Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос :  ea201291001a*\id

больше ...
Термины запроса в документе


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Данное изобретение относится в общем к области обнаружения микроорганизмов, в частности к обнаружению бактерий, к способам измерения ферментативной активности, такой как активность ДНК-полимеразы, и, в частности, относится к таким способам, осуществляемым на микробных неочищенных лизатах, полезных для определения микробных ферментативных активностей, которые могут быть связаны с генераторами амплификационного сигнала, такими как способы полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, обеспечивая таким образом возможность определения микробных патогенов в образцах, таких как неочищенная кровь и другие жидкости организма. Данное изобретение также относится к реагентам для использования в таких способах, и к тестирующим наборам, включающим такие реагенты для осуществления способов.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201291001 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.04.15
(51) Int. Cl. C12Q1/68 (2006.01)
(54)
СПОСОБЫ ИЗМЕРЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ, ПОЛЕЗНЫЕ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК В НЕОЧИЩЕННЫХ ОБРАЗЦАХ
(31) (32) (33)
(86) (87) (88) (71)
(72)
(74)
61/324,939; 61/324,949; 61/325,413 2010.04.16; 2010.04.16; 2010.04.19
PCT/US2011/032600
WO 2011/130584 2011.10.20
2013.07.11
Заявитель:
ЗИУС САЙЕНТИФИК, ИНК. (US) Изобретатель:
О'Хара Шон Марк, Цвайтциг Дэниел
Р. (US)
Представитель: Поликарпов А.В. (RU) (57) Данное изобретение относится в общем к области обнаружения микроорганизмов, в частности к обнаружению бактерий, к способам измерения ферментативной активности, такой как активность ДНК-полимеразы, и, в частности, относится к таким способам, осуществляемым на микробных неочищенных лизатах, полезных для определения микробных ферментативных активностей, которые могут быть связаны с генераторами ам-плификационного сигнала, такими как способы полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, обеспечивая таким образом возможность определения микробных патогенов в образцах, таких как неочищенная кровь и другие жидкости организма. Данное изобретение также относится к реагентам для использования в таких способах, и к тестирующим наборам, включающим такие реагенты для осуществления способов.
PCT/US2011/032600
МПК7: C12Q1/68 (2006.01)
СПОСОБЫ ИЗМЕРЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ, ПОЛЕЗНЫЕ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК В
НЕОЧИЩЕННЫХ ОБРАЗЦАХ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ Данная заявка на изобретение представляет собой заявку, по которой испрашивается приоритет, в частности, предварительной заявки на патент США № 61/324,939, поданной 16 апреля 2010 года, предварительной заявки на патент США № 61/324,949, поданной 16 апреля 2010 года, и предварительной заявки на патент США № 61/325,413, поданной 19 апреля 2010 года. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится в общем к области обнаружения микроорганизмов, и в частности, к обнаружению бактерий. Также в изобретении предложены усовершенствованные способы обнаружения микроорганизмов, которые являются высокочувствительными, применимы к неочищенным образцам и имеют многочисленные применения, вместе с тестовыми наборами, основанные на присутствии лигазы и/или фосфатазы в качестве показателя бактериальной жизнеспособности.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Измерение присутствия и уровней некоторых молекул, ассоциированных с жизнеспособностью клетки, является важным в различных случаях. Например, измерение уровней АТР (аденозинтрифосфата) полезно в клетках млекопитающих для анализа роста и задач токсикологии.
Культуральные подходы могут быть использованы для обнаружения небольшого количества бактерий, но такие способы требуют нескольких суток для завершения, особенно при попытке обнаружить небольшие количества бактерий, а также при обнаружении медленно-растущих микроорганизмов.
Альтернативно, тесты могут быть осуществлены на основе измерения присутствия молекулы, которая может быть связана с присутствием в образце инородной клетки или организма. Наиболее часто обнаруживаемая молекула представляет собой аденозинтрифосфат (АТР). Также предложено обнаружение ДНК и РНК, несмотря на то, что корреляция между присутствием
ДНК и РНК и жизнеспособностью не ясна вследствие вариации в сохранении нуклеиновых кислот в клетках после смерти (Кеег & Birch, Journal of Microbiological Methods 53 (2003) 175-183). Также предложено обнаружение аденилаткиназы в качестве индикатора жизнеспособности (Squirrell DJ, Murphy MJ, Leslie RL, Green JCD: A comparison of ATP and adenylate kinase as bacterial cell markers: correlation with agar plate counts, in Bioluminescence and Chemiluminescence Progress and Current Applications. Edited by: Stanley RA, Kricka LJ. John Wiley and Sons; 2002 and WO 96/02665). Обычно используемый способ для определения уровней АТР включает использование биолюминесценции. В способе используют зависимость АТР от реакции, в которой светоизлучающая люцифераза катализирует окисление люциферина. Этот способ может быть использован для измерения относительно низких концентраций АТР. Наборы, полезные для обнаружения АТР с использованием биолюминесценции, имеются в продаже от Roche, New Horizons Diagnostics Corp, Celsis и т.д. Тем не менее, множество проблем существует в отношении обнаружения биолюминесценции. Например, обнаружение только микробного АТР в присутствии АТР из немикробных источников может быть проблемой. Эта проблема решается до некоторой степени путем использования фильтров, которые могут отделять бактерии от небактериальных источников АТР, таким образом обеспечивая более точный сигнал.
Соответственно, понятно, что в уровне техники существует ряд проблем, связанных с обнаружением микробов. Для дополнительного решения таких проблем предложено обнаружение лигаз, как описано в опубликованной заявке на патент WO/1996/002665, опубликованной 1 февраля 1996 года, где раскрыт способ определения присутствия и/или количества микроорганизмов, и/или их внутриклеточного материала, присутствующего в образце, характеризующийся тем, что количество аденилаткиназы в образце оценивают путем его смешивания с аденозиндифосфатом (ADP), определения количества аденозинтрифосфата (АТР), продуцируемого образцом из этого ADP, и отнесения количества АТР, продуцируемого таким образом, с присутствием/или количеством аденилаткиназы и с микроорганизмами и/или их внутриклеточным материалом, где превращение ADP в АТР осуществляют в присутствии ионов магния в мольной концентрации, достаточной для достижения максимального
превращения ADP в АТР. Количество присутствующего магния предпочтительно является таким, что достаточно для получения одного моль магния на один моль ADP таким образом, что, все молекулы ADP могут быть ассоциированы по меньшей мере с одним ионом магния.
В опубликованной заявке на патент WO/2009/007719, опубликованной 15 января 2009 года, озаглавленной DETECTION OF MICRO-ORGANISMS BASED ON THEIR NAD-DEPENDENT DNA LIGASE ACTIVITY, раскрыты лигазы, в частности зависимые от NAD (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) лигазы, в качестве полезного индикатора присутствия (жизнеспособного) микроорганизма в образце. Лигазы представляют собой ферменты, катализирующие лигирование молекул нуклеиновой кислоты. Реакция лигирования требует АТР или NAD+ в качестве кофактора, зависящего от рассматриваемой лигазы. В этом описании применение зависимой от NAD лигазной активности используется в качестве показателя присутствия (жизнеспособного) микроорганизма в образце. Связь между зависимой от NAD лигазной активностью и жизнеспособностью является центральной для изобретения, раскрытого в данной заявке на изобретение (Korycka-Machala et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Aug. 2007, p2888-2897), поскольку дает возможность для использования активности этого фермента в качестве показателя жизнеспособных микробных клеток, в частности бактериального происхождения, в образце. Тем не менее, в экспериментах, приведших к разработке данного изобретения, обнаружено, что способы и концепции, описанные в этой опубликованной заявке на патент WO/2009/007719, не могут быть применены к определению жизнеспособных микроорганизмов в неочищенных образцах, таких как неочищенные микробные лизаты, кровь или гемокультуры, таким образом составляя основной недостаток технологии, описанной в этой ссылке. Тем не менее, обнаружено, что эти методологии также имеют проблемы. Например, обнаружено, что в целом обычная схема анализа с субстратом лигазы и, как результат, обнаружение ее сигнала, как раскрыто в вышеприведенной заявке на патент, не является специфической для лигазы при применении ее в отношении предполагаемого типа образца (полученные из крови неочищенные лизаты микробных клеток). Именно эти проблемы пытаются решить и преодолеть в данном изобретении.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В отличие от обычных способов, описанных выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к обнаружению ферментов, таких как полимеразы, в предпочтительных воплощениях ДНК или РНК полимераз, в качестве полезного показателя присутствия (жизнеспособного) микроорганизма или микроба в образце, в частности, в образце, который представляет собой, например, неочищенный микробный лизат, или неочищенную кровь, или гемокультуру. Связь, обнаруженная в соответствии с настоящим изобретением, между ферментом, например полимеразой, активностью и жизнеспособностью микроорганизмов или микробов, делает возможным обнаружение активности этих ферментов, используемых в качестве показателя жизнеспособных микробных клеток, в частности бактериального происхождения, в образце.
