфолин-борановый комплекс, лутидин-борановый комплекс,
триэтиламин-борановый комплекс или триметиламин-борановый комплекс. Особенно предпочтительным является цианоборгидрид натрия.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в присутствии NaCNBH3.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят в водной среде при рН 7 или менее, предпочтительно б или менее, в присутствии восстановительного агента, предпочтительно NaCNBH3.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 4 до 21°С в водной среде при рН 7 или менее, предпочтительно б или менее, в присутствии восстановительного агента, предпочтительно NaCNBH3.
Молярное соотношение производное полимера:белок, используемое в реакции, составляет предпочтительно в диапазоне от 200:1 до 10:1, более предпочтительно от 100:1 до 10:1 и особенно предпочтительно от 75:1 до 20:1.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, где указанный способ включает взаимодействие полимера или производного полимера, включающего альдегидную группу в водной среде с аминогруппой белка в присутствии восстановительного агента, при этом
восстановительный агент предпочтительно представляет собой NaCNBH3.
В соответствии с первым предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, согласно которому полимер содержит по меньшей мере две альдегидные группы, которые вводят в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, полимер предпочтительно включает по меньшей мере одну структуру, соответствующую формуле:
В соответствии с данным вариантом осуществления настоящего изобретения, можно использовать отдельный окислитель или комбинацию окислителей, которые способны окислять по меньшей мере одно сахаридное кольцо полимера с образованием открытого сахаридного кольца, содержащего по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две альдегидные группы. Данная реакция проиллюстрирована следующей реакционной схемой, на которой показано сахаридное кольцо полимера, которое окисляют с получением раскрытого кольца, имеющего две альдегидные группы:
Подходящими окислителями, наряду с другими, являются периодаты, такие как периодаты щелочного металла или смеси двух или более из них, где периодат натрия и периодат калия являются предпочтительными.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают реакции окисления с раскрытием цикла с использованием периодата, с образованием производного полимера, имеющего по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две альдегидные группы.
Для такой реакции окисления можно использовать полимер, содержащий восстановительный конец или в окисленном или в
неокисленном виде, где неокисленная форма является предпочтительной.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где используют полимер, восстановительный конец которого находится в неокисленном виде.
Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 0 до 5°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 1 минуты до 5 часов и особенно предпочтительно от 10 минут до 4 часов. В зависимости от желаемой степени окисления молярное соотношение периодат:полимер может быть выбрано подходящим образом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где реакцию окисления с раскрытием цикла проводят при температуре от 0 до 5°С.
Реакцию окисления полимера периодатом предпочтительно проводят в водной среде, наиболее предпочтительно в воде.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где реакцию окисления с раскрытием цикла проводят в водной среде. Подходящее значение рН реакционной смеси можно регулировать путем доабвления по меньшей мере одного подходящего буфера. Среди предпочтительных буферов можно отметить натрийацетатный буфер, фосфатный или боратный буферы.
Гидроксиэтилкрахмал, подвергаемый указанной реакции окисления с раскрытием цикла, предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно
0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и DS примерно 0,7.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об/об), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ,
гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 2 0 до 35°С, предпочтительно от 20 до 30°С.
В соответствии с предпочтительным вариантом окисления окисленный полимер, образующийся в результате реакции окисления, очищают с использованием по меньшей мере одного подходящего способа, такого как ультрафильтрование и/или диализ для того, чтобы, например, удалить нежелательные соли и полимерные компоненты с низкой молекулярной массой, что также дает возможность контролирования диапазона молекулярной массы окисленного полимера.
Окисленный полимер можно использовать непосредственно для взаимодействия с белком или его выделяют подходящим способом на первой стадии, например, путем лиофилизации, и повторно растворяют в воде для конъюгации с белком на второй стадии. Что касается конденсации по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой полимера путем восстановительного аминирования, здесь можно сделать ссылку на приведенное выше подробное описание, касающееся конкретных реакционных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН и температура. В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего
изобретения, в соответствии с которыми в качестве белков используют rhIL 2, rhIL 3, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhEPO, rhAT III, rhG-CSF, BSA, миоглобин и SOD, восстановительное аминирование предпочтительно проводят при температуре от 0 до 5°С, например, примерно при 4°С и рН примерно от 4,5 до 5,5, например, примерно 5,0, при этом, время реакции составляет примерно от 2 0 до 30 часов, например, примерно 2 4 часа.
В соответствии со вторым предпочтительным вариантом
осуществления полимер подвергают взаимодействию с по меньшей мере бифункциональным соединением, включающим по меньшей мере одну функциональную группу М, способную взаимодействовать с полимером, и по меньшей мере одну функциональную группу Q, которая представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, которая взаимодействует с белком при восстановительном аминировании.
Предпочтительным является использование соединения, содержащего не считая альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, по меньшей мере одну карбоксильную группу или по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно одну карбоксильную группу или одну реакционноспособную карбоксильную группу. Альдегидная группа или кетогруппа, или группа полуацеталя и карбоксильная группа или реакционноспособная карбоксильная группа могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно, углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой арильный остаток, имеющий от 5 до 7 и предпочтительно 6 атомов углерода. Наиболее предпочтительно углеводородный остаток представляет собой остаток бензола. В соответствии с данным предпочтительным вариантом осуществления карбоксильная группа и альдегидная группа могут быть расположены
в бензольном кольце в 1,4-положении, 1,3-положении или 1,2-положении, где положение 1,4 является предпочтительным.
В качестве реакционноспособной карбоксильной группы можно отметить реакционноспособный сложный эфир, изотиоцианаты и изоцианат. Предпочтительные реакционноспособные сложные эфиры являются производными N-гидроксисукцинимидов, таких как N-гидроксисукцинимид или сульфо-N-гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенных фенолов, таких как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,б-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,6-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолов, таких как
гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются N-гидроксисукцинимиды, где N-гидроксисукцинимид или сульфо-N-гидроксисукцинимид являются особенно предпочтительными. Все спирты можно использовать по отдельности или в виде подходящей комбинации двух или более из них. В качестве реакционноспособных сложных эфиров пентафторфениловый сложный эфир и сложный эфир N-гидроксисукцинимида являются особенно предпочтительными.
Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с формилбензойной кислотой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с пентафторфениловым эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с N-гидроксисукцинимидным сложным эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановой кислотой.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с бифункциональным соединением, которое представляет собой биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, сиалиловых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
Что касается альфа-кетокарбоновых кислот, то предпочтительно они представляют собой альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и в большинстве случаев они также могут быть выявлены в организме человека. Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кето-аланина. Карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот ваимодействует с группой Q полимера, представляющей собой аминогруппу. При этом образуется амидная группа. Оставшаяся свободная кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может быть подвергнута взаимодействию с функциональной группой белка, в частности с аминогруппой. Таким образом, образуется иминогруппа, которая может быть прогидрирована.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.
Что касается сиалиловых кислот или их производных, они предпочтительно являются биосовместимыми, в частности, они представляют собой сахара, найденные в организме человека, которые являются N- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловые кислоты представляют собой N-ацетилированные нейраминовые кислоты. Данные соединения обладают желательной жесткостью для выполнения функции в качестве спейсера благодаря структуре пиранозы. С другой стороны, в данные соединения посредством селективного окисления можно ввести альдегидную группу. Сиалиловые кислоты выявлены в организме человека, например, в качестве концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловая кислота может быть селективно окислена с образованием альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиалиловых кислот известны в данной области, смотри, например, L. W. Jaques, В. F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21-32 и Т. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. 01eo,M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669-673. Предпочтительно окисление сиалиловой кислоты может быть проведено перед взаимодействием с аминогруппой полимера.
Необязательно окисленная сиалиловая кислота затем может быть подвергнута взаимодействию по группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения будут содержать альдегидную группу, которая далее может быть подвергнута восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с необязательно окисленной сиалиловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой высоко биосовместимое бифункциональное соединение и также называется витамин В6. РуР представляет собой кофермент, который участвует в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и многочисленных модификациях боковых цепей аминокислот. Все требующие присутствия РуР ферменты действуют через образование оснований Шиффа между аминокислотой и коферментом.
Фосфатная группа РуР может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, в частности, гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР затем может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой белка с образованием основания Шиффа, которое затем может быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, структура конъюгата представляет собой HES-NH-P(О)2-0-(пиридоксаль)-CH-NH-белок.
В случае РуР, функциональную группу полимера
предпочтительно вводят в полимер с использованием диамино-соединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с пиридоксальфосфатом.
Гидроксиэтилкрахмал, подвергаемый взаимодействию с соединением, включающим М, где М предпочтительно представляет собой карбокисльную группу или реакционнноспособную карбоксильную группу, a Q представляет собой альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя; наиболее предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,7. Также возможно использование гидроксиэтилкрахмалов, имеющих среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,4 или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и DS примерно 0,7. Особенно предпочтительно, применение гидроксиалкилкрахмала и еще более предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, имеющего восстановительный конец в виде его окисленной формы.
Полученное производное полимера, содержащее альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, впоследствии подвергают взаимодействию с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования. Что касается конденсации по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя полимера при восстановительном аминировании, то здесь следует
сослаться на приведенное выше подробное описание, касающееся конкретных реакционных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН и температура. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым в качестве белка используется G-CSF, взаимодействие с аминогруппой белка предпочтительно проводят при температуре от от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 21°С. Время реакции предпочтительно колеблется в диапазоне от 30 минут до 72 часов, более предпочтительно от 2 до 48 часов и особенно предпочтительно от 4 часов до 17 часов. В качестве растворителя для реакции предпочтительной является водная среда. Значение рН реакционной среды предпочтительно находится в диапазоне от 4 до 9, более предпочтительно от 4 до 8 и особенно предпочтительно от 4,5 до 5,5.
В соответствии с третьим предпочтительным вариантом осуществления, полимер подвергают взаимодействию по его необязательно окисленному восстановительному концу с по меньшей мере бифункциональным соединением, включающим аминогруппу М и функциональную группу Q, где указанная аминогруппа М взаимодействует с необязательно окисленным восстановительным концом полимера, и где функциональную группу Q модифицируют химически для получения производного полимера,
функционализированного альдегидными группами, которое подвергают взаимодействию с аминогруппой белка путем восстановительного аминирования.
Термин "полимер подвергают взаимодействию по его восстановительному концу" или "полимер подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу", как он использован в контексте настоящего изобретения, может относиться к способу, в соответствии с которым гидроксиалкилкрахмал реагирует главным образом за счет его (селективно окисленного) восстановительного конца. Полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал, в частности гидроксиэтилкрахмал.
Термин "главным образом за счет его (селективно
окисленного) восстановительного конца" относится к способам, в соответствии с которыми статистически более чем 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, как например, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% молекул полимера, используемого для данной реакции взаимодействует за счет по меньшей мере одного (селективно окисленного) восстановительного конца на молекулу полимера, при этом данная молекула полимера, которая взаимодействует посредством по меньшей мере одного восстановительного конца, может в той же самой реакции реагировать по меньшей мере по одной дополнительной функциональной группе, которая содержится в указанной молекуле полимера, и которая не является восстановительным концом. Если одна или несколько молекул полимера реагируют по меньшей мере по одному восстановительному концу и одновременно по меньшей мере по одной дополнительной подходящей функциональной группе, которая содержится в данной(ых) молекуле(ах) полимера и которая не является его восстановительным концом, статистически предпочтительно, чтобы более чем 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 7 0%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% всех взаимодействующих функциональных групп, где указанные функциональные группы включают восстановительные концы, представляли бы собой восстановительные концы.
Термин "восстановительный конец", как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к концевой альдегидной группе молекулы полимера, которая может
присутствовать в виде альдегидной группы и/или в виде соответствующего ацеталя. В случае, когда восстановительный конец является окисленным, альдегидная и ацетальная группа находятся в виде карбоксильной группы и/или в виде соответствующего лактона.
Что касается функциональной группы Q, наряду с прочими можно отметить следующие функциональные группы:
двойные С-С-связи или тройные ОС-связи, или ароматические С-С-связи;
- тиогруппу или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфоновой кислоты;
гидразидаарилсульфоновой кислоты;
- 1,2-диолы;
-1,2-аминотиоспирты;
- азиды;
- 1,2-аминоспирты;
- аминогруппу -NHc или производные аминогрупп, включающие структурное звено -NH-, таких как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы;
гидроксиламино группу -0-№Ь или производные гидроксиаминогруппы, включающие структурное звено -0-NH-, такие как гидроксилалкиламино группы, гидроксилариламино группы, гидроксиларалкиламино группы или гидроксилалкариламино группы;
алкоксиамино группы, арилоксиамино группы,
аралкилоксиамино группы или алкарилоксиамино группы, каждая из которых включает структурное звено -NH-0-;
- остатки, имеющие карбонильную группу, -Q-C(=G)-М, где G представляет собой О или S, и М представляет собой, например,
- -ОН или -SH;
- алкоксильную группу, арилокси группу, аралкилокси группу или алкарилокси группу;
-- алкилтио группу, арилтио группу, аралкилтио группу или алкарилтио группу;
алкилкарбонилокси группу, арилкарбонилокси группу, аралкилкарбонилокси группу, алкарилкарбонилокси группу;
-- активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как N-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено 0-N, где N представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда G = О и Q отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где Q отсутствует или представляет собой NH или гетероатом, такой как S или О;
- -NH-NH; или -NH-NH-;
- -№> ;
- нитрильную группу;
- карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
- карбоксильную группу;
- группы -N=C=0 или группы -N=C=S;
винилгалогенидные группы, такие как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат; - - -С=С-Н;
- -(C-NH;C1) -Оалкил;
-группы -(С=0)-СН;-На1, где Hal представляет собой CI, Вг или I;
-CH=CH-SO;-;
- дисульфидную группу, включающую структуру -S-S-;
группу
- группу
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения термин "функциональная группа Q" относится к функциональной группе Q, которая включает химическую
структуру -NH-, например, -NH2 или производное аминогруппы, включающее структурное звено -NH-, такое как аминоалкильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения функциональная группа М представляет собой группу, имеющую структуру R'-NH-, где R' представляет собой водород или алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток, где циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или
циклоалкиларильный остаток могут быть непосредственно связаны с группой NH или, в соответствии с другим вариантом осуществления, могут быть связаны посредством кислородного мостика с группой NH. Алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остатки могут быть подходящим образом замещенными. Что касается предпочтительных заместителей, то здесь можно отметить галогены, такие как F, С1 или Вг. Особенно предпочтительные остатки R' представляют собой водород, алкильную и алкоксильную группы, и еще более предпочтительно представляют собой водород и незамещенную алкильную и алкоксильную группы.
Среди алкильных и алкоксильных групп, группы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, или 6 атомов С, являются предпочтительными. Более предпочтительными являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, метоксильная, этоксильная, пропоксильная и изопропоксильная группы. Особенно предпочтительными являются метил, этил, метокси, этокси, и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа М имеет структуру R'-NH-R"-, где R" предпочтительно включает структурное звено -NH- и/или структурное звено -(C=G)-, где G представляет собой О или S, и/или структурное звено -S03-. Конкретными примерами функциональной группы R" являются
где если G присутствует дважды, то он независимо представляет собой О или S.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгатам, как отмечено выше, где функциональную группу М выбирают из группы, состоящей из
G G
где G представляет собой О или S, и, если присутствует дважды, независимо представляет собой О или S, и R' представляет собой метил.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения функциональная группа М представляет собой аминогруппу -NH:.
В соответствии с первой альтернативой, функциональная группа М, представляющая собой аминогруппу -NH;, взаимодействует с окисленным восстановительным концом полимера, приводя к связыванию полимера и соединения, включающего группы М и Q посредством амидной связи.
В соответствии со второй альтернативой, функциональная группа М, представляющая собой аминогруппу -NH:, взаимодействует с окисленным восстановительным концом полимера посредством восстановительного аминирования, приводя к образованию
иминогруппы, которую впоследствии предпочтительно гидрируют с получением аминогруппы, иминогруппа и аминогруппа,
соответственно, связывают полимер и соединение, включающее группы М и Q. В данном случае возможно, чтобы функциональная группа Q представляла собой аминогруппу. В том случае, если полученное производное полимера будет подвергнуто последующей реакции с по меньшей мере бифункцональным соединением с участием карбоксильной группы или реакционноспособной карбоксильной группы, как описано далее, или другой группы по меньшей мере бифункционального соединения, которую нужно подвергнуть взаимодействию с аминогруппой, является предпочтительным, чтобы соединение, включающее М и Q, представляло собой первичный амин, который содержит в качестве функциональной группы только одну аминогруппу. В данном конкретном случае, хотя соединение содержит только одну функциональную группу, оно рассматривается как бифункциональное соединение, включающее М и Q, где М представляет собой аминогруппу, содержащуюся в соединении, которое подвергли восстановительному аминированию по восстановительному концу полимера, и где Q представляет собой вторичную аминогруппу, возникающую в результате
восстановительного аминирования и последующего гидрирования.
В соответствии с третьей альтернативой, неокисленный восстановительный конец полимера подвергают взаимодействию с аммиаком посредством восстановительного аминирования, приводящего к образованию концевой аминигруппы полимера, которую впоследствии предпочтительно гидрируют с получением терминальной аминогруппы полимера и, таким образом, получают терминальную первичную аминогруппу. В данном конкретном случае аммиак рассматривают как бифункциональное соединение, включающее М и Q, где М представляет собой NH;, содержащуюся в используемом аммиаке, и где Q представляет собой первичную аминогруппу, возникающую в результате восстановительного аминирования и последующего гидрирования.
Термин "аминогруппа Q" относится к функциональной группе Q, которая включает химическую структуру NH-, например, -Ш2/ или к производному аминогруппу, включающему структурное звено -NH-,
такому как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильная группа или алкариламино группы.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа Q представляет собой группу, имеющую структуру R'-NH-, где R' представляет собой водород или алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или
циклоалкиларильный остаток, где циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или
циклоалкиларильный остаток может быть связан непосредственно с группой NH или, в соответствии с другим вариантом осуществления, могут быть связаны посредством кислородного мостика с группой NH. Алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остатки могут быть подходящим образом замещенными. Что касается предпочтительных заместителей, то здесь можно отметить галогены, такие как F, С1 или Вг. Особенно предпочтительные остатки R' представляют собой водород, алкильную и алкоксильную группы, и еще более предпочтительно представляют собой водород и незамещенную алкильную и алкоксильную группы.
Среди алкильных и алкоксильных групп, группы, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, или б атомов С, являются предпочтительными. Более предпочтительными являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, метоксильная, зтоксильная, пропоксильная и изопропоксильная группы. Особенно предпочтительными являются метил, этил, метокси, этокси, и особое предпочтение отдается метилу или метокси.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа Q имеет структуру R'-NH-R"-, где Р"предпочтительно включает структурное звено -NH- и/или структурное звено -(C=G)-, где G представляет собой О или S, и/или структурное звено -SO;-. В соответствии с более предпочтительными вариантами осуществления, функциональную группу R" выбирают из группы, состоящей из
н н о
/ .G. II
где если G присутствует дважды, то он независимо представляет собой О или S.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как отмечено выше, где функциональную группу Q выбирают из группы, состоящей из
Н Н G
где G представляет собой О или S, и, если присутствует дважды, независимо представляет собой О или S, и R' представляет собой метил.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, функциональная группа Q представляет собой аминогруппу -NH2.
В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, оба М и Q включают аминогруппу -NH-. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления, оба М и Q представляют собой аминогруппу -NH2.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, соединение, включающее М и Q, представляет собой гомобифункциональное соединение, более предпочтительно, гомобифункциональное соединение, включающее в качестве функциональных групп М и Q наиболее предпочтительно аминогруппу -NH2, или в соответствии с другими вариантами осуществления, гидроксиламиногруппу -0-NH- или группу
G G
где G предпочтительно представляет собой О. Конкретными примерами данных соединений, включающих М и Q являются
Гидроксиэтилкрахмал, который подвергают взаимодействию с соединением, включающим М, где М предпочтительно представляет собой аминогруппу -NH-, и, более предпочтительно, представляет собой аминогруппу -Nib, еще более предпочтительно оба М и Q включают аминогруппу -NH-, и особенно предпочтительно оба М и Q включают аминогруппу -NH;, предпочтительно представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу примерно 10 кДа и DS примерно 0,7. Также возможно использованием гидроксиэтилкрахмалов, имеющих
среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 12 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,4, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 18 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,4 или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 50 кДа и DS примерно 0,7, или гидроксиэтилкрахмала, имеющего среднюю молекулярную массу примерно 100 кДа и DS примерно 0,7.
В том случае, когда оба М и Q представляют собой аминогруппу -NEb, М и Q могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до б и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, например, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6, и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с 1,4-диаминобутаном, 1,3-диаминопропаном или 1,2-диаминоэтаном, образуя производное полимера.
Взаимодействие по меньшей мере бифункционального соединения, включающего М и Q, с полимером предпочтительно проводят при температуре от 0 до 100°С, более предпочтительно от 4 до 80°С и особенно предпочтительно от 20 до 80°С; время реакции предпочтительно колеблется от 4 часов до 7 дней, более предпочтительно от 10 часов до 5 дней и особенно предпочтительно от 17 до 4 часов. Молярное соотношение по меньшей мере бифункциональное соединение:полимер предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 200, в частности от 50 до 100.
Растворитель для реакции по меньшей мере бифункционального соединения с полимером предпочтительно представляет собой по меньшей мере один апротонный растворитель, предпочтительно безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более, чем 0,5 процента по весу, предпочтительным является содержание воды не более чем 0,1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА),
диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
В качестве растворителя для реакции по меньшей мере бифункционального соединения с полимером также можно использовать водную среду.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления производное полимера, включающее полимер и по меньшей мере бифункциональное соединение, химически модифицируют по свободной функциональной группе Q с получением производного полимера, включающим альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя. В соответствии с этим вариантом осуществления является предпочтительным подвергнуть производное полимера взаимодействию с по меньшей мере одним бифункциональным соединением, которое содержит функциональную группу, способную взаимодействовать с функциональной группой Q, и альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя.
В качестве по меньшей мере бифункционального соединения подходящим является каждое соединение, которое содержит альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, и по
меньшей мере одну функциональную группу, которая способна образовывать связь с функциональной группой Q производного полимера. По меньшей мере одну функциональную группу выбирают из того же набора функциональных групп, что и Q, и выбирают так, чтобы она была способна взаимодействовать с Q. В предпочтительном случае Q представляет собой аминогруппу -NH_, или производное аминогруппы, включающее структурное звено -NH-, такое как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы, или алкариламино группы.
Предпочтительным является использование соединения, содержащего не считая альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, по меньшей мере одну карбоксильную группу или по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно одну карбоксильную группу или одну реакционноспособную карбоксильную группу. Альдегидная группа или кетогруппа, или группа полуацеталя и карбоксильная группа или реакционноспособная карбоксильная группа могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, , предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и особенно предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную группу, содержащую от 2 до 6 и предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Также возможно, чтобы между альдегидной или
кетогруппой и карбоксильной группой атома углерода не присутствовал. Альтернативно, углеводородный остаток может представлять собой замещенную или незамещенную циклическую углеводородную группу, содержащую от 3 до 11 атомов углерода, предпочтительно от 3 до б или от 3 до 5 атомов углерода. Когда циклическая углеводородняа группа является замещенной, заместитель может быть выбран из группы, состоящей из замещенных или незамещенных амино или алкоксильных групп. Число заместителей, если они присутствуют, предпочтительно составляет от 1 до 3. Кроме того, алкильная и/или циклическая углеводородная группа может содержать один или несколько гетероатомов, таких как О или S, в частности О. В таком случае предпочтительно присутствует от 1 до 3, в частности, 1 или 2 гетероатома. Предпочтительными соединениями в данном контексте являются те, которые выбраны из следующей группы соединений.
Ю 11
R= Н, алкил, арил, ацил, SiR'j R' = алкил, арил.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой
арильный остаток, имеющий от 5 до 7 и предпочтительно 6 атомов углерода. Наиболее предпочтительно углеводородный остаток представляет собой остаток бензола. В соответствии с данным предпочтительным вариантом осуществления карбоксильная группа и альдегидная группа могут быть расположены в бензольном кольце в 1,4-положении, 1,3-положении или 1,2-положении, где положение 1,4 является предпочтительным.
В качестве реакционноспособной карбоксильной группы можно отметить реакционноспособный сложный эфир, изотиоцианаты и изоцианаты. Предпочтительные реакционноспособные сложные эфиры являются производными N-гидроксисукцинимидов, таких как N-гидроксисукцинимид или сульфо-Ы-гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенных фенолов, таких как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2, 4, б-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2, 4, б-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолов, таких как
гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются N-гидроксисукцинимиды, где N-гидроксисукцинимид или сульфо-N-гидроксисукцинимид являются особенно предпочтительными. Все спирты можно использовать по отдельности или в виде подходящей комбинации двух или более из них. В качестве реакционноспособных сложных эфиров пентафторфениловый сложный эфир и сложный эфир N-гидроксисукцинимида являются особенно предпочтительными.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления функциональная группа, которая способна образовывать химическую связь с функциональной группой Q, где Q предпочтительно представляет собой NH2 или производное аминогруппы, включающее структурное звено -NH-, такое как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы, в частности представляет собой NH2, представляет собой реакционноспособную карбоксильную группу.
В данном случае функциональную группу, которая способна образовывать химическую связь с функциональной группой Q, и которая представляет собой карбоксильную группу, подходящим образом подвергают взаимодействию с получением
реакционноспособной карбоксильной группы. Следовательно, предпочтительным является подвергание взаимодействию по меньшей мере одного по меньшей мере бифункционального соединения, которое включает карбоксильную группу и альдегидную группу, или кето группу или группу полуацеталя, в котором карбоксильная группа преобразуется в реакционноспособную карбоксильную группу и полученное по меньшей мере бифункциональное соединение очищают и подвергают взаимодействию с функциональной группой Q производного полимера.
Конкретными примерами по меньшей мере бифункционального соединения, включающего карбоксильную группу, которое может быть подвергнуто взаимодействию для получения реакционноспособной карбоксильной группы, являются соединения 1-11 из вышеуказанного списка. В данном контексте, термин "карбоксильная группа" также относится к лактону и внутреннему ангидриду дикарбоновой кислоты.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее Q, где Q представляет собой NH; или производное аминогруппы, включающее структурное звено -NH-, такое как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы дополнительно подвергают взаимодействию с формилбензойной кислотой.
В соответствии с другим вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее Q, где Q представляет собой аминогруппу, дополнительно подвергают взаимодействию с пентафторфениловым эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где производное полимера, включающее Q, где Q представляет собой аминогруппу, дополнительно подвергают взаимодействию с N-гидроксисукцинимидным эфиром формилбензойной кислоты.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как
описано выше, где производное полимера, включающее Q, где Q представляет собой аминогруппу, дополнительно подвергают взаимодействию с 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановой кислотой.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с бифункциональным соединением, которое представляет собой биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, сиалиловых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
Что касается альфа-кетокарбоновых кислот, то предпочтительно они представляют собой альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и в большинстве случаев они также могут быть выявлены в организме человека.
Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кето-аланина. Карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот ваимодействует с группой Q полимера, представляющей собой аминогруппу. При этом образуется амидная группа. Оставшаяся свободная кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может быть подвергнута взаимодействию с функциональной группой белка, в частности с аминогруппой. Таким образом, образуется иминогруппа, которая может быть подвергнута гидрированию.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.
Что касается сиалиловых кислот или их производных, они предпочтительно являются биосовместимыми, в частности, они представляют собой сахара, найденные в организме человека, которые являются N- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловые кислоты представляют собой N-ацетилированные нейраминовые кислоты. Данные соединения обладают желательной жесткостью для выполнения функции в качестве спейсера благодаря структуре пиранозы. С другой
стороны, в данные соединения посредством селективного окисления можно ввести альдегидную группу. Сиалиловые кислоты выявлены в организме человека, например, в качестве концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиаловая кислота может быть селективно окислена с образованием альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиалиловых кислот известны в данной области, например, из публикаций L. W. Jaques, В. F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21-32 и Т. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669-673. Предпочтительно окисление сиалиловой кислоты может быть проведено перед взаимодействием с аминогруппой полимера.
Необязательно окисленная сиалиловая кислота затем может быть подвергнута взаимодействию по группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения содержат альдегидную группу, которая далее может взаимодействовать с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с необязательно окисленной сиалиловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой высоко биосовместимое бифункциональное соединение и также называется витамин В6. РуР представляет собой кофермент, который участвует в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и многочисленных модификациях боковых цепей аминокислот. Все требующие присутствия РуР ферменты действуют через образование оснований Шиффа между аминокислотой и коферментом.
Фосфатная группа РуР может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, в частности, гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР затем может быть подвергнута
взаимодействию с аминогруппой белка с образованием основания Шиффа, которое затем может быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, структура конъюгата представляет собой HES-NH-P (О) :-0-(пиридоксаль)-CH-NH-белок.
В случае РуР, функциональную группу полимера предпочтительно вводят в полимер с использованием диамино-соединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с пиридоксальфосфатом.
В качестве растворителя для реакции производного полимера, включащего аминогруппу, например, с формилбензойной кислотой, предпочтительным является по меньшей мере один апротонный растворитель или по меньшей мере один полярный растворитель. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
В качестве растворителя для реакции производного полимера, включащего аминогруппу, с по меньшей мере бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу, также можно использовать водную среду. Термин "водная среда", как он использован в контексте настоящего изобретения, относится к растворителю или к смеси растворителей, включающих воду в диапазоне от по меньшей мере 10% по весу или по меньшей мере 20% по весу, или по меньшей мере 30% по массе, или по меньшей мере 4 0% по массе, или по меньшей мере 50% по массе, или по меньшей мере 60% по массе, или по меньшей мере 7 0% по массе, или по меньшей мере 80% по массе, или по меньшей мере 90% по массе, или до 100% по массе из расчета на массу включенных растворителей.
Реакцию предпочтительно проводят при температуре от 0 до 40°С, более предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С в течение времени реакции предпочтительно от 0,5 до 24 часов и особенно предпочтительно от 1 до 17 часов.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления
реакцию проводят в присутствии активирующего агента. Подходящими активирующими агентами, наряду с прочими, являются карбодиимиды, такие как диизопропилкарбодиимид (DIC), дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-З-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), где диизопропилкарбодиимид (DIC) является особенно предпочтительным.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об/об), указывающем на равные объемы указанных соединений,
при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ,
гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С,
предпочтительно от 20 до 30°С.
Полученное производное полимера с альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя впоследствии подвергают взаимодействию с аминогруппой белка посредством
восстановительного аминирования. Что касается связывания по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя полимера посредством восстановительного аминирования, здесь следует сослаться на приведенное выше подробное описание, касающееся специфических реакционных параметров реакции восстановительного аминирования, таких как рН и температура. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым в качестве белка используют G-CSF, восстановительное аминирование проводят при температуре от 0 до 10°С, например, от 1 до 8°С или от 2 до б°С, например, примерно при 4°С, и при рН примерно от 4,5 до 5,5, например, примерно при 5,0. Время реакции составляет примерно от 10 до 20 часов, например от 12 до 19 часов, или от 14 до 18 часов, например, примерно 17 часов, или примерно от 20 до 30 часов, например, примерно 24 часа. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым в качестве белка используют rhIL 2, rhIL 3, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhEPO, rhAT III, BSA, миоглобин и SOD, восстановительное аминирование предпочтительно проводят при температуре от 0 до 5°С, например, примерно при 4°С, и при рН примерно от 4,5 до 5,5, например, примерно при 5,0, при времени реакции примерно от 20 до 30 часов, например, примерно 2 4 часа.
Таким образом, в соответствии с вышеуказанными предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение также относится в том случае, когда полимер подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, к конъюгату, соответствующему формуле
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления полимер представляет собой гидроксиэтилкрахмал, т.е. HAS' представляет собой HES', и п = 2, 3 или 4, наиболее предпочтительно 4, как описано выше. Следовательно, в том случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, настоящее изобретение также относится к конъюгату, соответствующему формуле
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, настоящее изобретение также относится, в том случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, к конъюгату, соответствующему формуле
¦NH-белок
где n = 2, 3 или 4, RA независимо представляет собой водород или метоксильную группу, и m = 0 в том случае, когда R4 представляет собой водород, и m = 1 в случае, когда R4 представляет собой метокси, HAS предпочтительно представляет собой HES'.
В каждой из вышеуказанных формул азот, связанный с белком, появляется из аминогруппы белка, с которым производное полимера связано через альдегидную группу.
Что касается вышеуказанных вариантов осуществления, в соответствии с которыми функциональные группы М и Q включают аминогруппу -№Ь, также возможно, что М представляет собой аминогруппу -NH;, a Q включает бета-гидрокси аминогруппу -СН(ОН)-CH:-NH2 и предпочтительно представляет собой бета-гидрокси аминогруппу.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где аминогруппа Q соединения, включающего две аминогруппы М и Q, представляет собой бета-гидрокси аминогруппу -СН(ОН)-CH2-NH;.
В таком случае М и Q могут быть разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит от 1 до 60, , предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 1 до б и особенно предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и особенно предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную
цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, углеводородный остаток представляет собой алкильную цепь, содержащую от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, и особенно предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода. Еще более предпочтительно, М и Q разделены метиленовой группой.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с 1,З-диамино-2-гидроксипропаном.
В случае, когда полимер реагирует по его окисленному восстановительному концу, производное полимера соответствует формуле
HAS*
которая особенно предпочтительна при HAS'= HES'.
Взаимодействие по меньшей мере бифункционального соединения, включающего М и Q, предпочтительно 1,З-диамино-2-гидроксипропана с полимером предпочтительно проводят при температуре от 40 до120°С, более предпочтительно от 40 до 90°С и особенно предпочтительно от 60 до 8 0°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 17 до 168 часов, более предпочтительно от 17 до 96 часов и особенно предпочтительно от 4 8 до 96 часов. Молярное соотношение по меньшей мере бифункциональное соединение:полимер предпочтительно находится в диапазоне от 200:1 до 10:1, в частности от 50:1 до 100:1.
Растворитель для реакции по меньшей мере бифункционального
соединения с полимером предпочтительно представляет собой по меньшей мере один апротонный растворитель, предпочтительно безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более, чем 0,5 процента по весу, предпочтительным является содержание воды не более чем 0, 1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА),
диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
Бета-гидрокси аминогруппа Q производного полимера может взаимодействовать с по меньшей мере бифункциональным соединением, включающим по меньшей мере одну функциональную группу, способную взаимодействовать с Q, и дополнительно включающим по меньшей мере одну функциональную группу, представляющую собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, или функциональную группу, которую можно модифицировать с образованием альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения бета-гидрокси аминогруппу непосредственно модифицируют химически с получением альдегидной группы посредством химического окисления.
Данное окисление может быть осуществлено с использованием всех подходящих окислителей, которые способны преобразовывать бета-гидрокси аминогруппу в альдегидную группу. Предпочтительные окислители представляют собой периодаты, такие как периодаты щелочных металлов. Особенно предпочтительным является периодат натрия, который предпочтительно используется в водном растворе. Данный раствор предпочтительно имеет концентрацию периодата от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ. Окисление проводят при температуре от 0 до 4 0°С, предпочтительно от 0 до 25°С и особенно предпочтительно от 4 до 2 0°С.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей
мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об/об), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ, гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С, предпочтительно от 2 0 до 3 0°С.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к
способу и конъюгату, как описано выше, где окисление бета-гидрокси аминогруппы Q проводят с использованием периодата.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, как описано выше, где при использовании полимера с окисленным восстановительным концом производное полимера, имеющее бета-гидрокси аминогруппу, особенно предпочтительно
HAS
Н О
и особенно с HAS'=HES', окисляют, предпочтительно с использованием периодата с получением призводного полимера, содержащего альдегидную группу, особенно предпочтительно
OR,
1IAS*
и в частности с HAS'=HES'
В соответствии с настоящим изобретение также возможно проводить взаимодействие соединения, включающего указанную выше 1-амино-2-гидрокси структуру с по меньшей мере бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу или
реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную, кето, или ацетальную группу, описанные выше, с получением производного полимера, который может быть подвергнут восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Полученное производное полимера с альдегидной группой А затем подвергают взаимодействию с белком. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, как описано выше, где указанный способ включает
взаимодействие производного полимера, имеющего бета-гидрокси аминогруппу, в случае, когда использовали полимер с окисленным восстановительным концом, особенно предпочтительно полимер, соответствующий формуле
Н О
и особенно с HAS'=HES', с аминогруппой белка.
Полученное производное полимера с альдегидной группой впоследствии подвергают взаимодействию с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования. Что касается связывания по меньшей мере одной аминогруппы белка с по меньшей мере одной альдегидной группой полимера посредством восстановительного аминирования, здесь следует сослаться на приведенное выше подробное описание.
Таким образом, в соответствии с вышеуказанным предпочтительным вариантом осуществления, настоящее изобретение также относится к конъюгату, соотвествующему формуле
и особенно с HAS'=HES', в том случае, когда используется полимер с окисленным восстановительным концом. В вышеуказанной формуле, азот, присоединенный к белку, имеет происхождение из аминогруппы белка, с которой полимер связан через альдегидную группу.
В соответствии со следующим вариантом осуществления,
настоящего изобретения, полимер первоначально подвергают взаимодействию с подходящим соединением с получением первого производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу. Данное первое производное полимера затем подвергают взаимодействию с дополнительным по меньшей мере бифункциональным соединением, где по меньшей мере одна функциональная группа дополнительного соединения взаимодействует с по меньшей мере одной реакционной карбоксильной группой производного полимера, и по меньшей мере одна другая функциональная группа дополнительного соединения представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, или представляет собой функциональную группу, которую химически модифицируют с получением альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, и где полученное производное полимера, включающее указанную альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, взаимодействует посредством восстановительного аминирования, как описано выше, с по меньшей мере одной аминогруппой белка. Также можно изменить последовательность взаимодействия соответствующих соединений друг с другом.
В соответствии с первой альтернативой указанного следующего варианта осуществления, полимер, включающий по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, получают селективным окислением полимера по его восстановительному концу и последующим взаимодействием окисленного полимера,
представляющего собой лактон
и/или карбоновую кислоту
HAS1
(lib)
OR3
или подходящую соль карбоновой кислоты, такую как соль щелочного металла, предпочтительно соль натрия и/или калия, и где HAS'предпочтительно представляет собой HES1, с подходящим соединением с получением полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу.
Окисление полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть осуществлено с использованием способа, или комбинации способов, которые приводят к соединениям, имеющим вышеуказанные структуры (На) и/или (lib).
Хотя окисление может быть осуществлено в соответствии с любым подходящим способом или способами, приводящими к окислению восстановительного конца гидроксиалкилкрахмала, его
предпочтительно проводят с использованием щелочного раствора иода, как описано, например, в патенте Германии DE 1962 705 А1, соответствующее содержание которого (пример А, колонка 9, строки 6-24) включено в данное описание путем ссылки.
Введение реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, который селективно окислен по его восстановительному концу, можно проводить с использованием любых возможных способов и всех возможных соединений.
В соответствии с конкретным способом по настоящему изобретению, полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу с по меньшей мере одним спиртом, предпочтительно по меньшей мере с одним кислым спиртом, таким как кислые спирты, имеющие величину рКА в диапазоне от 6 до 12 или от 7 до 11 при 2 5°С. Молекулярная масса кислого спирта может колебаться в диапазоне от 80 до 500 г/моль, например, от 90 до 300 г/моль или от 100 до 200 г/моль.
Подходящие кислые спирты представляют собой все спирты формулы H-0-RA, имеющие кислый протон и способные взаимодействовать с окисленным полимером с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира полимера, предпочтительно, соответствующего формуле
н О
Предпочтительные спирты представляют собой
N-гидроксисукцинимиды или сульфо-М-гидроксисукцинимид,
подходящим образом замещенные фенолы, таких как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,б-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,б-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолы, такие как
гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются N-гидроксисукцинимиды, где N-гидроксисукцинимид или сульфо-N-гидроксисукцинимид являются особенно предпочтительными. Все спирты можно использовать по отдельности или в виде подходящей комбинации двух или более из них. В контексте настоящего изобретения также возможно использование соединения, которое высвобождает соответствующий спирт, например, при добавлении сложных диэфиров карбоновых кислот.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к
способу, как описано выше, где полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, активируют посредством взаимодействия окисленного полимера с кислым спиртом, предпочтительно с N-гидроксисукцинимидом или сульфо-Ы-гидроксисукцинимидом.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу с по меньшей мере одним сложным карбоновым диэфиром RE-0-(С=0)-O-Rc, где RE и Rc могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно данный способ приводит к реакционноспособным полимерам, соответствующим формуле
OR,
в/с
где HAS' предпочтительно представляет собой HES'.
В качестве подходящих соединений сложных карбоновых диэфиров можно использовать соединения, спиртовые компоненты которых независимо представляют собой N-гидроксисукцинимиды, такие как N-гидроксисукцинимид или сульфо-Ы-гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2,4,6-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,б-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолы, такие как
гидроксибензотриазол. Особенно предпочтительными являются N, N'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-Ы,Ы'-
дисукцинимидилкарбонат, где N,N'-дисукцинимидилкарбонат является особенно предпочтительным.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где полимер, который является
селективно окисленным по его восстановительному концу, активируют путем взаимодействия окисленного полимера с N,N'-дисукцинимидилкарбонатом.
Кислый спирт подвергают взаимодействию с окисленным полимером или солью окисленного полимера при молярном соотношении кислый спирт:полимер, составляющем предпочтительно от 5:1 до 50:1, более предпочтительно от 8:1 до 20:1, при предпочтительной температуре от 2 до 4 0°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особенно предпочтительно от 15 до 25°С. Время реакции предпочтительно колеблется от 1 до 10 часов, более предпочтительно от 2 до 5 часов, более предпочтительно от 2 до 4 часов и особенно от 2 до 3 часов.
Сложный карбоновый диэфир подвергают взаимодействию с окисленным полимером или солью окисленного полимера при молярном соотношении сложный карбоновый диэфир:полимер, обычно составляющем от 1:1 до 3:1, как например, от 1:1 до 1,5:1. Время реакции предпочтительно колеблется от 0,1 до 12 часов, как например от 0,2 до б часов, или от 0,5 до 2 часов или от 0,75 до 1,25 часа.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения взаимодействие окисленного полимера с кислым спиртом и/или сложным карбоновым диэфиром проводят в по меньшей мере одном апротонном растворителе, таком как безводный апротонный растворитель, имеющий содержание воды не более, чем 0,5 процента по весу, предпочтительно не более чем 0,1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА) , димети л формами д (ДМФ) и смеси двух или более из них. Температура реакции предпочтительно составляет от 2 до 4 0°С, более предпочтительно от 10 до 30°С.
Для взаимодействия окисленного полимера с по меньшей мере одним кислым спиртом используют по меньшей мере один дополнительный активирующий агент.
Подходящими активирующими агентами, наряду с прочими, являются карбонилдимидазол, карбодиимиды, такие как
диизопропилкарбодиимид (DIC), дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-З-(З-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), где
дициклогексилкарбодиимид (DCC) и 1-этил-З-(3-
диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) являются особенно
предпочтительным.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где полимер, который является окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию с кислым спиртом в присутствии дополнительного активирующего агента с получение реакционноспособного сложного эфира полимера.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения взаимодействие окисленного полимера с карбоновым сложным диэфиром и/или кислым спиртом проводят при низкой основной активности, что может быть определено путем добавления реакционной смеси к воде в объемном соотношении воды к реакционной смеси, равном 10:1. Перед добавлением вода, которая по существу не содержит буфера, имеет значение рН равное 7 при 2 5°С. После добавления реакционной смеси, измеряют значение рН и получают основную активность реакционной смеси, которая имеет значение предпочтительно не более чем 9,0, более предпочтительно не более чем 8,0 и особенно предпочтительно не более чем 7,5.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, окисленный полимер взаимодействует с
N-гидроксисукицинимидом в сухом DMA в отсутствие воды при использовании EDC , приводя селективно к полимеру сложного эфира N-гидроксисукцинимида, соответствующего формуле
OR,
HAS*
более предпочтительно HAS' представляет собой HES'
Неожиданно оказалось, что реакция не приводит к побочным продуктам, возникающим в результате взаимодействия EDC с 0Н-группами HES, и реакция перегруппировки О-ацилизомочевины, образованной при реакции EDC и окисленного полимера, в соответствующую N-ацилмочевину неожиданного подавляется.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, окисленный полимер взаимодействует с N,N'-дисукцинимидилкарбонатом в сухом ДМФ в отсутствие воды и в отсутствие активирующего агента, приводя селективно к N-гидроксисукциниминовому сложному эфиру полимера,
соответствующему формуле
более предпочтительно HAS' представляет собой HES'.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, полимер, который является селективно окисленным по его восстановительному концу, подвергают взаимодействию по его окисленному восстановительному концу с азолидом, таким как карбонилдиимидазол или карбонилдибензимидазол, с получением полимера, содержащего реакционноспособную карбоксильную группу. В случае карбонилдиимидазола реакция приводит к реакционноспособному имидазолидному производному полимера, соответствующему формуле
HAS'
где HAS' предпочтительно представляет собой HES'.
В соответствии со второй альтернативой указанного следующего варианта осуществления настоящего изобретения, касающегося введения по меньшей мере одной реакционноспособной карбоксильной группы в полимер, реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстановительный конец которого не является окисленным, посредством взаимодействия по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера со сложным карбоновым диэфиром.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу и конъюгатам, где реакционноспособную карбоксильную группу вводят в полимер, восстановительный конец которого является не окисленным, посредством взаимодействия по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера с по меньшей мере одним сложным карбоновым диэфиром RB-0- (С=0) -0-RC/ где RB и Rc могут быть одинаковыми или различными.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, полимер, восстановительный конец которого является не окисленным, подвергают взаимодействию по меньшей мере по одной гидроксильной группе с азолидом, таким как карбонилимидазол, карбонил-ди-(1,2,4-триазол) или
карбонилдибензилимидазол, с получением полимера, содержащего реакционноспособную карбоксильную группу.
В качестве подходящих соединений сложных карбоновых диэфиров можно использовать соединения, спиртовые компоненты которых независимо представляют собой N-гидроксисукцинимиды, такие как N-гидроксисукцинимид или сульфо-N-гидроксисукцинимид, подходящим образом замещенные фенолы, такие как п-нитрофенол, о,п-динитрофенол, о,о'-динитрофенол, трихлорфенол, такой как 2, 4,б-трихлорфенол или 2,4,5-трихлорфенол, трифторфенол, такой как 2,4,б-трифторфенол или 2,4,5-трифторфенол, пентахлорфенол, пентафторфенол, или гидроксиазолы, такие как
гидроксибензотриазол.
Особенно предпочтительными являются симметричные соединения сложных карбоновых диэфиров, таким образом RB и Rc являются одинаковыми. Спиртовую компоненту карбонового диэфира предпочтительно выбирают из группы, состоящей из
N-гидроксисукцинимида, сульфонированного N-гидроксисукцинимида, N-гидроксибензотриазола, и нитро- или галогензамещенных фенолов. Среди прочих, нитрофенол, динитрофенол, трихлорефнол, трифторфенол, пентахлорфенол и пентафторфенол являются предпочтительными. Особенно предпочтительными являются N, N'-дисукцинимидилкарбонат и сульфо-^Ы'-
дисукцинимидилкарбонат, где N,N'-дисукцинимидилкарбонат является особенно предпочтительным.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к производному гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно производному гидроксиэтилкрахмала, где по меньшей мере одна гидроксильная группа, предпочтительно по меньшей мере две гидроксильные группы указанного крахмала были введены во взаимодействие с соединением сложного карбонового диэфира с получением соответствующего реакционноспособного сложного эфира.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения взаимодействие полимера, восстановительный конец которого является не окисленным, с по меньшей мере одним соединением сложного карбонового диэфира проводят при температуре от 2 до 40°С, более предпочтительно от 10 до 30°С и особенно от 15 до 25°С. Предпочтительное время реакции колеблется от 0,5 до 5 часов, более предпочтительно от 1 до 3 часов и особенно предпочтительно от 2 до 3 часов.
Молярное соотношение соединение сложного карбонового диэфира:полимер зависит от степени замещения полимера, относящегося к числу гидроксильных групп, взаимодействующих с соединением сложного карбонового диэфира, относительно числа гидроксильных групп, присутствующих в не подвергавшемся реакции полимере.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, молярное соотношение соединение сложного карбонового диэфира:звенья ангидроглюкозы полимера находится в диапазоне от 1:2 до 1:1000, более предпочтительно от 1:3 до 1:100 и особенно предпочтительно от 1:10 до 1:50, приводя к степени замещения в диапазоне от 0,5 до 0,001, предпочтительно
от 0,33 до 0,01 и особенно предпочтительно от 0,1 до 0,02.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, взаимодействие полимера, восстановительный конец которого является не окисленным, с соединением сложного карбонового диэфира проводят в по меньшей мере одном апротонном растворителе, особенно предпочтительно в безводном апротонном растворителе, имеющем содержание воды не более, чем 0,5 процента по весу, предпочтительно не более чем 0,1 процента по весу. Подходящими растворителями являются, наряду с прочими, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон, диметилацетамид (ДМА), диметилформамид (ДМФ) и смеси двух или более из них.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу, как описано выше, где реакцию по меньшей мере одной гидроксильной группы полимера, восстановительный конец которого является не окисленным, со сложным карбоновым диэфиром с получением реакционноспособной карбоксильной группы проводят в безводном апротонном полярном растворителе, где растворитель предпочтительно представляет собой диметилацетамид,
диметилформамид или их смесь.
Реакционноспособное производное полимера, включающее по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно возникающую в результате реакции полимера с кислым спиртом, карбонатом и/или азолидом, как описано выше, далее подвергают взаимодействию с дополнительным по меньшей мере бифункциональным соединением, где по меньшей мере одна функциональная группа Fi данного дополнительного соединения взаимодействует с по меньшей мере одной реакционноспособной карбоксильной группой производного полимера. Что касается по меньшей одной функциональной группы Fi дополнительного соединения, то здесь не существует каких-либо конкретных ограничений, при условии, что возможна реакция с по меньшей мере одной реакционноспособной карбоксильной группой полимера. Предпочтительными функциональными группами Fi являются, например, аминогруппа или гидроксильная группа, или тиогруппа, или карбоксильная группа.
Далее, по меньшей мере бифункциональное соединение включает
по меньшей мере одну другую функциональную группу F2, которая представляет собой альдегидную группу, или функциональную группу F2, которая может быть химически модифицирована с образованием альдегидной группы. Химическая модификация может представлять собой взаимодействие функциональной группы F2 с функциональной группой F3 следующего линкерного соединения или окисление или восстановление подходящей функциональной группы F2.
В том случае, когда F2 реагирует с функциональной группой F3 следующего соединения, F2 может быть выбран, помимо прочего, из
двойных С-С-связей или тройных С-С-связей или ароматических С-С-связей;
- тиогруппы или гидроксильных групп;
гидразида алкилсульфоновой кислоты; гидразида арилсульфоновой кислоты;
- 1,2-диолов;
- 1,2-аминотиоспиртов;
- азидов;
- 1,2-аминоспиртов;
- аминогрупп -NH2 или производных аминогрупп, включающих структурное звено -NH-, таких как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы;
гидроксиламино групп -0-NH2 или производных гидроксиаминогруппы, включающих структурное звено -0-NH-, таких как гидроксилалкиламино группы, гидроксилариламино группы, гидроксиларалкиламино группы или гидроксилалкариламино группы;
- алкоксиамино групп, арилоксиамино групп, аралкилоксиамино групп или алкарилоксиамино групп, каждая из которых включает структурное звено -NH-0-;
- остатков, имеющих карбонильную группу, -Q-C(=G)-М, где G представляет собой О или S, и М представляет собой, например,
- -ОН или -SH;
- алкоксильную группу, арилокси группу, аралкилокси группу или алкарилокси группу;
- алкилтио группу, арилтио группу, аралкилтио группу или
алкарилтио группу;
алкилкарбонилокси группу, арилкарбонилокси группу, аралкилкарбонилокси группу, алкарилкарбонилокси группу;
-- активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как N-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено 0-N, где N представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда G = О и Q отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где Q отсутствует или представляет собой NH или гетероатом, такой как S или О;
- -NH-NH; или -NH-NH-;
- -NCb;
- нитрильной группы;
карбонильных групп, таких как альдегидная группа или кетогруппа;
- карбоксильной группы;
- группы -N=C=0 или группы -N=C=S;
винилгалогенидных групп, таких как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат; - - -С=С-Н;
- -(C-NH:C1)-О-алкил;
-групп -(С=0)-CH^-Hal, где Hal представляет собой Cl, Вг или I;
- -CH=CH-SO;-;
- дисульфидной группы, включающей структуру -S-S-;
- группы
N02
где Fj представляет собой группу, способную образовывать химическую связь с одной из вышеуказанных групп, и предпочтительно выбран из вышеуказанных групп. Кроме того, второе связывающее соединение предпочтительно содержит по меньшей мере одну альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, которая способна взаимодействовать с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования.
Функциональная группа Fi и альдегидная группа, или кетогруппа, или группа полуацеталя по меньшей мере бифункционального связывающего соединения, которое
взаимодействует с полимером, и/или функциональные группы Fi и F-по меньшей мере бифункционального связывающего соединения, которое взаимодействует с полимером, и/или функциональная группа F3 и альдегидная группа, или кетогруппа, или группа полуацеталя по меньшей мере бифункционального связывающего соединения могут быть независимо разделены любым подходящим спейсером. Среди других, спейсер может представлять собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический, алифатический и/или ароматический углеводородный остаток. Обычно углеводородный остаток содержит до 60, , предпочтительно до 40, более предпочтительно до 20, более предпочтительно до 10 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа включает обычно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 , более предпочтительно от 1 до 6, более предпочтительно от 1 до 4 и особенно предпочтительно от 1 до 2 гетероатомов. В качестве гетероатома О является предпочтительным. Углеводородный остаток может включать необязательно разветвленную алкильную цепь, или арильную группу, или циклоалкильную группу, содержащую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или представлять собой аралкильную группу, алкарильную группу, где алкильная часть может представлять собой линейную и/или циклическую алкильную группу.
