Иммуносорбенты, наборы и композиции для диагностики расстройства центральной нервной системы, в частности пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии, включающиt измерение концентрации GluR1 или его фрагмента и/или антител против GluR1 в биологическом образце, полученном у человека. Способ особенно полезен для идентификации индивидуумов, у которых имеется риск связанных с мозгом припадков и эпилепсии, для дифференцировки эпилепсии от псевдоэпилепсии и подобных эпилепсии расстройств, для наблюдения после противосудорожного лечения и для подбора адекватного лечения и доз.

 

(57) Реферат / Формула:
наборы и композиции для диагностики расстройства центральной нервной системы, в частности пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии, включающиt измерение концентрации GluR1 или его фрагмента и/или антител против GluR1 в биологическом образце, полученном у человека. Способ особенно полезен для идентификации индивидуумов, у которых имеется риск связанных с мозгом припадков и эпилепсии, для дифференцировки эпилепсии от псевдоэпилепсии и подобных эпилепсии расстройств, для наблюдения после противосудорожного лечения и для подбора адекватного лечения и доз.

 

---

2420-137446ЕА/061
ИММУНОСОРБЕНТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПАРОКСИЗМАЛЬНЫХ
ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ РАЗРЯДОВ
Описание Связь с предыдущими заявками
Эта заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 60/517617, поданной 6 ноября 2003 г. Область изобретения
Настоящее изобретение относится к клиническим диагностическим тестам in vitro, в частности, иммунным и белковым тестам, для диагностики и оценки риска, связанного с нервными и психическими заболеваниями. Тесты выявляют специфические мозговые маркеры нейротоксичности, оценивают токсикологическое и неврологическое повреждение мозга и помогают в диагностике, терапии и борьбе с мозговыми расстройствами.
Описание предшествующего уровня техники
Эпилепсия представляет собой заболевание, характеризуемое эпилептическими припадками, в целом определяемыми как припадки, вызванные кратковременным прерыванием мозговой функции, включая временную патологическую электрическую активность в нервных клетках. Локализация этого прерывания в мозге определяет тип припадка. Эпилепсию, хотя она так часто приводит к потере сознания, следует отличать от обморока, при котором потеря сознания происходит вследствие преходящего нарушения церебрального кровотока.
Двумя основными типами эпилептических припадков являются частичные и генерализованные. Частичные припадки вовлекают часть мозга, тогда как генерализованные припадки вовлекают весь мозг. Частичные припадки могут стать генерализованными припадками, если эпилептическая активность распространяется на весь мозг.
Многие люди рождаются с эпилепсией. В других случаях эпилепсия развивается в результате повреждения мозга вследствие других расстройств. Например, опухоли мозга, травма головы, алкоголизм и болезнь Альцгеймера часто ведут к эпилепсии,
потому что они изменяют нормальные функции мозга. Инсульты, сердечные приступы и другие состояния, которые лишают мозг кислорода, также могут в некоторых случаях вызвать эпилепсию. Примерно 32% всех вновь развившихся случаев эпилепсии у пожилых людей оказываются связанными с цереброваскулярными заболеваниями. Менингит, СПИД, вирусный энцефалит и другие инфекционные заболевания могут вести к эпилепсии, как и гидроцефалия - состояние, при котором в мозге накапливается избыточная жидкость.
Эпилептиформная активность обычно начинается in vivo избыточной активацией АМРА-рецепторов; по мере интенсификации припадочной активности наблюдается возрастающее вовлечение NMDA-рецепторов (Dingledine, McBain, Basic Neurochemistry. Philadelphia, PA: Lippicott-Raven; 1998, 315-333). Избыточная активация NMDA- и АМРА-рецепторов обеспечивает возможность избыточного входящего тока Са2+ в клетки, приводящего к активации многих ферментов и протеаз, которые начинают разрушать компоненты клеточной мембраны. Это включает различные ферменты, активируемые Са2+, включая кальмодулин-зависимую протеинкиназу, кальцинейрин, кальпаин, PKS, фосфолипазу и ряд эндонуклеаз (Whetsell J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1996; 55: 113) .
Припадки в результате эпилепсии могут принимать разные формы. Генерализованные припадки включают в себя "тонические-клонические", "малые", "атонические" и "миотонические" припадки. Тонический-клонический припадок представляет собой классический и наиболее заметный тип припадка, связанного с эпилепсией, и он относится к припадку, при котором пациент теряет сознание, тело теряет гибкость, пациент падает, и у него начинаются движения в виде подергиваний. "Малые" припадки в целом характеризуются кратковременной потерей сознания; "атонические" припадки характеризуются внезапной потерей мышечного контроля, которая вызывает падение индивидуума на землю; и "миотонические" припадки характеризуются короткими, сильными подергиваниями всего тела или его части. Частичные припадки в целом классифицируются как "простые частичные"
(симптомы включают в себя подергивание; онемение; потливость; головокружение; тошноту; нарушение слуха, зрения, обоняния или вкуса; сильное ощущение Deja vu) или "сложные частичные" (индивидуум кажется отдающим отчет в своих действиях, тогда как на самом деле это не так). Часто трудно дифференцировать эти типы припадков в клинике, потому что припадок редко возникает в кабинете врача, и пациент обычно не помнит о припадке.
Один припадок или даже множество припадков не значат, что у индивидуума имеется эпилепсия. У многих маленьких детей бывают припадки, которые технически не вызваны эпилепсией, такие как судороги в результате лихорадки. Другие типы неэпилептических припадков вызваны дисбалансом биологических жидкостей или химических веществ, дородовым поражением мозга или связаны с другими патологическими состояниями, такими как сердечные заболевания и сахарный диабет. Эти неэпилептические припадки часто именуются "псевдоэпилепсией". Их часто трудно отличить от эпилептических припадков ввиду множества форм, которые может принимать припадок. Припадки могут быть часто вызваны состоянием, известным как расстройство в виде неэпилептического приступа ("NEAD"). Припадки, возникающие при этом состоянии, являются психогенными по природе и не имеют физического происхождения.
Существует ряд различных процедур, включая
электроэнцефалографию (ЭЭГ) и сканирование мозга (т.е. компьютерную томографию), для определения того, страдает ли индивидуум эпилепсией, и если да, то каким именно видом эпилепсии он страдает. Даже с помощью этих прогрессивных методов часто очень трудно провести дифференцировку между эпилепсией и неэпилепсией, или провести дифференцировку между различными типами эпилептических припадков. У индивидуумов, страдающих псевдоэпилепсией, часто диагностируется эпилепсия на основании ЭЭГ-исследования и пароксизмальных разрядов, наблюдаемых у этих пациентов во время периода исследования. Среди пациентов с припадками, которые проявляют патологические пароксизмальные разряды во время исследования, необходим способ дифференцировки между эпилепсией и неэпилепсией.
До настоящего времени имелась неудовлетворенная диагностическая потребность в диагностическом тесте in vitro для дифференцировки между эпилепсией и неэпилепсией. Имелась также неудовлетворенная диагностическая потребность в оценке риска развития эпилепсии у индивидуума и в улучшенном нацеливании, мониторинге и подборе схем лечения, таких как противосудорожная медикаментозная терапия и нейрохирургия, которые направлены против эпилепсии.
Цели изобретения
Поэтому целью изобретения является обеспечение возможности клинического применения исследования крови, основанного на иммуносорбентных и иммунохимических способах, и наборах, для диагностики расстройств центральной нервной системы, таких как пароксизмальные церебральные разряды и эпилепсия.
Другой целью согласно изобретению является повышение точности имеющихся в настоящее время способов диагностики пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии и повышение диагностической определенности связанных с мозгом припадков для исключения неэпилептических припадков.
Еще одной целью является предоставление анализов для выявления свободных фрагментов пептида GluRl в биологических образцах, не связанных в иммуноглобулиновых комплексах.
Еще одной целью согласно изобретению является предоставление способов диагностики пароксизмальных
церебральных разрядов и эпилепсии с использованием мозговых маркеров, которые обеспечивают дифференцировку между эпилепсией и псевдоэпилепсией.
Еще одной целью изобретения является предоставление иммуноанализов и иммунохимических анализов крови для определения риска и прогрессирования пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии или припадков в результате повреждения мозга.
Другой целью согласно изобретению является предоставление быстрых иммуноанализов и наборов для диагностики пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии, предоставление оценок в реальном времени связанных с мозгом
припадков, что обеспечивает возможность эффективного терапевтического вмешательства.
Другой целью согласно изобретению является предоставление быстрых и недорогих иммуноанализов и наборов для диагностики пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии, которые можно выполнять через частые интервалы для мониторинга прогрессирования связанных с мозгом припадков или эффективности противосудорожной терапии.
Краткое описание сущности изобретения
Были открыты способы установления природы и причины припадков у пациентов, проявляющих патологические пароксизмальные разряды, которые основаны на присутствии и количестве пептидов GluRl и их фрагментов в биологических жидкостях индивидуумов, которые испытали припадки. До настоящего времени ЭЭГ-измерения пароксизмальных разрядов в сочетании с клиническими оценками пациентов составляли "золотой стандарт" для оценки природы припадков у индивидуумов. Ввиду установленной связи между пароксизмальными разрядами и эпилепсией, у пациентов с патологическими пароксизмальными пиковыми потенциалами обычно (и часто ошибочно) ставится диагноз эпилепсии, и им часто назначают противосудорожную медикаментозную терапию или даже без необходимости оперируют, тогда как в действительности природа припадка не является пароксизмальной.
Авторы разработали способы, композиции и наборы на основе GluRl для определения того, является ли патологическая пароксизмальная активность действительно причиной припадка, и для более точной диагностики и лечения пациентов, которые испытывают припадки, не имеющие пароксизмальных причин, несмотря на существование патологических пароксизмальных разрядов, т.е. "псевдоэпилептические" состояния, такие как обмороки, мигрень, потеря сознания или амнезия и лихорадочные или температурные припадки (у детей). Поэтому в первом варианте осуществления изобретение предоставляет способ определения природы припадков у пациентов, которым поставлен диагноз пароксизмальных разрядов, включающий в себя прямой или непрямой
анализ биологической жидкости указанных пациентов на предмет определения наличия и количества GluRl или его иммуногенного фрагмента.
Авторы открыли также усовершенствованные способы лечения припадочных расстройств, которые возникают из патологических пароксизмальных пиковых разрядов. В частности, авторы определили, что тип, дозу и частоту медикаментозной терапии можно подобрать на основании изменений GluRl (или их отсутствия), наблюдавшихся у пациентов, получавших лечение данной медикаментозной терапией. Авторы также открыли способы оценки рекомендуемого снижения дозы или прекращения приема противосудорожного лекарственного средства на основании изменений GluRl, наблюдающихся, когда снижается доза или прекращается прием указанного лекарственного средства. В то время как дозировка лекарственного средства традиционно подбиралась методом проб и ошибок на основании того, страдает ли индивидуум от припадков и проявляет патологическую ЭЭГ-активность после изменения медикаментозной терапии, настоящее изобретение предоставляет тест in vitro для измерения реакции на подбор лекарственной терапии и для оценки риска припадков в результате подбора медикаментозной терапии. Поэтому в другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ лечения эпилепсии у пациента, включающий в себя (а) прямой или непрямой анализ биологической жидкости у указанного пациента для выяснения изменений количества GluRl в биологической жидкости или его фрагмента, или аналога в ответ на лечение первоначальной дозой противоэпилептического лекарственного средства или прекращения его приема, или снижения дозы противоэпилептического лекарственного средства; и (Ь) изменение или поддержание указанной дозы на основании указанных изменений.
