|
Патентная документация ЕАПВ |
|
||
| Запрос: | ea200601574a*\id |
|
Термины запроса в документе Реферат Настоящее изобретение относится к регио- и стереоселективному биопревращению ряда алифатических динитрилов в соответствующие цианокарбоновые кислоты. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены способы превращения 2-изобутилсукцинонитрила в (S)-3-циано-5-метилгексановую кислоту, представляющую собой полезное промежуточное соединение в синтезе (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина). Прегабалин может быть использован для лечения некоторых церебральных заболеваний, например в лечении и профилактике эпилептических припадков, боли и психотических расстройств. Полный текст патента (57) Реферат / Формула:
PCT/IB2005/000873 МПК7: C12P 13/00,7/40 СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНОЕ БИОПРЕВРАШЕНИЕ АЛИФАТИЧЕСКИХ ДИНИТРИЛОВ В ЦИАНОКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ Область изобретения Настоящее изобретение относится к новым биокаталитическим способам регио-и стереоселективного превращения выбранных алифатических динитрилов в соответствующие цианокарбоновые кислоты. Более конкретно в настоящем изобретении предложены способы превращения 2-изобутил-сукцинонитрила в (5)-3-циано-5-метилгексановую кислоту, представляющую собой полезное промежуточное соединение для синтеза (5)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалин). Прегабалин может быть использован для лечения ряда церебральных заболеваний, например в лечении и профилактике эпилептических припадков, боли, и психотических расстройств. Поскольку прегабалин эффективен в улучшении церебральных функций, он также полезен при лечении гериатрических пациентов. Предшествующий уровень техники Ферментативный гидролиз органических нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и амидов представляет собой важный альтернативный способ синтеза широкого спектра полезных соединений. Обычный химический гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и амидов как правило осуществляют с использованием в качестве катализатора сильной кислоты или основания в сочетании с высокими температурами реакции, что делает его непригодным для соединений, содержащих чувствительные функциональные группы. Кроме того, низкая селективность химического гидролиза может привести в результате к нежелательным побочным продуктам наряду со значительными количествами неорганических солей. Напротив, ферментативный гидролиз нитрилов происходит в мягких условиях (нейтральный рН, 30°С), обеспечивающих возможность для высокой хемо-, регио- и стереоселективности. В качестве дополнительного преимущества, он позволяет избежать образования в качестве побочных продуктов неорганических солей. Наиболее известным промышленным применением нитрилконвертирующих ферментов является получение акриламида (Т. Nagasawa et al., Tibtech., 1992, vol. 10, 402-408) и никотинамида (Т. Nagasawa et al., Appl. Environ. Microbiol, 1998, vol 54, 1766-1769) с использованием нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous Л. В нескольких недавних обзорах (L. Martinkova et al., Current Organic Chemistry, 2003, vol. 7, 1279-1295 и D. Cowan et al., Extremophiles, 1998, vol. 2, 207-216) описана биохимия и возможные промышленные применения нитрилконвертирующих ферментов. Ферментативный гидролиз нитрилов катализируется нитрилазами, превращающими нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты, и нитрилгидратазами, превращающими нитрилы в соответствующие амиды. Для превращения нитрилов в карбоновые кислоты могут быть использованы амидазы, гидролизующие амиды до соответствующих карбоновых кислот, в комбинации с нитрилгидратазами. Применение фермента нитрилазы для получения карбоновой кислоты из соответствующего нитрила раскрыто в WO 02/072856. Включение фермента в структурированную полимерную матрицу позволяет получить катализатор, обладающий улучшенной физической и биохимической целостностью. Региоселективное получение ю-нитрилкарбоновых кислот из алифатических а,со-динитрилов с помощью биокатализатора раскрыто в патенте США № 5,814,508. Например, катализатор, обладающий нитрилазной активностью, использовали для превращения 2-метилглутаронитрила в 4-цианопентановую кислоту. К. Yamamoto, et al. J. Ferment. Bioengineering, 1992, vol. 73, 125-129 описывает применение микробных клеток, обладающих нитрилгидратазной и амидазной активностью, для превращения трянс-1,4-дицианоциклогексана в транс-4-цианоциклогексанкарбоновую кислоту. Для ряда алифатических ос,ш-динитрильных соединений сообщалось о региоселективных биокаталитических превращениях динитрилов в цианозамещенные карбоновые кислоты с использованием микробных клеток, обладающих активностью алифатической нитрилазы, или комбинацией нитрилгидратазной и амидазной активностей (J. Е. Gavagan et al. J. Org. Chem., 1998, vol. 63,4792-4801). Стереоселективные ферментативные превращения нитрилов описаны для получения хиральных карбоновых кислот и амидов, обогащенных одним энантиомером (М Wieser et al., Chapter in Stereoselective Biocatalysis, Marcel Dekker Inc.: New York, 2000, 461-486). Фермент стереоселективную нитрилазу из Alcaligenes faecalls АТСС 8750 используют для получения (Л)-миндальной кислоты из рацемического манделонитрила (К. Yamamoto et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, vol. 57, 3028-3032). Нитрилаза из Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 преимущественно гидролизует (+)-2-метилгексанитрил в рацемической смеси 2-метилгексанитрила, при этом (-)-2 метилгексанитрил не вступает в реакцию (М. Gradley et al., Biotechnology Lett., 1994, vol. 16, 41-46). В патенте США № 5,593,871 раскрыт способ получения амидов 2-алкановой кислоты, обогащенных одним энантиомером, из нитрилов с использованием микроорганизмов, содержащих стереоселективные нитрилгидратазы. Энантиомерно чистые ос-аминокислоты и амиды получали из рацемических а-арил- и а-алкил-замещенных глициннитрилов с использованием Rhodococcus sp. AJ270, содержащего стереоселективную нитрилгидратазу и стереоселективную амидазу (М.