Примерами соединения с функциональными группами Fi и F; являются, например, необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 2 до 2 0 атомов углерода, особенно предпочтительно 1,2-диаминоэтан, 1,3-диаминопропан и 1,4-диаминобутан.
Предпочтительными примерами соединения с функциональной группой F3 и альдегидной группой или кетогруппой, или группой полуацеталя, являются, например, формилбензойная кислота, пентафторфениловый эфир 4-формилбензойной кислоты,
N-гидроксисукцинимидный эфир 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановая кислота или
биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кето карбоновых кислот, нейраминовых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер подвергают взаимодействию с бифункциональным соединением, которое представляет собой биосовместимое соединение, выбранное из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, нейраминовых или сиалиловых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
Что касается альфа-кетокарбоновых кислот, то предпочтительно они представляют собой альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, и в большинстве случаев они также могут быть выявлены в организме человека. Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кето-валина, кето-лейцина, кето-изолейцина и кето-аланина. Карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот ваимодействует с группой Q полимера, представляющей собой аминогруппу. При этом образуется амидная группа. Оставшаяся свободная кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может быть подвергнута взаимодействию с функциональной группой белка, в частности с аминогруппой. Таким образом, образуется иминогруппа, которая может быть прогидрирована.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.
Что касается сиалиловых кислот или их производных, они предпочтительно являются биосовместимыми, в частности, они представляют собой сахара, найденные в организме человека,
которые являются N- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловые кислоты представляют собой N-ацетилированные нейраминовые кислоты. Данные соединения обладают желательной жесткостью для выполнения функции в качестве спейсера благодаря структуре пиранозы. С другой стороны, в данные соединения посредством селективного окисления можно ввести альдегидную группу. Сиалиловые кислоты выявлены в организме человека, например, в качестве концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.
В предпочтительном варианте осуществления, сиалиловая кислота может быть селективно окислена с образованием альдегидной группы.
Способы селективного окисления сиалиловых кислот известны в данной области, смотри, например, L. W. Jaques, В. F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21-32 и Т. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Oleo, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669-673. Предпочтительно окисление сиалиловой кислоты может быть проведено перед взаимодействием с аминогруппой полимера.
Необязательно окисленная сиалиловая кислота затем может быть подвергнута взаимодействию по группе карбоновой кислоты с аминогруппой полимера.
Полученные соединения будут содержать альдегидную группу, которая далее может быть подвергнута восстановительному аминированию с аминогруппой белка.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с необязательно окисленной сиалиловой кислотой.
Что касается пиридоксальфосфата (РуР)/ он представляет собой высоко биосовместимое бифункциональное соединение и также называется витамин В6. РуР представляет собой кофермент, который участвует в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования, рацемизации и многочисленных модификациях боковых цепей аминокислот. Все требующие присутствия РуР ферменты действуют через образование оснований Шиффа между аминокислотой и
коферментом.
Фосфатная группа РуР может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой полимера, предпочтительно гидроксиалкилкрахмала, в частности, гидроксиэтилкрахмала, с образованием фосфорамида. Альдегидная группа РуР затем может быть подвергнута взаимодействию с аминогруппой белка с образованием основания Шиффа, которое затем может быть восстановлено. В предпочтительном варианте осуществления, структура конъюгата представляет собой HES-NH-P(О)2-0-(пиридоксаль)-CH-NH-белок.
В случае РуР, функциональную группу полимера предпочтительно вводят в полимер с использованием диамино-соединения, как описано выше.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, как описано выше, где полимер взаимодействует с пиридоксальфосфатом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения конъюгата, указанный способ включает взаимодействие полимера, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, по его необязательно окисленному восстановительному концу с соединением, выбранным из группы, состоящей из кислых спиртов, сложных карбоновых диэфиров и азолидов, с получением производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, взаимодействие указанного производного полимера с по меньшей мере одним по меньшей мере бифункциональным соединением с получением производного полимера, содержащего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя или функциональную группу, которая может быть модифицирована химически с образованием альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, необязательно химическую модификацию указанной функциональной группы с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, и взаимодействие производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к
конъюгату, включающему полимер, предпочтительно
гидроксиэтилкрахмал, и белок, ковалентно связанные друг с другом, получаемый способом получения конъюгата, где указанный способ включает взаимодействие полимера по его необязательно окисленному восстановительному концу с соединением, выбранным из группы, состоящей из кислых спиртов, сложных карбоновых диэфиров и азолидов, с получением производного полимера, включающего по меньшей мере одну реакционноспособную карбоксильную группу, взаимодействие указанного производного полимера с по меньшей мере одним по меньшей мере бифункциональным соединением с получением производного полимера, содержащего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя или функциональную группу, которая может быть модифицирована химически с образованием альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя, необязательно химическую модификацию указанной функциональной группы с получением производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, и взаимодействие производного полимера, включающего альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, с аминогруппой белка посредством восстановительного аминирования.
Конкретным примером соединения, содержащего функциональную группу Fi и функциональную группу F2, которое при окислении дает альдегидную группу является, например, соединение, содержащее аминогруппу в качестве Fi и бетагидроксиаминогруппу в качестве F2. Особенно предпочтительным примером является 1,З-диамино-2-гидроксипропан. Такое окисление может быть проведено с использованием всех подходящих окислителей, которые способны превращать бетагидроксиаминогруппу в альдегидную группу. Предпочтительными окислительными реагентами являются периодаты, такие как периодаты щелочных металлов. Особенно предпочтительным является периодат натрия, который предпочтительно используют в виде его водного раствора. Данный раствор предпочтительно имеет концентрацию иодата от 1 до 50 мМ, более предпочтительно от 1 до 25 мМ и особенно предпочтительно от 1 до 10 мМ. Окисление проводят при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до
25°С и особенно предпочтительно от 4 до 20°С.
Полученное производное полимера может быть очищено от реакционной смеси с использованием по меньшей мере одного подходящего способа. При необходимости, производное полимера может быть осаждено перед выделением с использованием по меньшей мере одного подходящего способа.
Если производное полимера первоначально осаждают, это возможно, например, при контакте реакционной смеси по меньшей мере с одним растворителем, или смесью растворителей, отличающихся от растворителя или смеси растворителей, присутствующих в реакционной смеси, при подходящей температуре. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, где в качестве растворителя используют водную среду, предпочтительно воду, реакционную смесь приводят в контакт с 2-пропанолом или со смесью ацетона и этанола, предпочтительно смесью в соотношении 1:1 (об/об), указывающем на равные объемы указанных соединений, при температуре предпочтительно в диапазоне от -20 до +50°С и особенно предпочтительно в диапазоне от -20 до 25°С.
Выделение производного полимера можно проводить с использованием подходящего способа, который может включать одну или более стадий. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, производное полимера первоначально отделяют от реакционной смеси или от смеси реакционной смеси с, например, водным 2-пропанолом, с использованием подходящего способа, такого как центрифугирование или фильтрование. На второй стадии, отделенное производное полимера может быть подвергнуто дополнительной обработке, такой как последующая обработка, как например, диализ, центрифужное фильтрование или фильтрование под давлением, ионообменная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ, МЭЖХ, гель-фильтрование и/или лиофилизация. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, отделенное производное полимера первоначально подвергают диализу, предпочтительно против воды, а затем лиофилизуют до тех пор, пока содержание
растворителя в реакционном продукте не станет достаточно низким в соответствии с желательными характеристиками продукта. Лиофилизацию можно проводить при температуре от 20 до 35°С,
предпочтительно от 2 0 до 30°С.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему гидроксиалкилкрахмал и белок, где
гидроксиалкилкрахмал связан с использованием его окисленного восстановительного конца с первым связывающим соединением посредством амидной связи, указанное связывающее соединение дополнительно связано амидной связью со вторым связывающим соединением, указанное второе связывающее соединение связано азометиновой и/или аминной связью с белком, где первое связывающее соединение предпочтительно используется в качестве диамино-функционализированного соединения, а второе связывающее соединение предпочтительно используется в качестве карбокси- и альдегидо- или кето-, или полуацеталь-, более предпочтительно в качестве карбокси- и альдегидо- функционализированного соединения.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), имеющий структуру, соответствующую формуле:
белок'
где Ri, R2 и R3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу,
гидроксиаралкильную группу, или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и
где L независимо представляет собой необязательно
замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, имеющий от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до б, более предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода и особенно предпочтительно 1 атом углерода, в частности, L представляет собой СН2.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), имеющий структуру, соответствующую формуле:
белок'
где Ri, R; и Ra независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу,
гидроксиаралкильную группу, или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1 до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и
где Li и L- независимо представляют собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильный, арильный, аралкильный, гетероалкильный и/или гетероаралкильный фрагмент, при этом указанный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, и
где D представляет собой связь, предпочтительно ковалентную связь, которая образована подходящей функциональной группой F:, связанной с Li и подходящей функциональной группой F3, связанной
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где Li представляет собой -(СН2)п-, где п = 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, предпочтительно 2, 3, 4, 5, б, более предпочтительно 2, 3, 4, и особенно предпочтительно 4.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где L2 включает необязательно замещенный подходящим образом арильный фрагмент, предпочтительно арильный фрагмент, содержащий б атомов углерода, особенно предпочтительно L2 представляет собой СгэН4.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где L2 выбирают из группы, включающей
двойные С-С-связи или тройные С-С-связи, или ароматические С-С-связи;
- тиогруппу или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфоновой кислоты; гидразид арилсульфоновой кислоты;
- 1,2-диолы;
- 1,2-аминотиоспирты;
- азиды;
- 1,2-аминоспирты;
- аминогруппу -NH2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -NH-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламино группы;
гидроксиламино группу -0-NH2 или производные гидроксиаминогруппы, включающие структурное звено -0-NH-, такие как гидроксилалкиламино группы, гидроксилариламино группы, гидроксиларалкиламино группы или гидроксилалкариламино группы;
алкоксиамино группы, арилоксиамино группы,
аралкилоксиамино группы или алкарилоксиамино группы, каждая из которых включает структурное звено -NH-0-;
- остатки, имеющие карбонильную группу, -Q-C(=G)-M, где G представляет собой О или S, и М представляет собой, например,
- -ОН или -SH;
-- алкоксильную группу, арилокси группу, аралкилокси группу или алкарилокси группу;
-- алкилтио группу, арилтио группу, аралкилтио группу или алкарилтио группу;
алкилкарбонилокси группу, арилкарбонилокси группу, аралкилкарбонилокси группу, алкарилкарбонилокси группу;
-- активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как N-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено 0-N, где N представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда G = О и Q отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где Q отсутствует или представляет собой NH или гетероатом, такой как S или О;
- -NH-NH- или -NH-NH-;
- -N0;;
- нитрильную группу;
- карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
- карбоксильную группу;
- группу -N=C=0 или группу -N=C=S;
- винилгалогенидные группы, такие как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат;
- - -С=С-Н;
- -(C-NH2C1)-Оалкил;
-группы - (С=0)-СН;-На1, где Hal представляет собой Cl, Вг или I;
-CH=CH-S02-;
- дисульфидную группу, включающую структуру -S-S-;
- группу
и где F3 представляет собой функциональную группу, способную образовывать химическую связь с F; и предпочтительно выбран из вышеуказанной группы, F3 предпочтительно включает фрагмент -NH-, более предпочтительно включает аминогруппу, F3 предпочтительно включает фрагмент -(C=G)-, более предпочтительно -(С=0)-, более предпочтительно фрагмент -(C=G)-G-, еще более предпочтительно -(C=0)-G-, и особенно предпочтительно - (С=0)-О, D предпочтительно представляет собой амидную связь.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, имеющему структуру, соответствующую формуле
NH-белок
п = 2, 3 или 4, R4 независимо представляет собой водород или метокси группу, и m = 0 в случае, когда R4 представляет собой водород, и m = 1 в случае, когда R4 представляет собой метокси.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), и белок представляет собой гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G-CSF), имеющему структуру, соответствующую формуле
HAS"-С-N- белок'
н2 н
где атом углерода фрагмента -CH;-N3- является производным альдегидной группы, которая была введена в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, и где атом азота получен из аминогруппы белка.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как
описано выше, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал.
Настоящее изобретение также относится к любому из описанных конъюгатов, где гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 7 0 кДа.
Настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, G-CSF, IFN альфа, IFN бета, AT III, IL-2, IL- 3, миоглобина, SOD и BSA, предпочтительно из группы, состоящей из rhEPO, rhG-CSF, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, миоглобина, SOD и BSA, и/или из группы, состоящей из А1АТ, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, tPA и АРС.
В способах получения конъюгата по изобретению степень конверсии в вышеуказанных способах может составлять по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 7 0%, еще более предпочтительно по меньшей мере 8 0% и в частности 95% или даже выше, как например, по меньшей мере 98% или 99%.
Конъюгаты согласно изобретению могут иметь по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 0%-ную чистоту, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную чистоту, в частности, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%-ную чистоту. В наиболее предпочтительном варианте осуществления конъюгат может иметь 100%-ную чистоту, т.е. в нем не присутствуют другие побочные продукты.
Следовательно, в соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к композиции, которая может включать конъюгат(ы) по изобретению, где количество конъюгата(ов) может составлять по меньшей мере 50 вес.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 0 вес.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90 вес.%, в частности, по меньшей мере 95 вес.% или по меньшей мере 99 вес.%. В наиболее предпочтительном варианте осуществления композиция может состоять из конъюгата(ов), т.е. количество конъюгата(ов) составляет 100 вес.%.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к конъюгату, как описано выше, или к конъюгату,
100
получаемому описанным выше способом, для применения в способе лечения человека или животного.
Соответственно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей терапевтически
эффективное количество конъюгата, как описано выше, или конъюгата, получаемого описанным выше способом.
Термин "терапевтически эффективное количество", как он использован в контексте настоящего изобретения относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант и/или носитель. Предпочтительно данный фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант и/или носитель является особенно полезным для терапии с использованием IFN альфа, IFN бета, ЕРО, AT III, G-CSF, АРС, А1АТ, tPA, Фактора VII, Фактора VIII или Фактора IX.
Все конъюгаты по настоящему изобретению белок-HAS предпочтительно вводят внутривенно (i.v.), подкожно (s.c.) или внутримышечно (i.m.). Конкретные пути введения выбирают в зависимости от состояния подвергаемого лечению. Предпочтительно конъюгаты вводят вместе с подходящим носителем, таким как известные в данной области (например, как использованные в биофармацевтических препаратах первого поколения/не
модифицированных, не содержащих альбумина или с использованием альбумина в качестве эксципиента), подходящим разбавителем, например, в виде стерильных растворов для внутривенного (i.v.), подкожного (s.c.) или внутримышечного (i.m.). применения. Требуемая дозировка будет зависеть от серьезности состояния, подвергаемого лечению, индивидуальной ответной реакции пациента, способа введения и тому подобного. Специалист способен определить корректную дозировку на основании обычных знаний.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше
101
способами, где белок представляет собой ЕРО, для получения лекарственного средства для лечения анемических нарушений или гематопоэтической дисфункции или связанных с этим заболеваний.
Введение изоформ эритропоэтина обычно проводят парентеральными путями. Конкретный выбранный путь будет зависеть от состояния, подвергаемого лечению. Введение изоформ эритропоэтина предпочтительно проводят в виде части препарата, содержащего подходящий носитель, такой как альбумин сыворотки человека, подходящий разбавитель, такой как забуференный физиологический раствор, и/или подходящий адъювант. Требуемая дозировка будет представлять собой количества, достаточные для повышения гематокритного числа пациента и будет изменяться в зависимости от тяжести состояния, подвергаемого лечению, способа введения и тому подобного. Задача лечения с использованием фармацевтической композиции по изобретению предпочтительно заключается в увеличении показателя для гемоглобина в крови до более чем 6,8 ммоль/л. С этой целью фармацевтическую композицию можно вводить таким образом, что показателя для гемоглобина будет увеличиваться в диапазоне от 0,6 ммоль/л до 1,6 ммоль/л в неделю. Если показатель для гемоглобина превышает 8,7 ммоль/л, терапию предпочтительно следует прервать до тех пор, пока показатель гемоглобина не снизится до значения ниже 8,1 ммоль/л. Композицию по изобретению предпочтительно используют в виде препарата, подходящего для подкожной или внутривенной, или парентеральной инъекции. Подходящие для этого эксципиенты представляют собой, например, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат динатрия, хлорат натрия, полисорбат 8 0, HAS и воду для инъекций. Композицию можно вводить три раза в неделю, предпочтительно два раза в неделю, более предпочтительно один раз в неделю и наиболее предпочтительно каждые две недели. Предпочтительно, фармацевтическую композицию вводят в количестве 0,01-10 мкг/кг веса тела пациента, более предпочтительно от 0,1 до 5 мкг/кг, от 0,1 до 1 мкг/кг или 0,2-0,9 мкг/кг, наиболее предпочтительно 0,3-0,7 мкг/кг и наиболее предпочтительно 0,4-0,6 мкг/кг. Обычно вводят в виде дозы предпочтительно между 10 мкг и 200 мкг, предпочтительно между 15 мкг и 100 мкг.
102
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой G-CSF, для получения лекарственного средства для лечения нарушения, характеризуемого пониженной гематопоэтической или иммунной функцией; указанное нарушение предпочтительно возникает в результате химиотерапии, лучевой терапии, инфекционного заболевания, тяжелой хронической нейтропении или лейкоза.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой Фактор VIII, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-AT III, как описано выше, или конъюгата HAS-белок, получаемого описанными способами для получения лекарственного средства для лечения наследственного дефицита AT III, венозного тромбоза, ожогов и устойчивости к гепарину при аорто-коронарном шунтировании (CABG), лечения перфорации кишечника в результате травмы и желудочно-кишечной хирургии, рассеянного внутрисосудистого свертывания крови (DIC) и/или сепсиса, а также для профилактики образования микросгустков, связанных с вентиляционной терапией. Следовательно, фармацевтическая композиция, включающая конъюгат HAS-AT III согласно изобретению, может использоваться для данных целей.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой А1АТ, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, цистозного фиброза, атопического дерматита, хронического обструктивного
103
заболевания легких (ХОЗЛ) и/или бронхита. Фармацевтическая композиция по изобретению, включающая конъюгат HAS-AT III согласно изобретению, может использоваться для данных целей.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой tPA, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечных приступов), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой АРС, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой IFN альфа, для получения лекарственного средства для лечения лейкоза, например, лейкоза волосковых клеток, хронического миелогенного лейкоза, множественной миеломы, фоликулярной лимфомы, рака, например, карциноидной опухоли, злокачественной меланомы, и гепатита, например, хронического гепатита В и хронического гепатита С.
В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, как описано выше, или конъюгата HAS-, предпочтительно конъюгата HES-белок, получаемого описанными выше способами, где белок представляет собой IFN бета, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
104
Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-Фактор VII конъюгат для получения лекарственного средства для лечения случаев гемофилии А или В у пациентов, обладающих ингибиторами Фактора VIII или Фактора IX.
Настоящее изобретение также относится к применению конъюгата HAS-Фактор IX для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (например, с врожденным дефицитом фактора IX или болезнью Кристмаса), включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах.
Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими фигурами, таблицами и примерами, которые не предназначены для ограничения объема изобретения.
Краткое описание фигур
Фигура 1а
На фиг.1а показан SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) анализ конъюгата HES-G-CSF, полученного в соответствии с примером 2.1(a), Neupogen(r). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue@Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) б. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF(Neupogen(r)) с HES, как описано в примере 2.1 (а).
Полоса С: исходное вещество G-CSF.
Фигура lb.
На фиг.lb показан SDS-PAGE анализ конъюгата HES-G-CSF, полученного в соответствии с примером 2.1(a), Granocyte(r). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini
105
Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В) . Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(c)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF (Granocyte(r)) с HES, как описано в примере 2.1(a).
Полоса С: исходное вещество G-CSF.
Фигура 2.
На фиг.2 показан SDS-PAGE анализ конъюгата HES-G-CSF, полученного в соответствии с примером 2.1(b), G-CSF представлял собой очищенный hG-CSF, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen(r). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с HES10/0,4 в 0,1М NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса С: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с HES10/0,7 в 0,1М NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса D: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с HES50/0,4 в 0,1М NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса Е: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с
106
HES50/0,7B 0,1M NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса F: исходное вещество G-CSF. Фигура 3
На фиг.З показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.2, G-CSF представлял собой очищенный hG-CSF, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen(c). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с окисленным HES10/0,7 в 0,1М NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса С: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с окисленным HES50/0,4 в 0,1М NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса D: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с окисленным HES50/0,7 0,1М NaOAc буфере, рН 5,0.
Полоса Е: исходное вещество G-CSF.
Фигура 4.
На фиг.4 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.3, G-CSF представлял собой Neupogen(r) или Granocyte(r). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В) . Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen
107
(i-N)
Неочищенный продукт (ii-N)
Неочищенный продукт (iii-N)
Неочищенный продукт (iv-N) Неочищенный продукт
Неочищенный продукт
Неочищенный продукт (iii-G)
Неочищенный продукт (iv-G)
:i-G)
:ii-G)
соответствии с
соответствии
соответствии
соответствии
в соответствии
соответствии
в соответствии
соответствии
GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, б кДа, 3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт примером 2.3.
Полоса С: примером 2.3.
Полоса D: примером 2.3.
Полоса Е: примером 2.3.
Полоса F: примером 2.3.
Полоса G: примером 2.3.
Полоса Н: примером 2.3.
Полоса I: примером 2.3.
Полоса J: Neupogen(c). Фигура 5.
На фиг.5 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.4, G-CSF представлял собой очищенный hG-CSF, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen(r). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) б. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, б кДа, 3 кДа.
108
Полоса В: Неочищенный продукт (vi) в соответствии с примером 2.4.
Полоса С: Неочищенный продукт (v) в соответствии с примером
2.4.
Полоса D: исходное вещество G-CSF.
Полоса Е: протеиновый маркер SeeBlue(c)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса F: Неочищенный продукт (ix) в соответствии с примером 2.4.
Полоса G: Неочищенный продукт (viii) в соответствии с примером 2.4.
Полоса Н: Неочищенный продукт (vii) в соответствии с примером 2.4.
Полоса I: исходное вещество G-CSF. Фигура 6.
На фиг.5 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.5, G-CSF представлял собой очищенный hG-CSF, имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen(r). Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 10% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт в соответствии с примером
2.5.
Полоса С: исходное вещество G-CSF. Фигура 7.
109
На фиг.7 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В) . Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы, имеющие объем, превышающий 15 мкл, концентрировали в вакууме до указанного объема.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(c)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Конъюгация IL-2 с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С: Конъюгация IL-2 с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса D: Контроль: IL-2, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Полоса Е: Конъюгация IFN-альфа с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса F: Конъюгация IFN-альфа с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса G: Контроль: IFN-альфа, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Фигура 8.
На фиг.8 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В) . Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы, имеющие объем, превышающий 15 мкл, концентрировали в вакууме до
указанного объема.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(c)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Конъюгация IL-3 с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С: Конъюгация IL-3 с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса D: Контроль: IL-3, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Полоса Е: Конъюгация миоглобина с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса F: Конъюгация миоглобина с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса G: Контроль: миоглобин, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Фигура 9.
На фиг.8 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 3-8% трис-ацетатный гель вместе с подвижным буфером Трис-ацетат SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа,17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Конъюгация BSA с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С: Конъюгация BSA с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса D: Контроль: BSA, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Ill
Фигура 10.
На фиг.10 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В) . Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы, имеющие объем, превышающий 15 мкл, концентрировали в вакууме до указанного объема.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(r)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Конъюгация SOD с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С: Конъюгация SOD с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса D: Контроль: SOD, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Полоса Е: Контроль: ЕРО, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Полоса F: Конъюгация ЕРО с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса G: Конъюгация ЕРО с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса Н: Конъюгация IFN-бета с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса I: Конъюгация IFN-бета с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса J: Контроль: IFN-бета, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Фигура 11.
На фиг.11 показан SDS-PAGE анализ конъюгатов HES-G-CSF, полученных в соответствии с примером 2.6. Для гель-электрофореза
112
использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 3-8% трис-ацетатный гель вместе с подвижным буфером трис-ацетат SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер SeeBlue(c)Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) 6. Маркер молекулярной массы сверху вниз: 188 кДа, 98 кДа, 62 кДа, 49 кДа, 38 кДа, 28 кДа, 17 кДа, 14 кДа, 6 кДа, 3 кДа.
Полоса В: Конъюгация AT III с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.9.
Полоса С: Конъюгация AT III с альдегидо-HES, синтезированным, как описано в примере 1.10.
Полоса D: Контроль: AT III, обработанный боргидридом натрия в отсутствие альдегидо-HES.
Фигура 12
На фиг. 12 показаны результаты in vitro примера 4. На диаграмме на оси х показана концентрация в пг/мл, на оси у представлено число клеток/100000.
На диаграмме следующие сокращения относятся к G-CSF/A32 Конъюгат G-CSF, полученный в
соответствии с примером 2.5. G-CSF/A33 Исходное вещество G-CSF, использованное
для получения конъюгата в примере 2.5. G-CSF/A57 Немодифицированный Neulasta(r)
G-CSF/A58 Немодифицированный Neupogen(c)
Фигура 13
SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия): проходящий поток и элюат HES-модифицированного G-CSF в соответствии с примером 2.5 после хроматографии (см. пример 3) на DEAE-Sepharose CL-6B; 1,5% указанных фракций обессоливали ультрафильтрованием, сушили на SpeedVac и наносили на 12,5% полиакриламидный гель.
Фигура 14: спектр MALDI/TOF G-CSF (см. пример 3)
Фигура 15: спектр MALDI/TOF G-CSF, модифицированного HES
113
(см. пример 3) Фигура 16:
На фиг.16 показаны результаты примера 5 (анализ неочищенных конъюгатов otlAT-HES, полученных, как описано в примере 5.5, с помощью гель-электрофореза).
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Power Рас 200 (Bio-Rad, Munchen, D). Использовали 3-8% Трис-ацетатный гель вместе с трис-ацетатным подвижным буфером для SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: неокрашенный SDS Page протеинового маркера 6,5200 кДа (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D) . Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 116 кДа, 67 кДа, 45 кДа, 29 кДа, 21 кДа, 14,3 кДа, 6,5 кДа;
Полоса В: Конъюгирование с альдегидо-HES, как описано в примере 5.5;
Полоса С: Конъюгирование с HES, как описано в примере 5.6; Фигура 17:
На фиг. 17 представлены результаты примера 5 (анализ фракций В1-С6, собранных после ионообменной хроматографии (см. пример 5.7)
Условия гель-электрофореза см. на фиг. 16.
