EA200600526A1 20070427 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2007\TIT_PDF/200600526 Титульный лист описания [PDF] EAPO2007/PDF/200600526 Полный текст описания EA200600526 20040902 Регистрационный номер и дата заявки US60/499,802 20030902 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2004/029042 Номер международной заявки (PCT) WO2005/020934 20050310 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [eaa] EAA20702 Номер бюллетеня [RU] МУТАНТ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ FSH Название документа C07K 14/59, C12N 15/16, C12N 15/63, C12N 5/10, A61K 38/24, A61P 5/30 Индексы МПК [US] Гэрон Луиз М., Аркинстолл Стефен Дж., Брондик Уилльям Х., Кэмпбелл Роберт К., Цзян Сюйлян, Маккенна Син Д., Теппер Марк Сведения об авторах [AN] АППЛАЙД РЕЗЕЧ СИСТЕМЗ АРС ХОЛДИНГ Н. В. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea200600526a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

Описывается новый мутантный FSH с повышенным гликозилированием и более продолжительными периодами полувыведения для использования для стимулирования фолликулогенеза у человека. Мутантный FSH позволяет использовать более низкие кумулятивные дозы FSH для достижения сходного или лучшего клинического результата.

 


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:
новый мутантный FSH с повышенным гликозилированием и более продолжительными периодами полувыведения для использования для стимулирования фолликулогенеза у человека. Мутантный FSH позволяет использовать более низкие кумулятивные дозы FSH для достижения сходного или лучшего клинического результата.

 


2420-136025ЕА/011
МУТАНТ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ FSH
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к полипептидам,
проявляющим фолликулостимулирующую гормональную активность, к способам получения таких полипептидов и к применению таких полипептидов для лечения, в частности, для лечения репродуктивных расстройств.
2. Описание предшествующего уровня техники а. Гонадотропины
Фолликулостимулирующий гормон (FSH) является членом семейства гонадотропинов, играющих ключевую роль в фертильности человека. Гонадотропины, включающие в себя также лютеинизирующий гормон (LH) и хорионический гонадотропин (CG), являются гетеродимерами, каждый из которых состоит из общей а-субъединицы (92 аминокислоты) и уникальной (3-субъединицы (111 аминокислот в FSH) . В SEQ ID No 1 и SEQ ID No 2 соответственно показаны последовательности аминокислот зрелых форм а- и Э~ субъединиц.
Человеческий FSH выделяли из гипофиза и из мочи в постклимактерическом периоде (ЕР 322,438) и получали рекомбинантными методами в клетках млекопитающих (патент США US 5639640, US 5156957, US 4923805, US 4840896, US 5767251, ЕР 211894 и ЕР 521,586). В последних ссылках также раскрывается р-субъединичный ген человеческого FSH. В US 5405945 раскрывается модифицированный человеческий а-субъединичный ген, содержащий единственный интрон.
В нижеперечисленных источниках: Liu et al., J Biol Chem 1993,15; 268 (2): 21613-7, Grossmann et al., Mol Endocrinol 1996 10 (6) : 769-79, Roth and Dias (Mol Cell Endocrinol 1995 1; 109 (2): 143-9, Valove et al., Endocrinology 1994; 135 (6): 2657-61, Yoo et al., JBiol Chem 1993 25; 268 (18): 13034-42), US 5, 508,261 and Chappel et al., 1998, Human Reproduction, 13 (3) :
1835 раскрывается исследование различных структурно-функциональных взаимоотношений и определяются аминокислотные остатки, вовлеченные в рецепторное связывание и активацию и в димеризацию FSH.
б. Применение_гонадотропинов_во_вспомогательных
репродуктивных технологиях
Гонадотропины играют решающую роль в репродуктивном цикле, и их применение в экзогенной терапии является существенно важным для вспомогательных репродуктивных технологий (ART) , таких как экстракорпоральное оплодотворение (IVF), IVF в сочетании с внутриплазматической инъекцией сперматозоида (IVF/ICSI) и трансплантацией зародыша (ЕТ), а также для индукции овуляции (01) у пациенток с отсутствием овуляции, которым проводится оплодотворение in vivo, как естественным путем, так и путем внутриматочного оплодотворения (IUI).
В патенте США US 4589402 и в US 4845077 раскрывается очищенный человеческий FSH, не содержащий LH, и его применение для экстракорпорального оплодотворения. В патенте ЕР 322 438 раскрывается белок с активностью FSH, составляющей по меньшей мере 6200 Ед/мг, который по существу является свободным от активности LH, и в котором а-субъединица и р-субъединица FSH могут, соответственно, быть его диким типом, или его определенной процессированной формой.
Для достижения терапевтического эффекта необходима длительная терапия, продолжающаяся у женщин обычно в течение 810 последовательных дней и иногда до 21 дня для стимуляции фолликул о г енеза, и до 18 месяцев у мужчин с гипогонадотропией для индукции сперматогенеза. Следствием обычного ежедневного внутримышечного (в/м) или подкожного (п/к) введения hFSH является дискомфорт и возможная местная реакция на инъекцию. Уменьшение частоты введения облегчило бы терапию и сделало бы введение гонадотропина более удобным, более переносимым и щадящим для пациента.
в. Гликозилирование FSH
Гонадотропины - это гликопротеины, имеющие в каждой субъединице аспарагин-связанные (N-связанные) олигосахаридные
боковые цепи, важные для активности in vivo и функционирования. Добавление углеводов к полипептидам (гликозилирование) - это посттрансляционный процесс, который приводит к добавлению сахаридных цепей к определенным аспарагиновым (N-связанным) или серин-треониновым (0-связанным) аминокислотам. В отличие от инвариантной аминокислотной последовательности протеинового участка гликопротеинов, структура углеводов является вариабельной - это признак, упоминаемый как
микрогетерогенность. Например, в одном и том же белке сайт N-гликозилирования может содержать различные углеводные структуры. Кроме того, даже на том же самом сайте гликозилирования заданного гликопротеина можно обнаружить различные углеводные структуры. Эта гетерогенность является следствием нематричного синтеза углеводов.
N-гликозилирование белков встречается специфично при консенсусной последовательности типа Asn-Xaa-Ser/Thr, и в меньшей степени при консенсусной последовательности типа: Asn-Xaa-Cys, где Хаа может быть любым аминокислотным остатком. Однако, присутствия консенсусного трипептида не достаточно для обеспечения гликозилирования аспарагинового остатка. Например, N-гликозилирование последовательности Asn-Pro-Ser/Thr
встречается в 50 раз реже, чем другие типы последовательности Asn-Xaa-Ser/Thr.
Человеческий FSH содержит четыре N-связанные сайта гликозилирования: два на общей а-субъединице в положениях 52 и 78 и два на 0-субъединице в положениях 7 и 24. Наиболее важными для сборки димера, целостности, секреции и сигнальной трансдукции являются углеводы, прикрепленные к а-субъединице FSH, тогда как (3-субъединичные углеводы имеют значение для сборки димера, секреции и выведения гетеродимеров из циркулирующей крови.
Galway et al., Endocrinology 1990; 127 (1): 93-100 указывают, что варианты FSH, продуцируемые N-ацетилглюкозамин трансферазой-I СНО-клеточной линией яичника китайского хомячка или СНО-клеточной линией, дефектной по транспорту сиаловой
кислоты, столь же активны, как и FSH, секретируемый диким типом клеток или как очищенный гипофизарный FSH in vitro, но не имеют активности in vivo, возможно вследствие быстрого выведения из сыворотки неадекватно гликозилированных вариантов. D'Antonio et al., Human Reprod 1999; 14 (5): 1160-7 описывают различные изоформы FSH, циркулирующие в крови. Изоформы имеют идентичные последовательности аминокислот, но отличаются по степени посттрансляционной модификации. Выявлено, что у группы менее кислых изоформ наблюдалось более быстрое выведение in vivo по сравнению с группой кислых изоформ, возможно вследствие различия изоформ по содержанию сиаловой кислоты. Кроме того, Bishop et al. Endocrinology 1995; 136 (6): 2635-40 пришли к заключению, что первичной детерминантой активности in vivo, по видимому, является период полувыведения из системы кровообращения. Эти наблюдения привели к гипотезе, что период полувыведения FSH можно увеличить путем введения дополнительных сайтов гликозилирования для повышения содержания сиаловой кислоты в полипептиде. г. Варианты FSH
Путем слияния карбоксиконцевого пептида hCG (СТР) с нативным рекомбинантным человеческим FSH (rhFSH) были разработаны агонисты FSH с увеличенными периодами полувыведения. Функциональная группа СТР состоит из аминокислот от 112-118 до 145 с четырьмя 0-связанными сайтами гликозилирования, располагающимися в положениях 121, 127, 132 и 138. В патентах US 5338835 и US 5585345 раскрывается р-субъединица модифицированного FSH, удлиненного С-концевым Glu, с СТР функциональной группой hCG. Указывается, что получаемый модифицированный аналог имеет биологическую активность нативного FSH, но период полувыведения его из циркулирующей крови пролонгирован. В патенте US 540594 5 раскрывается, что карбоксиконцевой участок р-субъединицы hCG или его вариант значительно влияет на выведение CG, FSH и LH.