Аналогично, в предпочтительном воплощении изобретения предложены способы обнаружения ДНК или РНК полимеразы как показателя присутствия микроорганизма в образце. Такой способ может включать:
(а) приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты,
действующей в качестве субстрата для полимеразной активности в образце,
(б) инкубирование приведенного таким образом в контакт образца в
условиях, подходящих для полимеразной активности; и
(в) определение присутствия (и/или количества) молекулы
нуклеиновой кислоты, полученной в результате действия полимеразы
микроорганизма на молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся субстратом,
для указания таким образом на присутствие микроорганизма.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены реагенты, полезные в предшествующих описанных способах, и тестовые наборы, включающие такие реагенты, полезные для осуществления способов.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложены усовершенствования способов, композиций и наборов, описанных в опубликованной заявке на патент WO/2009/007719, опубликованной 15 января 2009 года, названной DETECTION OF MICRO-ORGANISMS BASED ON THEIR NAD-DEPENDENT DNA LIGASE ACTIVITY, в которой идентифицированы лигазы, в частности, зависимые от NAD лигазы, в качестве полезного показателя присутствия (жизнеспособного) микроорганизма или микроба.
Полное описание, содержащееся в указанной WO/2009/007719, включено сюда путем ссылки как часть данной заявки на изобретение.
В настоящем изобретении, соответственно, предложены усовершенствования способов обнаружения фермента, выбранного из группы, состоящей из зависимой от NAD лигазы или фосфатазы, или их смеси, и композиции и наборы, основанные на них, как раскрыто в WO/2009/007719, как показателя присутствия микроорганизма в образце, где в усовершенствованных способах осуществляют:
(а) приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты,
действующей в качестве субстрата для ферментативной активности в образце,
не допуская мешающих сигналов от ДНК-полимеразы,
(б) инкубирование приведенного таким образом в контакт образца в
условиях, подходящих для ферментативной активности; и
(в) определение присутствия (и/или количества) молекулы
нуклеиновой кислоты, модифицированной ферментом, полученной в
результате действия выбранного фермента или смеси на молекулу
нуклеиновой кислоты, являющуюся субстратом, для указания на присутствие
микроорганизма.
Таким образом, понятно, что усовершенствованные способы по изобретению полезны для идентификации всех микроорганизмов, в которых экспрессируются такие ферменты или их смеси.
Как утверждается здесь, первая стадия в способе включает приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, действующей в качестве субстрата для ферментативной активности в образце, не допуская мешающих сигналов от ДНК-полимеразы. Таким образом, понятно, что любая подходящая лигируемая молекула, которая может быть специфически обнаружена после лигирования, может быть использована в способах по изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1, фиг. А - D демонстрируют шаблонные схемы и графические представления результатов, полученных в экспериментах, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, как здесь описано.
Фиг. 2, фиг. A-D представляют собой графические представления, демонстрирующие, что нелигируемые подходящие для полимеразы субстраты
являются чувствительными и специфическими для получаемых из микробов неочищенных клеточных лизатов.
Фиг. 3 представляет собой графическое представление, демонстрирующее, что нелигируемые подходящие для полимеразы субстраты являются чувствительными и специфическими для полученных из культур крови с микробами неочищенных лизатов клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, из предшествующего описания понятно, что способы по настоящему изобретению полезны для идентификации всех микроорганизмов, в которых экспрессируется фермент, такой как подходящая полимераза. В некоторых воплощениях способы по изобретению применяют для обнаружения жизнеспособных микроорганизмов и, таким образом, могут рассматриваться как способ для обнаружения жизнеспособного микроорганизма в образце. В частности, в предпочтительном воплощении способы по изобретению могут быть полезны для идентификации бактерий или микроорганизмов, в которых ген полимеразы нуклеиновой кислоты и транслированный с него белок активной полимеразы важны для жизнеспособности. Однако микроорганизмы, такие как бактерии, недавно ставшие нежизнеспособными (например, вследствие обработки антибактериальным средством), могут сохранить обнаруживаемую полимеразную активность, пока фермент не деградирует.
При разработке настоящего изобретения, обнаружено изменение подхода по приготовлению образца функциональных клеточных биохимических компонентов в том, что настоящее изобретение дает возможность для проведения анализов непосредственно на образцах из мягко лизированных клеток без дорогостоящих осложнений, добавляемых традиционными, и часто экстремальными, основанными на денатурации протоколами выделения. Таким образом, обнаружено, что данное изобретение дает возможность для обнаружения жизнеспособных организмов в образцах, таких как неочищенные клинические лизаты, включая, без ограничения, клеточные фракции из цельной крови и/или гемокультур, и из их больших объемов, которые обычно составляют 10-20 мл, предпочтительно в диапазоне 0,1-100 мл. Изобретение особенно полезно для обнаружения всех организмов, ассоциированных с сепсисом, и для ассоциированных с состояниями, включающими без
ограничения бактериемию, фунгемию и вирусные и паразитные состояния. Неожиданно обнаружено, что в соответствии с настоящим изобретением обнаружение таких организмов может быть осуществлено в таких неочищенных образцах, как описано выше, в отличие от концепции обычного уровня техники, в котором ингибирование полимеразы, полученной из образца, а также присутствие мешающих протеиназ и нуклеаз, составляют барьер для таких способов анализа при осуществлении на неочищенных образцах.
Как описано выше, лигазы, в частности зависимые от NAD лигазы, раскрыты в качестве полезного индикатора присутствия (жизнеспособного) микроорганизма в образце. Тем не менее, наоборот, в настоящем изобретении предложены другие ферменты, происходящие из жизнеспособной микробной клетки, более полезные, чем лигазы, которые можно аналогично использовать для связи их активности из жизнеспособных клеток с высокочувствительным генератором сигнала, таким как амплификация, посредством способов, таких как ПЦР и т.п. Эта особенность изобретения также потенциально дает возможность для дифференцирования бактерий и грибов. В примере воплощения изобретения могут быть использованы следующие:
а. Киназы, добавляющие Р04, который может использоваться для
активации лигазы или остановки полимеразы;
б. Фосфатазы могут использоваться для удаления Р04 и активации
полимераз;
в. ДНК и РНК полимеразы могут быть использованы для удлинения
субстратов для активации нисходящей традиционной ПЦР или изотермических
амплификаций;
г. Изотермические амплификации могут быть свободны от
эндонуклеазных ферментативных активностей;
д. Рибосомы;
е. механизмы микро-РНК;
ж. Гираза;
з. Геликаза;
и. Экзонуклеазы, 5 '-3', 3 '-5', т.е. удаляющие блокирующие группы,
такие как Р04, TaqMan и т.д.;
к. Эндонуклеазы;
л. Протеазы;
м. Дезоксирибонуклеазы;
н. РНКазы;
о. 1ЮГликозилазы;
п. Ферменты репарации.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения обнаружено, что измерение активности ДНК-полимеразы в соответствии с изобретением включает определение жизнеспособности клетки из неочищенных микробных лизатов. Последнее может быть верифицировано с помощью более селективных модифицированных олигонуклеотидных субстратов в комбинации с очень селективными "горячими стартами" (как хорошо известно в области техники) и контроля активности при КТ, 37, 60С.