Полоса А: неокрашенный SDS Page протеинового маркера 6,5200 кДа (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D) . Маркер молекулярной массы сверху вниз: 2 00 кДа, 116 кДа, 67 кДа, 45 кДа, 29 кДа, 21 кДа, 14,3 кДа, 6,5 кДа;
Полоса В: фракция В1
Полоса С: фракцияС1
Полоса D: фракция С2
Полоса Е: фракция СЗ
Полоса F: фракция С4
Полоса G: фракцияС5
Полоса Н: фракция С6
114
Полоса I: А1АТ (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) Фигура 18:
На фиг.18 показана остаточная ферментативная активность относительно концентрационной диаграммы Prolastin@ HS (Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Германия, Lot No. PR4HA43), A1AT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) и HES-AlAT-конъюгата, синтезированного, как описано в примере 5.5.
Фигура 19
На фиг.19 показан гель-электрофорез реакционных смесей примера 6.2 (Ь).
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Гель окрашивали с использованием Roti-синего (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа.
Полоса В: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с производным HES, полученным в примере 6.1(d)
Полоса С: Неочищенный продукт после конъюгации ofhG-CSF с производным HES, полученным в примере 6.1(b)
Полоса D: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с производным HES, полученным в примере 6.1(j)
Полоса Е: Контроль реакции: HES 50/0,7 (Mw 47000, DS = 0,7 6)
Фигура 20
На фиг.20 показан гель-электрофорез реакционных смесей примера 6.2(d).
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure
115
Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Гель окрашивали с использованием Roti-синего (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса А: протеиновый маркер Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа.
Полоса В: hG-CSF после замены буфера, как описано в примере 6.2(с) .
Полоса С: Неочищенный продукт после конъюгации G-CSF с производным HES, полученным, как описано в примере 6.1(f).
Полоса D: Неочищенный продукт после конъюгации hG-CSF с производным HES, полученным, как описано в примере 6.1(h).
Фигура 21
На фиг.21 показаны результаты анализа митогенности в соответствии с примером 6.3. На оси Y указано число клеток NFS-60/мл, а на оси X - концентрация в пг/мл.
Фигура 22
На фиг.22 показаны результаты анализа in vivo в соответствии с примером 6.4. Фигура 23
На фиг.2 3 показан анализ неочищенных конъюгатов EPO-HES примера 7 с использованием гель-электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса A: Roti(c)-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH +Co.KG,
116
Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа;
Полоса В: Конъюгация ЕРО к альдегидо-HES, как описано в примере 7.3;
Полоса С: Реакция ЕРО и альдегидо-HES без использования цианоборгидрида натрия (контроль реакции А) , как описано в примере 7.4;
Полоса D: Реакция ЕРО и цианоборгидрида натрия в отсутствие альдегидо-HES (контроль реакции В), как описано в примере 7.5.
Как это видно из фиг.23, реакции не наблюдалось для контроля реакции А и В либо в отсутствие альдегидо-HES, либо в отсутствие цианоборгидрида натрия.
Фигура 24
На фиг. 24 показан анализ конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ примера 8.3.1 с использованием гель-электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort El4 3 (CONSORTnv, Turnhout, B). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса X: Roti(c)-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH +Co.KG, Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа;
Полоса А: Конъюгация с альдегидоНЕЭ 10/0,4, как описано в примере 8.3.1, опыт А;
Полоса В: Конъюгация с альдегидоНЕЭ 10/0,7, как описано в примере 8.3.1, опыт с В;
Полоса С: Конъюгация с альдегидоНЕ530/0,4, как описано в примере 8.3.1, опыт С;
Полоса D: Конъюгация с альдегидоНЕ530/0,7, как описано в примере 8.3.1, опыт D;
Полоса Е: Конъюгация с альдегидоНЕ350/0,4, как описано в примере 8.3.1, опыт Е;
Полоса F: Конъюгация с альдегидоНЕ350/0,7, как описано в
117
примере 8.3.1, опыт F;
Полоса G: реакционный контроль, без альдегидоНЕБ, как описано в примере 8.3.1, опыт G;
Полоса I: реакционный контроль, без альдегидоНЕБ и в отсутствие NaCNBH3, как описано в примере 8.3.1, опыт I;
Полоса J: реакционный контроль, с использованием HES10/0,4 как описано в примере 8.3.1, опыт J;
Полоса К: реакционный контроль, с использованием HES10/0,4, но в отсутствие NaCNBH3, как описано в примере 8.3.1, опыт К.
Фигура 25
На фиг. 25 показан анализ конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ примера 8.3.2 с использованием гель-электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса X: Roti(c)-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа;
Полоса
Конъюгация
альдегидо
-HES,
как
описано
пример
.2, опыт
Полоса
Конъюгация
альдегидо
-HES,
как
описано
пример
.2, опыт
Полоса
Конъюгация
альдегидо
-HES,
как
описано
пример
.2, опыт
Полоса
Конъюгация
альдегидо
-HES,
как
описано
пример
.2, опыт
Полоса
Конъюгация
альдегидо
-HES,
как
описано
пример
.2, опыт
Полоса
Конъюгация
альдегидо
-HES,
как
описано
пример
.2, опыт
Полоса
реакционный
контроль,
с использованием
HES, как
описано в пример 8.3.2, опыт G.
118
Как это видно на фиг. 25, в условиях реакционного контроля G реакции не наблюдалось. Фигура 26
На фиг. 2 6 показан анализ конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ примера
8.3.3 с использованием гель-электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ неочищенных конъюгатов IFNot-HES с помощью гель-электрофореза.
Полоса A: Roti(c)-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз: 200 кДа, 119 кДа, 66 кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа;
Полоса В: Конъюгация IFNa с альдегидоНЕЭ, как описано в 8.3.3.1;
Полоса С: Конъюгация IFNa с альдегидоНЕЗ, как описано в 8.3.3.2;
Полоса D: Конъюгация IFNa с HES10/0,4-натрий (реакционный контроль), как описано в 8.3.3.3 Фигура 27
На фиг. 27 показан анализ конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ примера
8.3.4 с использованием гель-электрофореза.
Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 10% Бис-Трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS в восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полоса X: Roti(c)-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Маркер молекулярной массы сверху вниз:
119
200 кДа, 119 кДа, бб кДа, 43 кДа, 29 кДа, 20 кДа, 14,3 кДа;
Полоса А: Конъюгация с альдегидо-HES, как описано в пример 8.3.4;
Полоса В: Контроль реакции; конъюгация с HES (MW =7,6 кДа, DS = 0,41), как описано в примере 8.3.4.
Как это видно из фиг. 27, для реакционного контроля В реакции не наблюдалось.
Фигура 28
На фиг.28 показана пролиферативная активность Intron А по сравнению со стандартом NIH rhIFN-альфа 2а в соответствии с примером 9.1.
Фигура 29
На фиг. 29 показана относительная активность in vitro имитационно инкубированного IFN-альфа-НЕЗ по сравнению с немодифицированным исходным веществом IFN-альфа в соответствии с примером 9.2.
Фигура 30
На фиг.30 показана относительная активность in vitro конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ по сравнению с немодифицированным исходным веществом IFN-альфа, Intron А и Pegasys, соответственно, в соответствии с примером 9.3.
Фигура 31
На фиг.31 показана относительная активность in vitro конъюгата IFN-альфа-НЕЗ по сравнению с Intron А в соответствии с примером 9.4.
Фигура 32
На фиг.32 показано разведение образцов сыворотки крови, требуемое для достижения 50% защиты клеток MDBK против вирусной инфекции, относительно времени после внутривеннного инфицирования мышей в дозе 30 мкг/кг. Сыворотка, полученная от мышей, обработанных немодифицированным исходным веществом, обладает очень низким противовирусным действием. Модификация IFN-альфа с использованием HES в значительной степени продлевает противовирусное действие сыворотки. Период полураспада увеличивается с увеличением молекулярной массы HES, использованного для модификации IFN-альфа (см. пример 10).
120
Фигура 33
На фиг. 33, показаны данные РК-исследования на кроликах в соответствии с примером 11. IFN-альфа-НЕЗ продемонстрировал отчетливое увеличение продолжительности периода полураспада по сравнению с исходным веществом IFN-альфа. Для > 24 часов (приблизительно. < 1000 пКи/мл) кривая для немодифицированного вещества выравнивается и почти не наблюдается дальнейшего снижения активности.
Фигура 34
На фиг. 34, показаны данные РК-исследования на кроликах в соответствии с примером 11. Оценку данных проводили в период времени от 4 до 2 4 часов. IFN-альфа-НЕЗ продемонстрировал отчетливое увеличение продолжительности периода полураспада по сравнению с немодифицированным исходных веществом IFN-альфа.
Фигура 35
На фиг. 35, показана статистическая оценка РК-исследования (показан период до 12 часов) в соответствии с примером 11. В случае немодифицированного исходного вещества (см. фиг. 35(a)) концентрация падала почти до нуля во время первых двух часов, тогда как IFN-альфа-НЕЗ продемонстрировал отчетливое увеличение продолжительности периода полураспада (см. фиг. 35(b)). Фигура 36
На фиг. 36, показаны результаты примера 6.5 (сравнение определения периода полураспада конъюгата HES-G-CSF согласно изобретению, Neulasta(c) и Neupogen(c))
Фигура 37
На фиг. 37, показаны графически результаты примера 10,3 (противовирусная активность конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ) Фигура 38
На фиг. 38 показаны графически результаты примера 9.5 (противовирусная активность конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ) Примеры
Пример 1: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала
Пример 1.1(a): Синтез гидроксиэтилкрахмала, селективно окисленного по его восстановительному концу путем окисления
121
периодатом и выдерживания при 0°С.
100 мг Оксо-HESIO/O, 4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4, получен с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2 и охлаждали до 0°С. 21,4 мг периодата натрия (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера и охлаждали до 0°С. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 минут при 0°С добавляли 0,7 3 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 минут. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 часов против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,41.
Пример 1.1(b): Синтез гидроксиэтилкрахмала, селективно окисленного по его восстановительному концу путем окисления периодатом и выдерживания при 21°С.
100 мг OKCO-HES10/0, 4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4, получен с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2. 21,4 мг периодата натрия (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 минут при 21°С добавляли 0, 73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 минут. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 часов против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,41.
Пример 1.2(a): Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, путем окисления периодатом
122
гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом и выдерживания при 0°С.
100 мг OKCO-HESIO/O, 4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2 и охлаждали до 0°С. 21,4 мг периодата натрия (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера и охлаждали до 0°С. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 минут при 0°С добавляли 0,73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 минут. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 2 4 часов против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 8,5 кДа, и DS составляла 0,41.
Пример 1.2 (Ь) : Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала, путем окисления периодатом гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом и выдерживания при 21°С.
100 мг OKCO-HES10/0, 4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4, получен с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) растворяли в 5 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2. 21,4 мг периодата натрия (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 5 мл того же буфера. Оба раствора смешивали и после выдерживания в течение 10 минут при 21°С добавляли 0,73 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 минут. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 2 4 часов против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 8,5 кДа, и DS составляла 0,41.
Пример 1.3: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного
123
гидроксиэтилкрахмала и 4-формилбензойной кислоты
OKCO-HES 10/0,4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-HESlO/0,4 растворяли в 15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в 10 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 4 0°С в течение 19 часов. Реакционную смесь добавляли к смеси 80 мл этанола и 8 0 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 2 0 мл этанола и 2 0 мл ацетона и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 67% (3,4 г) амино-HES 10/0,4.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Tauflcirclien, D) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 204 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида. После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 1 г амино-HES 10/0,4. После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды
(SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.4: Синтез функционализированного альдегидными
124
группами гидроксиэтилкрахмала из гидроксиэтилкрахмала и формилбензойной кислоты
OKCO-HES 10/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,76.
83 мг 4-формилбензойной кислоты и 180 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Tauflcirclien, D) растворяли в 5 мл N,N-диметилформамида (ДМФ, качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 78 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида.
После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 0,5 г амино-HES 10/0,7. После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 37,5 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 2,5 мл воды и 2,5 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.5: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из гидроксиэтилкрахмала и формилбензойной кислоты
OKCO-HES 10/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия.
Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
50 мг 4-формилбензойной кислоты и 108 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Tauflcirclien, D) растворяли в 3 мл N,N-диметилформамида
125
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 47 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида. После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 0,3 г амино-HES 10/0,7. После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 23 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 1,5 мл воды и 1,5 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.6: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и пентафторфенилового эфира формилбензойной кислоты
OKCO-HES 10/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия/ в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,76.
6,0 г (0,6 ммоль) оксо-HESlO/O,7 растворяли в 20 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 6 мл (60 ммоль) 1,4-диаминобутана в 11 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 4 0°С в течение 19 часов. Реакционную смесь добавляли к смеси 8 0 мл этанола и 8 0 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 20 мл этанола и 2 0 мл ацетона и повторно растворяли в 8 0 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 52% (3,15 г)
126
амино-HES 10/0,7.
Пентафторфениловый эфир 4-формилбензойной кислоты синтезировали, как описано в публикации J. S. Lindsey at Al., Tetrahedron 50 (1994), стр. 8941-68, в частности на стр. 8956. 50 мг OKCO-HES 10/0,7 растворяли в 0,5 мл N,N-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 15,3 мг пентафторфенилового эфира 4-формилбензойной кислоты. После встряхивания в течение 22 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 3,5 мл охлажденного на льду 2-пропанола. Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 мл охлажденного на льду 2-пропанола, растворяли в 50 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.7: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и пентафторфенилового эфира формилбензойной кислоты
OKCO-HES 10/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,76.
Пентафторфениловый эфир 4-формилбензойной кислоты синтезировали, как описано в публикации J. S. Lindsey at Al., Tetrahedron 50 (1994), стр. 8941-68, в частности на стр. 8956. 2 00 мг OKCO-HES 10/0,7 растворяли в 2 мл N,N-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 61,2 мг пентафторфенилового эфира 4-формилбензойной кислоты. После встряхивания в течение 22 часов
при 22°С реакционную смесь добавляли к 15 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и повторно
127
растворяли в 1,4 мл воды и 0,7 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано выше, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.8: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и 4-(4-формил-З,5-
диметоксифенокси)бутановой кислоты
OKCO-HES 10/0,4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-HESlO/O,4 растворяли в 15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в 10 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 4 0°С в течение 19 часов. Реакционную смесь добавляли к смеси 8 0 мл этанола и 8 0 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 20 мл этанола и 2 0 мл ацетона и повторно растворяли в 80 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 67% (3,4 г) амино-HES 10/0,4.
80,5 мг 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты (Calbiochem-Novabiochem, Laufelfingen, CH) и 61 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH,
Tauflcirclien, D) растворяли в 3 мл N,N-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 45,4 мкл N,N1-диизопропилкарбодиимида.
128
После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 0,3 г амино-HES 10/0,4. После встряхивания в течение 22 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 23 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и повторно растворяли в 2 мл воды и 1 мл ДМФ и опять осаждали, как описано выше. Продукт реакции собирали центрифугированием, как описано выше, растворяли в 10 мл воды, и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.9: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала из аминофункционализированного гидроксиэтилкрахмала и 4-формилбензойной кислоты
OKCO-HES 10/0,4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,41.
5,1 г (0,51 ммоль) оксо-HESlO/O,4 растворяли в 15 мл безводного диметилсульфоксида (ДМСО, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли по каплям в атмосфере азота к раствору 5,1 мл (51 ммоль) 1,4-диаминобутана в 10 мл безводного диметилсульфоксида и перемешивали при 4 0°С в течение 19 часов. Реакционную смесь добавляли к смеси 8 0 мл этанола и 8 0 мл ацетона. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали смесью 2 0 мл этанола и 20 мл ацетона и повторно растворяли в 8 0 мл воды. Раствор подвергали диализу в течение 4 дней против воды SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и впоследствии лиофилизовали. Выход составлял 67% (3,4 г) амино-HES 10/0,4.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich ChemieGmbH,
129
Tauflcirclien, D) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида (качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 2 04 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида. После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 1 г амино-HES 10/0,4. После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 1.10: Синтез функционализированного альдегидными группами гидроксиэтилкрахмала путем окисления периодатом гидроксиэтилкрахмала, селективно окисленного по его восстановительному концу.
OKCO-HES 10/0,4 (MW = 10 кДа, DS = 0, 4) получали с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Молекулярная масса HES 10/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,41.
300 мг оксо-HESlO/O, 4 растворяли в 15 мл 20 мМ натрий фосфатного буфера, рН 7,2. 64,2 мг периодата натрия (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 15 мл того же буфера. Оба раствора смешивали и посыле выдерживания в течение 30 минут при 21°С добавляли 2 мл глицерина и реакционную смесь выдерживали при 21°С в течение 10 минут. Реакционную смесь подвергали диализу в течение 24 часов против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали.
Пример 2: Синтез G-CSF-конъюгатов путем восстановительного аминирования
G-CSF представлял собой очищенный G-CSF, имеющий по
130
существу такие же характеристики, что и коммерчески доступный продукт Neupogen(c) (Amgen, Мюнхен, Германия (D)).
Пример 2.1(a): Синтез G-CSF-конъюгатов путем
восстановительного аминирования с использованием
гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом при рН = 7,4
(Сравнительный пример)
В примере 2.1, для получения HES-G-CSF конъюгата предпринята попытка синтеза с использованием способа, описанного в WO 03/074087 (пример 12, страницы 22-23).
К 3,33 мкл водного раствора G-CSF (Neupogen(r) от Amgen, Мюнхен, Германия, D, или Granocyte(r) от Aventis Pharma AG, Цюрих, Швейцария, СН, соответственно, 3 мг/мл) в 0,1 М натрий фосфатном буфере с рН 7,4, добавляли 3,33 мкл раствора HES10/0,4 (MW = 10 кДа, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, 7 9 мг/мл) в том же буфере. К данной смеси добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере и полученную смесь выдерживали в течение 4 часов при 22°С. Затем добавляли другую порцию 3,33 мкл свежеприготовленного 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия. Во время периода выдерживания смеси в течение 30 часов добавляли всего 5 порций по 3,33 мкл свежеприготовленного 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Реакции не наблюдалось.
Пример 2.1(b): Синтез G-CSF-конъюгатов путем
восстановительного аминирования с использованием
гидроксиэтилкрахмала с неокисленным восстановительным концом при рН = 5, 0-9, 2
(Сравнительный пример)
К 3,33 мкл водного раствора G-CSF (3 мг/мл) в данном буфере добавляли 3,33 мкл раствора OKCO-HES (300 мг/мл) в том же буфере. Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С, и смесь выдерживали в течение 2 0 часов при 4°С.
Использовали следующие препараты HES и буферы:
131
a) Буфер: 0,1 М натрий ацетатный буфер рН 5,0
- HES 10/0,4 (MW= 10 кДа, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 8,5 кДа, и DS составляла 0,41.
- HES 10/0,7 (MW= 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
- HES 50/0,4 (MW = 50 кДа, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES50/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 57 кДа, и DS составляла 0,41.
- HES 50/0,7 (MW = 50 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES50/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 47 кДа, и DS составляла 0,76.
b) Буфер: 0,1 М натрий фосфатный буфер рН 7,2
- HES 10/0,7 (MW= 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
c) Буфер: 0,1 М натрий боратный буфер рН 8,3
- HES 10/0,7 (MW= 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
d) Буфер: 0,2 М калий боратный буфер рН 9,2
- HES 10/0,7 (MW= 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES 10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
Каждую реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Наблюдалось отсутствие конъюгирования или незначительное конъюгирование (сканы гелей для реакций b)-d) не показаны).
132
Пример 2.2: Синтез G-CSF-конъюгатов путем
восстановительного аминирования с использованием
гидроксиэтилкрахмала с окисленным восстановительным концом при рН = 5,0-9,2
(Сравнительный пример)
К 3,33 мкл водного раствора G-CSF (3 мг/мл) в данном буфере добавляли 3,33 мкл раствора OKCO-HES (300 мг/мл) в том же буфере. Смесь охлаждали до 4°С и добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С, и смесь выдерживали в течение 17 часов при 4°С.
Использовали следующие препараты HES и буферы:
a) Буфер: 0,1 М натрий ацетатный буфер рН 5,0
- OKCO-HESIO/O, 7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 14,5 кДа, и DS составляла 0,76.
- OKCO-HES50/0, 4 (MW = 50 кДа, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES50/0,4, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 42 кДа, и DS составляла 0,41.
- OKCO-HES50/0,7 (MW= 50 кДа, DS= 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES50/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 57 кДа, и DS составляла 0,76.
b) Буфер: 0,1 М натрий фосфатный буфер рН 7,2
- HES10/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
c) Буфер: 0,1 М натрий боратный буфер рН 8,3
-HES10/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HES10/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
d) Буфер: 0,2 М калий боратный буфер рН 9,2
133
- HESlO/0,7 (MW = 10 кДа, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия). Молекулярная масса HESlO/0,7, измеренная с использованием LALLS-GPC, составляла 10,5 кДа, и DS составляла 0,76.
Каждую реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Наблюдалось отсутствие конъюгирования или незначительное конъюгирование (сканы гелей для реакций b)-d) не показаны).
Окисление HES 10/0,4 (MW = 8,4 кДа, DS = 0,41 проводили с использованием Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия; в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1.
Пример 2.3: Синтез G-CSF-конъюгатов путем
восстановительного аминирования с использованием
функционализированного альдегидными группами
гидроксиэтилкрахмала, синтезированного окислением периодатом
К 3,33 мкл водного раствора G-CSF (Granocyte(r) от Aventis Pharma AG, Цюрих, Швейцария (СН), и Neupogen(r) от Amgen, Мюнхен, Гемания (D) , соответственно, 3 мг/мл) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0, добавляли 3,33 мкл раствора альдегидо-HES (79 мг/мл) в том же буфере. К смеси добавляли 2 3, 33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия и смесь выдерживали в течение 25 часов при 21°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза.
Использовали следующие конъюгаты HES, функционализированные альдегидными группами:
(i-N) получен с использованием Neupogen(r) в соответствии с примером 1.1(a) выше;
(ii-N) получен с использованием Neupogen(c) в соответствии с примером 1.1(b) выше;
(iii-N) получен с использованием Neupogen(r) в соответствии с примером 1.2(а) выше;
(iv-N) получен с использованием Neupogen(r) в соответствии с примером 1.2(b) выше;
(i-G) получен с использованием Granocyte(c) в соответствии с
134
примером 1.1(а) выше;
(ii-G) получен с использованием Granocyte(r) в соответствии с примером 1.1(b) выше;
(iii-G) получен с использованием Granocyte(r) в соответствии с примером 1.2 (а) выше;
(iv-G) получен с использованием Granocyte(r) в соответствии с примером 1.2(b) выше;
Пример 2.4: Синтез G-CSF-конъюгатов путем
восстановительного аминирования с использованием
функционализированного альдегидными группами
гидроксиэтилкрахмала, синтезированного конъюгированием
гидроксиэтилкрахмала с формилкарбоновой кислотой.
К 3,33 мкл водного раствора G-CSF (3 мг/мл) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0, добавляли 3,33 мкл раствора альдегидо-HES (118,5 мг/мл) в том же буфере и раствор охлаждали до 4°С. К смеси добавляли 3,33 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С и смесь выдерживали в течение 17 часов при 4°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза .
Использовали следующие конъюгаты HES, функционализированные альдегидными группами:
(v) получен в соответствии с примером 1.4 выше;
(vi) получен в соответствии с примером 1.5 выше;
(vii) получен в соответствии с примером 1.6 выше;
(viii) получен в соответствии с примером 1.7 выше;
(ix) получен в соответствии с примером 1.8 выше;
Пример 2.5: Синтез G-CSF-конъюгатов путем
восстановительного аминирования с использованием
функционализированного альдегидными группами
гидроксиэтилкрахмала, синтезированного конъюгированием
гидроксиэтилкрахмала с формилкарбоновой кислотой.
К 2,5 мл водного раствора G-CSF (2,27 мг/мл) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0 добавляли 136 мг альдегидо-HESlO/0,4, полученного, как описано выше в примере 1.3, и раствор охлаждали до 0°С. К смеси добавляли 2,5 мл охлажденного на льду 4 0 мМ
135
раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере и смесь выдерживали в течение 17 часов при 4°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза.
Пример 2.6: Синтез различных конъюгатов белка путем восстановительного аминирования с использованием
функционализированного альдегидными группами
гидроксиэтилкрахмала, синтезированного в соответствии с примерами 1.9 и 1.10 соответственно
К w мкл (см. далее таблицу I) раствора белка Р (см. далее таблицу I) в 0,1 М натрий ацетатном буфере рН 5,0 (х мг/мл; см. далее таблицу I) добавляли у мкл (см. далее таблицу I) раствора HES-производного (синтезированного, как описано в примерах 1.9 или 1.10) в том же буфере (200 мг/мл). Смесь охлаждали до 4°С и добавляли z мкл 12 0 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере при 4°С, и смесь инкубировали в течение 24 часов при 4°С. Неочищенную реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Для всех белков наблюдали успешное конъюгирование, на что указывал переход полосы белка в сторону большей молекулярной массы (см. фигуры 7-11). Увеличенные молекулярные массы связаны с распределением молекулярных масс для производных HES и числом производных HES, связанным с белком.
Таблица I:
Эксперименты, проведенные в соответствии с примером 2.б
Опыт
Белок Р
rhIL-2
(Strathmann Biotec, Hamburg, Германия)
4,41
3, 88
rhIFN-альфа
(Strathmann Biotec, Hamburg, Германия)
3, 91
3, 78
rhIL-3
(Strathmann Biotec, Hamburg, Германия)
3, 34
2, 67
136
Супероксиддисмутаза SOD (из бычьих эритроцитов, Sigma, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия)
6, 67
3,21
1, 97
Миоглобин
(из скелетных мышц лошади, Sigma, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия)
6, 67
2,33
rhEPO
6, 67
3, 34
rhAT III (ATryn(c) GTC
Biotherapeutics, Framingham, MA, США
6, 67
1, 73
1, 68
rhIFN-бета
0, 5
BSA
(Frakt. V, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Германия)
6, 67
1,49
1, 63
Использованный IFN бета представлял собой rhIFN бета la, полученный в клетках СНО, содержащих ди- и триантеннальные углеводные цепи и N-ацетиллактозаминные повторяющиеся фрагменты.
Использованный ЕРО представлял собой рекомбинантно продуцированный ЕРО, имеющий последовательность аминокислот ЕРО человека и по существу такие же характреистики, что и коммерчески доступный Erypo(r) (ORTHO BIOTECH, Jansen-Cilag) или NeoRecormon (Roche), см. ЕР 0148605, ЕР 0205564, ЕР 0411678.
Пример 3: Анализ конъюгата G-CSF, полученного в примере 2.5
А. Очистка
Получали G-CSF, представлявший собой hG-CSF и имеющий по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen(r) и одну аликвоту сохраняли в немодифицированном виде в качестве контроля.
1. Замена буфера для образцов G-CSF и G-CSF-конъюгата перед очисткой методом анион-обменной хроматографии.
В образце HES-модифицированного G-CSF и немодифицированного G-CSF (в качестве контроля) (0,5-5 мг белка) проводили замену
137
буфера с использованием прибора концентратора Vivaspin 6 (10000 MWCOPES, Vivascience, кат. № VS0602). Образцы концентрировали до объема 0,5-0,7 мл и разводили до 5 мл с использованием 10 мМ Na-фосфатного буфера с рН 7,2. Для каждого образца цикл концентрирование/замена буфера проводили 3 раза.
