Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос :  ea201492100a*\id

больше ...
Термины запроса в документе


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей: а) мутантный ген spr, кодирующий белок spr, имеющий мутацию одной или более аминокислот, выбранных из D133, Н145, Н157, N31, R62, I70, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 и G147, и b) ген, способный экспрессировать или избыточно экспрессировать один или более белков, способных облегчать сворачивание белков, таких как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD, при этом клетка имеет сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа; к способам, в которых используются клетки; к применению клеток в экспрессии белков и, в частности, антител, таких как анти-FcRn антитела, а также к белкам, полученным способами, описанными в настоящем документе.


2420-519610ЕА/030
РЕКОМБИНАНТНАЯ БАКТЕРИАЛЬНАЯ КЛЕТКА-ХОЗЯИН ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА
Изобретение относится к рекомбинантному бактериальному штамму-хозяину, в частности Е. coli. Изобретение также относится к способу получения интересующего белка в такой клетке.
Уровень техники изобретения
Бактериальные клетки, такие как Е. coli, обычно используют для получения рекомбинантных белков. Есть много преимуществ в использовании бактериальных клеток, таких как Е. coli, для получения рекомбинантных белков, в частности, из-за адаптивной природы бактериальных клеток в качестве клеток-хозяев, допускающей введение генов с помощью плазмид. Е. coli использовали для получения множества рекомбинантных белков, включая человеческий инсулин.
Несмотря на многие преимущества использования бактериальных клеток для получения рекомбинантных белков, все еще существуют значительные ограничения, в том числе сложность получения чувствительных к протеазам белков. Протеазы играют важную роль в обороте старых, поврежденных или неправильно свернутых белков в периплазме и цитоплазме Е. coli. Бактериальные протеазы расщепляют интересующий рекомбинантный белок, тем самым часто значительно снижая выход активного белка.
Известен целый ряд бактериальных протеаз. У Е. coli известны протеазы, включающие протеазу III (ptr), DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, clpP и Ion.
Tsp (также известная как Pre) представляет собой 60-кДа периплазматическую протеазу. Первым известным субстратом Tsp был пенициллин-связывающий белок-3 (РВРЗ) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli; Nagasawa H., Sakagami Y., Suzuki A., Suzuki H., Нага H., Hirota Y. J Bacterid. 1989 Nov; 171(11): 5890-3 и Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3; Нага H., Yamamoto
Y., Higashitani A., Suzuki H., Nishimura Y. J Bacteriol. 1991 Aug; 173 (15): 4799-813), однако позже было обнаружено, что Tsp также способна расщеплять белки фагового хвоста, и таким образом, она была переименована в специфичную для хвоста протеазу (Tsp) (Silber et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992) ) . В статье Silber с соавторами (Deletion of the pre(tsp) gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12; Silber, K.R., Sauer, R.T.; Mol Gen Genet 1994 242: 237-240) описан штамм с делецией pre (KS1000), в котором была создана мутация путем замены сегмента гена pre фрагментом, содержащим маркер Капг.
Для уменьшения протеолиза интересующих белков желательно
снижение активности Tsp (pre). Однако было обнаружено, что
клетки, лишенные протеазы pre, демонстрируют
термочувствительный рост при низкой осмолярности. Нага с соавторами выделили термоустойчивые ревертанты, содержащие экстрагенные супрессорные (spr) мутации (Нага et al., Microbial Drug resistance, 2: 63-72 (1996)) . Spr представляет собой 18-кДа связанную с мембраной периплазматическую протеазу, и субстратами spr являются Tsp и пептидогликаны в наружной мембране, вовлеченные в гидролиз клеточной стенки в процессе деления клеток. Ген spr имеет обозначение UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR_ECOLI).
Описаны усовершенствованные дефицитные по протеазе штаммы, содержащие мутантный ген spr. Chen с соавторами описывают конструкцию штаммов Е. coli, несущих различные сочетания мутаций в pre (Tsp) и другой протеазе, DegP, полученных путем амплификации участков, расположенных выше и ниже гена, и лигирование их вместе в векторе, содержащем селективные маркеры, и мутацию sprW174R (High-level accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (ADegP Дргс sprW174R) host strain (Chen C, Snedecor В., Nishihara J.C., Joly J.C., McFarland N., Andersen D.C., Battersby J.E., Champion K.M. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5; 85(5) : 463-74) . Установлено, что сочетание мутаций
ADegP, Aprc и sprW174R приводит к самым высоким уровням легкой цепи антитела, тяжелой цепи антитела и F(ab')2~LZ. В ЕР1341899 описан штамм Е. coli, дефицитный по хромосомным генам DegP и pre, кодирующим протеазы DegP и Pre, соответственно, и содержащий мутантный ген spr, который кодирует белок, подавляющий ростовые фенотипы, проявляемые штаммами, содержащими мутанты pre.
Другие усовершенствованные дефицитные по протеазам штаммы, содержащие мутации как в Tsp, так и в spr, описаны в W0 2011/086136.
Штаммы, описанные в WO 02/48376, являются 1ас~ и не могут расти в культурах, где тимидин, фукоза или мальтоза используются в качестве источника углерода. Это может быть серьезным недостатком для штаммов, предназначенных для использования в промышленных масштабах. Могут иметь место и другие недостатки, связанные с такими штаммами, например, отсутствие продукции щелочной фосфатазы. Последняя представляет собой периплазматический белок, принимающий участие в утилизации фосфата из культуральных сред.
Некоторые белки проявляют пептидил-пролил изомеразную и/или изомеразную активность, и/или шаперонную активность и, как установлено, привносят полезные свойства при использовании в линиях клеток, применяемых для экспрессии рекомбинантных белков.
Настоящее изобретение относится к новым бактериальным штаммам, несущим мутации как в Tsp, так и в spr, и по меньшей мере один ген, кодирующий белок или белки, способные облегчать сворачивание белков, что создает преимущества при производстве рекомбинантных белков.
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей:
а. мутантный ген spr, кодирующий белок spr, имеющий мутацию одной или более аминокислот, выбранных из D133, Н145,
Н157, N31, R62, 170, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 и G147, и
b. ген или гены, способные экспрессировать или избыточно экспрессировать один ли более белков, способных облегчать сворачивание белков, такие как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD,
при этом клетка имеет сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, кодирующей:
a. мутантный ген spr, кодирующий белок spr, имеющий мутацию одной или более аминокислот, выбранных из D133, Н145, Н157, N31, R62, 170, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 и G147,
b. ген или гены, способные экспрессировать или избыточно экспрессировать один ли более белков, способных облегчать сворачивание белков, такие как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD,
c. ген, способный экспрессировать интересующий белок, например, антитело или его связывающий фрагмент,
при этом клетка имеет сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа и остаток геномной ДНК клетки является изогенным с клеткой дикого типа, от которой происходит рекомбинантная клетка.
В одном варианте осуществления геном клетки является изогенным с бактериальной клеткой дикого типа, за исключением мутантного гена spr, модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа, и гена или генов, экспрессирующих белок, способный облегчать сворачивание белков.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, имеющей сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа и содержащей мутантный ген spr, кодирующий белок spr, при этом геном клетки является изогенным с бактериальной клеткой дикого типа, за исключением модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого
типа, мутантного гена spr и гена или генов, введенных для экспрессии белка, способного облегчать сворачивание белков.
Клетки, предложенные в первом и втором аспектах настоящего изобретения, демонстрируют выгодные фенотипы роста и белковой продуктивности.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения интересующего белка, включающему экспрессию интересующего белка в рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, описанной выше.
В четвертом аспекте настоящее изобретение также распространяется на белки, экспрессированные при помощи способа, описанного в настоящем документе.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведены результаты ферментации в масштабе 5 л, проведенной с различными сочетаниями клеток-хозяев и "шаперона". W3110 является штаммом Е. coli дикого типа. Различными сочетаниями были: дикий тип без шаперона; дикий тип с FkpA и Skp; МХЕ016 с мутациями spr и ATsp, как опубликовано в W0 2011/086136; МХЕ016 и FkpA; МХЕ016 и Skp; МХЕ016 и FkpA и Skp; МХЕ017, описанный в WO 2011/086136; МХЕ017 и FkpA и Skp.
На фиг.2 приведены результаты экспериментов с изменением скорости подпитки, при послеиндукционных скоростях подпитки 5,4, 6,0 и 7,0 г/ч, в случае МХЕ016 большинство дополнительных Fab' , полученных при более высоких скоростях подпитки, было потеряно в супернатанте.
На фиг.ЗА, В показана жизнеспособность клеток (ЗА) и титры Fab' (ЗВ) для MXE016+/-FkpA.
На фиг.4 приведены данные по первичному извлечению для опытного производства в масштабе 2 0 л.
На фиг.5 показан первично извлеченный продукт, полученный при опытном производстве в масштабе 2 0 л, в окрашенном геле SDS-ПААГ после электрофореза в невосстанавливающих условиях. Полосы в белковом профиле, отличные от относящихся к FkpA полос, выглядят очень схожими в двух штаммах.
На фиг.6 приведены результаты вестерн-блоттинга с
антителами к His-метке в невосстанавливающих условиях для опытного производства в масштабе 2 0 л. Полноразмерный FkpA обнаружен и соответствует полосе приблизительно 30 кДа, и никакого сигнала не обнаружено в случае только МХЕ016, как и ожидалось.
На фиг.7А-С показаны различные мутации в различных генах.
На фиг.7Б схематично изображено создание вектора, содержащего полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела (LC), тяжелую цепь антитела (НС) , полинуклеотидную последовательность FkpA и/или полинуклеотид Skp.
На фиг.8 приведены различные полинуклеотидные и аминокислотные последовательности.
Краткое описание последовательностей
SEQ ID N0:1 представляет собой последовательность ДНК гена Tsp дикого типа, включая б нуклеотидов ATGAAC выше инициирующего кодона.
SEQ ID N0:2 представляет собой аминокислотную последовательность белка Tsp дикого типа.
SEQ ID N0:3 представляет собой последовательность ДНК мутантного нокаутированного гена Tsp, включая б нуклеотидов ATGAAT выше инициирующего кодона.
SEQ ID N0:4 представляет собой последовательность ДНК гена протеазы III дикого типа.
SEQ ID N0:5 представляет собой аминокислотную последовательность белка протеазы III дикого типа.
SEQ ID N0:6 представляет собой последовательность ДНК мутантного нокаутированного гена протеазы III.
SEQ ID N0:7 представляет собой последовательность ДНК гена DegP дикого типа.
SEQ ID N0:8 представляет собой аминокислотную последовательность белка DegP дикого типа.
SEQ ID N0:9 представляет собой последовательность ДНК мутантного гена DegP.
SEQ ID N0:10 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка DegP.
SEQ ID N0:11 представляет собой последовательность 5' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена DegP, содержащего сайт рестрикции Asel.
SEQ ID N0:12 представляет собой последовательность 3' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена DegP, содержащего сайт рестрикции Asel.
SEQ ID N0:13 представляет собой последовательность 5' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена Tsp, содержащего сайт рестрикции Asel.
SEQ ID N0:14 представляет собой последовательность 3' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена протеазы III, содержащего сайт рестрикции Asel.
SEQ ID N0:15 представляет собой последовательность 5' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена протеазы III, содержащего сайт рестрикции Asel.
SEQ ID N0:16 представляет собой последовательность 3' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена Tsp, содержащего сайт рестрикции Asel.
SEQ ID N0:17 представляет собой последовательность ДНК гена spr дикого типа.
SEQ ID N0:18 представляет собой последовательность гена spr дикого типа, включая сигнальную последовательность, которая представляет собой первые 2 6 аминокислотных остатков.
SEQ ID N0:19 представляет собой последовательность немутантного гена spr без сигнальной последовательности.
SEQ ID N0:20 представляет собой нуклеотидную последовательность мутантной последовательности OmpT, содержащей мутации D210A и Н212А.
SEQ ID N0:21 представляет собой аминокислотную последовательность мутантной последовательности OmpT, содержащей мутации D210A и Н212А.
SEQ ID N0:22 представляет собой нуклеотидную последовательность мутантной нокаутированной последовательности OmpT.
SEQ ID N0:23 представляет собой последовательность олигонуклеотидного адаптера ОтрА.
SEQ ID N0:24 представляет собой олигонуклеотидную кассету, кодирующую межгенную последовательность 1 (IGS1) для экспрессии Fab в Е. coli.
SEQ ID N0:25 представляет собой олигонуклеотидную кассету, кодирующую межгенную последовательность 2 (IGS2) для экспрессии Fab в Е. coli.
SEQ ID N0:26 представляет собой олигонуклеотидную кассету, кодирующую межгенную последовательность 3 (IGS3) для экспрессии Fab в Е. coli.
SEQ ID N0:27 представляет собой олигонуклеотидную кассету, кодирующую межгенную последовательность 4 (IGS4) для экспрессии Fab в Е. coli.
SEQ ID N0:28 представляет собой последовательность ДНК гена FkpA дикого типа.
SEQ ID N0:29 представляет собой белковую
последовательность гена FkpA дикого типа.
SEQ ID N0:30 представляет собой последовательность ДНК гена FkpA с his-меткой.
SEQ ID N0:31 представляет собой белковую
последовательность для гена FkpA с his-меткой.
SEQ ID N0:32 представляет собой последовательность ДНК гена skp дикого типа.
SEQ ID N0:33 представляет собой белковую
последовательность для гена skp дикого типа.
SEQ ID N0:34 представляет собой последовательность ДНК гена skp с his-меткой.
SEQ ID N0:35 представляет собой белковую
последовательность для гена skp с his-меткой.
SEQ ID N0:36-74 представляют собой различные
аминокислотные последовательности и последовательности ДНК
антител FcRn или их фрагментов, которые подходят для экспрессии
в линии клеток по настоящему изобретению. В частности, SEQ ID
N0:50 представляет собой аминокислотную последовательность
вариабельной области легкой цепи анти-FcRn антитела 1519дН20 и
SEQ ID N0:58 представляет собой аминокислотную
последовательность вариабельной области тяжелой цепи анти-FcRn
антитела 1519gH20.
Подробное описание предпочтительных вариантов
осуществления изобретения
Авторами настоящего изобретения предложены
усовершенствованные рекомбинантные грамотрицательные
бактериальные клетки, подходящие для экспрессии интересующего рекомбинантного белка.
В одном варианте осуществления белок представляет собой антитело или его связывающий фрагмент, в частности терапевтическое антитело.
В частности, авторами настоящего изобретения предложены
усовершенствованные рекомбинантные грамотрицательные
бактериальные клетки, подходящие для экспрессии интересующего рекомбинантного белка за счет включения одного или более гена или генов, кодирующих белок, предназначенный для облегчения сворачивания белков, в грамотрицательные бактериальные клетки, несущие мутантный ген Tsp и мутантный ген spr.
В одном варианте осуществления ген или гены, кодирующие белок, предназначенный для облегчения сворачивания белков, интегрированы в геном клеток, например, для получения стабильной линии клеток. В одном варианте осуществления рекомбинантный белок для экспрессии (такой как терапевтический белок) трансфицирован в стабильную линию клеток для обеспечения экспрессии желаемого рекомбинантного белка.
В одном варианте осуществления ген или гены, кодирующие белок, предназначенный для облегчения сворачивания белков, предоставлены на одной или более плазмидах, например, плазмиды временно трансфицированы в клетки для получения линии клеток по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления ген или гены, кодирующие белок, предназначенный для облегчения сворачивания белков, предоставлены на плазмиде, также содержащей кодирующую последовательность для интересующего рекомбинантного белка.
В одном варианте осуществления ген или гены, кодирующие белок, предназначенный для облегчения сворачивания белков, предоставлены на плазмиде, которая не содержит кодирующую
последовательность для интересующего рекомбинантного белка.
В одном варианте осуществления изобретение относится к новым штаммам, имеющим усовершенствованный фенотип клеточного роста по сравнению с бактериальными клетками дикого типа и клетками, несущими только мутантный ген Tsp или мутантный ген Tsp и мутантный ген spr.
Клетки по настоящему изобретению обладают многими преимуществами. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что клетки по настоящему изобретению могут проявлять повышенную жизнеспособность клеток по сравнению с клеткой дикого типа или клеткой, содержащей мутантный ген Tsp и мутантный ген spr.
Жизнеспособность клеток имеет особенно большое значение с практической точки зрения, поскольку нежизнеспособные клетки, как правило, лизируются и засоряют культуру обломками ДНК. Эти обломки ДНК увеличивают сложность, стоимость и расходы при очистке желаемого белка. Вследствие этого, сведение к минимуму количества обломков ДНК из лизированных нежизнеспособных клеток является серьезной проблемой для эффективного производства рекомбинантных белков, смотрите, например, US 6258560.
Жизнеспособность клеток можно измерять с помощью любого из целого ряда рутинных методов, например, с использованием флуоресцентного красителя и анализа FACS или аналогичного анализа.
В частности, клетки по изобретению, как правило, демонстрируют фенотип сниженного клеточного лизиса по сравнению с клетками, несущими мутантный ген Tsp и мутантный ген spr.
Более того, новые штаммы могут иметь сниженную утечку белка из клеток и допускать более длительное периплазматическое накопление по сравнению с клетками, несущими мутантный ген Tsp и мутантный ген spr. Это особенно важно, поскольку, например, если общие уровни экспрессии целевого белка являются сходными, но больше белка накапливается в периплазме или меньше белка накапливается в супернатанте, поскольку утечка в случае данного штамма меньше, то клетки, отличающиеся меньшей утечкой, как правило, будут более подходящими для масштабного промышленного производства, поскольку из них легче извлекать белок.
Кроме того, клетки по настоящему изобретению могут отличаться повышенным выходом интересующего белка по сравнению с бактериальной клеткой дикого типа или клеткой, содержащей мутантный ген Tsp и мутантный ген spr в отсутствие гена или генов, кодирующих такой белок, как FkpA. Повышенный выход белка может быть выходом белка в периплазме и/или выходом белка в супернатанте. В одном варианте осуществления клетки по настоящему изобретению отличаются повышенным выходом белка в периплазме по сравнению с клеткой, несущей мутантный ген Tsp и мутантный ген spr, вследствие сниженной утечки из клеток.
Рекомбинантные бактериальные клетки могут быть способны к продукции интересующего белка с более высокой скоростью и, таким образом, одно и то же количество интересующего белка может продуцироваться за более короткое время по сравнению с бактериальной клеткой дикого типа или клеткой, содержащей мутантный ген Tsp и мутантный ген spr. Более высокая скорость продукции интересующего белка может быть особенно важна на протяжении начального периода роста клеток, например, в течение первых 5, 10, 2 0 или 3 0 часов после индукции экспрессии белка.
Клетки по настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют с максимальным выходом в периплазме и/или среде, составляющим примерно 1,0, 1,5, 1,8, 2,0, 2,4, 2,5, 3,0, 3,5 или 4,0 г/л интересующего белка.
Кроме того, экспрессия белка или белков, которые облегчают сворачивание, дополнительно оптимизирует экспрессию за счет максимального увеличения количества белка, свернутого надлежащим образом. Специалист в данной области хорошо знает, что правильное сворачивание необходимо для биологической функции и, таким образом, выделение белка, свернутого желательным образом, чрезвычайно важно. Это особенно важно, если белок экспрессируется в грамотрицательной клетке, поскольку экспрессируемый белок не будет естественным для клетки и, таким образом, клетка не сможет автоматически экспрессировать белок, свернутый надлежащим образом. Неправильное сворачивание может проявляться в виде агрегации или других примесей. Для выделения желаемого белка может
потребоваться значительная очистка, которая влечет за собой финансовые затраты и также может приводить к низкому выходу желаемого белка. Максимальное увеличение количества правильно свернутого экспрессированного белка сводит к минимуму необходимую очистку и может оптимизировать полезной выход и, таким образом, является выгодным.
Преимущества, связанные с экспрессией белка, который облегчает сворачивание, включают одно или более из следующего: более высокий титр (например, увеличенный до примерно 1,05 г/л по сравнению с 0,5 г/л у дикого типа); более высокая жизнеспособность в период сбора клеток (например, больше 95%); повышенный титр при увеличенной скорости подпитки (лучшие перспективы для развития процесса); более высокий титр в масштабах коммерческого производства, например, в масштабе 2 0 л и более высокая жизнеспособность в период сбора клеток; а также более легкая очистка экстракта, в частности, в масштабе 20 л.
Клетки по настоящему изобретению имеют сниженную протеазную активность Tsp по сравнению с клеткой дикого типа, что может уменьшать протеолиз интересующего белка, особенно интересующих белков, которые подвержены протеолизу Tsp. Таким образом, клетки по настоящему изобретению могут обеспечивать более высокий выход интактных белков, предпочтительно интересующего белка, и более низкий выход, или предпочтительно отсутствие, протеолитических фрагментов белков, предпочтительно интересующего белка, по сравнению с бактериальной клеткой дикого типа.
В одном варианте осуществления изобретения клетки несут только минимальные мутации в геноме, необходимые для введения модификаций по настоящему изобретению. Бактериальная клетка может отличаться от бактериальной клетки дикого типа только по одной или более мутациям в гене spr и по модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа, поскольку, например, ген или гены, кодирующие белок для облегчения сворачивания белков, могут быть введены в клетку временно, например, на плазмиде. В одном варианте осуществления клетки не несут никаких других мутаций,
которые могут оказывать пагубное влияние на клеточный рост и/или способность экспрессировать интересующий белок.
Соответственно, одна или более из рекомбинантных клеток-хозяев по настоящему изобретению могут отличаться улучшенной экспрессией белка и/или улучшенными ростовыми характеристиками по сравнению с клетками, содержащими дополнительные генно-инженерные мутации в геномной последовательности. Клетки по настоящему изобретению также более подходят для использования с целью получения терапевтических белков по сравнению с клетками, содержащими дополнительные нарушения в клеточном геноме.
Квалифицированный специалист сможет легко тестировать клеточный клон-кандидат для проверки того, обеспечивает ли он желаемый выход интересующего белка, с использованием методов, хорошо известных в данной области, включая метод ферментации, ELISA и ВЭЖХ с белком G. Подходящие методы ферментации описаны в статьях Humphreys D.P., et al. (1997) . Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH. 209: 193202; Backlund E., Reeks D., Markland K., Weir N., Bowering L., Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Journal of Biotechnology. 135(4): 358-65, 2008 Jul 31; Champion K.M., Nishihara J.C., Joly J.C., Arnott D. Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article] Proteomics. 1(9): 1133-48, 2001 Sep; и Horn U., Strittmatter W., Krebber A., Knupfer U., Kujau M., Wenderoth R., Muller K., Matzku S., Pluckthun A., Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-6): 524-32, 1996 Dec. Квалифицированный специалист также сможет легко протестировать секретированный белок для определения того, правильно ли свернут белок, с
использованием методов, хорошо известных в данной области, таких как ВЭЖХ с белком G, круговой дихроизм, ЯМР, рентгеновская кристаллография и методы измерения аффинности эпитопов.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В настоящем документе термины "белок" и "полипептид" используются взаимозаменяемо, если из контекста не следует иное. Термин "пептид" относится к 10 или менее аминокислотам.
Термин "полинуклеотид" включает ген, ДНК, кДНК, РНК, мРНК и так далее, если из контекста не следует иное.
Используемый в настоящем документе термин "сниженная активность" означает более низкие уровни ферментативной активности, например, ферментативной активности Tsp, по сравнению с соответствующей ферментативной активностью в штамме дикого типа при измерении в сопоставимых условиях в подходящем анализе. В одном варианте осуществления сниженная активность составляет 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее или 5% или менее от ферментативной активности компаратора дикого типа. В одном варианте осуществления анализы для определения уровней ферментативной активности выполняются одновременно, если результаты будут использованы для прямого сравнения.
Прямые сравнения при использовании в настоящем документе относятся к случаю, когда числовые значения двух или более результатов сравнивают для целей определения того, имеет ли место сниженная активность, описанная в настоящем документе, или для ранжирования данных по активности, полученных в анализе.
Используемый в настоящем документе термин "содержащий" в контексте настоящей спецификации следует интерпретировать как "включающий в себя".
В настоящем документе термин "клетка дикого типа" используется взаимозаменяемо с терминами "не мутантная клетка" или "контрольная клетка".
Не мутантная клетка или контрольная клетка в контексте настоящего изобретения означает клетку того же типа, что и
рекомбинантная грамотрицательная клетка по изобретению, но которая не была модифицирована для вышеуказанного снижения активности белка Tsp и для содержания мутантного гена spr. Например, не мутантная клетка может быть клеткой дикого типа и может происходить из той же популяции клеток-хозяев, что и клетки по изобретению до модификации с целью введения каких-либо мутаций.
Выражения "клетка", "линия клеток", "культура клеток" и "штамм" используются взаимозаменяемо.
Выражение "фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp" в
контексте настоящего изобретения означает фенотип, проявляемый
клеткой, имеющей мутантный ген Tsp. Как правило, клетки,
содержащие мутантный ген Tsp, могут лизироваться, особенно при
высоких плотностях клеток. Лизис этих клеток приводит к утечке
любого рекомбинантного белка в супернатант. Клетки, несущие
мутантный ген Tsp, могут также демонстрировать
термочувствительный рост при низкой осмолярности. Например, клетки не растут или растут с меньшей скоростью, или клетки погибают в гипотонической среде при высокой температуре, например, при 4 0°С или выше.
Термин "изогенный" в контексте настоящего изобретения означает, что геном клетки по настоящему изобретению имеет практически такую же или такую же геномную последовательность, что и клетка дикого типа, от которой происходит данная клетка, за исключением мутантного гена spr и модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp. В этом варианте осуществления геном клетки не содержит никаких дополнительных неприродных или генно-инженерных мутаций. В одном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению может иметь практически такую же геномную последовательность, что и клетка дикого типа, за исключением мутантного гена spr и модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp, принимая во внимание любые природные мутации, которые могут иметь место. В одном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению может иметь в точности такую же геномную последовательность,
что и клетка дикого типа, за исключением мутантного гена spr и модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp.