Авторы, кроме того, открыли способы прогноза риска будущих припадков, имеющих в своей основе пароксизмальные разряды. Эти способы особенно пригодны для пациентов с высоким риском таких припадков, таких как новорожденные, индивидуумы, которые перенесли травматическое повреждение мозга, и индивидуумы,
страдающие эпилепсией височной доли, которые могут сильно страдать при наступлении припадков, но у которых противосудорожную терапии обычно проводят с осторожностью ввиду рисков, связанных с такой терапией. Новорожденные с врожденными пороками, такими как врожденный порок сердца, особенно нуждаются в мониторинге в соответствии со способами согласно изобретению, потому что состояние этих пациентов часто нельзя оценить с использованием ЭЭГ, и потому что, как известно, операции на сердце в грудном возрасте вызывают поражение мозга, проявляющееся в виде припадков, задержки развития и двигательных аномалий (Bellinger et al., Circulation 1999, 100: 526-32). Пациенты с инсультом представляют собой другую особенно подходящую группу риска, т.к. известно, что цереброваскулярные заболевания являются основной причиной обычной эпилепсии в пожилом возрасте (Cleary et al., Lancet 2004, 363:1184-6). Таким образом, в другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ диагностики вероятности эпилепсии у пациентов с риском эпилепсии, включающий в себя прямой или непрямой анализ биологической жидкости у указанного пациента для выяснения наличия и количества GluRl или его фрагмента.
Эти способы конкретнее всего проводятся в иммуноанализах с использованием специфических последовательностей GluRl и антител, выработанных против этих последовательностей. Таким образом, в другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ диагностики и/или лечения эпилепсии или пароксизмальных разрядов у человека, включающий прямой или непрямой анализ биологической жидкости от указанного пациента для выяснения наличия и количества GluRl SEQ ID NO: 5 или 6 (как описано ниже) или иммуногенного фрагмента или его гомолога. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет композиции, наборы, реагенты, калибраторы и стандарты на основе указанных пептидных последовательностей и антител против них.
Дополнительные преимущества изобретения будут частично изложены в следующем описании, а частично будут очевидны из
описания, или о них можно узнать путем реализации изобретения. Преимущества изобретения станут понятными и смогут быть достигнуты посредством элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения. Следует также понимать, что и предшествующее общее описание, и следующее подробное описание являются лишь иллюстративными и поясняющими и не ограничивают заявленное изобретение. Обсуждение
Настоящее изобретение можно легче понять, обращаясь к следующему подробному описанию предпочтительных вариантов осуществления изобретения и включенным в него примерам. Перед раскрытием и описанием настоящих способов и методик следует понимать, что это изобретение не ограничивается определенными способами анализа или синтеза, поскольку они могут, конечно, варьировать. Следует также понимать, что применяемая здесь терминология используется только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
Определения и использование терминов
Биологический образец представляет собой кровь, плазму крови, спинномозговую жидкость, слюну, пот или мозговую ткань. Предпочтительнее, если биологический образец представляет собой биологическую жидкость. Биологическая жидкость представляет собой сыворотку и плазму крови.
Аналог белка, пептид или полипептид означает белок, пептид или полипептид, который содержит одно или несколько замен, делеций, добавлений или перестроек аминокислот. Например, в области биохимии белков хорошо известно, что аминокислота, относящаяся к группе аминокислот, имеющих определенный размер или характеристику (такую как заряд, гидрофобность и гидрофильность), может часто быть замещена другой аминокислотой без изменения активности белка, в частности, в областях белка, которые непосредственно не связаны с биологической активностью. Так, аналог рецептора GluRl или его фрагмент можно использовать в настоящем изобретения, если он включает замены, делеций, добавления или перестройки аминокислот в таких сайтах, что антитела, выработанные против аналога, все же специфичны против
АМРА-рецептора или его фрагмента.
Предпочтительно, когда рекомбинантный аналог GluRl имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% аминокислотную идентичность с природно встречающимся АМРА-рецептором. Аминокислотная идентичность определяется сравнением аналогов между рекомбинантным аналогом и природно встречающимся АМРА-рецептором. Эти 2 аминокислотные последовательности совмещены таким образом, который максимализирует количество общих аминокислот по длине их последовательностей; при получении совмещения допускается наличие гэпов в каждой или обеих последовательностях для максимализации количества общих аминокислот. Процентная степень идентичности аминокислот соответствует той из двух следующих величин, которая выше: (1) количество аминокислот, которые являются общими у этих 2 полипептидов при их выравнивании, деленное на количество аминокислот в аналоге GluRl или его фрагменте, умноженное на 100, или (2) количество аминокислот, которые являются общими у этих 2 полипептидов при их выравнивании, деленное на количество аминокислот в природно встречающемся АМРА-рецепторе или его фрагменте, умноженное на 100.
Производные GluRl и производные фрагментов GluRl также можно использовать в настоящем изобретении, и они включают природно встречающийся АМРА-рецептор и аналоги АМРА-рецептора и их фрагменты, которые химически или ферментативно дериватизированы у одной или нескольких составляющих аминокислот, включая модификации боковой цепи, модификации каркаса и N- и С-концевые модификации, например, адетилированием, гидроксилированием, метилированием,
амидированием, фосфорилированием или гликозилированием. Термин также включает в себя соли GluRl, такие как цинк-GluRl и аммоний-GluRl.
Содержание белка или пептида измеряется "прямо" в том смысле, что содержание самого белка или пептида измеряется в биологическом образце, в отличие от некоторого другого косвенного показателя наличия белка или пептида, такого как антигенные фрагменты, аналоги или производные белка или
пептида, или антитела против белка или пептида.
"Антиген" представляет собой белок или пептид, который вызывает иммунный ответ.
Термин "антитело" является синонимом "иммуноглобулина" и включает в себя природно встречающиеся человеческие антитела, поликлональные антитела и моноклональные антитела. Термин "антитело" предназначен для включения и нативного антитела, и биологически активных, и синтетических производных антител, таких, например, как Fab', F(ab')г или Fv, а также антител с одним доменом и с одной цепью. Биологически активное производное антитела сохраняет способность связывать антиген.
Термин "иммуноанализ" представляет собой лабораторный подход к прямому или непрямому выявлению белка или пептида в биологической жидкости использованием иммунологической реакции между антигеном и антителом.
Термин "калибратор" используется здесь в отношении иммуноанализов, в которых измеряют антитела против GluRl, относится к раствору антител против GluRl, содержащему известное количество антител против GluRl, и используемым для построения калибровочной кривой для количественного анализа концентрации антител в неизвестной биологической жидкости.
Термин "стандартный" используется здесь в отношении иммуноанализов, в которых измеряют антитела против GluRl, и относится к раствору антител против GluRl, выделенных и очищенных из биологических жидкостей человека в подходящей количественной форме, для контроля качества реагентов, содержащихся в наборе для иммуноанализа в соответствии с настоящим изобретением.
Термин "отрицательный контроль", используемый здесь в отношении иммуноанализов, в которых измеряют пептиды GluRl или их фрагменты непосредственно в биологических жидкостях, относится к синтетическому пептиду GluRl или его фрагменту в подходящем количестве, предназначенном для использования в качестве индикатора концентрации GluRl в биологических жидкостях от здоровых индивидуумов.
Термин "положительный контроль", используемый здесь в
отношении иммуноанализов, в которых измеряют пептиды GluRl или их фрагменты непосредственно в биологических жидкостях, относится к синтетическому пептиду GluRl или его фрагменту в подходящей количественной форме, предназначенной для использования в качестве индикатора концентрации GluRl в биологических жидкостях от индивидуумов, страдающих эпилептическими пароксизмальными разрядами. Общее обсуждение
Настоящее изобретение связано с осознанием того, что генетическое или случайное увеличение экспрессии АМРА-рецепторов или GluRl в мозге может коррелировать с пароксизмальными церебральными разрядами для диагностики припадков, связанных с мозгом, припадков, не связанных с мозгом, и припадков, связанных с психогенными факторами, а также для дифференцировки между припадками, связанными с мозгом, которые возникают в результате пароксизмальных разрядов, и припадками, которые не связаны с ними. Рекомбинантные рецепторы GluRl, которые аномально экспрессированы в мозге, быстро метаболизируются, и после проникновения через гематоэнцефалический барьер эти продукты метаболического распада попадают в систему кровообращения. Иммунная система распознает эти пептиды и белковые фрагменты в качестве инородных антигенов и реагирует на них генерированием антител. Быстрая оценка этих мозговых биологических маркеров у индивидуумов значительно повысит уверенность врачей при диагностике пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии и значительно улучшит диагностическую определенность связанных с мозгом припадков и наблюдение за противосудорожной терапией, которую можно назначить. Данные можно использовать независимо от других диагностических стратегий, но они предпочтительно формируют неотъемлемую часть всеобъемлющей диагностической стратегии, при которой используются обычные диагностические методики.
Данные, полученные по биологическим маркерам GluRl, особенно при сочетании с ЭЭГ или данными сканирования мозга, можно также использовать для мониторинга эффективности схемы
лечения. Неожиданно было обнаружено, что наличие пептида GluRl и антител против него являются доказательством нейротоксичности в реальном времени, и что снижение уровней циркулирующих пептидов GluRl или антител хорошо согласуется с ослаблением нейротоксических механизмов. Путем получения данных через соответствующие интервалы с использованием быстрых лабораторных методик, таких как агглютинация на латексе или латеральный поток, можно контролировать развитие эпизода в ответ на схему противосудорожной терапии.
Методики иммуноанализа в целом предпочтительны для измерения белков или пептидов согласно изобретению, как подробнее обсуждено здесь, хотя, как известно специалистам в данной области, имеются также другие аналитические методики, такие как ВЭЖХ. Аминокислотные последовательности предпочтительных субъединиц GluRl и их антигенных фрагментов приведены в SEQ ID N0: 5 и б, и любой фрагмент, аналог или производное этих последовательностей можно использовать в способах прямого выявления рецепторов, пока сохраняется достаточная антигенность. Однако при использовании иммуноанализов было обнаружено, что антигенные детерминанты концентрируются в N-концевом домене рецепторных субъединиц GluRl, GluR2, GluR3, и GluR4, и что антитела, полученные против N-концевых доменов и их фрагментов, следует использовать для получения оптимальных результатов тестов. Авторы секвенировали аминокислотную цепь N-концевых доменов этих рецепторов и в конце этого документа представили последовательности, соответственно, в виде SEQ ID N0: 1, 2, 3 и 4.