-С. Wang et al., J. Org. Chem., 2002, vol. 67, 6542). Вышеуказанные ссылки включены в данное описание путем ссылки. Было обнаружено, что терапевтическая ценность рацемического прегабалина, в особенности его эффективность в качестве противосудорожного средства, обусловлена прежде всего (ф-энантиомером. В процессе решения задачи обеспечения рентабельной лекарственной терапии прегабалином исследовали множество путей синтеза соединения, обогащенного (^-энантиомером. Например, асимметричное гидрирование соответствующего цианозамещенного олефина с последующим восстановлением цианогруппы до соответствующего амина позволяет получить прегабалин, существенно обогащенный (5)-энантиомером (публикация заявки на патент США № 2003/0212290). Синтез прегабалина, его производных и аналогов чисто химическими способами раскрыт в патентах США 6,642,398; 6,635,673; и 6,046,353. Краткое изложение сущности изобретения В способе в соответствии с настоящим изобретением регио- и стереоселективные биокаталитические превращениия алифатических динитрилов в цианокарбоновые кислоты осуществляют с использованием ферментативных катализаторов, обладающих нитрилазной активностью. Настоящее изобретение относится к новому способу получения (5)-энантиомера соединения формулы I соон где СЗ имеет (^-конфигурацию; R1 представляет собой водород, (СгСб)алкил или фенил; и R2 представляет собой (СгСвЭалкил, (С2-С8)алкенил, (Сз-С8)циклоалкил, -0(Ci-Сб)алкил, -СН2-СН2-0-(С1-Сб)алкил, (С1-Сб)алкил-ОН, -фенил-(С1-Сб)алкил-ОН, -фенил-0-(С1-Сб)алкил, фенил или замещенный фенил; при условии, что когда R2 представляет собой метил, тогда R1 представляет собой водород, (С1-Сб)алкил или фенил; включающий стадии: (1а) приведения соединение формулы II в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью; и (16) выделения (5)-изомера соединения формулы I из реакционной среды и возможно выделения неизмененного (Л)-изомера соединения И. Соединения формулы I полезны для синтеза соединений, обладающих фармацевтической активностью, таких как прегабалин. В предпочтительном воплощении изобретения R1 и R2 независимо представляет собой водород или Ci-Сзалкил. В предпочтительном воплощении изобретения соединение формулы II представляет собой рацемическую смесь, содержащую 3R и 35 изомеры. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой способ, посредством которого рацемический 2-изобутил-сукцинонитрил (соединение формулы II, где R1 представляет собой Н, и R2 представляет собой метил) превращают в (5)-3-циано-5-метилгексановую кислоту (соединение формулы I, где R1 представляет собой Н, и R представляет собой метил), включающий стадии: (2а) приведения рацемического 2-изобутил-сукционитрила в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью, и (26) выделения (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из водной смеси и возможно выделения неизмененного (Л)-2-изобутилсукцинонитрила. Предпочтительно реакционная среда представляет собой водную среду. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения выделенный и неизмененный (R) -изомер соединения II затем рацемизируют путем нагревания со слабым основанием в присутствии органического растворителя. Предпочтительное основание представляет собой 1,8-диазабицикло[5.4.0.]ундец-7-ен, а предпочтительный растворитель представляет собой толуол. Возможно получающийся в результате рацемат II может быть возвращен в любой из вышеуказанных способов на стадиях (1а) или (2а). В одном из воплощений настоящего изобретения ферментный катализатор представлен в форме целых микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов, очищенных ферментов или ферментных катализаторов, иммобилизованных на подложке. В еще одном воплощении настоящего изобретения ферментный катализатор представляет собой частично очищенный фермент. Примеры частично очищенных примеров включают NIT-101, NIT-102, NIT-103 (BioCatalytics Inc., Pasadena, СА) и нитрилазу из Arabidopsis thalicma (Jiilich Fine Chemicals, Julich, Germany), но не ограничиваются ими. В предпочтительном воплощении в соответствии с настоящим изобретением катализатор, представляющий собой фермент нитрилазу, иммобилизован на подложке. Примеры иммобилизованных катализаторов, представляющих собой фермент нитрилазу, включают NIT-102 С2 (BioCatalytics Inc., Pasadena, С A), NIT-102, иммобилизованный на Eupergit (Rohm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Germany), и нитрилазу из Arabidopsis thaliana, иммобилизованную на Eupergit, но не ограничиваются ими. В предпочтительном воплощении иммобилизованный катализатор, представляющий собой фермент нитрилазу, представляет собой NIT-102 С2. В еще одном воплощении реакционные среды состоят из дистиллированной воды или забуференной воды. Предпочтительно забуференная вода забуферена до рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0 и наиболее предпочтительно до рН в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0. Настоящее изобретение также относится к способу получения (5)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина), включающему стадии: (а) приведения рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью; (б) выделения (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из реакционной среды; (в) превращения (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты в ее соль; и (г) гидрирования указанной соли кислоты с получением (5)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалин). Предпочтительно соль кислоты имеет формулу ^со2м где М представляет собой Na, К, Li, NH4, N^R6!