В патенте US 5883073 раскрываются одноцепочечные белки, содержащие две ос-субъединицы с агонистической или
антагонистической активностью для CG, TSH, LH и FSH. В патенте US 55082 61 раскрываются гетеродимерные полипептиды, имеющие сродство к связыванию с рецепторами LH и FSH, содержащими а-субъединицу гликопротеинового гормона и не встречающийся в природных условиях р-субъединичный полипептид, в которых р-субъединичный полипептид представляет собой цепь аминокислот, содержащую четыре соединенных подпоследовательности, каждая из которых выбирается из списка конкретных последовательностей. Klein et al. (2 003) раскрывают одноцепочечный аналог FSH с увеличенным периодом полувыведения, у которого а- и р-субъединицы связаны олигопептидом, содержащим два N-связанных сайта гликозилирования.
Для увеличения периода полувыведения FSH in vivo, в патенте W0 01/58493 раскрывается 77 мутаций, возможных для а-субъединицы FSH и 51 мутация, возможная для р-субъединицы FSH. В W0 01/58493 раскрывается, что мутантные а- и р-субъединицы могут использоваться индивидуально (1 дополнительный сайт гликозилирования) или в сочетании (2 дополнительных сайта гликозилирования). Были определены 128 возможных мутантов путем использования 50 трехмерных (3D) моделей структуры FSH, полученных исключительно на основе структуры hCG и путем сравнительного анализа структуры последовательности FSH и hCG, несмотря на то, что идентичность р-субъединиц hCG и FSH составляет 32%. В патенте WO 01/58493 не раскрывается получение или испытание каких либо а- и р-субъединиц FSH, у которых сайт гликозилирования был бы внедрен сайт-направленным мутагенезом.
Существует клиническая потребность в продукте, который частично или полностью обеспечивает терапевтически значимые эффекты FSH, и который может вводиться с менее частыми интервалами введения по сравнению с доступными в настоящее время продуктами FSH, и который обеспечивает предпочтительно более стабильный уровень активности циркулирующего FSH по сравнению с доступными в настоящее время препаратами.
Настоящее изобретение направлено на такие продукты, а также на способы создания таких продуктов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к мутантному FSH, в котором а-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 3, и в котором р-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 4. Мутантный FSH может быть N-гликозилирован по 0, 1, 2, 3, 4, 5 или б аспарагиновым остаткам упомянутого мутантного FSH. Возможно гликозилирование N83 мутантной а-субъединицы. Возможно гликозилирование N55 мутантной 3-субъединицы.
Настоящее изобретение относится также к выделенной ДНК, кодирующей мутант а-субъединицы FSH, содержащий
последовательность SEQ ID No 3. Настоящее изобретение также относится к изолированной ДНК, кодирующей мутант р-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 4.
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему ДНК, которая кодирует мутант а-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 3. Вектор может быть экспрессионным вектором.
Настоящее изобретение относится также к вектору, содержащему ДНК, которая кодирует мутант р-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 4. Вектор может быть экспрессионным вектором.
Настоящее изобретение относится также к вектору, содержащему первую ДНК и вторую ДНК, в котором первая ДНК кодирует мутант а-субъединицы FSH, содержащий
последовательность SEQ ID No 3 и в котором вторая ДНК кодируют мутант р-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 4. Вектор может быть экспрессионным вектором.
Настоящее изобретение относится также к клетке, содержащей вектор, содержащий ДНК, которая кодирует мутант а-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 3. Вектор может быть экспрессионным вектором. Клетка может быть клеткой млекопитающего.
Настоящее изобретение относится также к клетке, содержащей вектор, содержащий ДНК, которая кодирует мутант р-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 4. Вектор может
быть экспрессионным вектором. Клетка может быть клеткой млекопитающего.
Настоящее изобретение относится также к клетке, содержащей вектор, содержащий первую ДНК и вторую ДНК, в котором первая ДНК кодирует мутант а-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 3 и в котором вторая ДНК кодирует мутант (3-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 4. Вектор может быть экспрессионным вектором. Клетка может быть клеткой млекопитающего.
Настоящее изобретение относится также к клетке, содержащей первый и второй вектор, в которой первый вектор содержит ДНК, кодирующую мутант а-субъединицы FSH, содержащий
последовательность SEQ ID No 3 и в которой второй вектор содержит ДНК, которая кодирует мутант (Ь-субъединицы FSH, содержащий последовательность SEQ ID No 4. Вектор может быть экспрессионным вектором. Клетка может быть клеткой млекопитающего.
Настоящее изобретение также относится к способу получения мутантного FSH, содержащего культуры клеток млекопитающих, способных к гликозилированию протеинов, где упомянутые клетки содержат первый вектор экспрессии, содержащий ДНК, которая кодирует а-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID No 1 и второй вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую (3-субъединицу FSH, содержащую последовательности SEQ ID No 2.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей мутантный FSH и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель, в которой а-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 3, ив которой р-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 4.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения бесплодия у млекопитающих, который предусматривает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного
количества мутанта мутантного FSH, в котором а-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 3, ив котором р-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 4.
Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции фолликулогенеза у млекопитающих, предусматривающему введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества мутанта мутантного FSH, в котором а-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 3, ив котором (В-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 4.
Настоящее изобретение также относится к способу индукции гиперстимуляции яичников у млекопитающих, предусматривающему введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества мутанта мутантного FSH, в котором а-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 3, и в котором (Ь-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID No 4.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 показывает плазмидную карту экспрессионного вектора, используемого для экспрессии aH83N субъединицы.
Фигура 2 показывает плазмидную карту экспрессионного вектора, используемого для транзиторной экспрессии PE55/V57T субъединицы.
Фигура 3 показывает плазмидную карту экспрессионного вектора, используемого для экспрессии (3E55/V57T субъединицы.
Фигура 4 показывает морфологию GM-1. Панель А и С: MALDI-TOF массспектрометрический анализ, выполненный на GM-1 и Gonal-F. Панель В: LDS-PAGE анализ GM-1 и Gonal-F.
Фигура 5 показывает выявление GM-1 на модели двухдневной индукции овуляции у неполовозрелой крысы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Несмотря на то, что показано, что увеличение содержания углеводов в FSH может приводить к увеличению периода полувыведения in vivo, увеличение периода полувыведения FSH является более сложным, чем простое добавление дополнительных сайтов гликозилирования. В то время как для добавления углеводов необходимо гликозилирование
консенсусной последовательности, не достаточно гарантировать, что будет использоваться сайт добавления углеводов.
Прикрепление олигосахарида на заданном сайте
консенсусной последовательности определяется другими факторами, такими как локальная укладка структуры белка и конформация в процессе биосинтеза. Кроме того, положение
консенсусной последовательности должно быть таким, чтобы сайт гликозилирования не взаимодействовал с рецепторным связыванием или не нарушал укладку, конформацию или устойчивость гликопротеина.
До сих пор аналоги FSH с увеличенными периодами полувыведения ограничивались слитыми белками, в которых слитый участок полипептида включал в себя дополнительные сайты гликозилирования. Тем не менее, аналоги FSH с увеличенными периодами полувыведения должны быть получены путем введения сайтов гликозилирования сайт-направленным мутагенезом.
Понимание структуры FSH является решающим при добавлении сайтов гликозилирования путем сайт-направленного мутагенеза, поскольку необходимо, чтобы консенсусные остатки были добавлены в положения, которые являются приемлемыми для углеводного добавления. Если сайт гликозилирования введен путем мутации, мутированные остатки не должны нарушать трехмерную структуру белка или существенно понижать желательную функцию белка, такую как рецепторное связывание или активацию. Кроме того, консенсусные остатки должны быть добавлены таким образом, чтобы они не погружались внутрь уложенной белковой структуры, иначе маловероятно, что гликозилирование пройдет на конкретном сайте.
До недавнего времени информация о трехмерной структуре гонадотропинов была ограничена двумя независимыми сообщениями о кристаллической структуре hCG: в одном рассматривалась структура частично дегликозилированного hCG (Lapthorn et al., 1994; Wu et al., 1994) и в другом - структура с низким разрешением трехчастного комплекса полностью гликозилированного hCG и двух Fv-фрагментов (Tegoni et al., 1999).
При том, что hCG и FSH имеют по существу идентичный характер укладки, две эти структуры значительно различаются (Fox et al, 2001) , и не возможно на основе ранее определенных структур hCG полноценно смоделировать подробную структуру
отдельных аминокислотных остатков у молекулы FSH (Wu et al, 1994; Lapthorn et al, 1994).