Термин "дикий тип" в контексте настоящего изобретения означает штамм грамотрицательных бактериальных клеток в том виде, в каком он может существовать в природе или быть выделен из окружающей среды, который не несет каких-либо генно-инженерных мутаций. Примером штамма Е. coli дикого типа является W3110, например штамм W3110 К-12.
Любую подходящую грамотрицательную бактерию можно использовать в качестве родительской клетки для получения рекомбинантной клетки по настоящему изобретению. Подходящие грамотрицательные бактерии включают Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и E. coli. Предпочтительно, родительской клеткой является Е. coli. Любой подходящий штамм Е. coli можно использовать по настоящему изобретению, однако предпочтительно используют штамм W3110 дикого типа, такой как К-12 W3110.
Недостаток, связанный с дефицитными по протеазе бактериальными штаммами, созданными ранее и используемыми для экспрессии рекомбинантных белков, заключается в том, что они содержат дополнительные мутации генов, вовлеченных в метаболизм клетки и репликацию ДНК, таких как, например, phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi и pro в штаммах E. coli. Эти мутации могут иметь множество негативных эффектов на клетку-хозяина, включая влияние на клеточный рост, стабильность, выход при экспрессии рекомбинантного белка и токсичность. Штаммы, имеющие одну или более из этих геномных мутаций, особенно штаммы, имеющие большое число таких мутаций, могут утрачивать свою хорошую форму, что приводит к снижению скорости роста бактерий до уровня, который не подходит для промышленного производства белков. Кроме того, любая из вышеуказанных геномных мутаций может влиять на другие гены в цис- и/или в транс-положении непредсказуемым пагубным образом, тем самым изменяя фенотип, пригодность для использования и белковый профиль штамма. Кроме
того, сильно мутировавшие клетки, как правило, не подходят для использования с целью производства рекомбинантных белков для коммерческого применения, особенно терапевтических средств, поскольку эти штаммы, как правило, имеют дефектные метаболические пути и, таким образом, могут расти плохо или совсем не расти в минимальных средах или средах с определенным химическим составом.
В одном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению является изогенной с бактериальной клеткой дикого типа, за исключением мутантного гена spr и модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа. Лишь минимальные мутации внесены в геном клетки для введения мутаций. Клетки не несут никаких других мутаций, которые могут оказывать негативное влияние на клеточный рост и/или способность экспрессировать интересующий белок. Соответственно, одна или более из рекомбинантных клеток-хозяев по настоящему изобретению могут демонстрировать улучшенную экспрессию белка и/или улучшенные ростовые характеристика по сравнению с клетками, содержащими дополнительные генно-инженерные мутации в геномной последовательности. Клетки по настоящему изобретению также являются более подходящими для использования в получении терапевтических белков, чем клетки, содержащие дополнительные нарушения в клеточном геноме.
В предпочтительном варианте осуществления клетка является изогенной с клеткой Е. coli дикого типа, такой как клетка штамма W3110, за исключением мутантного гена spr и модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа.
Клетка по настоящему изобретению может дополнительно
отличаться от клетки дикого типа содержанием полинуклеотида,
кодирующего интересующий белок. Полинуклеотидная
последовательность, кодирующая интересующий белок, может быть экзогенной или эндогенной. Полинуклеотид, кодирующий интересующий белок, может быть заключен в подходящем экспрессионном векторе, введенном трансформацией в клетку и/или
интегрированном в геном клетки-хозяина. В варианте осуществления, в котором полинуклеотид, кодирующий интересующий белок, встроен в геном хозяина, клетка по настоящему изобретению будет также отличаться от клетки дикого типа из-за встроенной полинуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий белок. Предпочтительно, полинуклеотид находится в экспрессионном векторе в клетке, тем самым вызывая минимальные повреждения в геноме клетки-хозяина.
Белок spr представляет собой связанную с мембраной Е. coli периплазматическую протеазу.
Аминокислотная последовательность белка spr дикого типа приведена в SEQ ID N0:21 с сигнальной последовательностью на N-конце и в SEQ ID N0:22 без сигнальной последовательности из 2 6 аминокислот (в соответствии с регистрационным номером UniProt P0AFV4). Нумерация аминокислот последовательности белка spr по настоящему изобретению включает сигнальную последовательность. Соответственно, аминокислота 1 в белке spr является первой аминокислотой (Met), приведенной в SEQ ID N0:21.
Мутантный ген spr предпочтительно представляет собой клеточный хромосомный ген spr.
Мутантный ген spr кодирует белок spr, способный подавлять фенотип клетки, дополнительно содержащей мутантный ген Tsp. Клетки, несущие мутантный ген Tsp, могут иметь хорошую скорость клеточного роста, но одним ограничением для этих клеток является их тенденция к лизису, особенно при высоких плотностях клеток. Соответственно, фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp, характеризуется тенденцией к лизису, особенно при высоких плотностях клеток. Клетки, несущие мутантный ген Tsp, также демонстрируют термочувствительный рост при низкой осмолярности. Однако мутации spr, которые несут клетки по настоящему изобретению, при введении в клетку, имеющую сниженную активность Tsp, подавляют фенотип сниженной активности Tsp и, таким образом, у клетки наблюдается менее выраженный лизис, особенно при высокой плотности клеток. Ростовой фенотип клетки может быть легко определен специалистом в данной области с использованием метода встряхиваемой колбы
или ферментации при высокой плотности клеток. Подавление фенотипа клеточного лизиса можно определять на основании улучшенной скорости роста и/или продукции рекомбинантного белка, в частности, в периплазме, которые проявляет клетка, несущая мутант spr и имеющая сниженную активность Tsp по сравнению с клеткой, несущей мутант Tsp и spr дикого типа.
Клетки по настоящему изобретению содержат мутантный ген spr, кодирующий белок spr, имеющий мутацию одной или более из аминокислот, выбранных из N31, R62, 170, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, Н145, G147 и HI57, предпочтительно мутацию одной или более из аминокислот, выбранных из С94, S95, V98, Y115, D133, V135, Н145, G147 и Н157. В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не имеет никаких других мутаций.
Мутация одной или более из вышеуказанных аминокислот может быть любой подходящей миссенс-мутацией одного, двух или трех из нуклеотидов, кодирующих аминокислоту. Мутация заменяет аминокислотный остаток на любую подходящую аминокислоту, результатом чего является мутантный белок spr, способный подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. Миссенс-мутация может заменять аминокислоту на аминокислоту, которая имеет другой размер и/или имеет другие химические свойства по сравнению с аминокислотой дикого типа.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий одну или более мутаций, выбранных из С94А, S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D или G, Н145А, G147C и Н157А.
В одном варианте осуществления мутации подвергается один, два или три из каталитической триады аминокислотных остатков С94, Н145 и Н157 (Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domein of Lipoprotein Spr from Escherichia coli. Structural Evidence for a Novel Cystein Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717) . Соответственно, мутантный ген spr может содержать: мутацию С94 или мутацию Н145; или мутацию Н157; или мутацию С94 и Н145; или мутацию С94 и Н157; или мутацию HI45 и Н157; или мутацию С94, Н145 и Н157.
В данном варианте осуществления белок spr предпочтительно
не имеет никаких других мутаций.
Один, два или три из С94, Н145 и Н157 могут быть мутированы в любую подходящую аминокислоту, результатом чего является белок spr, способный подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. Например, один, два или три из С94, HI 4 5 и HI 57 могут быть мутированы в небольшую аминокислоту, такую как Gly или Ala. Соответственно, белок spr может иметь одну, две или три из мутаций С94А, Н145А и Н157А. В одном варианте осуществления ген spr содержит миссенс-мутацию С94А, которая, как установлено, приводит к образованию белка spr, способного подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. В другом варианте осуществления ген spr содержит миссенс-мутацию Н145А, которая, как установлено, приводит к образованию белка spr, способного подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp.
В настоящем документе обозначение для мутанта по типу замены состоит из буквы, за которой следует номер, а затем буква. Первая буква обозначает аминокислоту в белке дикого типа. Номер означает положение аминокислоты, в котором происходит аминокислотная замена, и вторая буква обозначает аминокислоту, которую используют для замены аминокислоты дикого типа.
В одном варианте осуществления мутантный белок spr содержит мутацию одной или более из аминокислот, выбранных из N31, R62, 170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 и G147, предпочтительно мутацию одной или более из аминокислот, выбранных из S95, V98, Y115, D133, V135 и G147. В данном варианте осуществления белок spr предпочтительно не имеет никаких других мутаций. Соответственно, мутантный ген spr может содержать: мутацию N31 или мутацию R62; или мутацию 17 0; или мутацию Q7 3; или мутацию S95; или мутацию V98; или мутацию Q99; или мутацию R100; или мутацию L108; или мутацию Y115; или мутацию D133; или мутацию V135; или мутацию L136; или мутацию G140; или мутацию R144; или мутацию G147.
В одном варианте осуществления мутантный белок spr
содержит несколько мутаций аминокислот: S95 и Y115; или N31, Q7 3, R10 0 и G14 0; или Q7 3, R10 0 и G14 0; или R10 0 и G14 0; или Q73 и G140; или Q73 и R100; или R62, Q99 и R144; или Q99 и R144 .
Одна или более из аминокислот N31, R62, 170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 и G147 могут быть мутированы в любую подходящую аминокислоту, результатом чего является белок spr, способный подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. Например, одна или более из N31, R62, 170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 и R144 могут быть мутированы в небольшую аминокислоту, такую как Gly или Ala.
В одном варианте осуществления белок spr содержит одну или более из следующих мутаций: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D или V135G, L136P, G140C, R144C и G147C. В одном варианте осуществления белок spr содержит одну или более из следующих мутаций: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D или V135G и G147C. В данном варианте осуществления белок spr предпочтительно не имеет никаких других мутаций.
В одном варианте осуществления белок spr имеет одну мутацию, выбранную из N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D или V135G, L136P, G140C, R144C и G147C. В данном варианте осуществления белок spr предпочтительно не имеет никаких других мутаций.
В следующем варианте осуществления белок spr имеет несколько мутаций, выбранных из: S95F и Y115F; N31Y, Q73R, R100G и G140C; Q73R, R100G и G140C; R100G и G140C; Q73R и G140C; Q73R и R100G; R62C, Q99P и R144C или Q99P и R144C.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию С94А.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию V103E.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию D133A.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует
белок spr, имеющий мутацию V135D.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию V135A.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию Н14 5А.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию G147C.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию Н157А.
В одном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию, выбранную из Н145А, Н157А и D133A.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения любую подходящую мутацию или мутации можно осуществлять в гене spr, результатом чего будет белок spr, способный подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. Предпочтительно, белок spr может иметь одну или более из следующих мутаций: N31Y, R62C, I70T, Q73R, С94А, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, Н145А, G147C, Н157А и W174R. В одном варианте осуществления белок spr не содержит мутацию W17 4R. Предпочтительно, ген spr содержит одну или более мутаций, описанных выше.
Клетки по настоящему изобретению имеют сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа. Выражение "сниженная активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа" означает, что активность Tsp в клетке снижена по сравнению с активностью Tsp в клетке дикого типа. Клетка может быть модифицирована любым подходящим способом для снижения активности Tsp.
В одном варианте осуществления сниженная активность Tsp возникает вследствие модификации эндогенного полинуклеотида, кодирующего Tsp, и/или связанных регулирующих экспрессию последовательностей. Модификация может уменьшать или останавливать транскрипцию и трансляцию гена Tsp или может приводить к экспрессии белка Tsp, имеющего сниженную протеазную активность по сравнению с белком Tsp дикого типа.
В одном варианте осуществления связанная регулирующая
экспрессию последовательность модифицирована для снижения экспрессии Tsp. Например, промотор для гена Tsp может быть мутирован для предотвращения экспрессии гена.
В предпочтительном варианте осуществления клетки по настоящему изобретению несут мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность, или нокаутированный мутантный ген Tsp.
Предпочтительно, хромосомный ген Tsp является мутантным.
Используемый в настоящем документе термин "ген Tsp" означает ген, кодирующий протеазу Tsp (также известную как Pre) , которая является периплазматической протеазой, способной действовать на пенициллин-связывающий белок-3 (РВРЗ) и белки фагового хвоста. Последовательность гена Tsp дикого типа приведена в SEQ ID N0:1 и последовательность белка Tsp дикого типа приведена в SEQ ID N0:2.
Ссылка на мутантный ген Tsp или мутантный ген Tsp, кодирующий Tsp, относится либо к мутантному гену Tsp, кодирующему белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность, или к нокаутированному мутантному гену Tsp, если не указано иное.
Выражение "мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность" в контексте настоящего изобретения означает, что продукт мутантного гена Tsp не имеет полную протеазную активность по сравнению с продуктом не мутантного гена Tsp дикого типа.
Предпочтительно, мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp, имеющий 50% или менее, 4 0% или менее, 3 0% или менее, 2 0% или менее, 10% или менее или 5% или менее от протеазой активности не мутантного белка Tsp дикого типа. Более предпочтительно, мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp, не имеющий протеазную активность. В данном варианте осуществления клетка не дефицитна по хромосомному гену Tsp, то есть последовательность гена Tsp не была делетирована или мутирована для предотвращения экспрессии любой формы белка Tsp.
Любую подходящую мутацию можно вводить в ген Tsp для производства белка, имеющего сниженную протеазную активность.
Протеазную активность белка Tsp, экспрессированного грамотрицательной бактерией, может легко тестировать специалист в данной области любым подходящим методом, применяемым в данной области, таким как метод, описанный в статье Keiler et al. (Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease* THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, No. 48, Issue of December 1, pp. 28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler и Robert T. Sauer), которым была протестирована протеазная активность Tsp.
В статье Keiler et al. (выше) описано, что Tsp имеет активный центр, содержащий остатки S430, D441 и К455, и остатки G375, G37 6, Е433 и Т452 важны для поддержания структуры Tsp. В статье Keiler et al. (выше) приводятся данные о том, что мутантные гены Tsp S430A, D441A, К455А, К455Н, K455R, G375A, G37 6A, Е433А и Т452А не имели поддающуюся определению протеазную активность. Кроме того, сообщается, что мутантный ген Tsp S430C проявляет примерно 5-10% активности дикого типа. Соответственно, мутация Tsp для получения белка, имеющего сниженную протеазную активность, может включать такую мутацию, как миссенс-мутация одного или более из остатков S430, D441, К455, G375, G376, Е433 и Т452. Предпочтительно, мутация Tsp для получения белка, имеющего сниженную протеазную активность, может включать такую мутацию, как миссенс-мутация одного, двух или трех из остатков активного центра S430, D441 и К455.
Соответственно, мутантный ген Tsp может содержать: мутацию S430; или мутацию D441; или мутацию К455; или мутацию S430 и D441; или мутацию S430 и К455; или мутацию D441 и К455; или мутацию S430, D441 и К455.
Один или более из S430, D441, К455, G375, G376, Е433 и Т4 52 могут быть мутированы в любую подходящую аминокислоту, результатом чего является белок, имеющий сниженную протеазную активность. Примерами подходящих мутаций являются S430A, S430C, D441A, К455А, К455Н, K455R, G375A, G376A, Е433А и Т452А. Мутантный ген Tsp может содержать одну, две или три мутации остатков активного центра, например, ген может содержать: S430A или S430C; и/или D441A; и/или К455А или К455Н или K455R.
Предпочтительно, ген Tsp имеет точечную мутацию S430A или
S430C.
Выражение "нокаутированный мутантный ген Tsp" в контексте настоящего изобретения означает, что ген содержит одну или более мутаций, которые предотвращают экспрессию белка Tsp, кодируемого геном дикого типа, результатом чего является клетка, дефицитная по белку Tsp. Нокаутированный ген может частично или полностью транскрибироваться, но не транслироваться в закодированный белок. Нокаутированный мутантный ген Tsp может быть мутирован любым подходящим способом, например, путем внесения одной или более делеций, вставок, точечных, миссенс, нонсенс и со сдвигом рамки мутаций, чтобы не допустить экспрессии белка. Например, ген может быть нокаутирован путем вставки чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирующую последовательность гена.
В предпочтительном варианте осуществления ген Tsp не мутирован путем вставки чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирующую последовательность гена. В данном варианте осуществления ген Tsp может содержать мутацию инициирующего кодона гена и/или одного или более из стоп-кодонов, расположенных ниже инициирующего кодона гена и выше стоп-кодона гена, тем самым предотвращается экспрессия белка Tsp. Мутация инициирующего кодона может быть миссенс-мутацией одного, двух или всех трех нуклеотидов инициирующего кодона. Альтернативно или дополнительно, инициирующий кодон может быть мутирован путем мутации вставки или делеций со сдвигом рамки. Ген Tsp содержит два кодона ATG на 5'-конце кодирующей последовательности, один или оба из кодонов ATG могут быть мутированы путем миссенс-мутации. Ген Tsp может быть мутирован изменением второго кодона ATG (кодон 3) в TCG. Альтернативно или дополнительно, ген Tsp может содержать один или более стоп-кодонов, расположенных ниже инициирующего кодона гена и выше стоп-кодона гена. Предпочтительно, нокаутированный мутантный ген Tsp содержит и миссенс-мутацию инициирующего кодона и один или более вставленных стоп-кодонов. В предпочтительном варианте
осуществления ген Tsp мутирован путем удаления "Т" из пятого кодона, что вызывает сдвиг рамки, результатом чего является замена на стоп-кодоны кодонов 11 и 16. В предпочтительном варианте осуществления ген Tsp мутирован путем вставки сайта рестрикции Asel для создания третьего стоп-кодона в рамке считывания из кодона 21.
В предпочтительном варианте осуществления нокаутированный мутантный ген Tsp имеет последовательность ДНК SEQ ID N0:3, которая включает б нуклеотидов ATGAAT выше инициирующего кодона. В одном варианте осуществления мутантный ген Tsp имеет последовательность ДНК из нуклеотидов 7-2048 в SEQ ID N0:3.
В настоящем изобретении клетки также несут один или более генов, способных экспрессировать или избыточно экспрессировать один или более белков, способных облегчать сворачивание белков. Примеры включают такие белки, как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD.
В одном варианте осуществления белок для облегчения сворачивания белков представляет собой FkpA, Skp или их сочетание.
В одном варианте осуществления белок для облегчения сворачивания белков выбран из FkpA или сочетания FkpA и Skp.
FkpA представляет собой пептидил-пролил цис-транс изомеразу с номером в Swiss-Prot Р45523.
Skp представляет собой шаперонный белок с номером в Swiss-Prot P0AEU7.
Белок для облегчения сворачивания белков может быть закодирован геном, находящимся в геноме клеток или временно трансфицированным в них, например, на плазмиде, либо их сочетанием, по мере необходимости.
В одном варианте осуществления рекомбинантная грамотрицательная бактериальная клетка не содержит рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантная грамотрицательная бактериальная клетка дополнительно содержит мутантный ген DegP, кодирующий белок DegP, имеющий шаперонную активность и сниженную протеазную активность, и/или мутантный ген ptr, при этом мутантный ген ptr
кодирует белок протеазу III, имеющую сниженную протеазную активность, или является нокаутированным мутантным геном ptr, и/или мутантный ген OmpT, при этом мутантный ген OmpT кодирует белок OmpT, имеющий сниженную протеазную активность, или является нокаутированным мутантным геном OmpT.
Предпочтительно, в данном варианте осуществления геном клетки является изогенным с бактериальной клеткой дикого типа, за исключением вышеуказанных мутаций.
При использовании в настоящем документе "DegP" означает ген, кодирующий белок DegP (также известный как HtrA), который имеет двойную функцию в качестве шаперона и протеазы (Families of serine peptidases; Rawlings N.D., Barrett A.J. Methods Enzymol. 1994; 244: 19-61) . Последовательность не мутантного гена DegP приведена в SEQ ID N0:7 и последовательность не мутантного белка DegP приведена в SEQ ID N0:8.
При низких температурах DegP действует как шаперон, а при высоких температурах DegP преимущественно действует как протеаза (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to ProteAseln a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A., Ehrmann M. и The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J. et al. Microbiology 2008, 154, 3649-3658).
В вариантах осуществления, в которых клетка содержит мутацию DegP, результатом мутации DegP в клетке является мутантный ген DegP, кодирующий белок DegP, имеющий шаперонную активность, но не полную протеазную активность.
Выражение "имеющий шаперонную активность" в контексте настоящего изобретения означает, что мутантный белок DegP имеет такую же или практически такую же шаперонную активность, что и не мутантный белок DegP дикого типа. Предпочтительно, мутантный ген DegP кодирует белок DegP, имеющий 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более или 95% или более от шаперонной активности не мутантного белка DegP дикого типа. Более предпочтительно, мутантный ген DegP кодирует белок DegP, имеющий такую же шаперонную активность, что и DegP дикого
типа.
Выражение "имеющий сниженную протеазную активность" в
контексте настоящего изобретения означает, что мутантный белок
DegP не имеет полную протеазную активность в сравнении с не
мутантным белком DegP дикого типа. Предпочтительно, мутантный
ген DegP кодирует белок DegP, имеющий 50% или менее, 4 0% или
менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее или 5% или
менее от протеазной активности не мутантного белка DegP дикого
типа. Более предпочтительно, мутантный ген DegP кодирует белок
DegP, не имеющий протеазную активность. Клетка не является
дефицитной по хромосомному гену DegP, то есть
последовательности гена DegP не были делетированы или мутированы для предотвращения экспрессии любой формы белка DegP.
Любую подходящую мутацию можно вводить в ген DegP с целью получения белка, имеющего шаперонную активность и сниженную протеазную активность. Протеазную и шаперонную активность белка DegP, экспрессированного грамотрицательной бактерией, может легко протестировать специалист в данной области любым подходящим методом, таким как метод, описанный в статье Spiess et al., в которой протеазная и шаперонная активности DegP были протестированы на MalS, природном субстрате DegP (А Temperature-Dependent Switch from Chaperone to ProteAseln a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A., Ehrmann M.), а также метод, описанный в статье The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J. et al. Microbiology 2008, 154, 3649-3658.
DegP является сериновой протеазой и имеет активный центр, состоящий из каталитической триады аминокислотных остатков Hisl05, Aspl35 и Ser210 (Families of serine peptidases, Methods Enzymol. 1994; 244: 19-61, Rawlings N. , Barrett А.). Мутация DegP для получения белка, имеющего шаперонную активность и сниженную протеазную активность, может включать такую мутацию, как миссенс-мутация одного, двух или трех из Hisl05, Aspl35 и Ser210.
Соответственно, мутантный ген DegP может содержать: мутацию Hisl05; или мутацию Aspl35; или мутацию Ser210; или мутацию Hisl05 и Aspl35; или мутацию Hisl05 и Ser210; или мутацию Aspl35 и Ser210; или мутацию Hisl05, Aspl35 и Ser210.
Один, два или три из Hisl05, Aspl35 и Ser210 могут быть мутированы в любую подходящую аминокислоту, результатом чего является белок, имеющий шаперонную активность и сниженную протеазную активность. Например, один, два или три из Hisl05, Aspl35 и Ser210 могут быть мутированы в небольшую аминокислоту, такую как Gly или Ala. Другая подходящая мутация заключается в замене одного, двух или трех из Hisl05, Aspl35 и Ser210 на аминокислоту с противоположными свойствами, например, мутация Aspl35 в Lys или Arg, мутация полярного остатка Hisl05 в неполярную аминокислоту, такую как Gly, Ala, Val или Leu, и мутация небольшого гидрофильного остатка Ser210 в крупный или гидрофобный остаток, такой как Val, Leu, Phe или Туг. Предпочтительно, ген DegP содержит точечную мутацию S210A, как показано на фиг.11с, результатом которой, как установлено, является белок, имеющий шаперонную активность, но не протеазную активность (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to ProteAseln a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A., Ehrmann M.).
DegP имеет два домена PDZ, PDZ1 (остатки 260-358) и PDZ2 (остатки 359-448), которые опосредуют белок-белковое взаимодействие (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to ProteAseln a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A., Ehrmann M.) . В одном варианте осуществления настоящего изобретения ген degP мутирован для делеций домена PDZ1 и/или домена PDZ2. Делеция PDZ1 и PDZ2 приводит к полной потере протеазной активности белка DegP и снижению шаперонной активности по сравнению с белком DegP дикого типа, тогда как результатом делеций либо PDZ1, либо PDZ2 является 5% протеазной активности и сходная шаперонная активность в сравнении с белком DegP дикого типа (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to ProteAseln a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume
97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A., Ehrmann M.).
Мутантный ген DegP может также содержать молчащий сайт рестрикции неприродного происхождения, например, для Asel, для облегчения использования методов идентификации и скрининга, например, как показано на фиг.7С.
Предпочтительная последовательность мутантного гена DegP, содержащего точечную мутацию S210A и маркерный сайт рестрикции Asel, приведена в SEQ ID N0:9 и кодируемая белковая последовательность приведена в SEQ ID N0:10.
В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых клетка содержит мутантный ген DegP, кодирующий белок DegP, имеющий шаперонную активность и сниженную протеазную активность, одна или более из клеток по настоящему изобретению может обеспечивать повышенный выход надлежащим образом свернутых белков из клетки по сравнению с мутантными клетками, в которых ген DegP был мутирован для нокаута DegP, предотвращающего экспрессию DegP, например, дефицитными по хромосомному гену DegP. В клетке, содержащей нокаутированный мутантный ген DegP, предотвращающий экспрессию DegP, шаперонная активность DegP утрачена полностью, тогда как в клетке по настоящему изобретению шаперонная активность DegP сохранена, при том, что утрачена полная протеазная активность. В этих вариантах осуществления одна или более клеток по настоящему изобретению имеют сниженную протеазную активность для предотвращения протеолиза белка, при этом сохранена шаперонная активность, позволяющая белкам правильно сворачиваться и транспортироваться в клетке-хозяине.