*7, NH3R1 или NH(R6)2R7, где Далее для удобства представлены некоторые термины, использованные в описании, примерах и формуле изобретения. Если не указано иное, все использованные здесь технические и научные термины имеют значение, как правило, очевидное для специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Термин "алкил" представляет собой прямую или разветвленную группу, состоящую из 1-8 атомов углерода, включая метил, этил, пропил, бутил, изобутил и трет-бутп, но ими не ограничен. Использованный здесь термин "циклоалкил" включает группировки, являющиеся производными циклических углеводородов, содержащих от трех до семи атомов углерода в кольце, включая циклические углеводородные группировки, замещенные прямыми или разветвленными алкильными группировками. Использованный здесь термин "алкокси" означает "алкил-О-", где "алкил" является таким, как определено выше. Термин "алкенил" включает углеводородные цепи, имеющие прямую или разветвленную конфигурацию, содержащие одну или более углерод-углеродных двойных связей, которые могут находиься в любой стабильной точке вдоль цепи, такие как этенил и пропенил. Алкенильные группы обычно содержат от 2 до приблизительно 12 атомов углерода, более типично от 2 до приблизительно 8 атомов углерода. .CN каждый из R и R независимо представляет собой (С1-Сб)алкил. Использованный здесь термин "рацемат" означает эквимолярную смесь пары энантиомеров. Рацемат обычно образуется тогда, когда в результате синтеза образуется стереоцентр. Использованный здесь термин рацемическая смесь обозначает рацемат. Использованный здесь термин "энантиомеры" относится к соединениям, которые на молекулярном уровне являются ненакладываемыми с зеркальными изображениями друг друга. Энантиомеры могут существовать в (К) или (5) конфигурации. Использованный здесь термин "стереоселективный синтез" относится к химической реакции, которая ведет к образованию одного стереоизомера или энантиомерно-обогащенной смеси изомеров из числа двух или более возможных стереоизомеров. Использованный здесь термин "региоселективная" относится к реакции, которая происходит по одному атому или одной группе атомов из числа двух или более возможных атомов или групп атомов. Региоселективный гидролиз динитрила приводит в результате к превращению одной нитрильной группы в карбоксильную группу. "°С" оозначает градусы Цельсия; Использованный здесь термин "ферментный катализатор" означает катализатор, который характеризуется нитрилазной активностью или комбинацией нитрилгидратазной активности и амидазной активности. Катализатор может находиться в форме целой микробной клетки, пермеабилизованной(ых) микробной(ых) клетки(ок), одного или более компонентов микробного клеточного экстракта, частично очищенного(ых) фермента(ов) или очищенного(ых) фермента(ов). Использованный здесь термин "энантиомерный избыток" относится к выраженной в процентах мольной фракции основного энантиомера в смеси энантиомеров. Термин "водная реакционная смесь" означает смесь субстрата и ферментного катализатора в преимущественно водной среде. Термин "нитрилазная активность" означает ферментативную активность, которая превращает нитрильную группу в группу карбоновой кислоты. Использованный здесь термин "нитрилгидратазная активность" означает ферментативную активность, которая превращает нитрильную группу в амидную группу. Термин "амидазная активность" означает ферментативную активность, которая превращает амидную группу в группу карбоновой кислоты. АТСС представляет собой Американскую коллекцию типовых культур (American Type Culture Collection), расположенную по адресу 10801 University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, U.S.A. BioCatalytics Inc. расположена по адресу 129 N. Hill Avenue, Suite 103, Pasadena, CA, 91106, U.S.A. Julich Fine Chemicals GmbH расположена по адресу Rudolf-Schulten-StraBe 5, D-52428 Julich, Germany. Подробное описание изобретения В настоящем изобретении предложен ферментативный способ получения алифатических цианокарбоновых кислот формулы I из динитрилов формулы П. Для получения динитрильных (II) исходных веществ может быть использован любой подходящий способ, обычно используемый в данной области техники. Схема 1 относится к конкретному воплощению настоящего изобретения, в котором для превращения 2-изобутилсукцинонитрила (V) в (5)-3-циано-5-метилгексановую кислоту (VI) применяют хемоферментативный способ. Соединение VI может быть использовано в качестве промежуточного соединения в синтезе прегабалина (VII) так, как это проиллюстрировано на Схеме 2. На Стадии 3 Схемы 1 изображена рацемизация побочного продукта (Л)-изомера (Va) и последующий его возврат на Стадию 2. На Стадии 1 Схемы 1 рацемический 2-изобутил-сукцинонитрил (V) получают путем конденсации изовалерианового альдегида (III) с этилцианоацетатом (IV) с последующим добавлением KCN. Рацемат имеет место в силу наличия стереоцентра, возникающего на атоме углерода СЗ в V. На Стадии 2 Схемы 1 изображен регио- и стереоселективный гидролиз рацемата динитрила V с получением (8)-3-циано-5-метилгексановой кислоты (VI) и неизмененного (Л)-изомера V. Катализируемый нитрилазой гидролиз 2-изобутил-сукцинонитрила (V) до (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты VI является региоселективным и стереоселективным. Региоселективность основана на превращении цианогруппы в карбоксильную группу только на атоме углерода С1. Реакция стереоселективна в том, что (5)-энантиомер соединения V преимущественно вовлечен в превращение, тогда как (/?)