Настоящее изобретение направлено на мутантный FSH, который был разработан исключительно на основе трехмерной кристаллической структуры молекулы человеческого FSH (Fox et al, 2 001). Мутантный FSH настоящего изобретения ("GM-1") модифицировали для внедрения следующих заместителей с целью создания дополнительных сайтов узнавания для гликозилирования: H83N у а-субъединицы и E55N/V57T у (5-субъединицы. Возможно гликозилирование одного или более дополнительных сайтов гликозилирования рекомбинантного FSH. Этот один или более дополнительных сайтов гликозилирования мутантного FSH могут быть гликозилированы in vitro или in vivo.
Мутантный FSH настоящего изобретения может быть получен любым приемлемым способом, известным в данной области техники. Эти способы включают в себя конструирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующие мутанты FSH и экспрессию аминокислотной последовательности в подходящем трансфецированном хозяине. Мутантный FSH настоящего изобретения может также быть получен путем химического синтеза или сочетанием химического синтеза и технологий рекомбинантных ДНК.
Мутантный FSH настоящего изобретения может содержать а- и |3-субъединицы FSH в форме двух отдельных полипептидных цепей, где эти две цепи димеризуются in vivo с образованием димерного полипептида, или мутантный FSH может содержать одноцепочечную конструкцию, содержащую эти две субъединицы, ковалентно связанные пептидной связью или пептидным линкером. Свойства, которые могут проявлять аминокислотные остатки пептидного линкера, значительно не влияют на активность мутантного FSH.
Мутантный FSH настоящего изобретения может иметь увеличенный период полувыведения по сравнению с диким типом FSH. Мутантный FSH настоящего изобретения, возможно, обладает также повышенной стабильностью по сравнению с диким типом FSH. Мутантный FSH может содержать олигосахариды наО, 1, 2, 3, 4, 5 или на 6 из N-связанных сайтов гликозилирования. Мутантный FSH
может содержать одну или более изоформы мутантного FSH, при этом каждая изоформа содержит олигосахариды на 0, 1, 2, 3, 4, 5 или на б из N-связанных сайтов гликозилирования.
Можно создать нуклеотидную последовательность, кодирующую а- или р-субъединицы мутантных FSH настоящего изобретения путем выделения или синтеза нуклеотидной последовательности, кодирующей родительскую субъединицу FSH, такую как hFSH-альфа или hFSH-бета с аминокислотными последовательностями, показанными соответственно в SEQ ID No: 3 и 4. Возможно изменение нуклеотидной последовательности для выполнения замены соответствующих аминокислотных остатков. Можно изменять нуклеотидную последовательность сайт-направленным мутагенезом. В качестве альтернативы нуклеотидная последовательность может быть получена путем химического синтеза, в котором олигонуклеотиды созданы на основе конкретной аминокислотной последовательности мутантного FSH.
Возможна вставка нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в рекомбинантный вектор и функциональное связывание с контрольными последовательностями, необходимыми для экспрессии полипептида в желаемой трансфецированной клетке-хозяине. В одном из вариантов из данной области техники можно обойтись без неправомерного экспериментирования для того, чтобы сделать выбор среди этих векторов, контрольных последовательностей экспрессии и хозяев. Рекомбинантный вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, то есть вектором, существующим как экстрахромосомная единица, репликация которой происходит независимо от хромосомной репликации, например, плазмидой. С другой стороны, вектором может быть вектор, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой (хромосомами), в которую он был интегрирован.
Вектор может быть вектором экспрессии, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид настоящего изобретения, является функционально связанной с дополнительными сегментами, необходимыми для транскрипции
нуклеотидной последовательности. Вектор может быть производным плазмиды или вирусной ДНК. Ряд векторов экспрессии, подходящих для экспрессии в вышеупомянутых клетках-хозяевах, являются коммерчески доступными или описаны в литературе.
Рекомбинантный вектор может дополнительно содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозяине. Примером такой
последовательности (когда клетка-хозяин - это клетка млекопитающего) является начало репликации SV40. Вектор может также содержать выбранный маркер, например ген, чей продукт комплементирует дефект в клетке-хозяине, такой как ген, кодирующий дигидрофолат редуктазу (DHFR), или ген, который передает резистентность к лекарственному средству, например ампициллину, канамицину, тетрациклина хлорамфениколу, неомицину, гигромицину или метотрексату.
Вектор может также содержать амплифицированный ген, такой как DHFR,. с тем, чтобы возможно было отобрать на соответствующих средах клетки, имеющие множественные копии амплифицированного гена и фланкирующих последовательностей, включающие в себя ДНК мутантного FSH. Определение термина настоящей заявки "контрольные последовательности" охватывает все компоненты, которые являются необходимыми или предпочтительными для экспрессии полипептида настоящего изобретения. Примеры подходящих контрольных последовательностей для направления транскрипции в клетках млекопитающих включают в себя ранние и поздние промоторы SV40 и аденовирусы, например, основной поздний промотор аденовируса 2, промотор МТ-1 (гена металлотионеина) и предранний промотор гена человеческого цитомегаловируса (CMV).
Настоящее изобретение также связано с изолированной ДНК, кодирующей ос-субъединицу H83N и с изолированной ДНК, кодирующей |3-субъединицу E55N/V57T FSH. Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения, кодирующие мутанты FSH, созданные путем сайт-направленного мутагенеза, синтезом, ПЦР или другими способами, могут также необязательно включать в себя
нуклеотидную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид. Сигнальный пептид присутствует в случае, когда полипептид должен секретироваться из клеток, в которых он экспрессируется. В случае присутствия такого сигнального пептида, он должен распознаваться клеткой, выбранной для экспрессии полипептида. Сигнальный пептид для полипептида может быть гомологичным (например, являться обычно связанным с субъединицей hFSH) или гетерологичным (то есть происходящим не из hFSH) , или он может быть гомологичным или гетерологичным для клетки-хозяина, то есть быть сигнальным пептидом, обычно экспрессируемым клеткой-хозяином или сигнальным пептидом, который обычно не экспрессируется клеткой-хозяином.
Любой подходящий хозяин может использоваться для получения полипептидных субъединиц настоящего изобретения, включая бактерии, грибы (включающие в себя дрожжевые грибы), растительные клетки, клетки насекомых, млекопитающих, или другие адекватные животные клетки или клеточные линии, а также трансгенные животные или растения. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают в себя клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО), (например, CHO-KL; линии Американской коллекции типовых культур АТСС CCL-61), клеточные линии зеленой мартышки (COS) (например, COS 1 (АТСС CRL-1650) , COS 7 (АТСС CRL-1651)); клетки мыши (например, NSIO), клеточные линии почки детенышей хомячков (BI-EK) (например, АТСС CRL-1632 или АТСС CCL-10), и человеческие клетки (например, ВЕК 293 (АТСС CRL-1573)), а также растительные клетки в культуре тканей. Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области техники и доступны в общественных хранилищах, таких как Американская коллекция типовых культур США. Способы введения экзогенной ДНК в клетку-хозяина млекопитающего включают в себя трансфекцию, опосредованную фосфатом кальция, электропорацию, трансфекцию, опосредованную диэтиламиноэтил-декстраном (DEAE декстраном), липосомно-опосредованную трансфекцию и вирусные векторы.
Используя способы, известные в данной области техники, можно выращивать клетки в подходящей для создания полипептида
питательной среде. Например, клетки можно выращивать путем культивирования во встряхиваемой колбе, путем маломасштабной или крупномасштабной ферментации (включающей в себя непрерывную, периодическую, периодическую с подпиткой, или твердофазную ферментацию) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляя культивирование в подходящей питательной среде и при условиях, позволяющих экспрессировать и/или выделять полипептид. Культивирование происходит в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с использованием методик, известных в данной области техники. Подходящие среды можно получить у частных поставщиков или их можно приготовить в каталогах с опубликованной информацией о композициях (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). При секреции полипептида в питательную среду, он может быть извлечен непосредственно из питательной среды. Если полипептид не секретируется, он может быть извлечен из клеточных лизатов.
Получаемый полипептид мутантного FSH может быть извлечен способами, известными в данной области техники. Например, его можно извлекать из питательной среды в соответствии с общепринятыми методиками, включающими в себя центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, распылительную сушку, испарение или осаждение, но не ограничиваясь вышеперечисленным. Полипептиды мутантного FSH могут быть очищены с помощью различных методик, известных в данной области техники, включающих в себя хроматографию (например ионообменную, аффинную, гидрофобную хроматографию, хроматофокусирование и гель-фильтрацию), электрофоретические методики (например, препаративную изоэлектрическую фокусировку), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) , SDS-PAGE, или экстракцию, но не ограничиваясь вышеперечисленным.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей мутантный FSH согласно настоящему изобретению. Такие фармацевтические композиции могут использоваться для стимуляции фолликулогенеза, например, в сочетании с индукцией овуляции или вспомогательными
репродуктивными технологиями (ART) . Мутантный FSH настоящего изобретения является особенно эффективным для индукции развития и созревания множественных фолликулов, поэтому он в особенности подходит для использования в ART, для которых желательно получение множественных ооцитов.