Для получения антител можно использовать обычные способы. Например, с использованием пептида белка GluRl, используя стандартные способы, можно получить поликлональные антисыворотки или моноклональные антитела. Млекопитающее (например, мышь, хомяк или кролик) могут быть иммунизированы иммуногенной формой пептида (предпочтительно, рецептора GluRl, антигенной детерминанты рецептора GluRl или его аналога или производного), которая вызывает реакцию образования антител у млекопитающего. Методики придания иммуногенности пептиду
включают в себя сопряженное связывание с носителями или другие методики, хорошо известные в данной области. Например, пептид можно вводить в присутствии адъюванта. Развитие иммунизации можно контролировать выявлением титров антител в плазме и сыворотке. Стандартный метод ELISA или другие процедуры иммуноанализа можно использовать с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней антител. После иммунизации можно вводить антитсыворотки и, при желании, поликлональные антитела, выделенные из сывороток.
Для продукции моноклональных антител клетки, продуцирующие антитела (лимфоциты), можно получить у иммунизированного животного и гибридизировать их с клетками миеломы стандартными процедурами гибридизации соматических клеток, иммортализуя таким образом эти клетки и получая клетки гибридомы. Такие методики хорошо известны в данной области (например, методика гибридомы, первоначально разработанная Kohler и Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)), а также методики, такие как методика гибридомы человеческих В-клеток (Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)), методика гибридомы EBV для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al. Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96) и скрининг комбинационных библиотек антител (Huse et al., Science 246, 1275 (1989)]. Скрининг клеток гибридомы можно проводить иммунохимически для снижения уровня антител, специфически реагирующих с пептидом, и можно выделить моноклональные антитела. Поэтому изобретение также предусматривает клетки гибридомы, секретирующие антитела, со специфичностью в отношении белков GluRl или их фрагментов, как описано в настоящем описании.
Биологический образец, испытанный на наличие рецептора или фрагмента, можно получить из крови, мочи, плазмы крови, сыворотки крови, спинномозговой жидкости, слюны, пота или мозговой ткани. В предпочтительном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови. В еще более предпочтительном варианте осуществления биологический образец представляет собой образец крови, разведенный до
соотношения примерно от 1:2 примерно до 1:32 (об.:об.).
Изобретение также относится к непрямым способам измерения пептида рекомбинантного GluRl (GluRl) или его фрагмента. Таким образом, аналитические методики можно использовать для оценки непрямых показателей пептида GluRl или его фрагментов, таких как антитела, специфичные в отношении рекомбинантного пептида, или кДНК, которая кодирует этот пептид. В одном варианте осуществления пептид и антитела против GluRl одновременно измеряют для получения степени вероятности начала припадка. Концентрации GluRl выше чем 50 или 100 пкг/мл (выше 50 пкг/мл у младенцев), особенно в сочетании с концентрацией антител против GluRl выше чем 1,5 нг/мл для мужчин, 1,8 нг/мл для женщин, 1,0 нг/мл для детей, имеют высокую прогностическую ценность в отношении возникновения пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии и обычно оправдывают противосудоружную терапию, особенно когда они наблюдаются у пациентов, у которых имеются пароксизмальные пиковые потенциалы, по данным измерения ЭЭГ.
Предложенный анализ крови, основанный на иммуносорбентных антителах против GluRl, в течение 7 последних лет был испытан на образцах сыворотки крови более чем 2300 пациентов, у которых был поставлен следующий диагноз: эпилепсия (1650), пароксизмальная активность мозга, включая острый ишемический инсульт (187), паркинсонизм (148), шизофрению (маниакально-депрессивный психоз, циклотимию) (147), болезнь Альцгеймера (44), лекарственную зависимость (морфин, кокаин, гашиш) (117), а также у 2150 здоровых лиц, включая перекрестные анализы.
Способы лечения
Диагностические способы согласно изобретению особенно полезны при использовании в сочетании со схемами лечения, которые направлены против эпилептических припадков. Способы можно использовать в начале противосудорожной терапии, уменьшении или прекращении терапии или рассмотрении нейрохирургии. Способы предпочтительно выполняются в сочетании с дополнительными диагностическими способами, такими как ЭЭГ.
Так, например, неизлечимую эпилепсию, при которой оправдано нейрохирургическое вмешательство, можно
диагностировать, используя сочетание ЭЭГ и мониторинга GluRl. Нейрохирургия может быть оправдана, например, при наличии пароксизмальных пиковых потенциалов и аномально высоких профилей концентраций GluRl или его фрагментов, которые не реагируют на одну или несколько схем противосудорожной терапии.
Необходимость в изменении противосудорожных лекарственных средств или в увеличении дозы назначенной медикаментозной терапии можно аналогичным образом оценить на основании способности данной схемы медикаментозной терапии снижать уровни GluRl или снижать эти уровни ниже установленного стандарта, на основании популяционных норм. Предпочтительный установленный стандарт составляет 100, 75 или 50 пкг/мл фрагмента GluRl и/или 2,0, 1,8, 1,5 или 1,0 нг/мл антитела против GluRl для взрослых и 75, 50 или 35 пкг/мл фрагмента GluRl и/или 1,5, 1,0 или 0,8 нг/мл антитела против GluRl для детей.
В еще одном варианте осуществления способы согласно изобретению практикуются в сочетании с отменой или уменьшением дозы противосудорожной терапии. Уровни GluRl контролируются при отмене или уменьшении, и указанная терапия возобновляется, если уровни GluRl увеличиваются, или если они увеличиваются выше указанных выше установленных стандартов.
Новые наборы согласно изобретению
В другом варианте осуществления изобретение связано с наборами для диагностики расстройств центральной нервной системы, таких как пароксизмальные церебральные разряды и эпилепсия. Антитела или антигены рекомбинантного GluRl могут быть включены в диагностические наборы для иммуноанализа, в зависимости от того, измеряется ли уровень антител или GluRl. Набор может включать в себя композицию, содержащую препарат антигена или антитела. И препарат антитела, и препарат антигена должны предпочтительно предоставляться в подходящей количественной форме, с концентрациями антигена и/или антитела, так, чтобы можно было легко и быстро получить ориентировочный результат при количественных определениях.
Наборы могут также включать в себя реагент иммунологического выявления или метку для выявления
специфической иммунологической реакции между возможно предоставленным антигеном и/или антителом и диагностическим образцом. Подходящие реагенты для выявления хорошо известны в данной области, как проиллюстрировано радиоактивными, ферментными или другими хромогенными агентами, которые обычно используются в связи с антигеном и/или антителом или в связи со вторым антителом, обладающим специфичностью в отношении первого антитела. Таким образом, реакция выявляется или количественно характеризуется посредством выявления или количественного анализа метки. Реагенты и способы иммунологического выявления, подходящие для применения в связи с новыми способами согласно изобретению, в целом хорошо известны в данной области.
Реагенты могут также включать вспомогательные агенты, такие как агенты, придающие буферные свойства, и агенты, стабилизирующие белок, например, полисахариды и пр. Диагностический набор может, кроме того, включать в себя, при необходимости, агенты для снижения фоновых помех в тесте, агенты для увеличения сигнала, устройство для проведения теста, калибровочные кривые и диаграммы, кривые и диаграммы стандартизации и пр.
В более конкретном аспекте, изобретение относится к иммуносорбенту, содержащему антитела против GluRl или синтетического пептида GluRl или формат агглютинации на латексе. Так, в одном варианте осуществления набор содержит титровальный микропланшет, содержащий GluRl или его фрагменты или антитела против GluRl, и человеческий или синтетический калибратор. Реагенты могут также включать в себя вспомогательные агенты, такие как агенты, придающие буферные свойства, и агенты, стабилизирующие белок, например, полисахариды и пр. Диагностический набор может, кроме того, включать в себя, при необходимости, другие элементы продуцирующего сигналы устройства, членом которого является выявляемая группа (например, ферментные или неферментные субстраты), агенты для уменьшения фоновых помех при тесте, агенты для увеличения сигнала, устройство для проведения теста, калибровочная и стандартизирующая информация или инструкции и
им подобные.
Калибровка обычно осуществляется построением стандартной кривой по измерению образцов известной величины. Образцы с известными уровнями анализируемого вещества затем измеряют и сравнивают со стандартной кривой, используя математически выведенные связи. Стандартную кривую можно определить перед анализом взятых образцов или одновременно с ним, в зависимости от стабильности и воспроизводимости анализа. В одном варианте осуществления изобретение реализуется набором, включающим в себя в качестве калибратора или контроля, антитела, выработанные против фрагмента GluRl с последовательностью SEQ ID N0:5 или 6 или его иммуногенного фрагмента, гомолога или производного. В еще одном варианте осуществления набор изготовлен для сравнения со стандартом антитела, включающим в себя специфическую фракцию иммуноглобулина G, очищенного из крови человека, необязательно иммуноглобулин 95% чистоты, который специфически связывает пептид GluRl без значительного перекрестного взаимодействия с другими фрагментами рецепторов глутамата или другими нейрорецепторами (например, Dl, D2, D3, NMDAR, опиат и т.д.).
Агглютинация на латексе
Была также разработана методика агглютинации на латексе или формат латерального потока, который резко увеличивает скорость диагностики, полученную способами согласно изобретению, и, посредством этого, улучшает качество диагностики. Анализы агглютинации на латексе были описаны в публикациях Beltz, G.A. et al., в Molecular Probes: Techniques and Medical Applications, A. Albertini et al., eds., Raven Press, New York, 1989, включенных сюда в качестве ссылки. При анализе агглютинации на латексе антитело, выработанное против определенного биологического маркера, иммобилизуется на частицах латекса. Каплю частиц латекса добавляют к соответствующему подлежащему тестированию разведению серы и смешивают путем осторожного покачивания пластинки. При образцах с недостаточным уровнем биологических маркеров латексные частицы остаются в суспензии и сохраняют гладкий, молочный вид.
Однако если биологические маркеры, взаимодействующие с антителом, присутствуют, то латексные частицы группируются в визуально выявляемые агрегаты.
Анализ агглютинации можно также использовать для выявления биологических маркеров, где соответствующее антитело иммобилизуется на подходящей частице, отличной от латексных шариков, например, на желатине, эритроцитах, нейлоне, липосомах, частицах золота и т.д. Присутствие антител в анализе вызывает агглютинацию, аналогичную таковой реакции
преципитации, которую можно затем выявить такими методиками как нефелометрия, выявление мутности, инфракрасная спектрометрия, визуальный осмотр, колориметрия и пр.
Термин "агглютинация на латексе" используется здесь в целом для обозначения любого способа, основанного на формировании выявляемой агглютинации, и не ограничивается использованием латекса в качестве иммуносорбентного субстрата. Хотя предпочтительные субстраты для агглютинации основаны на латексе, такие как полистирол и полипропилен, в частности, полистирол, другие хорошо известные субстраты включают в себя шарики, образованные из стекла, бумаги, декстрана и нейлона. Иммобилизованные антитела могут быть ковалентно, ионно или физически связаны с твердофазным иммуносорбентом такими методами как ковалентное связывание через амидную или сложноэфирную связь, притяжение ионов или адсорбцию. Специалистам в данной области известны многие другие подходящие носители для связывания антител или, они могут определить их, используя обычное экспериментирование.