-энантиомер по существу остается неизменным. В соответствии со Схемой 2 соль Via S-цианокислоты VI гидрируют на следующей стадии с получением (5)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалин). Реакцию осуществляют в присутствии катализатора гидрирования, предпочтительно никеля Рэнея. Приемлемые соли кислоты включают соединения формулы Via, где М представляет собой Na, К, Li, NH4, NH2R6R7, NH3R0 или NH(R6)2R7, где R6 и R7 независимо представляют собой (С1-Сб)алкил. Схема 1 1. пиперидин/гексан СНО ^C02Et 2. KCN \^-^/CN 4CN 2 \rN Стадия 1 ,CN III IV (Д5)-2-изобугилсукцинонитрил (рацемат) нитрилаза Стадия 2 Стадия 3 Основание (5> 3-циано-5-метилгексановая кислота (Я)-2-изобутилсукцинонитрил Схема 2 Соль (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты Прегабалин В регио- и стереоселективном превращении рацемата V в (5)-цианокислоту VI в соответствии со Схемой I фермент нитрилаза взаимодействует преимущественно с (5)-энантиомером. Соответственно, реакционная смесь во все большей степени обогащается (Л)-энантиомером Va по мере осуществления превращения. Задача настоящего изобретения также заключается в том, чтобы избежать экономических потерь путем возвращения в оборот или повторного использования неизмененного (/?)-динитрила Va. Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ рацемизации (Л)-динитрила (Стадия 3, Схема 1) и последующего возвращения в оборот посредством Стадии 2 Схемы 1. Различные ферменты в соответствии с настоящим изобретением, обладающие нитрилазной активностью или комбинацией нитрилгидратазной и амидазной активностей, могут быть обнаружены путем использования протоколов скрининга, таких как методики выделения с обогащением, согласно которым сначала отбирают микроорганизмы на основании их способности расти в средах, обогащенных нитрилом. Методики выделения с обогащением, как правило, включают использование сред с ограничением по углероду или азоту, обогащенных нитрилом, который может представлять собой нитрильный субстрат для желаемого биопревращения или структурно родственное нитрильное соединение. Микроорганизмы, которые обладают нитрилазной активностью, первоначально могут быть отобраны по их способности расти в среде, обогащенной нитрилом. Gavagan et al., (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) vol. 52, 654-659) применял методики с обогащением для выделения из почвы грам-отрицательной бактерии Acidovorax facilis 72W (АТСС 55746), используя 2-этилсукцинонитрил в качестве единственного источника азота. Показано, что Acidovorax facilis 72W (АТСС 55746) полезен для селективного превращения 2-метилглутаронитрила в 4-цианопентановую кислоту. Методику с обогащением также использовали для выделения термофильной бактерии Bacillus pallidus Dac521, которая катализирует превращение 3-цианопиридина в никотиновую кислоту (Almatawah and Cowan, Enzyme Microb. Technol. (1999) vol. 25, 718-724). Микроорганизмы, выделенные при помощи методик с обогащением, могут быть протестированы на нитрилгидролизующую активность путем приведения суспензий микробных клеток в контакт с нитрильным соединением и тестирования на присутствие соответствующей карбоновой кислоты с использованием соответствующих аналитических способов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография, газожидкостная хроматография или жидкостная хроматография/масс-спектрометрия (ЖХ/МС). О методиках тестирования нитрилгидролизующей активности Acidovorax facilis 72W (АТСС 55746) сообщается в патенте США № 5,814,508. После выделения микроорганизма, обладающего нитрилазной активностью или нитрилгидратазной и амидазной активностями, для улучшения различных аспектов этих фермента(ов) может быть использована ферментная инженерия. Эти улучшения могут быть полезны для настоящего изобретения и включают увеличение селективности, каталитическую эффективность фермента, стабильность при более высоких температурах и более широком диапазоне рН, и дают ферменту возможность функционировать в реакционной среде, включающей смесь водного буфера и органического растворителя. Разнообразные методики, которые могут быть использованы в настоящем изобретении для получения ферментного катализатора, обладающего нитрилазной активностью или нитрилгидратазной и амидазной активностями, в дополнение к улучшенному выходу, производительности и качеству продукта, подходящего для конкретного способа биопревращения, включают методики ферментной инженерии, такие как способы рационального конструирования, которые включают сайт-направленный мутагенез и методики направленной эволюции с использованием способов случайного мутагенеза или "перетасовки" ДНК, но не ограничиваются ими. Подходящие ферментные катализаторы для превращения соединений формулы II в соединения формулы I представлены в форме целых микробных клеток, пермеабилизованных микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов или очищенных ферментов, и такие катализаторы могут быть иммобилизованы на подложке. Этот способ можно осуществлять в одну фазу путем приведения 2-изобутилсукцинонитрила в контакт с ферментным катализатором в дистиллированной воде или водном растворе буфера, который будет поддерживать исходное значение рН реакционной смеси между 5,0 и 10,0, предпочтительно между 6,0 и 8,0. Подходящие буферы включают фосфат калия и ацетат кальция. По мере протекания реакции рН реакционной смеси может меняться вследствие образования аммониевой соли карбоновой кислоты из соответствующей нитрильной функциональной группы динитрила. Реакция может проходить в отсутствие контроля рН, либо по мере протекания реакции для поддержания желаемого значения