В данных вариантах осуществления одна или более клеток по настоящему изобретению могут отличаться улучшенным клеточным ростом по сравнению с клетками, несущими мутантный нокаутированный ген DegP, предотвращающий экспрессию DegP. Без привязки к какой-либо теории, улучшенный клеточный рост может проявляться вследствие сохранения протеазой DegP шаперонной активности, что может повышать способность клетки процессировать все белки, для которых необходима шаперонная активность. Соответственно, продукция правильно свернутых
белков, необходимых для клеточного роста и воспроизводства, может быть повышена в одной или более из клеток по настоящему изобретению по сравнению с клетками, несущими нокаутирующую мутацию DegP, тем самым улучшается функционирование клеточных путей, регулирующих рост. Кроме того, известные дефицитные по протеазе DegP штаммы, как правило, являются температурно-чувствительными и обычно не растут при температурах выше, чем
примерно 2 8°С. Однако клетки по настоящему изобретению не являются температурно-чувствительными и могут расти при температурах 2 8°С или выше, включая температуры от примерно 3 0°С
до примерно 37°С, которые, как правило, используются для производства в промышленных масштабах белков из бактерий.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка несет мутантный ген ptr. При использовании в настоящем документе "ген ptr" означает ген, кодирующий протеазу III, протеазу, которая расщепляет высокомолекулярные белки. Последовательность не мутантного гена ptr приведена в SEQ ID N0:4 и последовательность не мутантного белка протеазы III приведена в SEQ ID N0:5.
Ссылка на мутантный ген ptr или мутантный ген ptr, кодирующий протеазу III, относится либо к мутантному гену ptr, кодирующему белок протеазу III, имеющую сниженную протеазную активность, либо к нокаутированному мутантному гену ptr, если не указано иное.
Выражение "мутантный ген ptr, кодирующий белок протеазу III, имеющую сниженную протеазную активность" в контексте настоящего изобретения означает, что продукт мутантного гена ptr не имеет полную протеазную активность по сравнению с продуктом не мутантного гена ptr дикого типа.
Предпочтительно, мутантный ген ptr кодирует протеазу III, имеющую 50% или менее, 4 0% или менее, 3 0% или менее, 2 0% или менее, 10% или менее или 5% или менее от протеазной активности не мутантного белка протеазы III дикого типа. Более предпочтительно, мутантный ген ptr кодирует белок протеазу III, не имеющую протеазную активность. В данном варианте
осуществления клетка не является дефицитной по хромосомному гену ptr, то есть последовательность гена ptr не была делетирована или мутирована для предотвращения экспрессии любой формы белка протеазы III.
Любую подходящую мутацию можно вводить в ген ptr для получения белка протеазы III, имеющей сниженную протеазную активность. Протеазную активность белка протеазы III, экспрессированной грамотрицательной бактерией, может легко протестировать специалист в данной области любым подходящим методом в данной области.
Выражение "нокаутированный мутантный ген ptr" в контексте настоящего изобретения означает, что ген содержит одну или более мутаций, в результате которых отсутствует экспрессия белка, кодируемого геном, для получения клетки, дефицитной по белку, кодируемому нокаутированным мутантным геном. Нокаутированный ген может частично или полностью транскрибироваться, но не транслироваться в кодируемый белок. Нокаутированный мутантный ген ptr может быть мутирован любым подходящим способом, например, путем внесения одной или более делеций, вставок, точечных, миссенс, нонсенс и со сдвигом рамки мутаций, чтобы не допустить экспрессии белка. Например, ген может быть нокаутирован путем вставки чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирующую последовательность гена.
В предпочтительном варианте осуществления ген не мутирован путем вставки чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирующую последовательность гена. Предпочтительно, ген протеазы III содержит мутацию инициирующего кодона и/или одного или более стоп-кодонов гена, расположенных ниже инициирующего кодона гена и выше стоп-кодона гена, тем самым предотвращается экспрессия белка протеазы III.
Мутация инициирующего кодона целевого нокаутированного гена вызывает потерю функции инициирующего кодона и, таким образом, является гарантией того, что целевой ген не содержит подходящий инициирующий кодон в начале кодирующей
последовательности. Мутация инициирующего кодона может быть миссенс-мутацией одного, двух или всех трех нуклеотидов инициирующего кодона. Альтернативно или дополнительно, инициирующий кодон может быть мутирован путем мутации вставки или делеций со сдвигом рамки.
В предпочтительном варианте осуществления ген ptr мутирован для замены инициирующего кодона ATG на АТТ.
Альтернативно или дополнительно, нокаутированный мутантный ген ptr может содержать один или более стоп-кодонов, расположенных ниже инициирующего кодона гена и выше стоп-кодона гена. Предпочтительно, нокаутированный мутантный ген ptr содержит и миссенс-мутацию инициирующего кодона и один или более вставленных стоп-кодонов.
Один или более вставленных стоп-кодонов предпочтительно
являются стоп-кодонами в рамке считывания. Однако один или
более вставленных стоп-кодонов могут альтернативно или
дополнительно являться стоп-кодонами за пределами рамки
считывания. Один или более стоп-кодонов за пределами рамки
считывания могут быть необходимы для остановки трансляции,
когда инициирующий кодон за пределами рамки считывания
заменяется на инициирующий кодон в рамке считывания путем
мутации вставки или делеций со сдвигом рамки. Один или более
стоп-кодонов могут быть введены путем любой подходящей мутации,
включая точечную нонсенс-мутацию и мутацию со сдвигом рамки.
Один или более стоп-кодонов предпочтительно вводят путем
мутации со сдвигом рамки и/или мутации вставки, предпочтительно
путем замены сегмента последовательности гена
последовательностью, содержащей стоп-кодон. Например, можно вводить сайт рестрикции Asel, который содержит стоп-кодон ТАА.
В предпочтительном варианте осуществления ген ptr мутирован для вставки стоп-кодона в рамке считывания путем вставки сайта рестрикции Asel, как показано на фиг.7А. В предпочтительном варианте осуществления нокаутированный мутантный ген ptr имеет последовательность ДНК SEQ ID N0:6.
Вышеописанные нокаутирующие мутации имеют преимущества, поскольку они вызывают минимальные или не вызывают нарушения в
хромосомной ДНК выше или ниже сайта целевого нокаутируемого гена и не требуют вставки и сохранения чужеродной ДНК, такой как маркеры устойчивости к антибиотикам, что может влиять на пригодность клетки для экспрессии интересующего белка, особенно терапевтических белков. Соответственно, одна или более из клеток по настоящему изобретению могут демонстрировать улучшенные ростовые характеристики и/или экспрессию белка по сравнению с клетками, в которых ген протеазы был нокаутирован путем вставки чужеродной ДНК в кодирующую последовательность гена.
В одном варианте осуществления клетки по настоящему изобретению несут мутантный ген OmpT. При использовании в настоящем документе "ген ОтрТ" означает ген, кодирующий протеазу OmpT (протеазу Т наружной мембраны) , которая является протеазой наружной мембраны. Последовательность не мутантного гена OmpT дикого типа представляет собой SWISS-PROT Р09169.
Ссылка на мутантный ген OmpT или мутантный ген OmpT, кодирующий OmpT, относится либо к мутантному гену OmpT, кодирующему белок OmpT, имеющий сниженную протеазную активность, либо к нокаутированному мутантному гену OmpT, если не указано иное.
Выражение "мутантный ген OmpT, кодирующий белок OmpT, имеющий сниженную протеазную активность" в контексте настоящего изобретения означает, что продукт мутантного гена OmpT не имеет полную протеазную активность по сравнению с продуктом не мутантного гена OmpT дикого типа. Мутантный ген OmpT может кодировать белок OmpT, имеющий 50% или менее, 4 0% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее или 5% или менее от протеазной активности не мутантного белка OmpT дикого типа. Мутантный ген OmpT может кодировать белок OmpT, не имеющий протеазную активность. В данном варианте осуществления клетка не является дефицитной по хромосомному гену OmpT, то есть последовательность гена OmpT не была делетирована или мутирована для предотвращения экспрессии любой формы белка OmpT.
Любую подходящую мутацию можно вводить в ген OmpT для
получения белка, имеющего сниженную протеазную активность. Протеазную активность белка OmpT, экспрессированного грамотрицательной бактерией, может легко протестировать специалист в данной области любым подходящим методом в данной области, таким как метод, описанный в статьях Kramer et al.
(Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site, FEBS Letters 505
(2001) 426-430) и Dekker et al. (Substrate Specificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries, Biochemistry 2001, 40, 1694-1701). Протеаза OmpT была описана в статье Kramer et al.
(Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000 468, 220-224), в которой сообщается, что замена остатков серина, гистидина и кислых остатков на остатки аланина приводит к приблизительно 10-кратному снижению активности для Glu2 7, Asp97, Asp208 или HislOl, приблизительно 500-кратному снижению активности для Ser99 и приблизительно 10000-кратному снижению активности для Asp83, Asp85, Asp210 или His212. В статье Vandeputte-Rutten et al. (Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site, The EMBO Journal 2001, Vol 20 No 18 5033-5039) описано наличие активного центра, содержащего пару Asp83-Asp85 и пару His212-Asp210. Кроме того, в статье Kramer et al.
(Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752) описано, что все из мутаций D208A, D210A, Н212А, H212N, H212Q, G216K/K217G, К217Т и R218L в петле L4 приводят к частичной или практически полной потере ферментативной активности.
Соответственно, мутация OmpT для получения белка, имеющего сниженную протеазную активность, может включать такую мутацию, как миссенс-мутация одного или более из остатков Е27, D43, D83, D85, D97, S99, Н101, Elll, Е136, Е193, D206, D208, D210, Н212 G216, К217, R218 и Е250.
Один или более из Е27, D43, D83, D85, D97, S99, Н101,
Elll, E136, E193, D206, D208, D210, H212, G216, K217, R218 и E2 50 может мутировать в любую подходящую аминокислоту, результатом чего является белок, имеющий сниженную протеазную активность. Например, один или более из Е27, D43, D83, D85, D97, S99, Н101, Elll, Е136, Е193, D206, D208, D210, Н212, G216, К217, R218 и Е2 50 могут быть мутированы в аланин. Примерами подходящих мутаций являются Е27А, D43A, D83A, D85A, D97A, S99A, Н101А, Е111А, Е136А, Е193А, D206A, D208A, D210A, Н212А, H212N, H212Q, G216K, K217G, К217Т, R218L и Е250А. В одном варианте осуществления мутантный ген OmpT содержит мутации D210A и Н212А. Подходящая мутантная последовательность OmpT, содержащая мутации D210A и Н212А, приведена в SEQ ID N0:23.
Выражение "нокаутированный мутантный ген ОтрТ" в контексте настоящего изобретения означает, что ген содержит одну или более мутаций, в результате которых отсутствует экспрессия белка, кодируемого геном, для получения клетки, дефицитной по белку, кодируемому нокаутированным мутантным геном. Нокаутированный ген может частично или полностью транскрибироваться, но не транслироваться в кодируемый белок. Нокаутированный мутантный ген OmpT может быть мутирован любым подходящим способом, например, путем внесения одной или более делеций, вставок, точечных, миссенс, нонсенс и со сдвигом рамки мутаций, чтобы не допустить экспрессии белка. Например, ген может быть нокаутирован путем вставки чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирующую последовательность гена.
В одном варианте осуществления ген OmpT содержит мутацию инициирующего кодона и/или одного или более стоп-кодонов гена, расположенных ниже инициирующего кодона гена и выше стоп-кодона гена, тем самым предотвращается экспрессия белка OmpT. Мутация инициирующего кодона может быть миссенс-мутацией одного, двух или всех трех нуклеотидов инициирующего кодона. Подходящая мутантная нокаутированная последовательность OmpT приведена в SEQ ID N0:24. Альтернативно или дополнительно, инициирующий кодон может быть мутирован путем мутации вставки или делеций со сдвигом рамки.
В одном варианте осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет нокаутированный мутантный ген OmpT, как если бы она была дефицитна по хромосомному гену OmpT.
В одном варианте осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет нокаутированный мутантный ген degP, как если бы она была дефицитна по хромосомному гену degP. В одном варианте осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет мутантный ген degP.
В одном варианте осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет нокаутированный мутантный ген ptr, как если бы она была дефицитна по хромосомному гену ptr.
Многие генно-инженерные мутации, включая нокаутирующие мутации, предусматривают использование маркеров устойчивости к антибиотикам, которые позволяют проводить отбор и идентификацию успешно мутированных клеток. Однако, как описано выше, существует ряд недостатков, связанных с использованием маркеров устойчивости к антибиотикам.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения клетка не содержит маркер устойчивости к антибиотику, и вышеуказанных недостатков, связанных с использованием маркеров устойчивости к антибиотикам, удается избежать, при этом мутантный ген Tsp, мутантный ген spr и, необязательно, мутантный ген DegP и/или мутантный ген ptr, и/или мутантный ген OmpT мутированы для содержания одного или более маркерных сайтов рестрикции. Сайты рестрикции введены в ген генно-инженерными методами и не являются природными. Маркерные сайты рестрикции являются полезными, поскольку они позволяют проводить скрининг и идентификацию надлежащим образом модифицированных клеток, которые содержат необходимые хромосомные мутации. Клетки, которые были модифицированы для содержания одного или более из мутантных генов протеаз, можно анализировать методом ПЦР геномной ДНК из клеточных лизатов с использованием пар олигонуклеотидов, разработанных для
амплификации области геномной ДНК, содержащей неприродный маркерный сайт рестрикции. Амплифицированную ДНК затем можно анализировать электрофорезом в агарозном геле до и после инкубации с соответствующим ферментом рестрикции, способным расщеплять ДНК в неприродном маркерном сайте рестрикции. Наличие фрагментов ДНК после инкубации с ферментом рестрикции подтверждает, что клетки были успешно модифицированы для содержания одного или более мутантных генов.
В варианте осуществления, в котором клетка несет нокаутированный мутантный ген ptr, имеющий последовательность ДНК SEQ ID N0:6, последовательности олигонуклеотидных праймеров, приведенные в SEQ ID N0:17 и SEQ ID N0:18, можно использовать для амплификации области ДНК, содержащей неприродный сайт рестрикции Asel, из геномной ДНК трансформированных клеток. Амплифицированную геномную ДНК затем можно инкубировать с ферментом рестрикции Asel и анализировать электрофорезом в геле для подтверждения наличия мутантного гена ptr в геномной ДНК.
В варианте осуществления, в котором клетка содержит нокаутированный мутантный ген Tsp, имеющий последовательность ДНК SEQ ID N0:3 или нуклеотиды 7-2 04 8 из SEQ ID N0:3, последовательности олигонуклеотидных праймеров, приведенные в SEQ ID N0:15 и SEQ ID N0:16, можно использовать для амплификации области ДНК, содержащей неприродный сайт рестрикции Asel, из геномной ДНК трансформированных клеток. Амплифицированную геномную ДНК затем можно инкубировать с ферментом рестрикции Asel и анализировать электрофорезом в геле для подтверждения наличия мутантного гена Tsp в геномной ДНК.
В варианте осуществления, в котором клетка содержит мутантный ген DegP, имеющий последовательность ДНК SEQ ID N0:9, последовательности олигонуклеотидных праймеров, приведенные в SEQ ID N0:19 и SEQ ID N0:20, можно использовать для амплификации области ДНК, содержащей неприродный сайт рестрикции Asel, из геномной ДНК трансформированных клеток. Амплифицированную геномную ДНК затем можно инкубировать с ферментом рестрикции Asel и анализировать электрофорезом в геле
для подтверждения наличия мутантного гена DegP в геномной ДНК.
Один или более сайтов рестрикции можно вводить путем любой подходящей мутации, включая внесение одной или более делеций, вставок, точечных, миссенс, нонсенс и со сдвигом рамки мутаций. Сайт рестрикции можно вводить путем мутации инициирующего кодона и/или мутации для введения одного или более стоп-кодонов, как описано выше. Данный вариант осуществления имеет преимущество, поскольку маркерный сайт рестрикции является непосредственным и уникальным маркером введенных нокаутирующих мутаций.
Можно вставлять маркерный сайт рестрикции, который содержит стоп-кодон в рамке считывания, такой как сайт рестрикции Asel. Это особенно выгодно, поскольку вставленный сайт рестрикции служит и маркерным сайтом рестрикции и стоп-кодоном для предотвращения полной транскрипции кодирующей последовательности гена. Например, в варианте осуществления, в котором стоп-кодон введен в ген ptr путем введения сайта Asel, это также создает сайт рестрикции, как показано на фиг.7А. Например, в варианте осуществления, в котором стоп-кодон введен в ген Tsp в кодон 21 путем введения сайта Asel, это также создает сайт рестрикции, как показано на фиг.7В.
Маркерный сайт рестрикции можно вставлять путем мутации инициирующего кодона и, необязательно, одной или более дополнительных точечных мутаций. В данном варианте осуществления маркерный сайт рестрикции предпочтительно представляет собой сайт рестрикции EcoRI. Это особенно выгодно, поскольку мутация инициирующего кодона также создает маркерный сайт рестрикции. Например, в варианте осуществления, в котором инициирующий кодон гена ptr изменен на АТТ, это создает маркерный сайт EcoRI, как показано на фиг.11а. Например, в варианте осуществления, в котором инициирующий кодон (кодон 3) гена Tsp изменен с ATG на TCG, как показано на фиг.lb, дополнительная точечная мутация кодона 2 с ААС на ААТ и мутация кодона 3 с ATG на TCG создает маркерный сайт рестрикции EcoRI, как показано на фиг.7В.
В варианте осуществления настоящего изобретения, в котором
клетка несет мутантный ген OmpT, один или более сайтов рестрикции можно вводить путем любой подходящей мутации, включая внесение одной или более делеций, вставок, точечных, миссенс, нонсенс и со сдвигом рамки мутаций. Например, в варианте осуществления, в котором ген OmpT содержит мутации D210A и Н212А, эти мутации вносят молчащий сайт рестрикции Hindlll, который можно использовать в качестве селективного маркера.
В гене DegP или гене spr маркерный сайт рестрикции может быть введен с использованием молчащих изменений кодонов. Например, сайт Asel можно использовать в качестве молчащего маркерного сайта рестрикции, при этом стоп-кодон ТАА находится вне рамки считывания, как показано на фиг.7С для мутантного гена DegP.
В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых ген ptr и/или ген Tsp мутированы для кодирования протеазы III или Tsp, имеющих сниженную протеазную активность, один или более маркерных сайтов рестрикции можно вводить с использованием молчащих изменений кодонов.
Рекомбинантную грамотрицательную бактериальную клетку по
настоящему изобретению можно получать любыми подходящими
способами. Квалифицированному специалисту известны
соответствующие методы, которые можно использовать для замены
последовательности хромосомного гена мутантной
последовательностью гена. Можно использовать подходящие векторы, которые допускают интеграцию в геном хозяина за счет гомологичной рекомбинации.
Соответствующие методы замены генов описаны, например, в статьях Hamilton et al. (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton CM. et al. , Journal of Bacteriology Sept. 1989, Vol. 171, No. 9 p 4617-4622), Skorupski et al. (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K. and Taylor R.K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al. (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. et al. , Mol Gen Genet 1987,
207: 294-301), Blomfield et al. (Allelic exchange in
Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a
temperature sensitive pSClOl replicon, Blomfield I.C. et al.,
Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) и Ried et al. (An
nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked
mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction
mutagenesis, Ried J.L. and Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246) .
Подходящей плазмидой, допускающей гомологичную
рекомбинацию/замену, является плазмида рКОЗ (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237).
Успешно мутировавшие штаммы можно идентифицировать с использованием методов, хорошо известных в данной области, включая ПЦР колоний для секвенирования ДНК и ПЦР колоний для рестрикционного картирования.
В варианте осуществления, в котором клетка содержит два или более мутантных хромосомных генов, мутантные гены могут быть введены в грамотрицательную бактерию на одном и том же или на разных векторах.
В одном варианте осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет нокаутированный мутантный ген OmpT, как если бы она была дефицитна по хромосомному гену OmpT.
В одном варианте осуществления клетки по настоящему изобретению содержат только три характерные мутации мутантного spr, сниженной активности Tsp и экспрессируют FkpA, Skp или сочетание FkpA и Skp.
В одном варианте осуществления линия клеток по настоящему изобретению содержит мутантный ген Tsp и мутантный ген spr, а также ген FkpA.
В одном варианте осуществления линия клеток по настоящему изобретению содержит мутантный ген Tsp и мутантный ген spr, а также ген Skp.
В одном варианте осуществления линия клеток по настоящему изобретению содержит мутантный ген Tsp и мутантный ген spr, ген FkpA и ген Skp.
В одном варианте осуществления ген или гены, способные
экспрессировать или избыточно экспрессировать один или более белков, способных облегчать сворачивание белков, таких как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD, временно введены трансформацией в клетку, например, в экспрессионном векторе, необязательно содержащем полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его связывающий фрагмент.
В одном варианте осуществления полинуклеотидная последовательность, кодирующая антитело, и полинуклеотид, кодирующий FkpA и/или Skp, вставлены в отдельные экспрессионные векторы.
Для получения продуктов, содержащих как тяжелую, так и легкую цепи, линию клеток можно трансформировать двумя векторами, первым вектором, кодирующим полипептид легкой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, можно использовать один вектор, содержащий последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.
Альтернативно, полинуклеотидная последовательность,
кодирующая антитело, и полинуклеотид, кодирующий FkpA и/или Skp, вставлены в один вектор. Предпочтительно, вектор содержит последовательности, кодирующие полипептиды легкой и тяжелой цепи антитела.
Настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий FkpA и/или Skp и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со специфичностью для человеческого FcRn. Экспрессионный вектор представляет собой мультицистронный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую FkpA и/или Skp, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело.
Мультицистронный вектор можно получать предпочтительным
способом клонирования, который допускает многократное
последовательное клонирование полинуклеотидных
последовательностей в вектор. В способе используются совместимые липкие концы пары сайтов рестрикции, такие как "АТ" концы сайтов рестрикции Asel и Ndel. Полинуклеотидную последовательность, содержащую кодирующую последовательность и
имеющую совместимые липкие концы, такую как фрагмент Asel-Ndel, можно клонировать в сайт рестрикции в векторе, например, Ndel. Вставка полинуклеотидной последовательности нарушает 5' сайт рестрикции, но создает новый 3' сайт рестрикции, например, Ndel, который можно затем использовать для вставки следующей полинуклеотидной последовательности, содержащей совместимые липкие концы. Затем процесс можно повторять для вставки следующих последовательностей. Каждая полинуклеотидная последовательность, вставленная в вектор, содержит некодирующую последовательность 3' по отношению к стоп-кодону, которая может содержать сайт Ssp I для скрининга, последовательность Шайна-Дальгарно для связывания рибосомы, А-богатый спейсер и сайт Ndel, кодирующий инициирующий кодон.
Схематическое изображение создания вектора, содержащего полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела (LC), тяжелую цепь антитела (НС), полинуклеотидные последовательности FkpA и дополнительную полинуклеотидную последовательность, приведено на фиг.7d.
Клетка по настоящему изобретению предпочтительно содержит экспрессионный вектор, описанный выше.
В варианте осуществления, в котором клетка также экспрессирует один или более дополнительных белков, таких как: один или более белков, способных облегчать сворачивание белков, таких как skp, SurA, PPiA и PPiD; и необязательно, один или более белков, способных облегчать секрецию или транслокацию белков, таких как SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY и Lep; один или более из дополнительных белков могут экспрессироваться с одного или более полинуклеотидов, вставленных в тот же вектор, что и полинуклеотид, кодирующий FkpA, и/или полинуклеотидная последовательность, кодирующая антитело. Альтернативно, один или более полинуклеотидов могут быть вставлены в отдельные векторы.
Экспрессионный вектор можно получать путем вставки одной
или более экспрессионных кассет, описанных выше, в подходящий
вектор. Альтернативно, регулирующие экспрессию
последовательности для направления экспрессии полинуклеотидной
последовательности могут содержаться в экспрессионном векторе и, таким образом, только кодирующая область полинуклеотида может быть необходима для завершения экспрессионного вектора.
Полинуклеотид, кодирующий FkpA и/или Skp, и/или полинуклеотид, кодирующий антитело, соответствующим образом вставлен в реплицируемый вектор, как правило, автономно реплицируемый экспрессионный вектор, для экспрессии в клетке под контролем подходящего для клетки промотора. Множество векторов известно в данной области для этой цели и выбор подходящего вектора может зависеть от размера нуклеиновой кислоты и особенно от типа клетки.
Примеры экспрессионных векторов, которые можно использовать для трансформации клетки-хозяина полинуклеотидом по изобретению, включают:
- плазмиду, такую как pBR322 или рАСТС184, и/или
- вирусный вектор, такой как бактериофаг,
- мобильный генетический элемент, такой как транспозон. Такие экспрессионные векторы обычно содержат плазмидную
точку начала репликации ДНК, селективный маркер устойчивости к антибиотику, промотор и терминатор транскрипции, разделенные участком множественного клонирования (экспрессионная кассета), и последовательность ДНК, кодирующую сайт связывания рибосомы.
Промоторы, используемые по настоящему изобретению, могут быть связаны с соответствующим полинуклеотидом напрямую или, альтернативно, могут быть расположены в подходящем положении, например, в векторе, так, что при вставке соответствующего полипептида на него может оказывать действие соответствующий промотор. В одном варианте осуществления промотор расположен перед кодирующей частью полинуклеотида, на который он действует, например, соответствующий промотор перед каждой кодирующей частью полинуклеотида. При использовании в настоящем документе слово "перед" подразумевает, что промотор находится на 5'-конце по отношению к кодирующей части полинуклеотида.
Промоторы могут быть эндогенными или экзогенными для клеток-хозяев. Подходящие промоторы включают lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet и T7.
Один или более промоторов, которые используют, могут быть индуцируемыми промоторами. В варианте осуществления, в котором полинуклеотид, кодирующий FkpA и/или Skp, и полинуклеотид, кодирующий антитело, вставлены в один вектор, нуклеотидные последовательности, кодирующие FkpA и антитело, могут находиться под контролем одного промотора или отдельных промоторов. В варианте осуществления, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие FkpA и/или Skp и антитело, находятся под контролем отдельных промоторов, промоторы могут быть независимо индуцируемыми промоторами.
Промоторы для использования в бактериальных системах, как правило, также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей интересующий полипептид. Промотор можно удалять из ДНК из бактериального источника путем расщепления ферментами рестрикции и вставлять в вектор, содержащий желаемую ДНК.