2. Анионобменная хроматография G-CSF и его HES-модифицированных форм на колонке с DEAE-Sepharose
Образцы G-CSF после модификации с помощью HES и для сравнения образцы немодифицированного G-CSF очищали и анализировали с помощью анион-обменной хроматографии при комнатной температуре с использованием исследовательской системы АКТА 10, как описано. Аликвоты G-CSF или перед или после HES-сиалилирования подвергали диализу с использованием ультрафильтрования против указанного буфера А (10 мМ Na-фосфат, рН 7,2) или разводили примерно в 13 объемах буфера А. Колонку, содержащую 2 мл DEAE-Sepharose (DEAE-Sepharose CL-бВ, Pharmacia, каталожный № 17-0710-01) регенерировали с использованием 5,0 объемов колонки (ОК) раствора 6,5 М гуанидин/HCl, 5,0 объемов колонки буфера А, 5,0 объемов колонки буфера С (1,5 М NaCl в 10 мМ Na-фосфате, рН 7,2), а затем 10 объемов колонки буфера А. Затем вводили образцы (0,8-4,5 мл в 10 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,2) при скорости потока 0,6 мл/мин. После промывания цикла образца 10 мл (2 мл на цикл образца) или 2 0 мл (5 мл цикл образца) буфера А, в зависимости от используемого образца, колонку дополнительно промывали 0-22 ОК буфера А (скорость потока = 0,8 мл/мин). Элюирование проводили с использованием линейного градиента от 0 до 100% буфера В для используемого объема в 5 ОК и изократического прохода 2,5 ОК 100% буфера В при скорости потока 0,6 мл/мин. Колонку повторно уравновешивали 5 ОК буфера А и регенерировали, как описано подробно выше при скорости потока 1 мл/мин.
При необходимости образцы концентрировали с использованием концентратора Vivaspin и проводили замену буфера, как описано выше. Образцы хранили при 0-8°С в 10 мМ Na-ацетатном буфере, рН 4,0 перед или после стерилизации фильтрованием с
138
использованием 0,2 мкм фильтрационного элемента (Corning, кат. No. 431215) . Для in-vitro биоанализов и для последующих аналитических анализов получали следующие образцы. Концентрацию белка определяли, как описано ниже в разделе В1:
I. 0401-15/АЗЗ, 0,44 мг/мл, объем = 500 мкл G-CSF (Е. coli)
II. 0401-13/А32, 0,28 мг/мл, объем = 900 мкл G-CSF (Е. coli) HES-модифицированный
III. 0401-28/А58, 0,60 мг/мл, объем = 350 мкл Neupogen
IV. 0401-28/А57, 0,50 мг/мл, объем = 400 мкл Neulasta
В. Анализ
Аликвоты образца анализировали для определения содержания белка и модификации
1. Количественная оценка белка G-CSF с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (RP-ВЭЖХ)
Содержание белка G-CSF в образце оценивали количественно с использованием препарата немодифицированного белка
(концентрация: 0,453 мг/мл) в качестве стандарта
Использовали систему ВЭЖХ Dionex, включающую насос Р 680 А HPG, дегазирующий элемент Degasys DG 1210, автоматический пробоотборник и инжектор ASI-100, замкнутую систему для образца в 250 мкл и термостатируемый отдел колонок ТСС 100 вместе с детектором УФ/Vis UVD17 0U, оборудованную программным обеспечением для управления хроматографией.
Использовали предварительную колонку СС 8/4 Nucleosil 120-5 С4, Macherey-Nagel, кат. No. 721889, и колонку разделения 40 С-4 Nucleosil MPN, 5 мкм, 125 х 4 мм RP-колонка (Macherey - Nagel, кат. No. 7200 45.40) . Растворитель А представлял собой Н20 плюс 0,06% (об/об) трифторуксусной кислоты, и растворитель В состоял из 90% ацетонитрила в Н20, содержащего 0,06% (об/об) трифторуксусной кислоты; скорость потока составляла 1 мл/мин.
УФ-детектирование проводили при длине волны 214, 221, 2 60 и 280 нм
139
Образцы приблизительно 10-20 мкг вводили через инжектор в колонку RP-ВЭЖХ. Использовали следующий градиент:
- 0-5 мин.: 0-10 % В
- 17 мин.: 10-45 % В
- 35 мин.: 45-80 % В
- 36 мин.: 80-100 % В
- 38 мин.: 100% В
- 39 мин.: 10% В
- 4 5 мин.: 10 % В
Использовали полученную площадь пика в момент элюирования стандартного препарата G-CSF с сравнивали со ссылочным стандартом путем сравнения пика, появляющегося примерно в момент времени 2 9 минут при длине волны 280 нм.
2. Редуцирование + карбоксамидометилирование белка G-CSF Проводили редуцирование (уменьшение в размере) и
карбоксамидометилирование аликвот образцов белка G-CSF, как описано в литературе (Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004); N-and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line; European J. Biochem, 273 (5), 907-919). Карбоксамидометилирование приводит к
модифицированным остаткам цистеина. Расщепление эндопротеиназой Glu-C карбоксамидометилированного белка проводили в 25 мМ NH4HCO3, содержащем 1 М мочевины, при рН 7,8 с использованием соотношения фермент/субстрат 0,2:10 в течение 18-24 часов.
3. Отделение пептидов Endo-Glu-C с помощью RP-ВЭЖХ Пептиды, полученные при расщеплении Endo-Glu-C отделяли с
использованием системы ВЭЖХ Dionex, включающей насос Р 680 А HPG, дегазирующий элемент Degasys DG 1210, автоматический пробоотборник и инжектор ASI-100, замкнутую систему для образца в 250 мкл и термостатируемый отдел колонок ТСС 100 вместе с детектором УФ/Vis UVD170U, оборудованную программным обеспечением для управлением хроматографией.
Использовали предварительную колонку СС 8/4 Nucleosil 120-5
140
С4, Macherey-Nagel, кат. No. 721889, и колонку разделения 40 С-4 Nucleosil MPN, 5 мкм, 125 х 4 мм RP-колонка (Macherey - Nagel, кат. No. 7200 45.40). Растворитель А представлял собой Н:0 плюс 0,06% (об/об) трифторуксусной кислоты, и растворитель В состоял из 90% ацетонитрила в Н:0, содержащего 0,06% (об/об) трифторуксусной кислоты; скорость потока составляла 1 мл/мин. Использовали следующий градиент:
- 0-5 мин.: 10 % В
- 17 мин.: 4 5 % В
- 65 мин.: 100 % В
- 67 мин.: 100 % В
- 69 мин.: 10 % В
- 75 мин.: 10 % В
УФ-детектирование проводили при длине волны 214, 221, 260 и 280 нм. Пептиды, полученные при Endo-Glu-C расщеплении оказались разделяемыми (данные не показаны).
4. Анализ протеолитических пептидов с использованием матрикс-вспомогательной с лазерной десорбцией/ионизацией время пролетной масс-спектроскопии (MALDI/TOF/TOF-MS)
Масс-спектроскопию использовали для обнаружения
незатронутого N-конца G-CSF в различных полученных образцах белка. Образцы (3-5 мкг), редуцированных и
карбоксамидометилированных образцов белка, полученные при расщеплении эндонуклеазой Glu-C использовали непосредственно для масс-спектрометрического анализа (без RP-ВЭЖХ на стадии 3) и очищали с использованием кончиков пипеток ZipTip, содержащих С18 материал с обращенной фазой в соответствии с инструкциями производителя. После промывания 0,1% (об/об) муравьиной кислотой элюирование пептидов проводили 10 мкл 0,1% (об/об) муравьиной кислоты в 60% (об/об) ацетонитриле.
Протеолитические фрагменты (Endo-Glu-C) анализировали с использованием время-пролетного прибора Bruker ULTRAFLEX (TOF/TOF) в линейном режиме положительного иона с использованием в качестве матрицы 22,4 мг 3,5-диметокси-4-гидроксициннамовой кислоты в 400 мкл ацетонитрила и 600 мкл 0,1% (об/об)
трифторуксусной кислоты в Н^О; массу (глико)пептидов измеряли с использованием в качестве матрицы 19 мг а-циано-4-гидроксициннамовой кислоты в той же смеси растворителей с использованием рефлектрона для усиленного разрешения. Растворы образцов объемом в 1 мкл с приблизительной концентрацией 1-10 пмоль/мкл"1 смешивали с равными объемами соответствующей матрицы. Данную смесь наносили в виде пятна на стальную мишень из нержавеющей стали и высушивали при комнатной температуре перед анализом. Спектр регистрировали в диапазоне масс 90 0-50 0 Дальтон. В таблице ниже приведена корреляция между ожидаемыми массами с полученными для соответствующих пептидов G-CSF.
Таблица:
Теоретические (моноизотопные) массы пептидов Endo-Glu-C,
полученных из G-CSF
Масса (Дальтон)
Наблюдалась в данном исследовании
Положение аа
Искусствен. Модификация(и)
Последовательность пептида
2132,11
1-20
Cys_CAM:
пол.18
m/z 2189,13
MTPLGPASSLPQSFLLKCLE
1512,81
21-34
QVRKIQGDGAALQE
1534,74
35-47
Cys_CAM: пол.37,43 m/z 1648,78
KLCATYKLCHPEE
4942,63
48-94
Cys_CAM: пол.65,75 m/z 5056,68
LVLLGHSLGIPWAPLSSCPS QALQLAGCLSQLHSGLFLYQ GLLQALE
502,25
95-99
GISPE
2835,37
100-124
LGPTLDTLQLDVADFATTIW QQMEE
4026,08
125-163
LGMAPALQPTQGAMPAFASA FQRRAGGVLVASHLQS FLE
1438,83
164-175
VSYRVLRHLAQP
Цистеиновые остатки были карбоксамидометилированными;
142
пептиды, отмеченные как жир, обнаружены в MALDI/TOF спектре немодифицированного G-CSF.
N-концевой пептид Endo-Glu-C (MTPLGPASSLPQSFLLKCLE; m/z 2189,1), включающий положение 1-20 белка обнаруживался в масс-спектре MALDI/TOF-MS образца после протеолитической обработки G-CSF эндопротеиназой Glu-C, как описано выше.
Результаты:
I. Очистка G-CSF и HES модифицированного варианта
HES-модифицированный G-CSF и немодифицированный G-CSF были подвергнуты очистке с использованием колонки CL-бВ с DEAE-Sepharose, как описано в разделе А4.
В случае немодифицированного образца 0401-15/АЗЗ, значительного поглощения при 2 80 нм не обнаруживалось в протекающем потоке, и белок был элюирован при 40-50% концентрации буфера В (0,16-0,20 М NaCl) в объеме б мл, при конкретной площади пика 600 MAU Х млх МГ - при 280 нм.
Образец (HES-модифицированный G-CSF) элюировался при большем диапазоне градиента при концентрации буфера В от 2 0 до 80% (0,08-0,32 М NaCl) в объеме 12 мл. Примерно 90% общего пика обнаруживалось при 28 0 нм в протекающем потоке, содержащем примерно 50% от общего белка, с очевидно несколько более высокой массой при сравнении с элюированным белком, как обнаружено по анализу SDS-PAGE, показанному на фиг.13.
Выделение белков рассчитывали на основании площади пика (А280 нм) для элюированных фракций по сравнению с немодифицированным белком G-CSF
143
Таблица 1:
Сравнение площадей пиков при детектировании при 280 нм.
DEAE-Sepharose Опыт №
Описание
Рассчитанн ое
количество
белка
для
впрыскивания
Элюат
Площадь[280нм] (MAU х мл)
Выход в элюате по сравнению с элюатом из опыта DS01 АЗЗ**
DS01 АЗЗ
G-CSF
0,5 мг
330
(0, 50 мг)
DS03 А32
HES-модифицированный G-CSF
4, 0 мг
1560
2,36 мг
RP-ВЭЖХ количественная оценка белка подтвердила данные
результаты
II. Анализ белков с помощью пептидного отображения и MALDI/TOF MS после обработки эндопротеиназой Glu-C
N-концевой пептид, полученный при расщеплении
эндопротеиназой Glu-C как карбоксамидометилированного немодифицированного G-CSF (Фигура 14), так и продажного продукта Neupogen (данные не показаны), четко определялся с помощью масс-спектроскопии MALDI/TOF-MS (MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE, m/z 2189,1; цистеин карбаксамидометилированный). Данный сигнал отсутствовал в образцах, подвергнутых модификации с использованием HES (Фигура 15) ив образце Neulasta (данные не показаны), указывая на модификацию пептида.
N-концевое секвенирование HES-модифицированного G-CSF выявило блокированный N-конец, что позволяет предположить тот факт, что N-концевой остаток метионина данного производного белка является модифицированным производным HAS
Код образца
Описание
Спектр MALDI/TOF
G-CSF А32
HES-модифицированный G-CSF
1/4810
G-CSF АЗЗ
G-CSF
1/4811
G-CSF А57
Neulasta
1/4812
G-CSF А58
Neupogne
1/4813
G-CSF А08
G-CSF
1/4815
144
Ссылки:
Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004) N-and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocytemacrophage colony-stimulating фактор secreted by a Chinese hamster ovary cell line.
Eur J. Biochem, 271 (5), 907-919
Nimtz, M., Grabenhorst, E., Conradt, H. S., Sanz, L. & Calvete, J. J. (1999) Structural characterization of the oligosaccharide chains of native and crystallized boar seminal plasma spermadhesin PSP-I and PSP-II glycoforms. Eur. J. Biochem. 265, 703-718.
Nimtz, M., Martin, W., Wray, V., Koppel, K.-D., Agustin, J. & Conradt, H. S. (1993) Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant BHK-21 cells. Eur J. Biochem. 213, 39-56
Nimtz, M., Noll G., Paques, E. & Conradt, H. S. (1990) Carbohydrate structures of human tissue plasminogen activator variant expressed in recombinant Chinese hamster ovary cells. FEBS Lett. 271, 14-18.
Schroter, S., Derr, P., Conradt, H. S., Nimtz, M., Hale, G. & Kirchhoff, C. (1999) Male-specific modification of human CD52. J. Biol.Cltem. 274, 29862-29873
E. Grabenhorst and H. S. Conradt (1999) The Cytoplasmic, Transmembrane and the Stem Regions of Glycosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi
J. Biol. Chem., 274, 36107-36116
E.Grabenhorst, A. Hoffmann, M. Nimtz, G. Zettlmeipi and H. S. Conradt (1995) Construction of этаблица BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(5l-4GlcNAc-R #2,6-sialyltransferase: 2,6-linked NeuAc is preferably attached to theGaipi-4GlcNAc(3l-2Man(5l-3-branch of biantennary oligosaccharides from secreted recombinant-trace protein.
145
Eur. J.Biochem., 232, 718-725
Пример 4: Результаты in vitro для G-CSF-конъюгата, полученного в примере 2.5 и очищенного в соответствии с примером 3. Митогенность вариантов G-CSF для мышиных клеток NFS-60
Известно специфическое действие G-CSF на пролиферацию, дифференциацию и активацию гематопоэтических клеток нейтрофильного гранулоцитного происхождения. Митогенная способность вариантов G-CSF была протестирована с использованием мышиных клеток NFS-60 (N. Shirafuji et al., Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119). Клетки, выращенные в среде RPMI, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco NVITROGEN GmbH, Karlsruhe, Германия), содержащей 5-10% кондиционированной среды WEHI-3B (DSMZ, Braunschweig, Германия; культивированы, как описано DSMZ) как источника экзогенного IL-3, собирали центрифугированием, промывали и делили на аликвоты по 10000 0 клеток на лунку в 24-луночном планшете. Клеткам давали возможность адаптироваться в течение 1 часа при 37°С в среде RPMI без кондиционированной среды WEHI-3B, после чего добавляли образцы факторов роста G-CSF, разведенные в той же среде. Клетки NFS-60 подвергали действию очищенных вариантов G-CSF в течение 3 дней при 37°С и затем клетки электронным образом подсчитывали (счетчик для клеток Casy ТТ Cell Counter, Scharfe System, Reutlingen, D) . Результаты суммированы на фиг.12. Как видно на фиг.12, различные варианты G-CSF (0,5-50 пг/мл) были способны стимулировать число клеток после 3-дневного воздействия по сравнению со средой, которая не содержала факторов роста.
Немодифицированные контрольные белки G-CSF/A33 и G-CSF/A58 стимулировали клетки очень похожим образом (ED50 = 5-10 пг/мл), в то время как конъюгаты G-CSF G-CSF/A32 и G-CSF/A57 показали лишь минимальное снижение активности по сравнению с немодифицированным образцом (ED50 = 10-25 пг/мл).
Пример 5. Конъюгаты А1АТ (alAT, альфа1аТ), синтезированные посредством восстановительного аминирования
Пример 5.1. Синтез амино-HES (А) из окисленного HES
6,09 г оксо-HES (MW = 57000 Да, DS = 0,76, Supramol
146
Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, получен в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 82%.
Пример 5.2. Синтез альдегидо-HES (А) из амино-HES(А) примера 5.1
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 38 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 155 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 3,8 г амино-HES (А) (получен, как описано в примере 5.1). После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1
(об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 2 0 мл N,N-диметилформамида и осаждали 8 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об), как описано выше в примере 5.1. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland
147
GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 77%.
Пример 5.3 Синтез амино-HES (В) из окисленного HES 10 г оксо-HES (MW = 57000 Да, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, получен в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, растворяли в токе азота в 52 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 2 мл 1,4-диаминобутана (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 8 0 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и проводили диализ в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 85%.
Пример 5.4. Синтез альдегидо-HES (В) из амино-HES (В) примера 5.3.
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 51 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 170 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 5,1 г амино-HES (В) (получен, как описано в примере 5.3). После встряхивания в течение 16 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1
(об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали 360 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1
148
(об/об), как описано выше в примере 5.1. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 5.5. Конъюгация альдегидо-HES (А) и (В) с А1АТ путем восстановительного аминирования
Смесь 189 мг альдегидо-HES (В) (получен, как описано в пример 5.4) и 172 мг альдегидо-HES (А) (получен, как описано в пример 5.2) растворяли в 2,88 мл реакционного буфера (0,1 М натрий фосфатный буфер, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). При 20°С добавляли 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере с последующим добавлением 0,455 раствора А1АТ (с(А1АТ) = 11,0 мг/мл в 20 мМ натрий фосфатном буфере, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, А1АТ = rhAlAT, полученный от GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, лот NO.080604A). Смесь инкубировали при 20°С. Через 17 часов дополнительно добавляли 6,7 мг цианоборгидрида натрия, растворенного в 200 мкл реакционного буфера, и смесь выдерживали дополнительно в течение 2 4 часов при той же температуре. 10 мкл данного раствора анализировали после общего периода инкубации, равного 25 часам, с помощью гель-электрофореза (см. фиг.16).
Пример 5.6. Конъюгация HES с А1АТ путем восстановительного аминирования (контроль реакции)
362 мг HES (MW = 56000 Да, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) растворяли в 2,88 мл реакционного буфера (0,1 М натрий фосфатный буфер, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2). При 20°С добавляли 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере с последующим добавлением 0,4 55 мл раствора А1АТ (с(А1АТ) = 11,0 мг/мл в 20 мМ натрий фосфатном буфере, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, alAT = rh alAT, полученный от GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, лот No.080604A). Смесь инкубировали при 20°С. Через 17 часов дополнительно добавляли 6,7 мг цианоборгидрида натрия, растворенного в 200 мкл реакционного буфера, и смесь выдерживали
149
дополнительно в течение 24 часов при той же температуре. 10 мкл данного раствора анализировали после общего периода инкубации, равного 25 часам, с помощью гель-электрофореза (см. фиг.17).
Пример 5.7. Очистка конъюгата HES-A1AT с омощью ионобменной хроматографии (IEC)
Конъюгаты А1АТ очищали с помощью ионообменной хроматографии на колонке HiTrap Q HP с использованием хроматографической системы AKTA-Explorer (оба от Amersham Biosciences). Очистку проводили в соотвествии с выделением А1АТ из плазмы крови человека, как описано в "Спеп, НамМопс!, Langand Lebing, Purification of Inhibitor от Human Plasma фракция IV-1 Ion Exchange Chromatography, VoxSanguinis 1998, 74, 232-241".
Получение образцов: замена буфера на обессоленной колонке HiPrep 26110 (Amersham Biosciences) в сочетании с хроматографической системой AKTA-Explorer с использованием 2 0 мМ фосфата натрия, 2 0 мМ хлорида натрия, рН 8 в качестве элюента.
Замену буфера проводили после разбавления неочищенной реакционной смеси (получена, как описано в примере 5.5, приблизительно 5 мл) обессоленной водой до конечного объема 10 мл с использованием следующих параметров: Колонка: HiPrep 2 6/10 обессоленная
Скорость потока: 10 мл/мин
Элюент: 2 0 мМ фосфат натрия,
2 0 мМ хлорид натрия рН 8
Объем образца: 10 мл
Разделение фракций: 2,5 мл
Уравновешивание: 5 объемов колонки
Длина элюирования: 2 объема колонки
Собирали первые 14 мл элюента и добавляли связывающий буфер, получая конечный объем 2 0 мл. Данный раствор, содержащий приблизительно 5 мг белка, очищали с помощью IEC с использованием следующих параметров: Колонка: HiTrapQ HP 1 мл
Скорость потока: 1 мл/мин
150
Связывающий буфер (ВВ) 2 0 мМ фосфат натрия,
2 0 мМ хлорид натрия рН 8
Элюирующий буфер (ЕВ) 2 0 мМ фосфат натрия,
1 М хлорид натрия рН 8
Объем образца: 20 мл
Фракционирование потока: 2 мл
Фракционирование элюата: 1 мл
Начальная концентрация ЕВ: 0%
Уравновешивание: 5 объемов колонки
Промывка несвязанного образца: 15 мл
Целевая концентрация ЕВ: 15%
Продолжительность градиента: 2 0 мл
Собранные после хроматографии фракции анализировали с помощью SDS-Page. Фракции, содержащие конъюгат HES-A1AT, были объединены (элюированный объем от 4 0 до 47 мл, соответствующий фракциям В1-С6, см фиг. 17). В некоторых из объединенных фракций обнаруживалось незначительное количество не вступившего в реакцию А1АТ. Первоначальная концентрация объединенных фракций после хроматографии, определенная с помощью ВСА (Pierce, кат.No. 23225) с использованием А1АТ (предоставленного GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, лот No.080604A) в качестве ссылочного стандарта, составляла 170 пг/мл. После разведения и замены буфера на буфер 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2, концентрация полученного белка составляла 54,5 пг/мл (ВСА (проход с А1АТ от GTC Biothearpeutics Inc., Framingham, MA, лот No. 080604A (в качестве ссылочного стандарта)). Данный конечный раствор использовали для определения ингибирующей активности конъюгата. Пример 5.8.
Определение ингибирующей способности in vitro конъюгата HES-A1AT конъюгат в отношении гранулоцитэластазы человека.
Исследования ингибирующей активности конъюгатов в отношении эластазы Elastase проводили в соответствии с Castillo et al., Anal.Biochem. 1979, 99, 53-64 с использованием модели
151
планшетного ридера Tecan UV-VIS-Platereader Model Sunrise.
Данный анализ основан на высвобождении п-нитроанилина из N-Met-О-сукцинил-Ala-Ala-Pro-Val-p-NO:-анилина, катализируемого эластазой. За ходом данного гидролиза можно следить по увеличению поглощения при 4 05 нм. Первоначальная скорость гидролиза близко коррелирует с активностью фермента. Анализ проводят в отсутствие и в присутствии различных концентраций тестируемого ингибитора. Снижение активности фермента в соответствии с ингибирующей активностью тестируемых веществ представлено по уменьшению наклона графика А^пь относительно времени. Остаточная активность эластазы в присутствии некоторой концентрации ингибитора приведена по наклону кривой ингибирования, деленной на наклон кривой без ингибирования. Имеется линейная корреляция между остаточной активностью фермента и концентрацией ингибитора. При использовании линейной регрессии можно достичь гладкой линейной прямой, и подсчитать остаточную активность фермента для данной концентрации ингибитора. Таким образом можно сравнить ингибрующую активность (= 1-остаточная активность фермента) для одной и той же концентрации различных ингибиторов (см. фиг.18).
Использовали следующие параметры:
Концентрация субстрата: 1,5 мМ
Активность эластазы: 7,5 мЕд.
Длина водны: 4 05 нм
Температура: 20°С
Интервал времени: 15 сек
Кинетические циклы: 2 5
Способ измерения: центрованный
Раствор для анализа состоял из 300 мкл буфера (0,1 М Hepes, 0,5 М NaCl, 0,05% (вес/об) Triton Х-100, рН 7,5), содержащего 10% ДМСО, 1,5 мМ ^Ме^О-сукцинил-А1а-А1а-Рго-Уа1-р-Ш2-анилина, 7,5 mU мЕд эластазы и различные количества ингибитора.
Эластазу получали от Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg. Все другие вещества получены от Sigma Aldrich, Taufkirchen.
152
Ингибирующую активность конъюгатов, синтезированных как описано в примере 5.5., тестировали в сравнении с проластином Prolastin(c) HS (Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Германия, лот No. PR4HA43) в качестве ссылки и с использованием А1АТ (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, лот No. 080604A) в качестве исходного вещества для конъюгирования. График остаточной активности феремента относительно концентрации приведен на фиг. 18. Линейность для всех кривых составляла R2 > 0,98. Ниже приведены значения 1С5о и ингибирование эластазы для с(ингибитор)=1 мкг/мл, а также ингибирующая активность для исходного вещества и конъюгата относительно ссылки. Данные, приведенные в таблице ниже, четко показывают, что большая часть активности А1АТ сохраняется после конъюгирования с HES.
Таблица примера 5.8
Ингибитор
Гладкая линейная
прямая
Уравнение
1С,0
[мкг/мл]
Ингибирование
эластазы
с(ингибитор)=
1 мкг/мл [%]
Ингибирующая активность по отношению к проластину
Проластин
у=-
0,6754х+0,9627
0, 685
71,3
А1АТ
у=-
0,5046х+0,9558
0, 903
54, 9
HES-A1AT-конъюгат
у=-
0,3757х+0,9627
1, 232
41,3
57, 9
Пример 5.9. Определение in-vivo периода полураспада конъюгата HES-rh альфа1АТ по сравнению с rh альфа1АТ и полученным из плазмы крови альфа1АТ
Самок мышей возрастом 8-10 недель (BALB/cOlaHsd,Harlan GmbH, Borchen, Германия) использовали в качестве подопытных организмов (42 мыши, 14 на образец). "Вес тела" каждого животного определяли непосредственно перед введением растворов различных образцов. 100 мкл раствора с концентрацией 50 мкг/мл указанных далее образцов в буфере с рН=7,2 (200 ммоль фосфата натрия, 150 ммоль хлорида натрия) вводили внутривенно в хвостовую вену мышей.
Образец 1: rh альфа1АТ (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, лот No. 080604A)
153
Образец 2: конъюгат rh альфа1АТ-НЕЗ, полученный, как описано в примере 5.5.