рН могут быть добавлены подходящие кислота или основание. Однако, как указано выше, с помощью таких методик, как ферментная инженерия и направленная эволюция, можно получать ферментные катализаторы, которые эффективно действуют в более широких диапазонах рН. Этот способ может быть осуществлен в реакционных смесях, состоящих из двух фаз: водной фазы, которая первоначально содержит фермент и растворенный 2-изобутил-сукцинонитрил, и органической фазы, которая состоит в основном из рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила. Двухфазные реакционные смеси готовят путем добавления 2-изобутил-сукцинонитрила к водному раствору фермента и буферного агента таким образом, чтобы добавленное количество 2-изобутил-сукцинонитрила превышало предел его водной растворимости. Предел водной растворимости 2-изобутил-сукцинонитрила в 50 мМ фосфате калия (30°С, рН 7,5) составляет приблизительно 0,06 М. В ходе реакции образуется аммониевая соль (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты, и ее концентрация в водной фазе увеличивается, тогда как органическая фаза уменьшается в объеме и обогащается (Л)-2-изобутил-сукцинонитрилом. Альтернативно, этот способ также может быть осуществлен в реакционных смесях, состоящих из трех фаз: водной фазы, которая первоначально содержит растворенный 2-изобутил-сукцинонитрил, органической фазы, состоящей в основном из рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила, и твердой фазы, состоящей из фермента, иммобилизованного на нерастворимой подложке. Трехфазные реакционные смеси готовят с помощью методики, описанной для двухфазной реакционной смеси, за исключением того, что вместо неиммобилизованного фермента используют фермент, иммобилизованный на нерастворимой подложке. Возможно, фермент может быть иммобилизован в полимерной матрице или на нерастворимой подложке. Иммобилизованные ферментные катализаторы могут быть использованы повторно и в непрерывных способх, и могут быть отделены от продуктов ферментативного способа легче, нежели неиммобилизованные ферментные катализаторы. Способы иммобилизации ферментов в полимерной матрице, такой как альгинат кальция или полиакриламид, или на нерастворимой подложке, такой как целит, хорошо известны специалистам в данной области техники. NIT-102 С2 (BioCatalytics Inc., Pasadena, С А), представляющий собой фермент нитрилазу, иммобилизованный на нерастворимой подложке, особенно полезен для превращения II в III, поскольку он может быть повторно использован в периодических или непрерывных способах. Концентрацию NIT-102 С2, используемого в реакции, выбирают таким образом, чтобы достигать желаемой скорости реакции, и она зависит от специфической активности катализатора и концентрации субстрата. Как правило, NIT-102 С2 используют в диапазоне от приблизительно от 0,001 г до 0,3 г влажной массы на 1 мл реакционного объема, причем предпочтительный диапазон составляет от 0,01 до 0,15 г влажной массы на 1 мл реакционного объема. Кроме того, для превращения II в III также подходят несколько лиофилизированных лизатов, полученных из микробных клеток и обозначенных NIT-101, NIT-102, NIT-103 (BioCatalytics Inc., Pasadena, С А), а также нитрилаза из Arabidopsis thaliana (Julich Fine Chemicals, Julich, Germany). Контакт NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазы из A. thaliana с I в водной реакционной смеси приводит в результате к образованию И. Реакции с использованием NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазы из Arabidopsis thaliana могут быть осуществлены в двухфазных реакционных смесях с использованием концентраций катализатора, находящихся в диапазоне 0,001-0,04 г сухой массы на 1 мл реакционного объема, причем предпочтительный диапазон составляет 0,002-0,02 г сухой массы на 1 мл реакционного объема. Температуру реакции гидролиза выбирают таким образом, чтобы оптимизировать скорость реакции и стабильность активности ферментного катализатора. Температура реакционной смеси может варьровать от точки замерзания суспензии (прибл. 0°С) до 60°С, причем предпочтительный диапазон температуры реакции составляет от 5°С до 35°С. Выделение (35) изомера соединения формулы I и выделение неизмененного (3R) изомера соединения формулы II может быть осуществлено с использованием подходящих способов разделения, выделения и очистки, хорошо известных специалистам в данной области техники. В предпочтительном способе выделения неизмененный (3R) изомер соединения формулы II отделяют от основной водной реакционной смеси путем экстракции органическим растворителем, таким как этилацетат. (35) изомер соединения формулы I в виде соли кислоты предпочтительно растворяют в водном слое и затем выделяют путем подкисления и экстракции органическим растворителем, таким как этилацетат. Соединения формулы I могут быть использованы для синтеза соединений, таких как прегабалин, которые полезны для лечения таких расстройств, таких как эпилепсия, судороги, тревога, боль и нейродегенеративные расстройства, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона и болезнь Паркинсона. Примерами конкретных соединений формулы I являются следующие соединения: (5)-3 -циано-5 -метил-октановая кислота; (5)-3-циано-5-метил-гептановая кислота; (5)-3-циано-5-метил-гексановая кислота; (5)-3-циано-5-метил-нонановая кислота; (5)-3-циано-5-этокси-гексановая кислота; (5)-3-циано-5-циклогексил-гексановая кислота и (5)-3 -циано-5 -трифторметил-гексановая кислота. ПРИМЕР 1 Получение 2-изобутил-сукцинонитрила Смесь этилцианоацетата (733 г, 6,48 моль), изовалерианового альдегида (613,9 г, 7,13 моль), пиперидина (5,5 г, 0,065 моль) и гексана (0,5 л) помещали в условия кипячения с обратным холодильником с