Экспрессионный вектор также предпочтительно содержит
дицистронную смысловую часть для продукции антитела или его
антигенсвязывающего фрагмента, как описано в W0 03/048208 или
WO 2007/039714 (содержание которых включено в настоящий
документ посредством ссылки). Предпочтительно, расположенный
выше цистрон содержит ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, и
расположенный ниже цистрон содержит ДНК, кодирующую
соответствующую тяжелую цепь, и дицистронная межгенная
последовательность (IGS) предпочтительно содержит
последовательность, выбранную из IGS1 (SEQ ID N0:23), IGS2 (SEQ ID N0:24), IGS3 (SEQ ID N0:25) и IGS4 (SEQ ID N0:26).
Терминаторы могут быть эндогенными или экзогенными для клеток-хозяев. Подходящим терминатором является rrnB.
Информацию о других подходящих регуляторах транскрипции, включая промоторы и терминаторы, а также методы таргетирования белка можно найти в книге "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C., Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p. 512-538.
Полинуклеотид FkpA, вставленный в экспрессионный вектор, предпочтительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую
сигнальные последовательности FkpA и кодирующую
последовательность FkpA. Вектор предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицироваться в одной или более из выбранных клеток-хозяев, предпочтительно реплицироваться независимо от хромосомы хозяина. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий.
В одном варианте осуществления FkpA и/или Skp и/или интересующий белок содержит гистидиновую метку на N-конце и/или С-конце.
Молекула антитела может секретироваться из клетки или направляться в периплазму с помощью соответствующих сигнальных последовательностей. Альтернативно, молекулы антитела могут накапливаться в цитоплазме клетки. Предпочтительно, молекула антитела направляется в периплазму.
Полинуклеотид, кодирующий антитело, может
экспрессироваться в виде слитого продукта с другим полипептидом, предпочтительно, сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления на N-конце зрелого полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна быть последовательностью, которая узнается и процессируется клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не узнают и не процессируют родную или эукариотическую сигнальную последовательность полипептида, сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью. Подходящие сигнальные последовательности включают OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA и DsbC. В варианте осуществления, в котором клетка содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела, каждый полинуклеотид может содержать сигнальную последовательность, такую как OmpA.
При конструировании подходящих векторов, содержащих один или более из вышеперечисленных компонентов, используют стандартные методы лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, присоединяют "хвосты" и повторно
лигируют в нужной форме для получения необходимых плазмид. Основные методы, с помощью которых можно конструировать векторы, методы трансфекции и методы культивирования хорошо известны специалистам в данной области. Информацию относительно этого можно найти в книге "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience, New York и в книге Maniatis Manual, выпущенной издательством Cold Spring Harbor Publishing.
Можно использовать стандартные методы молекулярной биологии для получения последовательностей ДНК, кодирующих антитело. Нужные последовательности ДНК можно синтезировать полностью или частично с использованием методик синтеза олигонуклеотидов. По мере необходимости можно использовать методы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе со ссылкой на полинуклеотид, в равной степени относятся к альтернативным вариантам осуществления изобретения, например, векторам, экспрессионным кассетам и/или клеткам-хозяевам, содержащим используемые в них компоненты, в тех случаях, когда к ним может быть применен соответствующий аспект.
Клетка по настоящему изобретению может дополнительно содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий белок. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая интересующий белок, может быть экзогенной или эндогенной. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая интересующий белок, может быть интегрирована в хромосому хозяина или может быть не интегрирована, в векторе, как правило, в плазмиде.
В одном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению экспрессирует интересующий белок. Термин "интересующий белок" в контексте настоящей спецификации должен относиться к полипептиду для экспрессии, как правило, рекомбинантному полипептиду. Однако интересующий белок может быть эндогенным белком, экспрессируемым с эндогенного гена в
клетке-хозяине.
Используемый в настоящем документе термин "рекомбинантный полипептид" относится к белку, который сконструирован или продуцируется с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Интересующий белок может представлять собой экзогенную последовательность, идентичную эндогенному белку, или ее мутантный вариант, например, с ослабленной биологической активностью, или ее фрагмент, экспрессируемый с экзогенного вектора. Альтернативно, интересующий белок может быть гетерологичным белком, обычно не экспрессируемым клеткой-хозяином.
Интересующий белок может быть любым подходящим белком, включая терапевтический, профилактический или диагностический белок.
Квалифицированный специалист сможет легко протестировать секретированный белок для определения того, правильно ли свернут белок, с использованием методов, хорошо известных в данной области, таких как ВЭЖХ с белком G, круговой дихроизм, ЯМР, рентгеновская кристаллография и методы измерения аффинности эпитопов.
В одном варианте осуществления интересующий белок является полезным в лечении заболеваний или нарушений, включая иммунные нарушения и/или аутоиммунные заболевания.
В одном варианте осуществления аутоиммунное заболевание
выбрано из острого диссеминированного энцефаломиелита (ADEM),
острого некротического геморрагического лейкоэнцефалита,
болезни Аддисона, агаммаглобулинемии, очаговой алопеции,
амилоидоза, ANCA-ассоциированного васкулита, анкилозирующего
спондилита, анти-6ВМ/анти-ТВМ нефрита, антифосфолипидного
синдрома (APS), аутоиммунного ангионевротического отека,
аутоиммунной апластической анемии, аутоиммунной вегетативной
дистонии, аутоиммунного гепатита, аутоиммунной гиперлипидемии,
аутоиммунного иммунодефицита, аутоиммунного заболевания
внутреннего уха (AIED), аутоиммунного миокардита, аутоиммунного
панкреатита, аутоиммунной ретинопатии, аутоиммунной
тромбоцитопенической пурпуры (АТР), аутоиммунного заболевания
щитовидной железы, аутоиммунной крапивницы, аксональных и
нейрональных невропатий, болезни Бало, болезни Бехчета,
буллезного пемфигоида, кардиомиопатии, болезни Кастлемена,
глютенчувствительной целиакии, болезни Шагаса, синдрома
хронической усталости, хронической воспалительной
демиелинизирующей полиневропатии (CIDP), хронического
рецидивирующего мультифокального остеомиелита (CRMO), синдрома
Черджа-Стросс, рубцового пемфигоида/доброкачественного
пемфигоида слизистых оболочек, болезни Крона, синдрома Когана,
болезни Холодовых агглютининов, врожденной блокады сердца,
миокардита Коксаки, CREST-синдрома, идиопатической смешанной
криоглобулинемии, демиелинизирующих невропатий, герпетиформного
дерматита, дерматомиозита, болезни Девика (нейромиелита
зрительного нерва), дилатационной кардиомиопатии, дискоидной
волчанки, синдрома Дресслера, эндометриоза, эозинофильного
ангиоцентрического фиброза, эозинофильного фасциита, узловатой
эритемы, экспериментального аллергического энцефаломиелита,
синдрома Эванса, фибромиалгии, фиброзирующего альвеолита,
гигантоклеточного артериита (височного артериита),
гломерулонефрита, синдрома Гудпасчера, гранулематоза с
полиангиитом (GPA) (Вегенера), болезни Грэйвса, синдрома
Гийена-Барре, энцефалита Хашимото, тиреоидита Хашимото,
гемолитической анемии, пурпуры Геноха-Шенлейна, герпеса
беременных, гипогаммаглобулинемии, идиопатического
гипокомплементемического тубулоинтерстициального нефрита, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), IgA нефропатии, 1дС4-связанного заболевания, 1дС4-связанной склерозирующей болезни, иммунорегуляторных липопротеинов, воспалительной аневризмы аорты, воспалительной псевдоопухоли, миозита с тельцами включения, инсулин-зависимого диабета (1 типа), интерстициального цистита, ювенильного артрита, ювенильного диабета, синдрома Кавасаки, опухоли Каттнера, синдрома Ламберта-Итона, лейкоцитокластического васкулита, красного плоского лишая, склероатрофического лишая, фибринозного конъюнктивита, IgA-зависимого линейного дерматоза (LAD), системной красной волчанки (SLE), болезни Лайма,
хронического фиброза средостения, болезни Меньера,
микроскопического полиангиита, синдрома Микулича, смешанной болезни соединительной ткани (MCTD), язвы Мурена, болезни Мухи-Габермана, мультифокального фибросклероза, рассеянного склероза, миастении, миозита, нарколепсии, нейромиелита зрительного нерва (Девика), нейтропении, глазного рубцового пемфигоида, неврита зрительного нерва, болезни Ормонда
(ретроперитонеального фиброза), палиндромного ревматизма,
PANDAS (детских аутоиммунных психоневрологических заболеваний,
связанных с Streptococcus), паранеопластической мозжечковой
дегенерации, парапротеинемической полиневропатии,
пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH), синдрома Парри-
Ромберга, синдрома Персонейджа-Тернера, парспланита
(периферического увеита), обыкновенной пузырчатки, периаортита,
периартериита, периферической невропатии, перивенозного
энцефаломиелита, пернициозной анемии, POEMS-синдрома,
узелкового полиартериита, аутоиммунных полигландулярных
синдромов I, II и III типа, ревматической полимиалгии,
полимиозита, постинфарктного синдрома,
постперикардиотомического синдрома, прогестеронного дерматита,
первичного биллиарного цирроза, первичного склерозирующего
холангита, псориаза, псориатического артрита, идиопатического
пульмонарного фиброза, гангренозной пиодермии, истинной
эритроцитарной аплазии, феномена Рейно, рефлекторной
симпатической дистрофии, синдрома Рейтера, рецидивирующего
полихондрита, синдрома беспокойных ног, ретроперитонеального
фиброза (болезни Ормонда), ревматической лихорадки,
ревматоидного артрита, тиреоидита Риделя, саркоидоза, синдрома
Шмидта, склерита, склеродермии, синдрома Шегрена, аутоиммунных
заболеваний органов мошонки, синдрома скованного человека,
подострого бактериального эндокардита (SBE), синдрома Сусака,
симпатической офтальмии, артериита Такаясу, височного
артериита/гигантоклеточного артериита, тромботической
тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), синдрома Толоса-Ханта, поперечного миелита, язвенного колита, недифференцированного заболевания соединительной ткани (UCTD), увеита, васкулита,
везикулобуллезного дерматоза, витилиго, макроглобулинемии Вальденстрема, тепловой идиопатической гемолитической анемии и гранулематоза Вегенера (современное название гранулематоз с полиангиитом (GPA).
В одном варианте осуществления неврологическое нарушение
выбрано из хронической воспалительной демиелинизирующей
полиневропатии (CIDP), синдрома Гийена-Барре,
парапротеинемической полиневропатии, нейромиелита зрительного нерва (NMO, расстройств NMO спектра или заболеваний NMO спектра) и миастении.
В одном варианте осуществления иммунное гематологическое заболевание выбрано из идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), тепловой идиопатической гемолитической анемии, синдрома Гудпасчера и донорского несоответствия при трансплантации из-за анти-HLA антител.
В одном варианте осуществления заболевание выбрано из миастении, нейромиелита зрительного нерва, CIDP, синдрома Гийена-Барре, парапротеинемической полиневропатии, рефракторной эпилепсии, ITP/TTP, гемолитической анемии, синдрома Гудпасчера, АВО несоответствия, волчаночного нефрита, почечного васкулита, склеродермии, фиброзирующего альвеолита, дилатационной кардиомиопатии, болезни Грэйва, диабета 1 типа, аутоиммунного диабета, пемфигуса, склеродермии, системной красной волчанки, ANCA васкулита, дерматомиозита, болезни Шегрена и ревматоидного артрита.
В одном варианте осуществления дерматологическое заболевание выбрано из буллезного пемфигоида, обыкновенной пузырчатки, ANCA-ассоциированного васкулита и дилатационной кардиомиопатии.
В одном варианте осуществления антитела или фрагменты по настоящему изобретению можно использовать в профилактике или лечении аллоиммунных заболеваний, связанных с трансплантацией аллогенного органа или ткани, или некоторых неонатальных состояний.
Белок может представлять собой чувствительный к протеолизу
полипептид, то есть белки, которые имеют тенденцию к расщеплению, чувствительные к расщеплению, или расщепляемые одной или более из протеаз грамотрицательных бактерий, таких как Е. coli, либо в нативном состоянии, либо во время секреции. В одном варианте осуществления интересующий белок чувствителен к протеолизу протеазой, выбранной из DegP, протеазы III и Tsp. В одном варианте осуществления интересующий белок чувствителен к протеолизу протеазой Tsp. В одном варианте осуществления интересующий белок чувствителен к протеолизу протеазами DegP и протеазой III. В одном варианте осуществления интересующий белок чувствителен к протеолизу протеазами DegP и Tsp. В одном варианте осуществления интересующий белок чувствителен к протеолизу протеазой Tsp и протеазой III. В одном варианте осуществления интересующий белок чувствителен к протеолизу протеазами DegP, протеазой III и Tsp.
Предпочтительно, белок представляет собой эукариотический полипептид.
Интересующий белок, экспрессируемый клетками по
изобретению, может быть, например, иммуногеном, слитым белком,
содержащим два гетерологичных белка, или антителом. Антитела
для использования в качестве интересующего белка, включают
моноклональные, мультивалентные, мультиспецифические,
гуманизированные, полностью человеческие или химерные антитела. Антитело может относиться к любому виду, но предпочтительно относится к моноклональному антителу, человеческому антителу или гуманизированному фрагменту. Антитело может относиться к любому классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD или IgA) или подклассу молекул иммуноглобулинов и может быть получено из любого вида, включая, например, мышь, крысу, акулу, кролика, свинью, хомяка, верблюда, ламу, козу или человека. Части фрагмента антитела могут быть получены из более чем одного вида, например, фрагменты антитела могут быть химерными. В одном примере константные области происходят из одного вида, а вариабельные области из другого.
Антитело может представлять собой полную молекулу антитела, имеющую полноразмерные тяжелые и легкие цепи, или ее
фрагмент, например, фрагмент VH, VL, VHH, Fab, модифицированные Fab, Fab', F(ab')2f Fv, scFv или антитело двойной специфичности, такое как Fab-dAb или Fab-Fv, как описано в W0 2009/040562 и WO 2010/035012.
В одном варианте осуществления белок представляет собой
Fab' .
Антитело может быть специфическим для любого целевого
антигена. Антиген может быть связанным с клеткой белком,
например, белком клеточной поверхности на таких клетках, как
бактериальные клетки, дрожжевые клетки, Т-клетки,
эндотелиальные клетки или опухолевые клетки, или он может быть растворимым белком. Интересующие антигены могут также представлять собой любой применимый в медицине белок, такой как те белки, регуляция которых повышена во время заболевания или инфекции, например, рецепторы и/или соответствующие им лиганды. Конкретные примеры белков клеточной поверхности включают молекулы адгезии, например, интегрины, такие как |31 интегрины, например, VLA-4, Е-селектин, Р-селектин или L-селектин, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (ОХ40), ICOS, ВСМР7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 или CSFl-рецептор, DPCR1, DPCR1, дудулин 2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, нектин-подобный 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, карциноэмбриональный антиген (CEA), глобулин человеческого молочного жира (HMFG1 и 2), антигены МНС класса I и МНС класса II, KDR и VEGF, и в случае необходимости, их рецепторы.
Растворимые антигены включают интерлейкины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 или IL-17, например, IL17A и/или IL17F, вирусные антигены, например, антигены респираторно-синцитиального вируса или цитомегаловируса, иммуноглобулины, такие как IgE, интерфероны, такие как интерферон а, интерферон |3 или интерферон у, фактор некроза опухолей TNF (ранее известный как фактор некроза
опухолей а) , фактор некроза опухолей |3, колониестимулирующие факторы, такие как G-CSF или GM-CSF, и тромбоцитарные факторы роста, такие как PDGF-a и PDGF-|3, и в случае необходимости, их рецепторы. Другие антигены включают антигены поверхности бактериальной клетки, бактериальные токсины, вирусы, такие как вирус гриппа, EBV, вирус гепатита А, В и С, средства биотерроризма, радиоактивные изотопы и тяжелые металлы, а также яды и токсины змей и пауков.
В одном варианте осуществления антиген представляет собой
FcRn.
Антитела для использования по настоящему изобретению можно
получать с использованием любого подходящего метода, известного
в данной области. Полипептид/белок FcRn, включая его слитые
белки и мутанты, включая клетки, (рекомбинантно или
естественно) экспрессирующие полипептид (такие как
активированные Т-клетки), можно использовать для получения антител, которые специфически узнают FcRn. Полипептид может быть "зрелым" полипептидом или его биологически активным фрагментом или производным. Человеческий белок зарегистрирован в Swiss-Prot под номером Р55899. В одном варианте осуществления иммуноген представляет собой альфа-цепь FcRn или ее фрагмент.
Полипептиды с целью использования для иммунизации хозяина можно получать способами, хорошо известными в данной области, из генетически измененных клеток-хозяев, содержащих экспрессионные системы, или их можно извлекать из природных биологических источников. В настоящей заявке термин "полипептиды" включает пептиды, полипептиды и белки. Они используются взаимозаменяемо, если не указано иное. Полипептид FcRn в некоторых случаях может быть частью большего белка, такого как слитый белок, например, быть слитым с аффинным маркером.
Антитела, вырабатываемые против полипептида FcRn, можно получать в случае, когда необходима иммунизация животного, путем введения полипептидов животному, предпочтительно, отличному от человека животному, с использованием хорошо
известных и обычных протоколов, смотрите, например, Handbook of Experimental Immunology, D.M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Можно иммунизировать различных теплокровных животных, таких как кролики, мыши, крысы, овцы, коровы, верблюды или свиньи. Однако, как правило, наиболее подходящими являются, мыши, кролики, свиньи и крысы.
В одном варианте осуществления антитело можно использовать
для функционального изменения активности интересующего
антигена. Например, антитело может нейтрализовать,
противодействовать или содействовать активности указанного антигена, прямо или косвенно, или просто блокировать связывание с ним нормального лиганда.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной
грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей мутантный
ген Tsp, при этом мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp,
обладающий сниженной протеазной активностью, или представляет
собой нокаутированный мутантный ген Tsp; мутантный ген spr,
кодирующий мутантный белок spr; ген, способный экспрессировать
или избыточно экспрессировать один или более белков, способных
облегчать сворачивание белков, и полинуклеотидную
последовательность, кодирующую антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, специфичный для FcRn.
Различные анти-FcRn антитела и фрагменты приведены в последовательностях 36-74.
В одном варианте осуществления тяжелая цепь содержит 1, 2 или 3 CDR, независимо выбранных из SEQ ID N0:36, 37 и 38.
В одном варианте осуществления легкая цепь содержит 1, 2 или 3 CDR, независимо выбранных из SEQ ID N0:39, 4 0 и 41.
В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:36 для CDR-H1, последовательность, приведенную в SEQ ID N0:37 для CDR-Н2, и последовательность, приведенную в SEQ ID N0:38 для CDRH3.
В одном варианте осуществления легкая цепь антитела содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:39 для CDR-L1, последовательность, приведенную в SEQ ID N0:40 для CDR-
L2, и последовательность, приведенную в SEQ ID N0:41 для CDRL3.
В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:36 для CDR-H1, последовательность, приведенную в SEQ ID N0:37 для CDR-Н2, последовательность, приведенную в SEQ ID N0:38 для CDRH3, последовательность, приведенную в SEQ ID N0:39 для CDR-L1, последовательность, приведенную в SEQ ID N0:40 для CDR-L2, и последовательность, приведенную в SEQ ID N0:41 для CDRL3.
В одном варианте осуществления клетка экспрессирует молекулу антитела с последовательностью, раскрытой в настоящем документе.
Молекулы антитела включают антитела и их связывающие фрагменты.
Соответственно, гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет вариабельный домен, содержащий человеческие акцепторные каркасные области, а также один или более из CDR, специально приведенных в настоящем документе. Таким образом, один вариант осуществления относится к гуманизированному антителу, которое связывает FcRn человека, при этом вариабельные домены содержат человеческие акцепторные каркасные области и донорские CDR, отличные от человеческих. В одном примере вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:50, и вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:58. В одном примере легкая цепь содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:54, и тяжелая цепь содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0:62.
После экспрессии фрагменты антитела могут дополнительно процессироваться, например, путем конъюгации с другим фрагментом, таким как эффекторная молекула.
Используемый в настоящем документе термин "эффекторная молекула" включает, например, антинеопластические средства, лекарственные средства, токсины (такие как ферментативно активные токсины бактериального или растительного происхождения и их фрагменты, например, рицин и его фрагменты), биологически активные белки, например, ферменты, другое антитело или
фрагменты антитела, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например, ДНК, РНК и их фрагменты, радиоактивные изотопы, в частности, радиоактивный иодид, радиоизотопы, хелатные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть обнаружены с помощью ЯМР или ЭПР-спектроскопии. Эффекторная молекула может быть присоединена к антителу или его фрагменту любым подходящим способом, например, фрагмент антитела может быть модифицирован для присоединения по меньшей мере одной эффекторной молекулы, как описано в W0 05/003171 или WO 05/003170 (содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки). В WO 05/003171 или WO 05/003170 также описаны подходящие эффекторные молекулы.
В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент, такой как Fab, является пегилированным для создания продукта с необходимыми свойствами, например, аналогичного целым антителам, если необходимо. Например, антитело может представлять собой пегилированные анти-TNF-a Fab', как описано в WO 01/094585, предпочтительно содержащие присоединенную к одному из остатков цистеина на С-конце тяжелой цепи производную от лизил-малеинимида группу, при этом каждая из двух аминогрупп остатка лизила имеет ковалентно присоединенный к ней остаток метоксиполи(этиленгликоля) с молекулярной массой примерно 20000 Да, так, что общая средняя молекулярная масса остатков метоксиполи(этиленгликоля) составляет примерно 40000 Да, более предпочтительно, производная от лизил-малеинимида группа представляет собой [ 1-[ [ [2-[ [3-(2,5-диоксо-1-пирролидинил)-1-оксопропил]амино]этил]амино]-карбонил]-1,5-пентандиил]бис(иминокарбонил).
В одном варианте осуществления Fab или Fab' по настоящему изобретению конъюгированы с молекулой человеческого сывороточного альбумина или молекулой крахмала.
Клетка также может содержать дополнительные
полинуклеотидные последовательности, кодирующие один или более
дополнительных интересующих белков.
В одном варианте осуществления один или более белков
хозяина Е. coli, которые, как известно, в диком типе в процессе
очистки очищаются совместно с рекомбинантным интересующим
белком, выбраны для генетической модификации, как описано в
статье Humphreys et al. "Engineering of Escherichia coli to
improve the purification of periplasmic Fab' fragments:
changing the pi of the chromosomally encoded PhoS/PstS
protein", Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118
и WO 04/035792 (содержание которых включено в настоящий
документ посредством ссылки). Использование таких
модифицированных белков хозяина улучшает процесс очистки интересующих белков, особенно антител, продуцируемых в Е. coli, за счет изменения физических свойств выбранных белков Е. coli таким образом, что они более не очищаются совместно с рекомбинантным антителом. Предпочтительно, белок Е. coli, который изменяют, выбран из одного или более из фосфат-связывающего белка (PhoS/PstS), дипептид-связывающего белка
(DppA), мальтоза-связывающего белка (МВР) и тиоредоксина.
В одном варианте осуществления физическое свойство примесного белка хозяина изменено добавлением аминокислотного маркера к С-концу или N-концу. В предпочтительном варианте осуществления физическим свойством, которое изменяют, является изоэлектрическая точка и аминокислотный маркер представляет собой маркер из полиаспарагиновой кислоты, присоединенный к С-концу. В одном варианте осуществления белки E.coli, измененные добавлением указанного маркера, представляют собой дипептид-связывающий белок (DppA), мальтоза-связывающий белок (МВР), тиоредоксин и фосфат-связывающий белок (PhoS/PstS). В одном конкретном варианте осуществления pi фосфат-связывающего белка
(PhoS/PstS) Е. coli уменьшается с 7,2 до 5,1 за счет добавления маркера из полиаспарагиновой кислоты (полиО), содержащего б остатков аспарагиновой кислоты, к С-концу.
Также предпочтительной является модификация специфических остатков примесного белка Е. coli для изменения его физических свойств, либо отдельно, либо в сочетании с добавлением N или С
концевых маркеров. Такие изменения могут включать вставки или делеций для изменения размера белка или аминокислотные замены для изменения pi или гидрофобности. В одном варианте осуществления эти остатки локализованы на поверхности белка. В предпочтительном варианте осуществления поверхностные остатки белка PhoS изменены для снижения pi белка. Предпочтительно, остатки, играющие важную роль в связывании фосфата (Bass, US 5304472), не затрагивают, чтобы сохранить функциональность белка PhoS. Предпочтительно, мишенью являются остатки лизина, которые сильно выступают над поверхностью белка или находятся внутри или рядом с большими группами основных остатков. В одном варианте осуществления белок PhoS имеет маркер из гексаполиаспарагиновой кислоты, присоединенный к С-концу, в то время как поверхностные остатки на противоположном конце молекулы являются мишенью для замены. Предпочтительно, выбранные остатки лизина заменяют на остатки глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты для придания большего потенциального изменения pi, чем при изменении нейтральных остатков на кислые остатки. Обозначение для мутанта замены в настоящем документе состоит из буквы, за которой следует номер, а затем буква. Первая буква обозначает аминокислоту в белке дикого типа. Номер означает положение аминокислоты, в котором происходит аминокислотная замена, и вторая буква обозначает аминокислоту, которую используют для замены аминокислоты дикого типа. В предпочтительных мутациях PhoS по настоящему изобретению остатки лизина (К) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 заменены на глютаминовую кислоту (Е) или глютамин (Q) путем одиночных или комбинированных мутаций, кроме того, лизин (К)318 может быть заменен на аспарагиновую кислоту (D) путем одиночной или комбинированной мутации. Предпочтительно, одиночными мутациями являются К2 62Е, К2 65Е и К2 6 6Е. Предпочтительно, комбинированными мутациями являются К2 65/2 66Е и К110/265/266Е. Более предпочтительно, все мутации скомбинированы с маркером из полиаспарагиновой кислоты (полиБ), присоединенным к С-концу, и, необязательно, также с заменой K318D. В предпочтительном варианте осуществления мутации
приводят к снижению величины pi по меньшей мере на 2 единицы. Предпочтительно, мутации по настоящему изобретению снижают величину pi белка PhoS с 7,2 до величины от примерно 4 до примерно 5,5. В одном варианте осуществления настоящего изобретения pi белка PhoS из Е. coli снижается с 7,2 до примерно 4,9, примерно 4,8 и примерно 4,5 при помощи мутаций полиБ K318D, полиБ К265/266Е и полиБ Kl10/265/266Е, соответственно.