С другой стороны, мутантный FSH настоящего изобретения при тщательном подборе дозы может применяться для стимуляции монофолликулогенеза для индукции овуляции (01), или фолликулогенеза по Паку (примерно до трех фолликулов) для внутриматочного оплодотворения (IUI), для оплодотворения in vivo. Монофолликулогенез также можно вызвать сниженной дозой мутантного FSH, или менее частым введением по сравнению с обычными препаратами FSH. Например, для 01 препарат FSH настоящего изобретения может вводиться в дозе 225-400 ME (международных единиц) каждые три дня, или в более низкой дозе, в зависимости от реакции пациента. Реакцию пациента можно отслеживать ультразвуковым исследованием.
Мутантный FSH настоящего изобретения может применяться для режима управляемой гиперстимуляции яичников (СОН). Стандартные режимы для СОН включают в себя фазу понижающей регуляции, в которой эндогенный лютеинизирующий гормон (LH) регулируется по типу отрицательной обратной связи введением агониста гонадотропинвысвобождающего гормона (GnRH), с последующей фазой стимуляции, в которой развитие фолликула (фолликулогенез) стимулируется ежедневным введением фолликулостимулирующего гормона (FSH), обычно в примерной дозе 150-225 МЕ/день. Альтернативная стимуляция начинается с FSH после спонтанной или вызванной менструации, с последующим введением антагониста GnRH (обычно начиная с примерно шестого дня фазы стимуляции) . При наличии по меньшей мере 3 фолликулов размером > 16 мм (одного, равного 18 мм) , для симуляции естественного выброса LH и индукции овуляции дается единственный болюс hCG (5-10000 ME) . Выход ооцита синхронизируется на 36-38 часов после введения hCG.
Мутантный FSH настоящего изобретения может также применяться для 01 и IUI. Например, FSH-стимуляция в суточной
дозе 75-150 ME с применением препаратов настоящего изобретения начинается после спонтанной или вызванной менструации. Когда 1 или 3 фолликула достигают диаметра по меньшей мере 16 мм, для индукции овуляции дается единственный болюс hCG. Оплодотворение осуществляется in vivo с регулярными половыми сношениями или путем IUI.
Поскольку мутантный FSH настоящего изобретения может иметь увеличенный период полувыведения относительно препаратов дикого типа FSH, для режимов, таких как вышеописанные режимы, можно использовать более низкие дозы FSH в ME, и/или режимы можно модифицировать путем уменьшения периода FSH-стимуляции, получая при этом такую же или лучшую ответную реакцию, в плане количества и жизнеспособности фолликулов. Например, применяя препараты FSH настоящего изобретения, можно достичь адекватного фолликулогенеза при суточных дозах, равных или около 50-150 ME FSH, предпочтительно равных или около 50-100, более предпочтительно равных или около 50-75 ME FSH. Введение FSH обычно осуществляют на ежедневной или полусуточной основе. Период введения может составлять менее чем 14 или около дней, предпочтительно менее, чем 12 или около дней, более предпочтительно менее, чем 11 или 10 или около дней. Препараты мутантного FSH настоящего изобретения для 01 могут вводиться в дозах от 25-150 ME FSH в день, предпочтительно, 50-125 ME FSH в день. Для лечения мужского бесплодия препараты мутантного FSH настоящего изобретения могут вводиться в дозе 3 х от 150 до 300 ME в неделю до достижения уровня сперматогенеза, адекватного для оплодотворения, как в результате регулярных половых сношений, так и техники ART.
Благодаря более длинному периоду полувыведения мутантного FSH настоящего изобретения, он может вводиться как препарат пролонгированного действия. Обычный FSH может вводиться в дозе, равной или около 300 ME через день, при достижении сходных результатов при ежедневном введении в дозе, равной или около 150 ME. Подразумевается, что формулировка "пролонгированное действие" охватывает препараты FSH, которые могут вводиться
реже, чем каждые два дня. Мутантный FSH настоящего изобретения может вводиться каждые три дня, каждые четыре дня, каждые пять дней, каждые шесть дней или каждые семь дней, при этом достигаются сходные или лучшие результаты, чем ежедневное введение обычного FSH.
В родственных аспектах, мутантный FSH или фармацевтические композиции, содержащие мутантный FSH, используются для производства лекарственного препарата для лечения заболеваний, нарушений или состояний. В другом аспекте, полипептид или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, используются в способе лечения млекопитающего, в частности человека, предусматривающем введение млекопитающему,
нуждающемуся в таком лечении, такого полипептида или фармацевтической композиции.
Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что эффективное количество полипептида, препарата или композиции настоящего изобретения зависит, в числе прочего, от заболевания, дозы, графика введения, от того, применяются ли полипептид или препарат или композиции отдельно или в сочетании с другими терапевтическими средствами, от периода полувыведения композиции из сыворотки, и от общего состояния здоровья пациента. Обычно, эффективная доза препарата или композиции настоящего изобретения является достаточной, чтобы гарантировать терапевтический эффект.
Мутантный FSH настоящего изобретения может вводиться в композиции, включающей в себя один или более фармацевтически приемлемых носителя или наполнителя. Термин "фармацевтически приемлемый" означает, что при введении пациентам носителя или наполнителя у них не возникает никаких неблагоприятных эффектов. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители широко известны в данной области техники, и полипептид настоящего изобретения может быть введен в фармацевтические композиции общеизвестными способами (см. например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer
and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)). Фармацевтически приемлемые наполнители, которые могут использоваться в композиции, содержащей полипептид настоящего изобретения, включают в себя, например, буферные вещества, стабилизирующие вещества, консерванты, средства, обеспечивающие изотоничность, неионные сурфактанты или детергенты ("смачивающие средства"), антиоксиданты, наполняющие агенты или наполнители, хелатообразующие средства и сорастворители.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения, содержащая мутантный FSH, может быть образована в виде разнообразных форм, включающих в себя жидкости, например готовые для применения растворы или суспензии, гели, лиофилизированные, или любые другие подходящие формы, например порошковая или кристаллическая, подходящие для приготовления раствора. Форма композиции может зависеть от конкретных показаний для лечения и будет очевидной для специалиста в данной области техники.
Фармацевтическая композиция, содержащая мутантный FSH настоящего изобретения, может вводиться внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, подъязычно, трансбуккально, интраназально, трансдермально, в виде ингаляции или любым другим приемлемым образом, например, используя техники PowderJect или ProLease или систему для инъекций карандашного типа. Способ введения может зависеть от конкретных показаний для лечения и будет очевиден для специалиста в данной области техники. Композиция может вводиться подкожно, так как это может позволить пациенту проводить инъекции самостоятельно.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут вводиться в сочетании с другими терапевтическими средствами. Эти средства могут являться частью указанной фармацевтической композиции или могут вводиться отдельно от полипептида настоящего изобретения, как одновременно, так и в соответствии с любым другим приемлемым графиком терапии. Кроме того,
полипептид, препарат или фармацевтическая композиции настоящего изобретения могут применяться в качестве дополнения к другим видам терапии.
Настоящее изобретение имеет множество аспектов, иллюстрируемых следующими примерами, не ограничивающими объем настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
Моносайтовые мутантные FSH
Идентификация возможных сайтов гликозилирования
Для идентификации возможных сайтов гликозилирования в а- и р-субъединицах FSH использовали трехмерную кристаллическую структуру человеческого FSH. В каждой асимметричной единице кристаллической структуры присутствовали две молекулы FSH (четыре субъединицы) . Две молекулы FSH совмещали и сравнивали, при этом каждый остаток визуально проверяли для идентификации потенциальных сайтов N-гликозилирования. Кристаллографическую структуру FSH соединяли со знанием рецепторного взаимодействия FSH/FSHR, чтобы дополнительно помочь в выборе потенциальных сайтов N-гликозилирования. Основными критериями конструирования являлись минимальное разрушение трехмерной структуры, минимальное разрушение предполагаемого места связывания и сайтов активации, и совместимость гликозилирования с предполагаемой трехмерной структурой.