Методика может быть приспособлена для использования при выявлении рецепторов GluRl, антител или любого другого подходящего биологического маркера против расстройств центральной нервной системы. Используя методику агглютинации на латексе, можно обеспечить биохимическую диагностику и мониторинг в реальном времени пациентов с эпилепсией (в пределах примерно 10 мин) и, посредством этого, резко улучшить поддерживающее противосудорожное лечение. Это неожиданно, потому что такие биологические маркеры являются встречающимися
в природе, и, в отличие от вирусов, для которых способы агглютинации на латексе были первоначально разработаны, проявляют гораздо меньшую прочность ассоциации со своими соответствующими антителами.
Таким образом, в одном варианте осуществления способ измерения рецептора GluRl, его фрагмента или другого биологического маркера производят путем агглютинации на латексе, включающим в себя: (i) обеспечение контакта биологического образца с агглютинирующим носителем, который включает в себя антитело против GluRl или антигенной детерминанты GluRl, в течение достаточного периода и в условиях, содействующих агглютинации; и (ii) считывание сигнала, генерированного в результате агглютинации; причем количество выявленного сигнала коррелирует с титром биологических маркеров, присутствующих в образце.
Реакция предпочтительно считывается макроскопически на темно фоне в течение достаточного периода времени. Способ предпочтительно дает клинически полезное показание в пределах примерно 30 мин или менее. Было экспериментально обнаружено, что латексные шарики, имеющие средний диаметр от примерно 0,25 до примерно 0,4 мкм, особенно предпочтительны при реализации согласно изобретению. Латексные шарики можно изготовить в целом добавлением антител к целевому биологическому маркеру в растворе-носителе, который содержит 1% концентрацию (по массе) латексных шариков, до тех пор, пока концентрация антител в растворе носителя не достигнет примерно 2 мг/мл, и предоставлением ингредиентам достаточного времени для ковалентного связывания, обычно примерно 1 ч, в присутствии связующего агента, такого как глутаральдегид.
В другом варианте осуществления изобретение связано с набором для агглютинации на латексе, который включает в себя (1) латексные шарики, которые содержат GluRl или его фрагменты или антитела против GluRl, а также (2) положительные и отрицательные контроли.
Новые композиции согласно изобретению
Способы согласно изобретению основаны на ряде новых
композиций, которые сами по себе являются частью изобретения. Так, в одной серии вариантов осуществления изобретение связано с рекомбинантным полипептидным фрагментом субъединиц GluRl, GluR12, GluR3 и GluR4 АМРА-рецептора, включающий в себя
1. N-концевой домен GluRl, SEQ ID NO: 1;
2. N-концевой домен GluR2, SEQ ID NO: 2;
3. N-концевой домен GluR3, SEQ ID NO: 3;
4. N-концевой домен GluR4, SEQ ID NO: 4;
5. Рекомбинантный GluRl, SEQ ID NO: 5 и 6,
или их антигенный фрагмент, аналог или производное. В другой серии вариантов осуществления изобретение связано с любым из предыдущих полипептидов, ковалентно связанных с определенной антигенной детерминантой, такой как человеческий сывороточный альбумин. В еще одной серии вариантов осуществления изобретение связано с любым из предыдущих полипептидов, связанных с любым из обсуждаемых выше иммуносорбентных материалов. Иммуносорбент может быть в форме шарика для агглютинации на латексе в обсуждаемых выше диапазонах размера, или в форме синтетической пластины для обычного иммунологического анализа. Полипептид может быть связан с имуносорбентом с использованием любого обычного средства связи, включая ковалентную связь, ионную связь и адсорбцию.
В другой серии вариантов осуществления настоящее изобретение относится к новым моноклональным и поликлональным антителам, специфичным для и/или выработанным против указанных выше полипептидов, включая указанные выше полипептиды, связанные с определенными антигенными детерминантами. Так, в одном варианте осуществления изобретение связано с нечеловеческими антителами против любого из указанных выше пептидов или полипептидов или их фрагментов, аналогов или производных. В другом варианте осуществления изобретение связано с иммуносорбентами, с которыми связаны такие антитела. Краткое описание списка последовательностей Признаки, аспекты и преимущества согласно изобретению будут лучше понятны в сочетании со следующим списком
последовательностей, где указанная в последовательности нумерация положения аминокислот отражает нумерацию, используемую во всем настоящем документе.
В SEQ ID NO:l показана аминокислотная последовательность N-концевохю домена субъединицы рецептора GluRl следующим образом:
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
ПЕПТИД: Человеческий ионотропный рецептор глутамата, GluRl Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:7557-7561 (1991)
19 AN FPNNIQIGGL FPNQQSQEHA AFRFALSQLT
EPPKLLPQID 60
61IVMSDSFEM TYRFCSQFSK GVYAIFGFYE RRTVNMLTSF CGALHVCFTT PSFPVDTSNQ 120
121FVLQLRPELQ DALISBDHY KWQKFVYIYD ADRGLSVLQK VLDTAAEKNW QVTAVNILTT 180
181TEEGYRMLFQ DLEKKKERLV WDCESERLN AILGQEKLE KNGIGYHY3L ANLGFMDIDL 240
241NKFKESGANV TGFQLVNYTD TTPAKIMQQW KNSDARDHTR VDWKRPKYTS ALTYDGVKVM 300
301AEAFQSLRRQ RIDISRRGNA GDCLANPAVP WGQGIDIQRA LQQVREEGLT GNVQFNEKGR 360
361RTNYTLHVIE MKHDSIRKIG YWNEDDKFVP AATDAQAGGD NSSVQNRTYIVTTILEDPYV 420
421 MLKKNANQPE GNDRYEGYCV ELAAEIAKHV GYSYRLETVS DGKYGARDPD TKAWNGMVGE 480
481LVYGRADVAV APLTTTLVRE EVTOFSKPFM SLGISMIKK PQKSKPGVFS
FLDPLA
В SEQ ID NO:2 показана аминокислотная последовательность N-концевого домена субъединицы рецептора GluR2 следующим образом:
SEQ ID N0:2
ПЕПТИД: Человеческий ионотропный рецептор глутамата, GluR2 NeuroReport 5:441-444 (1994)
22 VSSNSIQIG GLFPRGADQE YSAFRVGMVQ
FSTSEFRLTP 60
61 ffiDNLEVANS FAVTNAFCSQ FSRGVYAIFG FYDKKSVNTT TSFCGTLHVS
FTTPSFPTDG 120
121THPFVIQMRP DLKGALLSLIEYYQWDKFAY LYDSDRGLST LQAVLDSAAE KKWQVTAINV 180
181 GNINNDKKDE MYRSLFQDLE LKKERRVILD CEKDKVNDIV DQVITIGKHV KGYHYHANL 240
241GFTDGDLLKIQFGGANVSGF QIVDYDDSLV SKFIERWSTL EEKEYPGAHT TTKYTSALT 300
301 YDAVQVMTEA FRNLRKQPJEISRRGNAGDC LANPAVPWGQ GVEIERALKQ VQVEGLSGNI 360
361KFDQNGKRIN YTFNIMELKT NGPRKIGYWS EVDKMVVTLT ELPSGNDTSG LE^TVVVTT 420
421ILESPYVMMK KNHEMLEGNE RYEGYCVDLA AEIAKHCGFK YKXTIVGDGK YGARDADTKI 480 481WNGM
В SEQ ID NO: 3 показана аминокислотная последовательность N-концевого домена субгьединицы рецептора GluR3 следующим образом:
SEQ ID N0:3
ПЕПТИД: Человеческий ионотропный рецептор глутамата, GluR3 Biochim. Biophys. Acta 1219:563-566 (1994)
29 GF PNTISIGGLF MRNTVQEHSA
FRFAVQLYNT 60
61NQNTTEKPFH LNYHVDHLDS SNSFSVTNAF CSQFSRGVYAIFGFYDQMSM NTLTSFCGAL 120
121HTSFVTPSFP TDADVQFVIQ MRPALKGAIL SLLGHYKWEK FVYLYDTERG FSELQAMEA 180
181AVQNNWQVTA RSVGNIKDVQ EFRRHEEMD RRQEKRYLID CEVERINTIL EQWTLGKHS 240
241RGYHYMLANL GFTDDJLERV MHGGANTTGF QPVNNENPMV QQFIQRWVRL DEREFPEAKN 300
301APLKYTSALT HDAILVTAEA FRYLRRQRVD VSRRGSAGDC LANPAVPWSQ GIDIERALKM 360
361VQVQGMTGNI QroTYGRRTN YTIDVYEMKV SGSRKAGYWN EYERFVPFSD QQKNDSASS 420
421 ENRlTWrn LESPYVMYKK NHEQLEGNER YEGYCVDLAY FJAKHVTUKY KLSIVGDGKY 480
481GARDPETKIW NGMVGELVYG RADIAVAPLT TTLVREEVID FSKPLMSLGI SMKKPQKS 540
541KPGVFSFLDP LA
В SEQ ID NO: 4 показана аминокислотная последовательность N-концевого домена субъединицы рецептора GluR4 следующим образом:
SEQ ID N0:4
ПЕПТИД: Человеческий ионотропный рецептор глутамата, GluR4 Recept. Channels 3:21-31 (1995)
21 GAFPSSVQIG GLFIRNTDQE YTAFRLAIFL
HNTAPNASEA 60
61PFNLVPHVDNIETANSFAVT NAFCSQYSRG VFAIFGLYDK RSVHTLTSFC SALffiSUTP 120
121SFPTEGESQF VLQLRPSLRG ALLSLLDHYE WNCFVFLYDT DRGYSILQAI MEKAGQNGWH 180
181VSAICVENFN DVSYRQLLEE LDRRQEKKFVTDCEJERLQNILEQIVSVGK HVKGYHYIIA 240
241NLGFKDISLE RFIHGGANVT GFQLVDFNTP MVTKLMDRWK KLDQREYPGS ETPPKYTSAL 300
301TYDGVLVMAE TFRSLRRQKIDISRRGKSGD CLANPAAPWG QGIDMERTLK QVRIQGLTGN 360
361 VQroHYGRRV NYTMDVPELK STGPRKVGYW NDMDKLVLIQ DVPTLGNDTA AIENRTVWT 420
421TMESPYVMY KKNHEMFEGN DKYEGYCVDL ASEIAkHIGI KYKIAIVPDG KYGARDADTK 480
481IWNGMVGELV YGKAEIAIAP LTTTLVREEVIDFSKPFMSL GISMKKPQ KSKPGVFSFL 540
541DPLAYE
В SEQ ID N0:5 показана аминокислотная последовательность рекомбинантного GluRl следующим образом:
SEQ ID N0:5
ПЕПТИД: Рекомбинантный GluRl LANLGFMDroLNSGAVYGRAEIAGYCV
В SEQ ID NO: 6 показана аминокислотная последовательность рекомбинантного GluRl, другого такого пептида (27 аминокислот, полученных из последовательности GluRl и N-концевого Cys для присоединения к белку-носителю) следующим образом:
SEQ ID N0:6
ПЕПТИД: Искусственная последовательность
CN I^LGFMDroLNSGAVYGRAEIAGYCV ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Клиническая оценка при эпилепсии у детей Это рандомизированное и двойное слепое испытание проводили в 4 Детских эпилептических центрах в Москве и Санкт-Петербурге (Россия) с января 1995 г. по декабрь 1999 г. Хотя это исследование не является строго основанным на популяции, авторы включили в него индивидуумов для достижения размера группы, репрезентативной в отношении детей с эпилепсией в западной части страны.