Полинуклеотид, кодирующий интересующий белок, может экспрессироваться в виде слитого продукта с другим полипептидом, предпочтительно, сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления на N-конце зрелого полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна быть последовательностью, которая узнается и процессируется клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не узнают и не процессируют родную или эукариотическую сигнальную последовательность полипептида, сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью. Подходящие сигнальные последовательности включают OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA и DsbC.
При конструировании подходящих векторов, содержащих один или более из вышеперечисленных компонентов, используют стандартные методы лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, присоединяют "хвосты" и повторно лигируют в нужной форме для получения необходимых плазмид.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения используют экспрессионную кассету, несущую полинуклеотид, кодирующий интересующий белок, которая, как правило, содержит одну или более кодирующих белки последовательностей, которые кодируют один или более из интересующих белков, и одну или более регулирующих экспрессию последовательностей. Одна или более регулирующих экспрессию последовательностей могут включать промотор. Одна или более регулирующих экспрессию последовательностей могут также включать 3'-нетранслируемую область, такую как последовательность терминации. Подходящие
промоторы обсуждаются более подробно ниже.
В одном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению содержит вектор, такой как плазмида. Вектор предпочтительно содержит одну или более экспрессионных кассет, описанных выше.
В варианте осуществления, в котором интересующий белок представляет собой антитело, содержащее как тяжелую, так и легкую цепи, линия клеток может быть трансфицирована двумя векторами, первым вектором, кодирующим полипептид легкой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, можно использовать один вектор, содержащий последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.
Вектор для использования по настоящему изобретению можно получать путем вставки экспрессионной кассеты, описанной выше, в подходящий вектор. Альтернативно, регулирующие экспрессию последовательности для направления экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей интересующий белок, могут содержаться в векторе и, таким образом, только кодирующая область полинуклеотида может быть необходима для завершения вектора.
Примеры векторов, которые можно использовать для трансформации клетки-хозяина полинуклеотидом по изобретению, включают: плазмиду, такую как pBR322 или рАСТС184, и/или вирусный вектор, такой как бактериофаг, мобильный генетический элемент, такой как транспозон.
Доступны различные формы экспрессионного вектора. Такие векторы, как правило, содержат плазмидную точку начала репликации ДНК, селективный маркер устойчивости к антибиотику, промотор и терминатор транскрипции, разделенные участком множественного клонирования (экспрессионная кассета) и последовательность ДНК, кодирующую сайт связывания рибосомы.
Промоторы, используемые по настоящему изобретению, могут быть связаны с соответствующим полинуклеотидом напрямую или, альтернативно, могут быть расположены в подходящем положении, например, в векторе, так, что при вставке соответствующего
полипептида на него может оказывать действие соответствующий промотор. В одном варианте осуществления промотор расположен перед кодирующей частью полинуклеотида, на который он действует, например, соответствующий промотор перед каждой кодирующей частью полинуклеотида. При использовании в настоящем документе слово "перед" подразумевает, что промотор находится на 5'-конце по отношению к кодирующей части полинуклеотида.
Промоторы могут быть эндогенными или экзогенными для клеток-хозяев. Подходящие промоторы включают lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet и T7.
Один или более промоторов, которые используют, могут быть индуцируемыми промоторами.
Экспрессионные единицы для использования в бактериальных системах, как правило, также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (S. D.) для связывания рибосомы, функционально связанную с ДНК, кодирующей интересующий полипептид.
Экспрессионный вектор предпочтительно также содержит
дицистронную смысловую часть для продукции антитела или его
антигенсвязывающего фрагмента, как описано в W0 03/048208 или
WO 2007/039714 (содержание которых включено в настоящий
документ посредством ссылки). Предпочтительно, расположенный
выше цистрон содержит ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, и
расположенный ниже цистрон содержит ДНК, кодирующую
соответствующую тяжелую цепь, и дицистронная межгенная
последовательность (IGS) предпочтительно содержит
последовательность, выбранную из IGS1 (SEQ ID N0:38), IGS2 (SEQ ID N0:39), IGS3 (SEQ ID N0:40) и IGS4 (SEQ ID N0:41).
Терминаторы могут быть эндогенными или экзогенными для клеток-хозяев. Подходящим терминатором является rrnB.
Информацию о других подходящих регуляторах транскрипции, включая промоторы и терминаторы, а также методы таргетирования белка можно найти в книге "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C., Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p. 512-538.
Молекула антитела может секретироваться из клетки или направляться в периплазму с помощью соответствующих сигнальных
последовательностей. Альтернативно, молекулы антитела могут накапливаться в цитоплазме клетки. Предпочтительно, молекула антитела направляется в периплазму.
Варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе со ссылкой на полинуклеотид, в равной степени относятся к альтернативным вариантам осуществления изобретения, например, векторам, экспрессионным кассетам и/или клеткам-хозяевам, содержащим используемые в них компоненты, в тех случаях, когда к ним может быть применен соответствующий аспект.
Настоящее изобретение также относится к способу получения рекомбинантного интересующего белка, включающему экспрессию рекомбинантного интересующего белка в рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, как описано выше в первом или втором аспекте настоящего изобретения.
Грамотрицательную бактериальную клетку и интересующий белок предпочтительно используют в способе по настоящему изобретению, как подробно описано выше.
Если полинуклеотид, кодирующий интересующий белок, является экзогенным, полинуклеотид можно вводить в клетку-хозяина с использованием любых подходящих методов, известных в данной области. Как правило, полинуклеотид вводят в виде части экспрессионного вектора, который вводят трансформацией в клетку. Соответственно, в одном аспекте клетка по настоящему изобретению содержит экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий интересующий белок.
Полинуклеотидную последовательность можно вводить трансформацией в клетку при помощи стандартных методов, например, с использованием хлорида рубидия, ПЭГ или электропорации.
В способе по настоящему изобретению можно также использовать систему селекции для облегчения селекции стабильных клеток, которые были успешно трансформированы полинуклеотидом, кодирующим интересующий белок. В системе селекции, как правило, используют совместную трансформацию с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей селективный
маркер. В одном варианте осуществления каждый полинуклеотид,
введенный трансформацией в клетку, дополнительно содержит
полинуклеотидную последовательность, кодирующую один или более
селективных маркеров. Соответственно, трансформация
полинуклеотидом, кодирующим интересующий белок, и одним или более из полинуклеотидов, кодирующих маркер, происходит совместно и можно использовать систему селекции для отбора тех клеток, которые продуцируют желаемые белки.
Клетки, способные экспрессировать один или более маркеров,
способны выживать/расти/размножаться в определенных
искусственно созданных условиях, например, при добавлении токсина или антибиотика, благодаря свойствам, которые им придал полипептид/ген или полипептидный компонент системы селекции, включенный в них (например, устойчивости к антибиотику). Те клетки, которые не способны экспрессировать один или более маркеров, не способны выживать/расти/размножаться в искусственно созданных условиях. Можно выбирать более или менее жесткие искусственно созданные условия, по мере необходимости.
Любую подходящую систему селекции можно использовать по настоящему изобретению. Как правило, система селекции может быть основана на включении в вектор одного или более генов, которые придают устойчивость к известному антибиотику, например, гена устойчивости к тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину или ампициллину. Клетки, которые растут в присутствии соответствующего антибиотика, можно отбирать, поскольку они экспрессируют как ген, который придает устойчивость к антибиотику, так и желаемый белок.
В одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно включает этап культивирования трансформированной клетки в среде, чтобы при этом экспрессировался интересующий белок.
Для экспрессии интересующего белка в настоящем изобретении можно использовать систему индуцируемой экспрессии или коститутивный промотор. Подходящие системы индуцируемой экспрессии и конститутивные промоторы хорошо известны в данной области.
Для культивирования трансформированной клетки можно использовать любую подходящую среду. Среда может быть адаптирована для специфической системы селекции, например, среда может содержать антибиотик, чтобы в среде могли расти только те клетки, которые были успешно трансформированы.
Клетки, выросшие в среде, можно подвергать дальнейшему скринингу и/или очистке, по мере необходимости. Способ может дополнительно включать один или более этапов для экстракции и очистки интересующего белка, по мере необходимости.
Полипептид можно извлекать из клеток штамма, в том числе из цитоплазмы, периплазмы или супернатанта.
В одном варианте осуществления антитело выделяют из периплазмы.
В одном варианте осуществления послеиндукционная скорость подпитки находится в диапазоне от 5 до 7,5 г/ч, например, примерно 7 г/ч.
Конкретный метод(ы), используемый для очистки белка, зависит от типа белка. Подходящие методы включают фракционирование на иммуно-аффинных или ионообменных колонках; осаждение этанолом; обращенно-фазовую ВЭЖХ; хроматографию гидрофобного взаимодействия; хроматографию на силикагеле; хроматографию на ионообменной смоле, такой как S-сефароза и ДЭАЭ; хроматофокусирование; осаждение сульфатом аммония и гель-фильтрацию .
Антитела можно соответствующим образом отделять от
культуральной среды и/или цитоплазматического экстракта и/или
периплазматического экстракта общепринятыми методами очистки
антител, такими как, например, хроматография на белок А-
сефарозе, хроматография с белком G, хроматография с белком L,
тиофильная хроматография, хроматография на смешанных смолах,
хроматография с His-маркером, FLAG-маркером, на
гидроксилапатите, электрофорез в геле, диализ, аффинная
хроматография, осаждение сульфатом аммония,
фракционирование/осаждение этанолом или ПЭГ, хроматография на
ионообменных мембранах, адсорбционная хроматография на слое
вспученного адсорбента (ЕВА) или хроматография в
псевдодвижущемся слое.
Способ может также включать дополнительный этап количественного определения экспрессии интересующего белка и отбор клеток, имеющих высокие уровни экспрессии интересующего белка.
Способ может также включать один или более дополнительных последующих этапов обработки, таких как пегилирование интересующего белка, например, антитела или фрагмента антитела.
Один или более этапов способа, описанных в настоящем документе, можно проводить с использованием подходящего контейнера, такого как биореактор.
Антитела и фрагменты по настоящему изобретению можно использовать в лечении или профилактике.
Где это технически возможно, варианты осуществления по изобретению можно комбинировать. Варианты осуществления описаны в настоящем документе как содержащие определенные признаки/элементы. Настоящее изобретение также распространяется на отдельные варианты осуществления, состоящие из, или состоящие практически из указанных признаков/элементов. Технические литературные источники, приведенные в настоящем документе, такие как патенты и патентные заявки, включены в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение далее описано, исключительно в качестве иллюстрации, в следующих примерах, которые относятся к сопроводительным фигурам.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение линий клеток
Получение МХЕ016 и МХЕ017 описано в W0 2011/086136.
Получение плазмид для экспрессии анти-FcRn Fab' и экспрессии анти-FcRn Fab' с FkpA, анти-FcRn Fab' с skp и анти-FcRn Fab как с FkpA, так и с skp
Была сконструирована плазмида, содержащая
последовательности как тяжелой, так и легкой цепи анти-FcRn Fab (SEQ ID N0:63 и 55, соответственно). Плазмида pTTOD 1519.g57 Fab' была сконструирована с использованием общепринятых методик рестрикционного клонирования, которые можно найти в книге
Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y. Плазмида pTTOD 1519.g57 Fab' имела следующие признаки: последовательность сильного tac-промотора и lac-оператора. Плазмида содержала уникальный сайт рестрикции EcoRI после кодирующей области тяжелой цепи Fab', с последующей некодирующей последовательностью, содержащей сильный сайт связывания рибосомы, а затем уникальный сайт рестрикции Ndel.
Гены легкой цепи, тяжелой цепи Fab транскрибировались в виде одной полицистронной смысловой последовательности. ДНК, кодирующая сигнальный пептид из белка OmpA Е. coli, была слита с 5'-концом последовательностей генов как легкой, так и тяжелой цепей, она направляла транслокацию полипептидов в периплазму Е. coli. Терминацию транскрипции осуществляли с помощью двойного терминатора транскрипции rrnB tlt2. Ген laclq кодировал конститутивно экспрессируемый белок-репрессор LacI. Он подавлял транскрипцию с tac-промотора до того, как снятие репрессии было индуцировано присутствием аллолактозы или IPTG. Используемой точкой начала репликации была р15А, которую поддерживали при низком числе копий. Плазмида содержала ген устойчивости к тетрациклину для селекции с помощью антибиотика.
Плазмида pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, экспрессионный вектор
для анти-FcRn Fab и FkpA (периплазматический полипептид), была
сконструирована путем лигирования FkpA с 3'-концом
последовательности Fab' плазмиды pTTOD 1519.g57 Fab' с
использованием сайтов EcoRI и Ndel (смотрите (J)Hr.7d) . FkpA (SEQ
ID N0:30) конструировали синтетическими методами для удаления 2
сайтов PuvII, сайта Sful, сайта BamHI и EcoRI, так, что новый
конструкт кодировал 5' сайт EcoRI с последующим сильным сайтом
связывания рибосомы, за которым следовал природный инициирующий
кодон, сигнальная последовательность и зрелая
последовательность FkpA, заканчивающаяся С-концевым His-маркером и, в конце, сильным сайтом связывания рибосомы с последующим некодирующим сайтом Ndel. Рестрикционный фрагмент EcoRI-Ndel был рестрицирован и лигирован в экспрессионный вектор таким образом, что все три полипептида: легкая цепь Fab' , тяжелая цепь Fab' и FkpA были закодированы в одной
полицистронной мРНК.
Плазмида pTTOD 1519.g57 Fab' Skp, экспрессионный вектор для анти-FcRn Fab и Skp (периплазматический полипептид), была сконструирована путем лигирования skp с 3'-концом последовательности Fab' плазмиды pTTOD 1519.g57 Fab' с использованием сайтов EcoRI и Ndel. skp (SEQ ID N0:34) конструировали синтетическими методами для удаления 4 сайтов PstI и сайта EcoRV так, что новый конструкт кодировал 5' сайт EcoRI с последующим сильным сайтом связывания рибосомы, за которым следовал природный инициирующий кодон, сигнальная последовательность и зрелая последовательность Skp, заканчивающаяся С-концевым His-маркером и, в конце, сильным сайтом связывания рибосомы с последующим некодирующим сайтом Ndel. Рестрикционный фрагмент EcoRI-Ndel был рестрицирован и лигирован в экспрессионный вектор таким образом, что все три полипептида: легкая цепь Fab', тяжелая цепь Fab' и skp были закодированы в одной полицистронной мРНК.
Плазмида pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA Skp, экспрессионный
вектор для анти-FcRn Fab, FkpA и Skp (оба периплазматические
полипептиды), была сконструирована путем лигирования Skp в
плазмиду pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA на 3'-конце
последовательности FkpA с использованием сайта Ndel. Skp (SEQ ID N0:34) конструировали синтетическими методами для удаления 4 сайтов PstI и сайта EcoRV так, что конструкт кодировал 5' сайт Asel, включая природный инициирующий кодон, сигнальную последовательность и зрелую последовательность skp, заканчивающуюся С-концевым His-маркером и, в конце, некодирующим сайтом Ndel. Рестрикционный фрагмент Asel-Ndel был рестрицирован и лигирован в экспрессионный вектор таким образом, что все четыре полипептида: легкая цепь Fab', тяжелая цепь Fab', FkpA и Skp были закодированы в одной полицистронной мРНК.
Ферментация pTTOD 1519.g57 Fab', pTTOD 1519.д57 Fab' FkpA, pTTOD 1519. g57 Fab' Skp и pTTOD 1519. g57 Fab' FkpA skp в E.
coli W3110, MXE012 (E. coli W3110 spr H145A) , MXE016 (E. coli W3110 ATsp, spr C94A) и MXE017 (E. coli W3110 ATsp, spr H145A)
Штаммы E. coli W3110, MXE012, MXE016 и MXE017 были трансформированы плазмидами pTTOD 1519.g57 Fab', pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, pTTOD 1519. g57 Fab' Skp и pTTOD 1519. g57 Fab' FkpA Skp, полученными в примере 1. Трансформацию штаммов проводили методом, описанным в статье Chung СТ. et al. Transformation and storage of bacterial cells in the same solution, PNAS 86: 2172-2175 (1989). Эти трансформированные штаммы тестировали на экспрессию путем ферментации.
Пример 2: Эффект шаперонов на экспрессию Fab' Штаммы, приведенные на фиг.1, тестировали в экспериментах по ферментации в масштабе 1 л и 2,5 л, сравнивая экспрессию Fab' .
Ростовая среда, инокулят и этапы ферментации. Процесс ферментации начинали приготовлением инокулята из флакона клеточного банка и амплификацией на протяжении нескольких этапов предварительного культивирования (колба и реакторы) перед посевом в производственный ферментер. В производственном ферментере клетки выращивали в определенной среде до высокой плотности методом простой периодической культуры и периодической культуры с подпиткой. После достижения желаемой плотности клеток индуцировали экспрессию Fab' добавлением IPTG. Экспрессию Fab' направляли в периплазматическое пространство Е. coli, где происходило накопление Fab' на всем протяжении фазы индукции. Подпитку источником углерода применяли во время фазы индукции для контроля экспрессии и клеточного роста. Температуру, уровень растворенного кислорода (рОг) и рН контролировали для поддержания культуры в оптимальных условиях культивирования.
Измерение концентрации биомассы и скорости роста. Концентрацию биомассы определяли, измеряя оптическую плотность культур при 60 0 нм.
Периплазматическая экстракция. Клетки собирали из культуральных образцов центрифугированием. Фракцию супернатанта
сохраняли (при -20°С) для дальнейшего анализа. Фракцию клеточного осадка ресуспендировали до исходного объема культуры в буфере экстракции (100 мМ трис-НС1, 10 мМ ЭДТА; рН 7,4). После инкубации при 60°С в течение примерно 10-12 часов экстракт осветляли центрифугированием и фракцию супернатанта использовали сразу или сохраняли (при -20°С) для анализа.
Количественное определение Fab' . Концентрации Fab' в периплазматических экстрактах и культуральных супернатантах определяли при помощи ВЭЖХ с белком G. На 1-мл колонку HiTrap Protein-G HP (GE-Healthcare или эквивалентную) нагружали аналит (примерно нейтральное значение рН, 30°С, 0,2-мкм профильтрован) со скоростью 2 мл/мин, колонку промывали 2 0 мМ фосфатом, 50 мМ NaCl, рН 7,4, а затем Fab' элюировали путем инжекции 50 мМ буфера глицин/HCl, рН 2,7. Количество элюированных Fab' измеряли по А280 на системе ВЭЖХ Agilent 1100 или 1200 и рассчитывали, соотнося со стандартной кривой очищенного белка Fab' известной концентрации.
На фиг.1 приведены результаты 4 6 ферментаций в масштабе 5 л, проведенных с различными сочетаниями клеток-хозяев и "шаперона". W3110 представляет собой штамм Е coli дикого типа. Различными сочетаниями были: дикий тип без шаперона, дикий тип с FkpA и Skp, МХЕ016 с мутантным spr и ATsp, опубликованный в WO 2011/086136, МХЕ016 и FkpA, МХЕ016 и Skp, МХЕ016 и FkpA и Skp, МХЕ017, описанный в WO 2011/086136, МХЕ017 и FkpA и Skp.
Результаты показали, что МХЕ016, МХЕ016 и FkpA, МХЕ016 и FkpA и Skp, а также МХЕ017 и FkpA и Skp демонстрируют наилучшие уровни экспрессии.
Пример 3: Эффект послеиндукционной скорости подпитки
Эффект трех различных послеиндукционных скоростей подпитки 5,4, 6,0 и 7,0 г/ч тестировали на МХЕ016 и MXE016+FkpA.
Ростовая среда, инокулят и этапы ферментации. Процесс ферментации начинали приготовлением инокулята из флакона клеточного банка и амплификацией на протяжении нескольких этапов предварительного культивирования (колба и реакторы) перед посевом в производственный ферментер. В производственном
ферментере клетки выращивали в определенной среде до высокой плотности методом простой периодической культуры и периодической культуры с подпиткой. После достижения желаемой плотности клеток индуцировали экспрессию Fab' добавлением IPTG. Экспрессию Fab' направляли в периплазматическое пространство Е. coli, где происходило накопление Fab' на всем протяжении фазы индукции. Подпитку источником углерода применяли во время фазы индукции для контроля экспрессии и клеточного роста, в этом эксперименте скорость роста устанавливали на три отдельные заданные величины (показаны на фигуре). Температуру, уровень растворенного кислорода (рОг) и рН контролировали для поддержания культуры в оптимальных условиях культивирования.
На фиг.2 показан штамм МХЕ016, трансформированный плазмидами, либо не экспрессирующими шаперон, либо экспрессирующими FkpA. На фигуре продемонстрирован эффект возрастания послеиндукционной скорости подпитки на продукцию и удержание Fab' в периплазме в присутствии и в отсутствие FkpA. Данные свидетельствуют, что когда скорость подпитки возрастала без экспрессии FkpA, дополнительные продуцированные Fab' были потеряны в супернатант. Совсем другие результаты были получены при экспрессии FkpA, когда дополнительное количество Fab', продуцируемое при более высоких скоростях подпитки, сохранялось в периплазме, приводя к более высоким титрам.
Пример 4: Анализ выхода и жизнеспособности клеток На фиг.ЗА и В показан эффект на жизнеспособность клеток и титр Fab' в клетках МХЕ016, трансформированных плазмидами, либо не экспрессирующими шаперон, либо экспрессирующими FkpA, в масштабе 20 л. На фиг.ЗА показано, что жизнеспособность клеток ниже в случае, когда FkpA отсутствует. На фиг.ЗВ показано, что титры Fab' были более высокими и менее вариабельными в случае МХЕ016+FkpA.
На фиг.4 показано, что результатом более высоких титров в случае MXE016+FkpA является на 30% больше Fab' после первичного извлечения Fab-продукта.
На фиг.5 и б приведен результат SDS-ПААГ и вестерн-блоттинга с антителами против his-маркера образцов первичного
извлечения в случае МХЕ016 без шаперона и МХЕ016 с экспрессией FkpA.
Образцы нагружали в соответствии с концентрацией Fab' , нанося по 1 мкг Fab' на дорожку. Гели представляли собой 4-20% гели с трис-глицином от компании Novex и электрофорез проводили в невосстанавливающих условиях при 125 В в течение 2 часов. Гели окрашивали красителем Sypro Ruby и получали их изображение. Белки при вестерн-блоттинге переносили на PVDF мембрану с использованием системы Invitrogen iBlot и затем блокировали 1% раствором казеина. Затем мембраны обрабатывали анти-his антителом, конъюгированным с HRP (Novagen). Вслед за этим блоты проявляли с помощью раствора ECL и получали их изображение с использованием Amersham Life Sciences HyperProcesser.
При том, что данное изобретение было конкретно продемонстрировано и описано со ссылкой на предпочтительные варианты осуществления, специалистам в данной области будет понятно, что различные изменения формы и деталей могут быть внесены без отступления от объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантная грамотрицательная бактериальная клетка, содержащая:
a. мутантный ген spr, кодирующий белок spr, имеющий
мутацию одной или более аминокислот, выбранных из D133, Н145,
Н157, N31, R62, 170, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115,
V135, L136, G140, R144 и G147, и
b. ген, способный экспрессировать или избыточно
экспрессировать один или более белков, способных облегчать
сворачивание белков, таких как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD,
при этом клетка имеет пониженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа.
2. Клетка по п.1, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий одну или более мутаций, выбранных из D133A, Н145А, Н157А, N31Y, R62C, I70T, Q73R, С94А, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C и G147C.
3. Клетка по п. 2, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий одну или более мутаций, выбранных из S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D, V135G и G147C.
4. Клетка по п.З, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутации С94 и Н145А, например, С94.
5. Клетка по п. 2, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию, выбранную из D133A, Н145А и Н157А.
6. Клетка по п.1, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий мутацию, выбранную из С94А.
7. Клетка по любому из предшествующих пунктов, в которой мутантный ген spr интегрирован в геном клетки.
8. Клетка по любому из предшествующих пунктов, в которой ген, кодирующий белок, способный облегчать сворачивание белков, временно трансфицирован в клетку, например, на плазмиде.
9. Клетка по любому из пп.1-7, в которой ген, кодирующий белок, способный облегчать сворачивание белков, интегрирован в геном клеток.
10. Клетка по любому из предшествующих пунктов, в которой белок, способный облегчать сворачивание белков, представляет собой FkpA, Skp или сочетание FkpA и Skp, особенно FkpA.
2.
11. Клетка по любому из предшествующих пунктов,
дополнительно содержащая один или более из следующих мутантных
генов:
a. мутантный ген DegP, кодирующий белок DegP с шаперонной активностью и сниженной протеазной активностью;
b. мутантный ген ptr, кодирующий белок протеазу III со сниженной протеазной активностью или являющийся нокаутированным мутантным геном ptr; и
c. мутантный ген OmpT, кодирующий белок OmpT со сниженной протеазной активностью или являющийся нокаутированным мутантным геном OmpT.
12. Клетка по любому из предшествующих пунктов, содержащая мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp со сниженной протеазной активностью или являющийся нокаутированным мутантным геном Tsp.
13. Клетка по п.12, геном которой является изогенным с бактериальной клеткой дикого типа, за исключением мутантного гена spr и мутантного гена Tsp.
14. Клетка по любому из предшествующих пунктов, не содержащая ген, кодирующий DsbC.
15. Рекомбинантная грамотрицательная бактериальная клетка, имеющая сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа и мутантный ген spr, кодирующий белок spr, способный подавлять фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp, а также ген, кодирующий FkpA, Skp или сочетание FkpA и Skp, особенно FkpA, подходящий для экспрессии белка, способного облегчать сворачивание белков, при этом геном клетки является изогенным с бактериальной клеткой дикого типа, за исключением модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа, и мутантного гена spr.