В одном воплощении, изобретение может использоваться для скрининга продуктов крови, в особенности тромбоцитов, так как при этом использовании любой рост микроба является причиной для устранения продукта, и дифференцирование бактерий от грибов не является необходимым. В еще одном воплощении изобретения могут использоваться фосфатазы, и они представляют собой вероятно еще один превосходный кандидат в качестве фермента для запуска полимеразной активности, поскольку они удаляют 5'- или З'-фосфат, освобождая -ОН и таким образом запускают любую полимеразу путем удаления сконструированных включенных 5'-Taq, или лигазу (удаление 3'). Кроме того, фосфатазы являются устойчивыми и могут способствовать дифференцированию дрожжей и бактерий путем оптимизации рН. Таким образом, понятно, что любой подходящий фермент, который запускает полимеразы, как рассмотрено здесь, может быть полезным в практической реализации настоящего изобретения.
В практическом применении настоящего изобретения, обнаружение микроорганизмов может включать еще недавно жизнеспособные микроорганизмы, вплоть до момента, когда происходит деградация ДНК-полимеразы. Если требуется различие между жизнеспособными и еще недавно жизнеспособными микроорганизмами, то простой временной промежуток времени или сравнение полимеразной активности между двумя или более чем двумя моментами времени, в подходящих условиях должно быть достаточным
для того, чтобы определить, увеличивается ли, сохраняется или уменьшается полимеразная активность с течением времени. В предпочтительном воплощении, если полимеразная активность, как обнаруживают, сохраняется или увеличивается в течение продолжительного периода времени или в (а) более поздний момент(ы) времени (по сравнению с исходным измерением), последнее может указывать на то, что микроорганизмы жизнеспособны. Если полимеразная активность уменьшается в (а) более поздний момент(ы) времени, то последнее может указывать на то, что обнаруженная активность происходит от еще недавно жизнеспособных микроорганизмов. Указанный подход с измерением с течением времени может быть особенно полезным, когда применяется в отношении тестирования чувствительности к антибиотикам (AST), и как определение других подходящих способов лечения. Способы обнаружения здесь обсуждаются подробно. В специфических предпочтительных воплощениях изобретения микроорганизм представляет собой бактерию, как здесь описано, и способы по изобретения могут быть более широко применимыми (Wilkinson et al., Molecular Microbiology (2001) 40(6), 1241-1248). Бактерии могут также представлять собой, например мезофильные и/или термофильные бактерии.
Определено, что "образец" в контексте настоящего изобретения включает любой образец, в котором желательно тестировать присутствие микроорганизма, в частности бактерии. Таким образом, образец может состоять из клинического неочищенного лизата микробов, или может содержать клинический образец крови или гемокультуры, или содержит образец, подходящий, например, для системы анализа in vitro. Образцы также могут включать напиток или образцы пищи, или их препараты, или фармацевтические или косметические продукты, такие как продукты личной гигиены, включая шампуни, кондиционеры, увлажняющие кремы и т.д., все из которых протестированы на микробное загрязнение по заведенному порядку. Образец может включать ткань или клетки, и может содержать слюну или образец тромбоцитов. Кроме того, способы и наборы по изобретению могут использоваться для контроля загрязнения поверхностей, таких как, например, в местах приготовления пищи. В предпочтительном воплощении, о контаминации свидетельствует полимеразная активность. Контаминация может происходить
из любого микробного источника, в частности бактериальная контаминация. Кроме того, изобретение также полезно для контроля условий окружающей среды, таких как водоснабжение, сточные воды, морские среды и т.д. Изобретение также полезно для контроля бактериального роста в процедурах брожения и в образце воздуха, где содержание бактерий или спор может быть оценено в больнице, производственных объектах или в приложениях биологической защиты.
Способы по изобретению основаны на том факте, что если один или более чем один (жизнеспособный) микроорганизм, в частности бактерии, представлены в образце, то будет присутствовать ферментативная активность, предпочтительно активность ДНК-полимеразы. Таким образом, фермент может в подходящих условиях катализировать реакцию образования новой обнаруживаемой молекулы нуклеиновой кислоты (в последующем процессе). Новая молекула нуклеиновой кислоты может быть обнаружена при помощи любых подходящих средств, таких как описанные далее, таким образом давая возможность для определения присутствия микроорганизмов в тестируемом образце.
Таким образом, если микроорганизм не присутствует в образце, то не будет никакой ферментативной (например, полимеразной) активности в образце, и, таким образом, новая обнаруживаемая молекула нуклеиновой кислоты не будет продуцироваться.
Способы по настоящему изобретению обеспечивают существенные технические преимущества, в значительной степени благодаря факту, что новая молекула нуклеиновой кислоты продуцируется как часть способа. В способах по настоящему изобретению непрореагировавшая молекула нуклеиновой кислоты не будет вносить вклад в сигнал, и в результате никакие ложные положительные сигналы не должны возникать при осуществлении способов.
Кроме того, способы, предложенные в изобретении, высокочувствительны, и могут обеспечить обнаружение фермента (например, полимеразы), представленного в образце вплоть до уровня фемтограмм и возможно даже аттограмм. Чувствительность проистекает из того факта, что каждая бактериальная клетка содержит тысячи молекул фермента, и, таким
образом, каждая может катализировать многократные события в подходящих условиях. В отличие от прямых подходов ПЦР, которые должны быть направлены на одну или несколько копий гена на клетку или использовать дополнительные шаги или реагенты для обнаружения рибосомальной или информационной РНК, описанный здесь подход направлен на обнаружение множественных копий фермента на клетку в простом формате анализа.
Как здесь утверждается, первый шаг в способе по изобретению включает приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, действующей в качестве субстрата для ферментативной, например, полимеразной, активности в образце.
Подходящие молекулы нуклеиновой кислоты в качестве субстратов для применения в изобретении более подробно описаны ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты могут включать подходящие синтетические нуклеотидные аналоги или могут быть основаны, например на РНК или ДНК, или их смеси. Они могут быть мечены, как путем использования флуоресцентной метки или пары FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции), в некоторых воплощениях для упрощения обнаружения. Здесь описаны подходящие способы обнаружения.
"Нуклеиновая кислота" определена здесь, как включающая любую природную нуклеиновую кислоту и природные или синтетические аналоги, которые способны к образованию обнаруживаемой молекулы нуклеиновой кислоты под действием полимеразы. Подходящие молекулы нуклеиновой кислоты могут состоять из, например, двух- или одноцепочечной ДНК, и двух-или одноцепочечной РНК.
Хотя субстрат нуклеиновая кислота может содержать имеющую тупые концы молекулу двухцепочечной ДНК, в воплощении изобретения нуклеиновая кислота, являющаяся субстратом для полимеразы, содержит две двухцепочечные молекулы ДНК с комплементарными концами и 5'-фосфатными группами на соединяемых концах. В одном из конкретных воплощений комплементарные края составляют от 2 до 10, такие как 3 или 5 пар оснований. В альтернативном воплощении субстрат нуклеиновая кислота включает молекулу ДНК с разрывом, содержащим 5'-фосфат. Синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты имеются в продаже и могут быть заказаны с
терминальной 5'-присоединенной группой фосфата. Последнее имеет техническое преимущество, заключающееся в том, что 100% молекул нуклеиновой кислоты, используемых в способах по изобретению, будут мечены 5'-фосфатными группами.
В особенно предпочтительных воплощениях изобретения, если полимераза присутствует в образце, то она будет оказывать каталитическое действие, и будет образовываться новая молекула нуклеиновой кислоты (включающая полную новую последовательность), которая может быть обнаружена посредством последующего способа, как здесь подробно описано (такого как, например ПЦР).
Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты в качестве субстрата может, фактически, содержать, когда подходит, две или больше чем две молекулы нуклеиновой кислоты. Последнее применяется в общем к способам и наборам по изобретению.
В некоторых воплощениях субстрат нуклеиновая кислота включает две двухцепочечных молекулы нуклеиновой кислоты с одноцепочечными комплементарными краями.