Подлежащие включению в испытание пациенты были в возрасте от 4 мес до 14 лет, и у них был поставлен диагноз синдромов и припадков эпилепсии, которые классифицировались на основании всей информации, имеющейся при диагностике, и в соответствии с рекомендациями Международной лиги против эпилепсии (ILAE) четырьмя специалистами в области педиатрической эпилепсии. Они включают связанные с локализацией и генерализованные идиопатические синдромы (например, роландическая и детская малая эпилепсия) и криптогенные и симптоматические генерализованные синдромы. Симптоматические и криптогенные связанные с локализацией формы эпилепсии представляют широкий спектр синдромов, определенных причиной и локализацией, в той степени, в которой они известны. Исход у этой группы был
смешанным.
Этиологию классифицировали отдельно от синдрома, хотя она частично зависит от синдрома. Отделанная симптоматика относится к присутствию лежащего в основе неврологического состояния или поражений, связанных с повышенным риском эпилепсии (например, анамнезом бактериального менингита, инсульта, церебрального паралича). Идиопатическим синдромам почти всегда приписывают идиопатическую этиологию. Иногда неврологическая патология сосуществует с идиопатическим синдромом (например, детская малая эпилепсия с задержкой психического развития), и в этом случае этиологию классифицировали как отдаленную симптоматическую, несмотря на идиопатический синдром. Результаты нейровизуализационных исследований использовали при классификации этиологии. Криптогенная этиология относится к эпилепсии, которая не соответствует критериям идиопатического синдрома, и для которой нет идентифицированной значительной лежащей в основе неврологической аномалии или состояния. Такие индивидуумы представляются в остальном неврологически здоровыми.
Исходную частоту припадков определяли как отношение общего количества неспровоцированных припадков с момента диагностики эпилепсии, деленное на время между датами первого неспровоцированного припадка и формальной диагностики. Частоту припадков представляли как от 1 припадка/д до 1-2 приступов/г. Контрольные посещения и наблюдения для выявления уровней GluRl аАЬ относительно частоты припадков проводили по 7-й д и 6-й мес (необязательно).
Окончательный диагноз эпилепсии был основан на двух подтвержденных свидетелями и достаточно документированных начинающихся припадках или одном подтвержденном свидетелями и достаточно описанном припадке плюс или ЭЭГ-прослеживание или ЯМР/КТ-сканом с доказательством очаговой аномалии, согласующееся со связанной с локализацией эпилепсией.
Пациентов исключали из испытания по причине неэпилептических припадков (например, псевдоприпадков) или неизлечимой причины припадков; прогрессирующего или
дегенеративного расстройства; психиатрического или
поведенческого расстройства, требующего медикаментозной терапии, попытке суицида.
Детей с неэпилептическими неврологическими расстройствами и здоровые индивидуумы, представленные в подобранных по возрасту и полу группах, использовали в качестве контролей.
Испытание проводили в соответствии с международными правилами должной клинической практики. Перед началом связанных с испытанием процедур от родителей или законных опекунов пациентов получали письменное информированное согласие.
Для бивариантных сравнений использовали хи-квадрат и t критерии. Для нормализации высоко искаженного распределения при необходимости использовали логарифмические трансформации. Для некоторых непрерывных переменных величин строили категории для облегчения представления данных и тестирования допуска линейности.
В исследование всего было включено 605 детей (в возрасте от 4 мес до 14 лет, 302 девочки и 202 мальчика) . Исходный возраст в начале составил 1-2 г. Медиана периода наблюдения составила 1,0 г.
В этом клиническом исследовании концентрация GluRl в образцах крови здоровых детей и детей с неэпилептическими неврологичесикми расстройствами зависела от возраста и постоянно увеличивалась по мере того, как дети взрослели от новорожденных до подростков (фиг.1). Это, вероятно, вызвано развитием иммунной системы и увеличением уровня природно циркулирующих аутоантител во время созревания. Количество GluRl аАЬ значимо отличается у здоровых контролей и детей с неэпилептическими расстройствами (фиг.8). Сравнение средних величин GluRl аАЬ у независимых, подобранных по возрасту и полу групп показало, что величины аАЬ у здоровых детей и пациентов с другими неврологическими расстройствами относятся к одинаковому распределению со средней величиной 0,9-1,1 нг/мл.
Выявление концентрации GluRl аАЬ в образцах крови от пациентов с эпилепсией и эпилептическими синдромами показало, что независимо от возрастной группы, у всех детей были значимо
увеличенные количества GluRl аАЬ, по сравнению с количеством у контролей (фиг.9). Уровни аутоантител были выше у детей в возрасте от 4 мес до 3 лет, когда у большинства пациентов были неспровоцированные припадки и был поставлен диагноз эпилепсии или эпилептических синдромов. У педиатрических пациентов в возрасте 3-14 лет были выявлены сниженные уровни GluRl аАЬ, по сравнению с пациентами меньшего возраста (фиг.2).
Уровни GluRl аАЬ были значимо выше у пациентов с генерализованным типом припадков, по сравнению с частичными типами припадков (фиг.З). Значимая корреляция активности в виде пиковых потенциалов на ЭЭГ и концентраций GluRl аАЬ (коэффициент Spearman 0,89, р <0,01) была продемонстрирована во всех центрах исследования. Было установлено, что измерение GluRl аАЬ у детей имеет 2 потенциальных способа применения: 1) оценка риска эпилепсии и 2) содействие лучшей клинической диагностики у пациента с "подобными эпилепсии" симптомами. Эта посылка подтверждается высокой прогностической ценностью теста для распознавания индивидуумов с эпилепсией и эпилептическим синдромом (84% при отсечке 1,0 нг/мл).
Клинически заданная отсечка для GluRl аАЬ позволила заявителям дифференцировать пациентов в соответствии с частотой припадков. Мониторинг GluRl аАЬ у 41 пациента с эпилепсией в пределах 1 мес после поступления в стационар показал, что уровни GluRl аАЬ (2,6-2,7 нг/мл) при частоте припадков 1/д или 1/нед были выше чем уровни (2,2 нг/мл) при частоте припадков 1/мес. Тенденция сохранялась одинаковой у пациентов с эпилепсией и эпилептическими синдромами независимо от возраста и типа припадков.
Была установлена корреляция между GluRl аАЬ и данными, полученными компьютернотомографическими и ЯМР-сканами; полученные данные интерпретировали нейрорадиологи, которым слепым методом представляли результаты тестов у детей с неизлечимыми припадками, которым было назначено
нейрохирургическое лечение. Были выявлены максимальные концентрации GluRl аАЬ у пациента с локализацией эпилептического очага в правом полушарии (Iatsuk et al., Zh.
Nevropat. Psikhiat. Im. SS Korsakova. 1999, 99:34-6). Этиология заболевания воздействует на появление возросших уровней GluRl аАЬ: пренатальная травма (100% случаев), анамнез бактериального менингита (85,8% случаев) и опухоль (55,6% случаев).
Контрольное исследование (6 мес) противоэпилетической терапии, частоты припадков, изменений ЭЭГ и GluRl аАЬ у 19 детей со смешанным типом припадков привело к хорошей корреляции выявленных параметров. Улучшение состояния пациентов (снижение частоты или отсутствие припадков), сопровождающееся подавляющей регуляций GluRl до контрольного уровня, наблюдалось в 84% случаев. В этом исследовании корреляция данных ЭЭГ с величинами GluRl аАЬ составляла примерно 95%.
Пример 2 - Клиническая оценка эпилепсии у взрослых Двойное слепое испытание было проведено в отделении эпилепсии Института психиатрии и неврологии им. В.М.Бехтерева и отделении неврологии Российской Военно-медицинской Академии в Санкт-Петербурге (Россия) с февраля 1994 г. по декабрь 1997 г. Для участия в исследовании рассматривали 237 последовательных пациентов с эпилепсией в возрасте от 18 до 40 лет (130 женщин, 107 мужчин), поступивших в стационары указанных выше учреждений вследствие возросшей частоты припадков. Эпилепсию классифицировали в соответствии с рекомендациями ILAE, и следующие критерии включения учитывали в протоколе: длительность расстройства от 1 г до 20 лет; частота припадков от 1/д до 1/г; тип припадков: частичные простые, частичные множественные, генерализованные с малыми припадками, генерализованные тонические-клонические различной этиологии (например, с анамнезом бактериального менингита, инсульта, церебрального паралича, дородовой травмы и т.д.). Окончательный диагноз эпилепсии был основан на полно описанном анамнезе припадков плюс ЭЭГ или ЯМР/КТ сканы с доказательством очаговой патологии, согласующейся с эпилепсией, связанной с локализацией. Пациенты были исключены из испытания ввиду прогрессирующего или дегенеративного расстройства;
психиатрического или поведенческого расстройства, требующего медикаментозной терапии, попытки суицида.
Пациентов (n=193, 79 женщин, 114 мужчин) с неэпилептическими неврологическими расстройствами (травма мозга без припадков, боль в пояснице, арахноидит), неэпилептическими припадками (например, псевдоприпадками) и здоровых индивидуумов (п=93), представленных в группах, подобранных по возрасту и полу для пациентов с эпилепсией, использовали в качестве контролей.
Уровень GluRl аАЬ у здоровых пациентов, измеренный использованием теста PA-ELISA, составил 1,5+0,3 нг/мл, а у пациентов с неэпилептическими неврологическими расстройствами (NED) он составил 1,7+0,2 нг/мл (фиг.4). Сравнение средних величин GluRl аАЬ у независимых, подобранных по возрасту и полу групп, продемонстрировало, что величины аАЬ для контроля и пациентов с неэпилептическими неврологическими расстройствами относятся к одинаковому распределению. Положительные по GluRl аАЬ пациенты с эпилепсией имели среднюю концентрацию 3,02±0,4 нг/мл (диапзон 2,1-4,1). Различные контрольные величины GluRl аАЬ были также выявлены для женщин (1,8±0,1 нг/мл) и мужчин (1,5±0,1 нг/мл) во всей контрольной группе и пациентов с эпилепсией (фиг.5).
Исследования авторов изобретения продемонстрировали возросшее количество белков, связывающих аутоантитела с глутаматом, здоровых добровольцев, у которых была неустойчивая активность с пиковыми потенциалами на ЭЭГ (25% исследованных случаев). Эти результаты указывают на то, что возросшие уровни аутоантител к обоим фрагментам рецепторов глутамата могут быть кровяным маркером цереброваскулярных аномалий,
зарегистрированных ЭЭГ, без каких-либо неврологических признаков. Кроме того, перекрестная реакция обоих аутоантител к NMDA и АМРА-рецепторам была выявлена у некоторых пациентов (32%) с эпилепсией и инсультом (Dambinova et al. J.Neurol.Sci.1997, 152:93-7).