непрерывным удалением воды. Когда вода больше не собиралась, смесь охлаждали и перегоняли в вакууме для удаления растворителя. К оставшемуся маслу добавляли изопропанол (1 л), а затем раствор цианида калия (422 г, 6,48 моль) в воде (2 л). В ходе добавления раствора цианида калия реакционную смесь поддерживали при температуре ниже 35°С, а затем выдерживали при приблизительно 35°С в течение 4 ч. Реакционную смесь перегоняли при атмосферном давлении до тех пор, пока температура не достигала 95°С, а затем кипятили с обратным холодильником при этой температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждали, разбавляли водой (0,5 л) и экстрагировали 1 л метил-тирет-бутилового эфира (МТВЕ). МТВЕ экстракт промывали водой (0,5 л), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 873,4 г 2-изобутил-сукцинонитрила в виде масла. Очищенные образцы 2-изобутил-сукцинонитрила могут быть получены путем вакуумной перегонки (90°С при 36,66 Па (0,275 мм Hg)). 'Н ЯМР (CDC13, 400 МГц): 5 0.93-0.99 (m, 6Н), 1.43-1.50 (т, 1Н), 1.71-1.78 (т, 1Н), 1.81-1.91 (т, Ш), 2.69 (d, 2Н, J=6,5 Гц), 2.90-2.97 (т, 1Н). ПРИМЕР 2 Получение ( <У)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутил-сукнинонитрила с NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазой Arabidopsis thaliana В каждый из трех стеклянных сосудов с завинчивающимися пробками объемом 8 мл помещали 2-изобутил-сукцинонитрил (20 мг), 1 мл 50 мМ буфера на основе фосфата калия (рН 7,5, 2 мМ дитиотреитола (DTT)) и 10 мг фермента нитрилазы, выбранного из NIT-101, NIT-102 или NIT-103 (Biocatalytics Inc., Pasadena, СА). В один стеклянный сосуд с завинчивающейся пробкой объемом 8 мл помещали 2-изобутил-сукцинонитрил (20 мг) и 1 мл раствора нитрилазы Arabidopsis thaliana в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,8), содержащем 100 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 2 мМ DTT (Julich Fine Chemicals, Julich, Germany). Четыре реакционные смеси перемешивали при помощи магнитных мешалок в течение 15 ч при 30°С и затем индивидуально экстрагировали этилацетатом (2x6 мл). После удаления этилацетатных экстрактов водные фазы обрабатывали 4 н НС1 (0,15 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x6 мл). Этилацетатные экстракты подкисленных водных фаз концентрировали в вакууме с получением 7,8 мг (выход 34,2%), 8,8 мг (выход 38,6%), 8,1 мг (выход 35,5%) и 4,0 мг (выход 17,5%) (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты ((5)-СМНА) для реакций, проведенных соответственно с NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазой A. thaliana. Образцы (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты, полученные в результате каждой из реакций, обрабатывали избытком (триметилсилил)диазометана с получением их производных в виде метилового эфира и анализировали при помощи газовой хроматографии (ГХ) на колонке Chiraldex G-TA (30 М х 0,25 мм внутренний диаметр (в.д.), толщина пленки 125 микрон) для определения энантиомерной чистоты. Энантиомерная чистота продуктов реакции с NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазой A. thaliana составляла соответственно 96,3%, 91,1%, 95,5% и 98,5% э.и. (э.и. означает "энантиомерный избыток") ПРИМЕР 3 Получение (5УЗ-циано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутил-сукцинонитрила с NIT-102 В реакционный сосуд с рубашкой объемом 125 мл, в котором поддерживали 30°С, помещали 2-изобутил-сукцинонитрил (3,33 г), NIT-102 (0,5 г) и 122 мл 50 мМ буфера на основе фосфата калия (рН 7,5), содержащего 5 мМ DTT и 1 мМ ЭДТА (реакционный буфер). После перемешивания в течение 12,5 ч смесь продуктов экстрагировали этилацетатом (4 х 50 мл). Этилацетатные экстракты удаляли и водную фазу доводили до рН 2,5 с помощью 4М НС1 и экстрагировали этилацетатом (3x50 мл). Этилацетатные экстракты подкисленной водной фазы объединяли, сушили безводным MgS04, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением 1,56 г (5)-СМНА (41,1%). Образец продукта реакции обрабатывали (триметилсилил)диазометаном и анализировали при помощи ГХ в соответствии с примером 2 с установлением энантиомерной чистоты 98,5% э.и. 'Н ЯМР (CDC13, 400 МГц): 8 0.93-0.97 (m, 6Н), 1.30-1.37 (m, 1Н), 1.61-1.68 (ш, 1Н), 1.82-1.89 (m, 1Н), 2.57-2.63 (т, 1Н), 2.72-2.78 (т, 1Н), 2.98-3.06 (т, 1Н). ПРИМЕР 4 Получение (5)-3-циано-5-метилгексаноата калия из 2-изобутил-сукцинонитрила с NIT-102 С2 В каждый из двух реакционных сосудов с рубашками объемом 125 мл, в которых поддерживали 30°С, помещали 2-изобутил-сукцинонитрил (6,81 г), NIT-102 С2 (1,70 г) и 118,2 мл реакционного буфера. После перемешивания в течение 24 ч смеси продуктов декантировали, оставляя ферментный катализатор в реакционных сосудах. В каждый из реакционных сосудов добавляли реакционный буфер (20 мл), перемешивали в течение приблизительно 2 минут и затем декантировали и добавляли к смесям продуктов. Реакции повторяли путем добавления в каждый из реакционных сосудов 2-изобутил-сукцинонитрила (6,81 г) и реакционного буфера (118,2 мл) и перемешивания реакционных смесей в течение 24 ч. После завершения четырех реакций в каждом сосуде (всего восемь периодических реакций), смеси продуктов объединяли и экстрагировали МТВЕ (3 х 500 мл). Экстракты МТВЕ удаляли и водную фазу доводили до рН 2,1 фосфорной кислотой и экстрагировали МТВЕ (2 х 500 мл). МТВЕ эктракт подкисленной водной фазы концентрировали в вакууме с получением масла, которое обрабатывали водой (100 мл) и КОН (8,5 г). Получающийся в результате раствор концентрировали в вакууме с получением 24,2 г (31,3%) (5)-3-циано-5-метилгексаноата калия. Из (5)-3-циано-5-метилгексаноата калия получали метил-(5)-3-циано-5-метилгексаноат и анализировали при помощи хиральной ГХ с установлением энантиомерной чистоты 99,1 % э.