На основе вышеописанных критериев для аминокислотной последовательности FSH были созданы двадцать моносайтовых мутантов (8а и 12 Р), включающих в себя следующие два мутанта:
а-субъединицу H83N
р-субъединицу E55N/V57T
Транзиторная экспрессия FSH с моносайтовой мутацией Каждый из этих мутантов получали сайт-направленным мутагенезом, осуществлявшимся сходным с описанным в Примере 3 образом. Сходным с описанным в Примере 4 образом мутанты транзиторно экспрессировались в малом масштабе в клетках СНО-Dukx вместе с комплиментарной субъединицей дикого типа. ELISA-анализ полученных культивированием супернатантов определил, что 19 из этих 20 мутантов обладали способностью к транзиторной
экспрессии. Уровни транзиторной экспрессии контрольных групп и мутантов находились в диапазоне от 0 до 1,95 мкг/мл, соответственно, со средним значением 0,59 и медианой 0,5 мкг/мл, и 0 мкг/мл, неоднократно подтвержденными в пробных трансфекциях.
Морфологический анализ FSH с моносайтовой мутацией
Аликвотные количества концентрированных культивированных супернатантов транзиторно экспрессируемых FSH с моносайтовой мутацией анализировали электрофорезом при условиях нередуцированной LDS-PAGE, с разрешающей способностью, позволяющей выделять в интактных гетеродимерах FSH свободные а-и р-субъединицы. Белки переносили электрофорезом в PVDF (поливинилиденфторид) и анализировали с использованием первичных антител против а- и р-субъединиц FSH. Проводили пред-скрининговое тестирование ряда первичных антител от различных поставщиков, после чего их иногда использовали в качестве подтверждения анализа, но полезными первичными антителами с наибольшим постоянством оказались Chromaprobe BHS104 (биотинилированные поликлональные анти- а-субъединицы FSH козла) в дозе 1,5 мкг/мл и Chromaprobe BHS 105 (мышиные моноклональные анти- р-субъединицы FSH) в дозе 1,5 мкг/мл.
Два дополнительных типа морфологического анализа дополнили Вестерн-блоттинги гетеродимер-интактных образцов. Проводили анализ Вестерн-блоттинг гетеродимер-диссоциированных проб и авторадиографию разделенных электрофорезом гетеродимер-диссоциированных иммунных преципитатов мутантных и контрольных групп, метаболически меченых 35S-Cys.
Только у пяти мутантов из 19 экспрессируемых мутантных FSH проявлялось повышенное гликозилирование, что подтверждалось изменением распределения кажущейся молекулярной массы субъединицы или гетеродимера. Эти пять мутантов, проявляющих повышенное гликозилирование, включали в себя одну мутантную а-субъединицу и четыре мутантные р-субъединицы, включающие в себя E55N/V57T.
Интересно, что а-субъединичный мутант aH83N не проявлял
признаков повышенного гликозилирования, но, по-видимому, приводил к увеличению избытка гетеродимеров в белковой популяции относительно избытка гетеродимеров среди дикого типа субъединиц FSH, совместно экспрессируемых в сходных транзиторных условиях.
Период полувыведения транзиторно экспрессируемых FSH с моносайтовой мутацией
Фармакокинетику полученных транзиторной экспрессией пяти гипергликозилированных моносайтовых мутантов, включающих в себя 3 E55N/V57T, сравнивали с Gonal-F. Gonal-F - это рекомбинантная форма FSH, являющаяся неотличимой от нативного hFSH. Анализом ELISA количественно определяли содержание FSH во вводимом материале и образцах крысиной сыворотки, отбираемых в заданные точки времени вслед за введением, для каждого фармакокинетического эксперимента (РК). Ни один из 5 моносайтовых мутантов, включающих в себя 3~субъединичный мутант E55N/V57T, не показал более продолжительного, чем у контрольного Gonal-F, периода полувыведения.
Очистка и анализ мутантов с моносайтом гликозилирования
Иммуноаффинной хроматографией выделяли и очищали три из четырех гипергликозилированных моносайтовых 3~субъединичных мутанта, включающих в себя мутант E55N/V57T. С рекомбинантным FSH сравнивали активность in vitro трех гипергликозилированных моносайтовых 3~субъединичных мутанта, включающих в себя мутант E55N/V57T, путем исследования (i) способности конкурировать с меченным радиоактивным изотопом 125I FSH в связывании с мембранными препаратами, содержащими рецептор (Ki) человеческого FSH и способных стимулировать FSHR-иммобилизированную выработку цАМФ (ЕС5о) :
EC50
3 E55N/V57T
8, 6хЮ"1иМ
3, 9хЮ_11М
rhFSH
4, 8х1СГ1иМ
l,2xlO_iiM
Вышеприведенные результаты показывают, что 3_сУбъединичный мутант E55N/V57T имеет сопоставимую с диким типом FSH активность in vitro. Фактически, каждый из этих трех
моносайтовых (3-субъединичных мутантов имеет сопоставимую с диким типом FSH активность in vitro. Кроме того, масс-спектрометрический анализ очищенных моносайтовых р-субъединичных мутантов показывает, что изменения в распределении масс отмечены у каждого из этих трех мутантов. Однако, фармакокинетика очищенных белков, определяемая после единственного в/в введения неполовозрелым самкам крыс, не показывала существенно пролонгированного периода полувыведения ни у одного моносайтового гликозилированного мутанта. По сравнению с rhFSH, который имеет период полувыведения 3,8 ± 0,6 часа, PE55N/V57T имеет период полувыведения 4,8 ± 0,4 часа. ПРИМЕР 2
Получение и анализ двухсайтовых гликозилированных мутантов
Так как моносайтовые а-субъединичные и моносайтовые р-субъединичные мутанты были не способны увеличивать продолжительность периода полувыведения FSH, объединяли два моносайтовых а-субъединичных мутанта с тремя из моносайтовых р-субъединичных мутантов в транзиторной экспрессии для создания шести различных двухсайтовых мутантов, включающих в себя GM-1, который содержал а-субъединичный мутант H83N и р-субъединичный мутант E55N/V57T.
Пять из шести двухсайтовых мутантов, включающих в себя GM-1, были способны экспрессироваться. Пять двухсайтовых мутантов, способных экспрессироваться, анализировали на способность стимулировать FSHR-иммобилизированную выработку иАМФ. Каждый из этих пяти двухсайтовых мутантов, включающих в себя GM-1, сопоставляли с rhFSH по способности стимулировать FSHR-иммобилизированную выработку цАМФ in vivo.
Фармакокинетику этих же пяти двухсайтовых мутантов FSH сравнивали с фармакокинетикой рекомбинантного hFSH и CTP-FSH. Результаты Таблицы 1 показывают, что период полувыведения GM-1 значительно больше, чем у rhFSH и приближается к периоду полувыведения CTP-FSH.
Таблица 1
Фармакокинетика
Белок
ti/2(h)
rhFSH
3,4±0,5
CTP-FSH
7,6±2,6
GM-1
5,1±1,6
Является неожиданным увеличенный период полувыведения GM-1, принимая во внимание, что сам по себе моносайтовый (3-субъединичный мутант E55N/V57T не влияет на период полувыведения. Увеличенный период полувыведения GM-1 также вызывает удивление ввиду того, что а-субъединичный мутант H83N не ведет к повышению гликозилирования.
ПРИМЕР 3
Получение GM-1
Комплиментарную ДНК (кДНК) а- и |3-субъединиц человеческого FSH субклонировали в векторе pDONR (Invitrogen). Для внедрения N-связанных сайтов гликозилирования в а- и |3-субъединицы FSH использовали систему QuikChange(tm) Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). В системе QuikChange(tm) применяются два синтетических олигонуклеотидных праймера, содержащих желательную мутацию (мутации). Для внедрения N-связанных сайтов гликозилирования использовали следующие пары олигонуклеотидов:
Таблица 2
Олигонуклеотиды
Субъединица
Мутация
Олигонуклеотиды
SEQ ID No.
H83N
cacacggcgtgcaactgcagtacttg
SEQ Ш No.5
H83N
caagtactgcagttgcacgccgtgtg
SEQ Ш No.6
E55N, V57T
gcactctcactgtttcatatgtcaggttcttgaaggtacatgttttctg
SEQ Ш No.7
E55N, V57T
cagaaaacatgtaccttcaagaacctgacatatgaaacagtgagagtgc
SEQ Ш No.8
Последовательности мутантов подтверждали, используя терминатор ABI PRISM BigDye(tm) Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit с последующим использованием анализатора ABI PRISM 310 Genetic Analyzer.
Мутанты O.H83N и [3E55/V57T субклонировали в
модифицированном векторе экспрессии рС1 с использованием техники Gateway(tm) Cloning Technology (Invitrogen) , до выделения плазмид р13251 и р13252, как показано в Фигурах 1 и 2. Предварительно вектор экспрессии рС1 млекопитающих (Promega) конвертировали в целевой вектор, используя систему GATEWAY Vector Conversion System (Invitrogen). Вектор экспрессии pCI содержит человеческий цитомегаловирус и предранний ген-усилитель/промотор для регуляции экспрессии вставленного гена, интрон, расположенный выше по ходу гена, промотирующий экспрессию и обезьяний вирус 40 замедленного сигнала полиаденилирования, расположенный ниже по ходу от вставленного гена для терминации транскрипции.