Была продемонстрирована отрицательная корреляция между длительностью заболевания и величиной GluRl аАЬ (Odinak et al., Zh Nevropatol Psikhiatr Im S.S.Korsakova. 1996, 96: 45-48). У пациентов с длительностью эпилепсии менее чем 5 лет были более
высокие уровни GluRl аАЬ, чем у пациентов с более длительным сроком заболевания.
Исследование величин GluRl аАЬ у пациентов с различными типами и частотой припадков изображено на фиг.6. Самые высокие концентрации GluRl были зарегистрированы у пациентов с ежедневным генерализованным тоническим-клоническим и частичным множественным типами припадков в более чем 8 6% случаев. У пациентов с редкими приступами, менее 1 раза в полгода, величина аАЬ выше отсечки (1,5+0,3 нг/мл для всех взрослых) была выявлена в более чем 80% случаев (Odinak et al., Zh Nevropatol Psikhiatr Im S.S.Korsakova. 1996, 96: 45-48; Gromov et al. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S.S.Korsakova. 1997, 97: 469) . Корреляция частоты припадков только с концентрацией GluRl аАЬ была не такой высокой, как ожидалось: коэффициент Spearman 0,34 (р <0,01).
Сравнение результатов теста GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA с появлением пиковых потенциалов на ЭЭГ позволило диагностировать эпилепсию и подтвердить эпилептическую природу активности пиковых потенциалов в диапазоне 84%-95% случаев (Odinak et al., Zh Nevropatol Psikhiatr Im S.S.Korsakova. 1996, 96: 45-48).
Исследование течения во времени перед и после появления припадков выполняли в сотрудничестве с д-ром J. Majkowsky (Clinic of Epilepsy, Warsaw, Poland, 1994-1995) и д-ром P. Wolf (Epilepsy Center, Bielefield, Germany, 1995-1996) . Было продемонстрировано внезапное увеличение GluRl аАЬ перед проявлением припадков, а величины аАЬ поддерживались на высоком уровне в течение следующего дня. Эти результаты были подтверждены увеличенной активностью в виде пиковых потенциалов, определенной ежедневной ЭЭГ.
Пример 3 - Использование и оценка эффективности наборов для тестов GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA
Наборы GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA для выявления антител GluRl включают (i) иммуносорбент для пептида GluRl или антител к GluRl; и (ii) индикаторный реагент, включающий вторичные антитела, прикрепленные к генерирующему сигнал
соединению. Теса? был предназначен к использованию для оценки лиц, подвергающихся пароксизмальным церебральным разрядам и эпилепсии.
Качество микропланшетов, покрытых пептидом GluRl или антителами против GluRl, контролировали с использованием калибраторов и образцов сыворотки от здоровых лиц в присутствии и в отсутствие калибраторов (Gromova et al., Neirokhimiia, 1997, 1:23-7). Оценки вариабельности в пределах одного анализа, изменения от партии к партии и стабильность реакции ELISA для выявления антитела или калибраторов GluRl выполняли в различных условиях хранения (температуры, тип упаковки, длительности хранения). Кинетику взаимодействия исследовали для достижения оптимальных характеристик переменных величин. Затем оценивали концентрации пептида GluRl или антител против GluRl в образцах сыворотки крови или плазмы от пациентов с неврологическими расстройствами (инсульт, болезнь Паркинсона и Альцгеймера, параличи и рассеянный склероз), инфекционными заболеваниями (туберкулез, энцефалит, менингит), неинфекционными
расстройствами (фенилкетонурия, красная волчанка, сахарный диабет, лекарственная зависимость) и здоровых добровольцев, взятых в соответствии с утвержденным протоколом исследования у людей.
Линейность
В образцах крови от видимо здоровых индивидуумов резко повышали концентрацию GluRl-антител до конечной концентрации 200 нг/мл (сыворотка) или пептида GluRl до конечной концентрации 2,0 нг/мл (плазма). Каждый образец с пиковой концентрацией гравиметрически разводили образцом без пиковой концентрации для получения величин GluRl-антител или пептида GluRl во всем диапазоне анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy. Корреляцию проводили для небольшого количества ( <0,1 нг/мл для антител и <10 пкг/мл для пептида) эндогенных GluRl-антител или пептида GluRl в образце без пиковой концентрации. Анализ линейной регрессии данных показывает, что анализы имеют линейный диапазон 0-2,5 нг/мл для теста GluRl-антител и 0-200 пкг/мл.
Чувствительность анализа
Чувствительность анализа или самую низкую выявляемую концентрацию, которая отлична от нуля для GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA, определяли тестированием нулевого калибратора по 20 раз каждый, используя 4 лота реагентов на 5-й д. Средний 95% доверительный предел аналитической чувствительности теста GluRl-антител был менее чем 0,05 нг/мл (95% доверительный интервал 0,01-0,06 нг/мл), а тест пептида GluRl был менее чем 5 пкг/мл (95% доверительный интервал 0,2-4,9 пкг/мл).
Примеси
Гемоглобин (до 10000 мг/дкл) и липиды (холестерин до 1000 мг/дкл и триглицериды до 1000 мг/дкл) или билирубин (до до 20 мг/дкл), добавленные к образцам сыворотки, содержащим антитела против GluRl или пептид GluRl, не мешало извлечению антител против GluRl или пептида GluRl. Однако резко гемолизированных образцов следует, когда возможно, избегать. Когда образец оказывается резко гемолизированным, следует получить и тестировать другой образец (сыворотки или плазмы).
Аналитическая специфичность
Антитела
Иммунореактивные пептиды из N-концевых фрагментов p.- (M0R) или 8-опиоидных рецепторов (DOR), глутаматных рецепторов (NR1, GluR4) и допаминовых рецепторов (D2, D3, D4) или их специфических антител (IgG) оценивали на потенциальную перекрестную реактивность и помехи в анализе GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA в указанных ниже концентрациях. Не было ни значимых помех при измерении уровня GluRl-антител, ни какой-либо значимой перекрестной реактивности анализа.
Тип
неирорецептора
Концентрация вещества
извлечения
Ссылка
Антитела, мкг/мл
Пептид, нг/мл
M0R
1,0
100
105%
Dambinova,
DOR
1,0
100
107%
Dambinova,
GluR4
0,5
100
99%
Dambinova et al.,
NR1
0,5
100
101%
Izykenova et al.,
1,0
100
104%
Фрагмент 8-31
1,0
100
109%
Фрагмент 6-27
1,0
100
103%
Фрагмент 1-18
Пример 4 - Отклонение результатов эпилептических тестов GRACE-NeuroTest-Epilepsy
Неточность в пределах суток и общую неточность определяли, используя модель ANOVA (вариационного анализа), тестированием контролей и пулов человеческих образцов, в которых имелись соответствующие анализируемые вещества, добавленные в концентрациях, близких к решающим точкам анализа и по диапазону стандартной кривой. Исследование проводили в течение 20 д, тестируя каждый контроль 5 раз/д.
Средняя неточность между анализами
Средняя величина
Стандартное
Коэффициент вариации
отклонение
GluRl-
GluRl
GluRl-
GluRl
GluRl-
GluRl
антитела,
пептид,
антитела,
пептид,
антитела,
пептид, %
нг/мл
пкг/мл
нг/мл
пкг/мл
о. о
1,5
0,1
3, 0
7,0
6,0
3,2
100
0,2
5,0
6,5 "
5,0
12,5
500
0, 5
23,0
6, 0
4,6
Средняя неточность в анализах
Средняя величина
Стандартное
Коэффициент
отклонение
вариации
GluRl-
GluRl
GluRl-
GluRl
GluRl-
GluRl
антитела,
пептид,
антитела,
пептид,
антитела,
пептид, %
нг/мл
пкг/мл
нг/мл
пкг/мл
1,5
0,2
6,9
13,0
14,0
3,2
100
0,3
11,2
9,5
11,2
12, 5
500
0,8
49, 4
6, 5
9,9
Пример 5. Ожидаемые величины GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA у индивидуумов без эпилепсии
Концентрацию циркулирующего пептида GluRl и GluR-антител определяли в образцах крови от 214 детей (возраст от 4 мес до 14 лет, 111 девочек и 103 мальчика) и 286 индивидуумов (126 женщин и 160 мужчин) без эпилепсии. Эта популяция включала индивидуумов с неврологическими расстройствами (травма мозга без припадков, боль в пояснице, арахноидит, болезни Паркинсона и Альцгеймера, псевдоэпилепсия), инфекционными заболеваниями (туберкулез, энцефалит, менингит), неинфекционными
расстройствами (фенилкетонурия, красная волчанка, сахарный диабет, лекарственная зависимость) и здоровых волонтеров. Нет статистически значимых изменений концентрации антител против GluR, связанных с травмой мозга без припадков, болью в пояснице, арахноидитом, фенилкетонурией, красной волчанкой, лекарственной зависимостью, туберкулезом, энцефалитом и менингитом. Описательные статистические данные для концентраций GluR-антител у индивидуумов без эпилепсии показаны в следующей таблице. Величины являются репрезентативными для величин, полученных в результате клинических исследований. Порог принятия решения определяли 95% пределом доверительности концентрации антител против GluR у популяции различного возраста без эпилепсии. Эти величины переводятся в общую специфичность теста более 8 9% для антител против GluR и более 92% для GluR, т.е., менее чем 10% ожидаемых ложно положительных результатов у индивидуумов без эпилепсии.
Концентрация антител против GluR (нг/мл) у популяции без
эпилепсии
Показатель
Все
Дети
Взрослые, возраст 18-4 0
Возраст <1
Возраст 1-3
Возраст 3-14
Женщины
Мужчины
Средняя величина
0,70
1, 02
1,25
1,8
1,5
Стандартное
0,15
0,34
0,29
0,1
0,2
отклонение
Медиана
0, 60
0, 93
1,7
1,4
Процент
<1,0 нг/мл
99, 0%
98,0%
96%
<1,5 нг/мл
89%
<1,8 нг/мл
90%
Минимум
0, 5
0,5
0, 5
1,0
0,9
Максимум
0,9
1,2
1,4
1,9
1,5
126
160
Концентрация пептида GluR (пкг/мл) у популяции без эпилепсии
Показатель
Все
Дети
Взрослые, возраст 18-40
Возраст <3
Возраст 3-14
Женщины/Мужчины
Средняя величина, пкг/мл
45,2
Стандартное отклонение
5,1
7,7
8,2
Медиана
48,3
89,5
Процент
<50 пкг/мл
94,0%
1,0%
0,5%
<100 пкг/мл
3,0%
96,5%
92,1%
Минимум
38,2
75,3
88,4
Максимум
51,0
92,0
106,1
151
286
На основании обычной ЭЭГ и клинической оценки диагноз и прогрессирование эпилепсии можно прогнозировать лишь частично. До настоящего времени имелась неудовлетворенная потребность в лабораторном тесте образцов крови. GRACE-NeuroTest-Epilepsy удовлетворяет эту потребность. Рекомендуется использовать это подтверждающее исследование крови для всех неврологических рассмотрений в отношении дифференциальной диагностики эпилепсии. Проведена оценка анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy, и он предложен для следующих клинических показаний у детей:
- Решение при связанных с мозгом припадках и эпилепсии для увеличения степеней определенности диагноза
Дифференцировка псевдоэпилепсии и подобных эпилепсии расстройств.