Образец 3: h альфа1АТ, полученный из плазмы крови человека (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Германия)
Через 1, 2, 4, 10, 24, 31,5 и 48 часов после инъекции двух мышей из каждой группы убивали и отбирали образцы цельной крови (~50 0 мкл) из сердца мышей. Готовили сыворотку крови с использованием Microvette(r) 500 Z-Gel (Sarstedt, Numbrecht, Германия). Образцы сыворотки хранили при -8 0°С до начала измерений концентрации альфа1АТ.
Концентрации альфа1АТ определяли с использованием коммерчески доступного альфа1АТ-ЕЫЗА (Immundiagnostik, Bensheim, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Полученные результаты показывают существенное увеличение периода полураспада в плазме крови конъюгата альфа1АТ-НЕЗ по сравнению с немодифицированным исходным веществом rh альфа1АТ. Измеренные периоды полураспада конъюгата находятся в том же диапазоне, что и период полураспада h альфа1АТ, полученного из плазмы крови человека, в соответствии со следующей таблицей.
Таблица примера 5.9:
Период полураспада образцов 1-3 в плазме крови.
Образец №
Период полураспада в плазме крови мышей [ч]
1,2
3, 6
3,2
Пример 6. Синтез G-CSF-конъюгатов
Пример 6.1. Синтез альдегидо-HES производных
Пример 6.1(a). Синтез аминоНЕ310/0,4
5,12 г оксо-HESlO/0,4 (MW = 14500 Да, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, получен в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 25 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 5,13 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную
154
смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 67%. Пример 6.1(b). Синтез альдегидоНЕЭЮ/О, 4
105 мг 4-формилбензойной кислоты и 135 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 7 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 135 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 0,7 г амино-HES10/0,4 (синтезирован, как описано в примере 6.1(a)). После встряхивания в течение 18 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 42 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 5 мл ДМФ и осаждали 42 мл смеси этанол/ацетон, как описано выше. После центрифугирования собранный осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 95%.
Пример 6.1(c). Синтез аминоНЕЗЮ/О,7
6,02 г оксо-HESlO/O, 7 (MW = 15000 Да, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, получен в соответствии с патентом Германии DE 19628705) растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 6,03 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение
155
17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 52%. Пример 6.1(d). Синтез альдегидоНЕБЮ/0,7
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 2 04 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 1 г амино-HES10/0,7 (синтезирован, как описано в примере 6.1(c)). После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденного на льду 2-пропанола. Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 83%. Пример 6.1(e). Синтез аминоНЕ33 0/0,4
5 г OKCO-HES30/0,4 (MW = 28000 Да, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, с использованием молярных соотношений ингредиентов в соответствии с патентом Германии DE 1962 8 7 05 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и
156
этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 4 0 мл воды и проводили диализ в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли. Пример 6.1(f). Синтез альдегидоНЕЗЗО/О,4
130 мг 4-формилбензойной кислоты и 153 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 36 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 110 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 2,61 г амино-HES30/0,4 (синтезирован, как описано в примере 6.1(e)). После встряхивания в течение 22,5 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 81%.
Пример 6.1(g). Синтез аминоНЕ330/0,7
5 г OKCO-HES30/0,7 (MW = 31000 Да, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, с использованием молярных соотношений ингредиентов в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и
157
этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 4 0 мл воды и проводили диализ в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли. Пример 6.1(h). Синтез альдегидоНЕЗЗО/О,7
122 мг 4-формилбензойной кислоты и 144 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 34 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 103 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 2,46 г амино-HES30/0,7 (синтезирован, как описано в примере 6.1(g)). После встряхивания в течение 22,5 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 6.1(i). Синтез аминоНЕ350/0,7
6,09 г OKCO-HES 50/0,7 (MW = 57000 Да, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, с использованием молярных соотношений ингредиентов в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и
158
этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием.. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и проводили диализ в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 82%. Пример 6.1(j) Синтез альдегидоНЕ350/0,7
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 38 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 155 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 3,8 г амино-HES50/0,7 (синтезирован, как описано в примере 6.1(i)). После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 2 0 мл N, N-диметилформамида и осаждали 8 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 77%.
Пример 6.2. Синтез конъюгатов HES-G-CSF путем восстановительного аминирования
Пример 6.2(a). Замена буфера А:
33 мл раствора с концентрацией 0,454 мг/мл hG-CSF (очищенный hG-CSF имел по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen) в 10 мМ ацетате натрия, 50 мг/мл сорбита и 0,004% Tween 80 при рН 4,0 концентрировали
159
путем диафильтрования при 0°С до 4 мл с использованием концентратора Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, Германия) и повторно разводили до 15 мл с использованием 0,1 М натрий-ацетатного буфера при рН 5,0. Такое диафильтрование повторяли дважды. Конечная концентрация на последней стадии диафильтрования составляла 3 мг/мл.
Пример 6.2(b). Взаимодействие hG-CSF с производными альдегидоНЕБ примеров 6.1(b), 6.1(d) и 6.1 (j)
К 1,67 мл раствора hG-CSF после замены буфера в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (как описано в примере 6.2(a) выше) добавляли 1,67 мл раствора HES-производного и 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба в том же буфере, и раствор выдерживали в течение 15,5 часов при 4°С. Все растворы охлаждали до 0°С перед смешиванием.
Использовали следующие конечные концентрации HES:
39,4 мг/мл для производных HES, полученных в соответствии с примерами 6.1(b) и 6.1(d).
197 мг/мл для производного HES, полученного в соответствии с примером 6.1(j).
197 мг/мл HES50/0,7 (MW = 47000 Да, DS= 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) в качестве реакционного контроля.
Реакционные смеси анализировали с помощью гель-электрофореза (см. фиг.19).
Пример 6.2(c). Замена буфера В:
20 мл раствора с концентрацией 0,454 мг/мл hG-CSF (очищенный hG-CSF имел по существу такие же характеристики, что и коммерческий продукт Neupogen) в 10 мМ ацетате натрия, 50 мг/мл сорбита и 0,004% Tween 80 при рН 4,0 концентрировали путем диафильтрования при 15°С до 4 мл с использованием концентратора Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, Германия) и повторно разводили до 15 мл с использованием 0,1 М натрий-ацетатного буфера при рН 5,0. Такое диафильтрование повторяли дважды. Конечная концентрация на последней стадии диафильтрования составляла 1,5 мг/мл.
160
Пример 6.2(d). Взаимодействие hG-CSF с производными альдегидоНЕЗ примеров 6.1(f) и 6.1 (h)
К 3,3 мл раствора hG-CSF после замены буфера в 0,1М натрий-ацетатном буфере, рН 5,0 (как описано выше в пример 6.2(c)) добавляли 3,3 мл раствора 789 мг HES-производного и 3,3 мл 60 мМ цианоборгидрида натрия, оба в том же буфере, и раствор выдерживали в течение 30 часов при 4°С. Все растворы охлаждали до 0°С перед смешиванием.
Через 17 часов образцы удаляли для контроля реакции. Реакционные смеси анализировали с помощью гель-электрофореза (см. фиг.20).
Пример 6.3 Анализ митогенности вариантов G-CSF in vitro на мышиных клетках NFS-60
Известно специфическое действие G-CSF на пролиферацию, дифференциацию и активацию гематопоэтических клеток нейтрофильного гранулоцитного происхождения. Митогенная способность вариантов G-CSF была протестирована с использованием мышиных клеток NFS-60 cells(N. Shirafuji et al., Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119). Клетки выращенные в среде RPMI с 10% околоплодной телячьей сыворотки (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, Германия), содержащей кондиционированной среды 5-10% WEHI-3B (DSMZ, Braunschweig, Германия; культивированы, как описано DSMZ) как источника экзогенного IL-3, собирали центрифугированием, промывали и делили на аликвоты по 100000 клеток на лунку в 24-луночном планшете. Клеткам давали возможность адаптироваться в течение 1 часа при 37°С в среде RPMI без кондиционированной среды WEHI-3B, после чего добавляли образцы факторов роста G-CSF, разведенные в той же среде. Клетки NFS-60 подвергали действию очищенных вариантов G-CSF(очистка в соответствии с примерами 3 А1 и 2, количественная оценка белка в соответствии с примером ЗВ1):
Neupogen(r), Neulasta(r), оба от Amgen,
"конъюгат HES-GCSF10/0,4" (10/0,4), получен в примере 6.2(Ь) ,
"конъюгат HES-GCSF10/0,7" (10/0,7), получен в примере
161
6.2(b),
"конъюгат HES-GCSF30/0,4" (30/0,4), получен в примере 6.2(d),
"конъюгат HES-GCSF30/0,7" (30/0,7), получен в примере 6.2(d),
"конъюгат HES-GCSF50/0,7" (50/0,7), получен в примере 6.2(Ь),
"имитирующее инкубирование" (^реакционный контроль, 197 мг/мл HES50/0,7, MW 47000 Да, DS 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Германия) в течение 3 дней при 37°С, а затем клетки подсчитывали электронным методом (счетчик клеток Casy ТТ Cell Counter, Scharfe System, Reutlingen, D).
Результаты суммированы ниже в таблице и на фиг.21. Во всех случаях количество белка, приведенное ниже в таблице и на фиг.21, представляет собой только содержание G-CSF в конъюгатах. Как можно видеть из фиг.21, все различные варианты G-CSF (2,5-250 пг/мл) были способны стимулировать повышение числа клеток после 3 дней обработки по сравнению со средой, которая не содержала добавленного фактора роста. Все варианты достигали одинакового максимального уровня стимуляции при концентрации 250 пг/мл.
162
Таблица примера 6.3:
Пролиферация мышиных клеток NFS-60, индуцированная вариантами G-CSF
Концентрация [пг/мл]
2,5
2,8
5,7
11, 3
25,
28,4
56,7
250
283, 5
Neupogen
0, 44
0,86
1,20
1, 69
2, 33
2,49
2,41
HES-GCSF 10/0,7
0, 44
0, 72
0, 93
1,44
2,14
2,41
2,41
HES-GCSF 10/0,4
0,44
0,72
0, 97
1, 40
2,17
2, 67
2,75
HES-GCSF 50/0,7
0, 44
0, 62
0,70
0, 97
1, 68
2,15
2,32
имитирующее инкубирование
0,44
0, 85
1, 31
1,91
2, 38
2,47
2,41
HES-GCSF 30/0,4
0,44
0, 82
1,21
1, 62
2,28
2, 50
2, 60
HES-GCSF 30/0,7
0, 44
0, 80
1, 09
1, 66
2,20
2, 35
2,44
Neulasta
0,44
0, 63
0, 80
1,12
1,83
2,25
2, 33
163
Пример 6.4. Биологическое действие in vivo конъюгатов hG-CSF на крысах
По прибытии, крыс [самцы крыс CRL:CD(r) (возраст 7 недель), Charles river Deutschland GmbH, Sanghofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld)] случайным образом разбивали на группы по 5 штук в каждой. После акклиматизации в течение 7 дней крыс в плохом состоянии исключали из эксперимента и заменяли на запасных животных. Вес крыс по прибытии составлял 181-203 г.
Затем крысам в каждой группе из пяти случайным образом выбранных крыс вводили внутривенно 100 мкг белка на кг веса тела (скорость инъекции 15 секунд/доза; носитель 5 мл PBS/кг веса тела) следующих некоъюгированных или конъюгированных образцов G-CSF (очистка в соответствии с примерами 3 А1 и 2, количественная оценка белка в соответствии с примером ЗВ1):
Neupogen(r) и Neulasta(r), оба от Amgen,
"конъюгат HES-GCSF10/0,4" (10/0,4), получен в примере
(10/0,7), (30/0,4), (30/0,7), (50/0,7),
получен
примере
получен в примере
получен
получен
примере
примере
6.2(b),
"конъюгат HES-GCSF10/0,7" 6.2(Ь),
"конъюгат HES-GCSF30/0,4" 6.2(d),
"конъюгат HES-GCSF30/0,7" 6.2(d),
"конъюгат HES-GCSF50/0,7" 6.2(Ь),
"имитирующее инкубирование" (=реакционный контроль, 197 мг/мл HES50/0,7, MW 47000 Да, DS 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Германия) и контрольный носитель (PBS, используемый объем 5 мл/кг веса тела).
Образцы цельной крови у всех животных примерно с 200 мкл EDTA отбирали из ретробульбарного венозного сплетения под легкой анестезией эфиром. В день тестирования -5 кровь отбирали один раз утром у всех животных после голодания в течение ночи. В дни тестирования, с 1 по 8 день, кровь отбирали дважды в день с интервалом 12 часов. Первый образец крови в день 1 отбирали перед введением G-CSF/G-CSF-HES-конъюгата.
164
Подсчитывали лейкоциты (WBC) с использованием прибора BayerADVIA(tm) 120 (Fernwald, Германия). Результаты показаны на фиг.22.
Пример 6.5. Измерение периода полураспада in vivo конъюгатов, полученных из HES50/0,7 и G-CSF путем восстановительного аминирования (пример 6.2(b)) по сравнению с Neupogen(c) и Neulasta(c) (Amgen)
Использовали самок мышей BALB/cOlaHsd (Harlan GmbH/Borchen). В день введения измеряли вес животных (19-22 г). Каждой мыши вводили в виде инъекции в хвостовую вену 100 мкг на кг веса тела химически модифицированного образца rh-G-CSF, полученного в примере 6.2(b), а также образцы Neupogen(r) и Neulasta(c) (Amgen). Через 1, 3, 6, 11, 22, 30, 49, 72 часа после инъекции (см. таблицу ниже) отбирали образцы приблизительно в 150 мкл цельной крови из хвостовой вены или из венозного сплетения позади глазного яблока у 3 мышей соответствующей группы с использованием капилляров, содержащих гепарин натрия (Hirschmann, Eberstadt) и хранили их на льду до получения плазмы крови.
Таблица примера 6.5:
Проведение отбора проб
Образец
Мышь №
11ч
22ч
30ч
4 9ч
72ч
Neulasta
1 2 3
5 6
7 8 9
Neupogen
10 11 12
13 14 15
16 17 18
HES-G-
165
20 21
22 23 24
25 26 27
Цельную кровь центрифугировали в течение 10 минут при 2000д. Плазму переносили в другую пробирку и повторно центрифугировали в течение 5 минут при 3500д. Аликвоты хранили при -80°С до дня проведения анализа. Количество G-CSF в образцах плазмы крови оценивали количественно с использованием метода ELISA (R &D GmbH, Wiesbaden) в соответствии с инструкциями производителя.
Результаты представлены на фиг.3 6, откуда следует, что образец конъюгата HES-G-CSF согласно изобретению обладает намного большим периодом полураспада по сравнению с Neupogen (5,1 по сравнению с 1,2 часа), а по сравнению с Neulasta он имеет почти такой же период полураспада (5,1 по сравнению с 5,2 часа).
Пример 7. Конъюгация HES с рекомбинантным пЕРО с помощью восстановительного аминирования.
Использовали рекомбинантный ЕРО человека, имеющий последовательность аминокислот ЕРО человека и по существу такие же характеристики, что и коммерчески доступный Erypo(r) (Orhto Biotech, Jansen-Cilag) или NeoRecormon(r) (Roche) , см. ЕР 0148605, ЕР 0205564, ЕР 0411678.
Пример 7.1. Синтез амино-HES
10 г окисленного HES (MW = 57000 Да, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия, получен в соответствии с патентом Германии DE 19628705 А1) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, растворяли в токе азота в 53 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 2 мл 1,4-диаминобутана (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Carl Roth
166
GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 8 0 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3, 5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 85%.
Пример 7.2. Синтез альдегидо-HES
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 51 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 170 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 5,1 г амино-HES, полученного в соответствии с примером 7.1. После встряхивания в течение 16 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 3 60 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали 3 60 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 7.3 Конъюгация альдегидо-HES с ЕРО с помощью восстановительного аминирования.
625 мг альдегидо-HES, полученного в соответствии с примером 7.2, растворяли в 1,67 мл реакционного буфера (0,1 М натрий ацетатный буфер, рН 5,0) и охлаждали до 0°С. Добавляли 1,67 мл раствора ЕРО (3 мг/мл) и 1,67 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора в том же буфере и предварительно охлаждены
167
до 0°С, и смесь выдерживали при 0°С. Через 17 часов реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза (см. фиг.23, полоса В).
Пример 7.4 Реакционный контроль А: реакция альдегидо-HES с ЕРО в отсутствие цианоборгидрида натрия.
313 мг альдегидо-HES, полученного в соответствии с примером 7.2, растворяли в 0,8 3 мл реакционного буфера (0,1 М натрий ацетатный буфер, рН 5,0) и охлаждали до 0°С. Добавляли 0,83 мл раствора ЕРО (3 мг/мл) в том же буфере и 0,83 мл реакционного буфера, оба раствора были предварительно охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали при 0°С. Через 17 часов реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза (см. фиг.23, полоса С).
Пример 7.5 Реакционный контроль В: реакция ЕРО с цианоборгидридом натрия.
0,83 мл раствора ЕРО (Змг/мл) в реакционном буфере (0,1 М натрий ацетатный буфер, рН 5,0) охлаждали до 0°С, добавляли 0,8 3 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия в том же буфере и 0, 83 мл реакционного буфера, оба из которых были охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали при 0°С. Через 17 часов реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза (см. фиг.23, полоса D).
Пример 7.6. Ион-обменная хроматография для очистки ЕРО и производных ЕРО.
Очистку образцов ЕРО проводили при комнатной температуре с использованием исследовательской системы АКТА explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech), состоящей из насоса Р-903, смесителя М-925 с камерой на 0, б мл, монитором UV-900c 10 мМ проточной ячейкой, монитора рН/С-900, коллектора для сбора фракций Frac-900, замкнутой системы для образца на 2 мл и программного обеспечения Unicorn Version 3.2.1. Колонку, содержащую 5 мл Q-Sepharose Fast Flow, уравновешивали буфером А (20 мМ N-морфолинопропансульфоновая кислота/NaOH буфер, рН 8,0), используя объем, равный 10 объемам колонки (ОК) . Образцы ЕРО разводили в соотношении 1:10 буфером А, наконец доводили до
168
рН 7,8-8,2 и вводили в систему с помощью насоса для образцов со скоростью потока 1 мл/мин. После промывки насоса для образцов 10 мл буфера А колонку дополнительно промывали 6 объемами колонки буфера А при скорости потока 1 мл/мин. Затем вводили 4 объема 20 мМ Na-фосфата, рН 6,5; буфер В, при скорости потока 0,8 мл/мин и ЕРО элюировали с использованием крутого градиента от 0 до 40% буфера С (0,5М NaCl в 20 мМ Na-фосфате, рН 6,5) в течение 37 минут. Профили элюирования регистрировали при поглощении 206, 260 и 280 нм. После завершения элюирования колонку регенерировали 2 5 мл буфера С при скорости потока 1 мл/мин. Наконец через колонку пропускали 1М NaOH в течение 60 минут, повторно промывали буфером С и хранили до последующего использования.
Пример 7.7. Определение белка ЕРО
Количественное определение белка ЕРО проводили путем измерения УФ поглощения при 280 нм в соответствии с Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4 Monography) (Европейская Фармакопея, монография) 01/2002: 1316: концентрированный раствор эритропоэтина) в кювете с длиной пути 1 см. Дополнительно количественное содержание ЕРО оценивали с помощью метода RP-ВЭЖХ с использованием колонки RP-C4 (Vydac Protein С4, каталожный № 214ТР5410, Grace Vydac, Са, США); в способе ВЭЖХ проводили калибровку с использованием в качестве ссылочного стандарта эритропоэтина BRP'l (European Pharmacopeia, Conseil de 1'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1) .
Пример 7.8. Анализ in-vivo биологической активности HES-модифицированного ЕРО
Биоанализ ЕРО в нормоцитаэмической системе мыши проводили в соответствии с методиками, описанными в European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316: Erythropoietin concentrated solution and Ph. Eur. Chapter 5.3: "Statistical Analysis of Results of Biological Assays and Tests". Для HES-модифицированного ЕРО согласно примеру 7.3. величина специфической активности была определена как равная 418500 единиц на мг ЕРО белка, что указывает на приблизительно 4-5-кратное повышение специфической активности по сравнению с исходным веществом ЕРО.
169
Результаты исследования суммированы в следующей таблице.
Таблица примера 7.8:
Описание образца
Рассчитанная специфическая активность образца ЕРО (на основе А280 и определения RP-ВЭЖХ)
Исходное вещество ЕРО (не модифицированный)
89000 Ед/мг
Исходное вещество ЕРО (реакционный контроль А)
85500 Ед/мг
EPO-HES согласно примеру 7.3
418500 Ед/мг
Пример 8. Синтез конъюгатов HES-IFN-альфа с помощью восстановительного аминирования
Использованный IFN-oc представлял собой рекомбинантный интерферон альфа-2Ь человека, полученный методами рекомбинантной ДНК технологии с использованием Escherichia coli (Е. coli). Он состоит из 165 аимнокислот и имеет последовательность аминокислот, идентичную последовательности природного
интерферона альфа-2Ь человека (hIFN-альфа 2Ь).
Пример 8.1. Синтез OKCO-HES
HES, окисленный по его восстановительному концу, как описано ниже (оксо-HES), получали из HES с использованием щелочного раствора иода, как описано в патенте Германии 196 28 705 А1, соответствующее содержание которого (пример А, колонка 9, строки 6-24) включено в данное описание путем ссылки.
Пример 8.2. Синтез производных HES
В двухстадийном способе, оксо-HES примера 8.1 модифицировали по его восстановительному концу амином и вводили альдегидную группу во второй реакции. Полученный альдегидо-HES использовали для получения конъюгатов HES-IFN-альфа с помощью восстановительного аминирования, как описано в пример 8.3. Пример 8.2.1. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 6,09 г оксо-HES из примера 8.1 (MW = 14,5 кДа, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 25 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-
170
Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 5,13 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием.. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 67%.
Пример 8.2.2. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.1.
105 мг 4-формилбензойной кислоты и 135 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 7 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 135 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 0,7 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.1). После встряхивания в течение 18 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 42 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 5 мл ДМФ и осаждали 42 мл охлажденной на льду смеси этанола/ацетон, как описано выше. После центрифугирования собранный осадок растворяли в воде и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 95%.
Пример 8.2.3. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 6,09 г оксо-HES из примера 8.1 (MW = 14,7 кДа, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, и затем растворяли
171
в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 6,03 мл 1, 4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием.. Неочищенный продукт растворяли в 8 0 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 52%.
Пример 8.2.4. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.3.
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 204 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 1 г амино-HES
(синтезирован, как описано в примере 8.2.3). После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 84 мл охлажденного на льду 2-пропанола. Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды
(SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 83%.
Пример 8.2.5. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 5 г оксо-HES из примера 8.1 (MW = 28 кДа, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,67 мл
172
1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 17 5 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 4 0 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли.
Пример 8.2.6. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.5.
130 мг 4-формилбензойной кислоты и 153 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 3 6 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 110 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 2,61 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.5). После встряхивания в течение 22,5 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). После центрифугирования собранный осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 1 дня против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 81%.
Пример 8.2.7. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 5 г оксо-HES из примера 8.1 (MW = 30,8 кДа, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 28 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,67 мл
173
1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С. Неочищенный продукт растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта не определяли.
Пример 8.2.8. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.7.
122 мг 4-формилбензойной кислоты и 144 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 34 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 103 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 2,46 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.7). После встряхивания в течение 22,5 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). После центрифугирования осадок растворяли в 3 0 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.9. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 10 г оксо-HES из примера 8.1 (MW = 42, 1 кДа, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 53 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 2,01 мл
174
1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 8 0 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 7 6%.
Пример 8.2.10. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.7.
900 мг 4-формилбензойной кислоты и 1053 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 30 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 930 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли 3 г амино-HES
(синтезирован, как описано в примере 8.2.9 и растворенного в 2 0 мл N,N-диметилформамида). После встряхивания в течение 22,5 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 210 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1
(об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С и промывали охлажденной на льду смесью ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 97%.
Пример 8.2.11. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 (А) 6,09 г оксо-HES (MW = 56,8 кДа, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 32 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie
175
GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,22 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 150 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 4 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 4 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 82%.
Пример 8.2.12. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.11
125 мг 4-формилбензойной кислоты и 174 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 38 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 155 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 3,8 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.11). После встряхивания в течение 19 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 160 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл N,N-диметилформамида и осаждали с использованием 8 0 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1
(об/об), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 77%.
Пример 8.2.13. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 (В) 10 г оксо-HES (MW = 56,8 кДа, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в
176
течение ночи при 80°С в вакууме, и затем растворяли в токе азота в 53 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 2 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 4 0°С в течение 17 часов реакционную смесь добавляли к 350 мл охлажденного на льду 2-пропанола (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, промывали 8 0 мл охлажденного на льду 2-пропанола и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в 80 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 85%.
Пример 8.2.14. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.13
153 мг 4-формилбензойной кислоты и 241 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 51 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 170 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли 5,1 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.13). После встряхивания в течение 16 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 3 60 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 50 мл воды и осаждали с использованием 3 60 мл охлажденной на льду смеси ацетона и этанола в соотношении 1:1 (об/об), как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 50 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 3,5 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.15. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 (А)
177
5,0 г оксо-HES (MW = 29,3 кДа, DS = 0,86, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 8 0°С в вакууме, растворяли в токе азота в 2 0 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 1,67 мл 1,4-диаминобутана. После перемешивания при 40°С в течение 30,5 часов реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия) и этанола (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, Германия) в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием в течение 12 0 минут при 4°С, растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
Пример 8.2.16. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.15
150 мг 4-формилбензойной кислоты и 230 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 166 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 3 0 минут добавляли раствор 3,02 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.15) в 2 0 мл ДМФ. После встряхивания в течение 16 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 215 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия) и этанола
(Sonnenberg, DAB, Braunschweig, Германия) в соотношении 1:1
(об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 20 мл воды и осаждали смесью ацетон/этанол, как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 2,5 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 87%.
178
Пример 8.2.17. Синтез амино-HES из оксо-HES примера 8.1 5,0 г оксо-HES (MW = 97,9 кДа, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, Германия) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в токе азота в 20 мл сухого диметилсульфоксида (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) и добавляли 0,50 мл 1,4-диаминобутана (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После перемешивания при 40°С в течение 30,5 часов реакционную смесь добавляли к 175 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия) и этанола (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, Германия) в соотношении 1:1 (об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием в течение 120 минут при 4°С, растворяли в 40 мл воды и подвергали диализу в течение 2 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе 10 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 90%.
Пример 8.2.18. Синтез альдегидо-HES из амино-HES примера 8.2.17
73 мг 4-формилбензойной кислоты и 112 мг 1-гидрокси-1Н-бензотриазола (оба от Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия) растворяли в 10 мл N,N-диметилформамида
(качество для пептидного синтеза, Biosolve, Valkenswaard, Нидерланды) и добавляли 81,3 мкл N,N'-диизопропилкарбодиимида
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Германия). После выдерживания при 21°С в течение 30 минут добавляли раствор 3,09 г амино-HES (синтезирован, как описано в примере 8.2.17) в 2 0 мл ДМФ. После встряхивания в течение 16 часов при 22°С реакционную смесь добавляли к 215 мл охлажденной на льду смеси ацетона (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Германия) и этанола
(Sonnenberg, DAB, Braunschweig, Германия) в соотношении 1:1
(об/об). Выпавший в осадок продукт собирали центрифугированием при 4°С, повторно растворяли в 2 0 мл воды и осаждали смесью ацетон/этанол, как описано выше. После центрифугирования осадок растворяли в 30 мл воды и подвергали диализу в течение 2,5 дней против воды (SnakeSkin тюбинг для диализа, отсечение по массе
179
10 кДа, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, Германия) и лиофилизовали. Выход выделенного продукта составлял 96%.