На Фигуре 3 показано, что aH83N мутант также субклонировали в Da векторе до получения плазмид р13538. Вектор Da является производным от pCLH3AXSV2DHFR. Вектор модифицировали с включением в него гетерологичного интрона с синтетическим донором сплайсированного фрагмента,
конструируемого выше по ходу фрагмента в 2 т.п.н Xbal-PstI интрона А гонадотропина а-субъединичного гена (содержащего акцепторную точку сплайсинга). Гетерологичный интрон расположен между промотором и клонирующимся сайтом Xhol, помещая его в 5' нетранслируемую область РНК транскрипта. Более подробно вектор Da описан в исследованиях Kelton et al., Mol Cell Endocrinol 89:141-151 (1992).
ПРИМЕР 4
Экспрессия мутантного FSH
Мутант гликозилированного FSH GM-1 сначала получали ("GM-1 Lot 1") со-трансфекцией pl3251 (aH83N) и pl3251 ((3E55/V57T) , с тем, чтобы транзиторно получить экспрессию гонадотропина в бессывороточной питательной среде. Для крупномасштабной липофектамин-опосредуемой трансфекции (12-24 колб Т175) клетки CHO-Dukx высевали в количестве 1,3 х 107 клеток/на колбу в среду для выращивания (минимальная поддерживающая среда MEM a( + ), 10% фетальной бычьей сыворотки FBS, 1% L-глутамина) в течении 18-24 часов до трансфекции. Для трансфекции клеток
приготовляли смесь липофектамин 2000/Optimem в общей массе (одна часть на 17,6) и также приготовляли отдельную порцию ДНК в Optimem, применяя формулу: 33 мкг ДНК на каждую субъединицу (всего 66 мкг) на колбу Т175. Через двадцать минут после соединения препаратов Optimem/ДНК и Optimem/липофектамин, ДНК/липофектаминовые комплексы в Optimem распределяли (~10мл/ на колбу) на только что подпитанные (43,8мл/на колбу) клеточные монослои. После инкубации при 37° в течении четырех-шести часов клеточные монослои подпитывали 50 мл среды для выращивания. Примерно через 24 часа после трансфекции клетки переносили в продуцирующую питательную среду (Sigma СНО РЕМ с добавлением L-глутамина или в среду Serono - фирменное название препарата Sigma СНО PFM С0234). Через 48 часов получали кондиционированную продуцирующую питательную среду. ПРИМЕР 5
Клоны мутантного FSH Протоклоны
Используя стандартные методики, осуществляли
фосфатнокальциевую со-трансфекцию клеток CH0-DUKX с aH83N в Da (плазмида #13538) и 0E55N/V57T в pCIattR (плазмида #13252) в соотношении 1:3. Протоклоны производили через 48 часов после трансфекции путем высевания клеток в среду выбора (MEM а(-), 10% диализировэнной фетальной бычьей сыворотки dFBS, 4 ммоль L-глутамина) в количестве 10000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты (всего 1596 лунок). Примерно через 2 недели протоклоны разводили 1:8 средой выбора, содержащей 0,02 мкмоль метотрексата МТХ. Через возрастающие концентрации МТХ (0,1 мкмоль (192 лунок), 0,5 мкмоль, 1,0 мкмоль (116 лунок)) этот процесс разведения повторяли в течение 6-8 недель при 116 протоклонах, сохраняющихся в 1,0 мкмоль МТХ.
116 протоклонов оценивали на экспрессию лабораторной диагностической системой DSL ELISA, используя 24-часовые образцы экспрессии из 96-луночных планшетов (в 1,0 мкмоль МТХ и 10% FBS). Уровни экспрессии варьировали от значений, находящихся снизу за шкалой до 3,72 мкг/мл. Семнадцать
протоклонов с самой высокой экспрессией распределяли в 24-луночные планшеты, в колбу Т25, и затем замораживали 3 набора пробирок каждого протоклона. Два верхних протоклона оттаивали и для подтверждения экспрессии распределяли в масштабе Т25. GM1-21 и GM1-22 имели волюметрическую продуктивность соответственно 1,74 и 0,74 мкг/мл, со специфической продуктивностью, соответственно, 5,06 и 1,28 pcd. На основании этих результатов, GM1-21 выбрали для клонирования и производства второй партии GM-1 в роллерных флаконах, как описано в Примере 6. Клоны
Клонирование методом серийных разведений начинали с введения в 96-луночные планшеты 0,25, 0,5, 1,0, и 2,0 GM-1-21 клеток/на лунку, соответственно. Средой клонирования была DMEM/F12, содержащая 10% культуральной cFBS и 1% L-глутамина при отсутствии МТХ. Все лунки исследовали под микроскопом и устраняли любые лунки, содержащие множество клеток.
Примерно через 2 недели выращивания клеточные популяции распределяли в 24-луночные планшеты и, окончательно, в колбы Т25. Как только конфлуэнтность клеток достигала 80-100%, определяли волюметрическую продуктивность, используя DSL ELISA FSH (образцы содержали 10% FBS). Лучшие 8 клонов распределяли в колбы Т75 для определения 24-часовой волюметрической продуктивности и специфической экспрессии. Три набора пробирок каждого клона замораживали в среде DMEM/F12, содержащей 10% cFBS, 1% L-глутамина, и 10% ДМСО. Наивысшую волюметрическую продуктивность проявлял CHO-B1-GM1-21-98, составляющую 7,21 мкг/мл со специфической продуктивность в 6,25 pcd. Напротив, CHO-B1-GM1-21-107 проявлял самую высокую специфическую продуктивность, составляющую 7,71 pcd, с волюметрической продуктивностью в 5,81 мкг/мл.
CHO-B1-GM1-21-98 и CHO-B1-GM1-21-107 распределяли в четыре колбы Т175. При примерной конфлуэнтности клеток, составляющей 90%, пре-МСВ (25 пробирок каждого клона) замораживали в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, 1% L-глутамина, и 10% ДМСО. GM1-21-98 (пассаж 7) содержал 3,26 миллионов клеток на пробирку, и GM1-21-07 (пассаж 6) содержал 6,1 миллионов клеток на пробирку.
Пробирки каждой группы отправили в лабораторию Charles River Laboratories (Malvern, PA) для испытаний GMP. Испытания включали в себя РТС на микоплазму, стерильность, MAP с разрешающим тестированием на LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита), НАР - тестирование, расширенное фокусное индуцированное тестирование in vitro на ксенотропный вирус лейкемии мышей, расширенный ХС анализ бляшкообразования для вируса лейкемии мышей, и изоферментный анализ, с проведением всех испытаний каждого способа. ПРИМЕР б
Дополнительная экспрессия мутантного FSH
GM-1 получали, выращивая протоклон Protoclone GM1-21, вышеописанный в Примере 5, в двух роллерных флаконах площадью 850 см2 ("GM-1 Lot 2") . Объем бессывороточной питательной продуцирующей среды (DMEM-F12 + IFCS), кондиционированной для этой пробы, составлял 2600 мл. Небольшое количество (13 мл) концентрированного культивированного супернатанта, содержащего примерно 0,2 мг GM-1, оставляли на хранении в Serono Reproductive Biology Institute (SRBI) при -80C°, так как 36 мл аликвотного количества концентрированного культивированного супернатанта было потеряно во время диализного переноса. Количества определяли с помощью лабораторных диагностических систем DSL Active(r) FSH ELISA с использованием конвертации: 1МЕ = 138 нг FSH.
ПРИМЕР 7
Очистка мутантного FSH Подготовка пробы
Продуцирующую среду, содержащую мутантный FSH, собирали и фильтровали с использованием 0,22 мкм фильтрующих элементов и замораживали при -7 0°С Белки-мишени в среде оттаивали в течении ночи при температуре 4°С, и концентрировали ультрафильтрацией, используя устройство Ultrasette Screen Channel TFF, мембрану 10 К Omega, P/N 0S010C70, от фирмы Pall Life Science. Извлекали ретентат и подвергали диализу в течении ночи против раствора 0,1 моль триса, с рН 7,4 содержащего 3x5 литров 0,5 моль NaCl.
Диализованный белок извлекали, фильтровали с использованием 0,22 мкм, и немедленно очищали или сохраняли при -70°С до очистки.