16. Клетка по п.15, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий одну или более мутаций, выбранных из N31Y, R62C, I70T, Q73R, С94А, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, Н145А, G147C, Н157А и W174R.
17. Клетка по п.15, в которой мутантный ген spr кодирует белок spr, имеющий одну или более мутаций по любому из пп.1-6.
12.
18. Клетка по любому из предшествующих пунктов, имеющая нокаутированный мутантный ген Tsp, который содержит мутацию инициирующего кодона и/или одного или более из стоп-кодонов гена, расположенных ниже инициирующего кодона гена и выше стоп-кодона гена.
19. Клетка по п.18, в которой нокаутированный мутантный ген Tsp содержит маркерный сайт рестрикции, созданный путем миссенс-мутации инициирующего кодона гена и, необязательно, одной или более дополнительных точечных мутаций.
20. Клетка по п.19, в которой нокаутированный мутантный ген Tsp содержит SEQ ID N0:3.
21. Клетка по любому из предшествующих пунктов,
представляющая собой Е. coli, например, штамм К12 или W3110 Е.
coli.
22. Клетка по любому из предшествующих пунктов, содержащая
полинуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий
белок.
23. Клетка по п.21, в которой интересующий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
24. Клетка по п.22, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является специфичным для FcRn.
25. Рекомбинантная грамотрицательная бактериальная клетка,
имеющая сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой
дикого типа и содержащая мутантный ген spr, кодирующий
мутантный белок spr, и ген, подходящий для экспрессии белка,
способного облегчать сворачивание белков, а также
полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или
его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный для FcRn.
26. Клетка по п.25, содержащая мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp со сниженной протеазной активностью, или нокаутированный мутантный ген Tsp.
27. Способ получения интересующего белка, включающий культивирование рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки по любому из пп.1-26 в культуральной среде в условиях, эффективных для экспрессии рекомбинантного интересующего белка,
26.
и извлечение рекомбинантного интересующего белка из периплазмы рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки и/или культуральной среды.
28. Способ по п.27, дополнительно включающий извлечение интересующего белка из клетки.
29. Способ по п.28, в котором интересующий белок извлекают из периплазмы и/или супернатанта.
По доверенности
519610
(0Bh/j o'z) Vd> ld
(ОВЬ/J o'9) Vd> ld
I "Н?.'" |~" I
(0Bh/j f g) Vd> ld
(овь/j o'Z) BHodauem еэд
(ОВЬ/J o'9) BHodauBm еэд
CD H I
ra ira
CD С
m Ъ
I ' ¦ (-
(ОВЬ/J f g) BHodauBm еэд
(ufj) .qej d±Mi
(u/j) eqej d±Mi
СО О to
О) О)
i_ о
Q. s
itf 00.
о о
Я о
= "
> s со
0 s
1 g
J] я
о {Н С о
СО О) S х 0) m S X 0)
со со S
X S
(30
со ш
< to
Г*- ю
о см
h-со
со см
ш ш
It;
II I I
111 III
llll
i II"
tBBI
о. х
CD О
о с;
Q. I-
о О I
Гч1
СО СГ X
со I-О л со со
-8-
о с; си
х со I-со
О I
"3-
CD О
> S О
it: с;
н о
ОТ)
СО О. CD
-8-
ю и:
CD С
ш со ю о
с; о о IZ
(X)
со со со
|_ CD
LT)
I-о
со о
-8-
О О
3" со
О. I-
с; о о IZ
Г-.
со о. I-
CD С. О
о IZ
ФИГ.6 Вестерн-блот в невосстанавливающих условиях
для 20 л опытной партии
МХЕ016 FkpA
MW 1 В 2 3 В 4 5 6 7 8 9
1 - Положительный контроль на His-маркер (DsbC)
2 - Экстракт мелкой серии при 30°С
3 - Экстракт мелкой серии при 60°С
4 - Супернатант тяжелой фазы
5 - Легкая фаза
6 - После добавления буфера
7 - После экстракции
8 - После центрифугирования экстракта
9 - После фильтрации
ФИГ.7А Мутация в различных генах
5' ptr (протеаза III) дикого типа (SEQ ID N0:81 и 82)
* М PRS TWFKA LLLLV TGA ATG ССС CGC AGC АСС TGG ТТС AAA GCA ТТА TTG TTG ТТА GTT
A L W А Р L S GCC СТТ TGG GCA ССС ТТА AGT
5' мутантный Aptr (протеаза III) (SEQ ID N0:79 и 80)
EcoRI
I PRSTWFKA LLLLV TGA ATTCCC CGC AGC ACC TGG TTC AAA GCA TTA TTG TTG TTA GTT
Ase I
A L W A H * С GCC CTT TGG GCA CAT TAA TGT
ФИГ.7В
5' Tsp дикого типа (SEQ ID N0:75 и 76)
MNMFFRLT ALA G L LA ATG AAC ATG TTT TTTAGG CTT ACC GCG TTA GCT GGC CTG CTT GCA
I A G Q T F A ATA GCA GGC CAG ACC TTC GCT
5' мутантный ATsp (SEQ ID N0:77 и 78)
EcoRi
MNSFLGLPR * L ACL Q ATG AAT TCG TTT TTA GGC TTA CCG CGT TAG CTG GCC TGC TTG CAA
Ase I
Q A R H * L TAG CAG GCC AG A CAT TAA 7TG
ФИГ.7С
DegP дикого типа
202 D A A I NRG NSGG 949 GAT GCA GCG АТС AAC CGT GGT AAC TCC GGT GGT
Мутантный DegP S210A
Ase I
202 DAAINRGNAGG 949 GAT GCA GCG A 77 AA 7 CGT GGT AAC GCC GGT GGT
ФИГ.70
Вставка гена
EcoRI
EcoRI
Ndel
а--м* ч ttw--±i
Asel AT t AAT(G)
Ndel CA Г ATG
Asel
Ndel
ФИГ.8А SEQ ID N0:1 представляет собой последовательность ДНК гена Tsp дикого типа, включая 6 нуклеотидов ATGAAC выше инициирующего кодона
ATGAACATGTTTTTTAGGCTTACCGCGTTAGCTGGCCTGCTTGCAATAGCAGGCCAGACCTTCGCTGTAGAA GATATCACGCGTGCTGATCAAATTCCGGTATTAAAGGAAGAGACGCAGCATGCGACGGTAAGTGAGCGCGTA ACGTCGCGCTTCACCCGTTCTCATTATCGCCAGTTCGACCTCGATCAGGCATTTTCGGCCAAAATCTTTGAC CGCTACCTGAATCTGCTCGATTACAGCCACAACGTGCTGCTGGCAAGCGATGTTGAACAGTTCGCGAAAAAG AAAACCGAGTTAGGCGATGAACTGCGTTCAGGCAAACTCGACGTTTTCTACGATCTCTACAATCTGGCGCAA AAGCGCCGTTTTGAGCGTTACCAGTACGCTTTGTCGGTACTGGAAAAGCCGATGGATTTCACCGGCAACGAC ACTTATAACCTTGACCGCAGCAAAGCGCCCTGGCCGAAAAACGAGGCTGAGTTGAACGCGCTGTGGGACAGT AAAGTCAAATTCGACGAGTTAAGCCTGAAGCTGACAGGAAAAACGGATAAAGAAATTCGTGAAACCCTGACT CGCCGCTACAAATTTGCCATTCGTCGTCTGGCGCAAACCAACAGCGAAGATGTTTTCTCGCTGGCAATGACG GCGTTTGCGCGTGAAATCGACCCGCATACCAACTATCTTTCCCCGCGTAATACCGAACAGTTCAACACTGAA ATGAGTTTGTCGCTGGAAGGTATTGGCGCAGTGCTGCAAATGGATGATGACTACACCGTTATCAATTCGATG GTGGCAGGTGGTCCGGCAGCGAAGAGTAAAGCTATCAGCGTTGGTGACAAAATTGTCGGTGTTGGTCAAACA GGCAAGCCGATGGTTGACGTGATTGGCTGGCGTCTTGATGATGTGGTTGCCTTAATTAAAGGGCCGAAGGGC AGTAAAGTTCGTCTGGAAATTTTACCTGCTGGTAAAGGGACCAAGACCCGTACTGTAACGTTGACCCGTGAA CGTATTCGTCTCGAAGACCGCGCGGTTAAAATGTCGGTGAAGACCGTCGGTAAAGAGAAAGTCGGCGTGCTG GATATTCCGGGCTTCTATGTGGGTTTGACAGACGATGTCAAAGTGCAACTGCAGAAACTGGAAAAACAGAAT GTCAGCAGCGTCATCATCGACCTGCGTAGCAATGGCGGTGGGGCGTTAACTGAAGCCGTATCGCTCTCCGGT CTGTTTATTCCTGCGGGTCCCATTGTTCAGGTCCGCGATAACAACGGCAAGGTTCGTGAAGATAGCGATACC GACGGACAGGTTTTCTATAAAGGCCCGCTGGTGGTGCTGGTTGACCGCTTCAGTGCTTCGGCTTCAGAAATC TTTGCCGCGGCAATGCAGGATTACGGTCGTGCGCTGGTTGTGGGTGAACCGACGTTTGGTAAAGGCACCGTT CAGCAATACCGTTCATTGAACCGTATTTACGATCAGATGTTACGTCCTGAATGGCCAGCGCTGGGTTCTGTG CAGTACACGATCCAGAAATTCTATCGCGTTAACGGCGGCAGTACGCAACGTAAAGGCGTAACGCCAGACATC ATCATGCCGACGGGTAATGAAGAAACGGAAACGGGTGAGAAATTCGAAGATAACGCGCTGCCGTGGGATAGC ATTGATGCCGCGACTTATGTGAAATCAGGAGATTTAACGGCCTTTGAACCGGAGCTGCTGAAGGAACATAAT GCGCGTATCGCGAAAGATCCTGAGTTCCAGAACATCATGAAGGATATCGCGCGCTTCAACGCTATGAAGGAC AAGCGCAATATCGTTTCTCTGAATTACGCTGTGCGTGAGAAAGAGAATAATGAAGATGATGCGACGCGTCTG GCGCGTTTGAACGAACGCTTTAAACGCGAAGGTAAACCGGAGTTGAAGAAACTGGATGATCTACCGAAAGAT TACCAGGAGCCGGATCCTTATCTGGATGAGACGGTGAATATCGCACTCGATCTGGCGAAGCTTGAAAAAGCC AGACCCGCGGAACAACCCGCTCCCGTCAAGTAA
ФИГ.8В SEQ ID N0:2 представляет собой аминокислотную последовательность белка Tsp дикого типа
MFFRLTALAGLLAIAGQTFAVEDITRADQIPVLKEETQHATVSERVTSRFTRSHYRQFDLDQAFSAKIFDRY LNLLDYSHNVLLASDVEQFAKKKTELGDELRSGKLDVFYDLYNLAQKRRFERYQYALSVLEKPMDFTGNDTY NLDRSKAPWPKNEAELNALWDSKVKFDELSLKLTGKTDKEIRETLTRRYKFAIRRLAQTNSEDVFSLAMTAF AREIDPHTNYLSPRNTEQFNTEMSLSLEGIGAVLQMDDDYTVINSMVAGGPAAKSKAISVGDKIVGVGQTGK PMVDVIGWRLDDWALIKGPKGSKVRLEILPAGKGTKTRTVTLTRERIRLEDRAVKMSVKTVGKEKVGVLDI PGFYVGLTDDVKVQLQKLEKQNVSSVIIDLRSNGGGALTEAVSLSGLFIPAGPIVQVRDNNGKVREDSDTDG QVFYKGPLWLVDRFSASASEIFAAAMQDYGRALWGEPTFGKGTVQQYRSLNRIYDQMLRPEWPALGSVQY TIQKFYRVNGGSTQRKGVTPDIIMPTGNEETETGEKFEDNALPWDSIDAATYVKSGDLTAFEPELLKEHNAR IAKDPEFQNIMKDIARFNAMKDKRNIVSLNYAVREKENNEDDATRLARLNERFKREGKPELKKLDDLPKDYQ EPDPYLDETVNIALDLAKLEKARPAEQPAPVK*
SEQ ID N0:3 представляет собой последовательность ДНК мутантного нокаутированного гена Tsp, включая 6 нуклеотидов ATGAAT выше инициирующего кодона
ATGAATTCGTTTTTAGGCTTACCGCGTTAGCTGGCCTGCTTGCAATAGCAGGCCAGACATTAATTGTAGAAG ATATCACGCGTGCTGATCAAATTCCGGTATTAAAGGAAGAGACGCAGCATGCGACGGTAAGTGAGCGCGTAA CGTCGCGCTTCACCCGTTCTCATTATCGCCAGTTCGACCTCGATCAGGCATTTTCGGCCAAAATCTTTGACC GCTACCTGAATCTGCTCGATTACAGCCACAACGTGCTGCTGGCAAGCGATGTTGAACAGTTCGCGAAAAAGA AAACCGAGTTAGGCGATGAACTGCGTTCAGGCAAACTCGACGTTTTCTACGATCTCTACAATCTGGCGCAAA AGCGCCGTTTTGAGCGTTACCAGTACGCTTTGTCGGTACTGGAAAAGCCGATGGATTTCACCGGCAACGACA CTTATAACCTTGACCGCAGCAAAGCGCCCTGGCCGAAAAACGAGGCTGAGTTGAACGCGCTGTGGGACAGTA AAGTCAAATTCGACGAGTTAAGCCTGAAGCTGACAGGAAAAACGGATAAAGAAATTCGTGAAACCCTGACTC GCCGCTACAAATTTGCCATTCGTCGTCTGGCGCAAACCAACAGCGAAGATGTTTTCTCGCTGGCAATGACGG CGTTTGCGCGTGAAATCGACCCGCATACCAACTATCTTTCCCCGCGTAATACCGAACAGTTCAACACTGAAA TGAGTTTGTCGCTGGAAGGTATTGGCGCAGTGCTGCAAATGGATGATGACTACACCGTTATCAATTCGATGG TGGCAGGTGGTCCGGCAGCGAAGAGTAAAGCTATCAGCGTTGGTGACAAAATTGTCGGTGTTGGTCAAACAG GCAAGCCGATGGTTGACGTGATTGGCTGGCGTCTTGATGATGTGGTTGCCTTAATTAAAGGGCCGAAGGGCA GTAAAGTTCGTCTGGAAATTTTACCTGCTGGTAAAGGGACCAAGACCCGTACTGTAACGTTGACCCGTGAAC GTATTCGTCTCGAAGACCGCGCGGTTAAAATGTCGGTGAAGACCGTCGGTAAAGAGAAAGTCGGCGTGCTGG ATATTCCGGGCTTCTATGTGGGTTTGACAGACGATGTCAAAGTGCAACTGCAGAAACTGGAAAAACAGAATG TCAGCAGCGTCATCATCGACCTGCGTAGCAATGGCGGTGGGGCGTTAACTGAAGCCGTATCGCTCTCCGGTC TGTTTATTCCTGCGGGTCCCATTGTTCAGGTCCGCGATAACAACGGCAAGGTTCGTGAAGATAGCGATACCG ACGGACAGGTTTTCTATAAAGGCCCGCTGGTGGTGCTGGTTGACCGCTTCAGTGCTTCGGCTTCAGAAATCT TTGCCGCGGCAATGCAGGATTACGGTCGTGCGCTGGTTGTGGGTGAACCGACGTTTGGTAAAGGCACCGTTC AGCAATACCGTTCATTGAACCGTATTTACGATCAGATGTTACGTCCTGAATGGCCAGCGCTGGGTTCTGTGC AGTACACGATCCAGAAATTCTATCGCGTTAACGGCGGCAGTACGCAACGTAAAGGCGTAACGCCAGACATCA TCATGCCGACGGGTAATGAAGAAACGGAAACGGGTGAGAAATTCGAAGATAACGCGCTGCCGTGGGATAGCA TTGATGCCGCGACTTATGTGAAATCAGGAGATTTAACGGCCTTTGAACCGGAGCTGCTGAAGGAACATAATG CGCGTATCGCGAAAGATCCTGAGTTCCAGAACATCATGAAGGATATCGCGCGCTTCAACGCTATGAAGGACA AGCGCAATATCGTTTCTCTGAATTACGCTGTGCGTGAGAAAGAGAATAATGAAGATGATGCGACGCGTCTGG CGCGTTTGAACGAACGCTTTAAACGCGAAGGTAAACCGGAGTTGAAGAAACTGGATGATCTACCGAAAGATT ACCAGGAGCCGGATCCTTATCTGGATGAGACGGTGAATATCGCACTCGATCTGGCGAAGCTTGAAAAAGCCA GACCCGCGGAACAACCCGCTCCCGTCAAGTAA
SEQ ID N0:4 представляет собой последовательность ДНК гена протеазы III дикого типа
ATGCCCCGCAGCACCTGGTTCAAAGCATTATTGTTGTTAGTTGCCCTTTGGGCACCCTTAAGTCAGGCAGAA ACGGGATGGCAGCCGATTCAGGAAACCATCCGTAAAAGTGATAAAGATAACCGCCAGTATCAGGCTATACGT CTGGATAACGGTATGGTGGTCTTGCTGGTTTCTGATCCGCAGGCAGTTAAATCGCTCTCGGCGCTGGTGGTG CCCGTTGGGTCGCTGGAAGATCCCGAGGCGTACCAGGGGCTGGCACATTACCTTGAACATATGAGTCTGATG GGGTCGAAAAAGTACCCGCAGGCTGACAGTCTGGCCGAATATCTCAAAATGCACGGCGGTAGTCACAATGCC AGCACTGCGCCGTATCGCACGGCTTTCTATCTGGAAGTTGAGAACGACGCCTTGCCTGGTGCGGTAGACCGC CTGGCCGATGCTATTGCTGAACCTTTGCTCGACAAGAAATATGCCGAACGTGAGCGTAATGCGGTGAACGCT GAATTAACCATGGCGCGTACGCGTGACGGGATGCGCATGGCACAGGTCAGCGCAGAAACCATTAACCCGGCA CACCCCGGTTCAAAGTTTTCTGGTGGTAACCTCGAAACTTTAAGCGACAAACCTGGTAATCCGGTGCAGCAG GCGCTGAAAGATTTCCACGAGAAGTACTATTCCGCCAATTTGATGAAGGCGGTTATTTACAGTAATAAACCG CTGCCGGAGTTGGCAAAAATGGCGGCGGACACCTTTGGTCGCGTGCCGAACAAAGAGAGCAAAAAACCGGAA ATCACCGTGCCGGTAGTCACCGACGCGCAAAAGGGCATTATCATTCATTACGTCCCTGCGCTGCCGCGTAAA GTGTTGCGCGTTGAGTTTCGCATCGATAACAACTCAGCGAAGTTCCGTAGTAAAACCGATGAATTGATTACC TATCTGATTGGCAATCGCAGCCCAGGTACACTTTCTGACTGGCTGCAAAAGCAGGGATTAGTTGAGGGCATT AGCGCCAACTCCGATCCTATCGTCAACGGCAACAGCGGCGTATTAGCGATCTCTGCGTCTTTAACCGATAAA GGCCTGGCTAATCGCGATCAGGTTGTGGCGGCAATTTTTAGCTATCTCAATCTGTTACGTGAAAAAGGCATT
ФИГ.8С продолжение
GATAAACAATACTTCGATGAACTGGCGAATGTGCTGGATATCGACTTCCGTTATCCGTCGATCACCCGTGAT ATGGATTACGTCGAATGGCTGGCAGATACCATGATTCGCGTTCCTGTTGAGCATACGCTGGATGCAGTCAAT ATTGCCGATCGGTACGATGCTAAAGCAGTAAAGGAACGTCTGGCGATGATGACGCCGCAGAATGCGCGTATC TGGTATATCAGCCCGAAAGAGCCGCACAACAAAACGGCTTACTTTGTCGATGCGCCGTATCAGGTCGATAAA ATCAGCGCACAAACTTTCGCCGACTGGCAGAAAAAAGCCGCCGACATTGCGCTCTCTTTGCCAGAGCTTAAC CCTTATATTCCTGATGATTTCTCGCTGATTAAGTCAGAGAAGAAATACGACCATCCAGAGCTGATTGTTGAT GAGTCGAATCTGCGCGTGGTGTATGCGCCAAGCCGTTATTTTGCCAGCGAGCCCAAAGCTGATGTCAGCCTG ATTTTGCGTAATCCGAAAGCCATGGACAGCGCCCGCAATCAGGTGATGTTTGCGCTCAATGATTATCTCGCA GGGCTGGCGCTTGATCAGTTAAGCAACCAGGCGTCGGTTGGTGGCATAAGTTTTTCCACCAACGCTAACAAC GGCCTTATGGTTAATGCTAATGGTTACACCCAGCGTCTGCCGCAGCTGTTCCAGGCATTGCTCGAGGGGTAC TTTAGCTATACCGCTACGGAAGATCAGCTTGAGCAGGCGAAGTCCTGGTATAACCAGATGATGGATTCCGCA GAAAAGGGTAAAGCGTTTGAGCAGGCGATTATGCCCGCGCAGATGCTCTCGCAAGTGCCGTACTTCTCGCGA GATGAACGGCGTAAAATTTTGCCCTCCATTACGTTGAAAGAGGTGCTGGCCTATCGCGACGCCTTAAAATCA GGGGCTCGACCAGAGTTTATGGTTATCGGCAACATGACCGAGGCCCAGGCAACAACGCTGGCACGCGATGTG CAAAAACAGTTGGGCGCTGATGGTTCAGAGTGGTGTCGAAACAAAGATGTAGTGGTCGATAAAAAACAATCC GTCATCTTTGAAAAAGCCGGTAACAGCACCGACTCCGCACTGGCAGCGGTATTTGTACCGACTGGCTACGAT GAATACACCAGCTCAGCCTATAGCTCTCTGTTGGGGCAGATCGTACAGCCGTGGTTCTACAATCAGTTGCGT ACCGAAGAACAATTGGGCTATGCCGTGTTTGCGTTTCCAATGAGCGTGGGGCGTCAGTGGGGCATGGGCTTC CTTTTGCAAAGCAATGATAAACAGCCTTCATTCTTGTGGGAGCGTTACAAGGCGTTTTTCCCAACCGCAGAG GCAAAATTGCGAGCGATGAAGCCAGATGAGTTTGCGCAAATCCAGCAGGCGGTAATTACCCAGATGCTGCAG GCACCGCAAACGCTCGGCGAAGAAGCATCGAAGTTAAGTAAAGATTTCGATCGCGGCAATATGCGCTTCGAT TCGCGTGATAAAATCGTGGCCCAGATAAAACTGCTGACGCCGCAAAAACTTGCTGATTTCTTCCATCAGGCG GTGGTCGAGCCGCAAGGCATGGCTATTCTGTCGCAGATTTCCGGCAGCCAGAACGGGAAAGCCGAATATGTA CACCCTGAAGGCTGGAAAGTGTGGGAGAACGTCAGCGCGTTGCAGCAAACAATGCCCCTGATGAGTGAAAAG AATGAGTGA
SEQ ID N0:5 представляет собой аминокислотную последовательность белка протеазы III дикого типа
MPRSTWFKALLLLVALWAPLSQAETGWQPIQETIRKSDKDNRQYQAIRLDNGMVVLLVSDPQAVKSLSALW PVGSLEDPEAYQGLAHYLEHMSLMGSKKYPQADSLAEYLKMHGGSHNASTAPYRTAFYLEVENDALPGAVDR LADAIAEPLLDKKYAERERNAVNAELTMARTRDGMRMAQVSAETINPAHPGSKFSGGNLETLSDKPGNPVQQ ALKDFHEKYYSANLMKAVIYSNKPLPELAKMAADTFGRVPNKESKKPEITVPWTDAQKGIIIHYVPALPRK VLRVEFRIDNNSAKFRSKTDELITYLIGNRSPGTLSDWLQKQGLVEGISANSDPIVNGNSGVLAISASLTDK GLANRDQVVAAIFSYLNLLREKGIDKQYFDELANVLDIDFRYPSITRDMDYVEWLADTMIRVPVEHTLDAVN IADRYDAKAVKERLAMMTPQNARIWYISPKEPHNKTAYFVDAPYQVDKISAQTFADWQKKAADIALSLPELN PYIPDDFSLIKSEKKYDHPELIVDESNLRVVYAPSRYFASEPKADVSLILRNPKAMDSARNQVMFALNDYLA GLALDQLSNQASVGGISFSTNANNGLMVNANGYTQRLPQLFQALLEGYFSYTATEDQLEQAKSWYNQMMDSA EKGKAFEQAIMPAQMLSQVPYFSRDERRKILPSITLKEVLAYRDALKSGARPEFMVIGNMTEAQATTLARDV QKQLGADGSEWCRNKDWVDKKQSVIFEKAGNSTDSALAAVFVPTGYDEYTSSAYSSLLGQIVQPWFYNQLR TEEQLGYAVFAFPMSVGRQWGMGFLLQSNDKQPSFLWERYKAFFPTAEAKLRAMKPDEFAQIQQAVITQMLQ APQTLGEEASKLSKDFDRGNMRFDSRDKIVAQIKLLTPQKLADFFHQAWEPQGMAILSQISGSQNGKAEYV HPEGWKVWENVSALQQTMPLMSEKNE *
SEQ ID N0:6 представляет собой последовательность ДНК мутантного нокаутированного гена протеазы III