Пример 8.3. Синтез конъюгатов IFN-альфа с помощью восстановительного аминирования
Пример 8.3.1. Конъюгация с IFN-альфа в 2 0 мкг масштабе К 0,675 мг IFN-альфа, растворенного в 0,375 мл 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 150 мМ NaCl и 0,3 мМ EDTA, добавляли 4 мл реакционного буфера (0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0), и раствор центрифугировали в течение 30 минут при 3939 х g в концентраторе Vivaspin 6 (Viva Science, 5 кДа MWCO, Hannover, Германия). Процедуру промывки повторяли дважды путем разбавления оставшегося раствора реакционным буфером до объема 6 мл и центрифугирования, как описано. Объем конечного раствора IFN-альфа составлял 0,236 мл, что соответствовало расчитанной конечной концентрации IFN-альфа, равной 2,8 6 мг/мл. Концентрацию белка экспериментально не проверяли.
К 7 мкл раствора IFN-альфа, полученного, как описано выше, и охлажденного до 0°С, добавляли 10 мкл (50 эквив.) раствора соответствующего альдегидо-HES (см. таблицу ниже) и 11,3 мкл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 17 часов при 0°С. Реакционную смесь анализировали с помощью гель-электрофореза. Были использованы следующие концетрации растворов альдегидо-HES:
Таблица примера 8.3.1
Опыт
Производное HES
Концентрация [мг/мл]
альдегидо-HES (пример 8.2.2)
альдегидо-HES (пример 8.2.4)
альдегидо-HES (пример 8.2.6)
156
альдегидо-HES (пример 8.2.8)
156
альдегидо-HES (пример 8.2.10)
260
альдегидо-HES А (пример 8.2.12)
260
без производного HES, но в присутствии
180
NaCNBHj
без производного HES и без NaCNBH3
Неокисленный HES 10/04 (Mw 7,6 кДа, DS=0,41) в присутствии NaCNBH3
Неокисленный HES 10/04 (Mw 7,6 кДа, DS=0,41), без NaCNBHj
Анализ SDS-Page конъюгатов представлен на фиг.24.
Пример 8.3.2. Конъюгация с IFN-альфа в 3 мг масштабе К 20 мг IFN-альфа, растворенного в 25 мл 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 150 мМ NaCl и 0,3 мМ EDTA, добавляли 8 мл реакционного буфера (0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0), и раствор центрифугировали в течение 99 минут при 3939 х g в концентраторе Vivaspin 6 (Viva Science, 5 кДа MWCO, Hannover, Германия). Процедуру промывки повторяли дважды путем разбавления оставшегося раствора реакционным буфером до объема 18 мл и центрифугирования, как описано. Конечный раствор IFN-альфа разводили реакционным буфером до объема 6,66 мл, получая конечную расчитанную концентрацию IFN-альфа, равную 3 мг/мл. Концентрацию белка экспериментально не проверяли.
К 1 мл раствора IFN-альфа, полученного, как описано выше, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора альдегидо-HES (75 эквив. ) и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 часов при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для реакции, описанной в опыте G, использовали только 0,666 мкл соответствующих растворов. Были использованы следующие концетрации растворов альдегидо-HES:
Таблица примера 8.3.2
Опыт
Производное HES
Концентрация [мг/мл]
альдегидо-HES (пример 8.2.2)
117
альдегидо-HES (пример 8.2.4)
117
альдегидо-HES (пример 8.2.6)
350
181
альдегидо-HES (пример 8.2.8)
350
альдегидо-HES (пример 8.2.10)
584
альдегидо-HES А (пример 8.2.12)
584
Неокисленный HES 10/04 (Mw 7,6 кДа, DS=0,41)
117
Анализ SDS-Page конъюгатов представлен на фиг.25.
Пример 8.3.3. Конъюгация с IFN-альфа в 3 мг масштабе
8.3.3.1 Конъюгация альдегидоНЕЭ, полученного в примере 8.2.16, с IFNa путем восстановительного аминирования
К 10 мг IFNa, растворенного в 25 мл 25 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 150 мМ NaCl и 0,3 мМ EDTA, добавляли 8 мл реакционного буфера (0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0), и раствор центрифугировали в течение 30 минут при 3939 х g в концентраторе Vivaspin 6 (Viva Science, 5 кДа MWCO, Hannover, Германия). Процедуру промывки повторяли дважды путем разбавления оставшегося раствора реакционным буфером до объема 18 мл и центрифугирования, как описано. Конечный раствор IFNa разводили реакционным буфером до объема 3,33 мл, получая конечную расчитанную концентрацию IFNa, равную 3 мг/мл. Концентрацию белка экспериментально не проверяли.
К 1 мл раствора IFN-альфа, полученного, как описано выше, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора альдегидо-HES, полученного в примере 8.2.16 (75 эквив., 352 мг/мл), и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были
приготовлены в том же буфере и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 часов при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
182
8.3.3.2 Конъюгация альдегидоНЕБ, полученного в примере 8.2.18, с IFNa путем восстановительного аминирования
К 1 мл раствора IFN-альфа, полученного, как описано в примере 8.3.3.1, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора альдегидо-HES, полученного в примере 8.2.18 (75 эквив., 369 мг/мл), и 1,5 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 часов при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В). Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
8.3.3.3 Реакционный контроль: Конъюгация HES10/0,4 (Mw 7,6 кДа, DS= 0,41) с IFNa путем восстановительного аминирования
К 1 мл раствора IFN-альфа, полученного, как описано в примере 8.3.3.1, и охлажденного до 0°С, добавляли 1 мл раствора HES10/0,4 (75 эквив., 117 мг/мл), и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора были приготовлены в том же буфере и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в течение 22 часов при 0°С. Реакционную смесь очищали после анализа с помощью гель-электрофореза. Для гель-электрофореза использовали мини-ячейку XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) и источник энергоснабжения Consort Е143 (CONSORTnv, Turnhout, В) . Использовали 12% бис-трис гель вместе с подвижным буфером MOPS SDS при восстановительных условиях (оба от Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ SDS-Page конъюгатов представлен на фиг.26.
Пример 8.3.4. Конъюгация с IFN-альфа в 16 мг масштабе
Буфер в растворе, содержащем 20 мг IFN-альфа, заменяли, как описано в пример 8.3.2. Конечный раствор IFN-альфа разводили
183
реакционным буфером до объема 6,37 мл, получая конечную рассчитанную концентрацию, равную 3,14 мг/мл IFN-альфа. 100 мкл данного раствора разводили с использованием 900 мкл реакционного буфера и спектрофотометрически при 27 9 нм определяли концентрацию белка, которая оказалась равной 3,01 мг/мл, на основании молярного коэффициента экстинкции, равного 18 000. После объединения с веществом, использованным для определения концентрации белка конечный объем составил 7,0 мл при концентрации белка, равной 2,74 мг/мл.
К 5,91 мл данного раствора IFN-альфа (16,2 мг) , полученного, как описано выше и охлажденного до 0°С, добавляли раствор 3,152 г альдегидо-HES, полученного в примере 8.2.14 (75 эквив.) в 5 мл реакционного буфера и б мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С, и смесь выдерживали в
течение 22 часов при 0°С (см. фиг.27, полоса А) .
В качестве реакционного контроля 1,09 мл предварительно охлажденного раствора IFN-альфа (3 мг) смешивали с 1 мл раствора 122 мг неокисленного HES10/0,4 (Mw 7,6 кДа, DS = 0,41) в реакционном буфере и 1 мл 60 мМ раствора цианоборгидрида натрия, оба раствора в том же буфере (ацетат натрия, рН 5,0) и охлаждены до 0°С (см.фиг.27, полоса В).
Анализ SDS-Page конъюгатов представлен на фиг.27.
Пример 8.4. Очистка конъюгатов IFN-альфа-НЕЭ
8.4.1. Очистка HES-IFN-a, полученного при выдерживании восстановительно аминированного белка с активированными производными HES (отеделение модифицированного и
немодифицированного белка от производных HES)
Очистку всех образцов проводили при комнатной температуре с использованием исследовательской системы АКТА explorer 10. Колонку, содержащую 3 мл Q-Sepharose Fast Flow, уравновешивали буфером А (20 мМ Tris/HCl, рН 8,0) в объеме, равном 10 объемам колонки. Образцы разводили в соотношении 1:10 буфером А и вводили в систему с помощью насоса для образцов со скоростью потока 1 мл/мин. После промывки насоса для образцов 10 мл
184
буфера А колонку дополнительно промывали б объемами колонки буфера А при скорости потока 1 мл/мин. Элюирование проводили с использованием линейного градиента от 0 до 100% буфера В (0,3 М NaCl в 20 мМ Tris/HCl, рН 8,0) на протяжении 2 ОК и изократическом проходе 0,5 ОК буфера В при скорости потока 0,8 мл/мин. Колонку регенерировали с использованием 2 объемов колонки буфера С (1,5 М NaCl в 20 мМ Tris/HCl, рН 8,0), а затем 0,5 ОК буфера В при скорости потока 0,8 мл/мин. Повторное уравновешивание для следующего прохода проводили с использованием б ОК буфера А и скорости потока 1,0 мл/мин. 8.4.2. Материалы и методы
Оборудование: АКТА explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech), в комплекте с: насосом Р-903
смесителем М-925, с камерой на 0,6 мл монитором UV-900, с 10 мМ проточной ячейкой монитором рН/С-90 0 насосом Р-950 (насос для образца) Программное обеспечение Unicorn Version 3.21 Колонка: Amersham Biosciences С 10/10
Материал для Q-Sepharose Fast Flow, Code no. 17-0510-
01, лот № OD 06453 3 мл
20 мМ Tris/HCl, рН 8,0, лот № PL0746 0,3 М NaCl в20 мМ Tris/HCl, рН 8,0, лот № PL0747
1,5 М NaCl в20 мМ Tris/HCl, рН 8,0, лот № PL07 4 8
колонки: Объем колонки: Буфер А: Буфер В:
Буфер С:
Метод Объем Стадия
Буфер
Скорость потока
1 ОК Уравновешивание 5-28 мл Загрузка образца
10 мл Промывка насоса для образца
100% буфера А 1,0 мл/мин
Образец 1:10 1,0 мл/мин в буфере А
10 0% буфера А 1,0 мл/мин
185
100% буфера А 1,0 мл/мин
5 ОК Вымывание несвязанного
образца
Начало фракционирования
6 ОК Элюирование, линейный
градиент 2 ОК Элюирование,
изократическое 20К Регенерирование 0,5 ОК Регенерирование
Прекращение
фракционирования 5 ОК Повторное
уравновешивание Обнаружение: 280 нм, 2 60 нм, 22 0 нм рН
проводимость
Фракционирование: фракции по 1 мл 8.4.3 Результаты
8.4.3.1. Образец в соответствии с примером 8
100% буфера А 1,0 мл/мин
0-100% буфера 0,8 мл/мин В
100% буфера В 0,8 мл/мин
100% буфера С 0,8 мл/мин
100% буфера В 0,8 мл/мин
100% буфера В 0,8 мл/мин
10 0% буфера А 1,0 мл/мин
Состав образца:
исходный объем:
проходящий поток/промывка дата проведения эксперимента: эксперимент №:
1 мг ЕР2001 (rhIFN-a2b) в 25 мМ
Na-фосфате, 0,13 М NaCl и 0,3 мМ
EDTA, рН 7,5+ 0,2
0,5 мл, разведен 1:10 в буфере А
= 5 мл
9,3 мл
2004-09-29
QS24 D39 (см. таблицу примера 8.4.4.1)
8.4.3.2. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =А) Состав образца: 2,5 мг ЕР2001 + 97,5 мг
альдегидоНЕБ 10/0,4 (NZA256) в 0,1 М Na-ацетате, 20 мМ Na-цианоборгидрида, рН 5, 0 исходный объем: 2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А
186
проходящий поток/промывка: дата проведения эксперимента: эксперимент №:
= 25 мл 44 мл
2004-09-29
QS25 D56 (см. таблицу примера 8.4.4.1)
4.3.3. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =В)
Состав образца
исходный объем:
проходящий поток/промывка: дата проведения эксперимента: эксперимент №:
2,5 мг ЕР2001 + 97,5 мг
альдегидоНЕЭ 10/0,7 (NZA235A) в
0,1 М Na-ацетате, 20 мМ Na-
цианоборгидрида, рН 5,0
2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А
= 25 мл
41 мл
2004-09-30
QS2 6 D57 (см. таблицу примера 8.4.4.1)
8.4.3.4. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =С] Состав образца: 2,5 мг ЕР2001 + 292 мг
альдегидоНЕЗ 30/0,4 (NZA328) в 0,1 М Na-ацетате, 20 мМ Na-цианоборгидрида, рН 5,0 исходный объем: 2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А
= 25 мл
проходящий поток/промывка 42 мл дата проведения 2004-09-30 эксперимента:
эксперимент №: QS27 D58 (см. таблицу примера
8.4.4.1)
8.4.3.5. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =D] Состав образца: 2,5 мг ЕР2001 + 292мг
альдегидоНЕЗ 30/0,7 (NZA329) в
187
исходный объем:
проходящий поток/промывка дата проведения эксперимента: эксперимент №:
0,1 М Na-ацетате, 20 мМ
Na-цианоборгидрида, рН 5, 0
2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А
= 25 мл
40 мл
2004-09-30
QS28 D59 (см. таблицу примера 8.4.4.1)
8.4.3.6. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =Е) Состав образца: 2,5 мг ЕР2001 + 487 мг
альдегидоНЕЗ 50/0,4 (NZA303) в 0,1 М Na-ацетате, 20 мМ Na-цианоборгидрида, рН 5,0 исходный объем: 2,7 мл, разведен 1:10 в буфере А
= 27 мл
проходящий поток/промывка 50 мл дата проведения 2004-09-30
эксперимента:
эксперимент №: QS2 9 D60
(см.т а блицу примера
4.4.1
8.4.3.7. Образец в соответствии с примером 8.3.2
Состав образца;
(ввод =F) 487 мг
исходный объем:
проходящий поток/промывка дата проведения эксперимента: эксперимент №:
2.5 мг ЕР2 001 + альдегидоНЕЗ 50/0,7 (NZA309) в 0,1 М Na-ацетате, 20 мМ Na-цианоборгидрида, рН 5,0
2.6 мл, разведен 1:10 в буфере А = 26 мл
50 мл
2004-09-30
(см.т аблицу примера
QS30 D61 8.4.4.1)
8.4.3.8. Образец в соответствии с примером 8.3.2. (ввод =G) Состав образца: 1,7 мг ЕР2001 + 98MrHES 10/0,4
188
(Supramol Lot. 407В) в 0,1 M Na-ацетате, 20 мМ
Na-цианоборгидрида, рН 5,0 исходный объем: 2,5 мл, разведен 1:10 в буфере А
= 25 мл
проходящий поток/промывка 42 мл дата проведения 2004-10-01 эксперимента:
эксперимент №: QS31 D62 (см.таблицу примера
8.4.4.1) 8.4.4 Сравнение результатов
8.4.4.1 SDS-PAGE анализ пиков элюирования IFN-альфа
Таблица 1:
Сравнение площадей пиков, обнаруженных при 280 нм во вемя хроматографии на Q-Sepharose HES-производных IFN-a (Таблица примера 8.4.4.1)
Опыт №
Рассчитанное
использованное
количество
немодифицированного
IFN-a
Площадь элюата (280 нм) [мАПхмл]
Площадь элюата (280 нм)/мг немодифицированного белка [мАихмлхмг-1]
Вычисленный выход общего белка [мг] (ВЭЖХ-
количественн ая оценка при 280 нм*)
QS-
D39
1, 0 мг
961
961
0, 42
QS-
D56
2,5 мг
4370
1748
1,20
QS-
D57
2, 5 мг
5669
2268
1,64
QS-
D58
2, 5 мг
3350
1340
1, 60
QS-
D59
2,5 мг
2854
1142
1, 54
QS-
D60
2, 5 мг
2255
902
1, 52
QS-30
D-61
2,5 мг
9278
3711
3,44
QS-
D62
1,7 мг
1918
1128
1,40
данные количественного анализа, полученные с помощью
RP-ВЭЖХ-З
189
Пример 9.
Описание биоанализа противовирусной активности IFN альфа
Описание метода тестирования: противовирусная активность интерферона-альфа.
После предварительного разведения тестируемых продуктов в среде для культивирования клеток готовили серийные двукратные разведения. В лунки 96-луночного планшета добавляли разведенный интерферон в четырехкратной повторности на одно разведение к свеже трипсинизированным клеткам MDBK (4 0000 клеток на лунку). Анализируемые планшеты инкубировали в течение 2 4 часов при 37°С (общий объем на лунку: 150 мкл (пример 9.1) или 175 мкл (пример 9.2, 9.3, 9.4, 10) ) .
После этого 50 мкл разведенного исходного раствора VSV добавляли в каждую лунку (за исключением лунок положительного контроля), получая множественность инфекции, равную 0,1.
В каждый анализ включали следующий контроль: 12 лунок, в которые помещали вирус плюс среду для культивирования клеток вместо интерферона (отрицательный контроль) и 12 лунок, в которые помещали среду для культивирования клеток вместо интерферона и вирус (положительный контроль).
Планшеты для анализа инкубировали в течение 42 часов при
37°С.
По окончании периода инкубации клеточный культуральный супернатант в каждой лунке заменяли на 50 мкл раствора МТТ (по меньшей мере 2 мг/мл в среде для культивирования клеток). Клетки инкубировали в течение трех часов. Краситель формазан пурпурный, образованный пролиферирующими клетками, солюбилизировали путем добавления 100 мкл раствора изопропанол/HCl (изопропанол с 40 мМ НС1) в каждую лунку. Впоследствии измеряли значения поглощения растворов при 570/630 нм с использованием ридера для микротитровальных планшетов.
Пролиферативную активность клеток MDBK, выращенных в присутствии интерферона и VSV рассчитывали для каждого разведения интерферона в соответствии со следующим:
(creates гюпмцзде члырел лунж обрюрганных ингерфероюм) - (среднэе гоглшкме атрищгепьного кошроля)* 100 (среднге гоглоиное готажитсльнсго кшгроля) - (сред нее птда огри1етельнск) юнтраля)
190
Противовирусную активность интерферона-альфа определяли в четырех отдельных анализах для каждого из тестируемых объектов.
Пример 9.1. Противовирусная активность Intron А относительно стандарта NIH
Во всех экспериментах Intron А (IFN-альфа 2b, Schering-Plough) , калиброванный относительно стандарта NIH - rhIFN-альфа 2а (NIAID, NIH, Bethesda, USA, GxaOl-901-535), использовали в качестве внутренней лабораторной ссылки. Стандарт NIH обладает специфической активностью 9000 МЕ/мл. Внутренний лабораторный ссылочный Intron А обладает специфической активностью 8487000 МЕ/мл в исследовании, как описано в примере 9.
Пролиферативную активность Intron А сравнивали со стандартом NIH - rhIFN-альфа 2а, как показано на фиг.28.
Пример 9.2. Противовирусная активность имитировано инкубированного IFN-cc-HES относительно немодифицированного исходного вещества.
Как описано в примере 8.3.4 имитировано инкубированного IFN-a-HES (описан в примере 8.3.2, опыт G) использовали в качестве реакционного контроля. Противовирусную активность вещества сравнивали с активностью немодифицированного исходного вещества для исследования влияния процессов связывания и очистки на биоактивность. Имитирующее инкубирование не влияло на биоактивность IFN-альфа in vitro.
Относительная активность in vitro имитировано инкубированного IFN-a-HES по сравнению с немодифицированным исходным веществом показана на фиг.29.
Пример 9.3. Противовирусная активность конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ относительно Intron А
В системе для анализа, описанной в примере 9, конъюгаты (опыты А, В, С, D, Е примера 8.3.2, очищенные в соответствии с примером 8.4) были протестированы в сравнении с немодифицированным веществом IFN-альфа, Intron А и Pegasys (Roche). Для веществ рассчитывали концентрации СРЕ50. Все конъюгаты IFN-альфа-НЕЗ сохраняли противовирусную активность, которая была существенно выше активности Pegasys.
191
Относительная активность in vitro конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ по сравнению с немодифицированным исходным веществом IFN-альфа, Intron А и Pegasys показана на фиг. 30.
Пример 9.4. Противовирусная активность конъюгата IFN-альфа-НЕЗ в сравнении с Intron А
В системе для анализа, описанной в примере 9, конъюгат IFN-альфа-НЕЗ согласно примеру 8.3.4, очищенный в соответствии с примером 8.4, был протестирован в сравнении с Intron А. Для веществ рассчитывали концентрации СРЕ50. Конъюгат IFN-альфа-НЕЗ сохранял высокую противовирусную активность, превышающую 2 5% относительно активности Intron А.
Относительная активность in vitro конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ по сравнению с Intron А показана на фиг. 31.
Пример 9.5. Противовирусная активность конъюгата IFN-альфа-НЕЗ в сравнении с Intron А
В системе для анализа, описанной в примере 9, конъюгаты IFN-альфа-НЕЗ согласно примеру 8.3.3, очищенные в соответствии с примером 8.4, были протестированы в сравнении с Intron А и Peglntron.. Для веществ рассчитывали концентрации СРЕ50. Конъюгаты IFN-альфа-НЕЗ сохраняли противовирусную активность на уровне примерно 2 5% по сравнению с Intron А, которая находится на том же уровне, что и активность Peglntron in vitro.
Относительная активность in vitro конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ по сравнению с Intron А показана на фиг. 38.
Пример 10. Биоактивность конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ in vivo (РК исследование на мышах)
Пример 10.1. Влияние мышиной сыворотки крови на систему для анализа, описанную в примере 9.
Получали разведения интерферона-альфа в среде для культивирования клеток (контроль) и в мышиной сыворотке крови (разведение 1:40 и разведение 1:80). Анализ проводили, как описано в примере 9.
Противовирусную активность интерферона-альфа для контроля определяли в двух отдельных анализах, для разведения в мышиной сыворотке 1:40 и для разведения в мышиной сыворотке 1:80. Результаты показывают, что мышиная сыворотки при разведении 1:40
192
и 1:80 не влияет на биоанализ противовирусной активности интерферона-альфа.
Пример 10.2. In vivo исследование на мышах (I)
Противовирусную активность собранной сыворотки крови исследовали в анализе противовирусной активности. Сыворотку крови собирали от двух мышей (самки мышей BALB/c возрастом 8 недель) при умерщвлении в каждый момент времени, соответствующий 2 часам, 4 часам, 12 часам и 24 часам после внутривенной инъекции в дозе 30 мкг/кг (из расчета на содержание белка) IFN-альфа или конъюгата IFN-альфа-НЕЗ.
Образцы сыворотки крови оттаивали и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания (и разводили). В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения. Оттаивали пузырек с Intron А (разведенный) и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания. В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения.
Определяли ЕС50-разведения в анализе СРЕ из кривых доза-ответная реакция серий разведений 1:2, как описано в примере 9.
Определяли период полураспада веществ по сравнению с немодифицированным исходным веществом и Pegasys. Период полураспада рассчитывали из полулогарифмического графика разведения ЕС50 относительно времени после инъекции.
Противовирусная активность была обнаружена для (i) IFN-альфа-НЕЗ (пример 8.3.2, опыт в таблице), (ii) IFN-альфа-НЕЗ (пример 8.3.2, опыт D в таблице), (iii) IFN-альфа-НЕЭ (пример 8.3.4) в течение промежутка времени до 24 часов. Как можно видеть из фиг.32, период полураспада увеличивался от (i) (приблизительно 3 часа) до (ii) (приблизительно 5 часов) и далее до (iii) (приблизительно 7 часов).
Для немодифицированного IFN-альфа противовирусная активность сыворотки крови была слишком низка для расчета периода полураспада в сыворотке. В публикации К. R. Reddy et al. Advaced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586 период полураспада IFN-альфа в сыворотке крови крыс (внутривенно) был определен как равный 2 часам.
193
Пример 10.3. In vivo исследование на мышах (II)
Противовирусную активность собранной сыворотки крови исследовали в анализе противовирусной активности. Сыворотку крови собирали от двух мышей (самки мышей BALB/c возрастом 8 недель) при их умерщвлении в каждый момент времени, соответствующий 2 часам, 4 часам, 12 часам и 24 часам после внутривенной инъекции в дозе 3 0 мкг/кг (из расчета на содержание белка) IFN-альфа или конъюгата IFN-альфа-НЕЗ.
Образцы сыворотки крови оттаивали и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания (и разводили). В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения. Оттаивали пузырек с Intron А (разведенный) и тщательно гомогенизировали путем интенсивного вихревого перемешивания. В среде для культивирования клеток получали серийные двукратные разведения.
Определяли ЕС50-разведения в анализе СРЕ из кривых доза-ответная реакция серий разведений 1:2, как описано в примере 9.
Определяли период полураспада веществ по сравнению с немодифицированным исходным веществом и Pegasys. Период полураспада рассчитывали из полулогарифмического графика разведения ЕС50 относительно времени после инъекции.
Противовирусная активность была обнаружена для (i) Peglntron, (ii) IFN-альфа-НЕЗ 30/0,8 (пример 8.3.3.1) и (iii) IFN-альфа-НЕЗ 100/0,7 (пример 8.3.3.2) в течение промежутка времени до 24 часов. Как можно видеть из фиг.37, период полураспада увеличивался от (i) (приблизительно 3,6 часа) до (ii) и (iii) (приблизительно 6,5 и 6,8 часа).
Пример 11. In vivo биоактивность конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ (РК исследование на кроликах).
Пример 11.1. Радиоактивное маркирование IFN-альфа и конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ
Образцы, использованные для РК исследования, были помечены 1_51 с помощью метод использованием хлорамина Т. Хлорамин Т взаимодействует с йодом и образуется межгалогеновое (I-C1) промежуточное соединение. Межгалогеновое соединение
взаимодействует с ароматическим кольцом тирозина и замещает его
194
в орто-положении.
Пример 11.2. ссылочный эксперимент: маркирование OKCO-HES 50/0,4 1С51.
В первой экспериментальной серии в данных реакционных условиях исследовали возможность обнаружения следовых количеств йода, например, при образовании йодных, полийодных или полийодидных комплексов с HES. Для сравнения, OKCO-HES (MW 42,1 кДа, DS =0, 41) и IFN-альфа-НЕЗ (пример 8.3.2, опыт Е в таблице) были помечены в тех же условиях и после процесса очистки измеряли радиоактивность образцов. В соответствии с литературой амилопектин может образовывать комплексы с йодом, полийодом и полииодидом, когда спиральные структуры имеют по меньшей мере 11 звеньев ангидроглюкозы.