Справочные диапазоны в крови: (Iatsuk et al. Zh Nevropat Psikhiat. SS Korsakova 1999, 99:34-6)
Дети, зависимо от возраста
Нормальные справочные диапазоны
GluR-антитело нг/мл
пептид GluR пкг/мл
Отношение антитело/пептид
Возраст <3 лет
<0,7
<50
<14
Возраст от 3 до 14 лет
<1,0
<90
<11
Проведена оценка анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy, и он предложен для следующих клинических показаний у взрослых:
- Решение при связанных с мозгом припадках и эпилепсии для увеличения степеней определенности диагноза
- Фактор риска пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии после других расстройств
- Прогноз связанных с мозгом припадков
Наблюдение после лечения и для подбора адекватного лечения и доз
Справочные диапазоны в сыворотке: (Gromov et al. Zh
Nevropatol Psikhiat. Im SS Korsakova 1997, 97:46-49)
Взрослые
Нормальные справочные диапазоны
GluR-антитело, нг/мл
пептид GluR, пкг/мл
Отношение антитело/пептид
Мужчины
<1,5
<100
<15
Женщины
<1, 8
<100
<18
Пример 6. Ожидаемые величины GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA у индивидуумов с эпилепсией
Образцы крови получали у 391 ребенка (возраст от 4 мес до 14 лет, 191 девочка и 200 мальчиков) и 237 индивидуумов (130 женщин и 107 мужчин) с эпилепсией и эпилептическими синдромами. Описательные статистические данные концентраций GluRl-aAb у пациентов с эпилепсией и эпилептическими синдромами представлены в таблице ниже. Эти величины репрезентативны для величин, полученных в результате клинических испытаний.
Концентрация GluR-антител (нг/мл) у пациентов с эпилепсией и
эпилептическими синдромами
Показатель
Все
Дети
Взрослые, возраст 18-4 0
Возраст <1
Возраст 1-3
Возраст 3-14
Женщины
Мужчины
Средняя величина
2,0
2,5
2,8
3,2
2,7
Стандартное
0,2
0, 3
0,3
0,2
0,2
отклонение
Медиана
1,9
2,2
2,6
2,7
2,4
Процент
<1,0 нг/мл
16%
<1,5 нг/мл
57%
59%
55%
<1,8 нг/мл
21%
34%
37%
90%
88%
Минимум
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Максимум
2,4
3, 0
3,3
4,1
3,1
119
132
140
130
107
Концентрация пептида GluR (пкг/мл) у пациентов с эпилепсией и
эпилептическими синдромами
Показатель
Все
Дети
Взрослые, возраст 18-4 0
Возраст <3
Возраст 3-14
Женщины/Мужчины
Средняя величина, пкг/мл
298,2
307, 1
452, 9
Стандартное отклонение
91,1
146, 4
152,2
Медиана
304,3
332,0
490, 4
Процент <50 пкг/мл <100 пкг/мл
91,0% 8,0%
1,5% 96,5%
3% 93,2%
Минимум
48,2
47,5
99,0
Максимум
495,4
481,0
905,2
251
140
237
Пример 7. Чувствительность и специфичность GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA
Таблица 2 на 2 для всех групп детей, оцененных путем анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy, выявляющего GluR-антитела
Эпилепсия
Без эпилепсии
Положительные
330 (TP)
10 (FP)
340
Отрицательные
61 (FN)
204 (TN)
265
391
214
605
Общая
Чувствительность: 330/391=84% Специфичность: 204/214=95%
Таблица 2 на 2 для всех групп детей, оцененных путем анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy, позволяющего выявить пептид GluR
Эпилепсия
Без эпилепсии
Положительные
379 (TP)
11 (FP)
390
Отрицательные
12 (FN)
203 (TN)
215
391
214
605
Общая
Чувствительность: 379/391=97% Специфичность: 203/214=95%
Таблица 2 на 2 для всех групп взрослых, оцененных путем анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy, позволяющего выявить GluR-антитела
Эпилепсия
Без эпилепсии
Положительные
204 (TP)
26 (FP)
230
Отрицательные
33 (FN)
260 (TN)
293
237
286
523
Общая
Чувствительность: 204/237=86% Специфичность: 260/286=91%
Таблица 2 на 2 для всех групп взрослых, оцениваемых путем анализа GRACE-NeuroTest-Epilepsy, позволяющего выявить пептид GluR
Эпилепсия
Без эпилепсии
Положительные
221 (TP)
21 (FP)
242
Отрицательные
16 (FN)
265 (TN)
281
237
286
523
Общая
Чувствительность: 221/237=93% Специфичность: 265/286=93%
Пример 8. Интерпретация результатов GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA
Кривая зависимости рабочих характеристик приемника (R0C) отсечек величин GluRl-антител от клинической чувствительности и специфичности давала площадь под кривой > 0,95±0,01 и отсечки 1 нг/мл для детей (в возрасте <14 лет), 1,5 нг/мл для мужчин и 1,8 нг/мл для женщин. Кривая зависимости ROC отсечек величин GluRl-антител от клинической чувствительности и специфичности давала площадь под кривой > 0,97±0,01 и отсечки 50 пкг/мл для детей (в возрасте <3 лет) и 100 пкг/мл для подростков и взрослых. Клиническая чувствительность и специфичность теста GRACE-NeuroTest-Epilepsy ELISA с использованием установленных отсечек для групп различного возраста и пола описана в таблице ниже.
Чувствительность и специфичность против возраста и пола
Показатель
Все
Дети
Взрослые, возраст 18-40 лет
GluR-антитела
Пептид GluR
GluR-антитела
Пептид GluR
Чувствительность, % при 95%
84,0 78,0-88,5
97,0 95,4-99,1
85,0 83,3-95,5
93,0 90,4-96,2
Специфичность, % при 95%
95,0 93,5-98,0
95,0 92,1-97,7
91,0 85,2-98,7
93,0 89,9-95,4
Клиническая специфичность
Образцы сыворотки от лиц без пароксизмальных церебральных разрядов и эпилепсии анализировали на предмет наличия GluRl-антител. Было показано, что общая специфичность составила 91% для взрослых и 95% для детей.
Клиническая чувствительность
По определению, клиническая чувствительность анализа GluRl-антител для выявления пациентов с эпилепсией в случайной популяции составила 84-85%.
Клиническую чувствительность анализа для выявления эпилепсии определяли путем сравнения результатов тестов GluRl у 7 групп отобранных пациентов: с эпилепсией, при окончательном и при неопределенном диагнозе; с потерей сознания; обмороком/синкопе; мигренью и сердечно-сосудистыми
заболеваниями.
Таблица
Клиническая эффективность анализа пептида GluRl
Заболевание
Количество пациентов
Количество правильных "+" результатов
Количество ложных "-" результатов
Клиническая чувствительность* %
Клиническая специфичность %
Эпилепсия:
а) Окончательный
диагноз
б) Неопределенный
диагноз
976* 136*
839 106
137 30
75 10
Потеря сознания
100
Обморок/синкопе
100
Мигрень
Травматическое повреждение мозга
71*
Цереброваскулярные заболевания: Инсульт TIA
31 14
27 12
4 2
99 100
Опухоль мозга
19*
100
Паркинсонизм
100
Болезнь Альцгеймера
100
Рассеянный склероз
100
Другие заболевания:
а) Туберкулез
100
б) Фенилкетонурия
100
в) Красная волчанка
31*
100
г) Сахарный диабет
21*
100
д) Лекарственная
зависимость
33*
100
Здоровые лица
505*
461
Всего
2002
1754
248
Пример 9. GRACE-NeuroTest-Epilepsy LA
Быстрый анализ пептида GluRl для выявления эпилепсии, основанный на методике агглютинации на латексе, был направлен на повышение возможности постановки определенного диагноза.
В анализе GRACE-NeuroTest-Epilepsy LA используются тройные вогнутые покровные стекла со встроенным увеличивающим устройством для выявления визуальности реакции, обеспечивающие немедленный ответ "да" или "нет". В этом анализе образцы плазмы смешивают с антителом, соединенным с частицами цветного латекса, и агглютинация выявляется между 2 и 5 мин. Реакция происходит в однородной фазе и может быть выявлена визуально:
Антиген+латекс-антитело-> -> -> {латекс-антитело"-антиген}
Авторы разработали проточный микроанализ GRACE-NeuroTest-Epilepsy, основанный на методике латерального потока с использованием частиц латекса, содержащих антитела против GluRl. Кровь или плазма "растворяет" латекс-реагент и транспортирует его к линии выявления. В большинстве случаев выполняют сэндвич-анализы. Тест представляет собой неоднородный анализ; т.е. происходят реакции и в растворе, и в твердой фазе. Процедура теста проводится следующим образом:
Стадия 1. Кровь накапывают на определенный участок на устройстве латерального потока.
Стадия 2. Кровь растворяет цветной латексный реагент.
Стадия 3. Если рассматриваемое анализируемое вещество находится в крови, то происходит первая реакция:
Антиген связывается с антителом на латексных частицах-> -"комплекс- {антиген-"-"антитело-латекс} .
Стадия 4. Параллельно с реакцией стадии 3 происходит транспорт комплекса {антиген-> -> антитело-латекс} с другим антителом к линии выявления. Затем происходит следующая реакция:
{антиген-"•-"антитело-латекс}-> -^совмещение со вторым
антителом
Концентрация этого комплекса может быть достаточно высокой на линии выявления, и его можно выявить визуально (т.е., по цвету) или измерить устройством (флуорометрический способ). Чувствительность анализа высокая ввиду процесса концентрации цветных частиц ("принцип захвата"). У здоровых людей в целом концентрация пептида GluRl составляет 50 пкг/мл.
Клинические испытания GRACE-NeuroTest-Epilepsy в форматах ELISA и LA в комбинации с клиническими наблюдениями и данными ЭЭГ продемонстрировали его ценность. Это может быть очень наглядно показано путем сравнения вероятности эпилепсии у наблюдавшихся групп пациентов перед тестом и после теста:
Диагностическое показание
Вероятность припадков и активности в виде пиковых потенциалов на ЭЭГ перед тестом, %
GluRl-антитела LR*
Пептид GluRl LR*
Вероятность после теста**, %
Эпилепсия:
а) Окончательный
диагноз
б) Неопределенный
диагноз
63,5
9,4
28,1
83,5 (80, 95 CI) 95,0 (90, 98 CI)
35,0
1,1
5,0
35,0 (21,44 CI) 42,0 (32, 51 CI)
Потеря сознания
15,0
<0,04
<0, 01
0,15 <0,1
Обморок/синкопе
14,2
<0,04
<0,01
0,11 <0,1
Мигрень
<10
0,02
<0,01
<0,1 <0,05
Травма мозга
32,3
0,9
<0,01
3,5 <0,02
Инсульт
25,1
0,5
<0,01
1,5 <0,01
^Отношение положительной вероятности, LR=Чyвcтвитeльнocть/l-Специфичность;
**Вероятность после теста, полученная из вероятности перед
тестом, определяемой по клиническим наблюдениям проявлений в виде припадков, в комбинации с данными ЭЭГ и отношениями
вероятности (LR) для положительного теста на аутоантитела против GluRl в соответствии с http://www.med.nagoya-cu.ас.jp/psych.dir/graphical.htm; CI - доверительный интервал.