Понятно, что новые способы по настоящему изобретению могут использоваться для дифференцирования лигазы от полимеразы путем отбора образца, который, как предполагают, содержит оба фермента, и тестировании на полимеразу и на лигаза параллельно в отдельных реакционных сосудах, затем вычитая сигналы, таким образом, фактически определяя истинные уровни лигазы в образце. Последнее может быть представлено при помощи следующего уравнения:
[сигнал полимеразы - сигнал лигазы (полимераза + лигаза) = истинный сигнал лигазы]
Также понятно, что в любом воплощении настоящего изобретения действие полимераз на нуклеиновые кислоты хорошо известно, и, таким образом, можно видеть, что много различных типов нуклеиновых кислот в качестве субстратов могут быть выбраны для использования, и будут иметь преимущества для использования в новых способах по изобретению, как здесь описано. Предпочтительно, нуклеиновая кислота в качестве субстрата присутствует в избытке, и в частности в большом мольном избытке по
сравнению с полимеразой в образце. Последнее представляет собой важное техническое отличие по сравнению с предшествующим уровнем техники. Поскольку обнаруживают новую полимеризованную молекулу нуклеиновой кислоты, только присутствие этой молекулы в образце важно для способов обнаружения для эффективной работы. Таким образом, для способов по изобретению присутствие в образце других молекул нуклеиновой кислоты не является неблагоприятным, например, из обнаруживаемых бактерий, или из млекопитающих или грибковых источников, которые могут быть обнаружены, например, в тестируемом образце.
Настоящее изобретение может быть более подробно описано путем ссылки на следующие примеры экспериментальной работы, проведенной в соответствии с изобретением. Кроме того, несмотря на то, что описаны некоторые из предпочтительных воплощений настоящего изобретения и специфически проиллюстрированы выше, не предполагается, что изобретение ограничено такими воплощениями.
Пример 1. Открытие механизма, не зависимого от лигазы: Три различных субстрата ДНК (А) инкубировали с лигазой Е. coli или без лигазы и подвергали ПЦР, содержащей специфические праймеры для ПЦР для полноразмерной матрицы для ДНК-лигазы в присутствии/отсутствии UNG. ПЦР контролировали при помощи SYBR green (qPCR) и конечные реакции подвергали анализу на геле (В). Три различных матрицы ДНК (А) инкубировали с лигазой Е. coli или без лигазы и подвергали ПЦР, содержащей праймеры для обнаружения Si-Extension в присутствии/отсутствии UNG. ПЦР контролировали при помощи имеющейся в продаже методологии с зондом Zeus (qPCR) (Zeus Scientific, Inc., Raritan, NJ), и получающиеся в результате реакционные смеси подвергали анализу на геле (С). Уменьшающиеся количества нелигируемых субстратов ДНК (только SI/AS) инкубировали с тремя различными имеющимися в продаже ДНК-полимеразами и подвергали анализу Zeus-зонд qPCR. Результаты этих экспериментов проиллюстрированы графически на Фиг. 1.
Пример 2. Обнаружено, что нелигируемые подходящие для полимеразы субстраты являются чувствительными и специфическими в микробных неочищенных клеточных лизатах:
Уменьшающиеся количества микробов лизировали на шариковой мельнице и инкубировали с субстратом ДНК (только S1/AS) в присутствии буфера дл ДНК-полимеразы и dNTP при 37°С в течение 30 минут (А). Лизаты затем были подвергнуты qPCR Zews-Probe, содержащей специфические праймеры S1-удлинения. Результаты графически представлены на Фиг. 2.
Пример 3.
Обнаружено, что нелигируемые подходящие для полимеразы субстраты являются чувствительными и специфическими в неочищенных клеточных лизатах, происходящих из клеточной культуры с внесенными микробами:
Уменьшающиеся количества микробов вносили в 10 мл кровяного бульона. Микробы затем выделяли, подвергали лизису на шариковой мельнице и инкубировали с субстратом ДНК (только S1/AS) в присутствии буфера для ДНК-полимеразы и dNTP при 37°С в течение 30 минут (А). Лизаты затем были подвергнуты qPCR Zews-Probe, содержащей специфические праймеры S1-удлинения. Результаты графически представлены на Фиг. 3.
Соответственно, в еще одном аспекте настоящее изобретение вносит усовершенствование по сравнению с описанным и заявленным в WO/2009/007719. В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что субстрат, специфический для предполагаемой ДНК-лигазы, в соответствии с описанием указанного WO/2009/007719, приводит к устойчивым сигналам с очищенной ДНК-полимеразы или очищенной ДНК-лигазы, таким образом, что изложенные здесь способы не придают ДНК-лигазе специфичности при использовании в отношении предполагаемого типа образца, такого как септические образцы. Например, в разработке настоящего изобретения септические образцы с использованием способов приготовления образца, изложенных в WO/2009/007719, введены в протоколы анализов, как здесь изложено, в виде неочищенных лизатов микробных клеток, содержащих большое количество ДНК-полимераз. ДНК-полимераза(ы) находятся в большом количестве во всех живых клетках. Обнаружено, что анализы, раскрытые в
WO/2009/007719, не способны различать сигналы, происходящие с любой ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы при вводе образцов, не очищенных от лигазы, которые с практической точки зрения включают все введения клинических образцов, поскольку выделение лигазы не является ни практической, ни стандартной процедурой, как раскрыто в этой ссылке, при попытке получить результаты с клинических образцов. Наоборот, обнаружили, что эксперименты, проведенные в соответствии с приведенным в этой ссылке описанием, приводят к сигналу в исследовании, контаминированному сигналом с ДНК-полимеразы, а не специфическим для ДНК-лигазы, что составляет очевидно желаемый результат в соответствии с этой ссылкой.
Эти результаты, описанные выше, противоречат возможности системы, полученной в соответствии с концепцией WO/2009/007719, специфически обнаруживать ДНК-лигазу в живых клетках. Последнее дополнительно препятствует предполагаемой возможности раскрытого в этой ссылке анализа дифференцировать NAD-зависимую бактериальную лигазу из живых клеток от АТР-зависимой грибковой лигазы, поскольку активные полимеразы являются обычными для всех живых клеток и не могут дифференцироваться от каких-либо лигаз в такой системе анализа. Таким образом, идентифицировав эту критическую проблему, которая является совершенно непредвиденной в этой ссылке или в любой другой области техники, настоящее изобретение обеспечивает усовершенствования, которые дают возможность для обнаружения специфических лигазных сигналов в неочищенных лигазных образцах, таких как неочищенные микробные лизаты микроба, путем обеспечения альтернативных, замещающих субстратов ДНК, как описано далее, которые дают возможности для обнаружения мешающих сигналов от ДНК-полимеразы.
Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает усовершенствованные способы и композиции и наборы на их основе для обнаружения фермента, выбранного из группы, состоящей из NAD-зависимой лигазы, или фосфатазы, или их смеси в качестве индикатора присутствия микроорганизма в образце, включающие:
(а) приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты,
действующей в качестве субстрата для ферментативной активности в образце,
не допуская мешающих сигналов от ДНК-полимеразы,
(б) инкубирование приведенного таким образом в контакт образца в
условиях, подходящих для ферментативной активности; и
(в) определение присутствия (и/или количества) молекулы
нуклеиновой кислоты, модифицированной ферментом, полученной в
результате действия выбранного фермента или смеси на молекулу
нуклеиновой кислоты, являющуюся субстратом, для указания таким образом на
присутствие микроорганизма.
Таким образом, усовершенствованные способы по изобретению полезны для идентификации всех микроорганизмов, в которых экспрессируется NAD-зависимая лигаза, или фосфатаза, или их смеси.
В предпочтительном воплощении изобретения первый шаг в раскрытом здесь усовершенствованном способе включает приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, действующей в качестве субстрата для NAD-зависимой лигазной активности в образце, не допуская мешающих сигналов с ДНК-полимеразы. Любая подходящая ферментативно-модифицированная или лигируемая молекула, которая может быть в частности обнаружена, будучи лигированной, может быть использована в способах по изобретению.