и. 'НЯМР (D20, 400 МГц): 8 0.75-0.78 (m, 6Н), 1.18-1.25 (m, 1Н), 1.43-1.50 (m, 1Н), 1.53-1.68 (т, 1Н), 2.28-2.38 (d, 2Н, J=6,5 Гц), 2.86-2.93 (т, Ш). ПРИМЕР 5 Получение (5УЗ-циано-5-метилгексановой кислоты из 2-изобутил-сукцинонитрила с NIT-102 С2 в атмосфере азота В реакционный сосуд с рубашкой объемом 125 мл, в котором поддерживали 30°С, помещали 2-изобутил-сукцинонитрил (6,53 г), NIT-102 С2 (2,61 г), 120 г реакционного буфера и продували азотом. Получающуюся в результате смесь перемешивали в течение 24 ч и затем декантировали в стеклянный сосуд объемом 250 мл, оставляя катализатор в реакционном сосуде. Реакцию повторяли путем повторной загрузки в реакционный сосуд, содержащий используемый катализатор, 2-изобутил-сукцинонитрила (6,53 г) и 120 г реакционного буфера, продувания азотом и перемешивания получающейся в результате смеси в течение 24 ч. Образцы реакционной смеси (0,1 мл) смешивали с 0,4 мл смеси вода:метанол:трифторуксусная кислота (60:40:0,09, об./об./об.) и анализировали посредством ВЭЖХ на колонке Symmetry С8 (150 x 3,9 мм), поддерживаемой при 30°С. Колонку элюировали смесью вода:метанол:трифторуксусная кислота (60:40:0,09, об./об./об.) и осуществляли детектирование с использованием рефрактометрического детектора. В общей сложности были осуществлены пятьдесят периодических реакций с возвращением в оборот катализатора. Смеси продуктов из двух следующих друг за другом периодических реакций объединяли и экстрагировали этилацетатом (2 х 150 мл). Водную фазу затем доводили до рН 2 с использованием 4М НС1 и экстрагировали этилацетатом (2x150 мл). Этилацетатные экстракты подкисленной водной фазы объединяли, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением (S)-CMHA. В общей сложности в результате пятидесяти периодических реакций получили 160,8 г (выход 43,2%) (5)-СМНА. Исходные скорости для первой, двадцать шестой и пятидесятой реакции составляли соответственно 14,8, 17,4 и 15,1 мМ (5)-СМНА/ч. Анализ путем хиральной ГХ производного ( Получение_(5)-3-циано-5-метилгексановой_кислоты_из_Ъ изобутилсукцинонитрила с NIT-102 С2 в атмосфере окружающей среды Серии периодических реакций для превращения 2-изобутил-сукцинонитрила в (5)-СМНА с использованием NIT-102 С2 проводили так, как описано в примере 5, за исключением того, что реакции осуществляли в атмосфере окружающей среды вместо атмосферы азота. Образцы реакционной смеси анализировали путем ВЭЖХ, как описано в примере 5. В общей сложности были осуществлены пятьдесят периодических реакций с возвращением в оборот катализатора в атмосфере окружающей среды. Исходные скорости реакций, определенные в образцах реакционной смеси, отобранных через четыре часа, составляли 14,2, 13,2 и 9,3 мМ (5)-СМНА/ч для первой, двадцать шестой и пятидесятой реакции, соответственно. ПРИМЕР 7 Получение (5)-3-циано-5-метилгексаноата /яре/я-бутиламмония Смеси продуктов превращения 2-изобутил-сукцинонитрила в (5)-СМНА (Пример 6, реакции 37-44) объединяли и экстрагировали этилацетатом (2 х 250 мл). Этилацетатные экстракты сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением масла (32,5 г, выход 62,2%), которое представляло собой в основном (/^-2-изобутил-сукцинонитрил. Водную фазу доводили до рН 2 с помощью 4М НС1 и экстрагировали этилацетатом (2 х 250 мл). Этилацетатные экстракты концентрировали до объема 470 мл и затем перемешивали, одновременно добавляя по каплям /wpem-бутиламин (15,9 мл, 151,5 ммоль). Образовавшуюся белую кристаллическую соль собирали путем фильтрации и сушили на воздухе в течение ночи с получением 30,0 г (5)-3-циано-5-метилгексаноата трет-бутиламмония. Метил-(5)-3-циано-5-метилгексаноат получали из (5)-3-циано-5-метилгексаноата /ирети-бутиламмония и анализировали путем хиральной ГХ с установлением энантиомерной чистоты 99,5% э.и. !Н ЯМР (CDC13, 400 МГц): 5 0.90-0.94 (m, 6Н), 1.26-1.32 (т, ЮН), 1.54-1.61 (т, 1Н), 1.78-1.88 (т, 1Н), 2.30-2.35 (т. 1Н), 2.43-2.50 (т, Ш), 2.96-3.04 (т, 1Н). ПРИМЕР 8 Получение (5УЗ-аминометил-5-метилгексановой кислоты из (5УЗ-циано-5-метилгексаноата калия Смесь (5)-3-циано-5-метилгексаноата калия (20 г, 103,5 ммоль), воды (50 мл), 45%-ного КОН (12 г), изопропанола (12 г) и никеля Рэнея встряхивали в течение ночи в в шейкере Парра при давлении водорода 344,5 кПа (50 ф./кв.дюйм). Смесь фильтровали, нагревали приблизительно до 50°С, обрабатывали уксусной кислотой (6,5 мл) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь затем доводили до значения рН 7 чуть больше 7 с помощью 45%-ного КОН и концентрировали в вакууме для удаления большей части изопропанола. К смеси добавляли изопропанол (20 мл), и затем подкисляли уксусной кислотой, перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и фильтровали с получением 4,3 г (5)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты в виде белого кристаллического твердого вещества. Путем получения производного (5)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты с помощью реагента Марфея (Marfey's reagent, Мх-(2,4-динитро-5-фторфенил)-Ь-аланинамид) и анализа путем ВЭЖХ на колонке BDS Hypersil С18 (250 х 4,6 мм, 5 мк) с элюцией смесью ацетонитрил:1% триэтиламин (рН 3) (38:62, об./об.) определяли энантиомерную чистоту, которая составила 100% э.и. ПРИМЕР 9 Получение СУ)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты из (5УЗ-циано-5-метилгексаноата /яре/и-бутиламмония Смесь (S)-3-циано-5-метилгексаноата /ире/и-бутиламмония (26 г, 113,9 ммоль), воды (48,8 мл), этанола (35,8 мл), КОН (7,2 г, 91% хлопья) и Sponge Nickel(tm) (А-7000, 16,3 г влажная масса, Activated Metals & Chemicals, Inc., Sevierville, TN) встряхивали в течение ночи в шейкере Парра при давлении водорода 344,5 кПа (50 ф./кв.