Иммуноаффинная очистка
Мутант гликозилирования GM-1 очищали анти-FSH иммуноаффинной смолой В5 (Serobio), содержащей 2,2 мг анти-FSH антител в мл смолы. Объемный слой в 10,2 мл приготавливали в колонке OmniFit размером 1,5 см х 10 см. Смола была предварительно уравновешена 0,1 моль трисом, с рН=7,4, содержащим 0,5 моль NaCl. Диализованный общий белок загружали со скоростью 1 мл/в минуту. Колонку последовательно промывали: 0,1 моль Трисом, рН=7,4, содержащим 0,5 моль NaCl, в объеме, составляющем пять объемов колонки, 100 ммоль бикарбоната аммония с рН=7,6 в пять объемов колонки, и белком-мишенью, элюированном 1 моль NH4OH в объеме, равном 18-20 объемам колонки. Фракции, содержащие элюированный белок, объединяли, нейтрализовали ледяной уксусной кислотой, и концентрировали ультрафильтрацией с размешиванием клеток Amicon, используя мембрану Amicon YM 10. Ретентат подвергали диализу в диализной трубке Pierce Snakeskin, 10 К MWCO, против 4x5 литров воды в течении 24 часов. Диализованный белок восстанавливали и концентрировали с помощью Centriprep YM 10, для уменьшения объема до примерно одного мл.
Определение характеристик
Предполагаемым восстановлением очищенного белка GM-1 путем этого единственного этапа иммуноаффинного процесса является чистота гетеродимера, составляющая 31,4-52,9% в белковой концентрации от 73,8 до 80,6%, определяемой анализом аминокислотной композиции и молекулярным весом по формуле соединения, исходно составляющая 35000 Да в соответствии с данными MALDI-TOF гликоформенного распределения субъединиц.
Идентичность белка подтверждали секвенированием N-концевого пептида. Все N-концевые последовательности в GM-1, возможные для идентификации, отображали концы или а-субъединицы или (3-субъединицы FSH. Хотя невозможно установление
идентичности единственной малораспространенной зоны локализации белка, визуально определяемой по окрашиванию серебром, данные соответствовали чистоте субъединиц > 80%. ПРИМЕР 8
Морфология мутантного FSH
Для определения гликоформенного распределения очищенного белка проводили MALDI-TOF масс-спектрометрию GM-1 и Gonal-F. Масс-спектрометрический анализ, показанный в Фигуре 4А, показывает увеличение на 26%, по отношению к Gonal-F, относительной распространенности масс у классов с GM-1, содержащих гипергликозилированные формы, где они содержат всего 36,8% субъединичных гликоформ в противоположность 29,2% субъединичных гликоформ у Gonal-F. Различие масс-спектров между Gonal F и GM-1 по MALDI-TOF соответствует изменениям в распределении кажущихся молекулярных масс субъединицы и гетеродимера, и визуально определяются по ПААГ с окрашиванием серебром и вестерн-блоттингом (Фигура 4В).
В условиях масс-спектрометрии MALDI-TOF у GM-1 проявляется избирательное сохранение ар гетеродимерной конформации, показанное на Фигуре 4С, в отличие от случайного распределения act, ар, и ЭР димеров, отмечаемого у Gonal F. Предлагается, что GM-1, меньше чем Gonal-F, диссоциируется в условиях подготовки анализа MALDI-TOF, и это соответствует тому, что гетеродимер GM-1 считают возможным иметь более высокую термодинамическую или кинетическую устойчивость. Модель гликозилирования GM-1 рассчитывали, как биномиальное распределение случайного размещения на шести сайтах биантеннальных, фукозилированных, дисиализированных гликоформ без классов для полностью негликозилированных субъединиц и сравнивали с наблюдаемыми масс-спектрами. Результаты показали превышение предполагаемого размещения (0,021, против 0,0) у высшего класса (а0) , более низкое размещение (0,095 против 0,214) размещения у (al или Р0) класса, повышение (0,516 против 0, 428) размещения у (а2 или 3D класса, повышение (0,312 против 0,285) размещения у (аЗ или Р2) класса и более низкое размещение (0,056 против 0,071) у рз
класса.
ПРИМЕР 9
Анализ мутантного FSH
Связывание мутантного FSH in vitro
Анализом цАМФ FSHR определяли эффективность GM-1 Lot 1 и GM-1 Lot 2. Большие серии клеточных линий СНО, рекомбинантно экспрессирующих рецептор человеческого FSH или рецептор человеческого LH, выращивали и разрушали азотной кавитацией (20 минут, уравновешенной до 900 фунт/кв.дюйм, с последующим быстрым падением давления) в растворе 0,025 моль Триса, рН=7,4, содержащем 0,25 моль сахарозы, 10 ммоль MgCl2, 1 ммоль ЭДТА и одну на тысячу часть коктейля Sigma Protease Inhibitor cocktail (p8350). После предварительного осветления центрифугированием (10 минут при ЮООхд при 4°С) мембранную фракцию осаждали ультрацентрифугированием (60 минут при ЮООООхд при 4°С) . Мембранную фракцию ресуспендировали в буфере связывания (0,01 моль Триса с рН=7,4, содержащего 5 ммоль МдС1г) , при концентрации белка, определяемой белковой пробой Брэдфорда (BioRad), и сохраняли замороженной при -80°С для будущего использования. Обычно анализировали 15 мкг мембранного белка на лунку, соответственно несущего FSHR или LHR, в сравнительных пробах.
Радиолигандное связывание оценивали в 9б-луночном планшете, со 100 мкл пробы на лунку. Использовали аналитический буфер: 0,01 моль Трис с рН=7,4, содержащий 5 ммоль МдС1г и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,3 нмоль 125I-hCG (для LHR) или 0,4 нмоль 125I-FSH (для FSHR). Сравниваемый GM-1 разбавляли аналитическим буфером и перед добавлением мембран рецепторного связывания его смешивали с меченным радиоактивным изотопом лигандом. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 500 нмоль немеченых hCG или FSH. Связывание могло проходить при выравнивании в течение 90 минут при 37 °С с встряхиванием. Анализ со связыванием завершали фильтрацией через низкобелковую-связывающую твердопоровую мембрану (Millipore Multiscreen), предварительно инкубированную в
аналитическом буфере. Лунки фильтра трижды промывали буфером связывания, охлажденным до 0°С (не содержащим BSA аналитическим буфером), высушивали и пробивали. Радиоактивность связывания измеряли счетчиком гамма-излучения HP Cobra II gamma counter с использованием запрограммированного окна обнаружения, специфичного для эмиссии 12э1. Данные анализировали, используя единственную модель сайта и программное обеспечение Graph Pad Prizm.
Функция мутантного FSH in vitro
Функцию GM-1 Lot 1 и GM-1 Lot 2 определяли измерением кривой дозовой зависимости продукции цАМФ в гонадотропин-рецепторно-трансфектных клетках СНО, описанных выше. Данные характеристик высвобождения для двух лотов каждого ведущего белка объединены в Таблице 3, приведенной ниже:
Таблица 3
Характеристики функционирования и рецепторного связывания GM-1 in vitro
Белок/Лот
FSHR. ЕС50
FSHR Ki
GM-1/1
61,2±4,5хЮ"1М
1,9±0,ЗхЮ-уМ
GM-1/2
20, 9±2, 0xl0-lzM
2,3±0, бхЮ_уМ
ПРИМЕР 10
Устойчивость мутантного FSH
Рекомбинантный hFSH, вводимый в виде единственной дозы, не сумел вызывать овуляторную реакцию, в то время как GM-1 оказался способен ее вызвать. Кроме того, степень эффективности GM-1 в стандартном исследовании увеличения массы яичников (Steelman Pohley ovarian weight gain assay) сравнивалась с таковой у Gonal-F (данные не показаны).