Способ латексной агглютинации особенно подходит для использования в РОС, потому что уровни пептида GluRl повышены на самой ранней стадии пароксизмальных церебральных разрядов, и способ таким образом, обеспечивает индикацию нейротоксических явлений в реальном времени. Кроме того, результаты можно обработать менее чем за 10 мин, обеспечивая возможность своевременного и соответствующего вмешательства.
Этот способ обеспечивает надежные данные в простом для интерпретации формате. Применение методики агглютинации на латексе для анализа мозговых биологических маркеров эпилепсии снизит стоимость анализа, обеспечит возможность мониторинга хода процедуры лечения в реальном времени и позволит врачам определить эффективность медикаментозной терапии, применяемой для лечения эпилепсии.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ установления природы припадков у пациентов с диагнозом наличия пароксизмальных разрядов, включающий в себя прямой и непрямой анализ биологической жидкости указанных пациентов для выяснения наличия и количества GluRl.
2. Способ по п.1, где указанная природа припадков является пароксизмальной или непароксизмальной.
3. Способ по п.1, где указанная биологическая жидкость представляет собой кровь, мочу, плазму крови, сыворотку крови, спинномозговую жидкость, слюну, пот или мозговую ткань или их производное.
4. Способ по п.1, включающий в себя
a) прямое измерение уровня пептидов GluRl или их фрагментов; или
b) прямое измерение содержания антител против GluRl.
5. Способ по п.1, где указанные припадки ассоциированы с потерей сознания, обмороком, мигренью, травмой мозга, инсультом, психогенной активностью, нарколепсией, синдромом Туретта, сердечной аритмией, лекарственной зависимостью или инсультом.
6. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя сравнение указанного количества GluRl с исходным уровнем, выбранным из популяционных норм и прежних уровней GluRl, измеренных у указанного пациента.
7. Способ по п.1, где концентрация свободного GluRl или его фрагментов в крови, составляющая более 50 пкг/мл, указывает на пароксизмальную природу указанных припадков, а концентрация GluRl в крови менее чем 50 пкг/мл указывает на непароксизмальную природу указанных припадков.
8. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя использование, в качестве контроля или для калибровки, антител, выработанных против фрагмента GluRl с последовательностью SEQ ID N0:5 или б или его иммуногенного фрагмента, гомолога или производного.
9. Способ по п.1, где
а) указанную биологическую жидкость анализируют на предмет
определения наличия и количества аутоантител против GluRl,
b) указанный способ проводят с использованием диагностического набора, и
c) указанный набор изготовлен для сравнения со стандартом антитела, включающим в себя специфическую фракцию иммуноглобулинов G, очищенных из крови человека, необязательно иммуноглобулинов 95% чистоты, которые специфически связывают пептид GluRl без значительного перекрестного взаимодействия с другими фрагментами рецепторов глутамата или другими нейрорецепторами.
10. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя
a) анализ наличия у указанного пациента пароксизмальной пиковой активности на ЭЭГ;
b) клиническую оценку наличия трудноизлечимой эпилепсии у указанного пациента;
c) выполнение нейрохирургической операции у указанного пациента на основании наличия пароксизмальной пиковой активности, трудноизлечимой эпилепсии и аномально высоких профилей концентраций GluRl или его фрагмента.
11. Способ по п.1, при котором указанная природа припадков является пароксизмальной, дополнительно включающий в себя
a) лечение указанного пациента исходной дозой противосудорожной медикаментозной терапии;
b) прямой или непрямой анализ указанной биологической жидкости для выяснения наличия и количества GluRl; и
c) увеличение дозы, изменение препарата или лечение множеством препаратов, если наличие или количество GluRl не подпадает под уровень ниже установленного стандарта.
12. Способ по п.11, где указанный установленный стандарт составляет 100, 75 или 50 пкг/мл фрагмента GluRl, или 2, 0, 1,8, 1,5 или 1,0 нг/мл GluRl-антитела.
13. Способ по п.11, дополнительно включающий в себя корреляцию изменений GluRl с изменениями пароксизмальной пиковой активности, по данным измерения ЭЭГ.
14. Способ по п.1, при котором указанная природа припадков является пароксизмальной, дополнительно включающий в себя
a) прекращение или уменьшение исходной дозировки противосудорожной медикаментозной терапии;
b) прямой или непрямой анализ указанной биологической жидкости для выяснения наличия и количества GluRl; и
c) возврат к указанной противосудорожной терапии в ответ на увеличение количества GluRl.
15. Способ по п.14, где указанное увеличение превышает установленный стандарт, а указанный установленный стандарт составляет 100, 75 или 50 пкг/мл фрагмента GluRl, или 2,0, 1,8, 1,5 или 1,0 нг/мл GluRl-антитела.
16. Способ по п.1, выполняемый путем прямого или непрямого анализа ELISA, RIA, иммунопятна, иммуноблоттинга, агглютинации на латексе, латерального потока, анализа поляризации флуоресценции или микроанализа.
17. Способ по п.1, включающий в себя
a) приведение в контакт указанного биологического образца с твердой фазой, включающей в себя полипептид или белковый фрагмент GluRl или антитела против GluRl, в течение времени, достаточного для образования комплекса между GluRl или его фрагментом и антителами против GluRl;
b) приведение в контакт указанного комплекса с индикаторным реагентом, прикрепленным к генерирующему сигнал соединению; и
c) измерение генерируемого сигнала; где указанное количество выявленного сигнала коррелирует с количеством указанного GluRl или антител против GluRl, присутствующих в указанном образце.
18. Способ по п.17, где указанный индикаторный реагент включает в себя куриное антитело против человеческого IgG, прикрепленного к пероксидазе хрена.
19. Способ по п.1, включающий в себя
а) приведение в контакт указанного биологического образца с агглютинирующим носителем, включающим в себя полипептид или белковый фрагмент GluRl или антитела против GluRl, в течение времени, достаточного для образования комплекса между GluRl или его фрагментом и антителами против GluRl; и
b) считывание сигнала, генерируемого в результате агглютинации; где сигнал коррелирует с аномально высоким количеством GluRl, его фрагмента или антител против GluRl.
20. Способ по п.19, где достаточный период времени составляет 10 мин или менее.
21. Способ по п.1, где биологический образец представляет собой плазму или сыворотку, разведенные в отношении примерно 1:50.
22. Способ диагностики и/или лечения эпилепсии или пароксизмальных разрядов у человека-пациента, включающий в себя прямой или непрямой анализ биологической жидкости, взятой у указанного пациента, для выяснения наличия и количества GluRl с последовательностью SEQ ID N0:5 или 6 или его иммуногенного фрагмента или аналога.
23. Способ диагностики вероятности эпилепсии у пациентов с риском эпилепсии, включающий в себя прямой или непрямой анализ биологической жидкости указанного пациента для выяснения наличия и количества GluRl или его фрагмента.
24. Способ по п.23, дополнительно включающий в себя прямой или непрямой анализ биологической жидкости указанного пациента для выяснения наличия и количества GluRl или его фрагмента еще один или более раз, где
a) изменения указанных количеств GluRl доказывают наличие эпилепсии; и
b) постоянные количества GluRl на уровнях ниже установленного стандарта доказывают наличие псевдоэпилепсии.
25. Способ по п.24, дополнительно включающий в себя назначение противосудорожной терапии в ответ на изменения количеств GluRl или количеств антител против GluRl выше указанного определенного стандарта.
26. Способ по п.23, [используемый] для прогнозирования новорожденных с риском неврологических последствий.
27. Способ дифференциальной диагностики типов эпилепсии и эпилептических припадков, включающий в себя прямой или непрямой анализ биологической жидкости указанного пациента для выяснения наличия и количества GluRl или его фрагмента.
28. Набор для выявления агглютинации на месте оказания помощи, включающий в себя
a) поли- или моноклональные антитела против GluRl или пептида GluRl, иммобилизованного на носителе;
b) контрольный раствор;
c) вогнутые покровные стекла; и
d) пипетку.
29. Набор для выявления агглютинации на месте оказания помощи по п.28, включающий в себя утроенные вогнутые покровные стекла со встроенным или отдельным устройством для увеличения.
30. Набор для выявления агглютинации на месте оказания помощи по п.28, включающий в себя двухкамерную пипетку со встроенным фильтром для отделения плазмы.
31. Лабораторный набор для выявления GluRl, его фрагмента или антител против GluRl, включающий в себя
a) белковые фрагменты, содержащие GluRl или его фрагмент или поли- или моноклональные антитела, иммобилизованные на твердой фазе; и
b) индикаторный реагент, специфичный в отношении указанного GluRl, его фрагмента или антител против GluRl, включающий в себя вторичное антитело, прикрепленное к соединению, генерирующему сигнал.
По доверенности
137446
1/2
ffl
<1 г 1-3 г 3-14 г
п=70 п=81 п=63
ФИГ. 1
Количества аутоантител GluRl в сыворотке крови здоровых детей (белые столбцы) и детей с неэпилептическими расстройствами (закрашенные столбцы), от возраста.
ФИГ. 2
Количества уатоантител GluRl в сыворотке крови здоровых детей с эпилептическим синдромом (белые столбцы) и эпилепсией в зависимости (закрашенные столбцы) . Пунктирная линия показывает отсечку для GluRl-аАЬ
3.5
3 2.5
2 1.5
140.5 О
Эпилептический синдром Эпилепсия
п=96 п=116
3.5 -
3 -
2.5 -
2 ¦
1.5-
1 -
н О
0.5 -
0 -
С2 Эпилепсия
ФИГ.З
Аутоантитела GluRl в сыворотке крови детей с частичными (белые столбцы) и генерализованными припадками (Закрашенные столбцы). Пунктирная линия показывает отсечку для GluRl-аАЬ.
ФИГ. 4
Выявление GluRl-аАЬ в сыворотке крови здоровых лиц (С1), пациентов с неэпилептическими неврологическими расстройствами (С2) и пациентов с эпилепсией.
2/2
ФИГ. 5
Зависимость GluRl-аАЬ от пола: в общих контролях (белые столбцы) и пациентов с эпилепсией (закрашенные столбцы).
ФИГ. б
Зависимость GluRl-аАЬ от типа и частоты припадков: закрашенные стобцы -ежедневные припадки; светлые столбцы -1 в полгода. G - генерализованные тонические-клонические (n=98); GA -генерализованные с малыми припадками (n=50); PS - частичные простые (п=33) и РМ - частичные множественные (п=56).