Молекулы нуклеиновой кислоты в качестве субстрата для использования в способах и включения в наборы по настоящему изобретению должны иметь последовательность и структуру, такую что, NAD-зависимая лигаза может действовать на молекулу для образования обнаруживаемой ферментативно-модифицированной или лигированной (новой) молекулы нуклеиновой кислоты, и таким образом, что не допускаются мешающие сигналы с ДНК-полимеразы.
Понятно, что при разработке настоящего изобретения было отмечено, что устранение фонового сигнала от Taq-ДНК-полимеразы полимеразной цепной реакции (ПЦР) не представляет собой жизнеспособное решение отсутствию специфичности, которое было обнаружено в текущем воплощении субстрата, как раскрыто в WO/2009/007719, поскольку, как определено, она представляет собой отдельную систему обнаружения, которая должна быть решена отдельно и поэтому выходит за рамки объема настоящего описания.
Соответственно, в настоящем случае для экспериментов, приводящих к настоящему изобретению, специфически установлена цель блокировать всю ДНК-полимеразную активность путем добавки ингибитора, который не мешает сигналу с лигазы. Для осуществления этого, было отмечено, что ДНК-полимеразы обладают хорошо документированными ферментативными функциями, которые должны нейтрализоваться/контролироваться:
(а) 5'-3' ДНК-полимеразная активность,
(б) 3'-5' экзонуклеазная активность,
(в) 5'-3' экзонуклеазная активность,
(г) присущая эстеразная активность.
В соответствии с настоящим изобретением определили, что подходящие стратегии молекулы нуклеиновой кислоты в качестве субстрата для использования в новых способах по настоящему изобретению, подходящих для замены молекул субстрата, раскрытых как используемые в способах согласно WO/2009/007719, могут включать без ограничения следующие:
1. Модифицированные нуклеотиды, которые ингибируют любую полимеразную активность.
2. Дидезоксинуклеотиды ddCTP, ddGTP, которые останавливают полимеразу после добавления первого основания и прекращают-нейтрализуют ее действие, в то время как лигаза обеспечивает продуктивные реакции с использованием dATP.
3. Дидезоксиолигонуклеотиды, предотвращающие удлинение олигонуклеотида AS.
4. Олигонуклеотиды S1 с ингибирующими полимеразу модифицированными основаниями, включенными для блокирования их действия на субстрат ДНК.
5. Антитела, специфические для ДНК-полимеразы, которые ингибируют ее активность - они хорошо известны в области ПЦР.
6. Аптамерные олигонуклеотидные ингибирующие комплексы.
7. Стратегии гибридизации субстрата ДНК, которые устраняют субстраты, удлиненные полимеразой, от того, чтобы быть обнаруженными в нисходящих амплификациях, таких как ПЦР - путем укорочения AS на 5'-конце,
1.
комбинированного с истинным "горячим" стартом", в том смысле, в котором этот термин известен в области техники.
8. Стратегии гибридизации субстрата ДНК, устраняющие связывание полимеразы и удлинение путем укорочения AS на З'-конце, но не действующие на лигазу.
9. Относительная кинетика скорости реакции, комбинированная с удлинением полимеразой, сбалансированная в пользу лигазы.
10. Конкуренция за S1 З'-дидезокси (полноразмерный или 13-мер, который является комплементарным к 3' AS), осуществляемая до ПЦР.
11. Конкуренция за S1 3'-фосфат, осуществляемая до ПЦР.
12. Полное удаление AS с использованием оптимальных условий UNG (стандартный фермент UNG)
13. Полное удаление AS с использованием термостабильного UNG (NEB). Дает возможность для тепловой обработки UNG для устранения контаминирующей лигазы/полимеразы, ПЦР должна иметь dTTP.
14. Получение AS, имеющих дезоксиуридин (удаление UNG), и оставшиеся основания РНК для обеспечения совместной обработки UNG/РНКаза до ПЦР.
15. Необходимость получения дидезокси 3' AS.
16. Укорочение 3' конца AS для уменьшения прикрепления Taq при более высоких температурах (т.е. 65 градусах).
17. AS, ковалентно присоединенный к твердому носителю на стадии лигирования/удлинения.
18. З'-дидезокси S2 инвертированный комплемент (полноразмерный, или возможно всего лишь 13-мер, который является комплементарным к удлинению S1 Pol).
19. Для уменьшения фона - стратегии "Горячего старта", также известные в области техники - 100% устранение нежелательных олигонуклеотидов или расширенных гибридизаций олигонуклеотидов.
а) Истинный физический - сложный для реализации, так как все контактирующие материалы должны находиться при высокой температуре приблизительно 90 градусов по Цельсию, и температура никогда не должна опускаться ниже пороговой температуры приблизительно 65
градусов по Цельсию, проблема заключается в том, что процесс переноса создает падение температуры, которого нужно избежать.
б) Неферментативные Горячие старты, например капля в 2 мМ
MgCI (защищенный 1 мМ ЭДТА), праймеры, dNTP или другие важные
компоненты.
в) Горячий старт с химически модифицированным праймером .
Несмотря на то, что было показано, что усовершенствования по
настоящему изобретению могут быть реализованы путем замены описанных в WO/2009/007719 молекул на описанные здесь подходящие молекул нуклеиновой кислоты в качестве субстрата, понятно, что настоящее изобретение не должно быть ограничено в своем объеме конкретными описанными здесь воплощениями. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным здесь станут понятны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Предполагается, что все такие модификации оказываются в объеме настоящего изобретения. Кроме того, все описанные здесь воплощения рассматриваются как широко применимые и комбинируемые подходящим образом с любым и всеми другими непротиворечивыми воплощениями.
Специалистам в данной области техники понятно, что широкие фундаментальные принципы и концепции настоящего изобретения могут быть применимы для оптимизации всех вариаций анализа ПЦР с использованием денатурации неочищенного лизата (шариковые мельницы и ультразвуковые гомогенизаторы)-прямой зонд/SYBR различных биологических образцов ткани (включая без ограничения кровь, жидкость организма и мягкие ткани) не только в отношении микроорганизмов или микробов, описанных здесь конкретно, но также и для различных патогенов, таких как любые бактерии, грибы, вирус, паразиты и т.д.
Несмотря на то, что специфические ссылки сделаны здесь на ПЦР, дополнительно понятно, что усовершенствования данного изобретения не ограничены ПЦР или аналогичными способами. Анализы путем амплификации, рассматриваемые для применения в данном изобретении, включают без ограничения другие хорошо известные способы, основанные на нуклеиновой кислоте, такие как способы амплификации ДНК, анализы ПЦР, включающие
термостабильные полимеразы, и способы изотермической амплификации. Понятно, что специалист в данной области техники может представить различные подходящие способы амплификации, которые будут полезны при практической реализации данного изобретения, и что поэтому не предполагается, что изобретение не ограничено в своем объеме.
Также понятно, что настоящее изобретение имеет примененияя в любом и всех способах, процедурах и процессах, включая диагностику ДНК. Примеры таких применений включают без ограничения пищу, безопасность воды, биотерроризм, медицинские применения/лекарственные средства и/или любое применение, включающее обнаружение патогена. В пищевой промышленности данное изобретение может использоваться для контроля эффективности консервантов. Способ по изобретению обладает возможностью, которая применима ко всем клеткам. Несмотря на то, что в примере приведены бактериальные клетки, специалисту в данной области техники будет понятно, что способы по изобретению могут быть применены ко многим другим типам клеток. Изобретение может также использоваться для идентификации веществ, которые могут разрушить мембраны и/или уничтожать клетки, например бактериальные клетки. Идентификация новых дезинфицирующих средств и/или антибиотиков в настоящее время является приоритетом, так как организмы, обладающие мультилекарственной резистентностью, размножаются и распространяются в медицинских учреждениях и среди пациентов.