Тестированные дозы в Фигуре 5 соответствуют 6, 12 и 24 ME FSH. При тестировании FSH-CTP (Organon 3628 6) на этой модели в единственной дозе, 10 ME, с тремя режимами дозирования (4 х 25%, 2 х 50% и 1 х 100%) средний вес яичников, выявляемый у животных, составлял 16,3 ± 3,8, 19,1 ±3,6 и 21,5 ± 3,9, соответственно (данные не показаны). По вышеприведенным данным 12 ME GM-1, вводимых 1 х 100%, в среднем вызывали овуляторную реакцию в 9,4 ± 2,1 яйцеклеток на животное (6,8 ± 1,6 яйцеклеток на животное при 6 ME и 14,6 ±3,6 яйцеклеток на животное при 24 ME). Данные соответствуют вероятной возможности у GM-1 большего соблюдения режима "моноовуляции" или лучшей регуляции путем манипуляций с режимом дозирования.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Garone, Louise
Arkinstall, Steven Brondyk, William Campbell, Robert Jiang, Xuliang McKenna, Sean Tepper, Mark
<120> FSH Glycosylation Mutant <130> 05558.00003.PZUSOO <160> 8
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Asp Val Gin Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro
15 10 15
Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro lie Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gin Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
50 55 60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asn
Ser
Cys
Glu
Leu
Thr
Asn
Thr
Ala
Glu
Lys
Glu
Glu
Cys
Arg
Phe
Cys
Ser
Asn
Thr
Thr
Trp
Cys
Ala
Gly
Tyr
Cys
Tyr
Thr
Arg
Asp
Leu
Val
Tyr
Lys
Asp
Pro
Ala
Arg
Pro
Lys
Gin
Lys
Thr
Cys
Thr
Phe
Lys
Glu
Leu
Val
Tyr
Glu
Thr
Val
Arg
Val
Pro
Gly
Cys
Ala
His
His
Ala
Asp
Ser
Leu
Tyr
Thr
Tyr
Pro
Val
Ala
Thr
Gin
Cys
His
Cys
Gly
Lys
Cys
Asp
Ser Asp
Ser
Thr
Asp
Cys
Thr
Val
Arg Gly Leu
Gly
Pro
Ser
Tyr
Cys
Ser
Phe
Gly
Glu
Met
Lys
Glu
100
105
110
<210> 3
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> alpha subunit mutant H83N <400> 3
Ala Pro Asp Val Gin Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gin Glu Asn Pro
15 10 15
Phe Phe Ser Gin Pro Gly Ala Pro He Leu Gin Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gin Lys
Asn
Val
Thr
Ser
Glu
Ser
Thr
Cys
Cys
Val
Ala
Lys
Ser
Tyr Asn Arg
Val
Thr
Val
Met
Gly Gly
Phe
Lys
Val
Glu
Asn
His
Thr
Ala Cys Asn
Cys
Ser 85
Thr
Cys
Tyr
Tyr
His 90
Lys
Ser
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> beta
subunit
mutant :
E55N/V57T
<400> 4
Asn Ser Cys
Glu
Leu
Thr
Asn
Thr
Ala
Glu
Lys
Glu
Glu
Cys Arg Phe
Cys
Ser
Asn
Thr
Thr
Trp
Cys
Ala
Gly Tyr
Cys
Tyr Thr Arg
Asp
Leu
Val
Tyr
Lys
Asp
Pro
Ala
Arg
Pro
Lys
Gin
Lys Thr Cys
Thr
Phe
Lys
Asn
Leu
Thr
Tyr
Glu
Thr
Val
Arg
Val
Pro
Gly Cys Ala
His
His
Ala
Asp
Ser
Leu
Tyr
Thr
Tyr
Pro
Val
Ala
Thr
Gin Cys His
Cys
Gly 85
Lys
Cys
Asp
Ser
Asp 90
Ser
Thr
Asp
Cys
Thr 95
Val
Arg Gly Leu
Gly 100
Pro
Ser
Tyr
Cys
Ser 105
Phe
Gly
Glu
Met
Lys 110
Glu
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> mutagenesis oligo 1 for alpha H83N
<400> 5
cacacggcgt gcaactgcag tacttg 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> mutagenesis oligo 2 for alpha H83N
<400> 6
caagtactgc agttgcacgc cgtgtg 26
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> mutagenesis oligo 1 for beta E55N/V57T
<400> 7
gcactctcac tgtttcatat gtcaggttct tgaaggtaca tgttttctg 4 9
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> mutagenesis oligo 2 for beta E55N/V57T
<400> 8
cagaaaacat gtaccttcaa gaacctgaca tatgaaacag tgagagtgc 4 9
ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ, ПРЕДЛОЖЕННАЯ ЗАЯВИТЕЛЕМ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ
1. Рекомбинантный FSH, в котором а-субъединица FSH содержит последовательность SEQ ID N0: 3, и в котором (3-субъединица содержит последовательность SEQ ID N0: 4.
2. Рекомбинантный FSH по п.1, в котором гликозилирован N83 а-субъединицы, в котором гликозилирован N55 р-субъединицы, и в котором гликозилирован Т57 р-субъединицы.
3. Выделенная ДНК, кодирующая а-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID N0: 3.
4. Выделенная ДНК, кодирующая р-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID N0: 4.
5. Вектор, кодирующий а-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID No: 3.
6. Вектор кодирующий р-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID N0: 4.
7. Вектор по п.5 или 6, в котором упомянутый вектор является вектором экспрессии.
8. Клетка, содержащая вектор по п.5 или 6.
9. Клетка, содержащая вектор по п.7.
10. Клетка, содержащая первый вектор, содержащий ДНК, кодирующую а-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID N0: 3, и второй вектор, содержащий ДНК, кодирующую р-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID N0: 4.
11. Клетка по п.10, в которой первый и второй векторы являются векторами экспрессии.
12. Клетка по п.11, причем клетка является клеткой млекопитающего.
13. Способ получения мутантного FSH, предусматривающий
(а) обеспечение клеток млекопитающих, при этом клетки содержат первый вектор экспрессии и второй вектор экспрессии, и
(б) индукцию экспрессии мутантного FSH, при этом первый вектор экспрессии кодирует а-субъединицу FSH, содержащую последовательность SEQ ID N0: 3, и при этом второй вектор экспрессии кодирует р-субъединицу FSH, содержащую
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
33-1
последовательность SEQ ID NO: 4.
14. Способ по п.13, в котором клетки способны к гликозилированию белков.
15. Композиция, содержащая рекомбинантный FSH по п.2 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
16. Способ лечения бесплодия у животного, содержащий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества рекомбинантного мутантного FSH по п.2.
17. Способ стимуляции фолликулогенеза у млекопитающего, содержащий введение млекопитающему, нуждающемуся в такой стимуляции, эффективного количества рекомбинантного мутантного FSH по п.2.
18. Способ индукции гиперстимуляции яичников у млекопитающего, содержащий введение млекопитающему, нуждающемуся в такой индукции, эффективного количества рекомбинантного мутантного FSH по п.2.
По доверенности
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
1/5
136025
ФИГ.1
2/5
ФИГ. 2
3/5
ФИГ.З
SV40 earty polyA alpha H83N \i\
№ol (9SJ4)
(XhtfUSall)
Ватт (1)
SV40 early promoter
halpfta IVS
?roRVi;7757)
rtwni(r?5'ev
ASo 1(7373) ?и*1 <7357|
Synthetic spHcotlonor ^Xhd/SalQ
ВтТП(бт)
/ЙтПП <347)
OHFR
Л'с <Я <1066)
SV40 irrtron and poJyA
\Sall Г22М)
ffmdffl (546C)
4/5
ФИГ. 4
ОКРАШЕННЫЙ СЕРЕБРОМ ГЕЛЬ: Линия 1, Кипяченый стандартный Gonal F, Lot BFDA01529,50 нг; Линия 2, Кипяченый очищеный GM-1,50Hr; Линия 3,6, Прецизионная граница среднего молекулярного веса BioRad ;Линия 4,Не нагревшийся стандартный Gonal F, 50 нг; Линия 5, Не нагревавшийся очищенный GM-1,50 нг.
ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГ: Линия 1, Кипяченый стандартный Gonal F, Lot BFDA01529,50 нг; Линия 2, Кипяченый очищенный GM-1,50 нг; Линия 3, Не нагревавшийся стандартный Gonal F, 50 нг; Линия 4 > Не нагревавшийся очищенный GNM, 50 нг; Линия 5 > Прецизионная граница среднего молекулярного веса перед окрашиванием BioRad, биотинилированньп маркеры.
5/5
ФИГ. 5
РЕЖИМ ВВЕДЕНИЯ FSH
hCG ДЛЯ ЗАПУСКА ОВУЛЯЦИИ
& 40.
Никоя доза, Средняя доза. Высокая доза, 19,24 пмоль, 38,48 пмоль, 76,95 пмоль, 606,2 нг rhFSH 1212,4 нг rhFSH М24-8 "г *ган
1|"J 4x25%
Подсчет ооцитов 20 -в маточной трубе
ПРИМЕЧАНИЕ: масштаб оси у в гистограммах 4 х 25% и 1 х 100% различается между собой.
OF. 4 аил, 4
ВВЕДЕНИЕ ДОЗ
Однократная инъекция GM-1 значительно стимулирует раз витие фолликула
ОГ, 4 "4-1.4
1x100% Т Н
J j j
V OF.1 "1-1,1 OF, 1 "1-1.1 "F.1 1
ВВЕДЕНИЕ ДОЗ
Проводили трехмесячный анализ устойчивости биоактивности GM-1, поддерживая стерильность аликвотного количества GM-1 при 4°С в течении трех месяцев. Отбирали это аликвотное количество GM-1 и тестировали, проводя анализ цАМФ FSHR в точках времени -нулевой, на седьмой день, 32 день и 91 день. В условиях этого анализа медианная эффективная концентрация ЕС50 GM-1 изменилась меньше, чем в два раза в течение 91 дня при 4°С. Эти данные указывают, что биоактивность GM-1, содержащегося при 4°С, сохраняет устойчивость до трех месяцев.
ПРИМЕР 11
Фигура 5 показывает степень эффективности GM-1 в двухдневной модели индукции овуляции неполовозрелой крысы.