ATTCCCCGCAGCACCTGGTTCAAAGCATTATTGTTGTTAGTTGCCCTTTGGGCACATTAATGTCAGGCAGAA ACGGGATGGCAGCCGATTCAGGAAACCATCCGTAAAAGTGATAAAGATAACCGCCAGTATCAGGCTATACGT CTGGATAACGGTATGGTGGTCTTGCTGGTTTCTGATCCGCAGGCAGTTAAATCGCTCTCGGCGCTGGTGGTG CCCGTTGGGTCGCTGGAAGATCCCGAGGCGTACCAGGGGCTGGCACATTACCTTGAACATATGAGTCTGATG GGGTCGAAAAAGTACCCGCAGGCTGACAGTCTGGCCGAATATCTCAAAATGCACGGCGGTAGTCACAATGCC AGCACTGCGCCGTATCGCACGGCTTTCTATCTGGAAGTTGAGAACGACGCCTTGCCTGGTGCGGTAGACCGC CTGGCCGATGCTATTGCTGAACCTTTGCTCGACAAGAAATATGCCGAACGTGAGCGTAATGCGGTGAACGCT GAATTAACCATGGCGCGTACGCGTGACGGGATGCGCATGGCACAGGTCAGCGCAGAAACCATTAACCCGGCA CACCCCGGTTCAAAGTTTTCTGGTGGTAACCTCGAAACTTTAAGCGACAAACCTGGTAATCCGGTGCAGCAG GCGCTGAAAGATTTCCACGAGAAGTACTATTCCGCCAATTTGATGAAGGCGGTTATTTACAGTAATAAACCG CTGCCGGAGTTGGCAAAAATGGCGGCGGACACCTTTGGTCGCGTGCCGAACAAAGAGAGCAAAAAACCGGAA ATCACCGTGCCGGTAGTCACCGACGCGCAAAAGGGCATTATCATTCATTACGTCCCTGCGCTGCCGCGTAAA GTGTTGCGCGTTGAGTTTCGCATCGATAACAACTCAGCGAAGTTCCGTAGTAAAACCGATGAATTGATТАСС TATCTGATTGGCAATCGCAGCCCAGGTACACTTTCTGACTGGCTGCAAAAGCAGGGATTAGTTGAGGGCATT AGCGCCAACTCCGATCCTATCGTCAACGGCAACAGCGGCGTATTAGCGATCTCTGCGTCTTTAACCGATAAA GGCCTGGCTAATCGCGATCAGGTTGTGGCGGCAATTTTTAGCTATCTCAATCTGTTACGTGAAAAAGGCATT GATAAACAATACTTCGATGAACTGGCGAATGTGCTGGATATCGACTTCCGTTATCCGTCGATCACCCGTGAT ATGGATTACGTCGAATGGCTGGCAGATACCATGATTCGCGTTCCTGTTGAGCATACGCTGGATGCAGTCAAT ATTGCCGATCGGTACGATGCTAAAGCAGTAAAGGAACGTCTGGCGATGATGACGCCGCAGAATGCGCGTATC TGGTATATCAGCCCGAAAGAGCCGCACAACAAAACGGCTTACTTTGTCGATGCGCCGTATCAGGTCGATAAA ATCAGCGCACAAACTTTCGCCGACTGGCAGAAAAAAGCCGCCGACATTGCGCTCTCTTTGCCAGAGCTTAAC CCTTATATTCCTGATGATTTCTCGCTGATTAAGTCAGAGAAGAAATACGACCATCCAGAGCTGATTGTTGAT GAGTCGAATCTGCGCGTGGTGTATGCGCCAAGCCGTTATTTTGCCAGCGAGCCCAAAGCTGATGTCAGCCTG ATTTTGCGTAATCCGAAAGCCATGGACAGCGCCCGCAATCAGGTGATGTTTGCGCTCAATGATTATCTCGCA GGGCTGGCGCTTGATCAGTTAAGCAACCAGGCGTCGGTTGGTGGCATAAGTTTTTCCACCAACGCTAACAAC GGCCTTATGGTTAATGCTAATGGTTACACCCAGCGTCTGCCGCAGCTGTTCCAGGCATTGCTCGAGGGGTAC TTTAGCTATACCGCTACGGAAGATCAGCTTGAGCAGGCGAAGTCCTGGTATAACCAGATGATGGATTCCGCA GAAAAGGGTAAAGCGTTTGAGCAGGCGATTATGCCCGCGCAGATGCTCTCGCAAGTGCCGTACTTCTCGCGA GATGAACGGCGTAAAATTTTGCCCTCCATTACGTTGAAAGAGGTGCTGGCCTATCGCGACGCCTTAAAATCA GGGGCTCGACCAGAGTTTATGGTTATCGGCAACATGACCGAGGCCCAGGCAACAACGCTGGCACGCGATGTG CAAAAACAGTTGGGCGCTGATGGTTCAGAGTGGTGTCGAAACAAAGATGTAGTGGTCGATAAAAAACAATCC GTCATCTTTGAAAAAGCCGGTAACAGCACCGACTCCGCACTGGCAGCGGTATTTGTACCGACTGGCTACGAT GAATACACCAGCTCAGCCTATAGCTCTCTGTTGGGGCAGATCGTACAGCCGTGGTTCTACAATCAGTTGCGT ACCGAAGAACAATTGGGCTATGCCGTGTTTGCGTTTCCAATGAGCGTGGGGCGTCAGTGGGGCATGGGCTTC CTTTTGCAAAGCAATGATAAACAGCCTTCATTCTTGTGGGAGCGTTACAAGGCGTTTTTCCCAACCGCAGAG GCAAAATTGCGAGCGATGAAGCCAGATGAGTTTGCGCAAATCCAGCAGGCGGTAATTACCCAGATGCTGCAG GCACCGCAAACGCTCGGCGAAGAAGCATCGAAGTTAAGTAAAGATTTCGATCGCGGCAATATGCGCTTCGAT TCGCGTGATAAAATCGTGGCCCAGATAAAACTGCTGACGCCGCAAAAACTTGCTGATTTCTTCCATCAGGCG GTGGTCGAGCCGCAAGGCATGGCTATTCTGTCGCAGATTTCCGGCAGCCAGAACGGGAAAGCCGAATATGTA CACCCTGAAGGCTGGAAAGTGTGGGAGAACGTCAGCGCGTTGCAGCAAACAATGCCCCTGATGAGTGAAAAG AATGAGTGA
SEQ ID N0:7 представляет собой последовательность ДНК гена DegP дикого типа
ATGAAAAAAACCACATTAGCACTGAGTGCACTGGCTCTGAGTTTAGGTTTGGCGTTATCTCCGCTCTCTGCA ACGGCGGCTGAGACTTCTTCAGCAACGACAGCCCAGCAGATGCCAAGCCTTGCACCGATGCTCGAAAAGGTG ATGCCTTCAGTGGTCAGCATTAACGTAGAAGGTAGCACAACCGTTAATACGCCGCGTATGCCGCGTAATTTC CAGCAGTTCTTCGGTGATGATTCTCCGTTCTGCCAGGAAGGTTCTCCGTTCCAGAGCTCTCCGTTCTGCCAG GGTGGCCAGGGCGGTAATGGTGGCGGCCAGCAACAGAAATTCATGGCGCTGGGTTCCGGCGTCATCATTGAT GCCGATAAAGGCTATGTCGTCACCAACAACCACGTTGTTGATAACGCGACGGTCATTAAAGTTCAACTGAGC GATGGCCGTAAGTTCGACGCGAAGATGGTTGGCAAAGATCCGCGCTCTGATATCGCGCTGATCCAAATCCAG AACCCGAAAAACCTGACCGCAATTAAGATGGCGGATTCTGATGCACTGCGCGTGGGTGATTACACCGTAGCG ATTGGTAACCCGTTTGGTCTGGGCGAGACGGTAACTTCCGGGATTGTCTCTGCGCTGGGGCGTAGCGGCCTG AATGCCGAAAACTACGAAAACTTCATCCAGACCGATGCAGCGATCAACCGTGGTAACTCCGGTGGTGCGCTG GTTAACCTGAACGGCGAACTGATCGGTATCAACACCGCGATCCTCGCACCGGACGGCGGCAACATCGGTATC GGTTTTGCTATCCCGAGTAACATGGTGAAAAACCTGACCTCGCAGATGGTGGAATACGGCCAGGTGAAACGC GGTGAGCTGGGTATTATGGGGACTGAGCTGAACTCCGAACTGGCGAAAGCGATGAAAGTTGACGCCCAGCGC GGTGCTTTCGTAAGCCAGGTTCTGCCTAATTCCTCCGCTGCAAAAGCGGGCATTAAAGCGGGTGATGTGATC ACCTCACTGAACGGTAAGCCGATCAGCAGCTTTGCCGCACTGCGTGCTCAGGTGGGTACTATGCCGGTAGGC AGCAAACTGACCCTGGGCTTACTGCGCGACGGTAAGCAGGTTAACGTGAACCTGGAACTGCAGCAGAGCAGC CAGAATCAGGTTGATTCCAGCTCCATCTTCAACGGCATTGAAGGCGCTGAGATGAGCAACAAAGGCAAAGAT CAGGGCGTGGTAGTGAACAACGTGAAAACGGGCACTCCGGCTGCGCAGATCGGCCTGAAGAAAGGTGATGTG ATTATTGGCGCGAACCAGCAGGCAGTGAAAAACATCGCTGAACTGCGTAAAGTTCTCGACAGCAAACCGTCT GTGCTGGCACTCAACATTCAGCGCGGCGACAGCACCATCTACCTGTTAATGCAGTAA
SEQ ID N0:8 представляет собой аминокислотную последовательность белка DegP дикого типа
MKKTTLALSALALSLGLALSPLSATAAETSSATTAQQMPSLAPMLEKVMPSVVSINVEGSTTVNTPRMPRNF QQFFGDDSPFCQEGSPFQSSPFCQGGQGGNGGGQQQKFMALGSGVIIDADKGYVVTNNHVVDNATVIKVQLS DGRKFDAKMVGKDPRSDIALIQIQNPKNLTAIKMADSDALRVGDYTVAIGNPFGLGETVTSGIVSALGRSGL NAENYENFIQTDAAINRGNSGGALVNLNGELIGINTAILAPDGGNIGIGFAIPSNMVKNLTSQMVEYGQVKR GELGIMGTELNSELAKAMKVDAQRGAFVSQVLPNSSAAKAGIKAGDVITSLNGKPISSFAALRAQVGTMPVG SKLTLGLLRDGKQVNVNLELQQSSQNQVDSSSIFNGIEGAEMSNKGKDQGWVNNVKTGTPAAQIGLKKGDV IIGANQQAVKNIAELRKVLDSKPSVLALNIQRGDSTIYLLMQ
SEQ ID N0:9 представляет собой последовательность ДНК мутантного гена DegP
ATGAAAAAAACCACATTAGCACTGAGTGCACTGGCTCTGAGTTTAGGTTTGGCGTTATCTCCGCTCTCTGCA ACGGCGGCTGAGACTTCTTCAGCAACGACAGCCCAGCAGATGCCAAGCCTTGCACCGATGCTCGAAAAGGTG ATGCCTTCAGTGGTCAGCATTAACGTAGAAGGTAGCACAACCGTTAATACGCCGCGTATGCCGCGTAATTTC CAGCAGTTCTTCGGTGATGATTCTCCGTTCTGCCAGGAAGGTTCTCCGTTCCAGAGCTCTCCGTTCTGCCAG GGTGGCCAGGGCGGTAATGGTGGCGGCCAGCAACAGAAATTCATGGCGCTGGGTTCCGGCGTCATCATTGAT GCCGATAAAGGCTATGTCGTCACCAACAACCACGTTGTTGATAACGCGACGGTCATTAAAGTTCAACTGAGC GATGGCCGTAAGTTCGACGCGAAGATGGTTGGCAAAGATCCGCGCTCTGATATCGCGCTGATCCAAATCCAG AACCCGAAAAACCTGACCGCAATTAAGATGGCGGATTCTGATGCACTGCGCGTGGGTGATTACACCGTAGCG ATTGGTAACCCGTTTGGTCTGGGCGAGACGGTAACTTCCGGGATTGTCTCTGCGCTGGGGCGTAGCGGCCTG AATGCCGAAAACTACGAAAACTTCATCCAGACCGATGCAGCGATTAATCGTGGTAACGCCGGTGGTGCGCTG GTTAACCTGAACGGCGAACTGATCGGTATCAACACCGCGATCCTCGCACCGGACGGCGGCAACATCGGTATC GGTTTTGCTATCCCGAGTAACATGGTGAAAAACCTGACCTCGCAGATGGTGGAATACGGCCAGGTGAAACGC GGTGAGCTGGGTATTATGGGGACTGAGCTGAACTCCGAACTGGCGAAAGCGATGAAAGTTGACGCCCAGCGC GGTGCTTTCGTAAGCCAGGTTCTGCCTAATTCCTCCGCTGCAAAAGCGGGCATTAAAGCGGGTGATGTGATC ACCTCACTGAACGGTAAGCCGATCAGCAGCTTTGCCGCACTGCGTGCTCAGGTGGGTACTATGCCGGTAGGC AGCAAACTGACCCTGGGCTTACTGCGCGACGGTAAGCAGGTTAACGTGAACCTGGAACTGCAGCAGAGCAGC CAGAATCAGGTTGATTCCAGCTCCATCTTCAACGGCATTGAAGGCGCTGAGATGAGCAACAAAGGCAAAGAT CAGGGCGTGGTAGTGAACAACGTGAAAACGGGCACTCCGGCTGCGCAGATCGGCCTGAAGAAAGGTGATGTG ATTATTGGCGCGAACCAGCAGGCAGTGAAAAACATCGCTGAACTGCGTAAAGTTCTCGACAGCAAACCGTCT GTGCTGGCACTCAACATTCAGCGCGGCGACAGCACCATCTACCTGTTAATGCAGTAA
ФИГ.8Р
SEQ ID N0:10 представляет собой аминокислотную последовательность мутантного белка DegP.
MKKTTLALSALALSLGLALSPLSATAAETSSATTAQQMPSLAPMLEKVMPSVVSINVEGSTTVNTPRMPRNF QQFFGDDSPFCQEGSPFQSSPFCQGGQGGNGGGQQQKFMALGSGVIIDADKGYVVTNNHVVDNATVIKVQLS DGRKFDAKMVGKDPRSDIALIQIQNPKNLTAIKMADSDALRVGDYTVAIGNPFGLGETVTSGIVSALGRSGL NAENYENFIQTDAAINRGNAGGALVNLNGELIGINTAILAPDGGNIGIGFAIPSNMVKNLTSQMVEYGQVKR GELGIMGTELNSELAKAMKVDAQRGAFVSQVLPNSSAAKAGIKAGDVITSLNGKPISSFAALRAQVGTMPVG SKLTLGLLRDGKQVNVNLELQQSSQNQVDSSSIFNGIEGAEMSNKGKDQGWVNNVKTGTPAAQIGLKKGDV IIGANQQAVKNIAELRKVLDSKPSVLALNIQRGDSTIYLLMQ
SEQ ID N0:11 представляет собой последовательность 5' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена DegP, содержащего сайт рестрикции Asel.
CTGCCTGCGATTTTCGCCGGAACG
SEQ ID N0:12 представляет собой последовательность 3' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена DegP.
CGCATGGTACGTGCCACGATATCC
SEQ ID N0:13 представляет собой последовательность 5' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена Tsp, содержащего сайт рестрикции Asel.
GGGAAATGAACС ТGAGCAAAACGC
SEQ ID N0:14 представляет собой последовательность 3' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена протеазы III, содержащего сайт рестрикции Asel.
GGGAAAGGCGGCGGAACCGCCTAG
SEQ ID N0:15 представляет собой последовательность 5' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена протеазы III, содержащего сайт рестрикции Asel.
CTACTGTGCCAGCGGTGGTAATGG
SEQ ID N0:16 представляет собой последовательность 3' олигонуклеотидного праймера для области мутантного гена Tsp, содержащего сайт рестрикции Asel.
GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC
SEQ ID N0:17 представляет собой последовательность ДНК гена spr дикого типа.
ATGGTCAAATCTCAACCGATTTTGAGATATATCTTGCGCGGGATTCCCGCGATTGCAGTAGCGGTTCTGCTT TCTGCATGTAGTGCAAATAACACCGCAAAGAATATGCATCCTGAGACACGTGCAGTGGGTAGTGAAACATCA TCACTGCAAGCTTCTCAGGATGAATTTGAAAACCTGGTTCGTAATGTCGACGTAAAATCGCGAATTATGGAT CAGTATGCTGACTGGAAAGGCGTACGTTATCGTCTGGGCGGCAGCACTAAAAAAGGTATCGATTGTTCTGGT TTCGTACAGCGTACATTCCGTGAGCAATTTGGCTTAGAACTTCCGCGTTCGACTTACGAACAGCAGGAAATG GGTAAATCTGTTTCCCGCAGTAATTTGCGTACGGGTGATTTAGTTCTGTTCCGTGCCGGTTCAACGGGACGC CATGTCGGTATTTATATCGGCAACAATCAGTTTGTCCATGCTTCCACCAGCAGTGGTGTTATTATTTCCAGC ATGAATGAACCGTACTGGAAGAAGCGTTACAACGAAGCACGCCGGGTTCTCAGCCGCAGC
SEQ ID N0:18 представляет собой аминокислотную последовательность для гена spr дикого типа, включая сигнальную последовательность, которая представляет собой первые 26 аминокислотных остатков.
MVKSQPILRYILRGIPAIAVAVLLSACSANNTAKNMHPETRAVGSETSSLQASQDEFENLVRNVDVKSRIMD QYADWKGVRYRLGGSTKKGIDCSGFVQRTFREQFGLELPRSTYEQQEMGKSVSRSNLRTGDLVLFRAGSTGR HVGIYIGNNQFVHASTSSGVIISSMNEPYWKKRYNEARRVLSRS
SEQ ID N0:19 соответствует не мутантному гену spr без сигнальной последовательности.
CSANNTAKNMHPETRAVGSETSSLQASQDEFENLVRNVDVKSRIMDQYADWKGVRYRLGGSTKKGIDCSGFV QRTFREQFGLELPRSTYEQQEMGKSVSRSNLRTGDLVLFRAGSTGRHVGIYIGNNQFVHASTSSGVIISSMN EPYWKKRYNEARRVLSRS
SEQ ID N0:20 представляет собой мутантную последовательность OmpT, содержащую мутации D210A и Н212А.
ATGCGGGCGAAACTTCTGGGAATAGTCCTGACAACCCCTATTGCGATCAGCTCTTTTGCTTCTACCGAGACT TTATCGTTTACTCCTGACAACATAAATGCGGACATTAGTCTTGGAACTCTGAGCGGAAAAACAAAAGAGCGT GTTTATCTAGCCGAAGAAGGAGGCCGAAAAGTCAGTCAACTCGACTGGAAATTCAATAACGCTGCAATTATT AAAGGTGCAATTAATTGGGATTTGATGCCCCAGATATCTATCGGGGCTGCTGGCTGGACAACTCTCGGCAGC CGAGGTGGCAATATGGTCGATCAGGACTGGATGGATTCCAGTAACCCCGGAACCTGGACGGATGAAAGTAGA CACCCTGATACACAACTCAATTATGCCAACGAATTTGATCTGAATATCAAAGGCTGGCTCCTCAACGAACCC AATTACCGCCTGGGACTCATGGCCGGATATCAGGAAAGCCGTTATAGCTTTACAGCCAGAGGTGGTTCCTAT ATCTACAGTTCTGAGGAGGGATTCAGAGATGATATCGGCTCCTTCCCGAATGGAGAAAGAGCAATCGGCTAC AAACAACGTTTTAAAATGCCCTACATTGGCTTGACTGGAAGTTATCGTTATGAAGATTTTGAACTCGGTGGC ACATTTAAATACAGCGGCTGGGTGGAATCATCTGATAACGCTGAAGCTTATGACCCGGGAAAAAGAATCACT TATCGCAGTAAGGTCAAAGACCAAAATTACTATTCTGTTGCAGTCAATGCAGGTTATTACGTCACACCTAAC GCAAAAGTTTATGTTGAAGGCGCATGGAATCGGGTTACGAATAAAAAAGGTAATACTTCACTTTATGATCAC AATAATAACACTTCAGACTACAGCAAAAATGGAGCAGGTATAGAAAACTATAACTTCATCACTACTGCTGGT CTTAAGTACACATTTTAA
SEQ ID N0:21 представляет собой мутантную последовательность OmpT, содержащую мутации D210A и Н212А.
MRAKLLGIVLTTPIAISSFASTETLSFTPDNINADISLGTLSGKTKERVYLAEEGGRKVSQLDWKFNNAAII KGAINWDLMPQISIGAAGWTTLGSRGGNMVDQDWMDSSNPGTWTDESRHPDTQLNYANEFDLNIKGWLLNEP NYRLGLMAGYQESRYSFTARGGSYIYSSEEGFRDDIGSFPNGERAIGYKQRFKMPYIGLTGSYRYEDFELGG TFKYSGWVESSDNAEAYDPGKRITYRSKVKDQNYYSVAVNAGYYVTPNAKVYVEGAWNRVTNKKGNTSLYDH NNNTSDYSKNGAGIENYNFITTAGLKYTF
SEQ ID N0:22 представляет собой нуклеотидную последовательность мутантной нокаутированной последовательности OmpT.
ATTCGGGCGAAACTTCTGGGAATAGTCCTGACAACCCCTATTGCGATCAGCTCTTTTGCTTCTACCGAGACT TTATCGTTTACTCCTGACAACATAAATGCGGACATTAGTCTTGGAACTCTGAGCGGAAAAACAAAAGAGCGT GTTTATCTAGCCGAAGAAGGAGGCCGAAAAGTCAGTCAACTCGACTGGAAATTCAATAACGCTGCAATTATT AAAGGTGCAATTAATTGGGATTTGATGCCCCAGATATCTATCGGGGCTGCTGGCTGGACAACTCTCGGCAGC CGAGGTGGCAATATGGTCGATCAGGACTGGATGGATTCCAGTAACCCCGGAACCTGGACGGATGAAAGTAGA CACCCTGATACACAACTCAATTATGCCAACGAATTTGATCTGAATATCAAAGGCTGGCTCCTCAACGAACCC AATTACCGCCTGGGACTCATGGCCGGATATCAGGAAAGCCGTTATAGCTTTACAGCCAGAGGTGGTTCCTAT ATCTACAGTTCTGAGGAGGGATTCAGAGATGATATCGGCTCCTTCCCGAATGGAGAAAGAGCAATCGGCTAC AAACAACGTTTTAAAATGCCCTACATTGGCTTGACTGGAAGTTATCGTTATGAAGATTTTGAACTCGGTGGC ACATTTAAATACAGCGGCTGGGTGGAATCATCTGATAACGATGAACACTATGACCCGGGAAAAAGAATCACT TATCGCAGTAAGGTCAAAGACCAAAATTACTATTCTGTTGCAGTCAATGCAGGTTATTACGTCACACCTAAC GCAAAAGTTTATGTTGAAGGCGCATGGAATCGGGTTACGAATAAAAAAGGTAATACTTCACTTTATGATCAC AATAATAACACTTCAGACTACAGCAAAAATGGAGCAGGTATAGAAAACTATAACTTCATCACTACTGCTGGT CTTAAGTACACATTTTAA
SEQ ID N0:23 представляет последовательность олигонуклеотидного адаптера OmpA.
С GAT Т GAATGGAGAACТ Т GAAT ТCGGGCGAAACTТСТ GGGААТAG
SEQ ID N0:24 представляет кассету, кодирующую межгенную последовательность 1 (IGS1) для экспрессии Fab в Е. coli.
AAGTTTТААТAGAGGAGAGT GT ТААТ GAAGAAG
SEQ ID N0:25 представляет олигонуклеотидную кассету, кодирующую межгенную последовательность 2 (IGS2) для экспрессии Fab в Е. coli.
AAGTTTТААТAGAGGGGAGT GT ТААААТGAAGAAG
SEQ ID N0:26 представляет кассету, кодирующую межгенную последовательность 3 (IGS3) для экспрессии Fab в Е. coli.
AAGCTTTAATAGAGGAGAGTGTTGAGGAGGAAAAAAAAATGAAGAAA
SEQ ID N0:27 представляет кассету, кодирующую межгенную последовательность 4 (IGS4) для экспрессии Fab в Е. coli.
AAGCTTTAATAGAGGAGAGTGTTGACGAGGATTATATAATGAAGAAA
SEQ ID N0:28 представляет собой последовательность ДНК гена FkpA дикого типа.
ATGAAATCACTGTTTAAAGTAACGCTGCTGGCGACCACAATGGCCGTTGCCCTGCATGCACCAATCACTTTT GCTGCTGAAGCTGCAAAACCTGCTACAGCTGCTGACAGCAAAGCAGCGTTCAAAAATGACGATCAGAAATCA GCTTATGCACTGGGTGCCTCGCTGGGTCGTTACATGGAAAACTCTCTAAAAGAACAAGAAAAACTGGGCATC AAACTGGATAAAGATCAGCTGATCGCTGGTGTTCAGGATGCATTTGCTGATAAGAGCAAACTCTCCGACCAA GAGATCGAACAGACTCTACAAGCATTCGAAGCTCGCGTGAAGTCTTCTGCTCAGGCGAAGATGGAAAAAGAC GCGGCTGATAACGAAGCAAAAGGTAAAGAGTACCGCGAGAAATTTGCCAAAGAGAAAGGTGTGAAAACCTCT TCAACTGGTCTGGTTTATCAGGTAGTAGAAGCCGGTAAAGGCGAAGCACCGAAAGACAGCGATACTGTTGTA GTGAACTACAAAGGTACGCTGATCGACGGTAAAGAGTTCGACAACTCTTACACCCGTGGTGAACCGCTTTCT TTCCGTCTGGACGGTGTTATCCCGGGTTGGACAGAAGGTCTGAAGAACATCAAGAAAGGCGGTAAGATCAAA CTGGTTATTCCACCAGAACTGGCTTACGGCAAAGCGGGTGTTCCGGGGATCCCACCGAATTCTACCCTGGTG TTTGACGTAGAGCTGCTGGATGTGAAACCAGCGCCGAAGGCTGATGCAAAGCCGGAAGCTGATGCGAAAGCC GCAGATTCTGCTAAAAAA
SEQ ID N0:29 представляет собой белковую последовательность для гена FkpA дикого типа.
MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFAAEAAKPATAADSKAAFKNDDQKSAYALGASLGRYMENSLKEQEKLGI KLDKDQLIAGVQDAFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTS STGLVYQVVEAGKGEAPKDSDTWVNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGLKNIKKGGKIK LVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTLVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKK
SEQ ID N0:30 представляет собой последовательность ДНК гена FkpA с his-маркером.