Также понятно, что способы по изобретению в сочетании с количественной ПЦР в качестве инструмента могут быстро и успешно идентифицировать влияние дезинфицирующего средства и/или антибиотика без необходимости тратить время на выращивание клеток и ожидание роста. В некоторых случаях организмам может потребоваться от суток до недель для выращивания, и таким образом может потребоваться значительное время для того, чтобы видеть, в состоянии ли вещество-кандидат уничтожить клетки, такие как микроорганизмы. В других случаях некоторые организмы не будут расти в клеточной культуре, делая сложным определение, является ли вещество эффективным. Таким образом, применение новых способов по изобретению может сэкономить время и ресурсы для идентификации новых дезинфицирующих средств и/или антибиотиков.
Дополнительное преимущество новых способов по изобретению заключается в простоте их использования. Например, с использованием этих способов большие количества образцов могут легко быть протестированы в отношении присутствия жизнеспособных клеток, например бактерий. Например, образцы могут быть протестированы на присутствие потенциально живых бактерий с интактными клеточными мембранами. В еще одном воплощении образцы из окружающей среды могут быть протестированы на присутствие живых клеток, например бактерий. Эти образцы, например, могут быть собраны в почве или представлять собой части растений. Способы по изобретению дополнительно могут быть использованы для тестирования сточных вод до и после выпуска.
Способы по изобретению могут дополнительно быть использованы для тестирования лекарственных образцов, например образцов кала, гемокультур, слюны, образцов ткани (также срезов), материала раны, мочы и образцов из дыхательных путей, имплантатов и поверхностей катетера.
Еще одна область применения способов по изобретению может заключаться в контроле продуктов питания. В других воплощениях пищевые образцы получены из молока или молочных продуктов (йогурт, сыр, сладкий сыр, масло и пахта), питьевой воды, напитков (лимонады, пиво и соки), продукты пекарни или мясных продуктов. С использованием способа по изобретению можно определить, предотвращают ли консерванты или антибактериальная обработка еды (такая как пастеризация) рост клеток в еде. Еще одна область применения способа по изобретению заключается в анализе фармацевтических и косметических продуктов, например, мазей, кремов, настоек, экстрактов, растворов, капель и т.д.
Кроме того, способами по изобретению можно идентифицировать потенциально жизнеспособные члены микробного сообщества для экологических исследований, здоровья специфических почв для сельскохозяйственных и/или экологических систем. Традиционно, идентификацию бактериального сообщества осуществляют с использованием подходов, основанных на выращивании или подсчете колоний. Чем больше колоний насчитывают, тем больше бактерий, как оценивают, находится в исходном образце. Тем не менее, проблемы возникают в результате иногда
длительной инкубации (в диапазоне суток), делающей этот способ неподходящим для своевременных и точных результатов. В способах по изобретению решены эти недостатки.
Не ограничивающие объем изобретения примеры бактерий, которые могут быть подвергнуты анализу с использованием способов по изобретению, или для обнаружения потенциальной жизнеспособности в образце с использованием способа по изобретению, включают, например: В. pertussis, Leptospira pomona, S. paratyphi А и В, С. diphtheriae, С. tetani, С. botidinum, С. perfringens, C.feseri и другие бактерии, вызывающие газовую гангрену, В. anthracis, P. pestis, P. multocida, Neisseria meningitidis, N. gonorrheae, Hemophilus influenzae, Actinomyces (например, Norcardia), Acinetobacter, Bacillaceae (например, Bacillus anthracis), Bacteroides (например, Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (например, Borrelia burgdorferi), Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Coccidioides, Corynebacterium (например, Corynebacterium diptheriae), E. coli (например, энтеротоксигенные E. coli и энтерогеморрагический E. coli), Enterobacter (например, Enterobacter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (например, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (например, Haemophilus influenza тип В), Helicobacter, Legionella (например, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (например, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (например, Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (например, Vibrio cholerae), Pasteurellacea, Proteus, Pseudomonas (например, Pseudomonas aeruginosa), Rickettsiaceae, Spirochetes (например, Treponema spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Meningiococcus, Pneumococcus и все Streptococcus (например, Streptococcus pneumoniae и Группы А, В и С Streptococci), Ureaplasmas. Treponema pollidum, Staphylococcus aureus, Pasteurella haemolytica, анатоксин Corynebacterium diptheriae, Meningococcal polysaccharide, Bordetella pertusis, Streptococcus pneumoniae, анатоксин Clostridium tetani и Mycobacterium bovis. Вышеупомянутый список предназначен для того, чтобы быть исключительно иллюстративным, и ни в коем случае не предназначается для ограничения изобретения обнаружением этих конкретных бактериальных организмов.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения используют ПЦР. Общие процедуры ПЦР изложены в патенте США № 4683195 (Mullis et al) и патенте США № 4683202 (Mullis et al). Тем не менее, оптимальные условия ПЦР, используемые для каждой реакции амплификации, обычно определяют опытным путем или оценивают с использованием программного обеспечения, обычно используемого специалистами в данной области техники в производственных условиях. Множество параметров влияют на успех реакции. Среди них находятся температура и время отжига, время удлинения, Мд2+, рН и относительная концентрация праймеров, матриц и дезоксирибонуклеотидов. Обычно матричную нуклеиновую кислоту денатурируют путем нагревания до по меньшей мере приблизительно 95°С в течение 1-10 минут до реакции полимеразы. Приблизительно 20-99 циклов амплификации осуществляют с использованием денатурации в диапазоне от 90°С до 96°С в течение от 0,05 до 1 минуты, с отжигом при температуре в дапазоне от 48°С до 72°С в течение от 0,05 до 2 минут, и удлинения при температуре от 68°С до 75°С в течение по меньшей мере 0,1 минут с оптимальным конечным циклом. В одном из воплощений реакция ПЦР может включать приблизительно 100 нг матричной нуклеиновой кислоты, 20 мкМ праймеров выше и ниже по течению, и от 0,05 до 0,5 мм dNTP каждого вида, и от 0,5 до 5 единиц имеющихся в продаже термостабильных ДНК-полимераз.
Вариация стандартной ПЦР представляет собой реакцию ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), в которой обратная транскриптаза сначала превращает молекулу РНК в одноцепочечную молекулу кДНК, которую затем используют в качестве матрицы для последующей амплификации в полимеразной цепной реакции. Выделение РНК известно в области техники. При осуществлении ОТ-ПЦР обратную транскриптазу обычно добавляют к реакционному образцу после того, как целевая нуклеиновая кислота будет термически денатурирована. Реакционную смесь затем поддерживают при подходящей температуре (например, 30-45°С) в течение достаточного количества времени (10-60 минут) для генерации матрицы кДНК прежде, чем будут проведены запланированные циклы амплификации. Специалисту в данной области техники понятно, что если желателен количественный результат, то следует соблюдать осторожность при использовании способа,
поддерживающего или контролирующего относительное количество копий амплифицированной нуклеиновой кислоты. Способы "количественной" амплификации хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, количественная ПЦР может включать одновременную коамплификацию известного количества контрольной последовательности с использованием тех же самых праймеров. Это обеспечивает внутренний стандарт, который можно использовать для калибровки реакции ПЦР.
Другой альтернативой для ПЦР является количественная ПЦР (кПЦР). кПЦР может быть осуществлена при помощи конкурентных способов, использующих внутренний гомологический контроль, отличающийся по размеру от мишени за счет маленькой вставки или делеции. Тем не менее, также может быть использована не конкурентная и кинетическая количественная ПЦР. Комбинация кинетического обнаружения путем ПЦР в реальном времени вместе с внутренним гомологическим контролем, который может быть одновременно обнаружен вместе с последовательностями-мишенями, может быть благоприятной.