Радиоактивность обнаруживалась только в образце IFN-альфа-НЕЗ. Этот результат доказывает, что радиоактивность вызвана исключительно ковалентной модификацией тирозиновых остатков IFN-альфа, а не потенциальным физическим связыванием йода, который не был удален в процессе очистки. OKCO-HES 50/0,4 (MW = 42,1 кДа, DS = 0,41) можно рассматривать как отрицательный контроль. Благодаря большой молекулярной массе и низкой степени замещения в таких разновидностях оксо-HES МОЖНО было ожидать существование наиболее длинных спиральных структур, если они присутствуют, и следовательно, в таком случае имелся наиболее высокий риск комплексообразования с йодом.
Пример 11.3. Маркирование интерферона-альфа нерадиоактивным йодом ("холодное иодирование")
Интерферон-альфа метили не радиоактивным йодом в тех же самых условиях маркирования и очистки, что и конъюгаты IFN-альфа-НЕЭ-50/0,4. В противовирусном анализе противовирусная активность сохранялась. Однако количественная оценка проведена не была, поскольку в процессе маркирования и очистки концентрация изменялась и не могла быть определена из-за небольшого количества доступного вещества.
Пример 11.4. Радиоактивное маркирование конъюгатов IFN-альфа-НЕЗ
Образцы помечали в соответствии с примером 11.1 с
195
использованием радиоактивного 1251. Образцы представляли собой исходное вещество IFN-альфа, IFN-альфа-НЕЗ (пример 8.3.2, опыт D в таблице). Образцы имели специфическую активность 38 мкКи/мкг (исходное вещество IFN-альфа), 41 мкКи/мкг (IFN-альфа-НЕЗ 30/0,7).
Пример 11.5. In vivo РК исследование на кроликах. Пример 11.5. Экспериментальная методика
Тестируемые объекты использовали в разведенном виде. Получали раствор с концентрацией 4 мкКи/мл. В качестве буфера для разведения использовали PBS.
Четыре новозеландских белых кролика HsdIf:NZW. Источник Harlan Winkelmann GmbH, D- 33178 Borchen. Пол: самки; вес тела в начале исследования: > 2,5 кг. Всех животных обрабатывали внутривенно с использованием радиоактивных исследуемых веществ, вводя объем равный 1 мл/кг веса тела, что эквивалентно дозе 4 мкКи/кг веса тела. В определенные моменты времени отбирали пробы крови. В каждый момент отбора пробы брали приблизительно 600 мкл крови из ушной вены для дальнейших исследований.
Для отбора крови под общей анестезией (кетамин/ромпун) устанавливали постоянный катетер в ушную вену. Анестезию прерывали для отбора проб крови перед применением образцов, во время самого ввдения и и для отбора первых трех проб крови после введения (0,5 часа, 1 час и 2 часа). Катетеры оставляли на животных для дальнейшего отбора проб крови до тех пор, пока их не удаляли саим животные. Дальнейший отбор проб крови проводили с помощью канюли через различные участки ушных вен.
Дальнейшую обработку образцов крови проводили после отбора проб крови. Для определения радиоактивно меченых тестируемых веществ в крови собранные образцы крови обрабатывали в соответствии с конкретным протоколом солюбилизации. Для этого 2 50 мкл образцов крови переносили в новую пробирку и добавляли равный объем Solvable(tm). Образцы инкубировали в течение одного часа при 50°С при встряхивании на водяной бане. После окончания времени инкубации образцы охлаждали до комнатной температуры и добавляли 100 мкл раствора EDTA [100 мМ] . Затем добавляли
196
300 мкл Н2О2 [30 %] и после встряхивания образцы опять инкубировали в течение одного часа при 50°С при встряхивании на водяной бане. Образцы комплектовали перед дальнейшей обработкой.
По окончании отбора крови и солюбилизации образцы переносили в 2 0 мл сцинтилляционные ампулы и добавляли 10 мл сцинтилляционного "коктейля" Ultima Gold. До измерения содержания изотопа 1251 с помощью сцинтилляционного счетчика (примерно 72 часа после добавления "коктейля") образцы хранили в темноте при 2-8°С.
Перед обработкой и статистическим анализом данных определяли гашение обнаружения активности при определенных экспериментальных условиях. Коэффициент регрессии (г2=0,9970) представляет собой меру соответствия прямой линии. Было установлено, что фактор гашения был равен 3,315938.
Результаты (см. фиг. 33):
IFN-альфа-НЕЗ продемонстрировал явное увеличение
продолжительности времени полураспада по сравнению с исходным веществом. После 24 часов (приблизительно < 1000 пКи/мл) кривая немодифицированного вещества выравнивалась, и почти не наблюдалось понижения активности. Небольшие стандартные отклонения измеренной радиоактивности для всех образцов обеспечивают качество проведения эксперимента.
Период полураспада рассчитывали из концентрации IFN-альфа в образцах крови. Для оценки, представленной на фиг.34, рассматривались только данные, полученные в промежуток времени от 4 до 24 часов. Для немодифицированного вещества период полураспада был рассчитан как равный 7 часам. Для IFN-альфа-НЕЗ наблюдалось существенное увеличение периода полураспада (приблизительно 33 часа).
Данные оценивали статистически в соответствии с различными компартментными (разделенными по времени) моделями, как показано на диаграмме на фиг. 35а и b (отсечение 0-12 ч) . Для однокомпартментной модели очевидно, что концентрация IFN-альфа быстро падает в течение первых 2 часов после инъекции. Для IFN-альфа-НЕЗ период полураспада четко продлевается.
197
Статистически подсчитанный период полураспада составлял 0,2 6 ч для IFN-альфа, 7,7 часа для IFN-альфа-НЕЗ. В соответствии с некомпартментной моделью статистическая оценка приводит к периоду полураспада, равному 147 часов для немодифицированного IFN-альфа (на основании данных полученных за 24-120 часов), и 42,7 часа для IFN-альфа-НЕЗ (на основании данных полученных за 36-120 часов). Как описано выше, период полураспада IFN-альфа существенно удлинняется поскольку кривые выравниваются после 24 часов.
Периоды полураспада двух образцов суммированы в следующей таблице на основании описанных способов расчета
Таблица примера 11.5.1: Периоды полураспада IFN-альфа и IFN-альфа-НЕЗ,
рассчитанные в соответствии с различными моделями
Исходное вещество IFN-альфа
tl/2
IFN-альфа-НЕЗ
tl/2
Не компартментная модель
(147,0)*
42,7**
Однокомпартментная модель
0,26
7,7
Полуло г арифмич е с кий график (см. фиг.33, 4-24 часа)
* оцененные данные 24-12 0 ч,
** оцененные данные 3 6-12 0 ч
198
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения конъюгата, включающего белок и полимер, где полимер представляет собой гидроксиалкил крахмал, указанный способ включает
(а) (1) введение по меньшей мере одной альдегидной группы в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла, или
(a) (2) взаимодействие полимера с по меньшей мере бифункциональным соединением, где указанное соединение включает две функциональные группы М и Q, одна функциональная группа М взаимодействует с полимером и одна функциональная группа Q представляет собой
(i) альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя; или (ii) представляет собой функциональную группу, химически модифицированную для получения производного полимера, функционализированного альдегидными или кето- или
полуацетальными функциями; и
(b) ковалентное связывание по меньшей мере одной альдегидной группы или кетогруппы, или группы полуацеталя полимера или его производного с по меньшей мере одной аминогруппой белка путем восстановительного аминирования.
2. Способ по п. 1 где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал.
3. Способ по п.2 где гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 200 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 7 0 кДа.
4. Способ по любому из п.п.1-3, где восстановительное аминирование проводят в водной среде.
5. Способ по любому из п.п.1-4, где восстановительное аминирование проводят в присутствии NaCNBHs.
6. Способ по любому из п.п.1-5, где восстановительное аминирование проводят при рН 7,5, предпочтительно 7 или менее.
7. Способ по п. б, где рН равен б или менее.
8. Способ по любому из п.п.1-7, где восстановительное аминирование проводят при температуре от 0 до 25°С.
9. Способ по любому из п.п. 1-8, где в (а) (1), полимер
199
подвергают реакции окисления с раскрытием цикла с использованием периодата с получением производного полимера, имеющего по меньшей мере одну альдегидную группу.
10. Способ по п. 9, где реакцию окисления с раскрытием цикла проводят в водной среде.
11. Конъюгат по п. 9 или 10, где реакцию окисления с раскрытием цикла проводят при температуре от 0 до 5°С.
12. Способ по любому из п.п.9-11, где полимер используется при неокисленной форме его восстановительного конца.
13. Способ по любому из п.п. 1-8, где в (а) (2) (i), функциональная группа М представляет собой карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу, функциональная группа Q представляет собой альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя.
14. Способ по п.13, где бифункциональное соединение, включающее М и Q, выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового сложного эфира 4-формилбензойной кислоты, N-гидроксисукцинимидного сложного эфира 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты.
15. Способ по любому из п.п.1-8, где в (а)(2)(ii), функциональная группа М представляет собой аминогруппу, и функциональная группа Q представляет собой аминогруппу.
16. Способ по п.15, где соединение, включающее две аминогруппы М и Q, представляет собой необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 2 до 2 0 атомов углерода.
17. Способ по п.16, где диаминоалкан выбирают из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3-диаминопропана и 1,4-диаминобутана.
18. Способ по любому из п.п.15-17, дополнительно включающий взаимодействие производного полимера, полученного реакцией полимера по меньшей мере с одним бифункциональным соединением, включающем две аминогруппы М и Q, по аминогруппе Q с дополнительным бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную
200
группу и альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя с образованием производного полимера, содержащего альдегидную группу или кетогруппу или группу полуацеталя.
19. Способ по п.18, где дополнительное бифункциональное соединение выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового сложного эфира 4-формилбензойной кислоты, N-гидроксисукцинимидного сложного эфира 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты.
20. Способ по п.15, где аминогруппа Q соединения, включающего две аминогруппы М и Q, представляет собой бетагидроксиаминогруппу .
21. Способ по п.20, где бета-гидрокси аминогруппу окисляют с получением альдегидной группы.
22. Способ по п.п.2 0 или 21, где соединение, включающее две аминогруппы М и Q, где Q представляет собой бета-гидрокси аминогруппу, представляет собой 1,З-диамино-2-гидроксипропан.
23. Способ по п.п.21 или 22, где реакцию окисления проводят с использованием периодата.
24. Способ по любому из п.п.1-23, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, G-CSF, IFN альфа, IFN бета, AT III, IL-2, IL-3, миоглобина, SOD и BSA, предпочтительно из группы, состоящей из rhEPO, rhG-CSF, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, миоглобина, SOD и BSA, или из группы, состоящей из AlAT, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, tPA и АРС.
25. Конъюгат, включающий белок и полимер, полученный способом, как определено в любом из п.п.1-24.
26. Конъюгат по п.25, где полимер или его производное главным образом связан с N-концевой аминогруппой белка посредством азометиновой или аминовой связи, при этом белок, использованный для взаимодействия, включает N-концевую аминогруппу и по меньшей мере одну дополнительную аминогруппу, предпочтительно дополнительную группу лизина.
27. Конъюгат по любому из п.п.25 или 2 6, где использованный полимер, включающий по меньшей мере одну альдегидную группу, введенную в полимер путем реакции окисления с раскрытием цикла,
201
включает по меньшей мере одну структуру, соответствующую формуле
где Ri представляет собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу, гидроксиаралкильную группу или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 2 до 10 атомов углерода.
28. Конъюгат по п.п.25 или 26, где белок является ковалентно связанным с производным полимера посредством азометиновой и/или аминовой связи, указанное производное получено реакцией полимера с соединением, включающим две аминогруппы М и Q, по функциональной группе М, полученное соединение было дополнительно подвергнуто взаимодействию по Q с дополнительным бифункциональным соединением, включающим карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя, указанная карбоксильная группа или реакционоспособная карбоксильная группа образует амидную связь с аминогруппой Q, и указанная альдегидная группа или кетогруппа, или группа полуацеталя взаимодействует с аминогруппой белка при восстановительном аминировании.
29. Конъюгат по п.28, где дополнительное бифункциональное соединение, содержащее карбоксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу и альдегидную группу или кетогруппу, или группу полуацеталя выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового сложного эфира 4-формилбензойной кислоты, N-гидроксисукцинимидного сложного эфира 4-формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-З,5-диметоксифенокси)бутановой кислоты.
30. Конъюгат по п.29, имеющий структуру
202
HAS.
NH(tm) белок
R4 H
в случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, Ri, R2 и R3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, и п = 2,3 или 4, Rj независимо представляет собой водород или метоксигруппу, и m = 0 в случае, когда R4 представляет собой водород, и m = 1 в случае, когда R4 представляет собой метокси.
31. Конъюгат по п.п.25 или 2 6, где белок является ковалентно связанным с производным полимера посредством азометиновой и/или аминовой связи, указанное производное получено реакцией полимера с соединением, включающим две аминогруппы М и Q, где Q представляет собой бета-гидрокси аминогруппу и окислением бета-гидрокси аминогруппы Q с образованием альдегидной группы.
32. Конъюгат по п.31, где соединение, включающее две аминогруппы М и Q, где Q представляет собой бета-гидрокси аминогруппу, представляет собой 1,З-диамино-2-гидроксипропан.
33. Конъюгат по п.32, имеющий структуру
в случае, когда полимер подвергали взаимодействию по его окисленному восстановительному концу, Ri, R2 и R3 независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу.
34. Конъюгат по любому из п.п.25-33, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, G-CSF, I FN альфа, IFN бета, AT III, IL-2, IL-3, миоглобина, SOD и BSA.
203
35. Конъюгат по любому из п.п.25-33, где белок выбирают из группы, состоящей из rhEPO, rhG-CSF, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, миоглобина, SOD и BSA.
36. Конъюгат по любому из п.п.25-33, где белок выбирают из группы, состоящей из А1АТ, фактора VII, фактора VIII; фактора IX, tPA и АРС.
37. Конъюгат по любому из п.п.25-3 6 или 4 9-58, или конъюгат, получаемый способом по любому из п.п.1-24, для применения в способе лечения человека или животного.
38. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из п.п.25-36 или 4 9-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п. 1-24.
39. Фармацевтическая композиция по п.38, дополнительно включающая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель.
40. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п. 1-24, где белок представляет собой ЕРО, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения анемических нарушений или гематопоэтической дисфункции или связанных с этим заболеваний.
41. Применение конъюгата по любому из п.п.25-3 6 или 4 9-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой G-CSF, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения нарушения, характеризуемого пониженной гематопоэтической или иммунной функцией, указанное нарушение предпочтительно возникает в результате химиотерапии, лучевой терапии, инфекционного заболевания, тяжелой хронической нейтропении или лейкоза.
42. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой AT III, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения наследственного дефекта, венозного тромбоза, ожогов
204
и устройчивости к гепарину при аорто-коронарном шунтировании (CABG), для профилактики образования микросгустков, связанных с вентиляционной терапией, лечения перфорации кишечника в результате травмы и желудочно-кишечной хирургии, рассеянного внутрисосудистого свертываниюя крови (DIC) и/или сепсиса.
43. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой Фактор VIII, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения гемофилии А.
44. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой А1АТ, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения эмфиземы, цистозного фиброза, атопического дерматита, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ) и/или бронхита.
45. Применение конъюгата по любому из п.п.25-3 6 или 4 9-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой tPA, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения инфарктов миокарда (сердечных приступов), тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
46. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой АРС, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения тяжелого сепсиса, тромбоза, тромбоэмболии или окклюзионных заболеваний, особенно окклюзионных артериальных заболеваний.
47. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой IFN альфа, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения лейкоза, например, лейкоза волосковых клеток,
205
хронического миелогенного лейкоза, множественной миеломы, фоликулярной лимфомы, рака, например, карциноидной опухоли, злокачественной меланомы и гепатита, например, хронического гепатита В и хронического гепатита С.
48. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-54, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой IFN бета, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза, предпочтительно рецидивирующих форм рассеянного склероза.
49. Конъюгат, включающий гидроксиалкилкрахмал и белок, где гидроксиалкилкрахмал связан с использованием его окисленного восстановительного конца с первым связывающим соединением посредством амидной связи, указанное связывающее соединение дополнительно связано амидной связью со вторым связывающим соединением, указанное второе связывающее соединение связано азометиновой и/или аминной связью с белком, где первое связывающее соединение предпочтительно используется в качестве диамино-функционализированного соединения, а второе связывающее соединение предпочтительно используется в качестве карбокси- и альдегидо- или кето-, или полуацеталь-, более предпочтительно в качестве карбокси- и альдегидо- функционализированного соединения
50. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), имеющий структуру, соответствующую формуле:
PR,
HAS'
С-N-белок'
Н2 Н Н О
где Ri, R; и Rj независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу,
гидроксиаралкильную группу, или гидроксиалкарильную группу,
206
имеющую от 1, предпочтительно от 2, до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и
где L независимо представляет собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, имеющий от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до б, более предпочтительно от 1 до 2 атомов углерода и особенно предпочтительно 1 атом углерода, в частности L представляет собой С?Ь.
51. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), имеющий структуру, соответствующую формуле:
белок'
Н О
где Ri, R2 и Rj независимо представляют собой водород или гидроксиалкильную группу, гидроксиарильную группу,
гидроксиаралкильную группу, или гидроксиалкарильную группу, имеющую от 1, предпочтительно от 2, до 10 атомов углерода, предпочтительно водород или гидроксиалкильную группу, более предпочтительно водород или гидроксиэтильную группу, и где Li и L; независимо представляют собой необязательно замещенный, линейный, разветвленный и/или циклический углеводородный остаток, необязательно включающий по меньшей мере один гетероатом, включающий алкильный, арильный, аралкильный гетероалкильный и/или гетероаралкильный фрагмент, при этом указанный остаток содержит от 1 до 60, предпочтительно от 1 до 4 0, более предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10 атомов углерода, и
где D представляет собой связь, предпочтительно ковалентную
207
связь, которая образована подходящей функциональной группой F2, связанной с Li и подходящей функциональной группой F3, связанной с L2 .
52. Конъюгат по п.51, где Li представляет собой -(СН2)п-, где п = 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, более предпочтительно 2, 3, 4, и особенно предпочтительно 4.
53. Конъюгат по п. 51 или 52, где L2 включает необзательно замещенный подходящим образом арильный фрагмент, предпочтительно арильный фрагмент, содержащий б атомов углерода, особенно предпочтительно L2 представляет собой СбН4.
54. Конъюгат по любому из п.п.51-53, где F2 выбирают из группы, включающей
двойные С-С-связи или тройные С-С-связи, или ароматические С-С-связи;
- тиогруппу или гидроксильные группы;
гидразид алкилсульфоновой кислоты; гидразид арилсульфоновой кислоты;
- 1,2-диолы;
- 1,2-аминотиоспирты;
- азиды;
- 1,2-амино спир ты;
- аминогруппу -NH2 или производные аминогрупп, включающие структурное звено -NH-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;
гидроксиламино группу -0-NH2 или производные гидроксиаминогруппы, включающие структурное звено -0-NH-, такие как гидроксилалкиламино группы, гидроксилариламино группы, гидроксиларалкиламино группы или гидроксилалкариламино группы;
алкоксиамино группы, арилоксиамино группы,
аралкилоксиамино группы или алкарилоксиамино группы, каждая из которых включает структурное звено -NH-0-;
- остатки, имеющие карбонильную группу, -Q-C(=G)-М, где G представляет собой О или S, и М представляет собой, например,
- -ОН или -SH;
- алкоксильную группу, арилокси группу, аралкилокси группу
208
или алкарилокси группу;
-- алкилтио группу, арилтио группу, аралкилтио группу или алкарилтио группу;
алкилкарбонилокси группу, арилкарбонилокси группу, аралкилкарбонилокси группу, алкарилкарбонилокси группу;
-- активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как N-гидроксисукцинимид, или имеющие структурное звено 0-N, где N представляет собой часть гетероарильного соединения, или когда G = О и Q отсутствует, такие арилокси соединения с замещенным арильным остатком как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил;
где Q отсутствует или представляет собой NH или гетероатом, такой как S или О;
- -NH-NHc или -NH-NH-;
- -N02;
- нитрильную группу;
- карбонильные группы, такие как альдегидная группа или кетогруппа;
- карбоксильную группу;
- группу -N=C=0 или группу -N=0=3;
винилгалогенидные группы, такие как винилиодидная или винилбромидная группа или трифлат; - - -С=С-Н;
- -(C-NHjCl)-0-алкил;
- группы - (С=0)-СН:-На1, где Hal представляет собой Cl, Вг или I;
- CH=CH-S0:-;
- дисульфидную группу, включающую структуру -S-S-;
- группу
209
- группу
и где F3 представляет собой функциональную группу, способную образовывать химическую связь с F3 и предпочтительно выбран из вышеуказанной группы, F2 предпочтительно включает фрагмент -NH-, более предпочтительно включает аминогруппу, F3 предпочтительно включает фрагмент -(C=G)-, более предпочтительно -(С=0)-, более предпочтительно фрагмент -(C=G)-G-, еще более предпочтительно -(C=0)-G-, и особенно предпочтительно -(С=0)-О, D предпочтительно представляет собой амидную связь.
55. Конъюгат по п.54, имеющий структуру, соответствующую формуле:
п = 2, 3 или 4, R4 независимо представляет собой водород или метоксильную группу, и m = 0, когда R4 представляет собой водород, и m = 1 в случае, когда R4 представляет собой метокси.
56. Конъюгат, включающий белок и полимер или его производное, где полимер представляет собой гидроксиалкилкрахмал (HAS), имеющий структуру, соответствующую формуле
HAS"-С-Н- белок'
Н2 Н
где атом углерода фрагмента -CH;-NH- получен из альдегидной группы, которая была введена в полимер реакцией окисления с раскрытием цикла, и где атом азота получен из аминогруппы белка.
57. Конъюгат по любому из п. п. 54-71, где гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал.
58. Конъюгат по п.57 где гидроксиэтилкрахмал имеет молекулярную массу от 2 до 2 00 кДа, предпочтительно от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 4 до 70 кДа.
210
59. Конъюгат по любому из п.п.49-58, где белок выбирают из группы, состоящей из ЕРО, G-CSF, IFN альфа, IFN бета, AT III, IL-2, IL-3, миоглобина, SOD и BSA, предпочтительно из группы, состоящей из rhEPO, rhG-CSF, rhIFN альфа, rhIFN бета, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, миоглобина, SOD и BSA, и/или из группы, состоящей из А1АТ, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, tPA и АРС.
60. Применение конъюгата по любому из п.п.25-36 или 49-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п. 1-24, где белок представляет собой Фактор VII, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для лечения случаев гемофилии А или В у пациентов, обладающих ингибиторами Фактора VIII или Фактора IX.
61. Применение конъюгата по любому из п.п.25-3 6 или 4 9-58, или конъюгата, получаемого способом по любому из п.п.1-24, где белок представляет собой Фактор IX, и полимер представляет собой HAS, предпочтительно HES, для получения лекарственного средства для борьбы и профилактики геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В, предпочтительно с врожденным дефицитом фактора IX или болезнью Кристмаса, включая контроль и профилактику кровотечения при хирургических вмешательствах.
По доверенности
Ш9 139254ЕА/011
Фиг. la
В С
2/39
Фи г. lb
В С
3/39
Фиг.2
"" г'
А В С D Е F
Фиг.З
4/39
В С D Б
Фиг.4
5/39
¦Ш [Ш Ш:
А В С D E F G H I J
Фиг.5
6/39
"3. ?
А В
D E F G H
Фиг.6
7/39
А В С
8/39
Фиг.7
J i. .1 ¦
к 'if.
А В С D
Б F G
9/39
Фиг.8
А В С D
Е F G
Фиг.9
10/39
BCD
11/39
Фиг.10
Г m -г-
¦; ¦ ¦' '!-/:r " г..л •' *
if... . . ;
ABC D EFGft I J
Фи г. 11
12/39
Фиг. 12
13/39
М[кДа]~
.11391-Г
<
* К
о о, С
00 -* I
=tfc
CN го <
т О сл Q
Фи г. 14
15/39
1/4815-1 исходное вещество G-CSF
Фиг.15
16/39
1/4810-1 G-CSF сшитый с AMS-HAS
Фиг.16
17/39
19/39
Фиг.18
100,0
о н
с; _
о 5_
0,5
1 1,5
с [мкг/мл]
2,5
Проластин Линия (Проластин)
alAT
- Линия^АТ)
* коньюгат HEStx 1АТ ""Линия коньюгат НЕ &- Ь ii
Фиг.20
Полоса
21/39
¦V'i
А В С D
Фиг.21
22/39
Фиг.22
23/39
5 -'-Г"-1-:-1-
О 20 40 60 80
--•-
контроль носитель
Neupogen
---¦---
Neulasta
--о--
10/0.4
-. -± -:
10/0.7
---о-
30/0.4
--Чи-'-.
30/0.7
--?--
50/0.7
.......
имитирующее инкубирование
-с---
G-CSF"
время (ч)
Фиг.23
24/39
ABC D
Фиг.24
25/39
X А В С D.E F G
Фиг.25
26/39
А В С D Е F G
Фиг.26
27/39
"Мед
Полоса: & ^
Фиг.27
28/39
X А В
Фиг.28
29/39
о т
о и о я
X ю
а о
а 5 о о
•в- с
5 н
к о о = 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20.0 0,0 -¦- NIH lFN-альф l -в-IntronA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Разведение интерферона
Фиг. 29
30/39
'':-\ i ¦. .. X;.
.....
исходное вещество IFN-a имитация IFN-a-HES
Фиг.ЗО
31/39
Intron А исходное |FN-a- . IFN-a- IFN-a- IFN-a- IFN-a- Pegasys (30.10.) вещество HES10/0.4 HES10/0.7 HES30/0.4 HES30/0.7 HES50/0.4
IFN-a
? Intron A М исходное вещество liN-aMPegasys Ш IFN-a-HES
Фиг.31
32/39
Фиг.32
33/39
исходное вещество IFN-a IFN-a-HES10/0.7
I IFN-a-HES30/0.7
i IFN-a-HES50/0.7
, •жсмотенцшшь- (|FN-a-HES10/0.7)
иое сглаживание
экспсменциаль- (|FN^.HES30/0.7)
нос сглаживание
-"кспотснииаль- (IFN-a-HES50/0.7
нос сглаживание ноиый))
О 5 10 15 20 25
время (ч) после внутривенной инъекции
Фиг.33
34/39
Средние значения
юооооо
время(ч)
Фиг.34
35/39
Средние значения юоооо т---:-;-
время (ч)
¦ исходное вещество П'Ы-а Ш IFN-a-HES30/0.7
Фиг.35
36/39
а) исходное вещество IFN-альфа
время (ч)
. среднее геометрическое
¦ однокомпаргменгная модель
-012
время (ч)
Фиг.36
37/39
Фиг.37
38/39
время (ч) после внутривенной инъекции
39/39
Фиг.38
эксперимент in vitro
'> 120% с
S о
г 2
100% 80%
ё. бо%
га о
X Г
о о
Ё Ё
Я I
Н h
о о
40% 20% 0%
in vitro