дюйм). Смесь фильтровали (целит) и остаток на фильтре промывали водой (10 мл) и этанолом (5 мл). К фильтрату добавляли уксусную кислоту (9,4 мл) и получающуюся в результате смесь перемешивали в течение ночи при 4°С. Продукт фильтровали, промывали 10 мл изопропилового спирта и сушили в вакууме с получением 11,1 г (61%) белого твердого вещества. Порцию (10,0 г) этого вещества кристаллизовали из смеси 1:1 изопропилового спирта и воды с получением 8,8 г (5)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты с 100% э.и. ПРИМЕР 10 Рацемизация (1?)-2-изобутил-сукцинонитрила с использованием 1.8-диазабицикло[5.4.01ундец-7-ена (DBU) Рацемизацию (7?)-2-изобутил-сукцинонитрила осуществляли на материале, выделенном в результате биопревращения рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила с NIT-102 С2. Смесь (Л)-2-изобутил-сукцинонитрила (1,36 г, 10 ммоль, 69% э.и.), толуола (5 мл) и 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (DBU, 0,076 г, 5 ммоль) кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляли воду (10 мл) и получающуюся в результате смесь экстрагировали этилцетатом (2x10 мл). Объединенные органические экстракты последовательно промывали 5%-ной НС1 (20 мл) и насыщенным водным хлоридом натрия (20 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила (1,14 г, 84%). Энантиомерную чистоту определяли путем ГХ с использованием колонки Chiraldex(tm) G-TA (30 М х 0,25 мм в.д., толщина пленки 125 микрон). ПРИМЕР 11 Рацемизация (7?)-2-изобутил-сукцинонитрила с использованием Amberlite(r) IRA-400 Смолу Amberlite(r) IRA-400 (1 г влажной массы, Rohm & Haas, Philadelphia, PA) перемешивали с 5%-ным NaOH (10 мл) в течение 10 минут и промывали водой до тех пор, пока промывки не стали нейтральными. К смоле добавляли этанол (25 мл) и (R)-2-изобутил-сукцинонитрил (69% э.и.) и получающуюся в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток переносили в этилацетат (25 мл) и промывали водой (3x100 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила (0,81 г, 81%). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения соединения формулы I соон civ где СЗ имеет (^конфигурацию; R1 представляет собой водород, (С1-Сб)алкил или фенил; и R2 представляет собой (С1-С8)алкил, (С2-С8)алкенил, (Сз-С8)циклоалкил, -0(Ci-С6)алкил, -СН2-СН2-0-(С1-Сб)алкил, (С1-С6)алкил-ОН, -фенил-(С1-Сб)алкил-ОН, -фенил-0-(С1-Сб)алкил, фенил или замещенный фенил; 2 1 при условии, что когда R представляет собой метил, тогда R представляет собой водород, (С1-Сб)алкил или фенил; включающий стадии: (а) приведения соединения формулы II в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью; и (б) выделения (3iS)-H30Mepa соединения формулы I из реакционной среды и возможно выделения неизмененного (ЗЛ)-изомера соединения формулы П. 2. Способ по п. 1, где указанный выделенный неизмененный (ЗЛ)-изомер соединения формулы II со стадии (б) рацемизируют в рацемат соединения формулы II путем нагревания этого (ЗЛ)-изомера с основанием в присутствии органического растворителя. 3. Способ по п. 2, где стадию (а) повторяют с использованием рацемата, рацемизованного из выделенного неизмененного (ЗЛ)-изомера со стадии (б). -2- 4. Способ по п. 1, где указанный ферментный катализатор выбран из группы, состоящей из NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазы из Arabidopsis thaliana. 5. Способ по п. 1, где указанная реакционная среда состоит из дистиллированной воды или воды, забуференной до рН в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0. 6. Способ по п. 1 где соединение формулы I представляет собой (S)-3-циано-5-метилгексановую кислоту, соединение формулы II представляет собой рацемический 2-изобутил-сукцинонитрил, а выделенный неизмененный изомер со стадии (б) представляет собой (Я)-2-изобутилсукцинонитрил. 7. Способ по п. 6, где указанный выделенный неизмененный (R)-2-изобутилсукцинонитрил со стадии (б) рацемизируют в рацемический 2-изобутил-сукцинонитрил путем нагревания с основанием в растворителе. 8. Способ по п. 7, где стадию (а) повторяют с использованием рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила, рацемизированного из выделенного неизмененного (Я)-2-изобутил-сукцинонитрила со стадии (б). 9. Способ получения (5)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина), включающий стадии: (а) приведения 2-изобутил-сукцинонитрила в реакционной среде в контакт с ферментным катализатором, обладающим нитрилазной активностью; (б) выделения (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты из реакционной среды; (в) превращения (5)-3-циано-5-метилгексановой кислоты в соль кислоты; и (г) гидрирования этой соли кислоты с образованием (|У)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (прегабалина). 10. Способ по п. 9, где неизмененную (/?)-3-циано-5-метилгексановую кислоту выделяют из реакционной среды со стадии (а). 11. Способ по п. 9, где указанную неизмененную (Д)-3-циано-5-метилгексановую кислоту со стадии (а) рацемизируют путем нагревания с основанием в присутствии органического растворителя с образованием рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила и стадию (а) повторяют с использованием указанного рацемического 2-изобутил-сукцинонитрила. 12. Способ по п. 9, где указанный ферментный катализатор представляет собой нитрилазу в форме целых микробных клеток, пермеабилизованных микробных -3- клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов, очищенных ферментов или ферментного катализатора, иммобилизованного на подложке. 13. Способ по п. 9, где указанный ферментный катализатор выбран из группы, состоящей из NIT-101, NIT-102, NIT-103 и нитрилазы из Arabidopsis thaliana. 
|