Праймеры для ПЦР, ОТ-ПЦР и/или кПЦР выбраны в областях или конкретных бактериях, которые только амплифицируют область ДНК, выбранную для данного конкретного организма. Альтернативно, выбирают праймеры, которые гибридизируют и амплифицируют фрагмент ДНК, который характерен для всех организмов. Выбор праймера и конструкции в общем является обычным в области техники. В общем, один праймер располагается по одному концу амплифицируемой последовательности. Такие праймеры обычно составляют от 10 до 35 нуклеотидов в длину и имеют предпочтительную длину от 18 до 22 нуклеотидов. Самая маленькая последовательность, которая может быть амплифицирована, составляет приблизительно 50 нуклеотидов в длину (например, прямой и обратный праймер, оба из 20 нуклеотидов в длину, расположение которой в последовательностях разделено по крайней мере 10 нуклеотидами). Могут быть амплифицированы гораздо более длинные последовательности. Один из праймеров назван "прямым праймером" и располагается в левом конце области, которая будет амплифицирована. Прямой праймер идентичен по последовательности области в главной цепи ДНК (когда двухцепочечная ДНК
изображена с использованием соглашения, где главная цепь представлена полярностью в направлении от 5' к 3' концу). Последовательность прямого праймера является такой, что она гибридизируется с цепью ДНК, который является комплементарной к последовательности главной цепи ДНК. Другой праймер назван "обратным праймером" и располагается в правом конце области, которая будет амплифицирована. Последовательность обратного праймера такова, что он комплементарен по последовательности к, т.е. представляет собой обратный комплемент последовательности в, области в главной цепи ДНК. Обратный праймер гибридизируется с верхним краем ДНК. Праймеры для ПЦР должны также быть выбраны с учетом множества других условий. Праймеры для ПЦР должны быть достаточно длинными (предпочтительно от 10 до 30 нуклеотидов в длину) для уменьшения гибридизации с более чем одной области в матрице. По возможности следует избегать праймеров с более длительными последовательностями из одного основания. Праймеры должны предпочтительно иметь процент содержания G+C от 40 до 60%. По возможности процент содержания G+C по 3' концу праймера должен быть выше, чем процент содержания G+C по 5' концу праймера. Праймеры не должны содержать последовательности, которые могут гибридизироваться с другой последовательностью в праймере (т.е. палиндромы). Два праймера, используемые в той же самой реакции ПЦР, не должны обладать способностью гибридизироваться друг с другом. Несмотря на то, что праймеры для ПЦР предпочтительно выбраны таким образом, чтобы удовлетворять вышеприведенным рекомендациям, не обязательно, чтобы праймеры соответствовали этим условиям. Другие праймеры могут работать, но обладать меньшей вероятностью получения хороших результатов.
Праймеры для ПЦР, которые могут использоваться для амплификации ДНК в данной последовательности, могут быть выбраны с использованием одной из множества имеющихся компьютерных программ. Такие программы выбирают праймеры, которые оптимальны для амплификации заданной последовательности (т.е. такие программы выбирают праймеры с учетом вышеизложенных условий вместе с другими условиями, которые могут максимизировать функциональность праймеров для ПЦР). Одна компьютерная программа представляет собой пакет для анализа Genetics Computer Group
(GCG, недавно Accelrys), имеющий подпрограмму для выбора праймеров для ПЦР.
Олигонуклеотидные праймеры и зонды, раскрытые ниже, могут быть получены при помощи множества способов. Один из способов получения этих олигонуклеотидов заключается в том, чтобы синтезировать их с использованием имеющегося в продаже синтезатора нуклеиновых кислот. Множество таких синтезаторов существует и известно в области техники.
Нуклеиновая кислота может также быть обнаружена с использованием способов гибридизации. В этих способах меченая нуклеиновая кислота может быть добавлена к субстрату, содержащему меченые или немеченые зонды нуклеиновой кислоты. Альтернативно, меченая или немеченая нуклеиновая кислота может быть добавлена к субстрату, содержащему меченые зонды нуклеиновой кислоты. Методы гибридизации раскрыты, например в Micro Array Analysis, Marc Schena, John Wiley and Sons, Hoboken N.J. 2003.
Способы обнаружения нуклеиновых кислот могут включать использование метки. Например, радиоактивные метки могут быть обнаружены с использованием фотографической пленки или фосфорной визуализации (для обнаружения и количественного определения включения радиоактивного фосфата). Флуоресцентные маркеры могут быть обнаружены и количественно определены с использованием фотодетектора для обнаружения излучаемого света (смотри патент США № 5143854 в качестве примера аппарата). Ферментативные метки как правило обнаруживают путем получения фермента с субстратом и измерения продукта реакции, производимой действием фермента на субстрате. Колориметрические метки обнаруживают путем простой визуализации цветной метки. В одном из воплощений амплифицированные молекулы нуклеиновой кислоты визуализируют путем прямого окрашивания амплифицированных продуктов нуклеиновой кислотой -интеркалирующим красителем. Как очевидно для специалистов в данной области техники, примеры красителей включают без ограничения SYBR green, SYBR blue, DAPI, пропидий иодид и этидиум бромид. Количество люминесцентных красителей, интеркалированных в амплифицированные молекулы ДНК, прямо пропорционально количеству амплифицированных продуктов, которые могут быть для удобства определены количественно с
помощью стандартных обнаруживающих устройств в соответствии с указаниями производителей. Вариацией такого подхода является гель-электрофорез амплифицированных продуктов с последующим окрашиванием и визуализацией выбранного интеркалирующего красителя. Альтернативно, меченые олигонуклеотидные зонды для гибридизации (например, флуоресцентные зонды, такие как зонды для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) и колориметрические зонды) могут использоваться для обнаружения амплификации. При желании специфическая амплификация геномных последовательностей, типичных для тестированной биологической сущности, может быть верифицирована путем секвенирования или демонстрации того, что амплифицированные продукты имеют предполагаемый размер, демонстрируют предполагаемую картину рестрикционного расщепления или гибридизируются с правильными клонированным нуклеотидными последовательностями.
Данное изобретение также включает наборы. Например, набор может содержать субстрат, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты для активности выбранного фермента или смеси в образце (не позволяя мешать сигналам с полимеразы ДНК-полимеразы), средства инкубации для инкубирования образца и субстрата в условиях, подходящих для ферментативной активности, и средства для специфического определения присутствия (и/или количества) молекулы нуклеиновой кислоты, возникающей в результате действия выбранного фермента или смеси на молекуле нуклеиновой кислоты в качестве субстрата (как указание на присутствие микроорганизма). Такой набор может также содержать другие реагенты, подходящие для того, чтобы реализовать новые способы по изобретению, для скрининга обычно стерильных жидкостей организма в отношении присутствия/отсутствия микроорганизмов в ней, и для обеспечения диагностики, получения прогностической информации о лечении пациента, а также праймеры, полезные для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей организмам в частности или в общем, буферы и реагенты для выделения ДНК и реагенты для ПЦР. Набор может также включать детектируемый меченый олигонуклеотид, который гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид,
соответствующий интересуемым организмам. Набор может также содержать контрольный образец или серии контрольных образцов, которые могут быть измерены и сравнены с тестируемым образцом. Каждый компонент набора может быть включен в индивидуальном контейнере, и все из различных контейнеров могут находиться в единственном пакете, вместе с инструкциями для того, чтобы интерпретировать результаты анализа, выполняемого с помощью набора.
Также понятно, что способы, предложенные в изобретении, дополнительно включают проведение полного или частичного секвенирования последовательности генома микроорганизма и/или анализа последовательности транскриптома с использованием приведенных здесь принципов и концепции, и где полный или частичный анализ последовательности генома микроорганизма и/или анализ последовательности транскриптома может быть осуществлен одновременно, сопутствующим образом или параллельно с помощью подготовки единственного образца, как здесь описано. Также понятно, что новые способы по изобретению здесь могут обеспечить диагностическое измерение и обнаружение агентов, обладающих антимикробной и/или антиполимеразной активностью, полезных при лечении пациентов.
Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитированных в этой заявке на изобретение, включены здесь путем ссылки в той же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или заявка на патент были специфически и индивидуально указаны, как включенные путем ссылок.
Предшествующее подробное описание приведено только для ясности понимания, и никакие ненужные ограничения не должны быть выведены из него, поскольку модификации будут очевидны для специалистов в данной области техники. Не подтверждено, что любая приведенная здесь информация представляет собой предшествующий уровень техники или релевантна заявленным здесь изобретениям, или что любая публикация, на которую специфически или неявно ссылаются, представляет собой предшествующий уровень техники.
Если не определено иное, то все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, как обычно понимается специалистом в данной области техники, на которого направлено изобретение.