ATGAAATCACTGTTTAAAGTAACGCTGCTGGCGACCACAATGGCCGTTGCCCTGCACGCACCAATCACTTTT GCTGCTGAAGCTGCAAAACCTGCTACTGCTGCTGACAGCAAAGCAGCGTTCAAAAATGACGATCAGAAATCA GCTTATGCACTGGGTGCCTCGCTGGGTCGTTACATGGAAAACTCTCTAAAAGAACAAGAAAAACTGGGCATC AAACTGGATAAAGATCAACTGATCGCTGGTGTTCAGGATGCATTTGCTGATAAGAGCAAACTCTCCGACCAA GAGATCGAACAGACTCTACAAGCATTTGAAGCTCGCGTGAAGTCTTCTGCTCAGGCGAAGATGGAAAAAGAC GCGGCTGATAACGAAGCAAAAGGTAAAGAGTACCGCGAGAAATTTGCCAAAGAGAAAGGTGTGAAAACCTCT TCAACTGGTCTGGTTTATCAGGTAGTAGAAGCCGGTAAAGGCGAAGCACCGAAAGACAGCGATACTGTTGTA GTGAACTACAAAGGTACGCTGATCGACGGTAAAGAGTTCGACAACTCTTACACCCGTGGTGAACCGCTTTCT TTCCGTCTGGACGGTGTTATCCCGGGTTGGACAGAAGGTCTGAAGAACATCAAGAAAGGCGGTAAGATAAAA CTGGTTATTCCACCAGAACTGGCTTACGGCAAAGCGGGTGTTCCGGGGATTCCACCAAATTCTACCCTGGTG TTTGACGTAGAGCTGCTGGATGTGAAACCAGCGCCGAAGGCTGATGCAAAGCCGGAAGCTGATGCGAAAGCC GCAGATTCTGCTAAAAAACACCATCACCATCACCAC
SEQ ID N0:31 представляет собой белковую последовательность для гена FkpA с his-маркером.
MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFAAEAAKPATAADSKAAFKNDDQKSAYALGASLGRYMENSLKEQEKLGI KLDKDQLIAGVQDAFADKSKLSDQEIEQTLQAFEARVKSSAQAKMEKDAADNEAKGKEYREKFAKEKGVKTS STGLVYQVVEAGKGEAPKDSDTVVVNYKGTLIDGKEFDNSYTRGEPLSFRLDGVIPGWTEGLKNIKKGGKIK LVIPPELAYGKAGVPGIPPNSTLVFDVELLDVKPAPKADAKPEADAKAADSAKKHHHHHH
SEQ ID N0:32 представляет собой последовательность ДНК гена skp дикого типа.
GTGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGGTCTCGGTTTAGCACTGGCAACTTCTGCTCAGGCGGCTGACAAAATT GCAATCGTCAACATGGGCAGCCTGTTCCAGCAGGTAGCGCAGAAAACCGGTGTTTCTAACACGCTGGAAAAT GAGTTCAAAGGCCGTGCCAGCGAACTGCAGCGTATGGAAACCGATCTGCAGGCTAAAATGAAAAAGCTGCAG TCCATGAAAGCGGGCAGCGATCGCACTAAGCTGGAAAAAGACGTGATGGCTCAGCGCCAGACTTTTGCTCAG AAAGCGCAGGCTTTTGAGCAGGATCGCGCACGTCGTTCCAACGAAGAACGCGGCAAACTGGTTACTCGTATC CAGACTGCTGTGAAATCCGTTGCCAACAGCCAGGATATCGATCTGGTTGTTGATGCAAACGCCGTTGCTTAC AACAGCAGCGATGTAAAAGACATCACTGCCGACGTACTGAAACAGGTTAAATAA
SEQ ID N0:33 представляет собой белковую последовательность для гена skp дикого типа.
MKKWLLAAGLGLALATSAQAADKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQ SMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAY NSSDVKDITADVLKQVK
SEQ ID N0:34 представляет собой последовательность ДНК гена skp с his-маркером.
ATGAAAAAGTGGTTATTAGCCGCAGGTCTCGGTTTAGCACTGGCAACTTCTGCTCAGGCGGCTGACAAAATT GCAATCGTCAACATGGGCAGCCTGTTCCAGCAGGTAGCGCAGAAAACCGGTGTTTCTAACACGCTGGAAAAT GAGTTCAAAGGCCGTGCCAGCGAACTCCAGCGTATGGAAACCGATCTCCAGGCTAAAATGAAAAAGCTGCAA TCCATGAAAGCGGGCAGCGATCGCACTAAGCTGGAAAAAGACGTGATGGCTCAGCGCCAGACTTTTGCTCAG AAAGCGCAGGCTTTTGAGCAGGATCGCGCACGTCGTTCCAACGAAGAACGCGGCAAACTGGTTACTCGTATC CAGACTGCTGTGAAATCCGTTGCCAACAGCCAGGAAATCGATCTGGTTGTTGATGCAAACGCCGTTGCTTAC AACAGCAGCGATGTAAAAGACATCACTGCCGACGTACTGAAACAGGTTAAACACCATCACCATCACCAC
SEQ ID N0:35 представляет собой белковую последовательность для гена skp с his-маркером.
MKKWLLAAGLGLALATSAQAADKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQ SMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQEIDLVVDANAVAY NSSDVKDITADVLKQVKHHHHHH
Последовательности Ат СА170_1519
CDRH1
GFTFSNYGMV SEQ ID N0: 3 6
CDRH2
YIDSDGDNTYYRDSVKG
SEQ ID NO: 37
CDRH3
GIVRPFLY
SEQ ID NO: 38
CDRL1
KSSQSLVGASGKTYLY
SEQ ID NO: 39
CDRL2
LVSTLDS
SEQ ID NO: 40
CDRL3
LQGTHFPHT
SEQ ID NO: 41
OMr.8J
Область VL крысиного AT 1519 SEQ ID NO: 42
DVVMTQTPLS LSVALGQPAS ISCKSSQSLV GASGKTYLYW LFQRSGQSPK RLIYLVSTLD
SGIPDRFSGS GAETDFTLKI RRVEADDLGV YYCLQGTHFP HTFGAGTKLE LK
Область VL крысиного AT 1519 SEQ ID NO: 4 3
gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggttg cccttggaca accagcctcc
atctcttgca agtcaagtca gagcctcgta ggtgctagtg gaaagacata tttgtattgg
ttatttcaga ggtccggcca gtctccaaag cgactaatct atctggtgtc cacactggac
tctggaattc ctgataggtt cagtggcagt ggagcagaga cagattttac tcttaaaatc
cgcagagtgg aagccgatga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac acattttcct
cacacgtttg gagctgggac caagctggaa ttgaaa
Область VL крысиного AT 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 44
MMSPAQFLFLLMLtVIQGTSGDVVMTQTPLSLSVALGQPASISCKSSQSLVGASGKTYLYWLFQRSGQSPK RLIYLVSTLDSGIPDRFSGSGAETDFTLKIRRVEADDLGVYYCLQGTHFPHTFGAGTKLELK
Область VL крысиного AT 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 45
atgatgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ctgatgctct ggattcaggg aaccagtggt
gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggttg cccttggaca accagcctcc
atctcttgca agtcaagtca gagcctcgta ggtgctagtg gaaagacata tttgtattgg
ttatttcaga ggtccggcca gtctccaaag cgactaatct atctggtgtc cacactggac
tctggaattc ctgataggtt cagtggcagt ggagcagaga cagattttac tcttaaaatc
cgcagagtgg aagccgatga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac acattttcct
cacacgtttg gagctgggac caagctggaa ttgaaa
Область VH
крысиного AT 1519 SEQ ID NO: 4 6
EVPLVESGGG SVQPGRSMKL SCWSGFTFS NYGMVWVRQA PKKGLEWVAY IDSDGDNTYY
RDSVKGRFTI SRNNAKSTLY LQMDSLRSED TATYYCTTGI VRPFLYWGQG TTVTVS
Область VH
крысиного AT 1519 SEQ ID NO: 4 7
gaggtgccgc tggtggagtc tgggggcggc tcagtgcagc ctgggaggtc catgaaactc
tcctgtgtag tctcaggatt cactttcagt aattatggca tggtctgggt ccgccaggct
ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcatat attgattctg atggtgataa tacttactac
cgagattccg tgaagggccg attcactatc tccagaaata atgcaaaaag caccctatat
ttgcaaatgg acagtctgag gtctgaggac acggccactt attactgtac aacagggatt
gtccggccct ttctctattg gggccaagga accacggtca ccgtctcg
Область VH крысиного AT 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 4 8
MDISLSLAFL VLFIKGVRCE VPLVESGGGS VQPGRSMKLS CVVSGFTFSN YGMVWVRQAP
KKGLEWVAYI DSDGDNTYYR DSVKGRFTIS RNNAKSTLYL QMDSLRSEDT ATYYCTTGIV
RPFLYWGQGT TVTVS
Область VH крысиного Ат 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 4 9
atggacatca gtctcagctt ggctttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccggtgtqaq
gtgccgctgg tggagtctgg gggcggctca gtgcagcctg ggaggtccat gaaactctcc
tgtgtagtct caggattcac tttcagtaat tatggcatgg tctgggtccg ccaggctcca
aagaagggtc tggagtgggt cgcatatatt gattctgatg gtgataatac ttactaccga
gattccgtga agggccgatt cactatctcc agaaataatg caaaaagcac cctatatttg
caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtacaac agggattgtc
cggccctttc tctattgggg ccaaggaacc acggtcaccg tctcg
V-областьgL201519 SEQ ID NO: 5 0
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKSSQSLV GASGKTYLYW LFQKPGKAPK RLIYLVSTLD
SGIPSRFSGS GSGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQGTHFP HTFGQGTKLE IK
\/-областьд1_201519 SEQ ID NO: 51
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgta aaagctccca gtccctggtg ggtgcaagcg gcaaaaccta cctgtactgg
ctcttccaga aaccgggcaa agctccgaaa cgcctgatct atctggtgtc taccctggat
agcggtattc cgtctcgttt ctccggtagc ggtagcggta ccgaattcac gctgaccatt
agctccctcc agccggagga ctttgctacc tattactgcc tccagggcac tcattttccg
cacactttcg gccagggtac caaactggaa atcaaa
V-область gl_20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 52
МККГА JAJAV"ALAGFArV"AQADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLVGASGKTYLYWLFQKPGKAPKR LIYLVSTLDSGIPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHFPHTFGQGTKLEIK
V-область gl_20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 53
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg
actattacct gtaaaagctc ccagtccctg gtgggtgcaa gcggcaaaac ctacctgtac
tggctcttcc agaaaccggg caaagctccg aaacgcctga tctatctggt gtctaccctg
gatagcggta ttccgtctcg tttctccggt agcggtagcg gtaccgaatt cacgctgacc
attagctccc tccagccgga ggactttgct acctattact gcctccaggg cactcatttt
ccgcacactt tcggccaggg taccaaactg gaaatcaaa
Легкая цепь(V + константная)gl_20 1519 SEQ ID NO: 54
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKSSQSLV GASGKTYLYW LFQKPGKAPK RLIYLVSTLD
SGIPSRFSGS GSGTEFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQGTHFP HTFGQGTKLE IKRTVAAPSV
FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
Легкая цепь (V + константная) gl_20 1519 SEQ ID NO: 55
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgta aaagctccca gtccctggtg ggtgcaagcg gcaaaaccta cctgtactgg
ctcttccaga aaccgggcaa agctccgaaa cgcctgatct atctggtgtc taccctggat
agcggtattc cgtctcgttt ctccggtagc ggtagcggta ccgaattcac gctgaccatt
agctccctcc agccggagga ctttgctacc tattactgcc tccagggcac tcattttccg
cacactttcg gccagggtac caaactggaa atcaaacgta cggtagcggc cccatctgtc
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa
gtcacccatc agggcctgag ctcaccagta acaaaaagtt ttaatagagg ggagtgt
Легкая цепь gl_20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 5 6
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ ADIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCKSSQSL VGASGKTYLY
WLFQKPGKAP KRLIYLVSTL DSGIPSRFSG SGSGTEFTLT ISSLQPEDFA TYYCLQGTHF
PHTFGQGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASWC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL
QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
Легкая цепь gl_20 1519с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 57
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg
actattacct gtaaaagctc ccagtccctg gtgggtgcaa gcggcaaaac ctacctgtac
tggctcttcc agaaaccggg caaagctccg aaacgcctga tctatctggt gtctaccctg
gatagcggta ttccgtctcg tttctccggt agcggtagcg gtaccgaatt cacgctgacc
attagctccc tccagccgga ggactttgct acctattact gcctccaggg cactcatttt
ccgcacactt tcggccaggg taccaaactg gaaatcaaac gtacggtagc ggccccatct
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc
gaagtcaccc atcagggcct gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggggagtgt
V-областьgH201519 SEQ ID NO: 58
EVPLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFS NYGMVWVRQA PGKGLEWVAY IDSDGDNTYY
RDSVKGRFTI SRDNAKSSLY LQMNSLRAED TAVYYCTTGI VRPFLYWGQG TLVTVS
V-областьgH201519 SEQ ID NO: 5 9
gaggttccgc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc
tcttgtgcag tatctggctt cacgttctcc aactacggta tggtgtgggt tcgtcaggct
ccaggtaaag gtctggaatg ggtggcgtat attgactccg acggcgacaa cacctactat
cgcgactctg tgaaaggtcg cttcaccatt tcccgcgata acgccaaatc cagcctgtac
ctgcagatga acagcctgcg tgctgaagat actgcggtgt actattgcac cactggcatc
gtgcgtccgt ttctgtattg gggtcagggt accctcgtta ctgtctcg
V-область gl_20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 60
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVPLVESGG GLVQPGGSLR LSCAVSGFTF SNYGMVWVRQ
APGKGLEWVA YIDSDGDNTY YRDSVKGRFT ISRDNAKSSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTTG
IVRPFLYWGQ GTLVTVS
V-область gl_20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 61
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa
gctgaggttc cgctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt
ctctcttgtg cagtatctgg cttcacgttc tccaactacg gtatggtgtg ggttcgtcag
gctccaggta aaggtctgga atgggtggcg tatattgact ccgacggcga caacacctac
tatcgcgact ctgtgaaagg tcgcttcacc atttcccgcg ataacgccaa atccagcctg
tacctgcaga tgaacagcct gcgtgctgaa gatactgcgg tgtactattg caccactggc
atcgtgcgtc cgtttctgta ttggggtcag ggtaccctcg ttactgtctc g
Тяжелая цепь(V+CH1 гамма-1 человека + шарнир) Fab'gH20 1519 SEQ ID NO: 62
EVPLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFS NYGMVWVRQA PGKGLEWVAY IDSDGDNTYY
RDSVKGRFTI SRDNAKSSLY LQMNSLRAED TAVYYCTTGI VRPFLYWGQG TLVTVSSAST
KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
SLSSWTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCAA
Тяжелая цепь (V+CH1 гамма-1 человека + шарнир) Fab'gH20 1519 SEQ ID NO: 63
gaggttccgc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc
tcttgtgcag tatctggctt cacgttctcc aactacggta tggtgtgggt tcgtcaggct
ccaggtaaag gtctggaatg ggtggcgtat attgactccg acggcgacaa cacctactat
cgcgactctg tgaaaggtcg cttcaccatt tcccgcgata acgccaaatc cagcctgtac
ctgcagatga acagcctgcg tgctgaagat actgcggtgt actattgcac cactggcatc
gtgcgtccgt ttctgtattg gggtcagggt accctcgtta ctgtctcgag cgcttctaca
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtcgacaaga aagttgagcc caaatcttgt
gacaaaactc acacatgcgc cgcg
Тяжелая цепь Fab' gH20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0: 64
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVPLVESGG GLVQPGGSLR LSCAVSGFTF SNYGMVWVRQ APGKGLEWVA YIDSDGDNTY YRDSVKGRFT ISRDNAKSSL YLQMNSLRAE DTAVYYCTTG IVRPFLYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCAA
Тяжелая цепь Fab' gH20 1519 с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID N0:65
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa
gctgaggttc cgctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt
ctctcttgtg cagtatctgg cttcacgttc tccaactacg gtatggtgtg ggttcgtcag
gctccaggta aaggtctgga atgggtggcg tatattgact ccgacggcga caacacctac
tatcgcgact ctgtgaaagg tcgcttcacc atttcccgcg ataacgccaa atccagcctg
tacctgcaga tgaacagcct gcgtgctgaa gatactgcgg tgtactattg caccactggc
atcgtgcgtc cgtttctgta ttggggtcag ggtaccctcg ttactgtctc gagcgcttct
acaaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct
tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg
Тяжелая цепь lgG4gH20 1519(V + константная гамма-4Рчеловека) SEQ ID NO: 66
EVPLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFS NYGMVWVRQA PGKGLEWVAY IDSDGDNTYY
RDSVKGRFTI SRDNAKSSLY LQMNSLRAED TAVYYCTTGI VRPFLYWGQG TLVTVSSAST
KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY
SLSSWTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV
SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK
(DMr.8N
Тяжелая цепь lgG4 gH20 1519 (V + константная гамма-4Р человека, экзоны подчеркнуты) SEQ ID N0:67
gaggtaccacttgtggaaagcggaggaggtcttgtgcagcctggaggaagtttacgtctctcttgtgctgtgtctggctt
caccttctccaattacggaatggtctgggtcagacaagcacctggaaagggtcttgaatgggtggcctatattgactctg
acggggacaacacctactatcgggattccgtgaaaggacgcttcacaatctcccgagataacgccaagagctcactgtac
ctgcagatgaatagcctgagagccgaggatactgccgtgtactattgcacaacgggaatcgttaggccttttctgtactg
gggacagggcaccttggttactgtctcgagcgcttctacaaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccagga
gcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactca
ggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgac
cgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttggtga
gaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagccctcctgcctggacgcaccccggctgtgcagcc
ccagcccagggcagcaaggcatgccccatctgtctcctcacccggaggcctctgaccaccccactcatgcccagggagag
ggtcttctggatttttccaccaggctccgggcagccacaggctggatgcccctaccccaggccctgcgcatacaggggca
ggtgctgcgctcagacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactc
tccactccctcagctcagacaccttctctcctcccagatctgagtaactcccaatcttctctctgcagagtccaaatatg
gtcccccatgcccaccatgcccaggtaagccaacccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagta
gcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacgcatccacctccatctcttcctcagcacctgagttcctggggg
gaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtg
gtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaa
gccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggca
aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacc
cacggggtgcgagggccacatggacagaggtcagctcggcccaccctctgccctgggagtgaccgctgtgccaacctctg
tccctacagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagc
ctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaacta
caagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggc
aggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtct
ctgggtaaa
Легкая цепь Fat
DIQMTQSPSS SGIPSRFSGS FIFPPSDEQL SSTLTLSKAD QSPSSVSASV SGSGTDFTLT rvgL20 1519
LSASVGDRVT GSGTEFTLTI KSGTASVVCL YEKHKVYACE GDRVTITCQS ISSLQPEDFA 5EQ ID NO:
ITCKSSQSLV SSLQPEDFAT LNNFYPREAK VTHQGLSSPV SPSVWSNFLS TYYCGGGYSS 68
GASGKTYLYW YYCLQGTHFP VQWKVDNALQ TKSFNRGECS WYQQKPGKAP ISDTTFGCGT
LFQKPGKAPK HTFGQGTKLE SGNSQESVTE GGGGSGGGGS KLLIYEASKL KVEIKRT
RLIYLVSTLD IKRTVAAPSV QDSKDSTYSL GGGGSDIQMT TSGVPSRFSG
Легкая цепь Fat
gatatccaga attacgtgta ctctttcaga tctgggatac tcatcgctgc cacactttcg ttcatcttcc ctgaataact tcgggtaact agcagcaccc gtcacccatc ggtggcggtg cagagtcctt tctcctagcg aaacttctga tctggatcag acctactatt aaggtggaaa :vgL20 1519
tgacccagag agagctccca agcctggcaa cgtcacgatt aacccgagga gccaggggac cgccatctga tctatcccag cccaggagag tgacgctgtc agggcctgag gcagtggtgg catcggtatc tctggagcaa tttatgaagc ggacagactt gtggtggagg tcaaacgtac
SEQ ID NO:
cccatctagc
atctctcgtg
ggcaccaaaa
ttccggatct
ctttgctacc
aaaactcgaa
tgagcagttg
agaggccaaa
tgtcacagag
taaagcagac
ctcaccagta
gggaggctcc
cgcgtccgtt
ttttctatcc
ctcgaaactc
cacgttgaca
ttacagtagc
с 69
ttatccgctt ggtgcaagtg cggctgatct gggagcggaa tactactgcc atcaaacgta aaatctggaa gtacagtgga caggacagca tacgagaaac acaaaaagtt ggaggtggcg ggcgataggg tggtatcaac accagtggag atcagttcgc ataagtgata ccgttggtga gcaagaccta atctggtgtc ctgagttcac tgcaaggcac cggtagcggc ctgcctctgt aggtggataa aggacagcac acaaagtgta ttaatagagg gttcagacat tgactattac agaaaccggg ttccgtcaag tgcaaccaga cgacatttgg tcgcgtgaca tctgtactgg tacccttgac actcacgatt tcatttccct cccatctgtc tgtgtgcctg cgccctccaa ctacagcctg cgcctgcgaa ggagtgtagc acaaatgacc atgtcaaagc gaaggctcca attcagtggc ggactttgcg gtgcggtact
ФИГ.80
Легкая цепь gl_20 1519 FabFv с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 70
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLVGASGKTYLYWLFQKPGKAPKRLIYLV STLDSGIPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHFPHTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGECSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLI YEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIKRT
Легкая цепь gL20 1519 FabFv с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 71
atgtctgtccccacccaagtcctcggactcctgctactctggcttacagatgccagatgcgatatccagatg
acccagagcccatctagcttatccgcttccgttggtgatcgcgtgacaattacgtgtaagagctcccaatct
ctcgtgggtgcaagtggcaagacctatctgtactggctctttcagaagcctggcaaggcaccaaaacggctg
atctatctggtgtctacccttgactctgggataccgtcacgattttccggatctgggagcggaactgagttc
acactcacgatttcatcgctgcaacccgaggactttgctacctactactgcctgcaaggcactcatttccct
cacactttcggccaggggacaaaactcgaaatcaaacgtacggtagcggccccatctgtcttcatcttcccg
ccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag
gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac
agcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgacgctgtctaaagcagactacgagaaacacaaagtg
tacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcaccagtaacaaaaagttttaatagaggggagtgtagc
ggtggcggtggcagtggtgggggaggctccggaggtggcggttcagacatacaaatgacccagagtccttca
tcggtatccgcgtccgttggcgatagggtgactattacatgtcaaagctctcctagcgtctggagcaatttt
ctatcctggtatcaacagaaaccggggaaggctccaaaacttctgatttatgaagcctcgaaactcaccagt
ggagttccgtcaagattcagtggctctggatcagggacagacttcacgttgacaatcagttcgctgcaacca
gaggactttgcgacctactattgtggtggaggttacagtagcataagtgatacgacatttgggtgcggtact
aaggtggaaatcaaacgtacc
Тяжелая цепь FabFv gH20 1519 SEQ ID NO: 72
EVPLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSNYGMVWVRQAPGKGLEWVAYIDSDGDNTYYRDSVKGRFTISR DNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTGIVRPFLYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCSGGGGSGGGGTGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKCLEWIGIIW ASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS
Тяжелая цепь FabFvgH20 1519 SEQ ID NO: 73
gaggtaccacttgtggaaagcggaggaggtcttgtgcagcctggaggaagtttacgtctctcttgtgctgtg
tctggcttcaccttctccaattacggaatggtctgggtcagacaagcacctggaaagggtcttgaatgggtg
gcctatattgactctgacggggacaacacctactatcgggattccgtgaaaggacgcttcacaatctcccga
gataacgccaagagctcactgtacctgcagatgaatagcctgagagccgaggatactgccgtgtactattgc
acaacgggaatcgttaggccttttctgtactggggacagggcaccttggttactgtctcgagcgcgtccaca
aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgc
ctggtcaaggactacttccccgaaccagtgacggtgtcgtggaactcaggtgccctgaccagcggcgttcac
accttcccggctgtcctacagtcttcaggactctactccctgagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagc
ttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtcgataagaaagttgag
cccaaatcttgtagtggaggtgggggctcaggtggaggcgggaccggtggaggtggcagcgaggttcaactg
cttgagtctggaggaggcctagtccagcctggagggagcctgcgtctctcttgtgcagtaagcggcatcgac
ctgagcaattacgccatcaactgggtgagacaagctccggggaagtgtttagaatggatcggtataatatgg
gccagtgggacgaccttttatgctacatgggcgaaaggaaggtttacaattagccgggacaatagcaaaaac
accgtgtatctccaaatgaactccttgcgagcagaggacacggcggtgtactattgtgctcgcactgtccca
ggttatagcactgcaccctacttcgatctgtggggacaagggaccctggtgactgtttcaagt
Тяжелая цепь gl_20 1519 FabFv с выделенной подчеркиванием и курсивом
сигнальной последовательностью SEQ ID NO: 74
MЈ^S^FLFFLSyrrGV7JSEVPLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSNYGlWWVRQAPGKGLEWVAYIDS DGDNTYYRDSVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTGIVRPFLYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCSGGGGSGGGGTGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYA INWVRQAPGKCLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTA PYFDLWGOGTLVTVSS
1/24
1/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
2/24
3/24
3/24
6/24
5/24
6/24
7/24
8/24
8/24
9/24
9/24
9/24
9/24
9/24
9/24
9/24
9/24
9/24
9/24
10/24
11/24
ФИГ.8С
13/24
ФИГ.80
13/24
ФИГ.80
14/24
ФИГ.8Е
14/24
ФИГ.8Е
15/24
15/24
16/24
ФИГ.8С
16/24
ФИГ.8С
17/24
ФИГ.8Н
17/24
ФИГ.8Н
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
18/24
ФИГ.81
19/24
19/24
20/24
ФИГ.8К
20/24
ФИГ.8К
21/24
ФИГ.81-
21/24
ФИГ.81-
22/24
ФИГ.8М
22/24
ФИГ.8М
23/24
23/24
23/24
23/24
24/24
24/24