Несмотря на то, что настоящее изобретение описано подробно, определенные примеры приведены посредством специфической иллюстрации воплощений изобретения и для задач ясности понимания. Специалисту в данной области техники в свете концепции данного изобретения очевидно, что многие изменения и модификации могут быть сделаны в отношении этих воплощений, описанным таким образом, не отступая от сущности или концепции изобретения.
Хотя изобретение описано в связи со специфическими воплощениями, понятно, что имеется возможность к дополнительным модификациям, и данная заявка на изобретение предназначена для охвата любых вариаций, использований или адаптаций изобретения в соответствии, в общем, с принципами изобретения, и включая такие отклонения от настоящего описания, происходящие в рамках известной или общепринятой практики в области техники, которой принадлежит изобретение, и которая может быть применена к существенным изложенным здесь особенностям и находящимся в объеме формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ обнаружения полимеразной активности как показателя присутствия микроорганизма в образце, включающий:
(а) приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты,
действующей в качестве субстрата для полимеразной активности в образце;
(б) инкубирование приведенного таким образом в контакт образца в
условиях, подходящих для полимеразной активности; и
(в) специфическое определение присутствия (и/или количества)
молекулы нуклеиновой кислоты, полученной в результате действия
полимеразы микроорганизма на молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся
субстратом, для указания таким образом на присутствие микроорганизма.
2. Способ по п. 1, где полимераза представляет собой ДНК или РНК полимеразу.
3. Способ по п. 1, где обнаруженный микроорганизм представляет собой жизнеспособный микроорганизм в образце.
4. Способ по п. 1, где обнаруженный микроорганизм представляет собой интактный микроорганизм в образце.
5. Способ по п. 4, где обнаруженный интактный микроорганизм представляет собой микроорганизм, в котором ген полимеразы нуклеиновой кислоты и транслируемый с него белок активной полимеразы являются важными для жизнеспособности микроорганизма.
6. Способ по п. 1, где субстрат полимеразы является иммобилизованным.
7. Способ по п. 1, где образец, в котором обнаружен микроорганизм, представляет собой обычно стерильную жидкость организма.
8. Способ по п. 1, где образец готовят путем дифференциального клеточного лизиса, таким образом обеспечивая возможность только полученной из жизнеспособных микроорганизмов полимеразной активности модифицировать специфический для полимеразы субстрат.
9. Способ по п. 1, где образец, в котором обнаружен микроорганизм, приготовлен из неочищенных клеточных лизатов или очищенных клеточных фракций.
2.
10. Способ по п. 9, дополнительно включающий проведение полного или частичного анализа генома микроорганизма и/или анализ последовательности транскриптома.
11. Способ по п. 10, где полный или частичный анализ генома микроорганизма и/или анализ последовательности транскриптома может быть выполнен одновременно, совместно или параллельно с использованием единственного приготовления образца.
12. Способ по п. 10, где полный или частичный анализ генома микроорганизма и/или анализ последовательности транскриптома микроорганизмов дополнительно включает способ диагностического измерения и обнаружения агентов, обладающих противомикробной и/или антиполимеразной активностью, полезной для лечения пациентов.
13. Набор для анализа, состоящий из реагентов, полезных в способе по любому из пп. 1-12, для скрининга обычно стерильных жидкостей организма на присутствие/отсутствие в них микроорганизмов и для обеспечения диагностической, прогностической информации по лечению пациентов.
14. Способ обнаружения фермента, выбранного из группы, состоящей из NAD-зависимой лигазы, или фосфатазы, или их смеси, в качестве показателя присутствия микроорганизма в образце, включающий:
(а) приведение образца в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты,
действующей в качестве субстрата для ферментативной активности
выбранного фермента или смеси в образце, не допуская мешающих сигналов
от ДНК-полимеразы;
(б) инкубирование приведенного таким образом в контакт образца в
условиях, подходящих для ферментативной активности; и
(в) специфическое определение присутствия (и/или количества)
молекулы нуклеиновой кислоты, модифицированной ферментом, полученной в
результате действия выбранного фермента или смеси на молекулу
нуклеиновой кислоты, являющуюся субстратом, для указания таким образом на
присутствие микроорганизма.
15. Способ по п. 14, где микроорганизм представляет собой микроорганизм, в котором экспрессируется выбранный фермент или смесь.
15.
16. Способ по п. 14 или п. 15, где образец готовят путем дифференциального клеточного лизиса, таким образом обеспечивая возможность только полученной из жизнеспособных микроорганизмов лигазной и/или фосфатазной активности модифицировать специфический для лигазы субстрат.
17. Набор для анализа, предназначенный для осуществления анализа для обнаружения фермента, выбранного из группы, состоящей из NAD-зависимой лигазы, или фосфатазы, или их смеси, в качестве показателя присутствия микроорганизма в образце, включающий:
(а) субстрат, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, для
активности выбранного фермента или смеси в образце, в то же время не
допускающий мешающих сигналов от ДНК-полимеразы;
(б) средства для инкубации для того, чтобы инкубировать образец и
субстрат в условиях, подходящих для ферментативной активности; и
(в) средства для специфического определения присутствия (и/или
количества) молекулы нуклеиновой кислоты, полученной в результате действия
выбранного фермента или смеси на молекулу нуклеиновой кислоты,
являющуюся субстратом, как показателя присутствия микроорганизма.
Фиг. 1
ПЦР с использованием праймера удлинения S1 и прямого праймера LiMA для обнаружения Zeus-Probe
матрицы ^ {S1/S2/AS|S1/AS и ^ф &^Щ..^'
+/-Лигаза"" -li" <5 / " Матрица лигазы
/ {S1/AS/S2J
./' +Лигаза -i
¦f(NL-матрица , Лигируемая
. , к.. матрица
pl/A$ и S1/AS/S2"4 (S1/A5/52!
^ +лигаза - -лигаза .
4 ^ ж .V: м
:':::::::::Кривыс амплификации
Е. coli
' Эквивалент КОЕ в ПЦР
1 5еЗ /
*; 5е4 Отсутствие бактерий
Ш /> 5е2 /
5е1
NTC
:::;:;КрИВЫС аМПЛИфиКЭЦИИ
С. albicans
^ Эквивалент КОЕ в ПЦР 5е4" """
X * SeT'V
ч; 5е2 Отсутствие грибов
(r) №¦
Ж/Г
".("y^?c:^;- NTC
^:::::: ::: ^ амплификации
С. glabrata
Эквивалент КОЕ в ПЦР
5е4 ., <> ¦¦ 5еЗ '' ¦ ¦ / 5е 2 5i'l
'//
Отсутствие грибов NTC
Категория*
Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей
Относится к пункту №
WO 2009/007719 А2 (ISEAO TECHNOLOGIES LIMITED, et al.) 15.01.2009, формула п.п. I, 32
US 2007/0264680 Al (PROTEUS S. A.) 15.11.2007, формула п.п. 31, 38, 39, 57-65
1, 14, 17 2-13, 15-16
1-17
Особые категории ссылочных документов: "А" документ, определяющий общий уровень техники "Е" более ранний документ, но опубликованный на дату
подачи евразийской заявки или после нее "О" документ, относящийся к устному раскрытию, экспонированию и т.д.
"Р" документ, опубликованный до даты подачи евразийской
заявки, но после даты испрашиваемого приоритета "D" документ, приведенный в евразийской заявке
"Т" более поздний документ, опубликованный после даты приоритета и приведенный для понимания изобретения "X" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмегу поиска, порочащий новизну или изобретательский уровень, взятый в отдельности
"Y" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий изобретательский уровень в сочетании с другими документами той же категории
" &" документ, являющийся патентом-аналогом
"L" документ, приведенный в других целях
Дата действительного завершения патентного поиска:
29 апреля 2013 (29.04.2013)
Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности
РФ, 123995,Москва, Г-59, ГСП-5, Бережковская наб., д. 30-1.Факс: (499) 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Уполномоченное лицо :
t/faj^ Т. А. Леднева
Телефон № (499) 240-25-91
1 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
3 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
3 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
5 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
5 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
8 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
8 Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах